KR20120116494A - 유전적으로 변형된 유기체에서 도입유전자의 절제 - Google Patents

유전적으로 변형된 유기체에서 도입유전자의 절제

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KR20120116494A
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Abstract

식물에서 DNA의 영역을 제거하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 조직 특이적 프로모터(들), 예를 들어 화분 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 아연 핑거 뉴클레아제(들) (ZFN)을 코딩하는 핵산 분자로 식물을 형질전환하는 것을 포함한다. 방법은 식물에서 천연 유전자의 절제를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, ZFN은 천연 식물 유전자에 인접하는 서열을 인식하도록 조작된다. 추가의 실시양태에서, ZFN은 예를 들어, 핵산 서열이 비교적 늦은 발달기 동안 식물에서 특이적으로 절제되도록 발달기 특이적 프로모터의 제어 하에 발현된다. 개시된 방법의 수행 및 이 방법에 의해 생산된 식물에 유용한 핵산 분자가 포함된다.

Description

유전적으로 변형된 유기체에서 도입유전자의 절제{EXCISION OF TRANSGENES IN GENETICALLY MODIFIED ORGANISMS}
우선권 주장
본원은 미국 특허 가출원 61/297,628 (2010년 1월 22일 출원, 발명의 명칭 "Excision of Transgenes in Genetically Modified Organisms")의 이익을 주장한다.
본 발명은 일반적으로 트랜스제닉 식물의 생성을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 관심있는 하나 이상의 도입유전자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 도입유전자(들)의 절제는 본 발명의 트랜스제닉 식물에 의해 생산된 화분 및/또는 종자에 도입유전자(들)이 실질적으로 존재하지 않도록 화분 및/또는 종자에서 유도된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 트랜스제닉 식물은 트랜스제닉 식물에서 관심있는 도입유전자(들)의 생체구속 (bioconfinement)을 달성할 때 유용하다. 다른 실시양태에서, 도입유전자의 절제는 트랜스제닉 식물 및/또는 트랜스제닉 식물의 자손체로부터 그 발현 카세트만이 제거되도록 특이적 발현 카세트, 예컨대 선택가능 마커에 대한 것이다.
많은 식물은 바람직한 형질을 도입하기 위해서, 예컨대 영양가를 개선하고, 수율을 증가시키고, 해충 또는 질병 내성을 부여하고, 건조 및 스트레스 내성을 증가시키고, 원예 품질, 예컨대 색소 형성 및 성장을 개선하고/하거나 제초제 내성을 부여하고, 식물로부터 산업상 유용한 화합물 및/또는 물질의 생산을 가능하게 하고/하거나, 제약물질의 생산을 가능하게 함으로써 농업상 가치를 개선하기 위해서 다른 종으로부터의 유전자로 유전적으로 형질전환된다. 클로닝된 유전자의 식물 세포 내로의 도입 및 안정한 생식력 있는 트랜스제닉 식물의 회수는 상기 식물의 변형을 이루기 위해 사용될 수 있고, 바람직한 형질 또는 관심있는 품질 (예를 들어, 작물 개량)이 유전자 조작을 통해 식물 내로 도입되도록 허용하였다. 상기 방법에서, 외래 DNA는 일반적으로 진핵 식물 세포의 핵 또는 색소체 DNA 내로 도입된 후, 안정하게 형질전환된 식물 세포를 생산하기 위해 세포의 DNA 내로 통합된 외래 DNA를 함유하는 세포를 단리한다.
트랜스제닉 식물의 사용과 관련하여 발생하는 단점의 하나는 야생종 및 비-형질전환된 종으로의 도입유전자 누출 가능성이다. 이러한 특성은 도입유전자의 인접한 집단 내로의 이종교배, 존속, 및 유전자 이입 (introgression)의 위험을 증가시킬 수 있다. 유전적으로 변형된 (GM) 작물로부터 도입유전자의 누출은 대체로 주로 타가수분에 의한 유전자 유동을 통해 발생하지만 (Lu (2003) Eviron. Biosafety Res. 2:3-8), 유전자 이입을 통해 발생할 수도 있다 (Stewart Jr. et al. (2003) Nat. Reviews Gen. 4:806-17). 작물에서 작물로의 유전자 유동은 비-GM 변종의 오염을 야기하고, 이것은 제시된 농업 시스템에서 트랜스제닉 및 비-트랜스제닉 작물 변종의 전략적 배치에 영향을 줄 것이다. 트랜스제닉 물질에 의한 비-GM 작물의 오염은 많은 국가에 의한 트랜스제닉 생성물의 수입에 대한 법적 규제 때문에 국제 무역의 어려움을 야기한다. 작물에서 작물로의 유전자 유동은 도입유전자가 다중 내성 (예를 들어, 제초제, 해충, 및/또는 질병에 대한)을 부여한다면 잠재적으로 잡초가 될 수 있는 교잡종 내에 도입유전자의 축적을 야기할 수 있다. 추가로, 작물에서 작물로의 유전자 유동은 잡초 집단 또는 관련 야생종 내로 도입유전자 누출을 야기할 것이고, 이것은 도입유전자가 유성 번식 및/또는 영양 번식을 통해 잡초/야생 집단 내에서 지속되고 확립될 경우 심각한 잡초 문제 및 다른 생태학적 위험을 제시할 수 있다. 이것은 잡초/야생종의 생태학적 적합성을 증강시킬 경우 특히 우려된다. 작물 도입유전자의 유전자 이입은 몇몇의 연속적인 교잡종 생성을 수반하는 단계에서 발생한다. 유전자 이입은 도입되는 종의 유전적 배경에 도입유전자가 고정되기 전에 수년 및 수 세대가 걸릴 수 있는 동적인 과정이고, 따라서, 검출 및 모니터링의 어려움을 제시한다. 그러나, 선택이 강하고/하거나 집단 크기가 작을 경우, 유전자 이입된 유전자의 고정은 빠르게 발생할 수 있다.
유전적으로 변형되는 식물 내의 특이적 발현 카세트, 특히 선택가능 마커 발현 카세트의 도입은 달성하기 힘든 목표이다. 선택가능한 마커 유전자는 대체로 항생제 내성 또는 제초제 내성 유전자이지만, 리포터 유전자, 즉 β-글루쿠로니다제를 포함할 수 있다 (Graham et al. (1989) Plant Cell Tiss. Org. 20(1):35-39). 식물의 게놈 내로 동시 전달되는 선택가능한 마커는 선택 상의 잇점을 제공하고, 안정하게 형질전환된 트랜스제닉 식물의 확인을 허용한다. 식물의 형질전환에 사용될 수 있는 기능성 선택가능한 마커 유전자의 이용성은 다소 제한된다. 트랜스제닉 작물 식물에 대한 간행된 학술 문헌의 검토는 항생제 내성을 위해 가장 널리 사용되는 선택제가 카나마이신 (네오마이신 포스포트랜스퍼라제 타입 II 유전자에 의해 코딩됨 (Bevan et al. (1983) Nature 304:184-187)) 또는 히그로마이신 (히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자에 의해 코딩됨 (Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5:103-108))이고, 및 제초제 내성은 포스피노트리신 내성 (pat에 의해 코딩됨 (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37) 또는 bar 유전자 (DeBlock et al. (1987), EMBO J. 6 (9):2513-2518))임을 보여준다 (문헌 [Sundar et al. (2008) J. Plant Physiol. 165:1698-1716] 참조). 제한된 수의 선택가능 마커 유전자 및 상기 형질의 하위세트의 공통적인 사용을 고려할 때, 트랜스제닉 식물 내의 선택가능 마커의 절제 및 재사용을 허용하는 용액은 동일한 식물 내로의 후속 라운드의 유전자 전달 또는 유전자 축적시에 추가의 선택가능한 마커의 필요성을 제거한다. 또한, 선택가능 마커를 절제하는 능력은 마커의 발현에 의해 야기되는 식물 전사체 (transcriptome)에 대한 의도하지 않은 변화를 극복할 수 있다 (Abdeen et al. (2009) Plant Biotechnol. J. 7(3):211-218).
GM 작물과 다른 종 및 변종 사이의 유전자 유동을 억제하거나 최소화하기 위한 현재의 전략은 다음을 포함한다: (1) 트랜스제닉 작물의 물리적 단리; (2) 도입유전자의 엽록체 조작; (3) 도입유전자와 함께 완화 유전자의 동시 조작; (4) 유전자 이용 제한 기술 (GURT); (5) CRE/loxP 및 FLP/FRT 재조합효소-매개 유전자 결실 (예를 들어, 문헌 [Lee and atesan (2006) TRENDS Biotech. 24(3):109-14]; [Lu (2003), 상기 문헌]; 및 [Luo et al. (2007), Plant Biotech. J. 5:263-74] 참조); 및 (6) 메가뉴클레아제-매개 유전자 결실 (예를 들어, 미국 특허 출원 11/910,515; 및 미국 특허 출원 12/600,902 참조).
CRE, FLP, 및 R 재조합효소는 식물로부터 원치 않는 유전 물질의 절제를 위해 이용되었다 (Hare and Chua (2002) Nat. Biotech. 20:575-80). 문헌 [Luo et al. (2007), 상기 문헌]은 화분- 및 종자-특이적 "GM-유전자-제거자" 시스템을 보고하였고, 여기서 CRE 또는 FLP 재조합효소에 의한 도입유전자의 절제를 위한 인식 부위로서 loxP-FRT 융합 서열의 사용은 트랜스제닉 담배 식물의 화분, 또는 화분 및 종자 둘 모두로부터 도입유전자의 결실을 야기하였다. 식물에서 기능하는 것으로 밝혀진 상기 모든 부위-특이적 재조합효소 시스템은 인테그라제 패밀리의 구성원이다. 상기 시스템은 적어도 부분적으로는 다른 재조합효소가 재조합 효율에 대한 구조적 제약을 제시할 수 있는 보조 단백질 및 보다 복잡한 인식 부위를 필요로 할 수 있다는 사실 때문에 사용을 위해 선택되었다 (상기 문헌 참조). 상기 시스템은 몇몇의 유의한 결점을 갖는다: 인테그라제-타입 재조합효소는 또한 특이적 표적 서열로부터 크게 벗어날 수 있는 "위서열 (pseudo-sequence)"을 인식할 수 있고, 따라서 원치 않는 비-특이적 DNA 결실을 유발하고; 표적 서열의 절제는 잔여 인식 서열을 남기고, 이는 재조합효소에 대한 후속 노출시에 염색체 재배열 부위일 수 있거나, 또는 유전자 침묵 메카니즘을 활성화시킨다 (상기 문헌 참조). 또한, 상기 시스템은 기능성 재조합효소가 모 식물 중의 하나에 존재하고 발현되어야 하고 그의 존재는 화분 및/또는 종자 내의 결실을 위한 추가의 전략을 필요로 하기 때문에 추가로 제약된다. 상기 제한에도 불구하고, CRE/loxP 시스템은 식물에서 유전자 결실의 최적화를 위한 가장 적합한 전략으로서 인식된다 (상기 문헌 참조).
주문 설계된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)는 DNA 내의 표적화된 부위-특이적 이중가닥 파단을 생성하고 후속적으로 절단된 말단부를 재조합하도록 설계된 단백질이다. ZFN은 FokI 제한 엔도뉴클레아제의 비-특이적 절단 도메인을 아연 핑거 DNA-결합 단백질과 조합한다. 예를 들어, 문헌 [Huang et al. (1996) J. Protein Chem. 15:481-9]; [Kim et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3616-20]; [Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1156-60]; [Kim et al. (1994) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91:883-7]; [Kim et al. (1997b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12875-9]; [Kim et al. (1997c) Gene 203:43-9]; [Kim et al. (1998) Biol. Chem. 379:489-95]; [Nahon and Raveh (1998) Nucleic Acids Res. 26:1233-9]; [Smith et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27:674-81]을 참조한다. 개별적인 아연 핑거 모티프는 광범위한 DNA 부위를 표적화하고 결합하도록 설계될 수 있다. Cys2His2 아연 핑거 단백질은 α-나선을 이중 나선의 주 그루브 (groove) 내로 삽입함으로써 DNA에 결합한다. 아연 핑거에 의한 DNA의 인식은 모듈식 (modular)이다: 각각의 핑거는 1차적으로 표적 내의 3개의 연속적인 염기쌍과 접촉하고, 단백질 내의 몇 개의 핵심 잔기가 인식을 매개한다. FokI 제한 엔도뉴클레아제는 DNA를 절단하여 이중가닥 파단을 유도하기 위해 뉴클레아제 도메인을 통해 이량체화하여야 함이 밝혀졌다. 이와 유사하게, ZFN은 또한 DNA를 절단하기 위해 뉴클레아제 도메인의 이량체화를 필요로 한다 ([Mani et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 334:1191-7]; [Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-9]). ZFN의 이량체화는 2개의 인접한, 반대 배향의 결합 부위에 의해 용이해진다 (상기 문헌 참조). 또한, 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 야기된 이중가닥 파단은 비상동성 말단 연결 (NHEJ) 또는 상동성 유도 (directed) 복구 (HDR)을 통한 식물 DNA 복구 기구에 의해 해결되어, 잔여 인식 서열이 존재하지 않는 식물을 생성한다.
본 발명의 실시양태에 따라, 식물에서 DNA의 영역을 제거하는 방법을 제거하는 방법이 제공되고, 여기서 DNA의 영역을 포함하는 게놈 DNA를 함유하는 생존가능 식물이 제공되고; 인식 서열에서 게놈 DNA를 절단하도록 조작된 아연 핑거 뉴클레아제가 게놈 DNA를 함유하는 생존가능 식물에서 발현되거나 도입되고; 이에 의해 인식 서열에서 게놈 DNA의 절단을 유도하여 게놈 DNA의 절제를 야기하고, DNA의 영역이 게놈 DNA에 존재하지 않게 된다.
또 다른 실시양태에서, 식물에서 DNA의 영역을 제거하는 방법은 DNA의 영역, 및 DNA의 영역의 3' 말단에 인접하는 제1 인식 서열 및 5' 말단에 인접하는 제2 인식 서열을 포함하는 게놈 DNA를 함유하는 제1 생존가능 식물을 제공하는 것을 포함한다. 인식 서열에서 게놈 DNA를 절단하도록 조작된 아연 핑거 뉴클레아제를 코딩하는 DNA를 포함하는 게놈 DNA를 함유하는 제2 생존가능 식물이 제공된다. 제1 및 제2 생존가능 식물은 F1 종자가 제1 또는 제2 생존가능 식물에서 생산되도록 교배된다. 게놈 DNA를 함유하는 생성되는 F1 식물을 성장시키고, 여기서 DNA의 영역이 게놈 DNA에 존재하지 않게 된다. 특정 실시양태에서, 제1 인식 서열 및 제2 인식 서열은 동일할 수 있다.
특정 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 인식되는 제1 핵산 서열; 관심있는 유전자; 및 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 인식되는 제2 핵산 서열을 포함하고, 여기서 관심있는 유전자는 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 인식되는 제1 및 제2 핵산 서열이 인접한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 인식 서열 및 제2 인식 서열은 상동성 서열이 인접할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 트랜스제닉 식물을 생산하는 방법은 식물 세포 또는 식물 조직을 단리된 핵산 분자로 형질전환시키고 전체 식물을 재생시키는 것을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 관심있는 유전자의 다른 식물로의 전달을 감소시키는 방법은 전체 식물을 아연 핑거 뉴클레아제에 작동가능하게 연결된 화분-특이적 프로모터를 포함하는 단리된 핵산 분자로 형질전환된 식물 세포 또는 조직으로부터 재생된 식물과 교배시키는 것을 포함하고, 여기서 관심있는 유전자는 교배로부터 생성되는 자손체의 화분에서 특이적으로 절제된다. 교배로부터 생성되는 자손체를 재배한다. 상기 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 프로모터 및 아연 핑거 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 프로모터는 아연 핑거 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되고, 트랜스제닉 식물을 생성하는 방법은 식물 세포 또는 식물 조직을 단리된 핵산 분자로 형질전환시키고 전체 식물을 재생시키는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 인식되는 제1 핵산 서열; 선택가능 마커 유전자 발현 카세트; 및 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 인식되는 제2 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 함유하는 식물에서 DNA의 영역을 제거하는 방법이 제공되고, 여기서 선택가능 마커는 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 인식되는 제1 및 제2 핵산 서열이 인접한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 인식 서열 및 제2 인식 서열은 상동성 서열이 인접한다. 추가로, 인식 서열에서 게놈 DNA를 절단하도록 조작된 아연 핑거 뉴클레아제는 생존가능 식물 세포에서 발현되거나 도입되고; 이에 의해 인식 서열에서 게놈 DNA의 절단을 유도하여 게놈 DNA의 절제를 야기하고, 여기서 선택가능 마커는 게놈 DNA에 존재하지 않게 된다.
또 다른 실시양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제 단량체의 각각의 절반은 별개로 발현되고, 서로 함께 짝을 형성할 때 기능성 복합체를 형성한다. 예를 들어, 하나의 아연 핑거 뉴클레아제 단량체 (FokI 엔도뉴클레아제에 작동가능하게 연결된 아연 핑거 결합 모티프로 구성됨)를 발현하는 식물 전사 단위는 하나의 모 식물체 P1 내로 안정적으로 통합되고, 제2 단량체를 발현하는 식물 전사 단위는 제2 모 식물체 P2 내로 안정적으로 통합된다. P1 x P2의 유성 교배는 두 아연 핑거 단량체를 함유하는 자손체 식물을 생성한다. 생성되는 아연 핑거 뉴클레아제 이량체는 아연 핑거 결합 부위에 결합하여 절단 활성을 갖는 복합체를 형성할 수 있다. FokI 엔도뉴클레아제가 이량체로서 활성을 갖는다는 것을 감안할 때 (Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10,570-10,575), 절단 활성은 두 개의 기능적으로 발현하는 단량체를 모두 함유하는 자손체 내에서만 발생할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 인식 서열에서 아연 핑거 뉴클레아제에 의한 절제는 절단 연결의 형성을 유발하고, 이는 잔여 인식 서열에는 존재하지 않는다. 절단 연결은 본래의 아연 핑거 뉴클레아제(들)에 의해 결합되어 절단될 수 없다. 추가로, 절단 연결은 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)의 결과 또는 5' 인식 서열의 상류 및 3' 인식 서열의 하류에 위치하는 DNA의 2개의 상동성 영역 사이의 상동성 유도 복구의 결과 또는 또 다른 설명되지 않은 DNA 복구 메카니즘의 결과일 수 있다. 상동성 서열은 절단 후에 상동성 유도 복구가 발생할 수 있도록 결합 부위 외부에 위치할 수 있다. 이것은 절제를 위해 사용되는 부위의 나머지를 항상 남기는 재조합효소 시스템보다 개선된 것이다.
또 다른 실시양태에서, 식물에서 관심있는 천연 유전자를 절제하는 방법은 관심있는 유전자를 포함하는 식물 세포 또는 조직을 아연 핑거 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자 또는 아연 핑거 뉴클레아제를 코딩하는 단리된 단백질 서열로 형질전환시키는 것을 포함하고, 여기서 아연 핑거 뉴클레아제는 관심있는 천연 유전자에 인접하는 핵산 서열을 인식하고, 관심있는 천연 유전자는 특이적으로 절제된다. 이어서, 전체 식물이 재생된다. 다른 실시양태에서, 내인성 유전자 절제는 아연 핑거 뉴클레아제를 발현하는 식물을 표적 식물과 교배함으로써 달성될 수 있다.
도 1은 플라스미드 pDAS5380에 대한 플라스미드 지도를 포함한다.
도 2는 플라스미드 pDAS5381에 대한 플라스미드 지도를 포함한다.
도 3a는 T-DNA 삽입체의 모식도 및 제한 지도이다. 도 3b는 본 발명의 실시양태에 따른 플라스미드 pDAS5380으로부터의 전장 무손상 PTU를 함유하는 이벤트를 확인하기 위해 사용된 T0 서던 (Southern) 블롯 분석을 보여주는 몇몇의 패널을 포함한다. T0 서던 블롯 분석 영상은 pDAS5380 이벤트를 소화시키기 위해 제한 효소 MfeI 및 NsiI를 사용하였고, GUS 및 PAT의 동시-혼성화에 의한 무손상 T-DNA 삽입체를 보여준다.
도 4a는 T-DNA 삽입체의 모식도 및 제한 지도이다. 도 4b는 본 발명의 실시양태에 따른 플라스미드 pDAS5381로부터의 전장 무손상 PTU를 함유하는 이벤트를 확인하기 위해 사용된 T0 서던 블롯 분석을 보여주는 몇몇의 패널을 포함한다. T0 서던 블롯 분석 영상은 pDAS5381 이벤트를 소화시키기 위해 제한 효소 MfeI 및 NsiI를 사용하였고, HptII의 혼성화에 의한 무손상 T-DNA 삽입체를 보여준다.
도 5는 본 발명의 실시양태에 따라 보다 큰 샘플을 나타내는 이벤트의 선택된 군에 대한 서던 블롯 분석을 포함한다. 상기 샘플은 절제된 단편 (즉, 보다 작은 분자량 단편), 비-절제된 단편 (즉, 보다 큰 분자량 단편), 및 절제된 및 비-절제된 단편을 모두 함유하는 키메릭 (chimeric) 이벤트를 예시하기 위해 선택되었다. 또한, 야생형 게놈 DNA 및 100 pg의 pDAS5380 플라스미드의 대조군이 포함되었다. 상기 데이타는 GUS 발현 데이타와 서로 연관되었다. GUS에 대한 조직화학 염색을 통해 양성으로 염색되지 않는 이벤트는 전장 무손상 GUS PTU 발현 카세트를 함유하지 않았다.
도 6은 본 발명의 실시양태에 따라 서던 블롯 실험에 사용된 게놈 DNA 샘플의 PCR 증폭된 단편을 함유하는 아가로스 겔의 영상을 포함한다. 상기 PCR 앰플리콘 (amplicon)은 절제된 단편 (즉, 보다 저분자량 단편), 비-절제된 단편 (즉, 보다 고분자량 단편), 및 절제된 및 비-절제된 단편을 모두 함유한 키메릭 이벤트를 보여준다. 또한, 야생형 T0 식물의 대조군도 포함된다; 보다 큰 무손상 GUS PTU 발현 카세트가 이들 반응에서 증폭되었다. PCR 반응을 위해 야생형 게놈 DNA가 사용되거나 DNA가 사용되지 않은 (H2O) 음성 대조군도 포함된다. 상기 데이타는 GUS 발현 데이타 및 서던 블롯 데이타와 서로 연관되었다.
도 7a 및 7b는 본 발명의 실시양태에 따른 GUS 발현 카세트의 결실을 보여주는 2.4 kb 밴드의 서열 분석의 정렬을 포함한다. 굵은 글씨체의 서열은 At 액틴 프로모터 및 MAR 유전자 요소를 나타낸다. CCR5 결합 부위는 밑줄 및 이탤릭체로 확인된다. 이벤트당 다수의 앰플리콘이 생성되고 서열결정되었지만, 단지 하나의 앰플리콘만이 도면에 정렬되었다.
도 8은 본 발명의 실시양태에 따른 "무손상" F1 교잡종의 F2 자손체의 PCR 분석을 포함한다.
도 9는 본 발명의 실시양태에 따른 "무손상" F1 교잡종의 F2 자손체의 서던 분석을 포함한다.
도 10은 본 발명의 실시양태에 따른 "절제된" F1 교잡종의 F2 자손체의 PCR 분석을 포함한다.
도 11은 본 발명의 실시양태에 따른 "절제된" F1 교잡종의 F2 자손체의 서던 분석을 포함한다.
도 12는 본 발명의 실시양태에 따른 "키메릭" F1 교잡종의 F2 자손체의 PCR 분석을 포함한다.
도 13은 본 발명의 실시양태에 따른 "키메릭" F1 교잡종의 F2 자손체의 서던 분석을 포함한다.
서열 목록
첨부 서열 목록에 나열된 핵산 서열은 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 문자 약어를 사용하여 제시한다. 각각의 핵산 서열의 한 가닥만이 제시되지만, 상보성 가닥은 제시된 가닥에 대한 임의의 언급에 의해 포함되는 것으로서 이행된다. 첨부 서열 목록에서:
서열 1은 CCR5 ZFN 결합 부위를 보여준다.
서열 2는 CCR5 아연 핑거 뉴클레아제 유전자 서열을 보여준다.
서열 3은 TQPATS 프라이머를 보여준다.
서열 4는 TQPATA 프라이머를 보여준다.
서열 5는 TQPATFQ 프라이머를 보여준다.
서열 6은 TQPALS 프라이머를 보여준다.
서열 7은 TQPALA 프라이머를 보여준다.
서열 8은 TQPALFQ 프라이머를 보여준다.
서열 9는 HPT2S 프라이머를 보여준다.
서열 10은 HPT2A 프라이머를 보여준다.
서열 11은 HPTFQ 프라이머를 보여준다.
서열 12는 FokI_UPL_F 프라이머를 보여준다.
서열 13은 FokI_UPL_R 프라이머를 보여준다.
서열 14는 BY2ACT89S 프라이머를 보여준다.
서열 15는 BY2ACT89A 프라이머를 보여준다.
서열 16은 PTU PCR 분석을 위한 전방향 PCR 프라이머를 보여준다.
서열 17은 PTU PCR 분석을 위한 역방향 PCR 프라이머를 보여준다.
서열 18은 BYACTFQ 프라이머를 보여준다.
유전적으로 변형된 유기체에서 특이적 식물 조직으로부터 유전자를 절제하는 방법을 본원에 개시한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 ZFN (아연 핑거 뉴클레아제)은 비-GM 작물 내로의 유전자 유동을 감소시키는 수단으로서 특이적 식물 조직으로부터 도입유전자를 제거하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 제거되는 도입유전자는 선택가능 마커 유전자 카세트이다. 특정 실시양태에서, 특이적 식물 조직은 화분이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 ZFN은 상이한 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 및 추가의 실시양태에서, 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 ZFN 중의 하나는 하나의 모 식물 주 내로 형질전환될 수 있고, 상이한 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 ZFN으 다른 하나는 제2 모 식물 주 내로 형질전환될 수 있다. 각각의 하나 이상의 ZFN을 함유하는 모 식물주 사이의 교배는 인식 서열에서 DNA를 절단하는 기능성 ZFN을 함유하는 F1 식물주를 생산할 수 있다. 인식 서열은 식물의 DNA 내의 도입유전자에 인접할 수 있다.
조직-특이적 유전자 절제는 ZFN에 대한 조직-특이적 식물 프로모터의 작동가능한 연결에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 ZFN에 대한 조직-특이적 프로모터의 작동가능한 연결은 하나 이상의 ZFN의 조직-특이적 발현을 유도하여, ZFN, 선택가능 마커, 및/또는 특이적 조직 내의 인식 서열 사이에 위치하는 임의의 유전자 또는 핵산 서열을 절제를 유발한다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 ZFN은 동일한 식물 내에서 발현된다. ZFN은 식물의 보다 늦은 발달기 동안 ZFN의 발현을 유도하는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 및 다른 실시양태에서, 하나 이상의 기능성 ZFN은 하나 이상의 도입유전자(들)에 인접하는 특이적 인식 서열을 절단하여, 보다 늦은 식물 발달기 동안 식물 조직으로부터 하나 이상의 도입유전자를 제거할 수 있다.
약어
GM 유전적으로 변형된
PTU 식물 전사 단위
ZF 아연 핑거
ZFN 아연 핑거 뉴클레아제
ZFP 아연 핑거 단백질
용어
유전자 발현: 그에 의해 핵산 전사 단위 (예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA 포함)의 코딩되는 정보가 종종 단백질의 합성을 비롯하여 세포의 작동적, 비-작동적, 또는 구조적 부분으로 전환되는 과정. 유전자 발현은 외부 신호; 예를 들어, 유전자 발현을 증가시키거나 감소시키는 물질에 대한 세포, 조직, 또는 유기체의 노출에 의해 영향받을 수 있다. 또한, 유전자의 발현은 DNA로부터 RNA로, 다시 단백질로의 경로의 임의의 부위에서 조절될 수 있다. 유전자 발현의 조절은 예를 들어 전사, 번역, RNA 수송 및 프로세싱 (processing)에 대한 제어, 중간 분자, 예컨대 mRNA의 분해를 통해, 또는 생성된 후에 특이적 단백질 분자의 활성화, 불활성화, 구획화 (compartmentalization), 또는 분해를 통해, 또는 이들의 조합에 의해 수행된다. 유전자 발현은 노던 (Northern) 블롯, RT-PCR, 웨스턴 (Western) 블롯, 또는 시험관내, 계내 (in situ), 또는 생체내 단백질 활성 분석(들)을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정할 수 있다.
혼성화: 올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체는 상보성 염기 사이의 왓슨-크릭 (Watson-Crick), 훅스틴 (Hoogsteen) 또는 역 (reversed) 훅스틴 수소 결합을 포함하는 수소 결합에 의해 혼성화한다. 일반적으로, 핵산 분자는 피리미딘 (시토신 (C), 우라실 (U), 및 티민 (T)) 또는 퓨린 (아데닌 (A) 및 구아닌 (G))인 질소 염기로 구성된다. 상기 질소 염기는 피리미딘과 퓨린 사이에 수소 결합을 형성하고, 피리미딘의 퓨린에 대한 결합은 "염기쌍 형성"으로 언급된다. 보다 구체적으로, A는 T 또는 U에 수소 결합할 것이고, G은 C에 결합할 것이다. "상보성"은 2개의 별개의 핵산 서열 또는 동일한 핵산 서열의 2개의 별개의 영역 사이에 발생하는 염기쌍 형성을 의미한다.
"특이적으로 혼성화가능한" 및 "특이적으로 상보성"은 올리고뉴클레오티드와 DNA 또는 RNA 표적 사이에 안정하고 특이적인 결합이 발생하도록 충분한 정도의 상보성을 나타내는 용어이다. 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화가능한 그의 표적 서열에 100% 상보성일 필요는 없다. 올리고뉴클레오티드는, 표적 DNA 또는 RNA 분자에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합이 표적 DNA 또는 RNA의 정상 기능을 저해하고, 특이적 결합이 요구되는 조건 하에, 예를 들어 생체내 분석 또는 시스템의 경우에 생리학적 조건 하에 올리고뉴클레오티드의 비-표적 서열에 대한 비-특이적 결합을 방지하기에 충분한 정도의 상보성이 존재할 때 특이적으로 혼성화가능한 것이다. 상기 결합은 특이적 혼성화로서 언급된다.
특정 정도의 엄격성을 생성하는 혼성화 조건은 선택된 혼성화 방법의 특성 및 혼성화하는 핵산 서열의 조성 및 길이에 따라 상이할 것이다. 일반적으로, 혼성화 온도 및 혼성화 버퍼의 이온 강도 (특히 Na+ 및/또는 Mg2 + 농도)가 혼성화의 엄격성에 기여할 것이지만, 세척 횟수도 엄격성에 영향을 준다. 특정 정도의 엄격성 달성에 필요한 혼성화 조건에 대한 계산은 문헌 [Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 and 11]에 논의되어 있다.
본 개시내용의 목적을 위해, "엄격한 조건"은 혼성화 분자와 표적 서열 사이에 25% 미만의 미스매치 (mismatch)가 존재할 경우 혼성화가 발생하는 조건을 포함한다. "엄격한 조건"은 특정 수준의 엄격성으로 추가로 규정될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 "저 엄격성" 조건은 25% 초과의 미스매치를 갖는 분자가 혼성화하지 않는 조건이고; "중간 엄격성"의 조건은 15% 초과의 미스매치를 갖는 분자가 혼성화하지 않는 조건이고, "고 엄격성"의 조건은 10% 초과의 미스매치를 갖는 서열이 혼성화하지 않는 조건이다. "매우 높은 엄격성"의 조건은 6% 초과의 미스매치를 갖는 서열이 혼성화하지 않는 조건이다.
특정 실시양태에서, 엄격한 조건은 65℃에서의 혼성화, 이어서 0.1x SSC/0.1% SDS로 40분 동안 65℃에서의 세척을 포함할 수 있다.
단리된: "단리된" 생물학적 성분 (예컨대 핵산 또는 단백질)은 그 성분이 천연적으로 생성되는 유기체의 세포 내의 다른 생물학적 성분, 즉, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질로부터 실질적으로 분리되거나 이로부터 별도로 생산되거나 또는 정제되었다. "단리된"은 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질, 및 화학적으로 합성된 핵산 분자, 단백질, 및 펩티드를 포함한다.
핵산 분자: RNA, cDNA, 게놈 DNA의 센스 및 안티센스 가닥, 및 이들의 합성 형태 및 혼합된 중합체를 포함할 수 있는 뉴클레오티드의 중합체 형태. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 또는 이들 뉴클레오티드의 어느 한 형태의 변형된 형태를 의미한다. 본원에서 사용되는 "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 이 용어는 단일가닥 및 이중가닥 형태의 DNA를 포함한다. 핵산 분자는 천연 생성 및/또는 비-천연 생성 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 천연 생성 및 변형된 뉴클레오티드 중의 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.
핵산 분자는 당업자에 의해 쉽게 이해되는 바와 같이, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비-천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 상기 변형은 예를 들어, 표지, 메틸화, 및 하나 이상의 천연 생성 뉴클레오티드의 유사체에 의한 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 비하전 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등), 하전 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 매달린 모이어티 (moiety) (예를 들어, 펩티드), 삽입제 (intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이터, 알킬화제, 및 변형된 연결 (예를 들어, 알파 아노머 (anomeric) 핵산 등)을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 단일가닥, 이중가닥, 부분적으로 이중체화된, 삼중체화된, 헤어핀, 환상, 및 잠긴 (padlocked) 입체형태를 비롯한 임의의 구조적 입체형태를 포함한다.
작동가능하게 연결된: 제1 핵산 서열은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 존재할 때 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 줄 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 재조합 방식으로 생산될 때, 작동가능하게 연결된 핵산 서열은 일반적으로 인접하고, 2개의 단백질-코딩 영역을 연결하기 위해 필요한 경우 동일한 해독 프레임으로 존재한다. 그러나, 요소는 작동가능하게 연결되기 위해 인접할 필요는 없다.
프로모터: 전사에 필요한, 일반적으로 상류에 위치하는 (유전자의 5' 영역을 향한) DNA의 영역. 프로모터는 이들이 제어하는 유전자의 적절한 활성화 또는 억제를 허용한다. 프로모터는 전사 인자에 의해 인식되는 특이적 서열을 함유한다. 이들 인자는 프로모터 DNA 서열에 결합하여 유전자의 코딩 영역으로부터 RNA를 합성하는 효소인 RNA 중합효소의 동원을 유도한다. 일부 실시양태에서, 조직-특이적 프로모터, 예를 들어 화분-특이적 프로모터가 본 발명의 방법에 사용된다. 조직-특이적 프로모터는, 프로모터가 유기체의 다른 조직에 비해 특이적인 조직 내에서 보다 높은 수준의 관련 유전자의 전사를 지시하는 DNA 서열이다. 조직-특이적 프로모터의 예는 융단조직 (tapetum)-특이적 프로모터; 꽃밥-특이적 프로모터; 화분-특이적 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 7,141,424, 및 PCT 국제 특허 출원 공개 WO 99/042587 참조); 배주-특이적 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 출원 2001/047525A1 참조); 열매-특이적 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 4,943,674 및 5,753,475 참조); 및 종자-특이적 프로모터 (예를 들어, 미국 특허 5,420,034 및 5,608,152 참조)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발달기-특이적 프로모터, 예를 들어 후기 발달기에 활성을 보이는 프로모터도 사용된다.
형질전환된: 바이러스 또는 벡터는 핵산 분자를 세포 내로 이송할 때 세포를 "형질전환" 또는 "형질도입시킨다". 세포는 핵산 분자의 세포 게놈 내로의 통합에 의해 또는 에피좀 복제에 의해 핵산 분자가 세포에 의해 안정하게 복제될 때 세포 내로 형질도입된 핵산 분자에 의해 "형질전환된다". 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질전환"은 핵산 분자가 상기 세포 내로 도입될 수 있는 모든 기술을 포함한다. 그 예는 바이러스 벡터를 사용한 형질감염, 플라스미드 벡터를 사용한 형질전환, 전기천공 (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3), 리포펙션 (lipofection) (Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7), 미세주사 (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85), 아그로박테리움-매개 전달 (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7), 직접적인 DNA 흡수, 및 미세입자 투사법 (microprojectile bombardment) (Klein et al. (1987) Nature 327:70)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
도입유전자: 외인성 핵산 서열. 한 예에서, 도입유전자는 유전자 서열 (예를 들어, 제초제-내성 유전자), 산업상 또는 제약상 유용한 화합물을 코딩하는 유전자, 또는 바람직한 농업 형질을 코딩하는 유전자이다. 또 다른 예에서, 도입유전자는 안티센스 핵산 서열이고, 여기서 안티센스 핵산 서열의 발현은 표적 핵산 서열의 발현을 억제한다. 도입유전자는 도입유전자에 작동가능하게 연결된 조절 서열 (예를 들어, 프로모터)을 함유할 수 있다.
벡터: 세포 내로 도입되어 형질전환된 세포를 생성하는 핵산 분자. 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 허용하는 핵산 서열, 예컨대 복제 기점을 포함할 수 있다. 그 예는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, 또는 외인성 DNA를 세포 내로 운반하는 바이러스를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, 벡터는 하나 이상의 유전자, 안티센스 분자, 및/또는 선택가능 마커 유전자 및 당업계에 공지된 다른 유전자 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입하거나, 형질전환시키거나 감염시켜, 세포가 벡터에 의해 코딩되는 핵산 분자 및/또는 단백질을 발현하도록 유도할 수 있다. 벡터는 핵산 분자의 세포 내로의 도입을 돕는 물질 (예를 들어, 리포좀, 단백질 코딩 등)을 임의로 포함한다.
식물로부터 Zn - 핑거 뉴클레아제-매개 도입유전자의 절제
도입유전자 누출이 감소된 식물의 생산 방법, 및 상기 방법에 의해 생산된 식물, 및 이로부터 유래된 식물 물질, 예를 들어, 종자가 본원에 개시된다. 하나의 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 조직-특이적 프로모터(들) (예를 들어, 화분-특이적 프로모터)에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 아연 핑거 뉴클레아제(들) (ZFN)을 포함하는 벡터와 식물을 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 벡터의 발현은 그의 작동가능하게 연결된 프로모터가 활성을 보이는 특이적 조직에서 ZFN(들)의 생산을 유도한다. ZFN(들)은 그의 절제가 요구되는 핵산 서열에 인접하는 절단 서열을 인식하도록 설계되거나 조작될 수 있다. 이어서, 프로모터가 활성을 보이는 특이적 조직에서 ZFN(들)의 생산은 ZFN(들)에 의해 인식되는 절단 서열 사이의 핵산 서열의 절제를 유도하여, 잔여 인식 서열이 존재하지 않는 절단 연결을 함유하는 핵산 서열을 생성한다.
또 다른 실시양태에서, 방법은 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 ZFN(들); 관심있는 유전자; 임의로, 관심있는 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있는 하나 이상의 조절 요소(들); 및 관심있는 유전자 및 하나 이상의 조절 요소(들)에 인접하는, ZFN(들)에 의해 인식되는 하나 이상의 절단 서열을 포함하는 벡터와 식물을 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 벡터의 발현은 그의 작동가능하게 연결된 프로모터가 활성을 보이는 특이적 조직에서 ZFN(들)의 생산을 유도한다. 이어서, 프로모터가 활성을 보이는 특이적 조직에서 ZFN(들)의 생산은 관심있는 유전자 및, 임의로, 하나 이상의 조절 요소(들)을 포함하는, ZFN(들)에 의해 인식되는 절단 서열 사이의 핵산 서열의 절제를 유도한다.
추가의 실시양태에서, 방법은 식물 발달의 특정 기간에 활성을 보이는 하나 이상의 프로모터(들) (예를 들어, 비교적 늦은 발달기에서 발현을 유도하는 프로모터)에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 아연 핑거 뉴클레아제(들) (ZFN)을 포함하는 벡터와 식물을 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 벡터의 발현은 그의 작동가능하게 연결된 프로모터가 활성을 보이는 특정 발달 기간 동안 ZFN(들)의 생산을 유도한다. ZFN(들)은 그의 절제가 요구되는 핵산 서열에 인접하는 절단 서열을 인식하도록 설계되거나 조작될 수 있다. 이어서, 프로모터가 활성을 보이는 발달기에서 ZFN(들)의 생산은 ZFN(들)에 의해 인식되는 절단 서열 사이의 핵산 서열의 절제를 유도한다.
추가의 실시양태에서, 방법은 식물 발달의 특정 기간에 활성을 보이는 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 ZFN(들); 관심있는 유전자; 임의로, 관심있는 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있는 하나 이상의 조절 요소(들); 및 관심있는 유전자 및 하나 이상의 조절 요소(들)에 인접하는, ZFN(들)에 의해 인식되는 하나 이상의 절단 서열을 포함하는 벡터와 식물을 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 벡터의 발현은 그의 작동가능하게 연결된 프로모터가 활성을 보이는 특정 발달 기간 동안 ZFN(들)의 생산을 유도한다. 그의 작동가능하게 연결된 프로모터가 활성을 보이는 특정 발달 기간 동안 ZFN(들)의 생산은 관심있는 유전자 및 하나 이상의 조절 요소(들)을 포함하는, ZFN(들)에 의해 인식되는 절단 서열 사이의 핵산 서열의 절제를 유도한다.
ZFN 뉴클레아제
특정 실시양태에서, ZFN은 형질전환된 식물에서 핵산 서열의 절제를 유도하기 위해 형질전환된 식물 내의 핵산 분자로부터 발현된다. 특정 핵산 서열 (예를 들어, 도입유전자, 관심있는 유전자, 또는 선택가능 마커 유전자)에 인접하도록 조작된 인식 서열을 표적화하는 ZFN이 사용될 수 있거나 또는 ZFN은 절제되는 특정 핵산 서열에 인접하는 천연 생성 핵산 서열을 표적화하도록 설계될 수 있다. ZFN 시스템의 정교한 유연성 (flexibility) 및 특이성은 공지의 재조합효소-매개된 유전자 절제 전략에 의해 이전에 달성될 수 없는 제어 수준을 제공한다.
ZFN의 인식 특이성은 실험에 의해 쉽게 조작될 수 있다 (Wu et al. (2007) Cell. Mol. Life Sci. 64:2933-44). 아연 핑거 인식 잔기에 대한 코돈의 무작위 선택은 임의로 선택된 DNA 서열에 대해 높은 친화도를 갖는 새로운 핑거의 선택을 허용한다. 또한, 아연 핑거는 천연 DNA-결합 분자이고, 조작된 아연 핑거는 살아있는 세포 내에서 그의 설계된 표적에 대해 작용하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 아연 핑거를 기초로 한 뉴클레아제는 특이적인 임의의 인식 부위에 대한 표적화가 가능하다.
키메릭 아연 핑거 뉴클레아제의 절단 도메인의 이량체화 요건은 높은 수준의 서열 특이성을 부여한다. 3개 핑거의 각각의 세트는 9개의 연속적인 염기쌍에 결합하기 때문에, 2개의 키메릭 뉴클레아제는 각각의 아연 핑거 도메인이 완전한 특이성을 갖는다면 18 bp 표적을 효과적으로 처리한다. 상기 길이의 임의의 제시된 서열은 단일 게놈 (약 109 bp 가정) 내에서 특유할 것으로 예상된다 ([Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21(1):289-97]; [Wu et al. (2007), 상기 문헌]. 또한, 추가의 핑거는 향상된 특이성을 제공하고 ([Beerli et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14628-33]; [Kim and Pabo (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2812-7]; [Liu et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5525-30]), 따라서 각각의 DNA-결합 도메인 내의 아연 핑거의 수는 추가의 특이성을 제공하기 위해 증가될 수 있다. 예를 들어, 특이성은 24 bp 서열을 인식하는 4-핑거 ZFN의 쌍을 사용하여 추가로 증가시킬 수 있다 (Urnov et al. (2005) Nature 435:646-51).
α-나선의 출발 지점에 대한 위치 -1, 2, 3, 및 6에서 ZFN 내의 핵심 아미노산은 아연 핑거 모티프에 의한 대부분의 특이적 상호작용에 기여한다 ([Pavletich and Pabo (1991) Science 252:809-17]; [Shi and Berg (1995) Chem. Biol. 2:83-9]). 이들 아미노산은 나머지 아미노산을 컨센서스 백본으로서 유지하면서, 상이한 및/또는 신규한 서열 특이성을 갖는 ZFP를 생성하기 위해 변경될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Choo and Klug (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11163-7]; [Desjarlais and Berg (1992) Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:7345-9]; [Desjarlais and Berg (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2256-60]; [Greisman and Pabo (1997) Science 275:657-61]; [Isalan et al. (1998) Biochemistry 37:12026-33]; [Jamieson et al. (1994) Biochemistry 33:5689-95]; [Rebar and Pabo (1994) Science 263:671-3]; [Segal et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2758-63]; [Wolfe et al. (1999) J. Mol. Biol. 285:1917-34]; [Wu et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:344-8]을 참조한다. 또한, 절단을 생성하기 위해 서로 협력하도록 상이한 서열 특이성을 갖는 적어도 2개의 3-핑거 ZFN이 설계될 수 있다 (Smith et al. (2000), 상기 문헌).
본 발명의 ZFN의 제작을 위한 설계 및 선택 방법은 특이적 핵산 서열을 인식하는 하나 이상의 적절한 ZF 모티프를 결정함으로써 시작할 수 있다. 별법으로, 특이적 핵산 서열을 인식하는 ZFN은 특이적 핵산 서열 (예를 들어, 특이적 핵산 서열이 관심있는 유전자에 인접하는 경우) 및 필요한 다른 요소를 포함하는 핵산 분자를 제작하기 위해 사용될 수 있다. 파지 디스플레이 방법을 비롯하여 ZFP에 대한 설계 및 다양한 선택 방법이 검토되었다 ([Mani et al. (2005), 상기 문헌]; [Durai et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33:5978-90]; [Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-60]; [Kandavelou et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:686-87]; [Pabo et al. (2001) Annu. Rev. Biochem. 70:313-40]; [Segal et al. (2003) Biochemistry 42:2137-48]. 당업계에 공지된 임의의 설계 및/또는 선택 방법은 본 발명의 실시양태에 사용하기 위한 ZFN을 얻기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 세균 원-하이브리드 (one-hybrid) 및 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템을 사용한 세포-기반 선택 전략이 고 특이적 ZFP를 생산하기 위해 사용될 수 있다 ([Durai et al. (2006) Comb. Chem. High Throughput Screen. 9:301-11]; [Hurt et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:12271-6]; [Joung et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:7382-7]. 또한, 고 특이적 ZFP는 다중-핑거 ZFP의 최적화를 위한 일반적인 방법을 제공하는 유도 도메인 셔플링 (shuffling) 및 세포-기반 선택에 의해 얻을 수도 있다 (Hurt et al. (2003), 상기 문헌).
설계 및 파지 디스플레이 방법을 기초로 한 많은 데이타가 5' GNN 3' 및 5' ANN 3' 삼중자를 특이적으로 인식하는 ZF 모듈에 대해 이용가능하고, 더 작은 정도로 5' CNN 3' 및 5' TNN 3' 삼중자에 대한 ZF 모티프 선호도가 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Durai et al. (2005), 상기 문헌]; [Dreier et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:29466-78]; [Dreier et al. (2005) J Biol. Chem. 280:35588-97]; [Dreier et al. (2000) J. Mol. Biol. 303:489-502]; [Liu et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:3850-6]을 참조한다. 현재, 2개의 웰-기반 ZF 설계 소프트웨어 패키지가 이용가능하다 (예를 들어, zincfingertools.org에서). 이들에 의해, 게놈에서 코딩되는 거의 모든 유전자가 ZFN-매개 유전자 표적화에 적용될 수 있다 (Katada and Komiyama (2009) Chembiochem. 10(8):1279-88).
특정 실시양태에서, HIV 공-수용체 CCR5에 결합하는 ZFN이 사용된다 (Perez et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:808-16). 상기 ZFN는 "CCR5 ZFN"으로 언급된다. 특정 실시양태에서, CCR5 ZFN 코딩 영역은 다음을 포함한다: opaque-2 핵 위치 서열 (Maddaloni et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17(18):7532); r162y11 아연 핑거 결합 도메인, FokI 뉴클레아제 도메인 (Looney et al. (1989) Gene 80:193-208); 테소아 아시그나 (Thesoa assigna) 바이러스로부터 유래된 T2A 스터터 (stutter) 서열 (Mattion et al. (1996) J. Virol. 70:8124-7); 제2 opaque-2 핵 위치 서열, 168FA vE 아연 핑거 결합 도메인; 및 제2 FokI 뉴클레아제 도메인.
핵산 분자
일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 관심있는 유전자 (바람직한 형질 또는 표현형), 예컨대 2개 이상의 관심있는 유전자를 갖는 제1 식물을 제2 식물과 교배시키는 것을 포함한다. 또한, 제2 식물은 하나 이상의 관심있는 유전자를 가질 수 있다. 제1 식물은 관심있는 하나 이상의 유전자(들)에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 프로모터는 구성적 또는 유도가능 프로모터일 수 있다. 관심있는 유전자(들)을 코딩하는 핵산 서열은 ZFN 인식 부위가 인접할 수 있다. 임의로, 관심있는 유전자(들)에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 임의의 추가의 핵산 서열 (예를 들어, 조절 서열)에도 ZFN 인식 부위가 인접할 수 있다. 제2 식물은 ZFN을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 조직-특이적 또는 발달-특이적 프로모터를 포함할 수 있는 또 다른 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 두 식물의 게놈 내로 안정하게 통합될 수 있다. 제1 및 제2 식물의 교배 후에, 조직-특이적 또는 발달-특이적 프로모터는 상기 교배의 생성되는 자손체에서 ZFN의 발현을 특이적으로 유도한다. 상기 자손체에서 ZFN의 발현은 ZFN 인식 부위가 인접하는 핵산 서열의 절제를 유발하여, 자손체의 특이적 조직 및/또는 발달기에서 관심있는 유전자, 및 임의로 추가의 서열 (예컨대 선택가능 마커 유전자)을 감소시키거나 제거한다. 일부 실시양태에서, ZFN 인식 부위는 상동성 DNA 재조합을 추가로 촉진하기 위해 상동성 핵산 서열이 추가로 인접될 수 있다.
관심있는 유전자는 요구되는 형질 또는 표현형을 부여하기에 충분한 양으로 유전자의 발현을 유도하는 하나 이상의 식물 프로모터(들)에 일반적으로 작동가능하게 연결될 것이다. 상기 및 다른 용도에 적합한 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로모터를 설명하는 비-제한적인 예는 미국 특허 6,437,217 (옥수수 RS81 프로모터); 5,641,876 (쌀 액틴 프로모터); 6,426,446 (옥수수 RS324 프로모터); 6,429,362 (옥수수 PR-1 프로모터); 6,232,526 (옥수수 A3 프로모터); 6,177,611 (구성적 옥수수 프로모터); 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142, 및 5,530,196 (35S 프로모터); 6,433,252 (옥수수 L3 올레오신 프로모터); 6,429,357 (쌀 액틴 2 프로모터, 및 쌀 액틴 2 인트론); 5,837,848 (뿌리-특이적 프로모터); 6,294,714 (광-유도가능 프로모터); 6,140,078 (염-유도가능 프로모터); 6,252,138 (병원체-유도가능 프로모터); 6,175,060 (인 결핍-유도가능 프로모터); 6,388,170 (양방향성 프로모터); 6,635,806 (감마-코익신 프로모터); 및 미국 특허 출원 09/757,089 (옥수수 엽록체 알도라제 프로모터)를 포함한다. 추가의 프로모터는 노팔린 합성효소 (NOS) 프로모터 (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9); 옥토핀 합성효소 (OCS) 프로모터 (아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens))의 종양-유도 플라스미드 상에서 운반되는); 콜리모바이러스 (caulimovirus) 프로모터, 예컨대 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 프로모터 (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); CaMV 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-2); 현삼 (figwort) 모자이크 바이러스 35S-프로모터 (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); 수크로스 합성효소 프로모터 (Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); R 유전자 복합 프로모터 (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83); 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터; CaMV35S (미국 특허 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142, 및 5,530,196); FMV35S (미국 특허 6,051,753, 및 5,378,619); PC1SV 프로모터 (미국 특허 5,850,019); SCP1 프로모터 (미국 특허 6,677,503); 및 AGRtu.nos 프로모터 (젠뱅크 (GenBank) 기탁 번호 V00087; [Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73]; [Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7]) 등을 포함한다.
관심있는 유전자에 임의로 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 유전자 요소는 수송 펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 적합한 엽록체 수송 펩티드, 예를 들어 에이. 탈리아나 (A. thaliana) EPSPS CTP (Klee et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:437-42), 및 페츄니아 하이브리다 (Petunia hybrida) EPSPS CTP (della-Cioppa et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-7)의 통합은 이종성 EPSPS 단백질 서열을 트랜스제닉 식물 내의 엽록체에 대해 표적화하는 것으로 밝혀졌다. 디캄바 모노옥시게나제 (DMO)는 PCT 국제 특허 출원 공개 WO 2008/105890에 기재된 바와 같이 엽록체에 대해 표적화될 수 있다.
또한, 관심있는 유전자에 임의로 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 유전자 요소는 프로모터 서열과 번역 리더 서열로서 기능하는 코딩 서열 사이에 위치하는 5' UTR을 포함한다. 번역 리더 서열은 번역 출발 서열 상류의 완전히 프로세싱된 mRNA에 존재한다. 번역 리더 서열은 1차 전사체의 mRNA로의 프로세싱, mRNA 안정성, 및/또는 번역 효율에 영향을 줄 수 있다. 번역 리더 서열의 예는 옥수수 및 페츄니아 열 충격 단백질 리더 (미국 특허 5,362,865), 식물 바이러스 코트 단백질 리더, 식물 루비스코 리더 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36]을 참조한다. 5' UTR의 비제한적인 예는 GmHsp (미국 특허 5,659,122); PhDnaK (미국 특허 5,362,865); AtAnt1; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); 및 AGRtunos (젠뱅크 기탁 번호 V00087; 및 [Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7])를 포함한다.
또한, 관심있는 유전자에 임의로 작동가능하게 연결될 수 있는 추가의 유전자 요소는 3' 비-번역 서열, 3' 전사 종결 영역, 또는 폴리-아데닐화 영역을 포함한다. 이들은 폴리뉴클레오티드 분자의 하류에 위치하는 유전자 요소이고, 전사, mRNA 프로세싱, 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 폴리아데닐화 신호, 및/또는 다른 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 식물에서 mRNA 전구체의 3' 단부에 대한 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드의 부가를 유발하는 기능을 수행한다. 폴리아데닐화 서열은 천연 유전자로부터, 다양한 식물 유전자로부터, 또는 T-DNA 유전자로부터 유래될 수 있다. 3' 전사 종결 영역의 비제한적인 예는 노팔린 합성효소 3' 영역이다 (nos 3'; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7). 상이한 3' 비번역 영역의 용도의 예는 문헌 [Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-80]에 제시되어 있다. 폴리아데닐화 신호의 비제한적인 예는 피숨 사티붐 (Pisum sativum) RbcS2 유전자 (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9) 및 AGRtu.nos (젠뱅크 기탁 번호 E01312)로부터의 것을 포함한다.
식물 형질전환
본 발명에 따른 형질전환된 식물을 생산하기 위해, 도입유전자의 도입을 위한 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용할 수 있다. 식물의 형질전환에 적합한 방법은 DNA를 세포 내로 도입할 수 있는 실질적으로 임의의 방법, 예컨대 전기천공 (미국 특허 5,384,253에 예시됨); 미세입자 투사법 (미국 특허 5,015,580, 5,550,318, 5,538,880, 6,160,208, 6,399,861, 및 6,403,865에 예시됨); 아그로박테리움-매개 형질전환 (미국 특허 5,635,055, 5,824,877, 5,591,616; 5,981,840, 및 6,384,301에 예시됨); 및 원형질체 형질전환 (미국 특허 5,508,184에 제시됨) 등을 포함한다. 상기한 바와 같은 기술을 적용함으로써, 실질적으로 임의의 식물 종의 세포는 안정하게 형질전환될 수 있고, 이들 세포는 당업자에게 공지된 기술에 의해 트랜스제닉 식물로 발생할 수 있다. 예를 들어, 면화 형질전환에 특히 유용할 수 있는 기술은 미국 특허 5,846,797, 5,159,135, 5,004,863, 및 6,624,344에 개시되어 있고; 특히 브라시카 (Brassica) 식물의 형질전환을 위한 기술은 예를 들어 미국 특허 5,750,871에 개시되어 있고; 대두 형질전환을 위한 기술은 예를 들어 미국 특허 6,384,301에 개시되어 있고; 옥수수 형질전환을 위한 기술은 예를 들어 미국 특허 7,060,876, 미국 특허 5,591,616, 및 국제 PCT 공개WO 95/06722에 개시되어 있다.
외인성 DNA의 수여 세포로의 전달 후에, 다음 단계는 일반적으로 형질전환된 세포를 일반적으로 추가의 배양 및 식물 재생에 대해 확인하는 것에 관한 것이다. 형질전환체를 확인하는 능력을 개선하기 위해, 형질전환체 생성에 사용되는 형질전환 벡터에 선택가능한 또는 스크리닝가능한 마커 유전자를 사용할 수 있다. 이 경우에, 잠재적으로 형질전환된 세포 집단은 세포를 선택제(들)에 노출시킴으로써 분석될 수 있거나, 또는 세포는 목적하는 마커 유전자 형질에 대해 스크리닝될 수 있다.
선택제 노출시에 생존한 세포, 또는 스크리닝 분석에서 양성으로 평가된 세포는 식물 재생을 지지하는 배지에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 임의의 적합한 식물 조직 배양 배지 (예를 들어, MS 및 N6 배지)는 추가의 물질, 예컨대 성장 조절제를 포함시킴으로써 변형될 수 있다. 조직은 충분한 조직이 식물 재생 노력을 개시하기 위해 이용가능할 때까지, 또는 반복 라운드의 수동 선택 후에 조직의 형태가 재생을 위해 적합할 때까지 (예를 들어, 적어도 2주) 성장 조절제를 함유하는 기초 배지 상에 유지한 후, 싹 형성에 도움이 되는 배지로 이송될 수 있다. 배양액은 충분한 싹이 형성될 때까지 주기적으로 이송된다. 싹이 형성된 후에, 이들은 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 이송된다. 충분한 뿌리가 형성된 후에는, 식물은 추가의 성장 및 성숙을 위해 토양으로 이송될 수 있다.
재생 식물에서 관심있는 유전자의 존재를 확인하기 위해, 다양한 분석이 수행될 수 있다. 상기 분석은 예를 들어 분자 생물학적 분석, 예를 들어 서던 및 노던 블로팅 및 PCR; 예를 들어, 면역학적 수단 (ELISA 및/또는 웨스턴 블롯) 또는 효소 기능에 의한 단백질 생성물의 존재 검출과 같은 생화학적 분석; 식물의 일부 분석, 예컨대 잎 또는 뿌리 분석; 및 재생된 전체 식물의 표현형 분석을 포함한다.
트랜스제닉 식물의 배양 및 용도
본 발명에 따른 핵산 절제를 보이는 식물은 하나 이상의 바람직한 형질, 예컨대 2개 이상의 바람직한 형질을 가질 수 있다. 상기 형질은 예를 들어 곤충 및 다른 해충 및 질병 유발 물질에 대한 저항성; 제초제 내성; 향상된 안정성, 수율 또는 반감기; 환경 내성; 제약물질 생산; 산업 제품 생산; 및 영양 증진을 포함할 수 있다. 바람직한 형질은 식물에서 ZFN(들)의 발현이 그의 근본적인 유전자의 보유를 통해 형질의 다른 식물로의 전달 또는 후속적인 식물의 생성을 감소시키거나 제거하도록, 바람직한 형질을 보이는 식물에서 발현되는 ZFN(들)에 의해 인식되는 핵산 서열이 인접한 유전자에 의해 부여될 수 있다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 요구되는 형질은 ZFN 인식 서열이 인접할 수 있는 도입유전자(들)의 식물 내 존재에 의한 것일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 바람직한 형질은, 형질이 ZFN 인식 서열이 인접한 하나 이상의 유전자에 의해 부여될 수 있는 통상적인 육종을 통해 얻을 수 있다.
핵산 절제를 보이는 본 발명에 따른 식물은 본 발명의 핵산 분자로 형질전환될 수 있는 임의의 식물일 수 있다. 따라서, 식물은 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 쌍자엽 식물의 비제한적인 예는 알팔파, 콩, 브로콜리, 양배추, 당근, 꽃양배추, 셀러리, 중국 양배추, 면화, 오이, 가지, 상추, 멜론, 완두콩, 후추, 땅콩, 감자, 호박, 무, 평지, 시금치, 대두, 호박속 (squash), 사탕무, 해바라기, 담배, 토마토, 및 수박을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 단자엽 식물의 비제한적인 예는 옥수수, 양파, 벼, 수수, 밀, 호밀, 기장, 사탕수수, 귀리, 라이밀, 수수속의 풀 (switchgrass), 및 잔디를 포함한다.
본 발명에 따른 핵산 절제를 보이는 식물은 절제된 핵산 서열의 다른 식물로의 전달이 바람직하지 않은 임의의 방식으로 사용되거나 재배될 수 있다. 따라서, 특히 하나 이상의 요구되는 형질을 갖도록 조작된 GM 식물은 본 발명에 따른 핵산 분자로 형질전환되고, 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 경작되고 재배될 수 있다.
실시예
다음 실시예는 본 발명의 실시양태를 예시하기 위해 포함된다. 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실행시에 잘 기능하는 본 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타냄을 당업자는 이해할 것이다. 그러나, 본 개시내용에 비추어 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 비슷한 또는 유사한 결과를 계속 얻을 수 있는, 개시된 특이적인 실시양태에 대한 많은 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 수 있다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 관련된 특정 물질이 동일한 또는 유사한 결과를 달성하면서 본원에 기재된 물질 대신에 사용될 수 있음은 자명할 것이다. 당업자에게 자명한 모든 상기 유사한 치환 및 변형은 첨부되는 청구의 범위에 의해 규정되는 바와 같은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다.
실시예 I: 플라스미드 설계 및 제작
아연 핑거 결합 부위가 인접한 표적 리포터 유전자 발현 카세트를 함유하는 표적 구성체 (pDAS5380) 및 아연 핑거 뉴클레아제 유전자 발현 카세트를 함유하는 절제 구성체 (pDAS5381)를 설계하고 제작하였다. 구성체는 담배 내로 별개로 형질전환되도록 설계되었다. 표적 리포터 유전자 절제는 2개의 담배 식물주를 교배함으로써 수행하였고, 여기서 기능성 아연 핑거 뉴클레아제는 표적 리포터 유전자 카세트에 인접하는 아연 핑거 결합 부위를 인식하고, 게놈 DNA를 절단하였다. 표적 리포터 유전자 구성체를 함유하는 식물주와 절제 구성체를 함유하는 식물주의 교배는 식물 게놈으로부터 리포터 유전자의 제거/결실을 유발하였다.
표적 구성체 pDAS5380 의 제작 및 설계.
pDAS5380 (도 1)을 이원성 플라스미드 벡터로서 제작하였다. 상기 구성체는 다음 식물 전사 단위 (PTU) 발현 카세트 및 유전 요소를 함유한다: RB7 MAR (매트릭스 부착 영역 (Matrix Attachment Region (Thompson et al. (1997) WO9727207))::CCR5 결합 부위 (4회 반복) (Perez et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:808-16)::AtuORF1 3' UTR (아그로박테리움 튜메파시엔스 개방 해독 프레임-1, 3' 비번역 영역 (Huang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:1814-22)) / GUS (β-D-글루쿠로니다제 (Jefferson (1989) Nature 342:837-8)) / AtUbi10 (아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 유비퀴틴-10 프로모터 (Callis et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:12486-93))::CCR5 결합 부위 (4회 반복)::AtAct2 (에이. 탈리아나 액틴-2 프로모터 (An et al. (1996) Plant J. 10:107-21)) / Turbo GFP (터보-녹색 형광 단백질 (Evdokimov et al. (2006) EMBO Rep. 7(10):1006-12)) / Atu ORF23 3' UTR (에이. 튜메파시엔스 개방 해독 프레임-23, 3' 비번역 영역 (Gelvin et al. (1987) EP222493))::AtUbi10 / PAT (포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37)) / Atu ORF1 3' UTR. GUS PTU 발현 카세트는 GFP 및 PAT PTU 발현 카세트에 트랜스로 (in trans) 위치하였다. 또한, GUS PTU 발현 카세트에는 CCR5 아연 핑거 뉴클레아제 결합 부위가 인접하였다. 상기 서열 (서열 1)은 GUS PTU 발현 카세트의 상류 및 하류에 직접 4회 반복되었다. 아연 핑거 결합 부위의 위치는 도 1에서 "CCR5 결합 부위"로서 확인된다. 상기 부위는 절제자 (excisor) 구성체 pDAS5381에 의해 코딩되는 아연 핑거 뉴클레아제 단백질에 의해 인식되고 결합된다. 상기 이원성 벡터의 조립은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 완료하였다. 최종 플라스미드는 제한 효소 소화 및 DNA 서열결정을 통해 확인하였다.
절제자 구성체 pDAS5381 의 제작 및 설계.
CCR5 결합 부위 (서열 2)에 결합하도록 특이적으로 설계된 아연 핑거 뉴클레아제 유전자를 함유하는 이원성 플라스미드를 문헌 [Perez et al., (2008) Nature Biotechnol. 26:808-16]에 기재된 바와 같이 설계하고 제작하였다. pDAS5381 (도 2)은 다음 PTU 발현 카세트를 함유한다: CsVMV (카사바 엽맥 바이러스 프로모터 (Verdaguer et al., (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-39)) / CCR5 아연 핑거 뉴클레아제 코딩 영역 (opaque-2 핵 위치 서열 함유 (Maddaloni et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17(18):7532)); r162y11 아연 핑거 결합 도메인; FokI 뉴클레아제 도메인 (Looney et al. (1989) Gene 80:193-208); 테소아 아시그나 바이러스로부터 유래된 T2A 스터터 서열 (Mattion et al. (1996) J. Virol. 70:8124-7); 제2 opaque-2 핵 위치 서열; 168GA vE 아연 핑거 결합 도메인; 및 제2 FokI 뉴클레아제 도메인) / Atu ORF23 3' UTR::AtUbi3 프로모터 (에이. 탈리아나 유비퀴틴-3 프로모터 (Callis et al. (1995) Genetics 139(2):921-39)) / HPTII (히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 II (Gritz et al. (1983) Gene 25(2-3):179-88)) / Atu ORF24 3' UTR (에이. 튜메파시엔스 개방 해독 프레임-24, 3' 비번역 영역 (Gelvin et al. (1987) EP222493)). 상기 이원성 벡터의 조립은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 완료하였다. 최종 플라스미드는 제한 효소 소화 및 DNA 서열결정을 통해 확인하였다.
실시예 II : 아그로박테리움-매개 식물 형질전환.
pDAS5380 및 pDAS5381 을 사용한 아그로박테리움의 형질전환.
전기수용성 (electrocompetent) 에이. 튜메파시엔스 (균주 LBA4404) 세포를 인비트로겐 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드)으로부터 얻고, 문헌 [Weigel and Glazebrook (2002) "How to Transform Arabidopsis," in Arabidopsis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, U.S.A]으로부터 변용된 전기천공 방법을 사용하여 형질전환하였다. 형질전환된 콜로니를 스펙티노마이신 (50 ㎍/mL) 및 스트렙토마이신 (125 ㎍/mL)을 함유하는 효모 추출물 펩톤 배지 (YEP) 상에서 얻고, 제한 효소 소화를 통해 확인하였다. 정확한 제한 효소 밴드 형성 패턴을 보이는 콜로니를 -80℃에서 글리세롤 원액으로서 보관하였다.
니코티아나 타바쿰 ( Nicotiana tabacum )의 아그로박테리움-매개 형질전환.
담배 (재배종 페티트 하바나 (cv. Petit Havana)) 엽편 (leaf disc)을 pDAS5381 및 pDAS5380을 함유하는 에이. 튜메파시엔스 (균주 LBA4404)를 사용하여 형질전환시켰다. 이들 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움의 단일 콜로니를 스펙티노마이신 (50 ㎍/mL) 및 스트렙토마이신 (125 ㎍/mL)을 함유하는 4 mL의 YEP 내로 접종하고, 190 rpm에서 진탕기에서 28℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 이어서, 4 mL 종자 배양액을 사용하여, 125 mL의 배플이 있는 (baffled) 얼렌마이어 플라스크에서 성장시킨 스펙티노마이신 (50 ㎍/mL) 및 스트렙토마이신 (125 ㎍/mL)을 함유하는 YEP 배지의 25 mL 배양액을 접종하였다. 이 배양액을 ~1.2의 OD600에 도달할 때까지 190 rpm에서 진탕하면서 28℃에서 인큐베이팅하였다. 10 mL의 아그로박테리움 현탁액을 멸균 60x20 mm 페트리 접시 내에 넣었다.
PhytaTrays™ (시그마, 미국 미주리주 세인트루이스) 내의 30 g/L 수크로스를 함유하는 MS 배지 (파이토테크놀로지 랩스 (Phytotechnology Labs, 미국 캔자스주 쇼니 미션, #M524)에서 무균 상태로 성장한 식물로부터 절단된 25개의 새로 절단된 엽편 (0.5 cm2)을 수분 동안 아그로박테리움의 10 mL의 철야 배양액에 담그고, 멸균 여과지 상에서 액체를 제거하여 건조시킨 후, 1 mg/L 인돌아세트산 및 1 mg/L 벤지아미노 퓨린을 첨가한 동일한 배지에 넣었다. 공동 배양 48시간 후에, pDAS5380을 보유하는 아그로박테리움과 함께 공동 배양된 엽편을 5 mg/L 바스타 (Basta)® 및 250 mg/L 세포탁심을 함유하는 동일한 배지에 옮겼다. pDAS5381을 보유하는 아그로박테리움과 함께 공동 배양된 엽편을 10 mg/L 히그로마이신 및 250 mg/L 세포탁심을 함유하는 동일한 배지로 옮겼다. 3주 후에, 개개의 T0 묘목을, pDAS5380의 경우 10 mg/L 바스타® 및 250 mg/L 세포탁심을 함유하는 MS 배지로, 또는 pDAS5381의 경우 10 mg/L 히그로마이신 및 250 mg/L 세포탁심을 함유하는 MS 배지로 옮기고, 다시 3주 후에, 토양에 이식하고 온실로 옮겼다.
T 0 식물의 카피수 , 전장 PTU 및 발현 분석
카피수 분석.
pDAS5380 및 pDAS5381 내에 T-DNA의 단일 카피 통합을 함유하는 것을 확인하기 위해서 바스타®-내성 식물의 샘플을 스크리닝하기 위해 인베이더 (Invader)® 및 가수분해 프로브 분석을 수행하였다. 상세한 분석은 유전자 발현 카세트에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 수행하였다. 단일 카피 이벤트를 추가의 분석을 위해 확인하였다.
조직 샘플을 96-웰 플레이트에 수거하고, 2일 동안 동결건조시켰다. 조직 연화 (maceration)를 클레코™ (Kleco) 조직 분쇄기 및 텅스텐 비드 (bead) (미국 캘리포니아주 비살리아)로 수행하였다. 조직 연화 후에, 게놈 DNA를 제조자가 제시한 프로토콜에 따라 DNeasy 96 플랜트 (Plant) 키트™ (퀴아젠 (Qiagen, 미국 메릴랜드주 저먼타운))를 사용하여 고속 (high-throughput) 포맷으로 단리하였다. 게놈 DNA를 Quant-IT 피코 그린 DNA 분석 키트™ (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes), 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)에 의해 정량하였다. 정량된 게놈 DNA를 Biorobot3000™ 자동화 액체 핸들러 (퀴아젠, 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 인베이더® 분석을 위해 9 ng/㎕로 또는 가수분해 프로브 분석을 위해 5 ng/㎕로 조정하였다.
맞춤 인베이더® 분석은 홀로직 (Hologic, 미국 위스콘신주 메디슨)에 의해 담배에서 PAT 유전자 분석을 위해 개발되었다. 게놈 DNA 샘플 (9 ng/㎕의 7.5 ㎕)을 먼저 10분 동안 95℃에서의 인큐베이팅에 의해 96-웰 플레이트 포맷에서 변성시킨 후, 얼음 상에서 냉각하였다. 이어서, 7.5 ㎕의 매스터 믹스 (pat 및 내부 참조 유전자에 대한 3 ㎕의 프로브 믹스 (페닐알라닌 암모늄 리아제 (palA); 젠뱅크 ID: AB008199), 3.5 ㎕ 클리바제 (Cleavase)® XI FRET 믹스, 및 1 ㎕의 클리바제® XI 효소/MgCl2 용액)을 각각의 웰에 첨가하고, 샘플을 광유로 덮었다. 플레이트를 밀봉하고, 바이오라드 (BioRad) 테트라드 (Tetrad)® 열순환기에서 63℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 주변 온도로 냉각한 후, 형광 플레이트 판독기에서 판독하였다. 모든 플레이트에는 1 카피, 2 카피 및 4 카피의 표준물 및 야생형 대조군 샘플 및 샘플을 함유하지 않는 블랭크 (blank) 웰이 존재하였다. 판독치를 FAM (λ 485-528 nm) 및 RED (λ 560-620 nm) 채널 모두에 대해 수집하고, 이들 판독치로부터 각각의 채널에 대한 제로 (즉, 배경)에 대한 폴드 (fold over zero)를, 샘플 미가공 시그날을 비 템플리트 (no template) 미가공 시그날로 나눔으로써 각각의 샘플에 대해 결정하였다. 상기 데이타로부터, 표준 곡선을 작성하고, 최적 피트 (best fit)를 선형 회귀 분석으로 결정하였다. 상기 피트로부터 확인된 파라미터를 사용하여, 외관상 pat 카피수를 각각의 샘플에 대해 추정하였다.
TaqMan® 분석과 유사한 가수분해 프로브 분석에 의한 도입유전자 카피수 결정을 LightCycler®480 시스템 (로슈 어플라이드 사이언스 (Roche Applied Science, 미국 인디애나주 인디애나폴리스))을 사용하여 실시간 PCR에 의해 수행하였다. 분석은 LightCycler® 프로브 디자인 (Probe Design) 소프트웨어 2.0을 사용하여 HPTII, PAT 및 내부 참조 유전자 페닐알라닌 암모늄 리아제 (palA)에 대해 설계되었다. 증폭을 위해, LightCycler®480 프로브스 매스터 믹스 (Probes Master mix) (로슈 어플라이드 사이언시스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를 0.4 μM의 각각의 프라이머 및 0.2 μM의 각각의 프로브를 함유하는 10 ㎕ 부피의 다양한 반응액에 1x 최종 농도로 제조하였다 (표 1). 2단계 증폭 반응을 형광을 획득하면서 38초 동안 58℃에서 팽창시키면서 수행하였다. 모든 샘플에 대해 3회 수행하고, 평균 사이클 역치 (Ct) 값을 각각의 샘플 분석에 대해 사용하였다. 실시간 PCR 데이타의 분석은 상대적인 정량분석 모듈 (relative quant module)을 사용하여 LightCycler® 소프트웨어 릴리스 1.5로 수행하였고, 이는 ΔΔCt 방법을 기초로 한 것이었다. 이를 위해, 단일 카피 측정자 (calibrator) 및 공지의 2 카피 체크 (check)로부터의 게놈 DNA의 샘플이 각각의 실행에 포함되었다 (상기 인베이더® 분석에 사용된 것과 동일).
Figure pct00001
서던 블롯 분석을 통한 전장 PTU 분석.
삽입된 DNA 단편의 통합 패턴을 확립하고 전장 PTU를 함유한 pDAS5380 및 pDAS5381 이벤트를 확인하기 위해 서던 블롯 분석을 사용하였다. 담배 게놈 내로 삽입된 도입유전자의 통합 및 완전성을 입증하기 위한 데이타를 생성하였다. 서던 블롯 데이타를 사용하여, pDAS5380 및 pDAS5381로부터의 T-DNA의 무손상 카피의 간단한 통합을 확인하였다. 유전자 발현 카세트에 특이적인 프로브를 사용하여 상세한 서던 블롯 분석을 수행하였다. 이들 프로브와 특이적 제한 효소로 소화된 게놈 DNA의 혼성화를 통해, 그 패턴이 T1으로의 진행을 위한 이벤트를 확인하기 위해 분석될 수 있는 분자량의 게놈 DNA 단편을 확인하였다. 이들 분석은 또한 플라스미드 단편이 PTU의 재배열 없이 담배 게놈 DNA 내에 삽입되었음을 보여주었다.
조직 샘플을 50 mL 원뿔형 관 (피셔 시이언티픽 (Fisher Scientific, 미국 펜실베니아주 피츠버그)) 내에 수거하고, 2일 동안 동결건조시켰다. 조직 연화를 페인트 혼합기 조직 분쇄기 및 텅스텐 비드를 사용하여 수행하였다. 조직 연화 후에, 게놈 DNA를 제조자가 제안한 프로토콜에 따라 DNeasy™ 플랜트 맥시 키트 (Plant Maxi Kit) (퀴아젠, 미국 메릴랜드주 저먼타운)르르 사용하여 단리하였다. 정제된 게놈 DNA를 침전시키고, 500 ㎕ TE 버퍼에 재현탁하였다. 게놈 DNA를 퀴아젠 게놈 Tips™ 키트를 사용하여 추가로 정제하였다. 게놈 DNA를 Quant-IT 피코 그린™ DNA 분석 키트 (몰레큘라 프로브스, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드))에 의해 정제하였다. 정량된 게놈 DNA를 일관된 부피로 8 ㎍으로 조정하였다.
각각의 샘플에 대해, 8 ㎍의 게놈 DNA를 제한 효소 MfeI 및 NsiI (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs, 미국 매사추세츠주 비벌리))로 완전히 소화시켰다. 샘플을 37℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 소화된 DNA를 제조자가 제안하는 프로토콜에 따라 Quick Precipitation Solution™ (엣지 바이오시스템, 미국 메릴랜드주 게이더스버그)을 사용한 침전에 의해 농축하였다. 이어서, 게놈 DNA를 65℃에서 1시간 동안 25 ㎕의 물에 재현탁시켰다. 재현탁시킨 샘플을 1x TAE 내에 제조된 0.8% 아가로스 겔 상에 로딩하고, 1x TAE 버퍼 내에서 1.1 V/cm에서 철야 전기영동하였다. 겔을 순차적으로 30분 동안 변성시키고 (0.2 M NaOH/0.6 M NaCl), 30분 동안 중화 (0.5 M Tris-HCl (pH 7.5)/1.5 M NaCl)시켰다.
DNA 단편의 전달은 크로마토그래피 페이퍼 위크 (paper wick) 및 페이퍼 타월을 사용하여 20x SSC 용액을 겔을 통해 처리된 이모빌리언 (Immobilon)™ NY+ 전달 막 (밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌러리카) 상에 수동적으로 철야 위킹 (wicking)함으로써 수행하였다. 전달 후에, 막을 2x SSC로 짧게 세척하고, 스트라타링커 (Stratalinker)™ 1800 (스트라타진 (Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 홀라))과 가교결합시키고, 80℃에서 3시간 동안 진공 소성하였다.
블롯을 모델 400 혼성화 인큐베이터 (로빈스 사이언티픽 (Robbins Scientific, 미국 캘리포니아주 서니베일))를 사용하여 유리 롤러 병에서 65℃에서 1시간 동안 예비-혼성화 용액 (Perfect Hyb plus™, 시그마, 미국 미주리주 세인트루이스)과 함께 인큐베이팅하였다. 프로브는 전체 코딩 서열을 함유하는 PCR 단편으로부터 제조하였다. PCR 앰플리콘을 QIAEX II™ 겔 추출 키트를 사용하여 정제하고, 무작위 RT 프라임 (Prime) IT™ 표지 키트 (스트라타진, 미국 캘리포니아주 라 홀라)를 통해 α32P-dCTP로 표지하였다. 블롯을 약 2백만 카운트/블롯/mL로 혼성화 버퍼에 직접 첨가된 변성 프로브와 함께 65℃에서 철야 혼성화시켰다. 혼성화 후에, 블롯을 순차적으로 65℃에서 0.1xSSC/0.1% SDS로 40분 동안 세척하였다. 마지막으로, 블롯을 화학발광 필름 (로슈 다이어그노스틱스 (Roche Diagnostics, 미국 인디애나주 인디애나폴리스))에 노출시키고, 몰레큘라 다이내믹스 (Molecular Dynamics) 스톰 (Storm) 860™ 영상화 시스템을 사용하여 영상화하였다.
pDAS5380 또는 pDAS5381 단편의 공지의 제한 효소 부위를 기초로 하여 특정 소화물 및 프로브를 예상 및 관찰된 단편 크기를 도 3 및 4에 나타낸다. 본 연구에서 수행된 서던 블롯 분석은 담배 게놈 내로 삽입된 플라스미드 pDAS5380 또는 pDAS5381로부터의 전장 무손상 PTU를 함유하는 이벤트를 확인하기 위해 사용되었다 (각각 도 3 및 4).
GUS 발현 분석.
pDAS5380 트랜스제닉 식물이 기능성 GUS PTU 발현 카세트를 함유하는지 시험하기 위해, 잎 샘플을 수거하고, GUS 발현에 대해 조직화학적으로 염색하였다. 엽편 (~0.25 cm2)을 절단하고, 250 ㎕의 GUS 분석 용액 (Jefferson (1989) Nature 342:837-8)을 함유하는 24웰 트레이 (1 엽편/웰)에 넣었다. 24웰 접시를 네스코필름 (Nescofilm)® (피셔 시이언티픽, 미국 펜실베니아주 피츠버그)으로 감싸고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 24시간 후에, GUS 분석 용액을 각각의 웰로부터 제거하고, 250 ㎕의 100% 에탄올로 교체하였다. 접시를 네스코필름®으로 감싸고, 실온에서 2-3시간 동안 인큐베이팅하였다. 에탄올을 제거하고, 새 에탄올로 교체하였다. 이어서, 엽편을 해부 현미경으로 관찰하였다. 청색으로 염색된 엽편은 기능성 GUS PTU 발현 카세트를 함유하는 것으로 평가되었다.
GFP 발현 분석.
담배 잎 샘플을 ELISA를 사용하여 GFP 발현에 대해 분석하였다. 플레이트를 정제된 토끼 항-GFP 항체로 4℃에서 철야 코팅하였다. 분석일에, 플레이트를 PBST 내의 0.5% BSA로 차단하였다. 이중의 잎 샘플을, 3분 동안 최대 속도에서 클레코™ 조직 연마기로 2개의 스테인레스 스틸 비드를 사용하여 냉동된 잎을 타격함으로써 추출하였다. 샘플을 10분 동안 3000 rcf에서 원심분리하고, 상등액을 수거하였다. 추출물 샘플을 1:5 및 1:50 희석액으로 ELISA 플레이트에 로딩하였다. 이. 콜라이 (E. coli) 재조합 GFP 표준물을 12.5 ng/mL 내지 0.195 ng/mL의 농도에서 각각의 플레이트에 대해 시험하였다. 표준물 및 샘플을 ELISA 플레이트 상에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 세척하고, 양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 토끼 항-GFP 항체를 첨가하였다. 1시간 인큐베이션 후에, 플레이트를 세척하고, 기질을 첨가하였다. 발색되도록 한 후, H2SO4를 사용하여 반응을 중지시켰다. 흡광도를 650 nm 참조 필터와 함께 450 nm에서 플레이트 판독기로 판독하였다. OD에 대해 이. 콜라이의 농도를 피팅함으로써 2차 표준 곡선을 생성하였다. 미지 샘플의 농도를 선형 회귀에 의해 결정하였다.
표적 T 1 생산을 위한 T 0 식물의 선택.
총 68개의 바스타®-내성, GUS+/GFP+ 식물을 재생시켰고, 38개의 식물이 PAT 인베이더® 분석을 기초로 하여 1-2개의 도입유전자 카피를 갖는 것으로 밝혀졌다. 서던 분석은 14개의 단일-카피 이벤트를 확인하였고, 이 중 8개가 무손상 PAT, GUS 및 GFP PTU와 일치하는 밴드를 제시하였다. 단일 카피, 전장 PTU를 제시하고 GUS 및 GFP를 발현하는 3개의 pDAS5380 이벤트, 즉 pDAS5380-3, pDAS5380-18 및 pDAS5380-46을 자가수분시켜 T1 종자를 생성시켰다.
FokI 발현 분석.
pDAS5381로 형질전환된 T0 담배 식물에서 아연 핑거 뉴클레아제의 mRNA 발현을 정량하기 위해 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 사용하였다. 이들 수준을 투입 mRNA로부터의 mRNA 발현에 대해 정규화함으로써 담배 잎 샘플로부터의 상대적인 FokI mRNA 발현을 정량하기 위한 분석을 개발하였다. 총 mRNA에 대한 FokI mRNA의 정규화는 상이한 샘플 사이의 FokI 발현의 비교를 허용하고, 고도로 발현하는 것으로 보이는 이벤트를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 상대적인 ZFN 발현을 표 1.1에 나열한다.
<표 1.1>
Figure pct00002
pDAS5381로 형질전환된 T0 담배 식물로부터의 잎 물질을 수거하고, 얼음 상에 놓았다. 총 RNA는 퀴아젠의 RNeasy® 플랜트 미니 키트 (퀴아젠, 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 단리하였다. 총 mRNA를 정량적 RT-PCR 동안 증폭될 수 있는 임의의 오염 DNA를 제거하기 위해 제조자의 권고에 따라 RNase-미함유 DNase로 처리하였다. 제1 가닥 합성은 Superscript III™ 역전사효소 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)의 제조자의 지시에 따라 설정하고, 무작위 육량체를 사용하여 프라이밍하였다. 합성된 cDNA 가닥을 1:10 및 1:50의 비율로 물로 희석하였다. 각각의 분취액을 -20℃에서 저장하였다.
qRT-PCR 반응은 다음과 같이 수행하였다: 전방향 프라이머 FokI_UPL_F (서열 12), 역방향 프라이머 FokI_UPL_R (서열 13), 프로브 UPL#130 (cat #04693663001, 로슈, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)), 1x LC480 프로브스 매스터 버퍼 (로슈 다이어그노스틱, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)), 및 15 ㎕ 반응물 내의 1.5 ㎕의 합성된 cDNA. 합성된 cDNA의 연속 희석액을 제조하고, 반복 분석하였다. 칵테일 (cocktail)을 LightCycler® 480 프로브스 매스터 키트 #04707494001 (로슈 다이어그노스틱스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스))를 사용하여 증폭하였다. 96웰 마이크로플레이트의 경계를 정하고, 표시하고, 13.5 ㎕의 매스터 믹스를 웰마다 첨가하였다. 밀봉 호일을 마이크로플레이트에 부드럽게 부착하였다. 플레이트를 1분 동안 퀴아젠 마이크로플레이트 원심분리기로 3,000 rpm에서 원심분리하였다. 밀봉 호일을 제거하고, 1.5 ㎕의 해동되고 희석된 합성 cDNA 가닥을 첨가하였다. 호일 밀봉을 플레이트에 단단히 부착하고, 앞서 설명한 바와 같이 원심분리하였다. PCR 프로그램은 다음과 같이 수행하였다: i) 95℃에서 5분 동안 활성화; ii) 95℃에서 10초 동안 변성 (4.8℃/sec에서); iii) 60℃에서 25초 동안 어닐링/연장 (2.5℃/sec에서); iv) 72℃에서 1초 동안 획득 (4.8℃/sec에서); 단계 ii - iv를 45회 초과로 반복함; vi) 38℃로 5초 동안 냉각함.
내부 참조 유전자의 mRNA 발현을 정량하기 위한 qRT-PCR 분석을 아연 핑거 뉴클레아제 mRNA 발현을 정규화하기 위한 또 다른 방법으로서 수행하였다. 액틴 qRT-PCR 반응은 다음과 같이 수행하였다: 전방향 프라이머 BY2ACT89S (서열 14), 역방향 프라이머 BY2ACT89A (서열 15), 프로브 BYACTFQ (서열 18), 1x LC480 프로브스 매스터 버퍼, 및 10 ㎕ 반응물 내의 2.0 ㎕의 합성된 cDNA. 합성된 cDNA의 연속 희석액을 제조하고, 반복 분석하였다. 또한, 2 ㎕의 플라스미드 DNA 카피수 표준물을 최저 농도로부터 최고 농도까지의 희석 계열로 별개의 웰에 첨가하고, 이들 표준물을 카피수를 정량하기 위해 액틴 cDNA (총 mRNA로부터 합성됨)와 비교하였다. 액틴 DNA 카피수 표준물 시리즈는 표적 앰플리콘을 pCR2.1 플라스미드 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드) 내로 클로닝하고, 카피수를 정량하기 위해 희석 버퍼 (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 100 ㎍/mL 효모 tRNA) 내에 제조된 희석 계열을 제조함으로써 제조하였다. 칵테일을 LightCycler® 480 프로브스 매스터 키트 #04707494001 (로슈 다이어그노스틱스, 미국)을 사용하여 증폭하였다. 96웰 마이크로플레이트의 경계를 정하고, 표시하고, 8.0 ㎕의 매스터 믹스를 웰마다 첨가하였다. 밀봉 호일을 마이크로플레이트에 부드럽게 부착하였다. 플레이트를 1분 동안 퀴아젠 마이크로플레이트 원심분리기로 3,000 rpm에서 원심분리하였다. 밀봉 호일을 제거하고, 2.0 ㎕의 해동되고 희석된 합성 cDNA 가닥 또는 플라스미드 DNA를 첨가하였다. 호일 밀봉을 플레이트에 단단히 부착하고, 앞서 설명한 바와 같이 원심분리하였다. PCR 프로그램은 다음과 같이 수행하였다: i) 95℃에서 10분 동안 활성화; ii) 95℃에서 10초 동안 변성 (4.8℃/sec에서); iii) 56℃에서 40초 동안 어닐링/연장 (2.5℃/sec에서); iv) 72℃에서 1초 동안 획득 (4.8℃/sec에서); 단계 ii - iv를 45회 초과로 반복함; vi) 38℃로 5초 동안 냉각함.
절제자 T 1 생산을 위한 T 0 식물의 선택.
총 54개의 히그로마이신-내성 식물을 재생시켰고, 34개의 식물이 가수분해 프로브 분석을 기초로 하여 1-2개의 도입유전자 카피를 갖는 것으로 밝혀졌다. 서던 분석은 12개의 단일-카피 이벤트를 확인하였고, 이 중 7개가 무손상 HPT 및 ZFN PTU와 일치하는 밴드를 제시하였다. 단일 카피 도입유전자, 전장 PTU를 제시하고 FokI를 발현하는 T0 pDAS5381 이벤트, 즉 pDAS5381-18, pDAS5381-49 및 pDAS5381-56을 자가수분시켜 T1 종자를 생성시켰다.
실시예 III : T 1 식물의 생성 및 선택
동형접합성 T 1 식물을 생산하기 위한 T 0 식물의 자가수정
T0 식물 이벤트인 pDAS5380-3; pDAS5380-18; pDAS5380-46; pDAS5381-18; pDAS5381-49; 및 pDAS5381-56을 성숙시키고, T1 종자를 생산하기 위해 자가수정시켰다. 발아 후에, pDAS5380 및 pDAS5381 구성체에 동형접합성인 T1 식물을 도입유전자 결실을 위해 사용하였다. 멘델 유전에 따라, pDAS5381 동형접합성 단일 카피 T1 식물과 pDAS5380 동형접합성 단일 카피 T1 식물의 교배는 pDAS5381 및 pDAS5380 구성체 둘 모두의 이형접합성 단일 카피를 함유하는 F1 집단을 생성한다. 상기 교배의 자손체는 GUS 리포터 유전자의 한 카피를 함유할 것으로 예상되었다. 따라서, GUS를 발현하지 않는 F1 식물은 GUS PTU 발현 카세트가 절제되었음을 나타낸다.
T0 식물을 22-24℃의 주간 및 야간 온도에서 16:8-시간 광주기 하에 성장시켰다. 1차 개화 줄기가 자라고 꽃눈을 형성하기 시작할 때, 전체 식물을 이종교배를 방지하기 위해 자가수정 백으로 덮었다. 자가수분으로부터 유래된 종자를 이식 약 8주 후에 수거하였다. 자가수정된 식물로부터의 종자를 수거하고, 토양에 파종하였다. 생성되는 T1 집단을 상기한 바와 같은 조건 하에서 온실에서 성장시켰다.
T1 식물의 분자 스크리닝
접합성 ( zygosity ) 분석
T1 식물의 접합성을 정량하기 위한 분석은 상기 설명된 가수분해 프로브 방법 (카피수 분석)을 사용하여 수행하였다. 실시간 PCR 데이타의 분석을 수행하고, T1 식물에 함유된 도입유전자 카피수를 카피수 대조군과 비교하여 결정하였다. 이를 위해, 이전에 단일 카피 측정자를 함유하는 것으로 밝혀진 모 T0 식물로부터의 게놈 DNA의 샘플이 포함되었다. 동형접합성 pDAS5380 및 pDAS5381 T1 식물이 확인되었다.
GUS 발현 분석
교배 실험에 사용하기 위한 발현 이벤트를 확인하는 것이 중요하였다. pDAS5380 T1 식물을 상기한 프로토콜 (GUS 발현 분석)을 사용하여 분석하였다. 상기한 접합성 분석으로부터 pDAS5380 구성체에 대해 동형접합성으로서 선택된 pDAS5380 식물을 시험하였다. 모든 식물은 청색으로 염색되었다.
GFP 발현 분석
pDAS5380 T1 식물을 상기한 프로토콜 (GFP 발현 분석)을 사용하여 분석하였다. 상기한 접합성 분석으로부터 pDAS5380 구성체에 대해 동형접합성으로서 선택된 pDAS5380 식물을 시험하였다. 시험된 모든 식물은 GFP 발현에 대해 양성이었다.
FokI 발현 분석.
pDAS5381로 형질전환된 동형접합성 pDAS5381 T1 담배 식물에서 아연 핑거 뉴클레아제의 mRNA 발현을 정량하기 위해 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 사용하였다. 아연 핑거 뉴클레아제가 발현되고 있는지를 확인하고 GUS PTU 발현 카세트를 절제하기 위한 다량의 아연 핑거 뉴클레아제를 생산할 이벤트를 확인하기 위한 T1 식물의 스크리닝을 위해 상기한 바와 같은 프로토콜 (FokI 발현 분석)을 사용하였다.
T 1 식물의 선택.
T1 pDAS5380 이벤트를 GUS 및 GFP의 접합성 및 발현에 대해 스크리닝하였다. T1 pDAS5381 이벤트를 FokI의 접합성 및 발현에 대해 스크리닝하였다. 이들 결과를 기초로 하여, T1 이벤트들을 교배를 위해 선택하였다. 이들 이벤트들은 동형접합성, 단일 카피, 전장, 도입유전자-발현 이벤트이기 때문에 최적인 것으로 확인되었다. 또한, 형제가 없는 (sibling-null) pDAS5381 식물을 대조군으로서 사용하기 위해 유지하였다. 이들 이벤트는 아연 핑거 뉴클레아제 PTU 발현 카세트를 함유하지 않는다. 도입유전자는 도입유전자 분리의 결과로서 이들 T1 식물에 의해 유전되지 않았다. 선택된 이벤트는 성숙시키고, 아연 핑거 뉴클레아제를 통한 도입유전자 절제를 시험하기 위해 F1 식물을 생산하기 위해 교배시켰다. 교배 전략은 아래에서 제시한다.
F 1 을 생산하기 위한 동형접합성 T 1 식물의 교배
선택된 pDAS5380 식물을 선택된 pDAS5381 식물과 교배시켰다. 또한, 모 식물주가 수 및 암 식물주가 되도록 역교배를 수행하였다 (표 2). 식물은 손으로 교배시키고; 성숙 수 모 식물주의 꽃밥으로부터의 화분을 성숙 암 모 식물주의 암술머리에 도입하였다. 의도하지 않은 화분이 암 담배 식물을 수정시킬 가능성을 감소시키기 위해 교배를 위해 준비된 식물을 다른 식물로부터 제거하였다. 의도하지 않은 화분이 수 담배 식물을 수정시킬 가능성을 감소시키기 위해 교배를 위해 준비된 식물을 다른 식물로부터 제거하였다. 암 식물을 수 꽃에 의해 수분되기 ~15-30분 전에 핀셋을 사용하여 제웅 (emasculation)시켰다 (열개 (dehiscence) 전의 꽃밥 제거). 꽃은 꽃밥 및 꽃 색깔을 관찰함으로써 제웅을 위해 선택되었다. 새로 개화된 꽃은 가장자리 주위가 연분홍색이고, 꽃밥은 계속 닫힌 상태이었다. 열리거나 또는 부분적으로 열린 꽃밥이 있는 꽃은 사용하지 않았다. 담배 식물의 줄기로부터의 다수의 꽃을 제웅시키고, 수정시켰다. 줄기 상의 추가의 꽃 (예를 들어, 이미 수정된 꼬투리, 오래된 꽃, 매우 어린 봉오리 등)을 핀셋으로 제거하여 가지 상에 형성되는 꼬투리만이 제어된 교배로부터 사용되도록 보장하였다. 실시한 교배, 교배 시행 횟수, 및 수분 일자를 제시하는 수분 태그로 가지를 표지하였다. 수 식물주로부터의 꽃밥을 핀셋을 사용하여 수 식물주로부터 완전히 제거하고, 제웅된 암 식물주를 수정시키기 위해 사용하였다. 열개되는 수 꽃밥을 암술머리가 화분으로 덮일 때까지 점착성의 수용하는 암 식물주 암술머리에 문질렀다. 임의의 의도하지 않는 화분이 암 식물주 암술머리에 수분할 가능성을 감소시키기 위해 암술머리를 수회 덮었다. 수정된 식물로부터의 종자를 수거하고, 토양에 파종하였다. 생성되는 F2 자손체 식물을 상기한 조건 하에 온실에서 성장시켰다.
Figure pct00003
실시예 IV : ZFN -매개 도입유전자 결실에 대한 F 1 식물의 분석
GUS 분석.
F1 식물을 잎 물질을 조직화학적으로 염색함으로써 GUS 발현에 대해 시험하였다. GUS 스크린은 ZFN-매개 도입유전자 결실을 겪은 이벤트를 확인하기 위한 예비 시험이었다. GUS 스크린의 결과는 결정적인 것이 아니라, 추가의 분자 분석을 위한 식물을 확인하기 위한 표시자이었다. F1 식물을 상기한 바와 같은 프로토콜 (GUS 발현 분석)을 사용하여 분석하였다. 그 결과를 표 3에 제시한다.
Figure pct00004
서던 블롯 분석.
아연 핑거 뉴클레아제에 의한 GUS PTU 발현 카세트 절제의 분자 특성을 제공하기 위해 서던 블롯 분석이 사용되었다. 상기 데이타는 이벤트의 하위 세트에서 GUS PTU 발현 카세트의 절제, 이벤트의 또 다른 하위 세트에서 GUS PTU 발현 카세트의 비-절제, 및 절제된 및 비-절제된 GUS PTU 발현 카세트를 모두 함유하는 키메릭 이벤트의 하위 세트를 보여주었다. 상세한 서던 블롯 분석을 GFP PTU 발현 카세트에 특이적인 프로브를 사용하여 수행하였다. 특이적 제한 효소로 소화된 게놈 DNA와 프로브의 혼성화를 통해 특이적 분자량의 DNA 단편을 확인하였다. 이들 패턴은 절제된 GUS PTU 발현 카세트를 함유하거나, 무손상 GUS PTU 발현 카세트를 함유하거나, 또는 키메릭이고 절제된 및 무손상 GUS PTU 발현 카세트를 모두 함유하는 이벤트를 확인하기 위해 분석될 수 있다.
제한 소화는 10배 과다-소화를 위해 350 ㎕의 최종 부피에서 1x 버퍼 4 및 100 단위의 NdeI (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국 매사추세츠주 입스위치) 내의 10 ㎍의 각각의 샘플에 대해 수행하였다. 샘플을 37℃에서 철야 인큐베이팅하였다. 소화된 DNA를 제조자가 제안하는 프로토콜에 따라 Quick Precipitation Solution™ (엣지 바이오시스템, 미국 메릴랜드주 게이더스버그)을 사용한 재-침전에 의해 농축하였다. 회수된 소화물을 30 ㎕의 1x 로딩 버퍼에 재현탁하고, 30분 동안 65℃에서 인큐베이팅하였다. 재현탁된 샘플을 1x TAE (0.8M Tris-아세테이트 [pH 8.0] / 0.04 mM EDTA) 내에 제조된 0.8% 아가로스 겔 상에 로딩하고, 1x TAE 버퍼 내에서 1.1 V/cm에서 철야 전기영동하였다. 겔을 순차적으로 30분 동안 변성시키고 (0.2 M NaOH/0.6 M NaCl), 30분 동안 중화 (0.5 M Tris-HCl [pH 7.5]/1.5 M NaCl)시켰다. DNA 단편의 전달은 크로마토그래피 페이퍼 위크 및 페이퍼 타월을 사용하여 20x SSC 용액을 겔을 통해 처리된 이모빌리언™ NY+ 전달 막 (밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌러리카) 상에 수동적으로 철야 위킹함으로써 수행하였다. 전달 후에, 막을 2x SSC로 짧게 세척하고, 스트라타링커™ 1800 (스트라타진, 미국 캘리포니아주 라 홀라)과 가교결합시키고, 80℃에서 3시간 동안 진공 소성하였다. 블롯을 혼성화 인큐베이터를 사용하여 유리 롤러 병에서 65℃에서 1시간 동안 예비혼성화 용액과 함께 인큐베이팅하였다. 프로브는 퀴아젠 겔 추출 키트를 사용하여 정제된 gfp 코딩 서열을 함유하는 PCR 단편으로부터 제조하고, 표지 키트를 사용하여 50 μCi의 α32P-dCTP로 표지하였다. 블롯을 약 2백만 카운트/블롯/mL로 혼성화 버퍼에 직접 첨가된 변성 프로브와 함께 65℃에서 철야 혼성화시켰다. 혼성화 후에, 블롯을 순차적으로 65℃에서 0.1xSSC/0.1% SDS로 40분 동안 세척하였다. 블롯을 인광 영상화 스크린을 사용하여 노출시키고, 몰레큘라 다이내믹스 스톰 860™ 영상화 시스템을 사용하여 영상화하였다. 블롯의 결과를 도 5에 제시한다.
식물 전사 단위 PCR 분석.
GUS PTU 발현 카세트의 발현을 특성화하기 위해 PCR 반응을 수행하였다. MAR 서열 및 ORF 23 3' UTR 서열 (GFP PTU 발현 카세트의 3' UTR)에 결합하는 프라이머를 설계하였다. 상기 PCR 앰플리콘은 절제될 것으로 예상되는 GUS PTU 발현 카세트 영역에 걸친다. 따라서, 이들 PCR 프라이머의 사용은 GUS PTU 발현 카세트가 절제된 이벤트, 절제가 발생하지 않은 이벤트, 및 GUS PTU 발현 카세트가 이벤트 내에서 균일하게 제거되지 않은 키메릭 이벤트를 검출할 수 있다. 6.7 kb 단편의 증폭은 절제가 존재하지 않음을 나타내고, 2.4 kb 단편의 증폭은 GUS PTU 발현 카세트가 절제되었음을 제시한다. 두 크기의 단편을 함유하는 앰플리콘은 GUS PTU 발현 카세트가 완전히 제거되지는 않았음을 나타낸다.
게놈 DNA를 DNeasy™ 플랜트 맥시 키트를 사용하여 담배 잎 조직으로부터 단리하고, 상기 설명된 바와 같이 Quant-IT™ 피코 그린 DNA 분석 키트를 사용하여 정량하였다. 식물 전사 단위 PCR (PTU PCR)을 테트라드2™ 열순환기 (바이오라드, 미국 캘리포니아주 허큘레스)를 사용하여 수행하였다. VectorNTI™ 소프트웨어를 사용하여 PTU를 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하였다. 증폭을 위해, Ex Taq Polymerase™ (다까라 (TaKara, 일본 시가현 오츠))를 4 ng의 gDNA 주형을 사용하는 1.2 μM의 각각의 프라이머 (서열 16 및 17), 0.2 mM dNTP, 2% DMSO, 1.25 단위의 TAQ를 함유하는 25 ㎕ 부피 단일 반응물 내에 1x 최종 농도로 제조하였다. 3단계 증폭 반응을 다음과 같이 수행하였다; 94℃에서 3분의 초기 변성 및 94℃ 30초, 65.5℃ 6분, 72℃ 30초의 33 사이클, 및 72℃에서 10분 동안의 최종 연장. PCR 생성물의 분취액을 생성물의 크기를 결정하기 위해서 1Kb+ 마커 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 사용하여 에티듐 브로마이드가 존재하는 1% 겔 상에서 이동시켰다. PTU PCR 반응의 결과를 도 6에 제시한다.
PTU PCR 생성물의 스크리닝.
PTU PCR 반응으로부터의 2.4 kb 밴드를 겔로부터 절제하고, DNA를 퀴아젠 Qiaex II™ 겔 추출 키트 (퀴아젠, 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 정제하였다. 정제된 단편을 pCR2.1 TOPO-TA™ 클로닝 벡터 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드) 내로 라이게이션시켰다. pCR2.1 벡터 내의 클로닝된 PCR 앰플리콘의 존재는 제한 효소 소화를 통해 확인하였다. 증폭된 밴드를 함유하는 클론의 서열을 결정하였다. GUS PTU 발현 카세트의 제거에 의한 연결부의 서열은 도 7a 및 7b에 제시한다. 전체 PTU 발현 카세트를 제거하였다. 잔류하는 유일한 서열은 GUS PTU 발현 카세트에 인접하는 재배열된 아연 핑거 결합 부위이다. 또한, 몇몇의 PCR 앰플리콘은 GFP PTU 발현 카세트의 액틴 2 프로모터 내로 연장된 결실을 함유하였다.
6.7 kb 밴드의 제한 효소 분석.
보다 큰 6.7 kb 밴드의 PCR 앰플리콘을 제한 효소 소화를 통해 분석하였다. 이들 단편을 EcoRI으로, 및 NcoI/SacI 제한 효소 (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국 매사추세츠주 입스위치)로 소화시켰다. 증폭된 단편이 비-절제된 pDAS5380 도입유전자 게놈 삽입체에 걸침을 확인하기 위해 생성되는 밴드의 크기를 분석하였다.
F 2 자손체를 생산하기 위한 F 1 식물의 자가수정.
F2 자손체를 생성하기 위해 상기한 F1 식물의 대표적인 군을 자가수정시켰다. 표 5는 선택된 식물 및 그의 F1 표현형 및 유전자형을 제시한다. 선택된 F1 식물을 22-24℃의 주간 및 야간 온도에서 16:8-시간 광주기 하에 온실에서 성장시켰다. 1차 개화 줄기가 자라고 꽃눈을 형성하기 시작할 때, 전체 식물을 이종교배를 방지하기 위해 자가수정 백으로 덮었다. 자가수분으로부터 유래된 종자를 이식 약 8주 후에 수거하였다. 자가수정된 식물로부터의 종자를 수거하고, 토양에 파종하였다. 생성되는 F2 집단을 상기한 바와 같은 조건 하에서 온실에서 성장시켰다. F2 식물을 추가의 도입유전자 결실 및 F1 식물 내에서 특성화된 결실의 유전성에 대해 분석하였다.
실시예 V: T 1 식물의 생성 및 선택.
도입유전자 및 결실의 유전성에 대한 F 2 자손체의 분석.
GUS 분석.
F2 식물을 잎 물질의 조직화학적 염색에 의해 GUS 발현에 대해 시험하였다. 식물을 상기한 프로토콜 (GUS 발현 분석)을 사용하여 분석하였다. 그 결과를 표 5에 제시한다. F2 식물로부터의 GUS 발현 데이타는 예상된 바와 같았다. 절제된 GUS PTU 발현 카세트를 함유하는 것으로 확인된 F1 식물은 조직화학적 염색에 의해 확인될 때 100% GUS 음성인 F2 식물을 생성하였다. 이들 F2 식물 내의 GUS 발현의 부재는 F1 데이타를 확인하고, 이는 GUS PTU 발현 카세트가 아연 핑거 뉴클레아제-매개 도입유전자 결실을 통해 절제됨을 제시한다. 또한, 상기 데이타는 결실된 도입유전자의 후속 세대로의 유전성을 예시한다.
형제가 없는 대조군 식물은 F2 세대의 약 75%에서 GUS를 발현하였다. GUS가 조직화학적 염색을 통해 검출되지 않은 나머지 식물 (약 25%)이 예상되었다. GUS PTU 발현 카세트는 F2 집단 내에서 예상된 3:1 비율로 분리될 것으로 예상된다. F1에 절제된 및 비-절제된 GUS PTU 발현 카세트를 모두 함유한 키메릭 이벤트는 F2 내에서 분리되었다. 대부분의 식물은 GUS를 발현하였다.
Figure pct00005
녹색 형광 단백질 ELISA 분석.
선택된 F2 식물을 상기한 프로토콜 (GFP 발현 분석)을 사용하여 ELISA에 의해 GFP 발현에 대해 시험하였다. F2 식물로부터의 GFP 발현 데이타는 예상된 바와 같았다. F1 식물은 F2 세대의 약 75%에서 GFP를 발현하였다. GFP가 ELISA를 통해 검출되지 않은 나머지 식물 (약 25%)이 예상되었다. GFP PTU 발현 카세트는 F2 집단 내에서 예상된 3:1 비율로 분리될 것으로 예상된다. F1에 절제된 및 비-절제된 GFP PTU 발현 카세트를 모두 함유한 키메릭 이벤트는 F2 내에서 분리되었다. 대부분의 식물은 GFP를 발현하였다.
F 2 자손체의 PCR , 서던 블롯 , 및 GFP 분석.
표 5에 제시된 교배체의 3개로부터의 16개의 식물 (절제된, 무손상, 및 키메릭 자손체를 나타냄)을 추가의 분자 분석을 위해 유지하였다. 이들 16개의 식물은 형제가 없는 대조군 및 키메릭 식물에 대해 GUS 양성인 8개의 식물 및 GUS 음성인 8개의 식물로 구성되었다. 상기한 프로토콜 (서던 블롯 분석; 및 식물 전사 단위 PCR 분석)을 F2 식물로부터의 게놈 DNA를 사용하여 반복하였다. 선택된 F2 식물을 상기한 프로토콜 (GFP 발현 분석)을 사용하여 ELISA에 의해 GFP 발현에 대해 시험하였다. 분자 데이타를 통해, GUS를 발현하지 않는 식물은 무손상 GUS PTU 발현 카세트를 함유하지 않음을 확인할 수 있다. GFP 발현은 예상된 바와 같이 분리되었다. 그 결과를 도 8-13에 요약한다.
많은 예시적인 측면 및 실시양태가 위에서 논의되었지만, 당업자는 그의 특정 변형, 순열, 추가 및 하위 조합을 인식할 수 있을 것이다. 따라서, 다음에 첨부되는 청구의 범위 및 추후 도입될 청구의 범위는 그의 진정한 취지 및 범위 내에 포함되는 모든 상기 변형, 순열, 추가 및 하위 조합을 포함하는 것으로 해석되는 것이 의도된다.
본원에서 논의되는 참고문헌은 단지 본원의 출원일 이전의 이들의 개시내용을 제공하는 것이다. 본원의 어느 것도, 본 발명자들이 선행 발명에 의하여 상기 개시내용을 앞당길 자격이 없음을 인정하는 것으로서 고려되지 않아야 한다.
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Claims (20)

  1. DNA의 영역을 포함하는 게놈 DNA를 함유하는 생존가능 식물을 제공하고;
    인식 서열에서 게놈 DNA를 절단하도록 조작된 아연 핑거 뉴클레아제를 게놈 DNA를 함유하는 생존가능 식물에 도입하거나 상기 식물에서 발현시키는 것
    을 포함하고; 이에 의해 인식 서열에서 게놈 DNA의 절단을 유도하여 게놈 DNA의 절제를 야기하고, DNA의 영역이 게놈 DNA에 존재하지 않게 되는 것인, 식물에서 DNA의 영역을 제거하는 방법.
  2. 제1항의 방법에 의해 생산된 트랜스제닉 식물.
  3. DNA의 영역 및 DNA의 영역의 3' 말단에 인접하는 제1 인식 서열 및 5' 말단에 인접하는 제2 인식 서열을 포함하는 게놈 DNA를 함유하는 제1 생존가능 식물을 제공하고;
    인식 서열에서 게놈 DNA를 절단하도록 조작된 아연 핑거 뉴클레아제를 코딩하는 DNA를 포함하는 게놈 DNA를 함유하는 제2 생존가능 식물을 제공하고;
    제1 및 제2 생존가능 식물을 F1 종자가 제1 또는 제2 생존가능 식물에서 생산되도록 교배시키고;
    게놈 DNA를 함유하는 생성되는 F1 식물을 성장시키는 것
    을 포함하고, 여기서 DNA의 영역이 게놈 DNA에 존재하지 않게 되는 것인, 식물에서 DNA의 영역을 제거하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 제1 인식 서열 및 제2 인식 서열이 동일한 것인 방법.
  5. 제3항의 방법에 의해 생산된 트랜스제닉 식물.
  6. 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 인식되는 제1 핵산 서열;
    관심있는 유전자; 및
    아연 핑거 뉴클레아제에 의해 인식되는 제2 핵산 서열
    을 포함하고, 여기서 관심있는 유전자에 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 인식되는 제1 및 제2 핵산 서열이 인접하는 것인 단리된 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 관심있는 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 단리된 핵산 분자.
  8. 제6항에 있어서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열에 상동성 서열이 인접하는 것인 단리된 핵산 분자.
  9. 식물 세포 또는 식물 조직을 제1항의 단리된 핵산 분자로 형질전환시키고;
    전체 식물을 재생시키는 것
    을 포함하는, 트랜스제닉 식물을 생산하는 방법.
  10. 제9항의 방법에 의해 생산되는 트랜스제닉 식물.
  11. 프로모터; 및
    아연 핑거 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열
    을 포함하고, 여기서 프로모터는 아연 핑거 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되고, 핵산 서열에 아연 핑거 뉴클레아제 절단 부위가 인접하는 것인 단리된 핵산 분자.
  12. 식물 세포 또는 식물 조직을 제11항의 단리된 핵산 분자로 형질전환시키고;
    전체 식물을 재생시키는 것
    을 포함하는, 트랜스제닉 식물을 생산하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 프로모터가 화분-특이적 프로모터, 종자-특이적 프로모터, 및 발달기 특이적 프로모터로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 단리된 핵산 분자.
  14. 제9항의 식물을 제11항의 식물과 교배시키는 것을 포함하고, 여기서 교배로부터 생성되는 자손체가 관심있는 유전자의 아연 핑거 뉴클레아제-매개 절제를 보이는 것인, 식물에서 관심있는 유전자를 절제하는 방법.
  15. 제9항의 식물을 아연 핑거 뉴클레아제에 작동가능하게 연결된 화분-특이적 프로모터를 포함하는 단리된 핵산 분자로 형질전환된 식물 세포 또는 조직으로부터 재생된 식물과 교배시키고, 여기서 관심있는 유전자는 교배로부터 생성되는 자손체의 화분에서 특이적으로 절제되고 관심있는 천연 유전자가 절제되고,
    교배로부터 생성되는 자손체를 재배하는 것
    을 포함하는, 관심있는 유전자의 다른 식물로의 전달을 감소시키는 방법.
  16. 관심있는 유전자를 포함하는 식물 세포 또는 조직을 아연 핑거 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자 또는 아연 핑거 뉴클레아제를 코딩하는 단리된 단백질 서열로 형질전환시키고, 여기서 아연 핑거 뉴클레아제는 관심있는 천연 유전자에 인접하는 핵산 서열을 인식하고,
    전체 식물을 재생시키는 것
    을 포함하는, 식물에서 관심있는 천연 유전자를 절제하는 방법.
  17. 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 인식되는 제1 핵산 서열을 제공하고;
    선택가능 마커 유전자 발현 카세트를 제공하고;
    아연 핑거 뉴클레아제에 의해 인식되는 제2 핵산 서열을 제공하는 것
    을 포함하고, 여기서 선택가능 마커에 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 인식되는 제1 및 제2 핵산 서열이 인접하는 것인, 핵산 분자를 함유하는 식물에서 DNA의 영역을 제거하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열에 상동성 서열이 인접하는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 인식 서열에서 게놈 DNA를 절단하도록 조작된 아연 핑거 뉴클레아제가 생존가능 식물에서 발현되거나 상기 식물에 도입되고; 이에 의해 인식 서열에서 게놈 DNA의 절단을 유도하여 게놈 DNA의 절제를 야기하고, 선택가능 마커가 게놈 DNA에 존재하지 않게 되는 것인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 아연 핑거 뉴클레아제 단량체의 각각의 절반이 별개로 발현되고, 서로 함께 짝을 형성할 때 기능성 복합체를 형성하는 것인 방법.
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