EA031356B1 - Вырезание трансгенов в генетически измененных организмах - Google Patents

Abstract

Способ удаления участка ДНК в растении. В некоторых вариантах осуществления способ включает трансформацию растения молекулой нуклеиновой кислоты, где молекула нуклеиновой кислоты кодирует одну или более нуклеазу (нуклеазы) "цинковые пальцы" (ZFN), функционально связанную с одним или более тканеспецифичным промотором (промоторами), например промотором, специфичным для пыльцы. Способы включают вырезание нативных генов в растении. Соответственно в некоторых вариантах осуществления разрабатывают ZFN, которые распознают последовательности, которые фланкируют нативные гены растения. В других вариантах осуществления ZFN экспрессируются под контролем промоторов, специфичных для определенных стадий развития, таких что, например, последовательности нуклеиновой кислоты специфически вырезаются в растениях на относительно поздних стадиях развития. Включены молекулы нуклеиновой кислоты, полезные при осуществлении раскрытых способов, и растения, продуцируемые способами.

Description

Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной патентной заявки США № 61/297628, зарегистрированной 22 января 2010 г., имеющей название Вырезание трансгенов в генетически модифицированных организмах.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение в целом относится к композициям и способам создания трансгенных растений. В определенных вариантах осуществления трансгенные растения содержат один или более интересующих трансгенов. В определенных вариантах осуществления управляют вырезанием трансгена (трансгенов) в пыльце и/или семени, так что пыльца и/или семя, произведенное трансгенным растением изобретения, в основном не содержит трансгена (трансгенов). В некоторых вариантах осуществления трансгенные растения изобретения полезны, например, для достижения биоудержания интересующего трансгена (трансгенов) в трансгенном растении. В других вариантах осуществления вырезание трансгена направлено на специфическую кассету экспрессии, например, на выбираемый маркер, так что только указанная кассета экспрессии удаляется из трансгенного растения и/или потомства трансгенного растения.

Уровень техники

Многие растения генетически трансформируют с помощью генов других видов для придания им желаемых свойств, а именно, чтобы увеличить сельскохозяйственную ценность благодаря, например, улучшению качества пищевой ценности, увеличению урожайности, приданию устойчивости к вредителям или заболеваниям, увеличению устойчивости к засухе и стрессу, улучшению плодовых качеств, таких как пигментация и рост, и/или приданию устойчивости к гербицидам; обеспечению возможности продукции промышленно применимых соединений и/или материалов из растения; и/или обеспечению возможности продукции лекарственных средств. Введение клонированных генов в растительные клетки и восстановление стабильно плодоносящих трансгенных растений может быть использовано для получения таких модификаций растения, и обеспечивает желаемые признаки или интересующие качества, которые должны быть включены в растения с помощью генной инженерии (например, улучшение культуры). В указанных способах чужеродную ДНК обычно вводят в ядерную или пластидную ДНК эукариотической растительной клетки с последующим выделением клеток, содержащих чужеродную ДНК, интегрированную в клеточную ДНК, для получения стабильно трансформированных растительных клеток.

Один недостаток, который возникает в связи с применением трансгенных растений, заключается в возможности утечки трансгенов к диким видам и нетрансформированным видам. Указанные признаки могут увеличивать риск ауткроссинга, персистенции и интрогрессии трансгенов в соседней популяции. Утечка трансгенов из генетически модифицированных (GM) сельскохозяйственных культур обычно происходит благодаря потоку генов, главным образом посредством перекрестного опыления (Lu (2003) Eviron. Biosafety Res. 2:3-8), но также может происходить в результате интрогрессии (Stewart Jr. et al. (2003) Nat. Reviews Gen. 4:806-17). Поток генов от культуры к культуре будет приводить к контаминации неGM сортов, воздействуя на стратегическую расстановку трансгенных и нетрансгенных сортов сельскохозяйственных культур в данной сельскохозяйственной системе. Значительная контаминация не-GM культур трансгенным материалом вызывает сложности в международной торговле в связи с юридическими ограничениями на импорт трансгенных продуктов многими странами. Поток генов от культуры к культуре может вызвать накопление трансгенов в гибридах, которые потенциально могут стать самосевными сорняками, если трансгены придают множественную устойчивость (например, к гербицидам, вредителям и/или заболеваниям). Кроме того, поток генов от культуры к культуре может привести к утечке трансгенов в популяции сорняков или родственных диких видов, что может представлять собой серьезные проблемы с сорняками и другие экологические риски, если трансгены сохраняются и фиксируются в сорняковых/диких популяциях в результате полового размножения и/или вегетативного размножения. Это имеет особенно большое значение, если ускользнувшие гены усиливают экологическую приспособленность сорняковых/диких видов. Интрогрессия трансгена сельскохозяйственной культуры происходит во время стадий, вовлекающих несколько последовательных гибридных поколений. Интрогрессия является динамическим процессом, который происходит в течение много лет и поколений, прежде чем трансген закрепится в наследственности получающих видов и, таким образом, вызывает сложности в определении и мониторинге. Однако если отбор является строгим и/или размер популяции является небольшим, закрепление интрогрессивного гена может происходить стремительно.

Ограничение специфической кассеты экспрессии в пределах генетически модифицированных растений, особенно кассеты экспрессии селектируемого маркера, является труднодостижимой целью. Гены селектируемого маркера обычно представляют собой гены устойчивости к антибиотикам или к гербицидам, но могут включать репортерные гены (т.е. β-глюкуронидаза (Graham et al. (1989) Plant Cell Tiss. Org. 20 (1):35-39). Селектируемые маркеры, которые совместно переносят в геном растения, обеспечивают селективное преимущество и позволяют провести идентификацию стабильно трансформированных трансгенных растений. Доступность функциональных генов селектируемых маркеров, которые могут быть использованы для трансформации растений, до некоторой степени ограничена. Обзор опубликованной научной литературы по трансгенным сельскохозяйственным культурам показывает, что наиболее широко применяемые селективные агенты устойчивости к антибиотикам представляют собой агент ус

- 1 031356 тойчивости к канамицину (кодируемый геном неомицин-фосфотрансферазы типа II (Bevan et al. (1983) Nature 304: 184-187)) или к гигромицину (кодируемый геном гигромицин-фосфотрансферазы (Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5: 103-108)), и устойчивость к гербицидам является устойчивостью к фосфинотрицину (кодируемой генами pat (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37) или bar (DeBlock et al. (1987), EMBO J. 6 (9): 2513-2518)). См. Sundar et al. (2008) J. Plant Physiol. 165: 1698-1716. Принимая во внимание ограниченное число генов селектируемых маркеров и практическое использование ряда параметров этих признаков, решение, которое позволяет вырезание и повторное применение селектируемых маркеров в трансгенном растении устраняло бы потребность в дополнительных селектируемых маркерах в последовательных раундах переноса генов или стэкинга генов в том же самом растении. Кроме того, возможность вырезать селектируемый маркер может преодолеть непредусмотренные изменения транскриптома растения, которые вызываются экспрессией маркера (Abdeen et al. (2009) Plant Biotechnol. J. 7(3):211218).

Современные стратегии предотвращения или минимизации потока генов между GM-культурами и другими видами и сортами включают: (1) физическую изоляцию трансгенной культуры; (2) хлоропластный инжиниринг трансгенов; (3) ко-инжиниринг гена ослабления вместе с трансгеном; (4) генетическое использование рестрикционных технологий (GURT); (5) CRE/loxP и FLP/FRT рекомбиназаопосредованную делецию гена. См., например, Lee and Natesan (2006) TRENDS Biotech. 24(3): 109-14; Lu (2003), выше; и Luo et al. (2007), Plant Biotech. J. 5:263-74; и (6) мегануклеаза - опосредованную делецию генов. См., например, патентную заявку США № 11/910515 и патентную заявку США № 12/600902.

Рекомбиназы CRE, FLP и R использовали для удаления нежелательного генетического материала из растений. Hare и Chua (2002) Nat. Biotech. 20:575-80. Luo et al. (2007), выше описали специфичную к пыльце и семенам систему GM-gene-deletor, в которой применение гибридных последовательностей oxP-FRT в качестве сайтов распознавания для удаления трансгенов рекомбиназой CRE или FLP приводило к делеции трансгенов из пыльцы, или пыльцы и из семени трансгенных растений табака. Все эти сайт-специфические рекомбиназные системы, проявившие функциональность в растениях, являются членами семейства интеграз. Указанные системы выбраны для применения, по меньшей мере отчасти, вследствие того, что другие рекомбиназы могут нуждаться во вспомогательных белках и более сложных сайтах распознавания, что может наложить топологические ограничения на эффективность рекомбинации. Id. Указанные системы имеют несколько существенных недостатков: рекомбиназы типа интеграз также могут распознавать псевдопоследовательности, которые могут сильно отличаться от специфической последовательности-мишени и в следствие этого вызывать нежелательные неспецифические делеции ДНК; и при вырезании последовательности-мишени остается остаточная последовательность распознавания, которая может представлять собой сайты хромосомных реаранжировок после последовательной обработки рекомбиназой, или активировать механизмы сайленсинга генов. Id. Кроме того, указанные системы дополнительно ограничены, поскольку функциональная рекомбиназа должна быть представлена и экспрессирована в одном из родительских растений, присутствие которой требует дополнительных стратегий делеции при наличии в пыльце и/или семени. Несмотря на указанные ограничения, система CRE/loxP считается наиболее подходящей стратегией оптимизации делеции генов в растениях. Id.

Сконструированные по заказу нуклеазы цинковые пальцы (ZFN) представляют собой белки, разработанные для внесения направленного сайт-специфического двухцепочечного разрыва в ДНК, с последующей рекомбинацией расщепленных концов. ZFN объединяют в себе домен неспецифического расщепления эндонуклеазы рестрикции FokI с ДНК-связывающими белками цинковые пальцы. См., например, Huang et al. (1996) J. Protein Chem. 15:481-9; Kim et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3616-20; Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-60; Kim et al. (1994) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 91:883-7; Kim et al. (1997b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12875-9; Kim et al. (1997c) Gene 203:43-9; Kim et al. (1998) Biol. Chem. 379:489-95; Nahon and Raveh (1998) Nucleic Acids Res. 26: 1233-9; Smith et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27:674-81. Индивидуальные мотивы цинковые пальцы могут быть разработаны для выявления и связывания с большим набором сайтов ДНК. Белки цинковые пальцы Cys₂His₂ связывают ДНК путем введения α-спирали в большую бороздку двойной спирали. Распознавание ДНК цинковыми пальцами является модулярным: каждый палец сначала контактирует с тремя идущими подряд парами оснований в мишени, и несколько ключевых остатков в белке опосредуют распознавание. Показано, что эндонуклеаза рестрикции FokI должна димеризоваться через нуклеазный домен для расщепления ДНК, вызывая двухцепочечный разрыв. Аналогичным образом, ZFN также нуждаются в димеризации нуклеазного домена для разрезания ДНК. Mani et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 334: 1191-7; Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-9. Димеризации ZFN способствуют два прилегающих, противоположно ориентированных сайта связывания. Кроме того, двухцепочечные разрывы, вызванные нуклеазами цинковые пальцы устраняются репарационным аппаратом ДНК растений с помощью соединения негомологичных концов (NHEJ) или с помощью гомологичной рекомбинации (HD), приводя, таким образом, к образованию растений, которые не содержат остаточных последовательностей распознавания.

Описание изобретения

Согласно варианту осуществления изобретения предоставляется способ удаления участка ДНК в

- 2 031356 растении, в котором живое растение содержит геномную ДНК, где геномная ДНК содержит участок ДНК; и нуклеаза цинковые пальцы, сконструированная для расщепления геномной ДНК в последовательности распознавания, экспрессируется или вводится в живое растение, содержащее геномную ДНК; приводя тем самым к расщеплению геномной ДНК в последовательностях распознавания, что приводит к вырезанию геномной ДНК, где участок ДНК отсутствует в геномной ДНК.

В другом варианте осуществления способ удаления участка ДНК в растении включает предоставление первого жизнеспособного растения, содержащего геномную ДНК, содержащую участок ДНК, и первую последовательность распознавания, фланкирующую З'-конец и вторую последовательность распознавания, фланкирующую 5'-конец участка ДНК. Предоставляют второе жизнеспособное растение, содержащее геномную ДНК, где геномная ДНК содержит ДНК, кодирующую нуклеазу цинковые пальцы, сконструированную для расщепления геномной ДНК в последовательностях распознавания. Скрещивают первое и второе жизнеспособные растения, так что потомок F1 производится на первом или на втором жизнеспособном растении. Выращивают полученное растение F₁, содержащее геномную ДНК, в котором отсутствует участок ДНК из геномной ДНК. В определенных вариантах осуществления первая последовательность распознавания и вторая последовательность распознавания могут быть одинаковыми.

В конкретном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает: первую последовательность нуклеиновой кислоты, распознаваемую нуклеазой цинковые пальцы; интересующий ген; и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, распознаваемую нуклеазой цинковые пальцы, где интересующий ген фланкирован первой и второй последовательностями нуклеиновой кислоты, распознаваемыми нуклеазой цинковые пальцы. В другом варианте осуществления первая последовательность распознавания и вторая последовательность распознавания могут быть фланкированы гомологичными последовательностями. В еще одном варианте осуществления способ получения трансгенного растения включает трансформирование растительной клетки или растительной ткани выделенной молекулой нуклеиновой кислоты и регенерацию целого растения. В дополнительном варианте осуществления способ уменьшения передачи интересующего гена другим растениям включает скрещивание целого растения с растением, регенерированным из растительной клетки или ткани, трансформированной выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей специфичный для пыльцы промотор, функционально связанный с нуклеазой цинковые пальцы, где интересующий ген специфически вырезают в пыльце потомства, полученного в результате скрещивания. Потомство, полученное в результате скрещивания, культивируют. В таком варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит промотор и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую нуклеазу цинковые пальцы, где промотор функционально связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу цинковые пальцы, и способ получения трансгенного растения, который включает трансформацию растительной клетки или растительной ткани выделенной молекулой нуклеиновой кислоты и регенерацию целого растения.

В варианте осуществления способ удаления участка ДНК в растении содержит молекулу нуклеиновой кислоты, включающую: первую последовательность нуклеиновой кислоты, распознаваемую нуклеазой цинковые пальцы; кассету экспрессии гена селектируемого маркера; и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, распознаваемую нуклеазой цинковые пальцы, где селектируемый маркер фланкирован первой и второй последовательностями нуклеиновой кислоты, распознаваемыми нуклеазой цинковые пальцы. В другом варианте осуществления первая последовательность распознавания и вторая последовательность распознавания фланкированы гомологичными последовательностями. Кроме того, нуклеаза цинковые пальцы, сконструированная для расщепления геномной ДНК в последовательности распознавания, экспрессируется или вводится в жизнеспособную растительную клетку; приводя тем самым к расщеплению геномной ДНК в последовательностях распознавания, что приводит к вырезанию геномной ДНК, где селектируемый маркер отсутствует в геномной ДНК.

В другом варианте осуществления каждая половина мономера нуклеазы цинковые пальцы экспрессируется отдельно и при соединении вместе друг с другом они образуют функциональный комплекс. Например, единица транскрипции растения, которая экспрессирует один мономер нуклеазы цинковые пальцы (состоящий из связывающего мотива цинковые пальцы, функционально связанного с нуклеазой FokI) стабильно интегрируется в одного родителя, PI, и единица транскрипции растения, которая экспрессирует второй мономер, стабильно интегрируется во второго родителя, Р2. Половое скрещивание PI х Р2 дает в результате растения-потомки, которые содержат оба мономера цинковых пальцев. Получаемый димер нуклеазы цинковые пальцы способен к связыванию с сайтом связывания цинковых пальцев и к формированию комплекса, который обладает расщепляющей активностью. Учитывая, что эндонуклеаза FokI активна в качестве димера (Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,57010,575), расщепляющая активность способна проявиться только у потомства, которое содержит оба функционально экспрессирующих мономера.

В другом варианте осуществления вырезание нуклеазой цинковые пальцы в последовательности распознавания приводит к образованию соединения на месте расщепления, которое не содержит остаточной последовательности распознавания.

Соединение разрыва не может связываться и расщепляться исходной нуклеазой (нуклеазами) цинковые пальцы. Кроме того, соединение разрыва может быть результатом негомологичного соединения концов (NHEJ) или результатом гомологичной рекомбинации между двумя гомологичными областями ДНК, которые расположены выше 5'-последовательности распознавания и ниже З'-последовательности распознавания, или результатом другого неописанного механизма репарации ДНК. Гомологичная последовательность может располагаться за пределами сайтов связывания, так что после расщепления может происходить гомологичная рекомбинация. Это является усовершенствованием по сравнению с рекомбиназными системами, которые всегда оставляют после себя остаток сайта, использованного для проведения эксцизии.

В еще одном варианте осуществления способ вырезания нативного интересующего гена в растении включает трансформацию растительной клетки или ткани, содержащей интересующий ген, выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую нуклеазу цинковые пальцы или последовательность изолированного белка, которая кодирует нуклеазу цинковые пальцы, где нуклеаза цинковые пальцы распознает последовательность нуклеиновой кислоты, фланкирующую интересующий нативный ген, и интересующий нативный ген специфически вырезается. Затем регенерируют целое растение. В альтернативном варианте осуществления вырезание эндогенного гена может осуществляться скрещиванием растения, экспрессирующего нуклеазу цинковые пальцы, с растением-мишенью.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 включает карту плазмиды pDAS5380.

Фиг. 2 включает карту плазмиды pDAS5381.

Фиг. За представляет собой схематическую диаграмму и рестрикционную карту вставки Т-ДНК. Фиг. 3b включает несколько панелей, изображающих анализ Саузерн-блоттинг Т₀, использованный для идентификации событий, которые содержали полноразмерные интактные PTU из плазмиды pDAS5380 согласно варианту осуществления изобретения. Саузерн-блоттинг Т₀ изображает ферменты рестрикции Mfel и Nsil, используемые для расщепления событий pDAS5380, показывающие интактные вставки ТДНК при совместной гибридизации GUS и PAT.

Фиг. 4 А представляет собой схематическую диаграмму и рестрикционную карту вставки Т-ДНК. Фиг. 4b включает несколько панелей, изображающих Саузерн-блоттинг Т0, использованный для идентификации событий, которые содержали полноразмерные интактные PTU из плазмиды pDAS5381 согласно варианту осуществления изобретения. Саузерн-блоттинг Т0 изображает ферменты рестрикции Mfel и Nsil, используемые для расщепления событий pDAS5381, показывающие интактные вставки ТДНК при гибридизации HptII.

Фиг. 5 включает Саузерн-блоттинг выбранной группы событий, которые соответствуют более крупному образцу согласно варианту осуществления изобретения. Указанные образцы выбирали для иллюстрации вырезанного фрагмента (т.е. более короткого молекулярного фрагмента), невырезанного фрагмента (т.е. фрагмента с более высоким молекулярным весом), и химерных событий, которые содержали вырезанные и невырезанные фрагменты. Кроме того, включали контроли геномной ДНК дикого типа и 100 пг плазмиды pDAS5380. Результаты коррелировали с результатами экспрессии GUS. События, которые не давали положительной реакции при гистохимическом окрашивании на GUS, не содержали полноразмерной, интактной кассеты экспрессии PTU GUS.

Фиг. 6 включает изображение агарозного геля, содержащего образцы РС-амплифицированных фрагментов геномной ДНК, использованных в экспериментах Саузерн-блоттинга согласно варианту осуществления изобретения. Указанные ампликоны ПЦР иллюстрируют вырезанный фрагмент (т.е. фрагмент с меньшим молекулярным весом), невырезанный фрагмент (т.е. фрагмент с большим молекулярным весом), и химерные события, которые содержали вырезанный и невырезанный фрагменты. Кроме того, включены контроли диких растений Т0; более крупную кассету экспрессии интактного PTU GUS амплифицировали в указанных реакциях. Отрицательные контроли также включены в тех случаях, когда для реакций ПЦР использовали геномную ДНК дикого типа и не использовали ДНК (H₂O). Результаты коррелировали с результатами экспрессии GUS и с результатами Саузерн-блоттинга.

Фиг. 7а и 7b включают анализ выравнивания последовательности полосы 2,4 т.н., свидетельствующей о делеции кассеты экспрессии GUS согласно варианту осуществления изобретения. Последовательность, выделенная полужирным шрифтом, показывает промотор актина At и элементы гена MAR. Сайты связывания CCR5 выделены подчеркиванием и курсивом. Хотя несколько ампликонов получали и секвенировали на событие, только один ампликон выравнивали в фигурах.

Фиг. 8 включает анализ ПЦР потомков F₂ интактных гибридов F₁ согласно варианту осуществления изобретения.

Фиг. 9 включает Саузерн-блоттинг потомков F₂ интактных гибридов F₁ согласно варианту осуществления изобретения.

Фиг. 10 включает анализ ПЦР потомков F₂ вырезанных гибридов F₁ согласно варианту осуществления изобретения.

Фиг. 11 включает анализ Саузерн-блоттинг потомков F₂ вырезанных гибридов F₁ согласно вари

- 4 031356 анту осуществления изобретения.

Фиг. 12 включает анализ ПЦР потомков F₂ химерных гибридов F₁ согласно варианту осуществления изобретения.

Фиг. 13 включает анализ Саузерн-блоттинг потомков F₂ химерных гибридов F₁ согласно варианту осуществления изобретения.

Список последовательностей

Последовательности нуклеиновой кислоты, перечисленные в прилагаемом списке последовательностей, представлены с использованием стандартных буквенных сокращений нуклеотидных оснований. Показана только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но комплементарная цепь понятна, поскольку она включена посредством ссылки на представленную цепь. В прилагаемом списке последовательностей:

SEQ ID NO: 1 показывает сайт связывания ZFN CCR5.

SEQ ID NO: 2 показывает последовательность гена нуклеазы цинковые пальцы CCR5.

SEQ ID NO: 3 показывает праймер TQPATS.

SEQ ID NO: 4 показывает праймер TQPATA.

SEQ ID NO: 5 показывает праймер TQPATFQ.

SEQ ID NO: 6 показывает праймер TQPALS.

SEQ ID NO: 7 показывает праймер TQPALA.

SEQ ID NO: 8 показывает праймер TQPALFQ.

SEQ ID NO: 9 показывает праймер HPT2S.

SEQ ID NO: 10 показывает праймер НРТ2А.

SEQ ID NO: 11 показывает праймер HPTFQ.

SEQ ID NO: 12 показывает праймер FokI_UPL_F.

SEQ ID NO: 13 показывает праймер FokI_UPL_R.

SEQ ID NO: 14 показывает праймер BY2ACT89S.

SEQ ID NO: 15 показывает праймер BY2ACT89A.

SEQ ID NO: 16 показывает прямой праймер ПЦР для анализа ПЦР PTU.

SEQ ID NO: 17 показывает обратный праймер ПЦР для анализа ПЦР PTU.

SEQ ID NO: 18 показывает праймер BYACTFQ.

Способ(ы) осуществления изобретения

Раскрывается способ вырезания генов из специфической растительной ткани в генетически модифицированных организмах. В некоторых вариантах осуществления используют одну или более ZFN (нуклеаза цинковые пальцы) для удаления трансгенов из специфической растительной ткани как средство уменьшения потока генов в не-GM культуры. В некоторых вариантах осуществления удаляемый трансген представляет собой кассету гена селектируемого маркера. В определенных вариантах осуществления специфическая растительная ткань представляет собой пыльцу.

В некоторых вариантах осуществления одна или более ZFN могут быть функционально связаны с различными тканеспецифическими промоторами. В указанных и в других вариантах осуществления одна ZFN из одной или более ZFN, функционально связанная с тканеспецифическим промотором, может быть трансформирована в одну линию родительского растения, и другая ZFN из одной или более ZFN, функционально связанная с другим тканеспецифическим промотором, может быть трансформирована во вторую линию родительского растения. Скрещивание родительских линий, содержащих каждую из одной или более ZFN, может дать линию F₁, которая содержит функциональную ZFN, которая расщепляет ДНК в последовательности распознавания. Последовательности распознавания могут фланкировать трансгены в ДНК растения.

Вырезание тканеспецифического гена может быть достигнуто путем функционального связывания промоторов, специфических для тканей растения, с ZFN. В некоторых вариантах осуществления функциональное связывание тканеспецифического промотора с одной или более ZFN приводит к тканеспецифической экспрессии одной или более ZFN, и в связи с этим к вырезанию ZFN, селектируемых маркеров, и/или любых генов или последовательностей нуклеиновой кислоты, расположенных между последовательностями распознавания в специфической ткани.

В конкретных вариантах осуществления одна или более ZFN экспрессируются в одном и том же растении. ZFN могут быть функционально связаны с промоторами, которые запускают экспрессию ZFN во время более поздних стадий развития растения. В указанных и в других вариантах осуществления одна или более функциональные ZFN могут расщеплять специфические последовательности распознавания, которые фланкируют один или более трансген(ы), удаляя тем самым один или более трансгенов из ткани растения во время более поздних стадий развития растения.

Сокращения

GM - генетически модифицированный

PTU - единица транскрипции растения

ZF - цинковый палец

ZFN - нуклеаза цинковые пальцы

- 5 031356

ZFP - белок цинковые пальцы

Термины

Экспрессия гена. Процесс, с помощью которого кодируемая информация единицы транскрипции нуклеиновой кислоты (включая, например, геномную ДНК или кДНК) превращается в функциональную, нефункциональную или структурную часть клетки, часто включает в себя синтез белка. Экспрессия гена может находиться под влиянием внешних сигналов; например, воздействие на клетку, ткань или организм агента, который увеличивает или уменьшает экспрессию гена. Экспрессия гена также может регулироваться всюду в каскаде реакций от ДНК к РНК и к белку. Регуляция экспрессии гена происходит, например, посредством контролей, воздействующих на транскрипцию, трансляцию, транспорт и процессинг РНК, деградацию вспомогательных молекул, таких как мРНК, или с помощью активации, инактивации, компартментализации или деградации специфических белковых молекул, после того, как они были произведены, или с помощью их комбинаций. Экспрессию гена можно рассчитать из расчета уровня РНК или уровня белка любым методом, известным в данной области техники, включая, но без ограничения, нозерн-блоттинг, ОТ-ПЦР, вестерн-блоттинг, или тест(ы) определения активности белка in vitro, in situ или in vivo.

Гибридизация. Олигонуклеотиды и их аналоги гибридизуются путем образования водородных связей, которые могут быть водородными связями по модели Уотсона-Крика, хугстиновскими или обратными хугстиновскими, между комплементарными основаниями. В целом, молекулы нуклеиновой кислоты состоят из азотистых оснований, которые представляют собой пиримидины (цитозин (С), урацил (U), и тимин (Т)) или пурины (аденин (А) и гуанин (G)). Указанные азотистые основания образуют водородные связи между пиримидином и пурином, и связывание пиримидина с пурином обозначается как спаривание оснований. Более подробно, А будет образовывать водородную связь с Т или U, и G будет связываться с С. Комплементарный относится к спариванию оснований, которое происходит между двумя отдельными последовательностями нуклеиновой кислоты или двумя отдельными областями той же самой последовательности нуклеиновой кислоты.

Специфически гибридизуемый и комплементарный являются терминами, которые указывают достаточную степень комплементарности, таким образом, что происходит стабильное и специфическое связывание между олигомерным соединением и ДНК-или РНК-мишенью.

Олигонуклеотид не должен быть на 100% комплементарен своей последовательности-мишени для специфической гибридизации. Олигонуклеотид является специфически гибридизируемым, если связывание олигонуклеотида с молекулой-мишенью ДНК или РНК препятствует нормальному функционированию мишени ДНК или РНК, и имеется достаточная степень комплементарности, чтобы избежать неспецифического связывания олигонуклеотида с нецелевыми последовательностями в условиях, когда желательно специфическое связывание, например, в физиологических условиях в случае тестов или систем in vivo. Такое связывание называют специфической гибридизацией.

Условия гибридизации, дающие в результате различные степени жесткости, будут варьировать в зависимости от природы выбранного метода гибридизации и состава и длины гибридизующихся последовательностей нуклеиновой кислоты. В целом, температура гибридизации и ионная сила (в особенности концентрация Na⁺ и/или Mg²⁺) буфера гибридизации будут обеспечивать строгость гибридизации, хотя время отмывки также влияет на строгость. Расчеты, касающиеся условий гибридизации, необходимых для достижения определенных степеней строгости, обсуждаются в Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 и 11.

В контексте настоящего раскрытия Строгие условия охватывают условия, в которых гибридизация будет происходить, если имеется меньше чем 25% несоответствия между молекулой гибридизации и последовательностью-мишенью. Строгие условия можно дополнительно описать в определенных уровнях строгости. Таким образом, используемые в описании условия умеренной строгости представляют собой условия, в которых молекулы с более чем 25% несоответствия не будут гибридизоваться; условия средней строгости представляют собой условия, в которых молекулы с более чем 15% несоответствия не будут гибридизоваться, и условия высокой строгости представляют собой условия, в которых молекулы с более чем 10% несоответствия не будут гибридизоваться. Условия очень высокой строгости представляют собой условия, в которых молекулы с более чем 6% несоответствия не будут гибридизоваться. В конкретных вариантах осуществления строгие условия представляют собой гибридизацию при 65°С, с последующими последовательными отмывками при 65°С 0,1xSSC/0,1% SDS в течение 40 мин.

Изолированный. Изолированный биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота или белок) по существу отделен, произведен отдельно от, или очищен от других биологических компонентов клетки организма, в которой компонент присутствует естественным образом, т.е. от других хромосомных и экстрахромосомных ДНК и РНК и белков. Молекулы нуклеиновой кислоты и белки, которые изолировали, включают молекулы нуклеиновой кислоты и белки, очищенные стандартными методами очистки. Термин также охватывает нуклеиновые кислоты и белки, полученные с помощью рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине, а также химически синтезированные молекулы нуклеиновой кислоты,

- 6 031356 белки и пептиды.

Молекула нуклеиновой кислоты. Полимерная форма нуклеотидов, которая может включать смысловую и антисмысловую цепь РНК, кДНК и геномной ДНК, и их синтетические формы и смешанные полимеры. Термин нуклеотид означает рибонуклеотид, дезоксинуклеотид или модифицированную форму нуклеотидов любого типа. Термин молекула нуклеиновой кислоты, используемый в настоящем изобретении, является синонимом терминов нуклеиновая кислота и полинуклеотид. Термин также включает одноцепочечную и двухцепочечную формы ДНК. Молекула нуклеиновой кислоты может включать природные или модифицированные нуклеотиды или те и другие нуклеотиды, связанные друг с другом природными и/или неприродными нуклеотидными связями.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть модифицированы химически или биохимически, либо они могут содержать неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания, как может быть легко определено специалистом. Такие модификации включают, например, метки, метилирование, замена одного или нескольких природных нуклеотидов их аналогами, межнуклеотидные модификации, такие как введение незаряженных связей (например, метилфосфонатов, фосфотриэфиров, фосфорамидитов, карбаматов и т.п.), заряженных связей (например, фосфортиоатов, фосфордитиоатов и т.п.), боковых групп (например, полипептидов), интеркалирующих агентов (например, акридина, псоралена и т.п.), хелатообразующих агентов, алкилирующих агентов и модифицированных связей (например, а-аномерных нуклеиновых кислот и т.п.). Термин молекула нуклеиновой кислоты также охватывает любые топологические конформации, включая одноцепочечную, двухцепочечную, частично дуплексные и триплексные конформации, а также конформации типа шпильки, кольцевые конформации и конформации типа висячий замок.

Функционально связанный. Первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, если первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной зависимости со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор воздействует на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. При рекомбинантном получении функционально связанные последовательности нуклеиновой кислоты обычно граничат друг с другом и, при необходимости соединяют две кодирующие белок области в одной и той же рамке считывания. Однако элементы не обязательно должны граничить, чтобы быть функционально связанными.

Промотор. Область ДНК, которая обычно располагается в 3'-5' направлении (относительно 5'области гена), которая необходима для транскрипции. Промоторы обеспечивают соответствующую активацию или репрессию гена, который они контролируют. Промотор содержит специфические последовательности, которые распознаются факторами транскрипции. Указанные факторы связываются с промоторными последовательностями ДНК и приводят к the рекрутированию РНК-полимеразы, фермента, который синтезирует РНК из кодирующей области гена. В некоторых вариантах осуществления тканеспецифические промоторы используют в способах изобретения, например, промотор, специфичный для пыльцы. Тканеспецифичный промотор представляет собой последовательность ДНК, которая обеспечивает более высокий уровень транскрипции ассоциированного гена в ткани, для которой промотор является специфическим, по сравнению с другими тканями организма. Примеры тканеспецифических промоторов включают тапетум-специфичные промоторы; промоторы, специфичные для пыльника; промоторы, специфичные для пыльцы (см., например, патент США № 7141424, и международную публикацию РСТ № WO 99/042587); промоторы, специфичные для семязачатка; (см., например, патентную заявку США № 2001/047525 А1); промоторы, специфичные для плодов (см., например, патенты США № 4943674 и № 5753475); и промоторы, специфические для семян (см., например, патенты США № 5420034, и № 5608152). В некоторых вариантах осуществления промоторы, специфичные для стадии развития, используют в способах изобретения, например, промотор, активный на поздней стадии развития.

Трансформированный. Вирус или вектор трансформирует или трансдуцирует клетку, если он переносит молекулы нуклеиновой кислоты в клетку. Клетка трансформируется молекулой нуклеиновой кислоты, трансдуцированной в клетку, если молекула нуклеиновой кислоты стабильно реплицируется клеткой, с помощью включения молекулы нуклеиновой кислоты в клеточный геном или с помощью эписомальной репликации. Применяемый в описании термин трансформация охватывает все технологии, с помощью которых молекула нуклеиновой кислоты может быть введена в такую клетку. Примеры включают, но без ограничения трансфекцию вирусными векторами, трансформацию плазмидными векторами, электропорацию (Fromm et al. (1986) Nature 319: 791-3), липофекцию (Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7), микроинъекцию (Mueller et al. (1978) Cell 15: 579-85), Agrobacteriummediated transfer (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7), прямой захват ДНК и бомбардировку микрочастицами (Klein et al. (1987) Nature 327: 70).

Трансген. Экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты. В одном примере трансген представляет собой нуклеотидную последовательность гена (например, гена устойчивости к гербициду), гена, кодирующего промышленно или фармацевтически применимое соединение, или гена, кодирующего желаемый сельскохозяйственный признак. В еще одном примере трансген представляет собой антисмысло

- 7 031356 вую последовательность нуклеиновой кислоты, где экспрессия антисмысловой последовательности нуклеиновой кислоты ингибирует экспрессию последовательности-мишени нуклеиновой кислоты. Трансген может содержать регуляторные последовательности, функционально связанные с трансгеном (например, промотор).

Вектор. Молекула нуклеиновой кислоты, которую вводят в клетку, получая таким образом трансформированную клетку. Вектор может включать в себя последовательности нуклеиновой кислоты, которые позволяют ему реплицироваться в клетке-хозяине, например, точка начала репликации. Примеры включают, но без ограничения плазмиду, космиду, бактериофаг или вирус, который переносит экзогенную ДНК в клетку. Вектор также может включать один или более генов, антисмысловых молекул и/или гены селектируемого маркера и другие генетические элементы, известные в данной области техники. Вектор может трансдуцировать, трансформировать или инфицировать клетку, при этом заставляя клетку экспрессировать молекулы нуклеиновой кислоты и/или белки, кодируемые вектором. Вектор необязательно включает материалы, способствующие достижению проникновения молекулы нуклеиновой кислоты в клетку (например, липосома, кодирование белка и т.д.).

Опосредуемое Zn-пальцевой нуклеазой вырезание трансгенов из растений

Раскрываются способы получения растения, обладающего сниженной утечкой трансгенов, а также растения, полученные такими способами, и растительные материалы, произведенные из них, например, семена. В одном варианте осуществления способ включает взаимодействие растения с вектором, где вектор содержит одну или более нуклеазу (нуклеазы) цинковые пальцы (ZFN) функционально связанную с одним или более тканеспецифическим промотором (промоторами) (например, промотор, специфический для пыльцы). Экспрессия указанного вектора приводит к продукции ZFN в определенной ткани, в которой ее функционально связанный промотор является активным. ZFN может быть разработана или сконструирована для распознавания расщепляемой последовательности, которая фланкирует последовательность нуклеиновой кислоты, вырезание которой является желательным. Продукция ZFN, в таком случае, в определенной ткани, в которой промотор является активным, приводит к вырезанию последовательности нуклеиновой кислоты между расщепляемыми последовательностями, распознаваемыми ZFN, образуя при этом последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит соединение расщепления, которое не содержит остаточной последовательности распознавания.

В другом варианте осуществления способ включает: взаимодействие растения с вектором, где вектор содержит одну или более ZFN функционально связанную с тканеспецифическим промотором; интересующий ген; необязательно один или более регуляторный элемент(ы), который может быть функционально связан с интересующим геном; и одну или более расщепляемых последовательностей, распознаваемых ZFN, фланкирующих интересующий ген и один или более регуляторный элемент(ы). Экспрессия указанного вектора приводит к продукции ZFN в определенной ткани, где ее функционально связанный промотор является активным.

Продукция ZFN, в таком случае, в определенной ткани, где промотор является активным, приводит к вырезанию последовательности нуклеиновой кислоты между расщепляемыми последовательностями, распознаваемыми ZFN, которая включает в себя интересующий ген и, необязательно, один или более регуляторный элемент(ы).

В других вариантах осуществления способ включает взаимодействие растения с вектором, где вектор содержит одну или более нуклеаз цинковые пальцы (ZFN), функционально связанных с одним или более промотором (промоторами), активным в определенный период развития растения (например, промотор, который запускает экспрессию на относительно поздней стадии развития). Экспрессия указанного вектора приводит к продукции ZFN в определенный период развития, во время которого ее функционально связанный промотор является активным. ZFN могут быть разработаны или сконструированы для распознавания расщепляемой последовательности, которая фланкирует последовательность нуклеиновой кислоты, вырезание которой желательно. Продукция ZFN на стадии развития, во время которой промотор активен, приводит к вырезанию последовательности нуклеиновой кислоты между расщепляемыми последовательностями, распознаваемыми ZFN.

В других вариантах осуществления способ включает: взаимодействие растения с вектором, где вектор содержит одну или более ZFN, функционально связанных с промотором, активным в определенный период развития растения; интересующий ген; необязательно один или более регуляторный элемент(ы), который может быть функционально связан с интересующим геном; и одну или более расщепляемых последовательностей, распознаваемых ZFN, фланкирующих интересующий ген и один или более регуляторный элемент(ы). Экспрессия указанного вектора приводит к продукции ZFN в определенный период развития, во время которого ее функционально связанный промотор активен. Продукция ZFN в определенный период развития, во время которого активен его функционально связанный промотор, приводит к вырезанию последовательности нуклеиновой кислоты между расщепляемыми последовательностями, распознаваемыми ZFN, которая включает в себя интересующий ген и один или более регуляторный элемент(ы).

- 8 031356

Нуклеазы ZFN

В конкретных вариантах осуществления ZFN экспрессируются из молекул нуклеиновой кислоты в трансформированных растениях, чтобы управлять вырезанием последовательностей нуклеиновой кислоты в трансформированных растениях. Могут быть использованы ZFN, которые воздействуют на последовательность распознавания, сконструированную для фланкирования определенной последовательности нуклеиновой кислоты (например, трансген, интересующий ген или ген селектируемого маркера) или могут быть разработаны ZFN, которые воздействуют на встречающуюся в природе последовательность нуклеиновой кислоты, фланкирующую определенную последовательность нуклеиновой кислоты, которую нужно вырезать. Исключительная гибкость и специфичность ZFN-системы обеспечивает уровень контроля, недостижимый прежде с помощью известных ранее стратегий вырезания гена, опосредуемых рекомбиназами.

Специфичности распознавания ZFN можно легко регулировать экспериментальным путем (Wu et al. (2007) Cell. Mol. Life Sci. 64:2933-44). Рандомизация кодонов остатков, отвечающих за распознавание цинковых пальцев, обеспечивает отбор новых пальцев, которые обладают высокой аффинностью к произвольно выбранным последовательностям ДНК. Кроме того, цинковые пальцы являются естественными ДНК-связывающими молекулами, и показано, что сконструированные цинковые пальцы действуют на заданные мишени в живых клетках. Таким образом, нуклеазы на основе цинковых пальцев можно направить на специфические, но произвольные сайты распознавания.

Потребность в димеризации доменов расщепления химерных нуклеаз цинковые пальцы обеспечивает высокий уровень специфичности к последовательности. Поскольку каждый набор из трех пальцев связывается с девятью последовательными парами оснований, две химерные нуклеазы фактически требуют мишени из 18 п.н., если каждый домен цинковый палец обладает идеальной специфичностью. Предполагается, что установленная последовательность такой длины является уникальной в пределах одного генома (принимая приблизительно 10⁹ п.о.). Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21 (1): 289-97; Wu et al. (2007), выше. Кроме того, дополнительные пальцы обеспечивают повышенную специфичность, Beerli et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14628-33; Kim and Pabo (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2812-7; Liu et al. (1997) Proc, Natl. Acad, Sci. USA 94:5525-30, так что число цинковых пальцев в каждом ДНК-связывающем домене может быть увеличено для обеспечения дополнительной специфичности. Например, специфичность может быть дополнительно увеличена при использовании пары 4-пальцевых ZFN, которые распознают последовательность из 24 п. о. Urnov et al. (2005) Nature 435:646-51.

Ключевые аминокислоты ZFN, в положениях -1, 2, 3 и 6 относительно начала α-спирали, вносят наибольший вклад в специфические взаимодействия мотивов цинковых пальцев. Pavletich and Pabo (1991) Science 252: 809-17; Shi and Berg (1995) Chem. Biol. 2: 83-9. Указанные аминокислоты могут быть изменены, при сохранении оставшихся аминокислот в качестве конценсусной основной цепи, для образования ZFPs с различными и/или новыми специфичностями к последовательностям. См. , например, Choo and Klug (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11163-7; Desjarlais and Berg (1992) Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 7345-9; Desjarlais and Berg (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2256-60; Greisman and Pabo (1997) Science 275: 657-61; Isalan et al. (1998) Biochemistry 37: 12026-33; Jamieson et al. (1994) Biochemistry 33: 5689-95; Rebar and Pabo (1994) Science 263: 671-3; Segal et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2758-63; Wolfe et al. (1999) J. Mol. Biol. 285: 1917-34; Wu et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 344-8. Кроме того, могут быть сконструированы по меньшей мере две 3-пальцевые ZFN с различными специфичностями последовательностей, так что они действуют совместно при проведении расщепления. Smith et al. (2000), выше.

Подходы к дизайну и отбору при создании ZFN изобретения могут начинаться с определения одного или более подходящих мотивов ZF для распознавания специфической последовательности нуклеиновой кислоты. Альтернативно ZFN, которая распознает специфическую последовательность нуклеиновой кислоты, может быть использована для построения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей специфическую последовательность нуклеиновой кислоты (например, в которой специфическая последовательность нуклеиновой кислоты фланкирует интересующий ген) и другие элементы по необходимости. Рассматривались дизайн и различные подходы при отборе ZFP, включая метод фагового дисплея. Mani et al. (2005), выше; Durai et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33:5978-90; Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-60; Kandavelou et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:686-87; Pabo et al. (2001) Annu. Rev. Biochem. 70:313-40; Segal et al. (2003) Biochemistry 42:2137-48. Любой дизайн и/или метод отбора, известный в данной области, может быть использован для получения ZFN для применения в вариантах осуществления настоящего изобретения. Например, клеточные стратегии отбора с использованием бактериальных одногибридных и двухгибридных систем могут быть использованы для получения высокоспецифичных ZFP. Durai et al. (2006) Comb. Chem. High Throughput Screen. 9: 301-11; Hurt et al. (2003) roc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 12271-6; Jomg et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 7382-7. Высокоспецифичные ZFP также могут быть получены прямой перетасовкой доменов и клеточной селекцией, которая предлагает общий подход к оптимизации многопальцевых ZFP (Hurt et al. (2003), выше).

Множество данных, основанных на дизайне и методологиях фагового дисплея, доступно в отношении модулей ZF, которые специфически распознают триплеты 5' GNN 3' и 5' ANN 3', и в меньшей степе

- 9 031356 ни, известны предпочтения мотива ZF в отношении триплетов 5' CNN 3' и 5' TNN 3'. См., например, Durai et al. (2005), выше; Dreier et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:29466-78; Dreier (2005) J Biol. Chem. 280:35588-97; Dreier et al. (2000) J. Mol. Biol. 303:489-502; Liu et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:3850-6. В настоящее время доступны два пакета программ по дизайну ZF на основе Web-технологии (например, на zincfingertools.org). Вышеизложенное представляет практически все гены, кодируемые в геноме, восприимчивые к ZFN-опосредованному таргетированию генов. Katada and Komiyama (2009) Chembiochem. 10(8): 1279-88.

В конкретных вариантах осуществления используют ZFN, которая связывается с корецептором HIV CCR5. Perez et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26: 808-16. Указанную ZFN называют CCR5 ZFN. В конкретных вариантах осуществления кодирующая область CCR5 ZFN включает: последовательность opaque-2 с внутриядерной локализацией (Maddaloni et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17(18):7532); 1 домен связывания цинковых пальцев rl62yl, домен нуклеазы FokI (Looney et al. (1989) Gene 80: 193-208); статтерную последовательность Т2А (Mattion et al. (1996) J. Virol. 70: 8124-7), полученную из вируса Thesoa assigna; вторую последовательность opaque-2 с внутриядерной локализацией, домен связывания цинковых пальцев 168FA vE; и второй домен нуклеазы FokI.

Молекулы нуклеиновой кислоты

В некоторых вариантах осуществления способ включает скрещивание первого растения, содержащего один или более интересующих генов (которые могут придавать желаемое свойство или фенотип), а именно два или более интересующих генов, со вторым растением. Второе растение также может иметь один или более интересующих генов. Первое растение может содержать вектор, где вектор включает промотор, функционально связанный с одним или более интересующим геном (генами). Промотор может быть конститутивным или индуцибельным промотором.

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая интересующий ген(ы) может быть фланкирована сайтами распознавания ZFN. Необязательно, промотор, функционально связанный интересующим геном (генами), и любые дополнительные последовательности нуклеиновой кислоты (например, регуляторные последовательности), также могут быть фланкированы сайтами распознавания ZFN. Второе растение может содержать другой вектор, который может включать в себя тканеспецифический промотор или специфичный для стадии развития промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей ZFN. Векторы могут быть стабильно интегрированы в геномы обоих растений. После скрещивания первого и второго растений, тканеспецифический промотор или специфичный для стадии развития промотор специфически запускает экспрессию ZFN в получаемом потомстве такого скрещивания. Экспрессия ZFN в этом потомстве приводит к вырезанию последовательностей нуклеиновой кислоты, фланкированных сайтами распознавания ZFN, тем самым ослабляя или исключая интересующий ген, и необязательно дополнительные последовательности (такие как гены селектируемого маркера) в специфических тканях и/или стадиях развития потомства. В некоторых вариантах осуществления сайты распознавания ZFN могут быть дополнительно фланкированы гомологичными последовательностями нуклеиновой кислоты, чтобы в дальнейшем способствовать гомологичной рекомбинации ДНК.

Интересующий ген обычно будет функционально связан с одним или более промоторами растения, запускающими экспрессию гена в количестве, достаточном, чтобы обеспечить желаемое свойство или фенотип. Промоторы, подходящие для этого и для других применений, хорошо известны в данной области техники. Неограничивающие примеры, описывающие такие промоторы, включают патенты США № 6437217 (промотор кукурузы RS81); № 5641876 (промотор актина риса); № 6426446 (промотор кукурузы RS324); 6429362 (промотор кукурузы PR-1); 6232526 (промотор кукурузы A3); 6177611 (конститутивные промоторы кукурузы); 5322938, 5352605, 5359142 и 5530196 (промотор 35S); 6433252 (промотор олеозина L3 кукурузы); 6429357 (промотор актина 2 риса и интрон актина 2 риса); 5837848 (промотор, специфичный для корней); 6294714 (индуцируемые светом промоторы); 6140078 (индуцируемые солями промоторы); 6252138 (индуцируемые патогеном промоторы); 6175060 (индуцируемые дефицитом фосфора промоторы); 6388170 (двунаправленные промоторы); 6635806 (промотор гамма-коиксина); и патентную заявку США, серийный № 09/757089 (промотор альдолазы хлоропластов кукурузы).

Дополнительные промоторы включают промотор нопалинсинтазы (NOS) (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (16):5745-9); промотор октопинсинтазы (OCS) (которые содержатся в опухольиндуцирующих плазмидах Agrobacterium tumefaciens); промоторы колимовируса, такие как промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 19S (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); промотор CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-2; промотор вируса мозаики норичника 35S (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84(19):6624-8); промотор сахарозосинтазы (Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); промотор комплекса гена R (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1: 1175-83); промотор гена, кодирующего белок, связывающийся с хлорофиллом a/b; CaMV35S (патенты США № 5322938, 5352605, 5359142 и 5530196); FMV35S (патенты США № 6051753 и 5378619); промотор PC1SV (патент США № 5850019); промотор SCP1 (патент США № 6677503); и промоторы AGRtu.nos (номер доступа GenBank V00087; Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. (1983) Nature 304: 184-7) и т.п.

- 10 031356

Дополнительные генетические элементы, которые необязательно могут быть функционально связаны с интересующим геном, включают последовательности, кодирующие транзитные пептиды. Например, показано, что включение подходящего транзитного пептида хлоропласта, такого как A. thaliana EPSPS СТР (Klee et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210: 437-42), и Petunia hybrida EPSPS CTP (della-Cioppa et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6873-7) направляет гетерологичные последовательности белков EPSPS в хлоропласты в трансгенных растениях. Дикамба-монооксигеназа (DMO) также может быть нацелена на хлоропласты, как описано в международной РСТ публикации № WO 2008/105890.

Дополнительные генетические элементы, которые необязательно могут быть функционально связаны с интересующим геном, также включают 5'-UTR, расположенную между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью, которая работает как лидерная последовательность при трансляции. Лидерная последовательность трансляции в полностью процессированной мРНК в 3'-5' направлении от стартовой последовательности трансляции. Лидерная последовательность трансляции может воздействовать на процессинг первичного транскрипта мРНК, на стабильность мРНК, и/или эффективность трансляции. Примеры лидерных последовательностей трансляции включают лидеров белков теплового шока кукурузы и петуньи (патент США № 5362865), лидеры белков оболочки растительных вирусов, лидеры растительного фермента rubisco и другие. См., например, Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3): 225-36.

Неограничивающие примеры 5' UTR включают GmHsp (патент США № 5659122); PhDnaK (патент США № 5362865); AtAntl; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64: 1590-7); и AGRtunos (номер доступа GenBank V00087; и Bevan et al. (1983) Nature 304: 184-7).

Дополнительные генетические элементы, которые необязательно могут быть функционально связаны с интересующим геном, также включают 3'-нетранслируемые последовательности, 3'-области терминации транскрипции или области полиаденилирования. Они представляют собой генетические элементы, расположенные в 5'-3' направлении полинуклеотидной молекулы, и включают полинуклеотиды, которые обеспечивают сигнал полиаденилирования, и/или другие регуляторные сигналы, способные влиять на транскрипцию, процессинг мРНК или экспрессию генов. Сигнал полиаденилирования функционирует в растениях для добавления аденилатнуклеотидов к 3'-концу предшественника мРНК. Последовательность полиаденилирования может быть получена из природного гена, из множества растительных генов из генов Т-ДНК. Неограничивающим примером 3'-области терминации транскрипции является 3'-область нопалинсинтазы (nos 3'; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7). Пример применения различных 3'-нетранслируемых областей приводится в Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-80. Неограничивающие примеры сигналов полиаденилирования включают сигнал из гена aPisum sativum RbcS2 (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9) и AGRtu.nos (Номер доступа GenBank E01312).

Трансформация растений

Любой из методов, известных в данной области, для введения трансгенов в растения может быть использован для получения трансформированного растения согласно изобретению.

Предполагается, что подходящие методы трансформации растений включают практически любой метод, с помощью которого ДНК может быть введена в клетку, например: с помощью электропорации, как проиллюстрировано в патенте США № 5384253; с помощью бомбардировки микрочастицами, как проиллюстрировано в патентах США № 5015580, 5550318, 5538880, 6160208, 6399861, и 6403865; опосредованную Agrobacterium трансформацию, как проиллюстрировано в патентах США № 5635055, 5824877, 5591616; 5981840 и 6384301; и трансформацию протопластов, как описано в патенте США № 5508184 и т.д. Благодаря применению технологий, таких как указанные, клетки практически любых видов растений могут быть стабильно трансформированы, и указанные клетки могут развиваться в трансгенные растения с помощью технологий, известных специалистам в данной области. Технологии, которые могут быть особенно полезны в контексте трансформации хлопка, раскрываются в патенте США № 5846797, 5159135, 5004863 и 6624344; технологии трансформации растений рода Brassica в частности раскрываются, например, в патенте США № 5750871; технологии трансформации soybean раскрываются, например, в патенте США № 6384301; и технологии трансформации кукурузы раскрываются, например, в патенте США № 7060876, патенте США № 5591616 и в международной публикации РСТ WO 95/06722.

После осуществления доставки экзогенной ДНК реципиентным клеткам, следующие стадии обычно имеют отношение к идентификации трансформированных клеток для дальнейшего культивирования и регенерации растений. С целью увеличения способность идентифицировать трансформанты, может быть желательно применение гена селектируемого или скринируемого маркера с вектором трансформации, используемым для создания трансформанта. В таком случае, потенциально трансформированная клеточная популяция может быть проверена путем воздействия на клетки селективного агента или агентов, или может быть проведен скрининг клеток в отношении желаемого признака маркерного гена. Клетки, которые пережили воздействие селективного агента, или клетки, которые считали положительными в скрининговом тесте, могут быть культивированы в среде, которая поддерживает регенерацию растений. В некоторых вариантах осуществления, любая культуральная среда, подходящая для растительной ткани (например, среды MS и N6) может быть модифицирована включением других веществ, таких как регуляторы роста. Ткань можно поддерживать на основной среде с регуляторами роста до тех пор, пока дос

- 11 031356 тупно достаточное количество ткани для начала попыток по регенерации растения, или для последующих повторных раундов ручной селекции, до тех пор пока морфология ткани подходит для регенерации (например, по меньшей мере 2 недели), затем переносят на среду, благоприятствующую образованию ростка. Культуры переносят периодически, до тех пор, пока не произойдет достаточного формирования ростков. После того как ростки сформируются, их переносят на среду, благоприятную для образования корней. После формирования достаточной корневой системы растения могут быть пересажены в почву для дальнейшего роста и развития.

Для подтверждения присутствия интересующего гена (например, трансгена) в регенерированных растениях могут быть проведены различные тесты. Такие тесты включают, например: молекулярнобиологические тесты, такие как саузерн-блоттинг и нозерн-блоттинг и ПЦР; биохимические тесты, такие как определение присутствия белкового продукта, например, иммунологическими методами (ELISA и/или вестерн-блоттинги) или с помощью ферментативной функции; анализы частей растений, такие как анализы листьев и корней; и анализ фенотипа целого регенерированного растения.

Культивирование и применение трансгенных растений

Растение, в котором обнаруживается вырезание нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, может обладать одним или более желаемыми свойствами, например, два или более желаемых свойств. Такие свойства могут включать, например: устойчивость к насекомым и другим вредителям и болезнетворным агентам; устойчивость к гербицидам; повышенная устойчивость, урожайность, или сохраняемость; устойчивость к воздействиям внешней среды; фармацевтическую продукцию; производство промышленного продукта; и улучшенные пищевые качества. Желаемые свойства могут обеспечиваться генами, фланкированными последовательностью нуклеиновой кислоты, распознаваемой ZFN, экспрессированной в растении, проявляющем желаемые свойства, так что экспрессия ZFN в растении снижает или устраняет передачу свойства, с помощью ограничения лежащего в его основе гена, другим растениям или последующим поколениям растения. Таким образом, в одном варианте осуществления желаемое свойство может присутствовать благодаря наличию трансгена (трансгенов) в растении, который может быть фланкирован последовательностями распознавания ZFN. В дополнительном варианте осуществления желаемое свойство можно получить с помощью соответствующей селекции, любое свойство может обеспечиваться одним или более генами, фланкированными последовательностями распознавания ZFN.

Растение, в котором проявляется вырезание нуклеиновой кислоты согласно изобретению, может быть любым растением, способным к трансформации молекулой нуклеиновой кислоты изобретения. Соответственно, растение может быть двудольным растением или однодольным растением. Неограничивающие примеры двудольных растений, применимых в настоящих способах, включают люцерну, фасоль, брокколи, капусту, морковь, цветную капусту, сельдерей, китайскую капусту, хлопок, огурец, баклажан, салат, дыню, горох, перец, арахис, картофель, тыкву, редис, рапс, шпинат, сою, кабачок, сахарную свеклу, подсолнечник, табак, томат и арбуз.

Неограничивающие примеры однодольных растений применимых в настоящих способах, включают кукурузу, лук, рис, сорго, пшеницу, рожь, пшено, сахарный тростник, овес, тритикале, просо прутьевидное и газонную траву.

Растения, в которых обнаруживается вырезание нуклеиновой кислоты согласно изобретению, можно использовать или культивировать любым образом, там, где передача вырезанной последовательности нуклеиновой кислоты другим растениям является нежелательной. Соответственно, GM растения, которые были разработаны, inter alia, таким образом, что они обладают одним или более желаемыми свойствами, могут быть трансформированы молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и посажены и культивированы любым методом, известным специалистам в данной области.

Примеры

Нижеследующие примеры включены для иллюстрации вариантов осуществления изобретения. Специалистам в данной области ясно, что методики, раскрытые в Примерах, представляют собой методики, раскрытые авторами изобретения для правильного функционирования изобретения на практике. Однако специалистам в данной области в свете настоящего раскрытия будет понятно, что в конкретные варианты осуществления, которые раскрываются, могут быть внесены многочисленные изменения, и с получением такого же или сходного результата без нарушения объема изобретения. Более подробно, очевидно, что определенные агенты, которые связаны химически и физиологически, могут использоваться вместо агентов, описанных здесь, в то же время будут получены аналогичные или сходные результаты. Все такие сходные заместители и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, считают входящими в объем изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.

Пример I. Разработка и создание плазмид

Разрабатывали и создавали целевую конструкцию, содержащую кассету экспрессии целевого репортерного гена, фланкированную участками связывания цинковых пальцев (pDAS5380), и эксцизионную конструкцию, содержащую кассету экспрессии гена нуклеазы цинковые пальцы (pDAS5381). Разрабатывали конструкции, которыми трансформировали по отдельности растения табака. Вырезание целевого репортерного гена осуществляли путем скрещивания двух линий табака, где функциональная

- 12 031356 нуклеаза цинковые пальцы распознавала сайты связывания цинковых пальцев, фланкирующие кассету целевого репортерного гена, и расщепляла геномную ДНК. Скрещивание линий растений, содержащих конструкцию целевого репортерного гена, с линией растения, содержащего эксцизионную конструкцию, приводило к удалению/делеции репортерного гена генома растения.

Разработка и создание целевой конструкции pDAS5380 pDAS5380 (фиг. 1) создавали в виде бинарного плазмидного вектора. Данная конструкция содержала следующие кассеты экспрессии единицы транскрипции растения (PTU) и генетические элементы: RB7 MAR ((участок прикрепления к ядерному матриксу (Thompson et al. (1991) WO 9727207)) :: CCR5-связывающий участок, повторяющийся 4х (Perez et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:808-16) :: AtuORFl 3' UTR (открытая рамка считывания-1 Agrobacterium tumefaciens, 3'-нетранслируемая область (Huang et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 1814-22))/GUS (β-Dглюкуронидаза (Jefferson (1989) Nature 342:837-8))/AtUbi10 (промотор Arabidopsis thatiana убиквитин-10 (Callis et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:12486-93)) :: CCR5-связывающий участок, повторяющийся 4х : : AtAct2 (промотор актина-2 A. thaliana (An et al. (1996) Plant J. 10: 107-21))/Turbo GFP (зеленый флуоресцентный белок турбо-грин (Evdokimov et al. (2006) EMBO Rep. 7 (10) :1006-12))/Atu ORF23 3' UTR (открытая рамка считывания -23 A tumefaciens, 3' нетранслируемая область (Gelvin et al (1987) EP222493)) :: AtUbi10/PAT (фосфинотрицинацетилтрансфераза (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37))/Atu ORF1 3' UTR. Кассету экспрессии PTU GUS помещали в trans-положение по отношению к кассетам экспрессии GFP и PTU PAT. Кроме того, кассету экспрессии PTU GUS фланкировали сайтами связывания нуклеазы цинковые пальцы CCR5. Эту последовательность (SEQ ID NO: 1) повторяли 4х непосредственно слева и справа от кассеты экспрессии PTU GUS. Локализации сайтов связывания цинковых пальцев обозначены на фиг. 1 как САЙТ СВЯЗЫВАНИЯ CCR5. Указанные сайты распознаются и связываются белком нуклеазы цинковые пальцы, кодированным эксцизионной конструкцией pDAS5381. Сборку указанного бинарного вектора выполняли с применением стандартных технологий молекулярной биологии. Структуру получаемой плазмиды подтверждали путем расщепления ферментами рестрикции и секвенированием ДНК.

Разработка и создание эксцизионной конструкции pDAS5381

Бинарную плазмиду, содержащую ген нуклеазы цинковые пальцы, которая предназначена специально для связывания с сайтом связывания CCR5 (SEQ ID NO:2), разрабатывали и создавали, как описано Perez et al, (2008) Nature Biotechnol. 26:808-16. Конструкция pDAS53 81 (фиг. 2) содержит следующие кассеты экспрессии PTU: CsVMV (промотор вируса мозаики кассавы (Verdaguer et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31: 1129-39))/кодирующая область нуклеазы цинковые пальцы CCR5 (содержащая: последовательность opaque-2 внутриядерной локализации (Maddaloni et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17 (18):7532); 1 домен связывания цинковых пальцев rl62yl; домен нуклеазы FokI (Looney et al. (1989) Gene 80: 193-208); статтерная последовательность Т2А (Mattion et al. (1996) J. Virol. 70:8124-7) полученная из вируса Thesoa assigna; вторая последовательность opaque-2 внутриядерной локализации; домен связывания цинковых пальцев 168GA vE; и второй домен нуклеазы FokI)/Atu ORF23 3' UTR :: промотор AtUbi3 (промотор убиквинтина-3 A. thaliana (Callis et al. (1995) Genetics 139 (2): 921-39))/HPTII (гигромицин фосфотрансфераза II (Gritz et al. (1983) Gene 25(2-3): 179-88))/Atu ORF24 3' UTR (открытая рамка считывания-24 A. tumefaciens, 3' нетранслируемая область (Gelvin et al. (1987) EP222493)). Сборку указанного бинарного вектора выполняли с применением стандартных технологий молекулярной биологии. Структуру получаемой плазмиды подтверждали путем расщепления ферментами рестрикции и секвенированием ДНК.

Пример II. Agrobacterium-опосредованная трансформация растений Трансформация Agrobacterium с помощью pDAS5380 и pDAS5381

Электрокомпетентные клетки A. tumefaciens (штамм LBA4404) получали из Invitrogen (Carlsbad, CA) и трансформировали с использованием метода электропорации по материалам Weigel and Glazebrook (2002) How to Transform Arabidopsis, in Arabidopsis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, U.S.A. Трансформированные колонии получали на пептонной среде с дрожжевым экстрактом (YEP), содержащей спектиномицин (50 мкг/мл) и стрептомицин (125 мкг/мл), и подтверждали их структуру путем расщепления ферментами рестрикции. Клоны, которые проявляли картины распределения полос, соответствующие действию ферментов рестрикции, сохраняли в виде исходных культур в глицерине при -80°С.

Agrobacterium-опосредованная трансформация Nicotiana tabacum

Листовые диски табака (cv. Petit Havana) трансформировали с применением A. tumefaciens (штамм LBA4404), содержащей pDAS5381 и pDAS5380. Отдельные колонии Agrobacterium, содержащие указанные плазмиды, инокулировали в 4 мл среды YEP, содержащей спектиномицин (50 мкг/мл) и стрептомицин (125 мкг/мл) и инкубировали в течение ночи при 28°С на шейкере при 190 об/мин. Затем 4 мл культуры для посева использовали для инокуляции 25 мл культуры среды YEP, содержащей спектиномицин (50 мкг/мл) и стрептомицин (125 мкг/мл), выращиваемой в 125 мл колбе Эрленмейера с отводами. Культуру инкубировали при 28°С с перемешиванием при 190 об/мин до достижения значения OD₆₀₀ ~1,2. Десять мл суспензии Agrobacterium помещали в стерильные чашки Петри.

Двадцать пять свежесрезанных листовых дисков (0,5 см²), срезанных с растений, выращенных в асептических условиях на среде MS (Phytotechnology Labs, Shawnee Mission, KS, #M524) с 30 г/л сахаро

- 13 031356 зы в PhytaTrays™ (Sigma, St. Louis, МО) вымачивали в 10 мл суточной культуры Agrobacterium в течение нескольких минут, промокали насухо стерильной фильтровальной бумагой и затем помещали на ту же самую среду с добавлением 1 мг/л индолилуксусной кислоты и 1 мг/л бензиламинопурина. Через 48 ч совместного культивирования листовые диски, культивированные совместно с Agrobacterium, содержащей pDAS5380, переносили на ту же самую среду с 5 мг/л Basta® и 250 мг/л цефотаксима. Листовые диски, культивированные совместно с Agrobacterium, содержащей pDAS5381, переносили на ту же самую среду с 10 мг/л гигромицина и 250 мг/л цефотаксима. Через 3 недели отдельные ростки Т₀ переносили на среду MS с 10 мг/л Bast® и 250 мг/л цефотаксима в случае pDAS5380 или на среду MS с 10 мг/л гигромицина и 250 мг/л цефотаксима в случае pDAS5381, на следующие 3 недели перед пересадкой в почву и переносом в теплицу.

Число копий, полноразмерная PTU и анализ экспрессии растений Т₀

Проверка числа копий

Тесты Invader® и тесты с применением гидролизных зондов осуществляли для отбора образцов Basta®-устойчивых растений, чтобы идентифицировать растения, которые содержали в себе однокопийную интеграцию Т-ДНК в pDAS5380 и pDAS5381. Проводили подробный анализ с применением праймеров и зондов, специфичных к кассетам экспрессии генов. Однокопийные события идентифицировали для дополнительного анализа.

Образцы тканей собирали в 96-луночные планшеты и лиофилизировали в течение 2 дней. Мацерацию тканей выполняли с помощью измельчителя тканей Kleco™ и вольфрамовых гранул (Visalia, CA). После мацерации тканей геномную ДНК выделяли в высокопроизводительном формате с применением набора DNeasy 96 Plant kit™ (Qiagen, Germantown, MD) в соответствии с протоколом производителя. Определяли количество геномной ДНК с помощью набора реагентов Quant-IT Pico Green DNA assay kit™ (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). Количество геномной ДНК доводили до значения 9 нг/мкл, для теста Invader® или до значения 5 нг/мкл для теста с применением гидролизных зондов с использованием автоматического пробоотборника Biorobot3000™ (Qiagen, Germantown, MD).

Тесты Custom Invader® были разработаны для анализа гена

PAT в табаке компанией Hologic (Madison, WI). Образцы геномной ДНК (7,5 мкл при 9 нг/мкл) вначале денатурировали в формате 96-луночного планшета инкубацией при 95°С в течение 10 мин и затем охлаждали на льду. Затем 7,5 мкл реакционной смеси (3 мкл смеси зондов для pat и внутреннего референсного гена (фенилаланин-аммоний-лиаза (palA); GenBank ID: AB008199), 3,5 мкл смеси Cleavase® XI FRET и 1 мкл раствора Cleavase® XI Enzyme/MgCl2) добавляли в каждую лунку и образцы покрывали минеральным маслом. Планшеты плотно закрывали и инкубировали при 63°С в течение 1 ч в термоциклере BioRad Tetrad®. Планшеты охлаждали до комнатной температуры перед считыванием с помощью флуоресцентного планшетного ридера. Все планшеты содержали 1-копийные, 2-копийные и 4-копийные стандарты, а также контрольные образцы дикого типа и контрольные лунки, не содержащие образца. Считывание показаний производили для каналов FAM (λ 485-528 нм) и RED (λ 560-620 нм) и из этих показаний определяли перегиб выше нуля (т.е. фон) каждого канала для каждого образца путем деления необработанного сигнала образца на необработанный сигнал без матрицы. На основе этих данных строили калибровочную кривую и определяли максимальное соответствие с помощью линейного регрессивного анализа. Используя параметры, установленные из указанного соответствия, затем определяли очевидное подходящее число копий для каждого образца.

Определение числа копий трансгена в тесте с применением гидролизных зондов, аналогичном тесту TaqMan®, осуществляли с помощью ПЦР в режиме реального времени с применением системы LightCycler®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Тесты осуществляли для HPTII, PAT и внутреннего референсного гена фенилаланин-аммоний-лиазы (palA) с применением программного обеспечения Probe Design Software 2.0 LightCycler®. Для проведения амплификации готовили мастер-микс зондов LightCycler®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) в 1x конечной концентрации в объеме 10 мкл мультиплексной реакционной смеси, содержащей 0,4 мкМ каждого праймера и 0,2 мкМ каждого зонда (табл. 1). Осуществляли двухстадийную реакцию амплификации с удлинением при 58°С в течение 38 с с получением флуоресценции. Все образцы исследовали в триплетах и средние значения пороговых циклов (Ct) использовали для анализа каждого образца. Анализ результатов, полученных с помощью ПЦР в реальном режиме времени, выполняли с применением программного обеспечения LightCycler® версия 1.5 с применением модуля квантования относительных значений и основанного на методе ACt. С этой целью образец геномной ДНК однокопийного калибратора и известный двухкопийный контроль включали в каждую серию измерений (идентичные калибратору и контролю, которые применяли в тестах Invader® выше).

- 14 031356

Таблица 1. Информация о праймерах и зондах для проведения теста с применением гидролизных зондов для PAT, PAT, HPTII и внутреннего референсного гена (palA)_____________

Название праймера	Последовательность	Обнаружение
TQPATS	SEQ ID N0:3; 5' ACAAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGT 3'
TQPATA	SEQ ID N0:4; 5' CTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACAGT 3'
TQPATFQ	Seq ID N0:5; 5 ' CY5-GGTGTTGTGGCTGGTATTGCTTACGCTGG-BHQ2 3 '	Cy5
TQPALS	SEQ ID N0:6; 5' TACTATGACTTGATGTTGTGTGGTGACTGA 3'
TQPALA	SEQ ID N0:7; 5' GAGCGGTCTAAATTCCGACCCTTATTTC 3'
TQPALFQ	SEQ ID N0:8; 5' 6FAM-AAACGATGGCAGGAGTGCCCTTTTTCTATCAATBHQ1 3 '	6 FAM
HPT2S	SEQ ID N0:9; 5' ACACTACATGGCGTGATTT 3'
НРТ2А	SEQ ID N0:10; 5' AGCATCAGCTCATCGAGA 3'
HPTFQ	SEQ ID N0:11; 5' Cy5/ ACTGTGATGGACGACACCG/3BHQ2/ 3'	Cy5

Анализ полноразмерной PTU с использованием Саузерн-блоттинга

Саузерн-блоттинг использовали для определения паттерна интеграции вставляемого фрагмента ДНК и идентификации событий pDAS5380 и pDAS5381, которые содержали полноразмерную PTU. Получали результаты, чтобы показать интеграцию и целостность трансгенов, вставленных в геном табака. Результаты Саузерн-блоттинга использовали, чтобы идентифицировать простую интеграцию интактной копии Т-ДНК из pDAS5380 и pDAS5381. Подробный Саузерн-блоттинг осуществляли с применением зондов, специфичных к кассетам экспрессии генов. С помощью гибридизации указанных зондов с геномной ДНК, которая была расщеплена специфическими ферментами рестрикции, идентифицировали фрагменты геномной ДНК с молекулярными весами, характер распределения которых можно анализировать с целью выявления событий для продвижения в T₁. Указанные анализы также показали, что фрагмент плазмиды был вставлен в геномную ДНК табака без реаранжировок PTU.

Образцы тканей собирали в 50 мл конические пробирки (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) и лиофилизировали в течение 2 дней. Мацерацию тканей осуществляли с помощью мельницы для измельчения тканей и вольфрамовых шариков. После мацерации ткани геномную ДНК выделяли с использованием набора DNeasy™ Plant Maxi Kit (Qiagen, Germantown, MD) согласно протоколу производителя. Очищенную геномную ДНК осаждали и ресуспендировали в 500 мкл буфера ТЕ. Геномную ДНК затем очищали с применением набора Qiagen Genomic Tips™. Количество геномной ДНК определяли с помощью набора реактивов Quant-IT Pico Green™ (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). Количество геномной ДНК доводили до 8 мкг в соответствующем объеме.

Для каждого образца 8 мкг геномной ДНК тщательно расщепляли ферментами рестрикции Mfel и Nsil (New England Biolabs, Beverley, MA). Образцы инкубировали при 37°С в течение ночи. Расщепленную ДНК концентрировали осаждением раствором Quick Precipitation Solution™ (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) в соответствии с протоколом, предлагаемым производителем. Геномную ДНК затем ресуспендировали в 25 мкл воды при 65°С в течение 1 ч. Ресуспендированные образцы помещали в 0,8% агарозный гель, приготовленный в 1х TAE, и проводили электрофорез в течение ночи при 1,1 В/см в 1х TAE буфере. Гель последовательно подвергали денатурации (0,2 М NaOH/0,6 М NaCl) в течение 30 мин и нейтрализации (0,5 М Tris-HCl (pH 7,5)/1,5 М NaCl) в течение 30 мин. Перенос фрагментов ДНК осуществляли путем пассивного протекания 20х растворов SSC в течение ночи через гель на обработанную Immobilon™ NY+ блоттинг-мембрану (Millipore, Billerica, MA) с использованием фитиля из хроматографической бумаги и бумажных полотенец. После переноса мембраны быстро промывали 2х SSC, сшивали с Stratalinker™ 1800 (Stratagene, LaJolla, CA), и высушивали в вакууме при 80°С в течение 3 ч.

Блоты инкубировали с раствором для предварительной гибридизации (Perfect Hyb plus™, Sigma, St. Louis, МО) в течение 1 ч при 65°С в стеклянных роллерных флаконах с применением инкубатора для гибридизации, модель 400 (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA). Зонды готовили из ПЦР-фрагмента, содержащего полную кодирующую последовательность. Ампликон ПЦР очищали с применением набора для экстракции из геля QIAEX II™ и метили ³²P-dCTP с помощью набора для мечения Random RT Prime IT™ (Stratagene, La Jolla, CA). Блоты гибридизировали в течение ночи при 65°С с денатурированным зондом, добавленным непосредственно в гибридизационный буфер приблизительно до 2 млн импульсов

- 15 031356 на блот на мл. После проведения гибридизации блоты последовательно отмывали при 65°С 0,1х SSC/0,1% SDS в течение 40 мин. В заключение блоты экспонировали на хемилюминесцентную пленку, (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) и получали изображение с применением системы визуализации Molecular Dynamics Storm 860™.

Ожидаемые и наблюдаемые размеры фрагментов при использовании определенного расщепления и зонда, исходя из известных сайтов рестрикции ферментами фрагментов pDAS5380 или pDAS5381, представлены на фиг. 3 и 4. Анализы Саузерн-блоттинга, выполненные в данном исследовании, использовали для идентификации событий, которые содержали полноразмерные интактные PTU из плазмид pDAS5380 или pDAS5381, которые вставляли в геном табака (фиг. 3 и 4 соответственно).

Проверка экспрессии GUS

Чтобы проверить содержали ли трансгенные растения pDAS5380 функциональную кассету экспрессии PTU GUS, образцы листьев собирали и проводили гистохимическое окрашивание для определения экспрессии GUS. Листовые диски (-0,25 см²) резали и помещали в 24-луночный планшет (1 листовой диск на лунку), содержащий 250 мкл реакционного раствора GUS (Jefferson (1989) Nature 342: 837-8). 24луночный планшет обертывали пленкой Nescofilm® (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) и инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Через 24 ч реакционный раствор GUS удаляли из каждой лунки и заменяли 250 мкл 100% этанола. Планшет обертывали пленкой Nescofilm® и инкубировали при комнатной температуре в течение 2-3 ч. Этанол удаляли и заменяли свежим этанолом. Листовые диски затем осматривали под препаровальной лупой. Листовые диски, которые были окрашены в голубой цвет, оценивали, как содержащие функциональную кассету экспрессии GUS PTU.

Количественный анализ экспрессии GFP

Анализировали экспрессию GFP в образцах листьев табака с использованием ELISA. Наносили на планшеты очищенное кроличье антитело против GFP на ночь при 4°С. В день проведения анализа планшеты блокировали 0,5% BSA в PBST. Дублированные образцы листьев экстрагировали шаровым измельчением частей замороженных листьев с 2 бусинами из нержавеющей стали в гомогенизаторе Kleco™ в течение 3 мин при максимальной скорости. Образцы центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин и собирали супернатанты. Выделенные образцы наносили на планшеты для проведения теста ELISA в разведениях 1:5 и 1:50. На каждом планшете строили калибровочную кривую для рекомбинантного GFP Е. coli с концентрациями от 12,5 до 0,195 нг/мл.

Стандарты и образцы инкубировали на планшетах для проведения теста ELISA в течение 1 ч. Планшеты отмывали и добавляли пероксидазу хрена, конъюгированную с кроличьим антителом против GFP. После 1 ч инкубации планшеты отмывали и добавляли субстрат. После развития окрашивания останавливали реакцию добавлением H₂SO₄. Оптическую плотность определяли с помощью планшетного ридера при 450 нм с фильтром сравнения 650 нм. Квадратичную стандартную кривую строили путем нанесения по точкам концентрации стандарта Е. coli в зависимости от OD.

Концентрации в исследуемых образцах определяли с помощью линейной регрессии.

Селекция растений Т₀ для продукции Tj-мишеней

Всего регенерировали 68 Basta®-устойчивых, GUS+/GFP+ растений и обнаружили, что 38 растений содержали 1-2 трансгенных копии, исходя из результатов теста PAT Invader®.

Саузерн-блоттинг выявил 14 однокопийных событий, из которых 8 показали полосы, которые соответствовали интактным PTU: PAT, GUS и GFP. Три события pDAS5380, демонстрирующие однокопийную, полноразмерную PTU, и экспрессирующие GUS и GFP, pDAS5380-3, pDAS5380-18 и pDAS5380-46, самоопыляли для получения семян T₁.

Количественный анализ экспрессии FokI

Использовали количественную ПЦР в реальном времени (ПЦП-РВ) для количественного определения уровня экспрессии мРНК нуклеазы цинковые пальцы в растениях табака Т₀, трансформированных pDAS5381. Анализ осуществляли для количественного определения относительного уровня экспрессии мРНК FokI в образцах листьев табака, при нормализации указанных уровней относительно уровня экспрессии мРНК, полученного для входящей мРНК. Нормализация значения мРНК FokI относительно общей мРНК позволяет сравнить уровень экспрессии FokI в различных образцах и может быть использована для выявления событий, которые, по-видимому, являются высоко экспрессирующими. Относительная экспрессия ZFN приводится в табл. 1.1.

- 16 031356

Таблица 1.1. Количественное определение уровня экспрессии мРНК нуклеазы цинковые пальцы в растениях табака Т₀, трансформированных pDAS5381. *qRT-PCR для мРНК FokI, нормализованной по общей РНК. Среднее значение 4 повторных проб.______________________________

Событие ТО	Относительная экспрессия ZFN*	Стандартное отклонение	% CV
PDAS5381-14	3,21	1,56	36, 0
PDAS5381-18	41,30	1,56	3,8
PDAS5381-30	8,39	0,86	10,3
PDAS5381-39	17,70	1,92	10, 8
PDAS5381-49	47,55	1,79	3,8
PDAS5381-54	4,45	0,57	12,8
PDAS5381-56	11,73	2,5	21,3

Материал листьев растений табака T₀, которые были трансформированы pDAS5381, собирали и помещали на лед. Общую РНК выделяли с применением набора Qiagen's RNeasy® Plant Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD). Общую мРНК обрабатывали ДНКазой, не содержащей РНКазу, согласно рекомендации производителя, чтобы удалить любое загрязнение ДНК, которая может амплифицироваться во время проведения количественной ПЦР-РВ. Синтез первой цепи проводили согласно инструкциям производителя фермента обратной транскриптазы Superscript III™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) и подавали с применением случайных гексамеров. Синтезированные цепи кДНК разводили в воде в отношениях 1:10 и 1:50. Каждую аликвоту хранили при -20°С.

Реакцию ПЦР-РВ осуществляли следующим образом: прямой праймер FokI_UPL_F (SEQ ID NO: 12), обратный праймер FokI_UPL_R (SEQ ID NO: 13), зонд UPL#130 (каталожный #04693663001, Roche, Indianapolis, IN), 1x LC480 буфер для зондов (Roche Diagnostic, Indianapolis, IN), и 1,5 мкл синтезированной кДНК в 15 мкл реакционной смеси. Делали серийные разведения синтезированной кДНК, проводили анализ в повторах. Коктельную смесь амплифицировали с применением набора зондов LightCycler® 480 Probes Master kit #04707494001 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Размечали и подписывали 96луночный микропланшет, добавляли по 13,5 мкл реакционной смеси в лунку. Самоклеющуюся пленку осторожно приклеивали к микропланшету. Планшет центрифугировали в течение 1 мин при 3000 об/мин в центрифуге для микропланшетов Qiagen. Самоклеющуюся пленку удаляли и добавляли 1,5 мкл раствора размороженных, разведенных синтезированных цепей кДНК. Самоклеющуюся пленку прочно прикрепляли к планшету и центрифугировали как описано ранее. Программу ПС запускали следующим образом: i) активация, 95°С в течение 5 мин; ii) денатурация, 95°С в течение 10 с (@ 4,8°С/с); iii) отжиг/удлинение, 60°С в течение 25 с (@ 2,5°С/с); iv) получение, 72°С в течение 1 с (@ 4,8°С/с); стадии iiiv повторяли 45 раз; vi) охлаждение 38°С в течение 5 с.

Анализ ПЦР-РВ для количественного определения экспрессии мРНК внутреннего референсного гена выполняли в качестве другого метода для нормализации экспрессии мРНК нуклеазы цинковые пальцы. Реакцию ПЦР-РВ для актина осуществляли следующим образом: прямой праймер BY2ACT89S (SEQ ID NO: 14), обратный праймер BY2ACT89A (SEQ ID NO: 15), зонд BYACTFQ (SEQ ID NO: 18), 1x LC480 буфер для зондов, и 2,0 мкл синтезированной кДНК, в 10 мкл реакционной смеси. Делали серийные разведения синтезированной кДНК, проводили анализ в повторах. Кроме того, добавляли 2 мкл стандартов плазмидной ДНК с известным количеством копий, чтобы разделить лунки в сериях разведений от самой низкой до самой высокой концентраций, и эти стандарты сравнивали с кДНК актина (синтезированной из общей мРНК), чтобы определить количество числа копий. Серии стандартов числа копий ДНК актина создавали клонированием целевого ампликона в плазмиду pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), и получением серий разведений, приготовленных в буфере для разведения (10 мМ Tris-HCl [рН 8,0], 100 мкг/мл тРНК дрожжей), для определения количества числа копий. Коктельную смесь амплифицировали с применением набора зондов LightCycler® 480 Probes Master kit #04707494001 (Roche Diagnostics, USA). Размечали и подписывали 96-луночный микропланшет, и добавляли и по 8,0 мкл реакционной смеси в лунку. Самоклеющуюся пленку осторожно приклеивали к микропланшету. Планшет центрифугировали в течение 1 мин при 3000 об/мин в центрифуге для микропланшетов Qiagen. Самоклеющуюся пленку удаляли и добавляли 2,0 мкл раствора размороженных, разведенных синтезированных цепей кДНК или плазмидной ДНК. Самоклеющуюся пленку прочно прикрепляли к планшету и центрифугировали, как описано ранее. Программу ПС запускали следующим образом: i) активация, 95°С в течение 10 мин; ii) денатурация, 95°С в течение 10 с (@ 4,8°С/с); iii) отжиг/удлинение, 56°С в течение 40 с (@ 2,5°С/с); iv) получение, 72°С в течение 1 с (@ 4,8°С/с); стадии ii-iv повторяли 45 раз; vi) охлаждение до 38°С в течение 5 с.

Селекция растений T0 для продукции эксцизионных T1

Всего регенерировали 54 гигромицин-устойчивых растений и обнаружили, что 34 растения содержали 1-2 копии трансгена, на основании метода гидролизных зондов. Саузерн-блоттинг идентифицировал 12 однокопийных событий, из которых 7 демонстрировали полосы, соответствующие интактным

- 17 031356

PTU НРТ и ZFN. События T₀ pDAS5381, демонстрирующие одну копию трансгена, полноразмерную PTU, и экспрессирующие FokI, pDAS5381-18, pDAS5381-49 и pDAS5381-56, подвергали самоопылению для получения семян T₁.

Пример III. Воспроизведение и отбор растений T₁

Самоопыление растений T0 для получения гомозиготных растений

Следующие растительные события T₀: pDAS5380-3; pDAS5380-18; pDAS5380-46; pDAS5381-18; pDAS5381-49 и pDAS5381-56 выращивали до созревания и самоопыляли для получения семян T₁. После прорастания растения T_b которые являлись гомозиготными по конструкциям pDAS5380 и pDAS5381, использовали для делеции трансгена. В соответствии с менделевским наследованием, скрещивание гомозиготных однокопийных растений T₁ pDAS5381 с гомозиготными однокопийными растениями T₁ pDAS5380 дает популяцию F_b содержащую гетерозиготную уникальную копию обеих конструкций pDAS5381 и pDAS5380. Предполагалось, что потомство данного скрещивания содержит одну копию репортерного гена GUS. По существу, растение F1 не экспрессирующее GUS, показывает, что кассета экспрессии PTU GUS была вырезана.

Растения T₀ выращивали при длине светового дня 16:8 ч, с дневными и ночными температурами в диапазоне 22-24°С. Когда первичный цветочный стебель начинал удлиняться и образовывать бутоны, растение целиком накрывали мешочком для самоопыления, чтобы предотвратить случайное скрещивание. Семена, полученные в результате самоопыления, собирали приблизительно через восемь недель после высадки растений. Семена самоопыленных растений собирали и помещали в почву. Получаемые популяции T1 выращивали в теплице в условиях, описанных выше.

Молекулярный скрининг растений T₁

Анализ зиготности

Анализ количественного определения зиготности растений T₁ выполняли с применением метода гидролизных зондов, описанного выше (анализ числа копий). Проводили анализ результатов ПЦР в режиме реального времени и число копий трансгена, содержащихся в растениях T₁, определяли путем сравнения с числом копий контроля. Для этого в анализ включали образец геномной ДНК из родительского растения T₀, который, как было показано ранее, содержит однокопийный калибратор. Идентифицировали гомозиготные растения T₁ pDAS5380 и pDAS5381.

Проверка экспрессии GUS

Для продвижения экспериментов по скрещиванию важно было идентифицировать экспрессирующие события. Растения T₁ pDAS5380 проверяли с использованием протокола, описанного выше (Проверка экспрессии GUS). Тестировали растения pDAS5380, которые были отобраны в качестве гомозиготных по конструкции pDAS5380, по результатам теста на гомозиготность, описанного выше. Все растения давали голубое окрашивание.

Количественный анализ экспрессии GFP

Растения T₁ pDAS5380 тестировали с использованием протокола, описанного выше (количественный анализ экспрессии GFP). Тестировали растения pDAS5380, которые были отобраны в качестве гомозиготных по конструкции pDAS5380, в результате проверки гомозиготности, как описано выше. Все тестируемые растения являлись положительными по экспрессии GFP.

Количественный анализ экспрессии FokI

Использовали количественный метод ПЦР в реальном масштабе времени PCR (ПЦР-РВ) для количественного определения мРНК нуклеазы цинковые пальцы в гомозиготных растениях табака T₁ pDAS5381, трансформированных pDAS5381. Протоколы, описанные выше (Количественный анализ экспрессии FokI), использовали для скрининга растений T₁ для подтверждения, что нуклеаза цинковые пальцы являлась экспрессирующей, и для идентификации событий, которые могли бы продуцировать устойчивые количества нуклеазы цинковые пальцы для вырезания кассеты экспрессии PTU GUS.

Селекция растений T1

Проводили скрининг событий T₁ pDAS5380 на зиготность и экспрессию GUS и GFP. Проводили скрининг событий T₁ pDAS5381 на зиготность и экспрессию FokI. Исходя из указанных результатов, события T₁ отбирали для скрещивания. Указанные события были определены как оптимальные, поскольку они представляли собой гомозиготные, однокопийные, полноразмерные, экспрессирующие трансген события. Кроме того, растения сибс-ноль pDAS5381 сохраняли для применения в качестве контролей. Указанные события не содержали кассету экспрессии PTU нуклеазы цинковые пальцы. Трансген не наследовался указанными растениями T₁ в результате сегрегации трансгена. Отобранные события выращивали до зрелого состояния и скрещивали для получения растений F_b чтобы тестировать вырезание трансгена с помощью нуклеазы цинковые пальцы. Стратегия скрещивания изложена ниже.

Скрещивание гомозиготных растений T1 для получения F1

Отобранные растения pDAS5380 скрещивали с отобранными растениями pDAS5381. Кроме того, проводили возвратные скрещивания, так что родителями являлись мужская и женская формы (таблица 2). Растения скрещивали вручную; пыльцу из пыльников зрелой мужской родительской формы вводили в рыльце зрелой женской родительской формы. Растения, готовые к скрещиванию, убирали от других

- 18 031356 растений, чтобы уменьшить вероятность того, что женские формы растений табака будут опылены непредусмотренной пыльцой. Женские формы растений кастрировали (пыльники удаляли перед раскрытием) используя пинцет, за 15-30 мин до опыления мужской формой цветка. Цветки отбирали для кастрирования, принимая во внимание пыльники и окраску цветков. Вновь открытые цветки имели яркорозовую каемку, и пыльники были все еще закрыты. Цветки, содержавшие пыльники, которые были открыты или частично открыты, не использовали. Обильные цветки, на стебле растения табака, кастрировали и опыляли. Дополнительные цветки на стебле (например, уже опыленные коробочки, старые цветки, очень молодые бутоны и т.д.) удаляли пинцетом, чтобы гарантировать, что образовавшиеся на ветке коробочки были получены в результате контролируемого скрещивания. На ветку прикрепляли этикетку, в которой указано произведенное скрещивание, сколько скрещиваний произвели и дата опыления. Пыльники у мужской формы растения полностью удаляли пинцетом, и использовали для опыления кастрированной женской формы. Растрескивающимися пыльниками мужской формы касались клейкой рецептивной поверхности рыльца женской особи до тех пор, пока рыльце не покрывалось пыльцой. Рыльце покрывали пыльцой несколько раз, чтобы снизить вероятность непредусмотренного опыления какойлибо пыльцой, имеющей доступ к рыльцу женской формы растения. Семена оплодотворенных растений собирали и помещали в грунт. Получаемые растения-потомки F2 выращивали в теплице в условиях, описанных выше.

Таблица 2. Матрица экспериментального скрещивания

Событиямишени	Эксцизионные события
5381-18	5381-49	5381-56
	5381-18-17	5381-49-16	5381-56-5
5380-03	X	X	X
	5380-3-6	5380-3-12	5380-3-21
	5381-18-22	5381-49-16	5381-56-37
5380-18	X	X	X
	5380-18-17	5380-18-22	5380-18-22
	5381-18-17	5381-49-10	5381-56-5
5380-46	X	X	X
	5380-46-15	5380-46-15	5380-46-15
	5381-56-12	5381-56-12	5381-56-12
Null Events	X	X	X
	5380-3-10 и	5380-3-10 и	5380-3-10 и
	5380-25-10	5380-25-10	5380-25-10

Пример IV. Анализ растений F₁ в отношении ZFN-опосредованной делеции трансгена

Тестирование GUS

Растения F1 тестировали в отношении экспрессии GUS с помощью гистохимического окрашивания материала листьев. Скрининг GUS представлял собой предварительный тест для идентификации событий, которые перенесли делецию трансгена, опосредованную ZFN. Результаты скрининга GUS не предполагались как заключительные, но, скорее, являлись индикатором для определения растений для дальнейшего молекулярного анализа. Растения F1 тестировали с использованием протокола, описанного выше (Проверка экспрессии GUS). Результаты представлены в табл. 3.

Саузерн-блоттинг

Саузерн-блоттинг использовали для получения молекулярной характеристики вырезания кассеты экспрессии PTU GUS нуклеазой цинковые пальцы. Результаты выявили вырезанные кассеты экспрес

- 19 031356 сии PTU GUS у разновидности событий, невырезанные кассеты экспрессии PTU GUS у другой разновидности событий, и разновидность химерных событий, которые содержали вырезанные и невырезанные кассеты экспрессии PTU GUS. Детальный Саузерн-блоттинг проводили с применением зонда, специфичного к кассете экспрессии PTU GFP. Гибридизация зонда с геномной ДНК, которая была фрагментирована специфическими фрагментами рестрикции, идентифицировала фрагменты ДНК с определенным молекулярным весом. Указанные типы могут быть анализированы для идентификации событий, которые содержали вырезанную кассету экспрессии PTU GUS, содержали интактную кассету экспрессии PTU GUS, или являлись химерными и содержали вырезанную и интактную кассету экспрессии PTU GUS.

Рестрикционное расщепление выполняли с 10 мкг каждого образца в 1х буфере 4 и 100 единицами Ndel (New England BioLabs, Ipswich, MA) в конечном объеме 350 мкл, при 10-кратном избытке ферментов расщепления. Образцы инкубировали при 37°С в течение ночи. Расщепленную ДНК концентрировали повторным осаждением раствором Quick Precipitation Solution™ (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) в соответствии с протоколом, предлагаемым производителем. Получаемую смесь ресуспендировали в 30 мкл 1х буфера для внесения и инкубировали при 65°С в течение 30 мин. Ресуспендированные образцы наносили на 0,8% агарозный гель, приготовленный в буфере 1х ТАЕ (0,8М Трис-ацетат [рН 8,0]/0,04 мМ EDTA) и проводили электрофрез в течение ночи при 1,1 В/см в 1х ТАЕ буфере. Гель последовательно подвергали денатурации (0,2 М NaOH/0,6 М NaCl) в течение 30 мин, и нейтрализации (0,5 М Tris-HCl [рН 7,5]/1,5 М NaCl) в течение 30 мин. Перенос фрагментов ДНК осуществляли путем пассивного протекания 20х растворов SSC в течение ночи через гель на обработанную Immobilon™ NY+ блоттингмембрану (Millipore, Billerica, MA) с использованием фитиля из хроматографической бумаги и бумажных полотенец. После переноса мембрану быстро промывали 2х SSC, сшивали с Stratalinker™ 1800 (Stratagene, La Jolla, CA) и высушивали в вакууме при 80°С в течение 3 ч. Блоты инкубировали с раствором для предварительной гибридизации в течение 1 ч при 65°С в стеклянных роллерных флаконах с применением инкубатора для гибридизации. Зонд изготовляли из ПЦР-фрагмента, содержащего кодирующую последовательность gfp, которую очищали с применением наборя для экстракции из геля Qiagen и метили 50 мкКи a³²P-dCTP с использованием набора для мечения. Блоты гибридизировали в течение ночи при 65°С с денатурированным зондом, добавленным непосредственно в буфер гибридизации приблизительно до 2 миллионов импульсов блот на мл. После проведения гибридизации блоты последовательно отмывали при 65°С 0,1х SSC/0,1% SDS в течение 40 мин. Блоты экспонировали кассеты с экраном Phosphorimager screen и получали изображение с применением системы визуализации Molecular Dynamics Storm 860™. Результаты блотов представлены на фиг. 5.

Анализ ПЦР единицы транскрипции растения

Реакции ПЦР осуществляли, чтобы охарактеризовать вырезание кассеты экспрессии PTU GUS. Разрабатывали праймеры, которые связывались с последовательностью MAR и с последовательностью ORF 23 3' UTR (3' UTR для кассеты экспрессии PTU GFP). Указанный ампликон ПЦР охватывает участок кассеты экспрессии PTU GUS, который, как ожидается, должен быть вырезан. По существу, применение указанных праймеров ПЦР может обнаружить события, в которых кассета экспрессии PTU GUS вырезана, события, в которых вырезания не произошло и химерные объекты, в которых кассета экспрессии PTU GUS неравномерно удалена в событии. Амплификация фрагмента 6,7 т.н. показывает, что нет вырезания, тогда как амплификация фрагмента 2,4 т.н. позволяет предположить, что кассета экспрессии PTU GUS была вырезана. Ампликоны, содержащие фрагменты обоих размеров, служат признаком того, что кассета экспрессии GUS PTU была удалена не полностью.

Геномную ДНК выделяли из ткани табачных листьев с использованием набора Plant Maxi kit DNeasy™ и определяли количественно с использованием набора реактивов Pico Green DNA Quant-IT™, как описано выше. ПЦР для единицы транскрипции растения (PCR PTU) выполняли с использованием термоциклера Tetrad2™ (BioRad, Hercules, CA). Олигонуклеотидные праймеры разрабатывали для амплификации PTU с использованием программного обеспечения VectorNTI™. Для амплификации Ex Taq Polymerase™ (TaKara, Otsu, Shiga, Japan) готовили в 1х конечной концентрации в 25 мкл объеме реакционной смеси Singleplex, содержащей 1,2 мкМ каждого праймера (SEQ ID № 16 и 17), 0,2 мМ dNTP, 2% DMSO, 1,25 ед. TAQ с использованием 4 нг матрицы геномной ДНК. Трехстадийную реакцию амплификации осуществляли в следующем виде; 3 мин начальная денатурация при 94°С и 33 цикла по 30 с при 94°С, 6 мин при 65,5°С, 30 с при 72°С, с заключительной реакцией удлинения при 72°С в течение 10 мин. Аликвоту продукта ПЦР пропускали на 1% геле с бромидом этидия с применением маркера 1Kb+ (Invitrogen, Carlsbad, CA) для определения размера продукта. Результаты реакций ПЦР PTU представлены на фиг. 6.

Секвенирование продуктов ПЦР PTU

Полосы 2,4 т.н., полученные в результате реакций ПЦР PTU, вырезали из геля и очищали ДНК с применением набора для экстракции из геля Qiagen Qiaex II™ (Qiagen, Germantown, MD). Очищенные фрагменты лигировали в вектор клонирования pCR2.1 ТОРО-ТА™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Присутствие клонированного ампликона ПЦР внутри вектора pCR2.1 подтверждали путем расщепления фермен

- 20 031356 тами рестрикции. Клоны, содержащие полосы, соответствующие продуктам амплификации, секвенировали.

Последовательности места соединения, получаемого в результате удаления кассеты экспрессии PTU GUS, представлены на фиг. 7а и 7b. Полную кассету экспрессии PTU удаляли. Остающиеся последовательности представляют собой только реаранжированные сайты связывания цинковых пальцев, которые фланкировали кассету экспрессии PTU GUS. Кроме того, некоторые ампликоны ПЦР содержали делеции, которые распространялись на промотор актина 2 кассеты экспрессии PTU GFP.

Анализ с применением ферментов рестрикции полосы 6,7 т.н.

Ампликоны ПЦР более крупной полосы 6,7 т.н. анализировали с помощью расщепления ферментами рестрикции. Указанные фрагменты расщепляли рестрикционными ферментами EcoRI и Ncol/Sacl (New England Biolabs, Ipswich, MA). Размеры получаемых полос анализировали, чтобы подтвердить, что амплифицированные фрагменты включали невырезанную геномную вставку трансгена pDAS5380.

Самооплодотворение растений F₁ для получения потомков F₂

Показательную группу растений F₁, описанных выше, самоопыляли для получения потомков F₂. В таблице 5 перечислены растения, которые отбирали, и фенотип и генотип F₁. Отобранные растения F₁ выращивали в теплице при длине светового дня 16:8 ч, с дневными и ночными температурами в диапазоне 22-24°С. Когда первичный цветочный стебель начинал удлиняться и образовывать бутоны, растение целиком накрывали мешочком для самоопыления, чтобы предотвратить случайное скрещивание. Семена, полученные в результате самоопыления, собирали приблизительно через восемь недель после высадки растений. Семена самоопыленных растений собирали и помещали в почву. Получаемые популяции F2 выращивали в теплице в условиях, описанных выше. Растения F₂ анализировали на дальнейшую делецию трансгена и наследуемость делеции, которая была охарактеризована в растениях F1.

Пример V. Получение и отбор растений T1

Анализ потомков F2 на трансген и наследуемость делеции

Анализ GUS

Растения F2 проверяли на экспрессию GUS с помощью гистохимического окрашивания материала листьев. Растения тестировали с использованием протокола, описанного выше (Проверка экспрессии GUS). Результаты представлены в табл. 5. Результаты экспрессии GUS, полученные в растениях F2, соответствовали ожидаемым результатам. Растения F₁, которые идентифицировали, как содержащие вырезанную кассету экспрессии PTU GUS, производили растения F₂, которые являлись 100% GUSотрицательными, что подтверждали гистохимическим окрашиванием. Отсутствие экспрессии GUS в указанных растениях F2 подтверждает результаты, полученные с F1, что позволяет предположить, что кассета экспрессии PTU GUS вырезана с помощью делеции трансгена, опосредуемой нуклеазой цинковые пальцы. Кроме того, полученные результаты являются примером наследуемости удаляемого трансгена в последующей генерации.

Сибс-ноль контрольные растения экспрессировали GUS приблизительно у 75% потомства F₂. Остальные растения (приблизительно 25%), в которых GUS на обнаруживали с помощью гистохимического окрашивания, являлись ожидаемыми.

Предполагается, что кассета экспрессии PTU GUS сегрегирует в популяции F2 в ожидаемом отношении 3:1. Химерные события, которые содержали вырезанные и невырезанные кассеты экспрессии PTU GUS в F₁, сегрегировали в пределах F₂. Большинство растений экспрессировали GUS.

Таблица 5. Экспрессия GUS в потомках F₂

Скрещивание #	Обозначение скрещивания	Молекулярное/ фенотипическое описание FI	# тестируемых растений	# GUS +	# GUS
95	5380-46-1-15x5381-49-1-10-003	Выр е з анный/GUS	405	0	405
307	5381-49-1-10x5380-46-1-15.018	Выр е з анный/GUS	480	0	480
180	5380-3-1-6x5381-18-1-17.002	Выр е з анный/GUS	445	0	445
83	5380-46-1-15x5381-49-1-10-015	Выр е з анный/GUS	375	0	375
77	5380-46-1-15x5381-49-1-10-021	Выр е з анный/GUS	427	0	427
310	5381-49-1-10x5380-46-1-15.015	Выр е з анный/GUS	442	0	442
265	5381-49-1-16x5380-3-1-12.017	Выр е з анный/GUS	471	0	471
93	5380-46-1-15x5381-49-1-10-005	Выр е з анный/GUS	386	0	386
4	5380-18-1-22x5381-49-1-14(ноль).017	Интактный/сиэт (ноль)	473	356	117
214	5381-56-1-6(ноль) х5380-46-1-23.010	Интактный/биЗ+ (ноль)	480	377	102
292	5381-49-1-14(ноль) Х5380-18-1-22.013	Интактный/биЗ+ (ноль)	481	370	111
189	5380-46-1-15x5381-56-1-5.001	Интактный/биЗ+	456	345	111
335	5381-18-1-17x5380-46-1-15.011	Химерный/GUS +	449	326	123
350	5381-18-1-17x5380-18-1-22.020	Химерный/GUS+	457	342	114
331	5381-18-1-17x5380-46-1-15.016	Химерный/GUS+	452	347	104
53	5380-46-1-15x5381-18-1-17.014	Химерный/GUS+	470	359	109

Анализ ELISA с использованием зеленого флуоресцентного белка

Отобранные растения F2 тестировали на экспрессию GFP методом ELISA с использованием протокола, описанного выше (Количественный анализ экспрессии GFP). Результаты экспрессии GFP в расте

- 21 031356 ниях F₂ соответствовали ожидаемым результатам. Растения F₁ экспрессировали GFP приблизительно в 75% потомства F₂. Остальные растения (приблизительно 25%), в которых не обнаруживали GFP с помощью ELISA, являлись ожидаемыми. Предполагается, что кассета экспрессии PTU GFP сегрегирует в популяции F₂ в ожидаемом отношении 3:1. Химерные события, которые содержали вырезанные и невырезанные кассеты экспрессии PTU GFP в Fj, сегрегировали в F₂. Большинство растений экспрессировало GFP.

ПЦР, Саузерн-блоттинг и анализ GFP в потомстве F₂

Шестнадцать растений, полученных в результате трех скрещиваний, перечисленных в табл. 5 (представляющие собой потомков с вырезанным геном, интактных потомков и химерных потомков) сохраняли для дальнейшего молекулярного анализа. Указанные шестнадцать растений включали восемь растений, которые являлись GUS-положительными и восемь растений, которые являлись GUSотрицательными по отношению к контролю сибс-ноль и химерным растениям. Протоколы, описанные выше (Саузерн-блоттинг и анализ ПЦР единицы транскрипции растения), повторяли с геномной ДНК растений F₂. Отобранные растения F₂ тестировали на экспрессию GFP с помощью ELISA с использованием протокола, описанного выше (Количественный анализ экспрессии GFP). Молекулярные данные подтверждают, что растения, которые не экспрессировали GUS, не содержат интактной кассеты экспрессии PTU GUS. Экспрессия GFP сегрегировалась, как ожидалось. Результаты приведены на фиг. 8-13.

Несмотря на то, что ряд иллюстративных аспектов и вариантов осуществления обсуждался выше, специалистам в данной области будут понятны их определенные модификации, преобразования, дополнения и субкомбинации. Таким образом, следует понимать, что нижеприведенная формула изобретения и пункты формулы изобретения, привнесенные в дальнейшем, толкуются как включающие в себя все такие модификации, преобразования, дополнения и субкомбинации, поскольку они соответствуют существу и объему изобретения.

Ссылки, обсуждаемые в описании, предоставляются исключительно для их раскрытия до даты регистрации настоящей заявки. В описании нет ничего, что следует рассматривать как признание, что авторы не имеют право датировать задним числом такое раскрытие в силу предшествующего изобретения.

- 22 031356

	СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>	Dow AgroSciences Russell, Sean Petolino, Joseph F.
<120>	ВЫРЕЗАНИЕ ТРАНСГЕНОВ В ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫХ ОРГАНИЗМАХ
<130>	2971-9843. 1PC
<160>	18
<170>	Патент в версии 3.5
<210> <211> <212> <213>	1 33 ДНК Искусственная последовательность

<220> <223>	участок связывания ZFN CCR5
<400>	1

tggtcatcct catcctgata aactgcaaaa ggc 33 <210> 2 <211> 2139 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> последовательность гена нуклеазы цинковые пальцы” CCN5

<400> 2
atggctccaa	ggaagaggaa	ggagtctaac	agggagtcag	ctaggaggtc	aaggtacagg	60
aaggtgggta	tccacggggt	acccgccgct	atggccgaga	ggcccttcca	gtgtcgaatc	120
tgcatgcgta	acttcagtga	ccgctccaac	ctgtcccgcc	acatccgcac	ccacacaggc	180
gagaagcctt	ttgcctgtga	catttgtggg	aggaagtttg	ccatctcctc	caacctgaac	240
tcccatacca	agatacacac	gggatctcag	aagcccttcc	agtgtcgaat	ctgcatgcgt	300
aacttcagtc	gctccgacaa	cctggcccgc	cacatccgca	cccacacagg	cgagaagcct	360
tttgcctgtg	acatttgtgg	gaggaagttt	gccacctccg	gcaacctgac	ccgccacgcc	420
cagcgctgcg	gcggcctgcg	gggatcccaa	cttgtgaaat	cagaattgga	agagaaaaag	480
tctgagctta	gacacaaatt	gaagtacgtt	ccacatgaat	atatcgaact	tatcgagatt	540
gctaggaact	caacacagga	cagaattttg	gagatgaagg	ttatggagtt	ctttatgaaa	600
gtgtacggat	ataggggaaa	gcaccttggt	ggttctagga	aacctgatgg	tgcaatctac	660
actgtgggat	cacctattga	ctatggtgtt	atcgtggata	caaaggcata	ctctggtgga	720
tacaatttgc	caatcggaca	agctgacgaa	atggagagat	atgttgaaga	gaaccaaact	780
agaaacaaac	atcttaatcc	aaatgaatgg	tggaaggtgt	atccttcatc	tgttacagag	840

ttcaaattcc tttttgtgtc tggacacttt aagggtaact acaaagcaca gcttactagg

900

ttgaaccata	ttacaaattg	caatggtgct	gtgttgtcag	ttgaagagct	tttgatcgga	960
ggtgaaatga	ttaaggcagg	aacacttact	ttggaggaag	ttagaagaaa	attcaacaac	1020
ggtgaaatca	attttagatc	tggcggcgga	gagggcagag	gaagtcttct	aacatgcggt	1080
gacgtggagg	agaatcccgg	ccctaggatg	gctccaagga	agaggaagga	gtctaacagg	1140
gagtcagcta	ggaggtcaag	gtacaggaag	gtgggtatcc	acggggtacc	cgccgctatg	1200
gccgagaggc	ccttccagtg	tcggatctgc	atgcggaact	tcagcaggag	cgacaacctg	1260
agcgtacaca	tccgcaccca	cacaggcgag	aagccttttg	cctgtgacat	ttgtgggagg	1320
aaatttgccc	agaaaatcaa	cctccaggtc	cacaccaaga	tccacaccgg	agagaagccc	1380
tttcagtgca	gaatctgcat	gagaaacttc	tcccggtccg	acgtgctgag	cgagcacatt	1440
aggacccaca	ccggggagaa	acccttcgcc	tgcgacatct	gtggccgcaa	atttgcccag	1500
cgcaaccacc	ggacaacaca	cgcccagcgc	tgcggcggcc	tgcggggatc	ccaacttgtg	1560
aaatcagaat	tggaagagaa	aaagtctgag	cttagacaca	aattgaagta	cgttccacat	1620
gaatatatcg	aacttatcga	gattgctagg	aactcaacac	aggacagaat	tttggagatg	1680
aaggttatgg	agttctttat	gaaagtgtac	ggatataggg	gaaagcacct	tggtggttct	1740
aggaaacctg	atggtgcaat	ctacactgtg	ggatcaccta	ttgactatgg	tgttatcgtg	1800
gatacaaagg	catactctgg	tggatacaat	ttgccaatcg	gacaagctga	cgaaatgcag	1860
agatatgtta	aagagaacca	aactagaaac	aaacatatta	atccaaatga	atggtggaag	1920
gtgtatcctt	catctgttac	agagttcaaa	ttcctttttg	tgtctggaca	ctttaagggt	1980
aactacaaag	cacagcttac	taggttgaac	cataagacaa	attgcaatgg	tgctgtgttg	2040
tcagttgaag	agcttttgat	cggaggtgaa	atgattaagg	caggaacact	tactttggag	2100
gaagttagaa	gaaaattcaa	caacggtgaa	atcaatttt			2139

<210>	3
<211>	29
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Праймер TQPATS
<400>	3
acaagagtgg attgatgatc tagagaggt	29

<210> <211> <212> <213>

4 29 ДНК Искусственная последовательность

<220> <223>

Праймер TQPATA

<400> 4 ctttgatgcc tatgtgacac gtaaacagt

<210>	5
<211>	29
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	праймер TQPATFQ
<400>	5
ggtgttgtgg ctggtattgc ttacgctgg	29

<210>	6
<211>	30
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	праймер TQPALS
<400>	6
tactatgact tgatgttgtg tggtgactga	30

<210>	7
<211>	28
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	праймер TQPALA
<400>	7
gagcggtcta aattccgacc cttatttc	28

<210>	8
<211>	33
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	праймер TQPALFQ
<400>	8
aaacgatggc aggagtgccc tttttctatc aat	33

<210>	9
<211>	19
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	праймер HPT2S
<400>	9
acactacatg gcgtgattt	19

<211> <212> <213>

18 ДНК Искусственная последовательность

<220> <223>

праймер HPT2A

<400>10 agcatcagct catcgaga18

<210> <211> <212> <213>

11 19 ДНК Искусственная последовательность

<220> <223>	праймер HPTFQ
<400>	11

actgtgatgg acgacaccg 19

<210> <211> <212> <213>

12 21 ДНК Искусственная последовательность

<220> <223>	праймер Fok1_UPL_F
<400>	12

tgaatggtgg aaggtgtatc c 21

<210> <211> <212> <213>

13 25 ДНК Искусственная последовательность

<220> <223>	праймер Fok1_UPL_R
<400>	13

aagctgtgct ttgtagttac cctta 25

<210> <211> <212> <213>

14 21 ДНК Искусственная последовательность

<220> <223>

праймер BY2ACT89S

<400>14 cccagatcat gtttgagacc t21

<210> <211> <212> <213>

15 21 ДНК Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер BY2ACT89A <400> 15 ggaagcgcat atccctcata g

<210>	16
<211>	24
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Прямой праймер ПЦР для анализа ПЦР PTU
<400>	16
tgggctgaat tgaagacatg ctcc	24

<210>	17
<211>	22
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Обратный праймер ПЦР для анализа ПЦР PTU
<400>	17
tctgaaaata gtggccaccg ct	22

<210>	18
<211>	28
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	праймер BYACTFQ
<400>	18
ctagtggtcg tactactggt attgtgct	28

Claims (7)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ удаления полинуклеотида из генома растения, включающий обеспечение первого жизнеспособного растения и второго жизнеспособного растения, где первое жизнеспособное растение содержит геномную ДНК, включающую последовательность, кодирующую нуклеазу типа цинковый палец, предназначенную для расщепления геномной ДНК в первом и втором сайтах распознавания, где последовательность, кодирующая нуклеазу типа цинковый палец, функционально связана с тканеспецифическим промотором или с промотором, специфичным для стадии развития, где второе жизнеспособное растение содержит геномную ДНК, включающую в направлении 5'-3' первый сайт расщепления для нуклеазы типа цинковый палец, полинуклеотид, подлежащий удалению, и второй сайт расщепления для нуклеазы типа цинковый палец, и скрещивание первого и второго жизнеспособных растений с получением семян F₁ либо от первого, либо от второго жизнеспособного растения, геном которых не содержит указанного полинуклеотида; и выращивание указанных семян, геном которых не содержит указанного полинуклеотида.
2. 2. Способ по п.1, в котором первый сайт расщепления для нуклеазы типа цинковый палец и второй сайт расщепления для нуклеазы типа цинковый палец являются одинаковыми.
3. 3. Способ удаления полинуклеотида из растения, включающий скрещивание первого растения, содержащего геномную ДНК, включающую в направлении 5'-3' первый сайт расщепления для нуклеазы типа цинковый палец, полинуклеотид, подлежащий удалению, и второй сайт расщепления для нуклеазы типа цинковый палец, со вторым растением, содержащим геномную ДНК, включающую последовательность, кодирующую нуклеазу типа цинковый палец, предназначенную для расщепления геномной ДНК в первом и втором сайтах расщепления, где последовательность, кодирующая нуклеазу типа цинковый палец, функционально связана с тканеспецифическим промотором или с промотором, специфичным для стадии развития, и получение растений-потомков, причем геномная ДНК пыльцы и/или семян растений-потомков не содержит указанного полинуклеотида.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, где нуклеаза типа цинковый палец содержит SEQ ID NO: 2.

   CCR5 BINDING SITE RB7 MAR v3

   AtuORFI 3'UTR v3 _ ) , T-DNA Border В

   GUSvl

   AtUbilO promoter v2 _______

   CCR5 BINDING SITE'—

   AtAct2 promoter v2 AtAct2 promoter intron \

   Turbo GFP v2

   AtuORF23 3'UTR vl

   AtUbilO promote pDAB8279 i68tebp /

   PATv3

   Фиг. 1

   AtuORF23rUTRv1

   p..........

   trfA

   Фиг. 2

   SpecR trfA oriT

   On Rep oriV

   AUJbi3 promoter v2

   АШЫЗМгоп

   TPTlvI

   - -AtMORFHTUTRv2 _T-DNA Border A T-DNA Border A

   TOHA Bonier A \ On Rep

   - 28 031356

   AtAct2 promoter v2 ORF1 Poly A;

   CCR5 BINDING SITE

   CCR5 BINDING SITE· 4

   Seq ID No:)7 AtUbilO promoter y2 RB7 MAR v3,

   Mfel (89) ! H МЖ3995) ,I

   T-DNA Border В i '

   GUS v1

   Turbo GFP v2 AtuORF23 3'UTR v1 Seq ID No:16 | AtUbilO promoter v4

   AtuORFI 3' UTRv3 i Nsl (11025)

   T-DNA Border A ) iMfei (11138)

   PDAS5380

   11175 bp

   Фиг. 3 a

   AtuORF23 3'UTR v1

   Fokl Dicot KK

   168GAvE V3 I

   Opaque 2 NLS

   T2A (

   ΪΙ II

   Fokl Dicot EL r162y11 V3 Opaque2NLS (

   CsVMV promoter v2 '

   Mfe 1(120) \ ;

   T-DNA Border В ' '

   AtUbi3 promoter v2

   HPTII v1

   AtuORF24 3' UTRv2

   I

   Nsil (7070)

   T-DNA Border A

   PDAS5381

   7222 bp

   Фиг. 4а

   6.9 kb

   Саузерн-блоттинг PTU: расщепление Nsil/Msel, выявляемое с помощью hpt

   Фиг. 4b

   - 29 031356

   I I I I НИ·

   5380-3-1 -12x5381 -49-1 -16.002

   5380-46- 1-15x5381-49-1-10-015

   10-46-1-15x5381 -49-1 -10-021

   5381 -49-1-10x5380-46-1-15.015

   - 11-49-1-16x5380-3-1-12.017

   5380-46-1-15x5381-49-1-10-005

   5380-46-1-15x5381-49-1-10-016

   11-56-1-6(N)x5380-46-1-23.010

   1046-1-15x5381-56-1-5.001

   31-49-1-14(N)x5380-18-1-22.013

   31-18-1-17x5380-46-1-15.011

   31-18-1-1 7x538046-1-15.016 'T

   OOpgs pDAB8279

   Фиг. 5

   Фиг. 6

   Jas
5. 5:

   33;

   9;

   ΐ33ί ίΐ ‘ο мссйАж.ит^А^ААсткжжж^

   МССЖТГАМХ*.ОХ.и7йТиЖЛТЖЖ^^ &АахаС-ГСААТОСЛсКГХЧСЗт;ЯС^^^

   ААССС-АСТСАА?:САСЖА.А:7Г”АЗТС£Т:СТС^С7Т^:.тгСТ”АААНАААТТТСАТАСААТТ£АА::ГААТТ?АА7Т7:·

   ЖЯИИИЯИ!-------------------------------------------------------------------------ААГГГ-АЯТСАА’Т-л~:7*кА^_5Т*А7ГГГЛ“ТГ:7ГГ.ТТ‘'>*.~Т''.Т¹-’ААТ^5лТТТ CATACAA.TTCAATS’TAXfTTAATTCG

   ДЙЗЛХ^Т^Та^г^.СЭТА^ЖТЙЖГЩ’^ТЧ^теТТО^ТТ^ТПЗТ^АКСгЖСТАЙТГГААТГСС

   МСС^1СААТССАСССААСЗГТА7ГЕПС5Т£ЗГ®ТТС^Н7ТТСААт2АТТТ;^ТМАМТСАК;<ГГАКГТТЛАТГСЗ

   АЖг^АС-^АА?£ХчАЖГЛЛ.СгГТАЗГССК<ЛСЗГ2СГК-ХтГТаАТТАСАТПС.АТАСХАТТСА_ССТААТТТЖК:«

   ААСХ:С&СТЕ.иьТХА<^^СГТАЩССТЕСТССТССГТСССГГСТТОАГТА2АТГТСАТ^АА.ТГСАА:СТ.ШТТА^Г7С

   Ж^ЖТГААТСЕАЙХ.иД'ЗГТАСТГСТЕСТССГССтеСГЛ'СТТСААТТАСАТТТЕАТгГАА^САЗЕСТААТТТААТТСС.

   ДДТЖ^ТС^гК^ЖАЖГТЭТЙЯСаКгЛтаГИТТ^ТТйТЧ'гАЬП^ТТТС&ЖААТКЙЖет^ПААТГйЗ ?АЖА5Т:ААТС:Л«ЖАА^ТА5ТСгТСТЛС8Т2СТТС-^.тТТЦ%Ат^ТПСАТАСЛАТГС^ОТААТТТААТК:С

   МСЖ^1СААТ5ХАС5Х.Ш:ОТАЖ«Тгх:Т€^СГК^теГТС^га®.ТПСЛТ^ААТК.АК.ОТдаТТААТТАСif ТТТТЕТАГТА5АА^стТЗТА?САТМТТААТта£АС^^

   -? пгет.^пл5.игтотмсмхит£лпж^^^ .5 ГНСи^&^Т^ТСД^ТХМ.ТТ^^гЖвйи^ШАЭТЖП^ТСЙТЗдаТШ^АТТиР^ГМ ΐ ГТ ГПСТАТТACAST ГСТЛТ САТААТ Т^Т1£2£А5ГСТ GMAGiAACT СТС ГТТС&Т CATC TCI ТТ АТС ЖТ Τ ТАТАОААТАА

   ИТ1ГГлтй«ТЛ^%^ТТ^АТТёХД}йГ<?Г5иА^>5Г^<5Г«т^Т'^ГС^ГТЛ.ТЛЛГ4ТТ^|14Ш!&ЬТ1Л птгст&т^7т^тотАтл&ти.гттай^ажз^к5Ш13тск:пт^т;й.т2тшттл.т5йаТлттт^гжмж

   В®В1ЖЙМ1вВ^йЖ;1М^ЛЖШЖМЖйЖЖ®ШйШйвЖ^ОЯИйвК

   ЙвввИИИ·^ ^тт^ьтт^таптхАтттАтаяж^аам^т^жт^татст&тттлтссхтхтттшАШ.

   тпктАги^^тмсм^пда^ ттстп&ШАПТАТСАТА&ТиАТТЖЖК&Г^^^ ттттсттАй&^шслштш.т«йа&кст<^^

   8АТМЙАКТТТС&ТСА-ТЛТГаСТАТТСАСаАПА&татаТАаТТЛЛ»^ЕЖТАСТЖТЛСМСС-ЖАСТЖТСАМАСС

   САТАГААШТТТАаТСАГАТГЖТ^ттсЖСАТТАСТАТС-ТаСАТТАААТААТЗС-СТ^стжтлААТСССЖТСЗТСААААТС

   САЖХ4таТТТёкТАкТАГтаГТАТТЖ^ТТАСТАТЕ<ТАСкТТАМТААТ'ЗССТАСТЖТАСАТГ®^ТГаТГАи.А€5:

   са.т^^тстт?атгАтгатттжгАПА&ТАТстАаттАМТмтссгп7тютАсл,тсгсзА£:татс.шА2с ^ТДАААТ5ТТТААТЕАТАТТ^тТТА^АТТАС-ТАТЗТА^АТТКААТМТ^ТА7ТЖТАСАТСС<^Т^ТйдаА ^АТЖЛАШТПААТСАТАХГЖЖТСЖСАтСТАТСТАААТТАААТХАТСЗСТАСХСТАААТСС^ЖТСС-ТСМААСС £атА£^тгттто1Т^тг^тгтмтсш^пжгА^т^тп^т^<хст^^1шьтсстаАЕТтхгтАю:

   СА1ХЛА1«ТТ'7:л1^,^Шг7АС?2ТТСХ^.ШС-гА^ГА»Г1А2АГЛАГ^Сп;:Ж1^Ж:-ёААСТ;ХГСДАДл:0

   T»,7X^^TT7»T»W^m7TCASGAtTAGtA1V»»ttAUfMrGCKtACtK7AtATCCt»ASTCGKAAMGC

   -•XTACAAT5T'’7iACA-A-T^ATATTAA:^.TTA-:-'A7C.AAAT-AAATAAT3C-CTACTAE“ACATCC^XTC-;-TAAAAA-C аа«^^15тпато1ГАТп^т^тсшат1^Атот^ттА^йм«кт^т^к&тсг'зи»йт^ттАкг

   С-АТЛАА-АТЗТТТААТСА.Т.-.ТТАА2АТТСАйААТТАС-ТАТС.ТА-ЛТАААТААТЗС-СТАСТА£ТАСАТГСЗ.АСТСС-ТТАААА?С гкАТА^ААТСТТТЕАТСЛт7аАС^ТТЕА£5АТТАСТА7С7АЗьТ7^АгЛМТСЖ^СТК.7АЕЛТаГЖгТЗЗТГАЛААХ *”:ТСГ.----Acc^esjssrj асссссткзх ϊΐ.—Ул^яа.

   1?жтш г^сг-ΐ— гглс£707’гг .-' ACGCCCGCZ ;25?' .CCSCCStS'i 75Г ACCSXStSt 75? > KJtrCSIiSTZAIi

   ί.25ί) ACCtESGISQTCAI?^;· A'.:cct~K-- i2S€t й~ТС™И™··
6. 7S?T МЖС313ЙТ?лТССтал:

   73S;

   7:

   iii

   Фиг. 7а с:

   ССлТААА:~А :о ЗЗС ЗСАССТТЕСТ’ТТТТ 37ACAAACTTUT SCGGCE-3CTT CCCCGGGCArGGCUGGCCTT

   -----CQ3CGGiK»CC'ISKT'TTi’T'Tt??ACAAACT?GTGCiKEC£S27T£JGiXGiK'-XTG5£GCiXCTT'

   ------С 3TC-K3iSCrTGCT’ⁿT!’TT'77A7ASRCTTGT XGG7C ЗСТТ SXCGCKGATGGGGCGCCTT ----СО!КСО^ГТЕКТтТГОТЛСЛЛЙСТТОТ?Х^СХТТ<ЙХгаЖ^.ТаИГ£ИЙЙХТТ -А.ссссжсжсйсжстжттттттстАСАД^сттотазссссатттажсог&ЗАТсаижасстт

   ----i^GCGGAGEGT^TTTTTTGTAXAjaXT^TGCGGGGGETTGCCEG^GATGSMSiXECTT

   ----сахйс^^с^ттттттетАСААЛсттеттхгйсгжтт^жссса^жтшсоагсстт-----rmC&GJbGrETSrTTTrTTGTAJCAWTTTGTGC^CC^TTSCGr&GGGATGGCGEGECTT

   ------О£^таШХ^ТтТГСТА£^ЛДСТ?СТСЖ<Х^аСТТОССТХЗ£И01ТО5С£ЖЗХ7Т

   ------CG3EGa^E’KXCTTTTTGTJ^JWtCTTGTGES9CEGCTTGiXCG-SJCATG&CGCGCC7T

   -----C3GOGG.^rTizC7TT7T™A’AAA€TTGT^3JrC”TT<GaXGa;ZATG5r&SGCCTT ------сах&а^с^тттга^ц^.АДЕТтгт^з^агтт^ссзгсхгат^хссстт ------С ^Л^ИСОТОСТ'-ТТТТ TrACAAAETTGTSCGGEE^TT-SECEGiSGAriSCGCGCCTT

   -----CGC-CGG.AGCC ’RXTTTrTTSTACAAACTTGTGEXKECSCT TiXGCGQGGATGGCGizGCCTT ззс 3”

   AATTAAGO3G71 >Q> AATTAAGCXJGTG

   12, aattaagcggtg
7. 9. AAT7AAGCSGTG ί3)

   ΑΛΤΤΑΑχ.

   ΑΑΤΤΛΑ

   S33-3TG : AATTAAGCX33TG G ΑΑΤΤΆΑ .

   ) ААТТААл . ААТТАК ) AATTAAGCGGTi • AATTAASSGT?

   GCGGTG .GCdTG

   Фиг. 7b

   - 31 031356

   Фиг. 9

   Фиг. 10

   - 32 031356 β

   I

   292-36 <

   Illi III·

   83-5

   1Kb+

   1Kb+

   I

   Фиг. 11

   Фиг. 13