JP3713074B2 - 血清アミロイドaを認識するモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト血清中のアミロイドA(以下、SAAと省略する)を認識するモノクローナル抗体、ならびにこのモノクローナル抗体の使用に関するものである。
臨床検査等の分野では、物質の測定を簡便に行うために、あるいは高い感度で特異的に測定するためにしばしば免疫学的な測定方法が利用される。免疫学的な測定方法には、抗体が必要である。モノクローナル抗体は、均一な性状を備えた抗体を継続して供給できる点、1度の免疫操作で多量の抗体を得られるので抗原の使用量が少なくて済む点、そしてなによりも高度な特異性を持つ抗体を得やすい等の多くの利点を持っているので免疫学的な測定方法においては欠かすことのできないツールとなっている。また測定のみならず、物質の精製、生理活性や生体内における挙動の研究においてもモノクローナル抗体は重要なツールとなる。
SAAはある種のアミロイドーシスにおいて組織に沈着するアミロイド蛋白A(以下、AA蛋白と省略する)の前駆体蛋白とされる、分子量約12000の血清蛋白である。(J.Clin.Invest.53:1054-1061,1974)近年になって、このSAAの血清値がアミロイドーシス以外の炎症性疾患で上昇することが明らかにされ、鋭敏な炎症マーカーとして評価されている。(臨床検査32:2,P168,1988)
【0002】
【従来技術の問題点】
SAAを認識するモノクローナル抗体については、次のような報告が有る。これらの報告ではSAAを認識するモノクローナル抗体によってELISAを構成している。
J.Immunol.Methods 144,149-155;1991
Clin.Chem.40/7,1284-1290;1994
【0003】
ところで一般にELISAでは十分に使用に耐えるモノクローナル抗体も、凝集法では実用的な性能を示さないことが多い。その理由はラテックスのような担体粒子を利用する方法にしろ、あるいは免疫比濁法のような担体の助けを借りない方法にしろ、用いる抗体には次のような条件が要求されるためである。
【0004】
条件A:凝集法ではより高い親和性が要求される。
凝集反応を起こし、しかも物理的に安定した凝集塊を維持するには一般にELISAで要求されるよりも高い水準の親和性が必要である。特にモノクローナル抗体では限られたエピトープに対してのみ反応する抗体分子だけで反応を構成しなければならないので、高度な親和性を持つモノクローナル抗体を用意しなければならないが、従来のモノクローナル抗体はこのような条件を満足するものではなかった。
親和性が不十分なモノクローナル抗体で反応系を構成すると、実用的な感度で分析可能な凝集塊を形成しないので凝集法による測定を行うことはできない。たとえ抗体の使用量を増やして親和性の低さをカバーするとしても、抗原1分子に対して結合できる抗体の数は変わらないので十分な感度は得られない。またラテックスのような担体に抗体を結合して用いるときにも、やはり抗体の結合量に限界があるので、抗体の使用量を増やすという対策では不十分である。
【0005】
条件B:ELISAでは問題とならないエピトープの位置関係が凝集法では障害となることがある
凝集反応では、モノクローナル抗体が認識するエピトープが同一抗原上に複数存在していなければならない。この条件はELISAサンドイッチ法と同じである。しかし凝集法では先に述べたとおり物理的により強い結合を要求することから、たとえ物理的な位置が異なっていても接近したエピトープのみで反応させることは不利である。立体障害を起こしやすく、結果として安定で大きな凝集塊を得にくくなるためである。
このようにエピトープの選択という観点から見ても、これまでのモノクローナル抗体は凝集法向きではなかった。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、SAAの凝集反応による測定を可能とする新しいモノクローナル抗体の提供である。そしてこのような新規なモノクローナル抗体によって、優れた測定性能を持つSAAの免疫学的測定試薬と、測定方法を合わせて提供するものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明の課題は、次の反応性で特徴付けられるヒトSAAを認識するモノクローナル抗体により解決される。
(1)ヒトSAAを認識する
(2)ヒトSAAと反応して凝集する
本発明において、SAAと反応して凝集するという条件は次のような方法によって確認することができる。もっとも簡単な方法として、モノクローナル抗体とSAAを免疫反応に好適な条件の元で反応させ、免疫複合体が沈降物として生じるかどうかを指標として凝集能を確認する方法を示すことができる。ただしこの方法では増感剤などを組合せない場合は定量的な観察を行うことが困難である。モノクローナル抗体の凝集能を定量的につかむためには、ラテックス凝集反応を利用するとよい。以下にモノクローナル抗体のラテックス凝集反応による凝集能確認方法について説明する。
抗SAAモノクローナル抗体はポリスチレンラテックス(平均粒径0.109μm)に37℃で1時間物理吸着させた後、最終的にラテックス濃度1%となるように分散媒(1%BSAを含む0.1MのHEPES緩衝液pH7.4)に懸濁させてモノクローナル抗体感作ラテックス乳液とする。この乳液を一定のSAA濃度を持つ試料と反応させ、生じる凝集を光学的に測定する。光学測定には吸光度変化量や、散乱光変化量を測定する方法が知られている。
以下に吸光度変化量を免疫学的ラテックス凝集反応測定システムLA−2000(栄研化学・アナリティカルインスツルメント製、商品名)で確認する方法を例示する。測定条件は次のとおりである。この条件によって、反応開始後400秒間の吸光度変化がDOSとして算出される。この値は、LA−2000に固有の値である。
SAA濃度 :31.5μg/ml
検体量 :20μl
乳液量 :300μl
吸光度の測定 :400秒
この反応条件でまず0.1MのHEPES緩衝液(pH7.4)のみを測定して装置自身の光学的なバラ付きを測定する。更に空試験として同じ緩衝液を検体として試薬ブランクを取る。試薬ブランクの平均値に標準偏差の2倍を加え、更に装置のバラ付き幅を加えた値(試薬ブランク+2SD+光学装置のばらつき幅)を基準として、この基準よりも大きな値を示す時に凝集したと判定できる。同様の試験方法は、LA−2000のような専用システムを利用しなくても一般的な吸光光度計で実施することも可能である。
【0008】
本発明のモノクローナル抗体は、マウス、ラット等を精製SAAで免疫し、その抗体産生細胞をなんらかの手段で不死化することによって得る事ができる。不死化技術としては、ミエローマのような腫瘍細胞との細胞融合、あるいはエプスタインバールウイルスによる形質転換等が知られている。
細胞融合でハイブリドーマを調製するときには、免疫動物と同じ動物種のミエローマを用いても良いし、あるいは別種の動物に由来するミエローマとの融合によりヘテロ・ハイブリドーマとすることもできる。SAAはヒト以外の動物でも血清中に観察される蛋白であり、免疫という刺激を与える事により増加する。したがって免疫動物にはそのような現象のない動物、例えばラットを利用すれば抗体価が上昇しやすいので有利である。
免疫原に利用するSAAは、公知の方法によって精製されたものを用いる。具体的には、超遠心分離により原料血清から高比重リポタンパク分画(以下HDLと省略する)を得、脱脂後イオン交換クロマトグラフィー等で精製することでSAAを純粋な蛋白質として回収することができる。このように高度に精製した蛋白質を用いることは、SAAに特異的なモノクローナル抗体産生細胞を高い収率で得るために大切な条件である。例えば、超遠心によって得たHDL分画を精製することなく免疫原として利用した報告もあるが、このような免疫原によって得られる抗体産生細胞は各種アポリポ蛋白質抗原を認識する抗体を産生するものも多く、クローニング等の点で不利となることが予想される。
【0009】
また精製SAAを免疫原とするときに、その抗原性を高めるために様々な技術を応用することができる。フロイントのコンプリート・アジュバント(以下、FCAと省略する)は免疫原性を高めるために必要な成分の一つである。このほか脂質リポソームにSAAを吸着させて免疫原とする方法も有効である。SAAは多くのほ乳動物がもともと血液中に含んでいる蛋白質であるため、免疫動物に対して抗原性を示しにくいことが指摘されている。これまでに凝集反応に利用できるモノクローナル抗体の報告が無いのは、このSAAの抗原性の低さが原因の一つであると推測される。本発明者らは高度に精製したSAAを用いるとともに、SAAを各種アジュバント成分と組み合せて特殊な形の免疫原とすることによってSAAの抗原性を高め、新たなモノクローナル抗体を得ることに成功した。本発明のモノクローナルを得るために有用なアジュバント成分には、FCAに結核菌菌体を添加したものを示すことができる。結核菌はもともとFCAに含まれる成分であるが、これを増強することにより良い結果を得られる。また百日咳ワクチンを免疫時に筋肉注射する事によってより強い免疫効果が期待できる。
【0010】
こうして得られた本発明のモノクローナル抗体は、SAAと反応して凝集を起こす新規な特徴を備えている。本発明のモノクローナル抗体は凝集活性に優れ、単独でSAAと反応して凝集を示すものさえ存在する。また好ましい組合せにおいては、単独での使用で得ることのできる凝集よりも更に強い凝集反応を期待することができる。
表1に示したモノクローナル抗体の結合親和性を測定してみたところ、例えば次のような結果を得た。親和定数と凝集活性の強さとの間に特別な関連性は見られず、SAAに対するモノクローナル抗体の凝集活性は親和性の強さによって単純に推測することができないものと思われた。
クローン15:8.4×107
クローン16:2.0×108
クローン17:1.0×107
クローン18:8.5×107
更に、本発明者らが実際に得たモノクローナル抗体は、エピトープとしてたとえば図3に示すような領域を認識していたが、エピトープと凝集活性の間には一定の関係を見出すことができなかった。なお図3に示したエピトープは、表1に記載したモノクローナルの代表的なものについて分析した結果である。
したがってSAAを認識するモノクローナル抗体においては、エピトープのみによって凝集活性を予測することは困難なものと推定される。なお本明細書においては次のようなアミノ酸の略号を利用する。
アラニン A or Ala
アルギニン R or Arg
アスパラギン N or Asn
アスパラギン酸 D or Asp
システイン C or Cys
グルタミン Q or Gln
グルタミン酸 E or Glu
グリシン G or Gly
ヒスチジン H or His
イソロイシン I or Ile
ロイシン L or Leu
リジン K or Lys
メチオニン M or Met
フェニルアラニン F or Phe
プロリン P or Pro
セリン S or Ser
トレオニン T or Thr
トリプトファン W or Trp
チロシン Y or Tyr
バリン V or Val
【0011】
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、特許微生物寄託センターに次のような受託番号で寄託されている。
FERM P−15088(ハイブリドーマSAA−7)
FERM BP−5616(ハイブリドーマSAA−17)
FERM BP−5617(ハイブリドーマSAA−21)
FERM P−15093(ハイブリドーマSAA−22)
これらのハイブリドーマは、ラットを先に述べたような方法で免疫して抗体産生細胞を回収し、マウスミエローマ細胞と細胞融合させることによって確立したラット−マウスヘテロハイブリドーマである。これらのハイブリドーマは、ヌードマウスの腹腔に接種すれば腹水を回収してモノクローナル抗体を精製することができる。また適当な培地で培養すれば、培養上清を回収してモノクローナル抗体を精製することも可能である。
【0012】
更に本発明は、次の反応性で特徴付けられるヒトSAAを認識するモノクローナル抗体を含むSAAの免疫学的測定試薬を提供する。
(1)ヒト血清アミロイドAの抗原決定基を認識する
(2)ヒト血清アミロイドAと反応して凝集する
【0013】
本発明のモノクローナル抗体は、複数のモノクローナル抗体を組合せた場合にには先に述べたように組み合わせによって凝集特性に違いが存在する。したがってこのモノクローナル抗体を試薬として利用するときには、期待する感度や測定範囲を容易に実現できるように適当な組み合わせを経験的に選択すると良い。組み合わせるモノクローナル抗体の数は、2種類に限定されるものではなく更に多種類のモノクローナル抗体を組み合わせることも可能である。3種類以上のモノクローナル抗体の組み合わせによって、より安定で強い結合を持つ凝集塊の形成を期待できる。あるいはまた、組み合わせと混合比により凝集の強度や定量範囲をコントロールすることも可能である。
複数のモノクローナル抗体を粒子担体に結合して本発明の試薬を構成するときには、それぞれ単一種のモノクローナル抗体を粒子担体に結合後に混合する方法と、あらかじめ複数種のモノクローナル抗体を混合したものを粒子担体に結合する方法のいずれもが採用できる。前者の方法によれば、クローン間の微妙な結合条件の違いに対応することができ、また抗体の混合比の調整などが容易となるので有利である。
【0014】
本発明の免疫学的測定試薬においては、モノクローナル抗体が遊離の状態で用いられても良いしあるいは不溶性担体に結合していてもよい。好ましい不溶性担体には、ラテックス等の有機合成素材、シリカ、アルミナ、金コロイド等の無機素材からなる粒子状担体を挙げることができる。これらの粒子状担体へモノクローナル抗体を結合するには、化学結合や物理吸着を利用できる。
【0015】
本発明の試薬を構成するモノクローナル抗体は、リウマチ因子や補体による非特異的な影響を抑制することを目的として適当な酵素で消化した断片として用いることもできる。抗体断片としては、ペプシンによるF(ab’)2、パパインによるFab、プラスミンによるFacb’等が知られている。
【0016】
本発明のSAAの免疫学的測定試薬には、この他に公知の成分を組合せることができる。すなわち、免疫反応に必要なpHを与える緩衝剤、免疫反応を促進する反応増強剤、非特異反応を抑制する反応安定剤やブロッカー、試薬の保存性を高めるアジ化ナトリウムのような防腐剤等を組合せても良い。
【0017】
緩衝剤としては、次のようなものが利用されている。
GOOD緩衝剤
2−モルホリノエタンスルホン酸(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid、MESと省略する)
ピペラジン−ビス(2−エタンスルホン酸)(Piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)、PIPESと省略する)
(2−アセトアミド)−2−アミノエタンスルホン酸(N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid、ACESと省略する)
ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoehtanesulfonic acid、BESと省略する)
ビス(2−ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン(Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane、Bis−Trisと省略する)
3−[ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(3-[N,N-Bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid、DIPSOと省略する)
2−ヒドロキシエチルピペラジン−3−プロパンスルホン酸(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-3-propanesulfonic acid、EPPSと省略する)
ヒドロキシエチルピペラジン−2−エタンスルホン酸(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid 、HEPESと省略する)
2−ヒドロキシエチルピペラジン−2−ヒドロキシプロパン−3−スルホン酸(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-hydroxypropane-3-sulfonic acid、HEPPSOと省略する)
3−(モルホリノ)プロパンスルホン酸(3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid、MOPSと省略する)
3−(モルホリノ)−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid 、MOPSOと省略する)
ピペラジン−ビス(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)(Pioerazine-N,N'-bis(2-hydroxypropanesulfonic acid)、POPSOと省略する)
N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid 、TAPSと省略する)
トリス(ヒドロキシメチル)メチル−2−ヒドロキシ−3−アミノプロパンスルホン酸(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid、TAPSOと省略する)
トリス(ヒドロキシメチル)メチル−2−アミノメタンスルホン酸(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid、TESと省略する)
その他の緩衝剤
2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−1、3−プロパンジオール(2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol)
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)とも呼ばれる
リン酸緩衝液
アンモニウム緩衝液
これらの緩衝剤の中でも、HEPESやPIPES等のGOOD緩衝剤は、免疫反応に有利なpHを与えるのみならず、蛋白質への影響が小さいので特に好ましい緩衝剤として挙げられる。
【0018】
また反応増強剤としては、ポリエチレングリコールや硫酸デキストラン等が知られている。更に反応安定剤やブロッカーとしては、BSA(ウシ血清アルブミン)、動物血清、IgG、IgG断片(FabやFc)、アルブミン、乳蛋白、アミノ酸、ポリアミノ酸、コリン、ショ糖等の多糖類、ゼラチン、ゼラチン分解物、カゼイン、グリセリン等の多価アルコール等が免疫反応において反応の安定化や非特異反応の抑止に有効なことが知られている。
【0019】
これらの各種成分を含む本発明によるSAAの免疫学的測定試薬は、溶液状態で、あるいは乾燥状態で供給することができる。溶液状態で流通させるには、蛋白の安定性を高めることを目的として、更に各種界面活性剤、糖、不活性蛋白等を加えても良い。これらの安定化剤は、試薬を乾燥するときにも安定剤として、あるいは賦形剤として有効である。
【0020】
本発明によるSAAの免疫学的測定は、先に述べたSAAの免疫学的測定試薬により実現する。試薬が凝集反応用のものであれば、凝集反応の進行を光学的に、もしくは肉眼によって追跡する事によって行う事ができる。
【0021】
【作用】
本発明のモノクローナル抗体は、凝集反応による免疫学的測定を可能にする。これまでに知られていたSAAに対するモノクローナル抗体は、凝集反応を構成するには親和性が不十分なためELISA法のような限られた測定方法に用途が限定されていた。本発明のモノクローナル抗体は、SAAと反応して凝集するという新しい特徴を持つ。この特徴によって簡便性に優れる凝集反応に基づいたSAAの測定方法を提供することができるのである。
【0022】
【発明の効果】
本発明の新規なモノクローナル抗体の提供によって、SAAの凝集反応を使った免疫学的測定方法の特異性が向上し、試薬品質の安定化にも貢献する。これまでは特異性を得にくいうえ、均一な品質の維持が困難なポリクローナル抗体に頼らざるをえなかったSAAの凝集反応に基づく免疫学的な測定を、モノクローナル抗体によって実現できるのである。しかも本発明のモノクローナル抗体は、SAAと反応して強く凝集し十分な感度と測定範囲を実現する。
【0023】
【実施例】
1.SAA免疫原の調製
1−1.SAAの精製
SAA高値血清(100μg/ml)1L を出発原料とし、まず超遠心法により比重1.23の上層部を採取、次いで比重1.063の下層部を採取し、冷却下メタノール/エーテル (1:3)で脱脂後、セファデックスG−200カラム(6M 尿素、0.5%Tween 20を含む0.01M トリス−塩酸緩衝液pH 8.6で平衡化)にアプライし、更にブロムシアンで活性化したセファロース4B(ファルマシア) に常法により、 抗ApoA−I抗体、抗ApoCIII抗体、および抗ヒト血清アルブミン抗体を結合させたカラムに通して夾雑蛋白を除去し、1Lの血清より精製SAA30mgが得られた。 精製SAAはSDS−PAGEにより、分子量12000の位置に単一のバンドを示し、他のアポリポ蛋白抗体とは反応しなかった。また、アミノ酸配列はN末端からSer Phe Phe Ser PheLeu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr であり、データベース検索から、ダウレット他の報告(Biochem.27:P1677,1988 )によるN末端のArg を欠いたformII, IVと同一であることがわかった。
【0024】
2.モノクローナル抗体
2−1.ラットの免疫
1で精製したSAA100μg/頭と人型結核菌4mg/mlを加えたFCAで常法によりエマルジョンを作製し、9週齢のWKAH/HKmラットのメスに免疫した。同時に沈降精製百日咳ジフテリア破傷風混合ワクチン(武田薬品工業製)100μl/頭を左後肢腿に筋肉注射した。
この後3週おきにSAA50μg/頭をFCAと常法によりエマルジョンとしたものを免疫原として腹腔内注射し、定期的に採血してELISAで抗体価を測定した。ELISAの操作は次のとおりである。
【0025】
2−2.SAA抗体のELISA
抗体価の測定と抗原特異的抗体活性の確認は、ELISAで行った。ブロック、コンジュゲート希釈、血清希釈には1%のBSAを加えた0.15MのNaClを含む20mMリン酸緩衝液(pH7.2、以下BSA−PBSと省略する)を用いた。
精製SAAを10μg/mlとなるように20mMリン酸緩衝液(pH7.2、以下PBSと省略する)に溶解し住友ベークライトメディカル社製60穴テラサキプレート(MS−31600)に10μl/well入れ37℃で2時間感作し、PBSで洗浄後1%BSA−PBSを10μl/well入れ、37℃で2時間ブロックし、4℃で保存する。
プレートをPBSで1回洗浄後、抗体活性を調べようとする検体10μlをテラサキプレートに採り37℃で30分インキュベートした。このプレートをPBSで3回洗浄し、1%BSA−PBSで10,000倍に希釈した市販の抗ラットIgG−PODコンジュゲート(Cappel社製)10μlを入れ、37℃30分インキュベートし、PBSで3回洗浄後、OPDと過酸化水素を含む基質液10μlを加え37℃で30分インキュベートして発色を測定した。陰性対照として1%BSA−PBSを、陽性対照として102に希釈した免疫ラット血清10μlを用意し、検体にかえて同じ操作を行った。
【0026】
2−3.細胞融合とクローニング
ELISAによる抗体価が104に上昇したことを確認したところで、生理食塩水に溶解したSAA50μgを腹腔内注射し3日後に脾臓を摘出した。 脾細胞を採取してRPMI1640培地で洗浄し、マウスミエローマ細胞X−63−Ag8−653とポリエチレングリコール(以下PEGと省略する)法によって細胞融合させた。融合条件は次のとおりである。すなわち、脾細胞:ミエローマ細胞が3:1となるように遠心管に分注し、50%PEG溶液1mlを加え、更に加温した50mlのRPMI1640をゆっくり加えてPEGを希釈した。次いで遠心してPEGを除き、脾細胞として7.1×105/wellとなるようにHAT培地に分散し、これを96穴プレートにプレーティングした。
HATセレクション後にほとんどのウエルでコロニーが観察された。各ウエルの培養上清はPOD標識抗ラットIgG抗体を用いてELISAでスクリーニングし、発色した30ウエルからクローニングを始め、3回から4回の限界希釈法によるクローニングを行い、最終的にSAAとの反応性を示すIgGクラスのモノクローナル抗体を産生する13クローンを確立した。マウスを用いた方法、あるいはラットを用いても従来の免疫法ではこのように多くのクローンを安定して確立することは困難であったが、今回採用した免疫法では同時に多くのクローンを得ることができた。この13クローンを以下の反応性の確認に用いた。
【0027】
3.モノクローナル抗体による試薬の調製
2で得たハイブリドーマ13クローンを、それぞれプリスタン処理したヌードマウス(BALB/c−nu)の腹腔に接種し2週間後腹水を採集した。この腹水を遠心(3000rpm、5分)後、上清から硫安分画によってモノクローナル抗体を沈殿させた。沈殿を回収してPBSに溶解し、同じPBSに対して透析し抗SAAモノクローナル抗体(10mg/ml)とした。用いたモノクローナル抗体のサブクラスは以下のとおりである。サブクラスは、Bethyl社製抗ラットサブクラス抗血清と培養上清とのオクテロニー法で決定した。
クローン 3:IgG2a
クローン 6:IgG2b
クローン 7:IgG2a
クローン14:IgG2c
クローン15:IgG2a
クローン16:IgG2a
クローン17:IgG1
クローン18:IgG2a
クローン20:IgG2a
クローン21:IgG2a
クローン22:IgG2a
クローン25:IgG2a
クローン27:IgG2a
【0028】
各抗SAAモノクローナル抗体をポリスチレンラテックス(平均粒径0.109μm)に37℃で1時間物理吸着させ、最終的にラテックス濃度1%となるように分散媒(1%BSAを含む0.1MのHEPES緩衝液pH7.4)に懸濁させて13種類のSAAラテックス凝集反応用試薬(以下単に乳液と呼ぶ)を得た。
【0029】
4.モノクローナル抗体の反応性
3で得た各乳液を単独あるいは2種づつを等量混合し、合計91種類の試薬を調製し、これをSAAと反応させることによって凝集の有無を観察した。凝集反応は吸光度分析による免疫学的ラテックス凝集反応測定システムLA−2000(栄研化学・アナリティカルインスツルメント製、商品名)で確認した。測定条件は次のとおりである。この条件によって、反応開始後400秒間の吸光度の差がDOSとして算出される。この値は、LA−2000に固有の値である。結果は表1に示した。
SAA濃度 :31.5μg/ml
検体量 :20μl
乳液量 :300μl
吸光度の測定 :400秒
【0030】
【表1】
【0031】
各組合わせのDOSを表にした。表中、1クローンのみの反応(対角線上に位置する)は点線で囲い、DOSが単独の乳液でのDOSの1/2の和より10%以上高い(凝集が混合で促進されている)組合わせは斜体で示した。この結果から、単独でも凝集を示すモノクローナル抗体を得たことが確認できた(クローン17や21)。また2つのモノクローナル抗体を組み合わせる(つまり乳液を混合する)ことによって、単独の乳液より強い凝集の見られる組み合わせが多数観察された。組み合わせによって凝集を増強するパターンを示す組み合わせの中には、単独では凝集しないものの、特定のモノクローナル抗体と組み合わせることよって非常に強力な凝集能を持つようになる場合も観察された。たとえばクローン7はクローン3やクローン21と、またクローン21はクローン17等と組み合わせた時に大きな凝集能を示している。特に強い凝集が観察されたものを実線で囲んで示した。
他方、混合することによって単独の場合よりも凝集が弱くなるケース(表中で下線で示した)も多く観察され、単に複数種のモノクローナル抗体を組み合わるだけでは凝集の強化にはつながらないことが確認された。
なお凝集能の有無は次の基準によって判断した。まず、0.1MのHEPES緩衝液(pH7.4)のみを測定して装置自身の光学的なバラ付きを測定する(20)。更に空試験として同じ緩衝液を検体として試薬ブランクを取る(−11〜+10)。試薬ブランクの平均値(0.93)に標準偏差(2.93)の2倍を加え、更に装置のバラ付き幅を加えた値(試薬ブランク+2SD+光学装置のばらつき幅)を基準として、この基準よりも大きな値を示す時に凝集したと判断した。今回の実験では、この値は27である。したがって表中の数値が27を越えているものは、凝集していると判断できる。
【0032】
5.複数のモノクローナル抗体の組み合わせ
4で得た2種類の組み合わせの結果を参考にして、3種類以上の組み合わせについても凝集活性を調査した。表1に示したクローンNo.のうち、7、17、21、および22の各モノクローナル抗体で個別に調製した乳液を用意し、これをいろいろな割合で混合して複数種のモノクローナル抗体からなるSAAの凝集反応用試薬を作成した。この複数のモノクローナル抗体からなる乳液を用いて、4と同じ操作により様々な濃度のSAA含有血清試料を測定した。そして、ポリクローナル抗体によって調製した公知のSAA測定用ラテックス凝集反応試薬(Ann.Clin.Biochem.1993;30:72-76)による測定値との相関を調査した。結果は図1、および図2に示した。
図に示したように、例として示したモノクローナル抗体の組み合わせではいずれもポリクローナル抗体による測定値と高い相関を示した。このように本発明のモノクローナルを利用すれば、モノクローナル抗体の高い特異性を維持しながら、しかもポリクローナル抗体に匹敵する凝集活性を備えた免疫学的測定試薬の提供が可能である。いくつか示したモノクローナル抗体の組み合わせの中で、もっともポリクローナル抗体による測定値との相関が高かったのは、17:21:7:22=1:1:1:1混合の場合であった。(図1)
【図面の簡単な説明】
【図1】複数種のモノクローナル抗体で調製した乳液による測定値(μg/ml、縦軸)と、ポリクローナル抗体で調製した乳液による測定値(μg/ml、横軸)の相関図
【図2】複数種のモノクローナル抗体で調製した乳液による測定値(μg/ml、縦軸)と、ポリクローナル抗体で調製した乳液による測定値(μg/ml、横軸)の相関図
【図3】表1に示したモノクローナル抗体が認識するエピトープをSAAのアミノ酸配列にマッピングした図。
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- 受託番号FERM BP−5616として寄託されたハイブリドーマSAA−17が産生するモノクローナル抗体
- 受託番号FERM BP−5617として寄託されたハイブリドーマSAA−21が産生するモノクローナル抗体
- 次の反応性で特徴付けられるヒト血清アミロイドAを認識する請求項1または請求項2のモノクローナル抗体
(1)ヒト血清アミロイドAの抗原決定基を認識する
(2)ラテックス粒子に担持されたとき単独でヒト血清アミロイドAと反応して凝集する - 受託番号FERM BP−5616として寄託されたハイブリドーマSAA−17
- 受託番号FERM BP−5617として寄託されたハイブリドーマSAA−21
- 受託番号FERM BP−5616として寄託されたハイブリドーマSAA−17が産生するモノクローナル抗体を含む、免疫学的測定試薬
- 受託番号FERM BP−5617として寄託されたハイブリドーマSAA−21が産生するモノクローナル抗体を含む、免疫学的測定試薬
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