ES2327821T3 - Receptor soluble heterodimerico de citoquinas. - Google Patents

Abstract

Un receptor soluble aislado que comprende una subunidad IL-22R y una subunidad IL-20RB, donde la subunidad IL-22R comprende un polipéptido que comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 12, 13, 25, 26, 31 y 32, y la subunidad IL-20RB comprende un polipéptido que comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 28, 29, 34 y 35.

Description

Receptor soluble heterodimérico de citoquinas.

Las citocinas son proteínas solubles que influyen en el crecimiento y diferenciación de muchos tipos celulares. Sus receptores están compuestos por una o más proteínas de membrana que unen la citosina con alta afinidad y traducen este evento de unión a la célula a través de porciones citoplásmicas de ciertas subunidades del receptor. Los receptores de citocinas han sido agrupados dentro de varias clases en base a similitudes en sus dominios de unión del ligando extracelular. Por ejemplo, las cadenas del receptor responsables de unir y/o traducir el efecto de interferones (IFNs) son miembros de la familia del receptor de citocinas tipo II (CRF2), en base a un dominio extracelular característico de 200 restos. Las actividades demostradas in vivo de estos interferones ilustran el enorme potencial clínico de, y su necesidad para, otras citocinas, agonistas de citocinas, y antagonistas de citocinas. Algunas citocinas están implicadas en la cascada inflamatoria y pueden promover tales enfermedades como artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, soriasis, enfermedades del corazón, etc. Por ello, existe la necesidad de descubrir citocinas y sus receptores que están implicados en la inflamación. Se pueden usar los receptores solubles aislados de la citosina para inhibir la inflamación mediada por citocinas.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1-8 son representaciones esquemáticas de diferentes realizaciones del receptor soluble de la presente invención.

La presente invención proporciona un receptor soluble aislado que comprende una subunidad IL-22R y una subunidad IL-20RB, donde la subunidad de IL-22R comprende un polipéptido que comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 12, 13, 25, 26, 31, y 32, y la subunidad IL-20RB comprende un polipéptido que comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 28, 29, 34, y 35.

El receptor soluble se puede usar para regular a la baja IL-20 y así tratar enfermedades inflamatorias tales como soriasis y enfermedades de pulmón inflamado.

La presente invención también proporciona un método para producir un receptor soluble que comprende dominios extracelulares de IL-22R e IL-20RB que comprenden (a) introducir dentro de una célula hospedadora una primera secuencia de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la porción extracelular de IL-22R y el ADN que codifica una región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina; (b) introducir dentro de una célula hospedadora una segunda construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la porción extracelular de IL-20RB y una secuencia de ADN que codifica un dominio de región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina; (c) hacer crecer la célula hospedadora en un medio de crecimiento apropiado bajo condiciones fisiológicas para permitir la producción de una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular de IL-22R e IL-20RB; y (d) aislar el polipéptido de la célula hospedadora, donde el dominio extracelular de IL-22RB es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 12 y 13, y el dominio extracelular de IL-20RB es un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 16, 17, 18, 19, 20, y 21.

IL-29 se llamó formalmente "Zcyto10" (solicitud de patente internacional NO. WO 99/27103) y tiene las secuencias aminoacídicas de SEQ ID Nos: 1-9. Un receptor heterodimérico que se une a IL-20 está compuesto por dos cadenas, una cadena alfa y una cadena beta. La cadena alfa es denominada como IL-22R (llamada formalmente Zcyto11). Véase la Patente de EE.UU. No. 5.965.704. La cadena beta, denominada en lo sucesivo como IL-20RB, llamada formalmente D1RS1. Véase la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US99/03735. La presente invención es un receptor soluble comprendido por el dominio extracelular de IL-22R y el dominio extracelular de IL-20RB, tal como se define en las reivindicaciones.

La presente invención abarca un receptor soluble aislado, tal como se define en las reivindicaciones, comprendido por una subunidad "IL-22R" y una subunidad "IL-20RB", donde la subunidad IL-22R está comprendida por un polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 11, 12, y 13, y la subunidad IL-20RB está comprendida por el polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 14-23. Las subunidades IL-22R e IL-20RB generalmente están unidas juntas por un enlazador polipeptídico. La unión puede ser por cualquier medio, pero generalmente por un enlace peptídico o enlace disulfuro entre un polipéptido conectado a la subunidad IL-22R y un polipéptido conectado a la subunidad IL-20RB. La presente solicitud también describe polinucleótidos aislados que codifican los nuevos polipéptidos IL-22R e IL-20RB de la presente invención.

En una realización la subunidad IL-22R está unida a la región constante de la cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina (Ig) o una porción de la misma y la subunidad IL-20RB está unida a la región constante de la cadena ligera de una molécula de IG de forma que la región constante de la cadena ligera está unida por enlace disulfuro a la región constante de la cadena pesada, generalmente a un resto de cisteína en la región bisagra de la cadena pesada. También se puede dar lo opuesto, la subunidad IL-22R puede estar unida a la región constante de la cadena ligera de una molécula de Ig y la subunidad IL-20RB puede estar unida a la región constante de la cadena pesada de una molécula de IG.

En una realización del receptor soluble de la presente invención, la subunidad IL-22R unida a la región constante de la cadena pesada está comprendida por una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 25, 26, 31 y 32 y la subunidad IL-20RB unida a la región constante de la cadena ligera de la molécula de IG está comprendida por una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 28 y 29.

La presente solicitud también describe un método para inhibir interleucina-20 (IL-20), que comprende administrar a un individuo un polipéptido heterodimérico IL-22R/IL-20RB.

La presente solicitud también describe un método para inhibir IL-20, que comprende administrar a un anticuerpo que se una a IL-22R.

La presente solicitud además describe un polinucleótido que codifica el dominio extracelular de IL-22R y el dominio extracelular de IL-20RB. Un ejemplo de tal polipéptido es un vector o plásmido que contiene un polinucleótido que codifica IL-22R e IL-20RB.

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Definiciones

Antes de exponer la invención en detalle, ayuda a entender la misma para al definir los siguientes términos.

Los términos "amino terminal" y "carboxilo terminal" se usan en la presente memoria para indicar las posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando el contexto lo permite, estos términos se usan en referencia a una secuencia o porción particular de un polipéptido para indicar la proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia colocada próxima al extremo carboxilo terminal con respecto a una secuencia referencia dentro de un polipéptido está localizada próxima al extremo carboxilo terminal de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo terminal del polipéptido completo.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "proteína de unión a anticuerpo" se refiere a una molécula recombinante que comprende un componente de anticuerpo y un agente terapéutico. Ejemplos de agentes terapéuticos adecuados para tales proteínas de fusión incluyen inmunomoduladores ("proteína de fusión inmunomoduladora de anticuerpos") y toxinas ("proteína de fusión toxina-anticuerpo").

El término "par complemento/anti-complemento" indica restos no idénticos que forman un par estable, no asociado covalentemente en condiciones apropiadas. Por ejemplo, biotina y avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de un par complemeto/anti-complemento. Otro par complemento/anti-complemento de ejemplo incluye pares receptor/ligando, pares anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítopo), pares de polinucleótidos sentido/antisentido, y similares. Cuando se desea la disociación posterior del par complemento/anti-complemento, el par complemento/anti-complemento preferiblemente tiene una afinidad de unión de <10^{9} M^{-1}.

El término "complementos de una molécula de polinucleótido" es una molécula de polinucleótido que tiene secuencia de base complementaria y orientación inversa en comparación con la secuencia de referencia.

El término "contiguo" indica un polinucleótido que tiene un estiramiento continuo secuencia idéntica o complementaria con otro polinucleótido. Las secuencias contiguas se dice que "solapan" un estiramiento dado de secuencia polinucleotídica tanto en su totalidad como a lo largo de un estiramiento parcial del polinucleótido.

El término "secuencia nucleotídica degenerada" indica una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (en comparación con una molécula polinucleotídica de referencia que codifica un polipéptido). Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo resto de aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC codifican Asp).

El término "vector de expresión" se usa para indicar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés operativamente unido a segmentos adicionales que mantiene su transcripción. Tales segmentos adicionales incluyen secuencias promotoras y terminadoras, y también pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores de selección, un potenciador, una señal de poliadenilación, etc. Los vectores de expresión generalmente derivan de ADN de plásmido o de virus, o pueden contener elementos de ambos.

El término "aislado", cuando se aplica a un polinucleótido, indica que el polinucleótido ha sido separado de su entorno genético natural y por ello, está libre de otras secuencias codificantes extrañas o indeseables, y está en una forma adecuada para uso dentro de sistemas de producción de proteínas manipuladas genéticamente. Tales moléculas aisladas son aquellas separadas de su medio natural e incluyen ADNc y clones genómicos. Las moléculas aisladas de ADN de la presente invención están libres de otros genes con los que normalmente están asociadas, pero pueden incluir regiones 5' y 3' que se dan de forma natural tales como promotores y terminadores. La identificación de regiones asociadas será evidente para un experto en la materia (véase, por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316:774-78 (1985).

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Un polipéptido o proteína "aislados" es un polipéptido o proteína que se encuentra en una condición distinta de su medio natural, tal como fuera de la sangre o del tejido animal. En una forma preferida, el péptido aislado está sustancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal. Es preferible proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada, es decir, superior al 95% puros, más preferiblemente superior al 99% puros. Cuando se usa en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o alternativamente glicosilados o formas derivatizadas.

El término "operativamente unido", cuando se refiere a segmentos de ADN, indica que los segmentos están organizados de forma que funcionan conjuntamente para sus propósitos previstos, por ejemplo, la transcripción se inicia en el promotor y sigue a lo largo del segmento codificante hasta el terminador.

Un "polinucleótido" es un polímero de bases desoxirribonucleótidas o ribonucleótidas de cadena sencilla o doble que se lee desde el extremo 5' hasta el 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden ser aislados de fuentes naturales, sintetizados in vitro, o preparados a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de los polinucleótidos se expresan en pares de bases (abreviado "pb"), nucleótidos ("nt") o kilobases ("kb"). Donde el contexto lo permita, los dos últimos términos pueden describir polinucleótidos de una sola hebra o de doble hebra. Cuando el término se aplica a moléculas de doble hebra, se usa para indicar la longitud total y se entenderá que es equivalente al término "pares de bases". Se reconocerá por los expertos en la materia que las dos hebras de un polinucleótido de doble hebra puede diferir ligeramente en longitud y que los extremos del mismo pueden ser fraccionados como resultado de escisión enzimática; por ello, todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótido de doble hebra pueden no estar emparejados. Tales extremos no emparejados, en general, no excederán de 20 nucleótidos de longitud.

Un "polipéptido" es un polímero de restos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, tanto si se produce de forma natural como sintética. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 restos de aminoácidos comúnmente se denominan como "péptidos".

El término "promotor" se una en la presente memoria para su significado reconocido en el estado de la técnica para indicar una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que mantienen la unión de la ARN polimerasa e inician la transcripción. Las secuencias promotoras comúnmente, pero no siempre, se encuentran en las regiones 5' no codificantes de los genes.

Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos, tales como grupos de carbohidratos. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos pueden ser añadidos a una proteína por la célula en la que se produce la proteína, y variarán con el tipo de célula. Las proteínas se definen en la presente memoria en términos de sus estructuras aminoacídica; sustituyentes tales como grupos carbohidrato generalmente no se especifican, pero aún así, pueden estar presentes.

El término "receptor" indica una proteína asociada a la célula que se une a una molécula bioactiva (es decir, un ligando) y media el efecto del ligando sobre la célula. Los receptores unidos a membrana están caracterizados por una estructura de muti-dominios que comprende un dominio extracelular de unión a ligando y un dominio intracelular efector que típicamente está implicado en la transducción de la señal. La unión del ligando al receptor da como resultado un cambio conformacional en el receptor que causa una interacción entre el dominio efector y otra(s) molécula(s) en la célula. La interacción lleva a una alteración en el metabolismo de la célula. Los acontecimientos metabólicos que están unidos a las interacciones receptor-ligando incluyen transcripción génica, fosforilación, defosforilación, aumentos en la producción de MAP cíclico, movilización de calcio celular, movilización de lípidos de membrana, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos. En general, los receptores pueden estar unidos a membrana, ser citosólicos o nucleares, monoméricos (por ejemplo, receptor de la hormona estimuladora del tiroides, receptor beta-adrenérgico) o multiméricos (por ejemplo, receptor de PDGF, receptor de la hormona de crecimiento, receptor de IL-3, receptor de GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor de eritropoyetina y receptor de IL-6).

El término "secuencia señal secretora" indica una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un "péptido secretor") que, como componente de un polipéptido mayor, dirige al polipéptido mayor a lo largo de una ruta secretora de una célula en la que es sintetizado. El polipéptido mayor normalmente es escindido para separar el péptido secretor durante el tránsito a lo largo de la ruta secretora.

El término "variante de empalme" se usa en la presente memoria para indicar formas alternativas de ARN trascrito a partir de un gen. La variación de empalme se da de forma natural por el uso de lugares de empalme alternativos dentro de una molécula de ARN transcrita, o menos comúnmente entre moléculas de ARN transcritas separadamente, y puede dar como resultado varios ARNm transcritos a partir del mismo gen. Las variantes de empalme pueden codificar polipéptidos que tienen secuencia de aminoácidos alterada. El término variante de empalme también se usa en la presente memoria para indicar una proteína codificada por una variante de empalme de un ARNm trascrito a partir de un gen.

Los pesos moleculares y longitudes de los polímeros determinados por métodos analíticos imprecisos (por ejemplo, electroforesis en gel) se entenderá que son valores aproximados. Cuando tal valor es expresado como "aproximadamente" X o "aproximadamente" X, el valor indicado de X se entenderá que es exacto a \pm 10%.

Tal como se indica más arriba, se definió IL-20 (formalmente llamado Zcyto10) y los métodos para producirlo y los anticuerpos para IL-20 están contenidos en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US98/25228, publicación no. WO 99/27103, publicada el 25 de Noviembre de 1998 y la Solicitud de Patente de EE.UU. No. 09/313.458 depositada el 17 de Mayo de 1999. El polinucleótido y polipéptido de IL-20 Humano se representan por SEQ ID Nos: 1-4, y el IL-20 de ratón por SEQ ID Nos: 5-9.

Se ha descubierto un receptor que se une a IL-20 y es un heterodímero comprendido del polipéptido denominado "IL-22R" y un polipéptido denominado "IL-20RB". El IL-22R, también llamado ZcytoR11, polipéptido, ácido nucleico que lo codifica, anticuerpos para IL-22R, y métodos para producirlos se describen en la Patente de EE.UU. No. 5.965.704 presentada el 12 de Octubre de 1999. Las SEQ ID Nos: 10-12 son los polinucleótidos y polipéptidos de IL-22R. El dominio extracelular de IL-22R Humano está comprendido por SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13.

El dominio extracelular de IL-20RB (SEQ ID Nos: 14-15, y una variante SEQ ID Nos:22 y 23) está comprendido por un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 16-21. Preferiblemente, el dominio extracelular del polipéptido IL-22R y el dominio extracelular del polipéptido IL-20RB están covalentemente unidos. En una realización preferida, una subunidad extracelular del polipéptido tiene una región constante de una cadena pesada de una inmunoglobulina unida a su extremo carboxilo terminal y la otra subunidad extracelular tiene una cadena ligera constante de una inmunoglobulina (Ig) unida a su extremo carboxilo terminal de forma que los dos polipéptidos quedan juntos para formar un receptor soluble y se forma un enlace disulfuro entre las cadenas pesada y ligera de Ig. En otra realización, un enlazador peptídico puede estar unido a los dos extremos carboxilo terminales de los polipéptidos para formar un receptor soluble unido covalentemente.

Las SEQ ID Nos: 24 y 25 son construcciones del dominio extracelular de IL-22R unido a una región constante de una inmunoglobulina gamma 1 matada. SEQ ID NO: 26 es la secuencia madura predicha sin la secuencia señal. SEQ ID NOs: 27 y 28 son construcciones del dominio extracelular de IL-20RB unido a la región constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina kappa humana salvaje. SEQ ID NO: 29 es la secuencia madura predicha sin la secuencia señal. La Figura 1 es una representación esquemática del heterotetrámero.

Las SEQ IDN Nos: 30 y 31 son construcciones del dominio extracelular de IL-22R unido a una región constante de inmunoglobulina gamma 1 Humana mutada. SEQ ID NO: 32 es la secuencia madura predicha sin la secuencia señal. SEQ ID Nos: 33 y 34 son construcciones del dominio extracelular de IL-20RB unido a la región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina kappa Humana salvaje producida según el procedimiento del ejemplo 12. SEQ ID NO: 35 es la secuencia madura predicha sin la secuencia señal. El heterotetrámero resultante no tiene un enlazador polipeptídico entre los dominios extracelulares y el comienzo de las regiones constantes de Ig, 22 en la Figura 1. Más adelante, el término "dominio extracelular de un receptor" significa el dominio extracelular del receptor o una porción del domino extracelular que es necesario para unirse a su ligando, en este caso el ligando es IL-20.

Se pueden unir juntos dominios extracelulares de IL-22R e IL-20RB en un número de formas de forma que el receptor soluble resultante se puede unir a IL-20. Las Figuras 1-8 ilustran un número representativo de realizaciones de la presente invención. Los elementos comunes en cada dibujo tienen el mismo número. La Figura 1 representa la realización de la presente invención de SEQ ID Nos: 24, 25, 26, 27, 28, y 29. La construcción del receptor soluble, denominado 10, está comprendido por dos cadenas polipeptídicas de sitios de unión a IL-20 denominadas 12 y 14. Cada sitio de unión está comprendido por el dominio extracelular de IL-22R, denominado 16, y el dominio extracelular de IL-20RB denominado 18.

El dominio extracelular, 16, de IL-22R está unido al dominio constante pesado uno (CH1), 20, de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina gamma 1 vía el enlazador 22, que es SEQ ID NO: 36. El dominio CH1, 20, luego está unido al dominio CH2, 24, vía una región bisagra. El dominio CH2, 24, está unido al dominio CH3, 26, vía una región bisagra 25.

Comparando la construcción de la Figura 1 con SEQ ID NO: 25, el dominio extracelular maduro, 16, de IL-22R se extiende desde los resto aminoacídica 18, una prolina, hasta e incluyendo el resto aminoacídico 228, una treonina de SEQ ID NO: 25. El enlazador polipeptídico, 22, se extiende desde el resto aminoacídico 229, una glicina hasta e incluyendo el resto aminoacídico 243, una serina, de SEQ ID NO: 25. El dominio CH1, 22 de la Figura 1, se extiende desde el resto aminoacídico 244, una alanina, hasta e incluyendo el resto aminoacídico 341, una valina, de SEQ ID NO: 25. La región bisagra 23 de la Figura 1 se extiende desde el resto aminoacídico 342, un ácido glutámico, hasta e incluyendo el resto aminoacídico 356, una prolina, de SEQ ID NO: 25. Las cadenas 12 y 14 están juntas por enlaces disulfuro por medio de enlaces disulfuro 28 y 30. Los enlaces disulfuro se forman entre las cadenas pesadas por los restos de cisteína en las posiciones 352 y 356 de SEQ ID NO: 25 de cada una de las dos cadenas pesadas.

El dominio extracelular, 18, de IL-20RB está unido a la región constante de la cadena ligera kappa Humana (CL), 34 de la Figura 1 vía un enlazador polipeptídico 32, que es el polipéptido de SEQ ID NO: 36. El dominio extracelular, 18, de IL-20RB se extiende desde el resto aminoacídico 30, una valina, hasta e incluyendo el resto aminoacídico 230, una alanina, de SEQ ID NO: 28. El enlazador polipeptídico, 32, se extiende desde el resto aminoacídico 231, una glicina, hasta e incluyendo el resto aminoacídico 352, una serina, de SEQ ID NO: 28. La región constante ligera kappa, 34, se extiende desde el resto aminoacídico 246, una arginina, hasta e incluyendo el resto aminoacídico final 352, una cisteína, de SEQ ID NO: 28. La cisteína en posición 352 de SEQ ID NO: 28 forma un enlace disulfuro, 36 en la Figura 1, con la cisteína en la posición 346 de SEQ ID NO: 25. La cadena ligera constante 34, por ello, está unida a la región bisagra, 23, por enlace disulfuro, 36. De esta forma, el dominio extracelular, 16, de IL-22R está unido al dominio extracelular, 18, de IL-20RB para formar un receptor soluble.

Si los restos de cisteína en las posiciones 352 y 356 de SEQ ID NO: 25 se cambian por diferentes restos aminoacídicos, los dos polipéptidos de unión a IL-20, 12 y 14, no se unen por enlaces disulfuro y se forma una construcción que se muestra en la Figura 2, que tiene una región bisagra, 27.

La Figura 3 muestra un receptor soluble muy simple 38 de la presente invención, donde el dominio extracelular, 16, de IL-22R está conectado al dominio extracelular, 18, de IL-20RB por medio de un enlazador polipeptídico, 40. El enlazador polipeptídico se extiende desde el extremo amino terminal del dominio extracelular, 16, de IL-22R y está conectado al extremo carboxilo terminal del dominio extracelular, 18, de IL-20RB. El enlazador polipeptídico debe ser entre 100-240 aminoácidos de longitud, preferiblemente aproximadamente 170 restos de aminoácidos de longitud. Un enlazador adecuado debe estar comprendido por restos de glicina y serina. Un enlazador posible puede ser de unidades múltiples de SEQ ID NO: 36, preferiblemente aproximadamente 12.

La Figura 4 muestra una realización que tiene el dominio extracelular, 16, de IL-22 R unido al dominio extracelular, 18, de IL-20RB por medio de enlazador 40, como en la Figura 3. Mientras el dominio extracelular, 16, de IL-22R está unido al dominio CH1, 20, como en la Figura 1 por medio de enlazador polipeptídico 42, que debe ser de aproximadamente 30 restos aminoacídicos de longitud. Un enlazador ideal puede estar comprendido de glicina y serina como en SEQ ID NO: 72, y la secuencia bisagra, 23 de la Figura 1.

La Figura 5 muestra otra realización posible de la presente invención. En esta realización, un enlazador polipeptídico 44 de aproximadamente 15 restos aminoacídicos, por ejemplo SEQ ID NO: 36, une el extremo carboxilo terminal del dominio extracelular, 18, de IL-20RB con el extremo amino terminal del dominio extracelular, 16, de IL-22R. Un enlazador polipeptídico 46 de aproximadamente 30 restos aminoacídicos se extiende desde el extremo carboxilo terminal del dominio extracelular, 16, de IL-22R hasta el dominio CH2. El extremo carboxilo terminal del enlazador 46 preferiblemente puede estar comprendido por la región bisagra que se extiende desde el resto aminoacídico 342, un ácido glutámico, hasta e incluyendo el resto aminoacídico 356, una prolina, de SEQ ID NO: 25. Sin embargo, el enlazador polipeptídico 46 idealmente puede tener al menos un resto de cisteína en su extremo carboxilo terminal de forma que se pueda formar un enlace disulfuro.

El receptor soluble de IL-20 de la Figura 6 es idéntico al de la Figura 1 excepto que el dominio CH3, 26 de la Figura 1, no está presente en la realización de la Figura 6. La región CH3 empieza en el resto aminoacídico 467, una glicina, y se extiende hasta el último resto 573 de SEQ ID NO: 25.

La Figura 7 muestra una construcción del receptor soluble de IL-20 que es idéntica a la construcción de la Figura 1 excepto que los dominios CH2 y CH3 están ausentes. Los dominios CH2 y CH3 van desde el resto aminoacídico 357, una alanina, hasta el final de la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 25.

La Figura 8 muestra una construcción donde ambos IL-22R, 16, e IL-20RB tienen un enlazador polipeptídico, 48, unido a sus respectivos extremos carboxilo terminales. Cada enlazador polipeptídico tiene dos restos de cisteína de forma que, cuando se expresan, las cisteínas formas dos enlaces disulfuro, 50 y 52. En este caso, el enlazador polipeptídico está comprendido por la región bisagra, 23 en la Figura 1. La región bisagra está comprendida por los restos aminoacídicos 342, un ácido glutámico, hasta e incluyendo el resto aminoacídico 356 de SEQ ID NO: 25.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un receptor soluble comprendido por los dominios extracelulares de IL-22R e IL-20RB (tal como se define en las reivindicaciones), que comprende (a) introducir dentro de una célula hospedadora una primera secuencia de ADN comprendida por un promotor transcripcional operativamente unido a una primera secuencia señal secretora seguida aguas abajo por, y en marco de lectura apropiado, el ADN que codifica la porción extracelular de IL-22R y el ADN que codifica una región constante de la cadena ligera de inmuniglobulina; (b) introducir dentro de una célula hospedadora una segunda construcción de ADN comprendida por un promotor transcripcional operativamente unido a una segunda señal secretora seguida aguas abajo por, y en marco de lectura apropiado, una secuencia de ADN que codifica la porción extracelular de IL-20RB y una secuencia de ADN que codifica un dominio de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3 y C_{H}4; (c) hacer crecer la célula hospedadora en un medio de crecimiento apropiado en condiciones fisiológicas que permiten la secreción de una proteína de fusión comprendida por el dominio extracelular de IL-22R e IL-20RB; y (d) aislar el polipéptido de la célula hospedadora. En una realización, la segunda secuencia de ADN además codifica una región bisagra de la cadena pesada de inmunoglobulina donde la región bisagra está unida al dominio de la región constante de la cadena pesada. En otra realización, la segunda secuencia de ADN además codifica una región variable de inmunoglobulina unida agua arriba de, y en marco de lectura apropiado, con la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina.

En una realización alternativa, el método se proporciona para producir un receptor soluble comprendido por los dominios extracelulares de IL-22R e IL-20RB (tal como se define en las reivindicaciones) que comprende (a) introducir dentro de una célula hospedadora una primera secuencia de ADN comprendida por un promotor transcripcional operativamente unido a una primera secuencia señal secretora seguida aguas abajo por, y en marco de lectura apropiado, el ADN que codifica la porción extracelular de IL-22R y el ADN que codifica una región constante de la cadena ligera de inmuniglobulina; (b) introducir dentro de una célula hospedadora una segunda construcción de ADN comprendida por un promotor transcripcional operativamente unido a una segunda señal secretora seguida aguas abajo por, y en marco de lectura apropiado, una secuencia de ADN que codifica la porción extracelular de IL-22R y una secuencia de ADN que codifica un dominio de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3 y C_{H}4; (c) hacer crecer la célula hospedadora en un medio de crecimiento apropiado en condiciones fisiológicas que permiten la producción de una proteína de fusión heterodimérica dimerizada comprendida por el dominio extracelular de IL-22R e IL-20RB; y (d) aislar el polipéptido dimerizado de la célula hospedadora. En una realización, la segunda secuencia de ADN además codifica una región bisagra de la cadena pesada de inmunoglobulina donde la región bisagra está unida al dominio de la región constante de la cadena pesada. En otra realización, la segunda secuencia de ADN además codifica una región variable de inmunoglobulina unida agua arriba de, y en marco de lectura apropiado, con la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina. (Véase Patente de EE.UU. No. 5.843.725).

En otra realización, el método se proporciona para producir un receptor soluble comprendido por los dominios extracelulares de IL-22R e IL-20RB (tal como se define en las reivindicaciones) que comprende (a) introducir dentro de una célula hospedadora una construcción de ADN que contiene una construcción de ADN que codifica la porción extracelular de IL-20RB y una construcción de ADN de la porción extracelular de IL-22R, (b) hacer crecer la célula hospedadora en un medio apropiado en condiciones fisiológicas que permiten la producción del dominio extracelular de IL-22R y del dominio extracelular de IL-20RB; y (c) aislar los polipéptidos de la célula hospedadora.

Otros aspectos de la presente invención incluyen células hospedadoras transformadas o transfectadas con una construcción de ADN que codifica el dominio extracelular de IL-20RB y una construcción de ADN que codifica el domino extracelular de IL-20RB, tal como se define en las reivindicaciones. Ambas construcciones pueden estar en un vector o en vectores separados.

Un polinucleótido, generalmente una secuencia de ADNc, codifica los polipéptidos descritos en la presente memoria. Una secuencia de ADNc que codifica un polipéptido de la presente invención está comprendido por una serie de codones, cada resto aminoacídico del polipéptido es codificado por un codón y cada codón está comprendido por tres nucleótidos. Los restos aminoacídicos están codificados por sus respectivos codones tal como sigue.

Alanina (Ala) está codificado por GCA, GCC, GCG o GCT.

Cisteína (Cys) está codificado por TGC o TGT.

Ácido aspártico (Asp) está codificado por GAC o GAT.

Ácido glutámico (Glu) está codificado por GAA o GAG.

Fenilalanina (Phe) está codificado por TTC o TTT.

Glicina (Gly) está codificado por GGA, GGC, GGG o GGT.

Histidina (His) está codificado por CAC o CAT.

Isoleucina (Ile) está codificado por ATA, ATC o ATT.

Lisina (Lys) está codificado por AAA, o AAG.

Leucina (Leu) está codificado por TTA, TTG, CTA, CTC, CTG o CTT.

Metionina (Met) está codificado por ATG.

Asparagina (Asn) está codificado por AAC o AAT.

Prolina (Pro) está codificado por CCA, CCC, CCG o CCT.

Glutamina (Gln) está codificado por CAA o CAG.

Arginina (Arg) está codificado por AGA, AGG, CGA, CGC, CGG o CGT.

Serina (Ser) está codificado por AGC, AGT, TCA, TCC, TCG o TCT.

Treonina (Thr) está codificado por ACA, ACC, ACG o ACT.

Valina (Val) está codificado por GTA, GTC, GTG o GTT.

Triptófano (Trp) está codificado por TGG.

Tirosina (Tyr) está codificado por TAC o TAT.

Se reconoce que según la presente invención, cuando un polinucleótido se reivindica tal como se describe en la presente memoria, se entiende que lo que se reivindica son tanto la hebra sentido, como la hebra anti-sentido y el ADN como doble hebra que tiene la hebra sentido y anti-sentido hibridadas juntas por sus respectivos enlaces de hidrógeno. También se reivindica el ARN mensajero (ARNm) que codifica los polipéptidos de la presente invención, y cuyo ARNm está codificado por el ADNc descrito en la presente memoria. El ARN mensajero (ARNm) codificará un péptido usando los mismos codones que aquellos definidos en la presente memoria, con la excepción de que cada nucleótido timina (T) es sustituido por un nucleótido uracilo (U).

Un experto en la materia también apreciará que distintas especies pueden exhibir "uso preferente de codones". En general, véanse, Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8:1893-1912 (1980); Haas, et al. Curr. Biol. 6:315-324 (1996); Wain-Hobson, et al., Gene 13:355-364 (1981); Grosjean y Fiers, Gene 18:199-209 (1982); Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075-3087 (1986); Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573-597 (1982). Tal como se usa en la presente memoria, el término "uso preferente de codones" o "codones preferentes" es un término de la materia que se refiere a codones de traducción de proteínas que se usan más frecuentemente en células de ciertas especies, favoreciendo así uno o unos pocos representantes de los posibles codones que codifican cada aminoácido. Por ejemplo, el aminoácido Treonina (Thr) puede ser codificado por ACA, ACC, ACG, o ACT, pero en células de mamífero ACC es el codón más comúnmente usado; en otras especies, por ejemplo, células de insectos, levaduras, virus o bacterias, pueden ser preferentes otros codones de Thr. Los codones preferentes para una especie en particular pueden ser introducidos dentro de los polinucleótidos de la presente invención por una variedad de métodos conocidos en el estado de la técnica. La introducción de secuencias de codones preferentes dentro de ADN recombinante puede, por ejemplo, potenciar la producción de la proteína al hacer la traducción de la proteína más eficaz dentro de un tipo o especie celular en particular. Las secuencias que contienen codones preferentes se pueden ensayas y optimizar para la expresión en varias especies, y se ensayan para su funcionalidad tal como se describe en la presente memoria.

Los métodos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar ARNt son conocidos en el estado de la técnica. La transcripción y traducción de plásmidos que contienen mutaciones sin sentido se lleva a cabo en un sistema libre de células que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas y otros reactivos disponibles comercialmente. Las proteínas son purificadas por cromatografía. Véase, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991); Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991; Chung et al., Science 259:806-809 (1993); y Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-1019 (1993). En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en oocitos de Xenopus por microinyección de ARNm mutado y ARNts supresores químicamente aminoacilados, Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-19998 (1996). Dentro de un tercer método, células de E. coli se cultivan en ausencia de un aminoácido natural que es reemplazado (por ejemplo, fenilalanina) y en presencia del (los) aminoácido(s) no natural(es) deseado(s) (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina, o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido no natural es incorporado dentro de la proteína en lugar de su homólogo natural. Véase, Koide et al., Biochem. 33:7470-7476 (1994). Los restos aminoacídicos naturales se pueden convertir en especies no naturales por modificación química in vitro. La modificación química se puede combinar con mutagénesis dirigida al sitio para expandir de forma adicional el intervalos de sustitución. Wynn y Richards, Protein Sci. 2:395-403 (1993).

Un número limitado de restos aminoacídicos pueden ser sustituidos por aminoácidos no conservados, aminoácidos que no son codificados por el código genético, aminoácidos no naturales, y aminoácidos que no se dan en la naturaleza.

Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención pueden ser identificados según los procedimientos conocidos en el estado de la técnica, tales como mutagénesis dirigida a sitio, o mutagénesis de escrutinio de alanina, Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085 (1989); Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498-502 (1991). En la última técnica, se introducen mutaciones de una sola alanina en cada resto de la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se ensayan para su actividad biológica tal como se describe más abajo para identificar los restos aminoacídicos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699-708, 1996. los lugares de interacción ligando-receptor también se pueden determinar por análisis físico de estructura, como se determina por tales técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción electrónica o etiquetado de fotoafinidad, en conjunto con mutación de aminoácidos putativos de sitio de contacto. Véase, por ejemplo, de Vos et al., Science 255:306-312 (1992); Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992); Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64 (1992).

Se pueden hacer múltiples sustituciones de aminoácidos y se pueden ensayar usando métodos conocidos de mutagénesis y escrutinio, tales como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, Science 241:53-57 (1988) o Bowie y Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156 (1989). En pocas palabras, estos autores describen métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar para un polipéptido, y luego secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permitidas en cada posición. Otros métodos que se pueden usar incluyen exposición de fagos, por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 30:10832-10837 (1991); Ladner et al., Patente de EE.UU. No. 5.223.409; Huse, Publicación WIPO WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a región, Derbyshire et al., Gene 46:145 (1986); Ner et al., DNA 7:127 (1988).

Las variantes de los ADN y las secuencias polipeptídicas de IL-20, IL-22R e IL-20RB descritas se pueden generar por reubicación de ADN tal como se describe en Stemmer, Nature 370:389-391, (1994), Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 (1994) y la Publicación WIPO WO 97/20078. En pocas palabras, las variantes de ADN se generan por recombinación homóloga in vitro por fragmentación al azar de un ADN pariente seguido por re-ensamblaje usando PCR, que da como resultado mutaciones puntuales introducidas al azar. Esta técnica se puede modificar usando una familia de ADNs parientes, tales como variantes alélicas o ADNs de diferentes especies, para introducir variabilidad adicional dentro del proceso. La selección o escrutinio para la actividad deseada, seguidos de iteraciones adicionales de mutagénesis y ensayo proporcionan una rápida "evolución" de secuencias al seleccionar las mutaciones deseadas mientras se seleccionan de forma simultánea frente a cambios perjudiciales.

Los métodos de mutagénesis tal como se describe en la presente memoria se pueden combinar con métodos de escrutinio automatizados y de alto rendimiento para detectar la actividad de los polipéptidos mutagenizados clonados en las células hospedadoras. Las moléculas de ADN mutagenizados que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células hospedadoras y se secuencian rápidamente usando equipos modernos. Estos métodos permiten la rápida determinación de la importancia de restos aminoacídicos individuales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida.

Producción de proteínas

Los polipéptidos se pueden producir en células hospedadoras manipuladas genéticamente según las técnicas convencionales. Las células hospedadoras adecuadas son aquello tipos celulares que pueden ser transformados o transfectados con ADN exógeno y hacerlos crecer en cultivo, e incluyen bacterias, células fúngicas, y células eucariotas superiores cultivadas. Las células eucariotas, particularmente células cultivadas de organismos multicelulares, son preferidas. Las técnicas para manipular moléculas de ADN clonadas e introducir ADN exógeno dentro de una variedad de células hospedadoras se describen por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987).

En general, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido está operativamente unida a otros elementos genéticos necesarios para su expresión, generalmente incluyendo un promotor y terminador de transcripción, dentro de un vector de expresión. Comúnmente, el vector también contendrá uno o más marcadores de selección y uno o más orígenes de replicación, aunque aquellos expertos en la materia reconocerán que dentro de ciertos sistemas, los marcadores de selección pueden proporcionarse en vectores separados, y la replicación del ADN exógeno puede proporcionarse por integración dentro del genoma de la célula hospedadora. La selección de promotores, terminadores, marcadores de selección, vectores y otros elementos es una materia de diseño rutinario dentro del nivel del estado de la técnica. Muchos de estos elementos están descritos en la literatura y están disponibles a través de fabricantes comerciales.

Para dirigir un polipéptido dentro de la ruta secretora de una célula hospedadora, se proporciona en el vector de expresión una secuencia señal secretora (también conocida como una secuencia líder, pre-pro secuencia o pre secuencia). La secuencia señal secretora puede ser esa de los polipéptidos naturales, o puede derivar de otra proteína secretada (por ejemplo, t-PA) o sintetizada de novo. La secuencia señal secretora está operativamente unida a la secuencia de ADN, es decir, las dos secuencias están juntas en el marco de lectura correcto y posicionadas para dirigir el polipéptido nuevamente sintetizado dentro de la ruta secretora de la célula hospedadora. Las secuencias señal secretoras comúnmente están posicionadas 5' en la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias señal secretoras pueden estar posicionadas de cualquier forma en la secuencia de ADN de interés (véanse, por ejemplo., Welch et al., Patente de EE.UU. No. 5,037,743; Holland et al., Patente de EE.UU. No. 5,143,830).

De forma alternativa, la secuencia señal secretora contenida en el polipéptido de la presente invención es usada para dirigir otros polipéptidos dentro de la ruta secretora. La presente invención mantiene tales polipéptidos de fusión. La secuencia señal secretora contenida en los polipéptidos de fusión de la presente invención está preferiblemente unida en el extremo amino terminal a un péptido adicional para dirigir al péptido adicional dentro de la ruta secretora. Tales construcciones tienen numerosas aplicaciones conocidas en el estado de la técnica. Por ejemplo, estas construcciones de fusión de secuencias señal secretoras pueden dirigir la secreción de un componente activo de una proteína que normalmente no se secreta, tal como un receptor. Tales fusiones se pueden usar in vivo o in vitro para dirigir péptidos a través de la ruta secretora.

Las células de mamífero cultivadas son hospedadores apropiados dentro de la presente invención. Los métodos para introducir ADN exógeno dentro de células hospedadoras de mamífero incluyen transfección mediada por fosfato, Wigler et al., Cell 14:725 (1978), Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603 (1981); Graham y Van der Eb, Virology 52:456 (1973), electroporación, Neumann et al., EMBO J. 1:841-845 (1982), trasfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., ibid., y transfección mediada por liposomas Hawley-Nelson et al., Focus 15:73 (1993); Ciccarone et al., Focus 15:80 (1993), y vectores virales, Miller y Rosman, BioTechniques 7:980(1989); Wang y Finer, Nature Med. 2:714 (1996). La producción de polipéptidos recombinantes en células de mamífero cultivadas se describe, por ejemplo, por Levinson et al., Patente de EE.UU. No. 4,713,339; Hagen et al., Patente de EE.UU. No. 4,784,950; Palmiter et al., Patente de EE.UU. No. 4,579,821; y Ringold, Patente de EE.UU. No. 4,656,134. Células de mamífero cultivadas apropiadas incluyen líneas celulares COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314),293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977) y líneas celulares de ovario de hámster chino (por ejemplo. CHO-K1; ATCC No. CCL 61). Líneas celulares adecuadas adicionales se conocen en el estado de la técnica y están disponibles en los depósitos públicos tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland. En general, se prefieren fuertes promotores de transcripción, tales como promotores de SV-40 o citomegalovirus. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 4.956.288. Otros promotores adecuados incluyen aquellos de los genes de metalotioneína (Patente de EE.UU. Nos. 4.579.821 y 4.601.978) y el promotor tardío principal de adenovirus.

La selección de fármacos generalmente se usa para seleccionar células de mamífero cultivadas dentro de las cuales se ha insertado ADN extraño. Tales células comúnmente se denominan "transfectantes". Las células que han sido cultivadas en presencia del agente selectivo y son capaces de pasar el gen de interés a su progenie se denominan "transfectantes estables". Un marcador de selección preferido es un gen que codifica resistencia al antibiótico neomicina. La selección se lleva a cabo en presencia de un fármaco de tipo neomicina, tal como G-418 o similar. Los sistemas de selección también se pueden usar para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso denominado "amplificación". La amplificación se lleva a cabo cultivando los transfectantes en presencia de un bajo nivel del agente selectivo y luego, aumentando la cantidad de agente selectivo para seleccionar células que producen altos niveles de los productos de los genes introducidos. Un marcador de selección amplificable preferido es dihidrofolato reductasa, que confiere resistencia a metotrexato. También se pueden usar otros genes de resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a higromicina, resistencia a múltiples fármacos, puromicina acetiltransferasa). Se pueden usar marcadores alternativos que introducen un fenotipo alterado, tales como proteína verde fluorescente, o proteínas de superficie celular tales como CD4, CD8, MHC de Clase I, fosfatasa alcalina de placenta, para separar células transfectadas de las células no transfectadas, por medios tales como clasificación FACS o tecnología de separación por perlas magnéticas.

También se pueden usar otras células eucariotas superiores como hospedadores, que incluyen células de plantas, células de insectos y células de aves. El uso de Agrobacterium rhizogenes como vector para expresar genes en células de plantas se ha revisado por et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47 (1987). La transformación de células de insecto y la producción de polipéptidos extraños está descrita por Guarino et al., Patente de EE.UU. No. 5,162,222 y la publicación WIPO WO 94/06463. Las células de insectos pueden ser infectadas con baculovirus recombinante, que comúnmente deriva del virus de la polihedrosis de Autograpa californica (AcNPV). El ADN que codifica un polipéptido se inserta dentro del genoma del baculovirus en lugar del gen de la secuencia que codifica la polihedrina AcNPV, por uno de los dos métodos. El primero es el método tradicional de recombinación homóloga del ADN entre AcNPV salvaje y un vector de transfección que contiene el gen flanqueado por secuencias AcNPV. Las células de insecto adecuadas, por ejemplo células SF9, se infectan con AcNPV salvaje y se transfectan con un vector de transfección que comprende un polinucleótido operativamente unido a un promotor, terminador y secuencias de flanqueo del gen de polihedrina AcNPV. Véanse, King, L.A. y Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, (Chapman & Hall, London); O'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (Oxford University Press, New York, New York, 1994); y, Richardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, (Humana Press, Totowa, NJ 1995). La recombinación natural dentro de la célula del insecto dará como resultado un baculovirus recombinante que contiene secuencias codificantes dirigidas por el promotor de la polihedrina. Los conjuntos de virus recombinantes se hacen por métodos usados comúnmente en el estado de la técnica.

El segundo método para hacer baculovirus recombinantes utiliza un sistema basado en transposones descrito por Luckow, V.A, et al., J Virol 67:4566 (1993). Este sistema se vende en el kit Bac-to-Bac (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza un vector de transfección, pFastBac1^{TM} (Life Technologies) que contiene un transposón Tn7 para mover el ADN que codifica el polipéptido dentro de un genoma de baculovirus mantenido en E. coli como un plásmido grande llamado un "bácmido". El vector de transfección pFastBac1^{TM} utiliza el promotor de la polihedrina AcNPV para dirigir la expresión del gen de interés. Sin embargo, pFastBac1^{TM} puede ser modificado en un grado considerable. El promotor de la polihedrina puede ser separado y sustituido por el promotor de la proteína básica de baculovirus (también conocido como Pcor, p6.9 o promotor MP), que se expresa de forma temprana en la infección por baculovirus, y ha mostrado se ventajosos para expresar proteínas secretadas. Véanse, Hill-Perkins, M.S. y Possee, R.D., J Gen Virol 71:971 (1990); Bonning, B.C. et al., J Gen Virol 75:1551 (1994); y, Chazenbalk, G.D., y Rapoport, B., J Biol Chem 270:1543 (1995). En dichas construcciones de vectores de transfección, se puede usar una versión corta o langa del promotor de la proteína básica. Además, se pueden construir vectores de transfección que reemplazan las secuencias señal secretoras naturales por secuencias señal secretoras que derivan de proteínas de insecto. Por ejemplo, se puede usar una secuencia señal secretora de Ecdisteroide Glucosiltransferasa (EGT), Melittina de aveja (Invitrogen, Carlsbad, CA), o baculovirus gp67 (PharMingen, San Diego, CA) en construcciones para reemplazar la secuencia señal secretora natural. Además, los vectores de transfección pueden incluir una fusión en-marco con el ADN que codifica una etiqueta epítopo en el extremo C- o N- terminal del polipéptido expresado, por ejemplo, una etiqueta epítopo Glu-Glu, Grussenmeyer, T. et al., Proc Natl Acad Sci. 82:7952 (1985). Usando una técnica conocida en el estado de la técnica, un vector de transfección que contiene un gen recombinante es transformado dentro de E. coli, y escrutado por bácmidos que contienen un gen lacZ interrumpido indicativo de baculovirus recombinante. El ADN del bácmido que contiene el genoma del baculovirus recombinante se aísla, usando técnicas comunes, y se usa para transfectar células de Spodoptera frugiperda, por ejemplo células Sf9. El virus recombinante que expresa el polipéptido se produce posteriormente. Los conjuntos de virus recombinantes se hacen por métodos conocidos en el estado de la técnica.

El virus recombinante se usa para infectar células hospedadoras, típicamente una línea celular derivada de la oruga negra, Spodoptera frugiperda. Véase, en general, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 1994). Otra línea celular adecuada es la línea celular High FiveO^{TM} (Invitrogen) que deriva de Trichoplusia ni (Patente de EE.UU. # 5.300.435). Los medios libres de suero disponibles comercialmente se usan para crecer y mantener las células. Medios adecuados son Sf900 II^{TM} (Life Technologies) o ESF 921^{TM} (Expression Systems) para las células Sf9; y Ex-ce110405^{TM} (JRH Biosciences, Lenexa, KS) o Express FiveO^{TM} (Life Technologies) para las células T. Ni. Las células se hacen crecer a partir de una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 10^{5} células hasta una densidad de 1-2 x 10^{6} células, en cuyo tiempo se añade un conjunto de virus recombinantes a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 a 10, más típicamente cerca de 3. Las células infectadas con virus recombinantes típicamente producen el polipéptido recombinante a las 12-72 horas tras la infección y lo secretan con eficacia variable dentro del medio. Normalmente, el cultivo se recolecta 48 horas tras la infección. Se usa la centrifugación para separar las células del medio (sobrenadante). El sobrenadante que contiene el polipéptido se filtra a través de filtros microporo, normalmente de 0,45 \mum de tamaño de poro. Los procedimientos usados generalmente se describen en manuales de laboratorio disponibles (King, L. A. y Possee, R.D., ibid., O'Reilly, D.R. et al., ibid.; Richardson, C. D., ibid.).Se puede lograr la purificación posterior del polipéptido a partir del sobrenadante usando métodos descritos en la presente memoria.

También se pueden usar células fúngicas, incluyendo células de levaduras, dentro de la presente invención. Las especies de levadura de particular interés para este propósito incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y Pichiamethanolica. Los métodos para transformar células de S. Cerevisiae con ADN exógeno y producir polipéptidos recombinantes del mismo se describen por, por ejemplo, Kawasaki, Patente de EE.UU. No. 4.599.311; Kawasaki et al., Patente de EE.UU. No. 4.931.373; Brake, Patente de EE.UU. No. 4.870.008; Welch et al., Patente de EE.UU. No. 5.037.743; y Murray et al., Patente de EE.UU. No. 4.845.075. Las células transformadas se seleccionan por fenotipo determinado por el marcador de selección, comúnmente resistencia a fármacos o la capacidad de crecer en ausencia de un nutriente en particular (por ejemplo, leucina). Un sistema de vector preferido para uso en Saccharomyces cerevisiae es el sistema vector POT1 descrito por Kawasaki et al. (Patente de EE.UU. No. 4.931.373), que permite a las células transformadas ser seleccionadas por crecimiento en medio que contiene glucosa. Promotores y terminadores adecuados para uso en levaduras incluyen aquellos de genes de enzimas glicolíticas (véanse, por ejemplo, Kawasaki, Patente de EE.UU. No. 4.599.311; Kingsman et al., Patente de EE.UU. No. 4.615.974; y Bitter, Patente de EE.UU. No. 4.977.092) y genes de la alcohol deshidrogenasa. Véanse también las Patentes de EE.UU. Nos. 4.990.446; 5.063.154; 5.139.936 y 4.661.454. Los sistemas de transformación para otras levaduras, que incluyen Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa se conocen en el estado de la técnica. Véanse, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986) y Cregg, Patente de EE.UU. No. 4.882.279. Las células de Aspergillus pueden ser utilizadas según los métodos de McKnight et al., Patente de EE.UU. No. 4.935.349. Los métodos para transformar Acremonium chrysogenum se describen por Sumino et al., Patente de EE.UU. No. 5.162.228. Los métodos para transformar Neurospora se describen por Lambowitz, Patente de EE.UU. No. 4.486.533.

El uso de Pichia methanolica como hospedador para la producción de proteínas recombinantes se describe en las Publicaciones WIPO WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, y WO 98/02565. Las moléculas de ADN para usar en la transformación de P. methanolica se prepararán comúnmente plásmidos de como hebra doble y circulares, que preferiblemente se hacen lineales antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanolica, se prefiere que el promotor y el terminador en el plásmido sea el del gen de una P. methanolica, tal como el gen de utilización de alcohol de P. methanolica (AUG1 o AUG2). Otros promotores útiles incluyen aquellos de los genes de la dihidroxiacetona sintasa (DHAS), la formato deshidrogenasa (FMD), y la catalasa (CAT). Para facilitar la integración del ADN dentro del cromosoma del hospedador, se prefiere tener el segmento entero de expresión del plásmido flanqueado en ambos extremos por secuencias de ADN hospedador. Un marcador de selección preferido para usar en Pichia methanolica es un gen ADE2 de P. methanolica, que codifica la fosforribosil-5-aminoimidazol carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21), que permite a las células hospedadoras ade2 crecer en ausencia de adenina. Para procesos industriales a gran escala, donde es deseable minimizar el uso de metanol, se prefiere usar células hospedadoras en las que los genes de utilización del metanol (AUG1 y AUG2) están delecionados. Para la producción de proteínas secretadas, se prefieren las células hospedadoras deficientes en genes de la proteasa vacuolar (PEP4 y PRB1). Se usa la electroporación para facilitar la introducción de un plásmido que contiene ADN que codifica un polipéptido de interés dentro de células de P. methanolica. Se prefiere transformar células de P. methanolica por electroporación usando un campo eléctrico pulsado que decae de forma exponencial que tiene una fuerza de campo desde 2,5 a 4,5 kV/cm, preferiblemente aproximadamente 3,75 kV/cm, y un tiempo constante (t) desde 1 a 40 milisegundos, lo más preferiblemente aproximadamente 20 milisegundos.

Las células hospedadoras procariotas, incluyendo cepas de la bacteria Escherichia coli, Bacillus y otros géneros, también son células hospedadoras útiles dentro de la presente invención. Las técnicas para transformar estos hospedadores y expresar secuencias de ADN extrañas clonadas en las mismas son bien conocidas en el estado de la técnica; véase, por ejemplo, Sambrook et al., ibid.). Cuando se expresa un polipéptido en bacterias tales como E. coli, el polipéptido puede estar conservado en el citoplasma, típicamente como gránulos insolubles, o puede ser dirigido al especio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células se lisan, y se recuperan los gránulos y desnaturalizan usando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado luego se puede replegar y dimerizar diluyendo el desnaturalizador, tal como por diálisis frente a una solución de urea y una combinación de glutation reducido y oxidado, seguido de diálisis frente a una solución salina tamponada. En el último caso, el polipéptido se puede recuperar del espacio periplásmico en una forma soluble y funcional al romper las células (por, por ejemplo, sonicación o choque osmótico) para liberar los contenidos del espacio periplásmico y recuperar la proteína, obviando así la necesidad de desnaturalización y replegamiento.

Las células hospedadoras transformadas o transfectadas se cultivan según procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes necesarios para el crecimiento de las células hospedadoras elegidas. Se conocen en el estado de la técnica una variedad de medios adecuados, que incluyen medios definidos y medios complejos y generalmente incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios también pueden contener dichos componentes como factores de crecimiento o suero, como se necesite. El medio de crecimiento generalmente seleccionará las células que contienen el ADN añadido de forma exógena por, por ejemplo, selección de fármacos o deficiencia en un nutriente esencial, que es complementado por el marcador de selección llevado en el vector de expresión o co-transfectado dentro de la célula hospedadora. Las células de P. methanolica se cultivan en un medio que comprende fuentes adecuadas de carbono, nitrógeno y nutrientes traza a una temperatura de aproximadamente 25ºC a 35ºC. Los cultivos líquidos están proporcionados con suficiente aireación por medios convencionales, tales como agitación de matraces pequeños o flotación de fermentadores. Un medio de cultivo preferido para P. methanolica es YEPD (D-glucosa al 2%, Bacto^{Tm} Peptone al 2% (Difco Laboratories, Detroit, MI), extracto de levaduras Bacto^{Tm} al 1% (Difco Laboratories), adenina al 0,004% y L-leucina al 0,006%).

Aislamiento de Proteínas

Se prefiere purificar los polipéptidos de la presente invención a una pureza \geq 80%, más preferiblemente \geq 90% de pureza, incluso más preferiblemente \geq 95% de pureza, y particularmente preferido es un estado farmacéuticamente puro, que es más del 99,9% de pureza con respecto a macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libre de agentes infecciosos y pirogénicos. Preferiblemente, un polipéptido purificado está sustancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal.

Los polipéptidos recombinantes expresados (o polipéptidos quiméricos) pueden ser purificados usando métodos y medios de purificación por fraccionamiento y/o convencionales. Se puede usar la precipitación con sulfato amónico o extracción con ácido o caotropo para el fraccionamiento de muestras. Las etapas de purificación ejemplares pueden incluir hidroxiapatito, exclusión por tamaño, FPLC y cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa. Los medios adecuados para cromatografía incluyen dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices especiales, y similares. Se prefieren PEI, DEAE, QAE y derivados de Q. Medios cromatográficos ejemplares incluyen aquellos medios derivatizados con grupos fenilo, butilo, u octilo, tales como F Fenil-Sepharose (Pharmacia), Toyopearl Butilo 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octil-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Soporte sólidos adecuados incluyen perlas de vidrio, resinas basadas en sílice, resinas celulósicas, perlas de agarosa, perlas de agarosa reticulada, perlas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticulada y similares que son insolubles en condiciones en las que se usan. Estos soporte pueden ser modificados con grupos reactivos que permiten la unión de proteínas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o restos de carbohidratos. Ejemplos de compuestos químicos acoplantes incluyen activación con bromuro de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo, activación con hidracina, y derivados carboxilo y amino para compuestos químicos acoplantes de carbodiimida. Estos y otros medios sólidos son bien conocidos y ampliamente usados en el estado de la técnica, y están disponibles por fabricantes comerciales. Los métodos para unir polipéptidos de receptores al medio de soporte son bien conocidos en el estado de la técnica. La selección de un método en particular es una materia de diseño rutinario y se determina en parte por las propiedades del soporte. Véase, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988).

Los polipéptidos pueden ser aislados explotando sus propiedades. Por ejemplo, se puede usar cromatografía de adsorción iónico inmovilizada en metal (IMAC) para purificar proteínas ricas en histidina, incluyendo aquellas que comprenden etiquetas de polihistidina. En pocas palabras, primero un gel se carga con iones metálicos divalentes para formar un quelato, Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985). Las proteínas ricas en histidina se adsorberán a esta matriz con afinidad diferente, dependiendo del ión metálico usado, y se eluirán por elusión competitiva, disminuyendo el pH, o uso de fuertes agentes quelantes. Otros métodos de purificación incluyen purificación de proteínas glicosiladas por cromatografía de afinidad a lectina y cromatografía de intercambio iónico. Una proteína unida a la porción Fc de una inmunoglobulina puede ser purificada usando una "columna de Proteína A". Methods in Enzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.),page 529-539 (Acad. Press, San Diego, 1990). Dentro de realizaciones adicionales de la invención, se puede construir una fusión del polipéptido de interés y una etiqueta de afinidad (por ejemplo, proteína de unión a maltosa, un dominio de inmunoglobulina) para facilitar la purificación.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígeno, tales como fragmentos proteolíticos F(ab')_{2} y Fab. También se incluyen anticuerpos o fragmentos intactos genéticamente manipulados, tales como anticuerpos quiméricos, fragmentos Fv, anticuerpos de cadena sencilla y similares, así como péptidos y polipéptidos sintéticos de unión a antígenos. Los anticuerpos no Humanos pueden ser Humanizados injertando CDRs no Humanos en el marco y regiones constantes Humanas, o incorporando los dominios variables no Humanos enteros (opcionalmente "encubriéndolos" con una superficie de tipo Humano reemplazando los restos expuestos, donde el resultado es un anticuerpo "cubierto"). En algunos casos, los anticuerpos Humanizados pueden mantener restos no Humanos dentro de los dominios variables de la región marco Humana para potenciar las características de unión. Al Humanizar los anticuerpos, la semi-vida biológica se puede aumentar, y se reduce el potencial de reacciones inmunes adversas en la administración a seres Humanos.

Se puede utiliza una variedad de ensayos conocidos por aquellos expertos en la materia para detectar anticuerpos que se unen a proteína o péptido. Ejemplos de ensayos se describen en detalle en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (Eds.) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Ejemplos representativos de tales ensayos incluyen: inmunoelectroforesis simultánea, radioinmunoensayo, radioinmuno-precipitación, ensayo inmunisobente unido a enzima (ELISA), ensayo de transferencia puntual o transferencia Western, ensayo de inhibición o competición, y ensayo sándwich.

Los receptores solubles de la presente invención se pueden usar para regular a la baja IL-20, que ha mostrado estar implicado en un número de procesos inflamatorios. Especialmente, IL-20 ha mostrado que regula al alza IL-8- Las enfermedades inflamatorias en las que IL-8 juega un papel significativo, y por lo que una disminución de IL-8 podría ser beneficios son, enfermedad respiratoria del adulto (ARD), choque séptico, fallo multiorgánico, daño inflamatorio pulmonar tal como asma o bronquitis, neumonía bacteriana, soriasis, eczema, dermatitis atópica y de contacto, y enfermedad inflamatoria del intestino tal como colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn. Así, el receptor soluble de IL-20 de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, puede estar para tratar estas enfermedades.

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Biología de IL-20, su Receptor y su Papel en la Soriasis

Se identificaron dos receptores de citosina de clase II huérfanos, ambos expresados en piel, como subunidades del receptor de IL-20. Ambas subunidades del receptor de IL-20 son necesarias para la unión al ligando, que distinguen su papel de aquellas subunidades en los otros cuatro receptores de citocina de clase II conocidos. IL-20 e IL-20RB también están co-expresados en un número de tejidos Humanos además de en piel, que incluye ovario, glándula adrenal, testículos, glándula salival, músculo, pulmón, riñón, corazón y en un menor grado el intestino delgado, que sugieren tejidos diana adicionales para la acción de IL-20. Se concluye que el receptor heterodimérico de IL-20 es estructuralmente similar a otros receptores de citosina de clase II y se expresa en piel donde se ha demostrado actividad del ligando de IL-20.

Dos líneas de evidencia indican que el papel de IL-20 y su receptor están implicados en la soriasis. Esta enfermedad multigénica de la piel está caracterizada por aumento en la proliferación de queratinocitos, diferenciación alterada de queratinocitos, e infiltración de células inmune dentro de la piel. La primera línea de evidencia para un papel de IL-20 en la soriasis es la hiperqueratosis observada y el engrosamiento de la epidermis en ratones transgénicos que asemejan las anormalidades de la soriasis en seres Humanos. El descenso en el número de tonofilamentos, que se piensa está relacionado con defecto de queratinización, es una característica llamativa de la soriasis en seres Humanos. Se han encontrado inclusiones intramitocondriales en condiciones de hiperplasias de la piel de forma natural o química en ratones. La causa de las inclusiones y sus efectos sobre la función mitocondrial, si los hay, son desconocidos. Se concluye que los ratones transgénicos IL-20 exhiben muchas de las características observadas en la soriasis en seres Humanos.

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Uso de Antagonistas para IL-20 para Tratar la Soriasis

Tal como se indica en la discusión de más arriba y en los ejemplo de más abajo, IL-20 está implicado en la patología de la soriasis. Así, los receptores solubles de la presente invención pueden regular a la baja IL-20 y, por ello, tratar la soriasis.

La soriasis es una de las enfermedades dermatológicas más comunes, que afecta hasta el 1 al 2 por ciento de la población mundial. Es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel caracterizada por pápulas eritematosas, claramente demarcadas y placas redondeadas, cubiertas por escamas micáceas plateadas. Las lesiones de la piel de la soriasis son pruríticas de forma variable. Las áreas traumatizadas, a menudo desarrollan lesiones de soriasis. Adicionalmente, otros factores externos pueden exacerbar la soriasis, incluyendo infecciones, estrés, y medicación, por ejemplo, litio, beta bloqueantes y fármacos contra la malaria.

La variedad más común de soriasis se llama tipo placa. Los pacientes con soriasis de tipo placa tendrán placas que crecen de forma lenta y estable, que permanece básicamente sin cambios durante largos periodos de tiempo. Las áreas más comunes donde se da la soriasis en placa son los codos, rodillas, la hendidura del glúteo y el cuero cabelludo. La implicación suele ser simétrica. La soriasis inversa afecta a las regiones intertriginosas que incluyen las axilas, ingle, región submamaria, y ombligo, y también tiende a afectar al cuero cabelludo, las palmas y las plantas. Las lesiones individuales son placas claramente demarcadas pero pueden estar húmedas debido a su localización. La soriasis de tipo placa generalmente se desarrolla lentamente y tiene un curso indoloro. Raramente remite de forma espontánea.

La soriasis en erupción en más común en niños y adultos jóvenes. Se desarrolla con agudeza en individuos sin soriasis o en aquellos con soriasis de placa crónica. Los pacientes presentan muchas pápulas eritematosas pequeñas en escala, frecuentemente tras infección del tracto respiratorio superior con estreptococos beta-hemolíticos. Los pacientes con soriasis también pueden desarrollar lesiones pustulosas. Estas pueden estar localizadas en las palmas y plantas o pueden ser generalizadas y estar asociadas con fiebre, malestar, diarrea, y artalgias.

Aproximadamente la mitad de los pacientes con soriasis tienen implicación de la uña, donde aparece una lesión puntiforme en este lugar, engrosamiento de la uña o hiperqueratosis subungual. Aproximadamente del 5 al 10 por ciento de pacientes con soriasis tienen complicaciones articulares asociadas, y estas se encuentran más frecuentemente en pacientes con implicación de la uña. Aunque algunos tienen la incidencia coincidente de artritis reumatoide aguda, muchos tienen enfermedad articular que cae dentro de uno de los cinco tipos asociadas con la soriasis: (1) enfermedad limitada a una sola o unas pocas articulaciones (70 por ciento de los casos); (2) una enfermedad de tipo artritis reumatoide sero-negativa; (3) implicación de las articulaciones interfalángeas distales; (4) artritis destructiva severa con la implicación de "artritias mutilans"; y (5) enfermedad limitada a la columna.

La soriasis se puede tratar con antagonistas para IL-20. Los antagonistas preferidos son un receptor soluble para IL-20, tal como se define en las reivindicaciones. Los antagonistas para IL-20 pueden ser para administrar solos o en combinación con otras terapias establecidas, tales como lubricantes, queratinolíticos, corticosteroides tópicos, derivados tópicos de la vitamina D, antralina, antimetabolitos sistémicos tales como metotrexato, terapia de luz ultravioleta-psolaren (PUVA), etretinato, isotretinoina, ciclosporina, y el derivado tópico de la vitamina D, calcipotriol. El receptor soluble puede ser para administrar al individuo de forma subcutánea, intravenosa, o transdérmica usando una crema o parche transdérmico que contiene el antagonista de IL-20. Para la administración de forma subcutánea, el antagonista puede ser por inyección dentro de una o más placas soriásicas. Para la administración transdérmica, el antagonista puede ser para administrar directamente sobre las placas usando una crema que contiene el antagonista para IL-20.

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Uso de Antagonistas para IL-20 para Tratar Condiciones Inflamatorias del Pulmón

Un receptor soluble de IL-20 de la presente invención puede ser para administrar a una persona que tiene asma, bronquitis o fibrosis quística u otra enfermedad inflamatoria de pulmón para tratar la enfermedad. El antagonista puede ser para administrar por cualquier método adecuado incluyendo intravenoso, subcutáneo, lavado bronquial, y el uso de inhalador que contiene un antagonista para IL-20.

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Administración del Receptor Soluble de IL-20

Las cantidades del IL-20 soluble necesarias para una terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes, que incluyen medios de administración, lugar diana, estado fisiológico del paciente, y otras medicaciones administradas. Por ello, las posologías de tratamiento deber estar tituladas para optimizar la seguridad y eficacia. Típicamente, las posologías usadas in vitro pueden proporcionar una guía útil en las cantidades útiles para la administración in vivo de estos reactivos. Los ensayos animales de dosis eficaces para el tratamiento de enfermedades en particular proporcionarán indicaciones predictivas adicionales de la posología en seres Humanos. Los métodos para la administración incluyen administración oral, intravenosa, peritoneal, intramuscular, transdérmica o administración dentro del pulmón o tráquea en forma de pulverización por medio de un nebulizador o atomizador. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, suero salino, tampones, sólo para nombrar unos pocos. Los intervalos de posología normalmente deben se esperados de 1 \mug a 1000 \mug por kilogramo de peso corporal por día. Una posología para un adulto medio, del receptor soluble de IL-20 puede ser aproximadamente 25 mg dados dos veces por semana como una inyección subcutánea. Las inyecciones se pueden dar en el lugar de las lesiones soriásicas para el tratamiento de la soriasis. Para la administración subcutánea o intravenosa del antagonista para IL-20, el receptor soluble o anticuerpo puede estar en suero salino fosfato tamponado. También en enfermedades de la piel tal como soriasis, el antagonista para IL-20 puede ser administrado vía un ungüento o parche transdérmico. Las dosis deben ser superiores o inferiores tal como se determinan por un médico con conocimiento de la materia. Para una completa discusión de formulaciones e intervalos posológicos de fármacos véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., (Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1996), and Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 9th Ed. (Pergamon Press 1996).

La invención está además ilustrada por los siguientes ejemplos no limitantes:

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Ejemplo 1 Regulación al alza de IL-8 por IL-20 Métodos

Se sembraron, en el pasaje 2, queratinocitos neonatales Epidérmicos Humanos Normales (NHEK) (de Clonetics) y se hicieron crecer hasta confluencia en placas de cultivo tisular de 12 pocillos. KGM (el medio de crecimiento de Queratinocitos) se adquirió de Clonetics. Cuando las células alcanzaron la confluencia, se lavaron con medio KGM mínimo en factores de crecimiento = KGM (medio basal de queratinocitos). Las células se privaron de suero en KGM durante 72 horas antes de añadir los componentes de ensayo. Se usó trombina a 1 I.U./ml y tripsina a 25 nM como controles positivos. Se añadió un ml de medio/pocillo. Sólo se usó KGM como control negativo.

IL-20 se hizo en medio KGM y se añadió en varias concentraciones, de 2,5 \mug/ml a 618 ng/ml en un primer experimento y de 2,5 \mug/ml a 3 ng/ml en un segundo experimento.

Las células se incubaron a 37ºC, con CO_{2} al 5% durante 48 horas. Se separaron los sobrenadantes y se congelaron a -80ºC durante varios días antes de ensayarlas para los niveles de IL-8 y GM-CSF.Se usaron los kits de Inmunoensayo de IL-8 Humano # D8050 (RandD Systems, Inc.) y de Inmunoensayo de GM-CSF Humano # HSGMO (RandD Systems, Inc.) para determinar la producción de citocinas siguiendo las instrucciones del fabricante.

Resultados

Los resultados indicaron que la expresión de IL-8 y GM-SCF se inducía por IL-20.

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Ejemplo 2 Clonación de IL-20RB Clonación de la región codificante de IL-20RB

Se diseñaron dos cebadores de PCR basados en la secuencia de la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US
99/03735 (No. de publicación WO 99/46379) depositada el 8 de Marzo de 1999. SEQ ID NO: 38 contiene el codón ATG (Met1) con un sitio de restricción EcoRI, SEQ ID NO: 37 contiene un codón de parada (TAG) con un sitio de restricción XhoI. La amplificación por PCR se llevó a cabo usando una ADNteca de ADNc de queratinocito Humano (HaCaT) como molde y SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 38 como cebadores. La reacción de PCR se llevó a cabo como sigue: incubación a 94ºC durante 1 minutos, seguido de 30 ciclos de 94ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 2 minutos, tras 68ºC adicionales durante 4 minutos, la reacción se almacenó a 4ºC. Los productos de la PCR se probaron en un gel de Agarosa al 1%, y se observó una banda de ADN de 1 kb. Los productos de la PCR se cortaron del gel y se purificó al ADN usando un kit de Extracción en Gel QIAquick (Qiagen). El ADN purificado se digirió con EcoRI y XhoI, y se clonó dentro de un vector pZP que se llamó pZP7N. Un plásmido pZP es un vector de expresión de mamíferos que contiene un conjunto de genes de expresión que tiene el promotor de la metalotioneína-1 de ratón, el péptido líder tPA Humano, múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias codificantes, una etiqueta Glu-Glu, y un terminador de la hormona de crecimiento Humana. El plásmido también tiene un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión del marcador de selección de mamíferos que tiene un promotor de SV40, un potenciador y un origen de replicación, así como un gen DHFR, y el terminador de SV40. Se secuenciaron varios clones de IL-20RB-pZP7N. Todos ellos contiene tres mutaciones no conservadas en comparación con la secuencia de IL-20RB de PCT/US99/03735: (secuencia IL-20RB-pZP7N), 146 Pro (CCC) - Thr (ACC), 148 His (CAT) - Asp (GAT), y 171 Thr (ACG) - Arg (AGG).

Para verificar las tres sustituciones en el clon IL-20RB-pZP7N, se llevó a cabo una amplificación por PCR usando tres fuentes diferentes de ADNc maratón de piel de feto, ADN de ADNteca HaCaT, y ADN de ADNteca de músculo liso prostático - como moldes. Los productos de la PCR se purificaron en gel y se secuenciaron. La secuencia de cada uno de los tres productos de la PCR fue consistente con la del clon IL-20RB-pZP7N. IL-20RB es SEQ ID NO: 22 y 23, y el dominio extracelular madura es SEQ ID NO: 21.

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Ejemplo 3 Unión de IL-20 al Heterodímero IL-20RB/IL-22R

Se usó un ensayo de unión basado en células para verificar si IL-2 se une al heterodímero IL-22R-IL-20RB.

Los vectores de expresión que contienen receptores de citocinas de clase II conocidos y huérfanos (incluyendo IL-22R e IL-20RB) se transfectaron de forma transitoria dentro de células Baf3.

Se sembraron las células a 5000 células/pocillo, se trataron con IL-20 (zcyto10), MDA-7, y Proteínas Solubles.

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\vtcortauna Incubación a 37 grados durante 3 días (72 horas)

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\vtcortauna Añadir 20 ul(pocillo de Azul Alamar, incubación a 37 grados durante toda la noche (24 horas)

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\vtcortauna Lectura en f-Max (Molecular Devices) en la habitación de Robótica en 544 de excitación/590 de emisión.

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Resultados

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\vtcortauna Respuesta proliferativa positiva con tratamientos de IL-20 (zcyto10) y MDA-7 de 0,1 ng/ml a 100 ng/ml en la línea celular Baf3/DIRS1/cytoR11.

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\vtcortauna Una neutralización de la respuesta proliferativa positiva de IL-20 y MDA-7 (mismas concentraciones) cuando IL-20 y MDA-7 se trataron en combinación con el Receptor Soluble IL22R (Sol. Heterodimérica R.) en un exceso molar de 60 veces.

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\vtcortauna Una neutralización de la respuesta proliferativa positiva MDA-7 (de 0,1 ng/ml a 10 ng/ml) cuando MDA-7 se trata en combinación con el Receptor Soluble IL20RB (versión de trombina escindida) en un exceso molar de 60 veces.

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Ejemplo 4 Regulación al alza de Citocinas Inflamatorias por Tratamiento Celular con IL-20 Tratamiento Celular

La línea celular de queratinocitos Humanos, HaCaT se hizo crecer a 37ºC varios días tras confluencia en matraces de cultivo T-75. En este punto, se separó el medio de crecimiento normal (DMEM + FBS al 10%) y se reemplazó con medio libre de suero. Luego, las células se incubaron durante dos días a 37ºC. Luego, el DMEM se separó y cuatro matraces de células por tratamiento se trataron con cada una de las siguientes condiciones durante cuatro horas a 37ºC: IL-1 alfa recombinante Humana (rh) a 5 ng/ml, IL-1 alfa rh a 20 ng/ml, IL-1 alfa rh a 5 ng/ml + IL-20 a 1 \mug/ml, IL-20 a \mug/ml o IL-1 alfa rh a 10 ng/ml.

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Aislamiento de ARN

Tras el tratamiento con citocinas, se separó el medio y las células se lisaron usando una solución de tiocianato de guanidinio. Se aisló el ARN total del lisado celular por centrifugación durante toda la noche en un gradiente de cloruro de cesio. Al día siguiente, se resuspendió el sedimento de ARN en una solución TE/SDS y se precipitó con etanol. Luego, se cuantificó el ARN usando un espectrofotómetro, seguido de un tratamiento con DNasa según la Sección V.B del Manual de Usuario de los Ensayos de Expresión de ADNc Atlas^{TM} de Clontech (versión PT3140-1/PR9X390, publicado el 11/5/99). La calidad de las muestras de ARN se verificó por cálculos de pureza basados en lecturas de espectro, y por visualización en gel de agarosa. La contaminación genómica de las muestras de ARN se descartó por análisis de PCR del gen de la beta-actina.

Se siguieron los protocolos de Clontech para el enriquecimiento poliA+, la síntesis de sondas y la hibridación para ensayos Atlas^{TM} (véase más arriba, el Manual de Usuario del Sistema de Etiquetado de ARN Puro Total de plus Atlas^{TM}, PT3231-1/PR96157, publicado el 6/22/99). En pocas palabras, se aisló ARN poliA+ de 50 mg de ARN total usando perlas magnéticas cubiertas con estreptavidina (de Clontech, Palo Alto, CA) y un separador magnético de partículas. Luego, el ARN poliA+ se etiquetó con ^{alfa32}P-dATP vía RT-PCR. Se usaron en la reacción los cebadores CDS Clontech específicos para los genes 268 en el ensayo citocina/receptor Humanos de Atlas^{TM} (Cat. #7744-1). Se aisló la sonda etiquetada usando una cromatografía de columna y se contaron en líquido de centelleo.

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Ensayo de Hibridación en membrana

Los ensayos Atlas^{TM} se pre-hibridaron con 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado por calor de Clontech ExpressHyb plus durante al menos treinta minutos a 68ºC con agitación continua. Luego, las membranas se hibridaron con 1,9 X 10^{6} CPM/ml (un total de 1,14 x 10^{7} CPM) durante toda la moche a 68ºC con agitación continua. Al día siguiente, se lavaron las membranas durante cinco minutos en SSC 2X. Luego, las membrana del ensayo se colocaron un sobres de plástico Kodak sellados y se expusieron a una pantalla de imagen de fósforo durante toda la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, se escanearon las pantallas de fósforo en un aparato de imágenes de fósforo y se analizaron usando el software AtlasImage^{TM} 1.0 de Clontech.

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Resultados Genes regulados al alza por IL-20

1.

El Factor de Necrosis Tumoral (TNF) se reguló al alza por IL-20 1,9-2,4 veces.

2.

Los factores de crecimiento placentario 1 y 2 (PLGF) se regularon al alza por IL-20 1,9-2-0 veces.

3.

El receptor del factor II de coagulación se reguló al alza por IL-20 2.0-2,5 veces.

4.

El receptor de calcitonina se reguló al alza por IL-20 2,2-2,3 veces.

5.

La proteína TSG-6 de unión a hialuronidato inducida por TNF se reguló al alza por IL-20 2,1-2,2 veces.

6.

El precursor del receptor-1 del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), el receptor de tirosina-protein quinasa (FLT-1) (SFLT) se reguló al alza por IL-20 2,1-2,7 veces.

7.

MRP-8 (proteína de unión a calcio en macrófagos relacionados con MIF) se reguló al alza por IL-20 2,9-4,1 veces.

8.

MRP-14 (proteína de unión a calcio en macrófagos relacionados con MIF) se reguló al alza por IL-20 3,0-3,8 veces.

9.

La relaxina H2 se reguló al alza por IL-20 3,14 veces.

10.

El receptor III del factor de crecimiento beta transformante (TGF\beta) de 300 kDa se reguló al alza por IL-20 2,4-3,6 veces.

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Genes que muestran Sinergia con el Tratamiento de IL-20 + IL-1

1.

La proteína 2a morfogénica de hueso se reguló al alza 1,8 veces solo con el tratamiento de IL-20, 2,5 veces solo con el tratamiento de IL-1, y 8,2 veces con el tratamiento de IL-20 e IL-1 juntos.

2.

MRP-8 se reguló al alza 2,9 veces solo con el tratamiento de IL-20, 10,7 veces solo con el tratamiento de IL-1, y 18,0 veces con el tratamiento de IL-20 e IL-1 juntos.

3.

La proteína de diferenciación eritroide se reguló al alza 1,9 veces solo con el tratamiento de IL-20, 9,7 veces solo con el tratamiento de IL-1, y 19,0 veces con el tratamiento de IL-20 e IL-1 juntos.

4.

MRP-14 (proteína de unión a calcio en macrófagos relacionados con MIF) se reguló al alza 3,0 veces solo con el tratamiento de IL-20, 12,2 veces solo con el tratamiento de IL-1, y 20,3 veces con el tratamiento de IL-20 e IL-1 juntos.

5.

El factor de crecimiento de tipo EGF de unión a heparina se reguló al alza 2,0 veces solo con el tratamiento de IL-20, 14 veces solo con el tratamiento de IL-1, y 25,0 veces con el tratamiento de IL-20 e IL-1 juntos.

6.

La proteína de tipo beta-tromboglobulina se reguló al alza 1,5 veces solo con el tratamiento de IL-20, 15 veces solo con el tratamiento de IL-1, y 27 veces con el tratamiento de IL-20 e IL-1 juntos.

7.

El factor neurotrófica derivado de cerebro (BDNF) se reguló al alza 1,7 veces solo con el tratamiento de IL-20, 25 veces solo con el tratamiento de IL-1, y 48 veces con el tratamiento de IL-20 e IL-1 juntos.

8.

El factor quimiotáctico y activador de miocitos MCAF se reguló al alza 1,3 veces solo con el tratamiento de IL-20, 32 veces solo con el tratamiento de IL-1, y 56 veces con el tratamiento de IL-20 e IL-1 juntos.

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Ejemplo 5 Fenotipo Transgénico de IL-20

IL-20 Humano y de ratón se sobre expresaron en ratones transgénicos usando una variedad de promotores. El promotor de albúmina de ratón específico de hígado, que dirige la expresión de IL-20 Humano, se usó inicialmente en un intento de lograr niveles circulantes de proteína. Los estudios posteriores se condujeron usando el promotor de queratina 14 (K14), que principalmente se dirige a la expresión a la epidermis y otros epitelios escamosos estratificados; el promotor de la metalotioneína-1 de ratón, que da un amplio patrón de expresión; y el promotor E\muLCK, que dirige la expresión en células de la línea linfoide. Se obtuvieron resultados similares en los cuatro casos, debido posiblemente a que estos promotores dan niveles circulantes de IL-20.

En todos los casos, Los cachorros transgénicos que expresan IL-20 eran menores que los miembros de la camada no transgénicos, tenían una apariencia reluciente con piel tirante y arrugada y seca dentro de los primeros días tras el nacimiento. Los cachorros tenían leche en sus estómagos, que indica que fueron capaces de succionar. Estos ratones tenían extremidades, regiones de la cola, aletas de la nariz y de la boca hinchadas, y tenían dificultad para moverse. Además, los ratones eran débiles, con falta de tejido adiposo visible y tenían desarrollo retardado de orejas y dedos de las patas. Niveles bajos de expresión en hígado (menos de 100 moléculas de ARNm/célula) fueron suficientes para las anormalidades de la piel y la muestra neonatal. Los ratones transgénicos sin fenotipo visible o no expresaron el transgén, o no lo expresaron a niveles detectables, o eran mosaicos.

El análisis histológico de la piel de ratones transgénicos IL-20 mostró una epidermis engrosada, hiperqueratosis y estrato córneo compactado en comparación con los miembros de la camada no transgénicos. Ocasionalmente se observaron cortezas serocelulares (costras). El análisis de microscopio electrónico (EM) de la piel de ratones transgénicos mostró inclusiones lipoides intramitocondriales, gránulos moteados de queratohialina, y relativamente pocos tonofilamentos similares a los observados en la piel soriásica Humana y en modelos de enfermedad de la piel en ratón. Además, muchos de los ratones transgénicos tenían linfocitos apoptóticos en el timo. No se detectaron otras anormalidades por análisis histopatológico. Estos resultados histológicos y de EM soportan y extienden el grosor observado en las alteraciones de la piel.

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Ejemplo 6 Procedimientos Experimentales Ensayo de Luciferasa

Los ensayos de descripción de luciferaza se llevaron a cabo usando células BHK transfectadas de forma estable con IL-22R e IL-20RB y usando el conjunto de genes descriptivo de la luciferaza dirigido por STAT. Las células se cambiaron a medio libre de suero durante toda la noche antes del tratamiento con diluciones seriadas de IL-19, IL-20, y MDA-7 en presencia y ausencia del receptor soluble IL-20RA/IL-20RB. Las células se lisaron y se leyeron en el Berthold MicroLumat Plus para la actividad descriptiva de la luciferaza.

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Ensayo de Proliferación BaF3

Los ensayos de proliferación usaron Azul Alamar, que se añadió a las células 24 horas antes de leerse en un lector de placas fmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) usando el programa Softmax Pro.

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Análisis de RT-PCR sobre Tejidos Humanos

Se llevó a cabo la RT-PCR sobre un panel Rapid-Scan de expresión de genes Humanos (Origene Technologies, Inc.) usando cebadores 5'- ccccagacacggtctacagcat-3' y 5'-gggtcaggccgaagaactcatat-3' para amplificar un fragmento de 440 pb de IL22R Humano. Las condiciones de PCR fueron 94ºC durante 2 minutos, seguido de 35 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 72ºC durante 90 segundos, luego una etapa de extensión final de 72ºC durante 2 minutos.

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Resultados

Ya que IL-22R es una subunidad alfa compartida, se evaluó un panel Origene para la expresión del ARNm de IL-22R. La expresión más alta de IL-22Rse detectó en el páncreas, con piel y pulmón exhibiendo también fuerte expresión.

Para ensayos la posibilidad de que la subfamilia de IL-20 puede activar otras combinaciones de receptores de Clase II, Las células BaF3 se transfectaron de forma estable con subunidades de receptor de Clase II solos o en combinación y tratados con los ligandos. El ensayo muestra que IL-20 y MDA-7 estimulan un complejo de receptor adicional que consiste en IL-22R/IL-20RB (Tabla 1). Luego, se quiso determinar qué receptores solubles pueden bloquear la actividad del ligando. Tal como se menciona más arriba, el receptor soluble heterodimérico IL-20RA/IL-20RB bloqueaba la proliferación estimulada por IL-20, IL-19 y MDA-7. Además, el receptor soluble IL-20RB sólo bloqueaba la actividad de IL-19 y MDA-7, pero no IL-20.

Ya que IL-22R es una subunidad alfa compartida, se evaluó un panel Origene para la expresión de ARNm de IL-22R (Tabla 2). La expresión más alta se detectó en el páncreas con piel y pulmón exhibiendo también fuerte expresión. Por ello, IL-20R\alpha, IL-20R\beta, e IL-22R generales tienen robustas expresiones en piel y pulmón.

Ya que, IL-20R\alpha, IL-20R\beta, e IL-22R están todos expresados en el pulmón, se usó hibridación in situ para evaluar si los mismos tipos celulares expresaban los tres receptores. La Figura 3 muestra que las células epiteliales así como los infiltrados inmunitarios exhiben tinción positiva en secciones de pulmón ensayadas para la expresión de ARNm por hibridación in situ.

<110> Chandrasekher, Yasmin A.

\hskip1cm Novak, Julia E.

\hskip1cm Foster, Donald C.

\hskip1cm Wenfeng, Xu

\hskip1cm Jaspers Stephen R.

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<120> Receptor Soluble Heterodimérico de Citocina

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<130> 01-10PC

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<150> 60/274,560

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<151> 2001-03-09

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<150> 60/299,865

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<151> 2001-06-21

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<160> 40

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<170> FastSEQ para Windows, Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 176

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\hskip1cm1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 152

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\hskip1cm2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip1cm4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 176

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<212> PRT

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<213> Ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2831

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (34)...(1755)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm10

\hskip1cm11

\hskip1cm12

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 574

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm13

\hskip1cm14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 971

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)...(950)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm17

\hskip1cm18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 311

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip1cm19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm20

\hskip1cm21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm23

\hskip1cm24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1382

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (132)...(1034)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip1cm28

\hskip1cm29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip1cm30

\hskip1cm31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1764

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (34)...(1752)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm32

\hskip1cm33

\hskip1cm34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 573

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm35

\hskip1cm36

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 556

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip1cm37

\hskip1cm38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1081

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)...(1067)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm39

\hskip1cm40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 352

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 323

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm42

\hskip1cm43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1714

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (34)...(1707)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm44

\hskip1cm45

\hskip1cm46

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 558

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm47

\hskip1cm48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 541

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm49

\hskip1cm50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1011

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1008)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm51

\hskip1cm52

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 307

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm54

\hskip1cm55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgctcgagcc ttccgcaaac ctatgagatc ca

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaattcga gtctaccaaa tgcagacttt cac

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgccgcgttc ccgagatg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatgaggca gggctgacaa agtt

\hfill

24

Claims (22)

1. Un receptor soluble aislado que comprende una subunidad IL-22R y una subunidad IL-20RB, donde la subunidad IL-22R comprende un polipéptido que comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 12, 13, 25, 26, 31 y 32, y la subunidad IL-20RB comprende un polipéptido que comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 28, 29, 34 y 35.

2. El receptor soluble de la reivindicación 1, donde la subunidad IL-22R y la subunidad IL-20RB están unidas juntas por un enlazador polipeptídico.

3. El receptor soluble de la reivindicación 2, donde el enlazador polipeptídico tiene aproximadamente 100 a 240 restos aminoacídicos.

4. El receptor soluble de la reivindicación 3, donde el enlazador polipeptídico tiene aproximadamente 170 restos aminoacídicos.

5. El receptor soluble de la reivindicación 1, donde la subunidad IL-22R y la subunidad IL-20RB cada una comprenden un enlazador polipeptídico unido a la subunidad, y cada uno de los enlazadores polipeptídicos tiene al menos un resto de cisteína, donde se forma al menos un enlace disulfuro con una cisteína del enlazador polipeptídico de la subunidad IL-22R y con una cisteína del enlazador polipeptídico de la subunidad IL-20RB.

6. El receptor soluble de la reivindicación 5, donde la subunidad IL-22R está unida a toda o una porción de la región constante de una cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina (Ig), y la subunidad IL-20RB está unida a toda o una porción de la región constante de una cadena ligera de una molécula de inmunoglobulina, donde la cadena ligera y la cadena pesada están unidas por enlace disulfuro.

7. El receptor soluble de la reivindicación 6, donde la región constante de la cadena pesada comprende un dominio CH1.

8. El receptor soluble de la reivindicación 6, donde la región constante de la cadena pesada comprende un dominio CH2.

9. El receptor soluble de la reivindicación 6, donde la región constante de la cadena pesada comprende un dominio CH1, un dominio CH2, y una secuencia bisagra que conecta el dominio CH1 con el dominio CH2.

10. El receptor soluble de la reivindicación 6, donde la subunidad IL-22R unida a la región constante de la cadena pesada comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 25, 26, 31 y 32 y la subunidad IL-20RB unida a la región constante de la cadena ligera de la molécula de Ig comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 28, 29, 34 y 35.

11. El receptor soluble de una de las reivindicaciones 6-10, donde el receptor soluble está enlazado con enlaces disulfuro a un receptor soluble de una de las reivindicaciones 6-10.

12. El receptor soluble de la reivindicación 5, donde la subunidad IL-20RB está unida a toda o una parte de la región constante de una cadena pesada de una molécula de Ig, y la subunidad IL-22R está unida a toda o una porción de la región constante de una cadena ligera de una molécula de inmunoglobulina, donde la cadena ligera y la cadena pesada están unidas por enlace disulfuro.

13. El receptor soluble de una de las reivindicaciones 1-12, donde la subunidad IL-22R comprende un polipéptido que comprende una secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 13.

14. El receptor soluble de una de las reivindicaciones 1-12, donde la subunidad IL-20RB comprende un polipéptido que comprende una secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 18.

15. Un método para producir un receptor soluble que comprende dominios extracelulares de IL-22R e IL-20RB que comprende (a) introducir dentro de una célula hospedadora una primera secuencia de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la porción extracelular de IL-22R y el ADN que codifica una región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina; (b) introducir dentro de la célula hospedadora una segunda construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la porción extracelular de IL-20RB y una secuencia de ADN que codifica un dominio de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina; (c) hacer crecer a la célula hospedadora en un medio de crecimiento apropiado en condiciones fisiológicas para permitir la producción de una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular de IL-22R e IL-20RB; y (d) aislar el péptido de la célula hospedadora, donde el dominio extracelular de IL-22R comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 12 y 13, y el dominio extracelular de IL-20RB comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 16, 17, 18, 19, 20 y 21.

16. Un método para producir un receptor soluble que comprende dominios extracelulares de IL-22R e IL-20RB que comprende (a) introducir dentro de una célula hospedadora una primera secuencia de ADN que comprende ADN que codifica la porción extracelular de IL-20RB y el ADN que codifica una región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina; (b) introducir dentro de una célula hospedadora una segunda construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la porción extracelular de IL-22R y una secuencia de ADN que codifica una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina; (c) hacer crecer a la célula hospedadora en un medio de crecimiento apropiado en condiciones fisiológicas para permitir la producción de una proteína de fusión heterodimérica dimerizada que comprende el dominio extracelular de IL-22R e IL-20RB; y (d) aislar el polipéptido dimerizado de la célula hospedadora, donde el dominio extracelular de IL-22R comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 12 y 13, y el dominio extracelular de IL-20RB comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 16, 17, 18, 19, 20 y 21.

17. Un método para producir un receptor soluble que comprende dominios extracelulares de IL-22R e IL-20RB que comprende (a) introducir dentro de una célula hospedadora una construcción de ADN que contiene una construcción de ADN que codifica la porción extracelular de IL-20RB y una construcción de ADN de la porción extracelular de IL-22R; (b) hacer crecer a la célula hospedadora en un medio de crecimiento apropiado en condiciones fisiológicas para permitir la producción del dominio extracelular de IL-22R y el dominio extracelular de IL-20RB; y (d) aislar los polipéptidos de la célula hospedadora, donde el dominio extracelular de IL-22R comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 12 y 13, y el dominio extracelular de IL-20RB comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 16, 17, 18, 19, 20 y 21.

18. Una célula hospedadora transformada o transfectada con una construcción de ADN que codifica el dominio extracelular de IL-22RB y una construcción de ADN que codifica el dominio extracelular de IL-20RB, donde el dominio extracelular de IL-22R comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 12 y 13, y el dominio extracelular de IL-20RB comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID Nos: 16, 17, 18, 19, 20, y 21.

19. Un receptor soluble producido por los métodos de una de las reivindicaciones 15-17.

20. Uso de un receptor soluble aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en soriasis, asma, bronquitis, fibrosis quística, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerativa, y enfermedad de Crohn.

21. El uso de la reivindicación 20, donde dicha enfermedad es soriasis.

22. Un receptor soluble aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en soriasis, asma, bronquitis, fibrosis quística, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerativa, y enfermedad de Crohn.