ES2334140T3 - Anticuerpos anti-il-20 y componentes de union y procedimiento de uso en antiinflamacion. - Google Patents

Anticuerpos anti-il-20 y componentes de union y procedimiento de uso en antiinflamacion. Download PDF

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Abstract

Un hibridoma, que comprende un hibridoma seleccionado del grupo de: (a) el clon de hibridoma 2662.4.1.2.2.1 (ATCC [PTA-5350]); (b) el clon de hibridoma 262.5.1.6.4.4 (ATCC [PTA-5351]); o (c) el clon de hibridoma 262.7.1.3.2.4 (ATCC [PTA-5352]).

Description

Anticuerpos anti-IL-20 y componentes de unión y procedimiento de uso en antiinflamación.
Antecedentes de la invención
Las citocinas son proteínas pequeñas solubles que median una variedad de efectos biológicos que incluyen la regulación del crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de células (véase, por ejemplo, Arai y col., Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul y Seder, Cell 76:241 (1994)). Las proteínas que constituyen el grupo de las citocinas incluyen interleucinas, interferones, factores estimulantes de colonias, factores de necrosis tumoral y otras moléculas reguladoras. Por ejemplo, la interleucina-17 humana es una citocina que estimula la expresión de interleucina-6, molécula de adhesión intracelular 1, interleucina-8, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, y la expresión de prostaglandina E2, y desempeña una función en la maduración preferencial de precursores hematopoyéticos CD34+ en neutrófilos (Yao y col., J. Immunol. 155:5483 (1995); Fossiez y col., J. Exp. Med. 183:2593 (1996)).
Los receptores que unen citocinas están compuestos normalmente por una o más proteínas integrales de membrana que unen la citocina con alta afinidad y transducen este acontecimiento de unión a la célula mediante las partes citoplásmicas de ciertas subunidades de receptores. Los receptores de citocinas se han agrupado en varias clases basándose de similitudes en sus dominios de unión a ligando extracelulares. Por ejemplo, las cadenas de receptores responsables de unir y/o transducir el efecto de interferones son miembros de la familia de los receptores de citocinas de la clase II basada en un dominio extracelular característico de 200 residuos.
Las actividades in vivo demostradas de citocinas y sus receptores ilustran el potencial clínico de, y la necesidad de, otras citocinas, receptores de citocinas, agonistas de citocinas y antagonistas de citocinas. Por ejemplo, las actividades in vivo demostradas de la familia de citocinas proinflamatorias ilustra el enorme potencial clínico de, y la necesidad de, antagonistas de moléculas proinflamatorias.
Los documentos US 2002/042366 y WO 01/46261 describen un procedimiento para tratar inflamación usando un antagonista de IL-20.
El documento WO 99/27103 describe un polipéptido de mamífero similar a citocinas, Zcyto10, y polinucleótidos, anticuerpos y usos correspondientes del mismo.
La presente invención proporciona un hibridoma que comprende un hibridoma seleccionado del grupo de:
(a) el clon de hibridoma 262.4.1.2.2.1 (ATCC [PTA-5350]);
(b) el clon de hibridoma 262.5.1.6.4.4 (ATCC [PTA-5351]); o
(c) el clon de hibridoma 262.7.1.3.2.4 (ATCC [PTA-5352]).
La presente invención también proporciona un anticuerpo monoclonal expresado por dicho hibridoma. La presente invención proporciona además un inmunoconjugado que comprende dicho anticuerpo monoclonal, y una composición farmacéutica que comprende dicho inmunoconjugado.
La presente invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que puede competir por la unión a los polipéptidos de SEQ ID Nº: 2 ó 3 con dicho anticuerpo monoclonal.
La presente invención trata estas necesidades proporcionando anticuerpos para citocinas proinflamatorias y receptores de citocinas. En particular, la presente invención se refiere a anticuerpos para IL-20 (denominados indistintamente en lo sucesivo Zcyto10) y uno de sus receptores, IL-20RA/IL-20RB (denominados indistintamente en lo sucesivo ZcytoR7/pDIRSI), que incluye anticuerpos anti-IL-20, anticuerpos anti-IL-20RA, anticuerpos anti-IL-20RB y anticuerpos anti-IL-20RA/IL-20RB neutralizadores, además de proporcionar usos de los mismos en enfermedad inflamatoria, además de composiciones relacionadas y procedimientos.
Entre otras invenciones, la presente invención proporciona usos novedosos para anticuerpos neutralizadores para IL-20, y sus subunidades de receptores IL-20RA y IL-20RB, además del heterodímero de receptor, IL-20RA/IL-20RB. Específicamente, estos anticuerpos son útiles en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias humanas. La presente invención también proporciona fragmentos de anticuerpos de los mismos, es decir, para uso en enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias humanas. Los anticuerpos anti-IL-20, anticuerpos anti-IL-20RA, anticuerpos anti-IL-20RB neutralizadores y los anticuerpos de heterodímeros anti-IL-20RA/IL-20RB de la presente invención pueden usarse para antagonizar la actividad de IL-20 en el tratamiento de enfermedades humanas específicas tales como psoriasis, artritis psoriásica, artritis, endotoxemia, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), colitis y otras afecciones inflamatorias desveladas en este documento.
Una secuencia de nucleótidos ilustrativa que codifica IL-20 humana se proporciona por SEQ ID Nº: 1. Los polipéptidos codificados correspondientes se muestran en SEQ ID Nº: 2. El análisis de un clon de ADNc humano que codifica IL-20 (SEQ ID Nº: 1) reveló un marco de lectura abierto que codificaba 176 aminoácidos (SEQ ID NO: 2), con la Met inicial como se muestra en SEQ ID Nº: 1 y SEQ ID Nº: 2. Se cree que los residuos amino 1-24 son una secuencia señal, y el polipéptido de IL-20 maduro se representa por la secuencia de aminoácidos compuesta por los residuos 25, una leucina hasta el residuo 176, un ácido glutámico, también definido por SEQ ID Nº: 3. Otra realización de la presente invención se define por las secuencias de SEQ ID Nº: 4 y SEQ ID Nº: 5. El polipéptido de SEQ ID Nº: 5 está compuesto por 151 residuos de aminoácidos en el que los aminoácidos 1-24 comprenden una secuencia señal y la secuencia madura está compuesta por los residuos de aminoácidos 25, una leucina, hasta el aminoácido 151, un ácido glutámico, también definido por SEQ ID Nº: 6. Otra variante activa está compuesta por los residuos de aminoácidos 33, una cisteína, hasta el residuo de aminoácidos 176 de SEQ ID Nº: 2. Esta variante también se define por SEQ ID Nº: 7. La IL-20 murina está codificada por SEQ ID Nº: 8-12. La IL-20 se desvela en la patente de EE.UU. en propiedad como la presente nº 6.576.743 y la publicación WIPO en propiedad como la presente WO 98/25228.
Un receptor para la IL-20 está compuesto por dos cadenas, una cadena alfa y una cadena beta. La cadena alfa, denominada en lo sucesivo IL-20RA, se llamó formalmente ZcytoR7. La cadena beta, denominada en lo sucesivo IL-20RB, se llamó formalmente DIRS1. Una secuencia de nucleótidos ilustrativa de IL-20RA es SEQ ID Nº: 13. El polipéptido codificado se muestra en SEQ ID Nº: 14. El análisis de un clon de ADNc humano que codifica IL-20RA (SEQ ID Nº: 13) reveló un marco de lectura abierto que codificaba 553 aminoácidos (SEQ ID Nº: 14) que comprende un dominio de unión a ligando extracelular de aproximadamente 221 residuos de aminoácidos (residuos 30-250 de SEQ ID Nº: 14 y SEQ ID Nº: 15), un dominio transmembrana de aproximadamente 24 residuos de aminoácidos (residuos 251-274 de SEQ ID Nº: 14) y un dominio intracelular de aproximadamente 279 residuos de aminoácidos (residuos 275-553 de SEQ ID Nº: 14). Por tanto, el dominio extracelular de la IL-20RA humana está compuesto por un polipéptido seleccionado del grupo que está constituido por SEQ ID Nº: 16, 17, 18 y 19, estando la subunidad de receptores de longitud completa compuesta por SEQ ID Nº: 14. La IL-20RA se desvela en la patente de EE.UU. en propiedad como la presente nº 5.945.511 y la publicación WIPO en propiedad como la presente WO 98/03029.
Una secuencia de nucleótidos ilustrativa que codifica IL-20RB humana (pDIRS1) se proporciona por SEQ ID Nº: 20. El polipéptido codificado se muestra en SEQ ID Nº: 21. Una IL-20RB variante se proporciona por SEQ ID Nº: 22 y 23. El dominio extracelular de IL-20RB está compuesto por un polipéptido seleccionado del grupo que está constituido por SEQ ID Nº: 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. La IL-20RB se desvela en la patente de EE.UU. nº 6.586.228.
Como se describe más adelante, la presente solicitud describe polipéptidos aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 70%, al menos el 80%, o al menos el 90%, o superior al 95%, tal como el 96%, el 97%, el 98%, o superior al 99% o más, a SEQ ID Nº: 2, 3, 14, 15, 21 ó 23, en la que el polipéptido aislado se une específicamente con un anticuerpo que se une específicamente con un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2, 3, 14, 15, 21 ó 23. Además, la presente solicitud también describe polipéptidos aislados como se desvelan anteriormente que se unen a IL-20 (por ejemplo, secuencia de polipéptidos de IL-20 humana como se muestra en SEQ ID Nº: 2 ó 3), IL-20RA (por ejemplo, secuencia de polipéptidos de IL-20RA humana como se muestra en SEQ ID Nº: 14 ó 15) y IL-20RB (por ejemplo, secuencia de polipéptidos de IL-20RB humana como se muestra en SEQ ID Nº: 21 ó 23). La secuencia de polinucleótidos de IL-20 humana se muestra en SEQ ID Nº: 1. La secuencia de polinucleótidos de IL-20 de ratón se muestra en SEQ ID Nº: 10 y el polipéptido correspondiente se muestra en SEQ ID Nº: 11.
La presente solicitud también describe polipéptidos aislados y epítopes que comprenden al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2, 3, 14, 15, 21 ó 23. Los polipéptidos ilustrativos incluyen polipéptidos que o comprenden o están constituidos por SEQ ID Nº: 2, 3, 14, 15, 21 ó 23, un epítope antigénico de los mismos, o un fragmento de unión a IL-20 funcional de los mismos. Además, la presente solicitud también describe polipéptidos aislados como se desvelan anteriormente que se unen a, antagonizan o neutralizan la actividad de IL-20.
La presente solicitud también describe polipéptidos variantes de IL-20, IL-20RA y IL-20RB en los que la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante comparte una identidad con los residuos de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2 ó 3 para IL-20, SEQ ID Nº: 14 ó 15 para IL-20RA, o SEQ ID Nº: 21 ó 23 para IL-20RB, seleccionados del grupo que está constituido por al menos el 70% de identidad, al menos el 80% de identidad, al menos el 90% de identidad, al menos el 95% de identidad, o superior al 95% de identidad, tal como el 96%, el 97%, el 98%, o superior al 99% o más identidad, y en los que cualquier diferencia entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante y la secuencia de aminoácidos correspondiente es debida a una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. Tales sustituciones de aminoácidos conservativas se describen en este documento. Además, la presente invención también proporciona polipéptidos aislados como se desvelan anteriormente que se unen a, antagonizan o neutralizan la actividad de IL-20.
La presente invención proporciona además anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente con tales polipéptidos. Los anticuerpos a modo de ejemplo incluyen anticuerpos neutralizadores, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales murinos, anticuerpos humanizados derivados de anticuerpos monoclonales murinos y anticuerpos monoclonales humanos. Los fragmentos de anticuerpos ilustrativos incluyen F(ab')_{2}, F(ab)_{2}, Fab', Fab, Fv, scFv y unidades de reconocimiento mínimo. Los anticuerpos neutralizadores se unen preferentemente tanto a IL-20, IL-20RA como a IL-20RB de forma que se neutralice la interacción de IL-20 con su receptor. La presente invención incluye adicionalmente composiciones que comprenden un vehículo y un péptido, polipéptido, o anticuerpo descrito en este documento.
Además, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos uno de tales vectores de expresión o virus recombinantes que comprenden tales vectores de expresión. La presente invención incluye adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y un polipéptido o anticuerpo descrito en este documento.
La presente invención también contempla anticuerpos anti-idiotipo, o fragmentos de anticuerpos anti-idiotipo, que se unen específicamente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2, 3, 5, 6, 7, 14-19, 21, 23-30 o un fragmento del mismo. Un anticuerpo anti-idiotipo a modo de ejemplo se une con un anticuerpo que se une específicamente con un polipéptido que está compuesto por SEQ ID Nº: 3.
La presente solicitud también describe proteínas de fusión que comprenden tanto un polipéptido de IL-20, IL-20RA o IL-20RB como un resto de inmunoglobulina. En tales proteínas de fusión, el resto de inmunoglobulina puede ser una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, tal como un fragmento Fc humano. La presente solicitud describe además moléculas aisladas de ácidos nucleicos que codifican tales proteínas de fusión.
La presente solicitud también describe anticuerpos policlonales y monoclonales que comprenden tanto un fragmento de polipéptido de IL-20 como un dominio extracelular de IL-20RA o IL-20RB tal como receptores monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos que incluyen receptores solubles. Además, tales anticuerpos pueden usarse para antagonizar la unión de IL-20 a su receptor.
Además, la sobreexpresión de IL-20 se mostró en lesiones psoriásicas humanas sugiriendo que la IL-20 también participa en la psoriasis humana. Además, como se describe en este documento, la sobreexpresión de IL-20 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico y afectación de células inmunitarias indicativos de un fenotipo psoriásico. Como tales, los antagonistas para la actividad de IL-20, tales como receptores solubles de IL-20RA y anticuerpos para los mismos que incluyen anticuerpos monoclonales y neutralizadores tanto anti-IL-20 humana, anti-IL-20RA humana como anti-IL-20RB humana de la presente invención, son útiles en el tratamiento terapéutico de enfermedades inflamatorias, particularmente como antagonistas para IL-20 en el tratamiento de psoriasis. Además, los antagonistas para la actividad de IL-20, tales como los receptores solubles de IL-20RA y los anticuerpos para los mismos que incluyen los anticuerpos monoclonales y neutralizadores anti-IL-20RA humana de la presente invención, son útiles en el tratamiento terapéutico de otras enfermedades inflamatorias, por ejemplo, como antagonistas para IL-20 en el tratamiento de dermatitis atópica, EII, colitis, endotoxemia, artritis, artritis reumatoide y artritis psoriásica, enfermedad respiratoria aguda (ERA), choque séptico, fallo multiorgánico, lesión pulmonar inflamatoria tal como asma o bronquitis, neumonía bacteriana, psoriasis, eczema, dermatitis atópica y de contacto, y enfermedad inflamatoria del intestino tal como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn.
2. Definiciones
En la descripción que sigue, varios términos se usan ampliamente. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar el entendimiento de la invención.
Como se usa en este documento, "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquiera de ligadura, escisión, acción de endonucleasas y acción de exonucleasas. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas por monómeros que son nucleótidos que se producen naturalmente (tales como ADN y ARN) o análogos de nucleótidos que se producen naturalmente (por ejemplo, formas \alpha-enantioméricas de nucleótidos que se producen naturalmente), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en restos de azúcar y/o en restos de bases de pirimidina o purina. Las modificaciones de los azúcares incluyen, por ejemplo, sustitución de uno o más grupos hidroxilo con halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares pueden funcionalizarse como éteres o ésteres. Además, todo el resto de azúcar puede estar sustituido con estructuras estéricamente y electrónicamente similares, tales como aza-azúcares y análogos de azúcares carbocíclicos. Ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros sustitutos heterocíclicos muy conocidos. Los monómeros de ácidos nucleicos pueden estar ligados mediante enlaces fosfodiéster o análogos de tales enlaces. Los análogos de enlaces fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares. El término "molécula de ácido nucleico" también incluye los denominados "ácidos nucleicos de péptidos" que comprenden bases de ácido nucleico que se producen naturalmente o modificadas unidas a un esqueleto de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser tanto monocatenarios como bicatenarios.
El término "complemento de una molécula de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria y orientación inversa con respecto a una secuencia de nucleótidos de referencia.
El término "secuencia de nucleótidos degenerada" denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones redundantes con respecto a una molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido. Los codones redundantes contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo residuo de aminoácido (es decir, cada uno de los tripletes de GAU y GAC codifica Asp).
El término "gen estructural" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se transcribe en ARN mensajero (ARNm), que luego se traduce en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico.
Una "molécula de ácido nucleico aislada" es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un factor de crecimiento que se ha separado del ADN genómico de una célula es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico químicamente sintetizada que no está integrada en el genoma de un organismo. Una molécula de ácido nucleico que se ha aislado de una especie particular es más pequeña que la molécula de ADN completa de un cromosoma de esa especie.
Un "constructo de molécula de ácido nucleico" es una molécula de ácido nucleico, tanto monocatenaria como bicatenaria, que ha sido modificada por la intervención humana para contener segmentos de ácido nucleico combinados y yuxtapuestos en una disposición que no existe en la naturaleza.
"ADN lineal" denota moléculas de ADN no circular que tienen los extremos 5' y 3' libres. El ADN lineal puede prepararse a partir de moléculas de ADN circular cerrado, tales como plásmidos, mediante digestión enzimática o ruptura física.
"ADN complementario (ADNc)" es una molécula de ADN monocatenario que se forma a partir de un molde de ARNm por la enzima transcriptasa inversa. Normalmente se emplea un cebador complementario a partes de ARNm para la iniciación de la transcripción inversa. Los expertos en la materia también usan el término "ADNc" para referirse a una molécula de ADN bicatenario que está constituida por una molécula de ADN monocatenario tal y su hebra de ADN complementario. El término "ADNc" también se refiere a un clon de una molécula de ADNc sintetizada a partir de un molde de ARN.
Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción de un gen estructural. Normalmente, un promotor está localizado en la región no codificante 5' de un gen, proximal al sitio de inicio de la transcripción de un gen estructural. Los elementos de secuencia dentro de promotores que funcionan en la iniciación de la transcripción se caracterizan frecuentemente por secuencias de nucleótidos consenso. Estos elementos de promotores incluyen sitios de unión a ARN polimerasa, secuencias TATA, secuencias CAAT, elementos específicos para la diferenciación (DSEs; McGehee y col., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)), elementos de respuesta a AMP cíclico (CRE), elementos de respuesta al suero (SRE; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)), elementos de respuesta a glucocorticoides (GRE) y sitios de unión para otros factores de transcripción tales como CRE/ATF (O'Reilly y col., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)), AP2 (Ye y col., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)), SP1, proteína de unión a elementos de respuesta a cAMP (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) y factores octámeros (véanse, en general, Watson y col., eds. Molecular Biology of the Gene, 4^{a} ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987) y Lemaigre y Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)). Si un promotor es un promotor inducible, entonces la velocidad de transcripción aumenta en respuesta a un agente inductor. A diferencia, la velocidad de transcripción no está regulada por un agente inductor si el promotor es un promotor constitutivo. También se conocen promotores represibles.
Un "promotor mínimo" contiene secuencias de nucleótidos esenciales para la función de promotor que incluyen la caja TATA y el inicio de la transcripción. Mediante esta definición, un promotor mínimo puede o puede no tener actividad detectable en ausencia de secuencias específicas que pueden potenciar la actividad o conferir actividad específica para tejido.
Un "elemento regulador" es una secuencia de nucleótidos que modula la actividad de un promotor mínimo. Por ejemplo, un elemento regulador puede contener una secuencia de nucleótidos que se une con factores celulares que permiten exclusivamente o preferencialmente la transcripción en células, tejidos u orgánulos particulares. Estos tipos de elementos reguladores están normalmente asociados a genes que se expresan en un modo "específico para célula", "específica para tejido" o "específico para orgánulo".
Un "potenciador" es un tipo de elemento regulador que puede aumentar la eficiencia de transcripción, independientemente de la distancia u orientación del potenciador respecto al sitio de inicio de la transcripción.
"ADN heterólogo" se refiere a una molécula de ADN, o una población de moléculas de ADN, que no existe naturalmente dentro de una célula huésped dada. Las moléculas de ADN heterólogas para una célula huésped particular pueden contener ADN derivado de las especies de células huésped (es decir, ADN endógeno), mientras que el ADN huésped se combina con ADN no huésped (es decir, ADN exógeno). Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un segmento de ADN no huésped que codifica un polipéptido operablemente ligado a un segmento de ADN huésped que comprende un promotor de la transcripción se considera que es una molécula de ADN heteróloga. Por el contrario, una molécula de ADN heteróloga puede comprender un gen endógeno operablemente ligado a un promotor exógeno. Como otra ilustración, una molécula de ADN que comprende un gen derivado de una célula de tipo salvaje se considera que es ADN heterólogo si esa molécula de ADN se introduce en una célula mutante que carece del gen de tipo salvaje.
Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, tanto si se producen naturalmente como sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos se denominan comúnmente en lo sucesivo "péptidos".
Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos tales como grupos carbohidrato. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos pueden añadirse a una proteína por la célula en la que se produce la proteína, y variará con el tipo de célula. Las proteínas se definen en este documento en términos de sus estructuras de esqueleto de aminoácidos; generalmente no se especifican sustituyentes tales como grupos carbohidrato, pero no obstante pueden estar presentes.
Un péptido o polipéptido codificado por una molécula de ADN no huésped es un péptido o polipéptido "heterólogo".
Un "vector de clonación" es una molécula de ácido nucleico, tal como un plásmido, cósmido o bacteriófago, que tiene la capacidad de replicarse autónomamente en una célula huésped. Los vectores de clonación contienen normalmente uno o un número pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción que permiten la inserción de una molécula de ácido nucleico de un modo determinable sin pérdida de una función biológica esencial del vector, además de secuencias de nucleótidos que codifican un gen marcador que es adecuado para uso en la identificación y la selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores incluyen normalmente genes que proporcionan resistencia a tetraciclinas o resistencia a ampicilinas.
Un "vector de expresión" es una molécula de ácido nucleico que codifica un gen que se expresa en una célula huésped. Normalmente, un vector de expresión comprende un promotor de la transcripción, un gen y un terminador de la transcripción. La expresión génica está normalmente bajo el control de un promotor, y se dice que un gen tal está "operablemente ligado a" el promotor. Similarmente, un elemento regulador y un promotor mínimo están operablemente ligados si el elemento regulador modula la actividad del promotor mínimo.
Un "huésped recombinante" es una célula que contiene una molécula de ácido nucleico heteróloga tal como un vector de clonación o vector de expresión. En el presente contexto, un ejemplo de un huésped recombinante es una célula que produce IL-20, IL-20RA o IL-20RB a partir de un vector de expresión. A diferencia, IL-20, IL-20RA o IL-20RB pueden producirse por una célula que es una "fuente natural" de IL-20, IL-20RA o IL-20RB, y que carece de un vector de expresión.
Los "transformantes integrativos" son células huésped recombinantes en las que el ADN heterólogo se ha integrado en el ADN genómico de las células.
Una "proteína de fusión" es una proteína híbrida expresada por una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos de al menos dos genes. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender al menos parte de tanto un polipéptido de IL-20, IL-20RA como de IL-20RB fusionado con un polipéptido que se une a una matriz de afinidad. Una proteína de fusión tal proporciona un medio para aislar grandes cantidades de estos polipéptidos usando cromatografía de afinidad.
Como se usa en este documento, el término "proteína de fusión a anticuerpo" se refiere a una molécula recombinante que comprende un componente de anticuerpo y un agente terapéutico. Ejemplos de agentes terapéuticos adecuados para tales proteínas de fusión incluyen inmunomoduladores ("proteína de fusión de anticuerpo-inmunomodulador") y toxinas ("proteína de fusión de anticuerpo-toxina").
El término "receptor" denota una proteína asociada a célula que se une a una molécula bioactiva llamada un "ligando." Esta interacción media el efecto del ligando sobre la célula. Los receptores pueden estar unidos a la membrana, ser citosólicos o nucleares; monoméricos (por ejemplo, receptor de la hormona estimulante del tiroides, receptor beta-adrenérgico) o multiméricos (por ejemplo, receptor de PDGF, receptor de la hormona de crecimiento, receptor de IL-3, receptor de GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor de eritropoyetina y receptor de IL-6). Los receptores unidos a membrana se caracterizan por una estructura de múltiples dominios que comprende un dominio de unión a ligando extracelular y un dominio efector intracelular que normalmente participa en la transducción de señales. En ciertos receptores unidos a membrana, el dominio de unión a ligando extracelular y el dominio efector intracelular están localizados en polipéptidos separados que comprenden el receptor funcional completo.
En general, la unión del ligando al receptor produce un cambio conformacional en el receptor que produce una interacción entre el dominio efector y otra(s) molécula(s) en la célula que, a su vez, conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Los acontecimientos metabólicos que frecuentemente están ligados a las interacciones receptor-ligando incluyen transcripción de genes, fosforilación, desfosforilación, aumentos en la producción de AMP cíclico, movilización de calcio celular, movilización de lípidos de membrana, adhesión de células, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos.
Un "receptor soluble" es un polipéptido de receptor que no está unido a una membrana celular. Los receptores solubles son los polipéptidos de receptores de unión a ligando más comunes que carecen de dominios transmembrana y citoplásmico, y otro enlace a la membrana celular tal como mediante glicofosfoinositol (gpi). Los receptores solubles pueden comprender residuos de aminoácidos adicionales tales como marcas de afinidad que proporcionan la purificación del polipéptido o proporcionan sitios para la unión del polipéptido a un sustrato, o secuencias de región constante de inmunoglobulina. Muchos receptores de la superficie de la célula tienen equivalentes solubles que se producen naturalmente por proteolisis o se traducen a partir de ARNm alternativamente cortados y empalmados. Los receptores solubles pueden ser monoméricos, homodiméricos, heterodímericos o multiméricos, no comprendiendo generalmente los receptores multiméricos más de 9 subunidades, preferentemente no comprendiendo más de 6 subunidades, y lo más preferentemente no comprendiendo más de 3 subunidades. Se dice que los polipéptidos de receptores están sustancialmente libres de segmentos de polipéptidos transmembrana e intracelulares cuando carecen de suficientes partes de estos segmentos para proporcionar el anclaje de la membrana o la transducción de señales, respectivamente. Los receptores solubles de receptores de citocinas de clase I y clase II comprenden generalmente el dominio de unión a citocinas extracelular libre de un dominio transmembrana y dominio intracelular. Dentro del nivel de un experto en la materia se encuentra delinear qué secuencias de una secuencia de citocinas de clase I o clase II conocida comprenden el dominio de unión a citocinas extracelular libre de un dominio transmembrana e intracelular. Además, un experto en la materia que usa el código genético puede determinar fácilmente polinucleótidos que codifican tales polipéptidos de receptores solubles.
El término "secuencia señal secretora" denota una secuencia de ADN que codifica un péptido (un "péptido secretor") que, como componente de un polipéptido mayor, dirige al polipéptido mayor por una ruta secretora de una célula en la que se sintetiza. El polipéptido mayor se escinde comúnmente para eliminar el péptido secretor durante el tránsito por la ruta secretora.
Un "polipéptido aislado" es un polipéptido que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes tales como impurezas de carbohidratos, lípidos u otras proteináceas asociadas al polipéptido en la naturaleza. Normalmente, una preparación de polipéptido aislado contiene el polipéptido en una forma altamente purificada, es decir, al menos aproximadamente el 80% de pureza, al menos aproximadamente el 90% de pureza, al menos aproximadamente el 95% de pureza, más del 95% de pureza, tal como el 96%, el 97% o el 98% o más puro, o más del 99% de pureza. Una forma de mostrar que una preparación de proteína particular contiene un polipéptido aislado es por el aspecto de una única banda tras la electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio (SDS)-poliacrilamida de la preparación de proteínas y tinción con azul brillante de Coomassie del gel. Sin embargo, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas tales como dímeros o formas alternativamente glicosiladas o derivatizadas.
Los términos "extremo amino" y "extremo carboxilo" se usan en este documento para denotar posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando el contexto lo permita, estos términos se usan con referencia a una secuencia o parte particular de un polipéptido para denotar la proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia posicionada en el extremo carboxilo respecto a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido está localizada proximal al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo.
El término "expresión" se refiere a la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión implica la transcripción del gen estructural en ARNm y la traducción del ARNm en uno o más polipéptidos.
El término "variante de corte y empalme" se usa en este documento para denotar formas alternativas de ARN transcrito a partir de un gen. La variación de corte y empalme se produce naturalmente mediante el uso de sitios de corte y empalme alternativos dentro de una molécula de ARN transcrita, o menos comúnmente entre moléculas de ARN transcritas por separado, y puede dar como resultado varios ARNm transcritos a partir del mismo gen. Las variantes de corte y empalme pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. El término variante de corte y empalme también se usa en este documento para denotar un polipéptido codificado por una variante de corte y empalme de un ARNm transcrito a partir de un gen.
Como se usa en este documento, el término "inmunomodulador" incluye citocinas, factores de crecimiento de células madre, linfotoxinas, moléculas coestimuladoras, factores hematopoyéticos y similares, y análogos sintéticos de estas moléculas.
El término "par complemento/anti-complemento" denota restos no idénticos que forman un par estable no covalentemente asociado bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, la biotina y la avidina (o la estreptavidina) son miembros prototípicos de un par complemento/anti-complemento. Otros pares complemento/anti-complemento a modo de ejemplo incluyen pares receptor/ligando, pares anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítope), pares de polinucleótidos sentido/antisentido, y similares. Si se desea la posterior disociación del par complemento/anti-complemento, el par complemento/anti-complemento tiene preferentemente una afinidad de unión inferior a 10^{9} M^{-1}.
Un "anticuerpo anti-idiotipo" es un anticuerpo que se une con el dominio de región variable de una inmunoglobulina. En el presente contexto, un anticuerpo anti-idiotipo se une con la región variable de un anticuerpo anti-IL-20 y, por tanto, un anticuerpo anti-idiotipo imita a un epítope de IL-20. Como otro ejemplo, un anticuerpo anti-idiotipo se une con la región variable de un anticuerpo anti-IL-20RA y, por tanto, un anticuerpo anti-idiotipo imita a un epítope de IL-20RA. Como todavía otro ejemplo, un anticuerpo anti-idiotipo se une con la región variable de un anticuerpo anti-IL-20RB y, por tanto, un anticuerpo anti-idiotipo imita a un epítope de IL-20RB.
Un "fragmento de anticuerpo" es una parte de un anticuerpo tal como F(ab')_{2}, F(ab)_{2}, Fab', Fab y similares. Independientemente de la estructura, un fragmento de anticuerpo se une con el mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-IL-20 se une con un epítope de IL-20. Como otro ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-IL-20RA se une con un epítope de IL-20RA. Como otro ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-IL-20RB se une con un epítope de IL-20RB.
El término "fragmento de anticuerpo" también incluye un polipéptido sintético o genéticamente manipulado que se une a un antígeno específico, tal como polipéptidos que están constituidos por la región variable de cadena ligera, fragmentos "Fv" que están constituidos por las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moléculas de polipéptidos monocatenarios recombinantes en las que las regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un conector de péptidos ("proteínas scFv") y unidades de reconocimiento mínimo constituidas por los residuos de aminoácidos que imitan a la región hipervariable.
Un "anticuerpo quimérico" es una proteína recombinante que contiene los dominios variables y las regiones determinantes complementarias derivados de un anticuerpo de roedor, mientras que el resto de la molécula de anticuerpo deriva de un anticuerpo humano.
Los "anticuerpos humanizados" son proteínas recombinantes en las que las regiones determinantes de la complementariedad murinas de un anticuerpo monoclonal han sido transferidas de cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobulina murina a un dominio variable humano. La construcción de anticuerpos humanizados para uso terapéutico en seres humanos que derivan de anticuerpos murinos, tales como aquellos que se unen a o neutralizan una proteína humana, está dentro de la habilidad de un experto en la materia.
Como se usa en este documento, un "agente terapéutico" es una molécula o átomo que está conjugado a un resto de anticuerpo para producir un conjugado que es útil para terapia. Ejemplos de agentes terapéuticos incluyen fármacos, toxinas, inmunomoduladores, quelantes, compuestos de boro, agentes fotoactivos o colorantes, y radioisótopos.
Una "marca detectable" es una molécula o átomo que puede conjugarse a un resto de anticuerpo para producir una molécula útil para diagnóstico. Ejemplos de marcas detectables incluyen quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones paramagnéticos, u otros restos de marcadores.
El término "marca de afinidad" se usa en este documento para denotar un segmento de polipéptido que puede estar unido a un segundo polipéptido para proporcionar la purificación o detección del segundo polipéptido o proporcionar sitios para la unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, como marca de afinidad puede usarse cualquier péptido o proteína para el que esté disponible un anticuerpo u otro agente de unión específico. Las marcas de afinidad incluyen una marca de poli-histidina, proteína A (Nilsson y col., EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson y col., Methods Enzymol. 198:3 (1991)), glutatión S-transferasa (Smith y Johnson, Gene 67:31 (1988)), marca de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985)), sustancia P, péptido FLAG (Hopp y col., Biotechnology 6:1204 (1988)), péptido de unión a estreptavidina, u otro epítope antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Ford y col., Protein Expression and Purification 2:95 (1991). Las moléculas de ADN que codifican marcas de afinidad están disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Un "anticuerpo desnudo" es un anticuerpo completo, a diferencia de un fragmento de anticuerpo, que no está conjugado con un agente terapéutico. Los anticuerpos desnudos incluyen anticuerpos tanto policlonales como monoclonales, además de ciertos anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos quiméricos y humanizados.
Como se usa en este documento, el término "componente de anticuerpo" incluye tanto un anticuerpo completo como un fragmento de anticuerpo.
Un "inmunoconjugado" es un conjugado de un componente de anticuerpo con un agente terapéutico o una marca detectable.
Como se usa en este documento, el término "proteína de fusión a anticuerpo" se refiere a una molécula recombinante que comprende un componente de anticuerpo y un componente de polipéptido tanto IL-20, IL-20RA como IL-20RB. Ejemplos de una proteína de fusión a anticuerpo incluyen una proteína que comprende un dominio de polipéptido de IL-20 o un dominio extracelular de tanto IL-20RA como IL-20RB, y tanto un dominio Fc como una región de unión a antígeno.
Un "polipéptido diana" o un "péptido diana" es una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un epítope, y que se expresa en una célula diana, tal como una célula tumoral o una célula que lleva un antígeno de agente infeccioso. Las células T reconocen epítopes de péptidos presentados por una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad a un polipéptido diana o péptido diana y normalmente lisan la célula diana o reclutan otras células inmunitarias al sitio de la célula diana, destruyendo así la célula diana.
Un "péptido antigénico" es un péptido que se unirá a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad para formar un complejo MHC-péptido que es reconocido por una célula T, induciendo así una respuesta citotóxica de linfocitos con la presentación a la célula T. Por tanto, los péptidos antigénicos pueden unirse a una molécula apropiada del complejo mayor de histocompatibilidad e inducir una respuesta citotóxica de células T, tal como lisis de células o liberación de citocinas específicas contra la célula diana que se une a o expresa el antígeno. El péptido antigénico puede unirse en el contexto de una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I o clase II en una célula presentadora de antígeno o en una célula diana.
En eucariotas, la ARN polimerasa II cataliza la transcripción de un gen estructural para producir ARNm. Puede diseñarse una molécula de ácido nucleico para contener un molde de ARN polimerasa II en el que el transcrito de ARN tiene una secuencia que es complementaria a la de un ARNm específico. El transcrito de ARN se denomina un "ARN anti-sentido" y una molécula de ácido nucleico que codifica el ARN anti-sentido se llama una "gen anti-sentido". Las moléculas de ARN anti-sentido pueden unirse a moléculas de ARNm produciendo una inhibición de la traducción de ARNm.
Un "oligonucleótido anti-sentido específico para IL-20" o un "oligonucleótido anti-sentido de IL-20" es un oligonucleótido que tiene una secuencia (a) que puede formar un tríplex estable con una parte del gen de IL-20, o (b) que puede formar un dúplex estable con una parte de un transcrito de ARNm del gen de IL-20. Un "oligonucleótido anti-sentido específico para IL-20RA" o un "oligonucleótido anti-sentido de IL-20RA" es un oligonucleótido que tiene una secuencia (a) que puede formar un tríplex estable con una parte del gen de IL-20RA, o (b) que puede formar un dúplex estable con una parte de un transcrito de ARNm del gen de IL-20RA. Un "oligonucleótido anti-sentido específico para IL-20RB" o un "oligonucleótido anti-sentido de IL-20RB" es un oligonucleótido que tiene una secuencia (a) que puede formar un tríplex estable con una parte del gen de IL-20RB, o (b) que puede formar un dúplex estable con una parte de un transcrito de ARNm del gen de IL-20RB.
Una "ribozima" es una molécula de ácido nucleico que contiene un centro catalítico. El término incluye enzimas de ARN, ARN de autoempalme, ARN de autoescisión y moléculas de ácido nucleico que realizan estas funciones catalíticas. Una molécula de ácido nucleico que codifica una ribozima se llama un "gen de ribozima".
Una "secuencia guía externa" es una molécula de ácido nucleico que dirige la ribozima endógena, RNasa P, a una especie particular de ARNm intracelular produciendo la escisión del ARNm por RNasa P. Una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia guía externa se llama un "gen de secuencia guía externa".
El término "gen de IL-20 variante" se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es una modificación de SEQ ID Nº: 2. Tales variantes incluyen polimorfismos que se producen naturalmente de genes de IL-20, además de genes sintéticos que contienen sustituciones de aminoácidos conservativas de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2. Las formas de variantes adicionales de genes de IL-20 son moléculas de ácido nucleico que contienen inserciones o deleciones de las secuencias de nucleótidos descritas en este documento. Un gen de IL-20 variante puede identificarse, por ejemplo, determinando si el gen se hibrida con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº: 1, o su complemento, bajo condiciones restrictivas.
El término "gen de IL-20RA variante" se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es una modificación de SEQ ID Nº: 11. Tales variantes incluyen polimorfismos que se producen naturalmente de genes de IL-20RA, además de genes sintéticos que contienen sustituciones de aminoácidos conservativas de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 11. Las formas de variantes adicionales de genes de IL-20RA son moléculas de ácido nucleico que contienen inserciones o deleciones de las secuencias de nucleótidos descritas en este documento. Un gen de IL-20RA variante puede identificarse, por ejemplo, determinando si el gen se hibrida con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº: 10, o su complemento, bajo condiciones restrictivas.
El término "gen de IL-20RB variante" se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es una modificación de SEQ ID Nº: 13. Tales variantes incluyen polimorfismos que se producen naturalmente de genes de IL-20RB, además de genes sintéticos que contienen sustituciones de aminoácidos conservativas de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 13. Las formas de variantes adicionales de genes de IL-20RB son moléculas de ácido nucleico que contienen inserciones o deleciones de las secuencias de nucleótidos descritas en este documento. Un gen de IL-20RB variante puede identificarse, por ejemplo, determinando si el gen se hibrida con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº: 12, o su complemento, bajo condiciones restrictivas.
Alternativamente, los genes de IL-20, IL-20RA o IL-20RB variantes pueden identificarse mediante comparación de secuencias. Dos secuencias de aminoácidos tienen el "100% de identidad de secuencias de aminoácidos" si los residuos de aminoácidos de las dos secuencias de aminoácidos son los mismos cuando se alinean para la máxima correspondencia. Similarmente, dos secuencias de nucleótidos tienen el "100% de identidad de secuencias de nucleótidos" si los residuos de nucleótido de las dos secuencias de nucleótidos son los mismos cuando se alinean para la máxima correspondencia. Las comparaciones de secuencias pueden realizarse usando programas informáticos estándar tales como los incluidos en el juego informático de bioinformática LASERGENE, que es producido por DNASTAR (Madison, Wisconsin). Otros procedimientos para comparar dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos determinando el alineamiento óptimo son muy conocidos para los expertos en la materia (véanse, por ejemplo, Peruski y Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu y col., (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins" en Methods in Gene Biotechnology, páginas 123-151 (CRC Press, Inc. 1997), y Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2ª edición (Academic Press, Inc. 1998)). Los procedimientos particulares para determinar la identidad de secuencias se describen más adelante.
Independientemente del procedimiento particular usado para identificar cualquiera de los genes variantes o polipéptidos variantes descritos anteriormente, un gen variante o polipéptido codificado por un gen variante puede caracterizarse funcionalmente por su capacidad para unirse específicamente a un anticuerpo anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB. Un gen variante de IL-20RA o IL-20RB o polipéptido variante también puede caracterizarse funcionalmente por la capacidad para unirse a su ligando, IL-20, usando un ensayo biológico o bioquímico descrito en este documento.
El término "variante alélica" se usa en este documento para denotar cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica se produce naturalmente mediante mutación, y puede dar como resultado polimorfismo fenotípico dentro de poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. El término variante alélica también se usa en este documento para denotar una proteína codificada por una variante alélica de un gen.
El término "ortólogo" denota un polipéptido o proteína obtenido de una especie que es el equivalente funcional de un polipéptido o proteína de una especie diferente. Las diferencias de secuencias entre ortólogos son el resultado de especiación.
Los "parálogos" son proteínas distintas, pero estructuralmente relacionadas, producidas por un organismo. Se cree que los parálogos se producen mediante duplicación de genes. Por ejemplo, la \alpha-globina, la \beta-globina y la mioglobina son parálogos entre sí.
La presente invención incluye fragmentos funcionales de cualquiera de los genes de IL-20, IL-20RA o IL-20RB. Por ejemplo, dentro del contexto de esta invención, un "fragmento funcional" de un gen de IL-20RA se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una parte de un polipéptido de IL-20RA que es un dominio descrito en este documento o al menos se une específicamente con un anticuerpo anti-IL-20RA.
Debido a la imprecisión de procedimientos analíticos estándar, se entiende que los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros son valores aproximados. Cuando un valor tal se expresa como "aproximadamente" X, se entenderá que el valor expuesto de X es preciso al \pm10%.
3. Producción de polinucleótidos o genes de IL-20, IL-20RA y II-20RB
Las moléculas de ácido nucleico que codifican un gen de IL-20, IL-20RA o IL-20RB humana pueden obtenerse cribando una biblioteca ADNc humano o genómica usando sondas de polinucleótidos basadas en SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 13 o SEQ ID Nº: 20, respectivamente. Estas técnicas son estándar y muy establecidas y pueden llevarse a cabo usando kits de clonación disponibles de proveedores comerciales. Véanse, por ejemplo, Ausubel y col., (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3ª edición, John Wiley & Sons 1995; Wu y col., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc. 1997; Aviv y Leder, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:1408 (1972); Huynh y col., "Constructing and Screening cDNA Libraries in \lambdagt10 and \lambdagt11" en DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I, Glover (ed.), página 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) en páginas 47-52.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican un gen de IL-20, IL-20RA o IL-20RB humana también pueden obtenerse usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores de oligonucleótidos que tienen secuencias de nucleótidos que se basan en las secuencias de nucleótidos de cualquiera de los genes o ADNc. Los procedimientos generales para cribar bibliotecas con PCR se proporcionan por, por ejemplo, Yu y col., "Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries" en Methods in Molecular Biology, vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc. 1993. Además, las técnicas para usar PCR para aislar genes relacionados se describen por, por ejemplo, Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members" en Methods in Molecular Biology, vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc. 1993. Como alternativa, un gen de IL-20RA puede obtenerse sintetizando moléculas de ácido nucleico usando el cebado mutuo de oligonucleótidos largos y las secuencias de nucleótidos descritas en este documento (véase, por ejemplo, Ausubel (1995)). Las técnicas establecidas usando la reacción en cadena de la polimerasa proporcionan la capacidad para sintetizar moléculas de ADN de al menos dos kilobases de longitud (Adang y col., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot y col., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dillon y col., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes" en Methods in Molecular Biology, vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), páginas 263-268, (Humana Press, Inc. 1993), y Holowachuk y col., PCR Methods Appl. 4:299 (1995)). Para revisiones sobre la síntesis de polinucleótidos véanse, por ejemplo, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura y col., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984), y Climie y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633 (1990).
4. Producción de variantes de genes de IL-20, IL-20RA o IL-20RB
La presente invención proporciona una variedad de moléculas de ácido nucleico que incluyen moléculas de ADN y ARN que codifican los polipéptidos de IL-20, IL-20RA o IL-20RB desvelados en este documento. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente que, en vista de la degeneración del código genético, es posible una variación de secuencias considerable entre estas moléculas de polinucleótidos. Además, la presente invención también proporciona polipéptidos de receptores solubles aislados monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos que comprenden al menos una subunidad de receptores de IL-20RA o IL-20RB que es sustancialmente homóloga al polipéptido de receptores de SEQ ID Nº: 11 o SEQ ID Nº: 13, respectivamente.
La Tabla 1 expone los códigos de una letra para denotar las posiciones de nucleótidos redundantes. Las "resoluciones" son los nucleótidos denotados por una letra de código. "Complemento" indica el código para el (los) nucleóti-
do(s) complementario(s). Por ejemplo, el código Y denota tanto C como T, y su complemento R denotes A o G, siendo A complementaria a T, y siendo G complementaria a C.
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TABLA 1
1 
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En la Tabla 2 se exponen los codones redundantes que engloban todos los codones posibles para un aminoácido dado.
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TABLA 2
2 
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Un experto en la materia apreciará que se introduce algo de ambigüedad en la determinación de un codón redundante, representativo de todos los codones posibles que codifican un aminoácido. Por ejemplo, el codón redundante para serina (WSN) puede codificar, en algunas circunstancias, arginina (AGR), y el codón redundante para arginina (MGN) puede codificar, en algunas circunstancias, serina (AGY). Existe una relación similar entre codones que codifican fenilalanina y leucina. Por tanto, algunos polinucleótidos englobados por la secuencia redundante pueden codificar secuencias de aminoácidos variantes, pero un experto en la materia puede identificar fácilmente tales secuencias variantes mediante referencia a las secuencias de aminoácidos de IL-20 (SEQ ID Nº: 2), IL-20RA (SEQ ID Nº: 11) y IL-20RB (SEQ ID Nº: 13). Las secuencias variantes pueden probarse fácilmente para funcionalidad como se describe en este documento.
Las diferentes especies pueden presentar "uso de codones preferenciales". En general, véanse, Grantham y col., Nucl. Acids Res. 8:1893 (1980), Haas y col., Curr. Biol. 6:315 (1996), Wain-Hobson y col., Gene 13:355 (1981), Grosjean y Fiers, Gene 18:199 (1982), Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075 (1986), Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573 (1982), Sharp y Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6:494 (1995), y Makrides, Microbiol. Rev. 60:512 (1996). Como se usa en este documento, el término "uso de codones preferenciales" o "codones preferenciales" es un término de la técnica que se refiere a codones de traducción de proteínas que son los más frecuentemente usados en células de una cierta especie, favoreciéndose así uno o algunos representativos de los posibles codones que codifican cada aminoácido (véase la Tabla 2). Por ejemplo, el aminoácido treonina (Thr) puede ser codificado por ACA, ACC, ACG o ACT, pero en células de mamífero ACC es el codón más comúnmente usado; en otras especies, por ejemplo, células de insecto, levadura, virus o bacterias, pueden ser preferenciales diferentes codones de Thr. Los codones preferenciales para una especie particular pueden introducirse en los polinucleótidos de la presente invención mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. La introducción de secuencias de codones preferenciales en ADN recombinante puede potenciar, por ejemplo, la producción de la proteína haciendo la traducción de proteínas más eficaz dentro de un tipo de célula o especie particular. Por tanto, las secuencias de codones redundantes desveladas en este documento sirven de molde para optimizar la expresión de polinucleótidos en diversos tipos de células y especies comúnmente usados en la técnica y desvelados en este documento. Las secuencias que contienen codones preferenciales pueden probarse y optimizarse para la expresión en diversas especies, y probarse para la funcionalidad como se desvela en este documento.
Cualquiera de los ADNc que codifican IL-20, IL-20RA o IL-20RB puede aislarse mediante una variedad de procedimientos, tales como sondando con un ADNc humano completo o parcial o con uno o más conjuntos de sondas redundantes basadas en las secuencias desveladas. También puede clonarse un ADNc usando la reacción en cadena de la polimerasa con cebadores diseñados a partir de las secuencias humanas representativas desveladas en este documento. Además, puede usarse una biblioteca de ADNc para transformar o transfectar células huésped, y la expresión del ADNc de interés puede detectarse con un anticuerpo para cualquiera de los polipéptidos de IL-20, IL-20RA o IL-20RB.
Los expertos en la materia reconocerán que las secuencias desveladas en SEQ ID Nº: 1, 10 y 12 representan un único alelo de IL-20, IL-20RA o IL-20RB humana y se espera que se produzcan esa variación alélica y el corte y empalme alternativo. Las variantes alélicas de cualquiera de estas secuencias pueden clonarse sondando bibliotecas de ADNc o genómicas a partir de diferentes individuos según procedimientos estándar. Las variantes alélicas de las secuencias de nucleótidos desveladas en este documento, que incluyen aquellas que contiene mutaciones silenciosas y aquellas en las que las mutaciones producen cambios de secuencias de aminoácidos, están dentro del alcance de la presente invención ya que son proteínas que son variantes alélicas de las secuencias de aminoácidos desveladas en este documento. Las moléculas de ADNc generadas a partir de ARNm alternativamente cortados y empalmados, que conservan las propiedades de cualquiera de los polipéptidos citados anteriormente, están incluidas dentro del alcance de la presente invención ya que son polipéptidos codificados por tales ADNc y ARNm. Las variantes alélicas y las variantes de corte y empalme de estas secuencias pueden clonarse sondando bibliotecas de ADNc o genómico a partir de diferentes individuos o tejidos según procedimientos estándar conocidos en la técnica.
Usando los procedimientos tratados anteriormente, un experto en la materia puede preparar una variedad de polipéptidos que comprenden IL-20 o un fragmento del mismo que es sustancialmente homólogo a SEQ ID Nº: 1. Un experto en la materia también podría preparar una variedad de polipéptidos que comprenden tanto una subunidad de receptor soluble de IL-20RA que es sustancialmente homóloga a SEQ ID Nº: 10, o que codifica aminoácidos de SEQ ID Nº: 11, como una subunidad de receptor soluble de IL-20RB que es sustancialmente homóloga a SEQ ID Nº: 12, o que codifica aminoácidos de SEQ ID Nº: 13, o variantes alélicas de cualquiera de las dos, y todas conservan las propiedades de unión a ligando de la subunidad de receptores de tipo salvaje de IL-20RA o IL-20RB. Tales polipéptidos también pueden incluir segmentos de polipéptidos adicionales como generalmente se desvelan en este documento.
Dentro de ciertas realizaciones de la invención, las moléculas aisladas de ácido nucleico pueden hibridarse bajo condiciones restrictivas para dar moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos desveladas en este documento. Por ejemplo, tales moléculas de ácido nucleico pueden hibridarse bajo condiciones restrictivas para dar moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 13 o SEQ ID Nº: 20 o para dar moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos complementaria a estas secuencias, o fragmentos de las mismas.
En general, las condiciones restrictivas se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC inferiores al punto de fusión térmico (T_{m}) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. El Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente apareada. Tras la hibridación, las moléculas de ácido nucleico pueden lavarse para eliminar las moléculas de ácido nucleico no hibridadas bajo condiciones restrictivas, o bajo condiciones altamente restrictivas. Véanse, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel y col., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger y Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); y Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)). Están disponibles el software de análisis de secuencias tal como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) y Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA), además de sitios en internet, para analizar una secuencia dada y calcular el T_{m} basándose en los criterios definidos por el usuario. Dentro de las capacidades de un experto en la materia está adaptar las condiciones de hibridación y de lavado para uso con un híbrido de polinucleótido particular.
La presente invención también proporciona polipéptidos aislados de IL-20, IL-20RA y IL-20RB que tienen una identidad de secuencias sustancialmente similar a la de los polipéptidos de SEQ ID Nº: 2, SEQ ID Nº: 11 y SEQ ID Nº: 13, o sus ortólogos. El término "identidad de secuencias sustancialmente similar" se usa en este documento para denotar polipéptidos que tienen al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, tal como el 96%, el 97%, el 98%, o superior al 95% de identidad de secuencias respecto a las secuencias mostradas en SEQ ID Nº: 2, SEQ ID Nº: 11 y SEQ ID Nº: 13, o sus ortólogos. Por ejemplo, los receptores variantes y ortólogos de IL-20RA pueden usarse para generar una respuesta inmunitaria y producir anticuerpos de reactividad cruzada para IL-20RA humana. Tales anticuerpos pueden ser humanizados y modificarse como se describen en este documento, y usarse terapéuticamente para tratar psoriasis, artritis psoriásica, EII, colitis, endotoxemia además de en otras aplicaciones terapéuticas descritas en este documento.
La presente invención también contempla moléculas de ácido nucleico variantes de IL-20, IL-20RA y IL-20RB que pueden identificarse usando dos criterios: una determinación de la similitud entre el polipéptido codificado con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2, SEQ ID Nº: 11 y SEQ ID Nº: 13, y un ensayo de hibridación. Tales variantes incluyen moléculas de ácido nucleico (1) que permanecen hibridadas con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 10 y SEQ ID Nº: 12 (o sus complementos) bajo condiciones de lavado restrictivas, en las que la restricción del lavado es equivalente a 0,5x-2x SSC con SDS al 0,1% a 55-65ºC, y (2) que codifican un polipéptido que tiene al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, o superior al 95% tal como el 96%, el 97%, el 98% o el 99%, de identidad de secuencias respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3. Alternativamente, estas variantes pueden caracterizarse como moléculas de ácido nucleico (1) que permanecen hibridadas con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 10 y SEQ ID Nº: 12 (o su complemento) bajo condiciones de lavado altamente restrictivas, en las que la restricción del lavado es equivalente a 0,1x-0,2x SSC con SDS al 0,1% a 50-65ºC, y (2) que codifican un polipéptido que tiene al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% o superior al 95%, tal como el 96%, el 97%, el 98% o el 99% o superior, de identidad de secuencias respecto a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID Nº: 2, SEQ ID Nº: 11 y SEQ ID Nº: 13.
La identidad de secuencias en porcentaje se determina mediante procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Altschul y col., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986), y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992). Brevemente, dos secuencias de aminoácidos se alinean para optimizar las puntuaciones de alineación usando una penalización de abertura de hueco de 10, una penalización de extensión de hueco de 1 y la matriz de puntuación "BLOSUM62" de Henikoff y Henikoff (véase arriba) como se muestra en Tabla 3 (los aminoácidos se indican por los códigos de una letra estándar). Entonces, la identidad en porcentaje se calcula como: ([número total de apareamientos idénticos]/[longitud de la secuencia más larga más el número de huecos introducidos en la secuencia más larga con el fin de alinear las dos secuencias])(100).
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3
3
4
Los expertos en la materia aprecian que hay muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitudes "FASTA" de Pearson y Lipman es un procedimiento de alineamiento de proteínas adecuado para examinar el nivel de identidad compartido por una secuencia de aminoácidos desvelada en este documento y la secuencia de aminoácidos de una variante putativa de IL-20, IL-20RA o IL-20RB. El algoritmo FASTA se describe por Pearson y Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), y por Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990). Brevemente, FASTA caracteriza primero la similitud de secuencias identificando regiones compartidas por la secuencia en cuestión y una secuencia de prueba que tiene tanto la mayor densidad de identidades (si la variable ktup es 1) como pares de identidades (si ktup=2), sin considerar sustituciones de aminoácidos conservativas, inserciones o deleciones. Entonces, las diez regiones con la mayor densidad de identidades se vuelven a puntuar comparando la similitud de todos los aminoácidos emparejados usando una matriz de sustitución de aminoácidos, y los extremos de las regiones se "recortan" para incluir sólo aquellos residuos que contribuyen a la mayor puntuación. Si hay varias regiones con puntuaciones superiores al valor de "corte" (calculado por una fórmula predeterminada basada en la longitud de la secuencia y el valor ktup), entonces las regiones iniciales recortadas se examinan para determinar si las regiones pueden unirse para formar una alineación aproximada con huecos. Finalmente, las regiones con mayor puntuación de las dos secuencias de aminoácidos se alinean usando una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)) que permite inserciones y deleciones de aminoácidos. Los parámetros ilustrativos para el análisis FASTA son: ktup=1, penalización de abertura de hueco=10, penalización de extensión de hueco=1 y matriz de sustitución =BLOSUM62. Estos parámetros pueden introducirse en un programa de FASTA modificando el archivo de la matriz de puntuación ("SMATRIX") como se explica en el Apéndice 2 de Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990).
FASTA también puede usarse para determinar la identidad de secuencias de moléculas de ácido nucleico usando una relación como se desvela anteriormente. Para las comparaciones de secuencias de nucleótidos, el valor ktup puede oscilar entre uno y seis, preferentemente de tres a seis, lo más preferentemente tres, con otros parámetros expuestos como se describe anteriormente.
La presente invención incluye moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene un cambio de aminoácido conservativo en comparación con una secuencia de aminoácidos desvelada en este documento. Por ejemplo, pueden obtenerse variantes que contienen una o más sustituciones de aminoácidos de cualquiera de las secuencias desveladas en este documento en las que un alquilaminoácido está sustituido por un alquilaminoácido, un aminoácido aromático está sustituido por un aminoácido aromático, un aminoácido que contiene azufre está sustituido por un aminoácido que contiene azufre, un aminoácido que contiene hidroxi está sustituido por un aminoácido que contiene hidroxi, un aminoácido ácido está sustituido por un aminoácido ácido, un aminoácido básico está sustituido por un aminoácido básico, o un aminoácido monocarboxílico dibásico está sustituido por un aminoácido monocarboxílico dibásico. Entre los aminoácidos comunes, por ejemplo, una "sustitución de aminoácidos conservativa" se ilustra por una sustitución entre aminoácidos dentro de cada uno de los siguiente grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina y triptófano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina. La tabla de BLOSUM62 es una matriz de sustitución de aminoácidos derivada de aproximadamente 2.000 alineamientos múltiples locales de segmentos de secuencias de proteínas que representan regiones altamente conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff y Henikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)). Por consiguiente, las frecuencias de sustitución de BLOSUM62 pueden usarse para definir sustituciones de aminoácidos conservativas que pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Aunque es posible diseñar sustituciones de aminoácidos basadas únicamente en las propiedades químicas (como se trata anteriormente), el término "sustitución de aminoácidos conservativa" se refiere preferentemente a una sustitución representada por un valor de BLOSUM62 superior a -1. Por ejemplo, una sustitución de aminoácidos es conservativa si la sustitución se caracteriza por un valor de BLOSUM62 de 0, 1, 2 ó 3. Según este sistema, las sustituciones de aminoácidos conservativas preferidas se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 1 (por ejemplo, 1, 2 ó 3), mientras que las sustituciones de aminoácidos conservativas más preferidas se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 2 (por ejemplo, 2 ó 3).
Las variantes particulares de cualquiera de IL-20, IL-20RA o IL-20RB se caracterizan por tener al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% o superior al 95% tal como el 96%, el 97%, el 98%, o el 99% o superior de identidad de secuencias respecto a las secuencias de aminoácidos correspondientes (por ejemplo, SEQ ID Nº: 2, SEQ ID Nº: 14 y SEQ ID Nº: 21), en las que la variación en la secuencia de aminoácidos es debida a una o más sustituciones de aminoácidos conservativas.
Los cambios de aminoácidos conservativos en cualquiera de los genes de IL-20, IL-20RA o IL-20RB pueden introducirse, por ejemplo, sustituyendo los nucleótidos enumerados en cualquiera de SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 13 y SEQ ID Nº: 20 por nucleótidos. Tales variantes de "aminoácidos conservativos" pueden obtenerse mediante mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, mutagénesis de barrido con conectores, mutagénesis usando la reacción en cadena de la polimerasa y similares (véase Ausubel (1995); y McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)). Un polipéptido variante de IL-20, IL-20RA o IL-20RB puede identificarse por la capacidad para unirse específicamente a su anticuerpo respectivo.
Las proteínas de la presente invención también pueden comprender residuos de aminoácidos que se producen no naturalmente. Los aminoácidos que se producen no naturalmente incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina. Se conocen varios procedimientos en la técnica para incorporar los residuos de aminoácidos que se producen no naturalmente en proteínas. Por ejemplo, puede emplearse un sistema in vitro en el que las mutaciones terminadoras se suprimen usando ARNt supresor químicamente aminoacilado. Los procedimientos para sintetizar aminoácidos y ARNt aminoacilante son conocidos en la técnica. La transcripción y la traducción de plásmidos que contienen mutaciones terminadoras se llevan a cabo normalmente en un sistema sin células que comprende un extracto de S30 de E. coli y enzimas comercialmente disponibles y otros reactivos. Las proteínas se purifican por cromatografía. Véanse, por ejemplo, Robertson y col., J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991), Ellman y col., Methods Enzymol. 202:301 (1991), Chung y col., Science 259:806 (1993), y Chung y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:10145 (1993).
En un segundo procedimiento, la traducción se lleva a cabo en oocitos de Xenopus mediante microinyección de ARNm mutado y ARNt supresor químicamente aminoacilado (Turcatti y col., J. Biol. Chem. 271:19991 (1996)). Dentro de un tercer procedimiento, las células de E. coli se cultivan en ausencia de un aminoácido natural que va a sustituirse (por ejemplo, fenilalanina) y en presencia de el (los) aminoácido(s) que se produce(n) no naturalmente deseado(s) (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido que se produce no naturalmente se incorpora en la proteína en lugar de su equivalente natural. Véase, Koide y col., Biochem. 33:7470 (1994). Los residuos de aminoácidos que se producen naturalmente pueden convertirse en especies que se producen no naturalmente mediante modificación química in vitro. La modificación química puede combinarse con mutagénesis dirigida al sitio para expandir adicionalmente el intervalo de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2:395 (1993)).
Cualquiera de los residuos de aminoácidos de IL-20, IL-20RA o IL-20RB puede sustituirse con un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético, aminoácidos que se producen no naturalmente y aminoácidos desnaturalizados.
Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención pueden identificarse según procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de cribado con alanina (Cunningham y Wells, Science 244:1081 (1989), Bass y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:4498 (1991), Coombs y Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering" en Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). En esta última técnica, las mutaciones de alanina individuales se introducen en cualquier residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se prueban para la actividad biológica para identificar residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también Hilton y col., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996).
Aunque los análisis de secuencias pueden usarse para definir adicionalmente el dominio de unión a IL-20 o la región de unión a ligando de IL-20RA o IL-20RB, los aminoácidos que desempeñan una función en la actividad de unión a IL-20, IL-20RA y IL-20RB (tales como unión al ligando IL-20, o a un anticuerpo anti-IL-20RA o IL-20RB) también pueden determinarse mediante análisis físico de estructura como se determina por tales técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcado por fotoafinidad, conjuntamente con mutación de aminoácidos de sitio de contacto putativos. Véanse, por ejemplo, de Vos y col., Science 255:306 (1992), Smith y col., J. Mol. Biol. 224:899 (1992), y Wlodaver y col., FEBS Lett. 309:59 (1992).
Las sustituciones de múltiples aminoácidos pueden hacerse y probarse usando procedimientos conocidos de mutagénesis y cribado tales como los desvelados por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241:53 (1988)) o Bowie y Sauer (Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:2152 (1989)). Brevemente, estos autores desvelan procedimientos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido seleccionando el polipéptido funcional y luego secuenciando los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros procedimientos que pueden usarse incluyen expresión en fago (por ejemplo, Lowman y col., Biochem. 30:10832 (1991), Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.223.409, Huse, publicación internacional nº WO 92/06204 y mutagénesis dirigida a región (Derbyshire y col., Gene 46:145 (1986), y Ner y col., DNA 7:127, (1988)). Además, la IL-20RA marcada con biotina o FITC puede usarse para la clonación por expresión de ligandos de IL-20RA.
Las variantes de las secuencias de nucleótidos y polipéptidos de IL-20, IL-20RA y IL-20RB desveladas también pueden generarse mediante barajado de ADN como se desvela por Stemmer, Nature 370:389 (1994), Stemmer, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:10747 (1994) y la publicación internacional nº WO 97/20078. Brevemente, las moléculas de ADN variante se generan mediante recombinación de homólogos in vitro mediante fragmentación al azar de un ADN parental seguido por reensamblaje usando PCR, dando como resultado mutaciones puntuales aleatoriamente introducidas. Esta técnica puede modificarse usando una familia de moléculas de ADN parental tales como variantes alélicas o moléculas de ADN de diferentes especies para introducir variabilidad adicional en el procedimiento. La selección o el barrido de la actividad deseada, seguido de iteraciones adicionales de mutagénesis y ensayo, proporciona la rápida "evolución" de secuencias seleccionando mutaciones deseables mientras que simultáneamente se seleccionan contra cambios perjudiciales.
Los procedimientos de mutagénesis como se desvelan en este documento pueden combinarse con procedimientos de cribado automatizado de alto rendimiento para detectar actividad de polipéptidos mutagenizados clonados en células huésped. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos biológicamente activos, o polipéptidos que se unen con anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB, pueden recuperarse de las células huésped y secuenciarse rápidamente usando un equipo moderno. Estos procedimientos permiten la rápida determinación de la importancia de residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés y pueden aplicarse a polipéptidos de estructura desconocida.
La presente invención también incluye "fragmentos funcionales" de polipéptidos de IL-20, IL-20RA y IL-20RB y moléculas de ácido nucleico que codifican tales fragmentos funcionales. Los análisis de deleción rutinarios de moléculas de ácido nucleico pueden realizarse para obtener fragmentos funcionales de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de IL-20, IL-20RA o IL-20RB. Como ilustración, las moléculas de ADN que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº: 1 (IL-20) puede digerirse con nucleasa Bal31 para obtener una serie de deleciones anidadas. Entonces, los fragmentos se insertan en vectores de expresión en un marco de lectura apropiado y los polipéptidos expresados se aíslan y se prueban para la capacidad para unir anticuerpos anti-IL-20. Una alternativa a la digestión con exonucleasa es usar mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para introducir deleciones o codones de terminación para especificar la producción de un fragmento deseado. Alternativamente, los fragmentos particulares de un gen de IL-20 pueden sintetizarse usando la reacción en cadena de la polimerasa.
Esta solución general ejemplificada por estudios sobre la truncación en cualquiera o los dos extremos de interferones ha sido resumida por Horisberger y Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995). Además, las técnicas habituales para el análisis funcional de proteínas se describen por, por ejemplo, Treuter y col., Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993), Content y col., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon" en Biologic Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), páginas 65-72 (Nijhoff 1987), Herschman, "The EGF Receptor" en Control of Animal Cell Proliferation, vol. 1, Boynton y col., (eds.) páginas 169-199 (Academic Press 1985), Coumailleau y col., J. Biol. Chem. 270:29270 (1995); Fukunaga y col., J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchi y col., Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995), y Meisel y col., Plant Molec. Biol. 30:1 (1996).
La presente invención también contempla fragmentos funcionales de un gen de IL-20, IL-20RA o IL-20RB que tiene cambios de aminoácidos en comparación con una secuencia de aminoácidos desvelada en este documento. Un gen variante tal puede identificarse basándose en la estructura determinando el nivel de identidad con secuencias de nucleótidos y aminoácidos desveladas como se trata anteriormente. Una solución alternativa para identificar un gen variante basándose en la estructura es determinar si una molécula de ácido nucleico que codifica un gen variante de IL-20, IL-20RA o IL-20RB posible puede hibridarse a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 13 o SEQ ID Nº: 20, respectivamente.
La presente invención también incluye usar fragmentos funcionales de polipéptidos de IL-20, IL-20RA o IL-20RB, epítopes antigénicos, partes que llevan epítopes de polipéptidos de IL-20, IL-20RA o IL-20RB y moléculas de ácido nucleico que codifican tales fragmentos funcionales, epítopes antigénicos y partes que llevan epítopes de polipéptidos de IL-20, IL-20RA o IL-20RB. Tales fragmentos se usan para generar polipéptidos para uso en la generación de anticuerpos y componentes de unión que unen, bloquean, reducen, antagonizan o neutralizan la actividad de IL-20. Un polipéptido "funcional" de IL-20 o fragmento del mismo como se define en este documento se caracteriza por su capacidad para antagonizar actividad inflamatoria, proliferativa o diferenciadora de IL-20, por su capacidad para inducir o inhibir funciones de células especializadas o por su capacidad para unirse específicamente a un anticuerpo anti-IL-20, célula o receptor de IL-20. Un polipéptido "funcional" de IL-20RA o fragmento del mismo como se define en este documento se caracteriza por su capacidad para antagonizar actividad inflamatoria, proliferativa o diferenciadora de IL-20, por su capacidad para inducir o inhibir funciones de células especializadas o por su capacidad para unirse específicamente a un anticuerpo anti-IL-20RA, célula o IL-20. Un polipéptido "funcional" de IL-20RB o fragmento del mismo como se define en este documento se caracteriza por su capacidad para antagonizar actividad inflamatoria, proliferativa o diferenciadora de IL-20, por su capacidad para inducir o inhibir funciones de células especializadas o por su capacidad para unirse específicamente a un anticuerpo anti-IL-20RB, célula o IL-20. Como se describe previamente en este documento, IL-20 es una citocina de clase II y IL-20RA y IL-20RB se caracterizan por estructura de receptores de citocinas de clase II y dominios como se describen en este documento. Por tanto, la presente invención contempla adicionalmente usar proteínas de fusión que engloban: (a) moléculas de polipéptidos que comprenden uno o más de los dominios descritos anteriormente; y (b) fragmentos funcionales que comprenden uno o más de estos dominios. La otra parte del polipéptido de la proteína de fusión puede contribuirse mediante otro receptor de citocinas de clase II tal como IL-10R, IL-13R, IL-20RA, Crf2-4, IL-20RA2, o mediante un péptido señal secretor no nativo y/o sin relacionar que facilita la secreción de la proteína de fusión.
La presente invención también proporciona fragmentos de polipéptidos o péptidos que comprenden una parte que lleva epítopes de un polipéptido de IL-20, IL-20RA o IL-20RB descrito en este documento. Tales fragmentos o péptidos pueden comprender un "epítope inmunogénico", que es una parte de una proteína que provoca una respuesta de anticuerpo cuando toda la proteína se usa como un inmunógeno. Los péptidos que llevan epítopes inmunogénicos pueden identificarse usando procedimientos estándar (véase, por ejemplo, Geysen y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:3998 (1983)).
A diferencia, los fragmentos de polipéptidos o péptidos pueden comprender un "epítope antigénico" que es una región de una molécula de proteína a la que puede unirse específicamente un anticuerpo. Ciertos epítopes están constituidos por una extensión lineal o contigua de aminoácidos, y la antigenicidad de un epítope tal no está perturbada por agentes desnaturalizantes. Se conoce en la técnica que péptidos sintéticos relativamente cortos que pueden imitar a epítopes de una proteína pueden usarse para estimular la producción de anticuerpos contra la proteína (véase, por ejemplo, Sutcliffe y col., Science 219:660 (1983)). Por consiguiente, los péptidos que llevan epítopes antigénicos y los polipéptidos de la presente invención son útiles para producir anticuerpos que se unen con los polipéptidos descritos en este documento. Pueden usarse los perfiles de hidrofilia de Hopp/Woods para determinar regiones que tienen el potencial más antigénico dentro de cualquiera de SEQ ID Nº: 2, SEQ ID Nº: 11 y SEQ ID Nº: 13 (Hopp y col., Proc. Natl. Acad. Sci, 78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986 y Triquier y col., Protein Engineering 11:153-169, 1998). El perfil se basa en una ventana deslizante de seis residuos. Se ignoraron los residuos G, S y T enterrados y los residuos H, Y, y W expuestos. En cualquiera de IL-20, IL-20RA o IL-20RB, estas regiones pueden determinarse por un experto en la materia.
Además, los epítopes antigénicos de IL-20 dentro de SEQ ID Nº: 2 como se predijeron por una representación de Jameson-Wolf, por ejemplo usando el programa DNASTAR Protean (DNASTAR, Inc., Madison, WI) sirven de epítopes antigénicos preferidos, y pueden ser determinados por un experto en la materia. Tales epítopes antigénicos incluyen: residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 60 (Ile) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 69 (Glu) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 81 (Cys) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 96 (Lys) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 60 (Ile) a 69 (Glu) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 60 (Ile) a 81 (Cys) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 60 (Ile) a 96 (Lys) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 60 (Ile) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 69 (Glu) a 81 (Cys) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 69 (Glu) a 96 (Lys) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 69 (Glu) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 81 (Cys) a 96 (Lys) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 81 (Cys) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 96 (Lys) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 2.
Los epítopes antigénicos de IL-20RA incluyen: residuos de aminoácidos 1 (Met) a 9 (Leu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 36 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 41 (Ala) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 58 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 63 (Gln) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 80 (Lys) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 94 (Tyr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 104 (Tyr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 120 (Cys) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 128 (Arg) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 161 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 187 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 224(Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 316 (Ile) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 323 (Ile) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 335 (Asp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 371 (Cys) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 384 (Gln) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 412 (Ala) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 462 (Gln) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 483 (Asp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 496 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 523 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 63(Gln) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 94 (Tyr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 128 (Arg) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 63 (Gln) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 94 (Tyr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 128 (Arg) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 94 (Tyr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 128 (Arg) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 128 (Arg) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 412 (Ala) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 412 (Ala) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 412 (Ala) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 412 (Ala) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 412 (Ala) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 462 (Gln) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 462 (Gln) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 462 (Gln) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 462 (Gln) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 483 (Asp) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 483 (Asp) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 483 (Asp) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 496 (Ser) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 496 (Ser) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 523 (Glu) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14.
Los epítopes antigénicos de IL-20RB dentro de SEQ ID Nº: 21 incluyen: residuos de aminoácidos 70 (Tyr) a 74 (Tyr) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 70 (Tyr) a 101 (Asp) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 70 (Tyr) a 135 (Ser) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 70 (Tyr) a 178 (Glu) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 70 (Tyr) a 283 (Lys) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 92 (Thr) a 101 (Asp) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 92 (Thr) a 135 (Ser) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 92 (Thr) a 178 (Glu) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 92 (Thr) a 283 (Lys) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 130 (Pro) a 135 (Ser) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 130 (Pro) a 178 (Glu) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 130 (Pro) a 283 (Lys) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 171 (Arg) a 178 (Glu) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 171 (Arg) a 283 (Lys) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 279 (Asn) a 283 (Lys) de SEQ ID Nº: 21.
Los péptidos y polipéptidos que llevan epítopes antigénicos pueden contener al menos de cuatro a diez aminoácidos, al menos de diez a quince aminoácidos, o aproximadamente de 15 a aproximadamente 30 aminoácidos, de una secuencia de aminoácidos desvelada en este documento. Tales péptidos y polipéptidos que llevan epítopes pueden producirse fragmentando un polipéptido de IL-20, IL-20RA o IL-20RB o mediante síntesis química de péptidos como se describe en este documento. Además, los epítopes pueden seleccionarse mediante expresión en fago de bibliotecas de péptidos aleatorios (véanse, por ejemplo, Lane y Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993), y Cortese y col., Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)). Los procedimientos habituales para identificar epítopes y producir anticuerpos a partir de péptidos pequeños que comprenden un epítope se describen, por ejemplo, por Mole, "Epitope Mapping" en Methods in Molecular Biology, vol. 10, Manson (ed.), páginas 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992), Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies" en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter y Ladyman (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), y Coligan y col., (eds.), Current Protocols in Immunology, páginas 9.3.1-9.3.5 y páginas 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997).
Para cualquier polipéptido de IL-20, IL-20RA o IL-20RB, que incluye variantes y proteínas de fusión, un experto en la materia puede generar fácilmente una secuencia de polinucleótidos completamente redundante que codifica esa variante usando la información expuesta en las Tablas 1 y 2 anteriores. Además, los expertos en la materia pueden usar un software estándar para idear variantes de IL-20, IL-20RA y IL-20RB basándose en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos descritas en este documento.
5. Producción de polipéptidos de IL-20, IL-20RA y IL-20RB
Los polipéptidos de la presente invención, que incluyen polipéptidos de longitud completa; receptores solubles monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos; receptores de longitud completa; fragmentos de receptores (por ejemplo, fragmentos de unión a ligando y epítopes antigénicos), fragmentos funcionales y proteínas de fusión, pueden producirse en células huésped recombinantes siguiendo técnicas convencionales. Para expresar un gen de IL-20, IL-20RA o IL-20RB, una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido debe estar operablemente ligada a secuencias reguladoras que controlan la expresión de la transcripción en un vector de expresión y luego introducirse en una célula huésped. Además de las secuencias reguladoras de la transcripción, tales como promotores y potenciadores, los vectores de expresión pueden incluir secuencias reguladoras de la traducción y un gen marcador que es adecuado para la selección de células que llevan el vector de expresión.
Los vectores de expresión que son adecuados para la producción de una proteína foránea en células eucariotas contienen normalmente (1) elementos de ADN procariota que codifican un origen de replicación bacteriana y un marcador de resistencia a antibióticos para proporcionar el crecimiento y la selección del vector de expresión en un huésped bacteriano; (2) elementos de ADN eucariota que controlan la iniciación de la transcripción, tal como un promotor; y (3) elementos de ADN que controlan el procesamiento de transcritos, tales como una secuencia de terminación/poliadenilación de la transcripción. Como se trata anteriormente, los vectores de expresión también puede incluir secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia secretora que dirige el polipéptido heterólogo a la ruta secretora de una célula huésped. Por ejemplo, un vector de expresión de IL-20RA puede comprender un gen de IL-20RA y una secuencia secretora derivada de cualquier gen secretado.
Las proteínas de IL-20, IL-20RA y IL-20RB de la presente invención pueden expresarse en células de mamífero. Ejemplos de células huésped de mamífero adecuadas incluyen células de riñón de mono verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), células de riñón embrionario humano (293-HEK; ATCC CRL 1573), células de riñón de hámster bebé (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células de riñón canino (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovario de hámster chino (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin y col., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), células de pituitaria de rata (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hepatoma de rata (H-4-II-E; ATCC CRL 1548) células de riñón de mono transformadas con SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650) y células embrionarias murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658).
Para un huésped mamífero, las señales reguladoras de la transcripción y la traducción pueden derivarse de fuentes virales de mamífero, por ejemplo, adenovirus, virus del papiloma bovino, virus simio o similares, en las que las señales reguladoras están asociadas a un gen particular que tiene un alto nivel de expresión. Las secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción adecuadas también pueden obtenerse a partir de genes de mamífero, por ejemplo, genes de actina, colágeno, miosina y metalotioneína.
Las secuencias reguladoras de la transcripción incluyen una región promotora suficiente para dirigir la iniciación de la síntesis de ARN. Los promotores eucariotas adecuados incluyen el promotor del gen de metalotioneína I de ratón (Hamer y col., J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982)), el promotor TK del virus del herpes (McKnight, Cell 31:355 (1982)), el promotor temprano de SV40 (Benoist y col., Nature 290:304 (1981)), el promotor del virus del sarcoma de Rous (Gorman y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)), el promotor de citomegalovirus (Foecking y col., Gene 45:101 (1980)) y el promotor del virus del tumor de mama de ratón (véase, generalmente, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture" en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland y col., (eds.), páginas 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)).
Alternativamente, un promotor procariota, tal como el promotor de la ARN polimerasa T3 de bacteriófago, puede usarse para controlar la expresión génica de IL-20RA en células de mamífero si el promotor procariota está regulado por un promotor eucariota (Zhou y col., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990), y Kaufman y col., Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991)).
En ciertas realizaciones, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de receptores solubles de IL-20 o IL-20RA o IL-20RB, o un fragmento de un polipéptido de IL-20, IL-20RA o IL-20RB, está operablemente ligada a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, incluyendo generalmente un promotor y terminador de la transcripción, dentro de un vector de expresión. El vector también contendrá comúnmente uno o más marcadores de selección y uno o más orígenes de replicación, aunque los expertos en la materia reconocerán que dentro de ciertos sistemas los marcadores de selección pueden proporcionarse en vectores separados, y la replicación del ADN exógeno puede proporcionarse mediante la integración en el genoma de la célula huésped. La selección de promotores, terminadores, marcadores de selección, vectores y otros elementos es una cuestión del diseño rutinario dentro del nivel del experto en la materia. Muchos de tales elementos se describen en la bibliografía y están disponibles de proveedores comerciales. Los múltiples componentes de un complejo de receptores solubles pueden cotransfectarse en vectores de expresión individuales o estar contenidos en un único vector de expresión. Tales técnicas de expresar múltiples componentes de complejos de proteínas son muy conocidas en la técnica.
Un vector de expresión puede introducirse en células huésped usando una variedad de técnicas estándar que incluyen transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por liposomas, administración mediada por microproyectiles, electroporación y similares. Las células transfectadas pueden seleccionarse y propagarse para proporcionar células huésped recombinantes que comprenden el vector de expresión establemente integrado en el genoma de la célula huésped. Las técnicas para introducir vectores en células eucariotas y las técnicas para seleccionar tales transformantes estables usando un marcador de selección dominante se describen, por ejemplo, por Ausubel (1995) y por Murray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991).
Por ejemplo, un marcador de selección adecuado es un gen que proporciona resistencia al antibiótico neomicina. En este caso, la selección se lleva a cabo en presencia de un fármaco de tipo neomicina tal como G-418 o similares. Los sistemas de selección también pueden usarse para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, un procedimiento denominado en lo sucesivo "amplificación". La amplificación se lleva a cabo cultivando transfectantes en presencia de un bajo nivel del agente selectivo y luego aumentando la cantidad de agente selectivo para seleccionar células que producen altos niveles de los productos de los genes introducidos. Un marcador de selección amplificable adecuado es dihidrofolato reductasa (DHFR), que confiere resistencia a metotrexato. También pueden usarse otros genes con resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a higromicina, resistencia a múltiples fármacos, puromicina acetiltransferasa). Alternativamente, los marcadores que introducen un fenotipo alterado, tales como la proteína verde fluorescente, o proteínas de la superficie de la célula, tales como CD4, CD8, MHC de clase I, fosfatasa alcalina placentaria, pueden usarse para clasificar células transfectadas a partir de células sin transfectar mediante medios tales como clasificación por FACS o tecnología de separación con perlas magnéticas.
Los polipéptidos de IL-20, IL-20RA o IL-20RB también pueden producirse mediante células de mamífero cultivadas usando un sistema de administración viral. Los virus a modo de ejemplo para este fin incluyen adenovirus, retrovirus, herpesvirus, virus de la variolovacuna y dependovirus (AAV). El adenovirus, un virus de AND bicatenario, es actualmente el vector de transferencia génica mejor estudiado para la administración de ácido nucleico heterólogo (para una revisión véanse Becker y col., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994), y Douglas y Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)). Las ventajas del sistema de adenovirus incluyen la acomodación de insertos de ADN relativamente grandes, la capacidad para crecer hasta alto título, la capacidad para infectar una amplia variedad de tipos de células de mamífero y la flexibilidad que permite el uso con un gran número de vectores disponibles que contienen diferentes promotores.
Mediante la deleción de partes del genoma del adenovirus pueden acomodarse insertos más grandes (hasta 7 kb) de ADN heterólogo. Estos insertos pueden incorporarse en el ADN viral mediante ligadura directa o mediante recombinación homóloga con un plásmido cotransfectado. Una opción es eliminar el gen esencial E1 del vector vírico, que da como resultado la incapacidad para replicar a menos que el gen E1 sea proporcionado por la célula huésped. Las células 293 humanas infectadas por el vector de adenovirus (ATCC nº CRL-1573, 45504, 45505), por ejemplo, puede cultivarse como células adherentes o en cultivo en suspensión a densidad de células relativamente alta para producir cantidades significativas de proteína (véase Garnier y col., Cytotechnol. 15:145 (1994)).
La IL-20, IL-20RA o IL-20RB también puede expresarse en otras células eucariotas superiores tales como células aviares, fúngicas, de insecto, de levadura o vegetales. El sistema de baculovirus proporciona un medio eficaz para introducir genes clonados en células de insecto. Los vectores de expresión adecuados se basan en el virus de la polihedrosis nuclear múltiple de Autographa californica (AcMNPV) y contienen promotores muy conocidos tales como el promotor 70 de la proteína de choque térmico de Drosophila (hsp), el promotor del gen temprano-inmediato del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa california (ie-1) y el promotor 39K temprano retardado, promotor p10 de baculovirus y el promotor de la metalotioneína de Drosophila. Un segundo procedimiento de hacer recombinantes baculovirus utiliza un sistema basado en transposón descrito por Luckow (Luckow, y col., J. Virol. 67:4566 (1993)). Este sistema, que utiliza vectores de transferencia, se comercializa en el kit BAC-to-BAC (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza un vector de transferencia, PFASTBAC (Life Technologies) que contiene un transposón Tn7 para mover el ADN que codifica el polipéptido a un genoma de baculovirus mantenido en E. coli como una plásmido grande llamado un "bacmido". Véanse, Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, y col., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), y Chazenbalk, y Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión en el marco con ADN que codifica una marca de epítope en el extremo C o N del polipéptido expresado, por ejemplo, una marca de epítope Glu-Glu (Grussenmeyer y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. 82:7952 (1985)). Usando una técnica conocida en la técnica, un vector de transferencia que contiene un gen se transforma en E. coli y se criba para bacmidos que contienen un gen lacZ interrumpido indicativo de baculovirus recombinante. Entonces, el ADN de bacmido que contiene el genoma de baculovirus recombinante se aísla usando técnicas comunes.
El vector PFASTBAC ilustrativo puede modificarse hasta un grado considerable. Por ejemplo, el promotor de polihedrina puede eliminarse y sustituirse con el promotor de la proteína básica de baculovirus (también conocido como promotor Pcor, p6.9 o MP) que se expresa más temprano en la infección por baculovirus, y se ha mostrado que es ventajoso para expresar proteínas secretadas (véanse, por ejemplo, Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, y col., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). En tales constructos de vectores de transferencia puede usarse una versión corta o larga del promotor de la proteína básica. Además, pueden construirse vectores de transferencia que sustituyen las secuencias señal secretoras de IL-20RA nativas con secuencias señal secretoras derivadas de proteínas de insecto. Por ejemplo, una secuencia señal secretora de ecdisteroide glucosiltransferasa (EGT), melitina de abeja (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA) o baculovirus gp67 (PharMingen: San Diego, CA) puede usarse en constructos para sustituir la secuencia señal secretora nativa.
El virus recombinante o bacmido se usa para transfectar células huésped. Las células huésped de insecto adecuadas incluyen líneas celulares derivadas de IPLB-Sf-21, una línea de células de ovario de pupas de Spodoptera frugiperda, tal como Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE y Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), además de células de Drosophila Schneider-2, y la línea celular HIGH FIVEO (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (patente de EE.UU. nº 5.300.435). Los medios sin suero comercialmente disponibles pueden usarse para cultivar y para mantener las células. Los medios adecuados son Sf900 II^{TM} (Life Technologies) o ESF 921^{TM} (Expression Systems) para las células Sf9; y Ex-cellO405^{TM} (JRH Biosciences, Lenexa, KS) o Express FiveO^{TM} (Life Technologies) para las células de T. ni. Cuando se usan virus recombinantes, las células se cultivan normalmente a partir de una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 10^{5} células a una densidad de 1-2 x 10^{6} células momento en el cual se añade un caldo viral recombinante a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 a 10, más normalmente próxima a 3.
Las técnicas establecidas para producir proteínas recombinantes en sistemas de baculovirus se proporcionan por Bailey y col., "Manipulation of Baculovirus Vectors" en Methods in Molecular Biology, volumen 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), páginas 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991), por Patel y col., "The baculovirus expression system" en DNA Cloning 2: Expression systems, 2^{a} edición, Glover y col., (eds.), páginas 205-244 (Oxford University Press 1995), por Ausubel (1995) en las páginas 16-37 a 16-57, por Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995) y por Lucknow, "Insect Cell Expression Technology" en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland y col., (eds.), páginas 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996).
Las células fúngicas, que incluyen células de levadura, también puede usarse para expresar los genes descritos en este documento. Las especies de levadura de interés particular a este respecto incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Pichia methanolica. Los promotores adecuados para la expresión en levadura incluyen promotores de GAL1 (galactosa), PGK (fosfoglicerato quinasa), ADH (alcohol deshidrogenasa), AOX1 (alcohol oxidasa), HIS4 (histidinol deshidrogenasa), y similares. Se han diseñado muchos vectores de clonación de levadura y están fácilmente disponibles. Estos vectores incluyen vectores basados en YIp tales como YIp5, vectores de YRp tales como YRp17, vectores de YEp tales como YEp13 y vectores de YCp tales como YCp19. Los procedimientos para transformar células de S. cerevisiae con ADN exógeno y producir polipéptidos recombinantes a partir del mismo se desvelan por, por ejemplo, Kawasaki, patente de EE.UU. nº 4.599.311, Kawasaki y col., patente de EE.UU. nº 4.931.373, Brake, patente de EE.UU. nº 4.870.008, Welch y col., patente de EE.UU. nº 5.037.743 y Murray y col., patente de EE.UU. nº 4.845.075. Las células transformadas se seleccionan por el fenotipo determinado por el marcador de selección, comúnmente la resistencia a fármacos o la capacidad para crecer en ausencia de un nutriente particular (por ejemplo, leucina). Un sistema de vectores adecuado para uso en Saccharomyces cerevisiae es el sistema de vectores POT1 desvelado por Kawasaki y col. (patente de EE.UU. nº 4.931.373) que permite seleccionar células transformadas mediante crecimiento en medios que contienen glucosa. Los promotores y terminadores adecuados adicionales para uso en levadura incluyen los de genes de enzimas glicolíticas (véase, por ejemplo, Kawasaki, patente de EE.UU. nº 4.599.311, Kingsman y col., patente de EE.UU. nº 4.615.974 y Bitter, patente de EE.UU. nº 4.977.092) y genes de alcohol deshidrogenasa. Véanse también las patentes de EE.UU. nº 4.990.446, 5.063.154, 5.139.936 y 4.661.454.
En la técnica se conocen sistemas de transformación para otras levaduras, que incluyen Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillrmondii y Candida maltosa. Véanse, por ejemplo, Gleeson y col., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986) y Cregg, patente de EE.UU. nº 4.882.279. Las células de Aspergillus pueden utilizarse según los procedimientos de McKnight y col., patente de EE.UU. nº 4.935.349. Los procedimientos para transformar Acremonium chrysogenum se desvelan por Sumino y col., patente de EE.UU. nº 5.162.228. los procedimientos para transformar Neurospora se desvelan por Lambowitz, patente de EE.UU. nº 4.486.533.
Por ejemplo, el uso de Pichia methanolica como huésped para la producción de proteínas recombinantes se desvela por Raymond, patente de EE.UU. nº 5.716.808, Raymond, patente de EE.UU. nº 5,736.383, Raymond y col., Yeast 14:11-23 (1998), y en las publicaciones internacionales nº WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 y WO 98/02565. Las moléculas de ADN para uso en la transformación de P. methanolica se prepararán comúnmente como plásmidos circulares bicatenarios que preferentemente se linealizan antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanolica, el promotor y el terminador en el plásmido pueden ser el de un gen de P. methanolica, tal como un gen de utilización de alcohol de P. methanolica (AUG1 o AUG2). Otros promotores útiles incluyen los de los genes de dihidroxiacetona sintasa (DHAS), formiato deshidrogenasa (FMD) y catalasa (CAT). Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma huésped se prefiere tener todo el segmento de expresión del plásmido flanqueado en ambos extremos por secuencias de ADN huésped. Un marcador de selección adecuado para uso en Pichia methanolica es un gen ADE2 de P. methanolica que codifica fosforibosil-5-aminoimidazol carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21) y que permite que células huésped ade2 crezcan en ausencia de adenina. Para procedimientos industriales a gran escala en los que se desea minimizar el uso de metanol, pueden usarse células huésped en las que se eliminan ambos genes de utilización de metanol (AUG1 y AUG2). Para la producción de proteínas secretadas, las células huésped pueden carecer de genes de proteasa vacuolar (PEP4 y PRB1). La electroporación se usa para facilitar la introducción de un plásmido que contiene ADN que codifica un polipéptido de interés en células de P. methanolica. Las células de P. methanolica pueden transformarse por electroporación usando un campo eléctrico pulsado exponencialmente descendente que tiene una intensidad de campo de 2,5 a 4,5 kV/cm, preferentemente aproximadamente 3,75 kV/cm, y una constante de tiempo (t) de 1 a 40 milisegundos, lo más preferentemente aproximadamente 20 milisegundos.
Los vectores de expresión también pueden introducirse en protoplastos vegetales, tejidos vegetales intactos o células vegetales aisladas. Los procedimientos para introducir vectores de expresión en tejido vegetal incluyen la infección directa o cocultivo de tejido vegetal con Agrobacterium tumefaciens, administración mediada por microproyectiles, inyección de ADN, electroporación y similares. Véanse, por ejemplo, Horsch y col., Science 227:1229 (1985), Klein y col., Biotechnology 10:268 (1992), y Miki y col., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick y col., (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993).
Alternativamente, los genes de IL-20, IL-20RA o IL-20RB pueden expresarse en células huésped procariotas. Los promotores adecuados que pueden usarse para expresar polipéptidos de IL-20, IL-20RA o IL-20RB en un huésped procariota son muy conocidos para los expertos en la materia e incluyen promotores que pueden reconocer las polimerasas T4, T3, Sp6 y T7, los promotores P_{R} y P_{L} de bacteriófago lambda, los promotores trp, recA, de choque térmico, lacUV5, tac, Ipp-lacSpr, phoA y lacZ de E. coli, promotores de B. subtilis, los promotores de los bacteriófagos de Bacillus, promotores de Streptomyces, el promotor int de bacteriófago lambda, el promotor bla de pBR322 y el promotor CAT del gen de cloranfenicol acetiltransferasa. Los promotores procariotas han sido revisados por Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson y col., Molecular Biology of the Gene, 4^{a} ed. (Benjamin Cummins 1987) y por Ausubel y col. (1995).
Los huéspedes procariotas adecuados incluyen E. coli y Bacillus subtilus. Las cepas adecuadas de E. coli incluyen BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21 (DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF, DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, y ER1647 (véase, por ejemplo, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Las cepas adecuadas de Bacillus subtilus incluyen BR151, YB886, MI119, MI120 y B170 (véase, por ejemplo, Hardy, "Bacillus Cloning Methods" en DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)).
Cuando se expresa un polipéptido de IL-20, IL-20RA o IL-20RB en bacterias tales como E. coli, el polipéptido puede conservarse en el citoplasma, normalmente como gránulos insolubles, o puede dirigirse al espacio periplásmico mediante una secuencia de secreción bacteriana. En el caso anterior, las células se lisan y los gránulos se recuperan y se desnaturalizan usando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. Entonces, el polipéptido desnaturalizado puede renaturalizarse y dimerizarse diluyendo el desnaturante, tal como mediante diálisis contra una disolución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguido por diálisis contra una disolución de solución salina tamponada. En este último caso, el polipéptido puede recuperarse del espacio periplásmico en una forma soluble y funcional rompiendo las células (mediante, por ejemplo, sonicación o choque osmótico) para liberar el contenido del espacio periplásmico y recuperar la proteína, obviándose así la necesidad de desnaturalización y renaturalización.
Los procedimientos para expresar proteínas en huéspedes procariotas son muy conocidos para los expertos en la materia (véanse, por ejemplo, Williams y col., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies" en DNA Cloning 2: Expression systems, 2ª edición, Glover y col., (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995), Ward y col., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995) y Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria" en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland y col., (eds.), página 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)).
Los procedimientos estándar para introducir vectores de expresión en células bacterianas, de levadura, de insecto y vegetales se proporcionan, por ejemplo, por Ausubel (1995).
Los procedimientos generales para expresar y recuperar proteína foránea producida por un sistema de células de mamífero se proporcionan por, por ejemplo, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture" en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland y col., (eds.), páginas 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Las técnicas estándar para recuperar la proteína producida por un sistema bacteriano se proporcionan por, por ejemplo, Grisshammer y col., "Purification of over-produced proteins from E. coli cells" en DNA Cloning 2: Expression systems, 2ª edición, Glover y col., (eds.), páginas 59-92 (Oxford University Press 1995). Los procedimientos establecidos para aislar proteínas recombinantes de un sistema de baculovirus se describen por Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995).
Como alternativa, los polipéptidos de la presente invención pueden sintetizarse mediante síntesis exclusiva en fase sólida, procedimientos en fase sólida parcial, condensación de fragmentos o síntesis por disolución clásica. Estos procedimientos de síntesis son muy conocidos para los expertos en la materia (véanse, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart y col., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2ª edición), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton y col., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989), Fields y Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis", Methods in Enzymology, volumen 289 (Academic Press 1997), y Lloyd-Williams y col., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)). Las variaciones en las estrategias de síntesis química totales, tales como "ligadura química nativa" y "ligadura de proteínas expresadas" también son estándar (véanse, por ejemplo, Dawson y col., Science 266:776 (1994), Hackeng y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998), y Severinov y Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)).
Los péptidos y los polipéptidos de la presente invención comprenden al menos seis, al menos nueve, o al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos de SEQ ID Nº: 2, SEQ ID Nº: 11 o SEQ ID Nº: 13. Como ilustración, los polipéptidos pueden comprender al menos seis, al menos nueve, o al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos de SEQ ID Nº: 2, SEQ ID Nº: 11 o SEQ ID Nº: 13. Dentro de ciertas realizaciones de la invención, los polipéptidos comprenden 20, 30, 40, 50, 100 o más residuos contiguos de estas secuencias de aminoácidos. Las moléculas de ácido nucleico que codifican tales péptidos y polipéptidos son útiles como cebadores y sondas de la reacción en cadena de la polimerasa.
Además, los polipéptidos de IL-20, IL-20RA y IL-20RB y fragmentos de los mismos pueden expresarse como monómeros, homodímeros, heterodímeros o multímeros dentro de células eucariotas superiores. Tales células pueden usarse para producir polipéptidos de receptores monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos de IL-20, o IL-20RA y IL-20RB que comprenden tanto al menos un polipéptido de IL-20RA ("receptores que comprenden IL-20RA" o "polipéptidos de receptores que comprenden IL-20RA") como al menos un polipéptido de IL-20RB ("receptores que comprenden IL-20RB" o "polipéptidos de receptores que comprenden IL-20RB"); o pueden usarse como células de ensayo en sistemas de cribado. Dentro de un aspecto de la presente invención, un polipéptido de la presente invención que comprende tanto el dominio extracelular de IL-20RA como de IL-20RB o ambos dominios extracelular de IL-20RA y IL-20RB se produce mediante una célula cultivada, y la célula se usa para cribar ligandos para el receptor, que incluyen el ligando natural, IL-20, además de agonistas y antagonistas del ligando natural. Para resumir esta solución, un ADNc o gen que codifica el receptor se combina con otros elementos genéticos requeridos para su expresión (por ejemplo, un promotor de la transcripción) y el vector de expresión resultante se inserta en una célula huésped. Las células que expresan el ADN y producen el receptor funcional se seleccionan y se usan dentro de una variedad de sistemas de cribado. Cada componente del complejo de receptores monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos puede expresarse en la misma célula. Además, los componentes del complejo de receptores monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos también pueden fusionarse a un dominio transmembrana u otro resto de fusión a membrana para permitir el montaje de complejos y cribar transfectantes como se describe anteriormente.
Para ensayar los polipéptidos de antagonistas de IL-20 y anticuerpos de la presente invención, las células de mamífero adecuadas para uso en la expresión de receptores de IL-20 o IL-20 (por ejemplo, células que expresan IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB) y la transducción de una señal mediada por receptor incluyen células que expresan otras subunidades de receptores que pueden formar un complejo funcional con IL-20RA o IL-20RB. Estas subunidades pueden incluir las de la familia de receptores de interferón o de otros receptores de citocinas de clase II o clase I, por ejemplo CRF2-4 (nº de registro de Genbank Z17227), IL-10R (nº de registro de Genbank U00672 y NM_001558), IL-20RA (patente de EE.UU. en propiedad como la presente nº 5.965.704), zcytor7 (IL-20RA) (patente de EE.UU. en propiedad como la presente nº 5.945.511), IL-20RA/IL-20RB (publicación WIPO nº WO 01/46232) y IL-9R. También se prefiere usar una célula de la misma especie que el receptor que va a expresarse. Dentro de una realización preferida, la célula depende de un factor de crecimiento hematopoyético exógenamente aportado para su proliferación. Las líneas celulares preferidas de este tipo son la línea celular humana TF-1 (número ATCC CRL-2003) y la línea celular AML-193 (número ATCC CRL-9589), que son líneas celulares leucémicas humanas dependientes de GM-CSF, y BaF3 (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, (1985)) que es una línea de células pre-B murinas dependientes de IL-3. Otras líneas celulares incluyen células BHK, COS-1 y CHO. Las células huésped adecuadas pueden manipularse para producir las subunidades de receptores necesarias u otro componente celular necesario para la respuesta celular deseada. Esta solución es ventajoso porque las líneas celulares pueden manipularse para expresar subunidades de receptores de cualquier especie, venciéndose así las posibles limitaciones que surgen de la especificidad de especies. Los ortólogos de especies del ADNc de receptores humanos pueden clonarse y usarse dentro de líneas celulares de las mismas especies, tales como un ADNc de ratón en la línea celular BaF3. Por tanto, las líneas celulares que dependen de un factor de crecimiento hematopoyético, tal como GM-CSF o IL-3, pueden manipularse para hacerse dependientes de otra citocina que actúa mediante el receptor de IL-20RA, tal como IL-20.
Las células que expresan el receptor funcional se usan dentro de ensayos de cribado. En la técnica se conoce una variedad de ensayos adecuados. Estos ensayos se basan en la detección de una respuesta biológica en una célula diana. Un ensayo tal es un ensayo de proliferación celular. Las células se cultivan en presencia o ausencia de un compuesto de prueba, y la proliferación celular se detecta, por ejemplo, midiendo la incorporación de timidina tritiada o mediante ensayo colorimétrico basado en la descomposición metabólica de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, (1983)). Una forma de ensayo alternativa usa células que se manipulan adicionalmente para expresar un gen indicador. El gen indicador está ligado a un elemento de promotor que es sensible a la ruta ligada al receptor, y el ensayo detecta la activación de la transcripción del gen indicador. Un elemento de promotor preferido a este respecto es un elemento de respuesta al suero, o SRE. Véase, por ejemplo Shaw y col., Cell 56:563-572, (1989). Un gen indicador preferido tal es un gen de luciferasa (de Wet y col., Mol. Cell. Biol. 7:725, (1987)). La expresión del gen de luciferasa se detecta por luminiscencia usando procedimientos conocidos en la técnica (por ejemplo, Baumgartner y col., J. Biol. Chem. 269:29094-29101, (1994); Schenborn y Goiffin, Promega Notes 41:11, 1993). Los kit de ensayo de la actividad de luciferasa están comercialmente disponibles de, por ejemplo, Promega Corp., Madison, WI. Las líneas celulares diana de este tipo pueden usarse para cribar bibliotecas de productos químicos, medios de cultivo acondicionados con células, caldos fúngicos, muestras de tierra, muestras de agua y similares. Por ejemplo, un banco de muestras de medios acondicionados con células puede ensayarse en una célula diana para identificar células que producen ligando. Entonces, las células positivas se usan para producir una biblioteca de ADNc en un vector de expresión de mamífero que se divide en conjuntos, se transfecta en células huésped y se expresa. Entonces, las muestras de medios de las células transfectadas se ensayan, con la posterior división de conjuntos, re-transfección, subcultivo y re-ensayo de células positivas para aislar un ADNc clonado que codifica el ligando.
En la técnica se conocen o pueden construirse varias líneas celulares sensibles a IL-20, por ejemplo, Baf3/cytoR11/
DIRS1 o Baf3/cytoR7/DIRS1 (publicación WIPO nº WO 02/072607). Además, se conocen varias líneas celulares sensibles a IL-20 (Dumontier y col., J. Immunol. 164:1814-1819, 2000; Dumoutier, L. y col., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97:10144-10149, 2000; Xie MH y col., J. Biol. Chem. 275: 31335-31339, 2000; Kotenko SV y col., J. Biol. Chem. 276:2725-2732, 2001), además de las que expresan la subunidad de receptores de IL-20 IL-20RA y IL-20RB. Por ejemplo, las siguientes células son sensibles a IL-20: células HT-29 (Dumoutier y col., J. Immunol. 167: 3545-3549, 2001) y Colo205 del epitelio intestinal, línea de células de cáncer de pulmón A549 y HUVEC (célula endotelial de vena umbilical humana) de células endoteliales (Ramesh y col., Cancer Research 63: 5105-5113) y línea celular de queratinocitos HaCaT (Blumberg y col., Cell 104: 9-19). Estas células pueden usarse en ensayos para evaluar la funcionalidad de Acm anti-IL-20RA o IL-20RB como un antagonista de IL-20 o factor antiinflamatorio.
6. Producción de proteínas de fusión y conjugados de IL-20RA y IL-20RB
Una clase general de análogos de IL-20RA y IL-20RB son variantes que tienen una secuencia de aminoácidos que es una mutación de la secuencia de aminoácidos desvelada en este documento. Otra clase general de análogos de IL-20RA y IL-20RB se proporciona por anticuerpos anti-idiotipo, y fragmentos de los mismos, como se describe más adelante. Además, los anticuerpos recombinantes que comprenden dominios variables anti-idiotipo pueden usarse como análogos (véase, por ejemplo, Monfardini y col., Proc. Assoc. Am. Physicians 108:420 (1996)). Debido a que los dominios variables de anticuerpos anti-idiotipo de IL-20RA y IL-20RB imitan a IL-20RA y IL-20RB, estos dominios pueden proporcionar actividad de unión a IL-20RA y IL-20RB. Los procedimientos para producir anticuerpos catalíticos anti-idiotípicos son conocidos para los expertos en la materia (véanse, por ejemplo, Joron y col., Ann. N Y Acad. Sci. 672:216 (1992), Friboulet y col., Appl. Biochem. Biotechnol. 47:229 (1994), y Avalle y col., Ann. N Y Acad. Sci. 864:118 (1998)).
Otra solución para identificar análogos de IL-20RA y IL-20RB se proporciona mediante el uso de bibliotecas combinatorias. Se proporcionan procedimientos para construir y cribar expresión en fago y otras bibliotecas combinatorias, por ejemplo, por Kay y col., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press 1996), Verdine, patente de EE.UU. nº 5.783.384, Kay y col., patente de EE.UU. nº 5.747.334 y Kauffman y col., patente de EE.UU. nº 5.723.323.
Los péptidos de IL-20RA y IL-20RB tienen usos tanto in vivo como in vitro. Como ilustración, una forma soluble de IL-20RA o IL-20RB puede añadirse al medio de cultivo celular para inhibir los efectos de IL-20 producida por las células cultivadas.
Las proteínas de fusión de IL-20RA y IL-20RB pueden usarse para expresar IL-20RA y IL-20RB en un huésped recombinante, y para aislar la IL-20RA o IL-20RB producida. Como se describe más adelante, las proteínas de fusión de IL-20RA o IL-20RB particulares también tienen usos en diagnóstico y terapia. Un tipo de proteína de fusión comprende un péptido que guía, por ejemplo, un polipéptido de IL-20RA de una célula huésped recombinante. Para dirigir un polipéptido de IL-20RA a una ruta secretora de una célula huésped eucariota, se proporciona una secuencia señal secretora (también conocida como un péptido señal, una secuencia conductora, secuencia prepro o secuencia pre) en el vector de expresión de IL-20RA. Aunque la secuencia señal secretora puede derivarse de IL-20RA, una secuencia señal adecuada también puede derivarse de otra proteína secretada o sintetizada de novo. La secuencia señal secretora está operablemente ligada a una secuencia que codifica IL-20RA de forma que las dos secuencias se unen en el marco de lectura correcto y se posicionan para dirigir al polipéptido recientemente sintetizado a la ruta secretora de la célula huésped. Las secuencias señal secretoras están comúnmente posicionadas en 5' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias señal secretoras pueden estar posicionadas en cualquier sitio en la secuencia de nucleótidos de interés (véase, por ejemplo, Welch y col., patente de EE.UU. nº 5.037.743; Holland y col., patente de EE.UU. nº 5.143.830).
Aunque la secuencia señal secretora de IL-20RA o IL-20RB u otra proteína producida por células de mamífero (por ejemplo, secuencia señal de activador de plasminógeno de tipo tejido, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.641.655) es útil para la expresión de IL-20RA o IL-20RB en huéspedes mamíferos recombinantes, se prefiere una secuencia señal de levadura para la expresión en células de levadura. Ejemplos de secuencias señal de levadura adecuadas son las derivadas del factor de feromona a de apareamiento de la levadura (codificado por el gen MF\alpha1), invertasa (codificada por el gen SUC2) o fosfatasa ácida (codificada por el gen PHO5). Véase, por ejemplo, Romanos y col., "Expression of Cloned Genes in Yeast" en DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2ª edición, Glover y Hames (eds.), páginas 123-167 (Oxford University Press 1995).
Los polipéptidos de receptores solubles de IL-20RA o IL-20RB pueden prepararse expresando un ADN truncado que codifica el dominio extracelular, por ejemplo, un polipéptido que contiene SEQ ID Nº: 11 ó 13, o la región correspondiente de un receptor no humano. Se prefiere que los polipéptidos de dominio extracelular se preparen en una forma sustancialmente libre de segmentos de polipéptidos transmembrana e intracelulares. Para dirigir la exportación del dominio del receptor desde la célula huésped, el ADN de receptor está ligado a un segundo segmento de ADN que codifica un péptido secretor, tal como un péptido secretor t-PA. Para facilitar la purificación del dominio de receptor secretado, una extensión del extremo C, tal como una marca de poli-histidina, sustancia P, péptido Flag^{TM} (Hopp y col., Biotechnology 6:1204-1210, (1988); disponible de Eastman Kodak Co. New Haven, CT) u otro polipéptido o proteína para el que está disponible un anticuerpo u otro agente de unión específico, puede fusionarse al polipéptido de receptor. Además, los epítopes antigénicos de IL-20RA de los dominios extracelulares de unión a citocina también se preparan como se describe anteriormente.
En una solución alternativa, un dominio extracelular de receptor de IL-20RA, IL-20RB u otro componente de receptores de citocina de clase I o II puede expresarse como una fusión con regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina, normalmente un fragmento F_{C}, que contiene dos dominios de región constante y una región bisagra, pero que carece de la región variable (véase, Sledziewski, AZ y col., patentes de EE.UU. nº 6.018.026 y 5.750.375). Los polipéptidos solubles de IL-20RA o IL-20RB de la presente invención incluyen tales fusiones. Tales fusiones se secretan normalmente como moléculas multiméricas en las que las partes Fc están unidas entre sí por disulfuro y dos polipéptidos de receptores están expuestos en estrecha proximidad entre sí. Las fusiones de este tipo pueden usarse para purificar por afinidad el ligando relacionado de la disolución, como una herramienta de ensayo in vitro, para bloquear señales in vitro valorando específicamente el ligando y como antagonistas in vivo administrándolos parenteralmente para unir el ligando en circulación y quitarlo de la circulación. Por ejemplo, para purificar el ligando, una quimera IL-20RA-Ig se añade a una muestra que contiene el ligando (por ejemplo, medios de cultivo acondicionados con células o extractos de tejido) en condiciones que facilitan la unión receptor-ligando (normalmente temperatura, pH y fuerza iónica próximos a fisiológicos). Entonces, el complejo quimera-ligando se separa mediante la mezcla usando la proteína A, que está inmovilizada sobre un soporte sólido (por ejemplo, perlas de resina insolubles). Entonces, el ligando se eluye usando técnicas químicas convencionales tales como con una sal o gradiente de pH. Provisionalmente, la propia quimera puede unirse a un soporte sólido, realizándose la unión y la elución como anteriormente. Las quimeras pueden usarse in vivo para regular respuestas inflamatorias que incluyen respuestas de fase aguda tales como suero amiloide A (SAA), proteína C-reactiva (CRP) y similares. Las quimeras con alta afinidad de unión se administran parenteralmente (por ejemplo, mediante inyección intramuscular, subcutánea o intravenosa). Las moléculas en circulación se unen al ligando y se quitan de la circulación mediante procedimientos fisiológicos normales. Para uso en ensayos, las quimeras se unen a un soporte mediante la región F_{C} y se usan en una forma de ELISA.
Para ayudar en el aislamiento de anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB y componentes de unión de la presente invención puede emplearse ventajosamente un sistema de ensayo que usa un receptor de unión a ligando (o un anticuerpo, un miembro de un par complemento/anti-complemento) o un fragmento de unión del mismo, y un instrumento de biosensor comercialmente disponible (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Tal receptor, anticuerpo, miembro de un par complemento/anti-complemento o fragmento se inmoviliza sobre la superficie de un chip de receptor. El uso de este instrumento se desvela por Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-40, 1991 y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993. Un receptor, anticuerpo, miembro o fragmento se une covalentemente, usando química de aminas o sulfhidrilo, a fibras de dextrano que están unidas a una película de oro dentro de una celda de flujo. Una muestra de prueba se pasa a través de la celda. Si un ligando, epítope o miembro opuesto del par complemento/anti-complemento está presente en la muestra, se unirá al receptor, anticuerpo o miembro inmovilizado, respectivamente, produciendo un cambio en el índice de refracción del medio, que se detecta como un cambio en la resonancia de plasmón superficial de la película de oro. Este sistema permite la determinación de constantes de asociación y de disociación, a partir de las cuales puede calcularse la afinidad de unión, y la evaluación de la estequiometria de unión. Alternativamente, la unión ligando/receptor puede analizarse usando tecnología SELDI(TM) (Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA). Además, la tecnología BIACORE, descrita anteriormente, puede usarse para usarse en experimentos de competición para determinar si diferentes anticuerpos monoclonales se unen al mismo epítope o a diferentes epítopes en polipéptidos de IL-20, IL-20RA y IL-20RB, y como tales, usarse para ayudar en el mapeo de epítopes de anticuerpos neutralizadores de la presente invención que se unen a, o antagonizan IL-20.
Los polipéptidos de receptores de unión a ligando también pueden usarse en otros sistemas de ensayo conocidos en la técnica. Tales sistemas incluyen análisis de Scatchard para la determinación de la afinidad de unión (véase Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) y ensayos calorimétricos (Cunningham y col., Science 253:545-48, 1991; Cunningham y col., Science 245:821-25, 1991).
La presente invención proporciona además una variedad de otras fusiones de polipéptidos y proteínas multiméricas relacionadas que comprenden una o más fusiones de polipéptidos. Por ejemplo, un receptor soluble de IL-20RA o IL-20RB puede prepararse como una fusión para una proteína dimerizante como se desvela en las patentes de EE.UU. nº 5.155.027 y 5.567.584. Las proteínas dimerizantes preferidas a este respecto incluyen dominios de región constante de inmunoglobulina, por ejemplo IgG\gamma1, y la cadena ligera \kappa humana. Las fusiones inmunoglobulina-IL-20RA o IL-20RB soluble pueden expresarse en células genéticamente manipuladas para producir una variedad de análogos de receptores multiméricos de IL-20RA o IL-20RB. Los dominios auxiliares pueden fusionarse a receptor soluble de IL-20RA o IL-20RB para elegirlos como diana para células, tejidos o macromoléculas específicos (por ejemplo, colágeno, o células que expresan los ligandos de IL-20RA y IL-20RB, o IL-20). Un polipéptido de IL-20RA o IL-20RB puede fusionarse a dos o más restos, tales como una marca de afinidad para purificación y un dominio elegido como diana. Las fusiones de polipéptidos también pueden comprender uno o más sitios de escisión, particularmente entre dominios. Véase, Tuan y col., Connective Tissue Research 34:1-9, 1996.
En células bacterianas, frecuentemente se desea expresar una proteína heteróloga como una proteína de fusión para disminuir la toxicidad, aumentar la estabilidad y para potenciar la recuperación de la proteína expresada. Por ejemplo, cualquiera de los polipéptidos IL-20, IL-20RA o IL-20RB puede expresarse como una proteína de fusión que comprende un polipéptido de glutatión S-transferasa. Las proteínas de fusión de glutatión S-transferasa son normalmente solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de lisados de E. coli sobre columnas de glutatión inmovilizadas. En soluciones similares, una proteína de fusión que comprende un polipéptido de proteína de unión a maltosa puede aislarse con una columna de resina de amilosa, mientras que una proteína de fusión que comprende el extremo C de un gen de proteína A truncada puede purificarse usando IgG-Sepharose. Las técnicas establecidas para expresar un polipéptido heterólogo como una proteína de fusión en una célula bacteriana se describen, por ejemplo, por Williams y col., "Expression of foreign Proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies" en DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2ª edición, Glover y Hames (Eds.), páginas 15-58 (Oxford University Press 1995). Además, están disponibles sistemas de expresión comercialmente disponibles. Por ejemplo, el sistema de purificación de proteínas Xa PINPOINT (Promega Corporation; Madison, WI) proporciona un procedimiento para aislar una proteína de fusión que comprende un polipéptido que se biotiniliza durante la expresión con una resina que comprende avidina.
Las marcas de péptidos que son útiles para aislar polipéptidos heterólogos expresados por células tanto procariotas como eucariotas incluyen marcas de poli-histidina (que tienen una afinidad por resina quelante de níquel), marcas c-myc, proteína de unión a calmodulina (aislada con cromatografía de afinidad por calmodulina), sustancia P, la marca RYIRS (que se une con anticuerpos anti-RYIRS), la marca Glu-Glu y la marga FLAG (que se une con anticuerpos anti-FLAG). Véanse, por ejemplo, Luo y col., Arch. Biochem. Biophys. 329:215 (1996), Morganti y col., Biotechnol. Appl. Biochem. 23:67 (1996), y Zheng y col., Gene 186:55 (1997). Las moléculas de ácido nucleico que codifican tales marcas de péptidos están disponibles, por ejemplo, de Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO).
Otra forma de proteína de fusión comprende tanto un polipéptido de IL-20, IL-20RA o IL-20RB como una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, normalmente un fragmento FC, que contiene dos o tres dominios de región constante y una región bisagra, pero que carece de la región variable. Como ilustración, Chang y col., patente de EE.UU. nº 5.723.125, describe una proteína de fusión que comprende un fragmento Fc de interferón humano y uno de inmunoglobulina humana. El extremo C del interferón está unido al extremo N del fragmento Fc por un resto conector de péptidos. Un ejemplo de un conector de péptidos es un péptido que comprende principalmente una secuencia inerte de células T que es inmunológicamente inerte. Un conector de péptidos a modo de ejemplo tiene la secuencia de aminoácidos: GGSGG SGGGG SGGGG S (SEQ ID Nº: 14).
En otra variación, una proteína de fusión de IL-20, IL-20RA o IL-20RB comprende una secuencia de IgG, un resto de IL-20, IL-20RA o IL-20RB covalentemente unido al extremo amino de la secuencia de IgG y un péptido señal que está covalentemente unido al extremo amino del resto IL-20, IL-20RA o IL-20RB, y en el que la secuencia IgG está constituida por los siguientes elementos en el siguiente orden: una región bisagra, un dominio de CH_{2} y un dominio de CH_{3}. Por consiguiente, la secuencia de IgG carece de un dominio de CH_{1}. El resto de IL-20, IL-20RA o IL-20RB muestra su actividad respectiva, como se describe en este documento, tal como la capacidad para unirse con IL-20 (IL-20RA y IL-20RB) o su capacidad para unirse a su receptor respectivo (IL-20). Esta solución general para producir proteínas de fusión que comprenden tanto partes de anticuerpo como de no anticuerpo se ha descrito por LaRochelle y col., documento EP 742830 (WO 95/21258).
Las proteínas de fusión que comprenden un resto de IL-20, IL-20RA o IL-20RB y un resto Fc pueden usarse, por ejemplo, como una herramienta de ensayo in vitro. Por ejemplo, la presencia de un ligando de IL-20RA (es decir, IL-20) en una muestra biológica puede detectarse usando una proteína de fusión de IL-20RA-inmunoglobulina, en la que el resto de IL-20RA se usa para unir el ligando, y una macromolécula, tal como proteína A o anticuerpo anti-Fc, se usa para unir la proteína de fusión a un soporte sólido. Tales sistemas pueden usarse para identificar agonistas y antagonistas que interfieren con la unión de un ligando de IL-20RA, por ejemplo IL-20, a su receptor.
Otros ejemplos de proteínas de fusión a anticuerpos incluyen polipéptidos que comprenden un dominio de unión a antígeno y un fragmento de IL-20RA o IL-20RB que contiene un dominio extracelular. Tales moléculas pueden usarse para elegir como diana tejidos particulares para el beneficio de la actividad de unión.
La presente invención proporciona además una variedad de otras fusiones de polipéptidos. Por ejemplo, parte o todo un dominio que confiere una función biológica puede intercambiarse entre cualquiera de IL-20, IL-20RA o IL-20RB con el (los) dominio(s) funcionalmente equivalente(s) de otro miembro de la familia de los receptores de citocinas. Las fusiones de polipéptidos pueden expresarse en células huésped recombinantes para producir una variedad de análogos de fusión de IL-20, IL-20RA o IL-20RB. Un polipéptido de IL-20, IL-20RA o IL-20RB puede fusionarse a dos o más restos o dominios, tales como una marca de afinidad para la purificación y un dominio elegido como diana. Las fusiones de polipéptidos también pueden comprender uno o más sitios de escisión, particularmente entre dominios. Véase, por ejemplo, Tuan y col., Connective Tissue Research 34:1 (1996).
Las proteínas de fusión pueden prepararse mediante procedimientos conocidos para los expertos en la materia preparando cada componente de la proteína de fusión y conjugándolos químicamente. Alternativamente, un polinucleótido que codifica ambos componentes de la proteína de fusión en el marco de lectura apropiado puede generarse usando técnicas conocidas y expresarse mediante los procedimientos descritos en este documento. Los procedimientos generales para la escisión enzimática y química de proteínas de fusión se describen, por ejemplo, por Ausubel (1995) en las páginas 16-19 a 16-25.
Los dominios de unión de IL-20, IL-20RA o IL-20RB pueden caracterizarse adicionalmente por análisis físico de estructura, como se determina por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcado por fotoafinidad, conjuntamente con mutación de aminoácidos de sitio de contacto putativos de agonistas del ligando de IL-20RA. Véase, por ejemplo, de Vos y col., Science 255:306 (1992), Smith y col., J. Mol. Biol. 224:899 (1992), y Wlodaver y col., FEBS Lett. 309:59 (1992).
La presente invención también contempla composiciones o conjugados de IL-20, IL-20RA o IL-20RB químicamente modificados en los que un polipéptido de IL-20, IL-20RA o IL-20RB está unido a un polímero. Normalmente, el polímero es soluble en agua de manera que el conjugado no precipita en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiológico. Un ejemplo de un polímero adecuado es uno que se ha modificado para tener un único grupo reactivo, tal como un éster activo para la acilación, o un aldehído para la alquilación. De esta forma, el grado de polimerización puede controlarse. Un ejemplo de un aldehído reactivo es propionaldehído de polietilenglicol, o derivados de monoalcoxi (C1-C10) o ariloxi del mismo (véase, por ejemplo, Harris, y col., patente de EE.UU. nº 5.252.714). El polímero puede estar ramificado o sin ramificar. Además, puede usarse una mezcla de polímeros para producir conjugados.
Los conjugados de IL-20, IL-20RA o IL-20RB usados para terapia pueden comprender restos de polímeros solubles en agua farmacéuticamente aceptables. Los polímeros solubles en agua adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), monometoxi-PEG, monoalcoxi (C1-C10)-PEG, ariloxi-PEG, poli-(N-vinilpirrolidona)PEG, tresilmonometoxi-PEG, propionaldehído de PEG, bis-succinimidilcarbonato-PEG, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerina), poli(alcohol vinílico), dextrano, celulosa, u otros polímeros basados en hidratos de carbono. Los PEG adecuados pueden tener un peso molecular de aproximadamente 600 a aproximadamente 60.000 incluyendo, por ejemplo, 5.000, 12.000, 20.000 y 25.000. Un conjugado de IL-20, IL-20RA o IL-20RB también puede comprender una mezcla de tal polímero soluble en agua.
Un ejemplo de un conjugado de IL-20, IL-20RA o IL-20RB comprende un resto de IL-20, IL-20RA o IL-20RB y un resto de poli(óxido de alquilo) unido al extremo N del resto de IL-20, IL-20RA o IL-20RB. El PEG es un poli(óxido de alquilo) adecuado. Como ilustración, la IL-20RA puede modificarse con PEG, un procedimiento conocido como "PEGización". La PEGización de IL-20, IL-20RA o IL-20RB puede llevarse a cabo mediante cualquiera de las reacciones de PEGización conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, el documento EP 0 154 316, Delgado y col., Critical Reviews in Therapeutic Drugs Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan y Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994), y Francis y col., Int J Hematol 68:1 (1998)). Por ejemplo, la PEGización puede realizarse mediante una reacción de acilación o mediante una reacción de alquilación con una molécula reactiva de polietilenglicol. En una solución alternativa, los conjugados de IL-20RA se forman condensando el PEG activado, en el que un grupo hidroxi o amino terminal del PEG se ha sustituido por un conector activado (véase, por ejemplo, Karasiewicz y col., patente de EE.UU. nº 5.382.657).
La PEGización mediante acilación requiere normalmente hacer reaccionar un derivado de éster activo de PEG con un polipéptido de IL-20, IL-20RA o IL-20RB. Un ejemplo de un éster de PEG activado es PEG esterificado con N-hidroxisuccinimida. Como se usa en este documento, el término "acilación" incluye los siguientes tipos de enlaces entre IL-20, IL-20RA o IL-20RB y un polímero soluble en agua: amida, carbamato, uretano y similares. Los procedimientos para preparar las IL-20, IL-20RA o IL-20RB PEGizadas mediante acilación comprenderá normalmente las etapas de (a) hacer reaccionar un polipéptido de IL-20, IL-20RA o IL-20RB con PEG (tal como un éster reactivo de un derivado de aldehído de PEG) en condiciones en las que uno o más grupos de PEG se unen a IL-20, IL-20RA o IL-20RB, y (b) obtener el (los) producto(s) de reacción. Generalmente, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación se determinarán basándose en parámetros conocidos y resultados deseados. Por ejemplo, cuanto mayor sea la relación de, por ejemplo, PEG:IL-20RA, mayor será el porcentaje de producto de IL-20RA poliPEGizado.
El producto de PEGización mediante acilación es normalmente un producto de IL-20, IL-20RA o IL-20RB poliPEGizado en el que los grupos \varepsilon-amino de lisina se PEGizan mediante un grupo conector acilo. Un ejemplo de un enlace de conexión es una amida. Normalmente, la IL-20, IL-20RA o IL-20RB resultante estará mono-, di-, o tri-pegizada al menos el 95%, aunque pueden formarse algunas especies con mayores grados de PEGización dependiendo de las condiciones de reacción. Las especies PEGizadas pueden separarse de polipéptidos de IL-20, IL-20RA o IL-20RB sin conjugar usando procedimientos de purificación estándar tales como diálisis, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y similares.
La PEGización mediante alquilación implica generalmente hacer reaccionar un derivado de aldehído terminal de PEG con IL-20, IL-20RA o IL-20RB en presencia de un agente reductor. Los grupos de PEG pueden unirse al polipéptido mediante un grupo -CH_{2}-NH.
La derivatización mediante alquilación reductora para producir un producto monoPEGizado aprovecha la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios disponibles para la derivatización. Normalmente, la reacción se realiza a un pH que permite aprovechar las diferencias de pKa entre los grupos \varepsilon-amino de los residuos de lisina y el grupo \alpha-amino del residuo del extremo N de la proteína. Mediante tal derivatización selectiva se controla la unión de un polímero soluble en agua que contiene un grupo reactivo tal como un aldehído a una proteína. La conjugación con el polímero se produce predominantemente en el extremo N de la proteína sin modificación significativa de otros grupos reactivos tales como los grupos amino de la cadena lateral de lisina. La presente invención proporciona una preparación sustancialmente homogénea de conjugados de monopolímeros de IL-20, IL-20RA o
IL-20RB.
La alquilación reductora para producir una población sustancialmente homogénea de molécula conjugada de monopolímero de IL-20, IL-20RA o IL-20RB puede comprender las etapas de: (a) hacer reaccionar un polipéptido de IL-20, IL-20RA o IL-20RB con un PEG reactivo bajo condiciones de alquilación reductora a un pH adecuado para permitir la modificación selectiva del grupo \alpha-amino en el extremo amino de la IL-20, IL-20RA o IL-20RB, y (b) obtener el (los) producto(s) de reacción. El agente reductor usado para la alquilación reductora debe ser estable en disolución acuosa y sólo puede reducir la base de Schiff formada en el procedimiento inicial de alquilación reductora. Los agentes reductores ilustrativos incluyen borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, borano de dimetilamina, borano de trimetilamina y borano de piridina.
Para una población sustancialmente homogénea de conjugados de monopolímeros de IL-20, IL-20RA o IL-20RB, las condiciones de reacción de alquilación reductora son las que permiten la unión selectiva del resto de polímero soluble en agua al extremo N de IL-20, IL-20RA o IL-20RB. Tales condiciones de reacción proporcionan generalmente diferencias de pKa entre los grupos amino de lisina y el grupo \alpha-amino en el extremo N. El pH también afecta la relación de polímero respecto a proteína que va a usarse. En general, si el pH es inferior, se deseará un mayor exceso de polímero respecto a proteína porque cuanto menos reactivo sea el grupo \alpha del extremo N, más polímero se necesitará para lograr condiciones óptimas. Si el pH es mayor, el polímero:IL-20, IL-20RA o IL-20RB no necesita ser tan grande porque están disponibles más grupos reactivos. Normalmente, el pH estará dentro del intervalo de 3 a 9, ó 3 a 6. Este procedimiento puede emplearse para preparar conjugados de receptores solubles homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos que comprenden IL-20, IL-20RA o IL-20RB.
Otro factor a considerar es el peso molecular del polímero soluble en agua. Generalmente, cuanto mayor sea el peso molecular del polímero, menor número de moléculas de polímero pueden estar unidas a la proteína. Para las reacciones de PEGización, el peso molecular típico es aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 100 kDa, aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 12 kDa a aproximadamente 25 kDa. La relación molar de polímero soluble en agua respecto a IL-20, IL-20RA o IL-20RB estará generalmente en el intervalo de 1:1 a 100:1. Normalmente, la relación molar de polímero soluble en agua respecto a IL-20, IL-20RA o IL-20RB será de 1:1 a 20:1 para la poliPEGización, y 1:1 a 5:1 para la monoPEGización.
Los procedimientos generales para producir conjugados que comprenden un polipéptido y restos de polímeros solubles en agua se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, Karasiewicz y col., patente de EE.UU. nº 5.382.657, Greenwald y col., patente de EE.UU. nº 5.738. 846, Nieforth y col., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh y col., Anal. Biochem. 247:434 (1997)). Este procedimiento puede emplearse para preparar conjugados de receptores solubles homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos que comprenden IL-20RA o IL-20RB.
La presente invención contempla composiciones que comprenden un péptido o polipéptido descrito en este documento. Tales composiciones pueden comprender adicionalmente un vehículo. El vehículo puede ser un vehículo orgánico o inorgánico convencional. Ejemplos de vehículos incluyen agua, disolución de tampón, alcohol, propilenglicol, macrogol, aceite de sésamo, aceite de maíz y similares.
7. Aislamiento de polipéptidos de IL-20, IL-20RA y IL-20RB
Los polipéptidos de la presente invención pueden purificarse hasta al menos aproximadamente el 80% de pureza, hasta al menos aproximadamente el 90% de pureza, hasta al menos aproximadamente el 95% de pureza, o superior al 95%, tal como el 96%, el 97%, el 98%, o superior al 99% de pureza con respecto a macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y liberarse de agentes infecciosos y pirógenos. Los polipéptidos de la presente invención también pueden purificarse hasta un estado farmacéuticamente puro que es superior al 99,9% de pureza. En ciertas preparaciones, el polipéptido purificado está sustancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal.
Los procedimientos de purificación fraccionada y/o convencional pueden usarse para obtener preparaciones de IL-20, IL-20RA o IL-20RB sintética o recombinante y de fusión purificada a partir de células huésped recombinantes, o la misma purificada a partir de fuentes naturales (por ejemplo, fuentes de tejido humano). En general, la precipitación con sulfato de amonio y la extracción con ácido o caotrópica puede usarse para el fraccionamiento de muestras. Las etapas de purificación a modo de ejemplo pueden incluir cromatografía en hidroxiapatito, de exclusión de tamaño, FPLC y líquida de alta resolución de fase inversa. Los medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, especialidades de sílice y similares. Son adecuados derivados de PEI, DEAE, QAE y Q. Los medios cromatográficos a modo de ejemplo incluyen los medios derivatizados con grupos fenilo, butilo u octilo tales como fenil-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), octil-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen perlas de vidrio, resinas basadas en sílice, resinas celulósicas, perlas de agarosa, perlas de agarosa reticulada, perlas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticulada y similares que son insolubles en las condiciones en que van a usarse. Estos soportes pueden modificarse con grupos reactivos que permiten la unión de proteínas mediante grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o restos de carbohidratos.
Ejemplos de químicas de acoplamiento incluyen activación con bromuro de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo, activación con hidrazida y derivados de carboxilo y amino para las químicas de acoplamiento de carbodiimida. Estos y otros medios sólidos son muy conocidos y ampliamente usados en la técnica y están disponibles de proveedores comerciales. La selección de un procedimiento particular para el aislamiento y la purificación de polipéptidos es una cuestión de diseño rutinario y se determina en parte por las propiedades del soporte elegido. Véase, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988), y Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996).
Las variaciones adicionales en el aislamiento y la purificación de los polipéptidos de la presente invención pueden ser ideadas por los expertos en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos anti-IL-20, IL-20RA y IL-20RB obtenidos como se describe más adelante pueden usarse para aislar grandes cantidades de proteína mediante purificación por inmunoafinidad.
Los polipéptidos de la presente invención también pueden aislarse mediante la explotación de propiedades particulares. Por ejemplo, puede usarse la cromatografía de adsorción de iones metálicos inmovilizados (IMAC) para purificar proteínas ricas en histidina que incluyen las que comprenden marcas de polihistidina. Brevemente, un gel se carga primero con iones de metal divalente para formar un quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). Las proteínas ricas en histidina se adsorberán a esta matriz con diferentes afinidades que dependen del ión metálico usado y se eluirán mediante elución competitiva, reducción del pH o uso de agentes quelantes fuertes. Otros procedimientos de purificación incluyen purificación de proteínas glicosiladas mediante cromatografía de afinidad por lecitina y cromatografía de intercambio iónico (M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990)). Dentro de realizaciones adicionales de la invención, puede construirse una fusión del polipéptido de interés y una marca de afinidad (por ejemplo, un dominio de inmunoglobulina de proteínas de unión a maltosa) para facilitar la purificación. Además, pueden explotarse las propiedades de unión a ligando de tanto el dominio extracelular de IL-20RA como de IL-20RB para la purificación, por ejemplo, de receptores solubles que comprenden IL-20RA; por ejemplo, usando cromatografía de afinidad en la que el ligando de IL-20 se une a una columna y el receptor que comprende IL-20RA se une y posteriormente se eluye usando procedimientos estándar de cromatografía.
Los polipéptidos de la presente invención o fragmentos de los mismos también puede prepararse mediante síntesis química como se describe anteriormente. Los polipéptidos pueden ser monómeros o multímeros; glicosilados o no glicosilados; PEGizados o no PEGizados; y pueden o pueden no incluir un residuo de aminoácido de metionina inicial.
9. Producción de anticuerpos para proteínas de IL-20, IL-20RA y IL-20RB
Los anticuerpos para los polipéptidos de la presente invención pueden obtenerse, por ejemplo, usando el producto de un vector de expresión de IL-20, IL-20RA o IL-20RB o cualquiera de estos polipéptidos aislados de una fuente natural como un antígeno. Los anticuerpos anti-IL-20 particularmente útiles "se unen específicamente" con IL-20; los anticuerpos anti-IL-20RA particularmente útiles "se unen específicamente" con IL-20RA; mientras que los anticuerpos anti-IL-20RB particularmente útiles "se unen específicamente" con IL-20RB. Se considera que los anticuerpos se unen específicamente si los anticuerpos presentan al menos una de las siguientes dos propiedades: (1) los anticuerpos se unen a su diana específica (es decir, anti-IL-20 se une a IL-20) con un nivel umbral de actividad de unión, y (2) los anticuerpos no reaccionan significativamente de forma cruzada con polipéptidos relacionados con su diana específica (es decir, anti-IL-20 no se une a IL-22).
Con respecto a la primera característica, los anticuerpos se unen específicamente si se unen a un polipéptido de la presente invención, o péptido o epítope del mismo, con una afinidad de unión (K_{a}) de 10^{6} M^{-1} o mayor, preferentemente 10^{7} M^{-1} o mayor, más preferentemente 10^{8} M^{-1} o mayor, y lo más preferentemente 10^{9} M^{-1} o mayor. La afinidad de unión de un anticuerpo puede determinarse fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660 (1949)). Con respecto a la segunda característica, los anticuerpos no reaccionan significativamente de forma cruzada con moléculas de polipéptidos relacionadas, por ejemplo, si detectan IL-20RA, pero no polipéptidos actualmente conocidos usando un análisis de transferencia estándar de Western. Ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos incluyen los receptores de citocinas conocidos.
Los anticuerpos anti-IL-20 pueden producirse usando péptidos y polipéptidos que llevan epítopes antigénicos de IL-20. Los péptidos y los polipéptidos que llevan epítopes antigénicos de la presente invención contienen una secuencia de al menos nueve, o entre 15 y aproximadamente 30 aminoácidos contenidos dentro de SEQ ID Nº: 2 ó 3 u otra secuencia de aminoácidos desvelada en este documento. Sin embargo, los péptidos o polipéptidos que comprenden una mayor parte de una secuencia de aminoácidos de la invención, que contiene de 30 a 50 aminoácidos, o cualquier longitud de hasta y que incluye toda la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención, también son útiles para inducir anticuerpos que se unen con IL-20. Los anticuerpos anti-IL-20RA pueden producirse usando péptidos y polipéptidos que llevan epítopes antigénicos de IL-20RA. Los péptidos y polipéptidos que llevan epítopes antigénicos de la presente invención contienen una secuencia de al menos nueve, o entre 15 y aproximadamente 30 aminoácidos contenidos dentro de SEQ ID Nº: 14 ó 15 u otra secuencia de aminoácidos desvelada en este documento. Sin embargo, los péptidos o polipéptidos que comprenden una mayor parte de una secuencia de aminoácidos de la invención, que contiene de 30 a 50 aminoácidos, o cualquier longitud de hasta y que incluye toda la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención, también son útiles para inducir anticuerpos que se unen con IL-20. Los anticuerpos anti-IL-20RB pueden producirse usando péptidos y polipéptidos que llevan epítopes antigénicos de IL-20RB. Los péptidos y polipéptidos que llevan epítopes antigénicos de la presente invención contienen una secuencia de al menos nueve, o entre 15 y aproximadamente 30 aminoácidos contenidos dentro de SEQ ID Nº: 21 ó 23 u otra secuencia de aminoácidos desvelada en este documento. Sin embargo, los péptidos o polipéptidos que comprenden una mayor parte de una secuencia de aminoácidos de la invención, que contiene de 30 a 50 aminoácidos, o cualquier longitud de hasta y que incluye toda la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención, también son útiles para inducir anticuerpos que se unen con IL-20RB. Se desea que la secuencia de aminoácidos del péptido que lleva epítopes se seleccione para proporcionar solubilidad sustancial en disolventes acuosos (es decir, la secuencia incluye residuos relativamente hidrófilos, mientras que normalmente se evitan residuos hidrófobos). Además, las secuencias de aminoácidos que contienen residuos de prolina también pueden ser deseables para la producción de anticuerpos.
Como ilustración, los posibles sitios antigénicos en IL-20, IL-20RA y IL-20RB se identificaron usando el procedimiento de Jameson-Wolf, Jameson y Wolf, CABIOS 4:181, (1988), como se implementa por el programa PROTEAN (versión 3.14) de LASERGENE (DNASTAR; Madison, WI). En este análisis se usaron los parámetros por defecto.
El procedimiento de Jameson-Wolf predice posibles determinantes antigénicos combinando seis subrutinas principales para la predicción estructural de proteínas. Brevemente, el procedimiento de HoppWoods, Hopp y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:3824 (1981), se usó primero para identificar secuencias de aminoácidos que representaban áreas de mayor hidrofilia local (parámetro: siete residuos en promedio). En la segunda etapa se usó el procedimiento de Emini, Emini y col., J. Virology 55:836 (1985), para calcular las probabilidades de superficie (parámetro: umbral de decisión de superficie (0,6) = 1). Tercero, se usó el procedimiento de Karplus-Schultz, Karplus y Schultz, Naturwissenschaften 72:212 (1985), para predecir la flexibilidad de la cadena esqueleto (parámetro: umbral de flexibilidad (0,2) = 1). En las etapas cuarta y quinta del análisis se aplicaron predicciones de estructura secundaria a los datos usando los procedimientos de Chou-Fasman, Chou, "Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition" en Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (ed.), páginas 549-586 (Plenum Press 1990), y Garnier-Robson, Garnier y col., J. Mol. Biol. 120:97 (1978) (parámetros de Chou-Fasman: tabla de conformación = 64 proteínas; umbral de región \alpha = 103; umbral de región \beta = 105; parámetros de Garnier-Robson: constantes de decisión \alpha y \beta = 0). En la sexta subrutina se combinaron los parámetros de flexibilidad y los factores de hidropatía/accesibilidad del disolvente para determinar un valor de contorno superficial designado como el "índice antigénico". Finalmente, al índice antigénico se le aplicó una función de amplificación de picos que amplifica los picos superficiales principales añadiendo el 20, 40, 60 u 80% del valor de pico respectivo para representar energía libre adicional derivada de la movilidad de las regiones superficiales respecto a las regiones interiores. Sin embargo, este cálculo no se aplicó a ningún pico principal que residiera en una región helicoidal ya que las regiones helicoidales tienden a ser menos flexibles.
Los resultados de este análisis indicaron que las siguientes secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2 proporcionarían péptidos antigénicos adecuados: los perfiles de hidrofilia de Hopp/Woods pueden usarse para determinar regiones que tienen el mayor potencial antigénico dentro de SEQ ID Nº: 2 (Hopp y col., Proc. Natl. Acad. Sci, 78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986 y Triquier y col., Protein Engineering 11:153-169, 1998). El perfil se basa en una ventana deslizante de seis residuos. Se ignoraron los residuos G, S y T enterrados y los residuos H, Y, y W expuestos. Además, los epítopes antigénicos de IL-20 dentro de SEQ ID Nº: 2 como se predijeron por una representación de Jameson-Wolf, por ejemplo usando el programa DNASTAR Protean (DNASTAR, Inc., Madison, WI), sirven de epítopes antigénicos preferidos y pueden ser determinados por un experto en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos neutralizadores para IL-20 incluyen anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales neutralizadores que pueden unirse a epítopes antigénicos de IL-20. Por consiguiente, los péptidos y polipéptidos que llevan epítopes antigénicos de IL-20 son útiles para producir anticuerpos que se unen con los polipéptidos de IL-20 descritos en este documento, además de para identificar y cribar anticuerpos monoclonales anti-IL-20 que son neutralizantes, y que pueden antagonizar, reducir, inhibir o bloquear la actividad de IL-20. Tales anticuerpos monoclonales neutralizadores de la presente invención pueden unirse a un epítope antigénico de IL-20. Tales epítopes dentro de SEQ ID Nº: 8 como se predijeron por una representación de Jameson-Wolf, por ejemplo usando el programa DNASTAR Protean (DNASTAR, Inc., Madison, WI), sirven de epítopes antigénicos preferidos y pueden ser determinados por un experto en la materia. Tales epítopes antigénicos incluyen: residuos de aminoácidos 42 (De) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 8; residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 60 (Ile) de SEQ ID Nº: 8; residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 69 (Glu) de SEQ ID Nº: 8; residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 81 (Cys) de SEQ ID Nº: 8; residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 96 (Lys) de SEQ ID Nº: 8; residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 8; residuos de aminoácidos 60 (Ile) a 69 (Glu) de SEQ ID Nº: 8; residuos de aminoácidos 60 (Ile) a 81 (Cys) de SEQ ID Nº: 8; residuos de aminoácidos 60 (De) a 96 (Lys) de SEQ ID Nº: 8; residuos de aminoácidos 60 (Ile) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 8; residuos de aminoácidos 69 (Glu) a 81 (Cys) de SEQ ID Nº: 8; residuos de aminoácidos 69 (Glu) a 96 (Lys) de SEQ ID Nº: 8; residuos de aminoácidos 69 (Glu) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 8; residuos de aminoácidos 81 (Cys) a 96 (Lys) de SEQ ID Nº: 8; residuos de aminoácidos 81 (Cys) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 8; y residuos de aminoácidos 96 (Lys) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 8.
Los resultados de este análisis indicaron que las siguientes secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nº: 14 proporcionarían péptidos antigénicos adecuados: residuos de aminoácidos 1 (Met) a 9 (Leu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 36 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 41 (Ala) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 58 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 63 (Gln) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 80 (Lys) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 94 (Tyr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 104 (Tyr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 120 (Cys) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 128 (Arg) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 161 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 187 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 224(Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 316 (Tle) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 323 (Ile) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 335 (Asp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 371 (Cys) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 384 (Gln) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 412 (Ala) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 462 (Gln) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 483 (Asp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 496 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 523 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 63(Gln) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 94 (Tyr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 128 (Arg) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 63 (Gln) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 94 (Tyr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 128 (Arg) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos. 58 (Pro) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 94 (Tyr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 128 (Arg) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 128 (Arg) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 412 (Ala) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 412 (Ala) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 412 (Ala) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 412 (Ala) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 412 (Ala) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 462 (Gln) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 462 (Gln) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 462 (Gln) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 462 (Gln) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 483 (Asp) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 483 (Asp) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 483 (Asp) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 496 (Ser) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 496 (Ser) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 523 (Glu) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14.
Los resultados de este análisis indicaron que las siguientes secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nº: 14 proporcionarían péptidos antigénicos adecuados: los epítopes antigénicos de L-20RB dentro de SEQ ID Nº: 21 incluyen: residuos de aminoácidos 70 (Tyr) a 74 (Tyr) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 70 (Tyr) a 101 (Asp) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 70 (Tyr) a 135 (Ser) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 70 (Tyr) a 178 (Glu) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 70 (Tyr) a 283 (Lys) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 92 (Thr) a 101 (Asp) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 92 (Thr) a 135 (Ser) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 92 (Thr) a 178 (Glu) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 92 (Thr) a 283 (Lys) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 130 (Pro) a 135 (Ser) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 130 (Pro) a 178 (Glu) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 130 (Pro) a 283 (Lys) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 171 (Arg) a 178 (Glu) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 171 (Arg) a 283 (Lys) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 279 (Asn) a 283 (Lys) de SEQ ID Nº: 21. Además, los antígenos adecuados también incluyen los polipéptidos de IL-20RA o IL-20RB que comprenden un dominio de unión a citocinas IL-20RA o IL-20RB o extracelular desvelado anteriormente en combinación con otro dominio extracelular de citocinas de clase I o II, tal como los que forman los polipéptidos solubles heterodiméricos o multiméricos de IL-20RA y/o IL-20RB.
Los anticuerpos policlonales respecto a los polipéptidos recombinantes de la presente invención o respecto a los mismos polipéptidos aislados de fuentes naturales pueden prepararse usando procedimientos muy conocidos para los expertos en la materia. Véanse, por ejemplo, Green y col., "Production of Polyclonal Antisera" en Immunochemical Protocols (Manson, ed.), páginas 1-5 (Humana Press 1992) y Williams y col., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies" en DNA Cloning 2: Expression systems, 2^{a} edición, Glover y col., (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995). La inmunogenicidad de un polipéptido de la presente invención puede aumentarse mediante el uso de un adyuvante, tal como alumbre (hidróxido de aluminio) o adyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para inmunización también incluyen polipéptidos de fusión tales como fusiones de IL-20RA o IL-20RB o una parte de la misma con un polipéptido de inmunoglobulina o con proteína de unión a maltosa. El inmunógeno del polipéptido puede ser una molécula de longitud completa o una parte de la misma. Si la parte de polipéptido es "similar a hapteno", tal parte puede unirse o ligarse ventajosamente a un soporte macromolecular (tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA) o toxoide del tétanos) para la inmunización.
Aunque los anticuerpos policlonales se producen normalmente en animales tales como caballos, vacas, perros, pollos, ratas, ratones, conejos, cobayas, cabras u ovejas, un anticuerpo de la presente invención también puede derivarse de un anticuerpo de primate subhumano. Las técnicas generales para producir anticuerpos diagnóstica y terapéuticamente útiles en babuinos pueden encontrarse, por ejemplo, en Goldenberg y col., publicación de patente internacional nº WO 91/11465, y en Losman y col., Int. J. Cancer 46:310 (1990).
Alternativamente, pueden generarse anticuerpos monoclonales anti-IL-20, IL-20RA o IL-20RB. Los anticuerpos monoclonales de roedores para antígenos específicos pueden obtenerse mediante procedimientos conocidos para los expertos en la materia (véanse, por ejemplo, Kohler y col., Nature 256:495 (1975), Coligan y col., (eds.), Current Protocols in Immunology, vol. 1, páginas 2,5,1-2,6,7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"], Picksley y col., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli" en DNA Cloning 2: Expression systems, 2^{a} edición, Glover y col., (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)).
Brevemente, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse inyectando ratones con una composición que comprende un producto génico de IL-20, IL-20RA o IL-20RB, verificando la presencia de la producción de anticuerpos sacando una muestra de suero, extirpando el bazo para obtener linfocitos B, fusionando los linfocitos B con células de mieloma para producir hibridomas, clonando los hibridomas, seleccionando clones positivos que producen anticuerpos para el antígeno, cultivando los clones que producen anticuerpos para el antígeno y aislando los anticuerpos de los cultivos de hibridoma.
Además, un anticuerpo anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB de la presente invención puede derivarse de un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos monoclonales humanos se obtienen a partir de ratones transgénicos que han sido manipulados para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a exposición antigénica. En esta técnica, los elementos del locus de cadena pesada y ligera humana se introducen en cepas de ratones derivados de líneas de células madre embriónicas que contienen perturbaciones elegidas como diana de los loci de la cadena pesada y la cadena ligera endógena. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, y los ratones pueden usarse para producir hibridomas que secretan anticuerpos humanos. Los procedimientos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos se describen, por ejemplo, por Green y col., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg y col., Nature 368:856 (1994), y Taylor y col., Int. Immun. 6:579 (1994).
Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse a partir de cultivos de hibridoma mediante una variedad de técnicas muy establecidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con proteína A-Sepharose, cromatografía de exclusión de tamaño y cromatografía de intercambio iónico (véase, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y páginas 2.9.1-2.9.3; Baines y col., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)" en Methods in Molecular Biology, vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)).
Para usos particulares puede desearse preparar fragmentos de cualquiera de los anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB. Tales fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse, por ejemplo, mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse mediante digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos mediante procedimientos convencionales. Como ilustración, los fragmentos de anticuerpos pueden producirse mediante escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S llamado F(ab')_{2}. Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Opcionalmente, la reacción de escisión puede realizarse usando un grupo bloqueante para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escisión de enlaces disulfuro. Como alternativa, una escisión enzimática usando pepsina produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos procedimientos se describen, por ejemplo, por Goldenberg, patente de EE.UU. nº 4.331.647, Nisonoff y col., Arch Biochemi. Biophys. 89:230 (1960), Porter, Biochem. J. 73:119 (1959), Edelman y col., en Methods in Enzymology vol. 1, página 422 (Academic Press 1967), y por Coligan en las páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10.-2.10.4.
También pueden usarse otros procedimientos de escisión de anticuerpos, tales como separación de cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadena ligera-pesada, escisión adicional de fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, mientras que los fragmentos se unen con el antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.
Por ejemplo, los fragmentos Fv comprenden una asociación de cadenas V_{H} y V_{L}. Esta asociación puede ser no covalente, como se describe por Inbar y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659 (1972). Alternativamente, las cadenas variables pueden unirse mediante un enlace disulfuro intermolecular o reticularse mediante productos químicos tales como glutaraldehído (véase, por ejemplo, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)).
Los fragmentos Fv puede comprender cadenas V_{H} y V_{L} que están conectadas por un conector de péptidos. Estas proteínas de unión a antígenos monocatenarios (scFv) se preparan construyendo un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican los dominios V_{H} y V_{L} que están conectados por un oligonucleótido. El gen estructural se introduce en un vector de expresión que posteriormente se introduce en una célula huésped, tal como E. coli. Las células huésped recombinantes sintetizan una única cadena de polipéptido uniendo mediante un puente un péptido conector los dos dominios V. Los procedimientos para producir scFvs se describen, por ejemplo, por Whitlow y col., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991) (véase también, Bird y col., Science 242:423 (1988), Ladner y col., patente de EE.UU. nº 4.946.778, Pack y col., Bio/Technology 11:1271 (1993), y Sandhu, anteriormente).
Como ilustración, un scFV puede obtenerse exponiendo linfocitos a un polipéptido de la presente invención in vitro y seleccionando bibliotecas de expresión de anticuerpos en fago o vectores similares (por ejemplo, mediante el uso de proteína o péptido de IL-20, IL-20RA o IL-20RB inmovilizado o marcado). Los genes que codifican polipéptidos que tienen posibles dominios de unión a polipéptidos de IL-20, IL-20RA o IL-20RB pueden obtenerse cribando bibliotecas de péptidos aleatorios expresadas en fago (expresión en fago) o en bacterias, tales como E. coli. Las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos pueden obtenerse de varias formas, tales como mediante mutagénesis aleatoria y síntesis de polinucleótidos aleatorios. Estas bibliotecas de expresión de péptidos aleatorios pueden usarse para cribar péptidos que interactúan con una diana conocida que puede ser una proteína o polipéptido, tal como un ligando o receptor, una macromolécula biológica o sintética o sustancias orgánicas o inorgánicas. Las técnicas para crear y cribar tales bibliotecas aleatorias de expresión de péptidos se conocen en la técnica (Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.223.409, Ladner y col., patente de EE.UU. nº 4.946.778, Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.403.484, Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.571.698, y Kay y col., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)) y bibliotecas de expresión de péptidos aleatorios para cribar tales bibliotecas están disponibles comercialmente, por ejemplo, de CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Las bibliotecas de expresión de péptidos aleatorios pueden cribarse usando las secuencias de IL-20, IL-20RA y IL-20RB desveladas en este documento para identificar proteínas que se unen con IL-20.
Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica una única región determinante de la complementariedad (CDR). Los péptidos de CDR ("unidades de reconocimiento mínimo") pueden obtenerse construyendo genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes se preparan, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable de ARN de células productoras de anticuerpos (véanse; por ejemplo, Larrick y col., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106 (1991), Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies" en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter y col., (eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995), y Ward y col., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch y col., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).
Alternativamente, un anticuerpo anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB puede derivarse de un anticuerpo monoclonal "humanizado". Los anticuerpos monoclonales humanizados se producen transfiriendo regiones determinantes complementarias de ratón de cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobulina de ratón a un dominio variable humano. Entonces, los residuos típicos de anticuerpos humanos están sustituidos en las regiones estructurales de los equivalentes murinos. El uso de componentes de anticuerpos derivados de anticuerpos monoclonales humanizados obvia los posibles problemas asociados a la inmunogenicidad de regiones constantes murinas. Las técnicas generales para clonar dominios variables de inmunoglobulina murina se describen, por ejemplo, por Orlandi y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833 (1989). Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados se describen, por ejemplo, por Jones y col., Nature 321:522 (1986), Carter y col., Pro. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992), Singer y col., J. Immun. 150:2844 (1993), Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies" en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland y col., (eds.), páginas 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), y por Queen y col., patente de EE.UU. nº 5.693.762 (1997).
Los anticuerpos anti-idiotipo policlonales pueden prepararse inmunizando animales con anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB o fragmentos de anticuerpos usando técnicas estándar. Véase, por ejemplo, Green y col., "Production of Polyclonal Antisera" en Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), páginas 1-12 (Humana Press 1992). Véase también Coligan en las páginas 2.4.1-2.4.7. Alternativamente, los anticuerpos anti-idiotipo monoclonales pueden prepararse usando anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB o fragmentos de anticuerpos como inmunógenos con las técnicas descritas anteriormente. Como otra alternativa, los anticuerpos anti-idiotipo humanizados o anticuerpos anti-idiotipo de primate subhumano pueden prepararse usando las técnicas anteriormente descritas. Los procedimientos para producir anticuerpos anti-idiotipo se describen, por ejemplo, por Irie, patente de EE.UU. nº 5.208.146, Greene y col., patente de EE.UU. nº 5.637.677 y Varthakavi y Minocha, J. Gen. Virol. 77:1875 (1996).
Un anticuerpo anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB puede conjugarse con una marca detectable para formar un inmunoconjugado anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB. Las marcas detectables adecuadas incluyen, por ejemplo, un radioisótopo, una marca fluorescente, una marca quimioluminiscente, una marca enzimática, una marca bioluminiscente u oro coloidal. Los procedimientos de marcado y detección de tales inmunoconjugados detectablemente marcados son muy conocidos para los expertos en la materia y se describen más abajo en más detalle.
La marca detectable puede ser un radioisótopo que se detecta por autorradiografía. Los isótopos que son particularmente útiles con el fin de la presente invención son ^{3}H, ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S y ^{14}C.
Los inmunoconjugados anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB también pueden marcarse con un compuesto fluorescente. La presencia de un anticuerpo fluorescentemente marcado se determina exponiendo el inmunoconjugado a luz de longitud de onda apropiada y detectando la fluorescencia resultante. Los compuestos de marcado fluorescente incluyen isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.
Alternativamente, los inmunoconjugados anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB pueden marcarse detectablemente acoplando un componente de anticuerpo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del inmunoconjugado con marca quimioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia que se produce durante el transcurso de una reacción química. Ejemplos de compuestos de marcado quimioluminiscente incluyen luminol, isoluminol, un éster de acridinio aromático, un imidazol, una sal de acridinio y un éster de oxalato.
Similarmente, un compuesto bioluminiscente puede usarse para marcar inmunoconjugados anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes que son útiles para el marcado incluyen luciferina, luciferasa y aequorina.
Alternativamente, los inmunoconjugados anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB pueden marcarse detectablemente uniendo un componente de anticuerpo anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB a una enzima. Cuando el conjugado anticuerpo-enzima se incuba en presencia del sustrato apropiado, el resto de la enzima reacciona con el sustrato para producir un resto químico que puede detectarse, por ejemplo, mediante medios espectrofotométricos, fluorimétricos o visuales. Ejemplos de enzimas que pueden usarse para marcar detectablemente inmunoconjugados poliespecíficos incluyen \beta-galactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa y fosfatasa alcalina.
Los expertos en la materia sabrán de otras marcas adecuadas que pueden emplearse según la presente invención. La unión de restos de marcadores a anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB puede llevarse a cabo usando técnicas estándar conocidas en la técnica. La metodología típica a este respecto se describe por Kennedy y col., Clin. Chim. Acta 70:1 (1976), Schurs y col., Clin. Chim. Acta 81:1 (1977), Shih y col., Int'l J. Cancer 46:1101 (1990), Stein y col., Cancer Res. 50:1330 (1990) y Coligan, anteriormente.
Además, la comodidad y versatilidad de la detección inmunoquímica puede potenciarse usando anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB que han sido conjugados con avidina, estreptavidina y biotina (véase, por ejemplo, Wilchek y col., (eds.), "Avidin-Biotin Technologie", Methods In Enzymology, vol. 184 (Academic Press 1990), y Bayer y col., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology" en Methods In Molecular Biology, vol. 10, Manson (ed.), páginas 149-162 (The Humana Press, Inc. 1992).
Los procedimientos para realizar inmunoensayos están muy establecidos. Véanse, por ejemplo, Cook y Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays" en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter y Ladyman (eds.), páginas 180-208, (Cambridge University Press, 1995), Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology" en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch y Lennox (eds.), páginas 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995) y Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996).
La presente invención también contempla kits para realizar un ensayo de diagnóstico inmunológico para la expresión génica de IL-20, IL-20RA o IL-20RB. Tales kits comprenden al menos un recipiente que comprende un anticuerpo anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB, o fragmento de anticuerpo. Un kit también puede comprender un segundo recipiente que comprende uno o más reactivos que pueden indicar la presencia de anticuerpo de IL-20, IL-20RA o IL-20RB o fragmentos de anticuerpos. Ejemplos de tales reactivos indicadores incluyen marcas detectables tales como una marca radiactiva, una marca fluorescente, una marca quimioluminiscente, una marca enzimática, una marca bioluminiscente, oro coloidal y similares. Un kit también puede comprender un medio para transportar hasta el usuario esos anticuerpos de IL-20, IL-20RA o IL-20RB o fragmentos de anticuerpos usados para detectar la proteína correspondiente. Por ejemplo, las instrucciones por escrito pueden exponer que el anticuerpo encerrado o fragmento de anticuerpo puede usarse para detectar IL-20, IL-20RA o IL-20RB. El material por escrito puede aplicarse directamente a un recipiente, o el material por escrito puede proporcionarse en forma de un prospecto.
8. Uso de anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB para antagonizar la unión de IL-20RA y IL-20RB a IL-20
Las técnicas alternativas para generar o seleccionar anticuerpos útiles en este documento incluyen la exposición in vitro de linfocitos a polipéptidos de receptores solubles de IL-20RA o IL-20RB o fragmentos de los mismos tales como epítopes antigénicos, y la selección de bibliotecas de exposición de anticuerpos en fago o vectores similares (por ejemplo, mediante el uso de polipéptidos de receptores solubles inmovilizados o marcados de IL-20RA o IL-20RB o fragmentos de los mismos tales como epítopes antigénicos). Los genes que codifican polipéptidos que tienen posibles dominios de unión, tales como polipéptidos de receptores solubles de IL-20RA o IL-20RB o fragmentos de los mismos tales como epítopes antigénicos, pueden obtenerse cribando bibliotecas de péptidos aleatorios en fago (expresión en fago) o en bacterias tales como E. coli. Las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos pueden obtenerse de varias formas tales como mediante mutagénesis aleatoria y síntesis de polinucleótidos aleatorios. Estas bibliotecas de expresión de péptidos aleatorios pueden usarse para cribar péptidos que interactúan con una diana conocida que puede ser una proteína o polipéptido tal como un ligando o receptor, una macromolécula biológica o sintética, o sustancias orgánicas o inorgánicas. Las técnicas para crear y cribar tales bibliotecas aleatorias de expresión de péptidos se conocen en la técnica (Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.223.409; Ladner y col., patente de EE.UU. nº 4.946.778; Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.403.484 y Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.571.698) y las bibliotecas de expresión de péptidos aleatorios y los kits para cribar tales bibliotecas están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Las bibliotecas de expresión de péptidos aleatorios pueden cribarse usando los polipéptidos de receptores solubles de IL-20RA y/o IL-20RB o fragmentos de los mismos tales como secuencias de polipéptidos de epítopes antigénicos desveladas en este documento para identificar proteínas que se unen a polipéptidos de receptores que comprenden IL-20RA o IL-20RB. Estos "polipéptidos de unión" que interactúan con polipéptidos de receptores solubles que comprenden IL-20RA y/o IL-20RB pueden usarse para marcar células; para aislar polipéptidos homólogos mediante purificación por afinidad; pueden conjugarse directamente o indirectamente a fármacos, toxinas, radionúclidos y similares. Estos polipéptidos de unión también pueden usarse en procedimientos analíticos tales como para cribar bibliotecas de expresión y neutralizar actividad, por ejemplo para bloquear la interacción entre el ligando y el receptor de IL-20, o unión viral a un receptor. Los polipéptidos de unión también pueden usarse para ensayos de diagnóstico para determinar niveles en circulación de polipéptidos de receptores solubles que comprenden IL-20RA y/o IL-20RB; para detectar o cuantificar receptores solubles o no solubles que comprenden IL-20RA como marcador de la patología o enfermedad subyacente. Estos polipéptidos de unión también pueden actuar de "antagonistas" para bloquear la unión de polipéptidos de receptores monoméricos de IL-20RA o IL-20RB solubles o unidos a membrana u homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos de IL-20RA/IL-20RB (por ejemplo, al ligando) y la transducción de señales in vitro y in vivo. De nuevo, estos polipéptidos de unión sirven de polipéptidos de receptores monoméricos anti-IL-20RA o anti-IL-20RB u homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos anti-IL-20RA y/o anti-IL-20RB y son útiles para inhibir la actividad de IL-20, además de la actividad de receptores o unión a proteínas. Los anticuerpos producidos contra los complejos de receptor natural de la presente invención, y anticuerpos de unión a epítopes de IL-20, IL-20RA y IL-20RB, y anticuerpos monoclonales neutralizadores de anti-IL-20, IL-20RA o IL-20RB, pueden ser realizaciones preferidas ya que pueden actuar más específicamente y pueden inhibir IL-20. Además, la actividad antagonista y de unión de los anticuerpos de la presente invención puede ensayarse en un ensayo de proliferación de IL-20, de trampa de señales, de luciferasa o de unión en presencia de receptores solubles que comprenden IL-20 y IL-20RA y/o IL-20RB, y otros ensayos biológicos o bioquímicos descritos en este
documento.
Los anticuerpos para polipéptidos de receptores solubles de IL-20RA, IL-20RB y IL-20RB/IL-20RB o fragmentos de los mismos tales como epítopes antigénicos pueden usarse para inhibir los efectos inflamatorios de IL-20 in vivo, para uso terapéutico contra psoriasis, endotoxemia, artritis, asma, EII, colitis, artritis psoriásica, artritis reumatoide u otras afecciones inflamatorias inducidas por IL-20; marcado de células que expresan receptores de IL-20RA, IL-20RB y IL-20RB/IL-20RB; para aislar polipéptidos de receptores solubles que comprenden IL-20RA y/o IL-20RB mediante purificación por afinidad; para ensayos de diagnóstico para determinar niveles en circulación de polipéptidos de receptores solubles que comprenden IL-20RA y/o IL-20RB; para detectar o cuantificar receptores solubles que comprenden IL-20RA y/o IL-20RB como marcador de la patología o enfermedad subyacente; en procedimientos analíticos que emplean FACS; para cribar bibliotecas de expresión; para generar anticuerpos anti-idiotípicos que pueden actuar de agonistas de IL-20; y como anticuerpos neutralizadores o como antagonistas para bloquear la función de receptores de IL-20RA y/o IL-20RB, o para bloquear la actividad de IL-20 in vitro y in vivo. Las marcas directas adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, biotina, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares; las marcas indirectas pueden usar biotina-avidina u otros pares complemento/anti-complemento como productos intermedios. Los anticuerpos en este documento también pueden conjugarse directamente o indirectamente a fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, y usarse estos conjugados para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas in vivo. Además, los anticuerpos para polipéptidos de receptores solubles que comprenden IL-20RA y/o IL-20RB, o fragmentos de los mismos, puede usarse in vitro para detectar polipéptidos de receptores que comprenden IL-20RA y/o IL-20RB desnaturalizados o no desnaturalizados o fragmentos de los mismos en ensayos, por ejemplo, ensayos de transferencia de Western u otros ensayos conocidos en la
técnica.
Los anticuerpos para polipéptidos de receptores solubles de IL-20RA y/o IL-20RB o de receptores solubles homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos de IL-20RA o IL-20RB son útiles para marcar células que expresan los receptores correspondientes y ensayar sus niveles de expresión, para purificación por afinidad, en ensayos de diagnóstico para determinar niveles en circulación de polipéptidos de receptores, procedimientos analíticos que emplean clasificación de células activada por fluorescencia. Además, los anticuerpos divalentes y los anticuerpos anti-idiotípicos pueden usarse como agonistas para imitar el efecto de IL-20.
Los anticuerpos en este documento también pueden conjugarse directamente o indirectamente a fármacos, toxinas, radionúclidos y similares y usarse estos conjugados para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos o polipéptidos de unión que reconocen polipéptidos de receptores solubles de IL-20RA y/o IL-20RB o de receptores solubles homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos de IL-20RA o IL-20RB pueden usarse para identificar o tratar tejidos u órganos que expresan una molécula anti-complementaria correspondiente (por ejemplo, un receptor soluble unido a membrana o que comprende IL-20RA). Más específicamente, los anticuerpos para polipéptidos de receptores solubles que comprenden IL-20RA y/o IL-20RB, o fragmentos bioactivos o partes de los mismos, pueden acoplarse a moléculas detectables o citotóxicas y administrarse a un mamífero que tiene células, tejidos u órganos que expresan el receptor que comprende IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB tal como cánceres que expresan IL-20RA y/o IL-20RB.
Las moléculas detectables adecuadas pueden unirse directamente o indirectamente a polipéptidos que se unen a polipéptidos de receptores que comprenden IL-20RA y/o IL-20RB tales como "polipéptidos de unión" (incluyendo los péptidos de unión desvelados anteriormente), anticuerpos, o fragmentos bioactivos o partes de los mismos. Las moléculas detectables adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las moléculas citotóxicas adecuadas pueden unirse directamente o indirectamente al polipéptido o anticuerpo, e incluyen toxinas bacterianas o vegetales (por ejemplo, toxina de la difteria, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina y similares), además de radionúclidos terapéuticos tales como yodo-131, renio-188 o itrio-90 (tanto unidos directamente al polipéptido o anticuerpo como unidos indirectamente, por ejemplo, por medio de un resto quelante). Los polipéptidos o anticuerpos de unión también pueden conjugarse a fármacos citotóxicos tales como adriamicina. Para la unión indirecta de una molécula detectable o citotóxica, la molécula detectable o citotóxica puede conjugarse con un miembro de un par complementario/anti-complementario en el que el otro miembro está unido a la parte del polipéptido o anticuerpo de unión. Para estos fines, la biotina/estreptavidina es un par complementario/anti-complementario a modo de ejemplo.
En otra realización, las proteínas de fusión de polipéptido de unión-toxina o las proteínas de fusión de anticuerpo-toxina pueden usarse para la inhibición o ablación de células o tejidos elegidos como diana (por ejemplo, para tratar células o tejidos cancerosos). Alternativamente, si el polipéptido de unión tiene múltiples dominios funcionales (es decir, un dominio de activación o un dominio de unión a ligando, más un dominio de elección de diana), una proteína de fusión que sólo incluye el dominio de elección de diana puede ser adecuada para dirigir una molécula detectable, una molécula citotóxica o una molécula complementaria a un tipo de célula o tejido de interés. En los casos en los que la proteína de fusión que sólo incluye un único dominio incluya una molécula complementaria, la molécula anti-complementaria puede conjugarse a una molécula detectable o citotóxica. Por tanto, tales proteínas de fusión de dominio-molécula complementaria representan un vehículo de elección de diana genérico para la administración específica para célula/tejido de conjugados de molécula detectable anti-complementaria genérica/citotóxica.
En otra realización, las proteínas de fusión de polipéptido de unión a IL-20, IL-20RA o IL-20RB-citocina o anticuerpo-citocina pueden usarse para potenciar la destrucción in vivo de tejidos diana (por ejemplo, cánceres de bazo, pancreático, de la sangre, linfoide, de colon y de médula ósea) si el polipéptido de unión-citocina o el anticuerpo de receptores anti-IL-20, IL-20RA o IL-20RB elige como diana la célula hiperproliferativa (véase, generalmente, Hornick y col., Blood 89:4437-47, 1997). Las proteínas de fusión descritas permiten elegir como diana una citocina para un sitio acción de deseado, proporcionando así una concentración local elevada de citocina. Los anticuerpos de monómeros, homodímeros, heterodímeros o multímeros anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB adecuados eligen como diana una célula o tejido no deseable (es decir, un tumor o una leucemia), y la citocina fusionada media en la mejora de la lisis de células diana por las células efectoras. Las citocinas adecuadas para este fin incluyen, por ejemplo, interleucina 2 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF).
Alternativamente, las proteínas de fusión de polipéptidos o anticuerpos de unión a receptores de IL-20, IL-20RA o IL-20RB descritas en este documento pueden usarse para potenciar la destrucción in vivo de tejidos diana mediante la estimulación directa de una ruta apoptótica modulada por receptores de IL-20, IL-20RA o IL-20RB dando como resultado la muerte celular de células hiperproliferativas que expresan receptores de IL-20.
9. Usos terapéuticos de polipéptidos que tienen actividad de IL-20, IL-20RA o IL-20RB o anticuerpos para los mismos
Las secuencias de aminoácidos que tienen actividad soluble de IL-20RA y/o IL-20RB pueden usarse para modular el sistema inmunitario uniendo IL-20, y por tanto, previniendo la unión de IL-20 con IL-20RA/IL-20RB endógeno. Los antagonistas de IL-20, tales como anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA y anti-IL-20RB, también pueden usarse para modular el sistema inmunitario inhibiendo la unión de IL-20 con el receptor endógeno. Por consiguiente, la presente invención incluye el uso de proteínas, polipéptidos y péptidos que tienen actividad anti-IL-20 (tal como polipéptidos solubles de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB, fragmentos de polipéptidos, análogos y proteínas de fusión) para un sujeto que carece de una cantidad adecuada de este polipéptido, o que produce un exceso de IL-20. Los antagonistas de IL-20RA y IL-20RB (por ejemplo, anticuerpos anti-IL-20RA y IL-20RB) también pueden usarse para tratar un sujeto que produce un exceso de tanto IL-20 como IL-20RA y/o IL-20RB. Los sujetos adecuados incluyen mamíferos tales como seres humanos. Tales polipéptidos y anticuerpos son útiles en la antagonización de IL-20, en el tratamiento de psoriasis, artritis psoriásica, artritis, endotoxemia, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), colitis y otras afecciones inflamatorias desveladas en este documento.
Dos líneas de evidencia indican que una función de IL-20 y su receptor participan en la psoriasis. Esta enfermedad de la piel multigénica se caracteriza por un aumento de la proliferación de queratinocitos, alteración de la diferenciación de queratinocitos e infiltración de células inmunitarias en la piel. La primera línea de evidencia para una función de IL-20 en la psoriasis es que la hiperqueratosis observada y la epidermis engrosada en los ratones transgénicos se parece a la de anomalías psoriásicas. La disminución de los números de tonofilamentos, que se cree que está relacionada con la queratinización defectuosa, es una característica sorprendente de la psoriasis humana. Se han encontrado inclusiones intramitocondriales en afecciones de piel hiperplásica tanto químicamente inducida como naturalmente producida en ratones. La causa de las inclusiones y sus efectos en la función mitocondrial, si tiene alguno, son desconocidos. Los inventores concluyen con que los ratones transgénicos para IL-20 presentan muchas de las características observadas en la psoriasis humana.
Una segunda línea de evidencia que implica al receptor de IL-20 en la psoriasis es que tanto el ARNm de IL-20RA como de IL-20RB están marcadamente regulados por incremento en piel psoriásica humana en comparación con piel normal. Ambas subunidades de receptores de IL-20 se expresan en queratinocitos por toda la epidermis y también se expresan en un subconjunto de células inmunitarias y endoteliales. Los inventores proponen que un aumento de la expresión de un receptor de IL-20 activado puede alterar las interacciones entre células endoteliales, células inmunitarias y queratinocitos, conduciendo a una desregulación de la proliferación y diferenciación de queratinocitos.
Además, la IL-20 estimula la transducción de señales en la línea celular de queratinocitos humanos HaCaT, confirmando una acción directa de este ligando novedoso en la piel. Además, la IL-1\beta, el EGF y el TNF-\alpha, proteínas conocidas por ser activas en queratinocitos y por estar relacionadas con señales proliferativas y proinflamatorias en la piel, potencian la respuesta a IL-20. En las células tanto HaCaT como BHK que expresan el receptor de IL-20, la IL-20 señaliza mediante STAT3.
Como se indica en la discusión anterior y los ejemplos de más adelante, la IL-20 participa en la patología de la psoriasis. La presente invención es en particular un procedimiento para tratar psoriasis administrando antagonistas para IL-20. Los antagonistas para IL-20 pueden ser tanto un receptor soluble que se une a IL-20, tal como IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB soluble, o anticuerpos, anticuerpos monocatenarios o fragmentos de anticuerpos que se unen tanto a IL-20 como a una subunidad tal como IL-20RA o IL-20RB o el receptor de IL-20 como un todo. Por tanto, los antagonistas prevendrán la activación del receptor de IL-20.
La psoriasis es una de las enfermedades dermatológicas más comunes que afecta a hasta del 1 al 2 por ciento de la población mundial. Es un trastorno de la piel inflamatorio crónico caracterizado por pápulas eritematosas bien delimitadas y placas redondeadas cubiertas por escama micácea plateada. Las lesiones de la piel de psoriasis son variablemente pruriginosas. Las áreas traumatizadas desarrollan frecuentemente lesiones de psoriasis. Adicionalmente, otros factores externos pueden exacerbar la psoriasis incluyendo infecciones, estrés y medicaciones, por ejemplo, litio, beta-bloqueantes y antipalúdicos.
La variedad más común de la psoriasis se llama de tipo en placas. Los pacientes con psoriasis de tipo en placas tendrán placas estables que crecen lentamente que permanecen básicamente invariables durante largos periodos de tiempo. Las áreas más comunes para que se produzca la psoriasis en placas son los codos, rodillas, hendidura glútea y el cuero cabelludo. La afectación tiende a ser asimétrica. La psoriasis inversa afecta a las regiones intertriginosas que incluyen la axila, ingle, región submamaria y el ombligo, y también tiende a afectar al cuello cabelludo, las palmas y las plantas. Las lesiones individuales son placas muy delimitadas, pero pueden estar húmedas debido a su localización. La psoriasis de tipo en placas se desarrolla generalmente lentamente y sigue un curso indolente. Raramente remite espontáneamente.
La psoriasis eruptiva (psoriasis en gotas) es la más común en niños y adultos jóvenes. Se desarrolla agudamente en individuos sin psoriasis o en aquellos con psoriasis en placas crónica. Los pacientes presentan muchas pápulas descamativas eritematosas pequeñas, frecuentemente después de infección de las vías respiratorias altas por estreptococos beta-hemolíticos. Los pacientes con psoriasis también pueden desarrollar lesiones pustulosas. Éstas pueden localizarse en las palmas y las plantas o puede estar generalizadas y asociadas a fiebre, malestar, diarrea y artralgias.
Aproximadamente la mitad de todos los pacientes con psoriasis tienen afectación de las uñas, apareciendo como lesiones punteadas, engrosamiento de las uñas o hiperqueratosis subungueal. Aproximadamente del 5 al 10 por ciento de los pacientes con psoriasis tienen asociadas dolencias de articulaciones y éstas se encuentran más frecuentemente en pacientes con afectación de las uñas. Aunque algunos tienen la aparición coincidente de artritis reumatoide clásica, muchos tienen enfermedad de las articulaciones que se clasifica en uno de los cinco tipos asociados a psoriasis: (1) enfermedad limitada a una única articulación o a algunas articulaciones pequeñas (70 por ciento de los casos); (2) una enfermedad similar a artritis reumatoide seronegativa; (3) afectación de las articulaciones interfalángicas distales; (4) artritis destructiva grave con el desarrollo de "artritis mutilante"; y (5) enfermedad limitada a la espina dorsal.
La psoriasis puede tratarse administrando antagonistas para IL-20. Los antagonistas preferidos son tanto un receptor soluble para IL-20 o anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o anticuerpos monocatenarios que se unen a IL-20, IL-20RA o IL-20RB. Tales antagonistas pueden administrarse solos o en combinación con otras terapias establecidas tales como lubricantes, queratolíticos, corticosteroides tópicos, derivados de vitamina D tópica, antralina, antimetabolitos sistémicos tales como metotrexato, terapia con luz ultravioleta psoralena (PUVA), etretinato, isotretinoína, ciclosporina, y el derivado de vitamina D3 tópica calcipotriol. Además, tales antagonistas pueden administrarse al individuo subcutáneamente, intravenosamente o transdérmicamente usando una crema o parche transdérmico que contiene el antagonista. Si se administra subcutáneamente, el antagonista puede inyectarse en una o más placas psoriásicas. Si se administran transdérmicamente, los antagonistas pueden administrarse directamente sobre las placas usando una crema, pomada, bálsamo o disolución que contiene el antagonista.
Los antagonistas para IL-20 pueden administrarse a una persona que tiene asma, bronquitis o fibrosis quística u otra enfermedad pulmonar inflamatoria para tratar la enfermedad. Los antagonistas pueden administrarse mediante cualquier procedimiento adecuado que incluye intravenoso, subcutáneo, lavado bronquial y el uso de inhalante que contiene el antagonista. Las realizaciones particulares de la presente invención están dirigidas hacia el uso de IL-20RA y/o IL-20RB solubles y anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB como antagonistas en enfermedades inflamatorias e inmunitarias o afecciones tales como psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), enfermedad de Crohn, diverticulosis, asma, pancreatitis, diabetes de tipo I (IDDM), cáncer pancreático, pancreatitis, enfermedad de Graves, cáncer de colon e intestinal, enfermedad autoinmunitaria, septicemia, trasplante de órganos o médula ósea; inflamación debida a endotoxemia, traumatismo, cirugía o infección; amiloidosis; esplenomegalia; enfermedad de injerto frente a huésped; y en las que la inhibición de inflamación, supresión inmunitaria, reducción de la proliferación de células hematopoyéticas, inmunitarias, inflamatorias o linfoides, macrófagos, células T (incluyendo células Th1 y Th2), supresión de la respuesta inmunitaria a un patógeno o antígeno, u otros casos en los que se desea la inhibición de citocinas IL-20.
Además, los anticuerpos o polipéptidos de unión que unen polipéptidos de IL-20, IL-20RA o IL-20RB descritos en este documento son útiles para:
1)
Antagonizar o bloquear la señalización mediante receptores de IL-20 en el tratamiento de inflamación aguda, inflamación como resultado de traumatismo, lesión de tejidos, cirugía, septicemia o infección, y enfermedades inflamatorias crónicas tales como asma, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), colitis crónica, esplenomegalia, artritis reumatoide, episodios inflamatorios agudos recurrentes (por ejemplo, tuberculosis) y tratamiento de amiloidosis y aterosclerosis, enfermedad de Castleman, asma, y otras enfermedades asociadas a la inducción de respuesta de fase aguda.
2)
Antagonizar o bloquear la señalización mediante receptores de IL-20 en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como IDDM, esclerosis múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico (LES), miastenia grave, artritis reumatoide y EII para prevenir o inhibir la señalización en células inmunitarias (por ejemplo, linfocitos, monocitos, leucocitos). Alternativamente, los anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales (Acm) para cualquiera de los receptores que comprenden IL-20, IL-20RA o IL-20RB, también puede usarse como un antagonista para reducir células inmunitarias no deseadas para tratar enfermedad autoinmunitaria. El asma, la alergia y otra enfermedad atópica pueden tratarse con un Acm contra, por ejemplo, IL-20 para inhibir la respuesta inmunitaria o para reducir células causales. El bloqueo o la inhibición de la señalización mediante IL-20, IL-20RA o IL-20RB, usando los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención, también puede beneficiar enfermedades del páncreas, riñón, pituitaria y células neuronales. Pueden beneficiarse la IDDM, la NIDDM, la pancreatitis y el carcinoma pancreático. Los polipéptidos de la presente invención pueden servir de diana para terapia con Acm de cáncer en la que un Acm antagonizante inhibe el crecimiento del cáncer y elige como diana la destrucción inmunitariamente mediada (Holliger P, y Hoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998). Los Acm para IL-20RA soluble también pueden ser útiles para tratar nefropatías tales como glomeruloesclerosis, neuropatía membranosa, amiloidosis (que también afecta al riñón, entre otros tejidos), arteriosclerosis renal, glomerulonefritis de diversos orígenes, enfermedades fibroproliferativas del riñón, además de disfunción renal asociada a LES, IDDM, diabetes de tipo II (NIDDM), tumores renales y otras enfermedades.
3)
Agonizar o iniciar la señalización mediante receptores de IL-20 en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como IDDM, EM, LES, miastenia grave, artritis reumatoide y EII. Los anticuerpos neutralizadores y monoclonales anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB pueden señalizar linfocitos u otras células inmunitarias para que diferencien, alteren la proliferación o cambien la producción de citocinas o proteínas de la superficie de la célula que mejoran la autoinmunidad. Específicamente, la modulación de una respuesta de célula T auxiliar a un patrón alterno de secreción de citocinas puede desviar una respuesta autoinmunitaria para que mejore la enfermedad (Smith JA y col., J. Immunol. 160:4841-4849, 1998).
Los polipéptidos solubles descritos en este documento pueden usarse para neutralizar/bloquear IL-20 o la actividad de IL-20, tanto individualmente como juntos, en el tratamiento de enfermedad autoinmunitaria, enfermedad atópica, NIDDM, pancreatitis y disfunción renal como se describe anteriormente. Puede usarse una forma soluble de IL-20RA, IL-20RB y/o IL-20RA/IL-20RB para promover una respuesta de anticuerpo mediada por células Th y/o para promover la producción de IL-4 u otras citocinas por linfocitos u otras células inmunitarias.
Los receptores solubles que comprenden IL-20RA, IL-20RB y/o IL-20RA/IL-20RB de la presente invención son útiles como antagonistas de citocina IL-20. Tales efectos antagonistas pueden lograrse mediante la neutralización directa o unión de IL-20. Además de los usos antagonistas, los receptores solubles de la presente invención pueden unirse a IL-20 y actuar de proteínas portadoras para IL-20 con el fin de transportar el ligando a diferentes tejidos, órganos y células dentro del cuerpo. Como tales, los receptores solubles de la presente invención pueden fusionarse o acoplarse a moléculas, polipéptidos o restos químicos que dirigen el complejo receptor soluble-ligando a un sitio específico tal como un tejido, célula inmunitaria específica o tumor. Por ejemplo, en infección aguda o algunos cánceres, el beneficio puede resultar de la inducción de inflamación y proteínas de respuesta de fase aguda local mediante la acción de IL-20. Por tanto, los receptores solubles de la presente invención pueden usarse para dirigir específicamente la acción de IL-20. Véase, Cosman, D. Cytokine 5: 95-106, 1993; y Fernandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9:497-513, 2000.
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Además, los receptores solubles de la presente invención pueden usarse para estabilizar IL-20, para aumentar la biodisponibilidad, longevidad terapéutica y/o eficacia del ligando estabilizando el ligando de la degradación o eliminación o eligiendo como ligando el ligando para un sitio de acción dentro del cuerpo. Por ejemplo, el complejo de IL-6 que se produce naturalmente/IL-6R soluble estabiliza la IL-6 y puede señalizar por el receptor gp130. Véase, Cosman, D., anteriormente, y Fernandez-Botran, R., anteriormente. Además, los complejos pueden tener distintas propiedades farmacocinéticas tales como afectar la semivida, dosis/respuesta y especificidad para órganos o tejidos. Por tanto, los complejos de IL-20RA/IL-20 o IL-20RB/IL-20 pueden tener actividad agonista para potenciar una respuesta inmunitaria o estimular células mesangiales o para estimular células hepáticas. Alternativamente, sólo los tejidos que expresan una subunidad de señalización que se heterodimeriza con el complejo pueden afectarse análogamente a la respuesta a complejos IL6/IL6R (Hirota H. y col., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 92:4862-4866, 1995; Hirano, T. en Thomason, A. (Ed.) "The Cytokine Handbook", 3^{a} ed. pág., 208-209). Los complejos de receptor soluble/citocina para IL12 y CNTF muestran actividades similares.
Además, la inflamación es una respuesta protectora por un organismo a rechazar un agente invasor. La inflamación es un acontecimiento en cascada que implica muchos mediadores celulares y humorales. Por una parte, la supresión de respuestas inflamatorias puede dejar a un huésped inmunodeprimido; sin embargo, si queda sin comprobar, la inflamación puede conducir a complicaciones serias que incluyen enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, psoriasis, artritis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino y similares), choque séptico y fallo multiorgánico. Y, lo que es más importante, estos diversos estados de enfermedad comparten mediadores inflamatorios comunes. Las enfermedades colectivas que se caracterizan por inflamación tienen un gran impacto en la morbilidad y mortalidad humana. Por tanto, está claro que las proteínas antiinflamatorias, tales como IL-20, IL-20RA y IL-20RB, y los anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA y anti-IL-20RB, podrían tener un potencial terapéutico crucial para un amplio número de enfermedades humanas y animales, desde asma y alergia hasta autoinmunidad y choque séptico.
1. Artritis
La artritis, que incluye osteoartritis, artritis reumatoide, articulaciones artríticas como resultado de lesión y similares, son afecciones inflamatorias comunes que se beneficiarían del uso terapéutico de proteínas antiinflamatorias tales como los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, la artritis reumatoide (AR) es una enfermedad sistémica que afecta a todo el cuerpo y es una de las formas más comunes de artritis. Se caracteriza por la inflamación de la membrana que reviste la articulación que produce dolor, rigidez, calor, rojez e hinchazón. Las células inflamatorias liberan enzimas que pueden digerir hueso y cartílago. Como resultado de la artritis reumatoide, el revestimiento de la articulación inflamada, la membrana sinovial, puede invadir y dañar el hueso y el cartílago conduciendo al deterioro de las articulaciones y a un dolor fuerte, entre otros efectos fisiológicos. La articulación implicada puede perder su forma y alineación, dando como resultado dolor y pérdida de movimiento.
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad mediada por el sistema inmunitario caracterizada particularmente por inflamación y posterior lesión de tejidos que conduce a una grave invalidez y mortalidad elevada. Una variedad de citocinas se producen localmente en las articulaciones reumatoides. Numerosos estudios han demostrado que la IL-1 y el TNF-alfa, dos citocinas proinflamatorias prototípicas, desempeñan una función importante en los mecanismos que participan en la inflamación sinovial y en la destrucción progresiva de las articulaciones. De hecho, la administración de inhibidores de TNF-alfa y IL-1 en pacientes con AR ha conducido a una espectacular mejora de signos clínicos y biológicos de inflamación y a una reducción de signos radiológicos de erosión ósea y destrucción de cartílago. Sin embargo, a pesar de estos resultados alentadores, un porcentaje significativo de pacientes no responden a estos agentes, lo que sugiere que en la patofisiología de la artritis también están implicados otros mediadores (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2):135-149, 2002). Uno de estos mediadores podría ser la IL-20 y, como tal, una molécula que se une a o inhibe la actividad de IL-20, tal como polipéptidos de IL-20RA o IL-20RB, o anticuerpos anti-IL-20 o componentes de unión, podría servir de fármaco valioso para reducir la inflamación en artritis reumatoide y otras enfermedades artríticas.
En la técnica se conocen hay varios modelos animales para artritis reumatoide. Por ejemplo, en el modelo de artritis inducida por colágeno (AIC), los ratones desarrollan artritis inflamatoria crónica que se asemeja mucho a la artritis reumatoide humana. Debido a que la AIC comparte características inmunológicas y patológicas similares con la AR, esto lo hace un modelo ideal para cribar posibles compuestos antiinflamatorios humanos. El modelo de AIC es un modelo muy conocido en ratones que para que se produzca depende de tanto una respuesta inmunitaria como de una respuesta inflamatoria. La respuesta inmunitaria comprende la interacción de células B y células CD4+ T en respuesta a colágeno, que se administra como antígeno, y conduce a la producción de anticuerpos anti-colágeno. La fase inflamatoria es el resultado de respuestas de tejido de mediadores de inflamación como consecuencia de la reacción cruzada de algunos de estos anticuerpos con el colágeno nativo del ratón y la activación de la cascada del complemento. Una ventaja en el uso del modelo de AIC es que los mecanismos básicos de patogénesis son conocidos. Se han identificado los epítopes de células T y células B relevantes en el colágeno de tipo II y se han determinado diversos parámetros inmunológicos (por ejemplo, hipersensibilidad de tipo retardada y anticuerpo anti-colágeno) e inflamatorios (por ejemplo, citocinas, quimiocinas y enzimas degradadoras de la matriz) relacionados con la artritis mediada por el sistema inmunitario y, por tanto, pueden usarse para evaluar la eficacia de compuestos de prueba en el modelo de AIC (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams y col., Immunol. 89:9784-788, 1992; Myers y col., Life Sci. 61:1861-78, 1997; y Wang y col., Immunol. 92:8955-959, 1995).
2. Endotoxemia
La endotoxemia es una afección grave comúnmente resultante de agentes infecciosos tales como bacterias y otros agentes de enfermedades infecciosas, septicemia, síndrome de choque tóxico, o en pacientes inmunodeprimidos sujetos a infecciones oportunistas y similares. Las proteínas antiinflamatorias terapéuticamente útiles tales como polipéptidos y anticuerpos de la presente invención podrían ayudar en la prevención y el tratamiento de endotoxemia en seres humanos y animales. Los polipéptidos de IL-20, IL-20RA o IL-20RB, los anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB, podrían servir de fármacos valiosos para reducir la inflamación y los efectos patológicos en la endotoxemia.
La endotoxemia inducida por lipopolisacáridos (LPS) atrae a muchos de los mediadores proinflamatorios que producen efectos patológicos en las enfermedades infecciosas y la endotoxemia inducida por LPS en roedores es un modelo ampliamente usado y aceptable para estudiar los efectos farmacológicos de posibles agentes proinflamatorios o inmunomoduladores. El LPS, producido en bacterias gram-negativas, es una agente causal importante en la patogénesis de choque séptico (Glausner y col., Lancet 338:732, 1991). De hecho, un estado similar a choque puede inducirse experimentalmente mediante una única inyección de LPS a animales. Las moléculas producidas por células que responden a LPS pueden elegir como diana patógenos directamente o indirectamente. Aunque estas respuestas biológicas protegen al huésped de patógenos invasores, también pueden producir daño. Por tanto, la estimulación masiva de inmunidad innata, que se produce como resultado de infección grave por bacterias gram-negativas, conduce a una producción en exceso de citocinas y otras moléculas y al desarrollo de un síndrome mortal, síndrome de choque séptico, que se caracteriza por fiebre, hipotensión, coagulación intravascular diseminada y fallo multiorgánico (Dumitru y col., Cell 103:1071-1083, 2000).
La mayoría de estos efectos tóxicos de LPS están relacionados con la activación de macrófagos que conduce a la liberación de múltiples mediadores inflamatorios. Entre estos mediadores parece que el TNF desempeña una función crucial, como se indica por la prevención de la toxicidad de LPS por la administración de anticuerpos neutralizadores anti-TNF (Beutler y col., Science 229:869, 1985). Está muy establecido que 1 ug de inyección de LPS de E. coli en un ratón C57B1/6 producirá un aumento significativo en IL-6, TNF-alfa, IL-1 y proteínas de fase aguda (por ejemplo, SAA) en circulación aproximadamente 2 horas después de la inyección. Parece que el que la toxicidad de LPS esté medida por estas citocinas como inmunización pasiva contra estos mediadores puede dar como resultado un descenso de la mortalidad (Beutler y col., Science 229:869, 1985). Las posibles estrategias de inmunointervención para la prevención y/o el tratamiento de choque séptico incluyen Acm anti-TNF, antagonista de receptores de IL-1, LIF, IL-10 y G-CSF.
3. Enfermedad inflamatoria del intestino (EII)
En los Estados Unidos, aproximadamente 500.000 personas padecen enfermedad inflamatoria del intestino (EII) que puede afectar tanto al colon como al recto (colitis ulcerosa) o tanto al intestino delgado como al grueso (enfermedad de Crohn). La patogénesis de estas enfermedades no está clara, pero implica la inflamación crónica de los tejidos afectados. Los polipéptidos de IL-20, IL-20RA o IL-20RB, anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB o componentes de unión podrían servir de fármaco valioso para reducir la inflamación y los efectos patológicos en EII y enfermedades relacionadas.
La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatoria del intestino grueso, comúnmente llamado el colon, caracterizada por la inflamación y la ulceración de la mucosa o revestimiento más interno del colon. Esta inflamación hace que el colon se vacíe frecuentemente, produciendo diarrea. Los síntomas incluyen heces sueltas y calambres abdominales asociados, fiebre y pérdida de peso. Aunque la causa exacta de la CU es desconocida, la investigación reciente sugiere que las defensas naturales del cuerpo están actuando contra las proteínas en el cuerpo que el cuerpo piensa que son foráneas (una "reacción autoinmunitaria"). Quizás porque se asemejan a proteínas bacterianas en el intestino, estas proteínas pueden tanto instigar como estimular el proceso inflamatorio que empieza con la destrucción del revestimiento del colon. Como el revestimiento del colon está destruido, se forman úlceras que liberan mucosidad, pus y sangre. La enfermedad normalmente empieza en el área rectal y eventualmente puede extenderse por todo el intestino grueso. Los episodios repetidos de inflamación conducen al engrosamiento de la pared del intestino y el recto con tejido cicatricial. La muerte del tejido del colon o septicemia puede producirse con la enfermedad grave. Los síntomas de la colitis ulcerosa varían en gravedad y su aparición puede ser gradual o repentina. Los ataques pueden ser provocados por muchos factores, que incluyen infecciones respiratorias o estrés.
Aunque actualmente no hay cura disponible para la CU, los tratamientos se basan en suprimir el proceso inflamatorio anormal en el revestimiento del colon. Los tratamientos que incluyen inmunodepresores corticosteroides (por ejemplo, azatioprina, mercaptopurina y metotrexato) y aminosalicitatos están disponibles para tratar la enfermedad. Sin embargo, el uso a largo plazo de inmunodepresores tales como corticosteroides y azatioprina pueden producir graves efectos secundarios que incluyen adelgazamiento de los huesos, cataratas, infección y efectos en el hígado y la médula ósea. En los pacientes en los que las terapias actuales no son satisfactorias, la cirugía es una opción. La cirugía implica la eliminación de todo el colon y el recto.
Hay varios modelos animales que pueden imitar parcialmente la colitis ulcerosa crónica. El modelo más ampliamente usado es el modelo de colitis inducida por ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico/etanol (TNBS) que induce inflamación crónica y ulceración en el colon. Cuando se introduce TNBS en el colon de ratones susceptibles mediante instilación intrarrectal, induce una respuesta inmunitaria mediada por células T en la mucosa colónica que en este caso conduce a una inflamación masiva de la mucosa caracterizada por la infiltración densa de células T y macrófagos por toda la pared del intestino grueso. Además, este cuadro histopatológico va acompañado del cuadro clínico de pérdida progresiva de peso (consunción), diarrea hemorrágica, prolapso rectal y engrosamiento de la pared del intestino grueso (Neurath y col., Intern. Rev. Immunol. 19:51-62, 2000).
Otro modelo de colitis usa dextrano-sulfato sodio (DSS), que induce una colitis aguda manifestada por diarrea hemorrágica, pérdida de peso, acortamiento del colon y ulceración de la mucosa con infiltración de neutrófilos. La colitis inducida por DSS se caracteriza histológicamente por infiltración de células inflamatorias en la lámina propria, con hiperplasia linfoide, lesión de la cripta focal y ulceración epitelial. Se piensa que estos cambios se desarrollan debido a un efecto tóxico del DSS en el epitelio y por fagocitosis de las células de la lámina propria y la producción de TNF-alfa y IFN-gamma. A pesar de su uso común, quedan sin resolver varias cuestiones referentes a los mecanismos del DSS sobre la relevancia para la enfermedad humana. El DSS se considera como un modelo independiente de células T porque se observa en animales deficientes en células T tales como ratones SCID.
4. Psoriasis
La psoriasis es una afección crónica de la piel que afecta a más de siete millones de norteamericanos. La psoriasis se produce cuando células nuevas de la piel crecen anormalmente produciendo parches inflamados, hinchados y escamosos de piel donde la piel antigua no se ha mudado suficientemente rápido. La psoriasis en placas, la forma más común, se caracteriza por parches inflamados de piel ("lesiones") coronados con escamas blancas plateadas. La psoriasis puede limitarse a unas pocas places o implican áreas de moderadas a extensas de la piel, apareciendo más comúnmente en el cuero cabelludo, rodillas, codos y el tronco. Aunque es sumamente visible, la psoriasis no es una enfermedad contagiosa. La patogénesis de las enfermedades implica inflamación crónica de los tejidos afectados. Los polipéptidos de IL-20, IL-20RA o IL-20RB, anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB o componentes de unión podrían servir de fármaco valioso para reducir la inflamación y los efectos patológicos en la psoriasis, otras enfermedades inflamatorias de la piel, alergias de la piel y la mucosa y enfermedades relacionadas.
La psoriasis es un trastorno inflamatorio de la piel mediado por células T que puede producir un malestar considerable. Es una enfermedad para la que no hay cura y afecta a personas de todas las edades. La psoriasis afecta aproximadamente al dos por ciento de las poblaciones de Europa y América del norte. Aunque los individuos con psoriasis leve pueden controlar frecuentemente su enfermedad con agentes tópicos, más de un millón de pacientes en todo el mundo requieren terapia ultravioleta o sistémica inmunodepresora. Desafortunadamente, la incomodidad y los riesgos de la radiación ultravioleta y las toxicidades de muchas terapias limitan su uso a largo plazo. Además, los pacientes tienen normalmente reaparición de la psoriasis, y en algunos casos rebote, poco después de detener la terapia inmunodepresora.
La IL-20 es un homólogo de IL-10 novedoso que se mostró que producía letalidad neonatal con anomalías de la piel que incluyen diferenciación epidérmica aberrante en ratones transgénicos para IL-20 (Blumberg H y col., Cell 104:9-19, 2001). El receptor de IL-20 está espectacularmente regulado por incremento en piel psoriásica. Además, la sobreexpresión de IL-20 se mostró en lesiones psoriásicas humanas sugiriendo que la IL-20 participaba en la psoriasis humana. Además, como se describe en este documento, la sobreexpresión de IL-20 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico y afectación de células inmunitarias indicativos de un fenotipo psoriásico. Como tales, los antagonistas para la actividad de IL-20, tales como receptores solubles de IL-20RA, IL-20RB y/o IL-20RA/IL-20RB y anticuerpos para los mismos que incluyen los anticuerpos monoclonales y neutralizadores anti-IL-20 humana, anti-IL-20RA humana y anti-IL-20RB humana de la presente invención, son útiles en el tratamiento terapéutico de enfermedades inflamatorias, particularmente como antagonistas para IL-20 en el tratamiento de psoriasis. Además, los antagonistas para la actividad de IL-20, tales como los receptores solubles de IL-20RA, IL-20RB y/o IL-20RA/IL-20RB y los anticuerpos para los mismos, que incluyen los anticuerpos monoclonales y neutralizadores anti-IL-20 humana, anti-IL-20RA humana y anti-IL-20RB humana de la presente invención, son útiles en el tratamiento terapéutico de otras enfermedades inflamatorias, por ejemplo, como antagonistas para IL-20 en el tratamiento de dermatitis atópica, EII, colitis, endotoxemia, artritis, artritis reumatoide y artritis psoriásica, enfermedad respiratoria aguda (ERA), choque séptico, fallo multiorgánico, lesión pulmonar inflamatoria tal como asma o bronquitis, neumonía bacteriana, psoriasis, eczema, dermatitis atópica y de contacto, y enfermedad inflamatoria del intestino tal como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn.
Además, los receptores solubles y los anticuerpos de la presente invención pueden usarse en la prevención y la terapia contra la pérdida de peso asociada a varias enfermedades inflamatorias descritas en este documento, además de para cáncer (por ejemplo, quimioterapia y caquexia) y enfermedades infecciosas. Por ejemplo, la pérdida de peso grave es un marcador clave asociado a modelos de septicemia, EM, AR y modelos de tumor. Además, la pérdida de peso es un parámetro clave de muchas enfermedades humanas que incluyen cáncer, enfermedad infecciosa y enfermedad inflamatoria. La pérdida de peso se mostró en ratones inyectados con el adenovirus de IL-22 descrito en este documento. Los anticuerpos anti-IL-20 y los antagonistas de IL-20 tales como los receptores solubles y los anticuerpos de la presente invención pueden probarse para su capacidad para prevenir y tratar la pérdida de peso en ratones inyectados con adenovirus de IL-20 descritos en este documento. Los procedimientos de determinación de una pauta profiláctica o terapéutica para tales antagonistas de IL-20 se conocen en la técnica y pueden determinarse usando los procedimientos descritos en este documento.
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Los receptores solubles y los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse en sistemas de diagnóstico para la detección de niveles en circulación de IL-20, y en la detección de IL-20 asociada a respuesta inflamatoria de fase aguda. En una realización relacionada, los anticuerpos u otros agentes que se unen específicamente a los polipéptidos y receptores solubles de la presente invención pueden usarse para detectar polipéptidos de receptores en circulación; en cambio, los propios receptores solubles de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB pueden usarse para detectar polipéptidos de IL-20 en circulación que actúan localmente. Niveles elevados o reducidos de ligando o polipéptidos de receptores pueden ser indicativos de afecciones patológicas que incluyen inflamación o cáncer. Se sabe que la IL-20 induce respuesta inflamatoria de fase aguda asociada. Además, la detección de proteínas o moléculas de fase aguda tales como IL-20 puede ser indicativa de una afección inflamatoria crónica en ciertos estados de enfermedad (por ejemplo, psoriasis, artritis reumatoide, colitis, EII). La detección de tales afecciones sirve para ayudar en el diagnóstico de enfermedades, además de para ayudar a un médico en la elección de la terapia apropiada.
La administración in utero de anticuerpos neutralizadores anti-IL-20 puede usarse para mostrar eficacia in vivo en modelos de enfermedad reduciendo o eliminando el fenotipo de piel encontrado en crías transgénicas para IL-20 que sobreexpresan IL-20. Hay precedentes en la técnica para el tratamiento in utero con anticuerpos monoclonales (Acm) neutralizadores. En un caso, el desarrollo del subconjunto B-1 de células B se vio espectacularmente afectado por el tratamiento de ratones hembra preñadas con un Acm específico para la molécula específica para células B, CD19 (por ejemplo, Krop I. Y col., Eur. J. Immunol. 26(1):238-42, 1996). Krop y col. inyectaron ratones gestantes intraperitonealmente con 500 ug de Acm anti-CD19 de ratón de rata (o un Ac de control del mismo isotipo de rata) en PBS empezando en el día 9 de gestación, con inyecciones posteriores cada dos días hasta que parieron. Las crías también se inyectaron una vez con 500 ug de estos anticuerpos a los 10 días de edad. En otro caso, Tanaka y col. encontraron que en el tratamiento in utero con anticuerpo monoclonal para el receptor de IL-2, la cadena beta deroga completamente el desarrollo de células epidérmicas dendríticas Thy-1+. Las dos subunidades distintas del receptor de IL-2, es decir, la cadena alfa (IL-2R alfa) y la cadena beta (IL-2R beta), se expresan en un modo casi mutuamente exclusivo por toda la ontogenia del timo fetal. El bloqueo de IL-2R beta, un componente de la transducción de señales de IL-2R, administrando un Acm neutralizador para IL-2R beta produjo la desaparición completa y selectiva de células epidérmicas dendríticas de la piel Thy-1+. Se deprimió el desarrollo de cualquier otro subconjunto de células T. Esto indica que la IL-2 desempeña una función crucial en el desarrollo de células fetales V gamma 5+ y sus descendientes (véase, Tanaka, T. y col., Int Immunol. 4(4):487-9, 1992). Además, Schattemann GC y col. mostraron que el PDGF-A es requerido para el desarrollo cardiovascular murino normal usando un sistema in utero. Varias líneas de evidencia sugieren que la cadena del factor de crecimiento derivado de plaquetas A (PDGF-A) es requerida para el desarrollo cardiovascular embriónico normal. La introducción de anticuerpos neutralizadores anti-PDGF-A en caducas de ratón in utero produjo la interrupción selectiva de las interacciones ligando-receptor de PDGF-A in vivo durante un periodo de 18-24 h y permitió la evaluación de si el PDGF-A es requerido para el desarrollo cardiovascular y cuándo se requiere (véase, Schattemann GC y col., Dev. Biol. 176(1):133-42, 1996). Estos resultados, además de otros descritos en la técnica, proporcionan pruebas de que los Acm neutralizadores pueden provocar fuertes efectos in utero. Similarmente, pueden mostrarse datos que muestran la eficacia de IL-20 neutralizadora con anticuerpos monoclonales in vivo en modelos de enfermedad para reducir o eliminar el fenotipo de piel encontrado en crías transgénicas para IL-20 que sobreexpresan IL-20, respectivamente. Estos ratones transgénicos nacen con un aspecto de piel "brillante" debido al menos en parte a un engrosamiento de la epidermis como se describe en este documento. Las crías TG para IL-20 que expresan niveles realmente bajos de la citocina transgénica pueden recuperarse y sobreviven para reproducirse.
Además de otros modelos de enfermedad descritos en este documento, la actividad de anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA y anti-IL-20RB en tejido inflamatorio derivado de lesiones psoriásicas humanas puede medirse in vivo usando un modelo de ratón con inmunodeficiencia combinada grave (SCID). Se han desarrollado varios modelos de ratón en los que células humanas se han implantado en ratones inmunodeficientes (denominado en conjunto en lo sucesivo modelos de xenoinjerto); véanse, por ejemplo, Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18:513-22, 1994 y Flavell, DJ, Hematological Oncology 14:67-82, 1996. Como modelo de xenoinjerto in vivo para psoriasis, el tejido de piel psoriásica humana se implanta en el modelo de ratón SCID y se expone a un antagonista apropiado. Los antagonistas preferidos son anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA y anti-IL-20RB que bloquean la actividad de IL-20, sin embargo, la IL-20RA soluble, además de otros antagonistas bloqueantes de IL-20, pueden usarse en este modelo. Similarmente, los tejidos o células derivados de colitis humana, EII, artritis u otras lesiones inflamatorias pueden usarse en el modelo SCID para evaluar las propiedades antiinflamatorias de los antagonistas de IL-20 descritos en este documento.
Las terapias diseñadas para anular, retardar o reducir la inflamación usando anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA y anti-IL-20RB o sus derivados, agonistas, conjugados o variantes pueden probarse mediante la administración de estos anticuerpos o compuestos solubles de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB a ratones SCID que llevan tejido inflamatorio humano (por ejemplo, lesiones psoriásicas y similares). La eficacia del tratamiento se mide y se evalúa estadísticamente como el aumento del efecto antiinflamatorio dentro de la población tratada respecto al tiempo usando procedimientos muy conocidos en la técnica. Algunos procedimientos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, medir, por ejemplo, en un modelo de psoriasis, el espesor epidérmico, el número de células inflamatorias en la dermis superior y los grados de paraqueratosis. Tales procedimientos se conocen en la técnica y se describen en este documento. Por ejemplo, véanse Zeigler, M. y col., Lab Invest 81:1253, 2001; Zollner, T. M. y col., J. Clin. Invest. 109:671, 2002; Yamanaka, N. y col., Microbio.1 Immunol. 45:507, 2001; Raychaudhuri, S. P. y col., Br. J. Dermatol. 144:931, 2001; Boehncke, W. H y col., Arch. Dermatol. Res. 291:104, 1999; Boehncke, W. H y col., J. Invest. Dermatol. 116:596, 2001; Nickoloff, B. J. y col., Am. J. Patol. 146:580, 1995; Boehncke, W. H y col., J. Cutan. Patol. 24:1, 1997; Sugai, J. M. y col., J. Dermatol. Sci. 17:85, 1998; y Villadsen L.S. y col., J. Clin. Invest. 112:1571, 2003. La inflamación también puede monitorizarse con el tiempo usando procedimientos muy conocidos tales como citometría de flujo (o PCR) para cuantificar el número de células inflamatorias o de lesión presentes en una muestra, puntuación (pérdida de peso, diarrea, rectorragia, longitud del colon) para EII, puntuación de enfermedad de las patas y puntuación de inflamación para el modelo de AR de AIC. Por ejemplo, las estrategias terapéuticas apropiadas para probar en un modelo tal incluyen tratamiento directo usando anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA y anti-IL-20RB, otros antagonistas de IL-20, o conjugados o antagonistas relacionados basándose en la interacción por interrupción de anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB con IL-20, o para terapias basadas en células que utilizan anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA y anti-IL-20RB o sus derivados, agonistas, conjugados o variantes.
Además, la psoriasis es una enfermedad de la piel inflamatoria crónica que está asociada a queratinocitos epidérmicos hiperplásicos y células mononucleares infiltrantes que incluyen células T de memoria CD4+, neutrófilos y macrófagos (Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol. 110:199, 1996). Actualmente se cree que los antígenos medioambientales desempeñan una función significativa en la iniciación y la contribución a la patología de la enfermedad. Sin embargo, se cree que es la pérdida de tolerancia para los autoantígenos la que media la patología de la psoriasis. Se cree que las células dendríticas y las células T CD4+ desempeñan una función importante en la presentación y el reconocimiento de antígeno que media la respuesta inmunitaria que conduce a la patología. Los inventores han desarrollado recientemente un modelo de psoriasis basado en el modelo de transferencia de CD4+CD45RB (Davenport y col., Internat. Immunopharmacol. 2:653-672). Los anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB, o IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB soluble, se administran a los ratones. La inhibición de las puntuaciones de enfermedad (lesiones de la piel, citocinas inflamatorias) indica la eficacia de los antagonistas de IL-20 en psoriasis, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB o receptores solubles de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB, u otros antagonistas tales como anticuerpos contra IL-20 o sus receptores.
Para uso farmacéutico, los polipéptidos y anticuerpos solubles de la presente invención se formulan para administración parenteral, particularmente intravenosa o subcutánea, según procedimientos convencionales. La administración intravenosa será mediante inyección en bolo, liberación controlada, por ejemplo, usando minibombas u otra tecnología apropiada, o mediante infusión durante un periodo típico de una a varias horas. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán una proteína hematopoyética en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como solución salina, solución salina tamponada, dextrosa al 5% en agua o similares. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes de tamponamiento, albúmina para evitar la pérdida de proteínas en las superficies de viales, etc. Cuando se utiliza una terapia de combinación tal, las citocinas pueden combinarse en una formulación única o puede administrarse en formulaciones separadas. Los procedimientos de formulación son muy conocidos en la técnica y se desvelan, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed. Mack Publishing Co. Easton PA, 1990, que se incorpora en este documento por referencia. Las dosis terapéuticas estarán generalmente en el intervalo de 0,1 a 100 mg/kg de peso de paciente por día, preferentemente 0,5-20 mg/kg por día, con la dosis exacta determinada por el clínico según normas aceptadas, teniendo en cuenta la naturaleza y gravedad de la afección que va a tratarse, características del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel del experto en la materia. Las proteínas se administrarán comúnmente durante un periodo de hasta 28 días tras la quimioterapia o trasplante de médula ósea o hasta que se logre un número de plaquetas de >20.000/mm^{3}, preferentemente >50.000/mm^{3}. Más comúnmente, las proteínas se administrarán durante una semana o menos, frecuentemente durante un periodo de uno a tres días. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpos solubles de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB o anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB de la presente invención es una cantidad suficiente para producir un aumento clínicamente significativo en la proliferación y/o diferenciación de células progenitoras linfoides o mieloides que se manifestará como un aumento en los niveles en circulación de células maduras (por ejemplo, plaquetas o neutrófilos). Por tanto, el tratamiento de trastornos de plaquetas continuará hasta que se alcance un número de plaquetas de al menos 20.000/mm^{3}, preferentemente 50.000/mm^{3}. Los anticuerpos solubles de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB o anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB de la presente invención también pueden administrarse en combinación con otras citocinas tales como IL-3, -6 y -11; factor de células madres; eritropoyetina; G-CSF y GM-CSF. Dentro de las pautas de terapia de combinación, las dosis diarias de otras citocinas serán en general: EPO, 150 U/kg; GM-CSF, 5-15 lg/kg; IL-3, 1-5 lg/kg; y G-CSF, 1-25 lg/kg. La terapia de combinación con EPO, por ejemplo, se indica en pacientes anémicos con bajos niveles de
EPO.
Generalmente, la dosificación de anticuerpos solubles de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB o anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB administrados variará dependiendo de factores tales como la edad del paciente, peso, altura, sexo, condición médica general e historia médica previa. Normalmente, se desea proporcionar al receptor una dosificación de anticuerpos solubles de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB o anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB que esté en el intervalo de aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (cantidad de agente/peso corporal del paciente), aunque también puede administrarse una dosificación inferior o superior según dicten las circunstancias.
La administración de anticuerpos solubles de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB o anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB a un sujeto puede ser intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, mediante perfusión por un catéter regional o por inyección intralesional directa. Cuando se administran proteínas terapéuticas mediante inyección, la administración puede ser por infusión continua o por bolos individuales o múltiples.
Vías de administración adicionales incluyen oral, mucoso-membrana, pulmonar y transcutánea. La administración por vía oral es adecuada para microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas proteinoides, microesferas de policianoacrilato y sistemas basados en lípidos (véase, por ejemplo, DiBase y Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins" en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)). La viabilidad de una administración intranasal se ejemplifica por un modo tal de administración de insulina (véase, por ejemplo, Hinchcliffe e Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)). Las partículas secas o líquidas que comprenden IL-20RA pueden prepararse e inhalarse con la ayuda de dispersores de polvo seco, generadores de aerosol líquido, o nebulizadores (por ejemplo, Pettit y Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). Esta solución se ilustra por el sistema de tratamiento de la diabetes AERX que es un inhalador electrónico portátil que administra insulina aerosolizada a los pulmones. Los estudios han mostrado que las proteínas de hasta 48.000 kDa se han administrado a través de la piel a concentraciones terapéuticas con la ayuda de ultrasonidos de baja frecuencia, que ilustra la viabilidad de la administración transcutánea (Mitragotri y col., Science 269:850 (1995)). La administración transdérmica usando electroporación proporciona otro medio para administrar un polipéptido de la presente invención.
Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo soluble de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB o anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB puede formularse según procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, por lo que las proteínas terapéuticas se combinan en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es un "vehículo farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. La solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otros vehículos adecuados son muy conocidos para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19^{a} edición (Mack Publishing Company 1995).
Para fines de terapia, las moléculas de anticuerpos solubles de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB o anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administran a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se dice que una combinación de una molécula terapéutica de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable van a administrarse en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia produce un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor. Por ejemplo, un agente usado para tratar inflamación es fisiológicamente significativo si su presencia alivia la respuesta inflamatoria.
Una composición farmacéutica que comprende los polipéptidos de la presente invención puede proporcionarse en forma líquida, en un aerosol o en forma sólida. Las formas líquidas se ilustran por disoluciones inyectables y suspensiones orales. Las formas sólidas a modo de ejemplo incluyen cápsulas, comprimidos y formas de liberación controlada. Esta última forma se ilustra por bombas miniosmóticas e implantes (Bremer y col., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery" en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer y col., "Protein Delivery with Infusión Pumps" en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey y col., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant" en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)).
Los liposomas proporcionan un medio para administrar polipéptidos terapéuticos a un sujeto intravenosamente, intraperitonealmente, intratecalmente, intramuscularmente, subcutáneamente, o mediante administración por vía oral, inhalación o administración intranasal. Los liposomas son vesículas microscópicas que están constituidas por una o más bicapas de lípidos que rodean compartimentos acuosos (véanse, generalmente, Bakker-Woudenberg y col., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993), y Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers" en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Los liposomas son similares en composición a las membranas celulares y, por consiguiente, los liposomas pueden administrarse con total seguridad y son biodegradables. Dependiendo del procedimiento de preparación, los liposomas pueden ser unilaminares o multilaminares y los liposomas pueden variar en tamaño con diámetros que oscilan de 0,02 \mum a más de 10 \mum. En los liposomas puede encapsularse una variedad de agentes: reparto de agentes hidrófobos en las bicapas y reparto de agentes hidrófilos dentro del (de los) espacio(s) acuoso(s) interno(s) (véanse, por ejemplo, Machy y col., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987) y Ostro y col., American J. Hosp. Phann. 46:1576 (1989)). Además, es posible controlar la disponibilidad terapéutica del agente encapsulado variando el tamaño de los liposomas, el número de bicapas, la composición del lípido, además de la carga y las características superficiales de los liposomas.
Los liposomas pueden adsorberse a prácticamente cualquier tipo de célula y luego liberar lentamente el agente encapsulado. Alternativamente, un liposoma absorbido puede ser endocitado por células que son fagocíticas. La endocitosis va seguida de degradación intralisosómica de lípidos liposómicos y liberación de los agentes encapsulados (Scherphof y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985)). Después de la administración intravenosa, los liposomas pequeños (0,1 a 1,0 \mum) son captados normalmente por células del sistema reticuloendotelial, localizado principalmente en el hígado y bazo, mientras que los liposomas superiores a 3,0 \mum se depositan en el pulmón. Esta captación preferencial de liposomas más pequeños por las células del sistema reticuloendotelial se ha usado para administrar agentes quimioterapéuticos a macrófagos y a tumores del hígado.
El sistema reticuloendotelial puede ser sorteado por varios procedimientos que incluyen saturación con grandes dosis de partículas de liposomas o inactivación de macrófagos selectivos mediante medios farmacológicos (Claassen y col., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). Además, se ha mostrado que la incorporación de fosfolípidos derivatizados de glicolípidos o polietilenglicoles a membranas de liposomas produce una captación significativamente reducida por el sistema reticuloendotelial (Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
Los liposomas también pueden prepararse para elegir como diana células u órganos particulares variando la composición de los fosfolípidos o insertando receptores o ligandos en los liposomas. Por ejemplo, los liposomas preparados con un alto contenido de un tensioactivo no iónico se han usado para elegir como diana el hígado (Hayakawa y col., patente japonesa 04-244.018; Kato y col., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)). Estas formulaciones se prepararon mezclando fosfatidilcolina de soja, \alpha-tocoferol y aceite de ricino hidrogenado etoxilado (HCO-60) en metanol, concentrando la mezcla a vacío y luego reconstituyendo la mezcla con agua. También se ha mostrado que una formulación liposómica de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) con una mezcla de esterilglucósido derivado de soja (SG) y colesterol (Ch) elige como diana el hígado (Shimizu y col., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997)).
Alternativamente, diversos ligandos de elección de diana pueden unirse a la superficie del liposoma, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, carbohidratos, vitaminas y proteínas de transporte. Por ejemplo, los liposomas pueden modificarse con derivados de galactosil-lípido de tipo ramificado para elegir como diana receptores de asialoglicoproteínas (galactosa) que se expresan exclusivamente sobre la superficie de células del hígado (Kato y Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi y col., Biol. Pharm. Bull, 20:259 (1997)). Similarmente, Wu y col., Hepatology 27:772 (1998), han mostrado que el marcado de liposomas con asialofetuína condujo a una semivida acortada en plasma de liposomas y potenció enormemente la captación de liposoma marcado con asialofetuína por hepatocitos. Por otra parte, la acumulación hepática de liposomas que comprenden derivados de galactosil-lípido de tipo ramificado puede inhibirse mediante preinyección de asialofetuína (Murahashi y col., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). Los liposomas de albúmina de suero humana poliaconitilados proporcionan otra solución para elegir como diana liposomas para células del hígado (Kamps y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997)). Además, Geho, y col., patente de EE.UU. nº 4.603.044, describen un sistema de administración de vesículas dirigido a hepatocitos que tiene especificidad por receptores hepatobiliares asociados a las células metabólicas especializadas del hígado.
En una solución más general para elegir como diana tejido, las células diana están premarcadas con anticuerpos biotinilados específicos para un ligando expresado por la célula diana (Harasym y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). Después de la eliminación del plasma del anticuerpo libre se administran liposomas conjugados con estreptavidina. En otra solución, los anticuerpos de elección de dianas se unen directamente a liposomas (Harasym y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)).
Los polipéptidos y anticuerpos pueden encapsularse dentro de liposomas usando técnicas estándar de microencapsulación de proteínas (véanse, por ejemplo, Anderson y col., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson y col., Cancer Res. 50:1853 (1990) y Cohen y col., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving y col., "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies" en Liposome Technology, 2^{a} edición, vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef y col., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). Como se observa anteriormente, los liposomas terapéuticamente útiles pueden contener una variedad de componentes. Por ejemplo, los liposomas pueden comprender derivados de lípidos de poli(etilenglicol) (Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
Las microesferas de polímero degradables han sido diseñadas para mantener altos niveles sistémicos de proteínas terapéuticas. Las microesferas se preparan a partir de polímeros degradables tales como poli(lactida-co-glicolida) (PLG), polianhídridos, poli(orto-ésteres), polímeros de acetato de etilvinilo no biodegradables en los que las proteínas están atrapadas en el polímero (Gombotz y Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery" en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos y Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery" en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus y col., Science 281:1161 (1998); Putney y Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). Las nanoesferas recubiertas de polietilenglicol (PEG) también pueden proporcionar vehículos para la administración intravenosa de proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, Gref y col., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)).
Los expertos en la materia pueden idear otras formas farmacéuticas como se muestra, por ejemplo, por Ansel y Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5ª edición (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19ª edición (Mack Publishing Company 1995), y por Ranade y Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).
Como ilustración, las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse como un kit que comprende un recipiente que comprende un polipéptido con un dominio extracelular de IL-20RA o IL-20RB, por ejemplo receptores solubles monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos de IL-20RA o IL-20RB, o un antagonista de IL-20 o IL-20RA o IL-20RB (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB, o anticuerpo neutralizador anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB). Los polipéptidos terapéuticos pueden proporcionarse en forma de una disolución inyectable para dosis únicas o múltiples, o como un polvo estéril que se reconstituirá antes de inyección. Alternativamente, un kit tal puede incluir un dispersador de polvo seco, generador de aerosol líquido o nebulizador para la administración de un polipéptido terapéutico. Un kit tal puede comprender adicionalmente información por escrito sobre las indicaciones y uso de la composición farmacéutica. Además, tal información puede incluir un comunicado de que la composición de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB está contraindicada en pacientes con hipersensibilidad conocida a IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB.
Una composición farmacéutica que comprende anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB o componentes de unión (o fragmentos de anticuerpos anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB, fusiones de anticuerpos, anticuerpos humanizados y similares), o receptor soluble de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB, puede proporcionarse en forma líquida, en un aerosol, o en forma sólida. Las formas líquidas se ilustran por disoluciones inyectable, aerosoles, gotitas, disoluciones topológicas y suspensiones orales. Las formas sólidas a modo de ejemplo incluyen cápsulas, comprimidos y formas de liberación controlada. Esta última forma se ilustra por bombas miniosmóticas e implantes (Bremer y col., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery" en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer y col., "Protein Delivery with Infusión Pumps" en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey y col., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant" en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)). Otras formas sólidas incluyen cremas, pastas, otras aplicaciones topológicas, y similares.
Los liposomas proporcionan un medio para administrar polipéptidos terapéuticos a un sujeto intravenosamente, intraperitonealmente, intratecalmente, intramuscularmente, subcutáneamente, o mediante administración por vía oral, inhalación o administración intranasal. Los liposomas son vesículas microscópicas que están constituidas por una o más bicapas de lípidos que rodean compartimentos acuosos (véase, generalmente, Bakker-Woudenberg y col., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993), y Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers" en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Los liposomas son similares en composición a las membranas celulares y, por consiguiente, los liposomas pueden administrarse con total seguridad y son biodegradables. Dependiendo del procedimiento de preparación, los liposomas pueden ser unilaminares o multilaminares y los liposomas pueden variar en tamaño con diámetros que oscilan de 0,02 \mum a más de 10 \mum. En los liposomas puede encapsularse una variedad de agentes: reparto de agentes hidrófobos en las bicapas y reparto de agentes hidrófilos dentro del (de los) espacio(s) acuoso(s) interno(s) (véase, por ejemplo, Machy y col., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), y Ostro y col., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)). Además, es posible controlar la disponibilidad terapéutica del agente encapsulado variando el tamaño de los liposomas, el número de bicapas, la composición del lípido, además de la carga y las características superficiales de los liposomas.
Los liposomas pueden adsorberse a prácticamente cualquier tipo de célula y luego liberar lentamente el agente encapsulado. Alternativamente, un liposoma absorbido puede ser endocitado por células que son fagocíticas. La endocitosis va seguida de degradación intralisosómica de lípidos liposómicos y liberación de los agentes encapsulados (Scherphof y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985)). Después de la administración intravenosa, los liposomas pequeños (0,1 a 1,0 \mum) son captados normalmente por células del sistema reticuloendotelial, localizado principalmente en el hígado y bazo, mientras que los liposomas superiores a 3,0 \mum se depositan en el pulmón. Esta captación preferencial de liposomas más pequeños por las células del sistema reticuloendotelial se ha usado para administrar agentes quimioterapéuticos a macrófagos y a tumores del hígado.
El sistema reticuloendotelial puede ser sorteado por varios procedimientos que incluyen saturación con grandes dosis de partículas de liposomas o inactivación de macrófagos selectivos mediante medios farmacológicos (Claassen y col., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). Además, se ha mostrado que la incorporación de fosfolípidos derivatizados de glicolípidos o polietilenglicoles en membranas de liposomas produce una captación significativamente reducida por el sistema reticuloendotelial (Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
Los liposomas también pueden prepararse para elegir como diana células u órganos particulares variando la composición de los fosfolípidos o insertando receptores o ligandos en los liposomas. Por ejemplo, los liposomas preparados con un alto contenido de un tensioactivo no iónico se han usado para elegir como diana el hígado (Hayakawa y col., patente japonesa 04-244.018; Kato y col., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)). Estas formulaciones se prepararon mezclando fosfatidilcolina de soja, \alpha-tocoferol y aceite de ricino hidrogenado etoxilado (HCO-60) en metanol, concentrando la mezcla a vacío y luego reconstituyendo la mezcla con agua. También se ha mostrado que una formulación liposómica de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) con una mezcla de esterilglucósido derivado de soja (SG) y colesterol (Ch) elige como diana el hígado (Shimizu y col., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997)).
Alternativamente, diversos ligandos de elección de diana pueden unirse a la superficie del liposoma, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, carbohidratos, vitaminas y proteínas de transporte. Por ejemplo, los liposomas pueden modificarse con derivados de galactosil-lípido de tipo ramificado para elegir como diana receptores de asialoglicoproteínas (galactosa) que se expresan exclusivamente sobre la superficie de células del hígado (Kato y Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi y col., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). Similarmente, Wu y col., Hepatology 27:772 (1998), han mostrado que el marcado de liposomas con asialofetuína condujo a una semivida acortada en plasma de liposomas y potenció enormemente la captación de liposoma marcado con asialofetuína por hepatocitos. Por otra parte, la acumulación hepática de liposomas que comprenden derivados de galactosil-lípido de tipo ramificado puede inhibirse mediante preinyección de asialofetuína (Murahashi y col., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). Los liposomas de albúmina de suero humana poliaconitilados proporcionan otra solución para elegir como diana liposomas para células del hígado (Kamps y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997)). Además, Geho, y col., patente de EE.UU. nº 4.603.044, describen un sistema de administración de vesículas dirigido a hepatocitos que tiene especificidad por receptores hepatobiliares asociados a las células metabólicas especializadas del hígado.
En una solución más general para elegir como diana tejido, las células diana están premarcadas con anticuerpos biotinilados específicos para un ligando expresado por la célula diana (Harasym y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). Después de la eliminación del plasma del anticuerpo libre se administran liposomas conjugados con estreptavidina. En otra solución, los anticuerpos de elección de dianas se unen directamente a liposomas (Harasym y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)).
Los anticuerpos neutralizadores anti-IL-20, anti-IL-20RA o and-IL-20RB y los componentes de unión con actividad de unión a IL-20, o receptor soluble de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB, pueden encapsularse dentro de liposomas usando técnicas estándar de microencapsulación de proteínas (véanse, por ejemplo, Anderson y col., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson y col., Cancer Res. 50:1853 (1990), y Cohen y col., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving y col., "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies" en Liposome Technology, 2ª edición, vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef y col., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). Como se observa anteriormente, los liposomas terapéuticamente útiles pueden contener una variedad de componentes. Por ejemplo, los liposomas pueden comprender derivados de lípidos de poli(etilenglicol) (Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
Las microesferas de polímero degradables han sido diseñadas para mantener altos niveles sistémicos de proteínas terapéuticas. Las microesferas se preparan a partir de polímeros degradables tales como poli(lactida-co-glicolida) (PLG), polianhídridos, poli(orto-ésteres), polímeros de acetato de etilvinilo no biodegradables en los que las proteínas están atrapadas en el polímero (Gombotz y Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery" en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos y Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery" en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus y col., Science 281:1161 (1998); Putney y Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). Las nanoesferas recubiertas de polietilenglicol (PEG) también pueden proporcionar vehículos para la administración intravenosa de proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, Gref y col., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)).
Los expertos en la materia pueden idear otras formas farmacéuticas como se muestra, por ejemplo, por Ansel y Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5ª edición (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19ª edición (Mack Publishing Company 1995), y por Ranade y Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).
La presente invención contempla composiciones solubles de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB o anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB, y procedimientos y usos terapéuticos que comprenden anticuerpos, péptidos o polipéptidos tales descritos en este documento. Tales composiciones pueden comprender adicionalmente un vehículo. El vehículo puede ser un vehículo convencional orgánico o inorgánico. Ejemplos de vehículos incluyen agua, disolución de tampón, alcohol, propilenglicol, macrogol, aceite de sésamo, aceite de maíz y similares.
10. Producción de ratones transgénicos
La sobreexpresión de IL-20 se mostró en lesiones psoriásicas humanas sugiriendo que la IL-20 participa en la psoriasis humana. Además, como se describe en este documento, la sobreexpresión de IL-20 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico y afectación de células inmunitarias indicativos de un fenotipo psoriásico. Como tales, los antagonistas para la actividad de IL-20, tales como los anticuerpos neutralizadores y monoclonales anti-IL-20 humana, anti-IL-20RA humana y anti-IL-20RB humana de la presente invención, además de receptores solubles de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB, son útiles en el tratamiento terapéutico de enfermedades inflamatorias, particularmente como antagonistas para IL-20 en el tratamiento de psoriasis. Además, los antagonistas para la actividad de IL-20, tales como los anticuerpos neutralizadores y monoclonales anti-IL-20 humana, anti-IL-20RA humana y anti-IL-20RB humana de la presente invención, además de receptores solubles de IL-20RA, IL-20RB y IL-20RA/IL-20RB, son útiles en el tratamiento terapéutico de otras enfermedades inflamatorias, por ejemplo, como antagonistas para IL-20 en el tratamiento de dermatitis atópica, EII, colitis, endotoxemia, artritis, artritis reumatoide y artritis psoriásica, enfermedad respiratoria aguda (ERA), choque séptico, fallo multiorgánico, lesión pulmonar inflamatoria tal como asma o bronquitis, neumonía bacteriana, psoriasis, eczema, dermatitis atópica y de contacto, y enfermedad inflamatoria del intestino tal como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, y similares.
Dentro de un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo para un polipéptido que comprende: inocular un animal con un polipéptido seleccionado del grupo que está constituido por: (a) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3 del aminoácido número 1 (Pro) al aminoácido número 6 (Asp); (b) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3 del aminoácido número 26 (Ser) al aminoácido número 32 (Pro); (c) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3 del aminoácido número 41 (Lys) al aminoácido número 47 (Asp); (d) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2 del aminoácido número 49 (Val) al aminoácido número 62 (Cys); (e) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3 del aminoácido número 41 (Lys) al aminoácido número 62 (Cys); (f) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3 del aminoácido número 84 (Ala) al aminoácido número 97 (Ser); (g) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3 del aminoácido número 103 (Thr) al aminoácido número 108 (Asp); (h) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3 del aminoácido número 130 (Arg) al aminoácido número 135 (His); (i) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3 del aminoácido número 164 (Gly) al aminoácido número 166 (Lys); (j) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3 del aminoácido número 175 (Tyr), al aminoácido número 179 (Glu); (k) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3 del aminoácido número 193 (Lys) al aminoácido número 196 (Ala); (l) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3 del aminoácido número 203 (Lys) al aminoácido número 209 (Thr); y (m) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3; y (n) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 4; y en el que el polipéptido provoca una respuesta inmunitaria en el animal para producir el anticuerpo; y aislar el anticuerpo del animal; y en el que el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido de IL-20RA (SEQ ID Nº: 2 o SEQ ID Nº: 3); e inhibe la actividad proinflamatoria de IL-20 (SEQ ID Nº: 8) o IL-22 (SEQ ID Nº: 6).
Dentro de una realización se proporciona el procedimiento como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo producido mediante el procedimiento inhibe la actividad proinflamatoria de IL-20.
Dentro de un segundo aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo producido mediante el procedimiento que se desvela anteriormente, que se une a un polipéptido de SEQ ID Nº: 2, SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 14, SEQ ID Nº: 15, SEQ ID Nº: 21 o SEQ ID Nº: 23. Dentro de una realización se proporciona el anticuerpo como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo se selecciona del grupo que está constituido por: (a) un anticuerpo policlonal, (b) un anticuerpo monoclonal murino, (c) un anticuerpo humanizado derivado de (b), (d) un fragmento de anticuerpo y (e) un anticuerpo monoclonal humano.
Dentro de un tercer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos como se muestra en SEQ ID Nº: 2, SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 14, SEQ ID Nº: 15, SEQ ID Nº: 21 o SEQ ID Nº: 23; e inhibe la actividad proinflamatoria de IL-20. Dentro de una realización se proporciona el anticuerpo como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo comprende además un radionúclido, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marca de péptido, partícula magnética, fármaco o toxina.
Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para inhibir la proliferación o diferenciación inducida por IL-20 de células hematopoyéticas y células progenitoras hematopoyéticas que comprende cultivar médula ósea o glóbulos sanguíneos periféricos con una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo como se desvela anteriormente suficiente para reducir la proliferación o diferenciación de las células hematopoyéticas en la médula ósea o glóbulos sanguíneos periféricos con respecto a médula ósea o glóbulos sanguíneos periféricos cultivados en ausencia de receptor de citocina soluble. Dentro de una realización se proporciona el procedimiento como se describe anteriormente, en la que las células hematopoyéticas y las células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides.
Dentro de otra realización se proporciona el procedimiento como se describe anteriormente, en la que las células linfoides son macrófagos o células T.
Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de reducción de la inflamación inducida por IL-20 que comprende administrar a un mamífero con inflamación una cantidad de una composición de un anticuerpo como se desvela anteriormente suficiente para reducir la inflamación.
Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de supresión de una respuesta inflamatoria en un mamífero con inflamación que comprende: (1) determinar un nivel de proteína amiloide A sérica; (2) administrar una composición que comprende un anticuerpo como se desvela anteriormente en un vehículo farmacéutico aceptable; (3) determinar un nivel de administración posterior de proteína amiloide A sérica; (4) comparar el nivel de proteína amiloide A sérica en la etapa (1) con el nivel de proteína amiloide A sérica en la etapa (3), siendo una falta de aumento o disminución en el nivel de proteína amiloide A sérica indicativo de la supresión de una respuesta inflamatoria.
Dentro de una realización se proporciona el anticuerpo como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo comprende además un radionúclido, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marca de péptido, partícula magnética, fármaco o toxina.
Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para inhibir la proliferación o diferenciación inducida por IL-20 de células hematopoyéticas y células progenitoras hematopoyéticas que comprende cultivar médula ósea o glóbulos sanguíneos periféricos con una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo como se desvela anteriormente suficiente para reducir la proliferación o diferenciación de las células hematopoyéticas en la médula ósea o glóbulos sanguíneos periféricos con respecto a médula ósea o glóbulos sanguíneos periféricos cultivados en ausencia de receptor de citocina soluble. Dentro de una realización se proporciona el procedimiento como se describe anteriormente, en la que las células hematopoyéticas y las células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides.
Dentro de otra realización se proporciona el procedimiento como se describe anteriormente, en la que las células linfoides son macrófagos o células T.
Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de reducción de la inflamación inducida por IL-20 que comprende administrar a un mamífero con inflamación una cantidad de una composición de un anticuerpo como se desvela anteriormente suficiente para reducir la inflamación.
Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de supresión de una respuesta inflamatoria en un mamífero con inflamación que comprende: (1) determinar un nivel de proteína amiloide A sérica; (2) administrar una composición que comprende un anticuerpo como se desvela anteriormente en un vehículo farmacéutico aceptable; (3) determinar un nivel de administración posterior de proteína amiloide A sérica; (4) comparar el nivel de proteína amiloide A sérica en la etapa (1) con el nivel de proteína amiloide A sérica en la etapa (3), siendo una falta de aumento o una disminución en el nivel de proteína amiloide A sérica indicativo de la supresión de una respuesta inflamatoria. Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar un mamífero aquejado de una enfermedad inflamatoria en el que IL-20 desempeña una función, que comprende: administrar un antagonista de IL-20 al mamífero de forma que se reduzca la inflamación, en el que el antagonista se selecciona del grupo que está constituido por un anticuerpo o polipéptido de unión que se une específicamente a un polipéptido o fragmento de polipéptido de IL-20, IL-20RA o IL-20RB o es un polipéptido o fragmento de polipéptido de IL-20, IL-20RA o IL-20RB; y en el que se reduce la actividad inflamatoria de IL-20. Dentro de una realización se proporciona el procedimiento como se describe anteriormente, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica.
Dentro de otra realización se proporciona el procedimiento como se describe anteriormente, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica seleccionada del grupo que está constituido por: enfermedad inflamatoria del intestino; colitis ulcerosa; enfermedad de Crohn; artritis; y psoriasis.
Dentro de otra realización se proporciona el procedimiento como se describe anteriormente, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda. Dentro de otra realización se proporciona el procedimiento como se describe anteriormente, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda seleccionada del grupo que está constituido por: endotoxemia; septicemia; síndrome de choque tóxico; y enfermedad infecciosa.
Dentro de otra realización se proporciona el procedimiento como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo comprende además un radionúclido, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marca de péptido, partícula magnética, fármaco o toxina.
Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que comprende un anticuerpo monoclonal que se une a un epítope de IL-20 humana (SEQ ID Nº: 2), en el que el epítope comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que está constituido por: residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 60 (Ile) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 69 (Glu) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 81 (Cys) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 96 (Lys) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 42 (Ile) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 60 (Ile) a 69 (Glu) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 60 (Ile) a 81 (Cys) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 60 (Ile) a 96 (Lys) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 60 (Ile) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 69 (Glu) a 81 (Cys) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 69 (Glu) a 96 (Lys) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 69 (Glu) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 81 (Cys) a 96 (Lys) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 81 (Cys) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 2; residuos de aminoácidos 96 (Lys) a 102 (Asp) de SEQ ID Nº: 2, y en el que el anticuerpo reduce o neutraliza la actividad proinflamatoria de IL-20 humana (SEQ ID Nº: 2). Dentro de una realización se proporciona el anticuerpo como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo comprende además un radionúclido, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marca de péptido, partícula magnética, fármaco o toxina.
Dentro de otra realización se proporciona el anticuerpo como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo se selecciona del grupo que está constituido por: (a) un anticuerpo monoclonal murino, (b) un anticuerpo humanizado derivado de (a), (c) un fragmento de anticuerpo y (d) un anticuerpo monoclonal humano.
Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que comprende un anticuerpo monoclonal que se une a un epítope de IL-20RA humana (SEQ ID Nº: 14), en el que el epítope comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que está constituido por: residuos de aminoácidos 1 (Met) a 9 (Leu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 36 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 41 (Ala) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 58 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 63 (Gln) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 80 (Lys) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 94 (Tyr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 104 (Tyr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 120 (Cys) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 128 (Arg) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 161 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 187 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 224(Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 316 (Ile) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 323 (Ile) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 335 (Asp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 371 (Cys) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 384 (Gln) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 412 (Ala) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 462 (Gln) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 483 (Asp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 496 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 523 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 1 (Met) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 63(Gln) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 94 (Tyr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 128 (Arg) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 36 (Gly) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 63 (Gln) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 94 (Tyr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 128 (Arg) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 58 (Pro) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 94 (Tyr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 128 (Arg) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 80 (Lys) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 128 (Arg) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 120 (Cys) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 169 (Pro) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 161 (Trp) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 194 (Trp) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 187 (Asn) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 233 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 224 (Gly) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 323 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 316 (Ile) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 340 (Asn) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 354 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 335 (Asp) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 381 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 371 (Cys) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 397 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 384 (Gln) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 412 (Ala) a 418 (Glu) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 412 (Ala) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 412 (Ala) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 412 (Ala) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 412 (Ala) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 462 (Gln) a 476 (Ser) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 462 (Gln) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 462 (Gln) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 462 (Gln) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 483 (Asp) a 486 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 483 (Asp) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 483 (Asp) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 496 (Ser) a 511 (Gly) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 496 (Ser) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14; residuos de aminoácidos 523 (Glu) a 536 (Thr) de SEQ ID Nº: 14, y en el que el anticuerpo reduce o neutraliza la actividad proinflamatoria de IL-20 humana (SEQ ID Nº: 2). Dentro de una realización se proporciona el anticuerpo como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo comprende además un radionúclido, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marca de péptido, partícula magnética, fármaco o toxina.
Dentro de otra realización se proporciona el anticuerpo como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo se selecciona del grupo que está constituido por: (a) un anticuerpo monoclonal murino, (b) un anticuerpo humanizado derivado de (a), (c) un fragmento de anticuerpo y (d) un anticuerpo monoclonal humano.
Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que comprende un anticuerpo monoclonal que se une a un epítope de IL-20RB humana (SEQ ID Nº: 21), en el que el epítope comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que está constituido por: residuos de aminoácidos 70 (Tyr) a 74 (Tyr) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 70 (Tyr) a 101 (Asp) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 70 (Tyr) a 135 (Ser) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 70 (Tyr) a 178 (Glu) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 70 (Tyr) a 283 (Lys) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 92 (Thr) a 101 (Asp) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 92 (Thr) a 135 (Ser) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 92 (Thr) a 178 (Glu) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 92 (Thr) a 283 (Lys) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 130 (Pro) a 135 (Ser) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 130 (Pro) a 178 (Glu) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 130 (Pro) a 283 (Lys) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 171 (Arg) a 178 (Glu) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 171 (Arg) a 283 (Lys) de SEQ ID Nº: 21; residuos de aminoácidos 279 (Asn) a 283 (Lys) de SEQ ID Nº: 21, y en el que el anticuerpo reduce o neutraliza la actividad proinflamatoria de IL-20 humana (SEQ ID Nº: 2). Dentro de una realización se proporciona el anticuerpo como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo comprende además un radionúclido, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marca de péptido, partícula magnética, fármaco o toxina.
Dentro de otra realización se proporciona el anticuerpo como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo se selecciona del grupo que está constituido por: (a) un anticuerpo monoclonal murino, (b) un anticuerpo humanizado derivado de (a), (c) un fragmento de anticuerpo y (d) un anticuerpo monoclonal humano.
Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar una afección patológica en un sujeto asociada a actividad de IL-20 que comprende administrar una cantidad eficaz del anticuerpo como se desvela anteriormente, tratándose así dicha afección patológica. Dentro de una realización se proporciona el procedimiento como se describe anteriormente, en la que dicha afección patológica es una afección inflamatoria crónica.
Dentro de otra realización se proporciona el procedimiento como se describe anteriormente, en la que dicha afección inflamatoria crónica se selecciona del grupo que está constituido por: enfermedad inflamatoria del intestino; colitis ulcerosa; enfermedad de Crohn; artritis; y psoriasis. Dentro de otra realización se proporciona el procedimiento como se describe anteriormente, en la que dicha afección patológica es una afección inflamatoria aguda.
Dentro de otra realización se proporciona el procedimiento como se describe anteriormente, en la que dicha afección inflamatoria aguda se selecciona del grupo que está constituido por: endotoxemia; septicemia; síndrome de choque tóxico; y enfermedad infecciosa.
La invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitantes.
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Ejemplo 1 Clonación de IL-20 Clonación de IL-20 humana
Se esclareció la secuencia de longitud completa de IL-20x1 (la forma más larga - SEQ ID Nº: 1) y IL-20x2 (la forma más corta - SEQ ID Nº: 4) usando 3' RACE® y sometiendo los dos fragmentos generados a secuenciación (SEQ ID Nº: 30 y SEQ ID Nº: 31), luego cortando y empalmando artificialmente mediante un ordenador la secuencia EST mostrada en SEQ ID Nº: 32 con la secuencia de superposición a partir de los dos fragmentos 3' RACE.
Se diseñó un oligonucleótido, zc 15907 (SEQ ID Nº: 33), para el área justamente aguas arriba (5') de la metionina putativa para IL-20. Más aguas abajo se diseñó otro oligonucleótido, zc15906 (SEQ ID Nº: 34), para el área justamente aguas arriba del sitio de escisión de la secuencia señal. Estos oligonucleótidos se usaron en reacciones 3' RACE sobre ADNc Marathon de tráquea humana. El ZC15907 se usó en la reacción 3' RACE primaria y el zc15906 se usó en la reacción 3' RACE anidada. El ADNc MARATHON se preparó usando el kit de amplificación de ADNc Marathon (Clontech, Palo Alto, CA) según las instrucciones del fabricante partiendo de ARNm de tráquea humana comprado de Clontech.
Las reacciones de PCR se ejecutaron según las instrucciones del fabricante en el kit de amplificación de ADNc Marathon con alguna modificación en los parámetros de ciclado térmico. Los parámetros de ciclado usados en la reacción de PCR primaria fueron:
94ºC 1 min 30 s 1x
94ºC 15 s 68ºC 1 min 30x
72ºC 7 min 1x
Los parámetros de ciclado usados en la reacción de PCR anidada fueron: 94ºC 1 min 30 s 1x, 94ºC 15 s 68ºC 1 min 20 s, 30X 72ºC 7 min 1x.
Los productos resultantes se ejecutaron en un gel de agarosa al 1,2% (agarosa de Gibco) y se vieron dos bandas principales, separadas aproximadamente 80 pb. Las bandas se cortaron y se purificaron en gel usando la resina QIAEX^{TM} (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Entonces, estos fragmentos se sometieron a secuenciación, permitiendo que se percibiera la secuencia de longitud completa de IL-20.
Clonación de IL-20 murina
Cebadores de PCR: conjunto de cebadores 5' MARATHON RACE^{TM} (Clontech, Palo Alto, CA) de SEQ ID Nº: 35 unido al adaptador de AP1 MARATHON^{TM}, anidado con SEQ ID Nº: 36 unida al adaptador de AP2 MARATHON^{TM}, con conjunto de cebadores 3' MARATHON RACE^{TM} de SEQ ID Nº: 37 unido al adaptador de AP1 MARATHON RACE^{TM}, anidado con SEQ ID Nº: 38 unida al adaptador de AP2 MARATHON RACE^{TM} y la 5' y 3' RACE se realizó sobre ADNc MARATHON RACE^{TM} de piel de ratón. Varios fragmentos de estas reacciones se purificaron en gel y se secuenciaron, permitiendo la aclaración de la secuencia de codificación de longitud completa de la IL-20 de ratón, más alguna secuencia 5' y 3' UTR. Se descubrieron dos variantes de IL-20 murinas, concretamente SEQ ID Nº: 39 y 40 y SEQ ID Nº: 41 y 42. Los clones se amplificaron por PCR usando los cebadores SEQ ID Nº: 43 y 44.
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Ejemplo 2 Clonación de IL-20RA Clonación de IL-20RA humana
Se identificó la marca de secuencia expresada (EST) 277139 (SEQ ID Nº: 45). El clon de ADNc (nº ID 50416) se obtuvo del Laboratorio nacional Lawrence Livermore del consorcio IMAGE por Genome Systems, Inc. El ADNc se suministró como una barra de agar que contenía E. coli transfectada con un plásmido que tenía el ADNc de interés. La E. coli se cultivó en línea en una placa de agar. El plásmido se designó pSL7139. Se secuenció el inserto de ADNc en el plásmido pSL7139. Se determinó que el inserto tenía 1231 pb de longitud, pero no era una secuencia de longitud completa.
Se preparó un molde de ADNc de testículo humano usando un kit de amplificación de ADNc MARATHON^{TM} (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) según las instrucciones del proveedor. Se usó una reacción 5' RACE para obtener un ADNc de longitud completa. La reacción RACE se llevó a cabo en dos reacciones empleando dos conjuntos de cebadores. La reacción I (nido externo), usando los cebadores ZC11,107 (SEQ ID Nº: 46) y AP-1 (SEQ ID Nº: 47) (Clontech Laboratories), se ejecutó durante 35 ciclos a 98ºC durante 20 segundos, 45ºC durante 20 segundos; 68º durante 4 minutos y una extensión de tiempo final de 10 minutos a 68ºC. Un \mul de una dilución 1:100 del producto de reacción se usó como molde en la reacción II (nido interno). Los cebadores fueron ZC11,108 (SEQ ID Nº: 48) y AP-2 (SEQ ID Nº: 49) (Clontech Laboratories). La reacción se ejecutó a 98ºC durante 30 segundos, y 30 ciclos estando comprendido cada ciclo por 98ºC durante 28 segundos; 43ºC durante 20 segundos; y 68ºC durante 3,5 minutos con una extensión final a 68ºC durante 10 minutos.
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El producto de la reacción RACE de nido interno se subclonó usando un kit PCR-SCRIPT^{TM} (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) para preparar el plásmido pSLR7-1. El análisis de secuencias de este plásmido indicó que la secuencia generada por 5' RACE extendió la secuencia de pSL7139 555 pb.
El ADNc de longitud completa se obtuvo cribando una biblioteca de ADNc de testículo humano \lambdaZAP® II usando una sonda que fue generada por los cebadores de PCR ZC11,526 (SEQ ID Nº: 50) y ZC11,108 (SEQ ID Nº: 48) y pSLR7-1 como molde y luego se reamplificó. La sonda resultante se purificó mediante recuperación en electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión y se marcó con ^{32}P-\alpha-dCTP usando un kit de marcación MEGAPRIME^{TM} (Amersham Corp., Arlington, Heights, IL). La sonda marcada se purificó sobre una columna de empuje (columna de purificación de sondas NUCTRAP®; Stratagene Cloning Systems).
La reacción del ADNc de la primera cadena contuvo 15 \mul de poli (A)^{+} ARNm seleccionado dos veces con poli d(T) de testículo humano (Clontech Laboratories) a una concentración de 1,0 \mug/\mul, y 3 \mul de 20 pmol/\mul del cebador de la primera cadena ZC6091 (SEQ ID Nº: 51) que contenía un sitio de restricción Xho I. La mezcla se calentó a 70ºC durante 4 minutos y se enfrió enfriando sobre hielo. La síntesis del ADNc de la primera cadena se inició mediante la adición de 12 \mul de tampón de la primera cadena (5x tampón SUPERSCRIPT^{TM}; Life Technologies, Gaithersburgh, MD), 6 \mul de ditiotreitol 100 mM, 3 \mul de disolución de trifosfato de desoxinucleótido que contenía 10 mM de cada uno de dTTP, dATP, dGTP y 5-metil-dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) a la mezcla de ARN-cebador. La mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante 2 minutos, seguido por adición de 15 \mul de 200 U/\mul de transcriptasa inversa Rnasa H^{-} (SUPERSCRIPT II^{TM}; Life Technologies). La eficiencia de la síntesis de la primera cadena se analizó en una reacción paralela mediante la adición de 5 \muCi de ^{32}P-\alphadCTP a una alícuota de 5 \mul de una de las mezclas de reacción para marcar la reacción para el análisis. Las reacciones se incubaron a 37ºC durante 10 minutos, 45ºC durante 1 hora, luego se incubaron a 50ºC durante 10 minutos. El ^{32}P-\alphadCTP sin incorporar en la reacción marcada y los nucleótidos y cebadores sin incorporar en las reacciones de la primera cadena sin marcar se eliminaron por cromatografía sobre una columna de filtración en gel de tamaño de poro 400 (Clontech Laboratories). La longitud del ADNc de la primera cadena marcado se determinó por electroforesis en gel de agarosa.
La reacción de la segunda cadena contuvo 120 \mul del ADNc de la primera cadena sin marcar, 36 \mul de 5x tampón polimerasa I (Tris 125 mM: HCl, pH 7,5, KCl 500 mM, MgCl_{2} 25 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 50 mM)), 2,4 \mul de ditiotreitol 100 mM, 3,6 \mul de una disolución que contenía 10 mM de cada uno de desoxinucleótido trifosfato, 6 \mul de \beta-NAD 5 mM, 3,6 \mul de 3 U/\mul de ADN ligasa de E. coli (New England Biolabs), 9 \mul de 10 U/\mul de ADN polimerasa I de E. coli (New England Biolabs) y 1,8 \mul de 2 U/\mul de RNasa H (Life Technologies). Una alícuota de 10 \mul de una de las reacciones de síntesis de la segunda cadena se marcó mediante la adición de 10 \muCi de ^{32}P-\alphadCTP para monitorizar la eficiencia de la síntesis de la segunda cadena. Las reacciones se incubaron a 16ºC durante dos horas, seguido por la adición de 15 \mul de ADN polimerasa T4 (10 U/\mul, Boerhinger Mannheim, Indianápolis, IN) y se incubaron durante 5 minutos adicionales a 16ºC. La ^{32}P-\alphadCTP sin incorporar en la reacción marcada se eliminó por cromatografía a través de una filtración en gel de tamaño de poro 400 (Clontech Laboratories) antes del análisis por electroforesis en gel de agarosa. La reacción de la segunda cadena sin marcar se terminó mediante la adición de 20 \mul de EDTA 0,5 M y la extracción con fenol/cloroformo y cloroformo seguido por la precipitación en etanol en presencia de acetato de amonio 2,5 M y 4 \mug de vehículo de glicógeno. El rendimiento de ADNc se estimó que era aproximadamente 3 \mug a partir del molde de ARNm de partida de 15 \mug.
Los adaptadores Eco RI se ligaron sobre los extremos 5' del ADNc descrito anteriormente para permitir la clonación en un vector de expresión. Una alícuota de 10 \mul de ADNc (aproximadamente 1,5 \mug) y 5 \mul de 65 pmol/\mul de adaptador Eco RI (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) se mezclaron con 2 \mul de 10x tampón ligasa (Tris-HCl 660 mM, pH 7,5, MgCh 100 mM), 2 \mul de ATP 10 mM y 1 \mul de 15 U/\mul de ADN ligasa T4 (Promega Corp., Madison, WI). La reacción se incubó 2 horas a 5ºC, dos horas a 7,5ºC, 2 horas a 10ºC, y 10 horas a 12,5ºC. La reacción se terminó mediante incubación a 70ºC durante 20 minutos.
Para facilitar la clonación direccional del ADNc en un vector de expresión, el ADNc se digirió con Xho I produciendo un ADNc que tenía un extremo cohesivo Eco RI en 5' y un extremo cohesivo Xho en 3'. El sitio de restricción Xho I en el extremo 3' del ADNc se había introducido previamente usando el cebador ZC6091 (SEQ ID Nº: 51). La digestión con enzimas de restricción se llevó a cabo en una mezcla de reacción que contenía 20 \mul de ADNc como se describe anteriormente, 10 \mul de 10x H Buffer Xho I (Boehringer Mannheim), 69 \mul de H_{2}O y 1,0 \mul de 40 U/\mul de Xho I (Boehringer Mannheim). La digestión se llevó a cabo a 37ºC durante 40 minutos. La reacción se terminó mediante incubación a 70ºC durante 10 minutos y cromatografía a través de una columna de filtración en gel de tamaño de poro 400 (Clontech Laboratories).
El ADNc se precipitó en etanol, se lavó con etanol al 70%, se secó al aire y se resuspendió en 14 \mul de agua, 2 \mul de tampón ligasa (Promega Corp., Madison, WI), 2 \mul de polinucleótido cinasa T4 (10 U/\mul, Life Technologies). Tras la incubación a 37ºC durante 30 minutos, el ADNc se calentó hasta 65ºC durante 5 minutos, se enfrió sobre hielo y se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa al 0,8% de bajo punto de fusión. Los adaptadores contaminantes y el ADNc inferior a 0,6 kb de longitud se suprimieron del gel. Los electrodos se invirtieron y el ADNc se sometió a electroforesis hasta que se concentró próximo al origen del carril. El área del gel que contenía el ADNc concentrado se suprimió y se colocó en un tubo de microcentrífuga, y se determinó el volumen aproximado del trozo de gel. Al tubo se añadieron una alícuota de agua de aproximadamente tres veces el volumen del trozo de gel (300 \mul) y 35 \mul de 10x tampón \beta-agarosa I (New England Biolabs) y la agarosa se fundió mediante calentamiento hasta 65ºC durante 15 minutos. Tras el equilibrado de la muestra hasta 45ºC, se añadieron 3 \mul de 1 U/\mul de \beta-agarosa I (New England Biolabs) y la mezcla se incubó durante 60 minutos a 45ºC para digerir la agarosa. Después de la incubación, a la muestra se añadieron 40 \mul de acetato de Na 3 M y la mezcla se incubó sobre hielo durante 15 minutos. La muestra se centrifugó a 14.000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente para eliminar la agarosa sin digerir. El ADNc se precipitó en metanol, se lavó en etanol al 70%, se secó al aire y se resuspendió en 10 \mul de agua.
El ADNc resultante se clonó en el vector de fago lambda \lambdaZap^{TM} II (Stratagene Cloning Systems) que previamente se había digerido con Eco RI y Xho I y se desfosforiló. La ligadura del ADNc al vector \lambdaZap^{TM} II se llevó a cabo en una mezcla de reacción que contenía 1,0 \mul de vector preparado, 1,0 \mul de ADNc de testículo humano, 1,0 \mul de 10X tampón ligasa (Promega Corp.), 1,0 \mul de ATP 10 mM, 5 \mul de agua y 1,0 \mul de ADN ligasa T4 a 15 unidades/ml (Promega Corp.). La mezcla de ligadura se incubó a 5º-15ºC durante la noche en un gradiente de temperatura. Después de la incubación, la mezcla de ligadura se empaquetó en el fago usando un extracto de empaquetamiento in vitro (extracto de empaquetamiento Gigapack^{TM} III Gold; Stratagene Cloning Systems) y la biblioteca resultante se valoró según las especificaciones del fabricante.
La biblioteca \lambdaZAP^{TM} II de testículo humano se usó para infectar células huésped de E. coli (cepa XL1-Blue MRF' (Stratagene Cloning Systems)) y 1,5 x 10^{6} unidades formadoras de placa (ufp) se sembraron en placa sobre placas NZY de 150 mm a una densidad de aproximadamente 50.000 ufp/placa. Las placas inoculadas se incubaron durante la noche a 37ºC. Se prepararon elevaciones de placas de filtración usando membranas de nailon (Hybond^{TM}-N; Amersham Corp., Arlington Heights, IL), según los procedimientos proporcionados por el fabricante. Los filtros se procesaron mediante desnaturalización en disolución que contenía NaCl 1,5 M y NaOH 0,5 M durante 6 minutos a temperatura ambiente. Los filtros se transfirieron brevemente sobre papel de filtro para eliminar el exceso de disolución de desnaturalización, seguido por neutralización durante 6 minutos en Tris-HCl 1 M, pH 7,5, y NaCl 1,5 M. El ADN de fago se fijó sobre los filtros con 1.200 \muJoules de energía UV en un reticulador de UV (Stratalinker^{TM}; Stratagene Cloning Systems). Después de la fijación, los filtros se prelavaron primero en una disolución acuosa que contenía 0,25X citrato de sodio estándar (SSC), dodecilsulfato de sodio al 0,25% (SDS) y EDTA 1 mm para eliminar el residuo celular y luego se prehibridaron en disolución de hibridación (5X SSC, 5X disolución de Denhardt, SDS al 0,2% y DTA 1 mM). Se añadió ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado por calor a una concentración final de 100 \mug/ml. Los filtros se prehibridaron a 65ºC durante la noche.
Se preparó una sonda como un producto de PCR usando cebadores de oligonucleótidos diseñados para amplificar la región de codificación de IL-20RA humana. Se preparó una mezcla de reacción de PCR que contenía 2 \mul de ZC11526 (SEQ ID Nº: 50), 2 \mul de ZC11,108 (SEQ ID Nº: 48), 1 \mul de un cultivo bacteriano durante la noche de pSLR7-1, 1 \mul de dNTP 10 mM, 10 \mul de 10X tampón KlenTaq (Clontech Laboratories), 82 \mul de agua y 2 \mul de ADN polimerasa KlenTaq (Clontech laboratories). La reacción de PCR se ejecutó del siguiente modo: 94ºC durante 1 minuto; 30 ciclos de 95ºC durante 20 segundos, 43ºC durante 20 segundos, 68ºC durante 1 minuto; luego se mantuvo a 68ºC durante 10 minutos. El producto de PCR se reamplificó y se purificó en gel sobre un gel de agarosa al 8% de bajo punto de fusión.
Se radiomarcaron cincuenta nanogramos de producto de PCR con ^{32}P-\alpha-dCTP mediante cebado aleatorio usando el sistema de marcado de ADN MEGAPRIME^{TM} (Amersham) según las especificaciones del fabricante. La disolución de prehibridación se sustituyó por disolución de hibridación recién preparada que contenía 1,4 x 10^{6} cpm/ml de sonda marcada y se dejó hibridarse durante 64 horas a 60ºC. Después de la hibridación, la disolución de hibridación se eliminó y los filtros se aclararon en una disolución de lavado que contenía 0,25X SSC, SDS al 0,25% y EDTA 1 mM a 65ºC. Los filtros se colocaron sobre película de autorradiografía y se expusieron a -70ºC con pantallas intensificadoras durante 72 horas.
El examen de las autorradiografías reveló múltiples regiones que se hibridaron con la sonda marcada. Se escogieron tapones de agar de 12 regiones para la purificación. Cada tapón de agar se empapó 2 horas en 0,5 ml de disolución SM que contenía 25 ml de NaCl 4 M, 10 ml de MgSO_{4} 1 M, 25 ml de Tris HCl 2 M, 5 ml de gelatina al 2% y 935 ml de H_{2}O y 10% (v/v) de cloroformo (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{a} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Después de la incubación, los fagos de cada tapón se diluyeron 1:1000 en SM. Se sembraron alícuotas de 50 \mul en placa sobre placas de 100 mm que contenían 300 \mul de células XL-1 Blue MRF' de E. coli. Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC y se prepararon elevaciones de filtros, se prehibridaron durante la noche, se hibridaron durante la noche con una disolución de hibridación que contenía 1,1 x 10^{6} cpm/ml de sonda marcada, se lavaron y se autorradiografiaron. El examen de las autorradiografías resultantes reveló 10 señales positivas. Las placas positivas se sometieron a una ronda adicional de purificación.
Los plásmidos se eliminaron usando un sistema ExASSIST/SOLR^{TM} (Stratagene Cloning Systems) según las especificaciones del fabricante. Estos insertos de plásmido se amplificaron por PCR para la determinación del tamaño. Se secuenció un clon, designado pSLR7-2, y se determinó que tenía un inserto de 3,532 pb de tamaño.
Clonación de IL-20RA murina
Se generó una sonda de hibridación de especies cruzadas que contenía el fragmento de ADNc de longitud completa que codifica la IL-20RA humana. Se realizaron una transferencia de Southern de ADN genómico de ratón y transferencias de Northern de ARN de ratón para demostrar que el ADNc de IL-20RA humana podría hibridarse específicamente a secuencias de ratón. Los resultados de la transferencia de Northern indicaron que el ARN de IL-20RA de ratón estaba presente en embrión de ratón el día 15 y 17, además de corazón, cerebro, pulmón, hígado, riñón, testículos, bazo, timo, hígado, estómago e intestino delgado.
La sonda de hibridación de ADN de longitud completa de IL-20RA humana se usó para cribar una biblioteca genómica de ratón. La biblioteca, que se obtuvo de Clontech (Palo Alto, CA), se generó a partir de una digestión parcial con MboI de ADN genómico de ratón y se clonó en el sitio BamHI del bacteriófago lambda EMBL3 SP6/T7. El bacteriófago positivo se purificó en placa y el ADN de bacteriófago se preparó usando el sistema de purificación de ADN Promega's Wizard Lambda Preps. Se generaron dos fragmentos de enzima de restricción genómica, un fragmento EcoRI de 5,7 kb y un fragmento SacI de 8,0 kb, a partir del bacteriófago positivo y se subclonaron en pBluescript. El análisis de secuencias de ADN reveló la presencia de 3 exones del ortólogo de ratón para IL-20RA humana.
Se diseñaron cebadores de PCR de 5' UTR (SEQ ID Nº: 52) y 3' UTR (SEQ ID Nº: 53) para generar una secuencia de IL-20RA de ratón de longitud completa mediante amplificación por PCR. Se usó embrión de ratón de 15 días más ADNc de 17 días como molde para la amplificación por PCR. Los productos de PCR se subclonaron y se secuenciaron para la confirmación. Las secuencias de ratón son SEQ ID Nº: 54 y 55. El dominio extracelular maduro está compuesto por SEQ ID Nº: 56.
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Ejemplo 3 Clonación de IL-20RB humana
Se diseñaron cebadores de PCR basándose en la secuencia de la solicitud de patente internacional nº PCT/US99/
03735 presentada el 8 de marzo de 1999. La SEQ ID Nº: 57 contiene el codón ATG (Met1) con un sitio de restricción EcoRI, la SEQ ID Nº: 58 contiene el codón de terminación (TAG) con un sitio de restricción XhoI. La amplificación por PCR se llevó a cabo usando un ADN de biblioteca de ADNc de queratinocito humano (HaCaT) como molde y la SEQ ID Nº: 59 y SEQ ID Nº: 58 como cebadores. La reacción de PCR se realizó del siguiente modo: incubación a 94ºC durante 1 min seguido por 30 ciclos de 94ºC durante 30 s y 68ºC durante 2 min, después 68ºC adicionales durante 4 min, la reacción se almacenó a 4ºC. Los productos de PCR se ejecutaron en un gel de agarosa al 1% y se observó una banda de ADN de 1 kb. Los productos de PCR se cortaron del gel y el ADN se purificó usando un kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen). El ADN purificado se digirió con EcoRI y XhoI y se clonó en un vector pZP que se llamó pZP7N. Un plásmido pZP es un vector de expresión de mamífero que contiene un casete de expresión que tiene el promotor de metalotioneína-1 de ratón, péptido conductor tPA humano, múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias de codificación, una marca Glu-Glu; y un terminador de hormona de crecimiento humano. El plásmido también tiene un origen de E. coli de replicación, una unidad de expresión de marcador de selección mamífero que tiene un promotor SV40, un potenciador y un origen de replicación, además de un gen DHFR, y el terminador SV40. Se secuenciaron varios clones IL-20RB-pZP7N. Todos contienen tres mutaciones no conservativas en comparación con la secuencia de IL-20RB en el documento PCT/US99/03735: (secuencia IL-20RB-pZP7N), 146 Pro (CCC) - - Thr (ACC), 148 His (CAT) - - Asp (GAT) y 171 Thr (ACG) - - Arg (AGG).
Para verificar las tres sustituciones en el clon IL-20RB-pZP7N, se llevó a cabo la amplificación por PCR usando tres fuentes de ADNc diferentes - - ADNc Marathon de piel fetal, ADN de biblioteca de ADNc HaCaT y ADN de biblioteca de ADNc de músculo liso de la próstata - - como moldes. Los productos de PCR se purificaron en gel y se secuenciaron. La secuencia de cada uno de los tres productos de PCR era coherente con la del clon 1L-20RB-pZP7N. La IL-20RB es SEQ ID Nº: 20 y 21, y el dominio extracelular maduro es SEQ ID Nº: 59.
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Ejemplo 4 Heterotetrámero de fusión de receptor de IL-20RA/RB-Ig
El vector de expresión pEZE3 se usó para expresar la proteína de fusión recombinante de receptor de IL-20-Ig. El plásmido pEZE3 se deriva de pDC312. El pDC312 se obtuvo mediante licencia de Immunex Corporation. Los plásmidos pDC312 y pEZE3 contienen un segmento EASE como se describe en el documento WO 97/25420. La presencia del segmento EASE en un vector de expresión puede mejorar la expresión de proteínas recombinantes de dos a ocho veces en conjuntos de células estables.
El plásmido pEZE3 es un vector de expresión tricistrónico que puede usarse para expresar hasta tres proteínas diferentes en células de mamífero, preferentemente células de ovario de hámster chino (CHO). La unidad de expresión de pEZE3 contiene el potenciador/promotor de citomegalovirus (CMV), la secuencia conductora tripartita del adenovirus, un sitio de clonación múltiple para la inserción de la región de codificación para la primera proteína recombinante, el sitio interno de entrada al ribosoma de poliovirus tipo 2, un segundo sitio de clonación múltiple para la inserción de la región de codificación para la segunda proteína recombinante, un sitio interno de entrada al ribosoma del virus de la encefalomiocarditis, un segmento de codificación para la dihidrofolato reductasa de ratón y el terminador de la transcripción SV40. Además, pEZE3 contiene un origen de E. coli de replicación y el gen de beta-lactamasa bacteriano.
La proteína de fusión de receptor de IL-20-Ig es un heterotetrámero ligado por disulfuro que está constituido por dos cadenas del dominio extracelular de la IL-20RB humana fusionada a la región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana de tipo salvaje y dos cadenas del dominio extracelular de la proteína de IL-20RA humana fusionadas a una región constante de inmunoglobulina gamma 1 humana mutada. La región constante de inmunoglobulina gamma 1 humana contiene sustituciones de aminoácidos para reducir la unión de Fc\gammaRI y la fijación del complemento C1q.
El constructo de fusión de dominio extracelular de IL-20RB humana/región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana se generó mediante PCR de superposición. El segmento que codifica IL-20RB está constituido por los aminoácidos 1 a 230 de SEQ ID Nº: 20. El molde usado para la amplificación por PCR del segmento de IL-20R se generó por el constructo de expresión de región constante de cadena ligera kappa humana de IL-20RB como se describe más adelante. Se usaron los cebadores de oligonucleótidos SEQ ID Nº: 60 y SEQ ID Nº: 61 para amplificar el segmento de IL-20RB. Se usó toda la región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana de tipo salvaje. El molde usado para la amplificación por PCR del segmento de la región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana de tipo salvaje se generó por el constructo de expresión de la región constante de cadena ligera kappa humana de IL-20RB como se describe en Ejemplo 12. Se usaron los cebadores de oligonucleótidos SEQ ID Nº: 62 y SEQ ID Nº: 63 para amplificar la región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana de tipo salvaje. Los dos dominios que codificaban proteínas se ligaron mediante PCR de superposición usando los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 60 y SEQ ID Nº: 63. Un conector de péptidos (Gly_{4}Ser)_{3} (SEQ ID Nº: 64) se introdujo entre los dos dominios de proteínas. El conector de péptidos (Gly_{4}Ser)_{3} se codificó en los cebadores de PCR SEQ ID Nº: 61 y SEQ ID Nº: 62. El constructo de fusión de dominio extracelular de IL-20RB/región constante de cadena ligera kappa resultante se muestra por la SEQ ID Nº: 65 y 66. El polipéptido maduro predicho menos la secuencia señal es SEQ ID Nº: 67. La parte del dominio extracelular de IL-20RB que se usó estaba compuesta en realidad por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 26. La secuenciación del extremo N produjo la secuencia de aminoácidos predicha.
El constructo de fusión de dominio extracelular de IL-20RA humana/región constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma 1 humana se generó mediante PCR de superposición de cuatro fragmentos de ADN separados, generado cada uno por reacciones de amplificación por PCR separadas. El primer fragmento contuvo una secuencia señal de tPA optimizada (activador de plasminógeno tisular). La secuencia señal de tPA se amplificó usando cebadores de oligonucleótidos SEQ ID Nº: 68 y SEQ ID Nº: 69 usando un vector de expresión previamente generado en la empresa como molde. El segundo fragmento contuvo la región de codificación del dominio extracelular de IL-20RA que estaba constituida por los aminoácidos 30 a 243 de SEQ ID Nº: 14. Se usaron los cebadores de oligonucleótidos SEQ ID Nº: 70 y SEQ ID Nº: 71 para amplificar este segmento de IL-20RA usando un clon previamente generado de IL-20RA como molde.
La región constante de cadena pesada de gamma 1 humana se generó a partir de 2 segmentos. El primer segmento que contenía el dominio C_{H}1 se amplificó usando cebadores de oligonucleótidos SEQ ID Nº: 72 y SEQ ID Nº: 73 usando un clon de la región constante de cadena pesada de gamma 1 humana de tipo salvaje como molde. El segundo segmento que contenía los dominios bisagra restantes, C_{H}2 y C_{H}3, de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma 1 humana se generó mediante amplificación por PCR usando los cebadores de oligonucleótidos SEQ ID Nº: 74 y SEQ ID Nº: 75. El molde usado para esta amplificación por PCR fue de un constructo Fc de gamma 1 humana previamente generado que contenía codones para las sustituciones de aminoácidos para reducir la unión de Fc\gammaRI y la fijación del complemento C1q.
Los dominios de codificación de cuatro proteínas se ligaron mediante PCR de superposición usando los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 68 y SEQ ID Nº: 75. Un conector de péptidos (Gly_{4}Ser)_{3} se introdujo entre los dominios de proteínas de IL-20RA y CH1. El conector de péptidos (Gly_{4}Ser)_{3} se codificó en los cebadores de PCR SEQ ID Nº: 71 y SEQ ID Nº: 72. La proteína de fusión de dominio extracelular de IL-20RA/región constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma 1 humana y la secuencia de ADN se muestran en SEQ ID Nº: 76 y 77. La secuencia de polipéptidos madura predicha, menos la secuencia señal, es SEQ ID Nº: 78. La parte del dominio extracelular de IL-20RA que se usó estaba compuesta en realidad por SEQ ID Nº: 79.
El segmento de codificación de la fusión de dominio extracelular de IL-20RB/región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana se clonó en el segundo MCS, mientras que el segmento de codificación de la fusión de dominio extracelular de IL-20RA humana/región constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma 1 humana se clonó en el primer MCS de pEZE3. El plásmido se usó para transfectar células CHO. Las células se seleccionaron en medio sin hipoxantina o timidina y el transgén se amplificó usando metotrexato. La presencia de proteína se ensayó mediante transferencia de Western usando anticuerpos anti-región constante de cadena pesada de gamma 1 humana y anti-cadena ligera kappa humana. La secuenciación del extremo N reveló que el conductor tPA optimizado no se había escindido completamente. La masa observada indicó que el primer residuo de la secuencia de polipéptidos era ácido piroglutámico, y la secuencia del extremo N parece ser piroEEIHAELRRFRRVPCVSGG (SEQ ID Nº: 80), siendo la parte subrayada restos del conductor tPA.
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Ejemplo 5 Construcción de un heterodímero de receptor de IL-20
Se construyó un vector que expresaba un heterodímero de IL-20RA humana/IL-20B humana secretada. En este constructo, el dominio extracelular de IL-20RA humana se fusionó a la cadena pesada de IgG gamma 1 (IgG\gamma1), mientras que la parte extracelular de IL-20RB se fusionó a cadena ligera kappa humana (cadena ligera \kappa humana).
Construcción de vectores de fusión de IgG gamma 1 y de cadena ligera \kappa humana
La cadena pesada de IgG\gamma1 se clonó en el vector de expresión mamífero Zem229R (nº de depósito de ATCC 69447) de forma que cualquier parte extracelular de un receptor que tuviera un sitio 5' EcoRI y 3' NheI pudiera clonarse produciendo una fusión de dominio extracelular del extremo N-IgG\gamma1 del extremo C. El fragmento de IgG\gamma1 usado en este constructo se preparó usando PCR para aislar la secuencia de IgG\gamma1 de una biblioteca de ADNc de hígado fetal humano de Clontech como molde. Se ejecutó una reacción de PCR usando oligonucleótidos (SEQ ID Nº: 61) ZC11,450 y (SEQ ID Nº: 62) ZC11,443 del siguiente modo: 40 ciclos de 94ºC durante 60 s, 53ºC durante 60 s y 72ºC durante 120 s; y 72ºC durante 7 min. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa y se purificaron usando un kit de extracción en gel QiaQuick^{TM} (Qiagen). El fragmento de ADN aislado de 990 pb se digirió con Mlul y EcoRI (Boerhinger-Mannheim), se precipitó en etanol y se ligó con oligonucleótidos (SEQ ID Nº: 63) ZC11,440 y (SEQ ID Nº: 68) ZC11,441, que comprenden un conector de Mlul/EcoRI, en Zem229R previamente digerido con Mlul y EcoRI usando técnicas de biología molecular estándar desveladas en este documento. Este vector de clonación genérico se llamó el vector nº 76 IgG gamma 1 humana w/ Ch1 nº 786 Zem229R (vector nº76). La secuencia de polinucleótidos del dominio extracelular de IL-20RA humana fusionada a la cadena pesada de IgG gamma 1 se muestra en SEQ ID Nº: 69 y la secuencia de polipéptidos correspondiente se muestra en SEQ ID Nº: 70, cuya secuencia madura es SEQ ID Nº: 81.
La cadena ligera \kappa humana se clonó en el vector de expresión de mamífero Zem228R (nº de depósito ATCC 69446) de forma que cualquier parte extracelular de un receptor que tuviera un sitio 5' EcoRI y un sitio 3' KpnI pudiera clonarse produciendo una fusión de dominio extracelular del extremo N-cadena ligera \kappa humana del extremo C. El fragmento de cadena ligera \kappa humana usado en este constructo se preparó usando PCR para aislar la secuencia de cadena ligera \kappa humana de la misma biblioteca de ADNc de hígado fetal humano Clontech usada anteriormente. Se ejecutó una reacción de PCR usando oligonucleótidos (SEQ ID Nº: 71) ZC11,501 y (SEQ ID Nº: 72) ZC11,451 bajo la condición descrita anteriormente. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa y se purificaron usando un kit de extracción en gel QiaQuick^{TM} (Qiagen). El fragmento de ADN aislado de 315 pb se digirió con Mlul y EcoRI (Boerhinger-Mannheim), se precipitó en etanol y se ligó con el conector Mlul/EcoRI descrito anteriormente en el Zem228R previamente digerido con Mlul y EcoRI usando técnicas de biología molecular estándar desveladas en este documento. Este vector de clonación genérico se llamó el vector nº 77 \kappa ligera humana nº 774 Zem228R (vector nº 77). La secuencia de polinucleótidos de la parte extracelular de IL-20RB fusionada a la cadena ligera kappa humana se muestra en SEQ ID Nº: 73 y la secuencia de polipéptidos correspondiente se muestra en SEQ ID Nº: 74, cuya secuencia madura es SEQ ID Nº: 82.
Inserción de dominios extracelulares de IL-20RA y IL-20RB en constructos de vectores de fusión
Usando los vectores de construcción anteriores, se preparó un constructo que tenía IL-20RA humana fusionada a IgG\gamma1. Esta construcción se hizo mediante PCR para obtener el receptor de IL-20RA humana a partir del vector nº 102 de IL-20RA humana/IgG con oligonucleótidos (SEQ ID Nº: 75) ZC12,909 y (SEQ ID Nº: 83) ZC26,564 en condiciones descritas del siguiente modo: 30 ciclos de 94ºC durante 60 s, 57ºC durante 60 s y 72ºC durante 120 s; y 72ºC durante 7 min. El producto de PCR resultante se digirió con EcoRI y NheI, se purificó en gel, como se describe en este documento, y se ligó en un vector nº 76 previamente digerido con EcoRI y NheI y purificado por bandas (anteriormente). El vector resultante se secuenció para confirmar que la fusión de IL-20R\alpha humana/IgG gamma 1 (IL-20RA humana/IgG de Ch1) era correcta. El vector Zem229R de IL-20RA humana/IgG gamma 1 de Ch1 nº 1825 se llamó el vector nº 195.
También se construyó un constructo separado que tenía IL-20RB fusionada a la cadena ligera \kappa. La construcción de IL-20RB/cadena ligera \kappa humana se realizó como antes mediante PRC a partir de DR1/7N-4 con los oligonucleótidos (SEQ ID Nº: 84) ZC26,602 y (SEQ ID Nº: 85) ZC26,599 digiriendo la banda resultante con EcoRI y KpnI y luego ligando este producto en un vector nº 77 previamente digerido con EcoRI y KpnI y purificado por bandas (anteriormente). El vector resultante se secuenció para confirmar que la fusión de IL-20RB/cadena ligera \kappa humana (IL-20RB/\kappa ligera) era correcta. Este vector Zem228R de IL-20RB//\kappa ligera nº 1833 se llamó el vector nº 194.
Coexpresión de los receptores de IL-20RA humana y IL-20RB humana
Se cotransfectaron aproximadamente 16 \mug de cada uno de los vectores nº 194 y nº 195, anteriormente, en células BHK-570 (nº de ATCC CRL-10314) usando el reactivo LipofectaminePlus^{TM} (Gibco/BRL) según las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se seleccionaron durante 10 días en DMEM + SBF al 5% (Gibco/BRL) que contenía 1 \muM de metotrexato (MTX) (Sigma, St. Louis, MO) y 0,5 mg/ml de G418 (Gibco/BRL) durante 10 días. El conjunto resultante de tranfectantes se seleccionó de nuevo en MTX 10 \muM y 0,5 mg/ml de G418 durante 10 días.
El conjunto resultante de células doblemente seleccionadas se usó para generar proteína. Se usaron tres factorías (Nunc, Dinamarca) de este conjunto para generar 8 l de medio acondicionado sin suero. Este medio acondicionado se pasó por un columna de 1 ml de proteína A y se eluyó en (10) fracciones de 750 microlitros. Se recogieron 4 de estas fracciones que se encontró que tenían la mayor concentración y se dializaron (PM de corte 10 kD) contra PBS. Finalmente, el material dializado se analizó por BCA (Pierce) y se encontró que tenía una concentración de 317 \mug/ml. De esta purificación de 8 l se obtuvieron un total de 951 \mug.
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Ejemplo 6 Unión de IL-20 al heterodímero de IL-20RB/IL-20RA
Se usó un ensayo de unión basado en células para verificar que la IL-20 se une al heterodímero de IL-20RA-IL-20RB. Se transfectaron transitoriamente vectores de expresión que contenían receptores de citocinas de clase II conocidos y de orfano (incluyendo IL-20RA y IL-20RB) en células COS en diversas combinaciones, que luego se ensayaron para su capacidad para unirse a la proteína IL-20 marcada con biotina. Los resultados muestran que el heterodímero de IL-20RB-IL-20RA es un receptor para IL-20. El procedimiento usado se describe a continuación.
La transfección de células COS se realizó en una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos del siguiente modo: se mezclaron 0,5 \mug de ADN con medio que contenía 5 \mul de lipofectamina en 92 \mul de medio de Eagle modificado por Dulbecco sin suero (DMEM) (55 mg de piruvato de sodio, 146 mg de L-glutamina, 5 mg de transferrina, 2,5 mg de insulina, 1 \mug de selenio y 5 mg de fetuína en 500 ml DMEM), se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se añadieron a 400 \mul de medio DMEM sin suero. Entonces, esta mezcla de 500 \mul se añadió a 1,5 x 10^{5} células COS/pocillo y se incubaron durante 5 horas a 37ºC. Se añadieron 500 \mul de medio DMEM con suero bovino fetal al 20% (SBF) y se incubaron durante la noche.
El ensayo, una modificación de la "trampa de secreción" (Davis, S. y col., Cell 87: 1161-1169 (1996), se realizó del siguiente modo: se aclararon células con PBS/albúmina de suero bovino al 1% (BSA) y se bloquearon durante 1 hora con TNB (Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,15 M y reactivo de bloqueo al 0,5% (kit NEN Renaissance TSA-Direct, nº de catálogo NEL701) en agua). A esto le siguió una hora de incubación con 3 \mug/ml de proteína de IL-20 biotinilada en TNB. Las células se lavaron con PBS/BSA al 1% y se incubaron durante otra hora con 1:300 de estreptavidina diluida-HRP (kit NEN) en TNB. Tras otro lavado, las células se fijaron durante 15 minutos con formaldehído al 1,8% en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Entonces, las células se lavaron con TNT (Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,15 M y Tween-20 al 0,05% en agua). Las señales de unión positiva se detectaron tras una incubación de cinco minutos con reactivo fluoresceína-tiramida diluido 1:50 en tampón de dilución (kit NEN). Las células se lavaron con TNT, se conservaron con medio de montaje Vectashield (Vector Labs) diluido 1:5 en TNT, y se visualizaron usando un filtro de FTTC sobre un microscopio invertido de fluorescencia.
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Ejemplo 7 Heterotetrámero de fusión de receptor de IL-20RA/RB-Ig
Se usó el vector de expresión pEZE3 para expresar la proteína de fusión recombinante de receptor de IL-20-Ig. El plásmido pEZE3 se deriva de pDC312. pDC312 se obtuvo mediante licencia de Immunex Corporation. Los plásmidos pDC312 y pEZE3 contienen un segmento EASE como se describe en el documento WO 97/25420. La presencia del segmento EASE en un vector de expresión puede mejorar la expresión de proteínas recombinantes de dos a ocho veces en conjuntos de células estables.
El plásmido pEZE3 es un vector de expresión tricistrónico que puede usarse para expresar hasta tres proteínas diferentes en células de mamífero, preferentemente células de ovario de hámster chino (CHO). La unidad de expresión de pEZE3 contiene el potenciador/promotor de citomegalovirus (CMV), la secuencia conductora tripartita del adenovirus, un sitio de clonación múltiple para la inserción de la región de codificación para la primera proteína recombinante, el sitio interno de entrada al ribosoma de poliovirus tipo 2, un segundo sitio de clonación múltiple para la inserción de la región de codificación para la segunda proteína recombinante, un sitio interno de entrada al ribosoma del virus de la encefalomiocarditis, un segmento de codificación para la dihidrofolato reductasa de ratón y el terminador de la transcripción SV40. Además, pEZE3 contiene un origen de E. coli de replicación y el gen de beta-lactamasa bacteriano.
La proteína de fusión de receptor de IL-20-Ig es un heterotetrámero ligado por disulfuro que está constituido por dos cadenas del dominio extracelular de la IL-20RB humana fusionada a la región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana de tipo salvaje y dos cadenas del dominio extracelular de la proteína de IL-20RA humana fusionadas a una región constante de inmunoglobulina gamma 1 humana mutada. La región constante de inmunoglobulina gamma 1 humana contiene sustituciones de aminoácidos para reducir la unión de Fc\gammaRI y la fijación del complemento C1q.
El constructo de fusión de dominio extracelular de IL-20RB humana/región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana se generó mediante PCR de superposición. El segmento que codifica IL-20RB está constituido por los aminoácidos 1 a 230 de SEQ ID Nº: 20. El molde usado para la amplificación por PCR del segmento de IL-20R se generó por el constructo de expresión de región constante de cadena ligera kappa humana de IL-20RB como se describe más adelante. Se usaron los cebadores de oligonucleótidos SEQ ID Nº: 60 y SEQ ID Nº: 61 para amplificar el segmento de IL-20RB. Se usó toda la región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana de tipo salvaje. El molde usado para la amplificación por PCR del segmento de la región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana de tipo salvaje se generó por el constructo de expresión de la región constante de cadena ligera kappa humana de IL-20RB como se describe en el Ejemplo 12. Se usaron los cebadores de oligonucleótidos SEQ ID Nº: 62 y SEQ ID Nº: 63 para amplificar la región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana de tipo salvaje. Los dos dominios que codifican proteínas se ligaron mediante PCR de superposición usando los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 60 y SEQ ID Nº: 63. Un conector de péptidos (Gly4Ser)3 (SEQ ID Nº: 64) se introdujo entre los dos dominios de proteínas. El conector de péptidos (Gly_{4}Ser)_{3} se codificó en los cebadores de PCR SEQ ID Nº: 61 y SEQ ID Nº: 62. El constructo de fusión de dominio extracelular de IL-20RB/región constante de cadena ligera kappa resultante se muestra por la SEQ ID Nº: 65 y 66. El polipéptido maduro predicho menos la secuencia señal es SEQ ID Nº: 67. La parte del dominio extracelular de IL-20RB que se usó estaba compuesta en realidad por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 86. La secuenciación del extremo N produjo la secuencia de aminoácidos predicha.
El constructo de fusión de dominio extracelular de IL-20RA humana/región constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma 1 humana se generó mediante PCR de superposición de cuatro fragmentos de ADN separados, generado cada uno por reacciones de amplificación por PCR separadas. El primer fragmento contuvo una secuencia señal de tPA optimizada (activador de plasminógeno tisular). La secuencia señal de tPA se amplificó usando cebadores de oligonucleótidos SEQ ID Nº: 68 y SEQ ID Nº: 69 usando un vector de expresión previamente generado en la empresa como molde. El segundo fragmento contuvo la región de codificación del dominio extracelular de IL-20RA que estaba constituida por los aminoácidos 30 a 243 de SEQ ID Nº: 14. Se usaron los cebadores de oligonucleótidos SEQ ID Nº: 70 y SEQ ID Nº: 71 para amplificar este segmento de IL-20RA usando un clon previamente generado de IL-20RA como molde.
La región constante de cadena pesada de gamma 1 humana se generó a partir de 2 segmentos. El primer segmento que contenía el dominio C_{H}1 se amplificó usando cebadores de oligonucleótidos SEQ ID Nº: 72 y SEQ ID Nº: 73 usando un clon de la región constante de cadena pesada de gamma 1 humana de tipo salvaje como molde. El segundo segmento que contenía los dominios bisagra restantes, C_{H}2 y C_{H}3, de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma 1 humana se generó mediante amplificación por PCR usando los cebadores de oligonucleótidos SEQ ID Nº: 74 y SEQ ID Nº: 75. El molde usado para esta amplificación por PCR fue de un constructo Fc de gamma 1 humana previamente generado que contenía codones para las sustituciones de aminoácidos para reducir la unión de Fc\gammaRI y la fijación del complemento C1q como se describe en este documento.
Los dominios de codificación de cuatro proteínas se ligaron mediante PCR de superposición usando los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 68 y SEQ ID Nº: 75. Un conector de péptidos (Gly_{4}Ser)_{3} se introdujo entre los dominios de proteínas de IL-20RA y CH1. El conector de péptidos (Gly_{4}Ser)_{3} se codificó en los cebadores de PCR SEQ ID Nº: 71 y SEQ ID Nº: 72. La proteína de fusión de dominio extracelular de IL-20RA/región constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma 1 humana y la secuencia de ADN se muestran en SEQ ID Nº: 76 y 77. La secuencia de polipéptidos madura predicha, menos la secuencia señal, es SEQ ID Nº: 78. La parte del dominio extracelular de IL-20RA que se usó estaba compuesta en realidad por SEQ ID Nº: 79.
El segmento de codificación de la fusión de dominio extracelular de IL-20RB/región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana se clonó en el segundo MCS, mientras que el segmento de codificación de la fusión de dominio extracelular de IL-20RA humana/región constante de cadena pesada de inmunoglobulina gamma 1 humana se clonó en el primer MCS de pEZE3. El plásmido se usó para transfectar células CHO. Las células se seleccionaron en medio sin hipoxantina o timidina y el transgén se amplificó usando metotrexato. La presencia de proteína se ensayó mediante transferencia de Western usando anticuerpos anti-región constante de cadena pesada de gamma 1 humana y anti-cadena ligera kappa humana. La secuenciación del extremo N reveló que el conductor tPA optimizado no se había escindido completamente. La masa observada indicó que el primer residuo de la secuencia de polipéptidos era ácido piroglutámico, y la secuencia del extremo N parece ser piroEEIHAELRRFRRVPCVSGG (SEQ ID Nº: 80), siendo la parte subrayada restos del conductor tPA.
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Ejemplo 8 Purificación de proteína de fusión de IL-20RB-TbX-Fc4 expresada en baculovirus y recuperación del fragmento pDIRS1 Purificación de polipéptido de IL-20RB-TbX-Fc4 a partir de medios acondicionados con células de insecto de baculovirus
A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC, y todos los procedimientos de cromatografía líquida se hicieron mediante una estación de trabajo Applied Biosystems BioCad (Framingham, MA). El polipéptido de fusión de IL-20RB-TbX-Fc4 se capturó directamente de los medios acondicionados mediante una resina de proteína A conjugada disponible de Applied Biosystems. El medio acondicionado centrifugado y esterilizado por filtración se ajustó al 0,02% peso/volumen de azida de sodio y se enfrió hasta 4ºC, luego se cargó directamente sobre una columna POROS 50 A de tamaño apropiado y equilibrada con PBS (Gibco/BRL), según las especificaciones del fabricante. Entonces, las proteínas capturadas se eluyeron de la columna con un gradiente por etapas de glicina 0,1 M, pH 3,0. Las fracciones recogidas se neutralizaron inmediatamente a pH mediante un volumen predeterminado de tris 2 M, pH 8,0, se añadieron a los tubos de recogida y las fracciones de interés se determinaron mediante análisis de tinción con plata (Geno Tech. Inc., St. Louis, MO) por SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las fracciones recogidas se esterilizaron por filtración y la concentración de proteína se estimó mediante una lectura de absorbancia UV de 280 nm. El material final se almacenó a -80ºC hasta que se inició el procesamiento adicional.
Con el fin de eliminar cualquier agregado de alto peso molecular o contaminantes de polipéptidos más pequeños, se realizó una cromatografía de exclusión de tamaño en el material capturado por la proteína A. El conjunto capturado por la proteína A se descongeló, se concentró contra una membrana concentradora de células con agitación YM30 30 kD MWCO (Millipore, Bedford, MA) hasta un volumen nominal, luego se cargó en una columna de exclusión de tamaño Sephacryl 200 de Pharmacia apropiadamente dimensionada (Piscataway, NJ) según las especificaciones del fabricante. Las fracciones de interés se determinaron mediante análisis por SDS-PAGE, se recogieron y se esterilizaron por filtración. La concentración de proteínas se determinó mediante análisis por BCA (Pierce, Rockford, IL).
Digestión enzimática activada por trombina del polipéptido de pDIRS-TbX-Fc4
Para separar IL-20RB de la parte Fc4 de la molécula de longitud completa, la trombina se usó para promover una escisión específica para secuencia en el conector del sitio de escisión de trombina manipulado entre los dominios de IL-20RB y Fc4. Además, el polipéptido de longitud completa se inmovilizó sobre una resina de proteína A antes de la escisión activada por trombina para proporcionar la purificación de IL-20RB a partir de Fc4. Se añadió una cantidad conocida del polipéptido de longitud completa purificado a un volumen de suspensión apropiado de PBS, pH 7,2, se lavó y se equilibró la resina POROS 50 A, y se dejó que se absorbiera discontinuamente durante la noche con mezclado apropiado. El vial de absorción discontinua se calentó hasta temperatura ambiente, luego se añadió una cantidad predeterminada (1:100 peso/peso, enzima respecto a diana) de trombina rh (ZymoGenetics, Inc) a la reacción. El procedimiento enzimático continuó durante el tiempo predeterminado de 10 minutos a temperatura ambiente con mezclado apropiado y luego la suspensión se recogió en una columna por gravedad de vidrio (Bio-Rad, Hercules, CA).
Purificación del fragmento de polipéptido de IL-20RB liberado por trombina
Con el fin de separar IL-20RB de la trombina, se usó una resina de ABA para unir selectivamente la trombina fuera de la disolución. El eluato y tres lavados del volumen de la columna de la suspensión de la reacción pos-enzimática se recogieron sobre hielo, luego se equilibraron en NaCl 0,5 M y tris 20 mM, pH 8,0. Una columna por gravedad Tosohass TSK-GEL ABA-5PW Guardgel apropiadamente dimensionada (Montgomeryville, PA) se lavó y se equilibró en NaCl 0,5 M y tris 20 mM, pH 8,0, según las especificaciones del fabricante. La aplicación de las fracciones pos-enzimáticas ajustadas con el tampón se aplicaron lentamente sobre la columna de ABA, y los eluatos y los lavados de la columna también se recogieron sobre hielo.
Para proporcionar una separación final de IL-20RB de cualquier agregado de alto peso molecular o contaminantes de polipéptidos más pequeños, se realizó una cromatografía de exclusión de tamaño. Este procedimiento también proporcionó un intercambio de tampón en el tampón de formulación de elección. Las fracciones recogidas se reunieron, luego se concentraron contra un concentrador centrífugo Millipore 5 kD MWCO hasta un volumen nominal. Entonces, el concentrado se aplicó a una columna de exclusión de tamaño Superdex 75 de Pharmacia equilibrada con PBS, pH 7,2. Las fracciones de interés se determinaron mediante análisis por SDS-PAGE, se reunieron, se esterilizaron por filtración, se envasaron en viales y se almacenaron bajo condiciones establecidas apropiadas.
Caracterización de IL-20RB
El producto final se caracterizó por los siguiente procedimientos: análisis por SDS-PAGE (incluyendo tinción con coomassie y análisis de Western), BCA, AAA y secuenciación del extremo N. Los análisis por SDS-PAGE mostraron una banda doble con una migración del gel de aproximadamente un polipéptido de 25 kD. Tanto AAA como la secuenciación del extremo N proporcionaron evidencia de una muestra de alta pureza y un único extremo N.
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Ejemplo 9 Regulación por incremento de citocinas inflamatorias por IL-20 Tratamiento de células
La línea celular de queratinocitos humanos, HaCaT, se cultivó a 37ºC hasta varios días después de la confluencia en matraces de cultivo de tejido T-75. En este momento se eliminó el medio de crecimiento normal (DMEM + SBF al 10%) y se sustituyó por medio sin suero. Entonces, las células se incubaron durante dos días a 37ºC. Luego se elimino el DMEM y cuatro matraces de células por tratamiento se trataron con una de cada una de las siguientes condiciones durante cuatro horas a 37ºC: IL-1 alfa recombinante humana (rh) a 5 ng/ml, IL-1 alfa rh a 20 ng/ml, IL-1 alfa rh a 5 ng/ml + IL-20 a 1 \mug/ml, IL-20 a 1 \mug/ml, o IL-10 rh a 10 ng/ml.
Aislamiento de ARN
Tras el tratamiento de citocinas, el medio se eliminó y las células se lisaron usando una disolución de tiocianato de guanidio. El ARN total se aisló del lisado de células mediante centrifugación durante la noche en un gradiente de cloruro de cesio. Al día siguiente, el sedimento de ARN se resuspendió en una disolución de TE/SDS y se precipitó en etanol. Entonces, el ARN se cuantificó usando un espectrofotómetro, seguido por un tratamiento con ADNsa como por la sección V.B. de Clontech's Atlas^{TM} cDNA Expression Arrays User Manual (versión PT3140-1/PR9X390, publicada 11/5/99). La calidad de las muestras de ARN se verificó por los cálculos de pureza basados en lecturas de espectrofotometría y por la visualización en gel de agarosa. La contaminación genómica de las muestras de ARN se descartó por el análisis por PCR del gen beta-actina.
Síntesis de sondas
Se siguieron los protocolos de Clontech para la síntesis de sondas enriquecidas en poliA+ y la hibridación a matrices Atlas^{TM} (véase anteriormente, más Atlas^{TM} Pure Total RNA Labeling System User Manual, PT3231-1/PR96157, publicado 6/22/99). Brevemente, el ARN poliA+ se aisló de 50 mg de ARN total usando perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina (de Clontech, Palo Alto, CA) y un separador de partículas magnéticas. Entonces, el ARM poliA+ se marcó con ^{alfa32}P-dATP mediante RT-PCR. Los cebadores CDS de Clontech específicos para los 268 genes en la matriz de citocina humana/receptor Atlas^{TM} (nº de cat. nº7744-1) se usaron en la reacción. La sonda marcada se aisló usando cromatografía en columna y se contó en fluido de centelleo.
Hibridación de membranas de matrices
Las matrices Atlas^{TM} se prehibridaron con ExpressHyb de Clontech más 100 mg/ml de AND de esperma de salmón desnaturalizado por calor durante al menos treinta minutos a 68ºC con agitación continua. Entonces, las membranas se hibridaron con 1,9 x 10^{6} CPM/ml (un total de 1,14 x 10^{7} CPM) durante la noche a 68ºC con agitación continua. Al día siguiente, las membranas se lavaron durante treinta minutos x 4 en 2X SSC, SDS al 1% a 68ºC, más durante treinta minutos x 1 en 0,1X SSC, SDS al 0,5% a 68ºC, seguido por un lavado final a temperatura ambiente durante cinco minutos en 2X SSC. Entonces, las membranas de matrices se colocaron en bolsas de plástico Kodak selladas y se expusieron a una pantalla de un sistema de detección y cuantificación de la radiactividad durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, las pantallas de fósforo se cribaron en un sistema de detección y cuantificación de la radiactividad y se analizaron usando el software AtlasImage^{TM} 1.0 de Clontech.
Genes regulados por incremento por IL-20
1.
El factor de necrosis tumoral (TNF) se reguló por incremento 1,9-2,4 veces en IL-20.
2.
Los factores de crecimiento placentarios 1 & 2 (PLGF) se regularon por incremento 1,9-2,0 veces en IL-20.
3.
El receptor del factor II de la coagulación se reguló por incremento 2,0-2,5 veces en IL-20.
4.
El receptor de la calcitonina se reguló por incremento 2,2-2,3 veces en IL-20.
5.
La proteína de unión a hialuronato inducible por TNF TSG-6 se reguló por incremento 2,1-2,2 veces en IL-20.
6.
El precursor del receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el receptor de la proteína tirosina-cinasa (FLT-1) (SFLT) se reguló por incremento 2,1-2,7 veces en IL-20.
7.
MRP-8 (proteína de unión a calcio en macrófagos, relacionada con MIF) se reguló por incremento 2,9-4,1 veces en IL-20.
8.
MRP-14 (proteína de unión a calcio en macrófagos, relacionada con MIF) se reguló por incremento 3,0-3,8 veces en IL-20.
9.
La relaxina H2 se reguló por incremento 3,14 veces en IL-20.
10.
El receptor III del factor de crecimiento transformante beta (TGF\beta) de 300 kDa se reguló por incremento 2,4-3,6 veces en IL-20.
Genes que muestran sinergia con tratamiento con IL-20 + IL-1
1.
La proteína morfogénica ósea 2a se reguló por incremento 1,8 veces con tratamiento con IL-20 solo, 2,5 veces con tratamiento con IL-1 solo y 8,2 veces con ambos tratamientos con IL-20 y IL-1 juntos.
2.
La MRP-8 se reguló por incremento 2,9 veces con tratamiento con IL-20 solo, 10,7 veces con tratamiento con IL-1 solo y 18,0 veces con ambos tratamientos con IL-20 y IL-1 juntos.
3.
La proteína de diferenciación eritroide (EDF) se reguló por incremento 1,9 veces con tratamiento con IL-20 solo, 9,7 veces con tratamiento con IL-1 solo y 19,0 veces con ambos tratamientos con IL-20 y IL-1 juntos.
4.
La MRP-14 (proteína de unión a calcio en macrófagos, relacionada con MSI) se reguló por incremento 3,0 veces con tratamiento con IL-20 solo, 12,2 veces con tratamiento con IL-1 solo y 20,3 veces con ambos tratamientos con IL-20 y IL-1 juntos.
5.
El factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina se reguló por incremento 2,0 veces con tratamiento con IL-20 solo, 14 veces con tratamiento con IL-1 solo y 25,0 veces con ambos tratamientos con IL-20 y IL-1 juntos.
6.
La proteína similar a beta-tromboglobulina se reguló por incremento 1,5 veces con tratamiento con IL-20 solo, 15 veces con tratamiento con IL-1 solo y 27 veces con ambos tratamientos con IL-20 y IL-1 juntos.
7.
El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) se reguló por incremento 1,7 veces con tratamiento con IL-20 solo, 25 veces con tratamiento con IL-1 solo y 48 veces con ambos tratamientos con IL-20 y IL-1 juntos.
8.
El factor quimiotáctico y de activación de monocitos MCAF se reguló por incremento 1,3 veces con tratamiento con IL-20 solo, 32 veces con tratamiento con IL-1 solo y 56 veces con ambos tratamientos con IL-20 y IL-1 juntos.
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Ejemplo 10 Especificidad y afinidad de IL-20 por su receptor
La especificidad y la afinidad de IL-20 por su receptor se determinó usando células BHK establemente transfectadas con IL-20RA, IL-20RB o ambas subunidades de receptores. Los ensayos de unión usando ligando radiomarcado demostraron que la IL-20 se unió a transfectantes de BHK que expresan tanto IL-20RA como IL-20RB, pero no a células sin transfectar ni a transfectantes que no expresan ninguna de las dos subunidades de receptor solas. La unión de IL-20 marcada con ^{125} se eliminó en presencia de un exceso de 100 veces de IL-20 sin marcar, pero no con un exceso de 100 veces de la citocina sin relacionar, IL-21. Se determinó que la afinidad de unión (k_{D}) de IL-20 por el receptor heterodimérico de IL-20RA/IL-20RB era aproximadamente 1,5 nM.
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Ejemplo 11 Activación de receptores de IL-20
Para determinar si la unión de IL-20 conduce a la activación de receptores, la línea de células pre-B dependiente del factor BaF3 se cotransfectó con IL-20RA y IL-20RB y se trató con IL-20 a diversas concentraciones. La IL-20 estimuló la proliferación en un modo dependiente de la dosis y dio una señal detectable a 1,1 pM, con una respuesta media máxima a 3,4 pM. Los inventores observan que la concentración de IL-20 para la respuesta proliferativa media máxima en células BaF3 es 1000X inferior a la afinidad de unión media máxima en células BHK. Las posibles explicaciones para esta gran diferencia incluyen el uso de diferentes líneas celulares, diferentes niveles de expresión de receptores y diferentes resultados de ensayos. La IL-20 también estimuló la transducción de señales en la línea celular de queratinocitos humanos biológicamente relevante HaCaT, que expresa naturalmente IL-20RA y IL-20RB. Por tanto, la IL-20 se une a y activa el receptor heterodimérico de IL-20RA/IL-20RB a concentraciones esperadas para una citocina. Mientras que los controles negativos contienen BaF3 sin transfectar.
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Ejemplo 12 Análisis de expresión de IL-20RA y IL-20RB
Se realizaron análisis de RT-PCR en una variedad de tejidos humanos para determinar el modelo de expresión de IL-20RA y IL-20RB. Las dos subunidades de receptores son las más altamente expresadas en la piel y los testículos. El resultado significativo es que la IL-20RA y la IL-20RB se expresan ambas en la piel, en la que se ha mostrado que median en la respuesta inducida por IL-20. Tanto IL-20RA como IL-20RB también se expresan en monocitos, pulmón, ovario, músculo, testículo, glándula suprarrenal, corazón, glándula salival y placenta. La IL-20RA también está en el cerebro, riñón, hígado, colon, intestino delgado, estómago, tiroides, páncreas, útero y próstata, mientras que no está la IL-20RB.
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Ejemplo 13 La IL-20 está regulada por incremento en muestras de piel psoriásica humana Muestras de ARN
Se obtuvieron muestras de piel normal, además de piel de pacientes con psoriasis. Estas últimas incluyeron piel afectada por psoriasis y piel sin afectar adyacente. El ARN se aisló de las muestras de piel humana usando procedimientos convencionales. La integridad y la calidad de las muestras de ARN se probó en el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania).
Cebadores y sondas para la RT-PCR cuantitativa
Previamente se ha descrito la RT-PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) (véase, Heid, C.A. y col., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. y col., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. y col., Endocrinology 139:4756-4764, 1998). Este procedimiento incorpora el uso de una sonda específica para gen que contiene tanto colorantes fluorescentes indicadores como inhibidores de la fluorescencia. Si la sonda está intacta, la emisión del colorante indicador se invalida debido a la estrecha proximidad del colorante inhibidor de la fluorescencia. Durante la extensión por PCR usando cebadores directos e inversos específicos para genes adicionales, la sonda se escinde por la actividad nucleolítica de 5' a 3' de la ADN polimerasa rTth que libera el colorante indicador de la sonda produciendo un aumento en la emisión fluorescente.
Los cebadores y las sondas usados para los análisis de RT-PCR cuantitativa en tiempo real de la expresión de IL-20 se diseñaron usando el software de diseño de cebadores Primer Express^{TM} (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). El cebador directo, ZC40541 (SEQ ID Nº: 87) y el cebador inverso, ZC 40542 (SEQ ID Nº: 88) se usaron en una reacción de PCR (más adelante) a una concentración de 800 nM para sintetizar un producto de 71 pb. La sonda TaqMan® de IL-20 correspondiente, ZC 40544 (SEQ ID Nº: 89) se sintetizó y se marcó por PE Applied Biosystems. La sonda de IL-20 se marcó en el extremo 5' con un colorante fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) y en el extremo 3' con un colorante fluorescente inhibidor de la fluorescencia (6-carboxi-tetrametil-rodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems).
RT-PCR cuantitativa en tiempo real
Los niveles relativos de ARNm de IL-20 se determinaron analizando muestras de ARN total usando el kit TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents (PE Applied Biosystems). La ejecución del transcrito de IL-20 se hizo para generar una curva patrón usada para la cuantificación. La curva estuvo constituida por 10 diluciones sucesivas que oscilaban de 1e^{8} a 1e^{3} copias totales de mensaje completo para IL-20 con cada punto de la curva patrón analizado por triplicado. Las muestras de ARN total de piel también se analizaron por triplicado para los niveles de transcrito de IL-20 humana y para los niveles de hGUS como control endógeno. En un volumen total de 25 \mul, cada muestra de ARN se sometió a reacción de RT-PCR TaqMan EZ (PE Applied Biosystems) que contenía: aproximadamente 25 ng de ARN total en agua tratada con DEPC (libre de ADNsa/Rnasa); cebadores apropiados (ZC40541 aproximadamente 800 nM (SEQ ID Nº: 87) y ZC40542 (SEQ ID Nº: 88); sonda apropiada (ZC40544 aproximadamente 100 nM (SEQ ID Nº: 89); 1X tampón TaqMan EZ; acetato de manganeso 3 mM; d-CTP, d-ATP y d-GTP 300 \muM cada uno y 600 \muM de d-UTP; ADN polimerasa rTth (0,1 U/\mul); y AmpErasa UNG (0,01 U/\mul). Las condiciones de ciclado térmico de PCR fueron del siguiente modo: una etapa de tratamiento de UNG inicial de un ciclo a 50ºC durante 2 minutos; seguido por una etapa de transcripción inversa (RT) de un ciclo a 60ºC durante 30 minutos; seguido por una desactivación de la etapa de UNG de un ciclo a 95ºC durante 5 minutos; seguido por 40 ciclos de amplificación a 94ºC durante 20 segundos y 60ºC durante 1 minuto.
Los niveles relativos de ARN de IL-20 se determinaron usando el procedimiento de la curva patrón como se describe por el fabricante, PE Biosystems (boletín de usuario nº2: ABI Prism 7700 Sequence Detection Systems, Relative Quantitation of Gene Expression, 11 de diciembre de 1997). Las mediciones de hGUS se usaron para normalizar los niveles de IL-20. Los datos se muestran en la siguiente Tabla 4.
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TABLA 4
5
El ARNm de IL-20 fue detectable en muestras de piel de pacientes normales o de áreas sin afectar. A diferencia, hubo una regulación por incremento para el mensaje de IL-20 en piel afectada de pacientes con psoriasis. La IL-20RA y la IL-20RB se expresan en piel normal y enferma humana. Estos datos respaldan una fuerte asociación de la enfermedad con IL-20 en psoriasis humana.
La sobreexpresión de IL-20 se mostró en lesiones psoriásicas humanas sugiriendo que la IL-20 participa en la psoriasis humana. Además, como se describe en este documento, la sobreexpresión de IL-20 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico y afectación de células inmunitarias indicativos de un fenotipo psoriásico. Tales datos in vivo sugieren adicionalmente que la IL-20 participan en la psoriasis. Como tales, los antagonistas para la actividad de IL-20, tales como los anticuerpos monoclonales anti-IL-20 humana, anti-IL-20RA humana y anti-IL-20RB humana de la presente invención, además de receptores solubles y anticuerpos para los mismos, son útiles terapéuticamente como antagonistas para IL-20 en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como psoriasis, además de otras indicaciones como se desvelan en este documento.
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Ejemplo 14 Los ARNm de IL-20RA y IL-20RB están regulados por incremento en psoriasis
Se usó la hibridación in situ para determinar si la expresión de receptores de IL-20 está alterada en psoriasis. Muestras de piel de cuatro pacientes con psoriasis y tres pacientes sin afectar se ensayaron con sondas específicas para el ARNm de la subunidad de dos receptores. Las cuatro muestras de piel psoriásica tenían altos niveles de ARNm de IL-20RA y IL-20RB en los queratinocitos, mientras que las muestras de piel normal no tenían niveles detectables de ningún ARNm de la subunidad de receptores. También se observaron señales positivas en piel psoriásica en células inmunitarias mononucleares y en células endoteliales en un subconjunto de vasos. Por tanto, tanto la IL-20RA como la IL-20RB se expresan en queratinocitos, células inmunitarias y células endoteliales, los principales tipos de células que se cree que interactúan en la psoriasis.
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Ejemplo 15 La unión de IL-20 activa STAT3 en la línea celular de queratinocitos HaCaT
La IL-20 se une a líneas celulares transfectadas con ambas subunidades de su receptor (es decir, IL-20RA y IL-20RB). Sin embargo, estas líneas celulares sobreexpresan el receptor de IL-20 respecto a su nivel normal y no está clara su relevancia para la función fisiológica de IL-20. La línea celular de queratinocitos humanos HaCaT, que expresa IL-20RA y IL-20RB endógenas, se usó para examinar la transducción de señales de IL-20 en un tipo de célula biológicamente relevante. Las células HaCaT se infectaron con adenovirus recombinante que contenía un constructo indicador para permitir la detección de la señalización intracelular. El constructo está constituido por el gen de luciferasa de luciérnaga impulsado por secuencias promotoras/potenciadoras que comprenden el elemento de respuesta al suero (SRE) y transductores de señales y activadores de elementos de transducción (STAT). Este sistema de ensayo detecta interacciones ligando-receptor productivas e indica posibles componentes de transducción de señales aguas abajo que participan en la activación de receptores. El tratamiento con IL-20 solo produjo un aumento dependiente de la dosis en la actividad de la luciferasa con una respuesta media máxima que se produce a aproximadamente 2,3 nM. Los posteriores ensayos de indicadores de luciferasa usando vectores de adenovirus que sólo contenían el elemento SRE o sólo los elementos STAT produjeron activación indicadora detectable sólo mediante STAT.
Para determinar si otras citocinas actúan conjuntamente con IL-20, las células HaCaT se trataron con IL-20 sola o en combinación con una única dosis inferior a la máxima de EGF, IL-1\beta o TNF\alpha. En presencia de cada una de estas tres proteínas, el tratamiento con IL-20 produjo un aumento dependiente de la dosis en la actividad de luciferasa. La IL-20 en combinación con la IL-1\beta da como resultado una respuesta media máxima a aproximadamente 0,5 nM, aproximadamente cinco veces inferior que con IL-20 sola. Además, la activación del gen indicador es detectable a IL-20 0,1 nM, una dosis que es al menos diez veces inferior a la dosis de IL-20 requerida sola.
Las células BHK transfectadas con IL-20RA, IL-20RB o ambas subunidades de receptor se usaron para determinar si se requería el apareamiento de receptores para la estimulación de IL-20 de STAT-luciferasa. Como era el caso con los ensayos de unión, sólo las células transfectadas con ambas subunidades de receptores respondieron a IL-20 y lo hicieron con una respuesta media máxima de 5,7 pM. Los inventores observan que la concentración de IL-20 para la respuesta media máxima en células BHK es 400 veces inferior que para la respuesta media máxima en células HaCaT. Es probable que se necesite una menor concentración de IL-20 para la respuesta media máxima en células BHK, con respecto a células HaCaT, debido a los mayores niveles de receptor en los transfectantes de receptores de IL-20 de BHK.
Se usó un ensayo de translocación nuclear para identificar proteínas STAT que participaban en la acción de IL-20. Tanto las células HaCaT, con receptores de IL-20 endógenos, como las células BHK transfectadas con IL-20RA y IL-20RB, se trataron con proteína de IL-20 y la translocación de factores de transcripción de STAT3 y STAT1 desde el citoplasma hasta el núcleo se ensayó por inmunofluorescencia.
En células HaCaT sin estimular, la tinción de STAT3 fue predominantemente en el citosol. El tratamiento de células HaCaT con IL-20 produjo una acumulación distinta de STAT3 en el núcleo. La translocación nuclear de STAT3 en respuesta a concentraciones crecientes de IL-20 se produjo con una concentración de IL-20 media máxima de 7 nM. A diferencia de la translocación de STAT3, las células HaCaT tratadas con IL-20 no mostraron ninguna acumulación nuclear detectable de STAT1.
Se usaron células BHK transfectadas con IL-20RA y IL-20RB para confirmar que el receptor de IL-20 era requerido para la estimulación de IL-20 de la translocación nuclear de STAT3. En células BHK que carecen del receptor de IL-20, la STAT3 quedó citosólica tras el tratamiento con IL-20. A diferencia, en células BHK transfectadas con el receptor de IL-20, la STAT3 se translocó hacia el núcleo en respuesta a IL-20. De nuevo, la STAT1 quedó citosólica independientemente del tratamiento con IL-20 o la expresión de receptores de IL-20. Por tanto, el receptor de IL-20 es requerido para la activación de STAT3 mediada por IL-20.
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Ejemplo 16 Fenotipo transgénico de IL-20
Se sobreexpresaron IL-20 tanto humanas como de ratón en ratones transgénicos usando una variedad de promotores. El promotor de albúmina de ratón específica para hígado, que dirige la expresión de IL-20 humana, se usó inicialmente en un intento por lograr niveles en circulación de proteína. Se realizaron estudios posteriores usando el promotor de queratina 14 (K14), que elige principalmente como diana la expresión a la epidermis y otros epitelios escamosos estratificados; el promotor de la metalotioneína-1 de ratón, que da un amplio modelo de expresión; y el EULCK, que impulsa la expresión en células de la línea linfoide. Se obtuvieron resultados similares en los cuatro casos, posiblemente porque todos estos promotores producen niveles en circulación de IL-20.
En todos los casos, las crías transgénicas que expresan los transgenes de IL-20 fueron más pequeñas que sus compañeros de jaula no transgénicos, tenían un aspecto brillante con piel dura arrugada y murieron en el plazo de los primeros días después del nacimiento. Las crías tenían leche en sus estómagos que indicaba que podían amamantar. Estos ratones tenían las extremidades, las regiones de la cola, los orificios nasales y la boca hinchados y tenían dificultades en el movimiento. Además, los ratones estaban débiles, carecían de tejido adiposo visible y tenían un desarrollo retardado del oído y los dedos. Los bajos niveles de expresión en el hígado (inferiores a 100 moléculas de ARNm/célula) fueron suficientes para tanto la letalidad neonatal como las anomalías de la piel. Los ratones transgénicos sin un fenotipo visible ni expresaron el transgén ni lo expresaron a niveles detectables, o fueron mosaico.
El análisis histológico de la piel de los ratones transgénicos para IL-20 mostró una epidermis engrosada, hiperqueratosis y un estrato córneo compacto en comparación con los compañeros de jaula no transgénicos. Ocasionalmente se observaron costras serocelulares (escaras). El análisis por microscopio electrónico (ME) de la piel de ratones transgénicos mostró inclusiones de lípidos intramitocondriales, gránulos de queratohialina moteados y relativamente pocos tonofilamentos similares a los observados en la piel psoriásica humana y en modelos de enfermedades de la piel de ratón. Además, muchos de los ratones transgénicos tenían linfocitos tímicos apoptóticos. No se detectó ninguna otra anomalía mediante el análisis histopatológico. Estos resultados histológicos y de ME respaldan y extienden las alteraciones macroscópicas de la piel observadas.
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Ejemplo 17 Anticuerpos policlonales anti-IL-20 humana
Se prepararon anticuerpos policlonales inmunizando 2 conejos blancos hembra New Zealand con el péptido IL-20X1-2 humano (cgeeamkkyeqilshfeklepqaavvkalgeldillqw) (SEQ ID Nº: 90) o el polipéptido humano recombinante maduro purificado (SEQ ID Nº: 3) producido en células BKH, IL-20-BHK humano. El péptido se sintetizó usando un sintetizador de péptidos modelo 431 A de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Entonces, el péptido sintético IL-20X1-2 humano se conjugó a la proteína portadora de hemocianina de lapa californiana (KLH) activada con maleimida mediante el residuo de cisteína terminal (Pierce, Rock-ford, IL). A cada uno de los conejos se les administró una inyección intraperitoneal (ip) inicial de 200 \mug del péptido sintético conjugado IL-20X1-2 humano o el polipéptido recombinante maduro purificado IL-20-BHK humano en adyuvante completo de Freund seguido por inyecciones ip compatibles de refuerzo de 100 \mug del péptido conjugado o el polipéptido maduro en adyuvante incompleto de Freund cada tres semanas. Siete a diez días después de la administración de la segunda inyección de refuerzo (3 inyecciones totales), los animales se sangraron y se recogió el suero. Entonces, los animales se reforzaron y se sangraron cada tres semanas.
Los sueros de conejo específicos para los péptidos IL-20X1-2 humanos y específicos para los polipéptidos IL-20-BHK humanos se caracterizaron por ELISA usando 1 \mug/ml del péptido IL-20X1-2 humano o 500 ng/ml del polipéptido IL-20-BHK humano como dianas de anticuerpos específicos. Las 4 muestras de suero de conejo tenían título para sus dianas de anticuerpos específicos a una dilución de 1:5E^{6} (1:5.000.000).
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Los anticuerpos policlonales específicos para péptidos IL-20X1-2 humanos se purificaron por afinidad a partir de antisuero de conejo apropiadamente recogido usando una columna de péptidos EPOXI-SEPHAROSE 6B (Pharmacia LKB) que se preparó usando 10 mg del péptido sintético IL-20X1-2 humano por gramo de EPOXI-SEPHAROSE 6B. Los anticuerpos policlonales específicos para los polipéptidos de IL-20 humana se purificaron por afinidad a partir de antisuero de conejo apropiadamente recogido usando una columna de proteínas CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) que se preparó usando 10 mg del polipéptido humano recombinante maduro purificado producido en E. coli, IL-20-E. coli humano, por gramo de CNBr-SEPHAROSE. Tras la purificación, los anticuerpos policlonales resultantes se dializaron contra 4 cambios de 20 veces el volumen de anticuerpo de PBS durante un periodo de tiempo de al menos 8 horas.
Los anticuerpos policlonales específicos para los péptidos IL-20X1-2 humanos y los polipéptidos de IL-20 humana se caracterizaron por ELISA usando 1 \mug/ml del péptido sintético IL-20X1-2 humano o 500 ng/ml de los polipéptidos recombinantes purificados IL-20-BHK humanos, IL-20-Bv humanos o IL-20-E. coli humanos como dianas de anticuerpos. Los anticuerpos policlonales específicos para los péptidos IL-20X1-2 humanos presentaron limites de detección inferiores (LLD) de 100 pg/ml y 500 pg/ml para su antígeno específico IL-20X1-2 humano y el polipéptido IL-20-BHK humano, respectivamente. Los anticuerpos policlonales específicos para los polipéptidos de IL-20 humana presentaron LID de 100 pg/ml en las dianas de antígeno IL-20-BHK humano, IL-20-Bv humano y IL-20-E. coli humano.
Los anticuerpos policlonales purificados por afinidad específicos para los polipéptidos de IL-20 humana se caracterizaron adicionalmente por su capacidad para bloquear la actividad proliferativa de células ("ensayo de neutralización") de IL-20 humana recombinante purificada en células BaF3/IL-20RA/IL-20RB. Un exceso molar de 100X de los anticuerpos policlonales específicos para los polipéptidos de IL-20 humana fue suficiente para inhibir la proliferación celular.
Los anticuerpos policlonales purificados por afinidad específicos para los polipéptidos de IL-20 humana se caracterizaron por su utilidad en un ELISA para la determinación cuantitativa de los polipéptidos maduros recombinantes IL-20-BHK humano, IL-20-Bv humano o IL-20-E. coli humano en muestras de suero de ratón y humano. El ELISA resultante mostró un límite de detección inferior de 1 ng/ml en suero de ratón normal al 100% y 5 ng/ml en suero humano al 100% para las tres formas de polipéptido maduro recombinante IL-20 humana.
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Ejemplo 18 Construcción de células BaF3 que expresan el plásmido KZ134 y subunidades de IL-20RA y IL-20RB
Se construyeron células BaF3 que expresaban el plásmido KZ134 como se describe anteriormente y se designaron BaF3/KZ134. Estas células se usaron como control y se transfectaron adicionalmente con IL-20RB de longitud completa (SEQ ID Nº: 20) como se describe más adelante. Las células BaF3/KZ134 que expresaban IL-20RB se designaron BaF3/KZ134/IL-20RB. Estas células se usaron como control y se transfectaron adicionalmente con IL-20RA de longitud completa (SEQ ID Nº: 13) como se describe más adelante. Las células BaF3/YZ134/IL-20RB que expresaban IL-20RA se designaron BaF3/KZ134/IL-20RA/IL-20RB.
Construcción de células BaF3 que expresan el plásmido K134
La BaF3, una línea celular prelinfoide dependiente de interleucina-3 (IL-3) derivada de médula ósea murina (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot y col., Mol. Cell Biol. 6: 4133-4135, 1986), se mantuvo en medio completo (medio RPMI 1640 (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) complementado con suero bovino fetal al 10% inactivado por calor, 1 ng/ml de IL-3 murina (mIL-3) (R & D, Minneapolis, MN), L-glutamina 2 mM (Gibco BRL), piruvato de sodio 1 mM (Gibco BRL) y antibiótico PSN (Gibco BRL)). El plásmido KZ134 se construye con oligonucleótidos complementarios ZC12,749 (gtaccttcccgtaaatccctccccttcccggaattacacccgcgtatttcccagaaaag
gaactgtagatttctaggaattcaatccttggccacgcgtc) y ZC12,748 (tcgagacgcgtggccaaggattgaattcctagaaatctacagttccttttctgggaaa
tacgcgggtgtaattccgggaaggggagggatttacgggaag) que contienen elementos de unión al factor de transcripción STAT de 4 genes. Un elemento inducible c-fos Sis modificado (m67SIE, o hSIE) (Sadowski, H. y col., Science 261:1739-1744, 1993), el p21 SIE1 del gen p21 WAF1 (Chin, Y. y col., Science 272:719-722, 1996), el elemento de respuesta a glándulas mamarias del gen de la \beta-caseína (Schmitt-Ney, M. y col., Mol. Cell. Biol. 11:3745-3755, 1991) y un elemento inducible del gen Fcg RI (Seidel, H. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:3041-3045, 1995). Estos oligonucleótidos contienen extremos compatibles Asp718-XhoI y se ligan, usando procedimientos estándar, a un vector indicador de luciferasa de luciérnaga receptora con un promotor c-fos (Poulsen, L.K. y col., J. Biol. Chem. 273:6229-6232, 1998) digerido con las mismas enzimas y que contiene un marcador de selección de neomicina. El plásmido KZ134 se usa para transfectar establemente células BaF3 usando procedimientos de transfección y selección estándar (como se describe más adelante) con 500 \mug/ml de neomicina para preparar la línea celular BaF3/KZ134.
Construcción de células BaF3/KZ134 que expresan IL-20RB
La secuencia de ADNc de longitud completa IL-20RB (SEQ ID Nº: 20) se aisló de una biblioteca de ADNc y luego se clonó en un vector de expresión pZP7P. Antes de la electroporación se preparó IL-20RB/pZP7P y se purificó usando un kit Qiagen Maxi Prep (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Para la electroporación, las células BaF3/KZ134 se lavaron una vez en medio RPMI sin suero y luego se resuspendieron en medio RPMI sin suero a una densidad de células de 10 células/ml. Un ml de las células BaF3/KZ134 resuspendidas se mezcló con 30 \mug del ADN de plásmido de IL-20RB/pZP7P y se transfirió a cámaras de electroporación desechables separadas (GIBCO BRL). Tras una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, a las células se les dieron dos choques sucesivos (800 IFad/300 V.; 1180 IFad/300 V.) administrados por un aparato de electroporación (CELL-PORATOR^{TM}; GIBCO BRL). Después de un tiempo de recuperación de 5 minutos, las células electroporadas se transfirieron a 50 ml de medio completo y se colocaron en un incubador durante 15-24 horas a 37ºC y 5% de CO_{2}. Entonces, las células se centrifugaron y se resuspendieron en 50 ml de medio completo que contenía 500 \mug/ml de neomicina y 2 \mug/ml de puromicina en un matraz T-162 para aislar el conjunto resistente a puromicina. Los conjuntos de las células BaF3/KZ134 transfectadas, denominadas en lo sucesivo BaF3/KZ134/IL-20RB, se ensayaron para la capacidad de señalización como se describe más adelante. Además, estas células se transfectaron adicionalmente con IL-20RA como se describe más adelante. Las células BaF3/KZ134/IL-20RA también se prepararon como se describe anteriormente.
Construcción de células BaF3/KZ134/IL-20RB que expresan IL-20RA
Las células BaF3/KZ134/IL-20RB que expresaban IL-20RA de longitud completa (SEQ ID Nº: 14) se construyeron como anteriormente y se designaron BaF3/KZ134. Estas células se usaron como control y se transfectaron adicionalmente usando 30 \mug de un vector de expresión IL-20RA/pZP7Z. Tras la recuperación, los transfectantes se seleccionaron usando 500 \mug/ml de neomicina, 2 \mug/ml de puromicina y 200 \mug/ml de zeocina para aislar el conjunto resistente a zeocina. Los conjuntos de las células BaF3/KZ134/IL-20RB transfectadas se diluyeron y se sembraron en placa usando técnicas estándar. Los clones individuales se cribaron mediante el ensayo con luciferasa descrito en el documento de EE.UU. nº de serie 09/745.792, ejemplo 13, que se incorpora en este documento en su totalidad, usando IL-20x1-Bv humano recombinante purificado como inductor. Se seleccionaron clones con la mayor respuesta a luciferasa (mediante luciferasa STAT) y el menor ruido. En lo sucesivo, la línea celular transfectada se llama BaF3/KZ134/IL-20RA/IL-20RB.
Similarmente, también se construyó una línea celular BHK usando el procedimiento descrito en este documento, y puede usarse en el ensayo con luciferasa descrito anteriormente. La línea celular se llama BHK/KZ13 4/IL-20RA/IL-20RB.
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Ejemplo 19 Barrido de la actividad de IL-20 usando el ensayo de proliferación de BaF3/KZ134/IL-20RA/IL-20RB
Se usó IL-20x1-Bv humano recombinante purificado para probar la presencia de actividad proliferativa como se describe más adelante. Las células BaF3/KZ134/IL-20RA/IL-20RB se centrifugaron y se lavaron en medio de ensayo de BaF3 (medio RPMI 1640 (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) complementado con suero bovino fetal al 10% inactivado por calor, L-glutamina 2 mM (Gibco BRL), piruvato de sodio 1 mM (Gibco BRL) y antibiótico PSN (Gibco BRL); sin selección de mIL-3 y neomicina, puromicina y zeocina (denominado en lo sucesivo medio de ensayo de BaF3)). Las células se centrifugaron y se lavaron 3 veces en medio de ensayo de BaF3 para garantizar la eliminación de mIL-3. Entonces, las células BaF3/KZ134/IL-20RA/IL-20RB se contaron y se sembraron en una placa de 96 pocillos a 5000 células por pocillo en 100 \mul de medio de ensayo de BaF3. Se añadieron diluciones sucesivas de IL-20 que oscilaban de 1 pM a 1 nM a las células BaF3/KZ 134/IL-20RA/IL-20RB en 100 \mul de medio de ensayo de BaF3. El volumen de ensayo total fue 200 \mul por pocillo. Las placas de ensayo se incubaron a 37ºC y 5% de CO_{2} durante 72 horas, momento en el que se añadió azul de alamar (Accumed, Chicago, IL) a 20 \mul por pocillo. Las placas se incubaron de nuevo a 37ºC y 5% de CO_{2} durante 24 horas. El azul de alamar da una lectura fluorimétrica basada en el número de células vivas y, por tanto, es una medición directa de la proliferación celular en comparación con un control negativo (medio de ensayo de BaF3 solo). Las placas se leyeron en el lector de placas fmax^{TM} (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) usando el programa Softmax^{TM} Pro a longitudes de onda de excitación de 544 nm y de emisión de 590 nm. Los resultados confirmaron la respuesta proliferativa dependiente de la dosis de las células BaF3/KZ134/IL-20RA/IL-20RB a IL-20. La respuesta, como se mide, fue aproximadamente 30 veces superior al ruido en el extremo inferior 1 nM hasta 2 veces superior al ruido en el extremo inferior 1 pM. Las células parentales BaF3/KZ134, las células BaF3/KZ134/IL-20RA solas y las células BaF3/KZ134/IL-20RB solas no proliferaron en respuesta a IL-20, mostrando que la IL-20 es específica para el receptor heterodimérico de IL-20RA/IL-20RB. El ensayo de proliferación con azul de alamar en BaF3/KZ134/IL-20RA/IL-20RB también puede usarse para buscar antagonistas para IL-20, midiendo la abstinencia de la respuesta proliferativa a células de IL-20 cuando se ejecuta en combinación con antagonistas ("ensayo de neutralización").
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Ejemplo 20 Anticuerpos monoclonales anti-IL-20 humana
Se prepararon anticuerpos monoclonales de rata inmunizando 4 ratas hembra Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) con el polipéptido recombinante natural purificado (SEQ ID Nº: 3) producido en el baculovirus IL-20-Bv humano. A cada una de las ratas se les administró una inyección intraperitoneal (ip) inicial de 25 \mug del polipéptido recombinante purificado en adyuvante completo de Freund (Pierce, Rockford, IL) seguido por inyecciones ip de refuerzo de 10 \mug del polipéptido recombinante purificado en adyuvante incompleto de Freund cada dos semanas. Siete días después de la administración de la segunda inyección de refuerzo, los animales se sangraron y se recogió el suero.
Las muestras de suero de rata específicas para IL-20 humana se caracterizaron por ELISA usando 1 ug/ml del polipéptido recombinante maduro purificado IL-20-Bv humano como la diana de anticuerpos específicos. Tres muestras de suero de rata tenían título para la diana de anticuerpos específicos a una dilución de 1:1E^{6}. Una muestra de suero de rata tenía título para la diana de anticuerpos específicos a una dilución de 1:1E^{4}.
Se recogieron esplenocitos de una única rata de título alto y se fusionaron a células de mieloma SP2/0 (ratón) usando PEG 1500 en un único procedimiento de fusión (relación de fusión 4:1, esplenocitos respecto a células de mieloma, "Antibodies: A Laboratory Manual", E. Harlow y D.Lane, Cold Spring Harbor Press). Tras 9 días de crecimiento después de la fusión, los conjuntos de hibridomas productores de anticuerpos específicos se identificaron mediante radioinmunoprecipitación (RIP) usando el polipéptido recombinante marcado con yodo-125 IL-20-Bv humano como la diana de anticuerpos específicos y mediante ELISA usando 500 ng/ml del polipéptido recombinante IL-20-Bv humano como la diana de anticuerpos específicos. Los conjuntos de hibridomas positivos en cualquier protocolo de ensayo se analizaron adicionalmente para su capacidad para bloquear la actividad proliferativa de células ("ensayo de neutralización") de polipéptido recombinante purificado IL-20-Bv humano en células Baf3/IL-20RA/IL-20RB.
Los conjuntos de hibridomas que dan resultados positivos por RIP sola o RIP y el "ensayo de neutralización" se clonaron al menos dos veces mediante dilución limitante.
Los anticuerpos monoclonales purificados a partir de medios de cultivo de tejido se caracterizaron por su capacidad para bloquear la actividad proliferativa de células ("ensayo de neutralización") de IL-20 humana recombinante purificada en células Baf3 que expresaban ambas secuencias de receptores IL-20RA humana y IL-20RB humana. De este modo se identificaron tres anticuerpos monoclonales "neutralizadores".
Los hibridomas que expresan anticuerpos monoclonales neutralizadores para IL-20 humana descritos anteriormente se depositaron en el depositario de patentes de la Colección americana de cultivos y tejidos tipo (ATCC; Manassas VA) como depósitos originales bajo el Tratado de Budapest y se les dieron los siguientes nº de registro: 262.4.1.2.2.1 (ATCC [PTA-5350]); 262.5.1.6.4.4 (ATCC [PTA-5351]); 262.7.1.3.2.4 (ATCC [PTA-5352]).
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Ejemplo 21 Cribado de la actividad antagonista de IL-20 usando el ensayo de proliferación de BaF3/KZ 134/IL-20RA/IL-20RB
Con el fin de determinar si los anticuerpos monoclonales anti-IL-20 humana de rata pueden antagonizar IL-20x1-Bv humano recombinante purificado, los conjuntos de hibridomas positivos en el ensayo de RIP se analizaron adicionalmente para su capacidad para bloquear la actividad proliferativa de células ("ensayo de neutralización") de IL-20 en células BaF3/KZ134/IL-20RA/IL-20RB (Ejemplo 18).
Los anticuerpos monoclonales purificados a partir de medios de cultivo de tejido se caracterizaron por su capacidad para bloquear la actividad proliferativa de células ("ensayo de neutralización") de IL-20x1-E. coli humano recombinante purificado en células BaF3/KZ134/IL-20RA/IL-20RB. Los resultados se dan como valores de CE_{50} y CE_{100} en la siguiente Tabla 5.
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TABLA 5
6
Ejemplo 22 Determinación de la afinidad de unión (K_{d}) para los anticuerpos monoclonales anti-IL-20 humana de rata para IL-20
Preparación de ^{125}I-IL-20. Se preparó IL-20x1-E. coli humano recombinante purificado radiomarcado con reactivo de yodación Iodo-Beads® (Pierce) según las instrucciones del fabricante. Se radiomarcaron veinte \mug de IL-20 para actividades específicas de 45.000 a 137.000 recuentos por minuto por nanogramo precipitando del 95 al 100 por ciento de la radiactividad con el 10 por ciento de TCA. La bioactividad de cada preparación de ^{125}I-IL-20 se midió usando células BHK/KZ134/IL-20RA/IL-20RB para la respuesta a luciferasa (mediante luciferasa STAT) (documento de EE.UU. nº de serie 09/745.792). No hubo diferencias significativas en bioactividades de la IL-20 marcada con ^{125}I y la IL-20 sin marcar.
Unión de ^{125}I-IL-20 a los anticuerpos monoclonales anti-IL-20 humana de rata (Ejemplo ?). Se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos BreakApart Module (NUNC Brand Products, Roskilde, Dinamarca) durante la noche a 4ºC con los anticuerpos monoclonales anti-IL-20 humana de rata a una concentración de 2 nM en 100 \mul por pocillo de ELISA A (tampón de carbonato sódico 0,1 M, pH 9,6). La concentración de recubrimiento dos nM de anticuerpo se optimizó para las condiciones de ensayo. Las placas se lavaron dos veces usando un lavador de placas automático (SLT 96PW), 300 \mul por pocillo con ELISA C (Tween 20 al 0,05%/1x solución salina tamponada con fosfato). Las placas se bloquearon durante 5 minutos con 200 \mul por pocillo de tampón de bloqueo SuperBlock® (Pierce), se repitió. Las placas se lavaron como se describe anteriormente usando el lavador de placas automático. La unión se realizó a 37ºC con agitación durante 3,0 horas usando diluciones sucesivas de ^{125}I-IL-20 que oscilaban de concentración 3,3 pM a 2 nM en 100 \mul por pocillo de ELISA B (fracción de albúmina de suero bovino al 1% iv/Tween 20 al 0,05%/1x solución salina tamponada con fosfato). La unión específica se determinó en presencia (unión no específica) y ausencia (unión total) de IL-20 sin marcar a concentración 2 \muM. El periodo de tiempo de tres horas, las diluciones sucesivas de ^{125}I-IL-20 y la concentración de IL-20 sin marcar 2 \muM se optimizaron para las condiciones de ensayo. Las reacciones de unión se terminaron mediante la eliminación del medio de unión y el lavado de las placas manualmente cuatro veces con 200 \mul por pocillo de ELISA C. Entonces, las placas se desarmaron y los pocillos se leyeron individualmente en un contador gamma (Packard, Meriden, CT) para recuentos por minuto incorporados.
Para los tres anticuerpos monoclonales anti-IL-20 humana de rata se generaron curvas de unión específica usando GraphPad Prism® (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Los datos de unión específica se ajustaron directamente usando regresión no lineal para evaluar la K_{d} de ^{125}I-IL-20 para cada uno de los anticuerpos monoclonales anti-IL-20 humana de rata, como se muestra en la siguiente Tabla 6.
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TABLA 6
7
Ejemplo 23 Anticuerpos monoclonales de IL-20RA humana
Se prepararon anticuerpos monoclonales de ratón inmunizando 5 ratones Balb C hembra (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) con la proteína recombinante purificada IL-20RA-BHK. A cada uno de los ratones se les administró una inyección intraperitoneal (ip) inicial de 20 \mug de la proteína recombinante purificada en adyuvante completo de Freund (Pierce, Rockford, IL) seguido por inyecciones ip de refuerzo de 10 \mug de la proteína recombinante purificada en adyuvante incompleto de Freund cada dos semanas. Cinco días después de la administración de la segunda inyección de refuerzo, los animales se sangraron y se recogió el suero.
Las muestras de suero de ratón específico para IL-20RA se caracterizaron por ELISA usando 500 ng/ml de la proteína recombinante purificada heterodímero de fusión de receptor de IL-20RA/RB-Ig como diana de anticuerpos específicos. Las 5 muestras de suero de ratón tenían título por ELISA para la diana de anticuerpos específicos a una dilución de 1:1E^{6}.
Se recogieron esplenocitos y ganglios linfáticos de dos ratones de título alto y se fusionaron a la línea celular de mieloma de ratón P3-X63-Ag8.653 en un único procedimiento de fusión (relación de fusión 2,3:1, Hope Heart Institute Contract Antibody Development, Journal of Immunological Methods 81, 223-228). Tras 9 ó 10 días de crecimiento después de la fusión, los conjuntos de hibridomas productores de anticuerpos específicos se identificaron mediante ELISA usando 1 \mug/ml de la proteína recombinante purificada homodímero de fusión de receptor de IL-20RA-Ig como diana de anticuerpos específicos. Los conjuntos de hibridomas específicos para IL-20RA se analizaron adicionalmente por ELISA usando 1 \mug/ml de la proteína recombinante purificada homodímero de fusión de receptor de IL-20RA/IL-20RB-Ig y por FACS para su capacidad para unirse a células Baf3/KZ55/IL-20RA/IL-20RB.
Los conjuntos de hibridomas que dan resultados positivos por los ensayos de ELISA y FACS se analizaron para su capacidad para bloquear la actividad proliferativa de células ("ensayo de neutralización") de la proteína recombinante purificada IL-20-Bv humana en células Baf3/KZ55/IL-20RA/IL-20RB. De este modo se identificó un conjunto de hibridomas "neutralizadores".
Los conjuntos de hibridomas que dan resultados positivos por los ensayos de ELISA y FACS se clonaron al menos dos veces mediante dilución limitante.
Los anticuerpos monoclonales purificados a partir de medios de cultivo de tejido se caracterizaron por FACS para su capacidad para unirse a líneas celulares monocíticas humanas THP-1 nº ATCC TIB-202, HL-60 y U937 y a monocitos humanos en sangre. Se identificó un anticuerpo monoclonal de unión positiva y se aisló.
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Ejemplo 24 Anticuerpos policlonales de IL-20RB humana
Se prepararon anticuerpos policlonales anti IL-20RB inmunizando 2 conejos blancos hembra New Zealand con el homodímero de fusión de receptor de IL-20RB humana recombinante maduro purificado-Ig. A cada uno de los conejos se les administró una inyección intraperitoneal (ip) inicial de 200 \mug de proteína purificada en adyuvante completo de Freund seguido por inyecciones ip de refuerzo de 100 \mug de péptido en adyuvante incompleto de Freund cada tres semanas. Siete a diez días después de la administración de la segunda inyección de refuerzo (3 inyecciones totales), los animales se sangraron y se recogió el suero. Entonces, los animales se reforzaron y se sangraron cada tres semanas.
Los anticuerpos policlonales específicos para IL-20RA humana se purificaron por afinidad a partir de antisuero de conejo usando una columna de proteínas CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) que se preparó usando 10 mg del homodímero de fusión de receptor de IL-20RB humana-Ig escindido por trombina de antígeno específico y recombinante purificada por gramo de CNBr-SEPHAROSE. Tras la purificación, los anticuerpos policlonales se dializaron con 4 cambios de 20X el volumen de anticuerpo de PBS durante un periodo de tiempo de al menos 8 horas. Los anticuerpos específicos para IL-20RB humana se caracterizaron por ELISA usando 500 ng/ml de la proteína recombinante purificada heterotetrámero de fusión de receptor de IL-20RB humana-Ig como diana de anticuerpos. El límite de detección inferior (LLD) del anticuerpo purificado por afinidad anti-IL-20RB humana de conejo fue 500 pg/ml en su antígeno específico.
Los anticuerpos policlonales específicos para IL-20 humana se caracterizaron adicionalmente por su capacidad para bloquear la actividad proliferativa de células ("ensayo de neutralización") de IL-20-BHK humano recombinante purificado en células BaF3/IL-20RA/IL-20RB (como se describe en este documento). Fue suficiente un exceso molar de 100X de los anticuerpos policlonales específicos para IL-20 humana para inhibir la proliferación celular. Los anticuerpos policlonales específicos para IL-20RB humana también se caracterizaron adicionalmente por su utilidad en un ELISA para la determinación cuantitativa de heterotetrámero de fusión recombinante purificado de receptor de IL-20RA humana/IL-20RB-Ig en muestras de suero de ratón SCID. El ELISA resultante presentó un límite de detección inferior de 20,6 ng/ml en suero de ratón SCID al 100%.
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Ejemplo 25 Anticuerpos monoclonales de IL-20RB humana
Se prepararon anticuerpos monoclonales de rata inmunizando 4 ratas hembra Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) con la proteína escindida por trombina y recombinante purificada homodímero de fusión de receptor IL-20RB humana-Ig. A cada una de las ratas se les administró una inyección intraperitoneal (ip) inicial de 100 \mug de la proteína recombinante purificada en adyuvante completo de Freund (Pierce, Rockford, IL) seguido por inyecciones ip de refuerzo de 50 \mug de la proteína recombinante purificada en adyuvante incompleto de Freund cada dos semanas. Siete días después de la administración de la segunda inyección de refuerzo, los animales se sangraron y se recogió el suero.
Las muestras de suero de rata específico para IL-20RB humana se caracterizaron por ELISA y FACS usando 500 ng/ml de la proteína recombinante purificada escindida homodímero de fusión de receptor de IL-20RB humana-Ig o células Baf3/KZ55/IL-20RA/IL-20RB como dianas de anticuerpos específicos. Las 4 muestras de suero de rata tenían título por ELISA para la diana de anticuerpos específicos a una dilución de 1:1E^{6}. Dos muestras de suero de rata tenían título por FACS para las células Baf3/KZ55/IL-20RA/IL-20RB a una dilución de 1:1E^{3}.
Se recogieron esplenocitos de una única rata de título alto y se fusionaron a células de mieloma SP2/0 (ratón) usando PEG 1500 en un único procedimiento de fusión (relación de fusión 4:1, esplenocitos respecto a células de mieloma, "Antibodies: A Laboratory Manual", E. Harlow y D.Lane, Cold Spring Harbor Press). Tras 10 días de crecimiento después de la fusión, los conjuntos de hibridomas productores de anticuerpos específicos se identificaron por ELISA usando 1 \mug/ml de la proteína recombinante purificada heterodímero de fusión de receptor de IL20-RA/RB humana-Ig como diana de anticuerpos específicos y 1 \mug/ml de una proteína de fusión recombinante purificada no relacionada de receptor humano-Ig como diana no específica. Los conjuntos de hibridomas específicos para IL-20RB se analizaron adicionalmente por FACS para su capacidad para unirse a células Baf3/KZ55/IL-20RA/IL-20RB.
Los conjuntos de hibridomas que dan resultados positivos por tanto el ensayo de ELISA como de FACS se analizaron para su capacidad para bloquear la actividad proliferativa de células ("ensayo de neutralización") de la proteína recombinante purificada IL-20-Bv humana en células Baf3/KZ55/IL-20RA/IL-20RB. De este modo se identificaron siete conjuntos de hibridomas "neutralizadores".
Los conjuntos de hibridomas que dan resultados positivos por ensayos de ELISA y FACS se clonaron al menos tres veces mediante dilución limitante.
Los anticuerpos monoclonales purificados a partir de medios de cultivo de tejido se caracterizaron por FACS para su capacidad para unirse a la línea celular de leucemia monocítica aguda humana THP-1 nº ATCC TIB-202. Se identificaron dos anticuerpos monoclonales de unión positiva.
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Ejemplo 26 Antagonistas de IL-20 en el modelo de colitis y psoriasis de CD4^{+}CD45RB^{hi} (CD25^{-})
La transferencia de células T CD4+ CD45RB^{hi} o CD4+CD25- a ratones SCID singeneicos produce colitis en los ratones. La cotransferencia de células T reguladoras (CD4+CD25+ o CD4+CD45RB^{lo}) inhibe esta colitis. Después de transferir células T CD4+CD25- a ratones, si a los ratones se les inyecta adicionalmente enterotoxina B estafilocócica (SEB), los ratones no sólo desarrollan colitis, sino que también psoriasis. Los anticuerpos contra IL-20, IL-20RA y/o IL-20RB, o receptores solubles de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB, se administran los días 0-21 después de la transferencia de células y se monitorizan los síntomas de colitis y psoriasis. La inhibición de puntuación psoriásica o colitis (histología) indica que los anticuerpos contra IL-20, IL-20RA y/o IL-20RB, o receptores solubles de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB, pueden inhibir estas enfermedades autoinmunitarias.
Diseño del estudio
Se aíslan los bazos y los ganglios linfáticos inguinales de ratones B10.D2. Se forman suspensiones de células individuales y se cuentan. Usando el sistema de perlas de Miltenyi, las células CD25+ se clasifican mediante selección positiva. Las células se tiñen con CD25-PE (BD Pharmingen) a dilución 1:100 y se incuban durante 15 minutos. El exceso de anticuerpo se lava y las células se incuban con 10 ul de perlas anti-PE/10^{6} células durante 20 minutos. Las células se lavan con PBS y se pasan sobre una columna de LS (Miltenyi Biotech). Las células que pasan a través de la columna (CD25-) son retenidas para el análisis posterior. Se añade una mezcla enriquecida en CD4 (Stem Cell Technologies) (1:100) a estas células CD25- y se incuban durante 15 minutos. Las células se lavan con PBS. Se añade una dilución 1:10 de tetrámero anti-biotina a las células durante 15 minutos seguido por un coloide magnético (60 ul/10^{6} células) durante 15 minutos (todos de Stem Cell Technologies). Las células se pasan a través de una columna de selección negativa (0,5'', Stem Cell Technologies). Las células que pasan a través son las células CD4+CD25-. La pureza se analiza usando citometría de flujo. Se inyectan 0,4 x 10^{6} células i.v en ratones CB-17 SCID no sometidos previamente a experimentación en un volumen total de 200 \mul. A los ratones se les inyecta i.p 10 \mug de SEB al día siguiente (d1). Los síntomas de psoriasis y colitis se siguen durante 2-5 semanas. Los ratones se puntúan para enfermedad de psoriasis bajo los siguientes criterios. 0 - sin lesiones, 1 - lesiones leves en el cuello, 2 - lesiones graves en el cuello y la espalda (tronco) 3 - lesiones muy graves en el cuello, la espalda y la panza de los ratones. El engrosamiento de las orejas también se mide como una medida de gravedad de la enfermedad. Los grupos de ratones se inyectan i.p. con PBS, 100 \mug de anticuerpo de control o 10-100 \mug de anticuerpos contra IL-20, IL-20RA y/o IL-20RB, o IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB solubles los días 1-30 bajo diferentes pautas de dosificación (3X/semana o 2X/semana).
Resultados y conclusión
La inhibición de los síntomas psoriásicos y de colitis en ratones tratados con anticuerpos indica que la inhibición de la función de IL-20 puede inhibir síntomas autoinmunitarios en este modelo para psoriasis y colitis.
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Ejemplo 27 Cribado de la actividad antagonista de IL-20 en un ensayo de proliferación con azul de alamar
La línea de células pre-B BaF3 dependiente de factor se cotransfectó con IL-20RA y IL-20RB y se trató con IL-20 a diversas concentraciones. La proliferación se evaluó usando un ensayo con azul de alamar. La proliferación estimulada por IL-20 estimuló la proliferación de una forma dependiente de la dosis a concentraciones esperadas para una citocina, demostrando que la IL-20 se une a y activa el receptor de IL-20RA/IL-20RB heterodimérico a concentraciones esperadas para una citocina. No proliferaron los controles negativos que contenían BaF3 sin transfectar.
Con el fin de determinar si los anticuerpos anti-IL-20RA pueden antagonizar la actividad de IL-20, el ensayo descrito anteriormente se realiza usando tanto anticuerpos anti-IL-20, anticuerpos anti-IL-20RA como anticuerpos anti-IL-20RB como antagonista para la actividad de IL-20. Cuando la IL-20 se combina con tal antagonista, la respuesta a IL-20 a todas las concentraciones se reduce hasta niveles base. La presencia de un antagonista que destruye o reduce los efectos proliferativos de IL-20 demuestra que es un antagonista del ligando de IL-20. Este ensayo puede usarse para probar otros antagonistas de actividad de IL-20 descritos en este documento, tales como receptor soluble de IL-20RA, IL-20RB o IL-20RA/IL-20RB.
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Ejemplo 28 Los Acm anti-IL-20, Acm anti-IL-20RA o Acm anti-IL-20RB inhiben la gravedad de enfermedad en un modelo de AIC de ratón
El modelo de artritis inducida por colágeno (AIC) es un modelo de ratón para artritis reumatoide que refleja en gran parte la enfermedad vista en seres humanos. (Moore, Methods Mol. Biol. 225:175-179, 2003: Waksman, Scand. J. Immunol. 56:12-34, 2002). Los ratones se inmunizan con 2 dosis de colágeno emulsionado en ACF en la base de la cola. Esto produce hinchazón de las patas que aumenta durante un periodo de tiempo y puede tanto puntuarse visualmente como medirse usando un calibrador. Además, los anticuerpos anti-colágeno de suero guardan una buena relación con la gravedad de enfermedad. Basándose en datos que muestran que la IL-20 y la IL-22 inducen inflamación, los Acm anti-IL-20, anti-IL-20RA y anti-IL-20RB se administran por separado o en cualquier combinación de los mismos (es decir, Acm anti-IL-20 en combinación con Acm anti-IL-20RA y/o anti-IL-20RB; o Acm anti-IL-20RA en combinación con anti-IL-20RB) a grupos de ratones inmunizados con colágeno y se evalúan los efectos en las puntuaciones de enfermedad. Una disminución en las puntuaciones de las patas y el espesor de las patas después de la administración de cualquiera de estos Acm sugiere que la IL-20 promueve la respuesta inmunitaria continua en un modelo para autoinmunidad y que el bloqueo de la función de IL-20 puede inhibir trastornos autoinmunitarios. La inhibición de anticuerpos de TNFa y anti-colágeno de suero también sugiere que el bloqueo de IL-20, IL-20RA y/o IL-20RB puede ser beneficioso en la enfermedad autoinmunitaria.
Por tanto, para determinar si los Acm anti-IL-20, anti-IL-20RA y anti-IL-20RB tienen un efecto sobre la autoinmunidad, se prueban en un modelo de ratón para artritis reumatoide - artritis inducida por colágeno (AIC). Específicamente, a ratones DBA1J se les administran inyecciones de colágeno para inducir artritis similar a reumatoide. La inoculación en el día 0 es una inyección subcutánea de un homogeneizado que está constituido por adyuvante completo de Freund (ACF) y colágeno de tipo II (50-100 \mul, preparado como 2 mg/ml de colágeno). La inyección se administra próxima a la base de la cola. En el día 21 se administra una segunda inoculación, siendo la única diferencia que el homogeneizado se prepara usando adyuvante incompleto de Freund (AIC), en lugar de ACF. Diariamente se miden las puntuaciones de las patas y el espesor. Los grupos de ratones reciben PBS, 20-200 ug de anticuerpo monoclonal del mismo isotipo de control o 20-200 ug de Acm anti-IL-20, anti-IL-20RA y anti-IL-20RB i.p 2X o 3X/semana durante 1-4 semanas empezando en la segunda inyección de colágeno. Los ratones se monitorizan diariamente hasta el día 30. Los ratones se sacrifican en el día 30, se toma el suero para el análisis de los anticuerpos anti-colágeno y el análisis de citocinas en suero (TNF-alfa).
La inhibición de las puntuaciones de las patas, espesor de las patas, suero TNF-alfa y anticuerpos anti-colágeno de suero mediante la administración de Acm anti-IL-20, anti-IL-20RA y anti-IL-20RB sugiere que el bloqueo de IL-20, IL-20RA y/o IL-20RB puede inhibir una respuesta inmunitaria continua en un modelo para autoinmunidad y puede inhibir trastornos autoinmunitarios.
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Ejemplo 29 La IL-20 está regulada por incremento en muestras de piel de dermatitis atópica humana Muestras de ARN
Se obtuvieron muestras de piel normal, además de piel de pacientes con dermatitis atópica. El ARN se aisló de las muestras de piel humana usando procedimientos convencionales. La integridad y la calidad de las muestras de ARN se probó en el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania).
Cebadores y sondas para la RT-PCR cuantitativa
Previamente se ha descrito la RT-PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) (véanse, Heid, C.A. y col., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. y col., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. y col., Endocrinology 139:4756-4764, 1998). Este procedimiento incorpora el uso de una sonda específica para gen que contiene tanto colorantes fluorescentes indicadores como inhibidores de la fluorescencia. Si la sonda está intacta, la emisión del colorante indicador se invalida debido a la estrecha proximidad del colorante inhibidor de la fluorescencia. Durante la extensión por PCR usando cebadores directos e inversos específicos para genes adicionales, la sonda se escinde por la actividad nucleolítica de 5' a 3' de la ADN polimerasa rTth que libera el colorante indicador de la sonda produciendo un aumento en la emisión fluorescente.
Los cebadores y las sondas usados para los análisis de RT-PCR cuantitativa en tiempo real de la expresión de IL-20 se diseñaron usando el software de diseño de cebadores Primer Express^{TM} (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). El cebador directo, ZC40541 (SEQ ID Nº: 25) y el cebador inverso, ZC 40542 (SEQ ID Nº: 26) se usaron en una reacción de PCR (más adelante) a una concentración de 800 nM para sintetizar un producto de 71 pb. La sonda TaqMan® de IL-20 correspondiente, ZC 40544 (SEQ ID Nº: 27) se sintetizó y se marcó por PE Applied Biosystems. La sonda de IL-20 se marcó en el extremo 5' con un colorante fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) y en el extremo 3' con un colorante fluorescente inhibidor de la fluorescencia (6-carboxi-tetrametil-rodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems).
RT-PCR cuantitativa en tiempo real
Los niveles relativos de ARNm de IL-20 se determinaron analizando las muestras de ARN total usando el kit de reactivos central de RT-PCR TaqMan EZ (PE Applied Biosystems). La ejecución del transcrito de IL-20 se hizo para generar una curva patrón usada para la cuantificación. La curva estuvo constituida por 10 diluciones sucesivas que oscilaban de 1e^{8} a 1e^{3} copias totales del mensaje completo para IL-20 con cada punto de la curva patrón analizado por triplicado. Las muestras de ARN total de piel también se analizaron por triplicado para los niveles de transcrito de IL-20 humana y para los niveles de hGUS como control endógeno. En un volumen total de 25 \mul, cada muestra ARN se sometió a reacción de RT-PCR TaqMan EZ (PE Applied Biosystems) que contenía: aproximadamente 25 ng de ARN total en agua tratada con DEPC (libre de ADNsa/Rnasa); cebadores apropiados (ZC40541 aproximadamente 800 nM (SEQ ID Nº: 25) y ZC40542 (SEQ ID Nº: 26); sonda apropiada (ZC40544 aproximadamente 100 nM (SEQ ID Nº: 27); 1X tampón TaqMan EZ; acetato de manganeso 3 mM; d-CTP, d-ATP, y d-GTP 300 \muM cada uno y 600 \muM de d-UTP; ADN polimerasa rTth (0,1 U/\mul); y AmpErasa UNG (0,01 U/\mul). Las condiciones de ciclado térmico de PCR fueron del siguiente modo: una etapa de tratamiento de UNG inicial de un ciclo a 50ºC durante 2 minutos; seguido por una etapa de transcripción inversa (RT) de un ciclo a 60ºC durante 30 minutos; seguido por un desactivación de la etapa de UNG de un ciclo a 95ºC durante 5 minutos; seguido por 40 ciclos de amplificación a 94ºC durante 20 segundos y 60ºC durante 1 minuto.
Los niveles relativos de ARN de IL-20 se determinaron usando el procedimiento de la curva patrón como se describe por el fabricante, PE Biosystems (boletín de usuario nº2: ABI Prism 7700 Sequence Detection Systems, Relative Quantitation of Gene Expression, 11 de diciembre de 1997). Las mediciones de hGUS se usaron para normalizar los niveles IL-20.
El ARNm de IL-20 fue detectable a un bajo nivel (796 copias) en muestras de piel. A diferencia, hubo una regulación por incremento para el mensaje de IL-20 en pieles de pacientes con dermatitis atópica (8598 copias). Las subunidades de receptores para IL-20, que incluyen IL-20RA), IL-20RA y IL-20RB, se expresan en piel normal y enferma humana. Estos datos respaldan una fuerte asociación de la enfermedad de IL-20 con dermatitis atópica
humana.
La sobreexpresión de IL-20 se mostró en pieles con dermatitis atópica humana, sugiriendo que la IL-20 participa en la dermatitis atópica humana. Además, como se describe en este documento, la sobreexpresión de IL-20 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico y afectación de células inmunitarias indicativos de un fenotipo de dermatitis atópica. Tales datos in vivo sugieren adicionalmente que la IL-20 participa en dermatitis atópica. Como tales, los antagonistas para la actividad de IL-20, tales como los anticuerpos monoclonales anti-IL-20RA humana de la presente invención, además de receptores solubles y anticuerpos para los mismos, son útiles terapéuticamente como antagonistas para IL-20 en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como dermatitis atópica, además de otras indicaciones como se desvelan en este documento.
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Ejemplo 30 Farmacocinética de un anticuerpo monoclonal anti-IL-20 humana
El anticuerpo monoclonal de prueba, Acm anti-IL-20 humana, (clon nº 262.7.1.3.2.4; kd = 0,133 nM) se proporcionó en 3x alícuotas de 3 ml a una concentración de 1,08 mg/ml (determinada por absorbancia UV a 280 nM) y se almacenó a -80ºC hasta uso. El vehículo fue 1X PBS (NaPO_{4} 50 mM, NaCl 109 mM), pH 7,3. El Acm se descongeló a temperatura ambiente antes de uso y se usaron las alícuotas 1 y 2 como se proporcionan para los grupos de dosis de 100 \mug iv y sc, respectivamente. La mitad de la alícuota 3 se diluyó 1:2 en 1X PBS para el grupo de dosis de 50 \mug sc y la segunda mitad de la alícuota 3 se diluyó 1:10 en 1X PBS para el grupo de dosis de 10 \mug sc. Se recibieron ratones SCID hembra (n=96) de Charles River Labs. Se comprobó la salud de los animales al llegar y se alojaron por grupos (3 animales por jaula). Los ratones tenían 12 semanas de edad con un peso corporal promedio de 22 g al principio del estudio.
Protocolo de dosificación
Se colocaron aleatoriamente ratones SCID hembra (n=24/grupo de dosis) en cuatro grupos de dosificación (Tabla 7). Al grupo 1 se le administró el Acm anti-IL-20 humana mediante inyección iv de aproximadamente 93 \mul en una vena de la cola y a los grupos 2, 3 y 4 se les administró el Acm mediante inyección sc de aproximadamente 93 \mul en el cogote.
Recogida de muestras
Antes de la recogida de sangre, los ratones se anestesiaron completamente con halotano o isofluorano. Las muestras de sangre se recogieron mediante punción cardiaca durante todos los momentos, excepto el momento de 168 h (se recogió mediante hemorragia ocular y los mismos animales se sangraron de nuevo en el momento de 504 h mediante punción cardiaca). La sangre se recogió en tubos separadores de suero y se dejó coagular durante 15 minutos. Las muestras se centrifugaron posteriormente durante 3 minutos a 14.000 rpm. Tras la centrifugación, las alícuotas de 125-150 ul se dispensaron a tubos Eppendorf etiquetados e inmediatamente se guardaron a -80ºC hasta el análisis (Tabla 7).
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TABLA 7
8 
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Cuantificación de concentraciones de Acm anti-IL-20 humana de suero por ELISA
Se desarrolló un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y se cuantificó para analizar muestras de suero de ratón de animales dosificados con Acm anti-IL-20 de rata 267.7.1.3.2.4 durante los estudios farmacocinéticos. Este ensayo se diseñó para aprovechar un anticuerpo secundario comercialmente disponible y la detección colorimétrica usando TMB. Las diluciones usadas para la curva patrón se modificaron para mejorar la definición de la parte lineal de la curva patrón. Una curva patrón en el intervalo de 100 ng/ml a 0,231 ng/ml con 2 diluciones sucesivas permitió la cuantificación de las muestras de suero de ratón. Las muestras QC se diluyeron a 1:100, 1:1000 y 1:10000 en suero de ratón SCID al 10% y se interpolaron de la curva patrón.
Análisis farmacocinético
La concentración de suero frente a los datos de tiempo se descargó en el software WinNonlin Professional 4.0 (Pharsight, Inc.; Cary, NC) para el análisis farmacocinético. Se usaron análisis no compartimentales para determinar parámetros farmacocinéticos basándose en los datos medios en cada momento.
Resultados
Las concentraciones medias de Acm anti-IL-20 humana de suero tras la administración de 100 \mug iv y 100, 50 y 10 \mug sc se muestran en la Tabla 8.
TABLA 8
10
Tras la administración iv, la concentración de Acm frente a un perfil de tiempo demostró un descenso biexponencial. Tras la administración sc, pareció que los Acm tenían una fase de absorción lenta, con eliminación limitada de la velocidad de absorción. Los parámetros farmacocinéticos en suero basándose en los datos medios en cada momento se muestran en la Tabla 9.
TABLA 9
11
Tras la administración iv, los Acm demostraron un aclaramiento muy bajo (Cl = 0,002 ml/h) y una semivida de eliminación larga (t_{1/2}, \lambdaz = 21 días). Los Acm demostraron un volumen en estado estacionario de distribución (V_{ss} = 1,3 ml) que es inferior al volumen de la sangre en un ratón (= 1,7 ml), sugiriendo que los Acm no se distribuyeron sustancialmente fuera del compartimento vascular. La concentración máxima (C_{0}) extrapolada fue superior a la esperada basándose en la dosis inyectada y el volumen de sangre en el ratón. Esto, junto con el pequeño V_{ss}, sugiere que los Acm pueden confinarse en gran parte en la fracción de suero de la sangre.
Tras la administración sc, los valores C_{máx} aumentaron linealmente con la dosis. A la dosis de 100 \mug sc, el Acm tenía una t_{1/2}, _{\lambda z} de aproximadamente 25 días con aclaramiento y un volumen aparente de distribución similar al volumen tras la dosificación iv. La biodisponibilidad fue del 86%. A las dos dosis sc inferiores no pudieron estimarse la mayoría de los parámetros farmacocinéticos debido a la falta de una fase de eliminación terminal medible aún cuando las muestras se tomaron a 504 horas. La absorción del Acm tras la dosificación de Acm parece alcanzar un estado estacionario con la eliminación a lo largo de la duración del estudio.
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Ejemplo 31 Antagonistas de IL-20 en un modelo de psoriasis por trasplante en SCID humano
La piel con psoriasis humana injertada en ratón SCID puede mantener sus características psoriásicas clínicas, microscópicas ópticas e inmunohistoquímicas durante varias semanas. Este modelo proporciona un sistema para evaluar terapias previstas para restaurar tejido lesionado para un fenotipo normal. Una vez se ha injertado satisfactoriamente la piel humana, los anticuerpos contra heterodímeros de IL-20, IL-20RA, IL-20RB y/o IL-20RA/IL-20RB, o receptores solubles de IL-20, pueden administrarse durante varias semanas, y el espesor epidérmico puede analizarse para evaluar el efecto de estos antagonistas en la psoriasis.
Diseño del estudio
Se obtienen biopsias en sacabocados de 6 mm de espesor completo que están constituidas por toda la epidermis y varios mm de dermis de voluntarios adultos sanos y pieles con lesión psoriásica. Se obtienen de cuatro a seis biopsias de cada donante. Se trasplanta una biopsia en sacabocados de cada donante en la superficie dorsal de ratón SCID receptor (CB-17, Taconic). Los animales se mantienen en un entorno sin patógenos. El tratamiento se inicia después de un injerto satisfactorio (2-3 semanas después del trasplante) del siguiente modo: una biopsia para control negativo (PBS o Acm isotipo), una biopsia para control positivo (ciclosporina A) y 2-3 biopsias para tratamiento con Acm de heterodímero anti-IL-20 humana, anti-IL-20RA humana, anti-IL-20RB humana o anti-IL-20RA humana/IL-20RB o receptores solubles para IL-20 (inyección intraperitoneal, tres veces por semana durante 2-4 semanas en un programa L-X-V).
Análisis cuantitativo
Las observaciones y evaluaciones clínicas se prepararán regularmente durante todos los experimentos y se registrarán. La gravedad de las lesiones psoriásicas se evalúa para cicatrización, induración y eritema en un modo ciego. Los parámetros pueden puntuarse usando la escala de tres puntos: 0 = falta completa de afectación cutánea; 1 = ligera afectación; 2 = afectación moderada; 3 = grave afectación. Al final del periodo de dosificación, cada animal se sacrifica y los tejidos se recogen para la histología e IHC. (1) Parte del tejido se fija en formalina al 10% y se tiñe con hematoxilina y eosina. El área epidérmica se mide como una función de los cambios en el espesor epidérmico por unidad de longitud usando el software NIH Image. Las múltiples áreas de cada trasplante se cuantifican para proporcionar un alto valor de n y el área epidérmica media; (2) número de células mononucleares inflamatorias por campo de alta energía (0,103 x 0,135 mm) en la dermis superior; (3) el grado de paraqueratosis se puntúa en una escala arbitraria de 0 a 3 en la que 0 es sin paraqueratosis, 1 era paraqueratosis en menos de un tercio de la sección, 2 era paraqueratosis en más de un tercio de la sección pero en menos de dos tercios de la sección y 3 es paraqueratosis en más de dos tercios de la sección. (4) El resto del tejido se teñirá para Ki67 (marcador de queratinocitos proliferantes) para evaluar el número de queratinocitos ciclantes de Ki67 por milímetro de longitud de la sección. La gravedad reducida de psoriasis como se mide por el espesor epidérmico indica que la neutralización de la función IL-20 puede ser eficaz en este modelo de psoriasis. Para cuantificar la gravedad reducida de la psoriasis, los inventores miden el espesor epidérmico, el número de células inflamatorias en la dermis superior, los números de queratinocitos ciclantes de Ki67 y los grados de paraqueratosis. Los cuatro fragmentos significativamente reducidos para los grupos tratados en comparación con los ratones de control indican el posible uso terapéutico de antagonistas de IL-20.
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Ejemplo 32 Antagonistas de IL-20 en un modelo de psoriasis en cultivo de órganos
La piel de placas psoriásicas humanas puede mantenerse en cultivo de órganos, y las características histológicas anormales de la piel con lesión se mantienen en ausencia de factores de crecimiento exógenos. Pueden administrarse anticuerpos contra heterodímeros de IL-20, IL-20RA, IL-20RB y/o IL-20RA/IL-20RB, o receptores solubles de IL-20, y pueden mejorarse las características histológicas de la piel con lesión psoriásica.
Diseño del estudio
Se obtienen biopsias en sacabocados de 2 mm de espesor completo que están constituidas por toda la epidermis y varios mm de dermis de tanto voluntarios adultos sanos como de piel con lesión psoriásica. Inmediatamente a la biopsia, el tejido se sumerge en medio de cultivo que está constituido por medio basal de queratinocitos (KBM) (Clonetics Inc, Walkersville, MD). El medio de cultivo se complementa con CaCl_{2} para llevar la concentración de Ca^{2+} final a 1,4 mM (Varani y col., 1993, 1994). Entonces, las biopsias se incuban en pocillos de una placa de 96 pocillos que contiene 200 ul de KBM complementado con Ca^{2+} con o sin tratamientos adicionales de anticuerpos contra heterodímeros de IL-20, IL-20RA, IL-20RB y/o IL-20RA/IL-20RB, o receptores solubles de IL-20. Los cultivos se incuban a 37ºC en una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO_{2} durante 8 días.
Análisis cuantitativo
Al final del periodo de incubación, el tejido se fija en formalina tamponada al 10% y se examina histológicamente después de teñir con hematoxilina y eosina. El aspecto del tejido psoriásico expuesto a los anticuerpos o receptores solubles podría parecerse más al de tejidos normales, incluyendo la siguiente observación: las células epiteliales basales de forma irregular inicialmente desorganizadas desarrollaron un aspecto más cilíndrico con polaridad restaurada; remisión de crestas interpapilares epidérmicas, con menores áreas de expansión de células epiteliales en el espacio dérmico; y había menos degeneración global de las capas epidérmicas superiores. El modelo de cultivo de órganos proporciona un medio rápido y sensible para determinar si un compuesto particular tiene potencial como agente anti-hiperproliferativo. La característica histológica anormal puede mejorarse en presencia de un antagonista de IL-20, sugiriendo la eficacia de tal agente en el tratamiento de psoriasis.
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Ejemplo 33 Tratamiento de ratones transgénicos para IL-20 preñadas con anticuerpo monoclonal neutralizador anti-IL-20, anti-IL-20RA o anti-IL-20RB
Para probar los anticuerpos monoclonales (Acm) de rata anti-IL-20, IL-20RA o IL-20RB de ratón para neutralizar la actividad in vivo, a ratones transgénicos (Tg) para IL-20 preñadas se les inyecta intraperitonealmente uno de los Acm enumerados anteriormente. Entonces, las crías recién nacidas se evalúan para la presencia o ausencia del fenotipo de piel "brillante" que normalmente caracteriza estas cepas de ratones.
Específicamente, ratones Tg para IL-20 macho (que se generan usando los promotores de queratina-14 o Eulck) se reproducen con hembras C57BL/6 en celo y las hembras de cría se identifican por la presencia de un coágulo vaginal al siguiente día. Cada hembra preñada se coloca a un lado en una jaula separada y se monitoriza diariamente. Los grupos de tratamiento incluyen al menos 4 hembras preñadas, cada una para permitir un análisis estadísticamente significativo de tanto crías Tg como no Tg. Basándose en la experiencia anterior con estos ratones Tg, una camada oscila normalmente entre aproximadamente 6 y 8 crías por camada, de las que entre 2 y 3 son Tg+.
Siete a nueve días después de engendrarse los ratones (edad embriónica 7-9; e7-9), a las hembras se les inyecta intraperitonealmente 250-500 ug del Acm (isotipo IgG2a de rata) en un volumen de 200-250 ul de PBS. Se usan agujas cortas a un ángulo de inyección superficial para evitar inyectar directamente en el útero. Las hembras preñadas se inyectan de este modo 3 días a la semana (lunes, miércoles y viernes) durante 2 semanas (hasta el nacimiento) con el fin de obtener satisfactoriamente los embriones en desarrollo. Los grupos de control (de no menos de 4 ratones hembra preñadas cada uno) incluyen lo siguiente: control de isotipo Acm de IgG2a de rata, Acm anti-IL-20 humano/de ratón (isotipo IgGl de rata) y un control de isotipo Acm de IgGl de rata.
Desde el día 1 hasta el 5 después del nacimiento, las crías se monitorizan rigurosamente para el aspecto del fenotipo de piel brillante. En el día 5, las crías se sacrifican y se recoge una parte de la cola para el aislamiento de ADN para determinar el genotipo (Tg o no Tg) de cada cría. Las muestras de piel se recogen para el análisis histológico con el fin de evaluar si las crías presentan las capas de células epidérmicas engrosadas que normalmente caracterizan a estos ratones Tg. También se recoge sangre del tronco de las crías (y una hemorragia ocular de las madres un día después del nacimiento) para cuantificar, mediante ELISA, los niveles de Acm en el suero de cada ratón. Debido a que estos Acm son potentes inhibidores de IL-20 in vivo, las crías Tg tienen piel normal (es decir, ni engrosamiento epidérmico ni aspecto "brillante").
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Ejemplo 34 Evaluación de niveles de IL-20, IL-20RA y IL-20RB en muestras de piel psoriásica
Se evaluaron cinco (5) muestras de piel con dos ratones en el grupo de control (CD4+ control/CD25+) y tres ratones en el grupo psoriásico (CD4+ psoriásica/CD25-). Cada espécimen de tejido se fijó en ZnTRIS y se tiñó con un anticuerpo monoclonal anti-IL-20 humana de ratón (clon 240.8.4.7.16.5), anticuerpo monoclonal anti-IL-20RA humana de ratón (clon HH7.34.1F11.1G2), anticuerpo monoclonal anti-IL-20RB humana de rata (clon 264.13.1.3.2.3) y anticuerpo monoclonal anti-IL-22 humana de rata (clon 266.19.1.10.5.2), respectivamente, mediante inmunohistoquímica. En este estudio no se aplicaron células de control positivo y negativo porque el fijador usado para las células (NBF al 10%) era diferente de los tejidos (ZnTRIS). El control negativo reactivo incluyó isotipo IgG de ratón e isotipo IgG de rata para sustituir los anticuerpos primarios. La intensidad de tinción de cada anticuerpo en las muestras de piel se resumió brevemente en la Tabla 10.
TABLA 10
12
Anticuerpo monoclonal de IL-20 humana (clon 240.8.4.7.16.5)
La IL-20 no se detectó en ninguna de las muestras de piel de control o psoriásicas.
Anticuerpo monoclonal anti-IL-20RA humana de ratón (clon HH7.34.1F11.1G2)
La alta expresión de IL-20RA se observó en las muestras de piel psoriásica (grupo 2) en comparación con los controles (grupo 1). En el grupo de control, la epidermis y algunas células mononucleares dispersas en la dermis mostraron tinción positiva. En el grupo psoriásico, los tejidos se tiñeron del mismo modo, pero a un nivel mayor, por ejemplo, se observó una tinción positiva fuerte en la epidermis y en células mononucleares infiltradas en grandes números en la dermis. La piel demostró dermatitis similar a psoriasis y la tinción de IL-20RA en la epidermis se localizó principalmente en las capas externas (estrato granuloso y estrato córneo). El estrato basal, la capa germinal de la epidermis, no mostró tinción y el estrato espinoso, la capa de espinas de la epidermis, mostró una tinción débil y difusa. El anticuerpo también mostró algo de tinción no específica en los tejidos conjuntivos. Las muestras de piel teñidas con isotipo IgG de ratón mostraron tinción negativa.
Anticuerpo monoclonal anti-IL-20RB humana de rata (clon 264.13.1.3.2.3)
El anticuerpo monoclonal anti-IL-20RB humana de rata demostró una tinción similar a la del anticuerpo monoclonal anti-IL-20RA humana de ratón, pero con algunas células mononucleares positivas en la dermis. El anticuerpo también mostró tinción no específica para el músculo esquelético. Las muestras de piel teñidas con isotipo IgG de rata mostraron tinción negativa.
Anticuerpo monoclonal anti-IL-22 humana de rata (clon 266.19.1.10.5.2)
La IL-22 no se detectó en ninguna de las muestras de piel de control o psoriásicas.
Conclusión
Se observó la expresión de IL-20RA y IL-20RB en la epidermis en las muestras de piel psoriásica (CD4+ psoriá-
sica/CD25-) por inmunohistoquímica y microscópicamente estos tejidos presentaron epidermis anormalmente engrosada y dermatitis grave. La gran mayoría de la expresión de IL-20RA y IL-20RB encontrada en la epidermis parecía estar en los queratinocitos sobre las capas de células basales y de espinas, principalmente en el estrato granuloso caracterizado por gránulos intracelulares que contribuyeron al proceso de queratinización y en el estrato córneo constituido por restos de células fusionadas aplanadas (queratina). Además, la expresión de IL-20RA también se observó en células mononucleares en el área con dermatitis. Los tejidos de control (CD4+/control/CD25+) demostraron un nivel relativamente bajo de expresión de IL-20RA y IL-20RB en comparación con los tejidos psoriásicos. No se detectó ningún ligando de IL-20 y IL-22 en ningunas de las muestras de piel de control o psoriásica usando el anticuerpo monoclonal de IL-20 humana y el anticuerpo monoclonal anti-IL-22 humana de rata. Todas las muestras de piel teñidas con isotipo IgG de ratón o isotipo IgG de rata mostraron tinción negativa.
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Ejemplo 35 Expresión de IL-20RA en muestras de piel de ratones inactivados para IL-20TG/IL-20RA
Se estudiaron ocho (8) neonatos con dos (2) neonatos en cada grupo de genotipo: TG/0 HOM, TG/0 Het, 0/0 HOM y 0/0 Het de la K14 IL-20m (TG)/IL-20RA (KO). El tórax caudal de cada animal se fijó en formalina tamponada neutra al 10% (NBF) y se tiñó con un anticuerpo monoclonal anti-IL-20RA humana de ratón (clon HH7.34.1F11.1G2) mediante inmunohistoquímica (IL-20RA-IHC nº15, ARK IHC protocol). Como controles positivos se usaron células Baf3 transfectadas tanto con IL-20RA/RB humana como murina y pulmón humano conocido con expresión de IL-20RA. El control negativo reactivo incluyó isotipo IgG de ratón para sustituir el anticuerpo primario.
Resultados de IHC A. Las células y tejidos de control positivo
Las células mononucleares dispersas en el pulmón humano demostraron una tinción débil, sin embargo, las células Baf3 transfectadas con IL-20RA/RB murina mostraron tinción negativa. Las células Baf3 transfectadas con IL-20RA/RB humana no se encontraron en el portaobjetos, que puede ser debido a una preparación de muestra escasa o pérdida de células mediante el lavado repetido con tapón durante el procedimiento de IHC. Las células Baf3 de tipo salvaje eran transparentes sin tinción.
B. Las pieles de neonatos K14 IL20m (TG)/IL-20RA (KO)
Se encontró expresión débil de IL-20RA en una piel de neonato de dos en TG/0 Het y en una piel de neonato de dos en 0/0 Het, por ejemplo, células epidérmicas sobre la capa basal en la piel mostraron tinción citoplásmica difusa con el anticuerpo monoclonal. Las pieles de neonatos TG/0 HOM (n=2) y 0/0 HOM (n=2) no mostraron expresión de IL-20RA. Todas las pieles de neonato (TG/0 HOM, TG/0 Het, 0/0 HOM y 0/0 Het) teñidas con isotipo IgG de ratón mostraron tinción negativa. La intensidad de tinción de IL-20RA se resume brevemente en la Tabla 11.
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TABLA 11
13
Conclusión
La expresión de IL-20RA se observó en las células epidérmicas en los neonatos TG/0 Het (IL-20TG x IL-20RA KO) mediante inmunohistoquímica como se describe anteriormente. Los estudios con Physioscreen revelaron que estos neonatos mostraron fenotipo de piel extremadamente brillante y microscópicamente mostraron epidermis anormalmente engrosada. Además, la tinción del Acm de IL-20RA se asoció a engrosamiento epidérmico. Los resultados de IHC revelaron que una piel de neonato de dos en TG/0 Het y 0/0 Het mostraron tinción positiva de IL-20RA, respectivamente. Pareció que la gran mayoría de las células que expresaban IL-20RA en la epidermis estaban en los queratinocitos sobre la capa basal (suprabasal), pero la tinción era relativamente más débil en comparación con las muestras de piel de TG/0 Het del estudio de IL-20 TG x IL-20RA KO. No se observó expresión de IL-20RA en la epidermis ni en TG/0 HOM ni en 0/0 HOM. En resumen, la tinción del Acm de IL-20RA era positiva en Het, pero no en HOM.
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Ejemplo 36 Expresión de IL-20RA en muestras de piel de ratones inactivados para IL-20TG/IL-20RA
Se estudiaron ocho (8) neonatos con dos (2) neonatos en cada grupo de genotipo: TG/- HOM, TG/- Het, -/- HOM y -/- Het de la K14 IL-20m (TG)/IL-22RA (KO). El tórax caudal de cada animal se fijó en formalina tamponada neutra al 10% (NBF) y se tiñó con un anticuerpo monoclonal anti-IL-20RA humana de ratón producido contra humano (clon HH7.34.1F11.1G2). Como controles positivos se usaron células Cos transfectadas con IL-20RA humana y pulmón humano conocido con expresión de IL-20RA. Sin embargo, no estuvieron disponibles células y tejidos que expresaran IL-20RA de ratón como control ya que los ratones TG para IL-20RA fallecieron antes del nacimiento. El control negativo reactivo incluyó isotipo IgG de ratón para sustituir el anticuerpo primario.
Resultados de IHC A. El tejido de control positivo (pulmón humano)
Las células mononucleares dispersas en el pulmón humano demostraron una tinción positiva.
B. Los tejidos de ratón (pieles de neonatos IL-20TG/IL-22RA KO)
Los Acm anti-IL-20RA reconocieron IL-20RA de ratón en IHC. La expresión de IL-20RA se encontró en pieles de neonatos IL-20TG/IL-20RA KO Het (n=2) usando IHC, por ejemplo, las células epidérmicas en la piel mostraron tinción citoplásmica difusa con el anticuerpo. Las pieles de neonatos TG/- HOM (n=2), -/- HOM (n=2) y -/- Het (n=2) no mostraron expresión de IL-20RA. La piel de neonato TG/Het teñida con isotipo IgG de ratón mostró tinción negativa.
Conclusión
Se observó expresión de IL-20RA en las células epidérmicas en los neonatos TG/- Het mediante inmunohistoquímica y estudios con physioscreen previos revelaron que estos neonatos mostraron fenotipo de piel extremadamente brillante y microscópicamente mostraron epidermis anormalmente engrosada. Pareció que la gran mayoría de las células que expresaban IL-20RA en la epidermis estaban en los queratinocitos sobre la capa basal (suprabasal) y la tinción no se observó en los otros tejidos en la sección. No se observó expresión de IL-20RA en la epidermis ni en los neonatos TG/- HOM ni en los neonatos IL-20 TG (-/- HOM y -/- Het) que no mostraron fenotipo brillante. Además, todas las muestras de piel teñidas con isotipo IgG de ratón mostraron tinción negativa.
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Referencias citadas en la descripción
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18 
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\newpage
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19 
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20 
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<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
attcctagct cctgtggtct ccag 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Mus musculus 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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ctctgctgcg ttttatctcc tatgg 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcccaaattg agtgtcttca gt 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacagcttcc caaattgagt gtcttcagtc cagtggaagg agtcc 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
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<222> (237)...(1898)
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\vskip0.400000\baselineskip
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22
23
24
25 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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26
27 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
28
280 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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29 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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31 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip1.000000\baselineskip
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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33 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(950)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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34
35 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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\vskip1.000000\baselineskip
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36 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgaattcga gtctaccaaa tgcagactt cac 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgctcgagcc ttccgcaaac ctatgagatc ca 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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37 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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380 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 201
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<213> Homo sapiens 
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44 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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45 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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\hfill
24 
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctctgctgcg ttttatctcc tatgg 
\hfill
25 
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
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tggcgaggct gctgatcttt ctcag 
\hfill
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<213> Mus musculus 
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctttatgtct ttcaaagact cagtc 
\hfill
25 
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<212> ADN
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<213> Mus musculus 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catcagaatt ttaaggacga ctgagt 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Mus musculus 
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ggtggtcagg ggtctggtag acttt 
\hfill
25 
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Mus musculus 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (71)...(532)
\newpage
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Mus musculus 
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23 
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<211> 25
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
attgcagtgt aagggaatac agaga 
\hfill
25 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 451
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> EST 277139
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<221> misc_feature
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<222> (1)...(451)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\newpage
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51 
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<213> Homo sapiens 
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gctgggtgtt tctctttg 
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18 
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<213> Homo sapiens 
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ccatcctaat acgactcact atagggc 
\hfill
27 
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ggaatagccc atcacagaaa 
\hfill
20 
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\hskip-.1em\dddseqskip
actcactata gggctcgagc ggc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
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<213> Homo sapiens 
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caccagaggg tcttcaagga gt 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
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gagcacagaa ttcactactc gaggcggccg cttttttttt ttttttttt 
\hfill
49 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 553
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
52
53 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1659
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (1659)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
54
55
56 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 553
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
57
58 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1659
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1659)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
59
60
61 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 553
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
62
63 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgaattcga gtctaccaaa tgcagacttt cac 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgctcgagcc ttccgcaaac ctatgagatc ca 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
64 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggccggccat gcagactttc acaatggtt 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccgctaccg ccgcctccac tgccaccacc tccggcctct ccttgcacct cc 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtggaggcgg cggtagcgga ggcggtggca gtcgaactgt ggctgcacca tct 
\hfill
53 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggcgcgcctc tagattaaca ctctcccctg ttgaagct 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip1cm
65 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1081
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9) ... (1067)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
66
67 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 352
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
68 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 323
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
69 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcgaccatg gatgcaatga agagagggct 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacagggaac tctacggaag cgtctcaact 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttccgtaga gttccctgtg tctctggtgg ttt 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccagagcca cctccgcctg aaccgcctcc accttgatct ttcaaagtcc tgg 
\hfill
53 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caggcggagg tggctctggc ggtggcggat cggcctccac caagggccca t 
\hfill
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgggcacgg tgggcatgtg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacatgccca ccgtgcccag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agatctagat tatttacccg gagacaggga g 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1801
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)...(1789)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
71
73
74 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 594
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
75
76 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 559
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
77
78 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
79 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\hskip1cm
80 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgccgcgttc ccgagatg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acttgtggaa ttcgctagca ccaagggccc atcggt 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1806
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (38)...(1675)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
81
82
83 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 546
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
84
85 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
86
860 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 201
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
87 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo, ZC40541
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgccaattc ctttcttacc a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso, ZC40542
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccacaatgg catgtcatgt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda TaqMan® de IL-20 ZC40544
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agaaggacct ccggctctgt catgc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
88

Claims (31)

1. Un hibridoma, que comprende un hibridoma seleccionado del grupo de:
(a) el clon de hibridoma 262.4.1.2.2.1 (ATCC [PTA-5350]);
(b) el clon de hibridoma 262.5.1.6.4.4 (ATCC [PTA-5351]); o
(c) el clon de hibridoma 262.7.1.3.2.4 (ATCC [PTA-5352]).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un anticuerpo monoclonal expresado por un hibridoma según la reivindicación 1.
3. Un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo reduce o neutraliza la actividad proinflamatoria de IL-20 humana (SEQ ID Nº: 2 ó 3).
4. Un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2.
5. Un inmunoconjugado según la reivindicación 4, en el que el inmunoconjugado se une a IL-20 (SEQ ID Nº: 2 ó 3).
6. Un inmunoconjugado según la reivindicación 4 ó 5, en el que el inmunoconjugado reduce o neutraliza la actividad proinflamatoria de IL-20 humana (SEQ ID Nº: 2 ó 3).
7. Un inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que el inmunoconjugado está PEGizado.
8. Un inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que el inmunoconjugado comprende además un radionúclido, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marca de péptido, partícula magnética, fármaco o toxina.
9. Una composición farmacéutica que comprende un inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 4-8.
10. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que puede competir por la unión a los polipéptidos de SEQ ID Nº: 2 ó 3 con un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2.
11. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 10, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
12. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 10, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
13. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 10, en el que el fragmento de anticuerpo es F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv o scFv.
14. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en el que el anticuerpo reduce o neutraliza la actividad proinflamatoria de los polipéptidos de SEQ ID Nº: 2 ó 3.
15. Un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 10-14.
16. El inmunoconjugado según la reivindicación 15, en el que el inmunoconjugado reduce o neutraliza la actividad proinflamatoria de los polipéptidos de SEQ ID Nº: 2 ó 3.
17. Un inmunoconjugado según la reivindicación 15 ó 16, en el que el inmunoconjugado está PEGizado.
18. Un inmunoconjugado según la reivindicación 15 ó 16, en el que el inmunoconjugado comprende además un radionúclido, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marca de péptido, partícula magnética, fármaco o toxina.
19. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 10-14.
20. Un procedimiento in vitro para reducir o inhibir la proliferación o diferenciación inducida por IL-20 de células hematopoyéticas y progenitores de células hematopoyéticas que comprende cultivar médula ósea o glóbulos sanguíneos periféricos con una composición que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 2-3 ó 10-14; un inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 4-8 ó 15-18; o una composición farmacéutica según la reivindicación 9 ó 19;
en el que dicha reducción o inhibición se mide como una proliferación o diferenciación de las células hematopoyéticas en la médula ósea o glóbulos sanguíneos periféricos con respecto a médula ósea o glóbulos sanguíneos periféricos cultivados en ausencia de receptor de citocina soluble.
21. Un procedimiento según la reivindicación 20, en el que las células hematopoyéticas y las células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides.
22. Un procedimiento según la reivindicación 21, en el que las células linfoides son macrófagos o células T.
23. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 2-3 ó 10-14; un inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 4-8 ó 15-18; o una composición farmacéutica según la reivindicación 9 ó 19, para la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria inducida por IL-20.
24. Uso según la reivindicación 23 para reducir inflamación por IL-20 en un mamífero.
25. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 2-3 ó 10-14; un inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 4-8 ó 15-18; o una composición farmacéutica según la reivindicación 9 ó 19, para la preparación de un medicamento para suprimir una respuesta inflamatoria en un mamífero, en el que la supresión de dicha respuesta inflamatoria se define por una falta de aumento o disminución en el nivel de proteína amiloide A sérica en el mamífero.
26. Uso según las reivindicaciones 23-25, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica.
27. Uso según la reivindicación 26, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica que comprende enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, artritis, dermatitis atópica o psoriasis.
28. Uso según las reivindicaciones 23-25, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda.
29. Uso según la reivindicación 28, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda que comprende endotoxemia, septicemia, síndrome de choque tóxico o enfermedad infecciosa.
30. Un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 2-3 ó 10-14; un inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 4-8 ó 15-18; o una composición farmacéutica según la reivindicación 9 ó 19, para tratar una enfermedad inflamatoria inducida por IL-20.
31. Un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 2-3 ó 10-14; un inmunoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 4-8 ó 15-18; o una composición farmacéutica según la reivindicación 9 ó 19, para suprimir una respuesta inflamatoria en un mamífero, en el que la supresión de dicha respuesta inflamatoria se define por una falta de aumento o disminución en el nivel de proteína amiloide A sérica en el mamífero.
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