DE60030769T2

DE60030769T2 - Verfahren zur behandlung von entzündungen

Info

Publication number: DE60030769T2
Application number: DE60030769T
Authority: DE
Inventors: Penny Snohomish THOMPSON; C. Donald Lake Forest Park FOSTER; Wenfeng Seattle XU; L. Karen Bellevue MADDEN; D. James Mercer Island KELLY; A. Cindy Hereford SPRECHER; Hal Seattle BLUMBERG; A. Maribeth Seattle EAGAN; R. Stephen Edmonds JASPERS; Yasmin Saratoga Chandrasekher; E. Julia Suquamish NOVAK
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2020-12-23
Also published as: ATE459369T1; EP1244708A1; EP1616575B1; JP2012025766A; EP1743648B1; CA2395406C; DE60030769D1; EP1616575A1; ES2387394T3; JP2003535037A; DE60043957D1; JP2012025737A; EP2295078A3; AU2458001A; EP2295078A2; EP1743648A1; EP2248828A1; PT1616575E; WO2001046261A1; EP1244708B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Eine Entzündung ist normalerweise eine lokalisierte, vorbeugende Reaktion auf Trauma oder mikrobielle Invasion, die das schädliche Agens und das verletzte Gewebe zerstört, ausdünnt oder abstößt. In akuter Form ist sie charakterisiert durch die klassischen Anzeichen von Schmerz, Hitze, Rötung, Anschwellung und Funktionsverlust. Mikroskopisch bezieht sie eine komplexe Reihe an Ereignissen mit ein, einschließlich der Aufweitung von Arterien, Kapillaren und Venen, verbunden mit erhöhter Durchlässigkeit und Blutfluss, Ausscheidung von Flüssigkeiten, einschließlich Plasmaproteinen, und Leukozyten-Einwanderung in den Entzündungsbereichen.
Durch die Entzündung gekennzeichnete Erkrankungen sind signifikante Ursachen für Morbidität und Sterblichkeit bei Menschen. Gewöhnlich tritt die Entzündung als eine abwehrende Reaktion auf die Invasion des Wirtes durch fremdes, insbesondere mikrobielles, Material ein. Reaktionen auf mechanisches Trauma, Toxine und Neoplasie können ebenfalls zu entzündlichen Reaktionen führen. Die Ansammlung und nachfolgende Aktivierung von Leukozyten sind die zentralen Ereignisse in der Pathogenese der meisten Entzündungsformen. Defizite der Entzündung gefährden den Wirt. Übermäßige Entzündung, die durch abnormale Erkennung des Wirtsgewebes als fremd oder Verlängerung des Entzündungsprozesses verursacht wird, kann zu so verschiedenen Entzündungserkrankungen führen wie Diabetes, Arteriosklerose, Katarakt, Reperfusionsschädigung und Krebs, zu nachinfektiösen Syndromen, wie beispielsweise infektiöser Meningitis, rheumatischem Fieber, und zu rheumatischen Erkrankungen, wie beispielsweise systemischem Lupus erythematosus und rheumatoider Arthritis. Die zentrale Rolle der Entzündungsreaktion in diesen verschiedenen Erkrankungsprozessen macht deren Regulierung zu einem Hauptelement in der Vorbeugungskontrolle oder Heilung humaner Erkrankung.
Ein wichtiges Cytokin im Entzündungsprozess ist Interleukin-8 (IL-8). IL-8 ist ein Chemokin. Es wurde aufgrund zweier Effekte, der Chemotaxis und der Freisetzung granulierter Enzyme, als ein Agonist für Neutrophile identifiziert. IL-8 bindet an zwei Rezeptoren auf Neutrophilen. IL-8-Rezeptoren werden ebenfalls auf Monocyten, Basophilen und Eosinophilen gefunden. In humanen Fibroblasten wurde für das Cytomegalovirus gezeigt, dass es die Expression von IL-8-Rezeptoren induziert und diese schneller repliziert, wenn Zellen dem IL-8 ausgesetzt werden. IL-8 ist ein potenter Chemoattraktant für Neutrophile und die ersten Stadien der Paradontalerkrankung sind durch den Einstrom von Neutrophilen gekennzeichnet. IL-8 ist ein potenter Verursacher von Angiogenese in verschiedenen Angiogenese-abhängigen chronischen Entzündungszuständen, einschließlich rheumatoider Arthritis, Psoriasis und idiopathischer Lungenfibrose. Zusätzlich ist IL-8 eine wichtige Quelle für die angiogenische Aktivität in humanem Lungenkrebs. Die IL-8-Expression korreliert ebenfalls mit experimenteller metastatischer Aktivität in einigen Melanom-Zelllinien. Ein wirksames Verfahren zur Behandlung von Entzündungserkrankungen wäre somit die Verabreichung eines Mittels, das IL-8 inhibieren würde.
WO 99/27103 beschreibt Interleukin-20(IL-20)-Polypeptide und entsprechende Polynukleotide und deren Verwendung zur Detektion und Behandlung von Funktionsstörungen im Zusammenhang mit dem Immunsystem.
US 5945511 beschreibt Klasse-II-Cytokin-Rezeptor-Polypeptide und entsprechende Polypeptide und deren Verwendung in der Unterstützung der Proliferation und/oder Differenzierung von einer Reihe an Geweben.
Die vorliegende Erfindung wird diesem Bedarf im Stand der Technik gerecht durch Bereitstellung der Verwendung eines löslichen Rezeptors, der an das IL-20-Polypeptid bindet, wobei das IL-20-Polypeptid eine Aminosäure-Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 und 9, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Entzündungserkrankung, wobei der lösliche Rezeptor umfasst: eine erste Untereinheit, wobei diese erste Untereinheit eine Aminosäure-Sequenz, ausgewählt aus SEQ ID NOs: 11, 12, 55, 63 und 65, oder ein Fragment davon, das an ein IL-20-Polypeptid bindet, umfasst, und eine zweite Untereinheit, wobei diese zweite Untereinheit eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus SEQ ID NOs: 14, 15, 19, 59, 61, 67, 68 und 69, oder ein Fragment davon, das an ein IL-20-Polypeptid bindet, umfasst; wobei die Entzündungserkrankung eine Hauterkrankung ist.
1-8 sind schematische Darstellungen einer repräsentativen Anzahl an Ausführungsformen des löslichen IL-20-Rezeptors.
Wir haben gezeigt, dass IL-20 IL-8 hochreguliert. Entzündungserkrankungen, in welchen IL-8 eine signifikante Rolle spielt und für welche eine Erhöhung von IL-8 vorteilhaft wäre, sind die adulte Atmungserkrankung („adult respiratory disease", ARD), septischer Schock, multiples Organversagen, entzündliche Lungenbeschädigung, wie beispielsweise Asthma oder Bronchitis, bakterielle Pneomonie, Psoriasis und die entzündliche Darmerkrankung, wie beispielsweise ulzerative Kolitis und Crohnsche Erkrankung, Ekzem, atopische Dermatitis und Kontaktdermatitis. Somit können IL-20-Antagonisten verwendet werden, um diese Erkrankungen zu behandeln.
Die Lehren aller Referenzen, die hier zitiert werden, sind in deren Gesamtheit durch Bezugnahme darauf umfasst.
Definitionen
Vor der detaillierten Darlegung der Erfindung kann es für deren Verständnis vorteilhaft sein, die folgenden Terme zu definieren.
Die Terme "Amino-terminal" und "Carboxyl-terminal" werden hier verwendet, um Positionen in Polypeptiden zu bezeichnen. Solange es aus dem Kontext möglich ist, werden diese Terme mit Bezug auf eine bestimmte Sequenz oder einen Teil eines Polypeptids verwendet, um die Nähe dazu oder die relative Position zu bezeichnen. Zum Beispiel ist eine bestimmte Sequenz, die Carboxyl-terminal zu einer Bezugssequenz in einem Polypeptid positioniert ist, nahe dem Carboxyl-Terminus der Bezugssequenz lokalisiert, ist aber nicht notwendigerweise am Carboxyl-Terminus des vollständigen Polypeptids.
Der Term "komplementäres/antikomplementäres Paar" bezeichnet nicht-identische Reste, die unter geeigneten Bedingungen ein nicht-kovalent assoziiertes, stabiles Paar bilden. Zum Beispiel sind Biotin und Avidin (oder Streptavidin) prototypische Mitglieder eines komplementären/anti-komplementären Paares. Andere exemplarische komplementäre/anti-komplementäre Paare beinhalten Rezeptor/Ligand-Paare, Antikörper/Antigen(oder Hapten oder Epitop)-Paare, "Sense/Antisense"-Polynukleotid-Paare und Ähnliches. Sofern eine nachfolgende Dissoziation des komplementären/anti-komplementären Paares erwünscht ist, weist das komplemen täre/anti-komplementäre Paar vorzugsweise eine Bindungsaffinität von < 10⁹ M^–1 auf.
Der Term "Komplementäre eines Polynukleotid-Moleküls" ist ein Polynukleotid-Molekül, das eine komplementäre Basensequenz und reverse Orientierung im Vergleich zu einer Bezugssequenz aufweist. Zum Beispiel ist die Sequenz 5' ATG-CACGGG 3' komplementär zu 5' CCCGTGCAT 3'.
Der Term "Contig" bezeichnet ein Polynukleotid, das einen zusammenhängenden ("contiguous") Abschnitt einer identischen oder komplementären Sequenz zu einem anderen Polynukleotid aufweist. Zusammenhängende Sequenzen sollen mit einem gegebenen Abschnitt der Polynukleotid-Sequenz entweder in deren Gesamtheit oder entlang eines teilweisen Abschnitts des Polynukleotids "überlappen". Zum Beispiel stellen 5'-TAGCTTgagtct-3'- und 3'-gtcgacTACCGA-5' repräsentative "Contigs" zu der Polynukleotid-Sequenz 5'-ATGGCTTAGCTT-3' dar.
Der Term "degenerierte Nukleotid-Sequenz" bezeichnet eine Sequenz von Nukleotiden, die ein oder mehr degenerierte(s) Codon(s) (im Vergleich zu einem Bezugs-Polynukleotid-Molekül, das für ein Polypeptid kodiert) beinhaltet. Degenerierte Codons enthalten unterschiedliche Tripletts von Nukleotiden, kodieren aber für den gleichen Aminosäure-Rest (d. h., GAU- und GAC-Tripletts kodieren jeweils für Asp).
Der Term "Expressions-Vektor" wird zur Bezeichnung eines linearen oder zirkulären DNA-Moleküls verwendet, das ein Segment umfasst, das für ein interessierendes Polypeptid kodiert, welches mit zusätzlichen Segmenten, die für deren Transkription vorgesehen sind, operabel verknüpft ist. Solche zusätzlichen Segmente beinhalten Promotor- und Terminator-Sequenzen und können ebenfalls einen oder mehr Replikationsursprung/ursprünge ("origins of replication"), einen oder mehr selektierbare(n) Marker, einen Verstärker ("enhancer"), ein Polyadenylierungs-Signal, etc. beinhalten. Expressions-Vektoren stammen allgemein von Plasmiden oder viraler DNA oder können Elemente von beiden enthalten.
Der Term "isoliert" beschreibt, sofern auf ein Polynukleotid angewendet, dass das Polynukleotid aus dessen natürlichem genetischem Milieu entfernt wurde und so mit von anderen fremden oder ungewollten kodierenden Sequenzen frei ist und in einer Form vorliegt, die zur Verwendung in genetisch konstruiertem Protein-Herstellungssystemen geeignet ist. Diese isolierten Moleküle sind solche, die aus ihrer natürlicher Umgebung separiert wurden, und sie beinhalten cDNA- und genomische Klone. Isolierte DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind frei von anderen Genen, mit welchen sie gewöhnlich assoziiert sind, sie können aber natürlich vorkommende 5'- und 3'-untranslatierte Regionen, wie beispielsweise Promotoren und Terminatoren, beinhalten. Die Identifizierung assoziierter Regionen wird für einen Durchschnittsfachmann offensichtlich sein (siehe zum Beispiel Dynan and Tijan, Nature 316:774-78 (1985)).
Ein "isoliertes" Polypeptid oder Protein ist ein Polypeptid oder Protein, das in einem anderen Zustand als dessen nativer Umgebung vorgefunden wird, wie beispielsweise außerhalb von Blut oder Lebewesen-Gewebe. In einer bevorzugten Form ist das isolierte Polypeptid wesentlich frei von anderen Polypeptiden, insbesondere von anderen Polypeptiden tierischen und menschlichen Ursprungs. Es ist bevorzugt, die Polypeptide in einer hochaufgereinigten Form, d. h. mehr als 95% rein, bevorzugt mehr als 99% rein, bereitzustellen. Sofern er in diesem Kontext verwendet wird, schließt der Term "isoliert" die Anwesenheit des gleichen Polypeptids in alternativen Gestalten, wie beispielsweise Dimeren oder alternativ glykosylierten oder derivatisierten Formen, nicht aus.
Der Term "operabel verknüpft" weist, sofern er sich auf DNA-Segmente bezieht, darauf hin, dass die Segmente in der Weise angeordnet sind, dass sie für deren beabsichtigte Zwecke zusammenarbeiten, z. B. die Transkription startet im Promotor und schreitet über das kodierende Segment zum Terminator fort.
Ein "Polynukleotid" ist ein einzel- oder doppel-strängiges Polymer aus Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotid-Basen, die vom 5'- zum 3'-Ende gelesen werden. Polynukleotide beinhalten RNA und DNA und können aus natürlichen Quellen isoliert, in vitro synthetisiert oder aus einer Kombination aus natürlichen und synthetischen Molekülen hergestellt sein. Polynukleotid-Größen werden als Basenpaare (abgekürzt "bp"), Nukleotide ("nt") oder Kilobasen ("kb") ausgedrückt. Die letzten zwei Terme können, sofern der Kontext es gestattet, Polynukleotide beschreiben, die einzel-strängig oder doppel-strängig sind. Sofern der Term auf doppel-strängige Moleküle angewandt wird, wird er verwendet, um die Gesamtlänge zu bezeichnen, und wird so verstanden, dass er zu dem Term "Basenpaare" äquivalent ist. Von einem Fachmann wird erkannt, dass die zwei Stränge eines doppel-strängigen Polynukleotids sich leicht in der Länge unterscheiden können und dass deren Enden als ein Ergebnis enzymatischer Spaltung versetzt sein können; somit müssen nicht alle Nukleotide in einem doppel-strängigen Polynukleotid-Molekül gepaart sein. Solche ungepaarten Enden werden im Allgemeinen 20 Nukleotide in der Länge nicht überschreiten.
Ein "Polypeptid" ist ein Polymer aus Aminosäure-Resten, die durch Peptid-Bindungen verbunden sind, das entweder natürlich oder synthetisch hergestellt wurde. Polypeptide von weniger als etwa 10 Aminosäure-Resten werden allgemein als "Peptide" bezeichnet.
Der Term "Promotor" wird hier für dessen im Stand der Technik anerkannte Bedeutung verwendet, um einen Teil eines Gens, das DNA-Sequenzen enthält, die für die Bindung der RNA-Polymerase und die Initiierung der Transkription vorgesehen sind, zu bezeichnen. Promotor-Sequenzen werden allgemein, jedoch nicht immer, in den nicht-kodierenden 5'-Regionen von Genen gefunden.
Ein "Protein" ist ein Makromolekül, das eine oder mehr Polypeptid-Kette(n) umfasst. Ein Protein kann ebenfalls nicht-peptidische Komponenten, wie beispielsweise Kohlenhydrat-Gruppen, umfassen. Kohlenhydrate und andere nicht-peptidische Substituenten können an ein Protein durch die Zelle, in welcher das Protein hergestellt wird, angefügt werden und sie variieren mit dem Zelltyp. Proteine werden hier über ihre Aminosäure-Rückgrat-Strukturen definiert; Substituenten, wie beispielsweise Kohlenhydrat-Gruppen, werden allgemein nicht spezifiziert, können aber trotzdem vorhanden sein.
Der Term "Rezeptor" bezeichnet ein Zell-assoziiertes Protein, das an ein bioaktives Molekül (d. h. einen Liganden) bindet und die Wirkung des Liganden auf die Zelle vermittelt. Membran-gebundene Rezeptoren sind durch eine Mehrfach-Domänen-Struktur gekennzeichnet, umfassend eine extrazelluläre Ligandenbindungs-Domäne und eine intrazelluläre Effektor-Domäne, die typischerweise in die Signal-Transduktion einbezogen ist. Die Bindung des Liganden an den Rezeptor führt zu einer Konformationsänderung in dem Rezeptor, die eine Interaktion zwischen der Effektor-Domäne und anderem/n Molekül(en) in der Zelle verursacht. Diese Interaktion führt ihrerseits zu einer Änderung im Metabolismus der Zelle. Metabolische Ereignisse, die mit Rezeptor-Ligand-Interaktionen verknüpft sind, beinhalten die Gen-Transkription, Phosphorylierung, Dephosphorylierung, Anstiege in der Produktion von cyclischem AMP, Mobilisierung des zellulären Calciums, Mobilisierung von Membran-Lipiden, Zelladhäsion, Hydrolyse von Inositol-Lipiden und Hydrolyse von Phospholipiden. Im Allgemeinen können Rezeptoren Membran-gebunden, cytosolisch oder nuklear (Kern-bezogen), monomer (z. B. Schilddrüsenstimulierender Hormon-Rezeptor, Beta-adrenergischer Rezeptor) oder multimer (z. B. PDGF-Rezeptor, Wachstumshormon-Rezeptor, IL-3-Rezeptor, GM-CSF-Rezeptor, G-CSF-Rezeptor, Erythropoietin-Rezeptor und IL-6-Rezeptor) sein.
Der Term "sekretorische Signal-Sequenz" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid (ein "sekretorisches Peptid") kodiert, die als eine Komponente eines größeren Polypeptids das größere Polypeptid durch einen sekretorischen Pfad einer Zelle, in welcher es synthetisiert wird, führt. Das größere Polypeptid wird häufig geschnitten, um das sekretorische Peptid während des Durchgangs durch den sekretorischen Pfad zu entfernen.
Molekular-Gewichte und -Längen von Polymeren, die durch unpräzise analytische Verfahren (z. B. Gelelektrophorese) bestimmt werden, sollen als ungefähre Werte verstanden werden. Sofern ein solcher Wert als "etwa" X oder "ungefähr" X ausgedrückt wird, soll der angegebene Wert von X als auf ±10% genau verstanden werden.
Einleitung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von Entzündung und Entzündungserkrankungen, in welchen IL-20 entweder in der Initiierung oder Ausbreitung oder Erhaltung eine Rolle spielt, durch Verabreichung eines Antagonisten von IL-20 an das betroffene Individuum. Dieser Antagonist kann ein Antikörper gegen IL-20, ein löslicher Rezeptor, der an IL-20 bindet, ein „Antisense"-Molekül oder ein Antikörper, der entweder an die IL-20RA-Untereinheit oder die IL-20RB-Untereinheit des IL-20-Rezeptors bindet, sein.
Die Definition von IL-20 und Verfahren zu dessen Herstellung und Antikörper gegen IL-20 sind in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US98/25228, Veröffentlichungs-Nr. WO 99/27103, veröffentlicht am 25. November 1998, und U.S.-Patentanmeldung Nr. 09/313,458, eingereicht am 17. Mai 1999, enthalten. Das Polynukleotid und Polypeptid des humanen IL-20 sind durch SEQ ID NOs. 1-4 und des Maus-IL-20 durch SEQ ID NOs: 5-9 dargestellt.
Der Rezeptor von IL-20 wurde aufgeklärt und er ist ein Heterodimer, umfassend das Polypeptid, bezeichnet als 'IL-20RA' (formal als Zcytor7 benannt), und ein Polypeptid, bezeichnet als 'IL-20RB'. Das IL-20RA-Polypeptid, die Nukleinsäure, die dafür kodiert, Antikörper gegen IL-20RA und Verfahren zu dessen Herstellung sind in U.S.-Patent Nr. 5,945,511, erteilt am 31. August 1999, offenbart. SEQ ID NOs: 10-12 sind die IL-20RA-Polynukleotide und -Polypeptide. Die extrazelluläre Domäne des humanen IL-20RA besteht aus einem Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOs: 12, 55, 63 und 65. Die Rezeptor-Untereinheit mit voller Länge besteht aus SEQ ID NO: 11. Die extrazelluläre Domäne des Maus-IL-20RA ist SEQ ID NO: 38 und SEQ ID NO: 37 ist das gesamte Maus-IL-20RA.
Die extrazelluläre Domäne von IL-20RB (SEQ ID NOs: 13-14 und eine Variante SEQ ID NOs: 18 und 19) besteht aus einem Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOs: 15, 59, 61, 67, 68 und 69. Vorzugsweise sind die extrazelluläre Domäne des IL-20RA-Polypeptids und die extrazelluläre Domäne des IL-20RB-Polypeptids kovalent miteinander verknüpft. In einer bevorzugten Ausführungsform weist ein Polypeptid der extrazellulären Untereinheit eine konstante Region einer schweren Kette eines Immunoglobulins auf, die an dessen Carboxy-Terminus fusioniert ist, und die andere extrazelluläre Untereinheit weist eine konstante leichte Kette eines Immunoglobulins (Ig) auf, die an deren Carboxy-Terminus so fusioniert ist, dass die zwei Polypeptide beieinander liegen und einen löslichen Rezeptor bilden und eine Disulfid-Bindung zwischen den schweren und leichten Ig-Ketten gebildet wird. In einem anderen Verfahren könnte die Peptid-Verknüpfung ("linker") an zwei Carboxy-Termini der Polypeptide fusioniert sein, um einen kovalent gebundenen löslichen Rezeptor zu bilden.
SEQ ID NOs: 22 und 23 sind Konstrukte der extrazellulären Domäne von IL-20RA, fusioniert an eine konstante Gamma-1-Region eines mutierten humanen Immunoglobulins, die gemäß dem in Beispiel 5 dargestellten Verfahren hergestellt wurden. SEQ ID NO: 62 ist die vorhergesagte reife Sequenz ohne die Signal-Sequenz. SEQ ID NOs: 20 und 21 sind Konstrukte der extrazellulären Domäne von IL-20RB, fusioniert an die konstante Region der leichten Kappa-Kette des humanen Wildtyp-Immunoglobulin, die gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 hergestellt wurden. SEQ ID NO: 60 ist die vorhergesagte reife Sequenz ohne die Signal-Sequenz. 1 zeigt das nach Beispiel 5 hergestellte Heterotetramer.
SEQ ID NOs: 52 und 53 sind Konstrukte der extrazellulären Domäne von IL-20RA, fusioniert an eine konstante Gamma-1-Region eines mutierten humanen Immunoglobulins, die gemäß dem in Beispiel 12 dargestellten Verfahren hergestellt wurden. SEQ ID NO: 54 ist die vorhergesagte reife Sequenz ohne die Signal-Sequenz. SEQ ID NOs: 56 und 57 sind Konstrukte der extrazellulären Domäne von IL-20RB, fusioniert an die konstante Region der leichten Kappa-Kette des humanen Wildtyp-Immunoglobulins, die gemäß dem Verfahren von Beispiel 12 hergestellt wurden. SEQ ID NO: 58 ist die vorhergesagte reife Sequenz ohne die Signal-Sequenz. Das resultierende Heterotetramer ist mit dem nach Beispiel 5 hergestellten Heterotetramer nahezu identisch, wobei der größte Unterschied die Abwesenheit einer Polypeptid-Verknüpfung ("linker") zwischen den extrazellulären Domänen und dem Anfang der konstanten Regionen des Ig, 22 in 1, ist. Nachfolgend bedeutet der Term "extrazelluläre Domäne eines Rezeptors" die extrazelluläre Domäne des Rezeptors oder einen Teil der extrazellulären Domäne, der für die Bindung dessen/deren Liganden notwendig ist, wobei der Ligand in diesem Fall IL-20 ist.
Die extrazellulären Domänen von IL-20RA und IL-20RB können auf viele Weisen miteinander verknüpft werden, so dass der resultierende lösliche Rezeptor IL-20 binden kann. 1-8 veranschaulichen eine repräsentative Anzahl an Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Die gleichen Elemente in jeder der Zeichnungen sind mit der gleichen Nummer versehen. 1 stellt die gemäß Beispiel 5 (unten) hergestellte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. Das lösliche Rezeptor-Konstrukt, bezeichnet als 10, besteht aus zwei IL-20-Bindungsstellen-Polypeptid-Ketten, bezeichnet als 12 und 14. Jede Bindungsstelle besteht aus der extrazellulären Domäne von IL-20RA, bezeichnet als 16, und der extrazellulären Domäne von IL-20RB, bezeichnet als 18.
Die extrazelluläre Domäne, 16, von IL-20RA ist mit der konstanten schweren (eins) (CH1)-Domäne, 20, der konstanten Region der schweren Gamma-1-Kette des humanen Immunoglobulins über Verknüpfung ("linker") 22 verknüpft, welche SEQ ID NO: 72 ist. Die CH1-Domäne, 20, ist danach mit der CH2-Domäne, 24, über die Gelenkregion 23 verknüpft. Die CH2-Domäne, 24, ist mit der CH3-Domäne, 26, über die Gelenkregion 25 verknüpft.
Im Vergleich des Konstrukts von 1 mit SEQ ID NO: 22 reicht die extrazelluläre Domäne, 16, von IL-20RA vom Aminosäure-Rest 36, einem Valin, bis einschließlich Aminosäure-Rest 249, einem Glutamin, von SEQ ID NO: 22. Polypeptid-Verknüpfung ("linker"), 22, reicht vom Aminosäure-Rest 250, einem Glycin, bis einschließlich Aminosäure-Rest 264, einem Serin, von SEQ ID NO: 22. Die CH1-Domäne, 22 von 1, reicht vom Aminosäure-Rest 265, einem Alanin, bis einschließlich Aminosäure-Rest 362, einem Valin, von SEQ ID NO: 22. Gelenkregion 23 von 1 reicht vom Aminosäure-Rest 363, einem Glutamat, bis einschließlich Aminosäure-Rest 377, einem Prolin, von SEQ ID NO: 22. Ketten 12 und 14 sind über Disulfid-Bindungen 28 und 30 miteinander verbunden. Die Disulfid-Bindungen werden zwischen den schweren Ketten durch Cystein-Reste an Positionen 373 und 376 von SEQ ID NO: 22 jeder der beiden schweren Ketten ausgebildet.
Die extrazelluläre Domäne, 18, von IL-20RB ist mit der konstanten Region der humanen leichten Kappa-Kete (CL), 34 von 1, über Polypeptid-Verknüpfung ("linker") 32 verknüpft, welche das Polypeptid SEQ ID NO: 72 ist. Die extrazelluläre Domäne, 18, von IL-20RB reicht vom Aminosäure-Rest 30, einem Valin, bis einschließlich Aminosäure-Rest 230, einem Alanin, von SEQ ID NO: 20. Polypeptid-Verknüpfung ("linker"), 32, reicht vom Aminosäure-Rest 231, einem Glycin, bis einschließlich Aminosäure-Rest 245, einem Serin, von SEQ ID NO: 20. Die konstante leichte Kappa-Region, 34, reicht vom Aminosäure-Rest 246, einem Arginin, bis einschließlich zum letzten Aminosäure-Rest 352, einem Cystein, von SEQ ID NO: 20. Das Cystein an Position 352 von SEQ ID NO: 20 bildet eine Disulfid-Bindung, 36 in 1, mit dem Cystein an Position 367 von SEQ ID NO: 22 aus.
Die konstante leichte Kette, 34, ist somit mit der Gelenkregion 23 über Disulfid-Bindung, 36, verknüpft. Auf diese Weise ist die extrazelluläre Domäne, 16, von IL-20RA mit der extrazellulären Domäne, 18, von IL-20RB verknüpft und bildet einen löslichen Rezeptor.
Wenn die Cystein-Reste an Position 373 und 376 von SEQ ID NO: 22 zu anderen Aminosäure-Resten verändert wären, wären die beiden IL-20-Bindungs-Polypeptide, 12 und 14, nicht über Disulfid(e) miteinander verbunden und würden ein Konstrukt, wie in 2 gezeigt, das eine Gelenkregion, 27, aufweist, ausbilden.
3 zeigt einen sehr einfachen löslichen Rezeptor 38 der vorliegenden Erfindung, wobei die extrazelluläre Domäne, 16, von IL-20RA mit der extrazellulären Domäne, 18, von IL-20RB über eine Polypeptid-Verknüpfung ("linker"), 40, verbunden ist. Die Polypeptid-Verknüpfung ("linker") beginnt am Amino-Terminus der extrazellulären Domäne, 16, von IL-20RA und ist mit dem Carboxyl-Terminus der extrazellulären Domäne, 18, von IL-20RB verbunden. Die Polypeptid-Verknüpfung ("linker") sollte zwischen 100-240 Aminosäuren in der Länge, vorzugsweise etwa 170 Aminosäure-Reste in der Länge betragen. Eine geeignete Verknüpfung ("linker") würde aus Glycin- und Serin-Resten bestehen. Eine mögliche Verknüpfung ("linker") könnten mehrere Einheiten von SEQ ID NO: 72, vorzugsweise etwa 12, sein.
4 zeigt eine Ausführungsform, in der die extrazelluläre Domäne, 16, von IL-20RA, mit der extrazellulären Domäne, 18, von IL-20RB über Verknüpfung („linker") 40, wie in 3, verknüpft ist. So ist die extrazelluläre Domäne, 16, von IL-20RA mit der CH1-Domäne, 20, wie in 1, durch Polypeptid-Verknüpfung ("linker") 42, welche etwa 30 Aminosäure-Reste in der Länge betragen sollte, verknüpft. Eine ideale Verknüpfung ("linker") würde aus Glycin und Serin, wie in SEQ ID NO: 72, und der Gelenk("hinge")-Sequenz, 23 von 1, bestehen.
5 zeigt eine andere mögliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. In dieser Ausführungsform verknüpft eine Polypeptid-Verknüpfung ("linker") 44 von etwa 15 Aminosäure-Resten, z. B. SEQ ID NO: 72, den Carboxyl-Terminus der extrazellulären Domäne, 18, von IL-20RB mit dem Amino-Terminus der extrazellulären Domäne, 16, von IL-20RA. Eine Polypeptid-Verknüpfung ("linker") 46 von etwa 30 Aminosäure-Resten reicht von dem Carboxyl-Terminus der extrazellulären Domäne, 16, von IL-20RA bis zur CH2-Domäne. Der Carboxyl-Terminus von Verknüpfung ("linker") 46 würde vorzugsweise aus der Gelenkregion bestehen, die vom Aminosäure-Rest 363, einem Glutamat, bis einschließlich Aminosäure-Rest 377, einem Prolin, von SEQ ID NO: 22, reicht. Trotzdem würde die Polypeptid-Verknüpfung ("linker") idealerweise mindestens einen Cystein-Rest an ihrem Carboxyl-Terminus aufweisen, so dass eine Disulfid-Bindung ausgebildet werden könnte.
Der lösliche IL-20-Rezeptor von 6 ist mit dem von 1 identisch, mit Ausnahme der CH3-Domäne, 26 von 1, die in der Ausführungsform von 6 nicht vorhanden ist. Die CH3-Region beginnt mit einem Aminosäure-Rest 488, einem Glycin, und reicht bis zum letzten Rest 594 von SEQ ID NO: 22.
7 zeigt ein lösliches IL-20-Rezeptor-Konstrukt, das mit dem Konstrukt von 1 identisch ist, mit der Ausnahme, dass sowohl die CH2- als auch die CH3-Domänen fehlen. Die CH2- und CH3-Domänen laufen von Aminosäure-Rest 378, einem Alanin, bis zum Ende der Polypeptid-Sequenz von SEQ ID NO: 22.
8 zeigt ein Konstrukt, wobei sowohl IL-20RA, 16, als auch IL-20RB eine Polypeptid-Verknüpfung ("linker"), 48, aufweisen, die an deren entsprechende Carboxyl-Termini fusioniert ist. Jede Polypeptid-Verknüpfung ("linker") weist zwei Cystein-Reste auf, so dass, wenn diese exprimiert werden, die Cysteine zwei Disulfid-Bindungen, 50 und 52, ausbilden. In diesem Fall besteht die Polypeptid-Verknüpfung ("linker") aus der Gelenkregion, 23 in 1. Die Gelenkregion besteht aus Aminosäure-Resten 363, einem Glutamin, bis einschließlich Aminosäure-Rest 377 von SEQ ID NO: 22.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines löslichen Rezeptors, bestehend aus den extrazellulären Domänen von IL-20RA und IL-20RB, bereitgestellt, umfassend (a) Einbringung einer ersten DNA-Sequenz, bestehend aus einem transkriptionalen Promotor, der mit einer ersten sekretorischen Signal-Sequenz "downstream" gefolgt von der DNA im geeigneten Leserahmen operabel verknüpft ist, die für den extrazellulären Teil von IL-20RA kodiert, und der DNA, die für eine konstante Region der leichten Kette eines Immunoglobulins kodiert, in die Wirtszelle; (b) Einbringung eines zweiten DNA-Konstrukts, bestehend aus einem transkriptionellen Promotor, der mit einem zweiten sekretorischen Signal "downstream" gefolgt von einer DNA-Sequenz im geeigneten Leserahmen operabel verknüpft ist, die für den extrazellulären Teil von IL-20RB kodiert, und einer DNA-Sequenz, die für eine konstante Region-Domäne der schweren Kette eines Immunoglobulins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C_H1, C_H2, C_H3 und C_H4, kodiert, in die Wirtszelle; (c) Züchten der Wirtszelle in einem geeigneten Wachstumsmedium unter physiologischen Bedingungen zum Ermöglichen der Sekretion eines Fusionsproteins, bestehend aus der extrazellulären Domäne von IL-20RA und IL-20RB; und (d) Isolierung des Polypeptids aus der Wirtszelle. In einer Ausführungsform kodiert die zweite DNA-Sequenz weiterhin für eine Gelenkregion der schweren Kette eines Immunoglobulins, wobei die Gelenkregion mit der konstanten Region-Domäne der schweren Kette verbunden ist. In einer anderen Ausführungsform kodiert die zweite DNA-Sequenz weiterhin für eine variable Region eines Immunoglobulins, die "upstream" von und im geeigneten Leserahmen mit der konstanten Region der schweren Kette des Immunoglobulins verbunden ist.
In einer alternativen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Herstellung eines löslichen Rezeptors, bestehend aus den extrazellulären Domänen von IL-20RA und IL-20RB, bereitgestellt, umfassend (a) Einbringung einer ersten DNA-Sequenz, bestehend aus einem transkriptionalen Promotor, der mit einer ersten sekretorischen Signal-Sequenz "downstream" gefolgt von der DNA im geeigneten Leserahmen operabel verknüpft ist, die für den extrazellulären Teil von IL-20RB kodiert, und der DNA, die für eine konstante Region der leichten Kette eines Immunoglobulins kodiert, in eine Wirtszelle; (b) Einbringung eines zweiten DNA-Konstrukts, bestehend aus einem transkriptionalen Promotor, der mit einem zweiten sekretorischen Signal "downstream" gefolgt von einer DNA-Sequenz im geeigneten Leserahmen operabel verknüpft ist, die für den extrazellulären Teil von IL-20RA kodiert, und einer DNA-Sequenz, die für eine konstante Region-Domäne der schweren Kette eines Immunoglobulins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus C_H1, C_H2, C_H3 und C_H4, kodiert, in die Wirtszelle; (c) Züchten der Wirtszelle in einem geeigneten Wachstumsmedium unter physiologischen Bedingungen zum Ermöglichen der Sekretion eines dimerisierten heterodimeren Fusionsproteins, bestehend aus der extrazellulären Domäne von IL-20RA und IL-20RB; und (d) Isolierung des dimerisierten Polypeptids aus der Wirtszelle. In einer Ausführungsform kodiert die zweite DNA-Sequenz weiterhin für eine Gelenkregion der schweren Kette eines Immunoglobu lins, wobei die Gelenkregion mit der konstanten Region-Domäne der schweren Kette verbunden ist. In einer anderen Ausführungsform kodiert die zweite DNA-Sequenz weiterhin für eine variable Region eines Immunoglobulins, die "upstream" von und im geeigneten Leserahmen mit der konstanten Region der schweren Kette des Immunoglobulins verbunden ist. (Siehe U.S.-Patent Nr. 5,843,725).
Wie hier verwendet, beinhaltet der Term "Antikörper" polyklonale Antikörper, Affinitäts-aufgereinigte polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper und Antigenbindende Fragmente, wie beispielsweise F(ab')₂- und Fab-proteolytische Fragmente. Genetisch konstruierte intakte Antikörper oder Fragmente, wie beispielsweise chimäre Antikörper, Fv-Fragmente, Einzelketten-Antikörper und Ähnliches genauso wie synthetische Antigen-bindende Peptide und Polypeptide sind ebenfalls beinhaltet. Nicht-humane Antikörper können durch Transplantation nicht-humaner CDRs auf das humane Gerüst und konstante Regionen oder durch Einbau der gesamten nicht-humanen variablen Domänen (optional sie mit einer humanartigen Oberfläche durch Austausch von exponierten Resten „vehüllen", wobei das Ergebnis ein "furnierter" Antikörper ist) humanisiert werden. In manchen Beispielen können humanisierte Antikörper nicht-humane Reste in den Gerüst-Domänen der humanen variablen Region beibehalten, um korrekte Bindungseigenschaften zu verstärken. Durch Humanisierung von Antikörpern kann die biologische Halbwertszeit erhöht werden und das Potential für nachteilige Immunreaktionen nach der Verabreichung an Menschen wird reduziert. Die Bindungsaffinität eines Antikörpers kann durch einen Durchschnittsfachmann leicht bestimmt werden, zum Beispiel durch die Scatchard-Analyse. Eine Vielzahl an dem Fachmann bekannten Assays kann verwendet werden, um Antikörper, die an das Protein oder Polypeptid binden, zu detektieren. Exemplarische Assays werden im Detail in Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Lane (Hrsg.) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988) beschrieben. Repräsentative Beispiele solcher Assays beinhalten: gleichzeitige Immunoelektrophorese, Radioimmunoassay, Radioimmunopräzipitation, Enzymverknüpften Immunosorbentassay (ELISA), Punkt-Blot("dot blot")- oder Western-Blot-Assay, Inhibitions- oder Kompetitions-Assay und Sandwich-Assay.
Wir haben gezeigt, dass IL-20 IL-8 hochreguliert. Entzündungserkrankungen, in welchen IL-8 eine signifikante Rolle spielt und für welche eine Abnahme von IL-8 vorteilhaft wäre, sind adulte Atmungserkrankung ("adult respiratory disease", ARD), septischer Schock, multiples Organversagen, entzündliche Lungenbeschädigung, wie beispielsweise Asthma oder Bronchitis, bakterielle Pneumonie, Psoriasis und entzündliche Darmerkrankung, wie beispielsweise ulzerative Kolitis und Crohnsche Erkrankung, Ekzem, atopische Dermatitis und Kontaktdermatitis. Somit können Antagonisten von IL-20 verwendet werden, um diese Erkrankungen zu behandeln.
Biologie von IL-20, sein Rezeptor und seine Rolle in der Psoriasis
Zwei orphane Klasse-II-Cytokin-Rezeptoren, von denen beide in der Haut exprimiert werden, wurden als IL-20-Rezeptor-Untereinheiten identifiziert. Beide IL-20-Rezeptor-Untereinheiten werden für die Ligandenbindung benötigt, worin sich deren Rolle von der der Untereinheiten in den vier anderen bekannten Klasse-II-Cytokin-Rezeptoren unterscheidet. IL-20RA und IL-20RB werden neben der Haut ebenfalls in einer Anzahl humaner Gewebe, einschließlich Ovarium, Adrenaldrüse, Hoden, Speicheldrüse, Muskel, Lunge, Niere, Herz und zu einem geringeren Maße im Dünndarm co-exprimiert, was auf zusätzliche Target-Gewebe für die IL-20-Wirkung hinweist. Zusätzlich haben wir die IL-20RA-mRNA, nicht aber die IL-20RB-mRNA, in verschiedenen humanen Geweben detektiert, einschließlich Magen, Schilddrüse, Pankreas, Gebärmutter, Gehirn und Prostata, was darauf hinweist, dass IL-20RA mit anderen Klasse-II-Rezeptor-Untereinheiten Partnerschaften eingehen kann. Wir schließen daraus, dass der heterodimere IL-20-Rezeptor zu anderen Klasse-II-Cytokin-Rezeptoren strukturell ähnlich ist und in der Haut exprimiert wird, wo wir die Aktivität des IL-20-Liganden gezeigt haben.
Zwei Indizien deuten darauf hin, dass IL-20 und dessen Rezeptor in die Psoriasis einbezogen sind. Diese multigenetische Hauterkrankung ist durch Keratinocyten-Proliferation, veränderte Keratinocyten-Differenzierung und Infiltration von Immun-Zellen in die Haut gekennzeichnet. Das erste Indiz für eine Rolle von IL-20 in der Psoriasis ist, dass die beobachtete Hyperkeratose und verdickte Epidermis in transgenen Mäusen humanen psoriatischen Abnormitäten ähneln. Erniedrigte Mengen an Tonofilamenten, von denen angenommen wurde, dass sie mit gestörter Keratinisierung in Zusammenhang stehen, sind ein auffälliges Merkmal der humanen Psoriasis. Intramitochondriale Einschlüsse wurden sowohl in chemisch induzierten als auch in natürlich auftretenden hyperplastischen Hautzuständen in Mäusen gefunden. Die Ursache für die Einschlüsse und deren Wirkung auf die mitochondriale Funktion sind, falls überhaupt vorhanden, unbekannt. Wir schließen daraus, dass IL-20-transgene Mäuse viele der in der humanen Psoriasis beobachteten Kennzeichen aufweisen.
Ein zweites Indiz, das den IL-20-Rezeptor in der Psoriasis impliziert, ist, dass sowohl IL-20RA- als auch IL-20RB-mRNA in der humanen psoriatischen Haut, im Vergleich zur normalen Haut, deutlich hochreguliert sind. Beide IL-20-Rezeptor-Untereinheiten werden in Keratinocyten in der gesamten Epidermis exprimiert und werden ebenfalls in einem Teil der Immun- und Endothelial-Zellen exprimiert. Wir schlagen vor, dass die erhöhte Expression eines aktivierten IL-20-Rezeptors die Interaktionen zwischen Endothelial-Zellen, Immun-Zellen und Keratinocyten verändern könnte, was zu einer Deregulierung der Keratinocyten-Proliferation und -Differenzierung führt.
Ein kritischer Schritt im Verstehen der Funktion eines neuen Cytokins ist die Identifizierung und Charakterisierung dessen verwandten Rezeptors. Wir haben eine Struktur-basierte Näherung zum Isolieren eines neuen Interleukins erfolgreich verwendet, was schließlich zur Isolierung dessen Rezeptors führte. IL-20 stimuliert die Signal-Transduktion in der humanen Keratinocyten-HaCaT-Zelllinie, was eine direkte Wirkung dieses neuen Liganden in der Haut nahelegt. Zusätzlich verstärken IL-1β, EGF und TNF-α, Proteine, die dafür bekannt sind, dass sie in Keratinocyten aktiv sind, und in die proliferativen und pro-entzündlichen Signale in der Haut einbezogen sind, die Reaktion auf IL-20. Sowohl in HaCaT- als auch BHK-Zellen, die den IL-20-Rezeptor exprimieren, signalisiert IL-20 durch STAT3.
Verwendung des Antagonisten von IL-20 zur Behandlung der Psoriasis
Wie oben in der Diskussion und unten in den Beispielen angedeutet, ist IL-20 in die Pathologie der Psoriasis einbezogen. Die vorliegende Erfindung ist insbesondere ein Verfahren zur Behandlung von Psoriasis durch Verabreichung von Antagonisten von IL-20. Die Antagonisten von IL-20 können entweder ein löslicher Rezeptor, der an IL-20 bindet, oder Antikörper, Einzelketten-Antikörper oder Fragmente von Antikörpern, die entweder an IL-20 oder an den IL-20-Rezeptor binden, sein. Die Antagonisten werden somit die Aktivierung des IL-20-Rezeptors verhindern.
Psoriasis ist eine der häufigsten dermatologischen Erkrankungen, die bis zu 1 bis 2 Prozent der Weltbevölkerung befällt. Sie ist eine chronische entzündliche Funktionsstörung der Haut, die durch erythematose, scharf markierte/umrissene/deformierte Papulen bzw. Pusteln und abgerundete Plaques, bedeckt von silberlichen glimmerartigen Schuppen, gekennzeichnet ist. Die Psoriasis-Hautläsionen sind veränderlich juckend. Traumatisierte Bereiche entwickeln oft Psoriasis-Läsionen. Zusätzlich können andere externe Faktoren die Psoriasis erschweren, einschließlich Infektionen, Stress und Medikation, z. B. Lithium, Beta-Blocker und Anti-Malariamittel.
Die häufigste Art der Psoriasis wird als Plaque-Typ bezeichnet. Patienten mit der Plaque-Typ-Psoriasis weisen stabile, langsam wachsende Plaques auf, welche für lange Zeitdauern grundlegend unverändert bleiben. Die häufigsten Bereiche, an denen die Plaque-Psoriasis auftritt, sind Ellbogen, Knie, Gesäßspalte und die Kopfhaut. Das Auftreten ist meistens symmetrisch. Inverse Psoriasis befällt die intertriginen Regionen, einschließlich der Achselhöhle, Leistengegend, Unterbrust-Region und des Nabels, und sie befällt ebenfalls oft die Kopfhaut, die Handflächen und Fußsohlen. Die einzelnen Läsionen sind scharf markierte/umrissene/deformierte Plaques, die aber aufgrund ihrer Lokalisierung feucht sein können. Die Plaque-Typ-Psoriasis entwickelt sich allgemein langsam und verläuft nicht schmerzhaft. Sie klingt selten spontan ab.
Die Eruptiv-Psoriasis ("guttate psoriasis") kommt am häufigsten bei Kindern und jungen Erwachsenen vor. Sie entwickelt sich akut bei Individuen ohne Psoriasis oder bei solchen, die an der chronischen Plaque-Psoriasis leiden. Patienten weisen viele kleine erythematose Schuppen-Papulen auf, häufig nach der Infektion des oberen Atmungstrakts mit Beta-hämolytischen Streptokokken. Patienten mit Psoriasis können ebenfalls Pustel-Läsionen entwickeln. Diese können an den Handflächen oder Fußsohlen lokalisiert sein oder können überall vorliegen und mit Fieber, Unwohlsein, Diarrhoe und Arthralgie assoziiert sein.
Bei etwa der Hälfte aller Patienten mit Psoriasis sind die Fingernägel betroffen, was als punktuelle Grüppchenbildung, Nagelverdickung oder subunguale Hyperkeratose erscheint. Bei etwa 5 bis 10 Prozent der Patienten mit Psoriasis gehen Gelenksbeschwerden einher und diese werden am häufigsten bei Patienten vorgefunden, bei denen die Fingernägel betroffen sind. Obwohl bei manchen Patienten die klassische rheumatoide Arthritis zufällig auftritt, weisen viele Patienten Gelenkserkrankungen auf, die unter einen der fünf Typen, die mit Psoriasis assoziiert sind, fallen: (1) Erkrankung, die auf ein einzelnes oder ein paar wenige Gelenke beschränkt ist (70 Prozent der Fälle); (2) eine seronegative rheumatoide Arthritis-artige Erkrankung; (3) Einbezug der distalen interphalangealen Gelenke; (4) schwere destruktive Arthritis mit der Entwicklung von "Arthritis mutilans" und (5) Erkrankung, die auf die Wirbelsäule beschränkt ist.
Psoriasis kann durch Verabreichung von Antagonisten von IL-20 behandelt werden. Die bevorzugten Antagonisten sind entweder ein löslicher Rezeptor von IL-20 oder Antikörper, Antikörper-Fragmente oder Einzelketten-Antikörper, die entweder an den IL-20-Rezeptor oder an IL-20 binden. Die Antagonisten von IL-20 können allein oder in Kombination mit anderen bewährten Therapien, wie beispielsweise Gleitmitteln, Keratolytika, topischen Corticosteroiden, topischen Vitamin D-Derivaten, Anthralin, systemischen Antimetaboliten, wie beispielsweise Methotrexat, Psoralen-Ultraviolett-Lichttherapie ("psoralen-ultraviolet-light therapy", PUVA), Etretinat, Isotretinoin, Cyclosporin und dem topischen Vitamin D3-Derivat Calcipotriol, verabreicht werden. Die Antagonisten, insbesondere der lösliche Rezeptor oder die Antikörper, die an IL-20 oder den IL-20-Rezeptor binden, können dem Individuum subkutan, intravenös oder transdermal unter Verwendung einer Creme oder eines transdermalen Pflasters, die/das den Antagonisten von IL-20 enthält, verabreicht werden. Bei subkutaner Verabreichung kann der Antagonist in ein oder mehr psoriatische(s) Plaque(s) injiziert werden. Bei transdermaler Verabreichung kann der Antagonist direkt auf die Plaques unter Verwendung einer Creme, die den Antagonisten von IL-20 enthält, verabreicht werden.
Verwendung von Antagonisten von IL-20 zur Behandlung von Entzündungszuständen in der Lunge
Antagonisten von IL-20 können an eine Person verabreicht werden, welche Asthma, Bronchitis oder zystische Fibrose oder andere entzündliche Lungenerkrankungen aufweist, um die Erkrankung zu behandeln. Die Antagonisten können durch jedes beliebige geeignete Verfahren verabreicht werden, einschließlich intravenös, subkutan, Bronchialspülung und die Verwendung eines Inhalationsmittels, das einen Antagonisten von IL-20 enthält.
Verabreichung von Antagonisten von IL-20
Die Mengen der Antagonisten von IL-20, die für eine wirksame Therapie notwendig sind, werden von vielen unterschiedlichen Faktoren abhängen, einschließlich der Mittel zur Verabreichung, der zu verabreichenden Stelle, des physiologischen Zustands des Patienten und anderer verabreichter Medikationen. Somit sollten Behandlungsdosierungen titriert werden, um die Sicherheit und Wirksamkeit zu optimieren. Typischerweise können in vitro verwendete Dosierungen einen sinnvollen Hinweis auf die Mengen geben, die zur in vivo-Verabreichung dieser Reagenzien verwendbar sind. Tierversuche zu wirksamen Dosen zur Behandlung von bestimmten Funktionsstörungen werden weitere voraussagende Indikation für humane Dosierung geben. Verfahren zur Verabreichung beinhalten orale, intravenöse, peritoneale, intramuskuläre, transdermale oder Verabreichung in die Lunge oder Luftröhre in Form eines Sprays durch Hilfsmittel oder einen Vernebler oder Zerstäuber. Pharmazeutisch akzeptierbare Träger werden Wasser, Salzlösung, Puffer beinhalten, um nur ein paar wenige zu benennen. Als Dosierungsbereiche würden gewöhnlich von 1 μg bis 1000 μg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag erwartet werden. Eine Dosierung des löslichen IL-20-Rezeptors würde für einen Durchschnittserwachsenen bei etwa 25 mg liegen, die zweimal wöchentlich als eine subkutane Injektion verabreicht wird. Die Dosierung eines Antikörpers, der an IL-20 bindet, würde bei etwa 25 mg liegen, die zweimal wöchentlich verabreicht wird. Eine Mischung von Antikörpern, die an die IL-20RA- und IL-20-RB-Untereinheiten binden, würde bei etwa 25 mg liegen, die zweimal wöchentlich an einen Erwachsenen verabreicht wird. Die Injektionen könnten an der Stelle von psoriatischen Läsionen zur Behandlung der Psoriasis verabreicht werden. Für subkutane oder intravenöse Verabreichung des Antagonisten von IL-20 kann der Antikörper oder der lösliche Rezeptor in Phosphat-gepufferter Salzlösung vorliegen. In Hauterkrankungen, wie beispielsweise Psoriasis, kann der Antagonist von IL-20 ebenfalls über eine Salbe oder ein transdermales Pflaster verabreicht werden. Die Dosen können höher oder niedriger sein, wie durch einen Mediziner mit Durchschnittsfachwissen bestimmt werden kann. Für eine vollständige Diskussion von Wirkstoffsformulierungen und Dosierungsbereichen siehe Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausg., (Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1996), und Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 9. Ausg. (Pergamon Press 1996).
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiel 1
Hochregulierung von IL-8 durch IL-20
Verfahren:
Normale humane epidermale neonatale Keratinocyten (NHEK) (von Clonetics) wurden bei Passage 2 ausplattiert und bis zur Konfluenz in Gewebskulturplatten mit 12 Kammern gezüchtet. KGM ("Keratinocyte growth media", Keratinocyten-Wachstumsmedium) wurde von Clonetics bezogen. Wenn die Zellen Konfluenz erreichten, wurden sie mit KGM-Medium minus Wachstumsfaktoren = KBM („keratinocyte basal media", Keratinocyten-Grundmedium) gewaschen. Die Zellen wurden 72 Stunden vor der Zugabe der Testverbindung in KBM auf Serumentzug gesetzt. Thrombin bei 1 l.U./ml und Trypsin bei 25 nM wurden als Positivkontrollen verwendet. Ein ml Medium/Kammer wurde zugegeben. Als Negativkontrolle wurde nur KBM verwendet.
IL-20 wurde in KBM-Medium hergestellt und bei variierenden Konzentrationen, von 2,5 μg/ml bis herunter auf 618 ng/ml in einem ersten Experiment und von 2,5 μg/ml bis herunter auf 3 ng/ml in einem zweiten Experiment, zugegeben.
Die Zellen wurden bei 37°C, 5% CO₂ für 48 Stunden inkubiert. Die Überstände wurden entnommen und bei –80°C für einige Tage eingefroren, bevor sie auf IL-8- und GM-CSF-Niveaus untersucht wurden. Humanes IL-8-Immunoassay-Kit Nr. D8050 (RandD Systems, Inc.) und humanes GM-CSF-Immunoassay-Kit Nr. HSGMO (RandD Systems, Inc.) wurden verwendet, um die Cytokin-Produktion nach den Herstelleranweisungen zu bestimmen.
Ergebnisse
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Expression von IL-8 und GM-CSF durch IL-20 induziert wurde.
Beispiel 2
Klonierung von IL-20RB
Klonierung der kodierenden Region von IL-20RB
Zwei PCR-Primer wurden auf Basis der Sequenz aus der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US99/03735 (Veröffentlichungs-Nr. WO 99/46379), eingereicht am 8. März 1999, konstruiert. SEQ ID NO: 16 enthält das ATG(Met1)-Codon mit einer EcoRI-Restriktionsstelle, SEQ ID NO: 17 enthält das Stop-Codon (TAG) mit einer XhoI-Restriktionsstelle. Die PCR-Amplifizierung wurde unter Verwendung einer humanen Keratinocyten(HaCaT)-cDNA-Bibliothek-DNA als einer Matrize und SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 als Primer durchgeführt. Die PCR-Reaktion wurde wie folgt durchgeführt: Inkubation bei 94°C für 1 min, gefolgt von 30 Zyklen von 94°C für 30 sek und 68°C für 2 min, nach zusätzlichen 68°C für 4 min wurde die Reaktion bei 4°C gelagert. Das PCR-Produkt wurde auf 1%-igem Agarose-Gel untersucht und eine 1-kb-DNA-Bande wurde beobachtet. Das PCR-Produkt wurde aus dem Gel herausgeschnitten und die DNA wurde unter Verwendung eines QIAquick-Gel-Extraktions-Kits (Qiagen) aufgereinigt. Die aufgereinigte DNA wurde mit EcoRI und XhoI verdaut und in einen pZP-Vektor kloniert, der als pZP7N bezeichnet wurde. Ein pZP-Plasmid ist ein Säugetier-Expressionsvektor, der eine Expressions-Kassette enthält, die den Maus-Metallothionein-1-Promotor, das humane tPA-Leitpeptid, mehrere Restriktionsstellen zur Insertion von kodierenden Sequenzen, einen „Glu-Glu-Tag" und einen humanen Wachstumshormon-Terminator aufweist. Das Plasmid weist ebenfalls einen E. coli-Ursprung der Replikation ("origin of replication"), eine Expressionseinheit eines Säugetier-selektierbaren Markers, die einen SV40-Promotor, einen Verstärker ("enhancer") und einen Ursprung der Replikation ("origin of replication") aufweist, genauso wie ein DHFR-Gen und den SV40-Terminator. Verschiedene IL-20RB-pZP7N-Klone wurden sequenziert. Sie enthielten alle drei nicht-konservative Mutationen, verglichen mit der Sequenz von IL-20RB in PCT/US99/03735: (Sequenz IL-20RB-pZP7N), 146 Pro (CCC) – Thr (ACC), 148 His (CAT) – Asp (GAT) und 171 Thr (ACG) – Arg (AGG).
Zur Bestätigung der drei Substitutionen im IL-20RB-pZP7N-Klon wurde die PCR-Amplifizierung unter Verwendung dreier unterschiedlicher cDNA-Quellen durchgeführt – fötaler Haut-Marathon-cDNA, HaCaT-cDNA-Bibliothek-DNA und glatter Prostata-Muskel-cDNA-Bibliothek-DNA – als Matrizen. Die PCR-Produkte wurden über ein Gel aufgereinigt und sequenziert. Die Sequenz jedes der drei PCR-Produkte war in Übereinstimmung mit der des IL-20RB-pZP7N-Klons. IL-20RB ist SEQ ID NO: 13 und 14 und die reife extrazelluläre Domäne ist SEQ ID NO: 15.
Beispiel 3
Bindung von IL-20 an das IL-20RB/IL-20RA-Heterodimer
Ein Zell-basierter Bindungsassay wurde verwendet, um nachzuprüfen, ob IL-20 an das IL-20RA-IL-20RB-Heterodimer bindet.
Expressionsvektoren, enthaltend bekannte und orphane Klasse-II-Cytokin-Rezeptoren (einschließlich IL-20RA und IL-20RB), wurden transient in COS-Zellen in verschiedenen Kombinationen transfiziert, welche nachfolgend auf ihre Fähigkeit, Biotin-markiertes IL-20-Protein zu binden, untersucht wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass das IL-20RB-IL-20RA-Heterodimer ein Rezeptor für IL-20 ist. Das verwendete Verfahren ist unten beschrieben.
Die COS-Zell-Transfektion wurde in einer Gewebskulturplatte mit 12 Kammern, wie folgt, durchgeführt: 0,5 μg DNA wurden mit einem Medium vermischt, enthaltend 4 μl Lipofectamin in 92 μl Serum-freiem Dulbecco-modifiziertem Eaglesches Medium (DMEM) (55 mg Natriumpyruvat, 146 mg L-Glutamin, 5 mg Transferrin, 2,5 mg Insulin, 1 μg Selen und 5 mg Fetuin in 500 ml DMEM), bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert und nachfolgend zu 400 μl Serum-freiem DMEM-Medium zugegeben. Diese 500 μl-Mischung wurde nachfolgend zu 1,5 × 10⁵ COS-Zellen/Kammer zugegeben und für 5 Stunden bei 37°C inkubiert. 500 μl 20% fötales Rinderserum(FBS, "fetal bovine serum")-DMEM-Medium wurde zugegeben und über Nacht inkubiert.
Der Assay, eine Modifikation der "Sekretions-Falle" ("secretion trap") (Davis, S., et al., Cell 87 1161-1169 (1996) wurde durchgeführt, wie folgt: Die Zellen wurden mit PBS/1% Rinderserum-Albumin (BSA, "bovine serum albumin") gespült und für 1 Stunde mit TNB (0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl und 0,5% Blockreagens (NEN Renaissance TSA-Direkt-Kit-Kat.-Nr. NEL701) in Wasser) blockiert. Dem folgte eine einstündige Inkubation mit 3 μg/ml biotinyliertem IL-20-Protein in TNB. Die Zellen wurden mit PBS/1% BSA gewaschen und für eine weitere Stunde mit 1:300-verdünntem Streptavidin-HRP (NEN-Kit) in TNB inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurden die Zellen für 15 Minuten mit 1,8% Formaldehyd in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) fixiert.
Die Zellen wurden nachfolgend mit TNT (0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl und 0,05% Tween-20 in Wasser) gewaschen. Positive Bindungssignale wurden nach einer fünfminütigen Inkubation mit Fluorescein-Tyramid-Reagenz 1:50 in Verdünnungs-Puffer (NEN-Kit) verdünnt detektiert. Die Zellen wurden mit TNT gewaschen, mit Vectashield Mounting Media (Vector Labs), 1:5 in TNT verdünnt, konserviert und unter Verwendung eines FITC-Filters auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop visualisiert.
Beispiel 4
Hochregulierung der entzündlichen Cytokine durch IL-20
Zellbehandlung
Die humane Keratinocyten-Zelllinie HaCaT wurde bei 37°C in T-75-Gewebskulturflaschen bis zu einigen Tagen nach der Konfluenz gezüchtet. Zu diesem Zeitpunkt wurde das normale Wachstumsmedium (DMEM + 10% FBS) entfernt und durch Serum-freies Medium ausgetauscht. Die Zellen wurden nachfolgend für zwei Tage bei 37°C inkubiert. DMEM wurde nachfolgend entfernt und vier Flaschen mit Zellen pro Behandlung wurden mit jeweils einer der folgenden Bedingungen für vier Stunden bei 37°C behandelt. Rekombinantes humanes (rh) IL-1-alpha bei 5 ng/ml, rh IL-1-alpha bei 20 ng/ml, rh IL-1-alpha bei 5 ng/ml + IL-20 bei 1 μg/ml, IL-20 bei 1 μg/ml oder rh IL-10 bei 10 ng/ml.
RNA-Isolierung
Nach der Cytokinbehandlung wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden unter Verwendung einer Guanidiumthiocyanat-Lösung lysiert. Die gesamte RNA wurde aus dem Zelllysat auf einem Rotationsgerät auf einem Cäsium-Chlorid-Gradienten über Nacht isoliert. Am nachfolgenden Tag wurde das RNA-Pellet in einer TE/SDS-Lösung resuspendiert und mit Ethanol präzipitiert (ausgefällt). Die RNA wurde nachfolgend unter Verwendung eines Spektrophotometers quantifiziert, gefolgt von einer DNase-Behandlung, wie in Section V.B. der Atlas^TM-cDNA-Expression-Array-Anwenderanleitung von Clontech (Version PT3140-1/PR9X390, veröffentlicht am 5.11.99). Die Qualität der RNA-Proben wurde über Reinheitsberechnungen, die auf Ablesung von Spektren beruhen, und über Visualisierung auf dem Agarose-Gel geprüft. Genomische Kontamination der RNA-Proben wurde durch die PCR-Analyse des Beta-Actin-Gens ausgeschlossen.
Sondensynthese
Die Protokolle von Clontech für polyA+-Anreicherung, Sondensynthese und Hybridisierung an Atlas^TM-Arrays wurden berfolgt (siehe oben, dann Atlas^TM-Rein-Gesamt-RNA-Markierungssystem-Anwenderanleitung („Atlas^TM Pure Total RNA Labeling System User Manual"), PT3231-1/PR96157, veröffentlicht am 22.6.99). Zusammengefasst wurde polyA+-RNA aus 50 mg der gesamten RNA unter Verwendung von mit Streptavidin beschichteten magnetischen „Beads" ("Kügelchen") (von Clontech, Palo Alto, CA) und eines magnetischen Teilchenseparators isoliert. PolyA+-RNA wurde nachfolgend mit ^alpha32P-dATP über die RT-PCR markiert. CDS-Primer von Clontech, die für die 268 Gene des humanen Cytokin/Rezeptor-Atlas^TM-Arrays (Katalog-Nr. 7744-1) spezifisch sind, wurden in der Reaktion verwendet. Die markierte Sonde wurde unter Verwendung der Säulenchromatographie isoliert und in der Szintillationsflüssigkeit ausgezählt.
Array-Membran-Hybridisierung
Atlas^TM-Arrays wurden mit Clontech-ExpressHyb plus 100 mg/ml Hitzedenaturierter Lachssperma-DNA für mindestens dreißig Minuten bei 68°C unter ständigem Rühren bzw. Schütteln vorhybridisiert. Die Membranen wurden nachfolgend mit 1,9 × 10⁶ CPM/ml (gesamt 1,14 × 10⁷ CPM) über Nacht bei 68°C unter ständigem Rühren bzw. Schütteln hybridisiert. Am nachfolgenden Tag wurden die Membranen für dreißig Minuten × 4 in 2X SSC, 1% SDS bei 68°C, plus für dreißig Minuten × 1 in 0,1X SSC, 0,5% SDS bei 68°C, gefolgt von einem letzten Waschschritt für fünf Minuten in 2X SSC bei Raumtemperatur, gewaschen. Die Array-Membranen wurden nachfolgend in Kodak-Plastikbeuteln platziert, versiegelt und einem Phosphor-Imager-Screen über Nacht bei Raumtemperatur ausgesetzt. Am nächsten Tag wurden die Phosphor-Screens auf einem Phosphor-Imager gescannt und unter Verwendung der Software AtlasImage^TM 1.0 von Clontech analysiert.
Ergebnisse
Gen-Hochregulierung durch IL-20

1. Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) wurde 1,9-2,4-fach durch IL-20 hochreguliert.
2. Plazenta-Wachstumsfaktor 1 & 2 (PLGF) wurden 1,9-2,0-fach durch IL-20 hochreguliert.
3. Coagulationsfaktor-II-Rezeptor wurde 2,0-2,5-fach durch IL-20 hochreguliert.
4. Calcitonin-Rezeptor wurde 2,2-2,3-fach durch IL-20 hochreguliert.
5. TNF-induzierbares Hyaluronat-Bindeprotein TSG-6 wurde 2,1-2,2-fach durch IL-20 hochreguliert.
6. Vaskular-Endothelial-Wachstumsfaktor(VEGF)-Rezeptor-1-Vorläufer, Tyrosin-Protein-Kinase-Rezeptor (FLT-1) (SFLT) wurde 2,1-2,7-fach durch IL-20 hochreguliert.
7. MRP-8 (Calcium-Bindeprotein in Makrophagen, MIF-verwandt) wurde 2,9-4,1-fach durch IL-20 hochreguliert.
8. MRP-14 (Calcium-Bindeprotein in Makrophagen, MIF-verwandt) wurde 3,0-3,8-fach durch IL-20 hochreguliert.
9. Relaxin H2 wurde 3,14-fach durch IL-20 hochreguliert.
10. Transformier-Wachstumsfaktor-Beta(TGFβ)-Rezeptor-III-300 kDa wurde 2,4-3,6-fach durch IL-20 hochreguliert.

Gene, die mit IL-20- + IL-1-Behandlung Synergie zeigen

1. Knochen-morphogenes Protein 2a wurde 1,8-fach mit IL-20-Behandlung allein, 2,5-fach mit IL-1-Behandlung allein und 8,2-fach mit sowohl IL-20- als auch IL-1-Behandlung zusammen hochreguliert.
2. MRP-8 wurde 2,9-fach mit IL-20-Behandlung allein, 10,7-fach mit IL-1-Behandlung allein und 18,0-fach mit sowohl IL-20- als auch IL-1-Behandlung zusammen hochreguliert.
3. Erythroid-Differenzierungs-Protein (EDF) wurde 1,9-fach mit IL-20-Behandlung allein, 9,7-fach mit IL-1-Behandlung allein und 19,0-fach mit sowohl IL-20- als auch IL-1-Behandlung zusammen hochreguliert.
4. MRP-14 (Calcium-Bindeprotein in Makrophagen, MIF-verwandt) wurde 3,0-fach mit IL-20-Behandlung allein, 12,2-fach mit IL-1-Behandlung allein und 20,3-fach mit sowohl IL-20- als auch IL-1-Behandlung zusammen hochreguliert.
5. Heparin-Binde-EGF-artiger Wachstumsfaktor wurde 2,0-fach mit IL-20-Behandlung allein, 14-fach mit IL-1-Behandlung allein und 25,0-fach mit sowohl IL-20- als auch IL-1-Behandlung zusammen hochreguliert.
6. Beta-Thromboglobulin-artiges Protein wurde 1,5-fach mit IL-20-Behandlung allein, 15-fach mit IL-1-Behandlung allein und 27-fach mit sowohl IL-20- als auch IL-1-Behandlung zusammen hochreguliert.
7. Gehirn-entstammender neurotropher Faktor (BDNF) wurde 1,7-fach mit IL-20-Behandlung allein, 25-fach mit IL-1-Behandlung allein und 48-fach mit sowohl IL-20- als auch IL-1-Behandlung zusammen hochreguliert.
8. Monocyten-chemotaktischer und Aktivierungsfaktor MCAF wurde 1,3-fach mit IL-20-Behandlung allein, 32-fach mit IL-1-Behandlung allein und 56-fach mit sowohl IL-20- als auch IL-1-Behandlung zusammen hochreguliert.

Beispiel 5
IL-20RA/RB-Rezeptor-Ig-Fusion-Heterotetramer
Der Expressionsvektor pEZE3 wurde verwendet, um das rekombinante IL-20-Rezeptor-Ig-Fusionsprotein zu exprimieren. Das Plasmid pEZE3 stammt von pDC312 ab. pDC312 wurde durch Lizenzierung von Immunex Corporation erhalten. Die Plasmide pDC312 und pEZE3 enthalten ein EASE-Segment, wie in WO 97/25420 beschrieben. Die Anwesenheit des EASE-Segments in einem Expressionsvektor kann die Expression der rekombinanten Proteine in stabilen Zellpools zweibis achtfach verbessern.
Das Plasmid pEZE3 ist ein trizistronischer Expressionsvektor, der verwendet werden kann, um bis zu drei unterschiedliche Proteine in Säugetierzellen, vorzugsweise Chinesischer Hamster-Ovarium(CHO)-Zellen, zu exprimieren. Die pEZE3-Expressionseinheit enthält den Cytomegalovirus(CMV)-Verstärker/Promotor, die dreiteilige Adenovirus-Leitsequenz, eine Mehrfach-Klonierungsstelle zur Einbringung der kodierenden Region für das erste rekombinante Protein, die Poliovirus-Typ-2-interne Ribosomen-Eintrittsstelle, eine zweite Mehrfach-Klonierungsstelle zur Einbringung der kodierenden Region für das zweite rekombinante Protein, eine Enzephalomyocarditis-Virus-interne Ribosomen-Eintrittsstelle, ein für die Maus-Dihydrofolat-Reduktase kodierendes Segment und den SV40-Transkriptions-Terminator. Zusätzlich enthält pEZE3 einen E. coli-Ursprung der Replikation ("origin of replication") und das bakterielle Beta-Lactamase-Gen.
Das IL-20-Rezeptor-Ig-Fusionsprotein ist ein Disulfid-verknüpftes Heterotetramer, das aus zwei Ketten der extrazellulären Domäne des humanen IL-20RB, fusioniert an die konstante Region der leichten Kappa-Kette des humanen Wildtyp-Immunoglobulins, und zwei Ketten der extrazellulären Domäne des humanen IL-20RA-Proteins, fusioniert an eine konstante Gamma-1-Region eines mutierten humanen Immunoglobulins, besteht. Die konstante Gamma-1-Region des humanen Immunoglobulins enthält Aminosäure-Substitutionen zur Reduktion der FcγRI-Bindung und C1q-Komplement-Fixierung.
Das Fusionskonstrukt aus der extrazellulären Domäne des humanen IL-20RB und der konstanten Region der leichten Kappa-Kette des humanen Immunoglobulins wurde durch überlappende PCR erzeugt. Das IL-20RB-kodierende Segment besteht aus Aminosäuren 1 bis 230. Die zur PCR-Amplifizierung des IL-20R-Segments verwendete Matrize wurde durch das Expressionskonstrukt aus der konstanten Region des IL-20RB und der humanen leichten Kappa-Kette, wie unten in Beispiel 12 beschrieben, hergestellt. Die Oligonukleotid-Primer SEQ ID NO: 24 und SEQ ID NO: 25 wurden zur Amplifizierung des IL-20RB-Segments verwendet. Die gesamte konstante Region der leichten Kappa-Kette des humanen Wildtyp-Immunoglobulins wurde verwendet. Die für die PCR-Amplifizierung des Segments der konstanten Region der leichten Kappa-Kette des humanen Wildtyp-Immunoglobulins verwendete Matrize wurde durch das Expressionskonstrukt aus dem IL-20RB und der konstanten Region der humanen leichten Kappa-Kette, wie in Beispiel 12 beschrieben, hergestellt. Oligonukleotid-Primer SEQ ID NO: 26 und SEQ ID NO: 27 wurden zur Amplifizierung der konstanten Region der leichten Kappa-Kette des humanen Wildtyp-Immunoglobulins verwendet. Die zwei Protein-kodierenden Domänen wurden durch überlappende PCR unter Verwendung der Oligonukleotide SEQ ID NO: 24 und SEQ ID NO: 27 verknüpft. Eine (Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO: 72)-Peptid-Verknüpfung ("linker") wurde zwischen die zwei Protein-Domänen eingeführt. Die (Gly₄Ser)₃-Peptidverknüpfung war auf den PCR-Primern SEQ ID NO: 26 und SEQ ID NO: 25 kodiert. Das resultierende Fusionskonstrukt aus der extrazellulären Domäne von IL-20RB und der konstanten Region der leichten Kappa-Kette ist durch SEQ ID NO: 20 und 21 gezeigt. Das vorhergesagte reife Polypeptid, minus der Signal-Sequenz, ist SEQ ID NO: 60. Der Teil der extrazellulären Domäne von IL-20RB, der tatsächlich verwendet wurde, bestand aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 61. Die N-terminale Sequenzierung führte zu der vorhergesagten Aminosäuresequenz.
Das Fusionskonstrukt aus der extrazellulären Domäne des humanen IL-20RA und der konstanten Region der schweren Gamma-1-Kette des humanen Immunoglobulins wurde durch überlappende PCR von vier separaten DNA-Fragmenten hergestellt, wobei jedes einzelne durch separate PCR-Amplifizierungs-Reaktionen hergestellt wurde. Das erste Fragment enthielt eine optimierte tPA(„tissue plasminogen activator", Gewebs-Plasminogen-Aktivator)-Signal-Sequenz. Die tPA-Signal-Sequenz wurde unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer SEQ ID NO: 28 und SEQ ID NO: 29 mit einem intra muros zuvor hergestellten Expressionsvektor als Matrize amplifiziert. Das zweite Fragment enthielt die kodierende Region der extrazellulären Domäne von IL-20RA, bestehend aus Aminosäuren 30 bis 243 von SEQ ID NO: 11. Oligonukleotid-Primer SEQ ID NO: 30 und SEQ ID NO: 31 wurden zur Amplifizierung dieses IL-20RA-Segments unter Verwendung eines zuvor hergestellten Klons von IL-20RA als Matrize verwendet.
Die konstante Region der humanen schweren Gamma-1-Kette wurde aus zwei Segmenten hergestellt. Das erste Segment, enthaltend die C_H1-Domäne, wurde unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer SEQ ID NO: 32 und SEQ ID NO: 33 unter Verwendung eines Klons der konstanten Region der humanen schweren Wildtyp-Gamma-1-Kette als Matrize amplifiziert. Das zweite Segment, enthaltend die übrigen Gelenk-, C_H2- und C_H3-Domänen der konstanten Region der schweren Gamma-1-Kette des humanen Immunoglobulins, wurde durch PCR-Amplifizierung unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer SEQ ID NO: 34 und SEQ ID NO: 35 hergestellt. Die für diese PCR-Amplifizierung verwendete Matrize war aus einem zuvor hergestellten humanen Gamma-1-Fc-Konstrukt, das Codons für die Aminosäure-Substitutionen zur Reduktion der FcγRI-Bindung und C1q-Komplement-Fixierung enthielt, wie in Beispiel 12 beschrieben, hergestellt.
Die vier Protein-kodierenden Domänen wurden durch überlappende PCR unter Verwendung der Oligonukleotide SEQ ID NO: 28 und SEQ ID NO: 35 verknüpft. Eine (Gly₄Ser)₃-Peptid-Verknüpfung („linker") wurde zwischen die IL-20RA- und CH1-Protein-Domäne eingeführt. Die (Gly₄Ser)₃-Peptid-Verknüpfung („linker") war auf den PCR-Primern SEQ ID NO: 32 und SEQ ID NO: 31 kodiert. Das Fusionsprotein aus der extrazellulären Domäne von IL-20RA und der konstanten Region der schweren Gamma-1-Kette des humanen Immunoglobulins und die DNA-Sequenz sind in SEQ ID NOs: 22 und 23 gezeigt. Die vorhergesagte reife Polypeptid-Sequenz, minus der Signal-Sequenz, ist SEQ ID NO: 62. Der Teil der extrazellulären Domäne von IL-20RA, der tatsächlich verwendet wurde, bestand aus SEQ ID NO: 63.
Das kodierende Segment der Fusion aus der extrazellulären Domäne von IL-20RB und der konstanten Region der leichten Kappa-Kette des humanen Immunoglobulins wurde in die zweite MCS kloniert, während das kodierende Segment der Fusion aus der extrazellulären Domäne des humanen IL-20RA und der konstanten Region der schweren Gamma-1-Kette des humanen Immunoglobulins in die erste MCS von pEZE3 kloniert wurde. Das Plasmid wurde zur Transfektion von CHO-Zellen verwendet. Die Zellen wurden in einem Medium ohne Hypoxanthin oder Thymidin selektiert und das Transgen wurde unter Verwendung von Methotrexat amplifiziert. Die Anwesenheit des Proteins wurde durch Western-Blotten unter Verwendung von Antikörpern gegen die konstante Region der humanen schweren Gamma-1-Kette und der humanen leichten Kappa-Kette untersucht. N-terminate Sequenzierung zeigte, dass die optimierte tPA-Leitsequenz nicht vollständig geschnitten war. Die beobachtete Masse deutete darauf hin, dass der erste Rest der Polypeptid-Sequenz Pyroglutamat war, und die N-terminale Sequenz schien py roEEIHAELRRFRRVPCVSGG (SEQ ID NO: 64) zu sein, wobei die unterstrichenen Teile Reste der tPA-Leitsequenz sind.
Beispiel 6
Transgener IL-20-Phänotyp
Sowohl das humane als auch das Maus-IL-20 wurden in transgenen Mäusen unter Verwendung einer Vielfalt an Promotoren überexprimiert. Der Leber-spezifische Maus-Albumin-Promotor, der die Expression des humanen IL-20 steuert, wurde anfänglich in einem Versuch verwendet, um zirkulierende Niveaus des Proteins zu erreichen. Nachfolgende Studien wurden unter Verwendung des Keratin-14(K14)-Promotors durchgeführt, welcher hauptsächlich die Expression in der Epidermis und anderen vielschichtigen, schuppenartigen Epithelien bewirkt; des Maus-Metallothionein-1-Promotors, welcher ein breites Expressionsmuster ergibt; und des EμLCK-Promotors, welcher die Expression in Zellen der Lymphoid-Linie steuert. In allen vier Fälle wurden ähnliche Ergebnisse erhalten, wahrscheinlich, weil alle diese Promotoren zirkulierende Niveaus von IL-20 verursachten.
In allen Fällen waren die das IL-20-Transgen exprimierenden transgenen Jungtiere kleiner als nicht-transgene Wurfgenossen, sie wiesen eine durchscheinende Erscheinung mit fester, faltiger Haut auf und starben innerhalb der ersten paar Tage nach der Geburt. Die Jungtiere wiesen Milch in ihren Bäuchen auf, was darauf hinweist, dass sie zum Saugen in der Lage waren. Diese Mäuse wiesen geschwollene Extremitäten, Schwanz, Nasenlöcher und Mundregionen auf und hatten Schwierigkeiten sich zu bewegen. Zusätzlich waren diese Mäuse schwächlich, ihnen fehlte das sichtbare Adipose-Gewebe und sie wiesen verzögerte Ohren- und Zehenentwicklung auf. Geringe Expressionsniveaus in der Leber (weniger als 100 mRNA Moleküle/Zelle) waren ausreichend für sowohl die frühkindliche (neonatale) Sterblichkeit als auch für die Hautabnormitäten. Transgene Mäuse ohne einen sichtbaren Phänotyp exprimierten entweder das Transgen nicht, exprimierten dieses nicht in nachweisbaren Niveaus oder waren mosaikartig.
Histologische Analyse der Haut der IL-20-transgenen Mäuse zeigte eine verdickte Epidermis, Hyperkeratose und eine kompakte Corneum-Schicht ("stratum corneum") im Vergleich zu nicht-transgenen Wurfgenossen. Serozelluläre Krusten (Grinde) wurden gelegentlich beobachtet. Elektronenmikroskopische (EM) Analyse der Haut transgener Mäuse zeigte intramitochondriale Lipoideinschlüsse, gefleckte Keratohyalin-Granulen und relativ wenige Tonofilamente, was ähnlich dem war, was in humaner psoriatischer Haut und in Maus-Hauterkrankungs-Modellen beobachtet wurde. Zusätzlich wiesen viele der transgenen Mäuse apoptotische thymische Lymphocyten auf. Keine weiteren Abnormitäten wurden durch die histopathologische Analyse nachgewiesen. Diese histologischen und EM-Ergebnisse unterstützen und bekräftigen die beobachteten dramatischen Hautänderungen.
Beispiel 7
Spezifität und Affinität von IL-20 zu dessen Rezeptor
Die Spezifität und Affinität von IL-20 zu dessen Rezeptor wurde unter Verwendung von BHK-Zellen, die mit IL-20RA, IL-20RB oder beiden Rezeptor-Untereinheiten stabil transfiziert waren, bestimmt. Bindungs-Assays unter Verwendung eines radiomarkierten Liganden zeigten, dass IL-20 an BHK-Transfektanten, die sowohl IL-20RA als auch IL-20RB exprimierten, nicht jedoch an nicht-transfizierte Zellen, noch an Transfektanten, die jede Rezeptor-Untereinheit alleine exprimierten, gebunden hat. Die Bindung des ¹²⁵I-markierten IL-20 wurde in Anwesenheit eines 100-fachen Überschusses an unmarkiertem IL-20, jedoch nicht mit 100-fachem Überschuss des nicht-verwandten Cytokins, IL-21, eliminiert. Die Bindungsaffinität (k_D) von IL-20 zu dem IL-20RA/IL-20RB-heterodimeren Rezeptor wurde auf ungefähr 1,5 nM bestimmt.
Beispiel 8
IL-20-Rezeptor-Aktivierung
Um zu bestimmen, ob die IL-20-Bindung zur Rezeptor-Aktivierung führt, wurde die Faktor-abhängige Pre-B-Zelllinie BaF3 mit IL-20RA und IL-20RB co-transfiziert und mit IL-20 bei verschiedenen Konzentrationen behandelt. IL-20 stimulierte die Proliferation in einer Dosis-abhängigen Weise und ergab ein detektierbares Signal bei 1,1 pM mit einer halb-maximalen Reaktion bei 3,4 pM. Wir vermerken, dass die IL-20-Konzentration für die halb-maximale proliferative Reaktion in BaF3-Zellen 1000X niedriger als die für die halb-maximale Bindungsaffinität in BHK-Zellen ist. Mögliche Erklärungen für diese große Differenz beinhalten die Verwendung unterschiedlicher Zelllinien, unterschiedliche Rezeptor-Expressions-Niveaus und unterschiedliche Assay-Ergebnisse. IL-20 stimulierte ebenfalls die Signal-Tranduktion in der biologisch relevanten humanen Keratinocyten-Zelllinie HaCaT, welche IL-20RA und IL-20RB natürlicherweise exprimiert. Deshalb bindet und aktiviert IL-20 den heterodimeren IL-20RA/IL-20RB-Rezeptor bei Konzentrationen, die für ein Cytokin erwartet werden. Während die negativen Kontrollen untransfiziertes BaF3 enthielten
Beispiel 9
Expressionsanalyse von IL-20RA und IL-20RB
RT-PCR-Analyse wurde an einer Vielfalt humaner Gewebe durchgeführt, um das Expressionsmuster von IL-20RA und IL-20RB zu bestimmen. Beide Rezeptor-Untereinheiten werden am stärksten in der Haut und dem Hoden exprimiert. Das signifikante Ergebnis ist, dass IL-20RA und IL-20RB beide in der Haut exprimiert werden, wo für beide gezeigt wurde, dass diese die IL-20-induzierte Reaktion vermittelt. Sowohl IL-20RA als auch IL-20RB werden ebenfalls beide in Monocyten, der Lunge, dem Ovarium, dem Muskel, dem Hoden, der Adrenaldrüse, dem Herzen, der Speicheldrüse und der Plazenta exprimiert. IL-20RA ist ebenfalls im Gehirn, der Niere, der Leber, dem Dickdarm, dem Dünndarm, dem Magen, der Schilddrüse, dem Pankreas, der Gebärmutter und der Prostata vorhanden, während IL-20RB dort nicht vorhanden ist.
Beispiel 10
IL-20RA- und IL-20RB-mRNA werden in der Psoriasis hochreguliert
In situ-Hybridisierung wurde verwendet, um zu bestimmen, ob die IL-20-Rezeptor-Expression in der Psoriasis verändert ist. Hautproben aus vier Psoriasis-Patienten und drei nicht-befallenen Patienten wurden mit für mRNAs der zwei Rezeptor-Untereinheiten spezifischen Sonden untersucht. Alle vier psoriatischen Hautproben wiesen hohe IL-20RA- und IL-20RB-mRNA-Niveaus in Keratinocyten auf, während normale Hautproben keine detektierbaren Niveaus einer der Rezeptor-Untereinheit-mRNAs aufwiesen. Positive Signale in psoriatischer Haut wurden ebenfalls in mononuklearen Immun-Zellen und in Endothelial-Zellen in einem Teil der Gefäße beobachtet. Deshalb werden sowohl IL-20RA als auch IL-20RB in Keratinocyten-Immun-Zellen und Endothelial-Zellen exprimiert, wobei diese die Hauptzelltypen sind, für die eine Interaktion in der Psoriasis angenommen wird.
Beispiel 11
Klonierung von Maus-IL-20RA
Eine Zwischenarten-Hybridisierungssonde wurde hergestellt, welche das cDNA-Fragment mit voller Länge enthielt, das für das humane IL-20RA kodiert. Ein Southern-Blot von der genomischen Maus-DNA und Northern-Blots von der Maus-RNA wurden durchgeführt, um zu zeigen, dass die humane IL-20RA-cDNA an Maus-Sequenzen spezifisch hybridisieren konnte. Die Ergebnisse der Northern-Blots wiesen darauf hin, dass die Maus-IL-20RA-RNA in den Mausembryos am 15. und 17. Tag genauso wie im Herzen, im Gehirn, in der Lunge, der Leber, der Niere, den Hoden, der Milz, dem Thymus, der Leber, dem Magen und dem Dünndarm vorhanden war.
Die Hybridisierungssonde der humanen IL-20RA-DNA mit voller Länge wurde verwendet, um eine genomische Bibliothek der Maus zu screenen. Die Bibliothek, die von Clontech (Palo Alto, CA) erhalten wurde, wurde aus einem teilweisen Verdau der genomischen DNA der Maus mit MboI hergestellt und in die BamHI-Stelle der Lambda-Bakteriophage EMBL3 SP6/T7 kloniert. Die positive Bakteriophage wurde Plaque aufgereinigt und die Bakteriophagen-DNA wurde unter Verwendung des Wizard-Lambda-Preps-DNA-Aufreinigungssystems von Promega (Promega's Wizard Lambda Preps DNA Purification System) präpariert. Zwei genomische Restriktionsenzym-Fragmente, ein 5,7-kb-EcoRI-Fragment und ein 8,0-kb-SacI-Fragment, wurden aus der positiven Bakteriophage hergestellt und in pBluescript subkloniert. Die DNA-Sequenzanalyse zeigte die Anwesenheit von 3 Exons aus dem Maus-Orthologen zu humanem IL-20RA.
PCR-Primer von 5'-UTR, SEQ ID NO: 40, und 3'-UTR, SEQ ID NO: 41, wurden konstruiert, um eine Maus-IL-20RA-Sequenz mit voller Länge durch PCR-Amplifizierung herzustellen. Die cDNA der Mausembryos am 15. Tag plus 17. Tag wurde als Matrize zur PCR-Amplifizierung verwendet. PCR-Produkte wurden subkloniert und zur Bestätigung sequenziert. Die Maussequenzen sind SEQ ID NO: 36 und 37. Die reife extrazelluläre Domäne besteht aus SEQ ID NO: 38.
Beispiel 12
Konstruktion eines IL-20-Rezeptor-Heterotetramers
Ein Vektor, der einen sekretierten hIL-20RA/hIL-20RB-Heterodimer exprimiert, wurde konstruiert. In diesem Konstrukt wurde die extrazelluläre Domäne des hIL-20RA an die schwere Gamma-1-Kette des IgG (IgGγ1) fusioniert, während der extrazelluläre Teil von IL-20RB an die humane leichte Kappa-Kette (humane leichte κ-Kette) fusioniert wurde.
Konstruktion von IgG-Gamma-1- und humanen leichten κ-Fusionsvektoren
Die schwere Kette von IgGγ1 wurde in den Zem229R-Säugetier-Expressionsvektor (ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69447) auf eine Weise kloniert, so dass jeder beliebige extrazelluläre Teil eines Rezeptors, der eine 5'-EcoRI- und 3'-NheI-Stelle aufweist, einkloniert werden kann, was zu einer Fusion aus N-terminaler extrazellulärer Domäne und C-terminalem IgGγ1 führt. Das IgGγ1-Fragment, das in diesem Konstrukt verwendet wurde, wurde unter Verwendung der PCR zur Isolierung der IgGγ1-Sequenz aus einer humanen fötalen Leber-cDNA-Bibliothek von Clontech als Matrize hergestellt. Eine PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligos SEQ ID NO: 42 und SEQ ID NO: 43 wurde wie folgt durchgeführt: 40 Zyklen von 94°C für 60 sek, 53°C für 60 sek und 72°C für 120 sek und 72°C für 7 Minuten. Die PCR-Produkte wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt und unter Verwendung eines QiaQuick^TM-Gel-Extraktions-Kits (Qiagen Inc., Valencia, CA) aufgereinigt. Das isolierte 990-bp-DNA-Fragment wurde mit MluI und EcoRI (Boehringer-Mannheim) verdaut, mit dem QiaQuick^TM-Gel-Extraktions-Kit extrahiert und mit den Oligos SEQ ID NO: 44 und SEQ ID NO: 45, die eine MluI/EcoRI-Verknüpfung ("linker") umfassen, in Zem229R unter Verwendung der hier offenbarten molekularbiologischen Standardtechniken ligiert, der zuvor mit MluI und EcoRI verdaut wurde. Dieser generische Klonierungsvektor wurde als Vektor #76 hlgGgamma1 w/Ch1 #786 Zem229R (Vektor #76) bezeichnet. Die Polynukleotid-Sequenz der extrazellulären Domäne von hIL-20RA, fusioniert an die schwere Gamma-1-Kette von IgG, ist in SEQ ID NO: 52 gezeigt und die entsprechende Polypeptid-Sequenz ist in SEQ ID NO: 53 gezeigt, wobei das reife Polypeptid, minus der Signal-Sequenz, aus SEQ ID NO: 54 besteht. Der Teil der extrazellulären Domäne von IL-20RA, der verwendet wurde, bestand aus SEQ ID NO: 55.
Die humane leichte κ-Kette wurde in den Zem228R-Säugetier-Expressionsvektor (ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69446) auf diese Weise kloniert, so dass jeder beliebige extrazelluläre Teil eines Rezeptors, der eine 5'-EcoRI-Stelle und eine 3'-KpnI-Stelle aufweist, einkloniert werden kann, was zu einer Fusion aus N-terminaler extrazellulärer Domäne und C-terminaler humaner leichter κ-Kette führt. Das humane leichte κ-Kette-Fragment, das in diesem Konstrukt verwendet wurde, wurde unter Verwendung der PCR zur Isolierung der humanen leichten κ-Kette-Sequenz aus der gleichen hFötalen Leber-cDNA-Bibliothek von Clontech, wie oben verwendet, hergestellt. Eine PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der Oligos SEQ ID NO: 46 und SEQ ID NO: 47 durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt und unter Verwendung eines QiaQuick^TM-Gel-Extraktions-Kits (Qiagen) aufgereinigt. Das isolierte 315-bp-DNA-Fragment wurde mit MluI und EcoRI (Boehringer-Mannheim) verdaut, mit QiaQuick^TM-Gel-Extraktions-Kit extrahiert und mit der oben beschriebenen MluI/EcoRI-Verknüpfung ("linker") in Zem228R, der vorher mit MluI und EcoRI verdaut wurde, unter Verwendung der hier offenbarten molekularbiologischen Standardtechniken ligiert. Dieser generische Klonierungsvektor wurde als Vector #77 hκlight #774 Zem228R (Vektor #77) bezeichnet. Die Polynukleotid-Sequenz des extrazellulären Teils von IL-20RB, fusioniert an die humane leichte Kappa-Kette, ist in SEQ ID NO: 56 gezeigt und die entsprechende Polypeptid-Sequenz ist in SEQ ID NO: 57 gezeigt, wobei das reife Polypeptid, minus der Signal-Sequenz, aus SEQ ID NO: 58 besteht. Der Teil der extrazellulären Domäne von IL-20RB, der tatsächlich verwendet wurde, bestand aus SEQ ID NO: 59.
Einbringung der extrazellulären Domäne von hIL-20RA und IL-20RB in die Fusionsvektor-Konstrukte
Unter Verwendung der oberen Konstruktionsvektoren wurde ein Konstrukt, das das humane IL-20RA fusioniert an IgGγ1 aufweist, hergestellt. Diese Konstruktion wurde unter Verwendung von PCR durchgeführt, um den humanen IL-20RA-Rezeptor aus hIL-20RA/IgG-Vektor #102 mit den Oligos SEQ ID NO: 48 und SEQ ID NO: 49 zu erhalten, unter den wie folgt beschriebenen Bedingungen: 30 Zyklen von 94°C für 60 sek, 57°C für 60 sek und 72°C für 120 sek und 72°C für 7 min. Das resultie rende PCR-Produkt wurde mit EcoRI und NheI verdaut, Gel-aufgereinigt, wie hier beschrieben, und in einen zuvor mit EcoRI und NheI verdauten und Bandenaufgereinigten Vektor #76 (oben) ligiert. Der resultierende Vektor wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass die humane IL-20Rα/IgG-Gamma-1-Fusion (hIL-20RA/Ch1-IgG) korrekt war. Der hIL-20RA/Ch1-IgG-Gamma-1 #1825-Zem229R-Vektor wurde als Vektor #195 bezeichnet. Die somit erhaltene IL-20RA/Ch1-IgGγ1-Sequenz ist durch SEQ ID NO: 52 und 53 gezeigt. N-terminale Sequenzierung wies auf die Anwesenheit der vorhergesagten reifen Polypeptid-Sequenz von SEQ ID NO: 54 hin.
Ein separates Konstrukt, das IL-20RB an κ-leicht fusioniert, wurde ebenfalls konstruiert. Die IL-20RB/humane leichte κ-Kette-Konstruktion wurde wie oben durch die PCR aus DR1/7N-4 mit den Oligos SEQ ID NO: 50 und SEQ ID NO: 51 durchgeführt, wobei die resultierende Bande mit EcoRI und KpnI verdaut wurde und dieses Produkt nachfolgend in einen zuvor mit EcoRI und KpnI verdauten und Bandenaufgereinigten Vektor #77 (oben) ligiert wurde. Der resultierende Vektor wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass die IL-20RB/humane leichte κ-Kette-Fusion (IL-20RB/κleicht) korrekt war. Dieses IL-20RB//κleicht-Konstrukt ist durch SEQ ID NOs: 56 und 57 gezeigt. N-terminale Sequenzierung des resultierenden Polypeptids wies auf die Anwesenheit der vorhergesagten reifen Aminosäure-Sequenz, bestehend aus SEQ ID NO: 58, hin. SEQ ID NO: 59 ist der reife Teil der extrazellulären Domäne von IL-20RB, der verwendet wurde.
Co-Expression von humanen IL-20RA- und humanen IL-20RB-Rezeptoren
Ungefähr 16 μg jedes der Vektoren #194 und #195, wie oben, wurden in BHK-570-Zellen (ATCC-Nr. CRL-10314) unter Verwendung des Lipofectamine^TM-Reagenzes (Gibco/BRL) nach Herstelleranweisungen co-transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden für 10 Tage in DMEM + 5% FBS (Gibco/BRL), enthaltend 1 μM Methotrexat (MTX) (Sigma, St. Louis, MO) und 0,5 mg/ml G418 (Gibco/BRL), (für 10 Tage) selektiert.
Der resultierende Pool der doppelt selektierten Zellen wurde verwendet, um das Protein herzustellen. Drei Gefäße („factories") (Nunc, Dänemark) dieses Pools wur den verwendet, um 8 l Serum-freies konditioniertes Medium herzustellen. Dieses konditionierte Medium wurde über eine 1-ml-Protein-A-Säule gegeben und in (10) 750-Mikroliter-Fraktionen eluiert. 4 dieser Fraktionen, für die höchste Konzentration gefunden wurde, wurden gepoolt und gegen PBS dialysiert (10 kD MW Ausschlussgrenze („cutoff")). Letztendlich wurde das dialysierte Material durch BCA (Pierce) analysiert und es wurde eine Konzentration von 317 μg/ml gefunden. Insgesamt wurden 951 μg aus dieser 8 l-Aufreinigung erhalten.
Beispiel 13
IL-20-Bindung aktiviert STAT3 in der HaCaT-Keratinocyten-Zelllinie
IL-20 bindet Zelllinien, die mit beiden Untereinheiten dessen Rezeptors transfiziert sind. Jedoch überexprimieren diese Zelllinien den IL-20-Rezeptor im Vergleich zu dessen normalem Niveau und ihre Relevanz in der physiologischen Rolle von IL-20 ist unklar. Die humane HaCaT-Keratinocyten-Zelllinie, welche endogenes IL-20RA und IL-20RB exprimiert, wurde verwendet, um die IL-20-Signal-Transduktion in einem biologisch relevanten Zelltyp zu untersuchen. HaCaT-Zellen wurden mit rekombinantem Adenovirus, enthaltend ein Reporter-Konstrukt, das die Detektion des intrazellulären Signalisierens ermöglicht, infiziert. Das Konstrukt besteht aus dem Glühwürmchen-Luziferase-Gen, das durch die Promotor/Verstärker-Sequenzen gesteuert wird, die aus dem Serum-Reaktionselement (SRE, "serum response element") und Signal-Transduktoren und -aktivatoren der Transduktions-Elemente (STATs, "signal transducer and activators of transduction elements") besteht. Dieses Assay-System detektiert produktive Ligand-Rezeptor-Interaktionen und weist auf mögliche "Downstream"-Signal-Transduktions-Komponenten, die in die Rezeptor-Aktivierung einbezogen sind, hin. Die Behandlung mit IL-20 allein führte zu einer Dosis-abhängigen Erhöhung der Luziferase-Aktivität mit einer halbmaximalen Reaktion, die bei ungefähr 2,3 nM auftritt. Nachfolgende Luziferase-Reporter-Assays, unter Verwendung von Adenovirus-Vektoren, die nur das SRE-Element oder nur die STAT-Elemente enthielten, lieferten detektierbare Reporter-Aktivierung nur durch STATs.
Um zu bestimmen, ob andere Cytokine zusammen mit IL-20 agieren, wurden HaCaT-Zellen mit IL-20 allein oder in Kombination mit einer einzelnen submaximalen Dosis von EGF, IL-1β oder TNFα behandelt. In Anwesenheit jedes die ser drei Proteine führte die IL-20-Behandlung zu einer Dosis-abhängigen Erhöhung der Luziferase-Aktivität. IL-20 in Kombination mit IL-1β führte zu einer halbmaximalen Reaktion bei ungefähr 0,5 nM, etwa fünffach niedriger als mit IL-20 alleine. Zusätzlich ist die Aktivierung des Reporter-Gens bei 0,1 nM IL-20 detektierbar, einer Dosis, die mindestens zehnfach niedriger als die IL-20-Dosis ist, die alleine erforderlich ist.
BHK-Zellen, die mit IL-20RA, IL-20RB oder beiden Rezeptor-Untereinheiten transfiziert waren, wurden verwendet, um zu bestimmen, ob die Rezeptor-Paarung für die IL-20-Stimulierung der STAT-Luziferase erforderlich war. Wie es der Fall bei Bindungsassays war, reagieren nur Zellen, die mit beiden Rezeptor-Untereinheiten transfiziert waren, auf IL-20 und sie taten dies mit einer halb-maximalen Reaktion von 5,7 pM. Wir vermerken, dass die IL-20-Konzentration für die halb-maximale Reaktion in BHK-Zellen 400-fach niedriger als die für die halb-maximale Reaktion in HaCaT-Zellen ist. Es ist wahrscheinlich, dass eine niedrigere Konzentration von IL-20 für die halb-maximale Reaktion in BHK-Zellen, im Vergleich zu HaCaT-Zellen, aufgrund der höheren Rezeptor-Niveaus in den BHK-IL-20-Rezeptor-Tranfektanten notwendig ist.
Ein Kern-Translokations-Assay wurde verwendet, um in die IL-20-Wirkung einbezogene STAT-Proteine zu identifizieren. Sowohl die HaCaT-Zellen mit endogenen IL-20-Rezeptoren als auch die mit IL-20RA und IL-20RB transfizierten BHK-Zellen wurden mit dem IL-20-Protein behandelt und die Translokation der STAT3- und STAT1-Transkriptions-Faktoren aus dem Cytoplasma in den Kern wurde durch Immunofluoreszenz untersucht.
In unstimulierten HaCaT-Zellen fand die STAT3-Färbung hauptsächlich im Cytosol statt. Die Behandlung von HaCaT-Zellen mit IL-20 führte zu einer eindeutigen Akkumulation von STAT3 im Kern. Die Kern-Translokation von STAT3 als Reaktion auf erhöhte Konzentrationen von IL-20 trat mit einer halb-maximalen IL-20-Konzentration von 7 nM auf. Im Gegensatz zu der STAT3-Translokation zeigten mit IL-20 behandelte HaCaT-Zellen keine detektierbare Kern-Akkumulation von STAT1.
Mit IL-20RA und IL-20RB transfizierte BHK-Zellen wurden verwendet, um zu bestätigen, dass der IL-20-Rezeptor für die IL-20-Stimulierung der STAT3-Kern- Translokation erforderlich war. In BHK-Zellen, denen der IL-20-Rezeptor fehlte, verblieb STAT3 nach der Behandlung mit IL-20 cytosolisch. Im Gegensatz dazu wurde STAT3 als Reaktion auf IL-20 in mit dem IL-20-Rezeptor transfizierten BHK-Zellen in den Kern transloziert. Auch hier blieb STAT1, unabhängig von der IL-20-Behandlung oder IL-20-Rezeptor-Expression, cytosolisch. Wir schließen daraus, dass der IL-20-Rezeptor für die IL-20-vermittelte STAT3-Aktivierung erforderlich ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines löslichen Rezeptors, der an ein IL-20-Polypeptid bindet, wobei das IL-20-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 und 9, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer entzündlichen Erkrankung, wobei der lösliche Rezeptor umfasst: eine erste Untereinheit, wobei diese erste Untereinheit eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus SEQ ID NOs: 11, 12, 55, 63 und 65, oder ein Fragment davon umfasst, das an ein IL-20-Polypeptid bindet; und eine zweite Untereinheit, wobei diese zweite Untereinheit eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus SEQ ID NOs: 14, 15, 19, 59, 61, 67, 68 und 69, oder ein Fragment davon umfasst, das an ein IL-20-Polypeptid bindet; wobei die entzündliche Erkrankung eine Hauterkrankung ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die erste Untereinheit an eine konstante Region der schweren Kette eines Immunoglobulin-(Ig)-Moleküls fusioniert ist und die zweite Untereinheit an eine konstante Region einer leichten Kette eines Ig-Moleküls fusioniert ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Hauterkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Melanom, Psoriasis, Ekzem, atopischer Dermatitis und Kontaktdermatitis.