KR20100110864A - 인간화된 항-인간 ｎｋｇ2ａ 모노클로날 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 어떤 항-NKG2A 항체, 특히 뮤린 항-NKG2A 항체 Z199의 인간화 버전과 같은 CD94/NKG2A 수용체의 비-경쟁적 길항제인 제제, 그리고 이러한 제제 및 항체의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

인간화된 항-인간 ＮＫＧ2Ａ 모노클로날 항체{HUMANIZED ANTI-HUMAN NKG2A MONOCLONAL ANTIBODY}

본 발명은 어떤 항-NKG2A 항체, 특히 뮤린 항-NKG2A 항체 Z199의 인간화 버전을 포함하는 CD94/NKG2A 수용체의 비-경쟁적 길항제, 그리고 이러한 항체의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

CD94/NKG2A는 자연사멸 세포(NK 세포), 자연사멸 T 세포(NKT 세포) 및 T 세포(α/β 및 γ/δ)의 하위단위들에서 발견되는 억제성 수용체이다. CD94/NKG2A는 CD94/NKG2A-리간드 HLA-E를 발현하는 세포를 향한 상기 언급된 림프구들의 사이토카인 방출 및 세포독성 반응을 제한한다(예를 들어, WO 99/28748 참조). 또, HLA-E는 어떤 종양 세포(Derre et al., J Immunol 2006; 177:3100-7) 및 활성화된 내피 세포(Coupel et al., Blood 2007; 109:2806-14)에 의해서 가용성 형태로 분비되는 것으로 판명되었다. CD94/NKG2A 신호화를 억제하는 항체는 HLA-E 양성 표적 세포를 향한 림프구들의 사이토카인 방출 및 세포독성 활성, 예를 들어 HLA-E 발현 종양 세포를 향한 CD94/NKG2A-양성 종양-특이적 T 세포의 반응, 또는 바이러스에 감염된 세포를 향한 NK 반응을 증가시킬 수 있다. 따라서, CD94/NKG2A를 억제하지만 CD94/NKG2A-발현 세포의 사멸을 유발하지는 않는 치료 항체(즉, 비-고갈형 항체)는 암환자에서 종양-성장의 통제를 유도할 수 있다.

이에 더하여, 예를 들어 NK-림프종과 같은 어떤 림프종들이 CD94/NKG2A 발현을 특징으로 한다. 이러한 환자에서는 CD94/NKG2A-발현 세포를 표적으로 하여 죽이는 치료 항체(즉, 고갈형 항체)가 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성(CDC)에 의하여 종양 세포를 박멸할 수 있다. 또한, 항-NKG2A 항체는 자가면역 질환이나 염증성 질환의 치료에도 사용이 제안되었다(예를 들어, US 20030095965, WO 2006070286 참조).

NKG2A에 대한 여러 가지 다양한 항체들이 본 분야에서 설명되었다. 예를 들어, Sivori 등(Eur J Immunol 1996;26:2487-92)은 뮤린 항-NKG2A 항체 Z270을 언급하고, Carretero 등(Eur J Immunol 1997;27:563-7)은 뮤린 항-NKG2A 항체 Z199(현재 Beckman Coulter Inc.(USA)에서 상업적으로 입수가능, 제품번호 IM2750)를 설명하고, Vance 등(J Exp Med 1999;190:1801-12)은 래트 항-뮤린 NKG2-항체 20D5(현재 BD Biosciences Pharmingen(USA)에서 상업적으로 입수가능, 카탈로그 번호 550518)를 언급하고, 미국특허출원 공개 제20030095965호는 NKG2A, NKG2C 및 NKG2E와 결합한다고 알려진 뮤린 항체 3S9를 설명한다.

현재 이용가능한 항-CD94/NKG2A 항체는 비-인간 기원의 것으로서, 이것은 이들의 면역원성으로 인하여 인체 치료 용도로는 대부분 부적합하다. 따라서, 인간 환자의 치료에 적합한 항-CD94/NKG2A 항체가 필요하다.

본 발명은 항-NKG2A 항체와 같은 NKG2A 결합제, 이러한 제제를 포함하는 조성물, 및 이러한 제제의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 상기 제제는 전형적으로 인간 CD94/NKG2A 수용체의 비-경쟁적 길항제이고, 리간드인 HLA-E의 결합을 차단하지 않고 수용체의 억제 활성을 감소시킨다. 한 구체예에서, 상기 제제는 NKG2C보다 NKG2A에 상당히 더 높은 친화성으로 결합하는 항체이고, 잔기 P94-N107 및/또는 M189-E197을 포함하는 NKG2A의 세그먼트에 결합하거나, 또는 이들 세그먼트에 모두 결합한다. 추가의 또는 다른 구체예에서, 상기 제제는 CD94/NKG2A와의 결합에 있어서 뮤린 항-NKG2A 항체 Z199와 경쟁한다. 상기 제제는, 예를 들어 인간 또는 인간화된 항-NKG2A 항체일 수 있다.

한 구체예에서, 인간화된 항체는 Z199의 인간화된 버전이다. 예를 들어 낮은 면역원성, 개선된 항원-결합 또는 다른 기능적 특성들과 같은 개선된 특성, 및/또는 예를 들어 향상된 안정성과 같은 개선된 물리화학적 특성을 가진 이러한 인간화된 항체의 프레임워크 영역(FR) 내에서 아미노산 치환을 위한 전형적인 상보성-결정 영역(CDR) 잔기 또는 서열 및/또는 부위가 제공된다. 한 양태에서, 본 발명은 Z199 Kabat CDR의 적어도 일부분이 인간 어셉터 서열의 상응하는 부분과 동일한 인간화된 항체를 제공한다. 한 구체예에서, 인간 프레임워크 서열은 적어도 하나의 역돌연변이, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 역돌연변이를 포함한다. 다른 구체예에서, 가변 경쇄(VL) 도메인의 인간 프레임워크 서열은 단일 역돌연변이를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 이러한 제제와 담체를 포함하는 제약 조성물, 및 예를 들어 세포독성제 또는 검출가능한 제제에 콘쥬게이트된 이러한 제제를 포함하는 콘쥬게이트를 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 이러한 제제를 암호화하는 핵산 및 벡터, 및 이러한 핵산 및/또는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 또한, 이러한 숙주 세포를 배양하여 핵산을 생성하는 상기 제제의 제조를 위한 재조합 방법이 제공된다.

다른 양태에서, 본 발명은 이러한 제제를 포함하는 용기와 사용자가 환자의 암과 같은 질병이나 바이러스 질환을 치료할 수 있도록 지시하는 설명서를 포함하는 제조 물품을 제공한다. 선택적으로, 상기 물품은 또 다른 제제를 함유하는 또 다른 용기를 포함할 수 있다. 이때 설명서는 사용자가 제제와 항체를 조합 사용하여 질병을 치료할 수 있도록 지시한다.

또한, 본 발명은 환자의 암과 같은 질병, 바이러스 질환, 염증성 질병 또는 자가면역 장애의 치료에서, 선택적으로 다른 항암제, 항바이러스 질환제, 또는 항염제와 함께, 본 발명의 제제를 사용하는 방법을 사용한다.

도 1은 기능적 HLA-E를 발현하는 표적 세포 또는 결여하는 표적 세포를 죽이는 CD94/NKG2A-발현 NKL 세포의 능력, 및 HLA-E 발현 표적 세포의 사멸에 대한 뮤린 항체 HP-3D9(A)(항-CD94) 또는 Z199(B)(항-NKG2A)의 효과를 평가하는 Cr-51 방출 분석의 결과를 나타낸다. NKL 세포는 기능적 HLA-E를 결여한 Cr-51-표지된 표적 세포는 효과적으로 죽였지만, 기능적 HLA-E를 발현하는 표적 세포는 죽이는 데는 덜 효과적이었다. NKL 세포가 Z199와 예비 인큐베이션되었을 때, HLA-E를 발현하는 표적 세포는 HLA-E를 결여하는 표적 세포와 마찬가지로 똑같이 잘 죽었으며, 이로써 Z199가 CD94/NKG2A를 기능적으로 억제한다는 것이 확인된다.
도 2는 Biacore 실험을 나타내는데, 이 경우 HLA-E 테트라머와 예비 인큐베이션된 단쇄 CD94/NKG2A Fc(scCD94/NKG2A-Fc) 구성물은 Z199와 결합하는 것이 가능했지만, HP-3D9는 결합하지 못했다.
도 3은 유세포분석에 의해서 평가된, CD94/NKG2A를 과발현하는 Ba/F3 세포와 HLA-E 테트라머, HP-3D9 및 Z199와의 결합을 나타낸다. Z199와 예비 인큐베이션되었을 때, Ba/F3-CD94/NKG2A 세포는 HLA-E 테트라머와 결합하는 것이 여전히 가능했지만, HP-3D9와 예비 인큐베이션되었을 때는 그렇지 않았다.
도 4는 Z199의 VL(SEQ ID NO:2)과 VH(SEQ ID NO:4) 서열의 인간화에 대해 이루어진 서열 분석을 나타낸다. Kabat 방식에 따라서 넘버링한 잔기인 첫째 라인에서는 마스크가 밑줄로 표시되고, Kabat CDR이 볼드체로 표시된다. 점라인 서열에서는 마우스/인간 점라인의 차이가 회색 음영으로 표시된다(VKIII_L6/JK2: SEQ ID NO:12; VH3_21/JH3: SEQ ID NO:14). 인간화된 Z199(humZ199)의 VL(SEQ ID NO:13) 및 VH(SEQ ID NO:15) 영역의 결과의 서열에는 볼드체와 밑줄로서 인간으로서의 잠재적 역돌연변이 잔기가 주어진다.
도 5는 경쇄에 역돌연변이 E1Q, L46P, L47W, I58V 또는 D70S를 가진 humZ199 변이체의 Biacore에서의 결합 프로파일을 나타낸다. 재조합 발현된 모 뮤린 항체 Z199(rec)와 인간 IgG4(S241P) 부분을 가진 키메라 Z199(chim)는 scCD94/NKG2A-Fc에 효과적으로 결합되었고, 어떤 역돌연변이도 없는 인간화된 Z199(hum)는 scCD94-NKG2A-Fc에 대해서 아주 낮은 결합 역량을 가졌다. 반면에, Z199 경쇄에 존재하는 단일 역돌연변이 L46P는 결합을 회복시켰다.
도 6은 경쇄에 존재하는 L46P와 조합하여 선택된 역돌연변이를 가진 humZ199 변이체의 친화성 결정을 나타낸다. 각 돌연변이의 KD 값을 경쇄에 L46P 돌연변이를 가진 humZ199(도면에서 "huZ199(LC:L46P)로 표시됨)에 대해 정규화하여 KD의 상대적 변화를 얻었다.
도 7은 별표로 표시된, Z199 VL 및 VH 서열에 만들어진 Ala-돌연변이의 위치를 나타낸다. 서열 식별번호는 도 4를 참조한다.
도 8은 chimZ199에 대해 정규화된, VH 영역에 알라닌 돌연변이를 가진 Z199와 고정된 scCD94-NKG2A-Fc의 결합을 나타낸다.
도 9는 chimZ199의 결합에 대해 정규화된, VL 영역에 알라닌 돌연변이를 가진 Z199와 고정된 sc-CD94-NKG2A-Fc의 결합을 나타낸다.
도 10은 정렬된 NKG2A(SEQ ID NO:11)와 NKG2C(SEQ ID NO:16) 위의 노출된 잔기(밑줄)의 맵핑을 나타낸다. NKG2A 서열로부터 넘버링한 잔기가 사용되었다. 보존된 잔기는 *로 표시된다.

정의

본원에서 용어 "항체"는 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 전장 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중-특이적 항체(예를 들어, 이중-특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하고, 단 이들은 바람직한 생물학적 활성(예를 들어, 인간 CD94/NKG2A와의 결합)을 나타내야 한다. 항체 생산에 관련된 다양한 기술이 Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988) 등에서 제공된다.

"항체 단편"은 전장 항체의 일부분, 바람직하게 전장 항체의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함하며, 합성 및 반-합성 항체-유래 분자를 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)3, Fv(전형적으로 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인), 단쇄 Fv(scFv), dsFv, Fd 단편(전형적으로 VH 및 CH1 도메인), 및 dAb(전형적으로 VH 도메인) 단편; VH, VL, VhH, 및 V-NAR 도메인; 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 및 kappa 바디(예를 들어, Ill et al., Protein Eng 1997;10:949-57 참조); 낙타 IgG; IgNAR; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체 단편, 및 하나 이상의 분리된 CDR 또는 기능적 파라토프가 포함되며, 이 경우 분리된 CDR 또는 항원-결합 잔기 또는 폴리펩티드는 함께 회합되거나 연결되어 기능적 항체 단편을 형성할 수 있다. 항체 단편의 여러 가지 다양한 타입이 Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;23, 1126-1136; WO 2005040219, 및 공개된 미국특허출원 제20050238646호 및 제20020161201호 등에서 설명되거나 검토되었다.

본원에서 사용된 용어 "항체 유도체"는 전장 항체 또는 항체의 단편을 포함하고, 항체의 단편은 전장 항체의 적어도 항원-결합 또는 가변 영역을 포함하는 것이 바람직하며, 이때 아미노산 중 하나 이상은, 예를 들어 이 항체와 제 2 분자의 연결을 위해, 예를 들어 알킬화, PEG화, 아실화, 에스테르 형성 또는 아미드 형성 등에 의해서 화학적으로 변형된다. 이것은, 제한되지는 않지만, PEG화된 항체, 시스테인-PEG화된 항체, 및 이들의 변이체를 포함한다.

본원에서 사용된 "면역콘쥬게이트"는 세포독성제, 검출가능한 제제 등과 같은 제 2 제제와 회합되거나 연결된 항체 유도체와 같은 본 발명에 따른 제제를 포함한다.

"인간화된" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 인간/비-인간 키메라 항체이다. 대부분의 인간화된 항체는 수여자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 바람직한 특이성, 친화성 및 역량을 가진 마우스, 래트, 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수여자 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수여자 항체나 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이런 변형들은 항체 성능을 더욱 개량하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 전형적으로 두 개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 여기서 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 것들과 상응하고, FR 잔기의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 또한, 인간화된 항체는 선택적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분을 포함할 수 있으며, 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역이 포함된다. 더 상세한 내용은, 예를 들어 Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), WO 92/02190, 미국특허출원 제20060073137호, 및 미국특허 6,750,325, 6,632,927, 6,639,055, 6,548,640, 6,407,213, 6,180,370, 6,054,297, 5,929,212, 5,895,205, 5,886,152, 5,877,293, 5,869,619, 5,821,337, 5,821,123, 5,770,196, 5,777,085, 5,766,886, 5,714,350, 5,693,762, 5,693,761, 5,530,101, 5,585,089, 및 5,225,539를 참조한다.

본원에서 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 일으키는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"(경쇄 가변 도메인 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3)과 중쇄 가변 도메인 잔기 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabat et al., 1991, 상동)로부터의 아미노산 잔기 및/또는 "초가변 루프"(경쇄 가변 도메인 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3)과 중쇄 가변 도메인 잔기 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196:901-917)로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 전형적으로, 이 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat 등(상동)에 설명된 방법에 의해 수행된다. 본원에서 "Kabat 위치", "Kabat 잔기", "Kabat 넘버링을 사용하여", "Kabat에서와 같이 넘버링한 가변 도메인 잔기" 및 "Kabat에 따라서"와 같은 문구들은 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대한 이런 넘버링 시스템을 말한다. Kabat 넘버링 시스템을 사용하면 펩티드의 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축이나 또는 이들에의 삽입에 해당하는 만큼 더 적거나 추가된 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 CDR H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따라서 잔기 52a)과 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기들(예를 들어, Kabat에 따라서 잔기 82a, 82b 및 82c 등)을 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 항체 서열의 상동성의 영역에서 "표준" Kabat 넘버링된 서열과 정렬시킴으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. 달리 지시되거나 문맥상 모순되지 않는다면, 본원에 설명된 VL 또는 VH 서열의 모든 아미노산 잔기의 위치는 Kabat를 따른다.

"프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 CDR 이외의 다른 VH 또는 VL 잔기이다.

폴리펩티드의 "변이체"는 기준 폴리펩티드, 전형적으로 자생 또는 "모" 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 말한다. 폴리펩티드 변이체는 자생 아미노산 서열 내의 어떤 위치에 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 지닐 수 있다. "보존성" 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 물리화학적 특성의 특성을 가진 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 일족은 본 분야에 공지되어 있으며, 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 가진 아미노산을 포함한다.

두 아미노산 서열의 문맥에서 용어 "실질적으로 동일한"은 이 서열들의 디폴트 갭 하중을 사용하여 GAP 또는 BESTFIT 프로그램 등에 의해 최적 정렬되었을 때 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 95, 적어도 약 98, 또는 적어도 약 99 퍼센트 서열 동일성을 공유한다는 의미이다. 한 구체예에서, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존성 아미노산 치환에 의한 차이를 나타낸다. 서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존성 아미노산 치환을 포함하여 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 배정된 유사성의 척도를 이용하여 유사한 서열을 일치시킨다. 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 GCG 소프트웨어는 "Gap" 및 "BestFit"과 같은 프로그램을 함유하는데, 이들은 디폴트 파라미터와 함께 사용되어 상이한 종의 생물로부터의 상동성 폴리펩티드와 같은 밀접히 관련된 폴리펩티드들 사이의, 또는 야생형 단백질과 그것의 뮤테인 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정할 수 있다. 예를 들어, GCG 버전 6.1을 참조한다. 또한, 폴리펩티드 서열은 디폴트 파라미터나 권장 파라미터를 적용하는 FASTA 또는 ClustalW를 이용하여 비교될 수 있다. GCG 버전 6.1의 프로그램인 FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)은 쿼리 서열과 서치 서열 사이의 가장 잘 오버랩된 영역들의 정렬 및 서열 동일성 퍼센트를 제공한다(Pearson, Methods Enzymol. 1990; 183:63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000; 132: 185-219). 어떤 서열을 여러 생물로부터의 다수의 서열을 함유하는 데이터베이스와 비교할 때, 또는 추론할 때 바람직한 또 다른 알고리즘은 디폴트 파라미터를 이용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 Blastp이다. 예를 들어, Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990; 215:403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997; 25:3389-402 (1997)를 참조하며, 이들은 본원에 참고자료로 포함된다. 2개의 실질적으로 동일한 아미노산 서열에서 "상응하는" 아미노산 위치들은 여기 언급된 단백질 분석 소프트웨어 중 임의의 것에 의해 정렬된 것들이며, 이 경우 전형적으로 디폴트 파라미터가 사용된다.

기준 항체(예를 들어, Z199)의 "생물학적 특징"을 가진 항체는 동일한 항원(예를 들어, NKG2A)과 결합하는 다른 항체와 그것을 구별하는 그 항체의 생물학적 특징들 중 하나 이상을 지니는 것이다. 예를 들어, Z199의 생물학적 특징을 가진 항체는 NKG2A의 활성화를 차단하고, 및/또는 NKG2A의 세포외 도메인과의 결합에서 Z199와 교차-경쟁할 수 있다.

NKG2A(OMIM 161555, 전체 개시내용이 본원에 참고자료로 포함된다)는 NKG2 군의 전사체의 일원이다(Houchins, et al. (1991 ) J. Exp. Med. 173:1017-1020). NKG2A는 25kb에 걸친 7개 엑손에 의해 암호화되며, 어떤 차이가 있는 스플라이싱을 나타낸다. CD94와 함께 NKG2A는 헤테로다이머 억제성 수용체 CD94/NKG2A를 형성하며, 이것은 NK 세포, α/β T 세포, γ/δ T 세포, 및 NKT 세포의 하위단위들의 표면에서 발견된다. 억제성 KIR 수용체와 유사하게 이것도 세포질 도메인에 ITIM을 지닌다. 본원에서 사용된 "NKG2A"는 NKG2A 유전자 또는 암호화된 단백질의 어떤 변이체, 유도체 또는 동형을 말한다. 또, 야생형 전장 NKG2A와 하나 이상의 생물학적 특성이나 기능을 공유하는 한편, 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 동일성을 공유하는 어떤 핵산 또는 단백질 서열도 포함된다. 인간 NKG2A는 3개의 도메인에 233개 아미노산을 포함하며, 세포질 도메인이 잔기 1-70을 포함하고, 막통과 영역이 잔기 71-93을 포함하고, 세포외 영역이 잔기 94-233을 포함하며, 서열은 다음과 같다:

NKG2C(SEQ ID NO:16; OMIM 602891, 전체 개시내용이 본원에 참고자료로 포함된다)와 NKG2E(OMIM 602892, 전체 개시내용이 본원에 참고자료로 포함된다)는 NKG2 군의 전사체의 다른 두 일원이다(Gilenke et al. (1998) lmmunogenetics 48:163-173). CD94/NKG2C 및 CD94/NKG2E 수용체는 NK 세포 및 T 세포와 같은 림프구의 하위단위의 표면에서 발견되는 활성화 수용체이다.

HLA-E(OMIM 143010, 전체 개시내용이 본원에 참고자료로 포함된다)는 세포 표면에서 발현되고 펩티드, 예를 들어 다른 MHC 부류 I 분자의 신호 서열로부터 유래된 단편 등의 결합에 의해서 조절되는 종래에 볼 수 없던 MHC 분자이다. HLA-E의 가용성 버전도 또한 확인되었다. T 세포 수용체 결합 특성에 더하여, HLA-E는 CD94/NKG2A, CD94/NKG2B, 및 CD94/NKG2C와 특이적으로 결합함으로써, 자연사멸(NK) 세포, 자연사멸 T 세포(NKT) 및 T 세포(α/β 및 γ/δ)의 하위단위들과 결합한다(예를 들어, Braud et al. (1998) Nature 391:795-799, 전체 개시내용이 본원에 참고자료로 포함된다). HLA-E의 표면 발현은 표적 세포가 CD94/NKG2A+ NK, T, 또는 NKT 세포 클론에 의해 용해되는 것을 방지한다. 본원에서 사용된 "HLA-E"는 HLA-E 유전자 또는 암호화된 단백질의 어떤 변이체, 유도체 또는 동형을 말한다. 또, 야생형 전장 HLA-E와 하나 이상의 생물학적 특성이나 기능을 공유하는 한편, 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 동일성을 공유하는 어떤 핵산 또는 단백질 서열도 포함된다.

핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치된 경우 "작동 가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 전-서열 또는 분비 리더의 DNA는 만일 그것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전-단백질로서 발현된다면 폴리펩티드의 DNA에 작동 가능하게 연결된 것이다. 프로모터 또는 인핸서는 만일 그것이 서열의 전사에 영향을 미친다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 또는, 리보솜-결합 부위는 만일 그것이 번역을 촉진하도록 위치된다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 연속적이란 의미이며, 분비 리더의 경우에는 연속적이면서 리딩 페이즈 내에 있다는 의미이다. 그러나, 인핸서는 연속적이면 안 된다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 만일 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터나 링커가 종래의 관례에 따라서 사용된다.

"분리된" 분자는 조성물에서 지배적인 종들인 분자이며, 이때 이 분자는 분자가 속하는 분자의 부류와 관련하여 발견된다(즉, 조성물 중의 분자의 타입의 적어도 약 50%를 구성하며, 전형적으로 조성물 중의 분자, 예를 들어 펩티드의 종들의 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 그 이상을 구성할 것이다). 흔히 항체 분자의 조성물은 조성물 중에 존재하는 모든 펩티드 종들과 관련하여, 또는 적어도 제안된 사용과 관련해서 실질적으로 활성인 펩티드 종들과 관련하여 항체 분자에 대해 98%, 98%, 또는 99% 상동성을 나타낼 것이다.

본 발명과 관련하여, "치료" 또는 "치료하는"은, 문맥상 모순되지 않는다면, 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 임상적으로 관련된 징후의 예방, 완화, 개선, 관리, 치유 또는 감소를 말한다. 예를 들어, 질환 또는 장애의 어떤 증상이나 임상적으로 관련된 징후도 확인되지 않은 환자의 "치료"는 방지적 또는 예방적 치료법이지만, 질환 또는 장애의 증상이나 임상적으로 관련된 징후가 확인된 환자의 "치료"는 일반적으로 방지적 또는 예방적 치료법을 구성하지 않는다.

본 발명과 관련하여, "CD94/NKG2A 양성 림프구"는 세포 표면에서 CD94/NKG2A를 발현하는 림프양 계통의 세포(예를 들어, NK-, NKT- 및 T 세포)를 말하며, 이것은, 예를 들어 CD94 및 NKG2A 상의 조합된 에피토프 또는/및 NKG2A 단독 상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하는 유세포분석에 의해 검출될 수 있다. 또한, "CD94/NKG2A 양성 림프구"는 림프양 기원의 불멸 셀라인을 포함한다(예를 들어, NKL, NK-92).

본 발명과 관련하여, "CD94/NKG2A 양성 림프구의 표면에서 발현된 인간 CD94 /NKG2A 수용체의 억제 활성을 감소시키는"은 CD94/NKG2A의 사이토카인 방출 및 세포독성 반응과 같은 림프구 반응을 가져오는 세포내 과정에 네거티브한 영향을 미치는 능력이 억제되는 과정을 말한다. 이것은, 예를 들어 표준 NK- 또는 T 세포 기반 세포독성 분석에서 측정될 수 있으며, 여기서 CD94/NKG2A 양성 림프구에 의한 HLA-E 양성 세포의 사멸을 자극하는 치료용 화합물의 능력이 측정된다. 한 구체예에서, 항체 제제는 설명된 세포독성 분석에서 CD94/NKG2A-제약 림프구의 세포독성에 적어도 10% 증가, 바람직하게는 림프구 세포독성에 적어도 40% 또는 50% 증가, 또는 더 바람직하게 NK 세포독성에 적어도 70% 증가를 야기한다.

본 발명과 관련하여, "인간 CD94/NKG2A 수용체와 결합하는 제제"는 이 제제가 CD94/NKG2A 또는 NKG2A의 존재 하에 제제가 인큐베이션되고, 방사성 표지, 질량분광법과 같은 물리적 방법, 또는 예를 들어 세포형광분석(예를 들어, FACScan)에 의해 검출되는 직접 또는 간접 형광 표지를 통해 결합이 검출되는 임의의 표준 분석을 사용했을 때 인간 CD94/NKG2A 수용체에 대해 검출가능한 결합을 나타내는 제제를 말한다. 비-특이적 제제인 대조군에서 보이는 양을 넘는 어떤 결합 양은 이 제제가 표적과 결합한다는 것을 의미한다. 본 발명과 관련하여, "Z199 항체"는 뮤린 항-NKG2A 항체 Z199이며, 이것은 Carretero et al.(Eur J Immunol 1997;27:563-7)에 의해서 설명되었고, Beckman Coulter, Inc.(Product No. IM2750, USA)를 통해 현재 상업적으로 입수가능하다. Z199의 VH 및 VL 서열의 결정이 실시예 2에 설명된다. Z199의 인간화된 버전은 "humZ199", "huZ199", "hzZ199", 또는 "hZ199"로서 본원에서 언급될 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 인간 NKG2A의 세포외 부분에 결합하는 어떤 제제가 비-경쟁적 길항제라는 발견, 즉 수용체와 HLA-E의 결합을 차단하지 않으면서 CD94/NKG2A 수용체의 억제 활성을 감소시킨다는 발견에 일부 기초한다. 바람직한 제제는 활성화 CD94 /NKG2C 수용체보다 높은 효능으로 억제성 CD94/NKG2A 수용체와 결합한다. 본원에 나타낸 대로, 이러한 제제는 잔기 P94-N107, M189-E197 또는 이들 둘 다를 포함하는 NKG2A(SEQ ID NO:11)의 세그먼트에 결합할 수 있다. 본 발명의 비-경쟁적 CD94 /NKG2A 길항제는, 예를 들어 암, 바이러스 질환, 자가면역 질환 및/또는 염증성 장애와 같은 몇 가지 타입의 질환 및 장애에서 치료제로서 사용될 수 있다. 비-경쟁적 길항제는, 예를 들어 가용성 HLA-E가 존재하는 치료 용도에서 유리하게 사용될 수 있다.

본원에 설명된 비-경쟁적 길항제 중 한 가지 타입은 항-NKG2A 항체, 특히 인간 환자의 치료에 적합한 항체이다. 이러한 항체는 인간 항체 또는 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화 버전일 수 있다. 인간 CD94/NKG2A와의 결합에서 뮤린 항체 Z199와 경합하는 인간 또는 인간화된 항체가 본 발명의 특정한 양태이다. 한 구체예에서, CD94/NKG2A 수용체와의 결합에서 Z199와 경쟁하는 인간 또는 인간화된 항체는 잔기 P94-N107, M189-E197를 포함하는 NKG2A의 세그먼트에 결합하거나, 또는 이들 세그먼트에 모두 결합한다. 예를 들어, 항체는 NKG2A의 P94, S95, T96, L97, I98, Q99, R100, H101, L106, M189, 또는 E197로부터 선택된 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 구체예에서, 항체는 Z199와 동일한 에피토프에 결합한다. 실시예에 설명된 대로, Z199는 림프구에서 발현된 인간 CD94/NKG2A 수용체의 비-경쟁적 길항제인 것으로 판명되었는데, 이는 Z199가 CD94/NKG2A의 기능은 억제했지만(도 1에 도시), CD94/NKG2A 수용체와 HLA-E 결합(도 2 및 3)에는 영향을 미치지 않았기 때문이다. 또, Z199는 높은 특이성으로 CD94/NKG2A에 결합했으며, 이때 KD는 CD94/NKG2C 수용체에 대한 결합 특이성보다 적어도 100배 더 낮았다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 Z199의 인간화된 버전인 특정한 인간화된 항체를 제공한다. 이러한 항체는 전형적으로 인간 프레임워크 서열에 Z199 CDR의 핵심 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 인간화된 Z199 항체는 Z199 VL 도메인의 Kabat 잔기 Y32,L50 및 P95와 Z199 VH 도메인의 Kabat 잔기 Y56, Y98 및 P99를 포함할 수 있다. Z199 VH 및 VL 서열에서, 이들은 Z199 CDR에 존재하는 것들에 상응하는 Kabat 위치에서 Z199 VL 도메인(SEQ ID NO:2)의 아미노산 잔기 Y31, L49, 및 P94, 그리고 Z199 VH 도메인(SEQ ID NO:4)의 아미노산 잔기 Y57, Y102, 및 P103에 상응한다.

인간화된 Z199 항체는, 예를 들어 친화성, 안정성, 또는 인간화된 항체의 다른 특성을 증진시키기 위해서, 인간 프레임워크 서열에 하나 이상의 역돌연변이를 더 포함할 수 있다. 바람직한 역돌연변이는 바람직하게는 Z199 VH 및 VL 도메인에 존재하는 것들에 상응하는 Kabat 위치에서, Z199 VL 도메인 서열의 아미노산 잔기 Q1, P45, W46, V57, 및 S69 중 하나 이상 및/또는 Z199 VH 도메인 서열의 아미노산 잔기 A49, T78, 및 T97 중 하나 이상, 바람직하게는 Z199 VL 도메인 서열의 적어도 잔기 P45를 포함하는 인간화된 아미노산 항체가 얻어지는 것들을 포함한다. 한 구체예에서, 인간화된 Z199 항체는 Z199 VL 도메인 서열의 적어도 아미노산 잔기 24-33, 49-55, 및 88-96과 Z199 VH 도메인 서열의 적어도 아미노산 잔기 31-35, 50-60 및 99-108을 포함하고, 선택적으로 또한 Z199 VH 도메인 서열의 잔기 62, 64, 66를 포함한다. 또한, 인간화된 항체는 CDR, 특히 CDR_L1에 삽입된 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 Z199 VL 도메인의 잔기 30과 31 사이에 삽입된 세린(S)을 함유할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 분리된 항체 결합 인간 CD94/NKG2A 수용체를 제공하며, 이것은 다음을 포함한다.

(a) SEQ ID NO:5를 포함하는 CDR-L1;

(b) SEQ ID NO:6를 포함하는 CDR-L2;

(c) SEQ ID NO:7을 포함하는 CDR-L3;

(d) SEQ ID NO:8을 포함하는 CDR-H1;

(e) SEQ ID NO:9를 포함하는 CDR-H2;

(f) SEQ ID NO:10을 포함하는 CDR-H3;

(g) 인간 프레임워크 서열; 및

(h) VL 도메인의 Kabat 위치 46의 프롤린(P) 잔기.

Kabat 위치 46의 프롤린(P) 잔기는 인간 VL 프레임워크 서열에 원래 존재할 수도 있고, 아니면 서열의 아미노산 치환이나 다른 변형에 의해 도입될 수도 있다. 특정 구체예에서, 항체는 L46P 돌연변이를 가진 SEQ ID NO:13을 포함하는 VL 서열과 SEQ ID NO:15를 포함하는 VH 서열을 포함한다. 이 항체는 IgG4 불변 영역을 더 포함할 수 있고, 안정성을 개선하기 위한 S241P 돌연변이가 선택적으로 있을 수 있다.

이들 및 다른 양태들이 이후 단락들과 실시예에서 더 상세히 설명된다.

제제

본원 발명은 인간 CD94/NKG2A 수용체의 세포외 부분과 결합하는 제제에 관한 것으로서, 이 제제는 (a) CD94/NKG2A 양성 림프구의 표면에서 발현되는 인간 CD94/ NKG2A 수용체의 억제 활성을 감소시키고, 및 (b) HLA-E와 동시에 CD94/NKG2A에 결합할 수 있으며, 상기 제제는 Z199 항체가 아니다.

추가의 또는 다른 구체예에서, 본원 발명은 인간 CD94/NKG2A 수용체의 세포외 부분에 결합하는 제제에 관한 것으로서, 이 제제는 (a) CD94/NKG2A 양성 림프구의 표면에서 발현되는 인간 CD94/NKG2A 수용체의 억제 활성을 감소시키며, 및 (b) CD94/NKG2A와의 결합에서 HLA-E와 경쟁하지 않고, 상기 제제는 SEQ ID NO:2를 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)과 SEQ ID NO:4를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 항체가 아니다.

본 발명의 한 양태에서, CD94/NKG2A 양성 림프구는 NK 세포, 세포독성 T 세포, 예를 들어 α/β T 세포 또는 γ/δ T 세포, 및 NKT 세포로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 전장 항체, 항체 단편, 및 합성 또는 반합성 항체-유래 분자로부터 선택된 항체로서, CD94/NKG2A와의 결합에서 Z199 항체와 경쟁하는 항체로부터의 CDR을 적어도 포함한다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 완전 인간 항체, 인간화된 항체, 및 키메라 항체로부터 선택된 항체이다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM 항체로부터 선택된 항체이다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 이소타입으로부터 선택된 인간 불변 도메인을 포함하는 항체이다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM 항체로부터 선택된 항체의 단편이다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된 불변 도메인을 포함하는 항체의 단편이다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 Fab 단편, Fab' 단편, Fab'-SH 단편, F(ab)2 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 중쇄 Ig(라마 또는 낙타 Ig), VHH 단편, 단일 도메인 FV, 및 단쇄 항체 단편으로부터 선택된 항체 단편이다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 scFV, dsFV, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 카파 바디, IgNAR, 및 다중-특이적 항체로부터 선택된 합성 또는 반합성 항체-유래 분자이다.

본 발명은 이와 같이 NKG2A에 결합하는 항체 또는 다른 제제에 관한 것이다. 한 양태에서, 항체는 인간 NKG2C 또는 NKG2E에 대한 것보다 적어도 100배 더 낮은 KD로 NKG2A에 결합하는 뮤린 모노클로날 항체인 항체 Z199의 인간화된 버전이다. Z199는 인간 CD94/NKG2A의 기능을 차단할 수 있고, CD94/NKG2A-제한된 림프구에 의해 농도-의존적 방식으로 세포의 사멸을 특이적으로 유도한다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는, 예를 들어 CD94/NKG2A 수용체에서 입체구조적 변화를 방지 또는 유도하고, 및/또는 CD94/NKG2A 수용체의 다이머화 및/또는 클러스터화에 영향을 미침으로써 CD94/NKG2A 신호화를 방해하여 CD94/NKG2A-발현 림프구의 CD94/NKG2A-매개 억제를 감소시킨다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 NKG2C에 대한 것보다 적어도 100배 더 낮은 KD로 NKG2A의 세포외 부분에 결합한다. 추가의 바람직한 양태에서, 제제는 NKG2C에 대한 것보다 적어도 150, 200, 300, 400, 또는 10.000배 더 낮은 KD로 NKG2A의 세포외 부분에 결합한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 제제는 NKG2C 또는 NKG2E 분자에 대한 것보다 적어도 100배 더 낮은 KD로 NKG2A의 세포외 부분과 결합한다. 추가의 바람직한 양태에서, 제제는 NKG2C 또는 NKG2E 분자에 대한 것보다 적어도 150, 200, 300, 400, 또는 10.000배 더 낮은 KD로 NKG2A의 세포외 부분과 결합한다. 이것은, 예를 들어 BiaCore 실험에서 측정될 수 있으며, 이 실험에서는 고정된 CD94/NKG2A(CD94/NKG2 발현 세포로부터 정제된, 또는 생물-시스템에서 생산된)의 세포외 부분에 결합하는 제제의 능력이 측정되고, 동일한 분석에서 유사하게 생산된 CD94/NKG2C 및/또는 다른 CD94/NKG2 변이체에 대한 제제의 결합과 비교된다. 또는 달리, CD94/NKG2A를 자연적으로 발현하거나, 또는 과발현(예를 들어, 일시적 또는 안정한 트랜스펙션 후)하는 세포에 대한 제제의 결합이 측정되고, CD94/NKG2C 및/또는 다른 CD94/NKG2 변이체를 발현하는 세포의 결합과 비교된다. 본 발명의 항-NKG2A 항체는 선택적으로, CD94와 함께 억제성 수용체를 형성하는 NKG2A 스플라이스 변이체인 NKG2B와 결합한다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 인간 CD94/NKG2A 수용체의 세포외 부분과의 결합에서 항체 Z199와 경쟁한다. 이것은, 예를 들어 BioCore 실험에서 측정될 수 있으며, 이 실험에서는 Z199로 포화된 고정된 CD94/NKG2A 수용체(예를 들어, CD94/ NKG2A 발현 세포로부터 정제된, 또는 생물-시스템에서 생산된)의 세포외 부분에 결합하는 제제의 능력이 측정된다. 또는 달리, 포화 용량의 Z199와 예비 인큐베이션된, CD94/NKG2A 수용체를 자연적으로 발현하거나, 또는 과발현(예를 들어, 일시적 또는 안정한 트랜스펙션 후)하는 세포에 대한 제제의 결합이 측정된다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 Z199 항체와 동일한, 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합한다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 Z199 VH 및 VL 도메인으로부터 유래하는 CDR 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 양태에서, 제제는 Z199 CDR 서열에 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 제제는 제한된 수의 치환으로서, 예를 들어 Z199 CDR에 존재하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 역돌연변이와 같이, 자생 뮤린 CDR 서열에 역돌연변이를 포함한다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 Z199 가변 중쇄(VH) 도메인(SEQ ID NO:4)의 아미노산 잔기 31-35, 50-60, 62, 64, 66 및 99-108과 Z199 가변 경쇄(VL) 도메인 (SEQ ID NO:2)의 아미노산 잔기 24-33, 49-55 및 88-96을 포함하며, 선택적으로 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 아미노산 치환을 가진다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 경쇄의 Kabat 위치 46에 프롤린을 포함하는 완전 인간 또는 인간화된 항체이다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 재조합 점라인 서열들 및 관련된 체세포 초돌연변이로 구성된 군으로부터 선택된 인간 프레임워크 영역을 포함한다.

본 발명의 한 양태에서, 항체는 점라인 J-세그먼트로서 JH3 및 JK2를 가진, 인간 VH3_21 및 VKIII_L6 스캐폴드 서열을 포함하지만, 원칙적으로 말하면 VH3_21, VH3_23, VH3_11, VH3_07, VH3_48, VH3_30_3, VH3_64, VH3_30_5(중쇄) 및 VKIII_L6, VKI_L23, VKIII_A11, VKIII_A27, VKIII_L20, VKVI_A14, VKIJ.23, VKIJ.8, VKIJ.15 (경쇄)와 같은 다른 많은 주형이 사용될 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 항체 Z199가 결합하는 CD94/NKG2A 에피토프에 대해 발생된, 또는 Z199의 이디오타입에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체에 대해 발생된 완전 인간 항체이다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 인간 프레임워크 서열, 위치 46의 프롤린 잔기, 및 상보성-결정 영역(CDR) a) SEQ ID NO:8을 포함하는 CDR-H1; b) SEQ ID NO:9를 포함하는 CDR-H2; c) SEQ ID NO:10을 포함하는 CDR-H3; d) SEQ ID NO:5를 포함하는 CDR-L1; e) SEQ ID NO:6을 포함하는 CDR-L2; 및 f) SEQ ID NO:7을 포함하는 a CDR-L3을 포함한다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 적어도 부분적으로 정제된 형태이다.

본 발명의 한 양태에서, 제제는 본질적으로 분리된 형태이다.

본 발명은, 예를 들어 CDR-H2 같은 VH CDR의 적어도 일부분이 인간 VH 어셉터 서열의 상응하는 부분과 동일하고, 따라서 인간화된 항체의 면역원성을 감소시키는 humZ199 변이체를 제공한다. 예를 들어, 도 4에 나타낸 대로, humZ199 CDR-H2에서 잔기 Y58 내지 G65가 VH3_21 서열과 동일하다. 이러한 인간화된 변이체는 뮤린 또는 키메라 형태의 Z199와 유사한 CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구의 세포독성을 강화하는데도 또한 효과적일 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명은 뮤린 항체 Z199, 및 인간 프레임워크 서열에 존재하는 것들에 상응하는 어떤 항원-결합 잔기를 포함하는 CDR을 가진 항체를 제공한다. 예를 들어, 실시예 4에 나타낸 대로, Z199 VL CDR의 Kabat 잔기 Y32, L50, 및 P95와 Kabat 잔기 Y56, Y98, 및 Y99는 항원 인식에 유의하게 기여한다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 따라서 이들 잔기 중 적어도 일부, 바람직하게는 이들 잔기를 전부 포함한다.

인간화된 항- NKG2A 항체

비-인간 항체를 인간화하는 방법들이 본 분야에서 설명되었다. 일반적으로, 인간화 과정에서는 뮤린 항체의 상호작용-영역을 암호화하는 뉴클레오티드가 인간 IgG를 암호화하는 cDNA-벡터에서 클로닝될 수 있으며, 이것은 뮤린 CDR로부터의 아미노산 잔기를 숨기고 있는 인간 IgG 백본으로 구성된 키메라 항체가 생성되도록 행해질 수 있다. 이러한 항체는 원래 뮤린 항체에 비하여 낮은 친화성, 낮은 안정성, 또는 다른 바람직하지 않은 특징들을 나타낼 수 있고, 또한 면역원성일 수 있다. 따라서, 키메라 Ab의 각 아미노산은 인간에서 치료 용도를 위한 높은 품질의 기능적 mAb를 얻기 위해 최적화될 필요가 있다.

전형적으로, 인간화된 항체는 인간이 아닌 출처로부터 그것에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 주로 "임포트" 잔기라고 언급되며, 이것은 전형적으로 "임포트" 가변 도메인에서 취해진다. 인간화는 본질적으로 Winter와 동료들의 방법(Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988))에 따라서 인간 "어셉터" 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 치환함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화된" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다(미국특허 제4,816,567호). 실제로 인간화된 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기와 가능하다면 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

인간화된 항체를 제조하는 다른 방법이 미국 특허출원 공보 제2003/0017534호에 설명되는데, 여기서는 인간화된 항체와 항체 제제가 트랜스제닉 비-인간 동물로부터 생산된다. 비-인간 동물은 트랜스제닉 비-인간 동물에서 유전자 재배열 및 유전자 전환을 겪어서 다종의 인간화된 면역글로불린을 생산할 수 있는 하나 이상의 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 함유하도록 유전자 조작된다.

인간화된 항체의 제조에 사용될 수 있는 인간 가변 도메인 경쇄와 중쇄의 선택은 항원성의 감소를 위해 매우 중요하다. 소위 말하는 "베스트-핏" 방법에 따라서, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열이 공지된 인간 가변-도메인 서열의 라이브러리 또는 인간 점라인 서열의 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 다음에, 설치류의 서열에 가장 가까운 인간 서열이 인간화된 항체의 인간 프레임워크 영역으로서 수용될 수 있다(Sims et al., J. Immunol. 1993; 151:2296 et seq; Chothia et al, Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196:901-917). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 동일한 프레임워크가 몇 가지 상이한 인간화된 항체에서 사용될 수 있다(Carter et al., PNAS USA, 1992; 89:4285 et seq; Presta et al., J. Immunol. 1993; 151:2623 et seq). 인간 환자에서 항체 분자의 면역원성이 감소되도록 디자인된 다른 방법은 베니어드 항체(예를 들어, 미국특허 제6,797,492호 및 미국 특허출원 공보 제20020034765호 및 제20040253645호 참조) 및 T-세포 에피토프 분석 및 제거에 의해 변형된 항체(예를 들어, 미국특허 제5,712,120호 및 미국 특허출원 공보 제20030153043호 참조)를 포함한다.

항원에 대한 높은 친화성과 다른 유리한 생물학적 특성들을 보유한 채로 항체가 인간화되는 것이 또한 중요하다. 이 목표를 달성하기 위하여, 바람직한 방법에 따라서, 인간화된 항체는 모 서열 및 인간화된 서열의 3-차원 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 개념적인 인간화된 산물을 분석하는 과정에 의해 제조된다. 3-차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하며 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3-차원 입체형태 구조를 영상으로 표시하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 영상을 조사하여 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있는데, 즉 항원과 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능해진다. 이 방식으로, FR 잔기가 수여자 및 임포트 서열로부터 선택되어 조합될 수 있고, 이로써 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성 같은 바람직한 항체 특성이 달성된다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는데 직접 그리고 가장 실질적으로 연관된다.

Z199가 비-경쟁적 CD94/NKG2A 길항제라는 예상외의 발견이 실시예 1과 도 1, 2 및 3에 제시된다. HP-3D9(항-CD94)(도 1A), Z199(항-NKG2A)(도 1 B) 및 Z270(항-NKG2A)은 모두 효과적으로 CD94/NKG2A-제한된 림프구에 의한 HLA-E 발현 표적 세포의 사멸을 유도했다. 그러나, HP-3D9와 Z270은 CD94/NKG2A와 HLA-E의 상호작용을 방지했지만, Z199는 이 상호작용을 방지하지 않았다. 또한, 100pg/mL 내지 1㎍/mL의 용량 범위로 시험된 humZ199는 포화 용량의 HLA-E 테트라머와 함께 예비 인큐베이션된 CD94/NKG2A-발현 세포와 결합할 수 있었다.

따라서, Z199와 humZ199는 비-경쟁적 CD94/NKG2A 길항제이다. 이론에 제한되지는 않지만, 예를 들어, CD94/NKG2A 수용체의 입체형태의 변화를 방지하거나 유도함으로써, 및/또는 CD94/NKG2A 수용체의 다이머화 및/또는 클러스터화에 영향을 미침으로써 Z199가 CD94/NKG2A 신호화를 방해하는 것이 가능하다.

한 양태에서, 본 발명에 따른 제제는 비-경쟁적 길항제이다. 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 제제는 CD94/NKG2A 수용체의 내재화의 속도 또는 양에 대해서 상이한 효과를 가진 비-경쟁적 길항제이며, 이로써 더 많거나 더 적은 항원이 추가의 치료제 및/또는 HLA-E에 의한 결합에 이용될 수 있게 된다. CD94/NKG2A 수용체와 HLA-E의 상호작용을 방지하는 제제는 HLA-E와 다른 CD94/NKG2 수용체(예를 들어, CD94/NKG2C)의 결합을 증가시킬 수 있고, 이런 활성화는 이들 수용체에 의해 촉발되는 원치 않는 생물학적 효과를 일으킬 수 있다(예를 들어, 원치 않는 전-염증성 반응을 야기). 한 양태에서, 본 발명에 따른 제제는 다른 CD94/NKG2 수용체와 결합하여 이들을 촉발시키는 HLA-E의 잠재성은 증가시키지 않으면서 CD94/NKG2A 수용체를 차단하며, 이로써 다른 CD94/NKG2 수용체에 의해 유발된 원치 않는 부작용이 아마 적어질 것이다.

실시예 2는 전형적인 인간화된 항-NKG2A 항체의 디자인을 설명하고, 실시예 3은 humZ199 및 역돌연변이 변이체의 Biacore 분석을 설명한다. 처음에는 인간화된 Z199 항체는 항원과 결합할 수 없는 것으로 밝혀졌다. 따라서, humZ199의 경쇄 및 중쇄에 역돌연변이가 도입되었다. 흥미롭게도, 경쇄에 도입된 역돌연변이 L46P는 항원을 인식하여 결합하는 항체의 능력을 회복시켰다(도 5). 이 돌연변이의 친화성은 72pM으로서 측정되었는데, 이것은 키메라 Z199(24pM)과 동일한 정도의 크기였다(표 1). 경쇄에 도입된 다른 역돌연변이들은 L46P와 조합되었을 때 항체의 친화성을 그다지 증진시키지 못했다(도 6).

실시예 4는 알라닌-스캔에 의해 Z199 가변 서열에서 중요 잔기를 확인한 것을 나타낸다. 키메라 Z199와 비교하여, 키메라 Z199 경쇄의 Kabat 잔기 Y32, L50 또는 P95가 알라닌으로 치환되거나, 또는 중쇄의 Kabat 잔기 Y56, Y98 또는 P99가 알라닌으로 치환된 Z199 변이체를 제외한, 시험된 모든 ala-돌연변이가 분석에 사용된 두 mAb 농도(2.5nM 및 5nM)에서 비슷한 결합 프로파일을 나타냈다. Z199 경쇄 알라닌 돌연변이 Y32A, L50A 및 P95A는 약 40%의 항원-결합 능력을 나타냈다. 경쇄 돌연변이 Y49A의 상대 결합은 60-80%였다(도 9). 따라서, Z199 경쇄의 Kabat 잔기 Y32, L50 및 P95는 항원 인식에 상당히 기여했지만, 경쇄의 Kabat 잔기 Y49는 항원-결합에 중간 정도의 영향만을 미쳤다. 따라서, 본 발명은 VL 도메인에 Kabat 잔기 Y32, L50 또는 P95를 보유하는 humZ199 변이체를 제공한다.

아미노산 잔기의 넘버링에 관해서, 뮤린 Z199 경쇄의 가변 도메인이 humZ199의 것보다 1개 잔기가 짧으며, 따라서 humZ199 경쇄 서열에서 Kabat 잔기 S31에 상응하는 잔기를 결여한다는 것이 주지되어야 한다(도 4 및 7). 따라서, humZ199 경쇄 서열에서, 예를 들어 Y32, L46, L50 및 P95로서 Kabat에 따라서 넘버링된 잔기는 뮤린 Z199 경쇄 사슬에서 Kabat 잔기 Y31 , P45, L49 및 P94에 상응한다. 그러나, 다른 지시가 없다면, 도 4 및 7에 나타낸 Kabat 넘버링이 본원에서 언급된 모든 A199(뮤린 또는 인간화, 자생 또는 돌연변이, 중쇄 또는 경쇄) 가변 영역 잔기의 Kabat 넘버링의 기준으로서 사용된다.

Z199 중쇄 알라닌 돌연변이 Y56A, Y98A, 및 P99A는 항원-결합 능력의 약 40%를 보유했지만, 중쇄 돌연변이 Y58A 및 D97A의 상대 결합은 60-80%였다(도 8). 따라서, Z199 중쇄에서는 Kabat 잔기 Y56, Y98, 및 P99가 항원 인식에 상당히 기여한다. 한편, 중쇄에서 Kabat 잔기 Y58 및 D97은 항원-결합에 중간 정도의 영향을 미친다.

따라서, humZ199와 같은 Z199에 기초한 치료용 화합물은 Z199 경쇄에서 발견된 대로 CDR1에 Kabat 잔기 Y32, CDR2에 L50, 그리고 CDR3에 P95를, Z199 중쇄에서 발견된 배치대로 CDR2에 Kabat 잔기 Y56 그리고 CDR3에 Y98과 P99를 포함하는 것이 바람직하다.

한 양태에서, 본 발명은 Z199 하이브리도마에 의해 생산된 항-NKG2A 항체의 인간화된 버전, 및 Z199와 생물학적 특성 및/또는 실질적인 서열 동일성을 공유하는 비-인간 항체의 인간화된 버전을 제공한다. 다른 구체예에서, 모노클로날 항체 또는 그 단편 또는 유도체는 비-인간 영장류 NKG2A에 결합할 수 있다.

본원의 인간화된 항체는 인간 VH 및 VL 도메인에 편입된 비-인간 초가변 영역 또는 CDR 잔기를 포함한다.

한 양태에서, 본 발명은 인간 어셉터 프레임워크에 뮤린 항체 Z199의 CDR로부터의 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 제공하며, 이때 CDR-H2의 적어도 6개 C-말단 아미노산 잔기가 인간 어셉터 서열에 있는 것들과 동일하다. 이러한 인간화된 항체는, 예를 들어 CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구, 예를 들어 NK-t세포, NKT-세포, α/β T-세포, 및/또는 γ/δ T 세포의, 또는 CD94/NKG2A-발현 세포독성 림프구 집단의 세포독성 활성을 강화하는데 있어서 원래 뮤린 Z199 항체 또는 그것의 키메라 버전보다 더 효과적일 수 있다.

도 4에 도시된 대로, humZ199 VL 및 VH의 잠재적인 역돌연변이가 인간과 마찬가지로 밑줄친 볼드체로 제공된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 Kabat 넘버링을 사용했을 때, 다음의 역-돌연변이된 humZ199 경쇄 및 중쇄 변이체를 수반한다:

humZ199 VL: E1Q, L46P, L47W, I58V, D70S 및 (E1Q, L46P, L47W, I58V, D70S)의 임의의 조합.

humZ199 VH: S49A, S77T, A93T, A60P, S62T, K64T 및 (S49A, S77T, A93T, A60P, S62T, K64T)의 임의의 조합.

또한, 상기 나타낸 역-돌연변이된 인간화된 중쇄 및 경쇄의 어떤 조합을 포함하는 항체가 바람직하다.

다른 양태에서, 본 발명은 Z199 또는 humZ199(예를 들어, 도 4의 서열 참조)의 VH 도메인과 적어도 약 50%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 약 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 그 이상의 동일성)을 가진 VH 도메인을 포함하는 인간화된 항체를 제공한다. 다른 특정 양태에서, 본 발명은 인간 VH 도메인에 편입된 비-인간 CDR 잔기를 포함하는 VH 도메인을 포함하는 NKG2A에 결합하는 인간화된 항체를 제공하며, 이때 VH 도메인은 humZ199 VH와 적어도 약 50%(예를 들어, 적어도 90%) 동일하다.

인간화된 항체의 다양한 형태가 고찰된다. 예를 들어, 인간화된 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fab 또는 본원에 설명된 다른 타입의 단편일 수 있다. 또는 달리, 인간화된 항체는 전장 또는 무손상 항체, 예를 들어 전장 또는 무손상 IgG1 또는 IgG4 항체일 수 있다. 한 구체예에서, 인간화된 항체는 전장 IgG4 항체 또는 그 단편이다.

한 양태에서, 본 발명은 표적 세포가 NK 세포와 접촉하게 될 때, a) NKG2A와 특이적으로 결합하고; b) Fc 수용체와의 특이적 결합하지 않고; 그리고 c) 인간 NK 세포 상의 NKG2A와 결합되었을 때 상기 NK 세포가 표적 세포 표면에 HLA-E를 지닌 표적 인간 세포를 용해하는 것을 특징으로 하는 인간화된 항체를 제공한다. 한 구체예에서, 인간화된 항체는 Fc 수용체와의 결합을 방지하도록 변형된 인간 IgG1 불변 영역(예를 들어, IgG1, -2 또는 -3) 또는 인간 IgG4 불변 영역을 포함한다. Fc 수용체와 결합하지 않는 이러한 항체 및 항체 단편은, 항체 의존성 세포 세포독성에 의해 매개될 수 있는 NK 세포 자체의 고갈은 유발하지 않고 NK 세포를 활성화시키는 것이 바람직한 용도(예를 들어, 암, 감염성 질환)에서 특히 유용하며, "비-고갈형" 항체라고 언급될 수 있다.

추가의 양태에서, 인간화된 항체는 Fc 수용체와 결합하는 인간 IgG1 불변 영역(예를 들어, IgG1, -2 또는 -3), 또는 Fc 수용체와 결합하거나 Fc 수용체와의 결합이 증가되도록 변형된 인간 IgG1, 2, 3 또는 4 불변 영역, 또는 인간 IgG4 불변 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 모노클로날 항체 또는 그 단편이 항체가 결합되는 세포에 독성인 부분에 연결된다. 이러한 항체는 NK 세포가 고갈되는 것이 바람직한 용도에서 특히 유용하며, NK-LDGL(과립 림프구의 NK-타입 림프구증식성 질환; 또는 NK-LGL이라고 한다)와 같은 어떤 용도에서 유용하고, "고갈형" 항체라고 언급될 수 있다.

인간화된 항체의 재조합 생산을 위해, 인간화된 VH 및 VL 영역, 또는 그것의 변이체 버전이 표준 재조합 방법에 따라서 인간 항체로부터 전장 또는 말단 절단형 불변 영역을 암호화하는 발현 벡터에서 클로닝될 수 있다(예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 참조). 그 결과는 분비된 VH 및 VL 영역과 불변 영역을 포함하는, 관심의 인간화된 항체 분자를 발현하고 분비하는 트랜스펙션된 셀라인이다. 인간 항체의 불변 영역을 암호화하는 cDNA 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, GenBank를 통해 이용가능한 전형적인 cDNA 서열은 다음과 같고, 이들은 각각 그 전체가 본원에 참고자료로 포함된다:

인간 IgG1 불변 중쇄 영역: GenBank 수탁 No.: J00228;

인간 IgG2 불변 중쇄 영역: GenBank 수탁 No.: J00230;

인간 IgG3 불변 중쇄 영역: GenBank 수탁 No.: X04646;

인간 IgG4 불변 중쇄 영역: GenBank 수탁 No.: K01316; 및

인간 kappa 경쇄 불변 영역: GenBank 수탁 No.: J00241.

원한다면, 인간화된 항체의 부류는 공지의 방법에 의해서 "전환"될 수도 있다. 예를 들어, 원래 IgM 분자로서 생산된 항체가 IgG 항체로 부류 전환될 수 있다. 또한, 부류 전환 기술은 한 IgG 하위부류를 다른 하위부류로, 예를 들어 IgG1에서 IgG2로 전환하는데 사용될 수도 있다. 따라서, 다양한 치료 용도를 위하여, 본 발명의 항체의 이펙터 기능이, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM 항체로의 이소타입 전환에 의해 변화될 수 있다.

불변 영역은 공지의 방법에 따라서 더 변형될 수 있다. 예를 들어, IgG4 불변 영역에서, 잔기 S241이 프롤린(P) 잔기로 돌연변이될 수 있으며, 이로써 힌지에 완전한 이황화 다리의 형성이 가능해진다(예를 들어, Angal et al., Mol. Immunol. 1993; 30:105-8 참조).

항체 단편

본 발명의 인간화된 항체는 항체 단편으로서 제조될 수 있거나, 또는 항체 단편이 인간화된 전장 항체로부터 제조될 수 있다. 인간화된 항체의 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술들이 개발되었다. 종래에, 이들 단편은 전장 항체의 단백질 가수분해성 분해를 통해서 유래되었다(예를 들어, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). 그러나, 이들 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 또는, Fab'-SH 단편들이 E. coli로부터 직접 회수되고, 화학적으로 연결되어 F(ab')2 단편이 형성될 수 있다(Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). 다른 접근법에 따라서, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술들도 당업자에게 분명할 것이다. 다른 구체예에서, 선택된 항체는 단쇄 Fv 단편(scFv)이다. WO WO 1993/16185; 미국특허 제5,571,894호; 및 미국특허 제5,587,458호를 참조한다. 또 다르게는, 항체 단편은 "선형 항체", 예를 들어 미국특허 제5,641,870호에 설명된 것가 같다. 이러한 선형 항체 단편은 단일-특이적 또는 이중-특이적이 일수 있다.

이중-특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 가진 항체이다. 이중-특이적 항체를 제조하는 방법은 본 분야에 공지되어 있고, 전장 이중-특이적 항체의 전통적인 생산은 일반적으로 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 발현에 기초하며, 이 경우 이 2개 사슬이 상이한 특이성을 가진다(Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 본 발명에 따른 이중-특이적 항체에서, 적어도 하나의 결합 에피토프는 NKG2A 단백질 상에 있다. 항-NKG2A-결합 "팔"은 T 세포 수용체 분자(예를 들어, CD2 또는 CD3)와 같은 백혈구 상의 촉발 분자, 또는 IgG에 대한 Fc 수용체(Fc감마-R), 예를 들어 Fc-감마-RI(CD64), Rc-감마-RII(CD32) 및 Fc-감마-RIII(CD16)에 결합하는 "팔"과 조합될 수 있으며, 이로써 세포 방어 메커니즘이 NKG2A-발현 세포에 집중된다. 또한, 이중-특이적 항체는 NKG2A를 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화하는데 사용될 수 있다. 이들 항체는 NKG2A-결합 팔과 세포독성제(예를 들어, 사포린, 항-인터페론-알파, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트, 또는 방사성 동위원소에 결합하는 팔을 지닌다. 이중-특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')2 이중-특이적 항체)로서 제조될 수 있다. 2 이상의 원자가를 가진 항체들도 고찰된다. 예를 들어, 삼중-특이적 항체가 제조될 수 있다. Tutt et al., J. Immunol, 147: 60(1991 ).

Antibody Derivatives

본 발명의 범위 내의 항체 유도체는 제 2 제제에 콘쥬게이트된 또는 공유 결합된(예를 들어, 융합되는 등의) 인간화된 항체를 포함한다.

본 발명의 항 양태에서, 제제는 제 2 제제에 콘쥬게이트 또는 융합된다.

다른 양태에서, 제 2 제제는 PEG, 세포독성제, 검출가능한 마커, 표적화 제제와 같은 튀어나온 기로부터 선택된다.

예를 들어, 한 양태에서, 본 발명은 세포독성제에 콘쥬게이트 또는 공유 결합된 인간화된 항체를 포함하는 면역글로불린을 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 표면에 NKG2A 수용체를 지닌 세포를 죽일 수 있는 분자이다. 세포독성 또는 세포억제성 효과를 가진 어떤 부분도 본 발명의 항체에 콘쥬게이션될 수 있고, 이로써 본 발명의 세포독성 콘쥬게이트가 형성되고, 특이적 NK 수용체 발현 세포를 억제하거나 죽일 수 있으며, 이들은 치료용 방사선 동위원소, 독성 단백질, 독성 소 분자, 예를 들어 약물, 독소, 면역조정제, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 올리고뉴클레오티드, 효소 억제제, 치료용 방사선 핵종, 혈관형성 억제제, 화학요법제, 빈카 알칼로이드, 안트라시클린, 에피도필로톡신, 탁산, 항대사물질, 알킬화제, 항생제, COX-2 억제제, SN-38 안티미토틱, 항혈관형성 및 항 세포사멸제 및 자연사멸제, 특히 독소루비신, 메토트렉세이트, 탁솔, DTP1-1, 캄토테칸, 질소 머스터드, 겜시타빈, 알킬 술포네이트, 니트로소유레아, 트리아진, 폴산 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 백금 배위 착물, 슈도모나스 외독소, 리신, 아브린, 5-플루오로유리딘, 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 스타필로코칼 엔테로톡신-A, 미국자리공 항바이러스 단백질, 겔로닌, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소, 및 슈도모나스 내독소 및 기타를 포함한다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition(Mack Publishing Co. 1995); Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics(McGraw Hill, 2001); Pastan et al, (1986) Cell 47:641; Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43; U.S. Pat. No. 6,077,499 참조; 이들의 전문이 본원에 참고자료로 포함된다). 독소가 동물, 식물 진균, 또는 미생물 기원을 가질 수 있거나, 또는 화학 합성에 의해 새로 만들어질 수 있다는 것이 인정될 것이다.

또 다른 구체예에서, 항체는 방사선 활성 동위원소, 예를 들어 치료용 방사선 핵종 또는 검출 목적에 적합한 방사성 핵종으로 유도체화된다.

많은 적합한 방사선 활성 동위원소 중 어느 것이 사용될 수 있으며, 제한되지는 않지만, I-131, 인듐-111, 루테튬-171, 비스무스-212, 비스무스-213, 아스타틴-211, 구리-62, 구리-64, 구리-67, 이트륨-90, 로딘-125, 로딘-131, 인-32, 인-33, 스칸듐-47, 은-111 , 갈륨-67, 프라세오디뮴-142, 사마륨-153, 테르븀-161, 디스프로슘-166, 홀뮴-166, 레늄-186, 레늄-188, 레늄-189, 납-212, 라듐-223, 액티늄-225, 철-59, 셀레늄-75, 아르세닉-77, 스트론튬-89, 몰리브데늄-99, 레늄-105, 팔라듐-109, 프라세오디뮴-143, 프로메튬-149, 에르븀-169, 이리듐-194, 금-198, 및 납-211을 포함한다. 일반적으로, 방사선 핵종은 바람직하게 20 내지 6,000 keV 범위의 붕괴 에너지를 가지며, Auger 방출기에서는 바람직하게 60 내지 200 keV 범위이고, 베타 방출기에서는 100-2,500keV, 그리고 알파 방출기에서는 4,000-6,000 keV이다. 또한, 알파-입자의 생성과 함께 방사선 핵종은 실질적으로 붕괴는 것이 바람직하다.

다른 구체예에서, 제 2 제제는 검출가능한 부분으로서, 이것은 정량적 또는 정성적으로 관찰되거나 측정될 수 있는 어떤 분자일 수 있다. 본 발명의 콘쥬게이트된 항체에서 유용한 검출가능한 마커의 예는 방사선 동위원소, 형광 염료, 또는 상보성 결합 쌍의 구성원, 예를 들어 항원/항체(NKG2A에 대한 항체 이외의 다른 것), 렉틴/탄수화물, 아비딘/바이오틴, 수용체/리간드, 또는 분자 임프린트된 중합체/프린트 분자 시스템 중 어느 하나의 구성원이다.

또한 또는 다르게는, 제 2 제제는, 예를 들어 인간화된 항체의 순환 반감기를 증가시키는 것을 의도하는 중합체일 수 있다. 전형적인 중합체 및 이러한 중합체와 펩티드의 부착 방법은, 예를 들어 미국특허 제4,766,106호; 제4,179,337호; 제4,495,285호; 및 제4,609,546호에 예시된다. 추가의 예시 중합체는 폴리옥시에틸화된 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부분을 포함한다(예를 들어, 전장 항체 또는 항체 단편이 하나 이상의 PEG 부분에 콘쥬게이트될 수 있으며, 이때 PEG 분자의 분자량은 약 1,000 내지 약 40,000, 예를 들어 약 2000 내지 약 20,000, 예를 들어 약 3,000-12,000이다).

세포독성제 또는 다른 화합물들은 다수의 이용가능한 방법들 중 임의의 것을 사용하여 항체에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 제제는 이황화 결합 형성을 통해서, N-숙시닐 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)와 같은 가교결합제를 이용하여, 또는 항체의 Fc 영역에 있는 탄수화물 부분을 통해서 환원된 항체 성분의 힌지 영역에 부착될 수 있다(예를 들어, Yu et al., (1994) Int. J. Cancer 56:244; Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods" in Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch et al., (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995), Cattel et al., (1989) Chemistry today 7:51-58, Delprino et al., (1993) J. Pharm. Sci 82:699-704; Arpicco et al., (1997) Bioconjugate Chemistry 8:3; Reis- feld et al., (1989) Antibody Immuncon. Radiopharm. 2:217; 이들의 전문이 본원에 참고자료로 포함된다).

또 다르게는, 항-NKG2A 항체와 제 2(세포독성 또는 다른) 폴리펩티드 제제를 포함하는 융합 단백질이, 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다.

결합 분석

본 발명은 인간 NKG2A에 결합하는 항체, 특히 Z199 하이브리도마에 의해 생산된 항-NKG2A 항체의 인간화된 버전을 제공한다.

항체와 인간 NKG2A의 결합을 평가하는데 있어서 광범한 분석 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 특히, ELESA, 방사선 면역분석, 웨스턴 블롯팅, BIACORE, 및 기타 조성 분석법에 기초한 프로토콜이 사용에 적합하며 본 분야에 잘 알려져 있다.

예를 들어, 시험 항체를 표적 단백질 또는 에피토프(예를 들어, CD94/NKG2A 또는 그 일부분)의 존재하에 인큐베이션하고, 미결합 항체를 씻어내고, 결합된 항체의 존재를, 예를 들어 방사선 표지, 물리적 방법, 예를 들어 질량분광법, 또는 예를 들어 세포형광 분석(예를 들어 FACScan)을 이용하여 검출되는 직접 또는 간접 형광 표지를사용하여 평가하는 간단한 결합 분석이 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 비-특이적 항체인 대조군에서 보이는 양을 넘는 어떤 결합 양은 항체가 표적에 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다.

이러한 분석에서, 표적 세포 또는 인간 NKG2A와 결합하는 시험 항체의 능력이 동일한 표적에 결합하는 (음성) 대조군 단백질, 예를 들어 구조적으로 관련 없는 항원에 대해 발생된 항체, 또는 비 Ig 펩티드 또는 단백질의 능력과 비교될 수 있다. 대조군 단백질에 비하여 25%, 50%, 100%, 200%, 1000%, 또는 더 많이 증가된 친화성을 가진 어떤 적합한 분석을 사용했을 때 표적 세포 또는 NKG2A와 결합하는 항체 또는 단편은 표적"에 특이적으로 결합한다" 또는 "과 특이적으로 상호작용한다"라고 말하며, 하기 설명된 치료 방법에 사용하기에 바람직하다. 또한, NKG2A에 대한 (양성) 대조군 항체, 예를 들어 뮤린 또는 인간화된 Z199 또는 그 유도체들의 결합에 영향을 미치는 시험 항체의 능력이 평가될 수 있다.

인간화된 항-NKG2A 항체는 인간 NKG2C와 결합할 수도 있고 아닐 수도 있고, 인간 NKG2E와 결합할 수도 있고 아닐 수도 있고, 또는 인간 NKG2C 및 E 중 어느 것과 결합할 수도 있고 아닐 수도 있다. 특정 구체예에서, 모노클로날 항체 또는 단편은 다른 인간 CD94/NKG2 수용체, 구체적으로 활성화 수용체 CD94/NKG2C 및/또는 CD94/NKG2E와 CD94/NKG2A에 비해 상당히 낮은 친화성으로 결합한다. 본 발명의 항체의 NKG2C- 및 NKG2E-결합 특성은 NKG2A를 관심의 분자로 간단히 교환하여, 상기 설명된 것들과 유사한 분석으로 평가될 수 있다.

한 양태에서, 본 발명은 Z199와 생물학적 특징 및/또는 실질적으로 서열 동일성을 공유하는 비-인간 항체의 인간화된 버전을 제공한다. 한 전형적인 생물학적 특징은 Z199 에피토프, 즉 Z199 항체가 결합하는 NKG2A의 세포외 도메인에 있는 영역과의 결합이다. Z199 에피토프와 결합하는 항체들을 스크리닝하기 위해서, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)에 설명된 것과 같은 일반적인 교차-차단 분석이 수행될 수 있다.

전형적인 교차-차단 또는 경쟁 분석에서, Z199(대조군) 항체와 시험 항체가 혼합되고(또는 예비-흡착되고) NKG2A를 함유하는 샘플에 적용된다. 어떤 구체예에서, NKG2A-함유 샘플에 적용하기 전에 일정 시간 기간 동안 대조군 항체를 다양한 양의 시험 항체(예를 들어, 1:10 내지 1:100)와 미리 혼합한다. 다른 구체예에서, 항원/표적 샘플에 노출되는 동안 대조군과 다양한 양의 시험 항체가 간단히 혼합될 수 있다. 자유 항체로부터 결합된 항체를 구별(예를 들어, 분리 또는 세척 기술을 사용하여 미결합 항체를 제거함으로써)할 수 있고, 시험 항체로부터 대조군 항체를 구별(예를 들어, 종- 또는 이소타입-특이적 2차 항체 사용, 검출가능한 표지에 의한 대조군 항체의 특이적 표지, 또는 질량분광법과 같은 물리적 방법을 사용한 상이한 화합물들의 구별에 의해서)할 수 있는 한, 시험 항체가 대조군 항체와 항원의 결합을 감소시키는 지의 여부를 결정할 수 있을 것이며, 이는 시험 항체가 대조군과 실질적으로 동일한 에피토프를 인식한다는 것을 시사한다. 이 분석에서, 완전히 무관한 항체의 존재하에 (표지된) 대조군 항체의 결합은 높은 대조군 값이다. 표지된 (양성) 대조군 항체(Z199)를 표지되지 않은 대조군 항체와 함께 인큐베이션함으로써 낮은 대조군 값이 얻어지며, 이 경우 경쟁이 발생하여 표지된 항체의 결합이 감소한다.

시험 분석에서, 시험 항체의 존재 하에서 표지된 항체 반응성의 상당한 감소는 동일한 에피토프를 인식하는 시험 항체, 즉 표지된 대조군 항체와 "교차-반응"하는 항체를 나타낸다. 약 1:10 내지 약 1:100의 대조군:시험 항체 또는 화합물의 어떤 비율에서 적어도 50% 이상, 바람직하게 70%까지 항원/표적에 대한 표지된 대조군의 결합을 감소시키는 어떤 시험 항체 또는 화합물은 대조군과 동일한 에피토프 또는 결정소에 실질적으로 결합하는 항체 또는 화합물이라고 생각된다. 바람직하게, 이러한 시험 항체 또는 화합물은 항원/표적과 대조군의 결합을 적어도 90%까지 감소시킬 것이다. 그렇지만, 어떤 측정가능한 정도로 대조군 항체 또는 화합물의 결합을 감소시키는 어떤 화합물 또는 항체라도 본 발명에서 사용될 수 있다.

또한, Z199를 적합한 형태의 HLA-E로 교환한 다음, 유사한 교차-차단 분석을 사용해서 시험 (인간화된) 항체가 인간 CD94/NKG2A의 천연 리간드인 HLA-E와 CD94/ NKG2A의 결합에 영향을 미치는 지의 여부를 평가할 수 있다. 예를 들어, 인간화된 항-NKG2A 항체 제제가 HLA-E와 CD94/NKG2A의 상호작용을 감소 또는 차단하는 지의 여부를 결정하기 위해 다음의 시험이 수행될 수 있다: Ba/F3-CD94/NKG2A, NKL 또는 NK92와 같은 CD94/NKG2A를 발현하는 셀라인을 시험 항-NKG2A 항체의 농도를 증가시키면서 얼음 위에서 30분간 인큐베이션한다. 다음에, 세포를 PE-표지된 HLA-E 테트라머와 함께 얼음 위에서 30분간 인큐베이션하고, HLA-E 테트라머 결합을 표준 방법에 의해 유세포분석기(FACScalibur, Beckton Dickinson)에서 분석한다. 시험 항체의 부재 하에서는 HLA-E 테트라머가 세포에 결합한다. HLA-E와 CD94/NKG2A의 결합을 차단하는 항체 제제의 존재 하에서는 HLA-E 테트라머와 세포의 결합이 감소하며, 이러한 mAb를 "차단 항체"라고 칭한다. 본 발명은 HLA-E를 차단하지 않으면서 인간 CD94/NKG2A 수용체의 억제 활성을 감소시키는 항체를 제공한다. 따라서, 이러한 차단의 결여는 이들 분석에서 유사하게 검출될 수 있다.

본 발명의 어떤 양태에서, 예를 들어, NKG2A-발현 세포를 죽이는 것이 바람직하지 않은 경우, 본 발명의 인간화된 항체는 Fc 수용체들에 대해서 실질적인 특이적 결합을 나타내지 않는 것이 바람직하다. 이러한 항체는 Fc 수용체와 결합하지 않는다고 알려진 다양한 중쇄의 불변 영역을 포함할 수 있다. 한 이러한 예가 IgG4 불변 영역이다. 또는 달리, Fc 수용체 결합을 피하기 위해서 불변 영역을 포함하지 않는 항체 단편, 예를 들어 Fab 또는 F(ab')2 단편이 사용될 수 있다. Fc 수용체 결합은 본 분야에 공지된 방법에 따라서 평가될 수 있으며, 예를 들어 항체와 Fc 수용체 단백질의 결합을 BIACORE 분석에서 시험하는 것을 포함한다. 또한, Fc 수용체와의 결합을 최소화하거나 제거하도록 Fc 부분이 변형된 어떤 다른 항체 타입이 사용될 수도 있다(예를 들어, WO 03101485 참조, 그 명세서가 본원에 참고자료로 포함된다). Fc 수용체 결합을 평가하기 위한, 예를 들어 세포 기반 분석과 같은 분석이 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 WO 03101485에 설명된다.

기능적 분석

만일 항-NKG2A 항체가 CD94/NKG2A와 HLA-E 상호작용을 감소하거나 차단한다면, 그것은 CD94/NKG2A-제한된 림프구의 세포독성을 증가시킬 수 있다. 이것은 전형적인 세포독성 분석에 의해 평가될 수 있으며, 이들의 예가 아래 설명된다.

CD94/NKG2A-매개 신호화를 감소시키는 항체의 능력은, 예를 들어 CD94/NKG2A를 발현하는 NKL 세포와 HLA-E를 발현하는 표적 세포를 사용하여 표준 4시간 시험관내 세포독성 분석에서 시험될 수 있다. 이러한 NKL 세포는 CD94/NKG2A가 HLA-E를 인식하기 때문에 HLA-E를 발현하는 표적을 효과적으로 죽이지 못하므로, 림프구-매개 세포용해를 방지하는 억제 신호화가 개시되고 증폭된다. 이와 같은 시험관내 세포독성 분석은 본 분야에 잘 공지된 표준 방법에 의해 수행될 수 있고, 예를 들어 Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)에 설명된다. NKL 세포에 첨가하기 전에 표적 세포를 51Cr로 표지하고, 그 다음 사멸의 결과로서 세포로부터 51Cr의 배지로의 방출에 비례하여 사멸을 추정한다. CD94/NKG2A가 HLA-E와 결합하는 것을 방지하는 항체의 첨가는 CD94/NKG2A를 통한 억제 신호의 개시와 증식을 방지한다. 따라서, 이러한 제제의 첨가는 표적 세포의 림프구-매개 사멸을 증가시킨다. 이로써 이 단계에서, 예를 들어 리간드 결합을 차단함으로써 CD94/NKG2A-유도 음성 신호화를 방지하는 제제가 확인된다. 특정한 51Cr-방출 세포독성 분석에서, CD94/NKG2A-발현 NKL 이펙터-세포는 HLA-E-음성 LCL 721.221 표적 세포를 죽일 수 있지만, HLA-E-발현 LCL LCL 721.221-Cw3 대조군 세포는 꽤 덜 죽인다. 이와 반대로, CD94/NKG2A를 결여한 YTS 이펙터-세포는 두 셀라인을 모두 효과적으로 죽인다. 이와 같이, NKL 이펙터 세포는 CD94/NKG2A를 통한 HLA-E-유도 억제 신호화로 인하여 HLA-E+ LCL 721.221-Cw3 세포를 덜 효과적으로 죽인다. NKL 세포가 이와 같은 51Cr-방출 세포독성 분석에서 본 발명에 따른 차단 항-CD94/NKG2A 항체와 함께 예비 인큐베이션된 경우, HLA-E-발현 721.221-Cw3 세포는 항체-농도-의존성 방식으로 더욱 효과적으로 사멸된다.

또한, 본 발명의 항체의 억제 활성(즉, 세포독성 증진 잠재력)은 많은 다른 방식들, 예를 들어 본원에 참고자료로 명세서가 포함되는 Sivori et al., J. Exp. Med. 1997; 186:1129-1136에 설명된 세포내 자유 칼슘에 대한 항체의 영향에 의해 평가될 수 있다. 또한, NK, T, 또는 NKT 세포 활성은 세포 기반 세포독성 분석을 사용하여 평가될 수 있으며, 예를 들어 크롬 방출이나 다른 변수를 측정하여 P815, K562 세포, 또는 적합한 종양 세포를 죽이도록 NK 세포를 자극하는 항체의 능력을 평가할 수 있으며, 이들은 본원에 참고자료로 명세서들이 전부 포함되는 Sivori et al., J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136; Vitale et al., J. Exp. Med. 1998; 187: 2065-2072; Pessino et al. J. Exp. Med. 1998;188:953-960; Neri et al. Clin. Diag. Lab. Immun. 2001; 8:1131-1 135; Pende et al., J. Exp. Med. 1999; 190: 1505-1516에 개시된다.

한 구체예에서, 항체 제제는 CD94/NKG2A-제한된 림프구의 세포독성의 10% 증가, 바람직하게는 NK 세포독성의 적어도 40% 또는 50% 증가, 또는 더 바람직하게는 NK 세포독성의 적어도 70% 증가를 야기한다.

또, 세포독성 림프구의 활성은 사이토카인-방출 분석을 사용하여 다뤄질 수 있으며, 이 경우 NK 세포가 NK 세포의 사이토카인 생산(예를 들어, IFN-y 및 TNF-α 생산)을 자극할 수 있는 항체와 함께 인큐베이션된다. 전형적인 프로토콜에서, PBMC로부터 IFN-y 생산은 배양 4일 후 세포 표면 및 세포질내 염색 및 유세포분석에 의한 분석에 의해 평가될 수 있다. 간단히 말해서, 배양의 마지막 4시간 동안 Brefeldin A(Sigma Aldrich)를 5μg/ml의 최종 농도로 첨가한다. 다음에, 세포를 항-CD3 및 항-CD56 mAb와 함께 인큐베이션한 다음에, 이어서 투과화(IntraPrep™; Beckman Coulter) 및 PE-항-IFN-y 또는 PE-IgGI에 의한 염색(Pharmingen)을 수행한다. ELISA(GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN, IFN-: OptEIA set, Pharmingen)를 이용하여 상청액에서 폴리클로날 활성화된 NK 세포로부터 GM-CSF 및 IFN-y 생산을 측정한다.

특정 양태에서, 본 발명은 CD94/NKG2A-제한된 림프구의 세포독성 증가, CD94 /NKG2A-제한된 림프구의 세포독성 활성 강화, 또는 CD94/NKG2A-매개 신호화의 감소 또는 억제에 있어서 원래 비-인간화된 항체 및/또는 그것의 키메라 버전보다 더욱 능력을 가진 또는 더욱 효과적인 항체를 제공한다. 이러한 항체는, 예를 들어 원래 비-인간화된 항체 또는 그것의 키메라 버전보다 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 또는 적어도 20% 더 능력을 가지거나 효과적일 수 있다.

항체 생산

또한, 본 발명은 본원에 설명된 항-NKG2A 항체를 암호화하는 분리된 핵산, 그리고 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.

한 양태에서, 본 발명에 따른 제제를 암호화하는 핵산 단편이 제공된다.

한 양태에서, DNA 및 RNA 단편으로부터 선택되는, 본 발명에 따른 제제를 암호화하는 핵산 단편이 제공된다.

또한, 이러한 핵산 또는 벡터를 포함하는 적합한 숙주 세포를 배양함으로써 핵산을 발현시켜 인간화된 항체를 생산하는 것 등의 재조합 기술을 이용하여 이러한 항-NKG2A 항체를 생산하는 방법이 제공된다. 배양 전에, 숙주 세포는, 예를 들어 가변 중쇄 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터와 가변 경쇄 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로 공-트랙스펙션될 수 있다. 추가로, 공지된 기술을 이용하여 숙주 세포 배양물로부터 항체가 회수 및/또는 정제될 수 있다. 유용한 벡터, 숙주 세포 및 기술들이 아래 더 설명된다.

일반적으로, 항체의 재조합 생산을 위해서, 그것을 암호화하는 핵산이 분리되고, 전형적으로는 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동 가능하게 연결된, 더 이상의 클로닝(DNA의 증폭)이나 발현을 위한 복제가능한 벡터에 삽입된다. 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 종래의 과정을 이용하여 쉽게 분리되고 서열화된다(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써). 많은 벡터가 공지되어 있으며 이용할 수 있다. 벡터 구성요소는, 제한되지는 않지만, 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사-종결 서열 중 하나 이상을 일반적으로 포함한다.

신호 서열 성분

본 발명의 항-NKG2A 항체는 재조합에 의해서 직접 생산될 수 있을 뿐만 아니라, 이종성 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생산될 수도 있으며, 이종성 폴리펩티드는 바람직하게 신호 서열 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 가진 다른 폴리펩티드이다. 바람직하게 선택된 이종성 신호 서열은 숙주 세포에 의해서 인식되어 가공(즉, 신호 펩티다제에 의한 절단)되는 것이다.

자생 항-NKG2A 항체 신호 서열을 인식하여 가공하지 못하는 원핵 숙주 세포에서는 신호 서열이, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열-안정성 엔테로톡신 II 리더로부터 선택된 원핵 신호 서열로 치환된다. 효모 분비시에는 자생 신호 서열이, 예를 들어 효모 인베르타제 리더, 알파-인자 리더(사카로미세스 및 클루이베로미세스 알파-인자 리더를 포함), 산-포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 1990/13646에 설명된 신호로 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서는 포유동물 신호 서열 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어 헤르페스 심플렉스 gD 신호가 이용될 수 있다.

이러한 전구체 영역의 DNA가 리딩 프레임 내에서 항-NKG2A 항체를 암호화하는 DNA에 리게이션된다.

복제 기원 성분

발현 벡터와 클로닝 벡터는 모두 벡터로 하여금 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 이 서열은 벡터로 하여금 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있도록 하는 것이며, 복제 기원 또는 자가분비 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 각종 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기원은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기원은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스 기원(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV, EBV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기원 성분은 포유동물 발현 벡터에는 필요하지 않다(전형적으로 조기 프로모터를 함유하는 SV40 기원만이 유일하게 사용될 수 있다).

선택 유전자 성분

발현 벡터 및 클로닝 벡터는 선택성 마커라고도 하는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라시클린에 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결함을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요 영양물, 예를 들어 바실리의 D-알라닌 라세마제를 암호화하는 유전자를 공급하는 단백질을 암호화한다.

선택 방식의 한 예는 숙주 세포의 성장을 중단시키는 약물을 이용한다. 이들 세포는 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환되고, 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하며, 이로써 선택 방식에서 살아남는다. 이러한 우성 선택의 예는 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신 약물을 사용한다.

포유동물 세포에 대한 적합한 선택성 마커의 다른 예는 항-NKG2A 항체-암호화 핵산을 흡수할 수 있는 세포 적격성의 확인을 가능하게 하는 것들로서, 예를 들어 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데로신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이다.

예를 들어, DHFR의 경쟁 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 형질전환체를 전부 배양함으로써 DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포가 먼저 확인된다. 야생형 DHFR이 사용되었을 때의 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성에 결함이 있는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다.

또는 달리, 항-NKG2A 항체, 야생형 DHFR 단백질, 및 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스페라제(APH)와 같은 다른 선택성 마커를 암호화하는 DNA 서열로 형질전환되거나 공-형질전환된 숙주 세포(특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)가 아미노글리코시드계 항생제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418과 같은 선택성 마커에 대한 선택제를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 미국특허 제4,965,199호 참조.

효모에서 사용되는 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다(Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 성장할 수 있는 능력을 결여한 효모의 돌연변이 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다. Jones, Genetics, 85:12 (1977). 효모 숙주 세포 게놈에 trp1 병소의 존재는 트립토판의 부재 하의 성장에 따라서 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결함 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)가 Leu2 유전자를 지닌 공지의 플라스미드에 의해 보완된다.

이에 더하여, 1.6-μm 원형 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터가 클루이베로미세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 또는 달리, 재조합 소 키모신의 대규모 생산을 위한 발현 시스템이 케이. 락티스에 대하여 보고되었다(Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). 클루이베로미세스의 산업적 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 선택을 위한 안정한 멀티-카피 발현 벡터가 또한 개시되었다. Fleer et al., Bio/Technolog, 9:968-975 (1991).

프로모터 성분

발현 벡터 및 클로닝 벡터는 통상 숙주 생물에 의해 인식되고 항-NKG2A 항체-암호화 핵산에 작동 가능하게 연결되는 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주와 사용되는 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터들도 적합하다. 박테리아 시스템에서 사용되는 프로모터는 또한 항-NKG2A 항체를 암호화하는 DNA에 작동 가능하게 연결된 Shine-Dalgarno(S. D.) 서열을 함유할 것이다.

다양한 프로모터 서열이 진핵생물에 대해 공지되어 있다. 실제로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 약 25-30개 염기 상류에 위치된 AT-부화 영역을 가진다. 많은 유전자에서 전사 개시 부위로부터 70-80개 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역이며, 여기서 N은 임의의 유전자일 수 있다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 단부에는 AATAAA 서열이 존재하는데, 이것은 코딩 서열의 3' 단부에 폴리-A 테일을 부가하라는 신호일 수 있다. 이들 서열이 전부 진핵 발현 벡터에 적합하게 삽입된다. 효모 숙주와 사용되는 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코오스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코오스 이소머라제, 및 글루코키나제의 프로모터들을 포함한다.

성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가적인 이점을 가진 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 초래하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용되는 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73657에 더 설명된다. 또한, 효모 인핸서가 효모 프로모터와 함께 사용되면 유리하다.

포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 항-NKG2A 항체 전사는, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노 바이러스(아데노 바이러스 2 등), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로 바이러스(CMV), 레트로 바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻어진 프로모터, 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 및 열-충격 프로모터에 의해서 제어되며, 단 이러한 프로모터들은 숙주 세포 시스템과 양립 가능해야 한다.

SV40 바이러스의 조기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기원을 더 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다. 인간 시토메갈로바이러스의 즉시 조기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻어진다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 이용하여 포유동물에서 DNA를 발현하기 위한 시스템이 미국특허 제4,419,446호에 개시된다. 이 시스템의 변형이 미국특허 제4,601,978호에 설명된다. 또, 헤르페스 심플렉스 바이러스 유래의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA를 발현하는 것에 대해서는 Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982)를 참조한다. 또는, rous 육종 바이러스 긴-말단 반복부가 프로모터로서 사용될 수 있다.

인핸서 요소 성분

고등 진핵생물에 의한 본 발명의 항-NKG2A 항체를 암호화하는 DNA의 전사는 주로 벡터에 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 포유동물 유전자로부터 현재 알려져 있다(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토프로테인, 및 인슐린). 그러나, 전형적으로는 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서가 사용될 것이다. 예들은 복제 기원의 후기 쪽의 SV40 인핸서(bp 100-270), 시토메갈로 바이러스 조기-프로모터 인핸서, 복제 기원의 후기 쪽의 폴리오마 인핸서, 및 아데노 바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소에 대해서는 Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)를 참조한다. 인핸서는 항-NKG2A 항체-암호화 서열 쪽의 위치 5' 또는 3'에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치되는 것이 바람직하다.

전사 종결 성분

진핵 숙주 세포(예를 들어, 효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 생물로부터의 핵화된 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 또한 전사를 종결하고 mRNA를 안정화하는데 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 통상 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 미번역 영역의 5' 단부로부터, 때로는 3' 단부로부터 이용할 수 있다. 이들 영역은 항-NKG2A 항체를 암호화하는 mRNA의 미번역 부분에 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다. 한 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO 1994/11026 및 여기 개시된 발현 벡터를 참조한다.

숙주 세포의 선택 및 형질전환

벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현하기 위한 적합한 숙주 세포는 상기 설명된 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이 목적을 위한 적합한 원핵생물은 에우박테리아, 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 유기물, 예를 들어 엔테로박테리아세아에, 예를 들어 에스체리키아, 예를 들어 E. coli, 엔테로박터, 에위니아, 클레브시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예를 들어 살모넬라 티피뮤리움, 세라티아, 예를 들어 세라티아 마르세스칸스, 및 시겔라 그리고 바실리, 예를 들어 바실루스 섭틸리스 및 바실루스 리케니포르미스(예를 들어, 1989년 4월 12일에 공개된 DD 266,710에 개시된 바실루스 리케니포르미스 41P), 슈도모나스, 예를 들어 슈도모나스 아에루기노사 및 스트렙토미세스를 포함한다. 한 바람직한 E. coli 클로닝 숙주는 E. coli 294(ATCC 31,446)이며, E. coli B, E. coli X1776(ATCC 31,537) 및 E. coli W3110(ATCC 27,325)와 같은 다른 균주들도 적합하다. 이들 예는 예시이며 제한하는 것은 아니다.

원핵생물에 더하여, 사상 진균이나 효모와 같은 진핵 미생물이 항-NKG2A 항체-암호화 벡터를 위한 적합한 클로닝 숙주 또는 발현 숙주이다. 하등 진핵 숙주 미생물 중에서도 사카로미세스 세레비시아제나 통상의 제빵용 효모가 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 많은 다른 속들, 종들 및 균주들이 통상적으로 이용될 수 있으며 본 발명에서 유용한데, 예를 들어 시조사카로미세스 폼브; 클루이베로미세스 숙주, 예를 들어 클루이베로미세스 락티스, 클루이베로미세스 프라길리스(ATCC 12,424), 클루이베로미세스 불가리쿠스(ATCC 16,045), 클루이베로미세스 윅케라미(ATCC 24,178), 클루이베로미세스 왈티(ATCC 56,500), 클루이베로미세스 드로소필라룸(ATCC 36,906), 클루이베로미세스 서모톨레란스 및 클루이베로미세스 마르시아누스; 야로위아(EP 402,226); 피치아 파스토리스(EP 183,070); 칸디다; 트리코더마 리에시아(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사; 슈와니오미세스, 예를 들어 슈와니오미세스 오시덴탈리스; 및 사상 진균류, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움, 톨리포클라디움, 및 아스페르길루스 숙주, 예를 들어 아스페르길루스 니둘란스 및 아스페르길루스 니거이다.

글리코실화된 항-NKG2A 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 스포돕테라 프루기페르다(모충), 아에데스 아에깁티(모기), 아에데스 알보픽투스(모기), 드로소필라 멜라노가스테르(과일파리), 및 봄빅스 모리와 같은 숙주로부터 수많은 바큘로 바이러스 균주 및 변이체 그리고 상응하는 임의의 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 오토그라파 갤리포니카 NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주 등, 트랜스펙션을 위한 여러 바이러스 균주는 공개적으로 이용할 수 있으며, 이러한 바이러스는 본 발명에 따라서, 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 트랜스펙션을 위한 바이러스로서 사용될 수 있다.

또한, 목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물이 숙주로서 이용될 수 있다.

그러나, 가장 큰 관심은 척추동물 세포에 있으며, 배양물(조직 배양물)에서 척추동물 세포를 증식하는 것이 통례의 과정이 되고 있다. 유용한 포유동물 숙주 셀라인의 예는 SV40(COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 셀라인; 인간 배아 신장(HEK) 셀라인(현탁 배양물 중에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980), DG44(Urlaub et al., Som. Cell and Mol. Gen., 12:555-566 (1986)) 및 DP12 셀라인을 포함한다); 마우스 Sertoli 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암종 셀라인(Hep G2)이다.

숙주 세포는 항-NKG2A 항체 생산을 위한 상기 설명된 발현 및 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 또는 원하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭하도록 적합하게 변형된 종래의 영양 배지에서 배양된다.

숙주 세포 배양

본 발명의 항-NKG2A 항체를 생산하는데 사용되는 숙주 세포는 여러 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어 Ham's F10(Sigma), 최소 필수 배지((MEM), (Sigma), RPMI-1640(Sigma), FreeStyle™(Cibco) 및 Dulbecco's 변형 이글즈 배지((DMEM), Sigma)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 예를 들어 Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979); Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980); 미국특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 1990/03430; WO 1987/00195; 또는 미국특허 등록 제30,985호에 설명된 배지 중 어느 것이 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중 어느 것은 필요에 따라서 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염(예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 버퍼(HEPES 등), 뉴클레오티드(예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예를 들어, GENTAMYCIN. TM. 약물), 미량 원소(통상 마이크로몰 범위의 최종 농노로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코오스 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 또한, 어떤 다른 필수 보충물이 당업자에게 알려져 있는 적합한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등의 배양 조건은 발현을 위해서 선택된 숙주 세포에서 이미 사용되고 있는 것들이며, 당업자에게 자명할 것이다.

항체 정제

재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포내에 또는 원형질 주변 공간에 생산될 수 있거나, 또는 배지에 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에 생산되는 경우, 제 1 단계로서, 숙주 세포나 용해된 단편이 미립자 파편들이, 예를 들어 원심분리나 한외여과에 의해서 제거된다. Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)에 E. coli의 원형질 주변 공간에 분비된 항체를 분리하는 과정이 설명된다. 간단히 말해서, 약 30분 동안 아세트산 나트륨(pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에 세포 페이스트를 해동한다. 원심분리에 의해 세포 파편을 제거할 수 있다. 항체가 배지에 분비된 경우, 일반적으로 이러한 발현 시스템의 상청액을 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 AMICON™ 또는 MILLIPORE PELLICON™ 한외여과 유닛을 사용하여 먼저 농축한다. 단백질 가수분해를 억제하기 위해 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF)와 같은 프로테아제 억제제가 앞서 말한 단계들 중 어느 단계에 포함될 수 있고, 항생제가 외래 오염물질의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.

세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 어떤 면역글로불린 Fc 도메인의 종과 이소타입에 의존한다. 단백질 A는 인간 감마1, 감마, 또는 감마4 중쇄에 기초하여 항체를 정제하는데 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입과 인간 y3에 대해 권장된다(Guss et al., EMBO J., 5:15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 바탕질은 대부분 아가로스이지만, 다른 바탕질도 이용할 수 있다. 공극-제어형 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 바탕질은 아가로스에서 달성될 수 있는 것보다 빠른 유속과 단축된 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, BAKERBOND ABX™ 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ.)가 정제에 유용하다. 이온-교환 칼럼 분별, 에탄올 정제, 역상 HPLC, 실리카 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™ 크로마토그래피, 음이온- 또는 양이온-교환 수지(폴리아스파르트산 칼럼 등) 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 암모늄-술페이트 침전과 같은 다른 단백질 정제 기술이 회수될 항체에 따라서 또한 이용될 수 있다.

제약학적 조제물

한 양태에서, 제약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 제제가 제공된다.

한 양태에서, 악성 신생물, 바이러스 감염, 염증성 장애, 및 자가면역 질환의 치료에서 제약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 제제가 제공된다.

한 양태에서, 인간 환자에서 세포의 표면에서 발현되는 CD94/NKG2A 수용체의 억제 활성을 중화 또는 감소시키기 위한 제약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 제제가 제공된다.

한 양태에서, 인간 환자에서 CD94/NKG2A 발현 세포의 세포-사멸 활성을 강화하기 위한 제약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 제제가 제공된다.

한 양태에서, 인간 환자에서 Cw3 발현 표적 세포의 사멸을 유도하기 위한 제약으로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 제제가 제공된다.

추가의 양태에서, 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본 발명에 따른 제제를 포함하는 조성물이 제공된다.

한 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 담체와 함께 본원에 설명된 항체를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.

따라서, 본 발명의 한 가지 목적은 1 mg/ml 내지 500 mg/ml의 농도로 존재하는 이러한 항체를 포함하는 제약학적 조제물을 제공하는 것이며, 이때 상기 조제물은 2.0 내지 10.0의 pH를 가진다. 이 조제물은 버퍼 시스템, 보존제(들), 장성제(들), 킬레이트화제(들), 안정제, 및 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 제약학적 조제물은 수성 조제물, 즉 물을 포함하는 조제물이다. 이러한 조제물은 전형적으로 용액 또는 현탁액이다. 추가의 구체예에서, 제약학적 조제물은 수성 용액이다. 용어 "수성 조제물"은 적어도 50% w/w 물을 포함하는 조제물로서 정의된다. 마찬가지로, 용어 "수성 용액"은 적어도 50% w/w 물을 포함하는 용액으로서 정의되고, 용어 "수성 현탁액"은 적어도 50% w/w 물을 포함하는 현탁액으로서 정의된다.

다른 구체예에서, 제약학적 조제물은 동결-건조 조제물이며, 의사나 환자가 사용 전에 여기에 용매 및/또는 희석제를 첨가할 수 있다.

다른 구체예에서, 제약학적 조제물은 어떠한 사전 용해 없이 바로 사용할 수 있는 건조된 조제물(예를 들어, 동결-건조 또는 분무-건조)이다.

추가의 양태로서, 제약학적 조제물은 이러한 항체와 버퍼의 수성 용액을 포함하며, 이때 항체는 1 mg/ml 이상의 농도로 존재하고, 상기 조제물은 약 2.0 내지 약 10.0의 pH를 가진다.

다른 구체예에서, 조제물의 pH는 약 2.0 내지 약 10.0, 약 3.0 내지 약 9.0, 약 4.0 내지 약 8.5, 약 5.0 내지 약 8.0, 및 약 5.5 내지 약 7.5로 구성되는 리스트로부터 선택되는 범위이다.

추가의 구체예에서, 버퍼는 아세트산 나트륨, 탄산 나트륨, 시트레이트, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 리신, 아르기닌, 나트륨 디하이드로겐 포스페이트, 디나트륨 하이드로겐 포스페이트, 인산 나트륨, 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 바이신, 트리신, 말산, 숙시네이트, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 또는 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다. 이들 특정 버퍼의 각각은 본 발명의 다른 구체예를 구성한다.

추가의 구체예에서, 조제물은 제약학적으로 허용되는 보존제를 더 포함한다. 보존제는, 예를 들어 페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-히드록시벤조에이트, 2-페닐에탄올, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 및 티오메로살, 브로노폴, 벤조산, 이미드유레아, 클로로헥시딘, 나트륨 데히드로아세테이트, 클로로크레졸, 에틸 p-히드록시벤조에이트, 염화벤제토늄, 클로로페네신(3p-클로로페녹시프로판-1,2-디올) 또는 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 보존제는, 예를 들어 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 5 mg/ml 내지 10 mg/ml, 또는 10 mg/ml 내지 20 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 이들 특정 보존제의 각각은 본 발명의 다른 구체예를 구성한다. 제약학적 조성물에서 보존제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참조한다.

추가의 구체예에서, 조제물은 등장제를 더 포함한다. 등장제는, 예를 들어 염(예를 들어, 염화나트륨), 당 또는 당 알코올, 아미노산(예를 들어, L-글리신, L-히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨(예를 들어, 글리세롤(글리세린), 1,2-프로판디올(프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올, 폴리에틸렌글리콜(예를 들어, PEG400), 또는 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 단당류, 이당류 또는 다당류 같은 어떤 당, 또는 수용성 글루칸류, 예를 들어 프럭토스, 글루코오스, 만노스, 소르보스, 크실로스, 말토스, 락토스, 수크로오스, 트레할로스, 덱스트란, 풀룰란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 가용성 녹말, 히드록시에틸 녹말, 및 카르복시메틸셀룰로오스-Na가 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 당 첨가제는 수크로오스이다. 당 알코올은 적어도 하나의 -OH 기를 갖는 C4-C8 탄화수소로서 정의되며, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 크실리톨, 및 아라비톨을 포함한다. 한 구체예에서, 당 알코올 첨가제는 만니톨이다. 상기 언급된 당 또는 당 알코올은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 사용량에는 고정된 제한은 없지만, 다만 당이나 당 알코올이 액체 제제에 용해되어야 하고, 본 발명의 방법을 사용하여 달성되는 안정화 효과에 악영향을 미치지 않아야 한다. 당 또는 당 알코올 농도는, 예를 들어 약 1 mg/ml 내지 약 150 mg/ml일 수 있다. 등장제는, 예를 들어 1 mg/ml 내지 50 mg/ml, 1 mg/ml 내지 7 mg/ml, 8 mg/ml 내지 24 mg/ml, 또는 25 mg/ml 내지 50 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 이들 특정 등장제의 각각은 본 발명의 다른 구체예를 구성한다. 제약학적 조성물에서 등장제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참고한다.

추가의 구체예에서, 조제물은 또한 킬레이트화제를 포함한다. 킬레이트화제는, 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산 및 아스파르트산의 염들, 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 킬레이트화제는, 예를 들어 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 0.1 mg/ml 내지 2 mg/ml 또는 2 mg/ml 내지 5 mg/ml의 농도로 존재할 수 있다. 이들 특정 킬레이트화제 각각은 본 발명의 다른 구체예를 구성한다. 제약학적 조성물에서 킬레이트화제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참고한다.

본 발명의 추가의 구체예에서 조제물은 안정제를 더 포함한다. 제약학적 조성물에서 안정제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참고한다. 더 구체적으로, 본 발명의 조성물은, 치료적 활성 성분이 보관 동안 액체 제약학적 조제물 중에서 응집물 형성을 나타낼 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 안정화된 액체 제약학적 조성물일 수 있다. "응집물 형성"은 폴리펩티드 분자들 사이의 물리적 상호작용의 결과 올리고머가 형성되는 것을 의미하며, 이 올리고머는 여전히 가용성일 수도 있고, 아니며 용액으로부터 침전된 커다란 눈에 보이는 덩어리일 수도 있다. "보관 동안"은 일단 제조된 액체 제약학적 조성물 또는 조제물이 대상에게 즉시 투여되지 않는다는 의미이다. 오히려, 제조 후 그것은 보관을 위해 액체 형태로든, 냉동된 상태로든, 또는 건조된 형태로든 포장되고, 나중에 액체 형태나 다른 적합한 투여 형태로 복원되어 대상에 투여된다. "건조된 형태"는 액체 제약학적 조성물 또는 조제물이 동결 건조(즉, 동결건조; 예를 들어, Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59 참조), 분무 건조(Masters (1991), Spray-Drying Handbook(5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1 169-1206; 및 Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20 참조) 또는 공기 건조(Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; 및 Roser (1991) Biopharm. 4:47-53 참조)에 의해 건조된 것을 의미한다. 액체 제약학적 조성물의 보관 동안 폴리펩티드에 의한 응집물 형성은 해당 폴리펩티드의 생물학적 활성에 악영향을 미칠 수 있으며, 결과적으로 제약학적 조성물의 치료 효능이 손실된다. 또, 응집물 형성은 폴리펩티드-함유 제약학적 조성물을 주입 시스템을 사용하여 투여하는 경우 관, 막, 또는 펌프의 막힘과 같은 다른 문제를 유발할 수도 있다.

본 발명의 제약 조성물은 조성물의 보관 동안 폴리펩티드에 의한 응집물 형성을 감소시키기에 충분한 양으로 아미노산 염기를 더 포함할 수 있다. "아미노산 염기"는 아미노산 또는 아미노산의 조합을 의미하며, 이 경우 어떤 주어진 아미노산은 자유 염기 형태나 염 형태로 존재한다. 아미노산의 조합이 사용되는 경우에는, 모든 아미노산이 자유 염기 형태로 존재할 수도 있고, 모든 아미노산이 염 형태로 존재할 수도 있고, 또는 일부는 자유 염기 형태로 존재하고 나머지는 염 형태로 존재할 수도 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물을 제조하는데 사용할 수 있는 아미노산은 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 및 글루탐산과 같은 하전된 측쇄를 지닌 것들이다. 특정 아미노산(예를 들어, 메티오닌, 히스티딘, 이미다졸, 아르기닌, 리신, 이로류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌 및 이들의 혼합물)의 어떤 입체이성질체(즉, L, D 또는 이들의 혼합물) 또는 이들 입체이성질체의 조합이 본 발명의 제약학적 조성물에 존재할 수 있으며, 다만 특정 아미노산은 자유 염기 형태나 염 형태로 존재해야 한다. 한 구체예에서, L-입체이성질체가 사용된다. 본 발명의 조성물은 또 이들 아미노산의 유사체를 사용하여 조제될 수도 있다. "아미노산 유사체"는 본 발명의 액체 제약학적 조성물의 보관 동안 폴리펩티드에 의한 응집물 형성을 감소시키는 바람직한 효과를 유도하는 자연 발생 아미노산의 유도체를 의미한다. 적합한 아르기닌 유사체는, 예를 들어 아미노구아니딘, 오르니틴 및 N-모노에틸 L-아르기닌을 포함하고, 적합한 메티오닌 유사체는 에티오닌 및 부티오닌을 포함하고, 적합한 시스테인 유사체는 S-메틸-L-시스테인을 포함한다. 나머지 아미노산도 마찬가지로, 아미노산 유사체가 자유 염기 형태가 염 형태로 조성물에 혼입된다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 아미노산 또는 아미노산 유사체는 단백질의 응집을 방지하거나 지연하기에 충분한 농도로 사용된다.

본 발명의 추가의 구체예에서, 치료제로서 작용하는 폴리펩티드가 산화에 민감한 적어도 하나의 메티오닌 잔기를 포함하는 메티오닌일 때, 메티오닌 잔기의 메티오닌 술폭시드로의 산화를 억제하기 위해 메티오닌(또는 다른 황계 아미노산 또는 아미노산 유사체)가 첨가될 수 있다. "억제하다"는 시간에 따른 메티오닌 산화된 종의 최소한의 축적을 의미한다. 메티오닌 산화의 억제로 인하여 적합한 분자 형태의 폴리펩티드가 더 많이 보유된다. 메티오닌의 어떤 입체이성질체(L 또는 D) 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다. 첨가량은 메티오닌 술폭시드의 양이 규제당국이 허용하는 양이 될 만큼 메티오닌 잔기의 산화를 억제하기에 충분한 양이어야 한다. 전형적으로, 이것은 조성물이 약 10% 내지 약 30% 이하의 메티오닌 술폭시드를 함유한다는 의미이다. 일반적으로, 이것은 첨가된 메티오닌 대 메티오닌 잔기의 비가 약 1:1 내지 약 1000:1, 예를 들어 10:1 내지 약 100:1의 범위가 되도록 메티오닌을 첨가함으로써 달성될 수 있다.

추가의 구체예에서, 조제물은 고분자량 중합체 또는 저분자량 화합물의 군으로부터 선택된 안정제를 더 포함한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 이 안정제는 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, PEG 3350), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 카르복시/히드록시셀룰로오스 또는 그 유도체(예를 들어, HPC, HPC-SL, HPC-L 및 HPMC), 시클로덱스트린, 황-함유 물질, 예를 들어 모노티오글리세롤, 티오글리콜산 및 2-메틸티오에탄올, 및 상이한 염들(예를 들어, 염화나트륨)로부터 선택된다. 이들 특정 안정제의 각각은 본 발명의 다른 구체예를 구성한다.

또한, 제약학적 조성물은, 조성물 중의 치료적 활성 폴리펩티드의 안정성을 더욱 증진시키는 추가의 안정제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 특히 관심 있는 안정제는, 제한되지는 않지만, 메티오닌 산화에 대해 폴리펩티드를 보호하는 메티오닌 및 EDTA, 및 냉동-해동 또는 기계적 전단과 관련된 응집에 대해 폴리펩티드를 보호하는 비이온성 계면활성제를 포함한다.

추가의 구체예에서, 조제물은 계면활성제를 더 포함한다. 계면활성제는, 예를 들어 세제, 에톡실화 피마자유, 폴리글리콜화 글리세리드, 아세틸화 모노글리세리드, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 중합체(예를 들어, Pluronic® F68, 폴록사머 188 및 407, Triton X-100 등의 폴록사머류), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 및 폴리에틸렌 유도체, 예를 들어 알킬화 및 알콕시화 유도체(트윈류, 예를 들어 Tween-20, Tween-40, Tween-80 및 Brij-35), 모노글리세리드 또는 그것의 에톡실화 유도체, 디글리세리드 또는 그것의 폴리옥시에틸렌 유도체, 알코올, 글리세롤, 렉틴 및 인지질(예를 들어, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 이노시톨, 디포스파티딜 글리세롤 및 스핑고미엘린), 인지질의 유도체(예를 들어, 디팔미토일 포스파티드산) 및 리소인지질(예를 들어, 팔미토일 리소포스파티딜-L-세린 및 에탄올아민, 콜린, 세린 또는 트레오닌의 1-아실-sn-글리세로-3-포스페이트 에스테르) 및 리소포스파티딜 및 포스파티딜콜린의 알킬, 알콕실(알킬 에스테르), 알콕시(알킬 에테르)-유도체, 예를 들어 리소포스파티딜콜린의 라우로일 및 미리스토일 유도체, 디팔미토일포스파티딜콜린, 극성 머리기의 변형, 즉 콜린, 에탄올아민, 포스파티드산, 세린, 트레오닌, 글리세롤, 이노시톨, 및 양으로 하전된 DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, 리소포스파티딜세린 및 리소포스파티딜트레오닌, 및 글리세로인지질(예를 들어, 세팔린), 글리세로글리코리피드(예를 들어, 갈락토피라노시드), 스핑고글리코리피드(예를 들어, 세라마이드, 강글리오시드), 도데실포스포콜린, 달걀 리소레시틴, 푸시드산 유도체(예를 들어, 나트륨 타우로디히드로푸시데이트 등), C6-C12 장쇄 지방산 및 이들의 염(예를 들어, 올레산 및 카프릴산), 아실카르니틴 및 유도체, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘의 Nα-아실화 유도체, 또는 리신 또는 아르기닌의 측쇄 아실화 유도체, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘과 중성 또는 산성 아미노산의 어떤 조합을 포함하는 디펩티드의 Nα-아실화 유도체, 중성 아미노산과 2개의 하전된 아미노산의 어떤 조합을 포함하는 트리펩티드의 Nα-아실화 유도체, DSS(도쿠세이트 나트륨, CAS 레지스트리 no. [577-11-7]), 도쿠세이트 칼슘, CAS 레지스트리 no. [128-49-4]), 도쿠세이트 칼륨, CAS 레지스트리 no. [7491-09-0]), SDS(나트륨 도데실 술페이트 또는 나트륨 라우릴 술페이트), 나트륨 카프릴레이트, 콜산 및 그 유도체, 담즙산 및 그 염들 및 글리신 또는 타우린 콘쥬게이트, 우르소데옥시콜산, 나트륨 콜레이트, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 타우로콜레이트, 나트륨 글리코콜레이트, N-헥사데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트, 음이온성(알킬-아릴-술포네이트) 1가 계면활성제, 쯔위터 이온성 계면활성제(예를 들어, N-알킬-N,N-디메틸암모니오-1-프로판술포네이트, 3-콜아미도-1-프로필디메틸암모니오-1-프로판술포네이트, 양이온성 계면활성제(4차 암모늄 염기)(예를 들어, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드), 비이온성 계면활성제(예를 들어, 도데실 β-D-글루코피라노시드), 에틸렌디아민에 프로필렌 옥시드와 에틸렌 옥시드의 연속 부가에 의해서 유도된 4가 블록 공중합체인 폴록사민(예를 들어, Tetronic's)으로부터 선택될 수 있거나, 또는 계면활성제는 이미다졸린 유도체, 또는 이들의 혼합물의 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 특정 계면활성제의 각각의 본 발명의 다른 구체예를 구성한다.

제약학적 조성물에서 계면활성제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 편의를 위해 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995를 참고한다.

추가의 구체예에서, 조제물은 EDTA(에틸렌디아민 테트라아세트산) 및 벤자미딘 HCl과 같은 프로테아제 억제제를 더 포함하며, 다른 상업적으로 이용가능한 프로테아제도 사용될 수 있다. 프로테아제 억제제의 사용은 프로테아제의 자이모겐을 포함하는 제약학적 조성물에서 자가촉매작용을 억제하는데 특히 유용하다.

본 발명의 펩티드 제약학적 조제물에는 다른 원료들도 존재할 수 있다. 이러한 추가 원료들은 습윤제, 유화제, 항산화제, 벌크화제, 장성 조절제, 킬레이트화제, 금속 이온, 유성 부형제, 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질) 및 쯔위터 이온(예를 들어, 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 리신 및 히스티딘과 같은 아미노산)을 포함할 수 있다. 이러한 추가 원료들은 물론 본 발명의 제약학적 조성물의 전체적인 안정성에 악영향을 미치지 않아야 한다.

본 발명에 따른 항체를 함유하는 제약학적 조성물은 치료를 요하는 환자에게 몇몇 부위에서, 예를 들어 국소 부위, 예를 들어 피부 및 점막 부위, 흡수 우회 부위, 예를 들어 동맥내, 정맥내, 심장내 투여, 및 흡수 수반 부위, 예를 들어 피내, 피하, 근육내 또는 복부내 투여에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 제약학적 조성물의 투여는 몇몇 투여 경로를 통해서 이루어질 수 있으며, 예를 들어 피하, 근육내, 복강내, 정맥내, 혀, 혀밑, 협측, 구강내, 경구, 위장내, 코, 폐, 예를 들어 기관지 및 폐포 또는 이들의 조합을 통해, 표피, 진피, 경피, 질, 직장, 안구, 예를 들어 결막을 통해, 요도, 및 비경구 경로에 의해서 치료를 요하는 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 몇몇 제형으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 용액, 현탁액, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 다중 에멀젼, 폼, 살브, 페이스트, 플라스터, 연고, 정제, 코팅 정제, 린스, 캡슐, 예를 들어 경질 젤라틴 캡슐 및 연질 젤라틴 캡슐, 좌약, 직장 캡슐, 드롭, 젤, 스프레이, 분말, 에어로졸, 흡입제, 점안제, 안과용 연고, 안과용 린스, 질 페서리, 질 링, 질 연고, 주사 용액, 인시튜 변환 용액, 예를 들어 인시튜 겔화, 인시튜 경화, 인시튜 침전, 인시튜 결정화 용액, 주입 용액, 및 임플란트로서 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은, 예를 들어 공유, 소수성 및 정전기성 상호작용을 통해서, 약물 담체, 약물 송달 시스템 및 진보된 약물 송달 시스템과 더 화합되거나 이들에 부착될 수 있으며, 이로써 더 나아가 항체의 안정성이 증진되거나, 생체이용률이 증가되거나, 용해성이 증가되거나, 부작용이 감소되거나, 당업자에게 잘 알려진 크로노테라피가 달성되거나, 환자 순응성이 증가되거나, 또는 이들의 어떤 조합이 달성될 수 있다. 담체, 약물 송달 시스템 및 진보된 약물 송달 시스템의 예는, 제한되지는 않지만, 중합체, 예를 들어 셀룰로오스 및 유도체, 다당류, 예를 들어 덱스트란 및 유도체, 녹말 및 유도체, 폴리비닐 알코올, 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 중합체, 폴리락트산 및 폴리글리콜산 및 이들의 블록 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 담체 단백질, 예를 들어 알부민, 겔, 예를 들어 열겔화 시스템, 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 블록 공중합 시스템, 미셸, 리포솜, 마이크로스피어, 나노입자, 액체 결정 및 그것의 분산물, 액체-물 시스템 중의 상 거동을 나타내는 당업자에게 잘 알려진 L2 페이즈 및 그것의 분산물, 중합 미셸, 다중 에멀젼, 자기-유화, 자기-마이크로유화, 시클로덱스트린 및 그 유도체, 및 덴드리머를 포함한다.

본 발명의 조성물은, 예를 들어 계량형 흡입기, 건조 분말 흡입기 및 분무기를 이용한 항체의 폐 투여를 위한 고체, 반고체, 분말 및 용액의 조제에 유용하며, 이들 장치는 모두 당업자에게 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 제어, 지속, 연장, 지연, 및 서행 방출 약물 송달 시스템의 조제에 유용하다. 제한되지는 않지만, 더 구체적으로, 조성물은 당업자에게 잘 알려진 비경구 제어 방출 및 지속 방출 시스템(두 시스템은 모두 투여 회수의 여러 배의 감소를 가져온다)의 조제에 유용하다. 더 바람직한 것은 피하 투여되는 제어 방출 및 지속 방출 시스템이다. 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니지만, 유용한 제어 방출 시스템 및 조성물은 예는 하이드로겔, 유성 겔, 액체 결정, 중합 미셸, 마이크로스피어, 나노입자이다.

본 발명의 조성물에서 유용한 제어 방출 시스템의 제조 방법은, 제한되지는 않지만, 결정화, 응축, 공-결정화, 침전, 공-침전, 유화, 분산, 고압 균질화, 캡슐화, 분무 건조, 마이크로캡슐화, 코아세르베이션, 상 분리, 용매 증발에 의한 마이크로스피어 제조, 압출 및 초임계 유체 과정을 포함한다. 일반적으로 Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise, D. L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000) 및 Drug and the Pharmaceutical Sciences vol.99: Protein Formulation and Delivery(MacNally, E. J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000)를 참조한다.

비경구 투여는 주사기, 선택적으로는 펜 모양 주사기에 의한 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 수행될 수 있다. 또는 달리, 비경구 투여는 주입 펌프에 의해 수행될 수 있다. 추가의 옵션은 조성물이 코나 폐 스프레이의 형태로 항체 화합물을 투여하기 위한 용액 또는 현탁액일 수 있다는 것이다. 또 다른 옵션으로서, 본 발명의 항체를 함유하는 제약 조성물은 또한, 예를 들어 무바늘 주사기나 패치에 의해, 선택적으로는 이온토포레틱 패치에 의한 경피 투여, 또는 경점막 투여, 예를 들어 협측 투여에 적합하게 될 수 있다.

항체는 폐 약물 송달에 적합한 공지된 타입의 장치 중 어느 것을 이용하여 부형제 중에서, 용액, 현탁액 또는 건조 분말로서 폐 경로에 의해 투여될 수 있다. 이것들의 예는, 제한되지는 않지만, 폐 약물 송달을 위한 세 가지 일반적인 타입의 에어로졸 발생 장치를 포함하며, 제트 또는 초음파 분무기, 계량형 흡입기, 또는 건조 분말 흡입기를 포함할 수 있다(CYu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395-453 참조).

표준화된 시험 방법에 기초하여, 입자의 공기역학적 직경(da)가 단위 밀도(1 g/㎤)의 기준 표준 구형 입자의 기하 등가 직경으로서 정의된다. 가장 간단한 경우로서, 구형 입자에 대해, da는 밀도 비의 제곱근의 함수로서 기준 직경(d)와 관련되며, 다음에 의해 설명된다:

비-구형 입자에서는 이 관계가 변형된다(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385 참조). 용어 "MMAD" 및 "MMEAD"는 본 분야에 잘 설명되어 있고 알려져 있다(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R, 공기역학적 입자 크기 분포의 중간값의 측정을 나타낸다. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385 참조). 질량 중간 공기역학적 직경(MMAD)과 질량 중간 유효 공기역학적 직경(MMEAD)는 호환하여 사용되며, 통계적 변수로서, 입자가 폐에 침착되는 잠재력과 관련하여 에어로졸 입자의 크기를 경험적으로 설명하며, 실제 모양, 크기 또는 밀도와 무관하다(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385 참조). MMAD는 일반적으로 공기 중에서 입자의 비활동적 거동을 측정하는 기기인 임펙터에서 이루어진 측정으로부터 계산된다.

추가의 구체예에서, 조제물은 연무화와 같은 어떤 공지된 에어로졸화 기술에 의해 에어로졸화될 수 있으며, 이로써 10μm 미만, 더 바람직하게 1-5μm, 가장 바람직하게 1-3μm의 에어로졸 입자의 MMAD가 달성된다. 바람직한 입자 크기는 단백질이 최상으로 흡수되는 심폐까지 약물을 송달하기 위한 가장 효과적인 크기에 기초한다(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385 참조).

항체를 포함하는 폐 조제물의 심폐 침착은 흡입 기술의 변형, 제한되지는 않지만, 예를 들어 느린 흡입 유속(예를 들어, 30 L/분), 호흡 홀딩 및 가동 타이밍의 변형을 이용하여 선택적으로 더 최적화될 수 있다.

용어 "안정화된 조제물"은 증가된 물리적 안정성, 증가된 화학적 안정성 또는 증가된 물리화학적 안정성을 가진 조제물을 말한다.

본원에서 사용된 단백질 조제물의 "물리적 안정성"이란 용어는 열-기계적 스트레스에 단백질이 노출된 결과로서 및/또는 소수성 표면 및 계면과 같은 탈안정화 계면 및 표면과의 상호작용의 결과로서 단백질의 생물학적으로 비활성 및/또는 불용성인 응집물을 형성하는 단백질의 경향을 말한다. 수성 단백질 조제물의 물리적 안정성은 적합한 용기에 담긴 조제물을 다양한 시간 기간 동안 상이한 온도에 노출한 후 육안 검사 및/또는 탁도 측정에 의해 평가된다. 조제물의 육안 검사는 어두운 배경 하에 초집중광에서 수행된다. 조제물의 탁도는 탁도의 육안 점수 등급을 특징으로 하는데, 예를 들어 0에서 3까지 점수를 매긴다(탁도를 나타내지 않는 조제물은 육안 점수 0에 해당하고, 일광에서 육안 탁도를 나타내는 조제물은 육안 점수 3에 해당한다). 조제물이 일광에서 육안 탁도를 나타낸다면 그것은 단백질 응집과 관련하여 물리적으로 불안정한 것으로 분류된다. 또는, 조제물의 탁도는 당업자에게 잘 알려진 간단한 탁도 측정에 의해 평가될 수 있다. 또한, 수성 단백질 조제물의 물리적 안정성은 단백질의 입체구조적 상태에 대한 분광제 또는 분광 프로브를 사용하여 평가될 수 있다. 바람직하게 프로브는 단백질의 비-자생 컨포머와 우선적으로 결합하는 소 분자이다. 단백질 구조에 대한 소 분자 분광 프로브의 한 예는 티오플라빈 T이다. 티오플라빈 T는 아밀로이드 피브릴의 검출에 광범하게 사용되는 형광 염료이다. 피브릴과 아마도 또한 다른 단백질 형태의 존재 하에서, 티오플라빈 T는 피브릴 단백질 형태와 결합되었을 때 약 450nm에서 새로운 최대 여기, 그리고 약 482nm에서 증진된 방출을 일으킨다. 미결합 티오플라빈 T는 이 파장들에서 본질적으로 형광을 나타내지 않는다.

다른 소 분자들이 자생 상태에서 비-자생 상태로 단백질 구조의 변화에 대한 프로브로서 사용될 수 있다. 예를 들어, "소수성 패치" 프로브는 단백질의 노출된 소수성 패치에 우선적으로 결합한다. 소수성 패치는 일반적으로 자생 상태에서는 단백질의 3차 구조 안에 묻혀 있지만, 단백질의 접힘이 풀리거나 변성되기 시작하면서는 노출된다. 이들 소 분자 분광 프로브의 예는 방향족 소수성 염료, 예를 들어 안트라센, 아크리딘, 페난트롤린 등이다. 다른 분광 프로브로는 금속-아미노산 착체, 예를 들어 소수성 아미노산, 예를 들어 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌 및 발린 등의 코발트 금속 착체가 있다.

본원에서 사용된 단백질 조제물의 "화학적 안정성"이라는 용어는 단백질 구조의 화학적 공유 변화로 인한, 자생 단백질 구조에 비해 생물학적 효능 저하의 가능성 및/또는 면역원성 특성 증가의 가능성이 있는 화학적 변성 산물의 형성을 말한다. 자생 단백질의 타입과 성질 그리고 단백질이 노출된 환경에 따라서 다양한 화학적 변성 산물이 형성될 수 있다. 화학적 변성의 제거는 대부분 완전히 회피될 수 없고, 당업자에게 잘 알려진 대로 주로 단백질 조제물의 보관 및 사용 동안 화학적 변성 산물의 양이 증가하는 것이 보인다. 대부분의 단백질은 글루타미닐 또는 아스파라기닐 잔기의 측쇄 아미드기가 가수분해되어 자유 카르복실산을 형성하는 과정인 탈아미드화되는 경향을 나타낸다. 다른 변성 경로는 트랜스아미드화 및/또는 이황화 상호작용을 통해 둘 이상의 단백질 분자가 서로 공유 결합된 고분자량 전환 산물의 형성을 수반하며, 결과적으로 공유 결합된 다이머, 올리고머 및 폴리머 변성 산물이 형성된다(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahem. T.J. & Manning M. C, Plenum Press, New York 1992). 산화(예를 들어, 메티오닌 잔기의)는 화학적 변성의 다른 변형으로서 언급될 수 있다. 단백질 조제물의 화학적 안정성은 상이한 환경 조건에 노출된 후 상이한 시점에서 화학적 변성 산물의 양을 측정함으로써 평가될 수 있다(변성 산물의 형성은, 예를 들어 온도를 증가시킴으로써 주로 가속될 수 있다). 각 변성 산물의 양은 주로 다양한 크로마토그래피 기술(예를 들어, SEC-HPLC 및/또는 RP-HPLC)을 이용하여 분자 크기 및/또는 전하에 따라서 변성 산물을 분리함으로써 결정된다.

따라서, 상기 개략된 대로, "안정화된 조제물"은 증가된 물리적 안정성, 증가된 화학적 안정성 또는 증가된 물리화학적 안정성을 가진 조제물을 말한다. 일반적으로, 조제물은 유효 기간에 도달할 때까지 사용 및 보관 동안 안정해야 한다(권장된 사용 및 보관 조건에 따를 때).

본 발명의 한 구체예에서, 항체를 포함하는 제약학적 조제물은 사용시 6주 이상, 보관시 3년 이상 안정하다.

본 발명의 다른 구체예에서, 항체를 포함하는 제약학적 조제물은 사용시 4주 이상, 보관시 3년 이상 안정하다.

본 발명의 추가의 구체예에서, 항체를 포함하는 제약학적 조제물은 사용시 4주 이상, 보관시 2년 이상 안정하다.

본 발명의 추가의 구체예에서, 항체를 포함하는 제약학적 조제물은 사용시 2주 이상, 보관시 2년 이상 안정하다.

또한, 적합한 항체 조제물은 다른 이미 개발된 치료용 모노클로날 항체와의 경험을 시험하여 결정될 수 있다. Rituxan(Rituximab), Herceptin(Trastuzumab), Xolair(Omalizumab), Bexxar(Tositumomab), Campath(Alemtuzumab), Zevalin, 그리고 Oncolym와 같은 몇 가지 모노크로날 항체가 임상 상황에서 효과적이라고 나타났고, 유사한 조제물들도 본 발명의 항체와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 9.0 mg/mL 염화나트륨, 7.35 mg/mL 시트르산 나트륨 이수화물, 0.7 mg/mL 폴리소르베이트 80 및 주사용 멸균수 중에 IV 투여용으로 조제되며, 100mg (10mL) 또는 500mg(50mL) 일회용 바이알에 담아 10 mg/mL 농도로 공급될 수 있다. pH는 6.5로 조정된다. 다른 구체예에서, 항체는 약 6.0의 pH에서 약 20mM Na-시트레이트, 약 150mM NaCl을 포함하는 조제물로 공급된다.

치료 용도

본원에 설명된 항-NKG2A 항체를 이용하여 환자를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 한 구체예에서, 본 발명은 인간 환자에게 투여하기 위한 제약학적 조성물의 제조에서 본원에 설명된 항체의 사용을 제공한다. 전형적으로, 환자는 암, 바이러스 질환, 염증성 장애, 또는 자가면역 장애를 앓고 있거나, 그럴 위험이 있는 환자이다. 또는 달리, 본 발명의 항체는 환자에서 골수 이식을 개선하는데 사용된다.

예를 들어, 한 양태에서, 본 발명은 필요한 환자에서 CD94/NKG2A-제한된 림프구의 활성을 강화하는 방법을 제공하며, 이 방법은 CD94/NKG2A 수용체의 HLA-E-매개 활성화를 감소 또는 방지하는 항체인 인간 또는 인간화된 항-NKG2A 항체를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 증가된 NK, T, 및/또는 NKT 세포 활성이 유리하거나, NK, T, 또는 NKT 세포에 의한 세포용해에 민감한 세포를 수반하거나, 이러한 세포에 의해 영향을 받거나, 또는 이러한 세포에 의해 유발되거나, 또는 불충분한 NK, T, 또는 NKT 세포 활성에 의해 유발되거나 이들을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 암, 감염성 질환 또는 면역 장애를 가진 환자에서 이러한 림프구의 활성이 증가되도록 한다.

더 구체적으로, 본 발명의 방법 및 조성물은 각종 암 및 다른 증식성 질환의 치료에 유용하며, 이들은 제한되지는 않지만, 편평세포 암종을 포함하여 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 전립선, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선 및 피부의 암종을 포함하는 암종; 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 유모세포 림프종 및 베켓 림프종, 및 다발성 골수종을 포함하는 림프 계통의 조혈계 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병, 전골수성 백혈병, 및 골수이형성 증후군을 포함하는 골수 게통의 조혈계 종양; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함하는 간엽 기원의 종양; 흑색종, 수암, 기형암종, 신경모세포종 및 신경아교종을 포함하는 기타 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경아교종 및 신경초종을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 종양; 섬유육종, 횡문근육종 및 골육종을 포함하는 간엽 기원의 종양; 및 흑색종, 색소성 피부건조증, 각화극세포증, 고환종, 갑상선 여포암 및 기형암종을 포함하는 기타 종양을 포함한다.

본 발명에 따라서 치료될 수 있는 특정 장애들은 림프 계통의 조혈계 종양, 예를 들어 제한되지는 않지만, T 세포 장애를 포함하는 T 세포 및 B 세포 종양, 예를 들어 소 세포 및 대뇌양 세포 타입을 포함하는 T 전림프구성 백혈병(T-PLL); 바람직하게는 T 세포 타입의 대 과립 림프구 백혈병(LGL); 세자리 증후군(SS); 성인 T 세포 백혈병 림프종(ATLL); T-NHL 간비장 림프종; 말초/흉선뒤 T 세포 림프종(다형성 및 면역모구성 서브타입); 혈관 면역모구성 T 세포 림프종; 혈관중심성(코) T 세포 림프종); 악성(Ki 1+) 대 세포 림프종; 장 T 세포 림프종; T-림프모구성; 림프종/백혈병(T-Lbly/T-ALL), 다발성 골수종을 포함한다.

다른 증식성 장애들도 본 발명에 따라서 치료될 수 있으며, 예를 들어 과형성증, 섬유증(특히 폐뿐만 아니라 다른 타입의 섬유증, 예를 들어 신장 섬유증), 혈관신생, 건선, 죽상경화증 및 혈관내 평활근 증식, 예를 들어 협착 또는 혈관성형술 후 재협착을 포함한다.

특정 양태로서, 본 발명의 항체는 표면 항원 발현의 특징적인 조합을 나타내는 NK 세포 또는 NK-유사 세포, 즉 대 과립 림프구의 클론 확장에 의해서 유발되는 증식성 장애로 분류되는 과립 림프구의 NK-타입 림프구증식성 질환(또는 달리 NK-LGL이라고도 한다)을 치료하는데 사용된다(예를 들어, CD3-, CD56+, CD16+, 등; 예를 들어, Loughran (1993) Blood 82:1 참조). 이들 장애 상태에서 세포 증식은 일부 환자에서 보이는 경미한 증상에서부터 NK-LDGL 백혈병이라고 불리는 공격적이며 대체로 치명적인 형태의 질환에 이르는 범위까지 다양한 효과를 가질 수 있다. 이 부류의 장애의 증상은 열, 경미한 호중구감소증, 혈소판감소증, 빈혈, 림프구증식증, 비장비대증, 간비대증, 임파종, 골수 침윤 및 그외 다른 것들을 포함할 수 있다(예를 들어, Zambello et al. (2003) Blood 102:1797; Loughran (1993) Blood 82:1; Epling-Burnette et al. (2004) Blood-2003-02-400 참조).

또한, CD94/NKG2A 항체 기반 치료는, 바람직하게는 바이러스, 박테리아, 원충, 곰팡이 또는 진균에 의해 유발된 어떤 감염을 포함하는 감염성 질환을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 이러한 바이러스 감염성 유기체는, 제한되지는 않지만, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 바리셀라, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 타입 1(HSV-1), 헤르페스 심플렉스 타입 2(HSV-2), 우역, 리노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 유두종 바이러스, 유두종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 에치노바이러스, 아보바이러스, 헌타바이러스, 콕사키바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 루벨라바이러스, 폴리오바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스 타입 1 또는 타입 2(HIV-1, HIV-2)를 포함한다. 감염성 유기체의 다른 바람직한 부류를 구성하는 박테리아는, 제한되지는 않지만 스타필로코쿠스; 스트렙토코쿠스 피오게네스를 포함하는 스트렙토코쿠스; 엔테로코클; 바실루스 안트라시스 및 락토바실루스를 포함하는 바실루스; 리스테리아; 코리네박테리움 디프테리아에; 가드네렐라 바기날리스를 포함하는 가드네렐라; 노카디아; 스트렙토미세스; 서모악티노미세스 불가리스; 트레포네마; 캄플리오박터; 슈도모나스 아에루기노사를 포함하는 슈도모나스; 레지오넬라; 네이세리아 고노로에아에 및 네이세리아 메닝기티데스를 포함하는 네이세리아; 플라보박테리움 메닝고셉티쿰 및 플라보박테리움 오도라턴을 포함하는 플라보박테리움; 브루셀라; 보데텔라 퍼튜시스 및 보데텔라 브론키셉티카를 포함하는 보데텔라; 에스케리치아 콜리를 포함하는 에스케리치아, 클레브시엘라; 엔테로박터, 세라티아 마르세스센스 및 세라티아 리퀴파시엔스를 포함하는 세라티아; 에드워드시엘라; 프로테우스 미라빌리스 및 프로테우스 불가리스를 포함하는 프로테우스; 스트렙토바실루스; 릭케트시아세아에 픽케트스피를 포함하는 릭케트시아세아에, 클라미디아 시타시 및 클라미디아 트라코마티스를 포함하는 클라미디아; 미코박테리움 튜베르쿨로시스, 미코박테리움 인트라셀룰라, 미코박테리움 폴루이턴, 미코박테리움 라프라에, 미코박테리움 아비움, 미코박테리움 보비스, 미코박테리움 아프리카눔, 미코박테리움 칸사시, 미코박테리움 인트라셀룰라 및 미코박테리움 레프라에르누리움을 포함하는 미코박테리움; 및 노카디아를 포함한다. 원충은, 제한되지는 않지만, 레이슈마니아, 코크지디오아 및 트리파노소마를 포함할 수 있다. 기생충은, 제한되지는 않지만, 클라미디아 및 릭케트시아를 포함한다. 감염성 질환의 완전한 리스트는 질병관리센터(CDC)의 국제 감염성 질환 센터(NCID) 웹사이트(World-Wide Web (www) 주소 cdc.gov/ncidod/diseases/)에서 찾을 수 있으며, 이 리스트는 본원에 참고자료로 포함된다. 이들 질환은 모두 본 발명의 억제성 항-CD94/NKG2A 항체를 사용하여 치료할 수 있는 후보이다.

다른 양태로서, 항-NKG2A 항체는, 예를 들어 암성 세포 상의 CD94/NKG2A 발현을 특징으로 하는 암, 예를 들어 NK- 또는 T-세포 림프종으로 고통받는 환자에서 NKG2A-발현 세포를 표적화하여 죽이는데 사용된다. 한 구체예에서, 인간화된 항체와 세포독성제를 포함하는 면역콘쥬게이트의 형태로 인간화된 항체가 투여된다.

다른 양태에서, 항-NKG2A 항체는 자가면역 장애 또는 염증성 장애를 치료 또는 예방하는데 사용된다. 본 방법을 사용하여 치료될 수 있는 전형적인 자가면역 장애는, 특히 용혈성 빈혈, 악성빈혈, 전층동맥염, 전신 홍반성 루프스, 베게너 육아종증, 자가면역 간염, 베체트병, 크론병, 원발성 담도 경화증, 피부경화증, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 타입 1 당뇨병, 포도막염, 그레이브스병, 알츠하이머병, 갑상선염, 심근염, 류마티스 열, 피부경화증, 강직성 척추염, 류마티스 관절염, 사구체신염, 유육종증, 피부근염, 중증 근무력증, 다발성 근염, 길랑바레 증후군, 다발성 경화증, 원형탈모증, 수포창/유천포창, 수포성 유천포창, 하시모토 갑상선염, 건선 및 백반증을 포함한다.

이들 방법에 의해 치료될 수 있는 염증성 장애의 예들은, 제한되지는 않지만, 부신염, 폐포염, 혈관담낭염, 맹장염, 귀두염, 안검염, 기관지염, 윤활낭염, 심장염, 봉와직염, 자궁경부염, 담낭염, 성대염, 코클리티스, 대장염, 결막염, 방광염, 피부염, 게실염, 뇌염, 심장내막염, 식도염, 유스타키오관염, 결합조직염, 모낭염, 위염, 위장염, 치은염, 설염, 간비장염, 각막염, 내이염, 후두염, 임파선염, 유방염, 중이염, 뇌막염, 자궁염, 점액증, 심근염, 근염, 고막염, 신염, 신경염, 고환염, 골연골염, 이염, 심낭염, 건주위염, 복막염, 인두염, 정맥염, 급성 회백수염, 전립선염, 치수염, 망막염, 비염, 난관염, 공막염, 결공막염, 음낭염, 부비동염, 척추염, 황색지방증, 구내염, 활액막염, 이관염, 건염, 편도선염, 요도염, 및 질염을 포함한다.

또한, 수지상 세포의 동종반응성 NK 세포 사멸이 골수 이식에서 조혈 세포의 이식을 개선했다는 것이 밝혀졌다(L. Ruggeri et al., Science, 2002, 295:2097-2 100). 따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 활성화 항체를 포함하는 본 발명의 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 조혈 세포의 이식을 개선하는 방법을 제공한다. 이식의 개선은 이식편 대 숙주병의 감소된 발병 또는 중증도, 이식의 연장된 생존, 또는 이식에 의해 치료되는 질환(예를 들어, 조혈계 암)의 증상의 감소 또는 제거에 의해 나타난다. 이 방법은 바람직하게는 백혈병의 치료에 사용된다.

조합 치료

다수의 치료제가 암의 치료에 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 조성물 및 방법은 또한 특정 질환, 특히 종양, 암 질환, 또는 환자가 나타내는 다른 질환이나 장애의 치료에 일반적으로 사용되는 어떤 다른 방법과 조합될 수 있다. 특정 치료 접근법이 그 자체로서 환자의 상태에 유해하지 않고, 항-CD94/NKG2A 항체 기반 치료와 유의하게 상호작용하지 않는다고 한다면, 본 발명과의 조합이 고려된다.

고상 종양 치료와 관련하여, 본 발명은 고전적 접근법, 예를 들어 수술, 방사선 요법, 화학요법 등과 조합될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 항-CD94/NKG2A 항체가 수술 또는 방사선 치료법과 동시에, 전에, 또는 이후에 사용되거나, 또는 다른 항암제의 투여와 함께, 전에, 또는 이후에 환자에게 투여되는 조합 치료법을 제공한다. 이로써 확실히 본 발명의 조성물 중의 활성제와 조합된 수술, 방사선 요법 또는 항암제는 암에 대해 유리한 조합된 효과를 발휘할 것이다.

전형적인 항암제들은 화학요법제, 호르몬제, 항혈관형성제, 항전이제, 항암 항체(예를 들어, Rituximab), 억제성 KIR 분자에 대한 항체, 성장인자 억제제, 아폽토시스-촉진 화합물, 사이토카인 및 다른 면역조정제, 독소 또는 방사선 핵종과 콘쥬게이트된 종양-표적화제, DNA 복제, 미토시스 및 염색체 분리를 방해하는 화합물, 및 폴리뉴클레오티드 전구체의 합성 및 충실성을 파괴하는 제제를 포함한다.

자가면역 장애 또는 염증성 장애에 대해서, 특히 면역억제제, 예를 들어 아자티오프린(예를 들어, Imuran), 키오람부실(예를 들어, Leukeran), 시클로포스파미드(예를 들어, Cytoxan), 시클로스포린(예를 들어, Sandimmune, Neoral), 메토트렉세이트(예를 들어, Rheumatrex), 코르티코스테로이드, 프레드니손(예를 들어, Deltasone, Meticorten), 에탄에르셉트(예를 들어, Enbrel), 인플릭시맙(예를 들어, Remicade), TNF 억제제, FK-506, 라파르니신, 미코페놀레이트 모페틸, 레플루노미드, 항-림프구 글로불린, 데옥시스페르구알린 또는 OKT를 포함하는 어떤 다른 화합물이 일종 이상의 자가면역 또는 염증성 장애 또는 자가면역 또는 염증성 장애의 어떤 증상이나 특징에 효과적이라고 알려져 있다.

면역조정 화합물의 바람직한 예는 사이토카인을 포함한다. 다른 예들은 어떤 효과, 바람직하게는 NK 세포 활성을 활성화하거나 강화하는 효과, 또는 NK 세포의 증식을 유도하거나 지원하는 효과를 가진 화합물을 포함한다. 본 발명의 제제를 포함하는 조성물의 투여 전에, 동시에, 또는 이후에 투여되는 다른 화합물은 보조 화합물(예를 들어, 항구토제 및 진통제) 및 항바이러스제이다.

당업자에 의해 이해되는 대로, 항암제의 적합한 용량은 임상 요법에서 이미 사용되고 있는 것과 대략 비슷하며, 이때 항암제는 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여 투여된다. 치료될 상태에 따라서 용량 변동이 발생할 수 있을 것이다. 치료제를 투여하는 의사가 각 환자에 적합한 용량을 결정할 수 있다.

제조 물품

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 설명된 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 예를 들어, 제조 물품은 효과적인 양의 항체로 포유동물의 암 또는 바이러스 질환과 같은 장애를 치료할 수 있도록 사용자에게 지시하는 설명서와 함께 본원에 설명된 항체를 함유하는 용기를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 포유동물은 인간이다. 제조 물품은 전형적으로 용기 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리나 플라스틱과 같은 각종 재료로 형성될 수 있다. 용기는 상태를 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접근구를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백이나 피하주사 바늘로 뚫리는 마개를 가진 바이알일 수 있다). 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 본원의 인간화된 항-NKG2A 항체, 또는 이러한 인간화된 항체를 포함하는 항체 유도체(예를 들어, 면역콘쥬게이트)이다. 라벨 또는 포장 삽입물이 조성물이 선택된 상태, 예를 들어 암이나 바이러스 질환을 치료하는데 사용된다는 것을 표시한다.

더욱이, 제조 물품은 (a) 본원에 설명된 항체를 포함하는 조성물이 담긴 제 1 용기, 및 (b) 제1 항체 이외의 다른 치료제를 포함하는 조성물이 담긴 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 구체예에서 제조 물품은 제 1 및 제 2 조성물이 암이나 바이러스 질환을 치료하는데 조합하여 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 더 포함할 수 있다. 이러한 치료제는 앞 단락에서 설명된 보조 치료제 중 어느 것일 수 있다(예를 들어, 화학요법제, 항혈관형성제, 항호르몬 화합물, 심장보호제, 및/또는 사이토카인을 포함하는 포유동물 면역기능 조절제). 또는 달리, 또는 추가하여, 제조 물품은 주사용 정균수(BWFI), 인산염-완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 제약학적으로 허용되는 버퍼를 포함하는 제 2(또는 제 3) 용기를 더 포함할 수 있다. 그것은 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하여, 상업적인 관점과 사용자의 관점에서 바람직한 다른 재료들을 더 포함할 수 있다.

투여

상기 설명된 대로, 몇 가지 모노클로날 항체가 임상 상황에서 효과적인 것으로 밝혀졌으며(예를 들어, Rituxan(Rituximab) 및 기타), 유사한 투여 섭생(즉, 용량 및/또는 투여 프로토콜)이 본 발명의 항체와 함께 사용될 수 있다. 투여 일정 및 용량은 이들 제품에 대해 알려진 방법에 따라서, 예를 들어 제조자의 설명서에 따라서 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체 제조물은 10mg/ml의 농도로 100mg(10ml) 또는 500mg(50ml) 일회용 바이알에 담겨서 공급될 수 있다. 본 발명의 항체에 대한 전형적인 적합한 용량 범위는 약 10 mg/㎡ 내지 500 mg/㎡일 수 있다. 24시간, 48시간, 72시간 또는 1주일 또는 1개월 동안, 예를 들어 세포를 포화시킨 항-NKG2A 항체의 주사 양과 일정은 항체의 친화성과 약동학적 변수들을 고려하여 결정될 수 있다. 그러나, 이들 일정의 예시이며, 항체의 최적 일정 및 섭생 그리고 관용성은 임상 시험에서 결정되어야 한다는 것이 인정될 것이다.

비-치료 용도

또한, 본 발명의 항체(예를 들어, 인간화된 항-NKG2A 항체)는 비-치료 용도를 가진다.

예를 들어, 항체는 친화성-정제 제제로서 사용될 수 있다. 이 과정에서, 항체는 본 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 SEPHADEX™ 수지나 여과지와 같은 고체상 위에 고정된다. 고정된 항체는 정제될 NKG2A 단백질(또는 그것의 단편)을 함유하는 샘플과 접촉되고, 그 후 지지체가 적합한 용매로 세척되고 고정된 항체에 결합된 NKG2A 단백질을 제외한 샘플 중의 실질적으로 모든 물질이 제거된다. 마지막으로, 지지체가 글리신 버퍼 pH 5.0과 같은 다른 적합한 용매로 세척되어 항체로부터 NKG2A 단백질이 유리된다.

또한, 항-NKG2A 항체는 NKG2A 단백질의 진단 분석, 예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 그것의 발현을 검출하는데 유용할 수 있다.

진단 용도를 위해, 항체는 전형적으로 검출가능한 부분으로 표지될 것이다. 다음 범주로 일반적으로 분류될 수 있는 다수의 표지가 이용될 수 있다:

(a) 방사선 동위원소, 예를 들어 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I. Current Protocols in Immunology, Vol. 1 and 2, Coligen et al, Ed. Wiley-lnterscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)에 설명된 기술을 이용하여 항체가 방사선 동위원소로 표지될 수 있고, 예를 들어 방사성 활성이 섬광계수기를 사용하여 측정될 수 있다.

(b) 형광 표지, 예를 들어 희토류 킬레이트(유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 또는 그 유도체, 로다민 및 그 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린 및 텍사스 레드가 이용될 수 있다. 예를 들어, Current Protocols in Immunology(상동)에 설명된 기술을 이용하여 형광 표지가 항체예 콘쥬게이트될 수 있다. 형광측정기에서 형광이 정량될 수 있다.

(c) 다양한 효소-기질 표지가 이용될 수 있으며, 미국특허 제4,275,149호는 이들의 일부에 대한 리뷰를 제공한다. 효소는 일반적으로 발색 기질의 화학적 변경을 촉매하며, 이것이 다양한 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 효소는 기질의 색 변화를 촉매할 수 있고, 이것이 분광광도법으로 측정될 수 있다. 또는 달리, 효소는 기질의 형광이나 화학발광을 변경할 수 있다. 형광의 변화를 정량하는 기술은 상기 설명된다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기되어 측정될 수 있는 광을 방출하거나(예를 들어, 화학발광측정기를 사용하여), 형광 어셉터에 에너지를 제공할 수 있다. 효소 표지의 예들은 루시페라제(예를 들어, 반딧불 루시페라제 및 박테리아 루시페라제; 미국특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 디히드로게나제, 유레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO), 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당 옥시다제(예를 들어, 글루코오스 옥시다제, 갈락토오스 옥시다제, 및 글루코오스-6-포스페이트 디히드로게나제), 복소환식 옥시다제(예를 들어, 유리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소와 항체를 컨쥬게이션하는 기술은 O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay," Methods in Enzym. (Ed., J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166 (1981)에 설명된다.

효소-기질 조합의 예들은, 예를 들어 다음을 포함한다:

(i) 수소 퍼옥시다제가 기질인 양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO), 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체(예를 들어, 오르토페닐렌 디아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 염산염(TMB))를 산화시킨다;

(ii) 파라-니트로페닐 포스페이트가 기질인 알칼리성 포스파타제(AP); 및

(iii) 발색 기질(예를 들어, p-니트로페닐-베타-D-갈락토시다제) 또는 형광 기질 4-메틸룸베리페릴-p-베타-갈락토시다제를 갖는 베타-D-갈락토시다제(베타-D-Gal).

많은 다른 효소-기질 조합이 당업자에게 이용될 수 있다. 이들에 대한 일반적인 리뷰는 미국특허 제4,275,149호 및 제4,318,980호를 참조한다.

때로 표지는 항체에 간접적으로 콘쥬게이트된다. 당업자는 이것을 달성하기 위한 기술들을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 항체가 바이오틴에 콘쥬게이트될 수 있고, 상기 언급된 표지의 세 가지 광범한 범주 중 어느 것이 아비딘과 콘쥬게이트될 수 있으며, 또는 그 반대로 가능하다. 바이오틴은 아비딘과 선택적으로 결합하며, 따라서 이런 간접적인 방식으로 표지가 항체에 콘쥬게이트될 수 있다. 또 다르게는, 항체와 표지의 간접적인 콘쥬게이션을 달성하기 위해, 항체가 작은 합텐(예를 들어, 디곡신)과 콘쥬게이트되고, 상기 언급된 표지의 상이한 타입 중 하나가 항-합텐 항체(예를 들어, 항-디곡신 항체)에 콘쥬게이트된다. 따라서, 표지와 항체의 간접적인 콘쥬게이션이 달성될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 표지될 필요가 없으며, 그것의 존재는 NKG2A 항체와 결합하는 표지된 2차 항체를 사용하여 검출될 수 있다.

본 발명의 항체는 경쟁-결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석과 같은 임의의 공지된 분석 방법에서 사용될 수 있다. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

면역조직화학을 위해, 종양 샘플은 신선한 것이거나, 냉동될 수 있거나, 또는 파라핀에 포매되고 포르말린과 같은 보존제와 함께 고정될 수 있다.

또한, 항체는 생체내 진단 분석에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 항체는, 예를 들어 핵자기공명 또는 본 분야에 공지된 다른 수단에 의해 검출가능한 방사선 핵종 또는 비-방사선 활성 인디케이터로 표지된다. 바람직하게, 표지는 방사선 표지, 예를 들어 125I , 1311, 67Cu, 99mTc, 또는 111In이다. 표지된 항체가, 바람직하게는 혈류를 통해 숙주에 투여되고, 숙주에서 표지된 항체의 위치가 분석된다. 이 영상화 기술은 신생물의 검출, 단계화 및 치료에서 적합하게 사용된다. 방사선 동위원소는 금속-킬레이트화 화합물 또는 락토퍼옥시다제 또는 요오드화를 위한 요도젠 기술을 포함하는 어떤 수단에 의해 단백질에 컨쥬게이션된다.

편의상의 문제로서, 본 발명의 항체는 키트, 즉 정해진 양의 시약과 진단 분석을 수행하기 위한 설명서의 포장된 조합으로 제공될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우, 키트는 효소에 의해 요구되는 기질 및 보조인자를 포함할 것이다(예를 들어, 검출가능한 발색단이나 형광단을 제공하는 기질 전구체). 이에 더하여, 안정제, 버퍼(예를 들어, 차단 버퍼 또는 용해 버퍼) 등과 같은 다른 첨가제들도 포함될 수 있다. 여러 시약들의 상대적인 양은 분석 감도를 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 중의 농도를 제공할 수 있도록 광범하게 변화될 수 있다. 특히, 시약은 용해시 적합한 농도의 시약 용액을 제공하여 부형제를 포함하여, 건조 분말, 일반적으로 동결 건조된 분말로서 제공될 수 있다.

실시예

본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의해 더 상세히 예시된다.

실시예 1 - Z199 는 비-경쟁적 CD94 / NKG2A 길항제이다

이 실시예는 HP-3D9, Z270 및 Z199의 길항 능력과 HLA-E 차단 능력의 평가를 설명한다.

재료 및 방법

Z199 는 CD94 / NKG2A -제한된 NK 세포에 의해서 HLA -E 발현 종양 세포의 사멸을 유도한다. HLA-E는 도 1에 나타낸 대로 NK-억제성 수용체 CD94/NKG2A의 기능적 리간드이다. 이 도면은 대표적인 51Cr-방출 세포독성 분석을 함유하며, 51Cr-표지된 LCL 721.221(기능적으로 HLA-E-) 또는 LCL 721.221-Cw3 세포(기능적으로 HLA-E+)를 죽이는 CD94/NKG2A+ NKL 세포의 능력이 묘사된다. 이들 분석에서, 이펙터 세포(E)가 51Cr-표지된 표적 세포와 함께 다양한 E:T 비로 5% 이산화탄소를 함유하는 가습 인큐베이터에서 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션된다. 표적 세포의 사멸은 사멸시 표적 세포에 의해 방출되는, 조직 배양 배지 중의 51Cr의 양을 측정함으로써 분석된다. 사멸은 동일한 기간 동안 세포에 의한 51Cr의 자발적 방출에 대해 보정된, 최대 가능 사멸(즉, 모든 세포가 용해된 경우)의 퍼센트로서 표시된다. 특이적 사멸(%)은 다음과 같은 식으로 정의된다:

도 1에서, NKL 세포가 기능적 HLA-E를 결여하는 종양 세포(다이아몬드)에 비하여 기능적 HLA-E를 발현하는 종양 세포(삼각형)를 덜 효과적으로 죽인다는 것이 분명하다. NKL 세포가 포화 농도의 마우스 HP-3D9(항-CD94) 또는 Z199(항-NKG2A)와 예비 인큐베이션되었을 때, HLA-E+ 표적 세포는 훨씬 더 효과적으로 사멸되었으며(십자형), 이것은 동일한 분석에서 HLA-E- 종양 세포과 비슷한 수준이었다. 따라서, HLA-E는 CD94/NKG2A-발현 이펙터 세포(예를 들어, NK, NKT, α/β T-세포 및 γ/δ T-세포)에 의한 표적 세포의 사멸을 제한하며, 이것은 CD94/NKG2A를 기능적으로 차단하는 mAb에 의해 방지될 수 있다.

Z199 는 비-경쟁적 CD94 / NKG2A 길항제이다. CD94/NKG2A와 리간드(즉, HLA-E)의 결합을 CD94/NKG2A-억제성 항체가 방지하는지 시험하기 위해, 우리는 HP-3D9 및 Z199가 HLA-E 테트라머와 CD94/NKG2A 과발현 Ba/F3 세포(Ba/F3-CD94/NKG2A)의 결합을 방지할 수 있었는지를 분석했다. 이를 위해서, Ba/F3-CD94/NKG2A를 1) mAb(HP-3D9(10μg/ml) 또는 Z199(10μg/ml))과 함께 인큐베이션하거나, 2) PE-표지된 HLA-E 테트라머(4.7μg/ml)와 함께 인큐베이션하거나, 또는 3) 먼저 mAb와 함께 인큐베이션한 다음, PE-표지된 HLA-E 테트라머와 인큐베이션했다. 모든 인큐베이션은 얼음 위에서 2% FCS를 함유하는 조직 배양 배지에서 수행되었다. 계속해서, 세척 후에 세포를 마우스 Ab에 특이적인 APC-콘쥬게이트된 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, BD Biosciences FACSarray를 이용하여 유세포분석에 의해서 분석했다. 도 2에 나타낸 대로, HP-3D9(2A)와 Z199(2D)는 Y 축을 따라 세포 집단의 이동을 유발하며, 게이트를 벗어난 세포 잔류물은 염색되지 않았다(아래 좌측 1/4). 이와 반대로, HLA-E(2B, 2E)는 X 축을 따라 세포 집단의 이동을 유발하며, 아래 좌측 1/4을 벗어난 세포 잔류물은 염색되지 않았다. 항체와 HLA-E 테트라머는 모두 Ba/F3-NKG2D 세포와 결합하지 못했는데, 이는 이들이 이러한 분석에서 Ba/F3-CD94/NKG2A 상에서 CD94/NKG2A와 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다. Ba/F3-CD94/NKG2A 세포를 먼저 HP-3D9와 인큐베이션하고, 이어서 HLA-E 테트라머와 인큐베이션했을 때는, HLA-E 테트라머의 결합이 검출되지 않았다(도 2C). 따라서, HP-3D9는 CD94/NKG2A와 HLA-E의 결합을 방지하며, NK-세포독성 분석(도 1)에서 이 mAb의 CD94/NKG2A-억제성 효과는, HLA-E가 CD94/NKG2A에 의해 세포독성 림프구에 대한 음성 신호를 유도하는 능력을 방지한 결과이다. 이와 같이, HP-3D9는 경쟁적 CD94/NKG2A 길항제로서 간주될 수 있다. 이와 반대로, Ba/F3-CD94/NKG2A 세포를 먼저 Z199와 인큐베이션하고, 이어서 HLA-E 테트라머와 인큐베이션했을 때는, 도 2F에서 위 우측 1/4에 이중-양성 세포로서 나타낸 대로, 세포에 대한 Z199와 HLA-E 테트라머의 결합이 모두 검출되었다. Z199가 HLA-E와 CD94/NKG2A의 결합을 방지하지 못했으므로, 예를 들어 도 1에 나타낸 대로, NK-세포독성 분석에서 Z199의 CD94/NKG2A-억제성 효과는 HLA-E가 CD94/NKG2A를 통해 세포독성 림프구에 대한 음성 신호를 유도하는 능력을 방지하는 효과는 아닌 듯하다. 이와 같이, Z199는 비-경쟁적 CD94/NKG2A 길항제로서 간주될 수 있다.

도 2에 나타낸 관찰은 BiaCore 실험에서 확인되었다. 이들 실험에서, CD94 및 NKG2A의 세포외 부분으로 구성된 단쇄 구성물과 C-말단에서 융합된 뮤린 IgG1으로 구성된 Fc-융합 단백질인 scCD94/NKG2A-mFc를 칩 위에 고정한 다음, HP-3D9 또는 Z199로 포화시켰다. 계속해서, HLA-E 테트라머와 단백질-복합체의 결합을 분석했다. HP-3D9 포화된 scCD94/NKG2A는 HLA-E 테트라머와 결합하지 않았지만, Z199로 포화된 scCD94/NKG2A는 HLA-E 테트라머와 결합할 수 있었다(도 3). 이들 결과는 Z199가 HLA-E와 CD94/NKG2A의 결합을 방지하지 못한다는 것과, CD94/NKG2A를 기능적으로 차단하는 그것의 능력이 비-경쟁적 길항작용에 기초한다는 것을 확인시켜 준다.

결과

HP-3D9(항-CD94)(도 1A), Z199(항-NKG2A)(도 1B) 및 Z270(항-NKG2A)는 모두 CD94/NKG2A-제한된 림프구에 의해 HLA-E 발현 표적 세포의 사멸을 효과적으로 유도했다. 도 2A 및 2B에 나타낸 대로, HP-3D9는 CD94/NKG2A와 그것의 리간드인 HLA-E 사이의 상호작용을 방지했지만, Z199는 이 상호작용을 방지하지 못했다. Z270 또한 CD94/NKG2A와 HLA-E의 상호작용을 방지했다.

세포를 포화 용량의 HLA-E 테트라머와 예비 인큐베이션했을 때, 시험된 모든 용량의 humZ199(100pg/ml에서 1μg/ml까지)는 Ba/F3-CD94/NKG2A 세포와 결합할 수 있었지만, 결합의 KD에는 다소 영향이 있었는데(약 1 log), 이것은 아마도 사용된 HLA-E 복합체의 테트라머 성질로 인한 어떤 입체장애 때문인 듯하다(데이터 나타내지 않음).

따라서, Z199와 humZ199는비-경쟁적 CD94/NKG2A 길항제이다. 이론에 제한되는 것은 아니지만, Z199는, 예를 들어 CD94/NKG2A 수용체의 입체형태적 변화를 방지하거나 유도함으로써, 및/또는 CD94/NKG2A 수용체의 다이머화 및/또는 클러스터화에 영향을 미침으로써 CD94/NKG2A 신호화를 방해하는 것이 가능하다.

실시예 2 - Z199 의 인간화

Z199의 중쇄(Z199.H) 및 경쇄(Z199.L)의 가변 도메인을 암호화하는 cDNA를 Z199 하이브리도마로부터 추출된 mRNA로부터 5' RACE- 및 RT-PCR 클로닝에 의해 얻었다.

Z199 VH(1개 서열) 및 VL(1개 서열)의 서열을 Z199 하이브리도마로부터 클로닝(5' RACE 및 RT PCR, NN 차이나)에 의해 얻었다.

Z199 VL:

caaattgttctcacccagtctccagcactcatgtctgcgtctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatttactggtaccagcagaagccaagatcctcccccaaaccctggatttatctcacatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtggtaacccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgg (SEQ ID NO:1)

번역된 서열:

QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSGNPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO:2)

Z199 VH:

gaagttcaactggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcttgtgcagcctctggattcactttcagtagctatgccatgtcttgggttcgccagtctccagagaagaggctggagtgggtcgcagaaattagtagtggtggtagttacacctactatccagacactgtgaccggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctggaaatcagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtacaaggcatggtgactaccctaggttcttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctca (SEQ ID NO:3)

번역된 서열

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQSPEKRLEWVAEISSGGSYTYYPDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEISSLRSEDTAMYYCTRHGDYPRFFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO:4)

친화성은 발현에 의해 검증되었다.

Z199 서열의 분석으로부터, Kabat 정의에 따른 CDR은 다음과 같다:

구조 주형 PDB: 1MHP의 MOE를 사용하여 3D 단백질 구조 모델을 구축하였다. PDB 데이터베이스에 있는 201개의 항체-항원 복합체에 대한 통계적 분석에 기초하면, 파라토프에서 가장 가능한 잔기는 중쇄: 23-35, 49-58, 93-102; 경쇄: 24-34, 49-56, 89-97이다. MOE를 사용하여 파라토프와 상호작용(소수성, 수소결합, 전하)하는 잔기를 확인하고, 조합된 잔기 세트(파라토프 + 상호작용 잔기)를 Z199의 마스크로서 선택했다.

Z199.L 및 Z199.H로 점라인 V 데이터베이스를 검색하면 다음의 가능한 프레임워크 주형이 대응된다(괄호 안에 E 값이 주어진다):

중쇄: VH3_21(1e-044), VH3_23(1e-043), VH3_11(3e-043), VH3_07(6e-043), VH3_48(8e-043)

경쇄: VKVI_A14(3e-033), VKIII_L6(1e-032), VKIJ.23(2e-031), VKIJ.8(3e-031), VKI_L15(3e-031)

마스크로 점라인 데이터베이스를 검색하면 다음의 가능한 프레임워크 주형이 대응된다(괄호 안에 E 값이 주어진다):

중쇄: VH3_23(1e-012), VH3_21(1e-012), VH3_30_3(4e-012), VH3_64(7e-012), VH3_30_5(1e-011)

경쇄: VKIII_L6(3e-007), VKIJ.23(6e-007), VKIII_A11(1e-006), VKIII_A27 (2e-006), VKIII_L20(3e-006)

정렬 및 힛의 수동 검사 후, 인간 스캐폴드로서 VH3_21과 VKIII_L6이 선택되었지만, 원칙적으로는 많은 다른 주형도, 예를 들어 인간화된 단백질의 물리화학적 특성을 최적화할 목적으로 선택될 수 있었다. JH3 및 JK2가 점라인 J-단편으로 선택되었다.

인간화는 다음 규칙에 따라서 수행될 수 있었다:

- 마스크 외부의 잔기는 인간으로서 취급된다.

- 마스크 내부와 Kabat CDR 내부의 잔기는 뮤린으로서 취급된다.

- 마우스/점라인 컨센서스를 가진 마스크 내부와 Kabat CDR 외부의 잔기는 컨센스서 서열로 취급된다.

- 마우스/점라인 차이를 가진 마스크 내부와 Kabat CDR 외부의 잔기는 잠재적 역돌연변이로 취급된다.

Z199.L 및 Z199.H에 대한 분석이 도 4에 도시된다(마스크는 밑줄친 서열 번호로 표시되고, Kabat CDR(기준으로서 인간화된 서열을 사용)은 볼드체 서열 번호로 표시되고, 마우스/점라인 차이는 회색으로 표시되고, 잠재적 체세포 초돌연변이된 잔기는 밑줄친 잔기 문자로 표시되고, 잠재적 역돌연변이 잔기는 볼드체 잔기 문자로 표시된다).

결과의 humZ199 VL 및 humZ199 VH 서열이 인간처럼 잠재적 역돌연변이 잔기와 함께 주어진다. 인간화된 Z199의 변이체는 다음과 같다:

humZ199 VL: 야생형, E1Q, L46P, L47W, I58V, D70S 및 E1Q, L46P, L47W, I58V, 및 D70S의 어떤 조합.

humZ199 VH: 야생형, S49A, S77T, A93T 및 S49A, S77T, A93T의 어떤 조합.

또한, 상기 설명된 VH 및 VL 변이체의 상이한 조합을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 가진 인간화된 Z199 변이체가 생산될 수 있으며, 관심의 특성에 대해 시험될 수 있다.

Kabat 정의에 따른 이 신규 인간화된 항체의 CDR은 다음과 같다:

CDR_L1 및 CDR_H2에 존재하는, 뮤린 CDR과의 차이가 주지된다(볼드체로 나타냄).

실시예 3 - humZ199 및 역돌연변이 변이체의 Biacore 분석

뮤린(recZ199) 및 키메라(chimZ199, Z199의 가변 도메인에 융합된 인간 IgG4의 불변 도메인으로 구성된다)가 HEK2936E 세포에서 일시 과발현에 의해 생산되었다. 유사한 방식으로, 도 6에 나타낸 것들을 포함하여 인간화된 Z199(humZ199) 변이체가 생산되었다.

생산된 모든 항체를 단백질 A-비드를 사용하여 수거했다. 최적의 인간화된 humZ199 VL과 humZ199 VH 조합을 찾기 위해서, CD94/NKG2A와 결합하는 Z199 변이체의 능력을 항원으로서 고정된 단쇄 (sc)CD94/NKG2A-마우스 Fc 융합 단백질을 사용하여 Biocore T-100에 의해 결정했다.

Biocore T-100(Biacore AB, Uppsala, Sweden)에서 humZ199 변이체의 항원-결합 특성을 분석했다. 항원 sc-NKG2A-CD94-mFc를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(EDC)와 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 사용하여 아미노기에 의해 센서 CM5 칩(Biacore AB, Uppsala, Sweden) 위에 공유 고정시켰다. 고정 수준은 300 RU를 목표로 했다. 결합 분석을 위해서, 정제된 항체 변이체를 작업 버퍼 HBS-EP(10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% (v/v) Tween-20) 중에 10nM로 희석했다. 반응속도 연구를 위해, Z199 항체 변이체를 HBS-EP 버퍼 중에 일련의 농도(1.25, 2.5, 5, 7.5 및 10nM)로 희석했다. 다음에, 모든 샘플을 40 ul/분의 유속으로 2분간 고정된 항원 위에 주사했다. 계속해서, 항체 해리 분석을 위해서 작업 버퍼를 40 ul/분으로 4분간 주사했다. 각 작업 후에, 재생 버퍼(10mM NaOH, 500mM NaCl)를 주사하여(30초, 10 ul/분) 항원으로부터 나머지 항체를 완전히 분리했다. 데이터를 Biocore T-100 평가 소프트웨어로 평가했다.

결과

처음에는 인간화된 Z199 항체가 항원과 결합할 수 없는 것으로 판명되었다. 따라서, 역돌연변이를 humZ199의 경쇄 및 중쇄에 도입하였다. 흥미롭게도, 1개의 경쇄 역돌연변이 L46P은 항체 인식과 항원 결합을 가능하게 했다(도 5). 이 돌연변이의 친화성은 72pM로 측정되었는데, 이것은 키메라 Z199(24pM)(표 1)의 KD보다 단지 2.7배 더 적었다. 경쇄에서 L46P와 조합된 다른 역돌연변이는 항체 친화성에 더 이상의 유의한 증가를 가져오지 않았다(도 6). 따라서, 경쇄에 단일 역돌연변이 L46P를 가진 humZ199를 더 이상의 특성화를 위해 선택하였다.

실시예 4 - Z199 가변 서열에서 중요 잔기의 확인

알라닌 스캔을 수행하여 Z199 가변 서열에서 중요 잔기를 확인하였다.

Z199 항체의 컴퓨터 가상 구조 분석에 기초하여, chimZ199를 베이스로 사용하여 15개의 경쇄 및 9개의 중쇄 ala-스캔 돌연변이를 만들었고, CD94/NKG2A와 결합하여 길항제 기능을 발휘하는데 있어서 중요한 Z199의 잔기를 결정했다(ala 스캔 변이체에 대한 개요는 도 7을 참조한다). 다음은 생산된 돌연변이의 리스트이다:

LC: S24A, S26A, S27A, S28A, S30A, Y32A, Y49A, L50A, S52A, N53A, L54A, S56A, S92A, N94A, P95A.

HC: T28A, S30A, S31A, Y56A, Y58A, D97A, Y98A, P99A, V102A.

HEK293 세포에서 각각 돌연변이가 발현되었고, 발현된 항체를 함유하는 조직 배양 배지를 scCD94/NKG2A에 대한 결합 프로파일에 대해서 Biacore T-100(Biacore AB, Uppsala, Sweden)에서 시험하였다:

항원 sc-NKG2A-CD94-mFc를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 사용하여 아민기에 의해서 센서 CM5 칩(Biacore AB, Uppsala, Sweden) 위에 공유 고정했다. 고정 수준은 300 RU를 목표로 했다. 정제된 Z199 알라닌 돌연변이를 작업 버퍼 HBS-EP 중에 5nM 또는 10nM로 희석했다. 다음에, 모든 샘플을 10μl/분의 유속으로 4분간 고정된 항원 위에 주사했다. 계속해서, 항체 결합 안정성 분석을 위해 작업 버퍼를 10μl/분으로 1분간 주사했다. 각 작업 후에, 재생 버퍼(10mM NaOH, 500mM NaCI)를 주사하여(30초, 10μl/분) 항원으로부터 나머지 항체를 완전히 분리했다. 데이터를 Biacore T-100 평가 소프트웨어로 평가했다. 각 돌연변이의 상대적 결합을 Biacore로부터 얻어진 결합 수준(RU)을 chimZ199의 것으로 나눔으로써 계산했다.

결과

chimZ199와 비교하여, 모든 ala-스캔 샘플은 분석에 사용된 두 가지 mAb 농도(2.5nM 및 5nM)에서 비슷한 결합 프로파일을 나타냈으며, 다만 chimZ199 VL의 알라닌이 잔기 Y32, L50 또는 P95A로 치환되거나, 또는 chimZ199 VH의 알라닌이 잔기 Y56, Y98 또는 P99로 치환된 Z199 변이체는 예외였다.

Z199 중쇄 알라닌 돌연변이 Y56A, Y98A, 및 P99A는 항원-결합 능력의 약 40%를 보유했지만, 중쇄 돌연변이 Y58A 및 D97A의 상대적 결합은 60-80%이다(도 8). 따라서, Z199 중쇄에서 아미노산 Y56, Y98 및 P99가 항원 인식에 상당히 기여한다. 또한, 중쇄에서 아미노산 Y58 및 D97은 항원 결합에 중간 정도의 영향을 미친다.

유사하게, Z199 경쇄 알라닌 돌연변이 Y32A, L50A, 및 P95A는 약 40% 항원-결합 능력을 나타냈다. 경쇄 돌연변이 Y49A의 상대적 결합은 60-80%이다(도 9). 따라서, Z199 경쇄에서는 아미노산 Y32, L50 및 P95가 항원 인식에 상당히 기여하고, 경쇄에서 아미노산 Y49는 항원 결합에 중간 정도의 영향을 미친다.

따라서, humZ199와 같은 Z199에 기초한 치료용 화합물은 Z199_L에서 발견된 것처럼 CDR1에 Y32, CDR2에 L50, 그리고 CDR3에 P95의 배치, 그리고 Z199_H에서 발견된 것처럼 CDR2에 Y56 그리고 CDR3에 Y98과 P99의 배치를 포함하는 것이 바람직하다. 이들 Kabat 위치는 Z199 VL 도메인(SEQ ID NO:2)의 아미노산 잔기 Y31, L49 및 P94, 그리고 Z199 VL 도메인(SEQ ID NO:4)의 아미노산 잔기 Y57, Y102 및 P103에 각각 상응한다.

실시예 5 - Z199 에피토프의 확인

Z199와 같은 비-경쟁적 항-NKG2A 길항제 항체는 HLA-E와 동시에 CD94/NKG2A에 결합할 수 있다. 따라서, 이 항체는 HLA-E가 CD94/NKG2A 복합체에 결합되었을 때 노출된 채로 있는 세포외 NKG2A-잔기와 결합한다. 또한, 이 항체는 HLA-E가 단지 무손상 CD94/NKG2A 수용체와만 결합하므로 CD94 상호작용을 파괴하지도 않는다.

NKG2A/CD94에 복합체화된 HLA-E의 3D 구조(Petrie, EJ. et al., (2008) J. Exp. Med. 205:725-735)를 사용하여, 측쇄 원자가 노출된 세포외 NKG2A 잔기(사용된 프로브 반경 4.0Å)를 확인했다. 잔기 P94 - K112는 3D 구조에서는 보이지 않았으며, 따라서 모두 노출된 것으로 가정되었다.

도 10에 나타낸 대로, 비-경쟁적 NKG2A 항체의 에피토프는 다음 세그먼트 중 하나 이상에 잔기를 포함한다: P94-H115, H118, P120-E122, S127-N128, Y132, K135-T139, E141-E142, L144-L145, T148-N151, S153, D158-E161, K164, F178-N190, L192-A193, K195-E197, K199-N207, N214-R215, Q220-C221, S224, H231-K232, 및 이들의 어떤 조합.

NKG2A와 NKG2C의 아미노산 서열은 매우 유사하다(도 11 참조). NKG2A에 특이적이고 훨씬 더 낮은 친화성으로 NKG2C에 결합하는 항체의 NKG2A 에피토프(예를 들어, Z199)는 NKG2A 서열에만 존재하는 노출된 잔기를 포함한다. 따라서, 비-경쟁적 길항성 항-NKG2A 항체는 전장 NKG2A 서열의 잔기 P94-N107 및 M189-E197에 각각 상응하는 스턱이나 루프에 있는 에피토프와 결합한다. 바람직하게, 항체의 에피토프는 이들 세그먼트에 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 노출된 잔기, 더 구체적으로는 전장 NKG2A 서열(SEQ ID NO:11)의 잔기 P94, S95, T96, L97, I98, Q99, R100, M01, L106, M189, E197을 포함한다.

결론적으로, HLA-E와 경쟁하지 않고, CD94 상호작용을 파괴하지 않고, NKG2C보다 NKG2A와 훨씬 더 높은 친화성으로 결합하는 항-NKG2A 항체의 NKG2A 에피토프는 다음 세그먼트 중 한쪽 또는 양쪽에 잔기를 포함해야 한다: NKG2A 서열(SEQ ID NO:11)의 PSTLIQRHNNSSLN(P94 내지 N107) 또는 MNGLAFKHE(M189 내지 E197).

전형적인 구체예들

다음 단락은 본 발명의 전형적인 구체예들을 설명한다.

1. 인간 CD94/NKG2A 수용체의 세포외 부분에 결합하는 제제로서, 상기 제제는

(a) CD94/NKG2A 양성 림프구의 표면에서 발현되는 인간 CD94/NKG2A 수용체의 억제 활성을 감소시키고; 및

(b) HLA-E와 동시에 CD94/NKG2A에 결합할 수 있으며, 상기 제제는 뮤린 Z199 항체가 아니다.

2. 구체예 1에 있어서, CD94/NKG2A 양성 림프구가 NK 세포인 제제.

3. 구체예 1에 있어서, CD94/NKG2A 양성 림프구가 NKT 세포인 제제.

4. 구체예 1에 있어서, CD94/NKG2A 양성 림프구가 세포독성 T 세포인 제제.

5. 전술한 구체예 중 어느 하나에 있어서, HLA-E 유도된 CD94/NKG2A 신호화를 방해함으로써 CD94/NKG2A-발현 림프구의 CD94/NKG2A-매개 억제를 감소시키는 제제.

6. 전술한 구체예 중 어느 하나에 있어서, CD94/NKG2C와 같은 활성화 CD94/ NKG2 분자보다 적어도 100-배 더 낮은 KD로 CD94/NKG2A의 세포외 부분과 결합하는 제제.

7. 전술한 구체예 중 어느 하나에 있어서, 인간 CD94/NKG2A의 세포외 부분과의 결합에서 항체 Z199와 경쟁하는 제제.

8. 전술한 구체예 중 어느 하나에 있어서, CD94/NKG2A와 결합하는데 있어서 Z199 항체와 경쟁하는 항체로부터의 CDR을 적어도 포함하는, 항체, 항체 단편, 및 합성 또는 반합성 항체-유래 분자로부터 선택된 제제.

9. 구체예 8에 있어서, 완전 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 키메라 항체인 제제.

10. 구체예 9에 있어서, IgA, IgD, IgG, IgE 또는 IgM인 제제.

11. 구체예 10에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 제제.

12. 구체예 8에 있어서, 구체예 10 또는 11에 따른 항체의 단편인 제제.

13. 구체예 8에 있어서, Fab 단편, Fab' 단편, Fab'-SH 단편, F(ab)2 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 중쇄 Ig(라마 또는 낙타 Ig), VHH 단편, 단일 도메인 FV, 및 단쇄 항체 단편으로부터 항체 단편이 선택되는 제제.

14. 구체예 8에 있어서, scFV, dsFV, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 카파 바디, IgNAR, tandAb, BiTE; 및 다중-특이적 항체로부터 합성 또는 반합성 항체-유래 분자가 선택되는 제제.

15. 전술한 구체예 중 어느 하나에 있어서, Z199 VH 및 VL 도메인으로부터의 CDR 서열을 포함하는 제제.

16. 구체예 15에 있어서, Z199 CDR 서열에 존재하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 역돌연변이를 포함하는 제제.

17. 구체예 16에 있어서, Z199 가변 중쇄(VH) 도메인(SEQ ID NO:4)의 아미노산 잔기 31-35, 50-60, 62, 64, 66, 및 99-108, 및 Z199 가변 경쇄(VL) 도메인(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 잔기 24-33, 49-55, 및 88-96를 포함하는 제제.

18, 구체예 17에 있어서, 경쇄의 위치 46에 프롤린을 포함하는 완전 인간 또는 인간화된 항체인 제제.

19. 구체예 10에 있어서, 재조합된 점라인 서열 및 관련된 체세포 초돌연변이로 구성되는 군으로부터 선택된 인간 프레임워크 영역을 포함하는 제제.

20. 구체예 10-12 중 어느 하나에 있어서, 항체 Z199에 결합하는 CD94/NKG2A에 대해 발생되거나 또는 Z199의 이디오타입에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체에 대해 발생된 완전 인간 항체인 제제.

21. 전술한 구체예 중 어느 하나에 있어서, 인간 프레임워크 서열, 위치 46에 프롤린 잔기 및 다음의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 제제:

a) SEQ ID NO:8을 포함하는 CDR-H1;

b) SEQ ID NO:9을 포함하는 CDR-H2;

c) SEQ ID NO:10을 포함하는 CDR-H3;

d) SEQ ID NO:5을 포함하는 CDR-L1;

e) SEQ ID NO:6을 포함하는 CDR-L2; 및

f) SEQ ID NO:7을 포함하는 CDR-L3.

22. 전술한 구체예 중 어느 하나에 있어서, 적어도 부분적으로 정제된 형태인 제제.

23. 전술한 구체예 중 어느 하나에 있어서, 본질적으로 분리된 형태인 제제.

24. 전술한 구체예 중 어느 하나에 있어서, 제 2 제제에 콘쥬게이트 또는 융합된 제제.

25. 구체예 24에 있어서, PEG 같은 돌출기, 세포독성제, 검출가능한 마커 및 표적화제로부터 제 2 제제가 선택되는 제제.

26. 전술한 구체예 중 어느 하나에 있어서, 제약으로서 사용되는 제제.

27. 전술한 구체예 중 어느 하나에 있어서, 악성 신생물, 바이러스 감염, 염증성 장애, 및 자가면역 질환의 치료에서 제약으로서 사용되는 제제.

28. 전술한 구체예 중 어느 하나에 있어서, 인간 환자에서 세포 표면에서 발현되는 CD94/NKG2A 수용체의 억제 활성을 중화하거나 감소시키기 위한 제약으로서 사용되는 제제.

29. 전술한 구체예 중 어느 하나에 있어서, 인간 환자에서 CD94/NKG2A-발현 세포의 세포-사멸 활성을 강화하기 위한 제약으로서 사용되는 제제.

30. 전술한 구체예 중 어느 하나에 있어서, 인간 환자에서 Cw3-발현 표적 세포의 사멸을 유도하기 위한 제약으로서 사용되는 제제.

31. 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 전술한 구체예 중 어느 한 항에 따른 제제를 포함하는 조성물.

32. 구체예 9 및 구체예 9에 종속되는 한에서 구체예 10 중 어느 하나에 따른 제제를 암호화하는 핵산 단편.

33. 구체예 32에 있어서, DNA 및 RNA 단편으로부터 선택되는 핵산 단편.

34. 구체예 32 또는 33에 따른 핵산 단편을 포함하는 벡터.

35. 구체예 34에 있어서, 클로닝 벡터 및 발현 벡터로부터 선택되는 벡터.

36. 구체예 32 또는 33에 따른 핵산 단편 또는 구체예 34 또는 35에 따른 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포.

37. 구체예 36에 있어서,

(a) 중쇄와 경쇄 아미노산 서열의 코딩 영역을 모두 포함하며, 상기 코딩 영역들이 동일한 또는 상이한 조절성 유전자 요소의 제어 하에 있는, 구체예 32 또는 33에 따른 하나의 핵산 단편, 또는

(b) 하나는 경쇄 아미노산 서열을 암호화하고, 나머지 하나는 중쇄 아미노산 서열을 암호화하는, 구체예 32 또는 33에 따른 2개의 분리된 핵산 단편

을 포함하는 형질전환된 세포.

38. 구체예 36 또는 37에 있어서, 구체예 32 또는 33에 따른 핵산 단편(들)을 발현하는 형질전환된 숙주 세포.

39. 구체예 36-38 중 어느 하나에 따른 형질전환된 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 암호화하는 구체예 34 또는 35에 따른 벡터로, 또는 하나는 중쇄 아미노산 서열을 암호화하고, 나머지 하나는 경쇄 아미노산 서열을 암호화하는 구체예 34 또는 35에 따른 2개의 상이한 벡터로 숙주 세포를 트랜스펙션 또는 형질감염시키는 단계를 포함하는 방법.

40. 구체예 9 및 구체예 9에 종속되는 한에서 구체예 10에 따른 제제의 제조 방법으로서, 상기 방법은 구체예 32 또는 33의 핵산 단편의 발현을 촉진하는 조건 하에서 구체예 36-38 중 어느 하나에 따른 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 선택적으로 이와 같이 생산된 발현 산물을 회수하는 단계를 포함하는 방법.

41. 치료를 요하는 인간 환자에서 악성 신생물, 바이러스 감염, 염증성 장애 및 자가면역 장애를 치료 또는 완화하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 인간 환자에게 구체예 1-25 중 어느 하나에 따른 제제 또는 구체예 31에 따른 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.

42. 구체예 41에 있어서, 상기 악성 신생물이 편평세포암종, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 유모세포 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 급성 또는 만성 골수성 백혈병, 전골수성 백혈병, 섬유육종, 횡문근육종; 흑색종, 기형암종, 수암 신경모세포종, 신경아교종, 성상세포종, 신경모세포종, 신경아교종, 신경초종, 섬유육종, 횡문근육종, 골육종, 흑색종, 색소성 피부건조증, 각화극세포증, 고환종, 갑상선여포암, 기형암종, 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 전립선, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선 또는 피부의 기타 암종, 림프 계통의 기타 조혈계 종양, 골수 계통의 기타 조혈계 종양, 간엽 기원의 기타 종양, 중추신경계 또는 말초신경계의 기타 종양, 또는 간엽 기원의 기타 종양으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.

43. 구체예 42에 있어서, 악성 신생물이 다발성 골수종, 비호지킨 림프종 및 급성 골수성 림프종으로부터 선택되는 방법.

44. 구체예 41에 있어서, 상기 자가면역 장애가 용혈성 빈혈, 악성빈혈, 전층동맥염, 전신 홍반성 루프스, 베게너 육아종증, 자가면역 간염, 베체트병, 크론병, 원발성 담도경화증, 피부경화증, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 타입 1 당뇨병, 포도막염, 그레이브스병, 알츠하이머병, 갑상선염, 심근염, 류마티스열, 피부경화증, 강직성 척추염, 류마티스 관절염, 사구체신염, 유육종증, 피부근염, 중증 근무력증, 다발성 근염, 길랑바레 증후군, 다발성 경화증, 원형탈모증, 수포창/유천포창, 수포성 유천포창, 하시모토 갑상선염, 건선 및 백반증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.

45. 구체예 41에 있어서, 상기 염증성 장애가 부신염, 폐포염, 혈관담낭염, 맹장염, 귀두염, 안검염, 기관지염, 윤활낭염, 심장염, 봉와직염, 자궁경부염, 담낭염, 성대염, 코클리티스, 대장염, 결막염, 방광염, 피부염, 게실염, 뇌염, 심장내막염, 식도염, 유스타키오관염, 결합조직염, 모낭염, 위염, 위장염, 치은염, 설염, 간비장염, 각막염, 내이염, 후두염, 임파선염, 유방염, 중이염, 뇌막염, 자궁염, 점액증, 심근염, 근염, 고막염, 신염, 신경염, 고환염, 골연골염, 이염, 심낭염, 건주위염, 복막염, 인두염, 정맥염, 급성 회백수염, 전립선염, 치수염, 망막염, 비염, 난관염, 공막염, 결공막염, 음낭염, 부비동염, 척추염, 황색지방증, 구내염, 활액막염, 이관염, 건염, 편도선염, 요도염 및 질염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.

46. 구체예 41에 있어서, 상기 바이러스 감염이 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 바리셀라, 아데노바이러스, 헤르페스심플렉스 타입 1(HSV-1), 헤르페스심플렉스 타입 2(HSV-2), 우역, 리노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 유두종 바이러스, 유두종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 에치노바이러스, 아보바이러스, 헌타바이러스, 콕사키바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 루벨라바이러스, 폴리오 바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스 타입 1 또는 2(HIV-1, HIV-2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.

47. (a) CD94/NKG2A-발현 림프구의 표면에서 발현되는 인간 CD94/NKG2A 수용체의 세포외 부분에 결합하고; (b) 인간 CD94/NKG2A 수용체의 억제 활성을 감소시키고; (c) 인간 CD94/NKG2A 수용체와의 결합에서 HLA-E와 경쟁하지 않고, 및/또는 HLA-E와 동시에 CD94/NKG2A 수용체와 결합할 수 있고, 및/또는 CD94/NKG2A 수용체와 HLA-E의 결합을 방지하지 않는 분리된 인간 또는 인간화된 항체.

48. 구체예 47에 있어서, CD94/NKG2C보다 적어도 100-배 더 낮은 KD로 CD94/ NKG2A에 결합하는 항-NKG2 항체인 항체.

49. 구체예 47 또는 48에 있어서, 인간 CD94/NKG2A와의 결합에서 Z199 항체와 경쟁하는 인간 또는 인간화된 항체.

50. 구체예 47-49 중 어느 하나에 있어서, Z199 항체와 동일한 CD94/NKG2A 상의 에피토프에 결합하는 인간 또는 인간화된 항체.

51. 각각의 구체예에서,

(a) P94-N107 및/또는 M189-E197;

(b) P94 내지 N107; 또는

(c) M189 내지 E197

을 포함하는 NKG2A 서열(SEQ ID NO:11)의 세그먼트와 결합하는 인간 또는 인간화된 항체.

52. 구체예 47-51 중 어느 하나에 있어서, 인간화된 Z199 항체인 인간화된 항체.

53. 구체예 52에 있어서, Z199VL 도메인(SEQ ID NO:2)의 아미노산 잔기 Y31, L49, 및 P94, 및 Z199VL 도메인(SEQ ID NO:4)의 아미노산 잔기 Y57, Y102, 및 P103을 포함하는 인간화된 항체.

54. 구체예 52 또는 53에 있어서, 가변 중쇄(VH) 또는 가변 경쇄(VL) 도메인에 적어도 하나의 역돌연변이를 포함하는 인간화된 항체.

55. 구체예 52-54 중 어느 하나에 있어서, Z199 VL 도메인의 아미노산 잔기 P45를 포함하는 인간화된 항체.

56. 구체예 52-55 중 어느 하나에 있어서, Z199 VL 도메인의 아미노산 잔기 24-33, 49-55, 및 88-96, 및 Z199 VH 도메인의 아미노산 잔기 31-35, 50-60, 62, 64, 66, 및 99-108를 포함하는 인간화된 항체.

57. 구체예 52-56 중 어느 하나에 있어서, CDR_L1에 삽입된 아미노산을 포함하는 인간화된 항체.

58. 구체예 57에 있어서, 삽입된 아미노산이 Z199 VL 도메인의 잔기 30과 31 사이에 삽입된 세린(S)인 인간화된 항체.

59. 구체예 52-58 중 어느 하나에 있어서, Z199 VL 도메인의 아미노산 잔기 Q1, W46, V57 및 S69 중 하나 이상, 및/또는 Z199 VH 도메인의 아미노산 잔기 A49, T78 및 T97 중 하나 이상을 포함하는 인간화된 항체.

60. (a) SEQ ID NO:5를 포함하는 CDR-L1;

(b) SEQ ID NO:6를 포함하는 CDR-L2;

(c) SEQ ID NO:7를 포함하는 CDR-L3;

(d) SEQ ID NO:8를 포함하는 CDR-H1;

(e) SEQ ID NO:9를 포함하는 CDR-H2;

(f) SEQ ID NO:10을 포함하는 CDR-H3;

(g) 인간 스캐폴드 서열; 및

(h) Kabat 위치 46의 프롤린(P) 잔기

를 포함하는, 인간 CD94/NKG2A 수용체와 결합하는 분리된 항체.

61. 구체예 47-60 중 어느 하나에 있어서, 선택적으로 S241 P 돌연변이를 포함하는, IgG4 불변 영역을 포함하는 항체.

62. 구체예 47-60 중 어느 하나에 있어서, 항원-결합 항체 단편인 항체.

63. 구체예 47-60 중 어느 하나에 있어서, 제 2 제제에 콘쥬게이트 또는 융합된 항체.

64. 구체예 63에 있어서, PEG와 같은 돌출기, 세포독성제, 검출가능한 마커 및 표적화제로부터 제 2 제제가 선택되는 항체.

65. 구체예 47-64 중 어느 하나에 있어서, 제약으로서 사용되는 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편.

66. 구체예 47-64 중 어느 하나에 있어서, 악성 신생물, 바이러스 감염, 염증성 장애, 및/또는 자가면역 질환의 치료에 사용되는 항체.

67. 구체예 47-64 중 어느 하나에 있어서, 인간 환자에서 세포 표면에서 발현되는 CD94/NKG2A 수용체의 억제 활성을 감소시키는데 사용되는 항체.

68. 구체예 47-64 중 어느 하나에 있어서, 인간 환자에서 CD94/NKG2A-발현 세포의 세포-사멸 활성을 강화하는데 사용되는 항체.

69. 구체예 47-64 중 어느 하나에 있어서, 인간 환자에서 HLA-E 발현 표적 세포의 사멸을 유도하는데서 사용되는 항체.

70. 구체예 47-64 중 어느 하나의 항체 및 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.

71. 구체예 47-64 중 어느 하나에 따른 항체를 암호화하는 핵산 단편.

72. 구체예 70에 있어서, DNA 및 RNA 단편인 핵산 단편.

73. 구체예 71 또는 72의 핵산 단편을 포함하는 벡터.

74. 구체예 73에 있어서, 클로닝 벡터 및 발현 벡터인 벡터.

75. 구체예 71 또는 72의 핵산 단편 또는 구체예 73 또는 74의 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포.

76. 구체예 75에 있어서,

(a) 중쇄와 경쇄 아미노산 서열의 코딩 영역을 모두 포함하며, 상기 코딩 영역들이 동일한 또는 상이한 조절성 유전자 요소의 제어 하에 있는, 구체예 71 또는 72에 따른 하나의 핵산 단편, 또는

(b) 하나는 경쇄 아미노산 서열을 암호화하고, 나머지 하나는 중쇄 아미노산 서열을 암호화하는, 구체예 71 또는 72에 따른 2개의 분리된 핵산 단편

을 포함하는 형질전환된 세포.

77. 구체예 75 또는 76에 있어서, 핵산 단편(들)을 발현하는 형질전환된 숙주 세포.

78. 구체예 76 및 77 중 어느 하나의 형질전환된 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법은 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 암호화하는 구체예 73 또는 74의 벡터로, 또는 하나는 중쇄 아미노산 서열을 암호화하고, 나머지 하나는 경쇄 아미노산 서열을 암호화하는 구체예 73 또는 74에 따른 2개의 상이한 벡터로 숙주 세포를 트랜스펙션 또는 형질감염시키는 단계를 포함하는 방법.

79. 구체예 47-64 중 어느 하나의 항체의 제조 방법으로서, 상기 방법은 핵산 단편(들)의 발현을 촉진하는 조건 하에서 구체예 75-77 중 어느 하나에 따른 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 선택적으로 생산된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 방법.

80. 치료를 요하는 인간 환자에서 악성 신생물, 바이러스 감염, 염증성 장애 및 자가면역 장애를 치료 또는 완화하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 인간 환자에게 구체예 47-64 중 어느 하나의 항체 또는 구체예 70에 따른 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.

81. 구체예 80에 있어서, 상기 악성 신생물이 편평세포암종, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 유모세포 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 급성 또는 만성 골수성 백혈병, 전골수성 백혈병, 섬유육종, 횡문근육종; 흑색종, 기형암종, 수암 신경모세포종, 신경아교종, 성상세포종, 신경모세포종, 신경아교종, 신경초종, 섬유육종, 횡문근육종, 골육종, 흑색종, 색소성 피부건조증, 각화극세포증, 고환종, 갑상선여포암, 기형암종, 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 전립선, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선 또는 피부의 기타 암종, 림프 계통의 기타 조혈계 종양, 골수 계통의 기타 조혈계 종양, 간엽 기원의 기타 종양, 중추신경계 또는 말초신경계의 기타 종양, 또는 간엽 기원의 기타 종양으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.

82. 구체예 81에 있어서, 악성 신생물이 다발성 골수종, 비호지킨 림프종 및 급성 골수성 림프종으로부터 선택되는 방법.

83. 구체예 80에 있어서, 상기 자가면역 장애가 용혈성 빈혈, 악성빈혈, 전층동맥염, 전신 홍반성 루프스, 베게너 육아종증, 자가면역 간염, 베체트병, 크론병, 원발성 담도경화증, 피부경화증, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 타입 1 당뇨병, 포도막염, 그레이브스병, 알츠하이머병, 갑상선염, 심근염, 류마티스열, 피부경화증, 강직성 척추염, 류마티스 관절염, 사구체신염, 유육종증, 피부근염, 중증 근무력증, 다발성 근염, 길랑바레 증후군, 다발성 경화증, 원형탈모증, 수포창/유천포창, 수포성 유천포창, 하시모토 갑상선염, 건선 및 백반증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.

84. 구체예 80에 있어서, 상기 염증성 장애가 부신염, 폐포염, 혈관담낭염, 맹장염, 귀두염, 안검염, 기관지염, 윤활낭염, 심장염, 봉와직염, 자궁경부염, 담낭염, 성대염, 코클리티스, 대장염, 결막염, 방광염, 피부염, 게실염, 뇌염, 심장내막염, 식도염, 유스타키오관염, 결합조직염, 모낭염, 위염, 위장염, 치은염, 설염, 간비장염, 각막염, 내이염, 후두염, 임파선염, 유방염, 중이염, 뇌막염, 자궁염, 점액증, 심근염, 근염, 고막염, 신염, 신경염, 고환염, 골연골염, 이염, 심낭염, 건주위염, 복막염, 인두염, 정맥염, 급성 회백수염, 전립선염, 치수염, 망막염, 비염, 난관염, 공막염, 결공막염, 음낭염, 부비동염, 척추염, 황색지방증, 구내염, 활액막염, 이관염, 건염, 편도선염, 요도염 및 질염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.

85. 구체예 80에 있어서, 상기 바이러스 감염이 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 바리셀라, 아데노바이러스, 헤르페스심플렉스 타입 1(HSV-1), 헤르페스심플렉스 타입 2(HSV-2), 우역, 리노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 유두종 바이러스, 유두종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 에치노바이러스, 아보바이러스, 헌타바이러스, 콕사키바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 루벨라바이러스, 폴리오 바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스 타입 1 또는 2(HIV-1, HIV-2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.

여기 인용된 출판물, 특허출원 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은 각 참고문헌이 참고로서 포함되는 것을 개별적으로 그리고 구체적으로 나타낸 정도까지 그리고 전문으로 제시된 정도까지 본원에 참고자료로서 포함된다. 본원에서 특허 문헌의 인용이나 포함은 편의를 위한 것일 뿐이며, 이들의 유효성, 특허성 및/또는 강제성을 어떤 측면으로도 반영하지 않는다.

모든 표제와 부제는 편의를 위해서 사용되며, 어떤 식으로도 본 발명을 제한하지 않는다.

상기 설명된 요소들의 그것의 모든 가능한 변형의 어떤 조합도 본원에 달리 지시되거나 문맥상 분명히 모순되지 않는다면 본 발명에 포함된다.

본 발명을 설명하는 문맥에서 사용된 용어 "한", 및 "그" 및 유사한 단수형은 본원에 달리 지시되거나 문맥상 분명히 모순되지 않는다면 단수 및 복수를 모두 포함한다.

본원에서 달리 지시되지 않는다면 본원에서 수치 범위의 서술은 단순히 범위에 들어가는 각 개별 값을 개별적으로 언급하는 것의 속기 방법으로서만 소용되도록 의도되며, 각 개별 값은 그것이 본원에 개별적으로 인용된 것과 마찬가지로 본 명세서에 포함된다. 달리 말하지 않는다면, 본원에서 제공된 모든 정확한 값들은 상응하는 대략적인 값을 표시한다(예를 들어, 특정 인자 또는 측정과 관련하여 제공된 모든 정확한 예시적인 값들은 적합한 경우, "약"이라는 수식어와 함께 상응하는 대략적인 측정치도 제공하도록 고려될 수 있다).

여기 설명된 모든 방법은 달리 지시되거나 문맥상 분명히 모순되지 않는다면 어떤 적합한 순서로도 수행될 수 있다.

본원에서 제공된 임의의 및 모든 예들, 또는 예시적인 말(예를 들어, "와 같은")의 사용은 단순히 본 발명을 더 잘 예시하려는 의도이며, 달리 언급되지 않는다면 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서의 말은 훨씬 명백히 서술되지 않는다면 어떤 요소가 본 발명의 실시에 필수적임을 나타내는 것으로서 구성되지는 않는다.

요소 또는 요소들과 관련하여 "포함하는", "가지는", "비롯한" 또는 "함유하는"과 같은 용어들을 사용하여 본 발명의 어떤 양태나 구체예를 설명한 것은 달리 언급되거나 문맥상 분명히 모순되지 않는다면 그 특정 요소 또는 요소들"로 구성되는", "로 본질적으로 구성되는" 또는 "실질적으로 포함하는" 본 발명의 유사한 양태나 구체예에 대한 뒷받침을 제공하도록 의도된다(예를 들어, 특정 요소를 포함한다고 설명된 조성물은 달리 언급되거나 문맥상 분명히 모순되지 않는다면 또한 그 요소로 구성되는 조성물을 설명한다고 이해되어야 한다).

본 발명은 이용가능한 법에 의해 허용되는 최대 범위까지 본원에 제시된 양태 또는 청구항들에 인용된 대상의 모든 변형 및 동등물을 포함한다.

SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> HUMANIZED ANTI-HUMAN NKG2A MONOCLONAL ANTIBODY <130> 7655.204-WO <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 caaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcgt ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatttact ggtaccagca gaagccaaga 120 tcctccccca aaccctggat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtggtaacc cgtacacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaacg g 321 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 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Claims (17)

1. (a) CD94/NKG2A-발현 림프구의 표면에서 발현되는 인간 CD94/NKG2A 수용체의 세포외 부분에 결합하고;
   (b) 인간 CD94/NKG2A 수용체의 억제 활성을 감소시키고; 및
   (c) 인간 CD94/NKG2A 수용체와의 결합에서 HLA-E와 경쟁하지 않는 분리된 인간 또는 인간화된 항-NKG2A 항체.
2. 제 1 항에 있어서, 인간 CD94/NKG2C보다 적어도 100-배 더 낮은 KD로 CD94/NKG2A에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
3. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CD94/NKG2A 수용체와의 결합에서 Z199 항체와 경쟁하는 것을 특징으로 하는 항체.
4. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, Z199 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
5. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 잔기 P94-N107, M189-E197, 또는 이들 모두를 포함하는 NKG2A(SEQ ID NO:11)의 세그먼트에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
6. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, NKG2A(SEQ ID NO:11)의 P94, S95, T96, L97, I98, Q99, R100, H101, L106, M189, 또는 E197로부터 선택된 잔기, 또는 이들의 어떤 조합을 포함하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
7. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 Z199 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
8. 제 7 항에 있어서, Z199 가변 경쇄(VL) 도메인(SEQ ID NO:2)의 아미노산 잔기 Y31, L49 및 P94와 Z199 가변 중쇄(VH) 도메인(SEQ ID NO:4)의 아미노산 잔기 Y57, Y102 및 P103을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, VL 또는 VH 도메인 프레임 워크 서열에 적어도 하나의 역돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
10. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, Z199 VL 도메인의 아미노산 잔기 P45를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
11. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, Z199 VL 도메인의 아미노산 잔기 24-33, 49-55 및 88-96과 Z199 VH 도메인의 아미노산 잔기 31-35, 50-60, 62, 64, 66 및 99-108를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
12. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, Z199 VL 도메인의 잔기 30과 31 사이에 삽입된 세린(S)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
13. 인간 CD94/NKG2A 수용체에 결합하고,
    (a) SEQ ID NO:5를 포함하는 CDR-L1;
    (b) SEQ ID NO:6를 포함하는 CDR-L2;
    (c) SEQ ID NO:7를 포함하는 CDR-L3;
    (d) SEQ ID NO:8를 포함하는 CDR-H1;
    (e) SEQ ID NO:9를 포함하는 CDR-H2;
    (f) SEQ ID NO:10을 포함하는 CDR-H3;
    (g) 인간 VL 및 VH 프레임워크 영역; 및
    (h) VL 도메인의 Kabat 위치 46에 프롤린(P) 잔기
    를 포함하는 분리된 항체.
14. 제 13 항에 있어서, 선택적으로 S241P 돌연변이를 포함하는, 인간 IgG4 불변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
15. 전술한 항들 중 어느 한 항에 따른 항체와 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
16. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 악성 신생물, 바이러스 감염, 염증성 장애, 및/또는 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 항체.
17. 핵산 단편(들)의 발현을 촉진하는 조건 하에서 항체를 암호화하는 핵산 단편을 포함하는 하나 이상의 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 선택적으로 생산된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 제조 방법.
    
    

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