JPH03112487A - ＨＬＡ―Ｂｗ５３遺伝子およびＤＮＡプローブ並びに形質転換細胞 - Google Patents
ＨＬＡ―Ｂｗ５３遺伝子およびＤＮＡプローブ並びに形質転換細胞Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はＨＬＡ−Ｂｗ５３遺伝子およびＤＮＡプローブ
並びに形質転換細胞に関し、特にはＨＬ Ａ （ｈｕｎ
＋ａｎ Ｉｅｕｋｏｃｙｔｏ ａｎｔｉｇｅｎ） −Ｂ
Ｗ ５３抗原のアロタイプをコードするＤＮＡおよび
ＤＮＡタイピングで患者のクラスＩ遺伝子そのものを取
り出して同定する際に使用されるＤＮＡプローブ並びに
本発明のＤＮＡをヒト以外の真核細胞に導入することに
よりその細胞表面上にＨＬＡ−Ｂｗ５３抗原のアロタイ
プを発現した形質転換細胞に関する。ＨＬＡ−Ｂｗ５３
アロ抗原を発現した細胞は免疫原として動物に投与する
ことが可能であるためＨＬＡ−Ｂｗ５３抗原に特異性を
有するモノクローナル抗体の開発に有用である。さらに
、ヒトの真核細胞へ本発明の遺伝子を導入しＨＬＡ−Ｂ
ｗ５３抗原を発現した細胞は抗血清の特異性判定に使用
されるパネル細胞（ｐａｎｅｌ ｃａｌ！ ）として有
用である。
並びに形質転換細胞に関し、特にはＨＬ Ａ （ｈｕｎ
＋ａｎ Ｉｅｕｋｏｃｙｔｏ ａｎｔｉｇｅｎ） −Ｂ
Ｗ ５３抗原のアロタイプをコードするＤＮＡおよび
ＤＮＡタイピングで患者のクラスＩ遺伝子そのものを取
り出して同定する際に使用されるＤＮＡプローブ並びに
本発明のＤＮＡをヒト以外の真核細胞に導入することに
よりその細胞表面上にＨＬＡ−Ｂｗ５３抗原のアロタイ
プを発現した形質転換細胞に関する。ＨＬＡ−Ｂｗ５３
アロ抗原を発現した細胞は免疫原として動物に投与する
ことが可能であるためＨＬＡ−Ｂｗ５３抗原に特異性を
有するモノクローナル抗体の開発に有用である。さらに
、ヒトの真核細胞へ本発明の遺伝子を導入しＨＬＡ−Ｂ
ｗ５３抗原を発現した細胞は抗血清の特異性判定に使用
されるパネル細胞（ｐａｎｅｌ ｃａｌ！ ）として有
用である。
ＨＬＡ抗原はヒトの臓器移植の際、移植片の定着の可否
を決定する抗原として移植免疫に重要な役割を果たして
いる。この中でクラスＩ抗原は、細胞性免疫において細
胞傷害性Ｔ細胞による抗原認識に関与すると共に、尋常
性乾ｍ＜ｃＷ６）、天泡疹（ＡＩＯ） 、口座ヘルペス
（Ａ ２９） 。
を決定する抗原として移植免疫に重要な役割を果たして
いる。この中でクラスＩ抗原は、細胞性免疫において細
胞傷害性Ｔ細胞による抗原認識に関与すると共に、尋常
性乾ｍ＜ｃＷ６）、天泡疹（ＡＩＯ） 、口座ヘルペス
（Ａ ２９） 。
ベーチェット（Ｂ５７）などの疾患との有意な相関が明
らかにされている。（Ｏｚａｗａ、 Ａ、 、 ０ｈｋ
ｉｄｏ。
らかにされている。（Ｏｚａｗａ、 Ａ、 、 ０ｈｋ
ｉｄｏ。
Ｍ、＋Ｔｓｕｊｉ＋に、Ｊ、Ａｍ、Ａｃａｄ、Ｄｅｒｍ
ａｔｏ１＋１．２０５．１９８１）ＨＬＡ抗原は拒絶現
象や移植免疫に深く関連することから主要組織適合抗原
とも呼ばれ、それをコードする遺伝子群は主要ｉｌｌ織
適合性遺伝子複合体（ＭＭＣ）と呼ばれる。
ａｔｏ１＋１．２０５．１９８１）ＨＬＡ抗原は拒絶現
象や移植免疫に深く関連することから主要組織適合抗原
とも呼ばれ、それをコードする遺伝子群は主要ｉｌｌ織
適合性遺伝子複合体（ＭＭＣ）と呼ばれる。
ＨＬＡはヒトのＭＭＣであり、ＨＬＡクラスＩ抗原は細
胞膜上に存在する膜タンパク質であって、Ａ、Ｂ、Ｃの
３つの遺伝子座に支配されている。クラスＩ抗原は分子
１４４ｋｄの糖タンパク（α鎖）が分子量１２ｋｄのタ
ンパク質（Ｂ２−ミクログロブリン）と非共有結合によ
って会合した構造を持ち、α鎖は細胞外に位置するＮ末
端側に、Ｂ１．Ｂ２゜Ｂ３の３個のドメインがあり、次
いで細胞内に埋め込まれた領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒ
ａｎｅ Ｒｅｇｉｏｎ） 、細胞内に位置する領域（ｃ
ｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍｅｉｎ）が並んでいる。
胞膜上に存在する膜タンパク質であって、Ａ、Ｂ、Ｃの
３つの遺伝子座に支配されている。クラスＩ抗原は分子
１４４ｋｄの糖タンパク（α鎖）が分子量１２ｋｄのタ
ンパク質（Ｂ２−ミクログロブリン）と非共有結合によ
って会合した構造を持ち、α鎖は細胞外に位置するＮ末
端側に、Ｂ１．Ｂ２゜Ｂ３の３個のドメインがあり、次
いで細胞内に埋め込まれた領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒ
ａｎｅ Ｒｅｇｉｏｎ） 、細胞内に位置する領域（ｃ
ｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍｅｉｎ）が並んでいる。
Ｂ２−ミクログロブリンは１つのドメインからなり、α
鎖に結合している。
鎖に結合している。
ＨＬＡ遺伝子領域はヒト第６染色体短腕上に２．５セン
チモルガン（ｃＭ）の距離に亘って存在し、セントロメ
アーの側からクラスＩＩ Ｓｆｆ域（１，ＯｃＭ）、ク
ラスＩ［［ｊＪｔＪ！１ｉ（ＤＲ−Ｂ間＝０．７ｃＭ）
、クラスＩ ｅＩ域（０，８ｃ Ｍ ）の順に並んでい
る。
チモルガン（ｃＭ）の距離に亘って存在し、セントロメ
アーの側からクラスＩＩ Ｓｆｆ域（１，ＯｃＭ）、ク
ラスＩ［［ｊＪｔＪ！１ｉ（ＤＲ−Ｂ間＝０．７ｃＭ）
、クラスＩ ｅＩ域（０，８ｃ Ｍ ）の順に並んでい
る。
（Ｊｏｒｄａｎ、Ｂ、Ｒ，ｅｔ ａｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ
、Ｒｅｖ、、８４．７３＋１９８５）ＨＬＡクラスＩ抗
原を検査する方法は、血清学的方法および組み換えＤＮ
Ａ技術にょるＨＬＡ−ＤＮＡ ｔｙｐｉｎｇがある。
、Ｒｅｖ、、８４．７３＋１９８５）ＨＬＡクラスＩ抗
原を検査する方法は、血清学的方法および組み換えＤＮ
Ａ技術にょるＨＬＡ−ＤＮＡ ｔｙｐｉｎｇがある。
血清学的方法としては、補体依存性細胞障害性試験（Ｔ
ｅｒａｓａｋｉ、Ｐ、１． 、ａｎｄ ＭｃＣｌａｌｌ
ａｎｄ、Ｊ、Ｄ。
ｅｒａｓａｋｉ、Ｐ、１． 、ａｎｄ ＭｃＣｌａｌｌ
ａｎｄ、Ｊ、Ｄ。
Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） 、 ２０４．ｐｐ９
９８−１０００．１９６４ ）が標準的な手法である。
９８−１０００．１９６４ ）が標準的な手法である。
この方法はアロ抗血清を用い、家兎の血清を補体として
リンパ球細胞毒（ｌｙｍｐｏｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ
）によりＨＬＡをタイプする方法であるが、抗血清が
多産妊婦のアロ血清であること、および、抗血清は交差
反応性（ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を示しＨＬＡ
クラスｌアロタイプに単一特異的に反応するものが得難
いこと、さらに、抗血清はヒトから入手するため再現性
ある血清の安定供給は不可能であること、発現量の少な
いアロ抗原に対する抗血清は得られないことからアロ血
清に替わるモノクローナル抗体の開発が望まれている。
リンパ球細胞毒（ｌｙｍｐｏｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ
）によりＨＬＡをタイプする方法であるが、抗血清が
多産妊婦のアロ血清であること、および、抗血清は交差
反応性（ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を示しＨＬＡ
クラスｌアロタイプに単一特異的に反応するものが得難
いこと、さらに、抗血清はヒトから入手するため再現性
ある血清の安定供給は不可能であること、発現量の少な
いアロ抗原に対する抗血清は得られないことからアロ血
清に替わるモノクローナル抗体の開発が望まれている。
１９８４年の国際組織適合性ワークショップで、およそ
１５０種のモノクローナル抗体が提出されている。 （
Ｐａｕｃｈｅｔ。
１５０種のモノクローナル抗体が提出されている。 （
Ｐａｕｃｈｅｔ。
Ｒ，、Ｂｏｎｄｅｒ＋Ｊ、Ｇ、、Ｋｅｎｎｅｄｙ、Ｌ、
Ｊ、ｅｔ ａｌ、： ＨＬ ＡＡ、 Ｂ、 Ｃｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、 Ｈｉｓｔ。
Ｊ、ｅｔ ａｌ、： ＨＬ ＡＡ、 Ｂ、 Ｃｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、 Ｈｉｓｔ。
ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ １９８
４ （Ａｌｂｅｒｔ、Ｅ、Ｄ、。
４ （Ａｌｂｅｒｔ、Ｅ、Ｄ、。
Ｂａｕｒ＋ Ｍ、Ｐ、、Ｍａｙｒ、Ｗ、Ｒ，ｅｄ、）＋
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ。
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ。
Ｂｅｒｌｉｎ、Ｈｅｉｄａｌｂｅｒｇ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ、Ｔｏｋｙｏ： ２１１．１９８４）抗ＨＬＡモ
ノクローナル抗体の作成は、一般にヒトのリンパ球をマ
ウスに免疫して得られた牌細胞とマウス骨髄腫細胞を融
合させる方法を用いることができる。 （Ｏｆ＋Ｖ、Ｔ
、＋Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、Ｌ、Ａ、：Ｉｍｍｕｎｏｇ
ｌｏｂｕｌｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ
ｃｅｌｌ １ｉｎｅｓ。
ｒｋ、Ｔｏｋｙｏ： ２１１．１９８４）抗ＨＬＡモ
ノクローナル抗体の作成は、一般にヒトのリンパ球をマ
ウスに免疫して得られた牌細胞とマウス骨髄腫細胞を融
合させる方法を用いることができる。 （Ｏｆ＋Ｖ、Ｔ
、＋Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、Ｌ、Ａ、：Ｉｍｍｕｎｏｇ
ｌｏｂｕｌｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ
ｃｅｌｌ １ｉｎｅｓ。
５ｅｌｅｃｔｅｄ ５ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ、 ３５１＋１９８１）しかしながら、現在
まででモノクローナル抗体のうちでＨＬＡタイピングに
適した抗体−たとえばＨＬＡ−Ｂ抗原のアロタイプに対
するモノクローナル抗体を例にとると、Ｂｗ４，３ｗ６
゜Ｂ７．Ｂ８．Ｂ１３．Ｂ２７に単一特異的に結合する
モノクローナル抗体しか得られていない状況にあり、他
の多数のアロタイプに単一特異性を有するモノクローナ
ル抗体の開発が期待されている。また、現在まだ反応性
を有するモノクローナル抗体すら得られていないアロ抗
原が多数存在している。このようなアロ抗原については
他のアロ抗原と交差反応性を有するモノクローナル抗体
も有効である。最近さらに抗ＨＬＡモノクローナル抗体
作製方法の改善が成された。
ｏｌｏｇｙ、 ３５１＋１９８１）しかしながら、現在
まででモノクローナル抗体のうちでＨＬＡタイピングに
適した抗体−たとえばＨＬＡ−Ｂ抗原のアロタイプに対
するモノクローナル抗体を例にとると、Ｂｗ４，３ｗ６
゜Ｂ７．Ｂ８．Ｂ１３．Ｂ２７に単一特異的に結合する
モノクローナル抗体しか得られていない状況にあり、他
の多数のアロタイプに単一特異性を有するモノクローナ
ル抗体の開発が期待されている。また、現在まだ反応性
を有するモノクローナル抗体すら得られていないアロ抗
原が多数存在している。このようなアロ抗原については
他のアロ抗原と交差反応性を有するモノクローナル抗体
も有効である。最近さらに抗ＨＬＡモノクローナル抗体
作製方法の改善が成された。
この方法は、ヒトのＴＩＪンパ球優位の末梢リンパ球を
免疫原として用いた抗体産生法では、ヒト由来の抗原が
多数存在するために目的とするＨＬＡアロタイプの抗原
以外の多数の抗原部位に対し反応性を示すモノクローナ
ル抗体が得られる点を改善したものであり、免疫動物由
来の真核細胞にヒ）ＨＬＡ抗原遺伝子クローンを導入し
て形質転換した細胞を免疫動物に投与することで形質転
換細胞上に発現したヒ）ＨＬＡ抗原に対するモノクロー
ナル抗体を効率良 く産生ずる牌細胞を得る方法である
。（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ
ＨＬ Ａ −Ｄ Ｐ −ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｍｏ
ｕｓｅ Ｌ ｃｅｌｌ： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ｔｌｓＡ＋８３、ｐｐ ３４１
７−３４２１．１９８６）ＨＬＡクラスＩ抗原アロタイ
プに特異性を有する抗血清、モノクローナル抗体が得ら
れていないものについてはＤＮＡタイピングが有力な検
査方法である。尋常性乾廖はＨＬＡクラス！抗原である
０ｗ６，０ｗ７に非常に高い相関を示す疾患として知ら
れているａ （Ｏｚａｗａ ｅＬ ａｌ、：Ｓｏｍｅ
ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ＨＬ Ａ
ａｎｄ ５ｋｉｎｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｊ、Ａｍ、Ａｃａ
ｄ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、 ４＋ ２０５＋１９８１）
そこでＯｚａｗａらはＣ抗原遺伝子クローンＰ４２（Ｓ
ｏｄｏｙｅｒ、Ｒ，ｅｔ ａｌ、、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ
ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎ
ａｌｈｕｍａｎ ｃｌａｓｓ Ｉ ｈｉｓｔｏ ｃｏｍ
ｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ−Ｃｗ
３ ） 、 ＥＭＢＯＪ、、３ ；８７９．１９８４
）のＰｖｕ Ｕフラグメントをプローブとして０ｗ６゜
０ｗ７を有する尋常性乾ｆｆ１２１名と健常人１６名に
ついてＤＮＡタイピングを実施した。 （Ｏｚａｗａ。
免疫原として用いた抗体産生法では、ヒト由来の抗原が
多数存在するために目的とするＨＬＡアロタイプの抗原
以外の多数の抗原部位に対し反応性を示すモノクローナ
ル抗体が得られる点を改善したものであり、免疫動物由
来の真核細胞にヒ）ＨＬＡ抗原遺伝子クローンを導入し
て形質転換した細胞を免疫動物に投与することで形質転
換細胞上に発現したヒ）ＨＬＡ抗原に対するモノクロー
ナル抗体を効率良 く産生ずる牌細胞を得る方法である
。（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ
ＨＬ Ａ −Ｄ Ｐ −ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｍｏ
ｕｓｅ Ｌ ｃｅｌｌ： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ｔｌｓＡ＋８３、ｐｐ ３４１
７−３４２１．１９８６）ＨＬＡクラスＩ抗原アロタイ
プに特異性を有する抗血清、モノクローナル抗体が得ら
れていないものについてはＤＮＡタイピングが有力な検
査方法である。尋常性乾廖はＨＬＡクラス！抗原である
０ｗ６，０ｗ７に非常に高い相関を示す疾患として知ら
れているａ （Ｏｚａｗａ ｅＬ ａｌ、：Ｓｏｍｅ
ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ＨＬ Ａ
ａｎｄ ５ｋｉｎｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｊ、Ａｍ、Ａｃａ
ｄ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、 ４＋ ２０５＋１９８１）
そこでＯｚａｗａらはＣ抗原遺伝子クローンＰ４２（Ｓ
ｏｄｏｙｅｒ、Ｒ，ｅｔ ａｌ、、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ
ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎ
ａｌｈｕｍａｎ ｃｌａｓｓ Ｉ ｈｉｓｔｏ ｃｏｍ
ｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ−Ｃｗ
３ ） 、 ＥＭＢＯＪ、、３ ；８７９．１９８４
）のＰｖｕ Ｕフラグメントをプローブとして０ｗ６゜
０ｗ７を有する尋常性乾ｆｆ１２１名と健常人１６名に
ついてＤＮＡタイピングを実施した。 （Ｏｚａｗａ。
Ａ、ｅｔ ａｔ ： Ｄ Ｎ Ａ ｔｙｐｉｎｇ
ｉｎ ｐｓｏｒｉａｓｉｓＶｕｌｇａｒｉｓ、 Ｉｎ：
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ３ ｒｄ Ａ
ｓ１ａＯｃｅａｎｉａ Ｈ３ｓｔｏｃｏｓｐａｔｉｂｉ
ｌｉｔｙ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄＣｏｎｆｅｒｅｎ
ｃｅ＋ ｉｎ ｐｒｅｓｓ）その結果、シグナル配列、
α１ドメインα２ドメインの一部に相当するＰｖｕ Ｉ
Ｉ １．７ｋｂフラグメントをプローブとしたとき
に患者に特異的なバンドを検出した。
ｉｎ ｐｓｏｒｉａｓｉｓＶｕｌｇａｒｉｓ、 Ｉｎ：
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ３ ｒｄ Ａ
ｓ１ａＯｃｅａｎｉａ Ｈ３ｓｔｏｃｏｓｐａｔｉｂｉ
ｌｉｔｙ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄＣｏｎｆｅｒｅｎ
ｃｅ＋ ｉｎ ｐｒｅｓｓ）その結果、シグナル配列、
α１ドメインα２ドメインの一部に相当するＰｖｕ Ｉ
Ｉ １．７ｋｂフラグメントをプローブとしたとき
に患者に特異的なバンドを検出した。
従来の技術においては、単離され塩基配列の特定された
ＨＬＡ遺伝子が数多く得られていないため、ＨＬＡ抗原
アロタイプの解析、ＤＮＡタイピングの通用に制限を受
けていた。また、抗ＨＬＡモノクローナル抗体を作成す
るための良い免疫原が少なかった。
ＨＬＡ遺伝子が数多く得られていないため、ＨＬＡ抗原
アロタイプの解析、ＤＮＡタイピングの通用に制限を受
けていた。また、抗ＨＬＡモノクローナル抗体を作成す
るための良い免疫原が少なかった。
本発明はこのような事情に着目してなされたもので、新
規なＨＬＡ−Ｂｗ５３遺伝子およびＤＮＡプローブ並び
に形質転換細胞を提供することを目的とする。
規なＨＬＡ−Ｂｗ５３遺伝子およびＤＮＡプローブ並び
に形質転換細胞を提供することを目的とする。
〔課題を解決するための手段及び作用〕発明者はＨＬＡ
に関する研究を続けた結果、ＨＬＡ−Ｂｗ５３遺伝子の
単離に成功し、本発明を完成させた。
に関する研究を続けた結果、ＨＬＡ−Ｂｗ５３遺伝子の
単離に成功し、本発明を完成させた。
本発明のＨＬ Ａ −Ｂ ｗ ５３遺伝子は下記の塩基
配列で表わされるエクソンを有する。
配列で表わされるエクソンを有する。
ＡＴＧＣＧＧＧＴＣＡＣＧＧＣＧＣＣＣＣＧ＾八ＣＣＧ
ＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧへＧＧＧＧＣＡＧＴ
ＧＧＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＧＧＣ
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ＡＴＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＡＴＴ
ＧＧＧＡＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡ丁ＣＴＴＣＡＡ
ＧＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＧ
ＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＴＣＧＣＧＣＴＣＣＧＣＴＡＣＴ
ＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＧＧＴＣＴＣＡ
ＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＡＴＧＧＣＴＧＣ
ＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＣＣＧＡＣＧＧＧＣＧＣＣＴＣＣ
ＴＣＣＧＣＧＧＧＣＡＴＧＡＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡ
ＣＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＴＴＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧ
ＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＧ
ＣＧＧＣＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＣ
ＣＣＡＧＣＧＣＡＡＧＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＣＧＴ
ＧＴＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＧＧＧＣＣＴＡＣＣ
ＴにＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴ
ＣＣＧＣＡＧＡＴＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧ
ＧＡＧＡＣＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＣＧＧＡＣＣＣＣＣ
ＣＡＡＡＧＡＣＡＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣ
ＣＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧ
ＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣ
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ＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＣＡＴＧＣＣ
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ＧＴＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＧＴＧＡＴＧＴＧＴＡＧＧＡ
ＧＧＡＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧ
ＧＡＧＣＴＡＣＴＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＴＣＣＡＧＣ
ＧＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴ
ＣＴＣＴＣＡＣＡＧＣＴＴＧ＾ 上記塩基配列およびこの明細書の特許請求の範囲１発明
の詳細な説明に記載した塩基配列では、Ａはアデニン、
Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを示す。
ＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧへＧＧＧＧＣＡＧＴ
ＧＧＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＧＧＣ
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ＣＧＧＣＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＣ
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ＣＴＣＴＣＡＣＡＧＣＴＴＧ＾ 上記塩基配列およびこの明細書の特許請求の範囲１発明
の詳細な説明に記載した塩基配列では、Ａはアデニン、
Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを示す。
本発明のＨＬＡ−Ｂｗ５３遺伝子の塩基配列の一部に一
致するｃＤＮＡは、マーカー物質を標識してＤＮＡタイ
ピングに使用されるＤＮＡプローブに応用できる。マー
カー物質としては、ベルオキシラーゼ。鉄ポルフィリン
誘導体、ルシフェラーゼ等の発光物質、蛍光物質、２．
３−ブタジオン等のリン光物質およびｓｚ ｐ 、 ｓ
ｓ ３等の放射性物質が一般的に使用される。これらの
マーカー物質およびマーカー物質を１本ＭＤＮＡに標識
する方法は公知であるｅ （ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗ
Ｂｉｏｐｈｙｓ。Ｂｉｏｅｎｇ、ｐｐ１７５−１９５
． （１９８１） 。
致するｃＤＮＡは、マーカー物質を標識してＤＮＡタイ
ピングに使用されるＤＮＡプローブに応用できる。マー
カー物質としては、ベルオキシラーゼ。鉄ポルフィリン
誘導体、ルシフェラーゼ等の発光物質、蛍光物質、２．
３−ブタジオン等のリン光物質およびｓｚ ｐ 、 ｓ
ｓ ３等の放射性物質が一般的に使用される。これらの
マーカー物質およびマーカー物質を１本ＭＤＮＡに標識
する方法は公知であるｅ （ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗ
Ｂｉｏｐｈｙｓ。Ｂｉｏｅｎｇ、ｐｐ１７５−１９５
． （１９８１） 。
Ｒｉｇｂｙ ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、
１１３，２３７．（１９７７））このＨＬＡ−Ｂｗ５３
遺伝子はＨＬＡ−Ｂｗ５３抗原をコードするので真核細
胞に導入することによりＨＬＡ−Ｂｗ５３抗原を発現す
る形質転換細胞を得ることができる。
１１３，２３７．（１９７７））このＨＬＡ−Ｂｗ５３
遺伝子はＨＬＡ−Ｂｗ５３抗原をコードするので真核細
胞に導入することによりＨＬＡ−Ｂｗ５３抗原を発現す
る形質転換細胞を得ることができる。
本発明を実施例に基いて説明する。
ＨＬＡ−Ｂｗ５３の
染色体ＤＮＡの分離
ＨＬＡ−Ａｗ６８／Ａｗ６８，Ｂｗ５３／Ｂｗ５３．Ｃ
ｗ４／Ｃｗ４のパブロタイブをもち、ＥＢウィルス（Ｅ
ｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）で形質転換した
ヒトＢ細胞株ＡＭＡｒ ５Ｘ１０’個を１０ｄのリン
酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に浮遊させ、１５００ｒｐｍで
遠心した。上清を捨て、再び１ｏ−のＰＢＳに浮遊させ
、１５００ｒｐｍ＋で遠心し、上清を完全に取り除いた
。
ｗ４／Ｃｗ４のパブロタイブをもち、ＥＢウィルス（Ｅ
ｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）で形質転換した
ヒトＢ細胞株ＡＭＡｒ ５Ｘ１０’個を１０ｄのリン
酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に浮遊させ、１５００ｒｐｍで
遠心した。上清を捨て、再び１ｏ−のＰＢＳに浮遊させ
、１５００ｒｐｍ＋で遠心し、上清を完全に取り除いた
。
次に、ＡＭＡ Ｉ細胞を２−のＬＳＴ緩衝液（２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ溶液Ｐ Ｈ７，４，１０ｍＭ ＮａＣ１，３
＋ｎＭＭｇＣＩｇ）に浮遊させ１５００ｒｐ−で遠心し
上清を取り除いた。
Ｔｒｉｓ溶液Ｐ Ｈ７，４，１０ｍＭ ＮａＣ１，３
＋ｎＭＭｇＣＩｇ）に浮遊させ１５００ｒｐ−で遠心し
上清を取り除いた。
４°Ｃに冷却した５％５ｏｃｏｓｅ＋ ４％ＮＰ −４
０を含むＬＳＴｌ衝液ｌｄを加えＡＭＡ Ｉ細胞を浮遊
させ５分間放置した。その後１５００ｒｐｍで遠心し上
清を取り除き、冷却した５ｄのＡＣＥ緩衝液（５０ｍＭ
酢酸ナトリウム、Ｉｆ）ｗＭＥＤＴＡ）を加えて攪拌し
た。０．５−の１０％ＳＤＳ溶液を加えた後、５ｄのフ
ェノール溶液を加え４分間振盪した。その後２０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心し、上層を新しい試験管に入れた。
０を含むＬＳＴｌ衝液ｌｄを加えＡＭＡ Ｉ細胞を浮遊
させ５分間放置した。その後１５００ｒｐｍで遠心し上
清を取り除き、冷却した５ｄのＡＣＥ緩衝液（５０ｍＭ
酢酸ナトリウム、Ｉｆ）ｗＭＥＤＴＡ）を加えて攪拌し
た。０．５−の１０％ＳＤＳ溶液を加えた後、５ｄのフ
ェノール溶液を加え４分間振盪した。その後２０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心し、上層を新しい試験管に入れた。
この試験管に上層液と等量のクロロホルム溶液を加え４
分間振盪後、２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上層を
新しい試験管に入れた。上層をとった試験管に２倍量の
９９％エタノールをゆっくり加え混合しヒト染色体ＤＮ
Ａを糸状に分離した０分離したヒト染色体ＤＮＡ３０μ
ｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ９０単位（Ｕ）で３７°Ｃ３時
間インキュベートした。ＥｃｏＲｌで切断したヒト染色
体ＤＮＡを０．８％アガロースゲルの末端に添加し電気
泳動し、６．０ｋｂから８．５ｋｂの範囲にあるＤＮＡ
断片をＤＥペーパー分離法で分離し、ＨＬＡクラス■ゲ
ノムＤＮＡを得た。
分間振盪後、２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上層を
新しい試験管に入れた。上層をとった試験管に２倍量の
９９％エタノールをゆっくり加え混合しヒト染色体ＤＮ
Ａを糸状に分離した０分離したヒト染色体ＤＮＡ３０μ
ｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ９０単位（Ｕ）で３７°Ｃ３時
間インキュベートした。ＥｃｏＲｌで切断したヒト染色
体ＤＮＡを０．８％アガロースゲルの末端に添加し電気
泳動し、６．０ｋｂから８．５ｋｂの範囲にあるＤＮＡ
断片をＤＥペーパー分離法で分離し、ＨＬＡクラス■ゲ
ノムＤＮＡを得た。
ゲノムＤＮＡライブラリーの作成
分離したヒトＤＮＡ０．４ｇｇに対してλファージのア
ーム（ＥｃｏＲＩで処理したλＺＡＰ）２ｇｇを加え、
Ｔ４ リガーゼを加えて、４℃１８時間インキュベート
して結合させた。このサンプルをパフケージングキット
（Ｇｉｇａｐａｃｋ−ｇｏｌｄ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社製）を使ってｉｎ ｖｌｔｒｏでパッケージングした
。パフケージングがうまくいっているか確認するためパ
ッケージングしたファージサンプルの力価を以下の手順
で調べた。
ーム（ＥｃｏＲＩで処理したλＺＡＰ）２ｇｇを加え、
Ｔ４ リガーゼを加えて、４℃１８時間インキュベート
して結合させた。このサンプルをパフケージングキット
（Ｇｉｇａｐａｃｋ−ｇｏｌｄ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社製）を使ってｉｎ ｖｌｔｒｏでパッケージングした
。パフケージングがうまくいっているか確認するためパ
ッケージングしたファージサンプルの力価を以下の手順
で調べた。
（サンプルの力価の測定）
Ｌ Ｅ ３９２Ｅ、 ｃｏｌｉを少量とり、４０ｄのＬ
Ｂ培地（ＮａＣ１５ｇ、イーストイクストラクト５ｇ。
Ｂ培地（ＮａＣ１５ｇ、イーストイクストラクト５ｇ。
トリプトン１０ｇを１ｆＬＯにとかしたもの、）を入れ
である５０１１１の遠心管に入れ３７°Ｃ−晩振盪培養
した。培養したバクテリア培地１ｄを遠心管に加え、さ
らに３ｉのＬＢ培地と８０Ｍ１のＩＭＭｇＳＯａを加え
た。こうして得たバクテリア培地０．２ ｍとパッケー
ジングサンプルの希釈系列２ｕｆｆｉ（原液、１０倍希
釈液、１００倍希釈液、 ｉｏｏ。
である５０１１１の遠心管に入れ３７°Ｃ−晩振盪培養
した。培養したバクテリア培地１ｄを遠心管に加え、さ
らに３ｉのＬＢ培地と８０Ｍ１のＩＭＭｇＳＯａを加え
た。こうして得たバクテリア培地０．２ ｍとパッケー
ジングサンプルの希釈系列２ｕｆｆｉ（原液、１０倍希
釈液、１００倍希釈液、 ｉｏｏ。
倍希釈液）を６−の試験管に加え３７°Ｃ１５分間イン
キエベートした。４５℃保温の２．５１１ｄｌの０．７
％軟寒天を各試験管に加えて混ぜた後、直径９０ｍ＋ａ
の１．５％寒天皿の上に重層する。３７°Ｃ８時間培養
しプラーク数をカウントした。
キエベートした。４５℃保温の２．５１１ｄｌの０．７
％軟寒天を各試験管に加えて混ぜた後、直径９０ｍ＋ａ
の１．５％寒天皿の上に重層する。３７°Ｃ８時間培養
しプラーク数をカウントした。
ＨＬＡクラスＩゲノムＤＮＡのクローニング９（１ｍｍ
の皿に約４０００個のプラークができるようにライブラ
リーの原液を３Ｍ培地（ＮａＣ１１５，８ｇ、Ｍｇ５Ｏ
ａ ７Ｈ＊０ ２ｇ、５０ｄ ＩＭＴｒｉｓＣｌ
ｐＨ７，５，５ｍ ２％ｇｅｌａｔｉｎを１２Ｈ８０
にとかしたもの、）で希釈した。−次スクリーニングは
上記のサンプルの力価の測定と同様の手順で操作し９０
１ａ皿にファージプラークを形成した。ニトロセルロー
ス膜（’Ｇｅ１ｓ＋ａｎＳｃｉｅｎｃｅ社製）を軟寒天
層上に載せ５分間放置した０次に、ニトロセルロース膜
をｄｅｎａｔｕｒｅｔＩ液（０，１ＭＮａＯＨ，１，５
ＭＮａｃｌ）に浸したクロマトグラフィー用紙に、ファ
ージがついている面を上にして載せ５分間放置した０次
に、２倍のＳＳＣ溶液を含むクロマトグラフィー用紙に
ニトロセルロース膜を載せ５分間放置した後、ニトロセ
ルロース膜を室温で乾燥させた。
の皿に約４０００個のプラークができるようにライブラ
リーの原液を３Ｍ培地（ＮａＣ１１５，８ｇ、Ｍｇ５Ｏ
ａ ７Ｈ＊０ ２ｇ、５０ｄ ＩＭＴｒｉｓＣｌ
ｐＨ７，５，５ｍ ２％ｇｅｌａｔｉｎを１２Ｈ８０
にとかしたもの、）で希釈した。−次スクリーニングは
上記のサンプルの力価の測定と同様の手順で操作し９０
１ａ皿にファージプラークを形成した。ニトロセルロー
ス膜（’Ｇｅ１ｓ＋ａｎＳｃｉｅｎｃｅ社製）を軟寒天
層上に載せ５分間放置した０次に、ニトロセルロース膜
をｄｅｎａｔｕｒｅｔＩ液（０，１ＭＮａＯＨ，１，５
ＭＮａｃｌ）に浸したクロマトグラフィー用紙に、ファ
ージがついている面を上にして載せ５分間放置した０次
に、２倍のＳＳＣ溶液を含むクロマトグラフィー用紙に
ニトロセルロース膜を載せ５分間放置した後、ニトロセ
ルロース膜を室温で乾燥させた。
最後に、８０℃の真空乾燥機の中で１２０分間放置しプ
ロッティングを完了した。
ロッティングを完了した。
ハイブリダイゼーションで使用するＨＬＡ−Ｂ７ｃＤＮ
Ａプローブを以下のように調製した。
Ａプローブを以下のように調製した。
ＨＬ Ａ −Ｂ ７ ｃ Ｄ Ｎ Ａ１３４０ｂｐ （
Ｏｒｒ Ｈ，Ｔ、ｅｔａｌ ＨＢｉｏｃｈｅａ＋１ｓｔ
ｒｙ、１Ｂ、５７１１．１９７９ ）がＰｓｔｌｓｉｔ
ｅでＰＢＲ３２Ｂに入っているプラスミドｐＩ）ｐｏｏ
ｌ （ＤｒＪｅｌｓｍａｎ、Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙより入手）をＰｓｔｌで切断し、アガロースゲ
ルで電気泳動し、ＤＥペーパー法で１３４０ｂｐのＨＬ
Ａ−Ｂ７ｃＤＮＡを分離した０分離したＨＬＡ−Ｂ７ｃ
ＤＮＡ ２００ｎｇヲニックトランスレーション法によ
リコＩＰ−ｄＣＴＰで標識した。標識したｃＤＮＡと未
結合の”Ｐ−ｄＣＴＰを分離するためセファデックス０
５０カラムに流し放射能活性のある第１ピークを集めた
。
Ｏｒｒ Ｈ，Ｔ、ｅｔａｌ ＨＢｉｏｃｈｅａ＋１ｓｔ
ｒｙ、１Ｂ、５７１１．１９７９ ）がＰｓｔｌｓｉｔ
ｅでＰＢＲ３２Ｂに入っているプラスミドｐＩ）ｐｏｏ
ｌ （ＤｒＪｅｌｓｍａｎ、Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙより入手）をＰｓｔｌで切断し、アガロースゲ
ルで電気泳動し、ＤＥペーパー法で１３４０ｂｐのＨＬ
Ａ−Ｂ７ｃＤＮＡを分離した０分離したＨＬＡ−Ｂ７ｃ
ＤＮＡ ２００ｎｇヲニックトランスレーション法によ
リコＩＰ−ｄＣＴＰで標識した。標識したｃＤＮＡと未
結合の”Ｐ−ｄＣＴＰを分離するためセファデックス０
５０カラムに流し放射能活性のある第１ピークを集めた
。
以下の手順でＨＬＡクラスＩ遺伝子をクローニングした
。
。
ファージライブラリーをブロッティングしたニトロセル
ロース膜をハイブリダイゼーションバックに入れた。プ
レハイブリダイゼーション溶液（５０倍のＤｅｎｈａｒ
ｄｔ’ｓ ５ｏｌｕｔｉｏｎ ０．８ｍ＋１０１ｄＰｏ
ｒ１０１ｄＰｏｒ、 ０．２ｙｄ １０％ Ｓ Ｄ Ｓ
、０．５ｄの４１１ｇ／ｌｌ１１サケ***ＤＮＡ、
６．ｆｌ＋ｄ ２０倍ＳＳＣ，１，９１ｄ！）（ｇｏ）
を加えバックを密封し４２℃２時間インキエベートした
＠ ２ Ｘｌ０Ｉ′ｃｐｓのＨＬＡ−Ｂ７ｃＤＮＡプ
ローブと４■／−サケ***ＤＮＡ０．５ ｍをガラス試
験管に入れ１００°Ｃの水浴で１゜分間加熱した後、氷
の中で急冷した。このガラス試験管に０．８ｄの５０倍
Ｄｅｎｈａｒｄｔ’５ｏｌｕｔｉｏｎ。
ロース膜をハイブリダイゼーションバックに入れた。プ
レハイブリダイゼーション溶液（５０倍のＤｅｎｈａｒ
ｄｔ’ｓ ５ｏｌｕｔｉｏｎ ０．８ｍ＋１０１ｄＰｏ
ｒ１０１ｄＰｏｒ、 ０．２ｙｄ １０％ Ｓ Ｄ Ｓ
、０．５ｄの４１１ｇ／ｌｌ１１サケ***ＤＮＡ、
６．ｆｌ＋ｄ ２０倍ＳＳＣ，１，９１ｄ！）（ｇｏ）
を加えバックを密封し４２℃２時間インキエベートした
＠ ２ Ｘｌ０Ｉ′ｃｐｓのＨＬＡ−Ｂ７ｃＤＮＡプ
ローブと４■／−サケ***ＤＮＡ０．５ ｍをガラス試
験管に入れ１００°Ｃの水浴で１゜分間加熱した後、氷
の中で急冷した。このガラス試験管に０．８ｄの５０倍
Ｄｅｎｈａｒｄｔ’５ｏｌｕｔｉｏｎ。
１０ｄ ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、０．２ｄ ｉｏ％Ｓ Ｄ
Ｓ 、６．６ｄ ２０倍ＳＳＣ溶液、２ｄの５０％Ｄ
ｅｘｔｒａｎ ５ｕｌｆａｔｅの混合液を加えてハイブ
リダイゼーション溶液とした。ハイブリダイゼーション
バックからプレハイブリダイゼーション溶液を捨て、ハ
イブリダイゼーション溶液を加えてバックを密封し４２
°Ｃ１８時間インキュベートした。バックからニトロセ
ルロース膜を取り出し、２倍のＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ
からなる洗浄溶液で３７°Ｃ３０分間×２回、さらに５
２°Ｃ３０分間×２回洗った後ニトロセルロース膜を乾
燥させた。乾燥したニトロセルロース膜を−ｈａｔＩｌ
ａｎ ３ Ｍ Ｍ濾紙上に固定しＸ線フィルムのカセ
ットに入れＸ線フィルムに３−１１１１時間露光した後
、フィルムを感光させた。黒いドツトとして現れたポジ
ティブプラークを６１！認した後９０ｍ皿からポジティ
ブプラークをピペットで取りｌｄＳＭｌｌ街液の入って
いる１、５−遠心管に入れ３７℃１時間インキヱベート
した０次に、クロロホルムを数滴加えて１５０００ｒｐ
ｍで数秒遠心した後、上清を２次スクリーニングのファ
ージとした。
Ｓ 、６．６ｄ ２０倍ＳＳＣ溶液、２ｄの５０％Ｄ
ｅｘｔｒａｎ ５ｕｌｆａｔｅの混合液を加えてハイブ
リダイゼーション溶液とした。ハイブリダイゼーション
バックからプレハイブリダイゼーション溶液を捨て、ハ
イブリダイゼーション溶液を加えてバックを密封し４２
°Ｃ１８時間インキュベートした。バックからニトロセ
ルロース膜を取り出し、２倍のＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ
からなる洗浄溶液で３７°Ｃ３０分間×２回、さらに５
２°Ｃ３０分間×２回洗った後ニトロセルロース膜を乾
燥させた。乾燥したニトロセルロース膜を−ｈａｔＩｌ
ａｎ ３ Ｍ Ｍ濾紙上に固定しＸ線フィルムのカセ
ットに入れＸ線フィルムに３−１１１１時間露光した後
、フィルムを感光させた。黒いドツトとして現れたポジ
ティブプラークを６１！認した後９０ｍ皿からポジティ
ブプラークをピペットで取りｌｄＳＭｌｌ街液の入って
いる１、５−遠心管に入れ３７℃１時間インキヱベート
した０次に、クロロホルムを数滴加えて１５０００ｒｐ
ｍで数秒遠心した後、上清を２次スクリーニングのファ
ージとした。
９０Ｍ皿に１００−５００個のプラークができるように
上清を３Ｍ培地で希釈した後、１次スクリーニングと同
様の方法でニトロセルロース膜にプロッティングし、Ｈ
ＬＡ−Ｂ７ｃＤＮＡプローブを使用しハイブリダイゼー
ションを行いポジティブプラークを取った。
上清を３Ｍ培地で希釈した後、１次スクリーニングと同
様の方法でニトロセルロース膜にプロッティングし、Ｈ
ＬＡ−Ｂ７ｃＤＮＡプローブを使用しハイブリダイゼー
ションを行いポジティブプラークを取った。
２次スクリーニングで得たポジティブプラークをピペッ
トで取り１ａｆｓＭ培地の入っている！、５ｉ遠心管に
入れ室温１時間インキュベートした後クロロホルムを数
滴加えて１５００ｒｐｍ数秒間遠心する。遠心後の上滑
を３次スクリーニングのファージとし、２次スクリーニ
ングと同じ方法でスクリーニングを行い、すべてのプラ
ークがポジティブプラークであることをハイブリダイゼ
ーションによって確認し、クローニングを完了した。
トで取り１ａｆｓＭ培地の入っている！、５ｉ遠心管に
入れ室温１時間インキュベートした後クロロホルムを数
滴加えて１５００ｒｐｍ数秒間遠心する。遠心後の上滑
を３次スクリーニングのファージとし、２次スクリーニ
ングと同じ方法でスクリーニングを行い、すべてのプラ
ークがポジティブプラークであることをハイブリダイゼ
ーションによって確認し、クローニングを完了した。
ＤＮＡの精製
次の操作により３次スクリーニングで得たλファージに
組込んだゲノム遺伝子をヘルパーファージを使ってプラ
スミドに変換した。λフアージクローンを３次スクリー
ニングのプレートから取り５００ｐ７の３Ｍ培地と２０
ｐｌのクロロフォルムと混合しλＺＡＰ溶液とした。遠
心管に２００ｕＺ（７）λＺＡＰ溶液と、Ｌｏａｆ （
７） Ｉ Ｘ １０”ｐｆｕ／ｄ濃度ノＲ４０８ヘルパ
ー７７−ジと、２００＃ｊ （７） ８ Ｘ１０・個／
Ｉ１１のＸ Ｌ Ｉ Ｂｌｕｅ Ｅ、ｃｏｌｉとを
入れ混合し３７℃１５分間インキエベートした。次にこ
の遠心管に５Ｉ！ｄｌの２倍濃度のＹＴ培地（５ｇＮａ
ＣＩ 、 ５ｇ イーストイクストラクト、 ８ｇ
Ｂａｃｔ。
組込んだゲノム遺伝子をヘルパーファージを使ってプラ
スミドに変換した。λフアージクローンを３次スクリー
ニングのプレートから取り５００ｐ７の３Ｍ培地と２０
ｐｌのクロロフォルムと混合しλＺＡＰ溶液とした。遠
心管に２００ｕＺ（７）λＺＡＰ溶液と、Ｌｏａｆ （
７） Ｉ Ｘ １０”ｐｆｕ／ｄ濃度ノＲ４０８ヘルパ
ー７７−ジと、２００＃ｊ （７） ８ Ｘ１０・個／
Ｉ１１のＸ Ｌ Ｉ Ｂｌｕｅ Ｅ、ｃｏｌｉとを
入れ混合し３７℃１５分間インキエベートした。次にこ
の遠心管に５Ｉ！ｄｌの２倍濃度のＹＴ培地（５ｇＮａ
ＣＩ 、 ５ｇ イーストイクストラクト、 ８ｇ
Ｂａｃｔ。
−Ｔｒｙｐｔｏｎを１１の水にとかしたもの）を加え、
３７℃４時間振盪した。
３７℃４時間振盪した。
次に、７０℃で２０分間熱を加えた後、遠心管を１００
０ ｇで５分間遠心した。上清を新しい試験管へ移し、
この試験管に２００，１１１の８Ｘ１０”個／ｄのＸ
Ｌ １−Ｂｌｕｅ Ｅ、ｃｏｌｉを加え３７℃１５分
間インキエベートした。この試験管中の溶液１００ｐ７
をアンピシリンプレートに注ぎ３７°Ｃで一晩静置した
。翌日コロニーを取り、アンピシリンを含むＬＢ培地に
植え３７℃で一晩振盪した０次にこの培養液５Ｉｄをア
ンピシリンを含むＬＢ培地４００ ｍに加え、３７°Ｃ
でＯＤ Ａ。。−０，８になるまで振盪培養した。２ｄ
の３４■／ｄクロラムフエニコールを加え、さらに３７
℃で１２時間培養した。
０ ｇで５分間遠心した。上清を新しい試験管へ移し、
この試験管に２００，１１１の８Ｘ１０”個／ｄのＸ
Ｌ １−Ｂｌｕｅ Ｅ、ｃｏｌｉを加え３７℃１５分
間インキエベートした。この試験管中の溶液１００ｐ７
をアンピシリンプレートに注ぎ３７°Ｃで一晩静置した
。翌日コロニーを取り、アンピシリンを含むＬＢ培地に
植え３７℃で一晩振盪した０次にこの培養液５Ｉｄをア
ンピシリンを含むＬＢ培地４００ ｍに加え、３７°Ｃ
でＯＤ Ａ。。−０，８になるまで振盪培養した。２ｄ
の３４■／ｄクロラムフエニコールを加え、さらに３７
℃で１２時間培養した。
次に、この培養液を遠心管へ移し５０００ｒｐｓ＋で１
０分間遠心し上清を捨てた。この遠心管へ４０戚の０．
１Ｍ −Ｎ ａ Ｃ１，１０ｏ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ７，８）、 １ ａ＋Ｍ１！ＤＴＡを加えて沈澱
物を懸濁させた後、５０００ｒｐｍで１０分間遠心して
上清を捨てた。この遠心管に７ｍグルコース・リゾチー
ム溶液を加えて沈澱物を再懸濁し、室温で１０分間放置
した。さらに、遠心管に１４ｍ１アルカリ溶液を加え、
水冷しながら１０分間放置した。次に１０．５ｄ酢酸カ
リウム溶液を加え攪拌後水中で１０分間放置した。この
遠心管を１５０Ｏｒｐｍ ２０分間４℃で遠心し、上清
を５０−の新しい遠心管へ移した。これに０．６容のイ
ソプロピルアルコールを加え、混合した後、室温で２０
分間放置した。この遠心管を３０００ｒｐａ＋ １０分
間遠心し上清を捨てた。この遠心管に１００％エタノー
ルを加え、沈澱物を乾燥させた後、３．５ｄのＴＥ緩衝
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃ１，１ｍＭ ＥＤＴＡｐＨ
８，ｏ）を加え沈澱物を溶解した。このＤＮＡ溶液３．
５ｉに対して、３．７ｇ ＣｓＣ１，０，２ｄ １１
０ｆｆ１／−エチジウムブロマイド水溶液を加え、完全
に塩化セシウムを溶解した。得られた溶液をシールチュ
ーブに移し、５０％（Ｗ／Ｗ）塩化セシウム溶液でチュ
ーブを満たし、開口をシールした。シールチューブを１
５ ’Ｃ５５０００ｒｐｍ、 １５時間遠心して、プラ
スミドＤＮＡを分離した。このプラスミドＤＮＡ層注射
器で回収し、水で飽和したｎ−ブタノールをを等量加え
混合した。 ３０００ｒｐｓ １分間遠心して上層を
捨てた。この操作を３回繰り返し、エチジウムブロマイ
ドを除去した０次に、プラスミドＤＮＡをＴＥ緩衝液で
一晩透析してＤＮＡを精製した。
０分間遠心し上清を捨てた。この遠心管へ４０戚の０．
１Ｍ −Ｎ ａ Ｃ１，１０ｏ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ７，８）、 １ ａ＋Ｍ１！ＤＴＡを加えて沈澱
物を懸濁させた後、５０００ｒｐｍで１０分間遠心して
上清を捨てた。この遠心管に７ｍグルコース・リゾチー
ム溶液を加えて沈澱物を再懸濁し、室温で１０分間放置
した。さらに、遠心管に１４ｍ１アルカリ溶液を加え、
水冷しながら１０分間放置した。次に１０．５ｄ酢酸カ
リウム溶液を加え攪拌後水中で１０分間放置した。この
遠心管を１５０Ｏｒｐｍ ２０分間４℃で遠心し、上清
を５０−の新しい遠心管へ移した。これに０．６容のイ
ソプロピルアルコールを加え、混合した後、室温で２０
分間放置した。この遠心管を３０００ｒｐａ＋ １０分
間遠心し上清を捨てた。この遠心管に１００％エタノー
ルを加え、沈澱物を乾燥させた後、３．５ｄのＴＥ緩衝
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃ１，１ｍＭ ＥＤＴＡｐＨ
８，ｏ）を加え沈澱物を溶解した。このＤＮＡ溶液３．
５ｉに対して、３．７ｇ ＣｓＣ１，０，２ｄ １１
０ｆｆ１／−エチジウムブロマイド水溶液を加え、完全
に塩化セシウムを溶解した。得られた溶液をシールチュ
ーブに移し、５０％（Ｗ／Ｗ）塩化セシウム溶液でチュ
ーブを満たし、開口をシールした。シールチューブを１
５ ’Ｃ５５０００ｒｐｍ、 １５時間遠心して、プラ
スミドＤＮＡを分離した。このプラスミドＤＮＡ層注射
器で回収し、水で飽和したｎ−ブタノールをを等量加え
混合した。 ３０００ｒｐｓ １分間遠心して上層を
捨てた。この操作を３回繰り返し、エチジウムブロマイ
ドを除去した０次に、プラスミドＤＮＡをＴＥ緩衝液で
一晩透析してＤＮＡを精製した。
によるＨＬＡクラス■ 伝 の
クローニングしたＨＬＡクラス■ゲノムＤＮＡをｔｋ−
マウスＬ細胞に遺伝子導入しその細胞表面上での発現を
抗ＨＬＡクラスＩ抗体で調べた。
マウスＬ細胞に遺伝子導入しその細胞表面上での発現を
抗ＨＬＡクラスＩ抗体で調べた。
マウスＬ細胞へのＨＬＡクラスＩ遺伝子の導入遺伝子移
入の前日、５Ｘ１０’個のマウスＬ細胞を培養フラスコ
に入れ１０％ＦＣ３を含むＭＥＭ培地中で培養した。
入の前日、５Ｘ１０’個のマウスＬ細胞を培養フラスコ
に入れ１０％ＦＣ３を含むＭＥＭ培地中で培養した。
Ｃａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ沈殿法により沈殿物を以下の
手順で作成した。
手順で作成した。
（ａ）２０ｕｇ ／ １００μｉのＨＬＡクラスＩゲノ
ムＤＮＡと、１ ｕ ｇ／ １００１１１のチミジ７キ
ナーゼ遺伝子と、１００！ｊｊ！ ＣａＣ１，・２Ｈ
＊０溶液ＰＨ７，０と、７００μｌのＨｔ Ｏを濃合し
総量を１−とじた。
ムＤＮＡと、１ ｕ ｇ／ １００１１１のチミジ７キ
ナーゼ遺伝子と、１００！ｊｊ！ ＣａＣ１，・２Ｈ
＊０溶液ＰＨ７，０と、７００μｌのＨｔ Ｏを濃合し
総量を１−とじた。
（ｂ）Ｈｅｐｅｓ／ＮａＣ１溶液と １００倍のＮａＨ
ＰＯ，溶液を４９：ｌで混合し、その溶液を６１ｎ１の
試験管に入れた。
ＰＯ，溶液を４９：ｌで混合し、その溶液を６１ｎ１の
試験管に入れた。
（ｃ） （ａ）で作成した溶液を１滴ずつ（ｂ）の試験
管に入れ混合した後２０分間インキュベー）ＬＣａ−Ｄ
ＮＡ沈殿物を作成した。
管に入れ混合した後２０分間インキュベー）ＬＣａ−Ｄ
ＮＡ沈殿物を作成した。
前日培養したマウスＬ細胞をＣａ非含有ＰＢＳで１回洗
浄した後、Ｃａ−ＤＮＡ沈殿物を加えてフラスコ中で１
５分間インキュベートした。
浄した後、Ｃａ−ＤＮＡ沈殿物を加えてフラスコ中で１
５分間インキュベートした。
さらに１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含むＭＥＭ培地
を１〇−加えて３７℃６時間ＣＯ，インキュベーターで
インキュベートした０次に、ＦＣ３非含有培地を用いて
作成した３４％ＰＥＧ−５％ＤＭＳＯ溶液でフラスコ中
の培地を除いた後、２ｙｄの３４％ＰＥＧ−５％ＤＭＳ
Ｏ溶液を加えて３分間インキュベートした。ＦＣ３非含
有培地で３回洗浄後、ｌＯ％ＦＣ３を含む培地で２回洗
浄した０次に、１０ｄのｌＯ％ＦＣ３を含む培地を加え
一晩培養した。翌日、ＨＡＴ培地に変え培養した。２〜
３日毎にＨＡＴ培地を交替した。
を１〇−加えて３７℃６時間ＣＯ，インキュベーターで
インキュベートした０次に、ＦＣ３非含有培地を用いて
作成した３４％ＰＥＧ−５％ＤＭＳＯ溶液でフラスコ中
の培地を除いた後、２ｙｄの３４％ＰＥＧ−５％ＤＭＳ
Ｏ溶液を加えて３分間インキュベートした。ＦＣ３非含
有培地で３回洗浄後、ｌＯ％ＦＣ３を含む培地で２回洗
浄した０次に、１０ｄのｌＯ％ＦＣ３を含む培地を加え
一晩培養した。翌日、ＨＡＴ培地に変え培養した。２〜
３日毎にＨＡＴ培地を交替した。
約１４〜２１日でｔｋ遺伝子導入し細胞が増殖しコロニ
ーを形成するのを確認した。各コロニーをクローニング
リングを使って拾った後、各クローンを培養した。
ーを形成するのを確認した。各コロニーをクローニング
リングを使って拾った後、各クローンを培養した。
形質転換細胞上に発現したＨＬＡクラスＩ抗原の確認
クローン化した各コロニーＩ ＸＩＯ’ 個をＰＢＳで
２回洗い１００μｌのＰＢＳに浮遊させた後、５０ｐｌ
ずつ２本の試験管に入れた。２本の試験管に５０ｐ１の
抗ＨＬＡクラス！モノクローナル抗体Ｗ ６ ／ ３２
（Ｐａｒｈａｍ Ｐ ｅｔ ａｌ、Ｊ、ｒｍｍｕｎｏ
ｌ。
２回洗い１００μｌのＰＢＳに浮遊させた後、５０ｐｌ
ずつ２本の試験管に入れた。２本の試験管に５０ｐ１の
抗ＨＬＡクラス！モノクローナル抗体Ｗ ６ ／ ３２
（Ｐａｒｈａｍ Ｐ ｅｔ ａｌ、Ｊ、ｒｍｍｕｎｏ
ｌ。
（１９７９） 、 １２３． ｐｐ３４２−３４９ ）
と、５０μｌの抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体Ｌ
２４３ （Ｌａｍｐｓｏｎ ＬＡｅｔ ａｌ、Ｊ、Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、（１９８０）、１２５．ＰＩ）２９３−２
９９）を別々に加え４℃３０分インキュベートした。各
試験管に０．５−のＰＢＳを加えて１５００ｒｐｍで５
分間遠心し、上清を取り除いた。これを３回繰り返した
。５０倍希釈のＦＩＴＣ抗マウスＩｇ抗体（５ｌｌｅｎ
ｕｓ社製）を各試験管に加えて４°Ｃ３０分インキエベ
ートした。各試験管に０．５ｄ Ｐ Ｂ Ｓを加え、１
５００ｒｐ−で５分間遠心して、上清を取り除く作業を
３回繰り返した。最後に１ｄＰＢＳを各試験管に加えス
ペクトラム■（オルソ−社製）で蛍光強度を測定した。
と、５０μｌの抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体Ｌ
２４３ （Ｌａｍｐｓｏｎ ＬＡｅｔ ａｌ、Ｊ、Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、（１９８０）、１２５．ＰＩ）２９３−２
９９）を別々に加え４℃３０分インキュベートした。各
試験管に０．５−のＰＢＳを加えて１５００ｒｐｍで５
分間遠心し、上清を取り除いた。これを３回繰り返した
。５０倍希釈のＦＩＴＣ抗マウスＩｇ抗体（５ｌｌｅｎ
ｕｓ社製）を各試験管に加えて４°Ｃ３０分インキエベ
ートした。各試験管に０．５ｄ Ｐ Ｂ Ｓを加え、１
５００ｒｐ−で５分間遠心して、上清を取り除く作業を
３回繰り返した。最後に１ｄＰＢＳを各試験管に加えス
ペクトラム■（オルソ−社製）で蛍光強度を測定した。
Ｌ細胞上にＨＬＡクラス！抗原を発現している細胞は、
Ｗ６／３２抗体で蛍光強度がＬ２４３抗体より強くなり
発現が確認できる。
Ｗ６／３２抗体で蛍光強度がＬ２４３抗体より強くなり
発現が確認できる。
以上の方法により、ＡＭＡ Ｉ細胞から得たＨＬＡクラ
ス■ゲノム遺伝子クローン３４．１を導入した形質転換
細胞がＨＬＡクラス！抗原を発現しているのを確認した
。
ス■ゲノム遺伝子クローン３４．１を導入した形質転換
細胞がＨＬＡクラス！抗原を発現しているのを確認した
。
クローン３４．１の制限酵素を用いた遺伝子地図を他の
ＨＬＡ−８５交差反応グループの遺伝子地図と比較した
。クローン３４．１のＢｃｏＲＩ。
ＨＬＡ−８５交差反応グループの遺伝子地図と比較した
。クローン３４．１のＢｃｏＲＩ。
Ｘｂａｌ、 ＢａｍＨｒ、 ５ｔｅａＩ フラグメント
は、ＨＬＡ−Ｂ５１，Ｂｗ５２．Ｂ３５と同じであった
。
は、ＨＬＡ−Ｂ５１，Ｂｗ５２．Ｂ３５と同じであった
。
方、クローン３４．１のＰｕｖ ＵフラグメントはＨ
ＬＡ−Ｂ ３５と同じであったが、他のＨＬＡ−Ｂ５交
差反応グループと異っていた。それゆえクローン３４．
１はＨＬＡ−Ｂｗ５３遺伝子であることが強（示唆され
た。
ＬＡ−Ｂ ３５と同じであったが、他のＨＬＡ−Ｂ５交
差反応グループと異っていた。それゆえクローン３４．
１はＨＬＡ−Ｂｗ５３遺伝子であることが強（示唆され
た。
ローン３ のアロ の
クローン３４．１をハイグロマイシン耐性遺伝子と一緒
に、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ抗原を発現していないＢリンパ芽球
細胞株Ｈｍｙ２ｃＩＲ（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ。
に、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ抗原を発現していないＢリンパ芽球
細胞株Ｈｍｙ２ｃＩＲ（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ。
１６６、ｐｐ２８３−２８８． （１８９７））に導入
し、ハイグロマイシンＢ培地を用いて形質転換細胞を得
た。
し、ハイグロマイシンＢ培地を用いて形質転換細胞を得
た。
この形質転換細胞を、さらに培養し、Ｗ６／３２モノク
ローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによりクロ
ーン３４．１の遺伝子産物であるＨＬＡクラスＩ抗原を
高レベルで発現しているクローン３４．１形質転換Ｈｍ
ｙ２ＣＩＲ細胞株を得た。
ローナル抗体を用いたフローサイトメトリーによりクロ
ーン３４．１の遺伝子産物であるＨＬＡクラスＩ抗原を
高レベルで発現しているクローン３４．１形質転換Ｈｍ
ｙ２ＣＩＲ細胞株を得た。
同様の方法により、ＨＬＡ−８３５遺伝子をＨｍｙ２Ｃ
ＩＲに導入してＨＬＡ−８３５抗原を発現したＢ３５形
質転換転換ｙ２ＣＩＲ細胞株を得た。
ＩＲに導入してＨＬＡ−８３５抗原を発現したＢ３５形
質転換転換ｙ２ＣＩＲ細胞株を得た。
このクローン３４．１形質転換細胞株Ｈｍｙ２ＣＩＲの
アロ抗原性を補体依存性細胞障害性試験で調べた。
アロ抗原性を補体依存性細胞障害性試験で調べた。
ＨＬＡ−Ｂ３５，Ｂｗ５３に特異性を有する抗血清ＡＯ
Ｈ２２３他 表１に記載した種々の抗血清をあらかじめ
マイク・ロブレートの各ウェルに１ ｐｌずつ分注した
０次に、３Ｘ１０’個／ 、１の標的細胞を各ウェルに
１ ｐｌずつ分注し、室温で３０分間インキュベートし
た。
Ｈ２２３他 表１に記載した種々の抗血清をあらかじめ
マイク・ロブレートの各ウェルに１ ｐｌずつ分注した
０次に、３Ｘ１０’個／ 、１の標的細胞を各ウェルに
１ ｐｌずつ分注し、室温で３０分間インキュベートし
た。
次に５ｐＩ／ウエルのウサギ補体を各ウェルに分注し室
温で６０分間反応させた０次に２ｐｌ／ウエルの５％エ
オシン水溶液を各ウェルに分注し、室温で５分間静置し
た。Ｆ３ｐｌ／ウェルの３７％ホルムアルデヒドを各ウ
ェルに加え、反応を停止し細胞を固定した。室温で３０
分間放置後、顕微鏡下で観察し、全細胞に対する陽性細
胞の百分率を求めた。結果を表１に示す、標的細胞とし
てはＨｍｙ２ＣＩＨにクローン３４．１を導入して形質
転換した細胞株と、Ｈｍｙ２ＣＩＲにＨＬＡ−Ｂ３５遺
伝子を導入して形質転換した細胞株と、形質転換してな
いＨｓ＋ｙ２ ＣＩ Ｂ１１１胞株を陰性コントロール
として用いた。
温で６０分間反応させた０次に２ｐｌ／ウエルの５％エ
オシン水溶液を各ウェルに分注し、室温で５分間静置し
た。Ｆ３ｐｌ／ウェルの３７％ホルムアルデヒドを各ウ
ェルに加え、反応を停止し細胞を固定した。室温で３０
分間放置後、顕微鏡下で観察し、全細胞に対する陽性細
胞の百分率を求めた。結果を表１に示す、標的細胞とし
てはＨｍｙ２ＣＩＨにクローン３４．１を導入して形質
転換した細胞株と、Ｈｍｙ２ＣＩＲにＨＬＡ−Ｂ３５遺
伝子を導入して形質転換した細胞株と、形質転換してな
いＨｓ＋ｙ２ ＣＩ Ｂ１１１胞株を陰性コントロール
として用いた。
クローン３４．１ Ｂ３５
＊：非形質転換Ｈｍｙ２ＣＩＲ
表 １
以上の結果より、クローン３４．１はＨＬＡ−Ｂｗ５３
遺伝子であることを確認した。
遺伝子であることを確認した。
クローン３４．１のゲノムＤＮＡをジデオキシ法により
全塩基配列を決定した。結果を第１図に示す０図中ＨＬ
Ａ−Ｂｗ５３遺伝子の他に、参考までにＨＬＡ−Ｂｗ５
３の塩基配列を並記した０図中、Ａはアデニン、Ｃはシ
トシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを示す。
全塩基配列を決定した。結果を第１図に示す０図中ＨＬ
Ａ−Ｂｗ５３遺伝子の他に、参考までにＨＬＡ−Ｂｗ５
３の塩基配列を並記した０図中、Ａはアデニン、Ｃはシ
トシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを示す。
第２図は第１図に示したＨＬＡ−Ｂｗ５３遺伝子の各エ
クソン部がコードするペプチドのアミノ酸シークエンス
を示す、アミノ酸は１文字略記で表示してあり、Ａはア
ラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアス
パラギン酸、Ｃはシスティン、Ｑはグルタミン、Ｅはグ
ルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｈはシスチジン。
クソン部がコードするペプチドのアミノ酸シークエンス
を示す、アミノ酸は１文字略記で表示してあり、Ａはア
ラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアス
パラギン酸、Ｃはシスティン、Ｑはグルタミン、Ｅはグ
ルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｈはシスチジン。
■はイソロイシン、Ｌはロイシン、にはリジン。
Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリン
、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｗはトリプトファン、
Ｙはチロシン、■はバリンを示す。
、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｗはトリプトファン、
Ｙはチロシン、■はバリンを示す。
図中、参考までにＨＬＡ−Ｂ３５．Ｂ５１゜Ｂｗ５２，
Ｂｗ５８のアミノ酸配列を並記した。
Ｂｗ５８のアミノ酸配列を並記した。
ＨＬＡ−Ｂ５１，Ｂｗ５２はＪ、Ｉｎ＋ｍｕｎｏｌ＋
１４２＋ｐｐ３０６−３１１．１９８９． ＨＬ Ａ
−Ｂ ｗ ５ ＢはＪ、Ｂｉｏｌ。
１４２＋ｐｐ３０６−３１１．１９８９． ＨＬ Ａ
−Ｂ ｗ ５ ＢはＪ、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｓｓ、 ２６０． ｐｐ１１９２４−１１９３３
．１９８５ として公知である。
．１９８５ として公知である。
第１図、第２図中、ダッシュは、ＨＬＡ−Ｂｗ５３の配
列と同じ核酸またはアミノ酸であることを示す。
列と同じ核酸またはアミノ酸であることを示す。
ＤＮＡプローブへの、・
ＨＬＡ−Ｂｗ５３遺伝子の塩基配列が上述した実施例に
より明らかになったことから、１（ＬＡ−Ｂｗ５３のア
ロタイプをＤＮＡタイピングによって決定することが強
く期待される。
より明らかになったことから、１（ＬＡ−Ｂｗ５３のア
ロタイプをＤＮＡタイピングによって決定することが強
く期待される。
ＨＬ Ａ −Ｂ ｗ ５３とＢ３５はα１ドメインの領
域で６個のアミノ酸の置換が認められる。−方、他のド
メインのアミノ酸残基は全く同一である。したがって、
α１ドメインをコードするエクソン２の２２８番目から
２４５番目までの塩基配列部分である次の塩基配列（１
）を含む領域がＨＬＡ−Ｂｗ５３アロ抗原に特異的な塩
基配列と思われる。
域で６個のアミノ酸の置換が認められる。−方、他のド
メインのアミノ酸残基は全く同一である。したがって、
α１ドメインをコードするエクソン２の２２８番目から
２４５番目までの塩基配列部分である次の塩基配列（１
）を含む領域がＨＬＡ−Ｂｗ５３アロ抗原に特異的な塩
基配列と思われる。
（１”） ＡＣＣｒＧＣＧＧＡＴＣＧＣＧＣＴＣＣＤＮ
Ａプローブに用いるＤＮＡとしては、上記の塩基配列（
Ｉ）を含むｅｆｆ域であれば良い。
Ａプローブに用いるＤＮＡとしては、上記の塩基配列（
Ｉ）を含むｅｆｆ域であれば良い。
塩基配列が決定されたＤＮＡは、ＤＮＡ合成機又はホス
ホトリエステル合成法により合成する。
ホトリエステル合成法により合成する。
合成したＤＮＡにアルカリフォスファターゼ（３，１，
３，１） 、 ポリヌクレオチドキナーゼ〔２゜７．１
．７８．）とα−”ＰｄＡＴＰを加えて１本鎖ＤＮＡの
５′端にｓｔｐを標識することにより、ＤＮＡプローブ
が得られる。
３，１） 、 ポリヌクレオチドキナーゼ〔２゜７．１
．７８．）とα−”ＰｄＡＴＰを加えて１本鎖ＤＮＡの
５′端にｓｔｐを標識することにより、ＤＮＡプローブ
が得られる。
本発明は、ＨＬＡ−Ｂｗ５３アロ抗原の研究、検査、診
断に有用である。
断に有用である。
第１図（１）、 （ＩＩ）はＨＬＡ−Ｂｗ５３遺伝子
の塩基配列を示す図、第２図はＨＬＡ−Ｂｗ５３遺伝子
がコードするアミノ酸配列を示す図である。
の塩基配列を示す図、第２図はＨＬＡ−Ｂｗ５３遺伝子
がコードするアミノ酸配列を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下記の塩基配列で表わされるエクソンを有するＨＬ
Ａ−Ｂｗ５３遺伝子 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 上記式中、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン
、Ｔはチミンを示す。 ２、下記のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ−Ｂｗ５３
遺伝子 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 上記式中、Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパ
ラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステイン、Ｑはグ
ルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｈはヒス
チシン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン
、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリ
ン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｗはトリプトファン
、Ｙはチロシン、Ｖはバリンを示す。 ３、請求項１記載のＨＬＡ−Ｂｗ５３遺伝子の一部と、
ＤＮＡの一部に結合したマーカー物質とからなるＤＮＡ
プローブ。 ４、請求項１記載のＨＬＡ−Ｂｗ５３遺伝子を真核細胞
に導入して得られＨＬＡ−Ｂｗ５３抗原を発現すること
を特徴とする形質転換細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1247697A JPH03112487A (ja) | 1989-09-22 | 1989-09-22 | ＨＬＡ―Ｂｗ５３遺伝子およびＤＮＡプローブ並びに形質転換細胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1247697A JPH03112487A (ja) | 1989-09-22 | 1989-09-22 | ＨＬＡ―Ｂｗ５３遺伝子およびＤＮＡプローブ並びに形質転換細胞 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03112487A true JPH03112487A (ja) | 1991-05-14 |
Family
ID=17167307
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1247697A Pending JPH03112487A (ja) | 1989-09-22 | 1989-09-22 | ＨＬＡ―Ｂｗ５３遺伝子およびＤＮＡプローブ並びに形質転換細胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03112487A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999028748A3 (en) * | 1997-12-04 | 1999-12-23 | Isis Innovation | Hla-e binding |
| US8796427B2 (en) | 2008-01-24 | 2014-08-05 | Novo Nordisk A/S | Humanized anti-human NKG2A monoclonal antibody |
| US8901283B2 (en) | 2006-06-30 | 2014-12-02 | Novo Nordisk A/S | Anti-NKG2A antibodies and uses thereof |
| US8993319B2 (en) | 2004-12-28 | 2015-03-31 | Innate Pharma S.A. | Monoclonal antibodies against NKG2A |
| US9512228B2 (en) | 2011-06-17 | 2016-12-06 | Novo Nordisk A/S | Selective elimination of erosive cells |
-
1989
- 1989-09-22 JP JP1247697A patent/JPH03112487A/ja active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999028748A3 (en) * | 1997-12-04 | 1999-12-23 | Isis Innovation | Hla-e binding |
| US7410767B1 (en) | 1997-12-04 | 2008-08-12 | Isis Innovation Limited | HLA-E binding |
| JP2010024233A (ja) * | 1997-12-04 | 2010-02-04 | Isis Innovation Ltd | Ｈｌａ−ｅ結合 |
| US8993319B2 (en) | 2004-12-28 | 2015-03-31 | Innate Pharma S.A. | Monoclonal antibodies against NKG2A |
| US10160810B2 (en) | 2004-12-28 | 2018-12-25 | Innate Pharma, S.A. | Monoclonal antibodies against NKG2A |
| US8901283B2 (en) | 2006-06-30 | 2014-12-02 | Novo Nordisk A/S | Anti-NKG2A antibodies and uses thereof |
| US9683041B2 (en) | 2006-06-30 | 2017-06-20 | Novo Nordisk A/S | Anti-NKG2A antibodies and uses thereof |
| US8796427B2 (en) | 2008-01-24 | 2014-08-05 | Novo Nordisk A/S | Humanized anti-human NKG2A monoclonal antibody |
| US9422368B2 (en) | 2008-01-24 | 2016-08-23 | Novo Nordisk A/S | Humanized anti-human NKG2A monoclonal antibody |
| US9512228B2 (en) | 2011-06-17 | 2016-12-06 | Novo Nordisk A/S | Selective elimination of erosive cells |
| US11697687B2 (en) | 2011-06-17 | 2023-07-11 | Novo Nordisk A/S | Selective elimination of erosive cells |
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