KR20090056969A - Ｐｄｇｆｒ-알파에 대한 표적화된 결합제 및 그의 용도 - Google Patents

Ｐｄｇｆｒ-알파에 대한 표적화된 결합제 및 그의 용도

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KR20090056969A
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Abstract

항원 PDGFR-알파에 대한 표적화된 결합제 및 그의 용도가 본 원에 개시된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 항원 PDGFR-알파에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 측면은 또한 이러한 항체들을 발현하는 하이브리도마 또는 다른 세포주들에 관한 것이다. 개시된 표적화된 결합제 및 항체는 PDGFR-알파의 활성 및/또는 과발현과 연관된 질환의 진단 및 치료에 유용하다.

Description

ＰＤＧＦＲ-알파에 대한 표적화된 결합제 및 그의 용도{TARGETED BINDING AGENTS DIRECTED TO PDGFR-ALPHA AND USES THEREOF}
관련 출원의 상호참조
본 출원은 35 U.S.C. §119 하에, 그의 전체 내용을 본 원에서 참고로 포함하는 2006년 8월 3일자로 출원된 미국 가출원 제60/835,647호를 우선권으로 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 표적 항원 PDGFR-알파에 대한 표적화된 결합제 및 그의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예로, 본 발명은 PDGFR-알파에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체(fully human monoclonal antibody) 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 측면은 또한 이러한 표적화된 결합제 또는 항체들을 발현하는 하이브리도마 또는 다른 세포주들에 관한 것이다. 상술한 표적화된 결합제 및 항체는 PDGFR-알파의 활성 및/또는 과발현과 연관된 질환의 진단 및 치료에 유용하다.
관련 기술 설명
혈소판 유래 성장 인자(PDGF)는 세포의 성장 및 분열을 조절하는 단백질이다. 이량체로서 존재하고, 두개의 상이한 수용체(PDGFR-알파 및 PDGFR-베타)를 통해 세포 반응을 활성화하는 다섯개의 상이한 PDGF 아이소타입(isotype)(A, B, C, D 및 AB 헤테로이량체)이 존재한다. 특히, PDGF 이량체는 두 수용체에 결합하여 동시에 수용체의 이량체화, 자기인산화 및 세포내 신호전달을 유도한다.
혈소판 유래 성장 인자 수용체-알파(PDGFR-알파, CD140a로도 알려져 있음)는 다섯개의 IgG-류 도메인을 지닌 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 촉매 세포내 도메인을 특징으로 하는 III형 수용체 티로신 키나제이다. PDGFR-알파는 구조적으로 유사한 PDGFR-베타와 호모이량체 또는 헤테로이량체를 형성할 수 있다. PDGF-AA는 알파-알파 수용체 이량체만을 활성화하고, PDGF-AB 및 PDGF-CC는 알파-알파 및/또는 알파-베타 수용체 이량체를 활성화하며, PDGF-BB는 수용체 이량체의 세 배합체 모두를 활성화한다.
PDGFR-알파는 종양발생에 관여하며, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암 및 자궁내막암을 비롯한 다수 암 뿐 아니라 간세포 암종, 교모세포종, 흑색종, 및 위장관 간질 종양(GIST)에 연루된다.
몇몇 회사가 PDGFR-알파를 표적으로 하는 치료제를 개발하였다. Gleevec®(Novartis®) 및 SUTENT/SU11248(수니티닙 말레이트, Pfizer®)은 PDGFR-알파 뿐만 아니라 다른 수용체 티로신 키나제도 표적으로 하는 소분자 약물이다. 또한, PDGFR-알파를 표적으로 하는 모노클로날 항체가 보고되었다. 국제 특허 공개 제 WO1992/013867호에 마우스 또는 토끼 모노클로날 및/또는 폴리클로날 항체가 PDGF 수용체 작제물로 제조될 수 있음이 기재되었다. 국제 특허 공개 제 WO1995/000659호는 PDGFR-알파에 결합하나, PDGFR-베타에는 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, PDGFR-알파에 특이적인 모노클로날 항체에 관한 것이다. 상기 출원에는 고상 효소 면역 흡착 측정법(solid phase enzyme linked immunosorbent assay)으로 측정된 경우, 1/2 최대 결합 친화성이 5O pM 및 75 pM인 것을 특징으로 하는 두 항체가 기술되었다. 국제 특허 공개 제 WO2006/138729호에는 PDGFR-알파를 표적으로 하는, 3G3으로 칭해지는 완전한 인간 모노클로날 항체(ImClonc Systems, Inc.)가 개시되었다. 이 항체는 2가 친화성 분석법(여기에서, 가용성 PDGFR-알파는 센서 칩상에 고정되었으며, 항체는 다양한 농도로 주입됨)으로 측정한 경우, 가용성 PDGFR-알파에 대해 40 pM의 친화성을 가지는 것으로 보고되었다. 이 특허 출원에 기재된 바와 같이, 2가 분석법에서는, 실험 인공 산물이 측정된 친화성에 영향을 미칠 수 있다.
친화성이 40 pM을 초과하는 항체는 표준 투여량으로 인간에 투여되는 경우 PDGFR-알파 억제 정도 및/또는 기간을 늘릴 수 있기 때문에 바람직할 수 있다. 친화성이 40 pM을 초과하는 항체는 저 친화성 항체보다 낮은 유효 용량으로 투여될 수 있거나, 저 친화성 항체에 대한 표준 투약 간격에 비해 더 긴 투약 간격으로 투여될 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 구체예는 PDGFR-알파에 특이적으로 결합하고 PDGFR-알파를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 표적화된 결합제에 관한 것이다. 이것이 일어날 수 있는 메카니즘은, 종양 세포 성장에 관여하는 리간드 결합의 차단 및/또는 세포 신호전달 억제와, 혈관형성의 감소로 이어지는 간질 섬유모세포 성분의 저해를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 표적화된 결합제는 종양 성장 및 혈관형성을 감소시키는데 유용하다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 PDGFR-알파에 결합하여 PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB 및/또는 PDGF-CC 리간드가 PDGFR-알파에 결합하는 것을 억제하는 완전한 인간 항체이다. 본 발명의 다른 구체예는 PDGFR-알파에 결합하고, 수용체 자기인산화를 억제하는 완전한 인간 모노클로날 항체이다. 본 발명의 또 다른 구체예는 PDGFR-알파에 결합하고, 세포 성장에 관여하는 하류 세포 신호전달을 억제하는 완전한 인간 모노클로날 항체이다.
일부 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 PDGFR-알파에 결합하고, PDGFR-베타 수용체와 교차-반응하지 않으며, 즉 표적화된 결합제는 단일특이성이다. 일부 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 PDGFR-알파에 결합하고, 다른 클래스 III 수용체 티로신 키나제 패밀리 멤버, 예를 들어 FLT3, c-kit 및/또는 CSF-IR과 교차-반응하지 않는다.
본 발명의 다른 구체예는 본 원에 기술된 임의의 표적화된 결합제 또는 항체와 결합을 위해 경쟁하는 표적화된 결합제이다.
일 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 약 500 피코몰(pM) 미만의 KD로 PDGFR-알파와 결합한다. 다른 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 약 400, 300, 200 또는 100 pM 미만의 KD로 결합한다. 일 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 약 75, 60, 50, 40, 30, 20, 10 또는 5 pM 미만의 KD로 결합한다. 친화성(affinity) 및/또는 결합성(avidity) 측정은 본 원에 기술된 바와 같이, FMAT, FACS, KinExA® 및/또는 BIACORE®를 이용하여 측정할 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 1가 친화성 분석법으로 측정한 경우, 약 400, 300, 200, 또는 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 10 또는 5 pM 미만의 KD로 PDGFR-알파와 결합한다. 1가 친화성은 가용성 수용체가 고정화 항체상으로 유동하는 BIACORE® 분석법으로 측정할 수 있다. 2가 친화성 분석법에 비해, 1가 친화성 분석법으로 보고된 KD는 실험 인공 산물에 영향을 훨씬 덜 받을 것으로 보이며, 따라서 항체의 진정한 1가 친화성에 훨씬 근접한 KD가 보고될 수 있을 것이다. 2가 친화성 분석법에서, 고정화 수용체의 밀도는 단일 항체 분자가 유동하는 경우 그것이 고정화 수용체에 2회 결합 및/또는 재결합하는 정도에 영향을 준다. 그에 따라, 2가 친화성 분석법에서는, 수용체의 밀도가 보고된 KD에 직접 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 1가 친화성 분석법이 생물학적으로 훨씬 관련이 있는 친화성 측정을 제공한다.
다른 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 포화 리간드에 근접한 수준으로 수행된 경우, 약 400, 300, 200, 또는 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 10 또는 5 pM 미만의 IC50으로 수용체 이량체내에 리간드에 의한 인산 전이를 억제한다.
그밖의 다른 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 포화 리간드에 근접한 수준으로 수행된 경우, 약 400, 300, 200, 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 10 또는 5 pM 미만의 IC50으로 리간드에 의한 수용체 자기인산화를 억제한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 항체이다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 모노클로날 항체이다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 완전한 인간 모노클로날 항체이다. 본 발명의 다른 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소타입의 완전한 인간 모노클로날 항체이다. 본 발명의 다른 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 IgG2 아이소타입의 완전한 인간 모노클로날 항체이다. 이 아이소타입은 다른 아이소타입에 비해 효과기(effector) 기능 유발 가능성을 감소시켜 독성 감소로 이어질 수 있다.
추가의 구체예는 PDGFR-알파에 결합하고, 표 12에 예시된 1, 2 또는 3개의 상보성 결정 영역(CDR) 서열을 가지는 중쇄 아미노산 서열 및 표 13에 예시된 1, 2 또는 3개의 CDR 서열을 가지는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 특정 구체예에 있어서, 항체는 완전한 인간 모노클로날 항체이다. 일부 구체예에 있어서, 본 발명은 본 원에 개시된 임의의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
일 구체예에 있어서, 항체 2.175.3, 2.451.1, 2.449.1.3, 2.998.2 또는 2.84.3의 중쇄가 이종 경쇄와 쌍을 이룬다. 경쇄 혼잡성은 당업계에 주지되어 있다. 따라서, 임의의 항체 2.175.3. 2.451.1, 2.449.1.3, 2.998.2 또는 2.84.3, 또는 본 원에 개시된 다른 항체의 중쇄가 임의의 항체 2.175.3, 2.451.1, 2.449.1.3, 2.998.2, 2.84.3, 또는 본 원에 개시된 다른 항체의 경쇄와 쌍을 이룬다.
일 구체예로, 항원 결합 부위는 개시된 CDRs 내에 20, 16, 10, 9 또는 그 미만, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 정도로 많은 아미노산 첨가, 치환, 결실 및/또는 삽입과 함께, 임의의 항체 2.175.3, 2.451.1, 2.449.1.3, 2.998.2, 2.84.3의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 잠재적으로 CDRs 내 임의의 잔기에서 이루어질 수 있다.
다른 구체예로, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 12 또는 표 13에 예시된 바와 같은 CDR1, CDR2 또는 CDR3 서열중 어느 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯개를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예로, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 12에 예시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예로, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 13에 예시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예로, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 12에 예시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 표 13에 예시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 당업자들은 CDR 결정을 용이하게 수행할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]을 참조바란다.
또 다른 구체예로, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 12 또는 표 13에 예시된 바와 같은 완전한 인간 모노클로날 항체 2.175.3, 2.449.1.3 또는 2.998.2중 어느 하나의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 서열중 어느 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯개를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예로, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 12에 예시된 바와 같은 완전한 인간 모노클로날 항체 2.175.3, 2.449.1.3 또는 2.998.2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예로, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 13에 예시된 바와 같은 완전한 인간 모노클로날 항체 2.175.3, 2.449.1.3 또는 2.998.2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예로, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 12에 예시된 바와 같은 완전한 인간 모노클로날 항체 2.175.3, 2.449.1.3 또는 2.998.2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 표 13에 예시된 바와 같은 완전한 인간 모노클로날 항체 2.175.3, 2.449.1.3 또는 2.998.2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예로, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 12에 예시된 바와 같은 완전한 인간 모노클로날 항체 2.175.3의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 표 13에 예시된 바와 같은 완전한 인간 모노클로날 항체 2.175.3의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예로, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 12에 예시된 바와 같은 완전한 인간 모노클로날 항체 2.449.1.3의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 표 13에 예시된 바와 같은 완전한 인간 모노클로날 항체 2.449.1.3의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예로, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 12에 예시된 바와 같은 완전한 인간 모노클로날 항체 2.998.2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 표 13에 예시된 바와 같은 완전한 인간 모노클로날 항체 2.998.2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 구체예는 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체와 PDGFR-알파에 결합하기 위해 경쟁하는 표적화된 결합제이다. 본 발명의 다른 구체예는 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체와 PDGFR-알파에 결합하기 위해 경쟁하는 항체이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 완전한 인간 모노클로날 항체 2.175.3, 2.449.1.3 또는 2.998.2중 어느 하나와 PDGFR-알파에 결합하기 위해 경쟁한다. 본 발명의 일 구체예로, PDGFR-알파에 결합하기 위해 완전한 인간 모노클로날 항체 2.175.3. 2.449.1.3 또는 2.998.2중 어느 하나와 경쟁하는 항체가 제공된다.
본 발명의 추가의 구체예는 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체와 동일한 PDGFR-알파상의 에피토프에 결합하는 표적화된 결합제 또는 항체이다. 본 발명의 다른 구체예는 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체와 동일한 PDGFR-알파상의 에피토프에 결합하는 항체이다. 본 발명의 일 구체예로, 완전한 인간 모노클로날 항체 2.175.3, 2.449.1.3 또는 2.998.2중 어느 하나와 동일한 PDGFR-알파상의 에피토프에 결합하는 표적화된 결합제가 제공된다. 본 발명의 일 구체예로, 완전한 인간 모노클로날 항체 2.175.3, 2.449.1.3 또는 2.998.2중 어느 하나와 동일한 PDGFR-알파상의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 구체예는 프레임워크 영역(framework region) 및/또는 상보성 결정 영역(CDR's) 관통 인접 중쇄 및 경쇄 서열, 특히 표 12 또는 표 13에 예시된 바와 같은 모노클로날 항체중 어느 하나의 FR1 내지 FR4 또는 CDR1 내지 CDR3을 포함하는 표적화된 결합제 또는 항체이다.
일 구체예로, 서열번호 2의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 표적화된 결합제 또는 그의 항원-결합 부분이 제공된다. 일 구체예에 있어서, 상기 표적화된 결합제 또는 그의 항원-결합 부분은 서열번호 4의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 다른 구체예는 서열번호 10의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 표적화된 결합제 또는 그의 항원-결합 부분이다. 일 구체예에 있어서, 상기 표적화된 결합제 또는 그의 항원-결합 부분은 서열번호 12의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예는 서열번호 14의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 표적화된 결합제 또는 그의 항원-결합 부분이다. 일 구체예에 있어서, 상기 표적화된 결합제 또는 그의 항원-결합 부분은 서열번호 16의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
일 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 하나 이상의 완전한 인간 모노클로날 항체 2.175.3, 2.449.1.3 또는 2.998.2를 포함한다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 표적화된 결합제는 서열번호 2의 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 서열은 표 6의 각 칼럼에 제시된 생식계통(germline) 및 비생식계통 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 본 발명의 표적화된 결합제는 서열번호 10의 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 서열은 표 8의 각 칼럼에 제시된 생식계통 및 비생식계통 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 본 발명의 표적화된 결합제는 서열번호 14의 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 서열은 표 10의 각 칼럼에 제시된 생식계통 및 비생식계통 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 본 발명의 표적화된 결합제는 서열번호 4의 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 서열은 표 7의 각 칼럼에 제시된 생식계통 및 비생식계통 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 본 발명의 표적화된 결합제는 서열번호 12의 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 서열은 표 9의 각 칼럼에 제시된 생식계통 및 비생식계통 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 본 발명의 표적화된 결합제는 서열번호 16의 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 서열은 표 11의 각 칼럼에 제시된 생식계통 및 비생식계통 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 서열번호 2의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하며, 상기 서열은 표 6의 각 칼럼에 제시된 생식계통 및 비생식계통 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 서열번호 10의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하며, 상기 서열은 표 8의 각 칼럼에 제시된 생식계통 및 비생식계통 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 서열번호 14의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하며, 상기 서열은 표 10의 각 칼럼에 제시된 생식계통 및 비생식계통 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 서열번호 4의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 포함하며, 상기 서열은 표 7의 각 칼럼에 제시된 생식계통 및 비생식계통 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 서열번호 12의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 포함하며, 상기 서열은 표 9의 각 칼럼에 제시된 생식계통 및 비생식계통 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 서열번호 16의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 포함하며, 상기 서열은 표 11의 각 칼럼에 제시된 생식계통 및 비생식계통 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 서열번호 2, 6 또는 10에 따른 중쇄 서열을 포함하며, 여기에서,
30 위치의 잔기는 S 및 R 중에서 선택되고;
31 위치의 잔기는 S, N 및 D 중에서 선택되며;
33 위치의 잔기는 G 및 Y 중에서 선택되고;
35 위치의 잔기는 S, H 및 N 중에서 선택되며;
50 위치의 잔기는 Y, V 및 F 중에서 선택되고;
53 위치의 잔기는 Y, S 및 R 중에서 선택되며;
54 위치의 잔기는 S 및 D 중에서 선택되고;
57 위치의 잔기는 T, L, N 및 I 중에서 선택되며;
58 위치의 잔기는 K 및 I 중에서 선택되고;
61 위치의 잔기는 V 및 A 중에서 선택되며;
99 위치의 잔기는 G, D 및 E 중에서 선택되거나, 잔기는 결실되고;
100 위치의 잔기는 G 중에서 선택되거나, 잔기는 결실되며;
101 위치의 잔기는 S, H, P 및 R 중에서 선택되고;
102 위치의 잔기는 Y 및 I 중에서 선택되며;
103 위치의 잔기는 S, V 및 A 중에서 선택되고;
104 위치의 잔기는 G 및 A 중에서 선택되며;
105 위치의 잔기는 S 및 R 중에서 선택되고;
106 위치의 잔기는 P 및 G 중에서 선택되며;
107 위치의 잔기는 F 및 M 중에서 선택되고;
109 위치의 잔기는 Y 및 V 중에서 선택된다.
상기 중쇄 서열군은 "A 군"으로 칭해진다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 서열번호 14 또는 18의 중쇄 서열을 포함하며, 여기에서,
27 위치의 잔기는 G 및 D 중에서 선택되고;
28 위치의 잔기는 S 및 F 중에서 선택되며;
32 위치의 잔기는 S 및 F 중에서 선택되고;
33 위치의 잔기는 S, N, T 및 I 중에서 선택되며;
52 위치의 잔기는 S 및 T 중에서 선택되고;
56 위치의 잔기는 S 및 T 중에서 선택되며;
58 위치의 잔기는 S 및 T 중에서 선택되고;
63 위치의 잔기는 S 및 P 중에서 선택되며;
100 위치의 잔기는 H 중에서 선택되거나, 잔기는 결실되고;
101 위치의 잔기는 H 중에서 선택되거나, 잔기는 결실되며;
103 위치의 잔기는 V 중에서 선택되거나, 잔기는 결실된다.
상기 중쇄 서열군은 "B 군"으로 칭해진다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 서열번호 4, 8 또는 12에 따른 경쇄 서열을 포함하며, 여기에서,
25 위치의 잔기는 A 및 P 중에서 선택되고;
27 위치의 잔기는 Q, R 및 H 중에서 선택되며;
28 위치의 잔기는 G, V, S, I, D 및 R 중에서 선택되고;
29 위치의 잔기는 I 및 F 중에서 선택되며;
30 위치의 잔기는 S, N, A, R 및 T 중에서 선택되고;
31 위치의 잔기는 S, H, K, T 및 R 중에서 선택되며;
32 위치의 잔기는 S, T, Y, D, N 및 F 중에서 선택되고;
33 위치의 잔기는 L 및 I 중에서 선택되며;
50 위치의 잔기는 A, G, L, Y, S 및 V 중에서 선택되고;
51 위치의 잔기는 A, G 및 S 중에서 선택되며;
53 위치의 잔기는 T, Q, N, H, R 및 S 중에서 선택되고;
54 위치의 잔기는 L, R 및 S 중에서 선택되며;
55 위치의 잔기는 Q, P, F, A 및 V 중에서 선택되고;
56 위치의 잔기는 S, N, T 및 G 중에서 선택되며;
91 위치의 잔기는 S 및 T 중에서 선택되고;
92 위치의 잔기는 Y 및 F 중에서 선택되며;
94 위치의 잔기는 N, T 및 S 중에서 선택되거나, 잔기는 결실되고;
95 위치의 잔기는 F, W, P, I, A 및 L 중에서 선택되거나, 잔기는 결실되며;
96 위치의 잔기는 P 중에서 선택되거나, 잔기는 결실되고;
97 위치의 잔기는 W, L, R 및 I 중에서 선택되거나, 잔기는 결실된다.
상기 경쇄 서열군은 "C 군"으로 칭해진다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 서열번호 16 또는 20에 따른 경쇄 서열을 포함하며, 여기에서,
28 위치의 잔기는 S, I, G, D, R 및 V 중에서 선택되고;
29 위치의 잔기는 F, I 및 V 중에서 선택되며;
30 위치의 잔기는 S, A, T, G, R 및 N 중에서 선택되고;
31 위치의 잔기는 S, R, K, N 및 T 중에서 선택되며;
32 위치의 잔기는 Y, F, W, N, D 및 S 중에서 선택되고;
33 위치의 잔기는 L 및 I 중에서 선택되며;
34 위치의 잔기는 N, A 및 H 중에서 선택되고;
50 위치의 잔기는 A, Y, G, L 및 V 중에서 선택되며;
51 위치의 잔기는 A, G 및 S 중에서 선택되고;
52 위치의 잔기는 A, Y, G, L 및 V 중에서 선택되며;
54 위치의 잔기는 L, R 및 S 중에서 선택되고;
55 위치의 잔기는 Q, F, V, A 및 P 중에서 선택되며;
56 위치의 잔기는 S, N, T 및 G 중에서 선택되고;
92 위치의 잔기는 S 및 T 중에서 선택되며;
93 위치의 잔기는 S, N 및 I 중에서 선택된다.
상기 경쇄 서열군은 "D 군"으로 칭해진다.
일 구체예로, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 A 군 중쇄 서열중 어느 하나 및 C 군 또는 D 군 경쇄 서열중 어느 하나를 포함한다.
일 구체예로, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 B 군 중쇄 서열중 어느 하나 및 C 군 또는 D 군 경쇄 서열중 어느 하나를 포함한다.
일 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 본 원에 개시된 모노클로날 항체 또는 본 원에 개시된 경쇄 또는 중쇄 서열 또는 본 원에 개시된 CDRs의 변이체 또는 유도체를 함유한 항체를 포함한다. 변이체는 표 12 또는 표 13에 예시된 바와 같은 임의의 CDR1, CDR2 또는 CDR3, 또는 본 원에 개시된 경쇄 또는 중쇄 서열, 또는 본 원에 개시된 모노클로날 항체와 적어도 약 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 약 99% 아미노산 서열 동일성(identity)을 가지는 경쇄 또는 중쇄 서열을 가지는 항체를 포함한다. 일 구체예로, 변이체는 자연 발생적이거나, 또는 재조합 DNA 기술 또는 돌연변이 유발 기술을 이용하여 천연 서열을 시험관 내 공학처리함으로써 도입된 CDR 서열 또는 본 원에 개시된 경쇄 또는 중쇄 서열 변화를 포함한다. 자연 발생적인 변이체는 외래 항원에 대한 항체의 생성동안 상응하는 생식계통 뉴클레오티드 서열에서 생체 내로 생성된 것을 포함한다. 일 구체예로, 유도체는 이종 항체일 수 있으며, 즉 2 이상의 항체가 함께 연결된 항체이다. 유도체는 화학적으로 변형된 항체를 포함한다. 이의 예로는 하나 이상의 중합체, 예컨대 수용성 중합체, N-결합 또는 O-결합된 탄수화물, 당, 인산염 및/또는 기타 이러한 분자의 공유 결합을 들 수 있다. 유도체는 부착 분자의 타입 또는 위치가 자연 발생적이거나, 출발 항체와 상이한 방식으로 변형된다. 유도체는 항체상에 자연적으로 존재하는 하나 이상의 화학기의 결실을 더 포함한다.
본 발명의 다른 구체예는 PDGFR-알파에 결합하고, VH3-11 생식계통 서열로부터 유래된 중쇄 폴리펩티드를 가지는 인간 모노클로날 항체를 포함한다. 본 발명의 그밖의 다른 구체예는 PDGFR-알파에 결합하고, VH4-39 생식계통 서열로부터 유래된 중쇄 폴리펩티드를 가지는 인간 모노클로날 항체를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예는 PDGFR-알파에 결합하고, D1-26, D6-6 또는 D7-27 생식계통 서열로부터 유래된 중쇄 폴리펩티드를 가지는 인간 모노클로날 항체를 포함한다. 본 발명의 일부 구체예는 PDGFR-알파에 결합하고, Vk 경쇄를 가지는 인간 모노클로날 항체를 포함한다. 본 발명의 그밖의 다른 구체예는 VH3-11 또는 VH4-39 중쇄 유전자에 의해 코딩되거나 이로부터 유래된 중쇄와 쌍을 이룬 Vk 경쇄를 가지는 모노클로날 항체를 포함한다. 일부 구체예에 있어서, Vk 경쇄 폴리펩티드는 JK1 경쇄 유전자에 의해 코딩되거나 이로부터 유래된다. 또 다른 구체예에 있어서, Vk 경쇄 폴리펩티드는 JK5 경쇄 유전자에 의해 코딩되거나 이로부터 유래된다.
본 발명의 다른 구체예는 PDGFR-알파에 결합하고, VH3-11 생식계통 서열로부터 유래된 중쇄 폴리펩티드 및 012 경쇄 유전자로부터 유래된 Vk 경쇄 폴리펩티드를 가지는 인간 모노클로날 항체를 포함한다. 본 발명의 추가의 구체예는 PDGFR-알파에 결합하고, VH3-11 생식계통 서열로부터 유래된 중쇄 폴리펩티드 및 012 생식계통 서열 경쇄로부터 유래된 Vk 경쇄 폴리펩티드를 가지며, 여기에서 경쇄의 CDR1 중 제2 아미노산은 프롤린을 코딩하는 인간 모노클로날 항체를 포함한다. 경쇄의 CDR1 중 제2 아미노산 위치에서 프롤린을 코딩하는 것과 함께 VH3-11 중쇄 유전자 사용을 O12 경쇄 유전자 사용과 조합한 이러한 예는 다른 종류의 CDR3 중쇄 및 경쇄 서열, 즉 2.449.1.3 및 2.175.3(표 12 및 13 참조)을 가지는 독립 계통의 두 항체로부터 유래된 항체로 예시된다.
모노클로날 항체 2.175.3 및 2.449.1.3은 둘 다 PDGFRa에 고 친화성 항체이며, 시험관 내에서 고 효능으로 PDGF-유도 세포 반응을 차단한다. 이들 두 항체가 VH(VH3-11) 및Vk (012) 사용을 공유하더라도, 이들은 D, JH 및 Jk 사용이 다르다. 따라서, 이들은 상이한 B-세포 계통으로부터 유래된다. 그러나, 이들은 독특한 Vk 서열 패턴을 공유한다. 양 항체에서 잔기 25는 생식계통 알라닌으로부터 돌연변이된 프롤린이다. 프롤린은 어떠한 Vk 생식계통 유전자에 의해서도 사용되지 않으며, 카바트(Kabat) 데이터베이스의 경우 불과 0.2%의 인간 서열에서만이 이 위치에서 일어난다. 25 위치의 프롤린은 펩티드 백본에 예리한 각 및 단단한 펩티드 결합을 삽입할 것이며, 따라서 이들 양 항체의 경쇄의 Vk 영역내에 독특한 구조 특성이 발생할 것이다. 마찬가지로, Vk의 CDR1 중 27e 위치(카바트 넘버링)에서 돌연변이 아르기닌이 2.175.3 및 2.449.1.3 모두에 의해 이용된다. 아르기닌은 어떠한 Vk 생식계통 유전자에 의해서도 이러한 정규 위치에 사용되지 않으며, 카바트 데이터베이스의 경우 불과 0.4%의 인간 서열에서 일어난다. 본 발명의 일 구체예로, PDGFR-알파에 결합하고, 잔기 25에 프롤린을 포함하는 인간 모노클로날 항체가 제공된다. 본 발명의 일 구체예로, PDGFR-알파에 결합하고, CDR1의 27e 위치에 아르기닌을 포함하는 인간 모노클로날 항체가 제공된다.
본 발명의 다른 구체예로, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 그의 결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 본 발명의 또 다른 구체예로 본 발명의 항체 또는 그의 결합 단편 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 그밖의 다른 구체예는 종양성 질환의 치료가 필요한 동물을 선별하고, PDGFR-알파에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료적 유효량을 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 종양성 질환으로 고통받는 동물의 효과적인 치료방법을 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 동물은 인간이다. 특정 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 완전한 인간 모노클로날 항체이다. 특정 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는본 발명의 항체이고, 2.175.3, 2.449.1.3, 또는 2.998.2에서 선택될 수 있다.
치료가능한 종양성 질환으로는 예를 들어 흑색종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경아교종, 간세포(간) 암종, 갑상선 종양, 위(위장) 암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 교모세포종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도 암종, 두경부암, 중피종, 육종, 담도(담관암종), 소장 선암종, 소아 악성 종양, 표피양 암종 및 위장관 간질 종양(GIST)을 들 수 있다.
일 구체예로, 본 발명은 단독 또는 부분적으로 PDGFR-알파에 의존성인 종양 환자에서 PDGFR-알파를 길항하는데 사용하기에 적합하다.
본 발명의 추가의 구체예는 동물에서 종양 세포 성장을 억제하는 방법을 포함한다. 이 방법은 종양 세포 성장의 치료가 필요한 동물을 선별하고, PDGFR-알파에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료적 유효량을 동물에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예로, 본 발명의 방법은 종양 세포 성장의 치료가 필요한 동물을 선별하고, PDGFR-알파에 특이적으로 결합하는 완전한 인간 모노클로날 항체의 치료적 유효량을 동물에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 구체예는 동물에서 PDGFR-알파 발현이 연루된 질환 치료용 약제를 제조하는데 있어서 PDGFR-알파에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 용도를 포함한다. 본 발명의 추가의 구체예는 동물에서 PDGFR-알파 발현이 연루된 질환 치료용 약제를 제조하는데 있어서 PDGFR-알파에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 용도를 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 본 원에 개시된 표적화된 결합제 또는 항체는 동물에서 종양성 질환 치료용 약제를 제조하는데 사용될 수 있으며, 여기에서 항체는 PDGFR-알파에 특이적으로 결합한다.
본 원에 개시된 본 발명의 구체예는 PDGFR-알파에 결합하고, PDGFR-알파 기능에 영향을 미치는 모노클로날 항체에 관한 것이다. 다른 구체예는 PDGFR-알파에 대한 높은 결합 친화성, PDGFR-알파 신호전달 억제에 높은 선택성, 저 독성, PDGFR-알파에 대한 결합으로부터 PDGF-AA 리간드를 차단하는 능력, PDGFR-알파에 대한 결합으로부터 PDGF-AB 리간드를 차단하는 능력, PDGFR-알파에 대한 결합으로부터 PDGF-BB 리간드를 차단하는 능력, PDGFR-알파에 대한 결합으로부터 PDGF-CC 리간드를 차단하는 능력 및/또는 시험관 내 및 생체 내에서 종양 세포 성장을 억제하는 능력을 비롯하여, 치료적 측면에서 바람직한 특성을 가지는 완전한 인간 항 PDGFR-알파 항체 및 항 PDGFR-알파 항체 제제에 관한 것이다. 본 발명의 일부 구체예는 PDGFR-베타와 실질적으로 교차 반응하지 않는 완전한 인간 항 PDGFR-알파 항체에 관한 것이다. 본 발명의 다른 구체예는 상당한 인간 항-키메라 항체(Human Anti-Chimeric Antibody, HACA) 반응을 이끌지 않아 반복 투여가 가능할 수 있는 완전한 인간 항 PDGFR-알파 항체 및 항 PDGFR-알파 항체 제제에 관한 것이다.
일 구체예에 있어서, 본 발명은 매우 높은 친화성(Kd)으로 PDGFR-알파에 결합하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 또는 10-11 M 미만 또는 이중 임의의 범위 또는 값이 예시되나 이에 제한되지 않는 Kd로 PDGFR-알파에 결합할 수 있는 인간, 토끼, 마우스, 키메라 또는 인간화 항체가 예시된다. 친화성 및/또는 결합성 측정은 본 원에 기술된 KinExA® 및/또는 BIACORE®를 이용하여 측정할 수 있다.
따라서, 본 원에 개시된 일 구체예는 PDGFR-알파에 결합하는 분리 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 항체는 유리하게는 예를 들어 폴리클로날, 올리고클로날, 모노클로날, 키메라, 인간화 및/또는 완전한 인간 항체일 수 있다. 본 원에 개시된 본 발명의 구체예는 또한 이들 항체를 생성하기 위한 세포를 제공한다.
본 발명의 구체예가 항체의 어떤 특정 형태나, 발생 또는 제조 방법에 제한되지 않는 것으로 이해하여야 한다. 예를 들어, 항 PDGFR-알파 항체는 전장(full-length) 항체(예를 들어, 온전한 인간 Fc 영역을 가지는) 또는 항체의 결합 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, FV 또는 dAb)일 수 있다. 또한, 항체는 항체를 분비하는 하이브리도마 또는 항체를 코딩하는 유전자(들)로 형질전환되거나 형질감염된 재조합적으로 공학처리된 세포로 부터 제조될 수 있다. 추가로, 항체는 PDGFR-알파에 결합하는 낙타과(camelid) 또는 인간 단일 VH 또는 VL 도메인 등의 단일 도메인 항체, 예컨대 dAb 단편일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 본 원에 개시된 임의의 표적화된 결합제 또는 항체를 코딩하는 분리된 핵산 분자, 항 PDGFR-알파 항체를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 가지는 벡터 또는 이러한 임의의 핵산 분자로 형질전환된 숙주 세포를 포함한다. 또한, 본 발명의 일 구체예는 핵산 분자를 발현하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하고, 생산된 항체를 회수하여 항 PDGFR-알파 항체를 생산하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 인간 PDGFR-알파를 발현하는 세포, 인간 PDGFR-알파를 포함하는 분리된 세포막, 정제된 인간 PDGFR-알파 또는 그 단편 및/또는 하나 이상의 오르소로거스(orthologous) 서열 또는 그 단편으로 포유동물을 면역화시켜 PDGFR-알파에 대한 높은 친화성을 가지는 항체를 생산하는 방법을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예는 PDGFR-알파에 특이적으로 결합하는 분리 항체의 생산 및 동정에 기반한다. PDGFR-알파는 다수의 종양 타입상에서 발현된다. PDGFR-알파를 중화하는 항체는 PDGFR-알파에 의해 유도되는 종양 성장을 방지할 수 있거나, 소기 효과를 달성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 본 원에 개시된 바와 같이 제조된 항체를 사용하여 환자 또는 환자 샘플에서 PDGFR-알파의 수준을 검출하는, 질환 또는 상태의 진단 방법을 포함한다. 본 발명의 추가의 구체예에 있어서, 항 PDGFR-알파 항체를 사용하여 PDGFR-알파의 발현 및/또는 과발현을 확인하는 단계를 포함하는, 위험 인자의 확인, 질환의 진단 및 질환의 단계를 구분하는 방법이 제공된다. 본 발명의 일부 구체예에 있어서, 상기 방법은 세포에서 PDGFR-알파 단백질에 선택적으로 결합하는 완전한 인간 항체 접합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 항체 접합체는 PDGFR-알파에 선택적으로 결합하는 항체 및 표지를 포함한다. 상기 방법은 추가로 환자에서 상기 표지의 존재를 관찰하는 단계를 포함한다. 표지의 양이 상대적으로 많으면 질환의 위험성이 상대적으로 높은 것을 나타낼 것이고, 표지의 양이 상대적으로 적으면 질환의 위험성이 상대적으로 낮은 것을 나타낼 것이다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 표지는 녹색 형광 단백질이다.
본 발명은 또한, 항 PDGFR-알파 항체를 환자로부터 얻은 생물학적 샘플과 접촉하는 단계 및 상기 샘플에서 상기 항체와 PDGFR-알파 간의 결합 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 환자의 샘플에서 PDGFR-알파의 수준을 분석하는 방법을 제공한다. 본 발명의 더욱 특정적인 구체예에 있어서, 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈청이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 혈청 또는 세포를 항 PDGFR-알파 항체와 접촉시킨 후 PDGFR-알파의 존재를 검출함으로써, 세포에서 PDGFR-알파의 발현과 관련된 상태를 진단하는 방법을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 PDGFR-알파를 발현하는 세포가 관련된 질환을 선별하기 위하여 포유동물의 조직, 세포 또는 체액에서 PDGFR-알파를 검출하는 검사 키트(assay kit)를 포함한다. 상기 키트는 PDGFR-알파에 결합하는 항체 및 존재하는 경우 PDGFR-알파와 항체의 반응을 나타내기 위한 수단을 포함한다. 항체는 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 일 구체예에 있어서, PDGFR-알파에 결합하는 항체는 표지된다. 또 다른 구체예에 있어서, 항체는 비표지된 1차 항체이고, 키트는 상기 1차 항체를 검출하기 위한 수단을 추가로 포함한다. 일 구체예에 있어서, 수단은 항 면역글로불린인 표지된 2차 항체를 포함한다. 바람직하게, 상기 항체는 플루오로크롬, 효소, 방사선핵종(radionuclide) 및 방사선 비투과성 물질로 구성된 군중에서 선택되는 마커로 표지된다.
또 다른 구체예는 항 PDGFR-알파 항체의 유효량을 환자에 투여하여, 환자에서 PDGFR-알파의 발현과 관련된 질환이나 상태를 치료하는 방법을 포함한다. 항 PDGFR-알파 항체는 단독으로 투여되거나, 또는 추가의 항체, 화학치료 약물 또는 방사선 치료와 병용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 종양 성장을 억제하는 PDGFR-알파 항체의 모노클로날, 올리고클로날 또는 폴리클로날 혼합물은 종양세포의 증식을 직접적으로 억제하는 것으로 판명된 약물과 병용 투여될 수 있다. 상기 방법은 생체 내에서 수행될 수 있으며, 환자는 바람직하게는 인간 환자이다.
일부 구체예에 있어서, 항 PDGFR-알파 항체는 보체를 고정하고 보체-의존성 세포독성(CDC)에 관여하는 능력을 증대시키도록 변형될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 항 PDGFR-알파 항체는 효과기 세포의 활성화와 항체-의존성 세포독성(ADCC)에 관여하는 능력을 증대시키도록 변형될 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 항 PDGFR-알파 항체는 효과기 세포의 활성화와 항체-의존성 세포독성(ADCC)에 관여하는 능력을 증대시키고, 보체를 고정하고 보체-의존성 세포독성(CDC)에 관여하는 능력을 증대시키도록 변형될 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 컨테이너를 포함하는 제품을 제공한다. 컨테이너는 항 PDGFR-알파 항체를 포함하는 조성물 및, 이 조성물이 PDGFR-알파의 발현 또는 과발현이 특징인 질환을 치료하기 위하여 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물 또는 라벨을 포함한다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명은 항 PDGFR-알파 모노클로날 항체 및, 치료가 필요한 대상에 모노클로날 항체를 투여하는 것에 대한 설명서를 포함하는, PDGFR-알파 발현과 연관된 질환을 치료하기 위한 키트를 제공한다.
또 다른 측면으로, 환자에서 암성 세포를 선택적으로 사멸시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 환자에게 완전한 인간 항체 접합체를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 완전한 인간 항체 접합체는 PDGFR-알파의 세포외 도메인과 결합할 수 있는 항체 및 약제를 포함한다. 상기 약제는 독소, 방사성 동위원소 또는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 또 다른 물질이다. 이에 따라 항체 접합체는 암세포를 선택적으로 사멸시키게 된다. 상기 약제는 사포린일 수 있다.
일 측면으로, PDGFR-알파에 결합하는 접합된 완전한 인간 항체가 제공된다. 약제가 항체에 결합하고, 항체가 세포에 결합하면 약제가 세포에 전달된다. 일 구체예에 있어서, 상기 접합된 완전한 인간 항체는 PDGFR-알파의 세포외 도메인에 결합한다. 또 다른 구체예에 있어서, 항체와 접합된 독소는 PDGFR-알파를 발현하는 세포에 의해 내재화 된다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 약제는 세포독성제이다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 약제는 사포린, 오리스타틴, 슈도모나스 외독소, 겔로닌, 리신, 칼리케아민 또는 마이탄신계 면역접합체 등이다. 본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 약제는 방사성 동위원소이다.
본 발명의 일부 구체예에 있어서, 본 원에서 제공되는 항체의 글리코실화 패턴은 ADCC 및 CDC 효과기의 기능을 증대시키도록 변형된다(참조: Shields RL, et al., (2002) JBC., 277, 26733, Shinkawa T, et al., (2003) JBC., 278:3466 및 Okazaki A et al., (2004) J. Mol. Biol., 336, 1239).
도 1은 PDGF-AA에 의해 유도된 MG-63 종양 세포의 증식 억제율(%)에 대한 5개의 선별된 모노클로날 항체의 용량 반응을 나타내는 그래프로서, ng/ml의 항체에 대한 것이다. 세포 자극은 100 ng/ml(3.45 nM) PDGF-AA를 사용하여 수행하였다.
도 2a 내지 2b는 Calu-6 비소세포 폐암종 이종이식 모델에서 2.175.3 및 2.449.1.3의 생체 내 항종양 평가 결과를 나타낸다. 도 2a는 시간(일)에 대한 평균 종양 크기(mm3)를 나타내고, 도 2b는 시간(일)에 대한 평균 체중(g)을 나타낸다. 사각형은 비히클 처리군을 나타내고, 원은 2.175.3 10 mg/kg 처리군을 나타내며, 삼각형은 2.449.1.3 10 mg/kg 처리군을 나타낸다.
도 3은 SCID 마우스의 U118 신경아교종 이종이식 모델에서 항체의 생체 내 평가 결과를 나타낸다. 항체 처리군의 종양 크기(mm3)를 시간(일)에 대해 그래프화하였다. 사각형은 비히클 처리군을 나타내고, 원은 2.175.3 10 mg/kg 처리군을 나타내며, 삼각형은 2.449.1.3 10 mg/kg 처리군을 나타낸다.
본 원에 개시된 발명의 구체예는 PDGFR-알파에 결합하는 표적화된 결합제에 관한 것이다. 일부 구체예에 있어서, 표적화된 결합제는 PDGFR-알파에 결합하고 종양 세포의 성장을 억제하는 항체이다. 본 발명의 다른 구체예는 완전한 인간 항 PDGFR-알파 항체, 및 치료적으로 유용한 항체 제제를 포함한다. 이러한 항 PDGFR-알파 항체 제제는 바람직하게는 PDGFR-알파에 강한 결합 친화성, PDGFR-알파 신호전달 억제에 높은 선택성, 저 독성, PDGFR-알파에 대한 결합으로부터 PDGF-AA 리간드를 차단하는 능력, PDGFR-알파 또는 PDGFR-알파/베타 헤테로이량체에 대한 결합으로부터 PDGF-AB 리간드를 차단하는 능력, PDGFR-알파 또는 PDGFR-알파/베타 헤테로이량체에 대한 결합으로부터 PDGF-BB 리간드를 차단하는 능력, PDGFR-알파 또는 PDGFR-알파/베타 헤테로이량체에 대한 결합으로부터 PDGF-CC 리간드를 차단하는 능력 및/또는 시험관 내 및 생체 내에서 종양 세포 성장을 억제하는 능력을 비롯한 바람직한 치료적 특성을 가진다. 일부 구체예는 PDGFR-베타와 교차 반응하지 않는 완전한 인간 항 PDGFR-알파 항체에 관한 것이다.
본 발명의 구체예는 또한 항 PDGFR-알파 항체의 분리된 결합 단편인 표적화된 결합제를 포함한다. 바람직하게, 결합 단편은 완전한 인간 항 PDGFR-알파 항체에서 유래된다. 예시적인 단편은 이하에 보다 상세히 설명되는 바와 같은 Fv, Fab', dAb 또는 다른 널리 공지된 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 구체예는 또한 PDGFR-알파에 대한 완전한 인간 항체를 발현하는 세포를 포함한다. 세포의 예로는 하이브리도마 또는 PDGFR-알파에 대한 항체를 생산하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 재조합적으로 생산된 세포를 포함한다.
또한, 본 발명의 구체예는 질환을 치료하기 위하여 상기 항체를 이용하는 방법을 포함한다. 항 PDGFR-알파 항체는 종양 성장을 억제하는데 유용하다. 작용 메카니즘은 리간드 결합 차단 및/또는 세포 성장에 관여하는 세포 신호전달의 억제를 포함할 수 있으나 이에만 제한되는 것은 아니다. 상기 메카니즘으로 치료될 수 있는 질환으로는 종양성 질환, 예컨대 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암, 교모세포종, 흑색종 및 위장관 간질 종양(GIST)을 비롯한 암을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예는 환자 또는 생물학적 샘플에서 PDGFR-알파의 양 및/또는 존재를 특정적으로 결정하기 위한 진단용 검사를 포함한다. 검사용 키트는 상기 항체를 검출하기 위하여 필요한 표지와 함께 항 PDGFR-알파 항체를 포함할 수 있다. 상기 진단용 검사는 종양성 질환, 예컨대 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암, 교모세포종, 흑색종 및 위장관 간질 종양(GIST)을 비롯한 암을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는 PDGFR-알파-관련 질환을 선별하는데 유용하다.
다른 구체예로, 서열번호 2의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체가 제공된다. 일 구체예에 있어서, 항체는 서열번호 4의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예는 서열번호 10의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 항체는 서열번호 12의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 서열번호 14의 서열을 가지는 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체가 제공된다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 항체는 서열번호 16의 서열을 가지는 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
또 다른 구체예로, 상술된 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 생성하는 하이브리도마가 제공된다. 상기 하이브리도마는 완전한 인간 모노클로날 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 생성할 수 있다. 일 구체예로, 상기 하이브리도마는 완전한 인간 모노클로날 항체 2.175.3, 2.449.1.3 및 2.998.2의 경쇄 및/또는 중쇄를 생성한다. 다른 한편으로, 상기 하이브리도마는 완전한 인간 모노클로날 항체 2.175.3, 2.449.1.3 및 2.998.2와 동일한 에피토프(들)에 결합하는 항체를 생성할 수 있다. 선택적으로, 상기 하이브리도마는 완전한 인간 모노클로날 항체 2.175.3, 2.449.1.3 및 2.998.2와 PDGFR-알파 결합을 위해 경쟁하는 항체를 생성할 수 있다.
그밖의 다른 구체예로, 상술된 항체의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 핵산 분자가 제공된다. 이 구체예에서, 핵산 분자는 완전한 인간 모노클로날 항체의 경쇄 또는 중쇄를 코딩할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 핵산 분자는 완전한 인간 모노클로날 항체 2.175.3, 2.449.1.3 또는 2.998.2 중 하나의 경쇄 또는 중쇄를 코딩한다.
추가의 구체예로, 상술된 핵산 분자(들)를 포함하고, 상술한 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 벡터가 제공된다.
본 발명의 일 구체예는 상술된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 선택적으로, 상기 숙주 세포는 복수개의 벡터를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예는, 핵산 분자를 발현하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하고, 생산된 항체를 회수하여 항체를 생산하는 방법이다.
일 구체예로, 본 발명은 상술된 표적화된 결합제를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자로 적어도 하나의 숙주 세포를 형질감염시키고, 상기 숙주 세포에서 핵산 분자를 발현시킨 후, 표적화된 결합제를 분리하여 표적화된 결합제를 제조하는 방법을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예는 상술된 항체를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 분자로 적어도 하나의 숙주 세포를 형질감염시키고, 상기 숙주 세포에서 핵산 분자를 발현시킨 후, 항체를 분리하여 항체를 제조하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상술된 표적화된 결합제를 투여하여 PDGFR-알파를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법이다. 상기 방법은 PDGFR-알파의 발현과 관련된 질환의 치료가 필요한 동물을 선별하는 단계 및 PDGFR-알파에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료적 유효량을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면은 PDGFR-알파에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료적 유효량을 투여하여 포유동물에서 종양성 질환을 치료하는 방법이다. 상기 방법은 종양성 질환의 치료가 필요한 동물을 선별하는 단계 및 PDGFR-알파에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료적 유효량을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 약제는 단독으로 투여되거나, 항체, 화학치료 약물 또는 방사성 약물로부터 선택된 2차 항종양성 약제와 병용하여 투여될 수 있다.
또 다른 일 측면은 PDGFR-알파에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료적 유효량을 투여하여 포유동물에서 암을 치료하는 방법이다. 상기 방법은 암치료가 필요한 동물을 선별하는 단계 및 PDGFR-알파에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료적 유효량을 상기 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 약제는 단독으로 투여되거나, 항체, 화학치료 약물 또는 방사성 약물로부터 선택된 2차 항 종양성 약제와 병용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 종양성 질환 치료용 약제를 제조하기 위한, PDGFR-알파에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제가 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 PDGFR-알파 발현에 단독으로 또는 부분적으로 의존성인 종양 환자에서 종양 성장을 억제하는데 사용하기에 특히 적합하다.
본 발명의 또 다른 구체예는 종양성 질환 및/또는 섬유성 질환 및/또는 면역계 질환의 선별을 위하여 포유동물의 조직, 세포 또는 체액에서 PDGFR-알파를 검출하기 위한 검사 키트를 포함한다. 상기 키트는 PDGFR-알파에 결합하는 표적화된 결합제 및 존재하는 경우 PDGFR-알파와 표적화된 결합제의 반응을 나타내기 위한 수단을 포함한다. 상기 표적화된 결합제는 모노클로날 항체일 수 있다. 일 구체예에 있어서, PDGFR-알파에 결합하는 항체는 표지된다. 또 다른 구체예에 있어서, 항체는 비표지된 1차 항체이고, 키트는 상기 1차 항체를 검출하는 수단을 추가로 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 수단은 항 면역글로불린인 표지된 2차 항체를 포함한다. 바람직하게, 항체는 플루오로크롬, 효소, 방사선핵종 및 방사선 비투과성 물질을 포함하는 군으로부터 선택되는 마커로 표지된다.
이하, 항 PDGFR-알파 항체에 대한 추가의 구체예, 특징 등을 상세히 설명하기로 한다.
정의
다르게 정의하지 않는 한, 본 원에 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당업계의 숙련자들이 공통적으로 이해하고 있는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 필요치 않으면, 단수 단어는 복수를 포함하고, 복수 단어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본 원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 단백질 및 올리고-, 폴리뉴클레오티드 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 전문 용어 및 기술은 당업계에 공지되고 공용되는 것이다.
재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공법(electroporation), 양이온 지질법(lipofection))에 대해서는 표준 기술을 사용하였다. 효소반응과 정제기술은 제조업자의 설명에 따라 수행되거나, 당업계에 일반적으로 이용되거나, 본 원에 기술된 바와 같이 수행된다. 상술한 기술 및 방법은 일반적으로 당업계에 익히 공지된 통상적인 방법, 및 본 명세서에 전반적으로 인용되고 논의된 여러 일반적인 참조문헌 및 특정적인 참조 문헌에 기술된 바와 같이 수행하였다. 예를 들어, 본 원에서 참고로 인용한 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Mannual(3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001))]을 참고바란다. 본 원에 기술된 분석화학, 합성 유기화학, 의학 화학 및 약학 화학과 관련하여 이용되는 전문 용어, 실험 방법 및 기술은 당업계에서 공지되고 통상적으로 사용되는 것이다. 화학 합성, 화학 분석, 약학적 제조, 제형 및 환자의 치료 및 전달 등에 대해서는 표준 방법을 사용하였다.
본 원에 사용되는 다음의 용어들은, 달리 명시되지 않는 한, 다음과 같은 의미를 갖는 것으로 이해하여야 할 것이다:
화합물은 약 2,000 달톤(Dalton) 미만의 분자량을 가지는 임의의 소분자량 화합물을 의미한다.
"PDGFR-알파"는 PDGFR-알파 유전자에 의해 코딩되는 혈소판 유래 성장 인자 티로신 키나제 수용체-알파를 의미한다. PDGFR-알파는 또한 CD140a 및 PDGFR-α로도 알려져 있다.
"중화"라는 용어는 항체 등의 표적화된 결합제에 대해 언급되는 경우, 이 표적화된 결합제가 표적 항원의 활성을 제거하거나, 상당히 감소시킬 수 있는 능력을 말한다. 따라서, 본 발명의 항 PDGFR-알파 항체의 중화로 PDGFR-알파의 활성을 제거하거나, 상당히 감소시킬 수 있다. PDGFR-알파 항체의 중화는, 예를 들어 그의 수용체 PDGFR-알파에 대한 리간드의 결합을 차단함으로써 작용할 수 있다.
본 원에 사용된 "분리된 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 자연 발생 환경으로부터 분리된 폴리뉴클레오티드를 의미할 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 게놈, cDNA 또는 합성에 의한 것일 수 있다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는, 자연계에서 함께 결합된 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 그 부분과 연계되지 않는다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 연결되지 않는 다른 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결(operably linked) 될 수 있다. 또한, 분리된 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는, 사실상 더 큰 서열의 일 부분으로 발생하지는 않는다.
본 원에서 언급된 "분리 단백질"이란, 자연 발생 환경으로부터 분리된 단백질을 의미한다. 이러한 단백질은 게놈 DNA, cDNA, 재조합 DNA, 재조합 RNA 또는 합성 기원의 것 또는 이들의 일부 조합으로부터 유래될 수 있는데, 기원 또는 유래 기원에 의해, 상기 "분리 단백질"은 (1) 자연에서 발견되는 단백질과 연계되지 않고, (2) 동일 공급원으로부터의 다른 단백질, 예를 들어, 뮤린 단백질이 없으며, (3) 상이한 종의 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연계에서 발생하지 않는다.
본 원에서 포괄적인 용어로 사용된 "폴리펩티드"란 폴리펩티드 서열의 천연 단백질, 단편 또는 유사체를 의미한다. 따라서, 천연 단백질, 단편 및 유사체는 폴리펩티드 속의 종들이다. 본 발명에 따른 바람직한 폴리펩티드는 인간 중쇄 면역글로불린 분자 및 인간 카파(kappa) 경쇄 면역글로불린 분자를 비롯하여, 카파 또는 람다(lambda) 경쇄 면역글로불린 분자 등의 경쇄 면역글로불린과 중쇄 면역글로불린을 포함하는 조합 및 그 반대로 형성된 항체 분자, 및 이들의 단편과 유사체를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 폴리펩티드는 인간 중쇄 면역글로불린 분자 또는 그의 단편만을 단독으로 포함할 수도 있다.
본 원에서 대상에 적용되는 "자연 발생적인(naturally occurring)"이라는 용어는 대상이 자연계에서 발견될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 자연계의 공급물에서 단리할 수 있고 실험실 등에서 인간이 의도적으로 변형시키지 않은 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 자연 발생적인 것이다.
본 원에서 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"이란, 의도하는 방식으로 기능할 수 있는 관련성으로 성분들이 위치하는 것을 의미한다. 예를 들어, 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 조절 서열은 조절 서열과 호환되는 조건하에서 코딩 서열의 발현을 이룰 수 있는 방식으로 연결된 것이다
본 원에서 사용된 "조절 서열"이란, 연결되는 코딩 서열의 발현 및 처리(processing)에 효과 또는 영향을 주는데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 다르다; 원핵생물에서, 이러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위와 전사 종료 서열을 포함하고; 진핵생물에서, 이러한 조절 서열은 일반적으로, 프로모터, 인핸서(enhancer), 인트론, 전사 종료 서열, 폴리아데닐화 신호 서열과 5'와 3'의 비해독 부위를 포함한다. 상기 "조절 서열"이란 용어는, 최소한, 존재가 발현과 처리에 필수적인 모든 성분 및 존재가 이익이 되는 추가의 성분, 예를 들면, 선도서열 및 융합 파트너 서열을 포함하고자 한다.
본 원에 언급된 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 10 염기 이상의 길이인 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미하는데, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 또는 RNA-DNA 헤테로 듀플렉스 유형의 변형된 형태 등일 수 있다. 상기 용어는 단일 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다.
본 원에 언급된 "올리고뉴클레오티드"란 용어는 자연 발생 및 비자연 발생 연결부에 의해서 함께 연결된, 자연적으로 발생되고 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 200 염기 이하의 길이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 소집단이다. 바람직하게, 올리고뉴클레오티드는 그 길이가 10 내지 60 염기이고, 가장 바람직하게는 그 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 내지 40 염기이다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 유전자 돌연변이체의 작제에 사용하기 위해 이중 가닥일 수도 있지만, 일반적으로 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 프로브용으로서 단일 가닥이다. 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 원에 사용된 용어 "자연 발생 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 본 원에 언급된 "변형 뉴클레오티드"라는 용어는 변형되거나 치환된 당 기 등을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 본 원에 언급된 용어 "올리고뉴클레오티드 연결부"는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트, 포스포로아미데이트 등의 올리고뉴클레오티드 연결부를 포함한다. 예를 들어, 본 원에서 참고로 인용된 문헌 [Laplanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081(1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077(1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209(1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991); Zorn et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108(F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England(1991); Stec et al., 미국 특허 제5,151,510호; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543(1990)]을 참조바란다. 올리고뉴클레오티드는 필요에 따라, 검출용 표지를 포함할 수 있다.
본 원에 언급된 "선택적으로 혼성화한다"라는 용어는 검출가능하게 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 그의 단편은 혼성화 및 비특이적 핵산에 검출가능한 상당량의 결합을 최소화하는 세척 조건하에서 핵산 가닥에 선택적으로 혼성화된다. 선택적 혼성화 조건을 이루기 위해 당업계에 공지되고 본 원에 기술된 바와 같은 매우 엄격한 조건이 사용될 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 또는 항체 단편과 대상 핵산 서열 간의 핵산 서열 상동성은 적어도 80%일 것이며, 좀 더 전형적으로는 상동성을 적어도 85%, 90%, 95%, 99% 및 100%로 증가시키는 것이 바람직하다.
용어 "CDR 영역" 또는 "CDR"은 문헌 [Kabat et al. 1991 (Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington) 및 나중판에서 정의한 바와 같은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변성 영역을 나타내고자 한다. 항체는 전형적으로 3 중쇄 CDRs 및 3 경쇄 CDRs를 지닌다. CDR 또는 CDRs 란 용어는 본 원에서 경우에 따라, 항체를 인식하는 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 친화성에 의해 결합에 관여하는 아미노산 잔기 대부분을 함유하는 상기 영역중 하나 또는 수 개 또는 심지어 전체를 나타내기 위하여 사용된다.
중쇄의 제3 CDR(HCDR3)은 더 큰 크기 가변성을 가진다(본질적으로 그를 야기하는 유전자의 배열 메카니즘에 기인한 더 큰 다양성). 가장 긴 크기가 26으로 알려져 있긴 하지만, 이는 2 아미노산 정도로 짧을 수 있다. CDR 길이는 또한 특정 기본 프레임워크에 의해 조정될 수 있는 길이에 따라 달라질 수 있다. 기능적으로, HCDR3은 항체의 특이성 결정에 부분적으로 관여한다(Segal et al., PNAS, 71:4298-4302, 1974, Amit et al., Science, 233:747-753, 1986, Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987, Chothia et al., Nature, 342:877-883, 1989, Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 1990, Sharon et al.. PNAS, 87:4814-4817, 1990. Sharon et al., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990. Kabat et al.. J. Immunol., 147: 1709-1719. 1991).
본 원에서 언급된 "CDRs 세트"라는 용어는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 따라서, HCDRs 세트란 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 의미하고, LCDRs 세트란 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 의미한다. 달리 언급되어 있지 않으면, "CDRs 세트"는 HCDRs 및 LCDRs를 포함한다.
두 아미노산 서열 간에 부분 또는 완전한 동일성이 존재하면, 이 두 서열은 "상동성"이다. 예를 들어, 85% 상동성은 두 서열을 최대 매칭으로 배열시 아미노산의 85%가 동일하다는 의미이다. 갭(매칭한 두 서열에 존재)은 최대 매칭에서 가능하며, 5 이하의 갭 길이가 바람직하고 2 이하의 갭 길이가 보다 바람직하다. 다르게 그리고 바람직하게, 두 단백질 서열(또는 이들로 부터 유래된 약 30 아미노산 이상의 길이인 폴리펩티드 서열)은 상기 용어를 사용하는 것과 같이 6 이상의 갭 패널티 및 돌연변이 데이타 매트릭스를 이용한 프로그램 ALIGN을 이용하여 5 이상(표준 편차 단위)의 배열 스코어를 가질 경우 상동성이다. 문헌 [Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110(볼륨 5, National Biomedical Research Foundation(1972))와 이 볼륨의 Supplement 2, pp. 1-10]을 참조바람. 보다 바람직하게 두 서열 또는 이의 일부는, ALIGN 프로그램을 이용하여 최적으로 배열시 이들 아미노산이 50% 이상 동일하면 상동성이다. 두 오르소로거스 서열 내에서 상동성이 상이한 영역이 존재할 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 마우스 및 인간 오르소로거스의 기능성 부위는 비기능성 영역에 비하여 상동성 정도가 더 높을 수 있다.
본 원에 사용된 용어 "~에 상응하다"는 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부와 상동성(즉, 동일하지만, 엄격하게 진화적으로 관련성이 있는 것은 아님)이거나, 또는 폴리펩티드 서열이 기준 폴리펩티드 서열과 동일한 것을 의미한다.
대조적으로, 본 원에 사용된 용어 "~에 상보적이다"는 상보성 서열이 기준 폴리펩티드 서열의 전체 또는 일부와 상동성인 것을 의미한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 "TATAC"는 기준 서열 "TATAC"에 상응하고, 기준 서열 "GTATA"와 상보적이다.
용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 비교창에 걸쳐서 두 폴리펩티드 또는 아미노산 서열이 동일하다(즉, 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 잔기 대 잔기를 기본으로)는 의미이다. 용어 "서열 동일성 비율"은 비교창에 걸처 두개의 최적으로 배열된 서열을 비교하고, 매칭되는 위치의 수를 계산하기 위해서 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, U 또는 I) 또는 아미노산 잔기가 두 서열상에 존재하는 위치의 수를 결정하고, 매칭되는 위치의 수를 비교창 내 전체 위치수(즉, 창 크기)로 나누어, 그 값에 100을 곱해서 서열 동일성의 비율을 산출한다. 여기서 사용되는 용어 "실질적인 동일성"은 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 특징을 나타내는 것으로서, 여기서 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산은 18 뉴클레오티드(6 아미노산) 위치의 비교 창, 대체로는 적어도 24 내지 48 뉴클레오티드(8 내지 16 아미노산) 위치의 비교창에 걸친 기준 서열과 비교시 적어도 85%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90 내지 95% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 동일성의 비율은 비교창에 걸쳐서 기준 서열의 총 20% 이하의 결실 또는 첨가를 포함할 수 있는 서열에 대해서 기준 서열을 비교하여 산출한다.
본 원에서 사용하는 바와 같이, 20개의 통상적인 아미노산 및 그의 약어는 일반적인 관례에 따른다. 예컨대, 본 발명에 참고로 포함되는 문헌 [Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)]을 참조바란다. 20개의 통상적인 아미노산의 기하이성체(예를 들어, D-아미노산), 비천연 아미노산, 예컨대 α-, α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산 및 다른 비통상적인 아미노산도 본 발명의 폴리펩티드의 적절한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예에는 4-히드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, σ-N-메틸아르기닌 및 다른 유사 아미노산 및 이미노산(예를 들어, 4-히드록시프롤린)이 포함된다. 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드 표시법은 표준 관례 및 규정에 따라서 왼쪽 방향이 아미노 말단 방향이고 오른쪽 방향이 카복시 방향이다.
유사하게, 달리 특정하지 않으면, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 말단은 5'-말단이고, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향으로 나타내어진다. 신생 RNA 전사체의 5'에서 3' 첨가 방향을 전사 방향이라고 하고, RNA와 동일한 서열을 가지며 RNA 전사체의 5'에서 5' 말단인 DNA 가닥 상의 서열 영역을 "상류 서열"이라고하고, RNA와 동일한 서열을 가지고 RNA 전사체의 3'에서 3' 말단인 DNA 가닥 상의 서열 영역을 "하류 서열"이라고 한다.
폴리펩티드에 대해 적용되는 용어 "실질적인 동일성"은 디폴트 갭 가중치를 이용하여, 예컨대 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 배열시, 두 펩티드 서열이 적어도 80%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성 및 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존 아미노산 치환이 상이하다. 보존 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환성을 의미한다. 예를 들어서, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고, 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산 군은 세린 및 트레오닌이며, 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 아스파라긴 및 글루타민이며, 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 군은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이며, 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존 아미노산 치환군은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산-아스파르트산 및 아스파라긴-글루타민이다.
본 원에서 기술하는 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열 내 소수 변동은 본 발명에 포함되는 것으로 고려하는데, 단 아미노산 서열의 변동은 본 원에서 기술한 항체 또는 면역글로불린 분자에 대한 서열 동일성을 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95% 유지하고 가장 바람직하게는 99% 유지하는 것이다. 특히, 보존 아미노산 치환을 고려한다. 보존 치환은 관련 측쇄를 갖는 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 유전적으로 코딩된 아미노산은 일반적으로 다음의 패밀리로 나뉜다: (1) 산성 = 아스파테이트, 글루타메이트; (2) 염기성 = 리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성 = 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전된 극성 = 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 보다 바람직한 패밀리로서, 세린 및 트레오닌은 지방족-히드록시 패밀리이고; 아스파라긴 및 글루타민은 아미드 함유 패밀리이며; 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 지방족 패밀리이고, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 방향족 패밀리이다. 예를 들어, 이소류신 또는 발린으로 류신의 고립(isolated) 치환, 글루타메이트로 아스파테이트 치환, 세린으로 트레오틴 치환 또는 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산의 유사 치환은 특히 이러한 치환이 프레임워크 영역 내 아미노산을 포함하지 않으면 최종 분자의 결합 기능 또는 특성에 주요한 영향을 주지 않는 것으로 예측하는 것은 타당하다. 아미노산 변화가 기능성 펩티드를 생성하는지에 대해서는 폴리펩티드 유도체의 특정 활성을 분석하여 용이하게 결정할 수 있다. 분석법은 본 원에서 구체적으로 설명한다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 당업자라면 용이하게 제조할 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노 말단 및 카복시 말단은 기능성 도메인의 경계 부근에 존재한다. 구조 및 기능성 도메인은 공개 또는 독자적인 서열 데이타베이스와 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터의 비교를 통해 확인할 수 있다. 바람직하게, 전산화 비교 방법을 사용하여 공지 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 일어나는 서열 모티브 또는 예측되는 단백질 형태 도메인을 동정할 수 있다. 공지의 3차 구조로 폴딩되는 단백질 서열을 동정하는 방법은 알려져 있다. 예컨대, 문헌 [Bowie et al. Science 253:164 (1991)]을 참조바란다. 따라서, 상기 예들은 본 원에서 기술한 항체에 따라서 구조 및 기능성 도메인을 정하는데 사용할 수 있는 서열 모티브 및 구조 형태를 당업자가 인식할 수 있다는 것을 보여준다.
바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질 가수분해에 대한 감응성을 감소시키는 것, (2) 산화에 대한 감응성을 감소시키는 것, (3) 단백질 복합체 형성을 위한 결합 친화성을 변경시키는 것, (4) 결합 친화성을 변경시키는 것, 및 (4) 이러한 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형시키는 것이다. 유사체는 자연 발생 펩티드 서열 이외 서열의 다양한 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산 치환(바람직하게, 보존 아미노산 치환)은 자연 발생 서열(바람직하게 분자간 접촉부를 형성하는 폴리펩티드 외부 도메인(들)의 일부로)로 제조될 수 있다. 보존 아미노산 치환은 본 발명의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다(예를 들어, 치환 아미노산이 모 서열에 존재하는 헬릭스를 절단하지 않아야 하거나, 또는 모 서열에서 특징으로 하는 다른 유형의 2차 구조를 파괴하지 않아야 함). 당 분야에서 인지되는 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 예를 들어 문헌 [Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); 및 Thornton et al. Nature 354:105 (1991)]에 기술되어 있으며, 이들은 본 원에 참고로 포함된다.
아미노산 서열이 본 원에 제시된 것을 비롯하여, PDGFR-알파에 대한 표적제 및 항체에 사용될 수 있는 본 발명의 CDRs 및 VH 및 VL 도메인의 변이체는 목적하는 특성으로 표적화 한 항원의 선별 및 서열 변경 또는 돌연변이 방법으로 수득할 수 있다. 이러한 목적하는 특성의 예로는 항원에 특이적인 공지 항체에 대한 항원의 결합 친화성 증가; 활성이 공지된 경우, 항원에 특이적인 공지 항체에 대한 항원 활성의 중화 증가; 특정 몰비에서 항원에 대한 공지 항체 또는 리간드와의 특이적인 경쟁능; 리간드-수용체 복합체의 면역침전능; 특정 에피토프에 대한 결합능; 예를 들어, 선형 및/또는 속박 구조에서 선별된 펩티드를 이용하여 펩티드 결합 스캔으로 확인된 선형 에피토프, 예를 들면 펩티드 서열; 비연속 잔기로 형성된 구조 에피토프; PDGFR-알파 또는 하류 분자의 새로운 생물학적 활성의 조절능; 결합능 및/또는 중화능 및/또는 임의의 다른 목적 성질이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.
CDRs, 항체 VH 또는 VL 도메인 및 항원 결합 부위의 아미노산 서열내에 치환을 만드는데 필요한 기술은 당업계에서 이용가능하다. 본 원에 개시된 항체 분자의 변이체는 본 발명에서 제조하여 이용할 수 있다. 구조/성질-활성 관계에 대해 다변수 데이터 분석 기술을 적용하는데 있어서 컴퓨터 화학(Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics -Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984)을 숙지한 뒤, 널리 알려진 수학적 기술, 예컨대 통계적 회귀, 패턴 인식 및 분류(Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3rd edition (April 1998): Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (May 11, 1995); Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (December 2000); Witten. Ian H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (October 11, 1999): Denison David G. T. (Editor). Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (July 2002); Ghose, Amp K. & Viswanadhan, Vellarkad N. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles. Software, Tools, and Applications in Drug Discovery)를 이용하여 항체의 정량적인 활성-성질의 관계를 유도할 수 있다. 항체의 성질은 항체 서열의 실험 및 이론적 모델(예를 들어, 가능한 접촉 잔기 또는 계산된 물리화학적 성질의 분석)로부터 유도할 수 있으며, 기능 및 삼차원 구조와 이들의 성질은 단독으로 및 조합하여 고려될 수 있다.
VH 도메인 및 VL 도메인으로 구성된 항체 항원-결합 부위는 전형적으로 경쇄 가변 도메인(VL)으로부터 3개 및 중쇄 가변 도메인(VH)으로부터 3개로 된 6 루프의 폴리펩티드로 형성된다. 원자 구조가 알려진 항체의 분석은 항체 결합 부위의 삼차원 구조와 서열 간의 관계로부터 밝힐 수 있다. 이들 관계는 VH 도메인중 세 영역(루프)을 제외한 결합 부위 루프가 소수 주쇄 구조중 하나를 가진다는 것을 내포한다(정규 구조(canonical structures)). 특정 루프에서 형성된 정규 구조는 그의 크기와 루프 및 프레임워크 영역 둘 모두의 주요 부위에 특정 잔기의 존재로 결정되는 것으로 판명되었다.
이러한 서열-구조 관계의 연구는 그의 CDR 루프의 삼차원 구조를 유지함에 따라 결합 특이성을 유지하는데 중요한, 서열은 알려졌으나 삼차원 구조는 알려지지 않은 항체의 잔기를 예측하는데 이용될 수 있다. 이러한 예측은 리드 최적화(lead optimization) 실험으로부터의 결과와 상기 예측을 비교함으로써 백업할 수 있다. 구조적 접근법에서, 모델은 자유롭게 이용가능하거나 상용화된 패키지, 예컨대 WAM을 이용하여 항체 분자로 형성될 수 있다. 이어서, 단백질 가시화 및 분석 소프트웨어 패키지, 예컨대 Insight II(Accelrys. Inc.) 또는 Deep View를 활용하여 CDR 내 각 위치에서 가능한 치환을 평가할 수 있다. 이후, 이러한 정보를 활성에 최소 효과 또는 유익한 효과를 제공하거나 그밖의 다른 바람직한 성질을 부여할 수 있을 것 같은 치환을 만드는데 이용할 수 있다.
본 원에서 사용하는 용어 "폴리펩티드 단편"은 아미노 말단 및/또는 카복시 말단 결실을 갖지만, 나머지 아미노산 서열은 예를 들어, 전장 cDNA 서열에서 유래하는 자연 발생 서열 내 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 전형적으로 5, 6, 8 또는 10 아미노산 이상의 길이, 바람직하게는 14 아미노산 이상의 길이, 보다 바람직하게는 20 아미노산 이상의 길이이고, 일반적으로 50 아미노산 이상의 길이이며, 더욱 바람직하게는 70 아미노산 이상의 길이이다. 본 원에서 사용하는 용어 "유사체"는 유래한 아미노산 서열의 일부와 실질적으로 동일하고, (1) 적절한 결합 조건 하에서 PDGFR에 대한 특이적 결합, (2) PDGF-AA 결합의 억제능, (3) PDGF-AB 결합의 억제능, (4) PDGF-BB 결합의 억제능 및/또는 (5) PDGF-CC 결합 억제능의 특성 중 하나 이상을 갖는 25 이상의 아미노산 절편으로 구성된 폴리펩티드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩티드 유사체는 자연 발생 서열에 대해서 보존 아미노산 치환(또는 첨가 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 전형적으로 20 이상의 아미노산 길이, 바람직하게는 50 이상의 아미노산 길이, 또는 그 보다 길고, 대체로 전장 자연 발생 폴리펩티드 만큼 길 수 있다.
펩티드 유사체는 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 갖는 비펩티드 약물로서 약학 산업에서 공용된다. 이러한 유형의 비펩티드 화합물은 "펩티드 모방체" 또는 "펩티도미메틱"이라고 한다. 본 원에 참고로 포함되는 문헌 [J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); 및 Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)]을 참조바란다. 이러한 화합물은 종종 전산화 분자 모델링의 도움으로 개발되곤 한다. 치료적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체를 이용하여 동등한 치료 및 예방적 효능을 이룰 수 있다. 일반적으로, 펩티도미메틱은 전형적인 폴리펩티드(즉, 생화학적 특성 및 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드), 예컨대 인간 항체와 구조적으로 유사하지만, 당분야에서 익히 공지된 방법을 통해서 --CH2NH--, --CH2S--, --CH2-CH2--, --CH=CH--(시스 및 트랜스), --COCH2--, --CH(OH)CH2-- 및 --CH2SO--로 구성된 군에서 선택된 연결부로 임의 치환된 하나 이상의 펩티드 연결부를 갖는다. 동일 유형의 D-아미노산(예를 들어, L-리신 대신 D-리신)으로 공통 서열의 하나 이상의 아미노산의 체계적 치환을 이용하여 보다 안정한 펩티드를 생성할 수 있다. 또한, 공통 서열 또는 실질적으로 동일한 공통 서열 변이를 포함하는 제한된 펩티드를 당업계에 공지된 방법으로 생성할 수 있는데(Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), 이는 본 원에 참고로 포함됨); 예를 들어, 펩티드를 고리화하는 분자간 이황화 결합을 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가하여 생성할 수 있다.
본 원에서 사용하는 용어 "항체"는 항원의 항원 결정부의 특징에 상보적인 내부 표면 형상 및 전하 분포를 갖는 3 차원 결합 공간을 가지는 폴리펩티드의 폴딩으로 형성된 적어도 하나의 결합 도메인으로 구성된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 군을 의미한다. 항체는 전형적으로 폴리펩티드 쇄의 동일한 두 쌍을 포함하는 사량체 형태로서, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄" 및 하나의 "중쇄"를 갖는다. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다.
본 원에서 사용된 "표적화된 결합제"는 표적 부위에 결합하는 항체 또는 그의 결합 단편 등의 제제이다. 일 구체예에 있어서, 상기 표적화된 결합제는 오직 하나의 표적 부위에 특이적이다. 다른 구체예에 있어서, 상기 표적화된 결합제는 복수개의 표적 부위에 특이적이다. 일 구체예에 있어서, 상기 표적화된 결합제는 모노클로날 항체일 수 있고, 상기 표적 부위는 에피토프일 수 있다. 후술하는 바와 같이, 표적화된 결합제는 항체의 적어도 하나의 결합 도메인(예: CDR)을 포함할 수 있으며, 이 도메인은 이종 단백질 스캐폴드, 예를 들어 비항체 단백질 스캐폴드 내에 융합되거나 포함된다.
항체의 "결합 단편"은 재조합 DNA 방법 또는 완전한 항체의 효소 또는 화학적 절단에 의해 생산된다. 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb 및 단일 사슬 항체를 포함한다. "이중특이성" 또는 이중기능성" 항체 이외의 항체는 이의 각 결합 부위가 동일한 것으로 이해된다. 과량의 항체가 적어도 약 20%, 40%, 60% 또는 80%, 및 보다 일반적으로는 약 85% 초과(시험관 내 경쟁 결합 분석으로 측정한 것임) 정도로 카운터-수용체에 결합된 수용체의 양을 감소시키는 경우, 항체는 카운터-수용체에 대한 수용체의 부착을 실질적으로 억제한다.
항체는 올리고클로날, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, CDR-그라프트 항체, 다중특이성 항체, 이중특이성 항체, 촉매 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 완전한 인간 항체, 항-이디오타입 항체 및 가용성 또는 결합 형태로 표지화할 수 있는 항체를 비롯하여 이의 단편, 변이체 또는 유도체일 수 있으며, 단독 또는 공지 기술로 제공되는 다른 아미노산 서열과의 조합 형태일 수 있다. 항체는 임의 종에서 유래할 수 있다. 용어 항체는 또한, 본 발명의 항체의 결합 단편도 포함하고, 예시적인 단편은 Fv, Fab, Fab', 단일 가닥 항체(svFC), 이량체 가변 영역(디아바디) 및 이황화 안정화 가변 영역(dsFv)을 포함한다.
전 항체 단편은 결합 항원의 기능을 수행할 수 있는 것으로 판명되었다. 결합 단편의 예로는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편(Ward, E. S. et al., (1989) Nature 341, 544-546); VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편(McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554); 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편(Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490); (iv) VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989), McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554, Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490); (v) 분리된 CDR 영역; (vi) F(ab')2 단편, 두개의 결합 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (vii) VH 도메인과 VL 도메인을 조합하여 항원 결합 부위를 형성하도록 하는 펩티드 링커로 상기 두 도메인이 연결된 단일 사슬 Fv 분자(scFv)(Bird et al, (1988) Science, 242, 423-426, Huston et al, (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883); (viii) 이중특이성 단일 사슬 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) "디아바디(diabody)", 유전자 융합으로 작제된 다가 또는 다중특이성 단편(WO94/13804호; Holliger, P. (1993) et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448)을 들 수 있다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 이황화 브리지를 도입함으로써 안정화시킬 수 있다(Reiler, Y. et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). scFv가 CH3 도메인에 연결된 미니바디(minibody)도 또한 제조될 수 있다(Hu, S. et al, (1996) Cancer Res., 56, 3055-3061). 결합 단편의 그밖의 다른 예로는 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하여, 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에 수 개의 잔기 첨가로 Fab 단편이 상이한 Fab' 및 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올기를 가지는 Fab' 단편인 Fab'-SH가 있다.
용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정부를 포함한다. 에피토프 결정부는 일반적으로, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄 등과 같은 분자의 화학적으로 활성화된 표면 그룹핑으로 이루어지고, 항상 그렇지는 않지만, 특정 전하 특징뿐만 아니라 특정적인 3 차원적 구조 특징을 갖는다. 항체의 해리 상수가 ≤ 1 μM, 바람직하게는 ≤ 100 nM, 가장 바람직하게는 ≤ 10 nM인 경우 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.
용어 "제제"는 화학 화합물, 화학 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 물질로 제조된 추출물을 나타내기 위해 본 원에 사용된다.
PDGFR-알파 폴리펩티드와 관련된 "활성적" 또는 "활성"이라는 용어는 천연 PDGFR-알파 폴리펩티드의 생물학적 또는 면역학적 활성을 갖는 PDGFR-알파 폴리펩티드 부분을 의미한다. 여기에서 사용되는 "생물학적"이란 천연 PDGFR-알파 폴리펩티드의 활성으로부터 야기되는 생물학적 기능을 의미한다. 바람직한 PDGFR-알파 생물학적 활성은 예를 들어, 자기인산화를 포함한다.
본 원에 사용되는 "포유동물"은 포유동물로 간주되는 임의의 동물을 의미한다. 바람직하게, 포유동물은 인간이다.
효소, 파파인으로 항체를 분해하면 두개의 동일한 항원 결합 단편이 생성되는데, 이들은 또한 "Fab" 단편, 및 "Fc" 단편이라고도 알려져 있으며, 항원 결합 활성은 없지만 결정화되는 능력을 갖는다. 효소, 펩신으로 항체를 분해하면, F(ab')2 단편이 생성되는데, 이는 항체 분자의 두 암이 연결된 상태로 남아있고 두개의 항원 결합 부위를 포함한다. F(ab')2 단편은 항원을 가교결합하는 능력을 갖는다.
본 원에 사용되는 "Fv"는 항원 인식 부위 및 항원 결합 부위 둘다를 보유하는 항체의 최소 단편을 의미한다.
본 원에 사용되는 "Fab"는 중쇄의 CH1 도메인 및 경쇄의 불변 도메인을 포함하는 항체의 단편을 의미한다.
"dAb"는 단일 도메인 항체로서, 항체 중쇄의 가변 도메인(VH 도메인) 또는 항체 경쇄의 가변 도메인(VL 도메인)중 어느 하나를 포함한다. 각 dAb는 자연 발생적인 6개의 CDRs 중 세개를 함유한다(Ward et al., Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature 341, 544-546 (1989); Holt, et al., Domain antibodies: Protein for therapy. Trends Biotechnol. 21, 484-49 (2003)). 11 내지 15 kDa 범위의 분자량인 이들은 단편 항원 결합 (Fab)2 보다 4배 더 작으며, 단일 사슬 Fv(scFv) 분자 크기의 절반이다.
"mAb"라는 용어는 모노클로날 항체를 의미한다.
본 원에 사용되는 "리포솜"은 본 발명의 PDGFR-알파 폴리펩티드 또는 이러한 PDGFR-알파 폴리펩티드에 대한 항체를 포함할 수 있는 약물을 포유동물에게 전달하는데 유용할 수 있는 소포체를 의미한다.
본 원에 사용되는 "표지" 또는 "표지화"는 폴리펩티드에 검출가능한 부분의 부가를 의미하는데, 예를 들어 방사성 동위원소 표지, 형광 표지, 효소 표지 화학발광 표지화 또는 바이오티닐 기를 부가하는 것을 의미한다. 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종에는 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I가 포함될 수 있고, 형광 표지에는 로다민, 란타나이드, 포스포어 또는 FITC가 포함될 수 있으며, 효소 표지에는 홀스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제가 포함될 수 있다.
추가의 표지는 예시할 목적으로 제한없이 효소, 예컨대 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제("G6PDH"), 알파-D-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코스 아밀라제, 탄산탈수소효소, 아세틸콜린에스테라제, 리소자임, 말레이트 데하이드로게나제 및 퍼옥시다제; 염료; 추가의 형광 표지 또는 형광 물질, 예컨대 플루오레세인 및 그의 유도체, 플루오로크롬, GFP("녹색 형광 단백질"용 GFP), 단실, 움벨리페론, 피코에리스린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드 및 플루오레스카민; 형광단, 예컨대 란탄족 크립테이트 및 킬레이트, 예를 들어 유로퓸 등(Perkin Elmer and Cis Biointernational); 화학발광성 표지 또는 화학발광물질(chemiluminescer), 예컨대 이소루미놀, 루미놀 및 디옥세탄; 감작제; 코엔자임; 효소 기질; 입자, 예컨대 라텍스 또는 탄소 입자; 금속 졸; 미결정; 리포솜; 염료, 촉매 또는 기타 검출가능한 그룹으로 더 표지화될 수 있는 세포 등; 비오틴, 디곡시게닌 또는 5-브로모데옥시우리딘 등의 분자; 독소 부분, 예컨대 이를테면 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소(PE 또는 그의 세포독성 단편 또는 돌연변이), 디프테리아 독소 또는 그의 세포독성 단편 또는 돌연변이, 보툴리늄 독소 A, B, C, D, E 또는 F, 리신 또는 그의 세포독성 단편, 예를 들어 리신 A, 애브린 또는 그의 세포독성 단편, 사포린 또는 그의 세포독성 단편, 억새풀 항바이러스 독소 또는 그의 세포독성 단편 및 브리오딘 1 또는 그의 세포독성 단편의 군중에서 선택되는 독소 부분을 포함한다.
본 원에서 사용되는 용어 "약학 제제 또는 약물"은 환자에게 적절하게 투여시 목적하는 치료 효과를 유도할 수 있는 화학 화합물 또는 조성물을 의미한다. 다른 화학 용어는 당분야에서 통상적인 관례에 따라 사용하는데, 예를 들어 본 원에 참고로 포함되는 문헌 [The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)]을 참조바란다.
본 원에서 사용하는, "실질적으로 순수한"은 목적 종이 우세한 종으로 존재(즉, 몰을 기준으로 조성물 내 임의의 다른 개별 종에 비하여 풍부함) 한다는 의미로서, 바람직하게, 실질적으로 정제된 분획은 목적 종이 존재하는 모든 거대분자 종을 적어도 약 50%(몰 기준) 포함하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종을 약 80% 초과, 보다 바람직하게는 약 85%, 90%, 95% 및 99% 초과하여 포함한다. 가장 바람직하게, 목적 종은 본질적으로 균질하게 정제되는데(통상의 검출 방법을 통해서 조성물 내에 오염 종을 검출할 수 없음), 여기서 이 조성물은 본질적으로 단일 거대분자 종으로 이루어진다.
"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Ig Fc 수용체(FcRs)(예를 들어, 자연살(NK) 세포, 단핵체, 호중구 및 대식세포)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에 결합한 항체를 인지하여 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 의미한다. ADCC를 매개하기 위한 원발성 세포(primary cell)인 자연살 세포는 FcγRⅢ 만을 발현하는 반면, 단핵체는 FcγRⅠ, FcγRⅡ 및 FcγRⅢ를 발현한다. 조혈 세포상의 FcRs 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(991])의 464페이지 표 3에 요약되어 있다. 대상 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 개시되어 있는 시험관 내 ADCC 분석이 행해질 수 있다. 이 분석에 유용한 효과기 세포는 말초혈액 단핵세포(PBMC) 및 자연살(NK) 세포를 포함한다. 추가적으로, 또는 선택적으로, 대상 분자의 ADCC 활성은 예를 들어, 문헌 [Clynes, et al., PNAS(USA), 95: 652-656(1988)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 생체 내로 측정될 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 및 "CDC"는 항체가 세포사멸 기능을 수행하는 메카니즘을 의미한다. 이는 항체와 복합화된 Igs, IgG 또는 IgM의 Fc 도메인에 보체의 제1 구성 성분인 C1q가 결합함으로써 개시된다(참조: Hughs-Jones,. N.C., and B. Gardner, 1979, Mol. Immunol., 16: 697). C1q는 인간 혈청 내에서 70 ㎍/ml의 농도로 존재하는 ~410 kDa의 구조적으로 복잡한 대형 당단백질이다(참조: Cooper, N. R., 1985, Adv. Immuno., 37: 151). 두 세린 프로테아제인 C1r, C1s와 함께, C1q는 보체의 제1 성분인 복합체 C1을 형성한다. C1q의 적어도 두 N 말단의 구상 두부는 C1 활성화로 보체 연쇄 반응(complement cascade)을 개시하도록 Igs의 Fc와 결합해야 한다(참조: Cooper, N. R., 1985, Adv. Immunol., 37: 151).
"전혈 검사"는 천연 효과기 공급원으로서, 비분획 혈액을 사용한다. 혈액은 다형핵 세포(PMNs)와 단핵 세포(MNCs) 등의 FcR을 발현하는 세포 효과기와 함께, 혈장에 보체를 함유하고 있다. 따라서, 전혈 검사로 시험관 내에서 ADCC와 CDC 효과기 메카니즘의 상승 효과를 동시에 평가할 수 있다.
용어 "환자"는 인간 및 수의학적 대상을 포함한다.
본 원에 사용된 용어 "및/또는"은 특정된 두 특징 또는 성분을 각각 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 특정적으로 설명하기 위해 취해진다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B가 각각 본 원에 개별적으로 제시된 경우, 이들의 각각을 특정적으로 설명하기 위해 취해진다.
항체 구조
기본적인 항체의 구조 단위는 사량체로 알려져 있다. 각 사량체는 하나의 "경쇄"(약 25 kDa)와 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)를 가지는 폴리펩티드 사슬의 두 동일 쌍으로 이루어진다. 상기 각 사슬의 아미노 말단 부분은 주로 항원 인식에 관여하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산 가변 영역을 포함한다. 상기 각 사슬의 카복시 말단 부분은 주로 효과기 기능에 관여하는 불변 영역을 한정한다. 인간 경쇄는 카파와 람다 경쇄로 구분된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되고, 상기 항체의 아이소타입을 각각 IgM, IgD, IgA 및 IgE로 정한다. 경쇄 및 중쇄 내 가변 영역과 불변 영역은 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함하는 중쇄와 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결된다(일반 참조예: Fundamental Immunology Ch. 7(Paul W., ed. 2nd ed., Raven Press, N.Y.(1989), 그의 내용은 모든 목적을 위해 본 원에 참고로 포함됨). 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다.
따라서, 완전 항체는 두 결합 부위를 갖는다. 이중기능성 또는 이중특이성 항체를 제외하고, 상기 두 결합 부위는 동일하다.
사슬은 모두 상보성 결정 영역 또는 CDRs 라고도 칭해지는 세개의 고가변성 영역으로 연결된 상대적 보존 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 두 사슬로부터의 CDRs는 특이적인 에피토프에 결합할 수 있도록 프레임워크 영역에 의해 정렬된다. N 말단에서 C 말단까지, 경쇄 및 중쇄는 둘 다 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 도메인을 포함한다. 각 영역에 아미노산을 할당하는 것은 면역적으로 중요한 단백질의 Kabat 서열 정의를 따른다(참조: National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1987 및 1991) 또는 Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917(1987); Chothia, et al., Nature, 342:878-883(1989)).
이중특이성 또는 이중기능성 항체는 두 상이한 중쇄/경쇄 쌍과 두 상이한 결합 부위를 가지는 인공적인 혼성화 항체이다. 이중특이성 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 각종 방법에 의해 생성될 수 있다(참조예: Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321(1990), Kostelny, et al., J. Immunol. 148:1547-1553(1992)). 이중특이성 항체는 단일 결합 부위를 가지는 단편의 형태(예를 들어, Fab, Fab' 및 Fv)로 존재하지 않는다.
VH 또는 VL 도메인이 항원과의 결합을 위해 단독으로 사용될 수 있더라도, VH 도메인은 전형적으로 VL 도메인과 쌍을 이루어 항체 항원-결합 부위를 제공한다. VH 도메인(표 12 참조)은 VL 도메인(표 13 참조)과 쌍을 이루게 되고, 그에 따라 VH 및 VL 도메인을 둘 다 포함하는 항체 항원-결합 부위가 형성된다.
인간 항체 및 항체의 인간화
인간 항체는 뮤린 또는 래트의 가변 및/또는 불변 영역을 보유하는 항체와 관련된 문제의 일부를 해결한다. 이러한 뮤린 또는 래트 유래 단백질의 존재로 인하여 항체의 제거율이 빨라질 수 있거나, 환자에 의해서 이러한 항체에 대한 면역 반응이 일어날 수 있다. 뮤린 또는 래트 유래 항체의 사용을 피하기 위해서, 기능성 인간 항체의 유전자 좌를 설치류, 다른 포유동물 또는 동물에 도입하여 이 설치류, 다른 포유동물 또는 동물이 완전한 인간 항체를 생산하도록 하여 완전한 인간 항체를 생성시킬 수 있다.
완전한 인간 항체를 생성하기 위한 방법 중 하나는 인간 중쇄 유전자 좌 및 카파 경쇄 유전자 좌의 1000 kb 이하 크기의 생식계통 구조 단편을 함유하도록 공학적으로 처리된 XenoMouse® 계통의 마우스를 이용하는 것이다. 문헌 [Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) 및 Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)]을 참조바란다. XenoMouse® 계통의 마우스는 Abgenix, Inc.(Fremont, California, U.S.A.)에서 입수가능하다.
이러한 마우스는 인간 면역글로불린 분자 및 항체를 생성할 수 있고, 뮤린의 면역글로불린 분자 및 항체를 생성하지 않는다. 이를 이루는데 이용되는 기술은 본 원에 참고로 포함된 1996년 12월 3일자 출원한 미국 특허출원 제08/759,620호와 1998년 6월 11일자 공개된 국제 특허 출원 WO98/24893호 및 2000년 12월 21일자 공개된 국제 특허 출원 WO00/76310호에 개시되어 있다. 또한, 그의 개시 내용을 본 원에서 참고로 포함하는 문헌 [Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997)]을 참조바란다.
XenoMouse® 마우스주의 생산은 미국 특허 출원 제07/466,008호(1990년 1월 12일 출원), 제07/610,515호(1990년 11월 8일 출원), 제07/919,297호(1992년 7월 24일 출원), 제07/922,649호(1992년 7월 30일 출원), 제08/031,801호(1993년 3월 15일 출원), 제08/112,848호(1993년 8월 27일 출원), 제08/234,145호(1994년 4월 28일 출원), 제08/376,279호(1995년 1월 20일 출원), 제08/430,938호(1995년 4월 27일 출원), 제08/464,584호(1995년 6월 5일 출원), 제08/464,582호(1995년 6월 5일 출원), 제08/463,191호(1995년 6월 5일 출원), 제08/462,837호(1995년 6월 5일 출원), 제08/486,853호(1995년 6월 5일 출원), 제08/486,857호(1995년 6월 5일 출원), 제08/486,859호(1995년 6월 5일 출원), 제08/462,513호(1995년 6월 5일 출원), 제08/724,752호(1996년 10월 2일 출원), 제08/759,620호(1996년 12월 3일 출원), 미국 공개 특허 제2003/0093820호(2001년 11월 30일 출원) 및 미국 특허 제6,162,963호, 제6,150,584호, 제6,114,598호, 제6,075,181호, 및 제5,939,598호 및 일본 특허 제3 068 180 B2호, 제3 068 506 B2호, 및 제3 068 507 B2호에 기술되어 있다. 또한, 유럽 특허 제EP 0 463 151 B1호(1996년 6월 12일 공포됨), 국제 특허 출원 WO94/02602호(1994년 2월 3일 공개), 국제 특허 출원 WO96/34096호(1996년 10월 31일 공개), WO98/24893호(1998년 6월 11일 출원), WO00/76310호(2000년 12월 21일 공개)를 참조바란다. 상기 인용한 각 특허, 출원서 및 참조 문헌의 개시 내용은 전체가 참고로 본 원에 포함된다.
대안적인 방법으로는, GenPharm International, Inc.에서 "미니로커스(minilocus)" 방법을 이용하는 것이 포함된다. 이 미니로커스 방법에서는, Ig 유전자 좌로부터 조각(개별 유전자)을 도입하여서 외래 Ig 유전자 좌를 모방한다. 따라서, 하나 이상의 VH 유전자, 하나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 JH 유전자, 뮤 불변 영역 및 일반적으로 2차 불변 영역(바람직하게는 감마 불변 영역)을 동물에 삽입하기 위한 작제물로 형성시킨다. 이러한 방법은 미국 특허 제5,545,807호(Surani et al.) 및 미국 특허 제5,545,806호, 제5,625,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호, 제5,770,429호, 제5,789,650호, 제5,814,318호, 제5,877,397호, 제5,874,299호, 및 제6,255,458호(각 Lonberg 및 Kay), 미국 특허 제5,591,669호 및 제6,023,010호(Krimpenfort 및 Berns), 미국 특허 제5,612,205호, 제5,721,367호 및 제5,789,215호(Berns et al.), 및 미국 특허 제5,643,763호(Choi 및 Dunn), 및 GenPharm International의 미국 특허 출원 제07/574,748호(1990년 8월 29일 출원), 제07/575,962호(1990년 8월 31일 출원), 제07/810,279호(1991년 12월 17일 출원), 제07/853,408호(1992년 3월 18일 출원), 제07/904,068호(1992년 6월 23일 출원), 제07/990,860호(1992년 12월 16일 출원), 제08/053,131호(1993년 4월 26일 출원), 제08/096,762호(1993년 7얼 22일 출원), 제08/155,301호(1993년 11월 18일 출원), 제08/161,739호(1993년 12월 3일 출원), 제08/165,699호(1993년 12월 10일 출원), 제08/209,741호(1994년 3월 9일)에 개시되어 있으며, 이들은 본 원에 참고로 포함된다. 또한, 유럽 특허 제0 546 073 B1호, 국제 특허 출원 WO92/03918호, WO92/22645호, WO92/22647호, WO92/22670호, WO93/12227호, WO94/00569호, WO94/25585호, WO96/14436호, WO97/13852호 및 WO98/24884호 및 미국 특허 제5,981,175호를 참조할 수 있으며, 이들의 개시 내용은 본 원에 참고로 포함된다. 또한, 문헌 [Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), 및 Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996)]을 참조할 수 있으며, 이들 개시 내용은 본 원에 참고로 포함된다.
Kirin은 또한 마이크로셀 융합을 통해서, 염색체의 거대 조각, 또는 전체 염색체를 도입시킨 마우스로부터 인간 항체의 생성을 증명하였다. 예를 들어, 유럽 특허 출원 제773 288호 및 제843 961호를 참조할 수 있으며, 이들은 본 원에 참고로 포함된다. 추가로, Kirin의 Tc 마우스를 Medarex의 미니로커스(Humab) 마우스와 교접시킨 결과 KM™-마우스를 생성시켰다. 이 마우스는 Kirin 마우스의 인간 IgH 트랜스염색체 및 GenPharm 마우스의 카파 사슬 트랜스유전자를 보유한다(Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).
인간 항체는 또한 시험관 내 방법으로 유도할 수 있다. 적합한 예에는 파지 디스플레이(CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion(이전에 Proliferon), Affimed), 리보솜 디스플레이(CAT), 효모 디스플레이 등이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
다른 구체예로, 본 발명의 항체는 개시된 항체와 경쟁한다. 항체간 경쟁은, 예를 들어 ELISA를 이용하고/하거나, 동일한 에피토프 또는 중복 에피토프에 결합하는 항체를 확인할 수 있도록, 하나 이상의 다른 비태깅 항체의 존재하에 검출될 수 있는 하나의 결합막에 특정 리포터(reporter) 분자를 태깅하여 시험관 내에서 용이하게 분석할 수 있다. 이러한 방법은 당업자들에게 주지되어 있으며, 본 원에 보다 상세히 기술된다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면으로 항체 분자, 예를 들어 특히 PDGFR-알파에 결합하는 모 항체 또는 본 원에 개시된 임의 항체의 VH 및/또는 VL 도메인, CDR, 예를 들면 HCDR3 또는 CDRs 세트를 포함하는 항체 분자와 경쟁하는 인간 항체 항원-결합 부위를 가지는 항원 결합 부위가 제공된다. 일 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 2.175.3, 2.449.1.3 및/또는 2.998.2와 경쟁한다.
항체 제조
일반적으로, 융합된 하이브리도마에 의해 생산된 항체는 완전한 인간 카파 또는 람다 경쇄를 가지는 인간 IgG1 또는 IgG4 중쇄이다. 항체는 IgG2 중쇄를 포함하는 다른 인간 아이소타입의 항체일 수도 있다. 상기 항체는 전형적으로 FACS에 기초한 친화도 측정 기술로 세포에 대하여 측정하였을 때, 약 10-6 내지 약 10-12M 또는 그 이하의 Kd 값을 소유하여 높은 친화도를 가졌다. 상기 친화도는 고체상 및 용액상 기술에 의해서도 측정이 가능하다. 일 구체예에 있어서, 본 원에 개시된 항체는 약 500, 400, 300, 200 또는 100 피코몰(pM) 미만의 Kd 값으로 CD PDGFR-알파에 결합하고, 종양 성장을 억제한다. 일부 구체예에 있어서, 상기 항체는 약 75, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 10, 또는 5 pM 미만의 Kd 값으로 PDGFR-알파에 결합한다.
항 PDGFR-알파 항체는 하이브리도마 세포외의 다른 세포주에서 발현시킬 수 있는 것으로 이해할 수 있을 것이다. 특정 항체를 코딩하는 서열이 적합한 포유동물 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 형질전환은 예를 들어, 바이러스(또는 바이러스 벡터)에 상기 폴리뉴클레오티드를 패키징(packaging)하고 바이러스(또는 벡터)로 숙주 세포를 변환시키는 단계를 포함하는, 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 임의의 공지된 방법 또는 미국 특허 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호 및 제4,959,455호에 예시된 바와 같은 당업계에 공지된 형질감염 방법으로 행해질 수 있다. 이용되는 형질전환 방법은 형질전환시키기 위한 숙주에 따라 좌우된다. 포유동물 세포에 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법은 공지되어 있으며, 덱스트란을 이용한 형질감염법, 인산칼슘 침전법, 폴리브렌을 이용한 형질감염법, 원형질체 융합법, 전기천공법, 리포솜에 폴리뉴클레오티드의 캡슐화 및 핵에 DNA의 직접 미세주입법을 포함한다.
발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 당업계에 주지되어 있으며, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 어린 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장(COS) 세포, 인간 간세포 암종(예를 들어, Hep G2) 세포, 인간 상피 신장 293 세포 및 다수의 다른 세포주가 예시되나 이에 제한되지 않는 것을 비롯하여, 미국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로 부터 입수가능한 많은 불멸 세포주를 포함한다. 특히 바람직한 세포주는 고발현 수준을 나타내고 구조적 PDGFR-알파 결합성을 가지는 항체를 생성하는 세포주를 결정하여 선택된다.
항 PDGFR-알파 항체는 환자의 샘플에서 PDGFR-알파를 검출하는데 유용하고, 따라서 본 원에 기재된 질환 상태의 진단제로서 유용하다. 또한, 종양 성장 억제에 기초하여, 항 PDGFR-알파 항체는 PDGFR-알파의 발현으로 인한 증상 및 상태를 치료하는데 치료 효과를 가진다. 특정 구체예에 있어서, 본 원에 개시된 항체 및 방법은 PDGFR-알파에 의해 유도되는 종양 성장으로 인한 증상의 치료와 관련이 있다. 다른 구체예는, 종양성 질환, 예컨대 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암, 교모세포종, 흑색종 및 위장관 간질 종양(GIST)을 비롯한 암의 치료에 본 원에 개시된 항체 및 방법을 이용하는 것을 포함한다.
항체 서열
본 발명의 구체예는 하기 표 1에 예시된 특정 항 PDGFR-알파 항체를 포함한다. 이 표는 상응하는 중쇄 및 경쇄 유전자의 가변 영역의 서열번호와 함께, 각 항 PDGFR-알파 항체의 식별 번호(identification number)를 나타낸다.
각 항체에는 1 또는 2개의 소수점으로 구분되는 두 개 또는 세 개의 숫자를 포함하는 식별 번호가 주어졌다. 일부 경우에, 하나의 소수점으로 구분되는 두 개의 식별 번호만이 제시되어 있다. 그러나, 일부 경우에는, 한 항체의 다수 클론이 제조되었다. 이들 클론이 모 서열과 동일한 핵산 및 아미노산 서열을 갖고 있다 하더라도, 이들은 또한 두 번째 소수점의 오른쪽 숫자에 의해 클론 수를 표시하면서 따로 따로 열거될 수도 있다. 따라서, 예를 들어, 항체 2.84의 핵산 및 아미노산 서열은 항체 2.84.1, 2.84.2 및 2.84.3의 서열과 동일하다.
[표 1]
mAb 식별번호 서 열 서 열 번 호
2.175.3 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 1
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 2
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 3
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 4
2.451.1.1 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 5
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 6
경쇄 O12/JK5의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 7
경쇄 O12/JK5의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 8
경쇄 A20/JK5의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 21
경쇄 A20/JK5의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 22
2.449.1.3 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 9
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 10
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 11
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 12
2.998.2 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 13
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 14
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 15
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2.84.3 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 17
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 18
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 19
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 20
2.1576.1.2 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 23
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 24
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 25
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 26
3.625.1 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 27
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 28
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 29
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 30
2.414.2 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 31
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 32
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 33
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2.542.2 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 35
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경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 37
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2.737.1.4 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 39
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 40
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 41
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2.1623.2 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 43
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2.1853.3 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 47
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경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 50
2.1954.2 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 51
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3.23.2 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 55
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3.87.1.1 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 59
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 60
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3.341.1 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 63
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3.472.1.1 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 67
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 68
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경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 70
3.805.1.3 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 71
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3.818.4 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 75
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 76
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4.16.2 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 79
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5.1.1.1 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 83
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 84
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5.9.3 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 87
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 88
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 89
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2.796.2 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 91
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경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 93
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 94
3.772.2 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 95
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 96
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 97
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 98
5.16.1 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 99
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 100
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 101
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 102
2.2002.3 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 103
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 104
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 105
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 106
2.2071.1.3 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 107
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 108
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 109
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 110
3.23.3 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 111
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 112
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 113
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 114
3.457.3.1 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 115
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 116
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 117
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 118
2.84.1 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 119
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 120
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 121
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 122
2.351.3 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 123
중쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 124
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 125
경쇄의 가변 영역을 코딩하는 아미노산서열 126
본 원에서 실시예에 기술된 바와 같은 항체는 후술하는 바와 같이 XenoMouse® 기술을 이용하여 제조하였다. 이러한 마우스는 인간 면역글로불린 분자 및 항체를 생성할 수 있고, 뮤린의 면역글로불린 분자 및 항체를 생성하지 않는다. 이를 이루는데 이용되는 기술은 본 원의 배경기술 부분에 제시된 특허, 출원 및 참조 문헌에 개시되었다. 그러나, 특히 이로부터 형질전환 마우스 및 항체를 생성하는데 바람직한 구체예는 그의 내용이 본 원에 참고로 포함되는 1996년 12월 3일자 출원한 미국 특허 출원 제08/759,620호와 1998년 6월 11일자 공개된 국제 특허 출원 WO98/24893호 및 2000년 12월 21일자 공개된 WO00/76310호에 개시되어 있다. 또한, 역시 그의 내용이 본 원에 참고로 포함되는 문헌 [Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)]를 참조하기 바란다.
이러한 기술을 이용함으로써, 각종 항원에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체가 생산된다. 본질적으로, XenoMouse® 계통의 마우스를 관심의 대상 항원(예: PDGFR-알파)으로 면역화하여, 과면역화 마우스로부터 림프 세포(예: B-세포)를 회수한 후, 회수한 림프구를 골수형 세포주와 융합하여 불멸화 하이브리도마 세포주를 제조한다. 이들 하이브리도마 세포주를 선별하여 관심의 대상 항원에 특이적인 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 동정하는데 선택한다. 본 원에 PDGFR-알파에 특이적인 항체를 생성하는 다중 하이브리도마 세포주의 생산 방법이 제공된다. 또한, 본 원에서는 이 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 분석을 비롯하여, 상기 세포주로 생산된 항체의 특성화 방법이 제공된다.
한편으로, 하이브리도마를 생성하기 위해 골수종 세포에 융합시키는 것 대신에, B 세포를 직접 분석할 수 있다. 예를 들면, CD19+ B 세포를 과면역 XenoMouse® 마우스로부터 분리하여 항체-분비 형질 세포로 증식 및 분화시킬 수 있다. 이어서, 세포 상등액으로부터의 항체를 ELISA에 의해 PDGFR-알파 면역원에 대한 반응성에 대해 선별한다. PDGFR-알파상의 기능적으로 유용한 도메인 결합에 대한 상이한 항체의 추가 맵을 위해, 상등액을 PDGFR-알파의 단편에 대한 면역반응성에 대해서도 선별할 수 있다. 항체는 또한 다른 관련 인간 수용체 및 래트, 마우스 및 비인간 영장류, 예컨대 사이노몰거스 원숭이에 대해 PDGFR-알파의 오르소로거스에 대해서도 선별할 수 있으며, 후자는 종 교차 반응성을 결정하기 위한 것이다. 관심 항체를 함유하고 있는 웰로부터의 B 세포를 다양한 방법으로 불멸화할 수 있는데, 예컨대 개별 또는 풀화한 웰로부터 하이브리도마를 제조하기 위해 융합시키는 것을 포함하거나, 또는 EBV로 감염시키거나 공지된 불멸화 유전자로 형질감염시킨 후, 적절한 배지에 플레이팅하는 것을 포함한다. 다른 한편으로, 목적하는 특이성을 가지는 단일 형질 세포 분비 항체를 PDGFR-알파-특이적 용혈 플라크 측정법으로 분리한다(참조예: Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)). 용해 표적 세포는 바람직하게는 PDGFR-알파 항원으로 코팅된 양의 적혈구(SRBCs)이다.
대상 면역글로불린 및 보체를 분비하는 혈장 세포를 함유하는 B 세포 배양물의 존재하에서, 플라크 형성은 대상 혈장 세포 주변에서 양 적혈구의 특이적 PDGFR-알파 매개성 용해를 의미한다. 플라크의 중심부중 단일 항원 특이적 혈장 세포를 분리할 수 있고 항체의 특이성을 코딩하는 유전 정보를 이 단일 혈장 세포에서 분리한다. 역전사 후 PCR(RT-PCR)을 이용하여, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 클로닝할 수 있다. 이렇게 클로닝된 DNA를 적절한 발현 벡터, 바람직하게는 벡터 카세트, 예컨대 pcDNA, 보다 바람직하게는, 예컨대 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인을 함유하는 pcDNA 벡터에 추가로 삽입할 수 있다. 이후, 생성된 벡터를 숙주 세포, 예컨대 HEK293 세포, CHO 세포로 형질감염시키고, 전사 유도를 위해 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양한 후, 형질전환체를 선별하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시킬 수 있다.
항 PDGFR-알파 항체는 PDGFR-알파 발현과 관련된 증상 및 상태를 치료하는데 치료 효과를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 PDGFR-알파를 발현하는 세포의 성장을 억제하여 종양 성장을 억제할 수 있거나, 또는 약제와 결합하여 표적 세포에 치사 독소를 전달할 수 있다. 항 PDGFR-알파 항체는 섬유성 질환, 예컨대 심장, 폐, 간, 신장 또는 피부 섬유증을 치료하는데 치료 효과를 가질 수 있다. 항 PDGFR-알파 항체는 동종이식 혈관병증 또는 재협착 치료에도 치료 효과를 가질 수 있다. 또한, 항 PDGFR-알파 항체는 질환의 상태, 특히 종양성 질환, 섬유성 질환 및 면역계 질환용 진단제로 유용하다.
필요에 따라, 항 PDGFR-알파 항체의 아이소타입을, 예를 들어 다른 아이소타입의 생물학적 성질의 이점을 이용하기 위하여 스위칭할 수 있다. 예를 들어, 일부의 경우 이는, PDGFR-알파에 대한 치료 항체로서의 항체 생성과 관련하여 항체가 보체를 고정하여 보체-의존성 세포독성(CDC)에 관여할 수 있도록 하는 것이 바람직할 것이다. 뮤린 IgM, 뮤린 IgG2a, 뮤린 IgG2b, 뮤린 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgA, 인간 IgG1 및 인간 IgG3을 포함하나 이들에 제한되지 않는 다수의 항체 아이소타입이 있을 수 있다. 다른 구체예에 있어서, PDGFR-알파에 대한 치료 항체로서의 항체 생성과 관련하여 효과기 세포상에 Fc 수용체가 결합하여 항체-의존성 세포독성(ADCC)에 관여할 수 있도록 하는 것이 바람직할 것이다. 뮤린 IgG2a, 뮤린 IgG2b, 뮤린 IgG3, 인간 IgG1 및 인간 IgG3을 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 항체의 아이소타입이 있을 수 있다. 생성되는 항체는 처음부터 그러한 아이소타입을 가질 필요는 없으며, 어떠한 아이소타입이라도 가질 수 있고, 차후에 당업계에 공지된 통상적인 기술을 이용하여 스위칭된 아이소타입일 수도 있다. 그러한 기술은 특히 직접 재조합 기술(참조: 미국 특허 제4,816,397호), 세포 간 융합 기술(참조: 미국 특허 제5,916,771호 및 제6,207,418호)의 이용을 포함한다.
예로서, 상술된 항 PDGFR-알파 항체는 완전한 인간 항체이다. 항체가 PDGFR-알파에 원하는 결합을 갖는다면, 그것은 여전히 동일한 (항체의 특이성 및 친화성의 일부를 정의하는) 가변 영역을 지니면서 인간 IgM, 인간 IgG1 또는 인간 IgG3 아이소타입을 생성하도록 스위칭되는 아이소타입일 수 있다. 이러한 분자들은 보체를 고정하고 CDC에 관여할 수 있고/있거나 효과기 세포상의 Fc 수용체에 결합하여 ADCC에 관여할 수 있을 것이다.
세포 간 융합 기술에서, 골수종, CHO 세포 또는 다른 세포주는 임의의 원하는 아이소타입의 중쇄를 가지도록 작제되고, 또 다른 골수종, CHO 세포 또는 다른 세포주는 경쇄를 가지도록 작제된다. 이 세포를 차후에 융합하여 온전한 항체를 발현하는 세포주를 분리할 수 있다.
따라서, 상술된 바와 같은 바람직한 "구조적" 특성을 만족하는 항체 후보가 생성됨으로써, 이들은 일반적으로 아이소타입 스위칭을 통하여 원하는 임의의 "기능적" 특성을 제공받을 수 있다.
치료적 투여 및 제형
본 발명의 구체예는 질환 치료제로서 유용한 항 PDGFR 항체의 멸균된 약학 제형을 포함한다. 이러한 제형은 세포 성장을 억제함으로써, 예를 들어, PDGFR-알파 발현이 비정상적으로 상승하였거나, 또는 PDGFR-알파 발현 세포가 질환 상태를 매개하는 병리적 상태를 효과적으로 치료할 수 있을 것이다. 항 PDGFR-알파 항체는 바람직하게는 PDGFR-알파에 특정적으로 결합하기에 적절한 친화성을 보유하고, 바람직하게는 인간에서 빈번하지 않은 투약을 가능케 하는 적절한 작용 기간을 갖는다. 장기간의 작용 기간으로 교체 비경구 경로, 예컨대 피하 또는 근육내 주입을 통해서 덜 빈번하고 보다 편리한 투약 스케줄이 가능해 질 것이다.
멸균 제형은 예를 들어, 항체의 동결건조 및 재구성 전 또는 이후에 멸균 여과 멤브레인을 통해 여과시켜서 생성시킬 수 있다. 항체는 일반적으로 동결건조 형태 또는 액상으로 보관하게 된다. 치료적 항체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트, 예를 들어 제형의 복구를 가능하게 하는 어댑터, 예컨대 피하 주입 바늘에 의해 접합시킬 수 있는 스탑퍼 등을 지닌 정맥내 용액 백 또는 바이알 등을 구비한 용기에 위치한다.
항체의 투여 경로는 공지 방법에 따라서 이루어지는데, 예를 들어 정맥, 복강내, 뇌내, 근육내, 안구내, 동맥내, 포막내, 흡입 또는 병변내 경로에 의한 주사 또는 주입, 또는 하기 언급하는 서방형 시스템에 의한다. 항체는 바람직하게 주입 또는 볼러스 주사로 연속 투여된다.
치료적으로 사용되는 항체의 유효량은 예를 들어, 치료 대상, 투여 경로 및 환자의 상태에 따라 좌우될 것이다. 따라서, 필요에 따라 최적의 치료 효과를 얻기 위해 치료사가 투여 경로를 변경하고 용량을 적정하는 것이 바람직하다. 전형적으로, 임상의가 목적 효과를 얻게 되는 용량에 도달할 때까지 항체를 투여하게 된다. 이러한 치료의 진행은 본 원에서 기술한 분석법 또는 통상의 분석법을 통해 용이하게 모니터된다.
본 원에서 기술한 항체는 약학적으로 허용되는 담체와의 혼합물로 제조될 수 있다. 이러한 치료 조성물은 정맥내 투여하거나, 또는 코나 폐를 통해서, 바람직하게는 액상 또는 분말 에어로졸(동결건조형)로서 투여될 수 있다. 이 조성물은 또한, 필요에 따라 비경구적 또는 피하로 투여될 수 있다. 전신 투여시, 치료 조성물은 멸균되어야 하고, 발열원성이 없어야 하며, pH, 등장성 및 안정성이 적절한 비경구적으로 허용가능한 용액 중에 존재해야 한다. 이러한 조건은 당업자들에게 공지되어 있다. 간략하게, 본 원에 개시된 화합물의 용량 제형은 목적하는 정도의 순도를 갖는 화합물을 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여 투여용 또는 보관용으로 제조된다. 이러한 물질은 사용되는 용량 및 농도에서 수용체에게 비독성이어야 하고, 완충제, 예컨대 Tris HCl, 포스페이트 시트레이트, 아세테이트 및 다른 유기산 염 등; 산화방지제, 예컨대 아스코르브산; 저분자량(약 10 잔기 미만) 펩티드, 예컨대 폴리아르기닌, 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리디논; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루탐산, 아스파르트산 또는 아르기닌; 셀룰로스와 이의 유도체, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린 등을 비롯한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당알콜, 예컨대 만니톨 또는 솔비톨; 반대이온, 예컨대 나트륨 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN, PLURONICS 또는 폴리에틸렌글리콜 등을 포함한다.
주입용 멸균 조성물은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed, Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003)]에 기술된 바와 같이 통상의 약학 실시법에 따라 제형화할 수 있다. 예를 들어, 비히클, 예컨대 물 또는 자연산 식물유, 예컨대 참깨유, 땅콩유 또는 면실유 또는 합성 지방 비히클, 예컨대 에틸 올레에이트 등에 활성 화합물을 용해 또는 현탁시킨 것이 바람직할 수 있다. 완충제, 보존제, 산화방지제 등을 허용되는 약학 실시법에 따라 도입시킬 수 있다.
서방형 제제의 적절한 예에는 폴리펩티드를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반침투성 매트릭스가 포함되는데, 이 매트릭스는 성형 물품, 막 또는 미세캡슐의 형태일 수 있다. 서방형 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 문헌 [Langer et al. J. Biomed Mater. Res., (1981) 15:167-277 and Langer, Chem. Tech., (1982) 12:98-105]에 기술된 바와 같은 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호, EP 58,481호), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman et al. Biopolymers, (1983) 22:547-556), 비분해성 에틸렌비닐 아세테이트(Langer et al. 상동), 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON Depot™(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주입가능한 미세구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(EP 133,988호) 등을 포함한다.
중합체, 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산 등은 100 일 이상 동안 분자를 방출할 수 있지만, 특정 히드로겔은 보다 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 단백질이 장기간 체내에 잔류하는 경우, 이들은 37 ℃에서 수분에 노출된 결과로 변성되거나 응집될 수 있어서, 생물학적 활성을 손실하고 면역원성이 변화가능하다. 포함되는 메카니즘에 따라서 단백질 안정화를 위한 합리적인 전략을 모색할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 이황화 상호변화를 통해 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 확인되면, 설프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액에서 동결건조시키고, 수분 함량을 제어하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특수 중합체 매트릭스 조성물을 개발하여서 안정화를 이룰 수 있다.
서방형 조성물은 또한 현탁물 중에 결정을 유지시킬 수 있는 적절한 제형에 현탁된 항체의 결정 제제를 포함한다. 이러한 제제는 피하 또는 복막내 투여시 서방성 효과를 제공할 수 있다. 다른 조성물은 또한 리포솜으로 포획된 항체를 포함한다. 이러한 항체를 포함하는 리포솜은 예를 들어 미국 특허 제3,218,121호; 문헌 [Epstein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034]; EP 52,322호; EP 36,676호; EP 88,046호; EP 143,949호; EP 142,641호; 일본 특허 출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 유럽 특허 제102,324호에 기술된 공지 방법으로 제조한다.
소정의 환자에 대한 항체 제형의 용량은 질환의 중증도 및 유형, 체중, 성별, 식이, 투여 시간 및 경로, 다른 고려 사항 및 기타 관련 임상 인자를 포함하는 약물의 작용을 변형시키는 공지된 다양한 인자를 고려하여 주치의에 의해 결정된다. 치료적 유효 용량은 시험관 내 또는 생체 내 방법을 통해 결정할 수 있다.
본 원에서 기술된 치료적으로 사용되는 항체의 유효량은 예를 들어, 치료 대상, 투여 경로 및 환자의 상태에 따라 좌우된다. 따라서, 최적의 치료 효과를 얻는데 필요한 투여 경로를 변형하고 용량을 적정하는 것이 치료자에게 바람직하다. 통상의 1일 용량은 상기 언급한 인자들에 따라서, 약 0.001 mg/kg 내지 최대 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 대체로, 임상의는 목적하는 효능을 얻는데 용량이 도달할 때까지 치료적 항체를 투여하게 된다. 이러한 치료법의 진행은 통상의 분석법 또는 본 원에 기술된 방법에 따라 용이하게 모니터된다.
본 발명의 조성물 및 방법에 따른 치료물의 투여는 적절한 담체, 부형제 및 개선된 이동, 전달 내성 등을 제공하기 위해 제형에 도입되는 다른 제제와 함께 투여될 것이다. 이러한 제형은 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 소포체(예컨대, Lipofectin™)를 함유하는 지질(양이온 또는 음이온성), DNA 접합체, 무수 흡착 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카르보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔 및 카르보왁스를 함유하는 반고체 혼합물 등을 포함한다. 상기의 임의 혼합물은 본 발명에 따른 치료 및 요법에 적합할 수 있으나, 단 제형 내 활성 성분은 제형에 의해 불활성화되지 않고, 제형은 생리적으로 혼화성이며 투여 경로에 내성이어야 한다. 예를 들어 문헌 [Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid pharmaceuticals", Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts", J Pharm Sci .89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulation" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)] 및 제형, 약학 화학자에게 공지된 제형, 부형제 및 담체와 관련되어 여기서 언급한 추가 정보를 참조바란다.
다른 치료제의 설계 및 생성
PDGFR-알파에 대하여 본 원에서 생성되고 특정화된 항체의 활성에 준하고 본 발명에 따라서, 다른 치료 방식의 설계가 당업자에 의하여 용이하게 행해질 수 있다. 이러한 방식에는, 이중특이성 항체, 면역독소법, 방사성 동위원소 치료법 및 단일 항체 V 도메인, V 부위 스캐폴드와 다른 스캐폴드에 기초한 항체-유사 결합제, 펩티드 치료법의 개발, 유전자 치료법, 특히 인트라바디(intrabody), 안티센스 치료법 및 소분자 등의 개선된 항체 치료법이 제한없이 포함된다.
예컨대, 피브로넥틴 또는 사이토크롬 B 등의 비-항체 단백질 스캐폴드상에 CDRs의 배열(Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide et al. (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1 141-1 151; Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology. 7: 463-469), 또는 목적하는 표적에 대해 결합 특이성을 부여하기 위한 단백질 스캐폴드내 루프의 아미노산 잔기의 랜덤화 또는 돌연변이화에 의해 항원 결합 부위가 제공될 수 있다. 단백질에 새로운 결합 부위를 공학적으로 처리하기 위한 스캐폴드는 문헌 [Nygren et al. (Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7:463-469)]에 상세히 검토되었다. 항체 모방체에 대한 단백질 스캐폴드는 그의 전체 내용이 본 원에 참고로 포함되는 WO/0034784호에 기술되었으며, 여기에서 발명자들은 적어도 하나의 랜덤화 루프를 지니는 피브로넥틴 타입 III 도메인을 포함하는 단백질(항체 모방체)을 개시하였다. 면역글로불린 유전자 슈퍼패밀리의 임의의 도메인 멤버로 하나 이상의 CDRs, 예를 들어 HCDRs 세트를 그라프트하기에 적절한 스캐폴드가 제공될 수 있다. 스캐폴드는 인간 또는 비-인간 단백질일 수 있다. 비-항체 단백질 스캐폴드의 이점은 스캐폴드 분자내에 적어도 일부 항체 분자 보다 작고/작거나 제조가 용이한 항원-결합 부위를 제공할 수 있다는 것이다. 작은 크기의 결합 멤버는 유용한 생리적 특성, 예컨대 세포로 유입되거나 조직으로 깊게 침투하거나, 표적물을 다른 구조내에 도달하게 하거나, 또는 표적 항원의 단백질 강내에 결합할 수 있는 능력을 부여할 수 있다. 비-항체 단백질 스캐폴드중 항원 결합 부위의 이용에 대해서는 문헌 [Wess, 2004 (Wess, L. In: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004)]에 논의되어 있다. 루프(들)의 아미노산 서열이 특정적으로 또는 랜덤하게 돌연변이화하여 표적 항원에 결합하는 항원-결합 부위를 형성하는 안정한 백본 및 하나 이상의 가변 루프를 지니는 단백질이 전형적이다. 이러한 단백질은 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 트랜스페린, 알부민, 테트라넥틴, 피브로넥틴(예: 10 번째 피브로넥틴 타입 III 도메인), 리포카인으로부터의 단백질 A의 IgG-결합 도메인뿐 아니라 감마-결정성 및 기타 Affilin™ 스캐폴드(Scil 단백질)를 포함한다. 다른 접근법의 예로서 시클로타이드에 기초한 합성 "마이크로바디(Microbody)" - 분자내 이황화 결합을 갖는 소형 단백질, 미소단백질(VersabodiesTM, Amunix) 및 안키린(ankyrin) 반복 단백질(DARPins, Molecular Partners)을 들 수 있다.
항체 서열 및/또는 항원-결합 부위 외에, 본 발명에 따른 표적화된 결합제는 예를 들어 폴딩(folded) 도메인과 같은 펩티드 또는 폴리펩티드를 형성하거나, 또는 분자에 항원 결합능 외에 또 다른 기능적 특성을 부여하는 다른 아미노산도 포함할 수 있다. 본 발명의 표적화된 결합제는 검출가능한 표지를 가질 수 있거나, 또는 독소 또는 표적 부분 또는 효소에 접합될 수 있다(예를 들어 펩티딜 결합 또는 링커를 통해). 예를 들어, 표적화된 결합제는 촉매 부위(예를 들어 효소 도메인중에) 뿐 아니라 항원 결합 부위를 포함할 수 있으며, 여기에서 항원 결합 부위는 항원에 결합함에 따라 촉매 부위를 항원에 표적화한다. 촉매 부위는 예를 들어 절단에 의해 항원의 생물학적 기능을 저해할 수 있다.
개선된 항체 치료제의 생성과 관련하여, 보체의 고정이 원한는 특성이라면, 예를 들어 이중특이성, 면역독소 또는 방사성 동위원소를 사용하여 세포사멸에 대한 보체 의존성을 피할 수 있을 것이다.
예를 들어, 이중특이성 항체는 (i) PDGFR-알파 특이적인 항체와 제2 분자에 특이적인 다른 항체가 함께 접합된 두 항체, (ii) PDGFR-알파에 특이적인 하나의 사슬과 제2 분자에 특이적인 제2 사슬을 가지는 단일 항체, 또는 (iii) PDGFR-알파와 다른 분자 둘 다에 특이적인 단일 사슬 항체를 포함하도록 생성될 수 있다. 이러한 이중특이성 항체는 공지 기술을 이용하여 생성할 수 있다: 예를 들어, (i) 및 (ii)와 관련하여서는 문헌 [Fanger et al., Immunol. Methods., 4: 72-81(1994)] 및 [Wright and Harris, supra.] 및, (iii)과 관련하여는 문헌 [Traunecker et al., Int. J. Cancer.(Suppl.) 7: 51-52(1992)]이 적용됨. 각 경우에, 필요에 따라 제2 특이성이 제공될 수 있다. 예를 들어, CD16 또는 CD64(참조: Deo et al., 18: 127(1997)), 또는 CD89(참조: Valenrius et al., Blood, 90: 4485-4492(1997))을 포함하나 이에 제한되지 않는 중쇄 활성화 수용체에 제2 특이성을 부여할 수 있다.
항체는 또한 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 면역독소로서 작용하도록 변형될 수 있다(참조예: Vitetta, Immunol. Today, 14:252(1993), 및 미국 특허 제5,194,594호). 방사성 표지된 항체의 제조와 관련하여, 이러한 변형 항체는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다[참조예: Junghans et al., in Cancer Chemotherapy and Biotherapy, 655-686(2nd edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven(1996)]. 미국 특허 제4,681,581호, 제4,735,210호, 제5,101,827호, 제5,102,990호(RE 35,500), 제5,648,471호 및 제5,697,902호도 또한 참조바람. 면역독소 및 방사성 표지 물질의 각각은 원하는 다량체 효소 서브유닛 올리고머화 도메인을 발현하는 세포를 사멸시킬 것으로 여겨진다. 본 발명의 일부 구체예에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 유효량의 항체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
일부 구체예에 있어서, 항 PDGFR-알파 항체는 약제(방사성 동위원소, 약학 조성물 또는 독소)와 결합된다. 바람직하게, 이러한 항체는 PDGFR-알파를 발현하는 세포 또는 PDGFR-알파를 과발현하는 세포와 관련된 질환의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 약물이 항유사분열성, 알킬화, 항대사물질, 항혈관형성, 세포 자살, 알칼로이드, COX-2 및 항생제 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 약학적 특성을 가지는 것이 고려된다. 상기 약물은 질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아, 트리아젠, 엽산 유사체, 안트라사이클린, 택산, COX-2 억제제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 항대사물질, 항생제, 효소, 에피포도필로톡신, 백금 배위 착체, 빈카 알칼로이드, 치환 우레아, 메틸 히드라진 유도체, 부신피질 억제제, 길항제, 엔도스타틴, 택솔, 캄프토테신, 옥살리플라틴, 독소루비신 및 이들의 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군중에서 선택될 수 있다.
독소의 예로서는 겔로닌, 슈도모나스 외독소(PE), PE40, PE38, 디프테리아 독소, 리신, 아브린, 알파 독소, 사포린, 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 스타필로코커스 엔테로톡신-A, 억새풀(pokeweed) 항바이러스 단백질, 겔로닌, 슈도모나스 내독소뿐 아니라 이들의 그 유도체, 조합 및 변형이 추가로 포함된다.
방사성 동위원소의 예로서는, 감마 방출체, 양전자(positron) 방출체, 위치 추적 및/또는 치료를 위하여 사용될 수 있는 X 선 방출체, 치료용으로 사용될 수 있는 베타 및 알파 방출체를 포함한다. 진단제, 예후제 및 치료를 위한 시기결정(staging) 용으로 유용한 것으로 상술된 방사성 동위원소는 치료제로도 유용하다. 항암제 또는 항백혈병제의 예로서는, 독소루비신(아드리아마이신), 다우노루비신(다우노마이신), 이다루비신, 데토루비신, 카미노마이신, 에피루비신, 에소루비신, 몰폴리노 및 그의 치환 유도체, 조합 및 변형 등의 안트라사이클린을 포함한다. 대표적인 약물의 예로서는, 시스-백금, 택솔, 칼리케아미신, 빈크리스틴, 사이타라빈(Ara-C), 시클로포스파미드, 프레드니손, 다우노루비신, 이다루비신, 플루다라빈, 클로람부실, 인터페론 알파, 히드록시우레아, 테모졸로미드, 탈리도미드, 블레오마이신 및 그 유도체, 조합 및 변형을 포함한다. 바람직하게, 상기 항암제 또는 항백혈병제는 독소루비신, 몰폴리노독소루비신 또는 몰폴리노다우노루비신이다.
본 발명의 항체는 또한 포유동물, 바람직하게는 인간에서 반감기(예를 들어 혈청 반감기)가 비변형 항체의 것보다 긴 항체도 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 항체의 반감기는 약 15 일 초과, 약 20 일 초과, 약 25 일 초과, 약 30 일 초과, 약 35 일 초과, 약 40 일 초과, 약 45 일 초과, 약 2 개월 초과, 약 3 개월 초과, 약 4 개월 초과 또는 약 5 개월 초과이다. 포유동물, 바람직하게는 인간에서 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 반감기 증가는 포유동물에서 상기 항체 또는 항체 단편의 더욱 높은 혈청 역가로 이어지고, 그에 따라 상기 항체 또는 항체 단편의 투여 빈도가 줄어들고/들거나, 투여되는 상기 항체 또는 항체 단편의 농도가 감소하게 된다. 생체 내 반감기가 증가된 항체 또는 그의 단편은 당업자들에게 공지된 기술로 생성할 수 있다. 예를 들어, 반감기가 증가된 항체 또는 그의 단편은 당업자들에 공지된 기술로 생성할 수 있다. 예를 들자면, 반감기가 증가된 항체 또는 그의 단편은 Fc 도메인과 FcRn 수용체 간의 상호작용에 포함된 것으로 확인된 아미노산 잔기를 변경(예: 치환, 결실 또는 첨가)시켜 생성할 수 있다(참조예: 그의 전체가 본 원에 참고로 포함되는 국제 특허 공개 제 WO97/34631호 및 WO02/060919호). 생체 내 반감기가 증가된 항체 또는 그의 단편은 상기 항체 또는 항체 단편에 중합체 분자, 예컨대 고분자량 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 결합시켜 생성시킬 수 있다. PEG는 다작용성 링커의 존재 또는 부재하에 항체 또는 항체 단편의 N- 또는 C-말단에 PEG의 부위-특이적 접합을 이용하거나, 또는 리신 잔기상에 존재하는 엡실론-아미노기를 통해 상기 항체 또는 항체 단편에 결합될 수 있다. 생물학적 활성의 최소 손실이 일어나는 선형 또는 분지형 중합체 유도화가 이용될 것이다. PEG 분자가 항체에 적절히 접합되도록 접합도가 SDS-PAGE 및 질량 분석법으로 철저히 모니터될 것이다. 예를 들어, 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 접합체로부터 비반응 PEG를 분리할 수 있다.
당업자라면 이해할 수 있듯이, 상기 구체예에서, 친화도 값이 중요할 수 있지만, 항체의 특정 기능에 따라 다른 요소들이 보다 더 중요할 수도 있다. 예를 들어, 면역독소(항체에 접합된 독소)의 경우에는, 표적에 항체가 결합하는 작용이 유용할 수 있다; 그러나, 일부 구체예에서는, 목적하는 최종 결과인 세포에 독소의 내재화(internalization)가 중요하다. 그에 따라, 높은 비율의 내재화가 이들 상황에 요구될 수 있다. 따라서, 일 구체예로, 내재화 효율이 높은 항체가 고려된다. 고효율의 내재화는 내부로 들어간 항체의 비율로 측정되고, 낮은 값으로부터 100%에 이를 수 있다. 예를 들어, 여러 구체예에 있어서, 0.1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 45, 45 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 99 및 99 내지 100%가 높은 효율일 수 있다. 당업자라면 이해할 수 있듯이, 바람직한 효율은 상이한 구체예에 있어서, 예를 들어, 조합 약제, 일정 부위에 투여될 수 있는 항체의 양, 항체-약제 복합물의 부작용, 치료하기 위한 질환의 중증성 및 종류(암 종류)에 따라 다를 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 본 원에 개시된 항체는 PDGFR-알파의 발현의 변화와 관련된 질병 또는 질환을 탐색하기 위한 포유동물 조직 또는 세포에서 PDGFR-알파의 발현을 검출하기 위한 검사 키트를 제공한다. 상기 키트는 PDGFR-알파에 결합하는 항체와 존재한다면 항원과 항체의 반응을 나타내기 위한 수단을 포함한다.
일부 구체예에 있어서, 항 PDGFR-알파 항체를 포함하는 조성물, 조성물이 PDGFR-알파 발현에 의해 매개되는 질환을 치료하기 위하여 사용될 수 있음을 나타내는 패키징 삽입물 또는 라벨을 포함하는 제품이 제공된다. 바람직하게, 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이 항 PDGFR-알파 항체를 수용한다.
조합
본 원에 정의된 항종양 치료는 단독 요법으로 적용될 수 있거나, 본 발명의 화합물 외에, 통상적인 외과수술, 골수 및 말초 간세포 이식 또는 방사선치료 또는 화학요법을 포함할 수 있다. 이러한 화학요법은 하기 범주의 항종양제를 하나 이상 포함할 수 있다:
(i) 의학 종양학에서 사용되는 것과 같은 다른 항증식/항종양성 약물 및 이의 조합, 예컨대 알킬화제(예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 질소 머스타드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 테모졸라미드 및 니트로소우레아); 항대사물질(예를 들어, 젬시타빈 및 항엽산제, 예컨대 플루오로피리미딘, 이를테면 5-플루오로우라실 및 테가푸르, 랄티트렉시드, 메토트렉세이트, 시토신 아라비노시드 및 히드록시우레아); 항종양 항생제(예를 들어, 안트라사이클린, 이를테면 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 닥티노마이신 및 미트라마이신); 항유사분열제(예를 들어, 빈카 알칼로이드류, 이를테면 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈 및 탁소이드류, 이를테면 탁솔 및 탁소테르 및 폴로키나제 억제제 등); 및 토포이소머라제 억제제(예를 들어, 에피포도필로톡신, 이를테면 에토포시드 및 테니포시드, 암사크린, 토포테칸 및 캄프토테신);
(ii) 세포증식 억제제, 예컨대 항에스트로겐제(예를 들어, 타목시펜, 풀베스트란트, 토레미펜, 랄록시펜, 드롤록시펜 및 이오독시펜), 항안드로겐제(예를 들어, 비칼루타미드, 플루타미드, 닐루타미드 및 시프로테론 아세테이트), LHRH 길항제 또는 LHRH 작용제(예를 들어, 고세렐린, 류프로렐린 및 부세렐린), 프로게스토겐(예를 들어, 메게스트롤 아세테이트), 아로마타제 억제제(예를 들어, 아나스트로졸, 레트로졸, 보라졸 및 엑세메스탄) 및 5α-리덕타제의 억제제, 예컨대 피나스테리드;
(iii) 항침윤제(예를 들어, c-Src 키나제 패밀리 억제제, 이를테면 4-(6-클로로-2,3-메틸렌디옥시아닐리노)-7-[2-(4-메틸피페라진-1-일)에톡시]-5-테트라히드로피란-4-일옥시퀴나졸린(AZD0530; 국제 특허 출원 WO　01/94341호) 및 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-{6-[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일]-2-메틸피리미딘-4-일아미노}티아졸-5-카복사미드(다사티닙, BMS-354825; J. Med. Chem., 2004, 47, 6658-6661), 및 메탈로프로테아제 억제제, 이를테면 마리마스타트, 우로키나제 플라스미노겐 활성인자 수용체 기능 억제제, 또는 카텝신 억제제, 세린 프로테아제 억제제, 예를 들어 마트립타제, 헵신, 우로키나제, 헤파라나제 억제제);
(iv) 세포독성제, 예를 들어 플루다라빈, 2-클로로데옥시아데노신, 클로람부실 또는 독소루비신 및 이들의 조합물, 예컨대 플루다라빈 + 시클로포스파미드, CVP: 시클로포스파미드 + 빈크리스틴 + 프레드니손, ACVBP: 독소루비신 + 시클로포스파미드 + 빈데신 + 블레오마이신 + 프레드니손, CHOP: 시클로포스파미드 + 독소루비신 + 빈크리스틴 + 프레드니손, CNOP: 시클로포스파미드 + 미톡산트론 + 빈크리스틴 + 프레드니손, m-BACOD: 메토트렉세이트 + 블레오마이신 + 독소루비신 + 시클로포스파미드 + 빈크리스틴 + 덱사메타손 + 류코보린, MACOP-B: 메토트렉세이트 + 독소루비신 + 시클로포스파미드 + 빈크리스틴 + 프레드니손 고정 용량 + 블레오마이신 + 류코보린, 또는 ProMACE CytaBOM: 프레드니손 + 독소루비신 + 시클로포스파미드 + 에토포사이드 + 시타라빈 + 블레오마이신 + 빈크리스틴 + 메토트렉세이트 + 류코보린.
(v) 성장 인자 기능 억제제: 예를 들어 이러한 억제제는 성장 인자 항체 및 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 항-erbB2 항체 트라스투주맙[Herceptin™], 항-EGFR 항체 파니투무맙, 항-erbB1 항체 세투시맙[Erbitux, C225] 및 문헌 [Stern et al. Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, pp11-29]에 기술된 임의의 성장 인자 또는 성장 인사 수용체 항체)를 포함하며; 이러한 억제제는 또한 티로신 키나제 억제제, 예컨대 상피 성장 인자 패밀리의 억제제(예를 들어, EGFR 패밀리 티로신 키나제 억제제, 예컨대 N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민(제피티닙, ZD1839), N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민(에를로티닙, OSI-774) 및 6-아크릴아미도-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-(3-모르폴리노프로폭시)-퀴나졸린-4-아민(CI 1033), erbB2 티로신 키나제 억제제, 예컨대 라파티닙, 간세포 성장 인자 패밀리 억제제, 혈소판 유래 성장 인자 패밀리 억제제, 예컨대 이마티닙, 세린/트레오닌 키나제 억제제(예를 들어, Ras/Raf 신호전달 억제제, 예컨대 파네실 트랜스퍼라제 억제제, 예컨대 소라페닙(BAY 43-9006)), MEK 및/또는 AKT 키나제를 통한 세포 신호전달 억제제, 간세포 성장 인자 패밀리의 억제제, c-kit 억제제, abl 키나제 억제제, IGF 수용체(인슐린 유사 성장 인자) 키나제 억제제, 오로라 키나제 억제제(예를 들어, AZD1152, PH739358, VX-680, MLN8054, R763, MP235, MP529, VX-528 및 AX39459) 및 사이클린 의존성 키나제 억제제, 예컨대 CDK2 및/또는 CDK4 억제제, 및 생존 신호전달 단백질 억제제, 예컨대 Bcl-2, Bcl-XL, 예를 들면 ABT-737을 포함한다;
(vi), 예컨대 혈관 내피 성장 인자의 효과를 억제하는 것과 같은 항혈관형성제[예를 들어, 항혈관 내피 세포 성장 인자 항체 베바시주맙(Avastin™) 및 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제, 예컨대 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린(ZD6474; 예를 들어 WO01/32651호의 실시예 2), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)퀴나졸린(AZD2171; WO00/47212호의 실시예 240), 바탈라닙(PTK787; WO98/35985호) 및 SU11248(수니티닙; WO01/60814호), 국제 특허 출원 WO97/22596호, WO97/30035호, WO97/32856호 및 WO98/13354호에 개시된 바와 같은 화합물 및 다른 메카니즘으로 작용하는 화합물(예를 들어, 리노미드, 인테그린 ανβ3 기능 및 안지오스타틴 억제제)] 또는 집락 자극 인자 1(CSF1) 또는 CSF1 수용체;
(vii) 혈관 손상제, 예컨대 콤브레타스타틴 A4 및 국제 특허 출원 WO99/02166호, WO00/40529호, WO00/41669호, WO01/92224호, WO02/04434호 및 WO02/08213호에 기술된 화합물;
(viii) 안티센스 치료제, 예를 들어 상기 열거한 표적에 대한 것들, 예컨대 G-3139(제나센스), 항 bcl2 안티센스;
(ix), 예를 들어 이상 유전자, 예컨대 이상 p53 또는 이상 BRCA1 또는 BRCA2를 치환하기 위한 방법, GDEPT(유전자 지향 효소 프로드럭 요법) 방법, 예컨대 시토신 디아미나제, 티미딘 키나제 또는 박테리아 니트로리덕타제 효소를 사용하는 방법 및 화학요법 또는 방사선 요법에 대한 환자 내성을 증가시키기 위한 방법, 예컨대 다중 약물 내성 유전자 치료법을 포함하는 유전자 치료법;
(x) 예를 들어, CD52에 대한 모노클로날 항체인 알렘투주맙(Alemtuzumab, campath-1HTM)에 의한 치료 또는 CD22에 대한 항체에 의한 치료, 환자의 종양세포의 면역원성을 증대시키는 생체 외 또는 생체 내 방법, 인터루킨-2, 인터루킨-4 또는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 등의 사이토카인에 의한 형질감염, CTLA-4 기능을 억제하는 모노클로날 항체로 처리하는 것과 같은 T 세포의 무반응(anergy) 감소 방법, 사이토카인 형질감염된 가지 세포(dendritic cell)와 같이 형질감염된 면역세포를 사용하는 방법, 사이토카인 형질감염된 종양세포주를 사용하는 방법; 및 항 개별특이형(idiotypic) 항체를 사용하는 방법 등의 면역치료 접근법;
(xi) 벨케이드(Velcade, bortezomid) 등의 프로테아좀(proteasome) 억제제와 같은 단백질 분해 억제제; 및,
(xii) 예를 들어, 수용체 리간드를 격리하거나, 수용체에 대한 리간드 결합을 차단하거나, 수용체 신호전달을 감소시키는(예를 들어, 수용체 분해의 증가 또는 발현 수준의 감소에 의함) 펩티드 또는 단백질(예를 들어, 항체 또는 가용성 외부 수용체 도메인 구조)을 이용하는 방법 등의 생물학적 약물 치료방법.
이러한 공동 치료는 개별 치료 성분들을 동시 투약하거나, 연속 투약하거나, 또는 개별 투약하여 이룰 수 있다. 이러한 병용 산물은 상기에서 기술한 용량 범위 내의 본 발명의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 승인된 용량 범위 내의 다른 약학적 활성 제제를 사용한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 항종양성 치료는, 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF)의 효과를 억제하는 약제(예를 들어, 항-혈관 내피 세포 성장인자 항체 베바시주맙(Avastin®), 항-KDR 항체와 항-flt1 항체, 예를 들어 국제 특허 출원 WO97/22596호, WO97/30035호, WO97/3285호, WO98/13354호, WO00/47212호 및 WO01/32651호에 기재된 화합물 등의 항-혈관 내피 세포 성장 인자 수용체 항체), 및 다른 메카니즘으로 작용하는 화합물(예를 들어, 리노마이드, 인테그린 avb3 기능 및 안지오스타틴 억제제)과 병용하여 이용된다. 본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항종양성 치료는 혈관 내피 세포 성장 인자 수용체, KDR의 티로신 키나제 활성을 억제하는 제제(예를 들어, AZD2171 또는 AZD6474)와 병용하여 이용된다. AZD2171에 대한 추가의 세부적인 사항은 문헌 [Wedge et al. (2005) Cancer Research. 65(10): 4389-4400]에서 찾을 수 있을 것이다. AZD6474에 대한 추가의 세부적인 사항은 문헌 [Ryan & Wedge (2005) British journal of Cancer. 92 Suppl 1:S6-14]에서 찾을 수 있을 것이다. 이들 두 문헌은 그의 전체 내용이 본 원에 참고로 포함되었다. 본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 완전한 인간 항체 1.1.2, 1.5.3 또는 2.1.2는 단독으로 조합되거나, AvistinTM, AZD2171 또는 AZD6474과 함께 조합된다.
이러한 공동 치료는 개별 치료 성분들을 동시 투약하거나, 연속 투약하거나, 또는 개별 투약하여 이룰 수 있다. 이러한 병용 산물은 상기에서 기술한 용량 범위 내의 본 발명의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 승인된 용량 범위 내의 다른 약학적 활성 제제를 사용한다.
수행한 실험 및 얻은 결과를 포함하여 하기 실시예는 설명만을 목적으로 제공되는 것이고 본 원의 교시 내용을 한정하는 것으로 해석하여서는 안된다.
실시예 1
면역화 및 적정
면역원
재조합 가용성 PDGFR-알파 세포외 도메인을 R&D Systems(Minneapolis, MN, Catalog #: 322-PR/CF)로부터 입수하여 면역원으로 사용하였다. 또한, BHK(어린 햄스터 신장) 세포에서 발현된 재조합 인간 PDGFR-알파를 면역화 항원으로 사용하였다. BHK 세포는 미국 종균 협회(American Type Culture Collection, ATCC, catalog no. CCL-10)로 부터 입수하였다.
면역화
XenoMouse® 마우스(XenoMouse 계통: XMG2(IgG2 카파) 및 XM3C-1(IgG4 카파) Amgen, Inc. Fremont, CA)를 PDGFR-알파의 세포외 도메인(R&D Systems, Catalog #: 322-PR/CF)으로 연속 면역화하여 PDGFR-알파에 대한 모노클로날 항체를 생성하였다. XenoMouse 동물을 모든 주입에 대해 발바닥 경로를 통해 통상적인 수단으로 면역화하였다. 각 주입의 총 부피는 마우스당 10 마이크로그램의 PDGFR-알파 세포외 도메인을 함유하는 50 ㎕ 이었으며, 발바닥당 25 ㎕ 이었다. 어쥬번트는 Titermax GoldTM(Sigma, cat. T2684), 인산알루미늄 겔 어쥬번트, HCL Biosector(cat 1452-250) 및 ImmuneEasy 마우스 어쥬번트(qCpG, Qiagen cat. No 303105)를 포함하였다. 최초 주입은 Titermax GoldTM(0 일)으로 투여하였다. 5 ㎕의 인산알루미늄 겔 어쥬번트(5 ㎕) 및 qCpG(15 ㎕)를 10 ㎍의 PDGFR알파 세포외 도메인과 함께 3, 6, 10, 13, 20, 24, 27, 31 및 34 일에 추가 투여하였다.
실시예 2
림프구 회수, B-세포 분리, 융합 및 하이브리도마 생성
면역화 마우스를 경추 분리(cervical isolation)에 의해 사망시킨 후, 각 코호트(cohort)로부터 배출되는 림프절을 수확하여 풀화하였다. 림프구 세포를 DMEM에서 갈아 해리하여 조직으로부터 세포를 유리시키고, 세포를 DMEM에 현탁시켰다. 이들 세포의 수를 계수한 후, 108 림프구 당 0.9 ml의 DMEM을 세포 펠렛에 가하여 세포를 서서히 완전 재현탁시켰다. 108개의 세포 당 100 ㎕의 CD90+ 자기 구슬(magnetic bead)을 사용하여, 세포를 자기 구슬과 4 ℃에서 15 분간 인큐베이션하여 세포를 표지하였다. 108 이하의 양성 세포(또는 총 2×109 이하의 세포)를 포함하는 자기성 표지 세포 현탁액을 LS+ 칼럼에 로딩한 후, 칼럼을 DMEM으로 세척하였다. 총 유출물을 CD90-음성 분획으로 수집하였다(이들 세포의 대부분은 B 림프구일 것으로 예상되었다).
상술한 과정으로 얻은 세척한 강화 B 림프구와 ATCC(cat. no. CRL-1580)로부터 입수한 비분비성 흑색종 P3X63Ag8.653 세포를 1:1 비로 혼합하여 융합을 행하였다(Kearney et al., J. Immunol. 123, 1979:1548-1550). 세포 혼합물을 800×g으로 서서히 원심분리하여 펠렛화하였다. 상등액을 완전히 제거한 후, 세포를 프로나제 용액(Pronase solution, CalBiochem, cat.#53702; PBS 중 0.5 mg/mL) 2 내지 4 ml로 2 분 이하동안 처리하였다. 이후, 3 내지 5 ml의 FBS를 가하여 효소의 활성을 중단시키고, 전기 세포 융합 용액(electro cell fusion solution, ECFS)(0.3M 수크로스, Sigma, Cat# S7903, 0.1 mM 마그네슘 아세테이트, Sigma, Cat#M2545, 0.1 mM 칼슘 아세테이트, Sigma, Cat#C4705)을 이용하여 현탁액을 총 40 ml의 부피로 조정하였다. 원심분리 후에 상등액을 제거하고, 세포를 40 ml의 ECFS로 재현탁시켰다. 상기 세척 단계를 반복하고, 세포를 다시 2×106 세포/ml의 농도로 ECFS에 재현탁시켰다.
융합 생성기(모델 ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA)를 이용하여 전기 세포 융합을 행하였다. 융합 챔버의 크기는 2.0 ml로, 다음과 같은 장치의 조건으로 이용되었다; 얼라인먼트 조건(alignment condition): 전압: 50V, 시간: 50초; 세포막 파괴: 전압: 3000V, 시간: 30μ초, 융합 후 유지 시간: 3초.
ECF 후, 세포 현탁액을 멸균 조건하에 융합 챔버에서 주의하여 제거하여 15% FBS(Hyclone), L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신(pen/strep), OPI(옥살로아세테이트, 피루베이트, 소 알부민(모두 Sigma 제품), IL-6(Boehringer Mannheim)이 첨가된 동일 부피의 하이브리도마 배양 배지(DMEM, JRH Biosciences)를 함유한 튜브로 옮겼다. 세포를 37 ℃에서 15 분 내지 30 분동안 인큐베이션한 후, 400×g(1000 rpm)으로 5 분간 원심분리하였다. 세포를 소부피의 하이브리도마 선별 배지(0.5× HA(Sigma, cat.# A9666))가 첨가된 하이브리도마 배양 배지)에 조심스럽게 재현탁하고, 부피를 웰당 200 ㎕ 및 96 웰 플레이트당 총 5×106 B 세포의 최종 플레이팅을 기준으로, 더 많은 하이브리도마 선별 배지로 적절히 조정하였다. 세포를 조심스럽게 혼합하고, 96 웰 플레이트에 피펫팅하여 증식시켰다. 7 또는 10 일에, 배양액의 절반을 제거하고, 세포에 하이브리도마 선별 배지를 재공급하였다.
ELISA 선별
ELISA 분석을 위해, 재조합 인간 PDGFR-알파(R&D systems, cat#322-PR/CF)를 4 ㎍/ml의 농도로 포획제로서 사용하였다. 재조합 인간 PDGFR-알파를 항원 코팅 완충액(0.1M 카보네이트 완충액, pH 9.6 NaHCO3(MW 84) 8.4 g/L) 중에 웰당 50 ㎕의 부피로 ELISA 플레이트에 코팅하고, 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, ELISA 플레이트를 세척 완충액(1×PBS 중 0.05% Tween)으로 3회 세척하고, 실온에서 1 시간동안 웰당 200 ㎕의 차단 완충액(1% BSA, 0.1% Tween 20, 0.01% Thimerosal, 1×PBS 중)으로 차단하였다. 차단 단계가 완료되면, 웰당 50 ㎕의 하이브리도마 상등액을 실온에서 2 시간동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, ELISA 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 다음날, 웰에 검출 항체를 웰당 50 ㎕로 첨가하고, 실온에서 1 시간동안 인큐베이션하였다. 이어서, ELISA 플레이트를 세척 완충액으로 3회 연속 세척한 다음, TMB 기질을 첨가하였다(50 ㎕/웰). 정지 용액을 첨가한 후(50 ㎕/웰), ELISA 플레이트를 650 nm에서 ELISA 플레이트 판독기로 판독하였다. 이어, ELISA에 의해 양성으로 여겨지는 상등액을 FMAT 및 FACS로 평가하였다.
실시예 3
FMAT 및 FACS에 의한 후보 항체의 선별
인간 PDGFR-알파로 형질감염된 재조합 HEK293 세포 또는 인간 골육종 MG-63 세포주에 대한 선별 및 모 HEK293 세포에 대한 카운터-선별(counter-screen)을 수행함으로써, 14 일간 배양한 하이브리도마 상등액에서 PDGFR-알파 특이적인 모노클로날 항체를 FMAT(Flourometric Microvolume Assay Technology)로 선별하였다.
일차 선별에 준해, 양성 하이브리도마 세포 증식 웰로부터의 배양 상등액을 제거하고, PDGFR-알파 양성 하이브리도마 세포를 신선한 하이브리도마 배양 배지로 현탁시킨 후, 24 웰 플레이트로 옮겼다. 2 일간 배양한 후, 상등액을 이차 확인 선별(confirmation screen)에 사용하였다. 이차 확인 선별에서는, 항 PDGFR-알파 항체가 완전한 인간의 것임을 확인하기 위하여, 일차에서 양성으로 판정된 것들을 다음 검출 항체의 2 세트 또는 3 세트를 사용하여 FACS로 선별하였다: 인간 감마 사슬의 검출에 대해 1.25 ㎍/ml GAH-감마 Cy5(JIR#109-176-098), 인간 카파 경쇄의 검출에 대해서 1.25 ㎍/ml GAH-카파 PE(S.B.#2063-09) 및 인간 람다 경쇄의 검출에 대해서는 1.25 ㎍/ml GAH-람다 PE(S.B.#2073-09)를 각각 사용하였다.
실시예 4
PDGFR 티로신 인산화 분석
791 항체주를 PDGFR 티로신 인산화(pTyr) 분석을 이용하여 항체주가 종양 세포내 PDGFR-알파의 인산화를 억제할 수 있는지를 알아보았다.
요약하면, 인간 골육종 MG-63 세포를 100 ㎕ 삭제 배지(Starvation Media)(1% 목탄/덱스트린 처리된 FBS) 중 96-웰 FMAT 분석 플레이트에 웰당 10,000 세포로 시딩하고, 37 ℃에서 약 20 시간 인큐베이션하였다. 삭제 배지를 제거한 후, 샘플이 들어 있는 모든 웰에 37.5 ㎕의 배지를 첨가하고, 대조군(마우스 mAb 항 PDGFRa(BD PharMingen catalog # 556001) 또는 마우스 IgG2a(serotech, 2×최종 농도))가 들어 있는 웰에는 12.5 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 30 분간 인큐베이션하였다. 1% 분석 배지중 50 ㎕의 PDGF-AA(R&D)를 2×최종 농도(50 ng/ml)로 모든 플레이트에 가하고, 배지를 대조 플레이트의 칼럼 12에 가하였다. 플레이트를 37 ℃에서 10 분동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거하고, PBS/3% BSA 중 3.7% 포름알데히드 100 ㎕를 첨가한 후, 실온에서 20 분동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 2회 세척하고, 100 ㎕ 투과성 완충액(3% BSA/PBS 중 0.1% Triton-X)을 각 웰에 첨가하여 실온에서 10 분동안 인큐베이션한 뒤, 버렸다. PBS/3% BSA 중 0.6% 과산화수소 100 ml를 첨가하여 임의의 내인성 퍼옥시다제 활성을 불활성화시키고, 실온에서 20 분동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.1 % Tween-20으로 3회 세척한 다음, PBS/0.1% Tween-20 중 10% FBS 100 ㎕로 차단시켰다. 플레이트를 실온에서 1 시간동안 인큐베이션한 뒤, 차단 완충액을 제거하고, 50 ㎕의 항-포스포 PDGFa 항체(sc-12910-R)(1 ㎍/ml)를 10% FBS/PBST 중의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 2 시간동안 인큐베이션한 다음, PBST로 3회 세척하는데, 각 세척 중간에 5 분간 담가 두었다. 차단 완충액에서 희석시킨 50 ㎕의 염소 항-토끼 IgGFc-HRP 제2 항체를 첨가하여 실온에서 1 시간동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 5 분간 3회 세척하고, 가볍게 두드려 건조시켰다. 50 ㎕의 ECL 시약(LumiGLO Reserve, KPL catalog # 54-71-01)을 첨가하고 즉시 RLUs를 판독하였다. 플레이트를 PBST로 2회 세척하고, 가볍게 두드려 건조시켰다. 그후, 플레이트를 -80 ℃에서 30 내지 60 분간 냉동시켰다. 플레이트를 실온으로 하고, 각 웰에 100 ㎕의 CyQuant를 첨가하였다. 플레이트를 형광 판독기상에서 485 nm 여기 및 530 nm 방출로 판독하였다.
pTyr 분석에서 90% 이상의 중화에 기초해 103 주를 선별하였는데, 즉 선별된 항체주는 PDGF 수용체-알파의 티로신 인산화를 90% 이상 억제하였다(데이터는 나타내지 않음)
실시예 5
하이브리도마 상등액의 친화성 및 농도 분석
고 항원(HA)/제한 항원(LA) 분석
103 항체주를 하기 기술한 바와 같은 고 항원(HA)/제한 항원(LA) 분석을 이용하여 조사하였다. HA는 항체 농도 의존성이며, 따라서, 항체 농도의 척도이다. LA는 대부분 항체 친화성 의존 반응이며, 따라서 항체 친화성의 척도일 수 있다.
고 항원 정량 분석
요약하면, ELISA 플레이트를 후술하는 제한 항원 정량화 분석과 비교하여 보다 많은 양의 인간 PDGFR-알파 항원(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN Cat. No. 322-PR-050/CF)으로 코팅하였다. 항체-함유 하이브리도마 상등액을 1:51 내지 1:1656의 희석 범위에 걸쳐 적정하였다. 공지된 마우스 항-인간 PDGFR-알파-특이 항체 대조군(PharMingen Catalog No. 556001)을 선형 분석 범위를 정의하는데 이용하였다. 이어, 선형 범위내 데이터를 이용하여 각 적정 샘플내 PDGFR-특이 항체의 상대 농도를 유도하였다.
제한 항원 정량화 분석
미량역가 플레이트를 상술한 고 항원 정량화 분석과 비교하여 보다 적은 양의 인간 PDGFR-알파 항원으로 코팅하였다. 50 마이크로리터(50 ㎕)의 인간 PDGFR-알파를 1% 탈지유/1×PBS(pH 7.4)/0.5% 아지드중에 64, 32, 16, 8, 4 및 2 ng/ml(8.5 nM 내지 0.26 nM의 범위 포함)로 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 30 분동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 물로 4회 세척하고, 1% 탈지유/1×PBS(pH 7.4)/0.5% 아지드에서 1:25로 희석된 시험 항체를 함유한 50 ㎕의 하이브리도마 상등액을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 플라스틱 랩 또는 파라핀 필름으로 단단히 싸고, 실온에서 진탕하면서 밤새 인큐베이션하였다.
다음날, 모든 플레이트를 5회 세척하여 50 ㎕의 염소 항-인간 IgG Fc HRP 폴리클로날 항체를 1% 우유, 1×PBS(pH 7.4) 중에 0.5 ㎍/ml의 농도로 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 수돗물로 적어도 5회 세척하였다. 50 마이크로리터(50 ㎕)의 HPR 기질 TMB를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 30 분동안 인큐베이션하였다. 50 ㎕의 1M 인산을 각 웰에 첨가하여 HRP-TMB 반응을 중지시켰다. 450 nm에서 광밀도(흡광도)를 플레이트의 각 웰에 대해 측정하였다.
삼십사(34) 항체주를 상대 결합 친화성에 준해 선별하였다. 선별은 16 ng/ml 및 2 ng/ml에서의 항원 적정을 기반으로 하였다. 선별 컷오프(cut-off)는 LA가 0.3 OD 유니트 및 3.3 ㎍/ml 보다 큰 것이었다. 2 ng/ml 항원의 항원 농도에서 약한 반응성을 나타내는 항체주를 재선별하였다.
아홉개(9)의 추가의 항체주를 첨가하여 MG-63 세포내 PDGFR-알파 인산화 억제에 대한 후보 풀을 증가시켜 티로신 인산화를 강력히 억제하고 HA/LA 분석을 기준으로 높은 상대 친화성을 나타내는 총 43개의 항체주를 추가 수행시켰다. 상기 언급된 9개의 추가의 항체주는 PDGFR-알파 인산화를 완전히(즉, 100%) 억제한 것으로 나타났다. 항체주의 어떤 것도 PDGFR-베타 또는 동족체(FLT3, c-kit, CSF-1R)와 교차 반응하지 않았다.
[표 2]
MG-63 세포에서 PDGFR-알파 인산화를 강력히 억제할 수 있는 능력을 기초로 하여 선별된 43 항체주 요약
실시예 6
클로닝된 모노클로날 항체의 시험관 내 선별 및 데이터 분석
삼십개(30)의 항체주를 클로닝하고, 다음과 같이 더 조사하였다.
pTyr 분석
실시예 4에 기술된 바와 같은 MG-63 세포를 이용하여 PDGFR 티로신 인산화(pTyr 분석)를 수행하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.
증식 분석
PDGFR-알파에 대한 정제된 모노클로날 항체에 의한 MG-63 세포 성장 억제를 PDGF-AA 증식 분석 선별로 평가하였다.
요약하면, MG-63 세포를 100 ㎕ 완전 성장 배지중에 투명한 흑색 바닥 플레이트의 내부 웰에 웰당 5,000 세포로 시딩하고, 37 ℃에서 5% CO2로 3 내지 4 시간동안 인큐베이션하였다. 세포를 배지와 PBS 1×로 세척한 다음, 성장 삭제 배양 배지(MEM, 1% NEAA, 0.1% NaBicarb, 1% L glut)로 교체한 후, 밤새 스타빙하였다(starved). 플레이트로부터 배지를 제거하고, 50 ㎕의 2X mAb 또는 배지를 적절한 웰에 첨가하였다. 50 ㎕의 PDGF-AA 적정, 200 ng/ml PDGF-AA 또는 배지 단독을 첨가하고, 플레이트를 3 일동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 Alamar Blue로 530 여기 및 580 nm 방출로 판독하였다(웰당 100 ㎕/100 ㎕).
상부 15 모노클로날 항체, 즉 100 ng/ml(3.45 nM) PDGF-AA를 사용하여 세포 자극에 대해 최저 IC50 값을 나타내는 항체에 대한 데이터를 하기 표 3에 요약하여 나타내었다. 추가 분석을 위해 선별된 모노클로날 항체는 굵은 글씨로 표시하였다. 선별된 항체중 다섯개에 대한 용량 반응 곡선을 도 1에 도시하였다. 2.451.1.1 제제는 상기 모노클로날 항체에 대한 DNA 서열 분석동안 두개의 상이한 경쇄 서열이 검출되었기 때문에, 중쇄는 동일하나 경쇄가 상이한 두개의 상이한 항체를 포함할 수 있다.
[표 3] 증식 분석: MG-63 세포
FACS Kd 친화성 결정
PDGFR-알파에 대한 정제된 모노클로날 항체(mAbs 2.175.3, 2.449.1.3, 2.451.1.1, 2.998.2, 2.84.3)의 친화성을 FACS 분석으로 결정하였다.
요약하면, PDGFR-알파를 발현하는 MG-63 세포를 약 3 내지 5×106 세포/ml의 농도로 FACS 완충액(2% FBS, 0.05% NaN3)에 재현탁하였다. 세포를 얼음에 보관하였다. 정제된 항체 및 CD140a 대조군을 96 웰 플레이트의 11개 웰에 걸쳐 여과된 1× PBS(2×)에 순차적으로 희석하였다. 각 열의 12번째 웰에는 오직 완충액만 넣었다. 1×PBS와 세포를 각 mAb의 웰에, 최종 부피가 30 ㎕/웰이고, 각 웰이 약 100,000 세포를 포함하도록 가하였다. mAbs에 대한 최종 분자의 농도 범위는 다음과 같다:
mAb 농도
2.451.1.1 = 19.1 - 0.019 nM
2.175.3 = 10.8 - 0.021 nM
2.449.1.3 = 10.7 - 0.021 nM
2.449.1.3 = 9.2 - 0.009 nM
2.84.3 = 4.4 - 0.009 nM
2.449.1.3 = 9.2 - 0.009 nM
2.998.2 = 4.6 - 0.009 nM
CD140a = 20.2 - 0.020 nM
플레이트를 플레이트 진탕기상에서 4 ℃로 5 시간동안 방치한 다음, 원심분리하고 PBS로 3회 세척하였다. 100 또는 131 nM의 Cy5 염소 α-인간 폴리클로날 항체(Jackson Laboratories, #109-175-008) 200 ㎕를 각 웰에 가하고, 100 nM의 Cy5 염소 α-마우스 폴리클로날항체 200 ㎕를 CD140a 항체와 복합화된 세포에 가하였다. 그런 다음, 플레이트를 진탕기상에 4 ℃로 40 분간 두고, 원심분리하여 PBS로 3회 세척하였다.
각 mAb 농도에 대한 15,000 내지 20,000 세포 "이벤트"의 기하 평균 형광(Geometric Mean Fluorescence, GMF)을 FACSCalibur 기기를 이용하여 측정하였다. 각 mAb에 대해, GMF 데이터를 각 적정에서 동등한 mAb 농도점에 대한 양 중복 적정에 대해 정규화하였다. 상응하는 정규화 적정점을 평균내어 각 mAb 농도에 대해 하나의 정규화 GMF 점을 제공하였다. mAb 2.351.3에 대해 하나의 적정 데이터 세트만이 분석에 허용할 수 있는 품질의 것이었다. 분자 mAb 농도 함수로서의 GMF의 비선형 플롯을 하기 식을 이용하여 과학 소프트웨어로 작성하였다:
상기 식에서,
F는 기하 평균 형광을 나타내고,
LT는 총 분자 mAb 농도를 나타내며,
P'는 결합 mAb에 대한 임의의 형광 단위와 관련된 비례상수를 나타내고,
KD는 평형 해리상수를 나타낸다.
각 mAb에 대한 KD 값은 P'로 얻어졌고, KD는 비선형 분석에서 자유롭게 변동되었다. 다음 표 4는 95%의 고정된 신뢰 구간으로 각 mAb에 대한 KD 값을 나타낸다. mAbs를 친화성 감소 순으로 열거하였다.
[표 4]
마우스 교차 반응성
동물 이종이식 연구의 확립을 위해, 내인성 PDGFRa를 발현하는 뮤린 섬유모 세포주인 NIH3T3 세포로 FACS 분석을 수행하여 마우스 교차 반응성을 결정하였다. NIH3T3 세포를 0.5×106 세포/ml로 10 ㎍/ml의 시험 항체와 함께 얼음상에서 1 시간동안 인큐베이션한 뒤, 세정하고, Cy5로 표지된 5 ㎍/ml의 염소-항 인간 IgG 항체와 PBS에 재현탁시켰다. 세포를 세정하여 FACS에 의해 Cy5 존재에 대해 분석하였다. 시험한 모노클로날 항체에서 3개만이 마우스 교차 반응성을 나타내었다. 결과를 표 5에 요약하여 나타내었다.
내재화(Internalization) 퍼센트
세포에 내재화된 항체 퍼센트를 표준 내재화 프로토콜을 이용하여 결정하였다. 10 ㎍/ml 에서의 내재화 퍼센트 결과를 표 5에 요약하여 나타내었다.
결과
30개의 클로닝된 모노클로날 항체의 시험관 내 선별 및 데이터 분석 결과를 표 5에 요약하여 나타내었다. mAbs를 IC50 값 증가 순으로 열거하였다. 이탤릭체의 mAbs는 상위 10 퍼센트 mAbs로서 선별된 것이고, 굵은 글씨체의 항체는 세개의 선도 후보로서 선별된 것이다. "( )"는 표 5에서 순위를 나타낸다.
표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, mAb 2.175.3은 MG-63 세포의 PDGF-AA 증식 억제 효과가 우수할 뿐만 아니라 MG-63 세포에 대한 PDGFR-알파의 인산화 억제 효과도 우수하였다. mAbs 2.449.1.3 및 2.998.2도 또한 MG-63 세포에 대한 PDGFR-알파의 인산화를 억제하였고, MG-63 세포의 PDGF-AA 증식을 억제하였다. 또한, mAbs 2.449.1.3 및 2.998.2도 PDGFR-알파에 대한 고 결합 친화성을 나타내었다.
[표 5] PDGFR-알파 모노클로날 항체 요약
실시예 7
항 PDGFR-알파 항체의 구조 분석
항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 대해서 이들의 DNA 서열을 확인하기 위한 서열 분석을 수행하였다. 항 PDGFR-알파 항체에 대한 완전한 서열 정보는 각 감마 및 카파 사슬 조합에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열로 서열 목록에 제공되어 있다. 가변 중쇄 서열을 분석하여, VH 패밀리, D 영역 서열 및 J 영역 서열을 결정하였다. 이어 서열을 해독하여 1차 아미노산 서열을 결정하고 생식계통 VH, D 및 J 영역 서열과 비교하여 체세포 과돌연변이를 평가하였다. "-"는 생식계통 서열과 동일성을 나타내고, "#"는 생식계통에서 발견되지 않은 항체 서열에서의 추가의 아미노산을 나타낸다.
표 12는 항체의 중쇄 영역을 그들의 동족 생식계통 중쇄 영역과 비교한 표이다. 표 13은 항체 카파 경쇄 영역을 그들의 동족 생식계통 경쇄 영역과 비교한 표이다.
면역글로불린 사슬의 가변(V) 영역은 B 세포 개체발생 동안 기능성 가변 영역(VHDJH 또는 VKJK)에 연결된 다중 생식계통 DNA 분절에 의해 코딩된다.
특정 항체가 아미노산 수준에서 각자의 개별 생식계통 서열과 차이가 있는 경우, 항체 서열은 생식계통 서열로 역돌연변이될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 교정 돌연변이는 표준 분자 생물학적 기술을 이용하여 1, 2, 3 또는 그 이상의 위치, 또는 임의의 돌연변이된 위치의 조합에서 발생할 수 있다. 비제한적인 예시로, 표 12는 mAb 2.175.3(서열 번호 2)의 중쇄 서열이 특히 FR1 영역에서 Q에서 H로의 돌연변이(돌연변이 1), CDR1 영역에서 S에서 H로의 돌연변이(돌연변이 2), CDR2 영역에서 S에서 R로의 돌연변이(돌연변이 3)를 통해서 상응하는 생식계통 서열과 상이하다는 것을 보여준다. 따라서, mAb 2.175.3의 중쇄를 코딩하는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열은 돌연변이 1이 변화하여 돌연변이 1 부위에서 생식계통 서열을 생성하도록 변형될 수 있다. 또한, mAb 2.175.3의 중쇄를 코딩하는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열은 돌연변이 2 또는 돌연변이 3이 변화하여 돌연변이 2 또는 돌연변이 3의 부위에서 생식계통 서열을 생성하도록 변형될 수 있다. 실제로, mAb 2.175.3의 중쇄를 코딩하는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열은 이들 특정 부위에서 생식계통 서열이 생성되도록 2 이상의 돌연변이의 임의 조합을 포함할 수 있다. 하기 표 6 내지 11은 mAb 2.175.3, 2.449.1.3 및 2.998.2에 대한 생식계통 유래의 이러한 변이 위치를 나타낸다. 각 열은 제시된 위치에서 생식계통 및 비생식계통 잔기의 독특한 조합을 나타낸다. 서열 목록과 표 6 내지 11 간에 일치하지 않는 점이 있으면, 표에 제공된 정보가 우선한다.
[표 6] 지정 잔기 번호에서 생식계통에 대한 mAb 2.175.3 중쇄(서열 번호 2)의 예시적 돌연변이
[6-1]
[표 7] 지정 잔기 번호에서 생식계통에 대한 mAb 2.175.3 경쇄(서열 번호 4)의 예시적 돌연변이
[7-1]
[7-2]
[표 8] 지정 잔기 번호에서 생식계통에 대한 mAb 2.449.1.3 경쇄(서열 번호 10)의 예시적 돌연변이
[표 9] 지정 잔기 번호에서 생식계통에 대한 mAb 2.449.1.3 경쇄(서열 번호 12)의 예시적 돌연변이
[9-1]
[표 10] 지정 잔기 번호에서 생식계통에 대한 mAb 2.998.2 중쇄(서열 번호 14)의 예시적 돌연변이
[10-1]
[표 11] 지정 잔기 번호에서 생식계통에 대한 mAb 2.998.2 경쇄(서열 번호 16)의 예시적 돌연변이
[11-1]
[표 12] 항-PDGFR-알파 항체 중쇄 서열
[표 13] 항-PDGFR-알파 항체 경쇄 서열
실시예 8
BIACORE 분-석에 의한 친화성 결정
Biacore T1OO 장비를 22 ℃에서 사용하여 Biacore 실험을 수행하였다. 항체와 바이오센서(biosensor) 표면의 표준 알데히드 커플링을 이용하였다. 구체적으로, 각 mAb 50 ㎍을 0.1M NaOAc(pH 5.5) 중에 얼음상에서 ~1 mM NaIO4와 25 분동안 반응시킨 후, 샘플을 Sephadex G-25 핵산 정제-5 칼럼(NAP-5, GE biosciences) 상에서 10 mM NaOAC(pH 4.0)로 탈염시켜 산화 반응을 중단시켰다. 이어서, mAbs를 CM5 바이오센서 표면위로 유동시켜 EDC/NHS, 카보히드라지드 및 에탄올아민과 반응시켰다. 소정 표면 용량에 이르면, 고정화 mAbs를 통해 0.1M NaOAc(pH 4.0) 중의 0.1M NaBF3CN을 20 분간 유동시켜 mAb와 표면 간의 히드라존 결합을 환원시켰다.
mAbs 2.998.2(서열번호 14 및 16), 2.175.3(서열번호 2 및 4), 2.175.3 변이체 A(3Q, 8OY를 갖는 서열번호 2(서열번호 134); 46L, 77S를 갖는 서열번호 4(서열번호 135)), 2.449.1(서열번호 10 및 12) 및 2.449.1 변이체 A(49Y, 107I를 갖는 서열번호 10; 서열번호 12(서열번호 136))를 CM5 바이오센서 칩상에 고정화하였다. 재조합 인간 sPDGFR-알파(R&D catalog# 322-PR/CF; lot# QY056081)를 51.6 내지 0.806 nM(2× 연석 희석)의 농도 범위로 90 초간 주입한 후, 3 분 분리시켰다. 상기 분리기는 조사한 모든 상호작용에 대해 매우 느린 것이 확실하였기 때문에, 25.8 nM로 3회 및 3회 블랭크 완충액을 주입하는 추가의 6회 주입을 90 초 주입으로 수행하였는데, 첫 30 주입 완료 후 14,400 초(4 시간)의 분리기를 두었다. 샘플을 100 ㎍/ml의 BSA가 첨가된 헤페스(Hepes) 완충 식염수, 0.005% 폴리소르베이트 20(pH 7.4)(HBS-P)에서 제조하였다. 모든 샘플은 이중적 참조를 위해 완충액을 10회 이상 간간이 주입하면서 삼중으로 랜덤하게 주입하였다. 모든 센서그람(sensorgram) 데이터를 Scrubber 2.0으로 처리하고, CLAMP를 이용한 물질 전달 항목을 포함하여, 1:1 상호작용 모델에 포괄적으로 피팅하였다. 얻은 결합 상수를 하기 표에 나타내었다. mAb는 최고 친화성에서 최저 친화성 순으로 열거하였다.
[표 14] 선별 항체의 친화성
표 14의 결과는 2.175.3 및 2.449.1의 생식계통 변이체가 Biacore 분석으로 결정된 경우, 각 비생식계통 항체에 비해 가용성 PDGFRa에 대한 친화성이 증가되었음을 보여준다. 양 생식계통 항체는 그의 정상 상대에 비해 해리 상수가 감소된 것으로 나타났으며, 이는 관측된 친화성 증가에 기여한다. 표 14에서 최고 친화성을 나타내는 네 항체에 대해 실시예 2에 기술된 바와 같은 가용성 PDGFRa 결합 ELISA 및 실시예 4에 기술된 바와 같은 MG-63 인산화 분석을 시험하였다. 얻은 IC50 값을 하기 표 15에 나타내었다.
[표 15] sPDGFRa 결합 ELISA 및 수용체 인산화 분석에서 선별된 항체의 활성
실시예 9
인간 종양 이종이식 모델에서 항종양 효능 평가
상기 두 항체에 대한 항종양 효능을 Calu-6의 비소세포 폐암종 이종이식 모델에서 평가하였다. 숙주 마우스는 상동성 재조합에 의해 뮤린 PDGFRa 유전자가 인간 PDGFRa로 대체된 Black6/129 마우스를 SCID 마우스와 교접하여 얻은 것이다. 얻은 마우스는 인간 PDGFRa 수용체를 발현하였으나, 뮤린 수용체는 발현하지 않았다. 19 주령의 이들 녹인/녹아웃(knockin/knockout) 마우스(10/군)에 0.1 ml 매트리겔(matrigel) 중의 2×106 Calu-6 세포를 우측 복부에 주입하였다. 종양의 평균 크기가 170 mm3이 되면, 포스페이트 완충 식염수 비히클 또는 공(empty) 식염수 비히클중의 항체를 조사 기간동안 주 2회 킬로그램당 10 mg의 항체로 복강내 투여하였다. 도 2a는 처리군에 대한 평균 종양 크기를 시간에 대해 나타낸 것이고, 도 2b는 평균 체중을 시간에 대해 나타낸 것이다. 양 항체 처리군은 종양 성장 속도가 상당히 감소하였는데; 2.175.3 처리군은 55% 성장 감소율을 나타낸 반면(p=0.06), 2.449.1.3 처리군은 73% 성장 감소율을 나타었다(p<0.001). 조사동안 체중 변화에 대한 군 간 유의차는 없었다(도 2b).
2.449.1.3 및 2.449.1.3 변이체 A의 항종양 효능을 U118 신경아교종 이종이식 모델에서 추가로 평가하였다. 19 주령의 SCID 마우스(10/군)에 0.1 ml 매트리겔 중의 2×106 세포를 동물의 우측 복부에 주입하였다. 종양의 평균 크기가 280 mm3이 되면, 항체를 Calu-6 모델에 대해 상술된 바와 같이 투여하였다. 결과를 도 3에 나타내었다. 항체 2.449.1.3은 U118 종양 성장을 94% 까지 감소시켰다(p<0.000001). 2.449.1.3의 변이체 A는 성장을 101% 까지 감소시켰다. 따라서, 2.449.1.3 및 2.449.1.3 변이체 A는 모두 이 신경아교종 이종이식편의 성장을 감소시키는데 매우 활성적이며, 변이체 A의 돌연변이는 이 모델에서 생체 내 활성을 감소시키지 않았다.
참고에 의한 도입
이미 인용되지 않은 정도로 본 원에 인용된 특허, 특허 출원, 논문, 참고 서적 등을 비롯하여 본 원에 인용된 모든 참조 문헌은 전체가 본 원에 참고로 포함된다.
동등 사항
전술한 명세서는 당업자들이 본 발명을 실시하는데 충분한 것으로 판단된다. 전술한 본 발명의 상세한 설명 및 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 구체예를 상세히 설명하고 본 발명자들에 의해 최상의 모드라고 여겨지는 것을 기술하였다. 그러나, 상기에서 얼마나 상세하게 설명되었는지에 상관없이 본 발명은 다양한 방식으로 실시될 수 있고, 본 발명이 청구범위 및 그의 임의 동등물에 따라서 해석되어야 하는 것으로 이해하여야 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> AstraZeneca AB <120> Targeted Binding Agents Directed to PDGFR-Alpha and Uses Thereof <130> ASTR-013/01WO <150> US 60/835,647 <151> 2006-08-03 <160> 136 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caggtgcacc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactactaca tgcactggat ccgccaggct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtttcatac attagtagaa gtggcagtct catatactac 180 gtagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgaat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt actactgtgc gagagggggg 300 ccgtatagtg ggagcccctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Leu Ile Tyr Tyr 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ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctct 360 tca 363 <210> 76 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Gly Ser Ser Thr Thr Met Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Arg His Phe Asp Trp Ser Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 77 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctacat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagagacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag 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ctgtcatcag agtactaatt taccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 122 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Thr Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Thr Asn Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 123 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcatc ggctactatc ttcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgaatg gatgggatcg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg atcagggaca cgtccatcaa cacagcctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagataaa 300 cgtatcacta tggttcgggg agtccactat ctctactacg gttgggacgt ctggggccaa 360 gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384 <210> 124 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Gly Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ser Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Ile Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Lys Arg Ile Thr Met Val Arg Gly Val His Tyr Leu Tyr 100 105 110 Tyr Gly Trp Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 125 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcgagtca ggtcattagc aattatttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagttc ctcagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180 cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaac tataaaagtg ccccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 126 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Tyr Lys Ser Ala Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 127 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 128 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ile Ala Ala Arg Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 129 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 130 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 131 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 132 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 133 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 134 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Arg Ser Gly Ser Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Pro Tyr Ser Gly Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 135 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Pro Ser Gln Arg Ile Ser Arg Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 136 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Pro Ser Gln Ser Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Val Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Asn Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105

Claims (51)

  1. 약 4O pM 미만의 KD로 PDGFR-알파에 특이적으로 결합하고, PDGFR-알파를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 분리된 표적화된 결합제.
  2. 제1항에 있어서, PDGFR-알파에 대한 PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB 및/또는 PDGF-CC 리간드의 결합을 억제하는 표적화된 결합제.
  3. 제1항에 있어서, PDGFR-알파에 결합하고, 수용체 자기인산화를 억제하는 표적화된 결합제.
  4. 제1항에 있어서, PDGFR-알파에 결합하고, 세포 성장에 관여하는 하류 세포 신호전달을 억제하는 표적화된 결합제.
  5. 제1항에 있어서, PDGFR-알파에 결합하고, PDGFR-베타 수용체와 교차 반응하지 않는 표적화된 결합제.
  6. 제1항에 있어서, PDGFR-알파에 결합하고, 다른 클래스 III 수용체 티로신 키나제 패밀리 멤버와 교차 반응하지 않는 표적화된 결합제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물에서 종양 성장 및 전이를 억제하는 표적화된 결합제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 표적화된 결합제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1에 제시된 모노클로날 항체중 어느 하나인 표적화된 결합제.
  10. 제9항에 있어서, 모노클로날 항체 2.175.3인 표적화된 결합제.
  11. 제9항에 있어서, 모노클로날 항체 2.175.3 변이체 A인 표적화된 결합제.
  12. 제9항에 있어서, 모노클로날 항체 2.449.1.3인 표적화된 결합제.
  13. 제9항에 있어서, 모노클로날 항체 2.449.1.3 변이체 A인 표적화된 결합제.
  14. 제9항에 있어서, 모노클로날 항체 2.998.2인 표적화된 결합제.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체의 변이체 또는 유도체인 표적화된 결합제.
  16. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체와의 아미노산 서열 동일성이 80% 이상인 표적화된 결합제.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 완전한 인간 모노클로날 항체인 표적화된 결합제.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 완전한 인간 모노클로날 항체의 결합 단편인 표적화된 결합제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 결합 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 dAb로 구성된 군중에서 선택되는 것인 표적화된 결합제.
  20. 제1항에 있어서, 서열번호 2의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 표적화된 결합제.
  21. 제1항에 있어서, 서열번호 10의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 표적화된 결합제.
  22. 제1항에 있어서, 서열번호 14의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 표적화된 결합제.
  23. 제1항에 있어서, 서열번호 4의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 표적화된 결합제.
  24. 제1항에 있어서, 서열번호 12의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 표적화된 결합제.
  25. 제1항에 있어서, 서열번호 16의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 표적화된 결합제.
  26. PDGFR-알파에 결합하기 위해 제1항 내지 제25항의 표적화된 결합제 중 어느 하나와 경쟁하는 표적화된 결합제.
  27. 제1항 내지 제26항의 표적화된 결합제중 어느 하나와 동일한 PDGFR-알파 상의 에피토프에 결합하는 표적화된 결합제.
  28. 표 12 또는 표 13에 표시한 CDR3 서열;
    표 12에 표시한 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열;
    표 13에 표시한 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열; 또는
    표 12에 표시한 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 표 13에 표시한 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열
    을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 표적화된 결합제.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 항체인 표적화된 결합제.
  30. 제29항에 있어서, 완전한 인간 모노클로날 항체인 표적화된 결합제.
  31. 제30항에 있어서, 완전한 인간 모노클로날 항체의 결합 단편인 표적화된 결합제.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 표적화된 결합제를 코딩하는 핵산 분자.
  33. 제32항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  34. 제33항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  35. 종양성 질환(neoplastic disease)의 치료가 필요한 동물을 선별하는 단계; 및
    상기 동물에게 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 표적화된 결합제의 치료적 유효량을 투여하는 단계
    를 포함하는, 포유동물에서 종양성 질환의 치료 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 표적화된 결합제가 제10항 내지 제14항의 표적화된 결합제중 어느 하나에서 선택되는 것인 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양성 질환이 흑색종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경아교종, 간세포(간) 암종, 갑상선 종양, 위(위장) 암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 교모세포종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도 암종, 두경부암, 중피종, 육종, 담도(담관암), 소장 선암종, 소아 악성 종양, 표피양 암종 및 위장관 간질 종양(GIST)으로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  39. 비종양성 질환의 치료가 필요한 동물을 선별하는 단계; 및
    상기 동물에게 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 표적화된 결합제의 치료적 유효량을 투여하는 단계
    를 포함하는, 비종양성 질환의 치료 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 동물이 인간인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 표적화된 결합제가 완전한 인간 모노클로날 항체인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 표적화된 결합제가 제10항 내지 제14항의 표적화된 결합제중 어느 하나에서 선택되는 것인 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 비종양성 질환이 섬유성 질환 또는 면역계 질환중에서 선택되는 것인 방법.
  44. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 표적화된 결합제 또는 그의 결합 단편 및 치료제를 포함하는 접합체.
  45. 제44항에 있어서, 치료제가 독소인 접합체.
  46. 제45항에 있어서, 치료제가 방사성 동위원소인 접합체.
  47. 제46항에 있어서, 치료제가 약학적 조성물인 접합체.
  48. 종양성 질환 치료용 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 표적화된 결합제의 용도.
  49. 암 치료용 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 표적화된 결합제의 용도.
  50. 비종양성 질환 치료용 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 표적화된 결합제의 용도.
  51. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체와 조합된 표적화된 결합제.
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