CN112898431A

CN112898431A - 人源化抗激肽释放酶-2抗体

Info

Publication number: CN112898431A
Application number: CN202011566401.5A
Authority: CN
Inventors: P·O·V·蒂默曼德; A·T·特兰; S-E·斯特兰德; U·J·拉明梅基
Original assignee: FREDAX AB
Current assignee: FREDAX AB
Priority date: 2013-11-19
Filing date: 2014-11-19
Publication date: 2021-06-04
Also published as: LT3071595T; RU2016124229A; HUE043875T2; KR102574537B1; JP6599859B2; WO2015075445A1; US10100125B2; MX2016006561A; IL297678A; HRP20191095T1; PT3071595T; AU2014351611A1; CY1121900T1; JP7051777B2; KR20220020406A; US20190169312A1; EP3071595B1; IL245617A0; KR20160096621A; BR112016011025B1

Abstract

本发明提供了对人激肽释放酶‑2(hK2)具有结合特异性的抗体多肽，其中所述抗体多肽包含(a)包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区和/或(b)包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区，且其中所述重链可变区和轻链可变区包含来自一种或多种人抗体的框架氨基酸序列。本发明进一步提供了所述抗体多肽在诊断和治疗***癌中的用途。

Description

人源化抗激肽释放酶-2抗体

本申请是申请日为2014年11月19日，中国国家申请号为201480072422.8，发明名称为“人源化抗激肽释放酶-2抗体”的发明申请的分案申请。

发明领域

一般而言，本发明属于治疗和诊断剂和方法的领域，具体而言在*** 癌的领域中。

发明背景

目前，***癌是男性中最常见的癌症形式。***是男性中的一种核桃大小的腺，其生成作为***中的组分的流体。***具有以组织外层包围的两个或更多个叶或部分。***位于直肠前面并且就在膀胱下方，并且围绕尿道。

***癌的发生在欧洲西北部和美国是最高的。肿瘤的生长通常是长时间段期间发生的过程。***癌通常是癌症的轻度形式。实际上，大多数诊断出***癌的男性存活并恢复，仅少数男性遇到***癌的较具攻击性的形式，其在早期阶段中转移。***癌的此种攻击性形式仅当它在早期阶段时，在癌症已经扩散至囊外组织前得到诊断时可以能治愈。

现今，通常通过测量患者血液中的***特异性抗原(PSA)的浓度实施 ***癌的诊断和监测。若PSA的浓度在不同时间点时实施的几次连续测量中明显较高，则评估是有***癌的可能性。在此时间点时，可以实施活组织检查以确认***癌。

PSA(又称为激肽释放酶III)是一种由237个氨基酸的单链构成的蛋白质，其在***的分泌细胞中生成。可以在整个***腺体中找到这些分泌细胞。PSA是就***癌而言完善建立并且彻底研究的标志物。通过与健康细胞比较，PSA的生成在恶性细胞中更低并且在增生细胞中更高。相当矛盾的是，实际上，PSA的浓度在患有***癌的男性的血液中较高。然而，一种解释可以是恶性细胞具有恶化的细胞结构，并且因此对PSA更能透过。

适合作为***癌疗法的靶物的另一种重要的丝氨酸蛋白酶是人腺激肽释放酶2(hK2)。编码hK2的基因与编码PSA的基因一起位于染色体19上。就像PSA一样，hK2主要在***组织中表达。在***中，PSA以无活性的原形式存在，并且经由hK2的肽酶作用活化。就hK2而言的免疫组织化学研究已经显示了hK2相对于分化水平表达。这意味着hK2在低分化的组织(诸如经受***癌的组织)中以较高的产率表达，而在高分化的组织(诸如经受良性***增生(BPH)的组织，所述良性***增生是另一种常见的前列腺问题)中以较低的产率表达。

现今的***癌疗法是手术(例如根治性***切除术)、放射疗法(包括近程疗法和外部束放射疗法、高强度聚焦超声(HIFU))、化学疗法、口服化学治疗药物、冷冻手术(冷冻肿瘤)、激素疗法(诸如抗雄激素疗法)、去势或前述项的组合。

然而，这些疗法(手术和外部放射疗法)中的大多数仅(或主要)可用于治疗原发性肿瘤和大转移。化学疗法用于癌症的播散性，但是对于这些患者中的大多数，它是姑息效果和/或延长的存活。因此，其它或互补的治疗形式是必需的，以实现播散性恶性疾病的相当大的改善，特别是在微转移的情况中。

使用靶向性分子(诸如抗体和片段)疗法，诸如免疫疗法或放射性免疫疗法可以给出治疗播散性疾病的可能性。

如此，需要用于治疗和诊断***癌的新的治疗剂和方法。

发明概述

因而，本发明寻求单一或以任何组合缓和、减轻或消除本领域中的一个或多个上文鉴定的缺陷和缺点，并且通过提供依照所附专利权利要求书的治疗剂和方法至少解决上文提及的问题。

本发明的第一个方面提供了对人激肽释放酶-2(hK2)具有结合特异性的抗体多肽，其中所述抗体多肽包含：

(a)包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区，

CDRH1:SDYAWN SEQ ID NO:1

CDRH2:YISYSGSTTYNPSLKS SEQ ID NO:2

CDRH3:GYYYGSGF SEQ ID NO:3

和/或

(b)包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区，

CDRL1:KASESVEYFGTSLMH SEQ ID NO:4

CDRL2:AASNRES SEQ ID NO:5

CDRL3:QQTRKVPYT SEQ ID NO:6

且其中重链可变区和轻链可变区包含来自一种或多种人抗体的框架氨基酸序列。

上文的6种氨基酸序列代表本发明的抗体多肽的互补决定区(CDR)，如依照Kabatet al.,(1991)Sequences of Immunological Interest,第5版,NIH, Bethesda,MD(通过提及将其公开内容收入本文)定义的。

通过“抗体多肽”，我们包括基本上完整的抗体分子、单链抗体、双抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重和/或轻链的同二聚体和异二聚体、及其抗原结合片段和衍生物。

如本文中使用的，术语“氨基酸”包括标准的20种遗传编码氨基酸及其相应的“D”形式(与天然的“L”形式相比)的立体异构体、Ω-氨基酸、其它天然存在的氨基酸、非常规氨基酸(例如α,α-双取代的氨基酸、N-烃基氨基酸，等等)和化学衍生化的氨基酸(见下文)。

在明确列举氨基酸诸如“丙氨酸”或“Ala”或“A”时，术语指L-丙氨酸和D-丙氨酸两者，除非另有明确叙述。其它非常规氨基酸也可以是适合于本发明的多肽的组分，只要期望的功能特性由多肽保留。对于显示的肽，每种编码的氨基酸残基在适当的情况中以单字母名称代表，所述单字母名称对应于常规氨基酸的俗名。

在一个实施方案中，如本文中定义的多肽包含L-氨基酸或由L-氨基酸组成。

本发明的抗体多肽对hK2展现出特异性。

一种例示性的hK2序列描述为转录物：KLK2-201(ENST00000325321)，基因ENSG00000167751的产物，如在Ensemble数据库中给出的，所述数据库可以参见下述万维网地址：

ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Sequence_Protein？g＝ENSG00000167751 ；r＝19:51376689-51383822；t＝ENST00000325321

并且具有以下序列：

[SEQ ID NO:7]

(其中成熟的活性hK2蛋白的序列是加下划线的，所述序列在其N端前面有信号肽和前肽序列)。

***中找到的大部分hK2是无活性并且与蛋白C抑制剂(PCI)复合的。也可能的是，hK2与其它胞外蛋白酶抑制剂形成复合物。体外研究显示了hK2 能结合α2-抗纤维蛋白溶酶(α2-AP)、ACT、AMG、抗凝血酶III(ATIII)、C1- 灭活剂和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)。

在一个实施方案中，与hK2的复合同等型相比，抗体多肽对hK2的游离 (也就是说非复合)同等型具有特异性。对hK2的游离同等型具有特异性的结合模块可以对在hK2的游离同等型上暴露，但在hK2的复合同等型上未暴露的表位具有结合特异性，并且这可以是线性或构象性(也就是说非线性) 表位。例如，抗体多肽可以对包含一个或多个氨基酸残基的表位具有特异性，所述氨基酸残基是游离的hK2中暴露并且在复合同等型(诸如在hK2与PCI 复合时存在于***中的形式)中未暴露的hK2的催化裂缝的部分。hK2的表位定位记载于

et al,Clinical Chemistry 50:9,1607-1617(2004)，通过提及将其公开内容收入本文。

通过以下登录号鉴定hK2蛋白的别的例子：

(a)GenBank:AAF08277.1；

(b)GenBank:AAF08275.1；和

(c)UniProtKB/Swiss-Prot:P20151.1。

重组hK2的生成记载于Lovgren et al.,1999,Eur.J.Biochem.266:1050-5 (通过提及将其公开内容收入本文)。

通过“特异性”，我们意指抗体多肽能够在体内(即在hK2存在于人身体内的生理学条件下)结合hK2。优选地，抗体多肽在体内不结合任何其它蛋白质。

可以通过本领域中公知的方法，诸如ELISA、免疫组织化学、免疫沉淀、 Western印迹和使用表达hK2的转染细胞的流式细胞术测定此类结合特异性。有利地，抗体多肽能够选择性结合hK2，即它比对另一种蛋白质(特别地，其它激肽释放酶，诸如***特异性抗原或PSA)强烈至少10倍结合hK2。优选地，抗原多肽在体内不结合PSA。

对hK2具有特异性的鼠抗体是本领域中已知的。例如，

et al., 2004,Clinical Chemistry 50(9):1607-1617描述了对hK2具有特异性的小鼠中的单克隆抗体的生成(通过提及将其公开内容收入本文)。叙述了抗体中称作“11B6”和“7D7”的两种对hK2是选择性的。

在国际专利申请No.PCT/GB2012/052675(WO 2013/061083；通过提及将其公开内容完整收入本文)中披露了鼠抗体11B6的组分重和轻链的氨基酸序列；特别参见其中的SEQ ID NO:4和5。

本发明的抗体多肽基于11B6抗体的选定的人源化型式，其展现出意料不到的有利特性。

特别地，本发明的人源化抗体与衍生其CDR序列的亲本鼠11B6抗体 (m11B6)相比展现出增强的治疗比率(见实施例6)。

通过“增强的治疗比率”，我们意指本发明的抗体多肽(11B6抗体的人源化形式)在对***肿瘤患者施用时提供比亲本鼠11B6抗体(在相同放射性和施用路径时比较)更高的肿瘤吸收剂量与(健康)骨髓吸收剂量的比率。可以使用实施例6中描述的方法计算肿瘤与骨髓吸收剂量的比率。

本发明的抗体的好得意料不到的治疗概况容许使用较高的放射剂量(吸收剂量)，从而在不增加对健康组织和器官的副作用或“附带损伤”的情况下导致***癌治疗中的较大效力。

人源化(又称作重塑或CDR嫁接)是一种用于降低来自异种来源(通常来自啮齿类，诸如小鼠)的单克隆抗体的免疫原性并且用于改善其对人免疫 ***的激活的技术(参见Almagro&Fransson,2008,Frontiers in Bioscience 13:1619-1633的综述；通过提及将其公开内容收入本文)。临床试验中有几种人源化的单克隆抗体，并且已经对几种给予要作为药物使用的批准。虽然使用分子生物学技术生成工程化单克隆抗体的机械学是相对直截了当的，但是将啮齿类互补决定区(CDR)简单嫁接入人框架中不总是重建初始单克隆抗体的结合亲和力和特异性。为了使抗体人源化，人源化抗体的设计在再现初始分子的功能中是一个至关重要的步骤。

人源化抗体的设计包括几个关键的选择，包括要使用的CDR和要使用的人框架的程度。然而，为了保留亲本抗体的特异性，也可能至关重要的是将来自啮齿类单抗的一个或多个残基替代入人框架区中(所谓的回复突变)。鉴定必需的回复突变的位置需要详细的序列/结构分析。最近，已经使用噬菌体文库来改变选定位置处的氨基酸。类似地，已经使用许多方法来选择接受啮齿类CDR嫁接的最合适的人框架。早期实验使用有限亚组的完全表征的人单克隆抗体(经常在结构可用的情况中)，不管与啮齿类单克隆抗体的序列同一性(所谓的固定框架方法)。一些小组使用与啮齿类可变区具有高氨基酸序列同一性的可变区(同源性匹配或最佳拟合)；其它小组使用共有或种系序列，而又一些小组选择来自几种不同人单克隆抗体的每种轻或重链可变区内的框架序列的片段。还有用人单克隆抗体中找到的最常见的残基替换表面啮齿类残基的开发的人源化方法(“表面重修”或“镶面”)和那些使用CDR 程度的不同定义的方法。

然而，尽管抗体人源化的广泛研究，一些啮齿类单克隆抗体已经证明难以人源化。

本发明的抗体多肽的开放需要不仅在框架区中，而且还在一些CDR中的回复突变(见下文的实施例1)。如此，上文以SEQ ID NO:1至6表示的6种CDR 序列自鼠抗hK2抗体11B6衍生，但是相对于亲本鼠抗体含有CDRH2(SEQ ID NO:2)和CDRL1(SEQ ID NO:4)中的突变。做出CDR中的这些突变以对11B6 的人源化型式赋予最佳的特异性和稳定性。

在一个实施方案中，本发明的抗体多肽以大于0.1 x 10^-9M的K_D结合hK2。

用于测量相互作用(诸如抗体和配体之间的相互作用)的总体亲和力(K_D) 和结合速率(ka)和解离速率(kd)的方法是本领域中公知的。下文的实施例3中描述了例示性的体外方法。也想得到使用基于流式细胞术的方法(Sklar et al., 2002,Annu Rev BiophysBiomol Struct,31:97-119；通过提及将其内容收入本文)。

有利地，本发明的抗体多肽具有低于1.0 x 10^-10M的对hK2的亲和力(K_D)，例如低于9.0 x 10^-11M、8.0 x 10^-11M、7.0 x 10^-11M、6.0 x 10^-11M、5.0 x 10^-11M、 4.0 x 10^-11M、3.0 x 10^-11M、2.0 x 10^-11M或低于1.0 x 10^-11M的K_D。

本领域技术人员会领会，本发明的抗体多肽可以构成抗体重链、抗体轻链、抗体重和/或轻链的同二聚体和异二聚体、和抗原结合片段及其衍生物。

在一个实施方案中，抗体多肽包含完整(即完全)抗体或由完整(即完全)抗体组成，诸如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM分子。

有利地，抗体多肽包含完整IgG分子、或其抗原结合片段或衍生物，或者由完整IgG分子、或其抗原结合片段或衍生物组成。

IgG分子可以是任何已知亚型的，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

通过抗体的“抗原结合片段和衍生物”，我们包括Fv片段(例如单链Fv 和成二硫键的Fv)、Fab样片段(例如Fab片段、Fab’片段和F(ab)₂片段)和域抗体(例如单一V_H可变域或V_L可变域)。

例如，抗体多肽可以包含scFv或Fab片段或由scFv或Fab片段组成。

本发明的抗体多肽的进一步表征特征是重和轻链可变区中存在来自一种或多种人抗体的框架氨基酸序列。

通过“框架序列”，我们包括重和轻链可变域中除了CDR外的区域。通常，每个可变域会包含4个框架区，称作FR1至FR4，CDR序列位于所述框架区内：

FR1----CDR1----FR2----CDR2----FR3----CDR3----FR4。

应当领会，框架区的氨基酸序列可以是完全人的或者可以含有一处或多处回复突变(即，人框架中存在的氨基酸序列可以用衍生CDR的亲本啮齿类可变域内的相应位置处找到的氨基酸取代)。因此，本发明的抗体多肽的重和/或轻链可变域的FR1、FR2、FR3和/或FR4的序列可以是非天然存在的。

在一个实施方案中，抗体多肽的框架序列与来自一种或多种人抗体的框架区共享至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或更多。如此，抗体多肽可以包含与人抗体的FR1区共享至少70％序列同一性的重链FR1区。然而，会领会抗体多肽的重和轻链可以与不同人抗体的框架区共享序列同一性。

可以通过例如在Expasy设施站点 (http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)的LALIGN程序 (Huang andMiller,Adv.Appl.Math.(1991)12:337-357)使用全局比对选项、评分矩阵BLOSUM62、开放缺口罚分-14、延伸缺口罚分-4作为参数测定百分比同一性。或者，可以使用合适的计算机程序，例如威斯康辛大学遗传计算组(University of Wisconsin Genetic Computing Group)的GAP程序测定两种多肽间的百分比序列同一性，并且会领会，就已经最佳对比其序列的多肽而言计算百分比同一性。

或者，可以使用Clustal W程序(如记载于Thompson et al.,1994,Nucl. AcidRes.22:4673-4680，通过提及将其收入本文)实施比对。使用的参数可以如下：

-快速成对比对参数：K-元组(字)大小；1，窗口大小；5，缺口罚分；3，顶部对角线数目；5.评分罚分：x百分比。

-多重比对参数：缺口开放罚分；10，缺口延伸罚分；0.05。

-评分矩阵：BLOSUM。

或者，可以使用BESTFIT程序来测定局部序列比对。

在一个实施方案中，本发明的抗体多肽的重可变域的框架序列由人免疫球蛋白VH4基因家族编码。

例如，框架序列可以至少部分由VH4-28种系基因编码(例如FR1、FR2 和FR3可以由VH4-28编码，并且FR4可以由JH1编码)。

如此，在一个实施方案中，抗体多肽可以包含重链可变区或者由重链可变区组成，所述重链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成：

[SEQ ID NO:8]。

在一个实施方案中，本发明的抗体多肽的轻可变域的框架序列由人免疫球蛋白κV4基因家族编码。

例如，框架序列可以至少部分由IgkV4-B3种系基因编码(例如FR1、FR2 和FR3可以由IgkV4-B3编码，并且FR4可以由JK2编码)。

如此，在一个实施方案中，抗体多肽可以包含轻链可变区或者由轻链可变区组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成：

[SEQ ID NO:9]。

通过“至少部分”，我们包括框架序列包含由参照基因编码的至少10个连续氨基酸，例如至少20个连续氨基酸。我们还包括一个或多个，但不是所有FR区由参照基因编码(例如，FR1和FR2可以由参照基因编码，但FR3不然)。

在一个优选的实施方案中，抗体多肽包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由SEQ ID NO:9 的氨基酸序列组成。

任选地，本发明的抗体多肽进一步包含重链恒定区或其部分。

在一个实施方案中，抗体多肽包含IgG重链(诸如IgG1、IgG2、IgG3或 IgG4重链)的CH1、CH2和/或CH3区。如此，抗体多肽可以包含部分或整个来自IgG1重链的恒定区。例如，抗体多肽可以是包含CH1和CL恒定区的Fab 片段。

在一个实施方案中，抗体多肽可以包含抗体Fc区。技术人员会领会，Fc 部分可以来自IgG抗体，或者来自不同类的抗体(诸如IgM、IgA、IgD或IgE)。在一个实施方案中，Fc区是来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。

Fc区可以是天然存在的(例如内源生成的抗体的一部分)或者可以是人工的(例如包含相对于天然存在的Fc区的一处或多处点突变和/或对CH2域内的碳水化合物模块的修饰)。具有改善其结合FcR的能力的点突变的Fc区可以是有利的，例如通过改变血清半衰期或者通过调控(即增强或降低)牵涉 ADCC和CDC的对Fcγ受体(FcγR)的结合实现。

有利地，抗体多肽可以包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，或其部分：

[SEQ ID NO:10]。

任选地，本发明的抗体多肽进一步包含轻链恒定区或其部分。

在一个实施方案中，抗体多肽包含IgG轻链(诸如κ或λ轻链)的CL区。

例如，抗体多肽可以包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其部分：

[SEQ ID NO:11]。

有利地，抗体多肽包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区包含 SEQ IDNO:10的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成，所述轻链恒定区包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。

在一个优选的实施方案中，本发明的抗体多肽包含：

(a)重链，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成(其中可变区为粗体，并且CDR序列为有框的斜体字)：

[SEQ ID NO:12]，

和/或

(b)轻链，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列或由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成(其中可变区为粗体，并且CDR序列为有框的斜体字)：

[SEQ ID NO:13]。

例如，抗体多肽可以包含两个SEQ ID NO:12的重链和两个SEQ ID NO: 13的轻链或者由两个SEQ ID NO:12的重链和两个SEQ ID NO:13的轻链组成，所述两个SEQ ID NO:12的重链和两个SEQ ID NO:13的轻链通过二硫化物桥连接在一起以形成典型的IgG抗体结构。

本发明的抗体多肽可以包含已经修饰或衍生化的一个或多个氨基酸或者由已经修饰或衍生化的一个或多个氨基酸组成。

可以通过与官能性侧基反应实现一个或多个氨基酸的化学衍生物。此类衍生化的分子包括例如已经衍生化游离的氨基基团以形成胺氢氯酸盐(amine hydrochlorides)、对甲苯磺酰基基团、羧基苯甲酰氧基(carboxybenzoxy)基团、叔丁基氧基羰基(t-butyloxycarbonyl)基团、氯乙酰基(chloroacetyl)基团或甲酰基基团的那些分子。可以衍生化游离的羧基基团以形成盐、甲酯和乙酯或其它类型的酯和酰肼。可以衍生化游离的羟基基团以形成O-酰基或O-烃基衍生物。还以化学衍生物包括含有20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如：可以用4-羟脯氨酸替代脯氨酸；可以用5-羟赖氨酸替代赖氨酸；可以用3-甲基组氨酸替代组氨酸；可以用高丝氨酸替代丝氨酸，并且用鸟氨酸替代赖氨酸。衍生物还包括含有一处或多处添加或删除的肽，只要必要的活性得到维持。其它包括的修饰是酰胺化、氨基端酰化(例如乙酰化或硫代乙醇酸酰胺化)、末端羧基酰胺化(例如用氨水或甲胺)和类似的末端修饰。

本领域技术人员会进一步领会，肽模拟物化合物也可以是有用的。术语 “肽模拟物”指模拟作为治疗剂的特定肽的构象和期望特征的化合物。

例如，所述多肽不仅包括氨基酸残基通过肽(-CO-NH-)连接而连接的分子，而且还包括反转肽键的分子。可以使用本领域中已知的方法，例如诸如那些记载于Meziere etal.(1997)J.Immunol.159,3230-3237(通过提及将其收入本文)的方法生成此类逆反(retro-inverso)肽模拟物。此方法牵涉生成含有牵涉主链，而非侧链取向的变化的假肽。逆反肽(其含有NH-CO键而非 CO-NH肽键)对蛋白水解有多得多的抗性。或者，所述多肽可以是肽模拟物化合物，其中替换常规酰胺连接，通过-y(CH₂NH)-键连接一个或多个氨基酸残基。

在一个别的备选中，可以总体上分配肽键，只要使用保留氨基酸残基的碳原子间的间隔的合适接头模块；可以有利的是接头模块与肽键具有基本上相同的电荷分布和基本上相同的平面性。

会领会，所述多肽可以在其N或C端方便封闭，从而帮助降低对外切蛋白水解消化的易感性。

也已经使用多种未编码的或经修饰的氨基酸，诸如D-氨基酸和N-甲基氨基酸来修饰哺乳动物肽。另外，可以通过共价修饰，诸如环化或者通过掺入内酰胺或其它类型的桥稳定化假设的生物活性构象，例如见Veber et al.,1978, Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:2636和Thursell et al.,1983,Biochem.Biophys. Res.Comm.111:166，通过提及将其收入本文。

本领域技术人员会领会，可以用功能性模块提升本发明的抗体多肽以促进其意图的用途，例如作为体内成像剂或治疗剂。

如此，在一个实施方案中，抗体多肽与治疗性模块直接或间接连接。

可以使用任何合适的治疗性模块。合适的治疗性模块是能够降低或抑制 ***癌细胞的生长或者特别杀死***癌细胞的模块。例如，治疗剂可以是细胞毒性模块。细胞毒性模块可以包含一种或多种放射性同位素或由一种或多种放射性同位素组成。例如，一种或多种中的每一种放射性同位素可以独立选自下组：β-发射体、俄歇-发射体、转换电子-发射体、α-发射体、和低光子能量-发射体。可以期望一种或多种中的每一种放射性同位素独立具有在药剂附近创建高吸收剂量的局部吸收能量的发射样式。例示性的放射性同位素可以包括：长程β-发射体，诸如⁹⁰Y、³²P、¹⁸⁶Re/¹⁸⁶Re；¹⁶⁶Ho、⁷⁶As/⁷⁷As、 ⁸⁹Sr、¹⁵³Sm；中程β-发射体，诸如¹³¹I、¹⁷⁷Lu、⁶⁷Cu、¹⁶¹Tb、¹⁰⁵Rh；低能量β- 发射体，诸如⁴⁵Ca或³⁵S；转换或俄歇-发射体，诸如⁵¹Cr、⁶⁷Ga、⁹⁹Tc^m、¹¹¹In、 ^114mIn、¹²³I、¹²⁵I、²⁰¹Tl；和α-发射体，诸如²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ac、²²⁵Ac、²¹²Pb、 ²⁵⁵Fm、²²³Ra、¹⁴⁹Tb和²²¹At。其它放射性核素是可用的，并且会可能用于疗法。

在另一个实施方案中，可以期望治疗性模块或细胞毒性模块不是如在 WO 2006/087374 A1中，特别是在其第11页，第7-15行以“示踪剂”披露的模块。

在一个优选的实施方案中，抗体多肽与放射性同位素¹⁷⁷Lu连接(或用放射性同位素¹⁷⁷Lu以其它方式标记)。

或者，治疗性模块可以包含一种或多种治疗性(诸如细胞毒性)药物或者由一种或多种治疗性(诸如细胞毒性)药物组成，例如细胞抑制性药物；抗雄激素药物；可的松及其衍生物；膦酸盐/酯；睾酮-5-α-还原酶抑制剂；硼附加物；细胞因子；毒胡萝卜素(thapsigargin)及其代谢物；毒素(诸如皂草素(saporin)或加利车霉素(calicheamicin))；化学治疗剂(诸如抗代谢物)；或可用于治疗***癌的任何其它治疗剂或细胞毒性药物。

例示性的治疗剂/细胞毒性药物可以例如包括：

·细胞抑制剂，特别是那些具有剂量限制副作用的细胞抑制剂，包括但不限于环磷酰胺(cyclophosamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、异环磷酰胺 (ifosfamide)、白消安(busulphane,busulfan)、洛莫司汀(lomustine)、紫杉烷 (taxanes)、磷酸雌莫司汀(estramustine phosphate)和其它氮芥、抗生素(包括多柔比星(doxorubicine)、加利车霉素和针棘霉素(esperamicine))、长春花生物碱(vinca alkaloids)、楝碱(azaridines)、含铂化合物、内皮他丁(endostatin)、烷基磺酸盐(alkyl sulfonates)、亚硝基脲(nitrosoureas)、三氮烯(triazenes)、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、酶、取代尿素(substitutedurea)、甲基肼(methyl-hydrazine)衍生物、柔红霉素(daunorubicin)、两亲性胺(amphipathic amines)，

·抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)和比卡鲁胺(bikalutamide)及其代谢物；

·可的松及其衍生物；

·膦酸盐/酯，诸如二膦酸盐/酯(diphophonate)和双膦酸盐/酯(buphosphonate)；

·睾酮-5-α-还原酶抑制剂；

·硼附加物；

·细胞因子；

·毒胡萝卜素及其代谢物；

·可用于治疗***癌的其它药物。

或者，细胞毒性模块可以包含一种或多种模块或者由一种或多种模块组成，所述模块适合于在活化疗法，诸如光子活化疗法、中子活化疗法、中子诱导的俄歇电子疗法、同步加速器照射疗法、或低能量X-射线光子活化疗法中使用。

例如，凭借本发明的抗体多肽，会有使用同步加速器放射(或低能量X- 射线)以推进放射疗法的潜力，所述放射疗法主要聚焦于所谓的光子活化放射疗法(PAT)，其中通过与预施用的高Z肿瘤靶向剂相互作用在癌症组织中增强来自外部X-射线照射的局部能量沉积。

PAT治疗形式利用来自同步加速器来源的单色X-射线，诸如由格勒诺布尔(Grenoble)的欧洲同步加速器放射设施(European Synchrotron Radiation Facility,ESRF)的ID17生物医学束线提供，并且如预期在未来的其它设施，诸如新的瑞典同步加速器设施(Swedish synchrotron facility)Max-IV可用。

作为别的潜在治疗形式，关于“诱导的俄歇电子肿瘤疗法”的研究是在隆德(Lund)的即将到来的欧洲散裂源(European Spallation Source,ESS)，和有希望地医学实验站。已经长期使用反应器产生的热和半热中子进行硼中子俘获疗法(Boron-Neutron-Capture-Therapy)BNCT，既用于临床前实验又用于用给出高局部吸收能量的诱导的α-颗粒和反冲核(⁷L)治疗脑肿瘤。类似的方法是使用中子和适合于中子的用高横截面的稳定核标记的肿瘤靶向性分子。抗体或肽可以例如用稳定的钆(¹⁵⁷Gd)标记，并且起中子的靶分子作用，所述中子被Gd-核俘获，所谓的钆中子俘获疗法(GdNCT)。通过蒙特卡洛(MonteCarlo)技术，计算肿瘤和周围组织中的剂量分布，因为它源自γ-光子、中子、核反冲、以及特征性x-射线、来自钆或其它潜在元素的内部转换和俄歇-电子。

如上文讨论的，治疗性模块(诸如放射性同位素、细胞毒性模块等)可以与结合模块(诸如抗体或其片段)直接或间接连接。合适的接头是本领域中已知的，并且包括例如辅基、非酚接头(N-琥珀酰亚胺基-苯甲酸酯的衍生物；十二硼酸盐(dodecaborate))、大环类(macrocyclics)和无环螯合剂两者的螯合模块，诸如1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10,四乙酸(DOTA)的衍生物、去铁胺(DFO)、二乙撑三胺五乙酸(DTPA)的衍生物、S-2-(4-异硫氰酸苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)的衍生物和1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)的衍生物、3,6,9,15-四氮杂二环[9.3.1]-十五 -1(15),11,13-三烯-4-(S)-(4-异硫氰酸苄基)-3,6,9-三乙酸(PCTA)的衍生物、 5-S-(4-氨基苄氧)-1-氧杂-4,7,10-三氮杂环十二烷-4,7,10-三(乙酸)(DO3A)的衍生物和其它螯合模块。此类接头的使用在下述情况中可以是特别合适的，其中药剂包含经由接头与作为治疗性模块的放射性同位素连接的作为结合模块的抗体或其片段或由经由接头与作为治疗性模块的放射性同位素连接的作为结合模块的抗体或其片段组成。

一种优选的接头是DTPA，例如如¹⁷⁷Lu-DTPA-[本发明的抗体多肽]中使用的。

别的优选接头是去铁胺DFO，例如如⁸⁹Zr-DFO-[本发明的抗体多肽]中使用的。

任选地，本发明的抗体多肽可以(或不可以)进一步包含可检测模块。例如，可检测模块可以包含放射性同位素或由放射性同位素组成，诸如选自下组的放射性同位素：⁹⁹mTc、¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷²As、⁸⁹Zr、¹²³I和²⁰¹Tl。任选地，药剂可以包含一对可检测且细胞毒性的放射性核素，诸如⁸⁶Y/⁹⁰Y或 ¹²⁴I/²¹¹At。或者，药剂可以包含能够以多模式方式以可检测模块及也以细胞毒性模块同时起作用以提供所谓的“多模式治疗诊断学”的放射性同位素。如此，可以偶联结合模块与纳米颗粒，所述纳米颗粒具有多重成像(例如 SPECT、PET、MRI、光学或超声)的能力以及使用细胞毒性药物(诸如放射性核素或化学疗法剂)的治疗能力。在本发明的情况中还包括通过使用高频交替磁场的过热的治疗和伴随的超声成像的可能性。

或者，可检测模块可以包含顺磁性同位素或由顺磁性同位素组成，诸如顺磁性同位素选自下组：¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、¹⁶²Dy、⁵²Cr和⁵⁶Fe。

若抗体多肽包含可检测模块，则可检测模块可以通过成像技术，诸如 SPECT、PET、MRI、光学或超声成像可检出。

可以使用本领域中公知的方法将治疗性且可检测的模块与抗体多肽缀合或以其它方式组合(例如，现存的免疫缀合物疗法吉妥珠单抗奥佐米星 (gemtuzumabozogamicin)[商品名：

]包含与细胞毒素加利车霉素 (calicheamicin)连接的单克隆抗体)。

在别的实施方案中，以包含抗体多肽分子群体的配制剂的形式使用本发明的抗体多肽治疗***癌。在一个选项中，群体中的所有(或基本上所有，诸如按重量计大于90％、95％、99％、99.9％或更多)抗体多肽分子包含相同治疗性模块。在另一个选项中，群体包含具有不同治疗性模块的其它药剂的混合物。此选项会给出增强使用各种药剂(诸如化学治疗剂、激素治疗剂或其它疗法组合)的靶向放射性核素疗法的效果的可能性，其中靶向剂不仅将治疗活性放射性核素投递至肿瘤关联抗原，而且还通过调控(例如触发或阻断)胞内信号传导级联同时放射性敏化靶定的肿瘤细胞。此选项也可用于用细胞毒剂的混合物治疗***癌，例如使用α-发射体和不同射程的β-发射体的混合物，或具有不同射程、LET(线性能量传递)和RBE(相对生物学活性)的放射性核素的混合物，以组合治疗大肿瘤、微转移、和单一肿瘤细胞。在一个实施方案中，可以使用长程发射体治疗大肿瘤，并且可以使用短程发射体治疗较小的肿瘤，诸如微转移，和单一肿瘤细胞。

任选地，本发明的抗体多肽可以(不可以)进一步包含用于延长药剂的体内半衰期的模块。用于延长药剂的体内半衰期的例示性模块可以包括聚乙二醇(PEG)、人血清清蛋白、糖基化基团、脂肪酸和右旋糖苷。可以特别涵盖PEG。

会领会，可以冻干本发明的多肽以进行贮存，并且在使用前在合适的载剂中重建，例如经由冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷却、或者经由使用自超临界二氧化碳的颗粒形成(沉淀)。可以采用任何合适的冻干方法(例如冷冻干燥、喷雾干燥、滤饼干燥(cakedrying))和/或重建技术。本领域技术人员会领会，冻干和重建可以导致不同程度的活性丧失，并且可能不得不向上调节使用水平以进行补偿。优选地，冻干的(冷冻干燥的)多肽在再水合时丧失不超过约1％的其(冻干前)活性，或者在再水合时丧失不超过约5％、10％、 20％、25％、30％、35％、40％、45％或不超过约50％的其(冻干前)活性。

用于生成本发明的多肽的方法是本领域中公知的。

方便地，多肽是或包含重组多肽。适合于生成此类重组多肽的方法是本领域中公知的，诸如在原核或真核宿主细胞中表达(例如见Sambrook &Russell,2000,MolecularCloning,A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor,NewYork，在此通过提及收录该文献中的相关公开内容)。

也可以使用商品化体外翻译***，诸如家兔网织红细胞裂解物或麦胚裂解物(可获自Promega)生成本发明的抗体多肽。优选地，翻译***是家兔网织红细胞裂解物。方便地，可以偶联翻译***与转录***，诸如TNT转录-翻译***(Promega)。此***具有在与翻译相同的反应中自编码DNA多核苷酸生成合适的mRNA转录物的优点。

本领域技术人员会领会，或者可以人工合成本发明的多肽，例如使用公知的液相或固相合成技术(诸如t-Boc或Fmoc固相肽合成)进行。

本发明的第二个方面提供了编码本发明的抗体多肽或其组分多肽链的分离的核酸分子。通过“核酸分子”，我们包括DNA(例如基因组DNA或互补DNA)和mRNA分子，其可以是单链或双链。

在一个实施方案中，核酸分子是cDNA分子。

本领域技术人员会领会，可以密码子优化核酸分子以在特定的宿主细胞中表达抗体多肽，例如在人细胞中表达(例如见Angov,2011,Biotechnol.J. 6(6):650-659)。

在一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子包含：

(a)SEQ ID NO:14的核苷酸序列

[SEQ ID NO:14]，

和/或

(b)SEQ ID NO:15的核苷酸序列

[SEQ ID NO:15]。

本发明的范围内还包括下列各项：

(a)本发明的第三个方面提供了载体(诸如表达载体)，其包含依照本发明的第二个方面的核酸分子；

(b)本发明的第四个方面提供了宿主细胞(诸如哺乳动物细胞，例如人细胞)，其包含依照本发明的第二个方面的核酸分子或依照本发明的第三个方面的载体；和

(c)本发明的第五个方面提供了生成依照本发明的第一个方面的抗体多肽的方法，其包括在表达所述多肽的条件下培养依照本发明的第四个方面的宿主细胞的群体，并且自其分离多肽。

本发明的第六个方面提供了药物组合物，其包含药学有效量的本发明的第一个方面的抗体多肽和药学可接受稀释剂、载剂或赋形剂。

药物组合物中还可以包含别的化合物，包括螯合剂，诸如EDTA、柠檬酸盐、EGTA或谷胱甘肽。

可以以本领域中已知的方式制备药物组合物，其是足够贮存稳定的，并且适合于对人和动物施用。例如，可以例如经由冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷却、或者经由使用自超临界颗粒形成的颗粒形成冻干药物组合物。

通过“药学可接受的”，我们意指不降低本发明的药剂的激肽释放酶蛋白质结合活性的效率的无毒性材料。此类药学可接受缓冲剂、载剂或赋形剂是本领域中公知的(见Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,A.R Gennaro编Mack PublishingCompany(1990)和Handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版,A.Kibbe编,Pharmaceutical Press(2000)，通过提及将其公开内容收入本文)。

术语“缓冲剂”意图指以稳定化pH为目的的含有酸-碱混合物的水性溶液。缓冲剂的例子是Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、 Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、羟乙酸盐、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、 BES、CABS、甲次砷酸盐(cacodylate)、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、 TABS、TAPSO和TES。

术语“稀释剂”意图指以稀释药物制剂中的药剂为目的的水性或非水性溶液。稀释剂可以是下列一项或多项：盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(诸如红花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)。

术语“佐剂”意图指对配制剂添加以提高本发明的药剂的生物学效果的任何化合物。佐剂可以是下列一项或多项：具有不同阴离子的锌、铜或银盐，例如但不限于氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硫氰酸盐(tiocyanate)、亚硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、乳酸盐、羟乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、酒石酸盐、和不同酰基组成的乙酸盐。佐剂也可以是阳离子聚合物，诸如阳离子纤维素醚、阳离子纤维素酯、脱乙酰化透明质酸、壳聚糖、阳离子树枝状聚合物(dendrimer)、阳离子合成聚合物诸如聚(乙烯基咪唑)、和阳离子多肽(诸如聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸)、和含有这些氨基酸的肽。

赋形剂可以是下列一项或多项：碳水化合物、聚合物、脂质和矿物质。碳水化合物的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、和环糊精，其对组合物添加例如以促进冻干。聚合物的例子是淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、角叉菜胶(carageenans)、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚氧化丙烯共聚物、聚乙烯醇/不同程度水解的聚乙酸乙烯酯、和聚乙烯吡咯烷酮(都具有不同分子量)，它们对组合物添加，例如以控制粘度、以实现生物粘着、或者以保护脂质免于化学和蛋白水解降解。脂质的例子是脂肪酸、磷脂、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯、神经酰胺、鞘脂和糖脂(都具有不同的酰基链长度和饱和度)、蛋卵磷脂，大豆卵磷脂、氢化的蛋和大豆卵磷脂，出于与聚合物的那些原因相似的原因将它们添加至组合物。矿物质的例子是滑石、氧化镁、氧化锌和氧化钛，其对组合物添加以获得益处，诸如降低液体积累或有利的色素特性。

可以将本发明的抗体多肽配制成本领域中已知的任何类型的药物组合物以适合于其投递。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以为脂质体形式，其中在其它药学可接受载剂外，组合抗体多肽与两亲性药剂，诸如脂质，其以聚集形式以胶束、不溶性单层和液晶存在。适合于脂质体配制的脂质包括但不限于甘油单酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。合适的脂质也包括在极性首基中通过聚(乙二醇)修饰的上述脂质以延长血流循环时间。此类脂质体配制剂的制备可以参见例如US 4,235,871，通过提及将其公开内容收入本文。

本发明的药物组合物也可以为可生物降解微球的形式。已经在微球的生成中广泛使用脂肪族聚酯，诸如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、PLA和 PGA的共聚物(PLGA)或聚(己内酯)(PCL)和聚酐作为可生物降解聚合物。此类微球的制备可以参见US 5,851,451和EP 0 213 303，通过提及将其公开内容收入本文。

在别的实施方案中，可以以聚合物凝胶形式提供本发明的药物组合物，其中使用聚合物诸如淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、角叉菜胶(carageenans)、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚乙烯基咪唑、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚氧化丙烯共聚物、聚乙烯醇/不同程度水解的聚乙酸乙烯酯、和聚乙烯吡咯烷酮增稠含有药剂的溶液。聚合物也可以包含明胶或胶原。

或者，可以仅在盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(诸如红花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)、黄蓍胶、和/或各种缓冲剂中溶解抗体多肽。

会领会，本发明的药物组合物可以包含离子和限定的pH以增强活性抗体多肽的作用。另外，组合物可以进行常规制药操作诸如灭菌和/或可以含有常规的佐剂诸如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂、填充剂等。

可以经由本领域技术人员已知的任何合适的路径施用依照本发明的药物组合物。如此，可能的施用路径包括胃肠外(静脉内、皮下和肌肉内)、表面、眼、鼻、肺、含服、口服、胃肠外和直肠。自植入物施用也是可能的。由于施用药剂的潜在高细胞毒性，输注可以是期望的路径。

在一个实施方案中，胃肠外，例如静脉内、脑室内、关节内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌肉内或皮下施用药物组合物，或者可以通过输注技术施用它们。以无菌水性溶液形式方便地使用它们，所述无菌水性溶液可以含有其它物质，例如足以使溶液与血液等张的盐或葡萄糖。在必要时，应当适当缓冲水性溶液(例如至3-9的pH)。容易通过本领域技术人员公知的标准制药技术实现在无菌条件下制备合适的胃肠外配制剂。

适合于胃肠外施用的配制剂包括可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使配制剂与意图接受者的血液等张的溶质的水性和非水性无菌注射溶液；和可以包含悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。配制剂可以在单位剂量或多剂量容器(例如密封安瓿和管形瓶)中呈现，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，仅需要刚好在使用前添加无菌液体载剂(例如注射用水)。可以自先前描述种类的无菌粉末、颗粒剂和片剂制备即时注射溶液和悬浮液。

如此，本发明的药物组合物特别适合于胃肠外，例如静脉内施用或者对患者中的肿瘤的局部施用(例如肿瘤内或肿瘤周)。

会以药学有效剂量(即治疗性放射性核素的治疗有效吸收剂量)对患者施用药物组合物。

如本文中使用的，在本发明的抗体多肽的治疗用途的背景中，“药学有效量”，或“有效量”，或“治疗有效”指对于给定状况和施用方案提供治疗效果的量。这是活性材料的预先确定的数量，其经计算以与需要的添加剂和稀释剂(即载剂或施用媒介物)结合产生期望的治疗效果。此外，它意图指足以降低和/或防止宿主的活性、功能和应答的临床显著缺乏的量。或者，治疗有效量足以引起宿主中的临床显著状况的改善。如本领域技术人员领会的，化合物的量可以随其比活而变化。合适的剂量量可以含有经计算以与需要的稀释剂结合产生期望的治疗效果的活性组合物的预先确定数量。在用于制备本发明的组合物的方法和用途中，提供了治疗有效量的活性组分。基于患者特征，诸如年龄、重量、性别、状况、并发症、其它疾病等，治疗有效量可以由普通技术医学工作人员确定，如本领域中公知的(见下文实施例8)。可以既通过以个别剂量单位，否则几个较小剂量单位的形式的单次施用，又通过以特定时间间隔多次施用细分剂量实施药学有效剂量的施用。或者，可以在延长的时段里以连续输注提供剂量。

如本文中使用的，在本发明的抗体多肽的诊断用途的背景中，“药学有效量”，或“有效量”，或“诊断有效”指出于体内成像目的提供可检测信号的量。

根据使用的化合物的效力/毒性，可以以各种浓度配制本发明的抗体多肽。配制剂可以包含0.1μM和1mM之间，1μM和500μM之间，500μM和1mM 之间，300μM和700μM之间，1μM和100μM之间，100μM和200μM之间，200μM 和300μM之间，300μM和400μM之间，400μM和500μM之间和约500μM的浓度的多肽。

通常，人患者中的抗体多肽(具有或没有治疗性模块)的治疗剂量会在每次施用100μg至700mg的范围中(基于70kg的体重)。例如，最大治疗剂量可以在每次施用0.1至10mg/kg的范围中，例如0.1和5mg/kg之间或1和5mg/kg 之间或0.1和2mg/kg之间。会领会，可以以不同时间间隔施用此类剂量，如由肿瘤学家/内科医生确定的；例如，可以每天、每周两次、每周、每两周或每月施用剂量。

本领域技术人员会领会，可以单独或与治疗***癌中使用的其它治疗剂组合，或者在用用于治疗***癌的其它治疗形式，诸如其它治疗性抗体、手术(例如根治性***切除术)、放射性核素疗法、近程疗法、外部束放射疗法、高强度聚焦超声(HIFU)、化学疗法、口服化学治疗性药物、冷冻手术(冷冻肿瘤)、激素疗法(诸如抗雄激素疗法)、去势或前述项的组合治疗患者之前、之后或同时施用本发明的药物组合物。

本发明的第七个方面提供了试剂盒，其包含依照本发明的第一个方面的抗体多肽或依照本发明的第六个方面的药物组合物，连同如本文中描述的其用途的用法说明。

本发明的第八个方面提供了依照本发明的第一个方面的抗体多肽，其在药物中使用。

本发明的第九个方面提供了依照本发明的第一个方面的抗体多肽，其在治疗和/或诊断***癌中使用。

本发明的第十个方面提供了治疗受试者中的***癌的方法，所述方法包括对受试者施用治疗有效量的依照本发明的第一个方面的抗体多肽。

通过“治疗/处理”，我们包括患者的治疗性和防范性处理两者。术语“防范性”用于涵盖使用如本文中描述的药剂或其配制剂，其防止或降低*** 癌，或者患者或受试者中的局限性***癌的扩散、播散或转移的可能性。术语“防范性”还涵盖使用如本文中描述的药剂或其配制剂以防止先前已经治疗***癌的患者中的***癌复发。

本发明的第十一个方面提供了诊断受试者中的***癌的方法，所述方法包括对受试者施用诊断有效量的依照本发明的第一个方面的抗体多肽。

通过“诊断”，我们包括检测体内(即在患者身体内)或离体(即自患者的身体取出的组织或细胞样品内)的***癌细胞。

要治疗或诊断的***癌可以局限于***，或者可以是非局限性(也就是说播散性)***癌。依照TNM***(自肿瘤/结节/转移缩写)，例如可以将局限于***的***癌分类为临床T1或T2癌症，而例如可以将非局限性/播散性***癌分类为临床T3或T4癌症。

要治疗或诊断的***癌可以是转移性***癌。转移指癌症自其初始位置扩散到身体中的其它部位。例如，要治疗或诊断的转移性***癌可以是淋巴***中；骨(包括脊柱、椎骨、骨盆、肋骨)中存在的转移；骨盆、直肠、膀胱、或尿道内的转移。也可以用本发明治疗其它不太常见的位置处存在的转移。转移可以是微转移。微转移是一种转移形式，其中新形成的肿瘤一般太小以致于不能检出，或者难以检出。例如，本发明给技术人员提供了治疗单一癌细胞或细胞簇的手段，即使此类细胞或簇的存在不可能诊断，但是例如作为隐性播散性疾病存在。

因而，预期与***癌的现有技术治疗相比通过本发明提供的治疗的特别重要的技术优点是治疗播散性和/或转移性(包括微转移性)***癌中的增强的效力。

如此，在一个实施方案中，本发明提供了用于预防或治疗原发性*** 肿瘤的转移的抗体多肽和方法。

***癌趋向于在超过年龄50岁的男性中，更通常在超过60、65或70岁的男性中形成，并且尽管它是男性中的最普遍的癌症类型之一，但是许多人从未具有症状，不经历疗法，并且最终死于其它原因。这是因为***癌在大多数情况中是缓慢生长、无症状的，并且由于具有该状况的男性是年长的，他们经常死于与***癌无关的原因，诸如心脏/循环***疾病、肺炎、其它无关联的癌症、或老龄。约三分之二的***癌病例是缓慢生长的，另三分之一更具攻击性并且快速形成。

因而，用于治疗和诊断***癌的有效方法的开发对于管理更具攻击性且快速形成的癌症形式(特别是在较年轻的患者中)是特别重要的。因而，在一个实施方案中，本发明涉及治疗或诊断患者中的***癌，所述患者在诊断***癌时和/或在治疗时小于90、85、80、75、70、65、60、55、50、 45、40或更小岁龄。

与没有家族史的男性相比，认为具有一名具有***癌的一级亲属(父亲或兄弟)的男性具有形成***癌的风险的两倍，并且认为那些具有受累的两名一级亲属的男性具有大5倍的风险。因而，本发明可以涉及治疗或诊断患者中的***癌，所述患者的特征在于1、2名或更多家庭成员，特别是一级家庭成员(诸如父亲或兄弟)先前已经诊断出***癌。

本发明还涉及治疗或诊断患者中的***癌，其中要治疗的***癌具有去势抗性***癌(CRPC)。CRPC可以以通常在1至3年后对激素治疗变得难治，并且尽管有激素疗法仍恢复生长为特征。

在本发明的医学用途和方法中，通常将抗体多肽注射或输注入患者的身体中。在体内，抗体多肽然后结合生成靶抗原hK2的组织；主要是***癌细胞及其转移。在结合时，抗体多肽可以直接施加治疗效果(例如经由ADCC、 CDC或者依靠携带放射性同位素或其它细胞毒性模块诱导细胞死亡)。或者，结合的抗体多肽可以充当诊断(成像)工具，其可以引导疗法的选择或者帮助癌细胞的手术除去。

本领域技术人员会领会，可以与其它治疗和/或诊断剂/处理，诸如外部放射疗法、手术、细胞抑制剂和雄激素处理组合使用本发明的抗体多肽。

前述描述聚焦于适用于用于治疗和诊断***癌的方法的本发明的实施方案。然而，会领会，本发明不限于此类应用，而是可以可用于术后检查、和放射、细胞抑制和雄激素治疗期间或之后的检查。

在另一个实施方案中，可以在手术期间和/或之前使用放射引导手术 (RGS)或图像引导手术(Image-Guided Surgery,IGS)鉴定经示踪剂标记的本发明的抗体多肽。如此，可以在手术期间和/或之前施用包含如上文讨论的可检测模块的抗体多肽。在此实施方案中，首先可以输注抗体多肽。此后，可以在手术期间或之前使用RGS/IGS来用对可检测模块灵敏的检测仪鉴定hK2生成性组织。例如，可检测模块可以是放射发射或磁敏感性可检测模块；例如，它可以是契仑科夫(Cerenkov)放射和/或轫致放射(Bremsstrahlung)的发射体；它可以是荧光标记物和/或磁性或可磁化标记物。因而，依照本发明的 RGS/IGS可以例如是基于光学、契仑科夫、轫致放射、或β放射的检测；放射性核素标记物的检测，和/或可以牵涉磁力测定的方法。RGS作为手术技术而为本领域技术人员公知，所述手术技术使外科医生能够鉴定由可检测模块 “标记”的组织。

可以组合依照上述方法获得的显现与其它放射学显现方法，诸如 SPECT/PET、计算机断层摄影术(computed tomography,CT)、超声(US)、和磁共振成像(MRI)。

因而，在又一个方面中，本发明还提供了抗体多肽，其用于通过在手术 (诸如放射引导或图像引导手术)之前或期间对***癌患者施用在药物中使用。

本发明的又一个方面提供了用于检测受试者的血液中的***肿瘤细胞的体外方法，所述方法包括：

(a)提供来自要测试的受试者的血液样品；

(b)任选地，提取和/或纯化所述血液样品中存在的细胞；

(c)使依照本发明的第一个方面的抗体多肽与所述血液样品中存在的细胞接触；

(d)测定(直接或间接)所述抗体多肽是否结合游离(即未复合)的hK2，其中所述抗体多肽对游离的hK2的结合指示受试者血液中的***肿瘤细胞的存在。

如此，本发明包括实施测定法以测定血液样品是否含有游离的hK2；游离的hK2的存在指示受试者血液中的***肿瘤细胞的存在。

本领域技术人员会领会，有多种实施此类测定法的方式。例如，免疫测定法可以是同质的或更优选地异质的。也可以以竞争或更优选地非竞争形式实施测定法。

在异质的非竞争性测定法的情况中，例示性的方案可以是：

(a)提供来自要测试的受试者的血液样品；

(b)任选地，提取和/或纯化所述血液样品中存在的细胞；

(c)使固相固定化的依照本发明的第一个方面的抗体多肽与血液样品中存在的细胞接触；

(d)清洗以除去可溶性组分(不与固体表面结合)；

(e)添加示踪剂，即用报告分子/颗粒标记的另一种抗hK2特异性抗体；

(f)清洗以除去未结合的示踪剂抗体；并

(g)检测来自示踪剂抗体的信号。

在步骤b和c或c和d之间，通常应当有温育期以容许细胞生成可溶性hK2，然后使它被检出。

本发明的又一个方面提供了用于检测受试者的组织中的***肿瘤细胞的体外方法，所述方法包括：

(a)提供来自要测试的受试者的组织样品(此类组织学样品)；

(b)任选地，提取和/或纯化所述组织样品中存在的细胞；

(c)使依照本发明的第一个方面的抗体多肽与所述组织样品中存在的细胞接触；

(d)测定(直接或间接)所述抗体多肽是否结合游离(即未复合)的hK2，其中所述抗体多肽对游离的hK2的结合指示受试者组织中的***肿瘤细胞的存在。

在上述体外方法的一个实施方案中，通过ELISA实施步骤(d)。然而，可以使用适合于体外检测抗体-抗原相互作用的任何测定法。

在别的实施方案中，方法进一步包括量化样品中的***肿瘤细胞。

在上述体外方法的别的实施方案中，方法用于诊断受试者中的*** 癌。

在权利要求书和/或说明书中结合术语“包含”使用时，词语“一个”或 “一种”的使用可以意指“一个/种”，但是它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或超过一个/种”的意义一致。

在结合上述描述和附图考虑时会更好地领会并理解本发明的这些和其它实施方案。然而，应当理解，上述描述虽然指示本发明的各个实施方案及其众多具体细节，但作为例示而非限制给出。可以在本发明的范围内在不偏离其精神的前提下做出许多替代、修改、添加和/或重排，并且本发明包括所有此类替代、修改、添加和/或重排。

附图简述

附图形成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步表明本发明的某些方面。可以通过参考与本文中呈现的具体实施方案的详细描述结合的这些附图中的一幅或多幅更好地理解本发明。

图1：本发明的例示性人源化11B6 Fab片段的重和轻链可变区的序列。

图2：用鼠和人源化11B6抗体的天然和还原性样品进行的SDS-PAGE凝胶。

图3：在测试11B6抗体结合芯片上的hK2后的结合阶段。

图4：测试11B6抗体的解离阶段。

图5：经¹⁷⁷Lu标记的人源化11B6抗体的生物分布。

图6：例示性SPECT图像，其显示了经¹⁷⁷Lu标记的h11B6对小鼠中的前列腺肿瘤的结合。

图7：肿瘤和骨中的经¹⁷⁷Lu标记的h11B6和m11B6的百分比摄取。

图8：肿瘤与骨中的每克经¹⁷⁷Lu标记的h11B6和m11B6的百分比摄取的比率。

图9：(a)人源化11B6抗体和(b)鼠11B6抗体的动力学。

图10：自血液清除经¹⁷⁷Lu标记的h11B6和m11B6。

图11：用¹⁷⁷Lu-11B6处理之前(顶部图像)和之后(底部图像)的肿瘤大小的代表性照片。

图12：(a)单一放射性量“D”的¹⁷⁷Lu-11B6，(b)双重放射性量“2x D” 的¹⁷⁷Lu-11B6和(c)对照处理对LNCaP异种移植物中的肿瘤大小的影响的汇总。

图13：关于用单剂¹⁷⁷Lu-11B6处理的1只LNCaP异种移植物小鼠的(a)肿瘤生长数据和(b)SPECT图像。

图14：(a)接受经¹⁷⁷Lu标记的依照本发明的h11B6抗体的动物，(b)接受经 ¹⁷⁷Lu标记的非特异性IgG“同种型对照”抗体的动物和(c)仅接受NaCl的动物的作为注射后天数的函数的肿瘤体积。在第0天时施用处理。如果发生下述事件，那么终止动物：大肿瘤体积(直径>14mm)；大重量减轻(与初始重量相比，重量减轻>15％)；受负面影响的一般状况；或者所有这三项参数的组合。(右边的数字是每只动物的ID编号)。

图15：图14中显示的三种处理组的Kaplan-Meier曲线。实线：¹⁷⁷Lu-h11B6；虚线：经¹⁷⁷Lu标记的非特异性IgG“同种型对照”抗体；点线：NaCl。

包括以下实施例以表明本发明的具体实施方案。本领域技术人员应当领会，以下实施例中公开的技术代表由发明人发现在本发明的实施中完全发挥功能的技术，并且如此可以认为构成用于其实施的具体模式。然而，考虑到本公开内容，本领域技术人员应当领会可以在不背离本发明的精神和范围的前提下对公开的具体实施方案做出许多变化，并且仍获得相似或类似的结果。

实施例

实施例1：自杂交瘤细胞系克隆11B6

试剂

使用单克隆抗体11B6生成性杂交瘤细胞系进行mRNA提取和抗体生成，进一步亲和纯化所述抗体以进行蛋白质测序(

et al.,2004)。

限制酶、FastAP和T4 DNA连接酶来自Fermentas，引物来自土尔库大学生物技术部(University of Turku,Department of Biotechnology)(WO252)和 ThermoScientific。用Qiagen凝胶提取和PCR纯化试剂盒完成DNA纯化。

mRNA提取和cDNA合成

用QuickPrep Micro mRNA纯化试剂盒(Amersham Biosciences)自11B6单抗生成性杂交瘤细胞(5E6细胞)提取mRNA，并且用Applied Biosystems的高容量cDNA档案试剂盒(High-capacity cDNA archive kit)依照用法说明完成自mRNA的cDNA合成。

自cDNA扩增抗体基因

在赫尔辛基大学(University of Helsinki)蛋白质测序服务通过Edman降解测定纯化的11B6单抗重(H)和轻(L)链的N端序列。轻链序列是DIVLTQSPAS [SEQ ID NO:16]，并且重链序列是DVQLQESGPG[SEQ ID NO:17]。氨基酸的IMGT数据库比较分别鉴定基因：IGKV3和IGHV3。基于编码N端氨基酸的DNA序列(通过NCBI BLAST找到)设计正向PCR引物(简并)的互补区。用于克隆重链的反向引物设计为结合C_H1。在轻链的情况中，使用两种反向引物；第一PCR中使用的反向引物结合CL，并且第二PCR中使用的另一种反向引物结合V_L和C_L的边界。所有引物还含有克隆需要的限制酶识别位点(随后加下划线)。

轻链正向引物是SfiI_DIVLTQSPAS[SEQ ID NO:16]：(5’-TTACTCGGGGCCCAGCCGGC CATGGCGGAYATHGTRYTVACNCARTCTCC-3’；[SEQ ID NO:18])和反向引物WO252(5’-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCC TGTTGAA-3’，XbaI；[SEQ ID NO:19])和CpoI_JK2(5’-GATACAGTTGGTGC AGCATCGGTCCGTTTT ATTTCCAGCTTGGTCCCCCCT-3’；[SEQ ID NO: 20])。

重链正向引物是NotI_DVQLQESGPG[SEQ ID NO:17](5’-TGCTGCTGGCGGCCGCTCCAGCCATGGCTGAYGT VCARCTKCAGGAGTCDGG-3’； [SEQ ID NO:21])和反向引物asCH1_SacI(5’-CGCCACCAGAGCTCTCACA ATCCCTGGGCACAATTTTC-3’；[SEQ ID NO:22])。

在PCR反应中扩增V_L+C_L片段，所述PCR反应含有作为模板的100ng cDNA、0.2mMdNTP、0.5μM引物SfiI DIVLTQSPAS[SEQ ID NO:16]和 WO252、1xPhusion HF缓冲液和0.6UPhusion DNA聚合酶(Finnzymes)。通过下述方案完成扩增：98℃30sec，30个循环的98℃7sec，50℃20sec，72℃ 20sec，和72℃最终延伸10min。在对PCR产物测序并且找出V_L-C_L边界的序列后，在与上文相似的反应中再次自cDNA完成用于实际克隆的PCR，只是用引物SfiI_DIVLTQSPAS[SEQ ID NO:16]和CpoI_JK2以仅克隆V_L部分。通过下述方案完成扩增：98℃30sec，10个循环的98℃7sec，60℃20sec，72℃ 20sec，25个循环的98℃7sec，56℃20sec，72℃20sec，并且72℃最终延伸 10min。

在与V_L相似的反应中扩增V_H+C_H1片段，只是用引物 NotI_DVQLQESGPG[SEQ ID NO:17]和asCH1_SacI。扩增方案是98℃ 30sec，30个循环的98℃7sec，64℃20sec，72℃20sec，和72℃最终延伸10min。

克隆

自制备琼脂凝胶纯化正确大小的产物。用SfiI和CpoI消化V_L，用SacI和 NotI消化V_H+C_H1。用这两种酶组合分开消化接受载体pAK400 5404 FAb lch (自pAK400修饰，Krebberet al.,1997)，用FastAP使片段去磷酸化，并且自制备凝胶纯化。

用T4 DNA连接酶连接经消化的11B6 V_L和相应的载体片段，并且通过电穿孔转化入大肠杆菌(Escherichia coli)XL1-Blue细胞(Stratagene)中以生成载体pAK400-11B6-VL。经SacI+NotI消化的V_H+C_H1和载体片段的连接产物称作 pAK400-11B6-VH+CH1。通过DNA测序，并且将序列与初始蛋白质序列和与数据库(BLAST搜索)上找到的抗体比较确认正确的克隆。

为了构建完整的11B6 Fab，用NotI和SacI消化两种先前生成的构建体。使用载体pAK400-11B6-VL作为***来自载体pAK400-11B6-VH+CH1的 V_H+C_H1的接受载体。如上文那样完成连接和转化。用限制酶分析确认构建的 pAK400 11B6 FAb lch载体。

参考文献

Barbas CF 3rd,Kang AS,Lerner RA,Benkovic SJ.(1991)Assembly ofcombinatorial antibody libraries on phage surfaces:The gene IIIsite.Proc.Nat. Acad.Sci.,Vol.88,pp.7978-7982

Biomagnetic Techniques in Molecular Biology:Technical handbook.DynalA.S,2^nd edition,1995

Krebber A,Bornhauser S,Burmester J,Honegger A,Willuda J,Bosshard HR,Plückthun A.(1997)Reliable cloning of functional antibody variable domainsfrom hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phagedisplay system.J Immunol Methods.201(1):35-55

Lilja H,Christensson A,Dahlén U,Matikainen MT,Nilsson O,Pettersson K,

T.(1991)Prostate-specific antigen in serum occurs predominantly incomplex with alpha 1-antichymotrypsin.Clin Chem.37(9):1618-25

Pajunen M,Saviranta P,Jauria P,Karp M,Pettersson K,

P,Lovgren T.(1997)Cloning,sequencing,expression and characterization ofthreeanti-estradiol-17beta Fab fragments.Biochim Biophys Acta.1351(1-2):192-202

V,Eriksson S,Ivaska KK,Lilja H,Nurmi M,Pettersson K.(2004)Development of sensitive immunoassays for free and total human glandularkallikrein 2.Clin Chem.50(9):1607-17

实施例2：11B6抗体的人源化

使用CDR嫁接方法人源化鼠抗hK2抗体11B6的可变域。在此方法中，将鼠抗体的互补决定区(CDR)嫁接到可变重和轻域框架。另外，CDR区处的残基，框架区处的某些至关重要的位置中的残基作为鼠样保留，而不是转变为人样，以维持与其在亲本鼠抗体中的构象尽可能相似的嫁接的CDR环的构象。

贯穿此描述使用Kabat编号方案(Kabat et al.,1991)。

同源性建模

通过使用自动网络抗体建模服务器(VAM； http://antibody.bath.ac.uk/index.html)产生鼠11B6抗体的同源性模型。模型分别用于亲本鼠抗体和作为可变域人源化的框架使用的人免疫球蛋白序列之间不同的残基的重要性的基于视觉检查的评估。

11B6人源化V-域序列的设计

V_L域设计

使用ClustalW序列比对程序比较鼠11B6轻链可变域的氨基酸序列与 NCBI中的人免疫球蛋白种系序列的数据库。发现11B6 V_L与人种系序列B3 (IGKV4-1*01)，人V_κ4家族的唯一成员共享最高的相似性。关于编码可变域序列的C端部分的J区段，发现人J_κ2与鼠11B6的相应区域是最相似的。

使用人B3基因以及IGKJ2的序列作为框架以嫁接来自亲本鼠抗体11B6 的轻链的CDR环(图1)。在V_L的位置4中引入鼠起源的残基(亮氨酸)替换人样甲硫氨酸。此微调区(Vernier zone)(Foote andWinter,1992)残基直接位于轻链的CDR1和CDR3环下面。在CDR-L2中的位置54处，使用人样精氨酸替换鼠样缬氨酸。依照建模，此位置处的残基不可能形成与抗原的直接相互作用，然而，Arg54似乎与人框架中的位置60处的带负电荷的天冬氨酸形成盐桥。认为不可能的是，CDR-L1中的位置24处的残基牵涉抗原接触。因此，在此位置处引入人样赖氨酸替换鼠样精氨酸。

V_H域设计

使用clustalW序列比对程序，比较鼠11B6重链可变域的氨基酸序列与 NCBI中的人免疫球蛋白种系序列的数据库。发现11B6 V_H与人V_H4家族成员 VH4-28具有最高的相似性。关于编码可变域序列的C端部分的J区段，发现人J_H1与鼠11B6的相应区域是最相似的。

使用人VH4-28基因以及J_H1的序列作为框架以嫁接来自亲本鼠抗体11B6 的重链的CDR环(图1)。

分别在V_H的位置27和30处引入鼠样残基天冬酰胺和苏氨酸。虽然不属于依照Kabat定义(Kabat et al.,1991；图1)的CDR-H1，但通过一些其它CDR 定义规程，诸如Chothia(1989)的规程将它们分类为CDR残基。残基27和30 可以影响CDR-H1的其它部分的结构，并且可能参与与抗原的直接接触。已知第71位的残基在维持CDR-H2的构象中发挥重要作用(Tramontano et al., 1990)，并且本文使用鼠样精氨酸替换人样缬氨酸。在重要的CDR-H3环前的第94位处，引入鼠11B6衍生的残基苏氨酸替换人VH4-28样精氨酸。另外，认为不可能的是CDR-H2中的第60位的残基牵涉抗原接触。因此，在此位置处引入人样天冬酰胺替换鼠样丝氨酸。

以合成构建体购买编码作为Fab片段的人源化11B6(其中设计的V_H和V_L域分别与人C_H1和人C_κ恒定域连接)的基因(Genscript,US)。使用SfiI限制酶将基因克隆入自pAK400修饰的表达载体pAK400Fab(Krebber et al.,1997)中，所述SfiI限制酶在Fab盒的任一侧上具有识别位点。将载体转化入大肠杆菌XL-1 blue细胞中以表达人源化Fab片段。

图1中显示了本发明的例示性的人源化11B6Fab片段的重和轻链可变区的序列。

参考文献

Chothia,C.,Lesk,A.M.,Tramontano,A.,Levitt,M.,Smith-Gill,S.J.,Air, G.,Sheriff,S.,Padlan,E.A.,Davies,D.,Tulip,W.R.,Colman,P.M.,Spinelli,S., Alzari,P.M.,and Poljak,R.J.(1989)Conformations of immunoglobulin hypervariableregions Nature,342,877–883

Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.M.,Gottesman,K.S and Foeller,C.(1991)Sequences ofImmunoglogical Interest,5^th edit.,NIH,Bethesda,MD

Tramontano,A.,Chothia,C.and Lesk,A.M.(1990)Framework Residue 71 is aMajor Determinant of the Position and Conformation of the SecondHypervariable Region in the V_H Domains ofImmunoglobulins.J.Mol.Biol.215, 175-182

实施例3：h11B6的表达和纯化

将HEK293细胞扩充入FreeStyle 293表达培养基(Life Technologies)中的 2L悬浮培养物中。在转染当天，细胞密度是1 x 10⁶个细胞/ml。

为了在哺乳动物细胞中表达而密码子优化编码组分重或轻链(即分别为 SEQ IDNO:14和15)的核苷酸序列，将该核苷酸序列合成，并克隆至IgG表达载体。然后，混合含有重和轻链的核苷酸序列的质粒DNA(表达载体)与转染剂，并且在RT中温育10分钟。在缓慢旋动***情况中将DNA-转染剂- 混合物缓慢添加至细胞培养物。然后，于37℃，8％CO₂在以约135rpm旋转的定轨摇动器平台上将经转染的细胞培养物温育7天。

通过离心收获培养基，并且过滤流过5μm、0.6μm和0.22μm滤器***。

通过蛋白G层析纯化抗体，并且通过透析将缓冲液更换为PBS pH 7.4；随后，通过超滤浓缩抗体。

通过吸光度测量浓度。

DNA:轻链:p11B6VLhV1hk(4300bp)量：0.35mg

重链:p11B6VHhV1hIgG1(4900bp)量：0.6mg

没有优化DNA量。

转染剂：专有(然而，合适的商品化转染剂是容易可获得的，诸如Xfect^TM转染试剂(Clontech)、Lipofectamine(Life Technologies)、

HD转染试剂(Promega)、FreeStyle^TM Max Reagent(Invitrogen)、DEAE-右旋糖苷、聚乙烯亚胺和磷酸钙)。

总体产量：13.1mg(约6.5mg/L)

实施例4：h11B6的表征：亲和力

研究目的

研究的目的是通过在Biacore仪上使用表面等离振子共振(SPR)技术调查抗体11B6的4种变体和抗原hK2之间的结合动力学。

为了调查蛋白质样品(抗体和抗原)的质量，在SPR实验前运行 SDS-PAGE凝胶。

在预研究中，调查不同参数以寻找适合于研究中的实验的条件。

在研究中，对4种抗体和抗原实施多次结合测量。自收集的数据，计算结合和解离速率常数(k_结合和k_解离)和解离常数(KD)，并且在本文报告。

试剂和仪器信息

4种抗体和1种抗原的以下溶液由DiaprostAB提供：

·m11B6储液：a-ehk211B614.12013 PP，3.41mg/ml：0.9％NaCl，100μl

·h11B6储液：Innovagen批次90476.302013-04-12，1mg/ml：PBS pH 7.4，320μl

·h11B6-DTPA储液：0.2M乙酸钠pH 5.5，0.9mg/ml,340μl

·h11B6-DFO储液：0.2M乙酸铵pH 5.5，1.6mg/ml中的5mg/ml龙胆酸(gentisinacid)，400μl

·hK2储液：26.6μg/ml frakt 2 fr 7SL+蛋白质inh 5/2-021％BSA

将所有样品等分取样，并且在分析前在-20℃冷冻器中保持。

在Biacore 3000仪上在CM4芯片上实施所有结合实验。芯片和用于活化、固定化、失活、结合和再生需要的所有试剂购自GE Healthcare，并且依照来自制造商的准则使用。

SDS-PAGE

(a)实验的描述

在来自Novex的TRIS-Tricine 10-20％丙烯酰胺凝胶上依照来自制造商的准则运行由DiaprostAB提供的试剂。

与标准样品一起在同一凝胶上同时运行蛋白质样品的两种系列(天然的和还原性)。

天然系列中的每份样品含有：1-1.3μg蛋白质、TRIS缓冲液pH 8.8、SDS 和加载缓冲液。

还原性系列中的每份样品含有：1-1.3μg蛋白质、TRIS缓冲液pH 8.8、 SDS、加载缓冲液和0.04％v/vβ2-巯基乙醇(还原剂)。

在具有0.7、3.0、6.3的相应比例的乙酸、乙醇和水的Commasie亮蓝溶液中实施凝胶的染色。

在具有0.7、3.0、6.3的相应比例的乙酸、乙醇和水的溶液中实施凝胶的脱色。

(b)结果和结论

图2中显示了结果。

从这些结果看明显的是，抗体和抗原样品是高质量和纯度的。

亲和力研究

(a)CM4芯片上的抗原固定化

依照制造商的准则实施芯片CM4-2的活化以使用EDC和NHS混合物进行胺偶联。

在芯片CM4-2上的通道fc2-4上流过含有2.96μg/ml抗原hK2的溶液(在10 mMNaAc-缓冲液pH 3.8中稀释的hK2储备溶液)以将抗原固定化至芯片。流速：5μl/min，体积：200μl。

靶标RU≤M_W/10 M_W(hk2)＝25 900Da靶标RU(hk2)≤2590

使用通道fc1作为空白。

实现以下固定化：

fc2＝1104RU fc3＝731RU fc4＝688RU

在活化和固定化后通过乙醇胺封闭所有通道(fc1-4)。

这些数据证明了使用2.96μg/ml抗原实现了合适的固定化。

(b)结合阶段的调查

在芯片CM4-2上的通道fc2-4上以30μl/min的速率流过每种抗体的5种不同浓度的溶液(在HSP缓冲液中稀释的储备溶液)时追踪4种抗体对芯片 CM4-2的结合阶段达4-5分钟。

每种抗体的调查浓度是：100、50、25、12.5和6.25nM。

另外，自实验获得结合数据，其中追踪解离过程达480分钟。

总共，实施针对每种抗体的18个个别的结合实验。

对于所有数据，扣除来自空白fc1的信号。

在图3中，显示了5种不同浓度的每种抗体在芯片CM-2上的通道fc2中的结合阶段。

我们发现了在4-5分钟后，我们能够拟合关于结合过程的数据。

(c)调查解离阶段

在芯片CM4-2上的通道fc2-4上以30μl/min的速率使50nM抗体的溶液流动5分钟后对每种抗体追踪解离阶段达480分钟(图4)。

在计算解离速率常数中使用的所有数据中扣除来自空白fc1的信号。

数据指示解离过程是非常缓慢的。对于所有4种抗体，通道fc4中的信号在漂移，并且不能在该通道中追踪解离过程。

(d)评估解离速率常数(k_解离)

拟合解离阶段数据，并且评估解离速率常数(k_解离)(见表2)。

表2

基于对每种抗体采取的两次测量，测试的抗体的解离速率常数(k_解离) 之间似乎没有显著差异。

(e)评估结合速率常数(k_结合)

为了评估结合速率常数，在拟合方程中使用解离速率常数(表2)。

使用所有拟合的数据以对每种抗体计算结合速率常数的平均数值和标准差(见表3)。

表3

抗体	拟合实验的数目	均值k<sub>结合</sub>(10<sup>5</sup>M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>)	标准差
				m11B6	18/18	2.48	±0.85
h11B6	15/18	1.17	±0.38
				h11B6-DTPA	17/18	1.82	±0.54
h11B6-DFO	18/18	1.11	±0.22

基于对每种抗体采取的15-18次测量，测试的抗体的结合速率常数(k_结合) 之间似乎没有显著差异。

(f)评估解离常数(k_D)

表4中显示了测试的抗体之每种的解离常数(K_D)。

表4

抗体	均值K<sub>D</sub> 10<sup>-11</sup>M	标准差
			m11B6	19	±15
h11B6	65	±25
			h11B6-DTPA	93	±78
h11B6-DFO	54	±13

对于所有4种抗体，解离常数(K_D)在10^-12M范围中。

虽然不是统计学显著的，人源化抗体的解离常数似乎高于亲本鼠抗体的解离常数。

由于对于h11B6-DTPA或h11B6-DFO，K_D没有显著变化，人源化抗体的缀合似乎不显著影响亲和力。

汇总

·对于所有4种抗体，结合过程是非常快速的，并且基于每种抗体的15-18次实验，结合速率常数(k_结合)都在10⁵M^-1s^-1范围中。

·解离过程是非常缓慢的，并且几乎在Biacore的技术限度的范围中。基于每种抗体的两次实验，解离速率常数(k_解离)都在10^-5s^-1范围中。

·对于所有4种抗体，解离常数(K_D)在10^-12M范围中。

实施例5：h11B6的表征：聚集

执行摘要

已经对IgG的4种变体实施动态光散射(DLS)研究以研究其聚集的倾向。 DLS结果显示了所有构建体都具有合理的大小(200kDa或略高于200kDa，假设球形蛋白质)和很少聚集或无聚集。

目的

为了使用动态光散射就寡聚状态而言表征4种IgG构建体。使用胰岛素作为对照。

结果

动态光散射

将磷酸盐缓冲盐水(PBS pH 7.4)过滤流过0.22微米滤器。在PBS pH 7.4中将投递的蛋白质稀释至0.1mg/ml。使用Malvern APS设备，于20℃在一式两份样品中测量动态光散射。对每份样品测量三次。使用稀释缓冲液作为对照以确保合理地，缓冲液不含尘埃和聚集体。可以使用数量分布函数可靠测量所有样品。计算最丰富的种类的平均半径及种类的多分散性。还计算此种类的平均质量分布，见表5。

表5

自大小分布导出的动态光散射数据

构建体	平均半径(nm)	多分散性(％)	质量分布(％)
				胰岛素	2.8	28	100
h11B6	5.7	15	99.2
				M11B6	5.7	17	100
DFO-h11B6	6.0	22	99.9
				H11B6-DTPA	6.1	22	100

多分散性＝半径的标准差/平均半径x 100％

胰岛素对照(4mg/ml 20mM Na₂HPO₄，10mM Na₃EDTA)具有2.8nm的平均半径，其是约37kDa。在溶液中，已知胰岛素形成约35kDa的六聚体。对于具有完全球形形状的蛋白质，5.7nm的半径对应于约200kDa的分子量。对于具有完全球形形状的蛋白质，6.1nm的半径对应于约230kDa的分子量。合理地，这接近于150kDa的分子量(对于IgG分子)，这意味着大多数样品主要由单体和/或二聚体IgG分子组成。不排除二聚体的原因是基于分子形状，光散射给出大致的大小估计，并且这使得难以分开单体和二聚体，但是容易分开较大的聚集体与单体或者单体与六聚体(如在胰岛素情况中一样)。

结论

动态光散射显示了所有构建体具有合理的大小和很少的聚集或无聚集。所有4种构建体的大小分布是重叠的(数据未显示)。

实施例6：h11B6的表征：体内生物分布

此研究比较在与¹⁷⁷Lu标记时的鼠11B6和人11B6的体内生物分布。

材料和方法

材料

¹⁷⁷Lu购自Mallinkrodt Medical BV，佩滕(Petten)，荷兰。

自Sigma Aldrich获得所有化学品，并且使用分析级水(除非另外记录) 内部制备缓冲液。

自芬兰的土尔库大学(University of Turku,Finland)获得对人激肽释放酶2 特异性的亲本鼠抗体m11B6。

m11B6重链[SEQ ID NO:23]：

m11B6轻链[SEQ ID NO:24]：

如上文的实施例2和3中描述的那样生成人源化对应物抗体h11B6(见图 1)。

对于体内研究，使用表达hK2(ATCC,Manassas,VA,USA)和DU145 (ATCC,Manassas,VA,USA)的***癌细胞系LNCaP。在补充有10％胎牛血清和PEST(青霉素100IU/ml和100μg/ml链霉素)的RPMI 1640培养基中培养细胞。于37℃在具有5％CO₂的湿润培养箱中维持细胞，并且用胰蛋白酶 -EDTA溶液(0.25％胰蛋白酶，缓冲液中的0.02％EDTA，ThermoScientific) 分离。在异种移植LNCaP细胞时使用来自BD-biosciences(San-Jose,California, USA)的基质胶基质。用两种细胞系接种NMRI-Nu(Charles River)和Balb/c-Nu (内部品种)小鼠。

缀合和放射性标记

CHX-A”-DTPA与11B6的缀合：使用0.07M硼酸钠缓冲液将PBS中的鼠和人源化11B6单抗的溶液调节至pH 9.2，之后在Amicon Ultra-2离心滤器(2ml, 100K)上浓缩。然后，以3:1螯合剂与抗体的摩尔比率于40℃缀合所得的蛋白质溶液与螯合剂CHX-A”-DTPA(Macrocyclics,USA)。在4h后终止反应，并且通过在用20ml 0.2M乙酸铵缓冲液，pH 5.5平衡的NAP-5柱(GE Healthcare)上的大小排阻层析使CHX-A”-DTPA-11B6(DTPA-11B6)与游离的螯合物分开。用1ml乙酸铵缓冲液洗脱缀合的11B6抗体。

DTPA-11B6的放射性标记：将乙酸铵缓冲液pH 5.5中的鼠和人源化 DTPA-11B6与预先确定量的¹⁷⁷LuCl₃混合。使用每名受试者0.5-0.6MBq的最终活性进行生物分布或者使用每名受试者的18-20MBq的最终活性进行 SPECT研究。在于室温温育2h后，终止标记，并且在用PBS平衡的NAP-5柱上纯化。

动物研究

依照关于实验室动物保护的国家立法实施所有动物实验。

对此研究使用雄性免疫缺陷裸鼠NMRI-Nu(6-8周龄)和Balb/c-Nu。给所有小鼠在其左或右体侧上异种移植LNCaP细胞或DU145，100μl生长培养基和100μl基质胶中的800-1000万个细胞。

生物分布研究

对h11B6和m11B6两者实施生物分布研究。

给6组(n＝4)小鼠静脉内注射20μg h11B6或20μg用¹⁷⁷Lu标记的m11B6。在24hp.i.、48hp.i和72hp.i.时处死动物，并且用具有3-英寸NaI(Tl)检测器的自动NaI(Tl)孔计数器(1480WIZARD,Wallac Oy,Turku,Finland)分析感兴趣的器官。

如下计算组织摄取数值，其以每克组织的百分比注射剂量(％IA/g)表示：％IA/g＝(组织放射性/注射放射性)/器官重量x 100

其中对于iv注射：

注射放射性＝对照注射器中的平均放射性-用过的注射器中的放射性-尾部中的放射性

还在解剖后对器官称重。

动力学数据

DThe时间-％ID曲线直至48为止以直线ID(t)＝k*t+m表示。基于来自第二和第三时间点(分别为48和72h)的数据，对时间间隔[48,∞]应用单指数曲线(ID(t)＝ID(0)e^-λt)。然而，如果λ变为负值，即ID在48和72h之间在增加，则取而代之以直线对此时间间隔中的时间ID曲线建模，并且假设从72 小时起在器官中保留药物。为了获得时间-活性曲线，应用物理半衰期。

注意：在一些图中，ID称作“IA”；这些表述在本文中可互换使用。

结果

人源化¹⁷⁷Lu-11B6的生物分布

图5中显示了¹⁷⁷Lu-h11B6的生物分布。

抗体在到24小时内在LNCaP肿瘤中快速积累，并且发现在72小时时仍然较高。

最初，高水平的h11B6在血液和肾中也是明显的，其在随后的48小时时段里降低，因为自身体除去抗体。此类生物动力学是任何经放射性标记的抗体的静脉内注射的不可避免且预期的结果。

所有其它器官(诸如骨和肌肉)显示低水平的放射性。

这些数据证明了¹⁷⁷Lu-h11B6能在体内有效靶向***癌细胞。

图6显示了一幅例示性的SPECT图像，其中¹⁷⁷Lu-h11B6对经异种移植的小鼠内的LNCaP肿瘤细胞的结合是完全明显的。

¹⁷⁷Lu-h11B6展现出好得意料不到的治疗比率。

关于人源化¹⁷⁷Lu-11B6的生物分布数据与关于亲本鼠抗体(¹⁷⁷Lu-m11B6) 的生物分布数据的比较揭示了意料不到的且有利的差异。

如图7中显示的，与¹⁷⁷Lu-m11B6相比，¹⁷⁷Lu-h11B6对LNCaP肿瘤中的摄取在注射后72小时升高约20％。伴随地，与¹⁷⁷Lu-m11B6相比，¹⁷⁷Lu-h11B6 对健康骨中的摄取在注射后72小时降低约40％。

图8显示了在注射后24、48和72小时时以肿瘤对健康骨中的抗体摄取的比率表示的数据。到72小时，此比率对于人源化11B6抗体是明显增加的。

剂量测定法计算

吸收的剂量的计算提供本发明的人源化抗体的动力学相对于亲本鼠 11B6抗体的动力学的差异的更尖端的测量。

依照MIRD-图式

计算吸收的剂量，其中

是来源器官中的衰变的总数，并且S是每个衰变单位的吸收剂量(见Bolch et al.,2009,J.Nucl.Med.50:477-484，通过提及将其公开内容收入本文)。以时间-活性曲线里的时间积分计算

S-因子基于使用Moby幻图(Moby-phantom)的小鼠特异性蒙特卡洛模拟(见Larsson et al.,2011,Acta Oncol.50:973-980和Keenan et al.,2010,J.Nucl.Med.50:471-476)。为了得到总吸收剂量，认为所有器官是来源-或靶来源。

表6中显示了不同组织的计算的吸收剂量数值。

表6

如可以在表6中看出的，肿瘤吸收剂量自1.21Gy/MBq(对于m11B6)增加至2.2Gy/MBq(对于h11B6)，即80％的增加。肿瘤与骨髓吸收剂量的比率自3.9(对于m11B6)增加至5.6(对于h11B6)，约40％。在本文中，显示了与m11B6相比h11B6的增强的治疗效力，并且指示可以在较小的正常器官毒性的情况中给出对肿瘤的较高的吸收剂量。

抗体自血液的清除

图10中显示了人源化和鼠11B6抗体的血液水平分析。

结果提示了可以比鼠11B6抗体略快自血液清除h11B6。若这样的话，人源化抗体的此类增强的清除速率从安全性前景看也可以是治疗益处的，这潜在容许施用较高的活性。

增强的清除速率对于内部成像也可以是有益的。

结论

本研究的结果证明以下内容：

·人源化11B6抗体¹⁷⁷Lu-h11B6在体内有效靶向***肿瘤；

·人源化11B6抗体比其亲本鼠抗体展现出好得意料不到的治疗比率(如通过肿瘤中的摄取与健康骨中的摄取的比率测定的)；以及

·可以比鼠11B6抗体略快地自血液清除人源化11B6抗体。

总之，这些发现提供了人源化11B6抗体在治疗(和诊断)***癌中的增强的治疗效力的引人注目的证据。

由于人源化和鼠抗体靶向相同抗原(即人激肽释放酶2)，不能容易地预测或解释肿瘤与健康骨髓中的更新比率的计算差异(特别是考虑到与亲本鼠抗体相比，人源化抗体似乎展现出更低的对靶hK2抗原的亲和力；见实施例 4)。

由于此比较提供了治疗比率的测量，人源化和鼠11B6抗体之间与健康骨相比肿瘤中的相对摄取的差异是相当重要的。此比率的较高数值(如对于人源化11B6抗体明显的)指示较好的治疗抗体。特别地，较高的治疗比率意味着可以施用较高吸收剂量的经治疗放射性标记的h11B6以实现较好的治疗效果(因为人源化抗体对健康组织和器官的结合比对于鼠抗体低得多)。较高的比率还指示对于诊断目的，h11B6会好于鼠抗体(因为它等于较低的信噪比，容许较小的肿瘤，包括转移的成像)。

总之，数据证明了11B6抗体的人源化给出了早期诊断的增强的可能性和治疗***癌中高得意料不到的治疗效力。

实施例7：证明诊断和治疗效力

本研究的目的是确认11B6(一种特异性靶向hK2的催化裂缝内部的表位的单抗)作为媒介物以将高度毒性的放射性核素特异性投递至***癌生长的部位的效用。在概念研究的此证据中，我们用¹⁷⁷Lu(一种也采用γ发射的低能量β颗粒)标记亲本鼠11B6抗体，使得能够实施SPECT成像。

材料和方法

材料

¹⁷⁷Lu购自Mallinkrodt Medical BV，佩滕，荷兰。使用Cyclone^TM StoragePhosphor System和OptiQuant^TM图像分析软件(Perkin Elmer,Wellesley,MA, USA)测量ITLC(快速薄层层析)条(Biodex,US)上的放射性以测定标记动力学和放射性化学纯度。自Sigma Aldrich获得所有化学品，并且使用分析级水 (若没有另外记录的话)内部制备缓冲液。单抗11B6是一种对人激肽释放酶 2特异性且具有约1.2nM的对此抗原的亲和力的抗体；参见图1(获自芬兰的土尔库大学)。对于体内研究，使用表达hK2的***癌细胞系LNCaP(ATCC, Manassas,VA,USA)。在补充有10％胎牛血清和PEST(青霉素100IU/ml和100μg/ml链霉素)的RPMI 1640培养基中培养细胞。于37℃在具有5％CO₂的湿润培养箱中维持细胞，并且用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25％胰蛋白酶，缓冲液中的0.02％EDTA，Thermo Scientific)分离。

缀合和放射性标记

缀合CHX-A”-DTPA与11B6：使用0.07M硼酸钠缓冲液将PBS中的单抗 11B6的溶液调节至pH 9.2。在Amicon Ultra-2离心滤器(2ml,100K)上浓缩样品。以3:1螯合剂与抗体的摩尔比率于40℃缀合蛋白质溶液与螯合剂 CHX-A”-DTPA(Macrocyclics,USA)。在4h后终止反应，并且通过在用20ml 0.2M乙酸铵缓冲液，pH 5.5平衡的NAP-5柱(GE Healthcare)上的大小排阻层析使CHX-A”-DTPA-11B6(从现在起称作DTPA-11B6)与游离的螯合物分开。用1ml乙酸铵缓冲液洗脱缀合的11B6和5A10。

DTPA-11B6的放射性标记：混合乙酸铵缓冲液pH 5.5中的DTPA-11B6与预先确定量的¹⁷⁷LuCl₃。在于室温温育2h后，终止标记，并且在用PBS平衡的 NAP-5柱上纯化。用ITLC条监测标记效率和标记动力学，用0.2M柠檬酸洗脱。在此***中，放射性标记的缀合物保持于原点线，而游离的Lu-177在溶剂前面的情况中迁移。使用Optiquant作为量化软件(Perkin Elmer,Wellesley, MA,USA)，用PhosphorImager***(Perkin Elmer,Wellesley,MA,USA)测定放射性分布。

动物研究

依照关于实验室动物保护的国家立法实施所有动物实验。动物研究已经得到地方动物研究伦理委员会批准。使用购自Taconic Europe(Bomholt, Denmark)的雄性免疫缺陷裸鼠NMRI(6-8周龄)进行此研究。

在右体侧和/或左体侧中以每次注射约10*10⁶个细胞皮下植入hK2表达性LNCaP***癌细胞的异种移植物。

将形成LNCaP肿瘤的动物分成组，并且注射治疗剂¹⁷⁷Lu-DTP-11B6或对照，见下文表7：

表7

连续测量包括的所有动物，并且在3-4天的时间间隔内称重。

最初，一些动物得到较低活性(8MBq)的¹⁷⁷Lu-DTPA-11B6以使用SPECT 调查治疗剂的定位。也用SPECT研究来自组8的1只小鼠。这些动物已经被除去其器官，并且使用具有3英寸NaI(Tl)检测器的自动NaI(Tl)孔计数器(1480 WIZARD,Wallac Oy,Turku,Finland)量化这些组织样品中的放射性。

为了研究对骨髓的影响，定期采集血液样品(10μL)。在注射后一周两次收集血液样品达8周，并且在Medonic Cell Analyzer-Vet CA530 Vet(Boule Medical,Stockholm,Sweden)中分析WBC计数、RBC计数、和血小板计数。在血液取样时，监测动物的重量和身体状况。通过对动物监测体重减轻、一般状况的下降、和血液学毒性评估毒性。

用测径器测量肿瘤体积。测量长度l、宽度w和厚度t，并且计算体积。

疗法计划

基于经历用90Y和177Lu的放射性免疫疗法的大鼠中吸收剂量和对骨髓的生物学影响之间的关系(见Larsson et al.,2012,Med.Phys.39(7):4434-43)，可以评估骨髓的LD50会为12Gy等级。在文献中，关于大鼠和小鼠的短期照射的LD50是相同的，约9Gy(例如见Radiobiology for the radiologist,Hall& Giacca(编)，2006,第6版)。

然后，自对骨髓的可耐受吸收剂量12Gy的假设设计疗法。然后，自剂量测定法计算，计算与此吸收剂量对应的活性。

对对照使用相应的剂量/活性。

结果

动物肿瘤收缩

图11显示了小鼠之一中的肿瘤(在动物的体侧上可见，在皮肤下)在处理后如何在体积上缩小。

放射性免疫疗法结果

图12显示了在施用的活性(a)D、(b)2 x D和(c)对照组(其中D＝26.7 MBq)的情况中研究组的结果。

这两种处理组中有肿瘤体积缩小的清楚趋势。在注射177Lu-m11B6后几天已经看到肿瘤收缩的开始。在对照组中，在注射NaI溶液后有肿瘤体积的增加。

图13(a)显示了用活性A注射的组中的小鼠之一的结果。这里，在施用活性A的177Lu-m11B6时，肿瘤从第1天到第6天稳定生长。在处理后，观察到肿瘤体积的快速下降。

在SPECT研究(8dpi)中，在仍存在活性的情况中显示了肿瘤体积；见图 13(b)。

结论

用例示性抗体177Lu-m11B6的本研究清楚证明了针对***癌肿瘤的 hK2靶向性抗体的体内治疗效力。

实施例8：例示性的经¹⁷⁷Lu标记的本发明的人源化11B6抗体在***癌异种移植物中的治疗效力

材料和方法

抗体、缀合和放射性标记

抗体：例示性的人源化单克隆抗体11B6(IgG1/κ，在HEK 293细胞中瞬时表达)(其包含依照SEQ ID NO:12的重链和依照SEQ ID NO:13的轻链)由 Innovagen AB,Lund提供(在PBS pH 7.4中的1mg/ml，批次No.90476.30)。利用非特异性IgG抗体作为同种型对照(来自小鼠血清的IgG抗体，Sigma I-8765)。

缀合：如下缀合例示性的h11B6非特异性IgG对照抗体与螯合剂 CHX-A”-DTPA(Macrocyclics,USA)：在Amicon Ultra-2离心滤器(2mL,100K) 上浓缩抗体溶液，随后使用0.07M硼酸钠缓冲液(Sigma Aldrich)调节至pH 9.2。

与先前描述的方法(见Almqvist et al)类似地实施以约3:1(螯合剂与抗体)的摩尔比率偶联螯合剂化合物CHX-A”-DTPA与蛋白质溶液。可以通过分光光度法(Pippin etal)测定偶联效率，即每个抗体获得的螯合剂的数目，但是在本研究中没有分析。然而，优选地，偶联应当不超过3个螯合剂/抗体，以避免对蛋白质的损伤。对蛋白质添加螯合剂，并且在于40℃温和摇动的情况中温育溶液。

在4h后终止反应，并且通过在用20ml 0.2M乙酸铵缓冲液(Sigma Aldrich)，pH5.5平衡的NAP-5柱(GE Healthcare)上的大小排阻层析将 CHX-A”-DTPA-h11B6(称为DTPA-h11B6)与游离的螯合物分开。用1ml乙酸铵缓冲液洗脱缀合的h11B6，并且于-20℃贮存等分取样的样品。

以与上文类似的方式控制IgG对照抗体的缀合。

放射性标记：混合缀合的h11B6或IgG对照抗体(通常为200-300μL在 0.2M乙酸钠缓冲液pH 5.5中的约1μg/μL)与预先确定量(约200-300MBq)的 ¹⁷⁷LuCl₃(IDB Holland)，并且于室温温育1.5-2h。在温育后，终止标记，并且在用PBS(Thermo Scientific)平衡的NAP-5柱(GE Healthcare)上纯化。用快速薄层层析(Biodex,USA)监测标记效率，用0.2M柠檬酸(Sigma Aldrich)洗脱。在此***中，放射性标记的缀合物保持于原点线，而游离的¹⁷⁷Lu在溶剂前面的情况中迁移。使用Optiquant作为量化软件用Cyclone StoragePhosphor System(都来自Perkin Elmer)测定放射性分布。

以与上文相似的方式实施IgG对照抗体的放射性标记。

疗法研究

细胞系：LNCaP(hK2+)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。在补充有10％胎牛血清(Thermo Scientific)及青霉素100IU/mL和100μg/mL链霉素 (Thermo Scientific)的RPMI 1640培养基(Thermo Scientific)中培养细胞。于 37℃在湿润的培养箱中于5％CO₂维持细胞，并且用胰蛋白酶-EDTA溶液 (Thermo Scientific)分离。

遵照关于实验室动物保护的国家立法，并且在动物研究伦理委员会 (LundUniversity,Sweden)批准的情况中进行所有动物研究。使用内部育种的雄性免疫缺陷Balb/c裸鼠(6-8周龄)。通过在100μL生长培养基和100μL基质胶(BD Matrigel ^TM基底膜基质生长因子还原性(Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced)，无酚红，产品目录编号356231)中的s.c.注射 (800-1000万个细胞)给小鼠在其右体侧上异种移植LNCaP细胞。研究中包括具有建立的肿瘤的小鼠，并且分成下文在表8中描述的三组，所述建立的肿瘤具有至少约3mm的直径。在尾静脉中i.v.注射动物。选择20MBq活性水平，因为已经在用m11B6的研究中使用在此量的剂量，显示了良好的治疗效果(见实施例7)。

表8：包括三组动物：注射¹⁷⁷Lu-h11B6的一组、注射¹⁷⁷Lu非特异性单抗(以显示h11B6的特异性)的一组、和注射NaCl(作为对照组)的一组。

组	n	处理	活性(MBq)
				1	12	<sup>177</sup>Lu-h11B6	20
2	10	<sup>177</sup>Lu非特异性单抗	20
				3	10	NaCl	–

通过使用测径器重复测量肿瘤大小评估治疗效力。通过测量肿瘤的长度 (L)和宽度(W)，然后以0.5×L×W×W计算体积V计算肿瘤体积。

还有，对所有动物重复采取血液学(白细胞计数、红细胞计数、血小板数目和血红蛋白计数)和重量测量以鉴定任何潜在血液学毒性，并且监测动物的一般状况。在评估放射性免疫疗法时监测血液学毒性是尤其重要的，因为放射性会在血液中分布，并且最终达到血液干细胞定位的骨髓。

依照伦理准则终止小鼠，所述小鼠形成超出14mm的肿瘤长度/宽度，或与初始重量相比超出15％的重量减轻，或者在其它情况中具有受负面影响的一般状况，或者具有所有这三项参数的组合。

结果

治疗效力的评估

如图14(a)中显示的，施用本发明的例示性的人源化11B6抗体 (¹⁷⁷Lu-h11B6)阻止小鼠中的肿瘤生长(并且在除了一只外的所有测试动物中导致肿瘤体积的显著降低)。比较而言，肿瘤在用IgG对照抗体(见图14b) 或NaCl(见图14c)处理的小鼠中继续快速生长。

在图15中以Kaplan-Meier曲线形式汇总了图14中显示的来自个别动物的数据。¹⁷⁷Lu-h11B6的施用在实验期里产生小鼠存活率的显著增加，超过80％的动物在注射后60天实验终止时仍然活着(与两个对照组中的0％存活相比)。

血液学毒性的评估

白细胞计数、红细胞计数、血小板数目、血红蛋白计数和重量的评估没有揭示施用¹⁷⁷Lu-h11B6的任何毒性效应(数据未显示)。

讨论

本研究的结果揭示了¹⁷⁷Lu-h11B6处理在***癌异种移植物模型中的显著治疗效果。

对小鼠施用的活性(20MBq)对应于约10Gy的对骨髓的吸收剂量，其是由这些动物完全耐受的。甚至在20MBq的此低活性，观察到较大的治疗效果。如较早评估的，可以预期至少60Gy的肿瘤吸收剂量。

没有观察到血液学毒性的指示。

参考文献

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Pippin CG et al.Spectrophotometric method for the determination of abifunctional DTPA ligand in DTPA-monoclonal antibody conjugates.BioconjugChem.1992；3:342-5.

实施例9：放射性核素疗法剂量测定法计划和治疗患者中的***癌

对于放射性核素疗法(RNT)，整体分布放射源，并且通常以放射性药物 ***性施用放射性。放射性分布取决于随时间在不同组织中积累的放射性药物的量，其有时在患者间变化(1)。

RNT处理应当基于规定的吸收剂量(2)。然后，首先应当使用示踪剂量的放射性药物实施疗法前研究，并且确定肿瘤和器官吸收剂量。通常，此信息以描述每单位施用活性的器官吸收剂量的因素表示，以mGy/MBq为单位； D^P _T(器官)。

若然后在相似的条件下给出治疗性施用，则可以使用此因素来确定需要施用以将规定的吸收剂量投递至给定器官、组织或肿瘤的活性(4,6)。

在用经放射性标记的h11B6抗体的***癌治疗的情况中，疗法前研究应当基于用¹¹¹In-h11B6的¹¹¹In成像。当然后¹⁷⁷Lu要是治疗性放射性核素时， ¹¹¹In最适合于定量(平面/SPECT)成像。当然后测定D^P _T(器官)时，可以给予疗法，其中疗法活性A_T给出规定疗法效果。在疗法期间，应当基于成像计算活性分布和相应的剂量比率以得到对于评估治疗必需的对肿瘤和正常器官给予的实际疗法吸收剂量。

在由于治疗计划而达到骨髓毒性水平的疗法的情况中，则骨髓支持物是必需的，并且基于骨髓腔的剂量测定法计算，必须测定用于再输注干细胞的时间。

总之，应当相应地计划以下治疗方案：

疗法前剂量测定法研究

1.经¹¹¹In标记的h11B6(200-300MBq)注射

2.血液取样-第一周测定的血液和血浆中的活性浓度。

3.在1周里成像(SPECT/平面)(7次)

4.基于LundaDose方案(3)的器官剂量测定法

5.测定的疗法活性，其以对放射敏感性器官，如骨髓(2-3Gy)、肾(20-30Gy) 和肝(12-36Gy)的规定吸收剂量限制。

包括疗法内剂量测定法的疗法

1.施用的经¹⁷⁷Lu标记的h11B6(基于疗法前剂量测定法)

2.血液取样-血液和血浆中的活性浓度

3.在1周里成像(6次)

4.器官剂量测定法＝>确认规定的疗法吸收剂量。

关于剂量测定法的具体评述

累积的活性是在一段时间里在给定区域中发生的衰变的数目。单位是Bq s或Bqh。当离子化放射行进通过物质时，它相互作用并沉积能量。赋予的能量是给定体积中的所有能量沉积物的总和。吸收剂量是赋予的均值能量和体积质量的比率。吸收剂量的单位是格雷(Gray)(Gy)，1Gy等于1J/kg。

自不同时间时组织中的活性数值，通过积分测定累积的活性，并且可以测定均值吸收剂量。使用平面成像做出活性测量以进行全器官剂量测定法。定量SPECT/CT容许使用基于体元的方法的较小体积中的剂量测定法。

自活性浓度数值的3D分布，可以使用所谓的点剂量核或体元S值(其描述位于水(或骨)中的点源周围的能量沉积样式)计算吸收的剂量比率分布。此方法假设解剖学区域就密度而言是同质的，诸如躯干内的软组织。对于密度为异质的身体区域，如在肺中，直接的蒙特卡洛计算是优选的。这里，使用来自SPECT或PET的活性分布作为蒙特卡洛剂量计算代码的输入。

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<150> GB1401973.1

<151> 2014-02-05

<160> 24

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的鼠抗体衍生序列

<400> 1

Ser Asp Tyr Ala Trp Asn

1 5

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的鼠抗体衍生序列

<400> 2

Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的鼠抗体衍生序列

<400> 3

Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Phe

1 5

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的鼠抗体衍生序列

<400> 4

Lys Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Phe Gly Thr Ser Leu Met His

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的鼠抗体衍生序列

<400> 5

Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的鼠抗体衍生序列

<400> 6

Gln Gln Thr Arg Lys Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 261

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<220>

<223> hK2序列

<400> 7

Met Trp Asp Leu Val Leu Ser Ile Ala Leu Ser Val Gly Cys Thr Gly

1 5 10 15

Ala Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu

20 25 30

Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala

35 40 45

His Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala

50 55 60

His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu

65 70 75 80

Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe

85 90 95

Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg

100 105 110

Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu

115 120 125

Pro Ala Lys Ile Thr Asp Val Val Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln

130 135 140

Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile

145 150 155 160

Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu

165 170 175

His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val

180 185 190

Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr

195 200 205

Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln

210 215 220

Gly Ile Thr Ser Trp Gly Pro Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro

225 230 235 240

Ala Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr

245 250 255

Ile Ala Ala Asn Pro

260

<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的鼠抗体衍生序列

<400> 8

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Asn Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的鼠抗体衍生序列

<400> 9

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Phe

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 10

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的鼠抗体衍生序列

<400> 10

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的鼠抗体衍生序列

<400> 11

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 12

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的鼠抗体衍生序列

<400> 12

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Asn Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 13

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变的鼠抗体衍生序列

<400> 13

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Phe

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 14

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<222> 1..351

<223> /分子类型="未指派的DNA"

/注释="编码抗体多肽的核酸分子"

/有机体="人工序列"

<400> 14

caggttcagc tgcaggaaag cggacctggc ttggtgaaac ccagcgatac ccttagcctg 60

acatgtgctg tgtctggcaa ttccatcact tccgactatg cgtggaactg gattcggcaa 120

ccaccgggaa aagggctcga gtggataggg tacatcagct attctggttc aaccacgtac 180

aatccctcac tgaagagtag ggttaccatg tccagagaca cctccaagaa ccagttcagc 240

ctgaagctga gtagtgtgac agccgtagat acagccgtct attactgcgc aacagggtac 300

tactatggct ctggcttttg gggtcaagga actctcgtca ctgtgtcaag c 351

<210> 15

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<222> 1..333

<223> /分子类型="未指派的DNA"

/注释="编码抗体多肽的核酸分子"

/有机体="人工序列"

<400> 15

gacatagtgc tcactcagag ccctgatagc ttggctgtca gtcttgggga aagagccacc 60

atcaactgca aagcgtccga aagcgtcgag tatttcggga ctagcctgat gcactggtat 120

cagcagaaac ccggacaacc gcctaagctg ctgatctatg cagcctctaa tcgcgaaagt 180

ggcgttccag acaggttttc cggttctgga tcaggcacag acttcaccct cacgatttcc 240

tcactgcaag ctgaggatgt agccgtgtac tactgtcagc agacacggaa agtgccctac 300

acctttggtc agggcacaaa gctggagatt aag 333

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 16

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser

1 5 10

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 17

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly

1 5 10

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<222> 1..50

<223> /分子类型="未指派的DNA"

/注释="正向引物"

/有机体="人工序列"

<220>

<221> misc_feature

<222> 42

<223> /注释="其中 n 为 A, T, C 或 G"

<400> 18

ttactcgcgg cccagccggc catggcggay athgtrytva cncartctcc 50

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<222> 1..34

<223> /分子类型="未指派的DNA"

/注释="反向引物"

/有机体="人工序列"

<400> 19

gcgccgtcta gaattaacac tcattcctgt tgaa 34

<210> 20

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<222> 1..51

<223> /分子类型="未指派的DNA"

/注释="反向引物"

/有机体="人工序列"

<400> 20

gatacagttg gtgcagcatc ggtccgtttt atttccagct tggtcccccc t 51

<210> 21

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<222> 1..52

<223> /分子类型="未指派的DNA"

/注释="正向引物"

/有机体="人工序列"

<400> 21

tgctgctggc ggccgctcca gccatggctg aygtvcarct kcaggagtcd gg 52

<210> 22

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<222> 1..38

<223> /分子类型="未指派的DNA"

/注释="反向引物"

/有机体="人工序列"

<400> 22

cgccaccaga gctctcacaa tccctgggca caattttc 38

<210> 23

<211> 441

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus，属）

<220>

<223> m11B6重链

<400> 23

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Asn Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Thr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser

165 170 175

Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg

180 185 190

Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys

210 215 220

Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

225 230 235 240

Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val

245 250 255

Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe

260 265 270

Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu

275 280 285

Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His

290 295 300

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala

305 310 315 320

Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg

325 330 335

Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met

340 345 350

Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro

355 360 365

Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn

370 375 380

Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val

385 390 395 400

Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr

405 410 415

Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu

420 425 430

Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 24

<211> 218

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus，属）

<220>

<223> m11B6轻链

<400> 24

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Phe

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile Gln

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Phe Ser Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

115 120 125

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

145 150 155 160

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

180 185 190

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

195 200 205

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

Claims

1.一种对人激肽释放酶-2 (hK2)具有结合特异性的抗体多肽，其中所述抗体多肽包含：

a. 包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区；和

b. 包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区，

其中所述重链可变区和轻链可变区包含来自一种或多种人抗体的框架氨基酸序列。

2.依照权利要求1的抗体多肽，其中所述抗体多肽是完整IgG抗体。

3.依照权利要求1至2中任一项的抗体多肽，其包含轻链恒定区，其中所述轻链恒定区是κ或λ轻链的。

4.依照权利要求1至3中任一项的抗体多肽，其包含重链恒定区，其中所述重链恒定区是选自下组的免疫球蛋白亚型的：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

5.依照权利要求1至4中任一项的抗体多肽，其中与鼠11B6抗体相比，所述抗体多肽展现出增强的治疗比率。

6.依照权利要求1至5中任一项的抗体多肽，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

7.依照权利要求1至6中任一项的抗体多肽，其包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。

8.依照权利要求1至7中任一项的抗体多肽，其包含重链和轻链，所述重链由SEQ IDNO: 12的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成。

9.依照权利要求1至8中任一项的抗体多肽，其中所述抗体多肽与治疗性模块直接或间接连接。

10.依照权利要求9的抗体多肽，其中所述治疗性模块是细胞毒性模块，所述细胞毒性模块包含一种或多种放射性同位素。

11.依照权利要求10的抗体多肽，其中所述一种或多种放射性同位素是或各自独立选自下组：β-发射体、俄歇(auger)-发射体、转换电子-发射体、α-发射体、和低光子能量-发射体。

12.依照权利要求11的抗体多肽，其中所述一种或多种放射性同位素各自独立选自下组：长程β-发射体，诸如⁹⁰Y、³²P、¹⁸⁶Re/¹⁸⁶Re；¹⁶⁶Ho、⁷⁶As/⁷⁷As、¹⁵³Sm；中程β-发射体，诸如¹³¹I、¹⁷⁷Lu、⁶⁷Cu、¹⁶¹Tb；低能量β-发射体，诸如⁴⁵Ca、³⁵S或¹⁴C；转换或俄歇-发射体，诸如⁵¹Cr、⁶⁷Ga、^99mTc、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁵I、²⁰¹Tl；和α-发射体，诸如²¹²Bi、²¹³Bi、²²⁵Ac、和²²¹At。

13.依照权利要求12的抗体多肽，其中所述一种或多种放射性同位素选自¹⁷⁷Lu和²²⁵Ac。

14.依照权利要求12的抗体多肽，其中所述一种或多种放射性同位素选自^99mTc、¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷²As、⁸⁹Zr、¹²³I和²⁰¹Tl。

15.依照权利要求9至14中任一项的抗体多肽，其中所述治疗性模块是细胞毒性模块，所述细胞毒性模块包含一种或多种细胞毒性药物。

16.依照权利要求1至15中任一项的抗体多肽，其中所述抗体多肽进一步包含可检测模块。

17.依照权利要求16的抗体多肽，其中所述可检测模块包含放射性同位素。

18.依照权利要求17的抗体多肽，其中所述放射性同位素能够作为可检测模块及还作为细胞毒性模块以多模式方式同时起作用。

19.依照权利要求9至18中任一项的抗体多肽，其中所述治疗性模块和/或可检测模块经由连接模块与抗体多肽间接连接。

20.依照权利要求19的抗体多肽，其中所述连接模块是螯合剂，所述螯合剂选自下组：1,4,7,10-四氮杂-环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)的衍生物、去铁胺(DFO)、二乙撑三胺五乙酸(DTPA)的衍生物、S-2-(4-异硫氰酸根苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)的衍生物和1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)的衍生物。

21.一种分离的核酸分子，其编码依照权利要求9至16中任一项的抗体多肽。

22.依照权利要求21的核酸分子，其包含SEQ ID NO: 14和/或SEQ ID NO: 15的核苷酸序列。

23.一种药物组合物，其包含依照权利要求1至20中任一项的抗体多肽和药学可接受赋形剂、稀释剂或载剂。

24.依照权利要求1至20中任一项的抗体多肽在制备用于治疗和/或诊断***癌的药物中的用途。

25.依照权利要求24的抗体多肽的用途，其中要治疗的***癌是非局限性***癌。

26.依照权利要求24至25中任一项的抗体多肽的用途，其中要治疗的***癌是转移性***癌。

27.依照权利要求26的抗体多肽的用途，其中要治疗的转移性***癌是淋巴***转移；骨转移；或者骨盆、直肠、膀胱或尿道内转移。

28.依照权利要求24至27中任一项的抗体多肽的用途，其中要治疗的***癌是去势抗性***癌(CRPC)。

29.依照权利要求24至28中任一项的抗体多肽的用途，其中在施用所述抗体多肽后对所述患者实施放射引导手术以除去***癌细胞。