JP5686974B2 - 新規ターミネーターおよびその利用 - Google Patents
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Description
(i)配列番号7に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(ii)上記(i)のポリヌクレオチドの部分断片であって、配列番号7に示される塩基配列の第343位〜第460位を含み、かつ550bp以上のサイズを有するポリヌクレオチド;
(iii)上記(i)または(ii)とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ糸状菌細胞内でターミネーター活性を有するポリヌクレオチド。
本発明にかかる糸状菌用ターミネーター(以下「本発明のターミネーター」という)は、アスペルギルス・オリゼのゲノムDNAから見出されたものである。アスペルギルス・オリゼのゲノムの全遺伝子配列の解読は2005年に終了(Nature, 438, 1157-1161 (2005)を参照のこと)し、ポストゲノム期を迎えている。この成果により、有用な遺伝子の探索や生産性の高いプロモーターの取得などが行われている。
(i)配列番号7に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(ii)上記(i)のポリヌクレオチドの部分断片であって、配列番号7に示される塩基配列の第343位〜第460位を含み、かつ550bp以上のサイズを有するポリヌクレオチド。
(iii)上記(i)または(ii)とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、糸状菌細胞内でターミネーター活性を有するポリヌクレオチド。
本発明のターミネーターは、該ターミネーターの上流に糸状菌細胞内で機能し得るプロモーターを連結することによってベクターを構築することができる。上記プロモーターの下流(3’末端側)であり、かつ糸状菌用ターミネーターの上流(5’末端側)に所望のタンパク質(「目的タンパク質」という)をコードする遺伝子(「目的遺伝子」という)を連結し、この目的遺伝子が連結されたベクターでこれらの糸状菌宿主(例えばアスペルギルス属糸状菌等)を形質転換し、それを培養することにより、目的タンパク質を著量生産させることができる。すなわち本発明は、上記ベクター、該ベクターを用いた形質転換方法、該形質転換方法により得られた形質転換体、および該形質転換体を用いたタンパク質の生産方法をも包含する。ベクターを構築するためのDNAの連結、挿入などは、公知の遺伝子工学的手法により行うことができる。
本発明のベクターを構成する、「糸状菌細胞内において機能し得るプロモーター」としては、糸状菌細胞内で下流に連結されたタンパク質をコードする目的遺伝子を転写する機能を有するポリヌクレオチドであれば特に限定されるものではない。具体的には、α−アミラーゼ(参考文献:Biosci. Biotech. Biochem., 1992年,第56巻,第11号,p1849−1853)、グルコアミラーゼ(参考文献:Current Genetics, 1992年,第22巻,第2号,p85−91)、セルラーゼ、セロビオハイドラーゼ(参考文献:J Biotechnol., 1991年,第17巻,第1号,p35−49)、アセトアミダーゼ(参考文献:Nucleic Acids Res., 1991年,第19巻,第10号,p2655−2660)等の加水分解酵素遺伝子、エノラーゼ(参考文献:Current Genetics, 2001年, p260−267)、3−ホスホグリセレートキナーゼ(参考文献:Mol. Gen. Genet., 1992年,第233巻,第1−2号,p231−40)、グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(参考文献:Gene, 1992年,第120巻,第1号,p67−73)、アルコールデヒドロゲナーゼ(参考文献:Gene, 1989年,第79巻,第1号,p119−30)等の解糖系酵素遺伝子、トランスレーションエロンゲーションファクター遺伝子(参考文献:Appl. Microbiol. Biotechnol., 1998年,第50巻,第1号,p85−92)等のプロモーターが挙げられる。好適には、P−No8142プロモーター(参考文献:「化学と生物」,2000年,第38巻,第12号,p.831−838)が用いられる。
本発明の形質転換方法は、本発明のベクターのプロモーターの下流(3'末端側)であり、かつ糸状菌用ターミネーターの上流(5’末端側)に目的タンパク質をコードする遺伝子(目的遺伝子)が連結されているベクターで、糸状菌宿主(例えばアスペルギルス属糸状菌等)を形質転換する方法である。上記ベクターは、本発明のターミネーターを含んでいるため、かかる方法で得られた糸状菌の形質転換体を培養することによって、目的タンパク質を大量に生産させることができる。換言すれば本発明の形質転換方法は、目的タンパク質を高生産し得る糸状菌の作製方法であるとも言える。
(クローニング用プラスミドpSEGA3の作製)
本実施例において使用するpSEGA3プラスミドの構築手順を、図1に基づいて説明する。図1に示すように、まず、pUC118(タカラバイオ社製)をSapIで消化し、末端をブランチングした後、精製し、アルカリフォスファターゼで脱リン酸化を行った。pUC118のSapI消化物(ブランチング処理済)を再び精製した後、PstIで消化を行い、アガロース電気泳動により、単離および精製を行った。
アスペルギルス・オリゼRIB40(独立行政法人酒類総合研究所より入手)より、ゲノムDNAを取得し、制限酵素Sau3AIで部分分解を行った。アガロース電気泳動を行ってゲノムDNA断片(0.5〜4kb)を回収および精製を行った後に、事前にBamHIで消化および精製しておいたpSEGA3にライゲーションにより挿入した(図3を参照のこと)。
プラスミドライブラリーを調製後、アスペルギルス・ニガー NS48株(IFO4343から変異処理により取得したniaD、sC二重欠損株)へ、プロトプラスト-PEG法にて形質転換導入した。スクリーニング用培地として、0.2% 亜硝酸ナトリウムを含有する最少培地(Czapek-dox:0.2%NaNO3、0.1%K2HPO4、0.05%MgSO4、0.05%KCl、0.001%FeSO4、3%グルコースまたは3%デンプン、pH5.5)にβ−グルクロニダーゼが存在するとき青色の色素を生産するX− グルクロナイドを50μg/ml含むプレートに接種し、数日間培養後、青色に発色するコロニーを選択した。
β−グルクロニダーゼ高発現であった形質転換体からDNA画分を調製した。当該DNA画分を大腸菌(イー・コリDH5α)を形質転換し、その形質転換体から得られるプラスミドDNAのBamHIサイトに挿入されていたターミネーターとして機能するDNA鎖のシークエンス解析を行った。
実施例1で得られたアスペルギルス・オリゼ由来の新規ターミネーターと、従来公知のアスペルギルス・オリゼ由来α−グルコシダーゼ遺伝子のターミネーター(T-agdA)とのターミネーターとしての性能を比較すべく、それぞれのターミネーターを用いたときのタンパク質発現能を、β−グルクロニダーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として比較した。
pNANG-hsp12UTR中のα―グルコシダーゼ遺伝子のターミネーターを、新規ターミネーターに置換する手順を図5に示す。図5に示すように、pNANG-hsp12UTRをXbaI−SmaI消化した後、アガロース電気泳動を行って、pNANG-hsp12UTR−XbaI−SmaI消化物を単離および精製した。
構築したすべてのプラスミドを、同じくプラスミド上に含まれるniaDマーカー遺伝子内のEcoRIサイトで切断して直鎖状にし、アスペルギルス・オリゼniaD300(硝酸還元酵素欠損株)を形質転換した。それぞれの形質転換体からゲノムDNAを抽出し、サザン解析によりゲノム上のniaD遺伝子座にプラスミドが1コピー相同的に導入された形質転換体を得た。これらの形質転換体をデキストリン−ペプトン培地(2%デキストリン、1%ポリペプトン、0.5% KH2PO4、0.05%MgSO4・7H2O)にて培養し、菌体内のβ−グルクロニダーゼ比活性を測定し、それぞれのターミネーターの性能を比較した。その結果を表2に示す。
(3’RACE法による2−5−1ターミネーターの転写終結部位の決定)
2−5−1ターミネーターの転写終結部位を、公知の方法である3’RACE法(Rapid Amplification cDNA Ends)により決定した。具体的な方法を以下に述べる。
上述の3’RACE法で決定された転写終結部位、およびそれらの転写終結部位より上流30bpまでのヌクレオチド鎖を含む領域を削除しないようにトランケートした2−5−1ターミネーターの断片を4種類作製した。2−5−1ターミネーターと、作製された断片との関係を示す模式図を図6に示した。図6中の下向き三角は、3’RACE法によって決定された2−5−1ターミネーターの転写終結部位に相当する。
Claims (6)
- 糸状菌細胞内でターミネーター活性を有する糸状菌用ターミネーターであって、下記の(i)または(ii)の何れかに示されるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする糸状菌用ターミネーター:
(i)配列番号7に示される塩基配列の第261位〜第572位を含み、かつ550bp以上のサイズを有するポリヌクレオチド;
(ii)上記(i)のポリヌクレオチドと95%以上の相同性を有し、かつ糸状菌細胞内でターミネーター活性を有するポリヌクレオチド。 - 配列番号2、配列番号7、配列番号8、または、配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項1に記載の糸状菌用ターミネーター。
- 請求項1又は2に記載の糸状菌用ターミネーター、および糸状菌細胞内において機能し得るプロモーターを含むことを特徴とするベクター。
- 請求項3に記載のベクターのプロモーターの下流であり、かつ糸状菌用ターミネーターの上流に所望のタンパク質をコードする遺伝子が連結されたベクターで、糸状菌を形質転換することを特徴とする形質転換方法。
- 請求項4に記載の形質転換方法により取得された形質転換体。
- 請求項5に記載の形質転換体を培養する工程を含む、タンパク質の生産方法。
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