KR0180081B1 - 효모에서 지씨에스에프를 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DNA 제조합 기술을 이용하여 효모에서 과립구 군체 자극인자(Granulocyte Colony Stimulating Factor, 이하 GCSF 라고 약칭함)를 제조 하는 방법에 관한 것이다.

더욱 상세하게는 본 발명은 효모 유래 유전자 2종의 프로모터(promotor)로 만들어진 복합 프로모터, 효모의 살상 독소 및 interleukin 1β(IL-1β)의 아미노 말단으로 구성된 분비 시그날을 가지는 효모 발현 벡터를 이용하여 효모에서 과립구 군체 자극인자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 효모의 열자극단백질 150(Heat Shock Protein 150)의 프로모터와 분비시그날 서열을 가지는 발현 벡터를 이용하여 효모에서 과립구 군체자극인자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

효모에서 GCSF를 제조하는 방법

제1도는 YEp2-k의 제조과정을 나타낸 것이다.

제2도는 YEp2KIL20GC 제조과정을 나타낸 것이다.

제3도는 pIL20GC의 제조과정을 나타낸 것이다.

제4도는 YEpHSPGC의 제조과정을 나타낸 것이다.

제5도는 살상독소 선도서열-IL 1β 24AA-GCSF의 아미노산 서열과 선도서열 펩티다제와 KEX2 펩티다제에 의해서 절단되는 부위를 나타낸 것이다.

제6도는 효모에서 GCS를 발현시힌 후 SDS-PAGE로 분석한 것이다.

제7도는 효모에서 발현된 벡터 YEpHSPGC를 사용 GCSF를 발현 시킨 후 웨스턴 블럿(western blot)한 것이다.

제8도는 효모 배양액으로부터 조(粗) GCSF의 정제과정을 나타낸 것이다.

제9도는 세파크릴 S-200 컬럼크로마토그라피(Sephacry1 S-200 column chromatography)에 의한 GCS의 정제과정을 나타낸 것이다.

제10도는 G-CSF의 마지막 정제과정을 나타낸 것이다.

본 발명은 DNA 재조합 기술을 이용하여 효모에서 과립구 군체 자극인자(Granulocyte Clony Stimulating Factor, 이하 GCSF라고 약칭함)를 제조하는 방법에 관한 것이다.

더욱 상세하게는 본발명은 효모 유래 유전자 2종의 프로모터(promotor)로 만들어진 복합 프로모터, 효모의 살상 독소 및 interleukin 1β(IL-1β)의 아미노 말단으로 구성된 분비 시그날을 가지는 효모 발현 벡터를 이용하여 효모에서 과립구 군체 자극인자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 효모의 열자극단백질 150(Heat Shock Protein 150)의 프로모터와 분비시그날 서열을 가지는 발현 벡터를 이용하여 효모에서 과립구 군체자극인자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

골수 분화 증식 실험을 통해 인체내에 호중구계 과립구 또는 단구성 대식세포의 군체가 형성된다는 사실이 알려졌으며, 이로부터 생채내 군체행성을 자극하는 인자가 존재한다는 사실이 알려졌다[J. Cell. Comp. Physiol 66:319 (1965); Aust. J. Exp. Biol. Med.Sci. 44:287) (1996)].

군체형성 자극인자(Colony Stimulating Factor : 이하 CSF라고 약칭함)로 총칭되는 이 인자들은 특이성에 따라 다음과 같이 분류한다.

(i)GM-CSF(과립성 백혈구 및 단구성 대식세포 자극인자)는 과립성 백혈구 또는 단구성 대식세포의 간세포를 증식, 분화시켜 군체를 형성 시키고, (ii)M-CSF(단구성 대식세포 자극인자)는 주로 단구성 대식세포의 군체를 형성시키며, (iii)multi-CSF(다능성 세포자극인자)는 미분화된 다능성 세포의 간세포에 작용하여 다능성 세포의 군체를 형성시키고, (iv)G-CSF(과립성 백혈구 세포 자극인자)는 과립성 백혈구 군체를 형성시킨다[J.B.C. 252: 1998-2033 (1977). J.B.C. 252: 4045-4052 (1977), Biochem. J. 185:341-343 (1980), J.B.C 258: 9017-9021 (1983)].

GSCF는 약 20KDa의 당단백질로서 단구세포, 단구성 대식세포, 상피세포 및 섬유아세포와 같은 세포에서 생성되며, 사람의 GCSF유전자는 17번 염색체(chromosome)에 존재한다.

실제 GCSF는 생체외에서 호중구의 군집 형성을 자극하고, IL-3와 함께 작용해서 아세포, 지핵세포, 대식세포의 군체형성을 자극하며, 일부 백혈병 마이엘로마 세포주(myleoid leukemic line)는 GCSF에 의해 성숙되는 것으로 알려져 있다. 또한 생체내에서는 호중구 수를 증가시키고, 단핵세포의 수도 조금 증가시킨다.

GCSF는 임상적 용도는 다음과 같다.

첫째, 충실성 종양 및 혈액 악성 종양 환자의 호중구 감소증에 용량 의존적으로 호중구의 수를 증가시킨다.

둘째, 악성, 임파종, 폐암, 난소암, 고환종양, 요도 상피암, 급성 백혈병 등에 대한 화학요법에 의한 호중구 감소증을 신속하게 회복시킨다.

셋째, 급성 비임파성 백혈병 및 만성 골수 백혈병의 골수 이식시 호중구의 수를 증가시킨다.

넷째, 골수 이형성 증후군에 의한 호중구 감소증을 신속하게 회복시킨다.

다섯째, 재생 불량성 빈혈에 따른 호중구 감소증을 회복시킨다.

여섯째, 선천성 및 특발성 호중구 감소증에 유용하다.

일곱째, 항종양 화학요법에 의한 점막염, 열성 호중구 감소증의 발생을 방지 하거나 감소시킨다(Drug Evaluations Annual 1993, American Medical Associations p2232-2333).

이러한 GCSF를 다량으로 얻기 위하여 여러가지 유전공학적 방법이 시도되어 왔다. 우선 GCSF 유전자를 클로닝하여 대장균에서 발현시키는 방법이 시도되었다.[Science 232: 61-64(1986)].

그러나 대장균을 숙주세포로 사용하는 경우에는 다음과 같은 문제점이 있다.

GCSF와 같은 단백질은 인체내에서는 먼저 전구체로 만들어지며 이 전구체가 프로티아제에 의한 성숙과정을 거쳐 Thr-Pro-Leu의 N-말단 아미노산 서열을 가지는 GCSF로 만들어진다. 그러나, 대장균에서 발현시킬 경우 아미노 펩티디아제 효소역가에 따라 개시코돈(start codon)에 해당하는 메티오닌(methionine)이 N-말단에 존재하게 되어 경우에 따라 N-말단의 메티오닌이 제거되지 않은 단백질이 혼재하게 되는데 정제과정중에 이의 제거가 매우 어렵고, 또한 비활성의 불용성 단백질로 발현될 경우 활성을 가지는 가용성 형태로 만들어주는 과정을 거쳐야 하는데, 이때 수율이 떨어지는 단점이 있다.

또한 대장균의 경우 정제시 내독소(endotoxin)의 오염에도 유의해야 한다.

이외에 GCSF와 같이 당단백질인 경우 대장균에게는 번역후 수식(post-translational Modification)과정이 없기 때문에 글리코실레이션(glycosylation)을 할 수가 없다.

다음 GCSF 유전자를 클로닝하여 CHU-2(인간 GCSF 생산 암 세포주; hunam GCSF-producing tumor cell line) 또는 중국산 햄스터 난소세포(chinese hamster ovary cell)등의 동물세포에서 발현시켰다[EMBO J. 5: 871-876 (1980)](대한민국 특허, 공고번호 91-5624).

그러나 동물세포를 숙주세포로 하는 경우에는 세포배양시 값비싼 혈청을 사용해야 하기 때문에, 배양조건이 까다롭고, 대량의 배양액에서 미량의 단백질을 정제해야 하기 때문에 수율이 너무 적다는 문제점이 있다.

상기한 바와 같은 기존의 기술들이 지니는 문제점을 해결하기 위하여 효모 숙주세포를 이용하여 GCS를 발현 시키는 방법이 시도되었다.

효모를 숙주로 이용하여 원하는 폴리텝타이드나 단백질을 대량 배양을 통해 얻는 방법은 Loison 등에 의해서 잘 알려져 있으며 [Bio/Technol. 4 :433-437 (1986); Burrow, Baker's yeast, p349-420, in The yeast vol. 3 Rose and Harrison, eds. Academic Oress, London(1970)), 효모를 숙주로 사용하는 경우 동물세포나 대장균을 이용할때 얻을 수 없는 여러가지 이점을 가지고 있다.

이에 본 발명자들은 효모를 이용하여 GCSF를 제조하는 방법에 대하여 연구하였다.

효모는 미국 FDA 에서 인체에 대한 안전성이 인정 되었고, 유전자 발현 조절의 원리도 대부분 밝혀져 있다[Strathern 등, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Metabolism and Gene Expression, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(1982)].

효모를 숙주세포로 사용하는 경우 인체에 안전하며, 고농도 배양이 가능하기 때문에 대량 생산이 가능하고, 신호 펩타이드(signal peptide)를 이용하여 가용성 형태의 단백질을 세포밖으로 분비시킬 수 있기 때문에 정제방법이 용이하다.

최근 B형 간염 바이러스 인터페톤, 카프 카이모신(calf chymosin), 상피세포성인자(epidermal growth factor)와 같은 외부단백질을 효모에서 발현시키는 방법이 게속 보고되고 있다[Valensuela 등, Nature 298: 347-350 (1982); Hitzeman 등 NAR 11: 2745-2763(1983); McAleer 등, Nature 307: 178-180(1984); Tuite 등, EMBO, J. 1:603-608(1982); Mellor 등 Gene 24: 1-14 (1983); Urdea 등, PNAS 80: 7561-7465(1983)].

그러나 효모에서 이종단백질을 발현 시키면 정상의 동종 유전자 발현물의 생산과 비교해 볼 때 아주 적은 양이 생산 된다는 문제점이 있어서, 많은 연구자들이 여러가지 발현 벡터를 개발하여 효모에서 이종단백질 발현을 증가시키고자 노력하고 있다[Chen등 NAR 12: 8951-8970 (1984)].

예를들면, 유럽특허 84303833외부 유전자와 효모의 GAL1 프로모터를 가지고 있는 클로닝 벡터를 이용하여 효모에서 갈락토카이나제-보바인-프로카이모신(galactokinase-bovine prochymosin) 융합단백질을 생산하는 방법이 개시되어 있다.

이외에 효모 유전자인 GAL4를 외부 유전자와 GAL1 프로모터를 포함하는 벡터에 삽입한 경우 갈락토스에 의해 전사 수준을 조절하여 GAL4의 발현을 증가시킴으로써 외부단백질의 생산성을 높일 수 있는 방법이 알려져 있다[Laughon 등, PNAS 79: 6827-6831 (1982)].

유럽특허 84302723에는 효모의 α-인자(α-mating factor)의 프로모터와 분비시그날을 사용하여 인간 인터페론γ, 인간혈청 알부민, 보바인(bovine)인터페론α-1, α-2, 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator), 레닌(rennin), 인간 인슐린 유사 성장인자(human insulin-like growth factor)등을 효모에서 발현시키는 방법이 나와 있다.

본 발명자들은 DNA재조합 기술을 이용하여 효모에서 GCSF 를 제조하기 위해서는 GCSF를 다량 발현시켜야 할 뿐만 아니라 발현된 GCSF가 세포 밖으로 분비되어야 한다는 점에 착안하여 연구한 결과 다음과 같은 제조방법을 발명하였다.

먼저 성숙 GCSF 를 분비시키도록 하기 위하여 GCSF의 아미노 말단 부위에 여러 분비 시그날(signal peptide)를 접합하여 세포 밖으로의 분비를 시도하였다. 그러나 이 경우 분비 시그날이 존재함에도 불구하고 세포외로 분비가 용이하지 않았다.

한편 인터루킨-1β(interleukin IL-1β)는 효모에서 분비 시그날에 의해 매우 효율적으로 세포밖으로 분비되는 것이 보고된 바 있다[EMBO J.6: 229-234 (1987)]. 이에 본 발명자들은 분비시그날 외에 IL-1β의 아미노말단의 아미노산들이 발현된 GCSF를 세포외로 분비 시키는데 도움이 될 것이라는 점에 착안하여 GCSF 유전자 앞에 살상 독소 분비시그날과 약 20여개의 IL-1β의 아미노산 서열을 배치하여 GCSF의 발현과 세포의 분비를 유도한 결과 성공적으로 발현 및 분비되는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

이때 GCSF 단백질 앞에 20여개의 IL-1β의 아미노산이 존재하게 되므로 분비도중 IL-1β의 20여개의 아미노산의 절단을 유도하기 위하여 효모의 이염기 엔도펩티다제(dibasic endopeptidase)인 KEX2의 절단 부위를 IL-1β와 성숙한 GCSF 유전자 사이에 배치하였다.

이렇게 해서 얻어진 벡터는 살상독소 분비시그날-IL 1β의 20여개 아미노산-KEX2 절단 부위-성숙 GCSF의 배열을 갖는다. 이와같은 발현벡터에 의해 발현되는 단백질은 단백질 합성후 세포외로 분비되는 도중 먼저 분비시그날이 신호펩티다제(signal peptidase)에 의해 잘려지고, 다음 KEX2 펩티다제에 의해 IL-1β부위가 잘려져서 정확한 아미노 말단을 갖는 성숙한 GCSF가 최종적으로 분비되게 된다.

본 발명에서 사용한 GCSF 발현벡터를 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다.

GCSF 발현벡터는 효모 발현 벡터 YEpsec1-hI1[C. Baldari 등, EMBO J. 6: 229-234 (1987)]의 CYC-1 프로모터 대신 치환된 MFα-인자(Mating factor α1) 프로머터, 효도의 코돈(codon)사용에 따라 최적화시킨 살상 독소의 선도서열(leader sequence) 및 IL-1β의 24개 아미노 말단으로 구성된 복합 분비시그날, GCSF 유전자, 그리고 GAL 유전자 활성화제(activator)인 GAL4로 구성되어 있다. 이 벡터로 Saccharomyces cerevisiae 숙주세포를 형질전환시켜 우라실이 없는 최소 배지에서 올바른 형질전환체를 선별하여 GCSF 생산균주로 사용하였다.

또한 본 발명에서는 열충격 단백질(Heat shock Protein)을 이용하여 원하는 GCSF 단백질의 발현을 배양 온도차이 만으로 조절이 가능한 벡터도 시도하였다. 이미 알려진 여러가지 유도 가능한(inducible) 효모 발현벡터들 예를 들면, 갈락토스에 의해 유도되는 GAL프로모터, 인 고갈에 의해 유도되는 Pho5 프로모터, 포도당 고갈에 의해 유도되는 ADH II 프로모터와는 달리 열충격 단백질은 온도조절(37~42℃)만으로 쉽게 mRNA 및 단백질의 발현을 조절할 수 있고, 선도서열(leader sequence)에 의해 세포밖으로 분비되어 진다(PNAS, 89: 3671-3675). 이에 본 발명자들은 열충격단백질인 HSP 150의 프로모터와 열충격 단백질의 선도서열을 포함하는 발현벡터를 이용하여 GCSF를 제조하는 방법을 발명하였다.

다음의 실시예를 통하여 본 발명의 내용을 좀 더 상술하고자 한다.

실시예는 본 발명을 예시하는 것일뿐, 본 발명의 내용을 한정하는 것은 아니다.

1. YEp2-k 제조

원래 효모 발현 벡터 YEpsec1-hI1은 Gal 1, 10 유전자의 상류활성서열(upstream activation sequence)과 CYC-1 프로모터, Kluyveromyces lactis 의 살상독소 선도서열 [M. J. R. Stark 등, NAR 12: 6011-6031, (1984)], 그리고 인터루킨1β) 유전자로 구성되어 있는데, 유도제인 갈락토스에 의해 IL-1β가 발현된다.

YEpsec1-hI1을 좀더 효율적인 벡터로 만들기 위하여 살상독소 선도서열을 효모에서 대량으로 발현되는 단백질의 코돈으로 최적화 시키고, CYC-1프로모터를 더욱 효율적인 MFα1 프로모터로 치환시켰다.

또한 RNA전사 종결을 위해서 GAPDH의 전사 종결체를 GCSF의 3'쪽에 넣어주고 Gal유전자의 활성화제인 Gal4 유전자를 클로닝하여 GCSF 뒤쪽에 포함시켰다.

1). 살상독소(killer toxin) 선도서열(leader codon) 최적화

(YEpsec-ok)의 제조

[실시예 1]

살상독소(killer toxin) 선도서열 올리고펩타이드의 합성 효모 발현 벡터 YEpsec1-hI1의 살상독소(killer toxin)의 선도서열 코돈(leader sequence codon)을 Saccharomyces cerevisiae 에서 다량으로 발현되는 단백질의 코돈으로 치환하기 위하여 다음과 같은 올리고펩타이드(oligo peptide)를 합성기(ABI, 392 DNA/RNA synthesizer)로 합성하였다(J. Bennetzen, B. Hall. J. Biol. chem. 257: 3026-3031).

YEpsec1-hI1의 살상독소 선도서열을 잘라 낸 자리에 합성한 올리고 블록을 삽입하기 위하여 다음과 같이 처리하였다.

각 올리고펩타이드 5'을 인산화 시키기 위하여 ATP를 포함하는 반응용액[70mM Tris-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl₂, 5mM DTT(dithiothreitol)] 30㎕에서 T₄폴리뉴클레오타이드 카이네이즈(T₄polynucleotide kinase; NEB)를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

두 반응액을 섞어 65℃에서 20분 동안 방치한 후 30℃로 천천히 식히면서 어닐링시켰다.

[실시예 2] YEpsecl-hI1 절단

1㎍의 YEpsecl-hI1을 반응액[20mM Tris-아세테이트, 10mM 마그네슘 아세테이트, 50mM 포타슘 아세테이트, 1mM DTT(pH7.9)] 40㎕에서 제한효소 SacI, KpnI(NEB)으로 37℃에서 1시간동안 반응시킨 후 1% 평판 아가로스젤(agarose gel)로 전기영동 분리하여 8.4kb의 밴드를 잘라 내어 Jetsorb(GENOMED, cat#110300)를 이용하여 잘라낸 밴드로부터 DNA를 용출하여 정제 하였다.

[실시예 3] DNA연결 빛 형질전환

실시예1에서 어닐링된 살상독소 선도서열의 올리고블럭과 실시예2에서 제한효소 SacI, KpnI으로 절단된 YEpsecl-hI1을 50mM Tris-hcl(pH7.6), 10mM MgCl₂, 10mM DTT, 및 1mM ATP로 구성된 반응액 30㎕에 용해시키고, T₄DNA 리가제 100단위를 가하여 16℃에서 하룻밤 반응시켰다.

반응액을 Molecular Cloning A Laboratory Manual (Sambrook, Fritch, Maniatis. 2nd edition. CSH)에 따라 CaCl₂방법으로 대장균 XL-1 Blue(supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA46 thi relA1 Iac^-F'[proAB⁺lacI^qlac^ZM15 Tn10(tet^r)])를 형질 전환 시킨 후, LB-Amp한천 고형 배지(10g/l 트립톤, 5g/l 이스트 추출물, 10g/l NaCl, 1.5% Agar, 100㎕ /ml) 암피실린)에 도말 하여 37℃에서 50㎕/ml 20시간 동안 배양시켰다. 암피실린 내성 형질전환체(Amp^R)의 콜로니를 1.5ml의 액체 LB-Amp 배지에서 배양해 알칼리 용출 방법으로 용해 후 RPM 회전 필터(BIO 101)를 이용해 플라스미드를 정제하였다. 코돈 최적화에 의해 살상독소 선도서열의 DNA상에 존재하는 제한효소 SmaI 자리가 없어지기 때문에 제한요소 SmaI을 처리하여 절단되지 않는 플라스미드를 골라내어 YEpsec-ok 로 명명하였다.

[실시예 4] 단사슬 DNA

코돈 최적화를 위해 치환시킨 살상독소 선도코돈의 염기서열을 확인하기 위하여 시퀀싱(sequencing)을 수행하였다. 시퀀싱에 필요한 단사슬(Single-strand) 플라스미드를 만들기 위하여 다음과 같이 실시하였다.

실시예 3에서 얻은 YEpsecl-ok 플라스미드를 다시 제한효소 BamHI, SacI으로 절단하여 1.5% 아가로스 젤에서 분리한 후 0.66kb의 DNA 절편을 잘라내었다. GENE CLEAN KIT II 를 사용하여 젤에서 DNA를 용출해 내었다.

벡터 M13mp19 1㎍을 제한효소 BamHI, SacI으로 절단한 후 GENE CLEAN KIT II를 사용하여 정제하였다. 상기의 0.66kb의 DNA와 M13mp19를 연결(ligation)반응액 속에서 T₄DNA리가제를 가하여 16℃에서 하룻밤 반응시켰다. 반응액을 형질전환 가능한(competent) 대장균 XL-1Blue 에 형질전환 시킨 후, Molecular Cloning A Laboratory Manual(ibid)에 따라 단사슬 DNA를 분리하였다. 더 자세히 말하자면 연결반응액, 하룻밤 배양한 200㎕ XL-1 Blue 배양액, 40㎕ X-Gal(디메틸포름아미드중 20mg/ml), 4㎕ IPTG(200mg/ml)을 녹인 LB 아가(0.7% 아가 3ml)에 섞은 후, LB고형 한천 배지에 깔아 주었다. 37℃에서 하룻밤 배양 시킨 후, 한천 배지 상에 생긴 흰색 플라크 1개를 취하여, 200㎕의 XL-1Blue와 함께 20ml의 LB에 접종하여, 37℃, 250rpm에서 5시간 동안 진탕한 후 배양액을 원심분리하고, 상층액에 1/5 용적의 PEG(2.5 M NaCl중 20% PEG8000)를 넣고 얼음에 15분간 방치해 둔다. 다시 원심분리한 후, 상층액을 버리고, M13바이러스 펠렛을 200㎕ TE완충액(10mM Tris-HCl (pH 7.6), 1mM EDTA)에 현탁한 후, 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(25:24:1)으로 처리하여 탈단백화 하였다. 원심 분리후, 상층액에 2배 용적의 에탄올을 가하여 DNA를 침전시키고, 70% 에탈올로 DNA 펠렛을 세척하였다. 펠렛을 진공건조 시킨 후 20㎕의 증류수에 녹였다.

[실시예 5] 서열분석

디데옥시 사슬정지 DNA서열(dideoxy chain termination DNA sequencing)방법으로 실시예4에서 정제한 단사슬 플라스미드의 염기서열을 Sequenase(USB)를 사용하여 분석하였다. 시퀀싱에 필요한 시발체는 Biolab의 올리고 DNA를 합성기(ABI)로 합성 하였다.

염기서열분석용 올리고 DNA

염기서열분석 결과 다음과 같이 코돈이 최적화된 상태로 염기가 치환되었음을 알 수 있었다.

2) GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphatase dehydrogenase)의 전사 종결제(YEpsec-term의 제조)

[실시예 6] 올리고펩타이드 합성

Gall, 10 UAS(upstream activation sequence)-MFα1프로모터에 의해서 전사되는 mRNA를 효율적으로 종결 시키기 위하여 GAPDH [J. Biol. Chem. 245: 839-845.(1979)]의 전사 종결체를 아래와 같이 합성하였다.

합성후 OPC(oligo purification column)로 올리고펩타이드를 정제하였다. 실시예1의 방법에 따라 올리고펩타이드를 인산화, 어닐링 시켰다.

[실시예 7] YEpsec1-hI1 절단

발현되는 유전자의 하류(downstream)에 GAPDH 전사 종결체를 삽입하기 위하여 YEpsec1-hI1을 제한효소 BamHI, SalI으로 37℃에서 1시간동안 처리하였다. 절단된 플라스어드를 1% 평판 아가로스젤로 분리하여 약9kb의 밴드를 잘라 내어, Jetsorb를 이용하려 잘라낸 밴드로부터 DNA를 용출해 내었다.

[실시예 8] DNA연결 및 형질전환

실시예6에서 인산화, 어닐링 시킨 GAPDH의 전사 종결체 올리고펩타이드와 제한효소 BamHI, SalI으로 절단된 YEpsec1-hI1 fmf T₄DNA리가제로 16℃에서 연결시켰다. 반응액을 CaCl₂방법에 따라 대장균 XL-1 Blue를 형질 전환시켜 얻은 암피실린 내성 형질전환체의 콜로니를 1.5ml의 LB-Amp배지에서 배양한 후 RPM 필터로 플라스미드를 정제하였다. 제한효소 BamHI, SalI 으로 플라스미드를 절단한 후, 8% PAGE(polyacrylamide gelelectrophoresis)로 분석하여 약70bp의 밴드가 보이는 것을 YEpsec-term으로 명명하였다.

3) YEpsec-kt 의 제조

[실시예 9] YEpsec-ok 절단

1㎍의 YEpsec-ok을 제한효소 KpnI, SalI으로 37℃에서 1시간동안 절단한 후 1% 평판 아가로스젤로 분리하여 약 8.3kb의 밴드를 잘라내어 Jetsorb를 이용하여 DNA를 용출해 내었다.

[실시예 10] YEpsec-term 절단

1㎍의 YEpsec-term 을 제한효소 KpnI, SalI으로 37℃에서 1시간동안 절단 한 후 1% 평판 아가로스젤로 분리하여 약 0.6kb의 밴드를 잘라내어 DNA 를 용출해 내었다.

[실시예 11] DNA연결 및 형질전환

실시예 9에서 용출해 낸 8.3kb의 벡터와 B항에서 용출해낸 0.6kb의 삽입부를 연결 반응액 30㎕의 용해시키고 T₄DNA리가제를 가하여 반응시켰다.

반응액을 CaCl₂방법에 따라 대장균 XL-1 Blue 를 형질전환 시킨후, 암피실린 내성 혈질전환체의 콜로니를 취하여 1.5ml의 LB-Amp에 배양한 후, RPM 회전필터를 이용하여 플라스미드를 정제하였다. 제한효소로 플라스미드를 절단, 분석하여 YEpsec-ok 에 GAPDH의 전자종결체가 삽입된 것을 YEpsec-kt 로 명명하였다.

4)CYC-1프로모터를 MFα1 프로모터로 치환(Yepαkt의 제조)

원래 YEpsec1-hI1 에서는 갈락토스 대사에 관여하는 유전자들의 활성화제인 Gal₄단백질이 결합하는 GAL1-10 UAS조절 부위와 CYC-1프로모터의 복합 프로모터로 구성되어 있으나, 본 특허에서는 좀 더 효율적인 전사 개시점을 가지는 MFα1프로모터 [Kurjan 등, Cell. 30: 933-943 (1982)]로 CYC-1 프로모터를 치환하였다.

[실시예 12] MF α1 프로모터의 PCR(polymerase chain reaction)

클로닝의 편의를 위해서 적당한 절단부위를 가지는 시발체를 이용하여 PCR을 실시하여 MFα1 프로모터를 얻었다. 각 시발체의 5'말단에는 아래와 같이 제한효소 SalI과 SalI의 절단 부위를 가진다.

MFα1(mating factorα1)의 전사개시 서열(Transcription Initiation Sequence) 증폭용 시발체

PCR에 사용한 주형은 MFα1프로모터를 가지는 벡터 p70αT였다.

50pmol의 각 시발체, 200㎍ dNTP를 포함하는 10㎕의 반응액[10mM KCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 20mM Tris-HCl(pH8.8), 2mM MgSO₄0.1% 트리톤 X-100]에 2단위의 Vent DNA 중합효소를 가하여 PCR ROBOT(Fine사)를 사용하여 다음과 같은 조건하에서 35회 반응 시켰다.

전처리 94℃, 300초; 어닐링 53℃, 40초; 중합반응 72℃, 40초, 열변성 94℃, 40초, 후처리 53℃, 300초

증폭한 MFα1프로모터를 1.5% 평판 아가로스젤에 전기 영동하여 약105bp의 DNA 밴드를 확인하고 젤에서 용출하였다. 제한효소 SalI, SacI으로 절단하여 정제하였다.

[실시예 13] YEpsec-kt 절단

1㎍의 YEpsec-kt을 제한효소 XhoI, SacI으로 37℃에서 1시간동안 절단하였다. 절단된 플라스미드를 1% 평판 아가로스젤로 분리하여 약 8.8kb의 밴드를 잘라낸후 Jetsorb를 이용하여 DNA를 용출해 내었다.

[실시예 14] 연결 및 형질전환

실시예 12에서 얻은 SalI, SacI으로 절단한 α1프로모터와 실시예 13에서 얻은 XhoI, SacI으로 절단한 8.3kb의 벡터를 연결반응액 30㎕속에서 T₄DNA리가제를 가하여 반응시켰다. 반응액을 대장균 XL-1 Blue를 형질전환 시킨 후, 암피실린 내성 형질전환체의 콜로니를 1.5ml LB-Amp에서 콜로니를 배양한 후, 플라스미드를 정제하였다. XhoI 부위와 SalI부위가 바르게 연결되었을 경우 두 제한효소로 플라스미드를 절단할 수 없기 때문에 제한효소 XhoI, SalI으로 절단되지 않는 것을 선별하여 YEpαkt로 명명하엿다.

5) Gal4 유전자(YEpαktGAL4의 제조)

갈락토스가 탄소원으로 존재할때 갈락토스 대사에 관여하는 유전자들(Gal7,10,1, Gal2, Mel1)은 활성화제인 GAL4 단백질[Johnstone 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79: 6971-6975(1982)]에 의해 발현된다.

이러한 유도는 각 유전자의 전사 레벨에서 일어나게 되는데 GAL4 단백질은 전사 활성인자로 작용한다.

YEpsec1-hI1의 Gal1(kinase)-Gal10(epimerase)에는 GAL4의 결합부위인 UAS[Cirton 등, J. Bacteriol. 158: 269-278 (1984)]가 있다. YEpsec1-hI1플라스미드는 효모2μcircle의 복제 개시의 고사본수(high-copy number)플라스미드이고, GAL4단백질은 염색체 DNA에서 합성되기 때문에 갈락토스 유도시 GAL1-10 UAS 에서 결합할 수 있는 GAL4 단백질이 부족하여 충분히 발현되기 어렵다.

따라서 충분한 GAL4 단백질을 유지하기 위하여 Gal4유전자를 YEpsec1-hI1 플라스미드에 삽입 시켰다.

[실시예 15] GAL4 유전자 PCR

GAL4 유전자를 PCR하기 위하여 다음과 같은 시발체를 합성 하였다.

주형으로는 Saccharomyces cerevisiae 2805의 게놈 DNA를 사용하여 50pmol의 각 시발체, 200㎛ dNTP를 포함하는 100㎕의 반응액 [10mM KCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 20mM Tris-HCl(pH 8.8), 6mM MgSO₄, 0.1% 트리톤 X-100]에 2잔위의 Vent DNA중합요소를 가하여 PCR ROBOT(Fine사)를 사용하여 다음과 같은 조건하에사 35회 반응을 시켰다.

전처리 94℃, 300초; 어닐링 53℃, 50초; 중합반응 72℃, 260초; 열변성 94℃, 50초; 후처리 53℃, 300초.

증폭한 GAL4 유전자를 1% 평판 아가로스젤에 전기 영동하여 약 3.5kb의 DNA밴드를 확인하고 젤에서 용출한 후, 제한효소 EcoRI으로 절단하여 정제하였다.

[실시예 16] pUCGAL4 구축

pUC18를 제한효소 EcoRI으로 37℃에서 1시간 동안 절한 후 CIP(calf intestinal phosphatase, NEB)를 처리하여 탈 인산화 하였다.

EcoRI 으로 절단된 플라스미드를 Jetsorb를 이용하여 정제하였다.

상기의 EcoRI으로 절단한 GAL4 유전자와 pUC18를 연결반응액 30㎕속에서, T₄DNA 리가제를 가하여 16℃에서 하룻밤 반응시켰다. 반응액을 CaCl2 방법에 따라 대장균 XL-1 Blue를 형질전환 시킨 후, 콜로니를 배양하여, RPM 회전필터를 이용해 플라스미드를 정제하였다. 제한효소 EcoRI으로 플라스미드를 절단했을 때 3.5kb의 밴드가 보이는 것을 선벽하여 pUCGAL4로 명명하였다.

[실시예 17] YEpαktGAL4

YEpαkt에 GAL4유전자를 삽입하기 위하여 다음과 같이 실시하였다.

pUCGAL4를 제한효소 EcoRI으로 절단한 후 1% 평판 아가로스젤에 전기영동하여 약 3.5kb의 DNA 밴드를 잘라내어 젤에서 용출하여 정제하였다.

YEpαkt 1㎍를 제한효소 EcoRI으로 37℃에서 1시간동안 절단한 후 CIP(calf intestinal phosphatase, NEB)를 처리하여 탈인산화 하고 절단된 벡터를 Jetsorb를 이용하여 정제하였다.

EcoRI으로 절단한 GAL4 유전자와 YEpαkt를 연결반응액속에서 T₄DNA 리가제를 가하여 16℃에서 하룻밤 반응시켰다. 반응액을 CaCl2 방법에 따라 대장균 XL-1 Blue를 형질전환 시킨 후, 콜로니를 배양하여 플라스미드를 정제하였다. 제한효소 EcoRI으로 플라스미드를 절단했을 때 3.5kb의 밴드가 보이는 것을 선별하여 YEpαktGAL4로 명명하였다.

6) YEp2-k의 제조

[실시예 18] YEp2-k의 제조

YEpαktGAL4에는 제한효소 KpnI 절단부위가 2개 존재한다.

1개는 살상독소 선도서열의 말단에 존재하고 다른 1개는 선택 표지인 leu2-d 유전자내에 존재한다. 본 특허에서는 효모의 선택 표지로 URA3를 이용하기 때문에 클로닝의 편의를 위하여 leu2-d 유전자내에 존재하는 KpnI 절단부위를 제거하였다.

YEpαktGAL를 부분 절단한 후, 50㎕의 반응액(10mM Tris-HCl pH 8.0, 5mM MgCl₂, 5mM DTT, 100㎛ dNTP, 50㎍/ml BSA]속에서 10 단위 T₄DNA 중합효소를 가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켜 KpnI을 단면말단으로 만들었다. ATP와 T₄DNA 리가제를 가하여 16℃에서 하룻밤 반응시켰다.

CaCl₂방법에 따라 대장균 XL-1 Blue 를 형질 전환시킨 후, 15ml의 LB-Amp에 콜로니를 배양하여 플라스미드를 정제하였다. 제한효소로 플라스미드를 절단, 분석하여 leu2-d 유전자 내의 KpnI이 제거된 것을 YEp2-K로 명명하였다.

II. GCSF의 클로닝(YEp3KGC의 제조)

[실시예 19] GCSF의 제조

GCSF를 PCR(polymerase chain reaction)하기 위하여 다음과 같이 올리고 뉴클레오타이드를 합성하였다.

GCSF을 PCR하기 위하여 주형으로는 마크로파지 cDNA 도서관[macrophage cDNA library(Clontech)]를 사용하기 50pmol의 각 시발체.

200㎛ dNTP를 포함하는 100㎕의 반응액(10mM KCl, 10mM(NH₄)₂SO₄, 20mM Tris-HCl (pH 8.8), 2mM MgSO₄, 0.1% Triton X-100]에 2단위의 Vent DNA 중합효소를 가하여 PCR ROBOT(Fine사)를 사용하여 다음과 같은 조건하에서 35회 반응 시켰다.

전처리 94℃, 300호; 어닐링 53℃, 30초; 중합반응 72℃, 30초; 열변성 94℃, 30초; 후처리 53℃, 300초

증폭한 GCSF 유전자를 1% 평판 아가로스젤에 전기 영동하여 약 0.5bp의 DNA 밴드를 확인하고 정제한 후, 제한효소 KpnI, BamHI으로 절단하였다.

[실시예 20] YEpsec-kt 절단

1㎎의 YEp2-K을 제한효소 KpnI, BamHI 으로 37℃에서 1시간동안 절단한 후, 1% 평판 아가로스젤로 분리하여 IL-1β절편은 버리고 나머니 벡터 부분을 취하여 용출해 내었다.

[실시예 21] DNA 연결 및 형질전환

상기의 KpnI, BamHI 으로 절단한 GCSF 유전자와 YEp2-k를 연결반응액 30㎕속에서 T₄DNA 리가제를 반응 시켰다. 반응액을 대장균 XL-1Blue를 형질전환 시킨 후, 콜로니를 배양하여 플라스미드를 정제하였다.

제한효소 KpnI, BamHI으로 플라스미드를 절단 했을 때 GCSF 절편이 삽입 된 것을 선별하여 YEp2KGC로 명명 하였다.

III. YEpGalMF의 구축

일반적인 클로닝벡터인 YEp352 [J. E. Hill 등. Yease. 2: 163-167(1986)]에서 GCSF를 발현시키기 위하여 다음과 같이 실시 하였다.

YpGX265Gal에서 GCSF발현에 필요한 부분을 얻어 발현 벡터 YEpGalMF를 구축하여, GCSF발현에 이용하였다.

[실시예 22] GAL4-GAL1, 10 UAS-MFα1의 PCR

YpGX265GAL4 [US patents No. 5,013,652]에서 GAL4-GAL1, 10에 있는 UAS-MFα1를 얻기 위하여 GAL4와 MFα1프로모터에 상보적인 시발체를 사용하여 PCR을 수행하였다.

500pmol의 각 시발체, 200㎛ dNTP를 포함하는 100㎕의 반응액에 2단위의 Vent DNA 중합효소를 가하여 PCR ROBOT(Fine사)를 사용하여 다음과 같은 조건하에서 35회 반응 시켰다.

전처리 94℃, 300초; 어닐링 53℃, 30초; 중합반응 72℃, 30초; 열변성 94℃, 30초; 후처리 53℃, 300초

증폭한 GAL4-GAL1, 10 UAS MFα1 유전자를 1% 평판 아가로스 젤에 전기 영동하여 약4bp의 DNA 밴드를 확인하고 젤에서 용출한 후, 제한효소 SacI, EcoRI으로 절단하여 정제 하였다.

[실시예 23] YEp352절단

1㎍의 YEp352를 제한효소 SacI, EcoRI으로 37℃에서 1시간동안 절단 한 후, 1% 평판 아가로스젤로 분리하여 약 kb의 밴드를 잘라내어 Jetsorb를 이용하여 DNA를 용출해 내었다.

전처리 94%, 300초; 어닐링 50℃, 30초; 중합반응 72℃, 30초; 열변성 94℃, 30초; 후처리 53℃, 300초

[실시예 24] DNA 연결 및 형질전환

상기의 SacI, EcoRI으로 절단한 YpGX265GAL4의 GAL4-GAL1, 10 UAS-MFα1과 YEp352를 연결반응액 30㎕속에서 T₄DNA 리가제를 가하여 반응시켰다. 반응액을 대장균 XL-1 Blue를 형질전환 시킨 후, 콜로니를 배양하여 플라스미드를 정제하였다.

제한효소 SacI, EcoRI으로 플라스미드를 절단 했을때 3.5kb의 밴드가 보이는 것을 선별하여 YEp2GalMF 로 명명하였다.

IV. YEp2kIL20GC 구축

[실시예 25] IL20GCSF의 제조

1) 살상독소 선도서열과 IL-1β의 아미노 말단의 24 아미노산 그리고 엔도텝티다제 KEX2 절단 부위를 PCR하기 위하여 다음과 같은 시발체를 합성하였다.

주형으로는 YEp2-k를 사용하여 50pmol의 각 시발체, 200μM dNTP를 포함하는 100㎕의 PCR반응액에 2단위의 Vent DNA중합효소를 가하여 다음과 같은 조건하에서 35회 반응 시켰다.

전처리 94℃, 300초; 어닐링 50℃, 30초; 중합반응 72℃, 30초; 열변성 94℃, 30초; 후처리 53℃, 300초

증폭한 살상독소 선도서열 ILβ24AA를 1.5% 평판 아가로스젤에서 전기영동하여 약80bp의 DNA밴드를 확인하고 젤에서 용출하여 정제하였다. PCR된 DNA는 다음과 같은 염기서열을 가진다.

2) 이렇게 합성된 PCR 산물과 GCSF의 카복시 말단에 상보적인 올리고펩타이드를 사용하여 GCSF를 PCR하였다.

GCSF의 카복시 말단에 상보적인 올리고펩타이드를 다음과 같이 합성하였다.

주형으로는 실시예 21에서 얻은 YEp2KGC를 사용하여 50pmol의 시발체와 살상독소 서열 IL-1β의 24AA, 20㎛ dNTP를 포함하는 100㎕의 반응액에 2단위의 Vent DNA 중합효소를 가하여 다음과 같은 조건하에서 35회 반응시켰다.

전처리 94℃, 300초; 어닐링 50℃, 30초; 중합반응 72℃, 30초; 열변성 94℃, 30초; 후처리 53℃, 300초

증촉한 IL20GCSF를 1% 평판 아가로스젤에 전기영동하여 약 0.66kb의 DNA밴드를 확인하고 젤에서 용출하여 정제하였다. IL20GCSF를 제한효소 SacI, BamHI 로 절단한 후 정제하였다.

[실시예 26] YEp2-k 절단

YEp2-k 1㎍을 제한효소 SacI, BamHI으로 37℃에서 1시단동안 절단하였다. 절단된 플라스미드를 1% 아가로스젤로 분리하여 약 12kb의 밴드를 잘라내어 Jetsorb를 이용하여 DNA를 용출해 내었다.

[실시예 27] DNA 연결 및 형질변환

실시예 26에서 얻은 SacI, BamHI으로 절단한 IL20GCSF와 YEp2-K를 연결 반응액 30㎕속에서 T₄DNA 리가제를 가하여 반응시켰다. 반응액을 대장균 XL-1Blue를 형질전환 시킨 후, 콜로니를 배양하여, 플라스미드를 정제하였다. 제한효소로 플라스미드를 절단, 분석하여 IL20GCSF가 삽입된 것을 선별하여 YEp2kIL20GC로 명명하였다.

V. pIL20GC 구축

[실시예 28] YEp2kIL20GC 절단

YEp2kIL20GC에서 IL20GCSF-GAPDH 전사 종결체를 얻기 위하여 제한효소 KpnI, SalI으로 37℃에서 1시간 동안 절단하였다. 절단된 플라스미드를 상기의 방법으로 분리하여 약0.66kb의 밴드를 정제하였다.

[실시예 29] YEpGalMF 절단

YEpGalMF 1㎍을 제한효소 KpnI, SalI 으로 37℃에서 1시간 동안 절단하였다. 절단된 플라스미드를 상기의 방법으로 분리, 정제하였다.

[실시예 30] DNA 연결 및 형질전환

상기의 KpnI, SalI 으로 절단한 IL20GCSF-GAPDH 전사종결체와 YEpGgalMF을 연결반응액 30㎕속에서 T₄DNA리가제로 연결시킨 후, 형질전환 시켰다. 콜로니를 배양하여, 플라스미드를 정제하였다. 제한효소로 플라스미드를 절단, 분석하여 IL20GCSF-GAPDH 전사종결체가 삽입된 것을 선별하여 pIL20GC로 명명하였다.

VI. YEpHSPGC의 제조

HSP 150(heat shock protein)은 효모를 37℃~42℃에서 배양할 때 분비되는 당단백질의 일종이다. 이점을 GCSF 발현에 이용하면 쉽게 GCSF의 발현을 조절할 수 있게 된다. 먼저 HSP150의 프로모터의 분비 시그날을 클로닝한 다음 GCSF 유전자를 삽입하여 YEpHSPGC를 제조하였다.

[실시예 31] HSP 150 프로모터 및 선도서열 PCR

HSP 150 프로모터와 선도서열을 PCR하기 위하여 다음과 같은 시발체를 합성하였다.

위의 시발체를 사용하여 S. cerevisiae 게놈 DNA 에서 약 0.4kb의 HSP150프로모터와 선도서열을 PCR하였다. 정제후 KpnI과 SalI으로 절단하였다.

[실시예 32] YEpHSPGC의 제조

YEp2KGC의 MFα1(mating factor)프로모터와 살상독소 선도서열을 잘라 내고, HSP 150 프로모터와 선도서열을 치환하여 YEpHSPGC로 명명하였다.

VII. pIL20GC와 YEp2kIL20GC에 의한 GCSF 발현

[실시예 33] 효모 형질전환

GCSF를 효모에서 발현시키기 위하여 각각 pIL20GC와 YEp2kIL20GC로 형질전환 시켰다.

S. cervisidae 2805(a, pep4:: HIS3, pro 1 - δ, can1, GAL1, his3δ, ura3-52)를 3ml YEPD(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당)배지에 접종하여 30℃ 250rpm에서 하룻밤 배양하였다. 15ml YEPD에 재접종하여 OD₆₀₀이 약 1 정도가 되었을 때, 원심분리후 알칼리 양이온-효모 형질전환 키드(Bio 101)방법[Alcali Cation-Yeast transfrom kit (Bio 101) protocol]에 따라 형질전환가능한(competent)효모를 만들었다. 효모 펠렛을 TE완충액으로 세척 후, 리튬-아세테이트에 현탁하여 30℃, 120rpm에서 배양하였다.

현탁액을 원심분리하여 펠렛을 TE 완충액에 현탁시켜, 형질 전환시킬 클라스미드, 운반체 DNA, 히스타민이 들어 있는 에펜도르프 튜브에 넣어 섞어 주었다. 42℃에서 5분간 열충격을 실시하고 원심분리후, SOS배지 200㎕에 현탁시켜 SD한천 고형 배지[0.8g/l Yeast Nitrogen Base without Amino Acid(DIFCO), 2%포도당 1.5% 아가]에 도말하여 30℃에서 약 3일간 배양하여 URA⁺콜로니를 선별하였다. pIL20GC로 형질전환된 효모를 Saccharomyces cerevisiae GC1, YEp2kIL20GC로 형질전환된 효모를 Saccharomyces cerevisiae K2GC라고 각각 명명하고, 1995년 9월 27일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 0193BP, KCTC1095BP).

[실시예 34] GCSF 발현

콜로니를 SD배지에 접종하여 30℃, 250rpm에서 하룻밤 배양하였다.

배양액을 원심분리한 후 펠렛을 1ml YEPGal (1% 효모추출액, 2% 펩톤, 2% 갈락토즈)배지에 현탁시켜, 30℃, 250rpm 에서 약 15시간 배양하여 GCSF를 유도하였다. 유도 배양액을 원심분리한 후, 상층액 0.5ml을 BSA 100㎍/ml 존재하에서 10% TCA로 얼음에 20분 방치한 후 13000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 GCSF 를 침전시켰다. 펠렛에 20㎕의 증류수와 20㎕ 2X SDS 염료[125mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 2-메르캅토에탄올]를 가하여 녹인 후, 16%)]로 전기영동을 하여 쿠마시로 염색하였다. 결과 GCSF 17.3kDa의 밴드가 보였다.

VIII. YEpHSPGC에 의한 GCSG의 발현

[실시예 35] 효모형질환 및 GCSF의 발현

YEpHSPGC를 알칼리 양이온 효모 형질환 키트 Bio 101 [Alcali-Cation yeast transform kit (Bio 101)]를 이용하여 S. cerevisiae 2805에 형질전환시켜 Ura⁺선별을 실시하고, YEpHSPGC로 형질전환된 효모를 Saccharomyces cerevisiaeHGCA라고 명명하고 1995년 9월 27일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호 KCTC 0193BP).

Uracil이 없는 SD배지에서 자란 효모 콜로니를 3ml 액체 배지에 접종하여 36℃, 250rpm 에서 하룻밤 배양하였다.

배양액을 원심분리하여 펠렛을 1ml YEP Gal[1% 효모추출액, 2% 펩톤, 2%갈락토즈]에 현탁시킨 후 37℃, 250rpm에서 18시간 발현시켰다.

원심분리후 펠렛과 상층액으로 나누고, 각각에 SDS 염료를 가하여 16% SDS-PAGE를 수행하여 단백질을 분석 하였다. 상층액에서는 유도에 의해 생긴 단백질 밴드가 보이지 않았으나, 펠렛에서는 새로운 주요밴드가 20.1KDa에 나타났다. 이 새로운 밴드가 GCSF인지 확인하기 위하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. SDS-PAGE후 니트로셀루로스 필터에 옮긴 다음 GCSF Ab(RD system)와 항 마우스(IgG-알카라인 포스파타제를 이용하여 검출 하였다. 결과 20KDa에 주요 밴드가 나타났다.

IX. 발현된 GCSF 단백질의 정제

실시예 36 황산암모늄 침전

효모 세포 배양액을 10,000xg에서 10분간 원심분리하여 효모세포를 제거하였다. 효모세포가 제거된 상등액을 얻은 후 여기에(NH₄)₂SO₄를 85%로 포화시켜 24시간 4℃에서 방치시킨 후 생성된 침전물을 10,000xg 에서 30분간 원심분리하여 회수 하였다. 펠렛을 50mM Tris(pH 7.8), 0.1mM EDTA, 1mM DTT 완층용액에 녹이고 불용성 물질을 10,000xg 에서 10분간 원심분리 하여 제거시켰다. 위의 모든 과정은 4℃에서 실시하였다(제7도).

이렇게 얻은 조 GCSF를 다음 정제과정인 젤-침투 크로마토그라피(gel-permeation chromatography)의 시료로 사용하였다.

[실시예 37] 젤 침투 크로마토그라피(gel-permeation chromatography)

젤 침투 크로마토그라피를 위한 메디아로서 세파크릴-S-200(Pharmacia 제품)을 50mM Tris(pH 7.8), 1mM DTT, 0.1mM EDTA 완충액으로 세척한 후 컬럼(1.6 x 100cm)에 충전하여 준비하였다. (NH₄)₂SO4 침전물을 시료료 하여 20ml 배양 브로스를 농축시킨 것을 컬럼에 주입하여 50mM Tris(pH 7.8) 1mM DTT, 0.1mM EDTA 완충액으로 용출하여 280nm에서의 흡광도를 기준으로 각 피크를 모아 냉동건조하여 농축하였다. 각 피크를 SDS-PAGE로 분석한 결과 첫번째 피크에서 GCSF 밴드와 오염된 단백질들이 검출 되었고, 두번째 큰 피크에서 배지성분 단백질이 검출되었다(제8도). 세파크릴 S-200젤 침투 크로마토그라피를 통하여 대부분의 배지단백질을 제거할 수 있었다. 젤 침투 크로마토그라피로 부분적으로 분리된 GCSF 를 시료로 하여 C4역상 HPLC를 실시하였다.

[실시예 38] C4 역상 HPLC

젤 침투 크로마토그라피를 통하여 부분적으로 정제된 GCSF를 C4컬럼을 이용한 역상 HPLC 방법으로 순수하게 정제하였다. 사용한 C4 컬럼은 Vydac사 제품이고 컬럼 굵기는 1.0 x 25cm 이다. 유속은 2ml/min으로 하였다. 시료 약 100㎍을 컬럼에 주입 후 0.1%TFA(물에서)를 5분간 용출시킨 뒤, 0.1% 뒤(아세토니트릴에서)을 0에서 100%로 이르는 선상구배로 용출시켰다. GCSF는 0.1% TFA(아세토니트릴에서) 90%에서 용출 되었다. SDS-PAGE로 분석한 결과 GCSF는 순수하게 분리되었음을 확인 할 수 있었다.(제9도).

유도 배양 브로스에서 C4 역상 HPLC까지 이르는 정제과정의 GCSF 수율은 8%이었으며, 유도 배양 브로스 1L당 정제된 GCSF 약 1.6mg 을 얻을 수 있었다.

X. 정제된 GCSF의 N-말단 아미노산 분석

[실시예 39]

C4 역상 HPLC로 분리된 GCSF를 PVDF막에 블럿하여 N-말단 아미노산 시퀀싱을 수행하였다. 다음 실험조건에서 확인된 바와같이 순수한 GCSF의 N-말단 아미노산 서열과 일치하였다(NH₂-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-COOH).

(이 분석은 기초과학 지원 연구소 서울 분소에 의뢰하여 실시하였음).

분석에 사용한 단백질 시퀀싱하는 기구의 모델명은 Milligen 6600B이며 에드만 분해방법(Edman degradation method)으로 PTH-아미노산 유도체를 만든 뒤 HPLC로 분석 하였다.

이동상 A : 35mM 암모늄 아세테이트 완충액 (pH 4.8)

이동상 B : 100% 아세토니트릴

온도 : 50℃

또한 폴리머 커플링방법을 사용하여 아미노산 서열을 결정하였다. 막(membrane disk, PVDF)를 핀셋으로 잡고 A)용액을 양쪽면에 5ml 씩 스폿팅한 후 드라이어로 15~20초간 건조시킨다. 55℃ 열판 위에 놓고, B)용액을 30ml스폿팅한 후 7분간 건조시킨다 (10분은 초과하지 않는다).

막(Membrane disk)을 핀셋으로 잡고, C)용액을 5ml씩 양쪽면에 스폿팅한 후 드라이어로 15~20초간 건조시킨다. 55℃ 열판 위에 놓고, D용액 30ml을 스폿팅한 후 5분간 건조시키고, B)용액 20ml을 스폿팅한 후 5분간 건조시킨다. 에탄올, 물, 메탄올로 세척한다.

A) PITC 용액(에틸아세테이트중 10nmol/㎕)

B) 완충용액(50% v/v 메탄올중 2% v/v 트리에틸아민)

C)DITC 용액(에틸아세테이트에 0.1% w/v)

D)중합체 용액[(B 용액중 0.1% w/v 폴리아릴아민 하이드로클로라이드(저분자량)]

상기의 방법으로 아미노산 서열을 분석한 결과 첫번째 사이클에서 스레오닌, 번째 싸이클에서 프롤린, 세번째 싸이클에서 루신, 네번째 싸이클에서 클라이신, 다섯번째 싸이클에서 프롤린이 검출되었다. 따라서, 본 발명에서 제조된 GCSF는 NH-Thr-pro-Leu-Gly-Pro에 해당되는 아미노산 서열을 가지고 있으며, 이는 생리활성을 지닌 순수한 인간 GCSF와 일치하였다.

Claims (11)

1. GAL1-10UAS 조절부위와 MFα-인자 프로모터의 복합 프로모터인 효모 유래 프로모터와 살상독소 분비시그날 및 IL-1β의 아미노말단으로 구성된 효모 유래 분비시그날을 포함하는 것을 특징으로 하는 제11도의 제한효소 지도를 갖는 발현벡터 YEpαkt.
2. 제1항에 있어서, 살상독소 분비시그날은 효모에서 대량으로 발현되는 단백질의 코돈으로 최적화시킨 살상독소 분비시그날인 것을 특징으로 하는 발현벡터 YEpαkt.
3. 제1항의 효모 유래 프로모터와 효모유래 분비시그날외에 GDPH 전사종결체와 GAL4유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제12도의 제한지도를 갖는 발현벡터 YEp2-k.
4. 제13도의 제한지도를 갖는 발현벡터 YEp2kIL20GC.
5. 제14조의 제한지도를 갖는 발현벡터 pIL20GC.
6. 발현벡터 YEp2kIL20GC로 Saccharomyces cerevisiae를 형질전환시켜 얻은 형질전환체 Saccharomyces cerevisiae K2GC(수탁번호 KCTC 0190BP).
7. 발현벡터 pIL20GC로 Saccharomyces cerevisiae를 형질전환시켜 얻은 형질전환체 Saccharomyces cerevisiae GC1(수탁번호 KCTC 0193BP).
8. 제3항의 발현벡터 YEp2-k의 MFα1 프로모터와 살상독소 선도서열을 열충격단백질(Heat shock Protein) 150의 프로모터와 선도서열로 치환한 제15도의 제한 지로를 갖는 발현벡터.
9. 제16도의 제한 지도를 갖는 발현벡터 YEpHSPGC.
10. 발현벡터 YEpHSPGC로 Saccharomyces cerevisiae를 형질전환시켜 얻은 형질전환체 Saccharomyces cerevisiae HGCA(수탁번호 KCTC 0194BP).
11. 제6항, 제7항 또는 제10항의 형질전환체를 배양하여 GCSF를 제조하는 방법.