KR102466926B1 - 하이드로포빈의 가용성 발현 방법 및 정제 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하이드로포빈의 가용성 발현 방법 및 정제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하이드로포빈을 포함하는 재조합 융합 단백질을 숙주 세포에서 가용성으로 발현시킨 후, 정제하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 하이드로포빈 가용성 발현 및 정제 방법에 의해, 종래 봉입체의 형태로 발현되었던 하이드로포빈을 가용성 발현을 통해 수득, 정제함으로써, 종래의 단백질 재접힘(refolding) 단계가 필요 없어짐에 따라, 가용성 발현된 하이드로포빈을 용이하고 높은 효율로 정제 수득할 수 있다.
Description
본 발명은 하이드로포빈의 가용성 발현 방법 및 정제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하이드로포빈을 포함하는 재조합 융합 단백질을 숙주 세포에서 가용성 발현 후, 정제하는 방법에 관한 것이다.
하이드로포빈(hydrophobin)은 치마버섯(Shizophyllum commune)에서 최초로 분리된 작은 단백질이다. 하이드로포빈은 100 내지 150 여 개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 주로 균사형 곰팡이에서만 발현되는 특징이 있다. 진균류의 균사 형성 과정에서 하이드로포빈은 소수성으로 단량체가 외부에 분비될 때 자가조립(self-assembly)을 통해 소수성 표층을 형성하며, 결국 양친매성 다량체 구성을 통해 균사 표면을 코팅하는 작용을 수행한다. 상기 작용을 통해 주변 환경 변화에 대한 효과적인 대응을 가능하도록 할 뿐만 아니라, 세포벽과 공기층, 또는 세포벽과 고체 표면 간 계면에 위치하여, 포자 형성, 자실체 발달 및 숙주 침입을 통한 감염 구조 형성 과정에서 방어 기능을 발휘하는 것으로 알려져 있다(Bayry et al., 2012).
하이드로포빈은 단백질 분자 내에 포함된 8개의 시스테인 잔기(cysteine residue)로부터 4개의 이황화 결합을 분자 내에 형성하며, 이는 하이드로포빈에서 계면활성제와 유사한 활성을 부여하는 양친매성 3차 구조의 안정화에 중요한 역할을 수행하며, 친수성-소수성 계면에서 양친매성 단일층으로의 자가조립을 가능하도록 한다. 하이드로포빈은 소수성 플롯(hydropathy plot), 용해도, 자가조립 중 형성되는 구조에 따라 클래스 I(Class I) 및 클래스 II(Class II)로 구분되며, 모두 친수성-소수성 계면에서 양친매성 단일층을 형성하지만, 클래스 I 하이드로포빈은 친수성-소수성 계면에서 불용성인 아밀로이드 유사 로드릿(rodlets)을 형성하는 반면, 클래스 II 하이드로포빈은 용해성이 높은 단일층을 형성한다.
상기와 같은 특징으로 인해, 하이드로포빈이 생물 소재 산업에서 주목 받고 있으며, 이를 통해 안정되고 균일한 거품이 요구되는 화장품 또는 식음료 등에서의 용도로 활용하고자 하는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 이외에도, 하이드로포빈은 의료용 코팅제, 생체적용 나노 구조물을 위한 기능성 입자 등 다양한 산업 분야에서 차세대 혁신 소재로서 대두되고 있다.
현재까지 하이드로포빈은 원 균주인 곰팡이 자체를 이용하여 생산하는 방법 이외에, 박테리아, 식물 세포, 효모 등을 이용하는 방법 등이 시도되고 있으며, 특히 박테리아에서는 봉입체(inclusion body) 형태로 생산되는 단백질을 정제하여 사용하고 있다. 이 경우, 최종 하이드로포빈 단백질의 수득을 위해 변성/재생(refolding) 과정이 필수로 요구되며, 이는 대규모 하이드로포빈 생산에 있어 비용 부담의 현저한 증가를 의미한다.
실예로, 2009년 BASF SE.에 의해 2가지 재조합 클래스 I 하이드로포빈인 H*Protein A(yaaD-A. nidulans DewA-His6) 및 H*Protein B(절단된 yaaD- A. nidulans DewA-His6)이 박테리아를 숙주로 이용하여 산업적 이용이 가능한 정도로 생산이 가능하다는 보고가 있었으나, 이 경우에도 하이드로포빈이 봉입체 형태로 제조되는 것이며, 현재까지 재조합 하이드로포빈의 가용성 발현을 성공적으로 수행한 예는 보고된 바가 없다(Wendel et al. 2010)
상기 문제와 함께 종래 하이드로포빈은 정제 시 HPLC, 계면활성제를 이용하는 이상분리법이 주로 사용되었으나, 절차가 복잡하고 취급이 용이하지 않은 화학물질의 사용으로 인해 정제시 시간과 비용이 많이 필요한 단점이 있어, 이에 대한 해결이 절실한 상황이다.
Bayry J. et al. PLOS Pathog 8(5):e1002700 (2012).
Linder M. B. et al. FEMS Microbiol Rev 29(5):877-896 (2005).
Kwan AHY et al. PNAS USA 2006; 103:3621 LP 3626 (2006).
Wendel W. et al. Eur. Biophys. J. 39:457-468 (2010).
상기와 같은 문제의 해결을 위해, 본 발명은 이종 숙주로부터 하이드로포빈의 가용성 발현을 위한 재조합 단백질 및 이의 제조방법을 제공하며, 상기 제조방법을 통한 가용성 하이드로포빈의 정제 방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 융합 단백질은 목적 단백질 및 상기 목적 단백질의 N-말단에 융합된 번역 속도 조절용 램프 태그(ramp tag)를 포함하는 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질로서, 상기 목적 단백질은 N-말단의 신호 서열(signal sequence)에 변이가 가해진 것이다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질에 있어서, 상기 목적 단백질은 하이드로포빈(hydrophobin)일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질에 있어서, 상기 목적 단백질은 클래스 I 하이드로포빈일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질에 있어서, 상기 목적 단백질은 DewA일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질에 있어서, 상기 목적 단백질의 야생형은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질에 있어서, 상기 목적 단백질은 상기 목적 단백질은 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질에 있어서, 상기 램프 태그는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질에 있어서, 상기 신호 서열은 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질에 있어서, 상기 변이는 신호 서열의 일부 또는 전체 아미노산의 치환, 결실, 및 신규 아미노산의 추가로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 염기서열이 도입된 재조합 융합 단백질의 가용성 발현용 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 재조합 융합 단백질의 가용성 발현용 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질 정제 방법은 a) 목적 단백질 및 상기 목적 단백질의 N-말단에 융합된 번역 속도 조절용 램프 태그를 포함하는 재조합 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 도입한 벡터를 인간을 제외한 숙주 세포에 형질전환하여 재조합 융합 단백질을 발현하는 단계; 및 b) 상기 발현된 재조합 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성 단백질 정제 방법에서, 상기 b) 단계는, b1) 상기 형질전환체 세포를 현탁 후 파쇄하고 원심분리하여 제 1 상등액을 얻는 단계 b2) 상기 제 1 상등액에 제 1 용매를 첨가하여 얻은 제 1 혼합물을 진탕 후 원심분리하여 제 2 상등액을 얻는 단계 및 b3) 상기 제 2 상등액에 제 2 용매를 첨가하여 얻은 제 2 혼합물을 진탕 후 원심분리하여 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질 정제 방법에 있어서, 상기 목적 단백질은 하이드로포빈일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질 정제 방법에 있어서, 상기 목적 단백질은 클래스 I 하이드로포빈일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질 정제 방법에 있어서, 상기 목적 단백질은 DewA일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질 정제 방법에 있어서, 상기 목적 단백질의 야생형은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질 정제 방법에 있어서, 상기 목적 단백질은 상기 목적 단백질은 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질 정제 방법에서, 상기 램프 태그는 숙주 세포의 희귀 코돈(rare codon)의 수집을 통해 얻을 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질 정제 방법에서, 상기 숙주 세포는 에스케리치아 속(Escehreichia sp.), 살모넬라 속(Salmonellae sp.), 예르시니아 속(Yersinia sp.), 쉬겔라 속(Shigella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 속 (Proteus sp.) 또는 클레브시엘라 속(Klebsiella sp.)의 박테리아일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질 정제 방법에서, 상기 제 1 용매 및 제 2 용매는 각각 C3 유기 용매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질 정제 방법에서, 상기 제 1 상등액에 혼합하는 유기 용매의 부피비는 1:2 내지 1:3일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질 정제 방법에서, 상기 램프 태그는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질 정제 방법에서, 상기 희귀 코돈의 수집은 코돈의 빈도수 및 이소수용체(isoacceptor) tRNA 유전자 수를 분석하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질 정제 방법에서, 상기 코돈의 빈도 수는 0.1 내지 1%일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질 정제 방법에서, 상기 이소수용체 tRNA 유전자 수는 0 내지 2개일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질 정제 방법에서, 상기 목적 단백질은 호르몬류 및 이의 수용체, 생물학적 반응 조절물질(biological response modifier) 및 이의 수용체, 사이토카인류 및 이의 수용체, 효소류, 항체류, 항체 단편류를 포함하는 생리활성 단백질일 수 있다.
본 발명의 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질 정제 방법은 상기 정제 방법을 통해 정제된 것이다.
본 발명의 하이드로포빈 가용성 발현 및 정제 방법에 의해, 종래 봉입체의 형태로 발현되었던 하이드로포빈을 가용성 발현을 통해 수득, 정제함으로써, 종래의 단백질 재접힘(refolding) 단계가 필요 없어짐에 따라, 가용성 발현된 하이드로포빈을 용이하고 높은 효율로 정제 수득할 수 있게 되었다.
도 1은 하이드로포빈의 가용성 발현을 위한 재조합 융합 단백질 구조의 모식도이다.
도 2는 하이드로포빈의 가용성 발현 확인을 위해 (a) 37℃ 및 (b) 18℃에서 배양한 후의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 3은 본 발명에 따라 발현된 가용성 하이드로포빈의 정제 과정 흐름의 일 예시이다.
도 4는 본 발명에 따라 정제된 가용성 하이드로포빈의 정제 효율 확인을 위한 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 5는 종래 공지된 트리톤 X-114를 이용한 이상분리법에 의한 하이드로포빈의 정제 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 트리톤 X-114를 이용한 이상분리법에 의해 정제된 하이드로포빈의 정제 효율 확인을 위한 SDS-PAGE 결과이다.
도 2는 하이드로포빈의 가용성 발현 확인을 위해 (a) 37℃ 및 (b) 18℃에서 배양한 후의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 3은 본 발명에 따라 발현된 가용성 하이드로포빈의 정제 과정 흐름의 일 예시이다.
도 4는 본 발명에 따라 정제된 가용성 하이드로포빈의 정제 효율 확인을 위한 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 5는 종래 공지된 트리톤 X-114를 이용한 이상분리법에 의한 하이드로포빈의 정제 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 트리톤 X-114를 이용한 이상분리법에 의해 정제된 하이드로포빈의 정제 효율 확인을 위한 SDS-PAGE 결과이다.
이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명에 따른 하이드로포빈의 가용성 발현 방법 및 정제방법에 대해 상세히 설명한다.
다음에 소개되는 도면들은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 이하 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 이하 제시되는 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한 본 발명의 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.
본 발명에서 “목적 단백질(target protein)”은 당해 기술분야의 통상의 기술자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다.
또한, "재조합 단백질(recombinant protein)“또는 ”융합 단백질(fusion protein)"은 최초 목적 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다. 또한 상기 용어는 본 발명의 융합 파트너와 목적 단백질이 연결된 재조합 융합 단백질 형태 또는 단백질 절단 효소에 의해 융합 파트너가 제거된 목적 단백질의 재조합 단백질을 의미한다.
“벡터(vector)” 또는 "발현 벡터(expression vector)"는 유전자 전사와 번역에 제공되는 요소와 추가 단편으로 구성되어 작동 가능하도록 연결된 폴리펩티드를 코딩하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 추가 단편은 프로모터 및 전사 종료 신호서열을 포함한다. 벡터 또는 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점과 하나 이상의 선택 마커 등을 포함한다. 벡터 또는 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 포함한다.
또한 본 발명의 명세서에서, “포함한다”는 표현은 “구비한다”, “함유한다”, “가진다” 또는 “특징으로 한다” 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다. 또한 “실질적으로…로 구성된다”는 표현은 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양으로 존재할 수 있는 것을 의미한다. 또한 “구성된다”는 표현은 기재된 요소, 재료 또는 공정만이 존재하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어 “샘플” 또는 “시료”는 분석을 위한 대상을 나타내는 것으로, 명세서에 걸쳐 동일한 의미로 사용되었다.
이하 본 발명의 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질은 목적 단백질 및 상기 목적 단백질의 N-말단에 융합된 번역 속도 조절용 램프 태그(ramp tag)를 포함하는 재조합 융합 단백질로서, 상기 목적 단백질은 N-말단의 신호 서열(signal sequence)에 변이가 가해진 것이다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질에 있어서, 상기 목적 단백질은 하이드로포빈(hydrophobin)일 수 있으며, 보다 바람직한 일 예로는 클래스 I 하이드로포빈(Class I hydrophobin)일 수 있고, 더욱 바람직한 일 예로는 클래스 I DewA(Class I DewA)일 수 있으며, 상기 목적 단백질의 야생형은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 본 발명의 일 실시예로부터, N-말단의 신호 서열에 변이가 가해진 상기 목적 단백질은 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질에 있어서, 상기 램프 태그는 1~20개, 바람직하게는 6~12개, 더욱 바람직하게는 6~8개의 아미노산으로 구성될 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 융합 단백질에 있어서, 상기 램프 태그는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 출원인에 의해 기출원 등록된 대한민국 등록특허공보 제1446054호에 개시된 재조합 단백질의 발현을 위한 번역속도 조절용 램프 태그 및 이용에 사용된 방법 등이 본 출원의 발명의 상세한 설명에 포함된다. 본 발명의 상세한 설명에 해당 내용에 대해 특별한 기재가 없는 경우, 상기 등록특허공보에 사용된 방법 또는 본 발명의 목적에 부합되도록 적절히 변형된 방법 등을 적용할 수 있다.
상기 등록특허공보에 개시된 내용과 관련된 구체적인 일 예시로, 숙주 세포에 따른 희귀 코돈표(rare codon table)을 작성하는 단계; 목적 유전자의 DNA 서열을 코돈 변환하는 단계; 상기 작성된 희귀 코돈표 내의 희귀 코돈이 목적 유전자 ORF(open reading frame)에 출현하는 빈도와 위치를 분석하는 단계; 및 희귀 코돈을 수집하여 배치하는 단계를 포함하는 방법에 의해 번역 속도 조절용 램프 태그(ramp tag)를 제작하고, 이를 이용하여 부가가치가 높으나 발현이 어려운 단백질, 일 예로 에스테라아제(esterase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase), 사이토리신 A(cytolysin A), 재조합 항체(single chain Fv, scFv), 아스파라기나아제 B(asparaginase B), 테트라-세포 접합 분자(T-CAM) 또는 B3(Fv)PE38 등의 효율적 발현 결과를 얻었다.
본 발명에서 상기 램프 태그는 상기 등록특허공보의 번역 속도 조절용 램프 태그를 목적 단백질의 N-말단에 융합하는 형태로 제작될 수 있으며, 이를 통해 상기 재조합 융합 단백질에 포함될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질에 있어서, 상기 신호 서열은 일 예로 외분비 신호 서열 예측 프로그램인 SignalP(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0) 등 통상의 방법을 이용하여 확인할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 일 실시예로부터, 상기 신호 서열은 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질에 있어서, 상기 변이는 신호 서열의 일부 또는 전체 아미노산의 치환, 결실, 및 신규 아미노산의 추가로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예로부터, 상기 변이는 신호 서열의 일부 또는 전체 아미노산의 결실일 수 있으며, 일 예로, 1 번째 아미노산에서 18 번째 아미노산까지 결실된 서열일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따른 구체적인 예로, 표 1에서 서열번호 1의 밑줄친 부분에 해당하는 전체 신호 서열의 결실을 들 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예로부터, 도 1은 목적 단백질의 가용성 발현을 위한 재조합 융합 단백질의 구조에 대한 일 예시를 나타내고 있다. 이로부터, 상기 램프 태그는 목적 단백질로 사용된 하이드로포빈(hydrophobin)의 N-말단에 융합되고, 상기 하이드로포빈은 신호 서열(signal sequence)의 전체가 결실되었으며, 상기 목적 단백질로 사용된 하이드로포빈의 C-말단에는 단백질의 검출, 정제 등을 위해 사용될 수 있는 다양한 종류의 아미노산 서열이 융합될 수 있으며, 일 예로, His tag, T7 tag, S-tag, Flag-tag, HA-tag, V5 epitope, PelB 및 Xpress epitope로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 태그 또는 단백질이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 6 개의 히스티딘으로 코딩되는 태그(6 x His tag)에 대한 코돈이 연결될 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
후술하는 실시예로부터 본 발명에 따른 가용성으로 발현되는 재조합 융합 단백질의 경우, 불용성의 봉입체(insoluble inclusion body) 형태로만 발현되던 목적 단백질이 가용성 단백질의 형태로 발현되는 새로운 효과를 확인하였다. 이를 통해, 기존 방법의 단점이었던 단백질 재접힘(protein refolding) 등의 근본적 문제를 해결하여, 본래의 활성을 갖는 목적 단백질을 높은 수율로 얻을 수 있음을 확인하였고, 또한 종래 불용성 봉입체 형태의 목적 단백질의 정제 과정 대비 현저히 간소화된 과정 및 높은 분리 효율로의 정제가 가능한 과정을 확립하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 상기 재조합 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 제공한다. 본 발명의 일 실시예로부터, 일 예로 상기 염기서열은 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 염기서열이 도입된 단백질의 가용성 발현용 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 재조합 융합 단백질의 가용성 발현용 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 일 실시예로부터, 상기 형질전환체의 종류는 본 발명의 목적을 달성할 수 있다면 특별히 제한되는 것은 아니나, 유전자 작업이 용이한 개체를 선택하여 사용할 수 있으며, 일 예로 대장균(Escherichia coli) 등이 될 수 있다.
이하 본 발명의 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법은 a) 목적 단백질 및 상기 목적 단백질의 N-말단에 융합된 번역 속도 조절용 램프 태그를 포함하는 재조합 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 도입한 벡터를 인간을 제외한 숙주 세포에 형질전환하여 재조합 융합 단백질을 발현하는 단계 및 b) 상기 발현된 재조합 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 상기 b) 단계는, b1) 상기 형질전환체 세포를 현탁 후 파쇄하고 원심분리하여 제 1 상등액을 얻는 단계 b2) 상기 제 1 상등액에 제 1 용매를 첨가하여 얻은 제 1 혼합물을 진탕 후 원심분리하여 제 2 상등액을 얻는 단계 및 b3) 상기 제 2 상등액에 제 2 용매를 첨가하여 얻은 제 2 혼합물을 진탕 후 원심분리하여 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 상기 목적 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 본 발명의 일 실시예로부터, 상기 목적 단백질은 하이드로포빈(hydrophobin)일 수 있으며, 보다 바람직한 일 예로는 클래스 I 하이드로포빈(Class I hydrophobin)일 수 있고, 더욱 바람직한 일 예로는 클래스 I DewA(Class I DewA)일 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 상기 램프 태그는 숙주 세포의 희귀 코돈(rare codon)의 수집을 통해 얻을 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 상기 숙주 세포는 에스케리치아 속(Escehreichia sp.), 살모넬라 속(Salmonellae sp.), 예르시니아 속(Yersinia sp.), 쉬겔라 속(Shigella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 속 (Proteus sp.) 또는 클레브시엘라 속(Klebsiella sp.) 등에 포함되는 박테리아일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 일 실시예에 따른 구체적인 예로 대장균(Escherichia coli), 보다 구체적으로는 대장균 BL21 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 상기 정제시 유기 용매를 이용하는 이상분리법(two phase separation) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니며, 본 발명에 따른 가용성 단백질을 고효율로 분리할 수 있는 정제 방법이라면 적절히 도입하여 사용할 수 있다.
상기 정제시 유기 용매를 이용하는 경우, 상기 제 1 용매 및 제 2 용매는 각각 C3 유기 용매 등으로부터 선택하여 사용할 수 있다. 상기 제 1 용매 및 제 2 용매의 구체적인 예는 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol) 등이다. 또한, 본 발명의 실시예에 따른 구체적인 예로서, 상기 제1 용매 및 제2 용매로서 이소프로필 알코올을 사용하고 이상분리법을 적용하는 경우, 가용성으로 발현된 목적 단백질을 높은 효율로 분리할 수 있어 바람직하나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질을 상기 이상분리법을 통해 정제한 것은 종래 적용된 바 없는 새로운 시도이며(대한민국 공개특허공보 제2014-0022839호 참조; C1-C3 알코올을 이용한 하이드로포빈 정제 시도는 있었으나, 가용성 발현에 대한 정제 방법은 아님), 이를 통해 가용성 발현 단백질을 고효율로 분리, 정제가 가능한 것을 후술하는 구체적인 실시예 등으로부터 확인하였다. 도 3은 본 발명에 따른 가용성 발현 단백질을 유기 용매를 이용한 이상분리법으로 정제하는 방법의 일 예시를 나타내는 것으로, 상기 방법을 통해 가용성 발현된 단백질을 높은 효율로 정제할 수 있는 것을 확인하였다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 목적 단백질의 가용성 발현 후 수행되는 세포의 회수, 현탁 및 파쇄 등의 공정은, 본 발명의 목적 달성이 가능한 범위에서 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 시약, 방법 등을 적절히 도입하여 수행할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 상기 b1) 단계의 원심분리는 1 내지 10℃, 바람직하게는 2 내지 8℃, 더욱 바람직하게는 3 내지 6℃의 온도 범위에서 수행할 수 있으며, 상기 범위에서 파쇄된 세포로부터 제 1 상등액의 분리가 보다 효과적으로 이루어질 수 있어 바람직하다.
또한, 상기 b2) 및 b3) 단계의 원심분리는 15 내지 28℃, 바람직하게는 17 내지 25℃, 더욱 바람직하게는 19 내지 23℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으며, 상기 범위에서 제 1 혼합물 및 제 2 혼합물 각각에서 제 2 상등액 및 목적 단백질의 분리가 보다 효과적으로 이루어질 수 있어 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 상기 원심분리는 3000 내지 20000 rpm으로 1 내지 90분간 수행될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예로부터, 상기 b1) 단계의 원심분리는 3000 내지 10000 rpm, 바람직하게는 4000 내지 8000 rpm, 더욱 바람직하게는 5000 내지 7000 rpm으로 수행할 수 있으며, 이를 40 내지 80분, 바람직하게는 45 내지 75분, 더욱 바람직하게는 50 내지 70분 동안 수행할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니며, 상기 범위에서 파쇄된 세포로부터 제 1 상등액의 분리가 보다 효과적으로 이루어질 수 있어 바람직하다.
또한, 상기 b2) 단계의 원심분리는 6000 내지 15000 rpm, 바람직하게는 7500 내지 13500 rpm, 더욱 바람직하게는 8500 내지 11500 rpm으로 수행할 수 있으며, 이를 40 내지 80분, 바람직하게는 45 내지 75분, 더욱 바람직하게는 50 내지 70분 동안 수행할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니며, 상기 범위에서 파쇄된 세포로부터 제 2 상등액의 분리가 보다 효과적으로 이루어질 수 있어 바람직하다.
또한, 상기 b3) 단계의 원심분리는 6000 내지 15000 rpm, 바람직하게는 7500 내지 13500 rpm, 더욱 바람직하게는 8500 내지 11500 rpm으로 수행할 수 있으며, 이를 1 내지 20분, 바람직하게는 4 내지 16분, 더욱 바람직하게는 7 내지 13분 동안 수행할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니며, 상기 범위에서 파쇄된 세포로부터 목적 단백질의 분리가 보다 효과적으로 이루어질 수 있어 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 상기 제 1 상등액에 혼합하는 유기 용매의 부피비는 1:1.5 내지 1:4, 바람직하게는 1:2 내지 1:3.5, 더욱 바람직하게는 1:2 내지 1:3의 비율일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 일 실시예에 따른 구체적인 예로는 1:2.5의 비율을 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 일 에에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 상기 제 2 상등액에 혼합하는 유기 용매의 부피비는 1:0.5 내지 1:1.5, 바람직하게는 1:0.6 내지 1:1.4, 더욱 바람직하게는 1:0.8 내지 1:1.2의 비율일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 일 실시예에 따른 구체적인 예로는 1:1의 비율을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 상기 목적 단백질은 하이드로포빈(hydrophobin)일 수 있으며, 보다 바람직한 일 예로는 클래스 I 하이드로포빈(Class I hydrophobin)일 수 있고, 더욱 바람직한 일 예로는 클래스 I DewA(Class I DewA)일 수 있으며, 상기 목적 단백질의 야생형은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 본 발명의 일 실시예로부터, N-말단의 신호 서열에 변이가 가해진 상기 목적 단백질은 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 상기 램프 태그는 1~20개, 바람직하게는 6~12개, 더욱 바람직하게는 6~8개의 아미노산으로 구성될 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 융합 단백질에 있어서, 상기 램프 태그는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 상기 희귀 코돈의 수집은 코돈의 빈도수 및 이소수용체(isoacceptor) tRNA 유전자 수를 분석하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 상기 코돈의 빈도 수는 0.05 내지 3%, 바람직하게는 0.1 내지 1%일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 상기 이소수용체 tRNA 유전자 수는 0 내지 2개일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 상기 목적 단백질은 호르몬류 및 이의 수용체, 생물학적반응 조절물질(biological response modifier) 및 이의 수용체, 사이토카인류 및 이의 수용체, 효소류, 항체류, 항체 단편류를 포함하는 생리활성 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법에서, 상기 목적 단백질의 구체적인 일 예로 하이드로포빈(hydrophobin), GST, MBP, NusA, CBP, GFP, Thioredoxin, Mistic, Sumo 및 DSB 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 더욱 구체적으로는 하이드로포빈(hydrophobin)을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[시약, 재료 및 프로토콜]
- 목적 단백질: GenBank ID: gi67902037, 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans) 유래의 클래스 I 하이드로포빈 DewA(BASF, 2009)이며, 상기 GenBank의 유전 정보에 기초하여 ㈜ 바이오니아(대전, 대한민국)에 의뢰하여 합성하여 사용하였다.
- 램프 태그(ramp-tag): 대한민국 등록특허공보 제1446054호에 기재된 대장균의 코돈 용법 분석을 방법으로 제작하여 사용하였다..
- pET24a 플라스미드 벡터: New England Labs (UK)에서 구입하여 사용하였다.
- 기타 시약은 Sigma Aldrich (US) 등에서 구입하여 사용하였다.
[시험예 1] 재조합 융합 단백질 발현을 위한 유전자 조작
종래 불용성 봉입체 형태로 발현되던 목적 단백질의 가용성 발현을 확인하기 위해, 목적 단백질로는 A. nidulans 유래의 클래스 I 하이드로포빈 DewA을 이용하였으며, 이의 염기서열 및 아미노산 서열을 하기 표 1에 도시하였다.
| 서열번호 | 구분 | 서열 (5' -> 3') |
| 1 | DewA 염기서열 | atgcgcttcatcgtctctctcctcgccttcactgccgcggccaccgcaaccgccctcccggcctctgccgcaaagaacgcgaagctggccacctcggcggccttcgccaagcaggctgaaggcaccacctgcaatgtcggctcgatcgcttgctgcaactcccccgctgagaccaacaacgacagtctgttgagcggtctgctcggtgctggccttctcaacgggctctcgggcaacactggcagcgcctgcgccaaggcgagcttgattgaccagctgggtctgctcgctctcgtcgaccacactgaggaaggccccgtctgcaagaacatcgtcgcttgctgccctgagggaaccaccaactgtgttgccgtcgacaacgctggcgccggtaccaaggctgagtaa |
| 2 | DewA 아미노산 서열 | MRFIVSLLAFTAAATATALPASAAKNAKLATSAAFAKQAEGTTCNVGSIACCNSPAETNNDSLLSGLLGAGLLNGLSGNTGSACAKASLIDQLGLLALVDHTEEGPVCKNIVACCPEGTTNCVAVDNAGAGTKAE |
| 3 | DewA 신호 서열 (전체 염기서열)a | atgcgcttcatcgtctctctcctcgccttcactgccgcggccaccgcaaccgccctcccggcctctgccgca |
| a상기 신호서열은 외분비 신호서열 예측 프로그램인 SignalP (Ver 4.0)을 이용하여 예측된 서열이다. | ||
상기 신호 서열의 일부 또는 전체 결실은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 통상적인 중합효소연쇄반응(PCR) 방법을 이용하여 수행하였다.
또한, 상기 목적 단백질인 클래스 I 하이드로포빈인 DewA의 N-말단에 결합되는 램프 태그 서열은 대한민국 등록특허공보 제1446054호에 기재된 희귀 코돈의 분석 방법을 적용하여 제작하였으며, 그 염기서열 및 아미노산 서열을 하기 표 2에 도시하였다.
| 서열번호 | 구분 | 서열 (5' -> 3') |
| 4 | 램프 태그 염기서열 | cttcacagtcctaatccc |
| 5 | 램프 태그 아미노산 서열 | LPASAA |
| 6 | 6 x His Tag 염기서열 | caccaccaccaccaccac |
상기 표 1의 클래스 I 하이드로포빈 DewA의 염기서열에서, 신호 서열의 일부 또는 전체가 결실된 실험군을 제작하여, 신호 서열이 변이된 하이드로포빈 DewA의 서열을 각각 서열번호 7부터 하기 표 3과 같이 부여하였다.
| 서열번호 | 실험군 | 변이된 하이드로포빈 염기서열 및 아미노산 서열 (5' -> 3') |
| 7 | 실시예 1 | aagaacgcgaagctggccacctcggcggccttcgccaagcaggctgaaggcaccacctgcaatgtcggctcgatcgcttgctgcaactcccccgctgagaccaacaacgacagtctgttgagcggtctgctcggtgctggccttctcaacgggctctcgggcaacactggcagcgcctgcgccaaggcgagcttgattgaccagctgggtctgctcgctctcgtcgaccacactgaggaaggccccgtctgcaagaacatcgtcgcttgctgccctgagggaaccaccaactgtgttgccgtcgacaacgctggcgccggtaccaaggctgagtaa |
| 8 | KNAKLATSAAFAKQAEGTTCNVGSIACCNSPAETNNDSLLSGLLGAGLLNGLSGNTGSACAKASLIDQLGLLALVDHTEEGPVCKNIVACCPEGTTNCVAVDNAGAGTKAE | |
| 9 | 실시예 2 | ctcccggcctctgccgcaaagaacgcgaagctggccacctcggcggccttcgccaagcaggctgaaggcaccacctgcaatgtcggctcgatcgcttgctgcaactcccccgctgagaccaacaacgacagtctgttgagcggtctgctcggtgctggccttctcaacgggctctcgggcaacactggcagcgcctgcgccaaggcgagcttgattgaccagctgggtctgctcgctctcgtcgaccacactgaggaaggccccgtctgcaagaacatcgtcgcttgctgccctgagggaaccaccaactgtgttgccgtcgacaacgctggcgccggtaccaaggctgagtaa |
| 10 | LPASAAKNAKLATSAAFAKQAEGTTCNVGSIACCNSPAETNNDSLLSGLLGAGLLNGLSGNTGSACAKASLIDQLGLLALVDHTEEGPVCKNIVACCPEGTTNCVAVDNAGAGTKAE | |
| 1 | 비교예 1 | atgcgcttcatcgtctctctcctcgccttcactgccgcggccaccgcaaccgccctcccggcctctgccgcaaagaacgcgaagctggccacctcggcggccttcgccaagcaggctgaaggcaccacctgcaatgtcggctcgatcgcttgctgcaactcccccgctgagaccaacaacgacagtctgttgagcggtctgctcggtgctggccttctcaacgggctctcgggcaacactggcagcgcctgcgccaaggcgagcttgattgaccagctgggtctgctcgctctcgtcgaccacactgaggaaggccccgtctgcaagaacatcgtcgcttgctgccctgagggaaccaccaactgtgttgccgtcgacaacgctggcgccggtaccaaggctgagtaa |
[실시예 1]
상기 서열번호 1의 염기서열에서 신호 서열 전체가 결실된 서열번호 7의 염기서열, 서열번호 4의 램프 태그 염기서열, 서열번호 6의 6 x His Tag 서열을 도 1의 모식도에 나타난 순서와 같이 합성한 후, pET24a 플라스미드 벡터에 통상의 클로닝 방법을 사용하여, 재조합 발현 벡터(pET24a-Ramp-DewA(-ss)-6xHis)를 제조하였다.
[실시예 2]
상기 실시예 1에서 변이된 하이드로포빈의 염기서열만 서열번호 8로 상이하며, 다른 과정및 조건은 동일하게 하여 재조합 발현 벡터를 제조하였다.
[비교예 1]
상기 실시예 1에서, 신호 서열의 변이가 일어나지 않은 것(서열번호 1)을 제외하고 다른 과정 및 조건은 동일하게 하여 재조합 발현 벡터(pET24a-Ramp-DewA-6xHis)를 제조하였다.
[시험예 2] 재조합 융합 단백질의 가용성 발현 여부 확인
상기 표 3의 각 실험군에 대하여, 재조합 융합 단백질의 가용성 발현 여부를 확인하기 위해 각각의 재조합 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환한 후, 카나마이신 100 ug/mL이 첨가된 한천(agar)이 포함된 고체 LB 배지(10 g/L NaCl, 10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출물)에 접종하고 37℃에서 12시간 고체 배양하였다.
이후, 각 실험군에 대해 3.5 mL 액체 LB 배지 배지에 각각 3개의 단일 콜로니(#1, #2, #3)를 각각 접종하여, 37℃에서 220 rpm으로 5~6 시간 동안 전배양하였다.
전배양이 완료된 배양액 100 uL를 카나마이신 100 ug/mL이 혼합된 새로운 LB 배지 3.5 mL에 계대한 후, 37℃에서 220 rpm으로 배양하여, 600 nm에서의 흡광도(OD600)가 0.7 정도에 도달하였을 때 0.2 mM IPTG(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 발현을 유도하였다.
상기 IPTG 첨가 후, 각 실험군을 37℃ 및 18℃의 2개 온도 실험군으로 나누어 각 온도에서 250 rpm으로 3시간 동안 목적 단백질인 클래스 I 하이드로포빈 DewA의 발현을 유도하였다.
이후, 각각의 온도에서 배양된 대장균으로부터, 아래 방법으로 발현된 목적 단백질을 회수하였다.
a) 각 배양액 5 mL씩을 4℃에서 13,200 rpm으로 2분간 원심분리하여 침전물을 수득하고, 이를 200 mM Tris-HCl(pH8.0)에 현탁한 후, 2초 펄스(pulse)를 사용하여 20초간 초음파 파쇄하였다.
b) 회수한 세포 파쇄물을 4℃에서 13,200 rpm으로 20분간 원심분리하여, 세포 잔존물(cell debris)이 제거된 제 1 상등액을 수득하였다. 이 때, 세포 파쇄 후, SDS-PAGE 분석을 위한 분석용 샘플(전체 분획; total fraction, T)을 취하고, 상기 세포 파쇄물을 원심분리 한 후 마찬가지로 분석용 샘플(가용성 분획; Soluble fraction, S)를 취하여, SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 나머지 원심분리 후 분획은 불용성 분획(Insoluble fraction, I)을 나타내며, 그 분석 결과를 도 2에 도시하였다.
도 2의 결과로부터, IPTG를 통한 발현 유도 후, 37℃에서 발현한 경우, 비교예 1은 가용성 분획인(S) (5 wt%) 대비 불용성 분획(I)에서의 목적 단백질 DewA 발현량 (95 wt%)이 현저히 많은 것을 확인하였다.
반면, 실시예 1의 경우, 가용성 분획(S) (93 wt%) 대비 불용성 분획(I) (7 wt%)에서의 목적 단백질 DewA 발현량이 현저히 감소하여, 대부분의 DewA 단백질이 가용성 발현된 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 목적 단백질인 클래스 I 하이드로포빈 DewA를 본 발명에 따른재조합 융합 단백질의 제조를 통해 높은 효율로 가용성 발현하였음을 의미하는 것이며, 특히 대장균 총 단백질 대비 15% 이상의 고발현을 나타내어, 고농도 세포 배양(high cell density culture)을 수행할 경우, 1 g/L의 가용성 단백질 생산이 가능한 것을 확인하였다.
또한, 18℃에서 배양한 경우, 비교예 1은 가용성 분획인(S) (거의 없음) 대비 불용성 분획(I)에서의 목적 단백질 DewA 발현량 (~100 wt%)이 대부분을 차지하는 것을 확인하였다.
반면, 실시예 1의 경우, 가용성 분획(S) (95 wt%) 대비 불용성 분획(I) (5 wt%)에서의 목적 단백질 DewA 발현량이 현저히 감소하여, 대부분의 DewA 단백질이 가용성 발현된 것을 확인하였다.
이는 37℃에서의 배양과 유사한 것으로, 배양 온도에 관계없이, 재조합 융합 단백질에서의 신호 서열의 결실과 램프 태그의 융합에 의해, 목적 단백질의 가용성 발현이 가능해진 것을 확인할 수 있었다.
한편, 실시예 2의 경우, 목적 단백질의 DewA의 가용성 발현이 비교예 1에 비해 어느 정도 개선된 것으로 확인되었으나, 목적 단백질의 가용성 발현을 전제로 하는 본 발명의 정제 방법에 적용할 정도는 아닌 것으로 평가되었다(데이터는 나타내지 않음).
상기 결과는 클래스 I 하이드로포빈 DewA의 경우에 대한 결과만을 예시로 기재한 것이나, 하이드로포빈은 분자 내에 8개의 시스테인을 보유하고 있어, 4개의 이황화 결합(disulfide bond; S-S)을 분자 내에 형성한다는 공통적인 특징을 보유하고 있으므로, 상기 결과를 적어도 클래스 I 하이드로포빈, 넓게는 전체 하이드로포빈까지 확장되어 합리적으로 일반화가 가능하다는 것은 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명한 것으로 이해되어야 할 것이다.
[시험예 3] 가용성 발현된 클래스 I 하이드로포빈 DewA의 정제
상기 시험예 1의 각 실험군에 대하여, 시험예 2에서와 같은 방법으로 대장균에서 재조합 융합 단백질을 발현하고, 하기와 같은 정제 단계를 통해 가용성 발현된 목적 단백질인 클래스 I 하이드로포빈 DewA의 정제를 수행하였다.
a) 표 3의 각 실험군과 같은 방법으로 클래스 I 하이드로포빈 DewA를 발현하였다.
b) DewA가 발현된 배양액을 4℃, 6000 rpm으로 원심분리하여 세포를 회수하였다.
c) 회수한 세포를 200 mM Tris-HCl(pH8.0)으로 재현탁하고, 초음파 처리하여 세포를 파쇄하였다. 이 때 전체 분획 샘플을 취하였다.
d) 파쇄된 세포를 4℃에서 10,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리하여 제 1 상등액을 회수하였다. 이 때 가용성 분획 샘플을 취하였다.
e) 상기 제 1 상등액에 제 1 상등액 부피의 2.5배 부피의 이소프로필 알코올을 서서히 첨가하여 제 1 혼합물을 수득하였다.
f) 상기 제 1 혼합물을 30℃에서 200~250 rpm으로 15분간 진탕하였다.
g) 상기 진탕 후, 제 1 혼합물을 20℃ 실온에서 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 제 2 상등액을 회수하였다.
h) 상기 제 2 상등액에 제 2 상등액과 동일한 부피의 이소프로필 알코올을 서서히 첨가하여 제 2 혼합물을 수득하였다.
i) 상기 제 2 혼합물을 30℃에서 200~250 rpm으로 15분간 진탕하였다.
j) 이후, 상기 진탕 후, 제 2 혼합물을 20℃ 실온에서 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 백색 침전 형태의 정제된 목적 단백질인 클래스 I 하이드로포빈 DewA 단백질을 분리하였다.
상기 c), d) 단계에서 수득한 전체 분획 샘플, 가용성 분획 샘플 및 j) 단계에서 수득한 백색 침전 형태의 목적 단백질 DewA를 각각 재현탁 용매인 200 mM Tris-HCl(pH8.0) 1 mL에 용해하고, 이후 1 mL Tris-HCl을 순차적으로 연속 첨가하여 희석한 샘플들에 대하여, SDS-PAGE 분석을 수행한 후, 그 결과를 도 4에 도시하였다.
도 4에서 레인 1은 전체 분획 샘플(T)을 나타내고, 레인 2는 가용성 분획 샘플(S)를 나타내며, 레인 3은 상기 정제 방법을 통해 정제한 목적 단백질인 클래스 I 하이드로포빈 DewA를 상기 방법으로 200 mM Tris-HCl(pH8.0) 1 mL에 용해한 샘플이며, 레인 4는 상기 레인 3의 샘플에 1 mL의 Tris-HCl을 추가로 첨가한 것이며, 레인 5 내지 7은 같은 방식으로 이전 샘플에 1 mL의 Tris-HCl을 가하여 희석한 샘플을 나타낸다.
상기 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 레인 1의 전체 분획 샘플 80% 이상이 레인 2의 가용성 분획 샘플에서도 관찰되며, 레인 3 내지 레인 7에서는 본 발명의 유기 용매를 이용한 이상분리법을 통해 가용성 발현된 목적 단백질을 효율적으로 정제할 수 있다는 점을 나타내고 있다.
이로부터, 가용성 발현된 하이드로포빈을 복잡한 물리, 화학적 정제 과정을 거치치 않고서도, 단순한 정제 방법을 통해 고효율로 정제할 수 있음을 학인하였다.
또한, 시험예 2에서와 마찬가지로, 상기 결과는 클래스 I 하이드로포빈 DewA의 경우에 대한 결과만을 예시로 기재한 것이나, 하이드로포빈은 분자 내에 8개의 시스테인을 보유하고 있어, 4개의 이황화 결합(disulfide bond; S-S)을 분자 내에 형성한다는 공통적인 특징을 보유하고 있으므로, 상기 결과를 적어도 클래스 I 하이드로포빈, 넓게는 전체 하이드로포빈까지 확장되어 합리적으로 일반화가 가능하다는 것은 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명한 것으로 이해되어야 할 것이다.
[비교예 2]
상기 시험예 3에서, 실시예 1을 통해 발현시킨 재조합 융합 단백질을 이소프로필 알코올 대신 유기 용매로서 메탄올, 에탄올 및 이소부틸 알코올을 각각 이용하여, 다른 과정 및 조건은 동일하게 하여, 정제 과정을 수행하였다.
[비교예 3]
상기 시험예 3에서, 실시예 1을 통해 발현시킨 재조합 융합 단백질을, 제 2 상등액과 혼합되는 이소프로필 알코올의 양을 제 1 상등액의 부피와 동일하게 하는 것을 제외하고, 다른 과정 및 조건은 동일하게 하여, 정제 과정을 수행하였다.
[비교예 4]
상기 시험예 3에서, 실시예 1을 통해 발현시킨 재조합 융합 단백질을, 재현탁 용매인 Tris-HCl(pH 8.0)의 농도가 각각 50 mM, 400 mM가 되도록 하고, 다른 과정 및 조건은 동일하게 하여, 정제 과정을 수행하였다.
그 결과, 상기 비교예 2 ~ 비교예 4에서 본 발명의 범위를 벗어난 정제 방법의 형태로 수행하는 경우, 가용성 발현된 클래스 I 하이드로포빈 DewA가 효율적으로 정제되지 않는 문제가 발생하는 점을 확인하였다(데이터는 나타내지 않음).
이로부터, 본 발명의 정제 과정 및 이에 부합되는 조건으로 정제를 수행하는 것을 통해서만이, 가용성 발현된 하이드로포빈을 고효율로 정제하는 것이 가능하며, 상기 시험예 2, 3에서 언급한 바와 같이, 상기 결과는 클래스 I 하이드로포빈 A의 경우에 대한 결과만을 예시로 기재한 것이나, 하이드로포빈은 분자 내에 8개의 시스테인을 보유하고 있어, 4개의 이황화 결합(disulfide bond; S-S)을 분자 내에 형성한다는 공통적인 특징을 보유하고 있으므로, 상기 결과를 적어도 클래스 I 하이드로포빈, 넓게는 전체 하이드로포빈까지 확장되어 합리적으로 일반화가 가능하다는 것은 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명한 것으로 이해되어야 할 것이다.
[비교예 5] 종래기술에 따른 하이드로포빈의 정제 (비이온성 계면활성제인 트리톤 X-114)
융합 단백질을 비이온성 계면활성제인 트리톤 X-114를 이용하여 해당 내용을 포함하는 문헌(Clifton N. J. et al. Article in Methods in molecular biology, 2012)에 기술된 방식으로 정제하였다.
상기 실시예 1의 재조합 발현 벡터(pET24a-Ramp-DewA(-ss)-6xHis)를 37℃, 200 rpm의 조건에서 배양하고, 600 nm에서의 흡광도가 0.5 정도가 되는 시점에서 0.2 mM IPTG를 첨가하여, 재조합 융합 단백질의 발현을 유도하였다.
상기 발현이 유도된 세포를 10,000 rpm으로 원심분리하여 배지와 세포를 분리하고, 회수한 세포는 초음파 처리하여 전체 분획 샘플을 수득하였다.
상기 전체 분획 샘플을 4℃에서 10,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 가용성 분획 샘플(상등액)을 수득하였다.
이후, 비이온성 계면활성제 트리톤 X-114를 총 부피의 5% 양으로 첨가하고 1분간 혼합한 후 실온에서 정치하여 상 분리를 유도하였다.
이후, 상층부를 제거하여 하이드로포빈이 포함된 하층부만을 남기고, 이 하층부와 동일한 부피의 이소부틸 알코올을 첨가한 후 1분간 볼텍싱하여 혼합하고, 4℃에서 5,000 rpm으로 상 분리를 확인하면서 원심분리하였다.
이전 단계에서 제거된 상층부 역시 상기 방식과 동일하게 이소부틸알코올을 이용하여 추출하였다.
상기 과정 및 결과를 도 5에 도시하였다.
도 5에서 튜브 (1)은 세포 파쇄 후 전체 분획 샘플(1) 및 이의 원심분리 후 가용성 분획 샘플(2)을 수득하고, 가용성 분획 샘플(상등액)과 트리톤 X-114를 혼합한 후 볼텍싱한 직후의 상황을 나타낸다.
튜브 (2)는 상층부(3)와 하층부(4)로 상 분리 후 상황을 나타낸다.
튜브 (3)은 상층부(3)와 이소부틸 알코올을 혼합한 후, 상층부와 하층부(5)로 상 분리 후의 상황을 나타내며, 튜브 (4)는 하층부(4)와 이소부틸 알코올을 혼합한 후 상층부와 하층부(6)로 상 분리된 후의 상황을 나타낸다.
각 단계에서 수득한 총 6개의 샘플에 대해 2회에 걸쳐 SDS-PAGE 분석을 실시한 결과를 도 6에 도시하였다.
도 6에서 레인 1은 전체 분획 샘플을, 레인 2는 가용성 분획 샘플을 의미하며, 레인 3은 튜브 (2) 상층부, 레인 4는 튜브 (3) 하층부, 레인 5는 튜브 (4) 상층부, 및 레인 6은 튜브 (4)의 하층부 샘플이다.
앞에서 설명한 바와 같이, 레인 6에서 가용성 발현된 하이드로포빈이 관찰되어야 하지만, 이와 같은 결과를 얻을 수는 없었으며, 이는 종래 하이드로포빈의 정제 방법인 비이온성 계면활성제인 트리톤 X-114를 이용한 정제 방법을 통해 가용성 하이드로포빈의 발현 및 정제가 이루어지지 않으며, 이와 같은 문제를 본 발명의 재조합 융합 단백질의 구성 및 정제 방법을 통해 원래 불용성 봉합체의 형태로 발현되는 하이드로포빈 단백질을 가용성으로 발현시킨 후, 간단한 과정을 통해 고효율의 하이드로포빈 단백질 정제가 가능한 것을 확인하였다.
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<160> 10
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<210> 1
<211> 408
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DewA nucleotide
<400> 1
atgcgcttca tcgtctctct cctcgccttc actgccgcgg ccaccgcaac cgccctcccg 60
gcctctgccg caaagaacgc gaagctggcc acctcggcgg ccttcgccaa gcaggctgaa 120
ggcaccacct gcaatgtcgg ctcgatcgct tgctgcaact cccccgctga gaccaacaac 180
gacagtctgt tgagcggtct gctcggtgct ggccttctca acgggctctc gggcaacact 240
ggcagcgcct gcgccaaggc gagcttgatt gaccagctgg gtctgctcgc tctcgtcgac 300
cacactgagg aaggccccgt ctgcaagaac atcgtcgctt gctgccctga gggaaccacc 360
aactgtgttg ccgtcgacaa cgctggcgcc ggtaccaagg ctgagtaa 408
<210> 2
<211> 135
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DewA amino acid
<400> 2
Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala
1 5 10 15
Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser
20 25 30
Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser
35 40 45
Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu
50 55 60
Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr
65 70 75 80
Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu
85 90 95
Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val
100 105 110
Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala
115 120 125
Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu
130 135
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DewA signal sequence
<400> 3
atgcgcttca tcgtctctct cctcgccttc actgccgcgg ccaccgcaac cgccctcccg 60
gcctctgccg ca 72
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ramp Tag nucleotide
<400> 4
cttcacagtc ctaatccc 18
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ramp Tag amino acid
<400> 5
Leu Pro Ala Ser Ala Ala
1 5
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6 x His Tag nucleotide
<400> 6
caccaccacc accaccac 18
<210> 7
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DewA nucleotide - Example 1
<400> 7
aagaacgcga agctggccac ctcggcggcc ttcgccaagc aggctgaagg caccacctgc 60
aatgtcggct cgatcgcttg ctgcaactcc cccgctgaga ccaacaacga cagtctgttg 120
agcggtctgc tcggtgctgg ccttctcaac gggctctcgg gcaacactgg cagcgcctgc 180
gccaaggcga gcttgattga ccagctgggt ctgctcgctc tcgtcgacca cactgaggaa 240
ggccccgtct gcaagaacat cgtcgcttgc tgccctgagg gaaccaccaa ctgtgttgcc 300
gtcgacaacg ctggcgccgg taccaaggct gagtaa 336
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DewA amino acid - Example 1
<400> 8
Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu
1 5 10 15
Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala
20 25 30
Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu
35 40 45
Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser
50 55 60
Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu
65 70 75 80
Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr
85 90 95
Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu
100 105 110
<210> 9
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DewA nucleotide - Example 2
<400> 9
ctcccggcct ctgccgcaaa gaacgcgaag ctggccacct cggcggcctt cgccaagcag 60
gctgaaggca ccacctgcaa tgtcggctcg atcgcttgct gcaactcccc cgctgagacc 120
aacaacgaca gtctgttgag cggtctgctc ggtgctggcc ttctcaacgg gctctcgggc 180
aacactggca gcgcctgcgc caaggcgagc ttgattgacc agctgggtct gctcgctctc 240
gtcgaccaca ctgaggaagg ccccgtctgc aagaacatcg tcgcttgctg ccctgaggga 300
accaccaact gtgttgccgt cgacaacgct ggcgccggta ccaaggctga gtaa 354
<210> 10
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DewA amino acid - Example 2
<400> 10
Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala
1 5 10 15
Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala
20 25 30
Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly
35 40 45
Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser
50 55 60
Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu
65 70 75 80
Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys
85 90 95
Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Lys Ala Glu
115
Claims (29)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- a) 서열번호 8 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 목적 단백질 하이드로포빈 DewA; 및 상기 목적 단백질의 N-말단에 융합된 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 번역 속도 조절용 램프 태그를 포함하는 재조합 융합 단백질을 코딩하는 염기서열을 도입한 벡터를 인간을 제외한 숙주 세포에 형질전환하여 재조합 융합 단백질을 가용성으로 발현시키는 단계; 및
b) 상기 발현된 재조합 융합 단백질을 정제하는 단계;
를 포함하는, 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법으로,
상기 b) 단계는,
b1) 상기 형질전환체 세포를 현탁 후 파쇄하고 원심분리하여 제 1 상등액을 얻는 단계;
b2) 상기 제 1 상등액에 제 1 용매로 이소프로필 알코올을 첨가하여 얻은 제 1 혼합물을 진탕 후 원심분리하여 제 2 상등액을 얻는 단계; 및
b3) 상기 제 2 상등액에 제 2 용매로 이소프로필 알코올을 첨가하여 얻은 제 2 혼합물을 진탕 후 원심분리하여 목적 단백질을 회수하는 단계;
를 포함하는, 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 13항에 있어서,
상기 목적 단백질의 야생형은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법. - 삭제
- 제 13항에 있어서,
상기 램프 태그는 숙주 세포의 희귀 코돈(rare codon)의 수집을 통해 얻는 것인, 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법. - 제 13항에 있어서,
상기 숙주 세포는 에스케리치아 속(Escehreichia sp.), 살모넬라 속(Salmonellae sp.), 예르시니아 속(Yersinia sp.), 쉬겔라 속(Shigella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 속 (Proteus sp.) 또는 클레브시엘라 속(Klebsiella sp.)의 박테리아인, 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법. - 삭제
- 제 13항에 있어서,
상기 제 1 상등액에 혼합하는 이소프로필 알코올의 부피비는 1:2 내지 1:3인, 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법. - 삭제
- 제 20항에 있어서,
상기 희귀 코돈의 수집은 코돈의 빈도수 및 이소수용체(isoacceptor) tRNA 유전자 수를 분석하여 이루어지는 것인, 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법. - 제 25항에 있어서,
상기 코돈의 빈도 수는 0.1 내지 1%인, 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법. - 제 25항에 있어서,
상기 이소수용체 tRNA 유전자 수는 0 내지 2개인, 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법. - 삭제
- 제 13항, 제 18항, 제 20항, 제 21항, 제 23항 및 제 25항 내지 제27항 중 어느 한 항의 정제 방법을 통해 정제된, 가용성으로 발현된 재조합 융합 단백질.
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