KR20240057506A - Atp 생합성 강화를 통한 목적 단백질 분비 생산능이 향상된 재조합 코리네박테리움 - Google Patents
Atp 생합성 강화를 통한 목적 단백질 분비 생산능이 향상된 재조합 코리네박테리움 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 코리네박테리움 속 에너지 생산 관련 유전자인 zwf 및/또는 cydABDC가 과발현되어 있고, 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 분비 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 재조합 미생물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 코리네박테리움 속 개량된 재조합 미생물은 분비 생산에 필요한 에너지원을 과생산하도록 도움으로써, 목적 단백질의 분비 생산에 있어 향상된 분비능을 나타내므로, 산업적 적용에 유리한 목적 단백질 분비 생산용 숙주로 이용이 용이하다.
Description
본 발명은 목적 단백질의 분비 생산능이 향상된 재조합 코리네박테리움에 관한 것으로, 보다 상세하게는 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 에너지 생산 관련 유전자인 zwf 및/또는 cydABDC가 과발현되어 있고, 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 목적 단백질의 세포 외 분비 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 재조합 미생물 및 이의 용도에 관한 것이다.
코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물은 아미노산 및 핵산 생산에 있어 산업적으로 사용되고 있는 미생물로서, generally recognized as safe(GRAS) 균주로 안정성이 인정되어 비타민 및 재조합 효소 등을 생산하는 숙주로써 이용되고 있다. 특히 코리네박테리움 속 미생물을 분비 생산 시스템을 보유하고 있어, 이를 이용하여 재조합 단백질에 분비 생산의 숙주로 사용이 가능하다. 분비 생산 시스템을 이용하는 것은 산업적으로 유용성이 크다. 일반적으로 재조합 단백질 생산은 세포 내 생산을 주로 하기 때문에 세포 내 생산된 재조합 단백질을 회수하기 위하여 세포 파쇄 공정이 필수적으로 필요한 반면, 분비 생산 시스템을 이용한 재조합 단백질 생산은 세포 외 재조합 단백질을 생산함으로써 세포 파쇄 공정이 필요하지 않기 때문에 산업적 재조합 단백질 생산 공정에서의 이점을 가지고 있기 때문이다. 이에 코리네박테리움 속 미생물을 이용한 분비 생산 시스템은 산업적으로 재조합 단백질의 세포 외 분비 생산을 가능하게 할 수 있기 때문에 경제적이고 효과적인 생산 시스템으로 사용할 수 있다.
코리네박테리움을 이용한 재조합 단백질 분비 생산에 관련된 연구들은 숙주가 가지고 있는 분비 생산 시스템을 이용하거나(Yim, S. S. et al., (2016) Biotechnology and bioengineering, 113(1), 163-172), 합성 분비신호 펩타이드 구축을 통해 분비 생산능을 증가 시키거나, 분비 생산능 향상을 위해 내재적 유전자를 제거하여 분비 생산능이 향상된 재조합 숙주를 개발하는 방법 등이 있다. 그러나, 상기 방법들은 재조합 단백질의 분비 생산 시스템 구축에 초점을 맞추거나 분비 생산 시 분비능에 영향을 주는 인자의 제거를 통하여 분비 생산능을 높이는 연구들로서, 분비 생산을 향상시키기 위해 균주를 개량하는 연구는 미흡한 실정이다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 분비 생산 시스템 구축 및 개량에 의해 분비 생산능을 향상시키는 것과 별개로, 목적 단백질의 분비 생산이 가능한 코리네박테리움 속 미생물의 개량을 통하여 분비 생산능이 향상된 코리네박테리움을 개발하고자 하였으며, 분비 생산능을 향상시킬 수 있는 에너지 대사 관련 유전자의 개량을 통해 코리네박테리움에서의 목적 단백질 분비 생산능이 향상됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
Yim, S. S. et al., (2016) Biotechnology and bioengineering, 113(1), 163-172
Yim, S. S. et al, (2013) Biotechnology and bioengineering. 110, 2959-2969
An, S.J. et al., (2013) Protein Expression and Purification, 89, 251-257
본 발명은 목적 단백질의 세포 외 분비 생산능이 향상된 신규한 코리네박테리움 속 재조합 미생물 및 이의 용도를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 zwf 유전자의 프로모터가 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 H36 프로모터로 치환; 및/또는 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 cydABDC 유전자의 프로모터가 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 H30 프로모터로 치환되고, (b) 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 목적 단백질의 세포 외 분비·생산능이 개선된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 재조합 미생물을 배양하여 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시켜 목적 단백질을 분비·생산하는 단계; 및 (b) 상기 분비·생산된 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 분비·생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 코리네박테리움 속 개량된 재조합 미생물은 분비 생산에 필요한 에너지원을 과생산하도록 도움으로써, 목적 단백질의 분비 생산에 있어 향상된 분비능을 나타내므로, 산업적 적용에 유리한 목적 단백질 분비 생산용 숙주로 이용이 용이하다.
도 1은 에너지원인 NADPH를 증가시키기 위한 메커니즘 및 균주 개량 모식도와 NADPH 측정 결과이다. 도 1A는 zwf 유전자의 메커니즘이고, 도 1B는 chromosome의 zwf 유전자를 H36 프로모터(특허공개 10-2014-0110134)로 치환한 개량된 코리네박테리움 모식도, 도 1C는 chromosome의 zwf 유전자를 H36 프로모터로 치환 후의 NADPH 양 측정 결과이다.
도 2는 분비 생산능의 변화를 보기 위해 적용한 목적 단백질 분비 생산 시스템 및 분비 생산된 재조합 단백질의 SDS-PAGE 결과이다. 도 2A는 XynA의 분비 생산의 플라스미드 모식도이고, 도 2B는 도 2A의 플라스미드를 C. glutamicum SP002 균주(한국 특허공개 10-2022-0049827) 및 도 1B의 개량된 코리네박테리움에 도입하여 분비된 단백질을 30배 농축하여 분비 생산능을 비교한 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 에너지원인 ATP의 증가를 위해 도입한 cydABDC 과발현 플라스미드 시스템의 모식도와 이에 따른 ATP 양 측정 결과이다. 도 3A는 cydABDC 유전자를 H30 프로모터(Yim, S. S. et al, (2013) Biotechnology and bioengineering. 110, 2959-2969) 하에 과발현하는 시스템의 모식도이고, 도 3B는 cydABDC를 과발현하는 플라스미드를 가지거나, cydABDC 유전자가 없는 pXMJ19(empty plasmid)를 가진 C. glutamicum SP002 균주의 ATP 양 측정 비교 결과이다.
도 4는 cydABDC를 과발현하는 플라스미드를 가지거나, cydABDC 유전자가 없는 pXMJ19(empty plasmid)를 가진 C. glutamicum SP002 균주에서의 XynA의 분비 생산능을 비교한 SDS-PAGE 결과이다. 각 분비 생산량은 10배 농축한 결과이다.
도 5는 chromosome의 zwf 유전자를 H36 프로모터로 치환 및 cydABDC를 플라스미드 시스템으로 과발현하는 개량된 C. glutamicum SP003의 모식도 및 이를 이용하여 다양한 재조합 단백질의 생산능을 비교한 SDS-PAGE 결과이다. 도 5A는 C. glutamicum SP003의 모식도로써, 내재된 zwf 유전자의 프로모터가 H36 프로모터로 치환 및 cydABDC가 플라스미드 시스템으로 과발현되는 개량된 코리네박테리움 균주의 모식도이다. 도 5B는 XynA의 분비 생산능을 C. glutamicum SP002와 C. glutamicum SP003에서 비교한 SDS-PAGE 결과로, 분비 생산된 XynA를 10배 농축한 결과이다. 도 5C는 cAbHuL22의 분비 생산능을 C. glutamicum ATCC13032(WT)와 C. glutamicum SP003에서 비교한 SDS-PAGE 결과로, 분비 생산된 cAbHuL22를 30배 농축한 결과이다. 도 5D는 M18의 분비 생산능을 C. glutamicum ATCC13032(WT)와 C. glutamicum SP003에서 비교한 SDS-PAGE 결과로, 분비 생산된 M18를 50배 농축한 결과이다.
도 6은 목적 단백질 분비 생산능이 향상된 C. glutamicum SP004 균주의 모식도이다.
도 7은 C. glutamicum SP004와 C. glutamicum SP002에서의 ATP 양 비교 및 분비 생산능을 비교한 SDS-PAGE 결과이다. 도 7A는 pHCP(Empty plasmid, 한국 특허공개 10-2018-0092110)와 cAbHuL22를 분비 생산하는 시스템을 가진 C. glutamicum SP004 및 C. glutamicum SP002에서의 ATP 양 측정 결과이다. 도 7B는 C. glutamicum SP004와 C. glutamicum SP002에서의 cAbHuL22의 분비 생산능을 비교하기 위해 분비된 단백질을 30배 농축한 SDS-PAGE 결과로, lane C는 pHCP(empty plasmid)이고, lane 1은 C1 분비 신호 펩타이드(한국 특허출원 10-2021-0092055)를 이용하여 분비 생산한 cAbHuL22이다.
도 8은 C. glutamicum SP002, C. glutamicum SP003, C. glutamicum SP004에서의 XynA의 분비 생산능을 비교한 SDS-PAGE 결과이다. 분비된 XynA는 10배 농축하여 확인하였다.
도 9는 ppk 동시발현 시스템과 C. glutamicum SP004의 cAbHuL22 분비 생산능을 비교한 SDS-PAGE 결과이다.
도 2는 분비 생산능의 변화를 보기 위해 적용한 목적 단백질 분비 생산 시스템 및 분비 생산된 재조합 단백질의 SDS-PAGE 결과이다. 도 2A는 XynA의 분비 생산의 플라스미드 모식도이고, 도 2B는 도 2A의 플라스미드를 C. glutamicum SP002 균주(한국 특허공개 10-2022-0049827) 및 도 1B의 개량된 코리네박테리움에 도입하여 분비된 단백질을 30배 농축하여 분비 생산능을 비교한 SDS-PAGE 결과이다.
도 3은 에너지원인 ATP의 증가를 위해 도입한 cydABDC 과발현 플라스미드 시스템의 모식도와 이에 따른 ATP 양 측정 결과이다. 도 3A는 cydABDC 유전자를 H30 프로모터(Yim, S. S. et al, (2013) Biotechnology and bioengineering. 110, 2959-2969) 하에 과발현하는 시스템의 모식도이고, 도 3B는 cydABDC를 과발현하는 플라스미드를 가지거나, cydABDC 유전자가 없는 pXMJ19(empty plasmid)를 가진 C. glutamicum SP002 균주의 ATP 양 측정 비교 결과이다.
도 4는 cydABDC를 과발현하는 플라스미드를 가지거나, cydABDC 유전자가 없는 pXMJ19(empty plasmid)를 가진 C. glutamicum SP002 균주에서의 XynA의 분비 생산능을 비교한 SDS-PAGE 결과이다. 각 분비 생산량은 10배 농축한 결과이다.
도 5는 chromosome의 zwf 유전자를 H36 프로모터로 치환 및 cydABDC를 플라스미드 시스템으로 과발현하는 개량된 C. glutamicum SP003의 모식도 및 이를 이용하여 다양한 재조합 단백질의 생산능을 비교한 SDS-PAGE 결과이다. 도 5A는 C. glutamicum SP003의 모식도로써, 내재된 zwf 유전자의 프로모터가 H36 프로모터로 치환 및 cydABDC가 플라스미드 시스템으로 과발현되는 개량된 코리네박테리움 균주의 모식도이다. 도 5B는 XynA의 분비 생산능을 C. glutamicum SP002와 C. glutamicum SP003에서 비교한 SDS-PAGE 결과로, 분비 생산된 XynA를 10배 농축한 결과이다. 도 5C는 cAbHuL22의 분비 생산능을 C. glutamicum ATCC13032(WT)와 C. glutamicum SP003에서 비교한 SDS-PAGE 결과로, 분비 생산된 cAbHuL22를 30배 농축한 결과이다. 도 5D는 M18의 분비 생산능을 C. glutamicum ATCC13032(WT)와 C. glutamicum SP003에서 비교한 SDS-PAGE 결과로, 분비 생산된 M18를 50배 농축한 결과이다.
도 6은 목적 단백질 분비 생산능이 향상된 C. glutamicum SP004 균주의 모식도이다.
도 7은 C. glutamicum SP004와 C. glutamicum SP002에서의 ATP 양 비교 및 분비 생산능을 비교한 SDS-PAGE 결과이다. 도 7A는 pHCP(Empty plasmid, 한국 특허공개 10-2018-0092110)와 cAbHuL22를 분비 생산하는 시스템을 가진 C. glutamicum SP004 및 C. glutamicum SP002에서의 ATP 양 측정 결과이다. 도 7B는 C. glutamicum SP004와 C. glutamicum SP002에서의 cAbHuL22의 분비 생산능을 비교하기 위해 분비된 단백질을 30배 농축한 SDS-PAGE 결과로, lane C는 pHCP(empty plasmid)이고, lane 1은 C1 분비 신호 펩타이드(한국 특허출원 10-2021-0092055)를 이용하여 분비 생산한 cAbHuL22이다.
도 8은 C. glutamicum SP002, C. glutamicum SP003, C. glutamicum SP004에서의 XynA의 분비 생산능을 비교한 SDS-PAGE 결과이다. 분비된 XynA는 10배 농축하여 확인하였다.
도 9는 ppk 동시발현 시스템과 C. glutamicum SP004의 cAbHuL22 분비 생산능을 비교한 SDS-PAGE 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
코리네박테리움 속 미생물은 내재적으로 단백질 분비 시스템을 가지고 있기 때문에, 산업적으로 유용한 재조합 단백질 생산에 광범위하게 활용된다. 그러나, 단백질 분비 생산시 필요한 에너지 대사 향상을 위한 시스템은 개발된 바 없다.
본 발명의 일 실시예에서는, 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 zwf 유전자 및 cydABDC 유전자를 과발현하는 시스템을 도입함으로써 목적 단백질의 분비량을 현저히 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 zwf 유전자의 프로모터가 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 H36 프로모터로 치환; 및/또는 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 cydABDC 유전자의 프로모터가 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 H30 프로모터로 치환되고, (b) 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 목적 단백질의 세포 외 분비·생산능이 개선된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 재조합 미생물에 관한 것이다.
서열번호 1: zwf 유전자의 nucleotide 서열(1545 bp)
GTGAGCACAAACACGACCCCCTCCAGCTGGACAAACCCACTGCGCGACCCGCAGGATAAACGACTCCCCCGCATCGCTGGCCCTTCCGGCATGGTGATCTTCGGTGTCACTGGCGACTTGGCTCGAAAGAAGCTGCTCCCCGCCATTTATGATCTAGCAAACCGCGGATTGCTGCCCCCAGGATTCTCGTTGGTAGGTTACGGCCGCCGCGAATGGTCCAAAGAAGACTTTGAAAAATACGTACGCGATGCCGCAAGTGCTGGTGCTCGTACGGAATTCCGTGAAAATGTTTGGGAGCGCCTCGCCGAGGGTATGGAATTTGTTCGCGGCAACTTTGATGATGATGCAGCTTTCGACAACCTCGCTGCAACACTCAAGCGCATCGACAAAACCCGCGGCACCGCCGGCAACTGGGCTTACTACCTGTCCATTCCACCAGATTCCTTCACAGCGGTCTGCCACCAGCTGGAGCGTTCCGGCATGGCTGAATCCACCGAAGAAGCATGGCGCCGCGTGATCATCGAGAAGCCTTTCGGCCACAACCTCGAATCCGCACACGAGCTCAACCAGCTGGTCAACGCAGTCTTCCCAGAATCTTCTGTGTTCCGCATCGACCACTATTTGGGCAAGGAAACAGTTCAAAACATCCTGGCTCTGCGTTTTGCTAACCAGCTGTTTGAGCCACTGTGGAACTCCAACTACGTTGACCACGTCCAGATCACCATGGCTGAAGATATTGGCTTGGGTGGACGTGCTGGTTACTACGACGGCATCGGCGCAGCCCGCGACGTCATCCAGAACCACCTGATCCAGCTCTTGGCTCTGGTTGCCATGGAAGAACCAATTTCTTTCGTGCCAGCGCAGCTGCAGGCAGAAAAGATCAAGGTGCTCTCTGCGACAAAGCCGTGCTACCCATTGGATAAAACCTCCGCTCGTGGTCAGTACGCTGCCGGTTGGCAGGGCTCTGAGTTAGTCAAGGGACTTCGCGAAGAAGATGGCTTCAACCCTGAGTCCACCACTGAGACTTTTGCGGCTTGTACCTTAGAGATCACGTCTCGTCGCTGGGCTGGTGTGCCGTTCTACCTGCGCACCGGTAAGCGTCTTGGTCGCCGTGTTACTGAGATTGCCGTGGTGTTTAAAGACGCACCACACCAGCCTTTCGACGGCGACATGACTGTATCCCTTGGCCAAAACGCCATCGTGATTCGCGTGCAGCCTGATGAAGGTGTGCTCATCCGCTTCGGTTCCAAGGTTCCAGGTTCTGCCATGGAAGTCCGTGACGTCAACATGGACTTCTCCTACTCAGAATCCTTCACTGAAGAATCACCTGAAGCATACGAGCGCCTCATTTTGGATGCGCTGTTAGATGAATCCAGCCTCTTCCCTACCAACGAGGAAGTGGAACTGAGCTGGAAGATTCTGGATCCAATTCTTGAAGCATGGGATGCCGATGGAGAACCAGAGGATTACCCAGCGGGTACGTGGGGTCCAAAGAGCGCTGATGAAATGCTTTCCCGCAACGGTCACACCTGGCGCAGGCCATAA
서열번호 2: H36 프로모터의 nucleotide 서열(75 bp)
TCTATCTGGTGCCCTAAACGGGGGAATATTAACGGGCCCAGGGTGGTCGCACCTTGGTTGGTAGGAGTAGCATGG
서열번호 3: CydABDC 유전자의 nucleotide 서열(5646 bp)
GTGGATGTCGTCGACATCGCACGGTGGCAATTCGGAATTACCACCGTCTATCACTTCATTTTTGTCCCACTGACCATTGGCTTAGCGCCGCTGGTCGCAATCATGCAAACGTTTTGGCAAGTTACCGGCAAAGAGCACTGGTATCGGGCCACAAGATTTTTTGGCACTGTGCTGCTCATCAACTTCGCGGTTGGTGTAGCAACGGGCATTGTGCAGGAGTTCCAGTTCGGTATGAACTGGTCGGAATATTCGCGTTTCGTCGGTGATGTTTTCGGCGGACCGCTGGCTTTGGAGGGTCTTATCGCGTTCTTCCTTGAGTCTGTATTCCTGGGACTGTGGATTTTCGGATGGGGGAAGATTCCTGGTTGGTTGCACACTGCATCCATTTGGATCGTTGCTATTGCGACGAATATTTCTGCCTATTTCATCATCGTGGCCAACTCGTTTATGCAGCATCCGGTGGGTGCTGAGTATAACCCTGAGACTGGTCGTGCGGAGCTTACTGATTTTTGGGCTCTTCTCACAAACTCCACCGCGCTGGCTGCGTTCCCGCATGCTGTTGCCGGTGGTTTTTTAACAGCTGGAACTTTCGTTCTCGGAATTTCGGGTTGGTGGATTATTCGTGCGCACCGTCAGGCCAAGAAGGCTGAGTCGGAAATCGAGTCGAAGCATTCGATGCACAGGCCCGCGTTGTGGGTTGGTTGGTGGACCACAGTTGTCTCTTCCGTGGCGCTGTTCATCACTGGCGATATCCAGGCGAAGCTCATGTTCGTGCAGCAGCCAATGAAGATGGCGTCGGCGGAATCCTTGTGTGAAACCGCCACAGATCCAAACTTCTCCATTCTGACAATTGGTACGCACAACAACTGCGATACGGTAACCCACCTGATCGATGTTCCGTTTGTGCTTCCATTCTTGGCTGAAGGAAAATTCACCGGTGTGACTTTGCAGGGTGTAAACCAGCTCCAAGCTGCAGCGGAGCAAGCATACGGTCCTGGCAACTACTCCCCTAACTTGTTTGTCACCTACTGGTCATTCCGCGCAATGATCGGCCTGATGCTTGGTTCTTTGGCTATCGCTGCGATTGCGTGGCTGTTGCTGCGTAAGAAGCGCACACCAACTGGAAAGATTGCTCGTCTGTTCCAGATCGGCAGCCTCATTGCTATCCCGTTCCCATTCTTGGCCAACTCTGCTGGTTGGATCTTCACCGAGATGGGCCGCCAGCCTTGGGTGGTGCACCCGAACCCTGAATCTGCCGGCGATGCCCGAACAGAGATGATCCGGATGACTGTTGATATGGGTGTATCTGATCATGCGCCATGGCAAGTCTGGCTGACTCTCATTGGCTTCACGATTCTCTATCTCATTTTGTTCGTGGTGTGGGTGTGGCTGATTCGCCGCGCAGTTCTGATCGGACCACCAGAGGAAGGCGCTCCATCCGTGGAGGCAAAGACTGGACCGGCAACCCCGATTGGTTCAGATATGCCCATGACACCGCTGCAATTTACTGCCGCTGCCCCAACCACAGGTGAAAAGGAATAACCATGGATCTCAATACCTTTTGGTTTATTCTCATCGCATTTTTGTTTGCGGGATACTTTCTCCTCGAAGGATTCGACTTCGGCGTCGGAATTTTGGCACCCATCATCGGTAAAGATTCAGCGGCTAGGAACACAGTGATCCGTACGATTGGCCCTGTCTGGGACGGAAATGAAGTGTGGCTGATCGTGGCAGGTGGCGCTTTGTTTGCTGCCTTCCCTGAGTGGTACGCAACGATGTTCTCCGGAATGTATCTGCCGCTGTTCCTCGTGCTTGTGTCGTTGATCATGCGCGTGGTGGGCCTTGAATGGCGCAAGAAAGTCGATGATCCTCGTTGGCAAAAGTGGTCTGACCGGGCCATCTTTATTGGTTCTTGGACTCCACCGCTGATGTGGGGATTCATCTTCGCCAATATTTTGCGTGGCATGCCCCTCAAGGCGGATCACACCATCGATGCTGCGGCAGCCCTTCCTGGCATGGTCAACGTCTTCGCCATTCTGGGTGCACTTGCGTTCACCGCACTGTTCGCCCTTCATGGTCTCGCATTCATCCGCCTGAAAACTGCTGGTCGGGTGCGCACCGATGCGGCGAAGGCAGCTCCAGTAGTCGCACTTCTTGCTGCGGTGACTGGTGGACCTTTCGTGTTGTGGGCTGCCATCGCATACGGCCGTTCCTGGTCCTGGATCCTCGCAGTGCTGATCATCGCAGCGGTTCTCGGTGGAGCTTTCGCACTGATCAAAGACCGCGATGGATTAAGCTTCCTGTCCACTTCCGTCGCTGTCATCGGTGTCGTTGCACTGCTGTTTAGTTCGCTTTTCCCCAACGTCATGCCAACAACGCTTGCTGATGGCGTGAGCCTGGATATCTGGAACGCCTCCGCAAGCGCCTACGCATTTACTATCCTGACTTGGACCGCCGCTGTGATCGCACCGCTGGTTGTCCTCTACCAAGGCTGGACCTACTGGGTGTTCCGCAAACGACTTCACGCCGAGCCAGTGTCTGCTTAAAGTTGGAAAAATTGAGTACTAAATCTTCAGCTCCTGCAAAAAGGCGCGCCGGCCCCGTCGATCCGCGGCTTTTGCGCCTATCCCCCGCTACCCGCCGTTGGGTGATAATCGCAGGTGTTCTCACCGCGTTGAAAACCCTCGCGACAGTCGCAATGGGCTTGCTCATCGGCCAGATGGCAGCGGGCATCATTGAGGTTTCGGGAAGTTCTTTGCCCCGAATGGAACTCATCGCGCTCGCCATCACGGTGGTTGTGCGCGGACTTCTTGCGTGGGCACAGGATCGGTTCGCGCAACGCGCATCGTCCCAGGTGACTGTGGATCTTCGGGAGAAAACCCTGCGGCACCTGGCACAAAGCGATCCCCGCACCATCGATCAAGCCTTGTGGCGCACCCGTTTGACCTCTGGCCTTGATGGTTTGGGGCCTTACCTCACCGGATTTTTGCCAGCTCTAGCCGCCACGATCATTGCCACCCCGGTCATGCTCGCGGTGGTGGGTTGGCTGGATGTTGGGTCCATGGTCATCGCGATCATCACGCTCCCCCTCATTCCGGTGTTCATGTGGCTGGTGGGAACACTCACCGCAGGTCGCACCGAACAACGCCTCAGCGACCTAGCCATTTTGGGAGGTCAGCTGCTTGATCTCATCGCAGGCTTGCCCACCTTGCGAGCATTCAGGCGCCACCAAGACATGGCAGCTCAGGTCACGCGACTATCCTCCCAACATGCAAGCTCCACGTTGAGCGTGCTGAAAATCGCGTTCCTTTCCAGCTTTGTGTTGGAATTTTTGGCCACACTATCGGTCGCATTGGTAGCGGTTGGCATCGGATTTCGCCTGCTCGCGGGCGATCTCACCCTCGCCATCGGCCTGACCGTACTGATCATCATCCCAGAGGTCTACGCGCCGATCCGCGAAGTCGGCACCCGCTTCCACGACGCCCAAGACGGCCTGGTTGCCACCGATGAGATCCTAAAATTACTCAGCGTTTCTTCGCTTGTCGACGCGCCTACCCACACACCCCGCGACGTTGCAGGCGGGCTGGAGGTGAGCGTCGAAAAGCTTCGCGCTGATGGACGCGATGGGCCGAGGCCTGCTGATTTGTCGTTCACCGCAAAGCCTGGGCAGTTGACGGTGCTGTGGGGGCCAAACGGCAGCGGCAAATCCACGGCCTTGCTAGCGGTGTTGGGCTTGGCGACGGAAGGCATCACTGGAGAGGTTTCCGTCAAGGATGCCTCGGGCCAGGAATTTAAGGACAGCGCATTGTGGGAGCACTGCGCATATTTGCCGCAGCGGCCGGTCATTGATCCGGAAAGTGTCAGTGATTATGCGGAACTGTCGCTTGGGCAGCGCCAACGGCTTGCGCTGAAACGTGAGCTTGGGGCGCAATTGCTCCTGTTGGATGAGCCGACCGCGCACCTGGATCCAGACAACGCTGCGATCATGATCCAGCAATTGCAGGCTGAAGCCCGCCGAGGCACCACAGTACTGGCGGTTTCGCATGATCCTTTGCTGCGTGCGGCTGCCGATGAAGTGGTGGAGGTCAAATGAACACCCTGGTAAAACTTCGTTTCCGCGAGCTAATTCCCGCCGTTGTTGCAGGTAGCGTCACGATGATCGCCTCCATCACCCTGACGGTGGTGTCGGCCTGGCTGATCACCAAAGCTTGGGAAATGCCGCCAGTGATGGATCTGACCGTGGCGGTCACCGCTGTGCGAGCCCTGGGCATTAGCCGTGCGATGTTCCGTTATATAGAGAGAATCGTTTCACATGACTTGGCGTTGAAGGCAGCCAGCCGAGCCCGTTCGAGTGCATATCAACGCCTGGCTTCGTCGCCAAACTCTGCGTTGACGATGCGCCGCGGCGAACTGCTTAGCCGCCTTGGTGTGGATATCGATTCGGTTGCCGATGTCATCGTCCGCGCCGTCATTCCCGCCGGAGTTGCCCTGCTCACCGGAGTTGTCGCGATCATCTTCACCGCGATTCTCAGCCCCGCAACCGCACTTGTCCTGGCGATTGGATTGATTGCTGCTGCAATTATCCCTCCCCTGCTTGCTGCTCGCGGAGTTAAAACAGCCGAAGCCCGGCGCGCTGAATCCAGCGAAGCCTACTTGAGTTCCTTGGATCAGGTGCTGTCCAACCAGGCGGCGCTTCGTGTTCGTGGTGAAATGCCGGCCGCTCTGTCCAAGGCGGATGTGGCTGCGCGTTCCTATTCTTCTTCACTGGAGGCAGGCGCGAAAGACACTGCCATTGGCGCAGCGAGTTCCCTGTGGATTCACGGTTTCACTGTCATTGGTGTGCTCATGGTTTCCGCGTCACTGTATGCAGATGGAAGCCATTCACCGCAGTGGTTTGGTGTGTTGGTGCTGCTTTCACTCGCAGCTTTCGAGGCTGTCTCTGTTCTCCCCGATGCTGCGATTGCTCGTACCCGCGCCGCAGATGCCACCAGGAGGCTTGCGGAAATCTCGGCGCTGCCAGAATCTGTCTCTCTTGAGCTTCGCACGGCCTCTGACCAGCCCGTATTACGCGCCGAGAATCTAGTTTATGGATGGGACAGCGACCTAGGCACGAGCAACCTGGATCTCACCTTTGGTTCACGACATGAAATCATCGCACCCTCTGGAACTGGCAAAACGACCCTGCTGCTCACACTTGCGGGGCTGTTGGAACCTCGTGGAGGCCAAGTGCTTATCGACGGCACCAATCCTTCCGAGTTGAAAAACGCCGTGCTGTTCAGTCCAGAAGATGCCCACATTTTTGCCACCACTGTCCGAGATAACTTAGCACTCGGAGCACCGGAAGCAACCGACGCGGAAATGACATCGATCCTGGAACATGTTGGTTTGTCAGAGTGGGTTCAAGGTTTACCCGATGGTCTTGGCACTGTCCTTGATTCAGGTGCCGATAGTCTCTCGGGAGGTCAGCGCCGCCGCCTGCTCCTTGCCCGCGTACTACTAAGTGATGCACCAATTCTGCTTTTGGATGAACCCACCGAGCACCTCGACACTGCAGGCTCCTCTGAAATCTTGTCTATGCTGGCCTCCGATGAACTCCCTGGTAAAAGAGCTAGGAGAACCGTAGTGATTGTGAGGCATGTGAGGTAA
서열번호 4: H30 프로모터의 nucleotide 서열(74 bp)
AAAGTAACTTTTCGGTTAAGGTAGCGCATTCGTGGTGTTGCCCGTGGCCCGGTTGGTTGGGCAGGAGTATATTG
본 발명에 있어서, 상기 “zwf 유전자”는, 포도당-6-인산 탈수소효소(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD, G6PDH)를 코딩하는 유전자를 의미하며, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 포도당-6-인산 탈수소효소는 하기의 화학 반응을 촉매하는 효소이다.
D-glucose 6-phosphate + NADP+ + H2O 
6-phospho-D-glucono-1,5-lactone + NADPH + H+
본 발명에 있어서, 상기 “cydABDC 유전자”는 cydABDC gene cluster와 동일한 의미로 사용되며, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. cydA 및 cydB 유전자는 각각 cytochrome bd oxidase의 subunit I 및 subunit II를 코딩하며, cydC 및 cydD 유전자는 활성 cytochrome bd oxidase 형성에 필요한 ABC transporter를 코딩한다.
본 발명에 있어서, 상기 “H36 프로모터” 및 “H30 프로모터”는 각각 서열번호 2 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, “H36 프로모터” 및 “H30 프로모터”는 각각 zwf 유전자 및 cydABDC 유전자의 과발현을 위해 치환되었으며, zwf 유전자 및 cydABDC 유전자를 과발현하도록 작용하는 프로모터는 작동 원리상 그 종류에 관계없이 사용될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 치환 또는 도입은 유전자가 숙주 미생물에 도입되어 게놈 자체에 통합되어 있는 경우뿐만 아니라, 상기 유전자가 플라스미드나 벡터의 형태로 숙주 미생물 게놈에 독립적으로 도입되어 있는 경우를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 코리네박테리움 글루타미쿰의 chromosome 내 zwf 유전자의 발현 프로모터를 H36으로 치환하거나, cydABDC 유전자 및 H30 프로모터를 삽입한 플라스미드를 구축하여 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 형질전환하거나, 또는 코리네박테리움 글루타미쿰의 chromosome 내 zwf 유전자의 발현 프로모터는 H36으로 치환하고 chromosome 내 cydABDC 유전자의 발현 프로모터는 H30 프로모터로 치환하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 벡터를 사용할 수 있다. 이 경우, 상기 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 하나의 재조합 벡터에 도입되는 것이 바람직하다. 상기 목적 단백질은 분비 신호 펩타이드와 작동 가능하게 연결되어 발현됨으로써 목적 단백질의 세포 외 분비가 촉진된다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자의 도입을 위해 사용할 수 있는 벡터는 pHCP, pXMJ19, pTac15K, pBBR1MCS, pEKEx1 및 pCES208로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 유전자가 도입 또는 증폭되어 있다는 것은, 상기 유전자에 의해 생성되는 펩타이드 또는 단백질이 숙주 미생물에 없는 경우 이를 인위적으로 숙주 미생물에서 발현하도록 하여 펩타이드 또는 단백질의 활성 또는 기능을 갖도록 하는 것뿐만 아니라, 상기 유전자에 의해 생성되는 펩타이드 또는 단백질의 활성 또는 기능이 내재적 활성 또는 기능에 비하여 강화되도록 변형된 것을 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 "내재적 활성 또는 기능"이란, 본래 미생물이 변형되지 않은 상태에서 가지고 있는 효소, 펩타이드, 단백질 등이 보유하는 활성 또는 기능을 의미하고, "내재적 활성 또는 기능에 비하여 강화되도록 변형"되었다는 의미는 변형 전 상태의 펩타이드 등의 활성 또는 기능과 비교할 때 당해 활성 또는 기능이 신규로 도입되거나 더 향상된 것을 의미하며, 활성 또는 기능을 나타내는 유전자가 도입되거나 또는 당해 유전자의 카피수 증가(예를 들어, 유전자가 도입된 플라스미드를 이용한 발현), 발현조절 서열의 변형, 예를 들어 개량된 프로모터의 사용 등과 같이, 조작이 이루어지기 전의 미생물이 가지는 활성에 비하여 조작이 이루어진 이후의 미생물이 가지고 있는 활성 또는 기능이 증가된 상태를 의미한다.
본 발명에 있어서, "펩타이드 기능의 강화"란, 펩타이드 자체의 기능이 새로 도입되거나 증대되어 본래 기능 이상의 효과를 도출하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 내재적 유전자 기능의 증가, 내부 또는 외부 요인으로부터 내재적 유전자 증폭, 유전자 카피수 증가, 외부로부터의 유전자 도입, 발현조절 서열의 변형, 특히 프로모터 교체 또는 변형 및 유전자내 돌연변이에 의한 펩타이드 기능의 증가 등에 의해 그 기능이 증대되는 것을 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 "과발현"이란 보통 상태에서 세포 내 해당 유전자가 발현되는 수준보다 높은 수준의 발현을 일컫는 것으로써, 유전체 상에 존재하는 유전자의 프로모터를 강력한 프로모터로 치환하거나, 발현벡터에 해당유전자를 클로닝하여 세포에 형질전환시키는 방법을 통해 발현량을 증가시키는 것 등을 포함하는 개념이다.
본 발명에 있어서, 용어 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단 부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.
상기 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있으며, 본 발명의 효과를 위해 추가적으로 변형될 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원(Ori)을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 게놈 DNA에 통합될 수 있다. 바람직하게는 벡터 내로 삽입되어 전달된 유전자가 숙주세포의 게놈 내로 비가역적으로 융합되어 세포 내에서 유전자 발현이 장기간 안정적으로 지속되도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능 하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및/또는 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및/또는 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
아울러, 본 발명에서 도입된 유전자는 숙주세포의 게놈에 도입되어 염색체 상 인자로서 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 코리네박테리움 속 미생물들을 이용하여 분비 생산된 목적 단백질은 엔도자일라나아제(endoxylanase, XynA), cAbHuL22 또는 M18인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이외에 다른 재조합 단백질이 적용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질은 코리네박테리움 속 미생물에서 목적 단백질 분비를 유도하는 분비 신호 펩타이드에 작동 가능하게 연결되어 도입되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질 분비를 유도하는 분비 신호 펩타이드는 Cg2052 분비 신호 펩타이드, Cg1514 분비 신호 펩타이드, CgR0949 분비 신호 펩타이드, TorA 분비 신호 펩타이드, CspA 분비 신호 펩타이드, Prorin B(PorB) 분비 신호 펩타이드, C1 분비 신호 펩타이드, CgR_2070 분비 신호 펩타이드 및 AprE 분비 신호 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 코리네박테리움 속 미생물에서 목적 단백질의 분비를 유도할 수 있는 분비 신호 펩타이드는 제한 없이 사용 가능함은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 아세토글구타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenes) 및 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 재조합 미생물을 배양하여 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시켜 목적 단백질을 분비·생산하는 단계; 및 (b) 상기 분비·생산된 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 분비·생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 상술한 “코리네박테리움(Corynebacterium) 속 재조합 미생물”을 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이므로, 중복된 내용은 그 기재를 생략한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1:
NADPH
과생산을
위한
코리네박테리움 속
미생물 개량
세포내 에너지원 중에 하나인 NADPH를 증대시키기 위해 NADPH 생산에 관여하는 zwf 유전자(도 1A)를 코리네박테리움의 chromosome 상에서 강한 프로모터인 H36 프로모터(특허공개 10-2014-0110134) 하에 발현될 수 있도록 코리네박테리움을 개량하였다(도 1B). Chromosome 내 zwf 유전자의 발현 프로모터를 H36으로 치환하기 위해 코리네박테리움 ATCC13032을 주형으로 하여 zwf 유전자를 zwfUp_F(서열번호 5)과 zwfUp_R(서열번호 6), zwfDown_F(서열번호 7)와 zwfDown_R(서열번호 8)을 이용하여 PCR로 증폭하였고, 이 두 PCR 산물과 H36 프로모터 부분(Yim, S. S. et al, (2013) Biotechnology and bioengineering. 110, 2959-2969)을 pCES208_confirm_F(서열번호 9)와 H36_R(서열번호 10)을 이용하여 증폭한 H36 프로모터 PCR 산물을 이용하여 zwfUp_F과 zwfDown_R으로 overlap PCR하여 최종산물을 얻었다. 서열번호 5 내지 서열번호 10의 프라이머 서열은 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
|
서열
번호 |
Primer name | Sequence(5’-> 3’) |
| 5 | zwfUp_F | GATTAGCATGCTCCACTCTGTGGCTTCCTTCTT |
| 6 | zwfUp_R | TGAACGCCGGAGGATCAGCTACTTCAGGCGAGCTTCCATG |
| 7 | zwfDown_F | AACTTTAAGAAGGAGATATACATGTGAGCACAAACACGACCCC |
| 8 | zwfDown_R | GTAATCCCGGGTCTTCGGTGGATTCAGCCAT |
| 9 | pCES208_confirm_F | ctgatcctccggcgttca |
| 10 | H36_R | atgtatatctccttcttaaagtt |
PCR 반응 조건은 98℃ 5분, 1 Cycle; 98℃ 5분, 55℃ 20초, 72℃ 1분 30초, 30 Cycle; 72℃ 5분, 1 Cycle로 시행하였다. 이를 SphI과 XmaI 제한효소 처리 후 같은 제한효소 처리를 한 pK19mobSacB 플라스미드에 삽입하여 pK19MobSacB_H36_zwf를 구축하였다. pK19MobSacB_H36_zwf를 최소 1 μg/μl 이상 되도록 준비하여 한국 특허공개 10-2022-0049827의 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) SP002 균주에 전기천공법을 사용하여 1차 재조합을 유도하였다. 이때 전기천공한 균주를 카나마이신(kanamycin)이 20 μg/μl 포함된 LB 한천플레이트에 도말하여 콜로니를 분리한 후 게놈상의 유도한 위치에 적절히 삽입되었는지 PCR 및 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 이렇게 분리된 균주는 다시 2차 재조합을 유도하기 위해 10% 수크로오스(sucrose)를 함유한 LB 한천 액체 배지에 하룻밤 배양하여 동일 농도의 수크로오스 한천플레이트에 도말하여 콜로니를 분리하였다. 최종 분리된 콜로니 중 항생제 카나마이신(kanamycin) 내성 여부를 확인한 후 항생제 내성이 없는 균주들 중 H36 프로모터가 삽입되었는지 염기서열 분석을 통해 확인하였다.
이렇게 만들어진, NADPH 과생산을 위해 H36 프로모터가 삽입된 코리네박테리움 글루타미쿰 SP002 균주(C. glutamicum SP002 ::H36 zwf)는 NADPH의 양이 증가하였는지 확인을 위해 BHI(Brain heart infusion, BD) 배지에 접종하여 24시간 동안 30℃, 200 rpm에서 배양하였다. 이후, 250mL flask의 신선한 CGXII 배지에 15g/L yeast extract, 7g/L casamino acid가 포함된 배지 50 mL에 상기 배양된 균주를 1/100의 부피만큼 옮겨서 동일 조건으로 배양하였다. 10시간 배양한 후 OD600nm에서 4로 원심분리(13,000 rpm, 10 min, and 4℃)하여 회수하였다. NADPH양 측정을 위해서 NADP/NADPH quantification colorimetoric kit(BioVision, Korea)를 사용하였다. 회수한 H36 프로모터가 삽입된 코리네박테리움 글루타미쿰 SP002 균주는 NADP/NADPH extraction buffer 400 μL에 풀어 50% pulse and 20% amplitude(Sonics, Newtown, CT, USA)의 조건으로 7분 파쇄하였다. 이를 다시 원심분리(13,000 rpm, 10 min, and 4℃)하여 상층액을 회수하여 제조사의 colorimetric 방법을 이용하여 NADPH 양을 측정하였다.
NADPH 측정 결과, H36 프로모터로 치환하기 전에 비하여 NADPH 양이 증가함을 확인하였다(도 1C).
실시예
2:
NADPH를
과생산하는
개량된
코리네박테리움 속
미생물을 이용한 분비능 분석
실시예 1에서 구축한 NADPH를 과생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 SP002(C. glutamicum SP002 ::H36 zwf)를 이용하였을 때 목적 단백질 분비능에 효능을 보이는지 확인하기 위해, 합성 분비 신호 펩타이드인 C1을 이용하여 XynA를 분비 생산하는 시스템(한국 특허출원 10-2021-0092055)을 도입하여 분비된 단백질을 SDS-PAGE로 분석 및 비교하였다(도 2). NADPH를 과생산하지 않는 코리네박테리움 글루타미쿰 SP002를 이용하여 분비능 향상을 비교하였다.
BHI(Brain heart infusion, BD) 배지에서 30℃, 200 rpm, 24시간의 배양 후, 새로운 250 mL의 플라스크에 1/100의 부피만큼 옮겨 동일한 조건으로 배양하였다. 배양 후, 13000 rpm, 4℃, 10분 원심분리를 통해 배양액만을 회수하여 아세톤 침전방법을 이용하여 30배 농축하여 단백질을 수득하였다.
그 결과, 실시예 1에서 개량한 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 분비능이 향상됨을 확인하였다(도 2B).
실시예
3: ATP
과생산을
위한 플라스미드 시스템 구축 및 ATP 분석과 목적 단백질
분비능
비교
ATP 과생산을 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 cydABDC 유전자를 과발현 하는 시스템을 제작하였다. CydABDC 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 주형으로 하여 G_H30_cydA_F(서열번호 11)와 G_cydC_R(서열번호 12)을 이용하여 PCR로 증폭하였다. 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 서열은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.
|
서열
번호 |
Primer name | Sequence(5’-> 3’) |
| 11 | G_H30_cydA_F | GGTTGGTTGGGCAGGAGTATATTGGGATCCGTGGATGTCGTCGACATCGCAC |
| 12 | G_cydC_R | TTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCgcttaTTACCTCACATGCCTCACAATCAC |
PCR 반응 조건은 98℃ 5분, 1 Cycle; 98℃ 5분, 55℃ 20초, 72℃ 6분, 30 Cycle; 72℃ 15분, 1 Cycle로 시행하였다. 이를 Gibbson assembly 방법을 이용하여 H30 프로모터가 삽입되어 있는 pXMJ19 플라스미드에 삽입하여 pXMJ19_cydABDC를 구축하였다(도 3A). 구축한 pXMJ19_cydABDC는 코리네박테리움 글루타미쿰 SP002 균주에 형질전환하여 배양하였다.
형질전환된 균주를 BHI(Brain heart infusion, BD) 배지에 접종하여 24시간 동안 30℃, 200 rpm에서 배양하였다. 이후, 250 mL flask의 신선한 CGXII 배지에 15g/L yeast extract, 7g/L casamino acid가 포함된 배지 50 mL에 상기 배양된 균주를 1/100의 부피만큼 옮겨서 동일 조건으로 배양하였다. 10시간 배양한 후 OD600nm에서 8로 원심분리(13,000 rpm, 10 min, and 4℃)하여 회수하였다.
ATP 양 측정을 위해서 ATP assay kit(Biomax, Korea)를 사용하였다. 회수한 균주는 ATP assay buffer 200 μL에 풀어 50% pulse and 20% amplitude(Sonics, Newtown, CT, USA)의 조건으로 7분 파쇄하였다. 이를 다시 원심분리(13,000 rpm, 10 min, and 4℃)하여 상층액을 회수하여 제조사의 Fluorometic 방법을 이용하여 ATP 양을 측정하였다. ATP 측정 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 SP002 균주에 empty plasmid(pXMJ19)를 형질전환한 것과, pXMJ19_cydABDC를 형질전환한 균주를 비교하였을 때, cydABDC를 과발현하는 시스템을 포함한 코리네박테리움 글루타미쿰 SP002 균주에서의 ATP 양이 2배 이상 증가함을 확인하였다(도 3B).
CydABDC의 과발현으로 인해 목적 단백질 분비능에 효능을 보이는지 확인하기 위해, 실시예 2에서 사용한 XynA를 분비 생산하는 시스템을 도입하여 분비된 단백질을 SDS-PAGE로 분석 및 비교하였다(도 4). 배양 조건은 ATP 측정 시 사용한 조건과 동일하고, 24시간 배양을 진행하였다. 배양 후, 13000 rpm, 4℃, 10분 원심분리를 통해 배양액만을 회수하여 아세톤 침전방법을 이용하여 10배 농축하여 단백질을 수득하였다. 그 결과, 도 4에서와 같이 cydABDC를 과발현하는 시스템을 가지고 있는 균주에서의 목적 단백질 분비능이 증가함을 확인하였다.
실시예
4:
NADPH와
ATP를
과생산하는
코리네박테리움 속
미생물을 이용한 목적 단백질
분비능
분석
실시예 1에서 개량한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(C. glutamicum SP002 ::H36 zwf)에 실시예 3에서 구축한 pXMJ19_cydABDC를 형질전환하여, NADPH와 ATP를 과생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) SP003을 구축하였다(도 5A). 개량한 코리네박테리움 글루타미쿰 SP003 균주에서의 목적 단백질 분비능을 비교하기 위해, 실시예 2에서 사용한 XynA를 분비 생산하는 시스템을 도입하여 분비된 단백질을 SDS-PAGE로 분석 및 비교하였다. 배양 조건은 실시예 3과 동일하고, 아세톤 침전방법을 이용하여 10배 농축하여 단백질을 수득하여 비교하였다. 그 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 SP002 균주에서보다 코리네박테리움 글루타미쿰 SP003 균주에서의 분비 생산능이 증가함을 확인하였다(도 5B).
다른 분비 생산 시스템을 도입하였을 때에도 목적 단백질 분비 생산능이 증가하는지 확인하기 위하여 pCES_Cg1514_cAbHuL22(Yim, S. S. et al., (2016) Biotechnology and bioengineering, 113(1), 163-172)와 pCES208_H36_PorB_M18(An, S.J. et al., (2013) Protein Expression and Purification, 89, 251-257) 플라스미드를 코리네박테리움 글루타미쿰 SP003 균주에 형질전환하여, 기존 보고된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주(WT)와의 분비능을 비교하였다. cAbHuL22는 30배 농축하여 분비능을 비교하였고, M18은 50배 농축하여 분비능을 비교하였다. 그 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 SP003 균주에서의 분비능이 증가함을 확인하였다(도 5C, 도 5D).
실시예
5:
NADPH와
ATP를
과생산하는
코리네박테리움 속
미생물 개량
실시예 4에서 확인한 코리네박테리움 글루타미쿰 SP003에서의 목적 단백질 분비 생산능의 향상을 확인하였으나, SP003는 cydABDC를 과발현하는 플라스미드와 재조합 단백질을 분비 생산하는 플라스미드 시스템을 모두 포함하고 있다. 이를 보다 용이하게 사용하기 위해 cydABDC 유전자의 과발현을 실시예 1에서 개량한 코리네박테리움 글루타미쿰의 chromosome에서 시행하고자 하였다. CydABDC 과발현을 위해서 chromosome 내의 cydABDC의 내재된 프로모터를 합성 H30 프로모터로 치환하고자 하였다.
코리네박테리움 ATCC13032을 주형으로 하여 cydABDC 유전자의 프로모터 부분을 HindIII_Cg1302_A_F(서열번호 13)와 Cg1302_R(서열번호 14)을 이용하여 PCR로 증폭하였고, 실시예 3에서 구축한 pXMJ19_cydABDC를 주형으로 Cg1302_H30_F(서열번호 15)와 XbaI_CydA_B_R(서열번호 16)을 이용하여 PCR로 증폭하였다. 이 두 개의 PCR 산물을 HindIII_Cg1302_A_F(서열번호 13)와 XbaI_CydA_B_R(서열번호 16)을 이용하여 overlap PCR하여 최종 산물을 수득하였다. 서열번호 13 내지 서열번호 16의 프라이머 서열은 하기 표 3에 기재된 바와 같다.
| 서열번호 | Primer name | Sequence(5’-> 3’) |
| 13 | HindIII_Cg1302_A_F | AATTaagcttCAGAAACAATGGATTTTGGCAA |
| 14 | Cg1302_R | GCTTGGTTGCGGTGGTTAC |
| 15 | Cg1302_H30_F | GTAACCACCGCAACCAAGCgggaacaaaagctgggtacc |
| 16 | XbaI_CydA_B_R | TTAAtctagaAGCTCCGCACGACCAGTCT |
PCR 반응 조건은 98℃ 5분, 1 Cycle; 98℃ 5분, 55℃ 20초, 72℃ 1분 30초, 30 Cycle; 72℃ 5분 1 Cycle로 시행하였다. 이를 HindIII와 XbaI 제한효소 처리 후 같은 제한효소를 처리한 pK19mobSacB 플라스미드에 삽입하여 pK19MobSacB_H30_CydA를 구축하였다. pK19MobSacB_H30_CydA는 실시예 1과 같이 전기천공법을 이용하여 실시예 1에서 개량한 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum SP002 ::H36 zwf)에 추가적으로 개량을 하였고, H30 프로모터가 삽입되었는지 염기서열 분석을 통해 확인하였다. 이렇게 최종적으로 개량된 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) SP004로 명명하였다(도 6).
실시예
6:
코리네박테리움
글루타미쿰
SP004를 이용한 ATP 측정 및 목적 단백질
분비능
분석
ATP 양 비교를 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 SP002와 코리네박테리움 글루타미쿰 SP004 균주에 empty plasmid인 pHCP(한국 특허공개 10-2018-0092110)와 pHCP 시스템에 합성 분비 신호 펩타이드 C1을 이용하여 cAbHuL22를 분비하는 시스템을 도입하여 비교하였다. 분비 신호 펩타이드 C1을 이용하여 cAbHuL22를 분비 생산하기 위해, 실시예 2에서 사용된 XynA 분비 생산 시스템을 플라스미드로 이용하였고, pCES_Cg1514_cAbHuL22를 주형으로 하여 cAbHuL22 유전자를 SapI_cAbHuL22_F(서열번호 17)와 NotI_cAbHuL22_R(서열번호18)을 이용하여 PCR로 증폭하였고, 실시예 2에서 합성 C1 분비 신호 펩타이드를 NdeI_C1_F(서열번호 19)와 NotI SfiI SapI_C1_R(서열번호 20)을 이용하여 PCR로 증폭하였다. 서열번호 17 내지 서열번호 20의 프라이머 서열은 하기 표 4에 기재된 바와 같다.
| 서열번호 | Primer name | Sequence(5’-> 3’) |
| 17 | SapI_cAbHuL22_F | TAGAGCTCTTCTGCAcaggtccaactgcaagaaagcggt |
| 18 | NotI_cAbHuL22_R | atgcatgcgcggccgctcagtgatggtgatgatgatgtgaagagac |
| 19 | NdeI_C1_F | aacatATGAATAAGAGTAAGGACTCTTCC |
| 20 | NotI SfiI SapI_C1_R | TCTTgcggccgcGGCCCCCGAGGCCAAAAGCTCTTCATGCTCTTGGTGCTGGGGT |
PCR 반응 조건은 98℃ 5분, 1 Cycle; 98℃ 5분, 55℃ 20초, 72℃ 1분 30초, 30 Cycle; 72℃ 5분, 1 Cycle로 시행하였다. 2개의 PCR 산물과 실시예 2에서 사용된 pHCP 벡터에 NdeI, SapI, NotI 제한효소를 처리한 후 클로닝하여 pHCP_C1_cAbHuL22를 구축하였고, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 SP002와 SP004에 형질전환하여 사용하였다.
실시예 3과 같은 방법으로 ATP 양을 측정한 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 SP004에서의 ATP 양이 증가함을 확인하였다(도 7A).
또한 배양 조건 및 분비 생산된 단백질의 회수 방법은 실시예 3과 동일하게 하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 SP002 균주와 SP004 균주에서 분비능을 SDS-PAGE를 이용하여 비교하였을 때(분비 생산된 cAbHuL22를 30배 농축하여 비교), 개량한 코리네박테리움 글루타미쿰 SP004 균주에서 분비능이 향상됨을 확인하였다(도 7B). 코리네박테리움 글루타미쿰 SP002, SP003, SP004에서 XynA를 분비 생산하여 10배를 농축하여 비교한 결과에서도 SP002에서보다 SP003, SP004에서의 분비능이 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 8).
실시예
7:
코리네박테리움
글루타미쿰
SP004를 이용한 목적 단백질
분비능
비교
목적 단백질 분비 생산에 적용된 것은 아니나, 세포 내 대사증진을 위해 ATP 생합성을 증진시키는 전략으로 기존 사용된 polyphosphate kinase(PPK) 동시 발현 방법(Motomura K, et al., Appl Environ Microbiol. 2014 Apr;80(8):2602-8, Chen H, Zhang YPJ. Crit Rev Biotechnol. 2021 Feb;41(1):16-33)과 코리네박테리움 글루타미쿰 SP004의 목적 단백질 분비능을 비교하고자 하였다. 배양 조건 및 분비 생산된 단백질의 회수 방법은 실시예 3에 기재된 바와 같다.
PPK 동시 발현 코리네박테리움 글루타미쿰 균주와 SP004 균주에서 분비능을 SDS-PAGE를 이용하여 비교한 결과, SP004 균주에서의 목적 단백질 분비가 현저히 증가한 것을 확인하였다(도 9).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (4)
- (a) 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 zwf 유전자의 프로모터가 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 H36 프로모터로 치환; 및/또는 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 cydABDC 유전자의 프로모터가 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 H30 프로모터로 치환되고, (b) 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 목적 단백질의 세포 외 분비·생산능이 개선된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 목적 단백질은 코리네박테리움 속 미생물에서 목적 단백질 분비를 유도하는 분비 신호 펩타이드에 작동 가능하게 연결되어 도입되는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 재조합 미생물.
- 제2항에 있어서, 상기 목적 단백질 분비를 유도하는 분비 신호 펩타이드는 Cg2052 분비 신호 펩타이드, Cg1514 분비 신호 펩타이드, CgR0949 분비 신호 펩타이드, TorA 분비 신호 펩타이드, CspA 분비 신호 펩타이드, Prorin B(PorB) 분비 신호 펩타이드, C1 분비 신호 펩타이드, CgR_2070 분비 신호 펩타이드 및 AprE 분비 신호 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 재조합 미생물.
- 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 분비·생산 방법:
(a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 재조합 미생물을 배양하여 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시켜 목적 단백질을 분비·생산하는 단계; 및
(b) 상기 분비·생산된 목적 단백질을 회수하는 단계.
Priority Applications (1)
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| KR1020220137530A KR20240057506A (ko) | 2022-10-24 | 2022-10-24 | Atp 생합성 강화를 통한 목적 단백질 분비 생산능이 향상된 재조합 코리네박테리움 |
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| KR100919704B1 (ko) | 2007-09-12 | 2009-10-06 | 한국생명공학연구원 | 효모에서 재조합단백질을 고효율로 분비발현시키는 방법 |
| KR20140110134A (ko) | 2013-03-04 | 2014-09-17 | 한국과학기술원 | 코리네박테리아 발현용 합성프로모터 |
| KR20220049827A (ko) | 2020-10-15 | 2022-04-22 | 한국과학기술원 | 목적 단백질의 분비 생산능이 향상된 재조합 코리네박테리움 |
-
2022
- 2022-10-24 KR KR1020220137530A patent/KR20240057506A/ko unknown
Patent Citations (3)
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| Title |
|---|
| An, S.J. et al., (2013) Protein Expression and Purification, 89, 251-257 |
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