KR20080073708A

KR20080073708A - 항원을 측정하는 방법 및 여기에 사용되는 키트

Info

Publication number: KR20080073708A
Application number: KR1020087011402A
Authority: KR
Inventors: 료 고지마; 요시로 사토; 가츠히로 가타야마
Original assignee: 니토 보세키 가부시기가이샤
Priority date: 2005-11-18
Filing date: 2006-11-10
Publication date: 2008-08-11
Also published as: CN101310186A; US7981690B2; CN101310186B; DE602006020904D1; EP1950565A4; US20100151587A1; KR101298433B1; JP5239340B2; EP1950565A1; EP1950565B1; WO2007058129A1; JPWO2007058129A1

Abstract

균질한 계에서의 경합적 면역응집 측정에 사용되는 항체로서, 수용성 중합체에 공유적으로 결합된 항체를 사용함으로써, 희석에 의존하지 않고, 비희석된 계에서 고농도인 단백질 항원을 정확하게 측정할 수 있다.

면역응집, 수용성 중합체, 항원, 항체

Description

항원을 측정하는 방법 및 여기에 사용되는 키트{METHOD OF ASSAYING ANTIGEN AND KIT TO BE USED THEREIN}

본 발명은 항원을 측정하는 방법 및 여기에 사용되는 키트에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 균질한 계에서 경합적 면역응집 측정법에 의해 샘플 중의 항원을 측정하는 방법으로서, 생물학적 샘플 중에 존재하는 단백질인 알부민과 같은 항원을 측정하는데 적합한 방법, 및 여기에 사용되는 키트에 관한 것이다.

라텍스 면역비탁법(latex turbidimetric immunoassay)과 같은 면역비탁법은 혈액 샘플 중에 존재하는 단백질을 측정하기 위한 방법의 하나로서 알려져 있다. 상기 방법은 단기간에 다수의 샘플을 측정할 수 있으므로, 검사실 시험 영역에서 널리 사용되고 있다. 그러나, 알부민과 같이 혈액 중 약 10^-3M의 고농도로 존재하는 단백질을 측정하는 시도에 상기 방법이 사용되는 경우, 여러 가지 문제점이 발생한다. 구체적으로, 상기의 경우, 샘플로서 수집된 혈액 분석물을 사용 전에 희석하여야 하므로, 측정 전의 조작이 복잡하다. 또한, 상기 방법에는 측정 시약으로서 대량의 항체의 사용이 요구되어, 측정 시약의 비용이 높아진다. 더 욱이, 전지대 현상(prozone phenomenon)이 쉽게 일어나고, 결과적으로 고농도 영역에서의 상기 측정이 불가능할 수 있다. 그 결과, 희석되지 않은 계 중의 단백질을 면역비탁법에 의하여 측정하는 것은 아직 실제적으로 사용되지 않고 있다.

한편, 면역비탁법과 관련하여, 균질한 계에서의 경합적 면역응집 측정법은 면역학적 측정법의 하나로 알려져 있다(특허 문헌 1, 2 및 3). 균질한 계에서의 상기 경합적 면역응집 측정법은, 미세 입자 상에서 운반된 항원과 항체 사이의 항원-항체 반응의 결과인 응집의 정도에 기초하여 항원을 정량적으로 측정하는 방법이며, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 측정되는 항원, 항원에 대한 항체, 및 항체에 결합할 수 있는 항원을 운반하는 미세 입자를 함유하는 샘플을 혼합하는 단계; 및 샘플 중의 항원과 미세 입자 상에서 운반된 항원 상이의 항원-항체 반응을 경합시키는 단계. 상기 반응은, 다양한 노력을 통해 저농도의 항원이 측정될 수 있다는 이점을 가지며, 따라서 이러한 관점에서 연구가 수행되어 왔다. 그러나, 상기 방법을 고농도의 단백질 측정에 사용하는 경우, 표준화 곡선을 만들었을 때, 측정되는 단백질의 농도가 0 일 때의 측정 바탕값(blank) 이 측정 가능한 상한을 초과한다. 따라서, 측정이 불가능하게 된다. 그러므로, 상기 방법을 사용하여 고농도의 단백질을 측정할 수 있었던 연구가 거의 없었고, 그 결과, 상기 방법은 실제적으로 사용되지 않고 있다.

특허 문헌 1: JP-A-57-206859

특허 문헌 2: JP-A-58-500874

특허 문헌 3: JP-A-2002-296281

따라서, 본 발명은, 전통적으로 고농도의 항원을 측정하기 위한 방법으로는 거의 사용되지 않았던, 균질한 계 중에서의 경합적 면역응집 측정법을 사용하여, 희석되지 않은 계 중의 항원을 측정하는 방법을 제공하고, 또한, 상기 측정 방법에 사용하기 위한 키트를 제공하기 위한 것이다.

이러한 상황하에서, 상기 문제점들을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 균질한 계에서의 경합적 면역응집 측정법에 의해 샘플 중의 알부민을 측정하는 연구를 수행하였는데, 이는 고농도의 단백질 평가의 측면에서 거의 고려되지 않았던 것이었다. 그 결과, 놀랍게도, 균질한 계에서의 경합적 면역응집 측정법에 사용되는 항체로서, 수용성 중합체에 공유적으로 결합된 항체가 사용되는 경우, 희석하지 않고서도 비희석된 계에서 고농도의 알부민이 정밀하게 측정될 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명이 달성되었다.

따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 균질한 계에서 경합적 면역응집 측정법에 의하여 항원을 측정하는 방법에 관한 것이다: 측정되는 항원, 항원에 대한 항체, 및 측정되는 항원과 동일한 항원 또는 상기 항원의 유사체(상기 유사체는 항체와 항원-항체 반응이 진행될 수 있다)를 운반하는 미세 입자를 함유하는 샘플을 혼합하는 단계; 샘플 중의 항원과, 측정되는 항원과 동일한 항원 또는 상기 항원의 유사체 사이에서(이들은 미세 입자 상에서 운반됨), 항체의 항원-항체 반응을 경합시키는 단계; 및 측정되는 항원과 동일한 항원 또는 그 유사체(이들은 미세 입자 상에서 운반됨)와 항체의 항원-항체 반응의 결과로서 응집 정도에 기초하여 측정되는 항원을 정량적으로 측정하는 단계를 포함하며, 상기 항체가 수용성 중합체에 공유적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은, 항원을 측정하는 키트에 관한 것으로서, 상기 키트는 측정되는 항원에 대한 항체(상기 항체는 수용성 중합체에 공유적으로 결합됨), 및 측정되는 항원과 동일한 항원 또는 항체와 항원-항체 반응이 진행될 수 있는 항원의 유사체를 운반하는 미세 입자를 포함한다.

본 발명에 따른 측정 방법은, 전지대 현상이 일어나지 않을 뿐 아니라, 샘플을 희석함이 없이, 측정 시약으로서 고가의 항체를 소량 사용하여, 알부민과 같이 생물학적 샘플 중에 고농도로 존재하는 단백질인 항원의 면역측정법을 수행할 수 있게 한다.

[본 발명을 수행하기 위한 최선의 모드]

본 발명에 따른 측정법은, 경합적 면역 반응에서, 다른 성분들을 물에 용해되는 반면, 반응 시약 또는 생성물 중 하나가 혼탁도를 가진다는 원리에 기초한 것이다. 상기 원리는 이하에서 설명된다.

반응 시약으로서 하기 물질들을 사용하여 혼합한다: 샘플로부터 유래된 항원 (i); 상기 항원 (i) 과 동일한 항원 또는 상기 항원의 유사체와 미세 입자간의 결합체 (ii); 및 시약으로서 항체 (iii). 항체 (i), 결합체 (ii) 및 항체 (iii) 는 모두 물에 녹을 수 있거나 균질한 분산이 가능하다. 이들은 이후 혼합되어 항원-항체 반응을 거치게 되는데, 이것은 하기 항원-항체 복합체의 경합적 형성을 야기한다: 결합체 (ii) 와 항체 (iii) 와의 복합체 (iv); 및 항원 (i) 과 항체 (iii) 과의 복합체 (v). 상기 복합체 (iv) 는 불용성이며, 이것이 혼탁을 야기하는 반면, 복합체 (v) 는 수용성이다. 그러므로, 복합체 (iv) 가 많이 생성될수록, 반응 용액의 혼탁도가 증가한다.

상기 경합적 반응에서, 항원 (i) 은, 결합체 (ii) 와 경합적으로, 제한된 양의 항체 (iii) 와 반응하고, 이로 인하여 생성되는 불용성 복합체 (iv) 의 양이 감소되고, 반응 용액의 혼탁도가 감소된다. 그러므로, 샘플 중의 항원의 농도가 증가함에 따라, 반응 용액의 혼탁도가 감소한다. 샘플 중의 항원이 혼탁 정도에 근거하여 측정될 수 있다.

한편, 경합적 면역 반응에서, 샘플 중 항원 (i) 의 농도가 높은 경우, 결합체 (ii) 및 항체 (iii) 의 농도가 증가되어야 한다. 이 경우, 대량의 (iv) 의 결합체가 형성되므로, 혼탁이 지나치게 농후해지고, 따라서, 측정이 불가능해 질 수 있다.

본 발명에서, 수용성 중합체와 공유적으로 결합된 항체가, 항원-항체 반응을 저해하는 시약으로서 항체로 사용되어, 반응계의 혼탁도를 측정가능한 수준으로 감소시킬 수 있다.

본 발명에서, 측정되는 항원이 생물학적 샘플 중에 존재하는 물질, 특히 생물학적 샘플 중에 고농도로 존재하는 단백질인 것이 바람직하다. 구체적으로, 알부민, IgG IgA 및 IgM 이 바람직하며, 알부민 및 IgG 가 더욱 바람직하다. 이들 물질 중, 알부민이 가장 바람직한데, 이는 정량적 측정이 실험실적 테스트 영역에서 아직 실제적으로 사용되지 않음에도, 본 발명은 샘플을 희석함이 없이 면역측정법에 의하여 정량적 측정을 가능하게 하기 때문이다. 본 발명에서, 샘플은, 예를 들어, 살아있는 생물로부터 유래된 액체 샘플이다. 상기의 예는 플라즈마, 혈청 또는 뇨를 포함한다.

본 발명에서 사용되는 항체는, 측정되는 항원에 대한 항체이다. 상기에 기재된 항체인 이상, 다클론 항체 및 단클론 항체가 사용될 수 있다.

본 발명에서, 항원 유사체는, 항원과 구조적으로 유사한 물질이며, 항체와 항원-항체 반응을 통해 결합할 수 있다.

본 발명에서, 면역 응집에 사용되는 미세 입자가 그 자체로 전형적으로 사용될 수 있다. 가장 보편적인 미세 입자는 라텍스 입자이다. 0.01 내지 0.5 마이크론의 입자 크기 범위를 가지는 미세 입자가 일반적으로 사용된다.

본 발명에서, 물리적인 흡착 방법 또는 소수성 상호작용에 기초한 공유 결합 방법과 같은 통상적인 방법을 사용하여, 미세 입자 상에서 운반되는, 측정되는 항원과 동일한 항원 또는 그 유사체를 만들 수 있다.

항체가 공유적으로 결합하는 수용성 중합체의 예는, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알콜, 덱스트란, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리아크릴 아미드, 폴리아크로일모르폴린 또는 폴리옥사졸린, 폴리(N-2-(히드록시프로필)메타크릴 아미드)를 포함한다. 상기 중합체 중, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리비닐 알콜이 바람직하며, 단 중합체는 실온에서 수용성이다.

폴리에틸렌 글리콜은 특별히 제한되어 있지 않고, 중합체가 -CH₂-CH₂O- 반복단위를 갖는 한, 폴리에텔렌 글리콜 동질중합체, 폴리옥시에틸렌화 폴리올, 폴리옥시에틸렌화 글리세린, 폴리옥시에틸렌화 폴리올, 폴리옥시에틸렌화 소르비톨, 또는 폴리옥시에틸렌화 글루코오스가 포함된다. 폴리에틸렌화 글리콜의 한 말단이 탄소 원자 1 내지 4 개, 바람직하게는 1 내지 2 개를 갖는 알킬기로 치환될 수 있다.

폴리에틸렌 글리콜의 바람직한 예는 비치환된 폴레에틸렌 글리콜, 모노메틸 폴리에틸렌 글리콜, 또는 폴리옥시에틸렌화 글리세린을 포함한다. 이들 폴리에틸렌 글리콜 중, 모노메틸 폴리에틸렌 글리콜이 더욱 바람직하다.

펩티드 또는 단백질을 수용성 중합체에 공유적으로 결합시키는 전통적인 방법을 사용하여, 항체를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수용성 중합체에 공유적으로 결합시킬 수 있다. 예를 들어, 수용성 중합체와 항체는 하기에 의해 공유적으로 결합될 수 있다: 카르복시산의 4-히드록시-3-니트로벤젠술포네이트 에스테르 또는 N-히드록시 숙신이미드 에스테르 (N-히드록시 숙시네이트 이미드) 또는 p-니트로페닐 카르보네이트 또는 2,4,5-트리클로로 페닐 카르보네이트를, 바람직하게는 스페이서를 통하여, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수용성 중합체의 말단에 결합시키고; 생성된 물질을 항체의 아미노기와 반응시켜; 아미노 결합 또는 우레탄 결합을 형성시킴.

중합체의 평균 분자량은, 예를 들어 사용되는 항체에 따라 선택된다. 그러나, 일반적으로, 이들의 평균 분자량은, 바람직하게는 약 200 내지 10,000, 더욱 바람직하게는 300 내지 4,000 이다. 분자량이 너무 작으면, 항원-항체 반응의 저해가 불충분할 수 있다. 반면, 분자량이 너무 크면, 수용성 중합체에 공유적으로 결합하는 항체가 물에 녹기 어려울 수 있다.

본 발명에서, 응집의 정도를 정량적으로 측정하기 위한 방법으로서, 생성된 혼탁을 흡광도에 의해 측정하는 방법이 일반적이다. 그러나, 육안으로 응집물을 관찰하거나, 비-응집된 입자의 수를 세는 것에 의해 수행될 수도 있다.

구체적으로는, 본 발명에 의한 측정 방법은 하기와 같이 수행될 수 있다:

측정되는 항원과 동일한 항원 또는 그의 유사체를 운반하는 미세 입자가, 포스페이트 완충액과 같은 완충액에 균질하게 분산되어 있는 제 1 시약, 및 수용성 중합체가 공유적으로 결합된 항체가 포스페이트 완충액과 같은 완충액에 용해되어 있는 제 2 시약을 포함하는 시약들을 제조하는 것으로 개시된다. 이어서, 상기 제 1 시약 또는 제 2 시약을, 자동화 분석기를 사용하여 분석되는 항원을 함유하는 샘플에 첨가하고, 항원-항체 반응을 수행하여, 응집률을 수득하는데, 상기 응집률은, 2-포인트 엔드 법 (two-point end method) 에 의해, 예를 들어 800 nm 의 파장에서 흡광도의 변화량으로 측정된다.

사전에 제작된, 공지의 항원 농도의 표준 샘플을 이용한 표준화 곡선과 대조하여 수득된 측정에 의하여, 샘플 중의 목적하는 항체를 정량적으로 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 정량적 측정을 달성하기 위하여, 항원에 대한 항체(상기 항체는 수용성 중합체에 공유적으로 결합되어 있음), 및 항원 또는 그 유사체를 운반하는 미세 입자를 포함하는, 항체를 정량적으로 측정하기 위한 키트가 사용될 수 있다.

정량적 측정 방법에서 기재된, 상기 항체 및 미세 입자는, 항원에 대한 항체 (상기 항체는 수용성 중합체에 공유적으로 결합되어 있음), 및 항원 또는 그 항원의 유사체를 운반하는 미세 입자로서, 사용될 수 있다.

도 1 은 본 발명에 따른 측정 방법에 의해 작성된 표준화 곡선을 나타낸다.

도 2 는 본 발명의 방법과 TIA 방법 간의 상관 관계에 대한 혈청 알부민 측정의 결과를 나타낸다.

하기 예들은 본 발명을 설명하나, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.

실시예 1 및 비교예 1

PEG 화 항체의 고찰

항체를 PEG(폴리에틸렌 글리콜)에 결합시키는 것에 의하여 항원-항체 반응을 조절하기 위한 목적으로, 하기 실험을 수행하였다.

비교를 위해, 염화 나트륨과 같은 면역 반응 저해제를 비-PEG 화된 항체에 첨가함으로써 실험을 수행하였다.

1) 인간 알부민-민감 라텍스 입자의 제조

알부민을 라텍스 입자에 하기와 같이 흡착시켰다:

인간 혈청 알부민(The Scripps Research Institute 에 의해 제조됨) 을 포스 페이트 완충액에 10% 로 용해시켜 제조된 용액 100 ml 를 입자 크기 67 nm 의 폴레스티렌 라텍스 입자의 1% 현탁액 100 ml 에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반시키고, 이어서 18,000 rpm 에서 3 시간 동안 원심분리시켜 상층액을 제거함으로써, 침전물을 수득하였다.

상기와 같이 수득한 침전물을 포스페이트 완충액 100 ml 에 현탁시키고, 원심분리하여, 흡수되지 않은 과량의 인간 혈청 알부민을 이로부터 제거하였다. 이후, 생성된 침전물을 포스페이트 완충액 20 ml 에 현탁시키고, 이어서 초음파 처리하여 라텍스 입자를 완전히 분산시켰다. 5% 의 라텍스 농도를 가진 인간 알부민-민감 라텍스 입자의 현탁액을 냉각시켰다.

2) PEG 화된 항-인간 알부민 염소 혈청 γ 분획의 제조

식 CH₃O(CH₂CH₂O)_nCOCH₂CH₂CO-OSu (식 중, OSu 는 HOSu (N-히드록시숙시닉 이미드) 로 부터 H 가 제거된 잔기임) 로 표시되는 시약 (NOF 사에 의해 제조됨, 상표명: SUNBRIGHT ME-020CS, PEG 분자량 2,000) 을 PEG 화 시약으로서 사용하였다. 항체를 하기와 같이 PEG 화 하였다:

항체로서, 항-인간 알부민 염소 혈청 γ 분획 (International Immunology Corporation 에 의해 제조됨, 총 단백질 농도 6.5 g/dL) 의 용액 10 ml 를 사용하였다. 상기 항체에 더하여, PEG 화 시약 1g 을 포스페이트 완충액 10 ml 에 첨가하고, 용해시켜 PEG 화 용액을 제조하였다. 이어서, 항체 용액 및 PEG 화 용액을 혼합비 1:1 로 혼합하고, 실온에서 밤새 방치시켜, 단백질 농도 3.25 g/dL 인 PEG 화 항체를 수득하였다.

3) 혈청 알부민 측정 시약의 제조

알부민을 흡착시킨 라텍스 입자 및 PEG 화 항체를 사용하여 제 1 시약 및 제 2 시약을 제조하였다.

제 1 시약으로서, 포스페이트 완충액 5 ml 을 인간 알부민-민감 라텍스 입자의 현탁액 20 mL 에 첨가하여 제조된, 라텍스 농도 4% 의 현탁액이 사용되었다. 제 2 시약으로서, 포스페이트 완충액 15 mL 을 단백질 농도 3.25 g/dL 인 PEG 화 항-인간 알부민 염소 혈청 γ 분획의 용액 10 mL 에 첨가하여 제조된, 단백질 농도 1.3 g/dL 의 용액이 사용되었다. 생성된 용액은 20% 의 γ 분획 농도를 갖는다.

또한, 비-PEG 화 항-인간 알부민 염소 혈청 γ 분획을 포스페이트 완충액으로 단백질 농도 1.3 g/dL 로 희석함으로써, 대조 시약을 제조하였다.

더욱이, 비교예 1 로서, 면역 반응을 저해하기 위한 염화 나트륨 1,000 mM 을 비-PEG 화 항-인간 알부민 염소 혈청 γ 분획에 첨가함으로써, 단백질 농도 1.3 g/dL 인 γ 분획 용액을 제조하였다.

알고 있는 알부민 농도의 혈청을 생리학적 식염수로 희석하여, 샘플을 제조하였다.

각 시약의 조성은 하기에 기재된 바와 같다:

포스페이트 완충액의 조성

인산이수소나트륨 2 수화물 20 mM pH 7.50

EDTA·2Na 1 mM

제 1 시약의 조성

인산이수소나트륨 2 수화물 20 mM pH 7.50

EDTA·2Na 1 mM

인간 알부민-민감 라텍스 입자 4% (v/v)

제 2 시약의 조성

인산이수소나트륨 2 수화물 20 mM pH 7.50

EDTA·2Na 1 mM

PEG 화 항-인간 알부민 염소 혈청 γ 분획 (단백질 농도) 1.3 g/dL

제 2 시약의 조성 (대조 시약)

인산이수소나트륨 2 수화물 20 mM pH 7.50

EDTA·2Na 1 mM

항-인간 알부민 염소 혈청 γ 분획(비처리) (단백질 농도) 1.3 g/dL

제 2 시약의 조성 ( 비교예 1)

인산이수소나트륨 2 수화물 20 mM pH 7.50

EDTA·2Na 1 mM

염화 나트륨 1,000 mM

4) 흡광도의 측정

제 1 시약 및 제 2 시약 각각 270μL 를 샘플인 혈청 2 μL 와 반응시킨 혈 청 알부민을 Hitachi 7170S 형 자동화 분석기로 측정하였다. 이어서, 파장 800 nm 에서, 2-포인트 엔드 법에 의하여, 광도 측정 포인트 19 와 광도 측정 포인트 30 (제 2 시약 첨가 후 1 내지 4 분에 해당) 사이의 흡광도 변화량을 측정하였다.

5) 측정 결과

상기 기재된 시약을 사용하여 혈청 알부민을 측정한 경우의 흡광도 변화량을 표 1 에 나타내었다.

표 1: Hitachi 7170S 형 자동화 분석기에 의한 혈청 알부민의 흡광도 변화량

혈청 알부민의 농도 (g/dL)	800 nm 에서의 흡광도 변화량
혈청 알부민의 농도 (g/dL)	실시예 1: PEG 화 항체	대조 시약: 비-PEG 화 항체	비교예 1: 비-PEG 화 항체 및 염화 나트륨
0	0.3865	측정가능한 흡광도 초과	측정가능한 흡광도 초과
1.0	0.2551	측정가능한 흡광도 초과	측정가능한 흡광도 초과
2.0	0.1713	측정가능한 흡광도 초과	측정가능한 흡광도 초과
4.0	0.0955	측정가능한 흡광도 초과	측정가능한 흡광도 초과
6.0	0.0645	측정가능한 흡광도 초과	측정가능한 흡광도 초과
8.0	0.0376	측정가능한 흡광도 초과	측정가능한 흡광도 초과

상기 표 1 에 나타난 바와 같이, PEG 화 항체를 사용하는 경우, 알부민 농도가 증가함에 따라 흡광도가 감소한다. 이는 샘플 중의 알부민과 시약에 첨가된 라텍스 입자에 결합된 알부민 간의 경합 반응에 의해 야기된다.

더욱이, 본 발명에서, 반응에 사용되는 항체가 PEG 화 되었으므로, 반응의 흡광도는 측정가능한 수준에 머무른다. 이는 항체의 PEG 화가 항체에 결합된 알부민에 입체 장애를 부여하여, 결과적으로 흡광도가 적절히 조절되기 때문인 것으로 이해된다. 본 발명은, 반응의 흡광도가 항체의 PEG 화에 의해 자유롭게 조절될 수 있다는 것을 처음으로 발견한 것으로서, 이는 예측할 수 없는 것이었다.

한편, 비-PEG 화 항체를 사용한 경우, 항체와 알부민-민감 라텍스 입자 간의 반응은 조절할 수 없게 되어, 흡광도는 자동화 분석기의 측정가능한 상한을 초과한다. 결과적으로, 측정을 수행하기가 전혀 불가능하다. 마찬가지로, 염화 나트륨과 같은 면역 반응 저해제가 사용된 경우, 흡광도는 측정가능한 상한을 초과하게 되는데, 이에 의해 측정이 불가능해 진다.

실시예 2

혈청 알부민의 측정

알부민을 흡착시킨 라텍스 입자 및 PEG 화 항체를 사용하여 혈청 알부민을 측정하였다.

1) 인간 알부민-민감 라텍스 입자의 제조

인간 혈청 알부민을 포스페이트 완충액에 10% 농도로 용해시켜 제조된 용액 200 ml 를 입자 크기 67 nm 의 폴레스티렌 라텍스 입자의 1% 현탁액 200 ml 에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반시키고, 이어서 실시예 1 에서와 동일한 방식으로 원심분리하였다. 이어서, 상기와 같이 수득한 침전물을 포스페이트 완충액 40 ml 에 현탁시키고, 초음파 처리하여 라텍스 입자를 분산시켰다. 실시예 1 에서 기재된 바와 같이, 5% 의 라텍스 농도를 가진 인간 알부민-민감 라텍스 입자의 현탁액을 수득하였다.

2) PEG 화 항-인간 알부민 염소 혈청 γ 분획의 제조

상기 실시예 1 의 2) 에서와 동일한 방식으로, PEG 화 항-인간 알부민 염소 혈청 γ 분획을 제조하였다.

3) 혈청 알부민 측정을 위한 시약의 제조

알부민을 흡착시킨 라텍스 입자 및 PEG 화 항체를 사용하여, 상기 실시예 1 에서와 동일한 방식으로 제 1 시약 및 제 2 시약을 제조하였다.

제 1 시약으로서, 포스페이트 완충액 10 mL 을 인간 알부민-민감 라텍스 입자 현탁액 40 mL 에 첨가하여 제조된, 라텍스 농도 4% 의 현탁액이 사용되었다. 제 2 시약으로서, 포스페이트 완충액 30 mL 을 PEG 화 항-인간 알부민 염소 혈청 γ 분획의 용액 20 mL 에 첨가하여 제조된, 단백질 농도 1.3 g/dL 의 용액이 사용되었다.

각 시약의 조성은 하기에 기재된 바와 같다:

제 1 시약의 조성

인산이수소나트륨 2 수화물 20 mM pH 7.50

EDTA·2Na 1 mM

인간 알부민-민감 라텍스 입자 4% (v/v)

제 2 시약의 조성

인산이수소나트륨 2 수화물 20 mM pH 7.50

EDTA·2Na 1 mM

PEG 화 항-인간 알부민 염소 혈청 γ 분획 1.3 g/dL(단백질 농도)

4) 흡광도의 측정

제 1 시약 및 제 2 시약 각각 270μL 를 샘플인 혈청 2 μL 와 반응시킨 혈청 알부민을 Hitachi 7170S 형 자동화 분석기로 측정하였다. 이어서, 파장 800 nm 에서, 2-포인트 엔드 법에 의하여, 광도 측정 포인트 19 와 광도 측정 포인트 30 (제 2 시약 첨가 후 1 내지 4 분에 해당) 사이의 흡광도 변화량을 측정하였다.

분석기의 다 포인트 표준화 곡선 생성 기능을 사용하여 제작된 표준화 곡선과 대조하여, 알부민의 농도를 계산하였는데, 여기서 단백질 표준 혈청 CRM 470 에 의해 평가된 혈청을 표준품으로 사용하였다. 또한, TIA 법에 따라, "N-assay TIA Micro Alb" (Nitto Boseki Co., Ltd. 에서 제조됨) 를 대조 시약으로 사용함으로써, 상관관계를 확인하였다. 생리학적 식염수로 100 배 희석된 혈청을 TIA 법에 따른 시약의 샘플로서 사용하였다. 상기 기재된 바와 같이, Hitachi 7170S 형 자동화 분석기를, 지정된 파라미터에 따라 작동시켜, 측정을 수행하였다. 측정 결과에 100 을 곱하여, 혈청 알부민 값을 수득하였다.

5) 측정 결과

A) 본 발명에 따른 측정의 표준화 곡선

각 표준품의 흡광도 변화량을 표 2 에 나타내었으며, 표준화 곡선을 도 1 에 나타내었다.

표 2: 본 발명에 따른 측정 방법에서의, Hitachi 7170S 형 자동화 분석기에 의한 각 표준품의 흡광도 변화량

표준품의 농도 (g/dL)	800 nm 에서의 흡광도 변화량
0	0.3736
0.53	0.3103
1.05	0.2604
2.11	0.1946
4.08	0.1218
7.96	0.0873

표 2 및 도 1 에 나타난 바와 같이, 라텍스 입자에 알부민이 흡착되는 양, 및 PEG 화 항체를 조절함으로써, 희석에 의존하지 않고, 혈청 샘플을 측정할 수 있다. 본 발명의 방법은 경합 반응을 이용하므로, 알부민 농도가 증가함에 따라, 흡광도가 감소한다. 이는, 면역 반응을 이용하는 측정 시약에서의 문제를 야기시키는, 전지대 현상을 방지하는 것을 가능하게 하였다.

전통적인 면역측정법에 따른 혈청 알부민 측정에서는, 샘플을 측정가능한 농도로 희석하여야 한다. 그러나, 본 발명의 방법은 희석에 의존하지 않고 측정하는 것을 가능하게 하는데, 이것은 본 발명의 방법이 정확성 및 샘플 희석의 수행가능성 면에서 매우 유용하다는 점을 설명한다.

B) TIA 법과의 상관관계

본 발명의 방법과 TIA 법 간의 상관관계에 대한 혈청 알부민 측정의 결과를 도 2 에 나타내었다.

상기 상관관계는, TIA 법을 X 로 나타내고, 본 발명의 방법을 Y 로 나타내어 확인하였다. 상기 결과는 양호한 상관관계, 즉 Y=0.97X + 0.05 이고 상관 계수 0.974 (N = 30) 를 나타내었다. 혈청 알부민 측정에서, 면역측정법이 혈청 알부민을 정밀하게 측정하는 유일한 방법이라고 알려져 왔다. 그러므로, 본 발명이 면역측정법 중 하나인 TIA 법과 상관관계가 있다고 확인되었으므로, 본 발명에 의하여 혈청 알부민이 정확하게 측정될 수 있다.

본 발명에 따른 측정 방법은, 전지대 현상을 나타내지 않을 뿐 아니라 희석에 의존하지 않고, 측정 시약으로서 고가의 항체를 소량으로 사용하여, 알부민과 같이 생물학적 샘플 중에 고농도로 존재하는 단백질인 항원의 면역측정을 수행하는 것을 가능하게 한다.

Claims

하기 단계를 포함하는, 균질한 계에서의 경합적 면역응집 측정에 의하여 항원을 측정하는 방법으로서:

측정되는 항원, 항원에 대한 항체, 및 상기 측정되는 항원과 동일한 항원 또는 항체와 항원-항체 반응이 진행될 수 있는 항원의 유사체를 운반하는 미세입자를 함유하는 샘플을 혼합하는 단계:

샘플 중의 항원 및 측정되는 항원과 동일한 항원 또는 항원의 유사체(여기서 양자는 모두 미세 입자 상에서 운반됨) 사이에, 항체의 항원-항체 반응을 경합시키는 단계; 및

측정되는 항원과 동일한 항원 또는 항원의 유사체(여기서 양자는 모두 미세 입자 상에서 운반됨)와 항체의 항원-항체 반응의 결과인 응집의 정도에 기초하여, 측정되는 항원을 정량적으로 측정하는 단계

를 포함하며,

상기 항체가 수용성 중합체에 공유적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
제 1 항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 동질중합체, 또는 폴리비닐 알콜인 측정 방법.
제 1 항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 측정 방법.
제 1 항 내지 제 3 항에 있어서, 측정되는 항원이 생물학적 샘플 중에 고농도로 존재하는 단백질인 측정 방법.
제 4 항에 있어서, 측정되는 항원이 알부민인 측정 방법.
제 1 항 내지 제 5 항에 있어서, 상기 측정이, 측정되는 항원을 함유하는 샘플을 희석하지 않고 수행되는 것인 측정 방법.
균질한 계에서의 경합적 면역응집 측정에 의해 항원을 측정하기 위한 키트로서, 수용성 중합체에 공유적으로 결합될 수 있는, 측정되는 항원에 대한 항체, 및 측정되는 항원과 동일한 항원 또는 항체와 항원-항체 반응이 진행될 수 있는 항원의 유사체를 운반하는 미세입자를 포함하는 키트.
제 6 항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 동질중합체, 또는 폴리비닐 알콜인 키트.
제 7 항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 키트