JPWO2007058129A1 - 抗原の測定法およびそれに用いるキット - Google Patents
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Abstract
競合的均一系免疫凝集測定法に用いる抗体として、水溶性ポリマーを共有結合した抗体を用いることにより、高濃度の蛋白質抗原を、希釈することなく、無希釈系で正確に測定できる。
Description
本発明は、抗原の測定法およびそれに用いるキットに関する。更に詳細には、本発明は、試料中の抗原の競合的均一系免疫凝集測定法による測定法であって、生体試料中に高濃度で存在する蛋白質であるアルブミンなどの抗原の測定に適した抗原の測定法およびそれに用いるキットに関する。
血液試料に存在する蛋白質を測定する一つの方法として、ラテックス免疫比濁法等の免疫比濁法が知られている。これらの方法は、多数の試料を短時間で測定できるので、臨床検査業界で幅広く用いられている。しかし、アルブミンのような血中に１０−３Ｍ程度の高濃度で存在する蛋白質をこのような方法で測定しようとする場合、いろいろ問題が発生する。つまり、この場合、試料として採取した血液検体を希釈して使用する必要があり、測定前の操作が繁雑であるという問題があった。また、測定試薬として用いる抗体を多量に使用する必要があり、測定試薬が高価になるという問題もあった。さらには、プロゾーン現象が起こりやすく、高濃度域では測定できないことがあるという問題があった。その結果、免疫比濁法による、これら蛋白質の測定は、無希釈系では、実用化されていないのが現状である。
ところで、免疫測定法には、上記の免疫比濁法に関連して、競合的均一系免疫凝集測定法が知られている（特許文献１、２および３）。競合的均一系免疫凝集測定法とは、測定すべき抗原を含む試料と、該抗原に対する抗体と、その抗体と結合可能な抗原を担持してある微細粒子とを混合し、該抗体と、試料中の抗原および微細粒子が担持した抗原との間で、抗原抗体反応を競合させて、微細粒子が担持した抗原と抗体との抗原抗体反応による凝集の度合いから、測定すべき抗原を定量する方法である。この方法は、種々の工夫により、低濃度の抗原を測定できるというメリットがあり、その観点からいくつか研究がなされてきた。しかしながら、この方法を用いて、高濃度の蛋白質を測定する場合には、検量線を作成しようとすると、測定対象の蛋白質濃度が０の場合の測定ブランクが測定限界を超えてしまうため、測定不可能となる。その結果、この方法を用いて高濃度の蛋白質を測定することは、ほとんど研究されておらず、その結果、実用化もされていないのが現状である。
従って、本発明の課題は、従来、高濃度の抗原を測定することには、ほとんど用いられていなかった競合的均一系免疫凝集測定法を用いて、無希釈系で抗原を測定する、抗原の測定法を提供することにある。また、そのような測定法に用いる測定用キットを提供することにある。
そのような状況下、これらの問題を解決するため、本発明者らは、高濃度の蛋白質を測定する点からはほとんど検討されていなかった競合的均一系免疫凝集測定法により、試料中のアルブミンを測定することを検討した。その結果、驚くべきことに、競合的均一系免疫凝集測定法に用いる抗体として、水溶性ポリマーを共有結合した抗体を用いると、高濃度のアルブミンを、試料を希釈することなく、すなわち、無希釈系で正確に測定できることが判明した。本発明はかかる経過により達成されたものである。
従って、本発明は、測定すべき抗原を含む試料と、該抗原に対する抗体と、該抗原と同じ抗原または該抗原の類似物であって該抗体と抗原抗体反応し得る類似物に担持した微細粒子とを混合して、該抗体と、試料中の抗原および微細粒子が担持した該抗原と同じ抗原または該抗原の類似物との間で、抗原抗体反応を競合させて、該抗体と微細粒子が担持した該抗原と同じ抗原または該抗原の類似物との抗原抗体反応による凝集の度合いから、測定すべき抗原を定量する競合的均一系免疫凝集測定法において、該抗体は水溶性ポリマーが共有結合した抗体であることを特徴とする、抗原の測定法に関する。
更に本発明は、測定すべき抗原に対する抗体であってかつ水溶性ポリマーが共有結合した抗体と、測定すべき抗原と同じ抗原またはその抗原の類似物であって該抗体と抗原抗体反応し得る類似物に担持した微細粒子を含む抗原測定用キットに関する。
本発明の測定法により、測定試薬である高価な抗体を少なく用い、プロゾーン現象を発現することなく、かつ、試料を無希釈のまま、アルブミン等の生体試料中に高濃度で存在する蛋白質である抗原を免疫測定することができる。
本発明の測定法は、競争免疫反応で、反応試薬および生成物のうちの、1個のみが濁りを有し、他の成分が水に溶解するということに基づいており、その原理を、以下に例示して説明する。
まず、反応試薬として混合する対象として、(i) 試料由来の抗原、(ii) 該抗原と同じ抗原またはその抗原の類似物と微細粒子との結合体、(iii）試薬としての抗体を用いるが、これら (i)-(iii) の抗原、結合体および抗体は、すべて水に可溶あるいは均一分散可能である。次いで、これらを混合して抗原抗体反応をさせると、(ｉv）(ii)の結合体と (iii) の抗体との結合物、および (v）(i) の抗原と (iii) の抗体との結合物の２つの抗原抗体反応物が競合して生成する。(iv) の結合物は水に不溶性で濁りが生じるのに対し、(v) の結合物は水に可溶性である。従って、(iv）の結合物が多く形成されればされるほど、反応液の濁度が増加する。
この競争反応では、(i) の抗原は、(ii) の結合体と、限定量の (iii) の抗体に対して競争反応し、それによって、生じる不溶性の (iv) の結合物の量を減少させると同時に、反応溶液中の濁度を低下させる。そのため、試料中の抗原が高濃度になればなるほど、反応液の濁りが小さくなる。従って、濁りの度合いから試料中の抗原を測定することができる。
まず、反応試薬として混合する対象として、(i) 試料由来の抗原、(ii) 該抗原と同じ抗原またはその抗原の類似物と微細粒子との結合体、(iii）試薬としての抗体を用いるが、これら (i)-(iii) の抗原、結合体および抗体は、すべて水に可溶あるいは均一分散可能である。次いで、これらを混合して抗原抗体反応をさせると、(ｉv）(ii)の結合体と (iii) の抗体との結合物、および (v）(i) の抗原と (iii) の抗体との結合物の２つの抗原抗体反応物が競合して生成する。(iv) の結合物は水に不溶性で濁りが生じるのに対し、(v) の結合物は水に可溶性である。従って、(iv）の結合物が多く形成されればされるほど、反応液の濁度が増加する。
この競争反応では、(i) の抗原は、(ii) の結合体と、限定量の (iii) の抗体に対して競争反応し、それによって、生じる不溶性の (iv) の結合物の量を減少させると同時に、反応溶液中の濁度を低下させる。そのため、試料中の抗原が高濃度になればなるほど、反応液の濁りが小さくなる。従って、濁りの度合いから試料中の抗原を測定することができる。
ところで、この競争免疫反応において、(i) の試料中の抗原の濃度が高い場合、(ii) の結合体、(iii) の抗体の濃度を高くしなければならない。この場合、(iv) の結合物が多量に形成され濁りが濃すぎて測定不能になりやすい。
本発明においては、試薬の抗体として、水溶性ポリマーが共有結合された抗体を用いて抗原抗体反応を抑制し、反応系の濁りを、測定できる程度に減少させることができる。
本発明においては、試薬の抗体として、水溶性ポリマーが共有結合された抗体を用いて抗原抗体反応を抑制し、反応系の濁りを、測定できる程度に減少させることができる。
本発明において、測定対象の抗原は、生体試料に存在する物質、特に生体試料に高濃度に存在する蛋白質が好適である。具体的には、アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭが好適であり、アルブミン、ＩｇＧがさらに好適である。特に、アルブミンは、試料を無希釈で免疫測定法で定量することは、臨床検査業界では、実用化されていないにもかかわらず、本発明で実施可能な点から最も好適である。本発明において、試料とは、例えば、生体由来の液体試料であり、具体的には、血漿、血清、尿等を例示できる。
本発明に用いる抗体とは、測定すべき抗原に対する抗体であり、そのような抗体であればポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれをも用いることができる。
本発明に用いる抗体とは、測定すべき抗原に対する抗体であり、そのような抗体であればポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれをも用いることができる。
本発明において、抗原の類似物とは、抗原に類似した構造をもち、かつ、抗体と抗原抗体反応して結合可能な物質である。
微細粒子とは、免疫凝集反応に通常使用される微細粒子をそのまま使用することができる。最も一般的な微細粒子は、ラテックス粒子である。微細粒子は、通常０．０１〜０．５ミクロンのものが使用される。
本発明において、測定対象の抗原と同じ抗原またはその類似物を微細粒子に担持しておく場合、担持の方法は、疎水性相互作用による物理的吸着法や共有結合法等の通常の担持する方法を用いることができる。
微細粒子とは、免疫凝集反応に通常使用される微細粒子をそのまま使用することができる。最も一般的な微細粒子は、ラテックス粒子である。微細粒子は、通常０．０１〜０．５ミクロンのものが使用される。
本発明において、測定対象の抗原と同じ抗原またはその類似物を微細粒子に担持しておく場合、担持の方法は、疎水性相互作用による物理的吸着法や共有結合法等の通常の担持する方法を用いることができる。
抗体に共有結合させる水溶性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール類、ポリビニルアルコール、デキストラン、ポリ（N-ビニルピロリドン）、ポリアクリルアミド、ポリアクロイルモルホリン、ポリオキサゾリン、ポリ（N−２−（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）などが例示できる。なかでも、ポリエチレングリコール類、ポリビニルアルコールが好ましい。但し、ポリマーが室温で水溶性であることを条件とする。
ポリエチレングリコール類は、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−の繰り返し単位を有するポリマーであれば特に限定されず、ポリエチレングリコール単独重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化グリセリン、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトールまたはポリオキシエチル化グルコースが例示できる。なお、ポリエチレングリコール類は、一方の端部が炭素数１〜４、好ましくは炭素数１〜２のアルキル基で置換されていてもよい。
ポリエチレングリコール類としては、非置換ポリエチレングリコール、モノメチルポリエチレングリコールまたはポリオキシエチル化グリセリンが好ましく、特に、モノメチルポリエチレングリコールであることが好ましい。
ポリエチレングリコール類は、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−の繰り返し単位を有するポリマーであれば特に限定されず、ポリエチレングリコール単独重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化グリセリン、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトールまたはポリオキシエチル化グルコースが例示できる。なお、ポリエチレングリコール類は、一方の端部が炭素数１〜４、好ましくは炭素数１〜２のアルキル基で置換されていてもよい。
ポリエチレングリコール類としては、非置換ポリエチレングリコール、モノメチルポリエチレングリコールまたはポリオキシエチル化グリセリンが好ましく、特に、モノメチルポリエチレングリコールであることが好ましい。
ポリエチレングリコール類のような水溶性ポリマーと抗体とを共有結合させるには、ペプチドまたは蛋白質に水溶性ポリマーを共有結合させる慣用の方法によって行うことができる。例えば、ポリエチレングリコール類等の水溶性ポリマーの末端に、所望によりスペーサーを介して、カルボン酸の４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホネートエステルまたはＮ−ヒドロキシスクシイミドエステル（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）、またはｐ−ニトロフェニルカーボネートまたは２，４，５−トリクロルフェニルカーボネートを結合させたものを、抗体中のアミノ基と反応させ、アミド結合またはウレタン結合を生成することにより、水溶性ポリマーと抗体とを共有結合させることができる。
ポリマーの平均分子量は例えば、使用される抗体に応じて選択されるが、一般的には、約２００〜１０，０００であることが好ましく、３００〜４，０００であることがより好ましい。分子量が低すぎると抗原抗体反応を抑制することが不十分になることがあり、分子量が高すぎると、水溶性ポリマーと共有結合した抗体が、水に溶けにくくなることもある。
ポリマーの平均分子量は例えば、使用される抗体に応じて選択されるが、一般的には、約２００〜１０，０００であることが好ましく、３００〜４，０００であることがより好ましい。分子量が低すぎると抗原抗体反応を抑制することが不十分になることがあり、分子量が高すぎると、水溶性ポリマーと共有結合した抗体が、水に溶けにくくなることもある。
本発明においては、凝集の度合いを定量する方法としては、通常、生成する濁りを吸光度で測定するのが一般的であるが、凝集塊を肉眼で観察したり、凝集をしなかった粒子を計数することによっても実施することができる。
本発明の測定法を実施するには、例えば、次の具体的な方法が挙げられる。まず、試薬として、測定すべき抗原と同じ抗原または該抗原の類似物に担持した微細粒子を、りん酸緩衝液などの緩衝液に均一分散した第一試薬、並びに、水溶性ポリマーが共有結合した抗体を、りん酸緩衝液などの緩衝液に溶解した第二試薬を調製する。次いで、自動分析装置を用いて、測定すべき抗原を含む試料に、第一試薬および第二試薬を加えて、抗原抗体反応をさせ、生じる凝集割合を、例えば、波長８００nｍにて２ポイントエンド法により吸光度変化量として測定し、得られた測定値から、予め抗原濃度既知の標準試料を用いて作成した検量線に基づいて、目的とする試料中の抗原を定量することができる。
本発明の測定法を実施するには、例えば、次の具体的な方法が挙げられる。まず、試薬として、測定すべき抗原と同じ抗原または該抗原の類似物に担持した微細粒子を、りん酸緩衝液などの緩衝液に均一分散した第一試薬、並びに、水溶性ポリマーが共有結合した抗体を、りん酸緩衝液などの緩衝液に溶解した第二試薬を調製する。次いで、自動分析装置を用いて、測定すべき抗原を含む試料に、第一試薬および第二試薬を加えて、抗原抗体反応をさせ、生じる凝集割合を、例えば、波長８００nｍにて２ポイントエンド法により吸光度変化量として測定し、得られた測定値から、予め抗原濃度既知の標準試料を用いて作成した検量線に基づいて、目的とする試料中の抗原を定量することができる。
このような本発明の定量方法を実現するためには、抗原に対する抗体であってかつ水溶性ポリマーが共有結合された抗体と、抗原またはその抗原の類似物に担持した微細粒子とを含む抗原定量用キットを用いることができる。
抗原に対する抗体であってかつ水溶性ポリマーが共有結合された抗体、抗原またはその抗原の類似物に担持してある微細粒子は、それぞれ、定量方法で説明した抗体、微細粒子をそのまま用いることができる。
抗原に対する抗体であってかつ水溶性ポリマーが共有結合された抗体、抗原またはその抗原の類似物に担持してある微細粒子は、それぞれ、定量方法で説明した抗体、微細粒子をそのまま用いることができる。
以下の実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１並びに比較例１
抗体のＰＥＧ化の検討
抗体にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を結合させることにより、抗原抗体反応を制御することを目的として以下の実験を行った。なお、塩化ナトリウム等の免疫反応抑制剤を、ＰＥＧ化されていない抗体に添加し同様の実験を行って比較をした。
実施例１並びに比較例１
抗体のＰＥＧ化の検討
抗体にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を結合させることにより、抗原抗体反応を制御することを目的として以下の実験を行った。なお、塩化ナトリウム等の免疫反応抑制剤を、ＰＥＧ化されていない抗体に添加し同様の実験を行って比較をした。
１）ヒトアルブミン感作ラテックス粒子の調製
ラテックス粒子へのアルブミンの吸着は以下のように行った。
１％濃度とした粒径６７ｎｍのポリスチレン製ラテックス粒子懸濁液１００ｍLに、ヒト血清アルブミン（スクリプス社製）をりん酸緩衝液に１０％となるように溶解した溶液１００ｍLを混合し、室温にて２時間攪拌した。そして、１８,０００rpmで３時間遠心分離を行い、上清を廃棄し沈殿物を回収した。この沈殿物にりん酸緩衝液１００ｍLを加え、沈殿物を懸濁した後、再び遠心分離を行い、未吸着の剰余ヒト血清アルブミンを取り除いた。さらに遠心分離後の沈殿物に、りん酸緩衝液２０ｍLを加え、沈殿物を懸濁し超音波処理を行い、ラテックス粒子を完全に分散させた。このラテックス濃度５％のヒトアルブミン感作ラテックス粒子懸濁液は、冷蔵にて保存した。
ラテックス粒子へのアルブミンの吸着は以下のように行った。
１％濃度とした粒径６７ｎｍのポリスチレン製ラテックス粒子懸濁液１００ｍLに、ヒト血清アルブミン（スクリプス社製）をりん酸緩衝液に１０％となるように溶解した溶液１００ｍLを混合し、室温にて２時間攪拌した。そして、１８,０００rpmで３時間遠心分離を行い、上清を廃棄し沈殿物を回収した。この沈殿物にりん酸緩衝液１００ｍLを加え、沈殿物を懸濁した後、再び遠心分離を行い、未吸着の剰余ヒト血清アルブミンを取り除いた。さらに遠心分離後の沈殿物に、りん酸緩衝液２０ｍLを加え、沈殿物を懸濁し超音波処理を行い、ラテックス粒子を完全に分散させた。このラテックス濃度５％のヒトアルブミン感作ラテックス粒子懸濁液は、冷蔵にて保存した。
２）ＰＥＧ化抗ヒトアルブミンヤギ血清γフラクションの調製
ＰＥＧ化試薬として、CH３O（CH２CH２O)nCOCH２CH２CO−OSｕ（ただし、OSｕは、ＨＯＳｕ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）のＨが除去された残基である）で表される試薬（NOF 社製、商品名：SUNBRIGHT ME-020CS PEG 分子量 2000）を用いて行った。抗体のＰＥＧ化は以下のように行った。
まず、抗体として抗ヒトアルブミンヤギ血清γフラクション溶液（International Immunology Corporation 製、総タンパク濃度 6.5g/dL）１０ｍＬを用いた。それとは別に１ｇのＰＥＧ化試薬をりん酸緩衝液１０ｍＬに添加溶解しＰＥＧ化溶液として調製した。続いて、これら抗体溶液とＰＥＧ化溶液を１：１で混合し、室温にて1晩放置し、蛋白濃度３．２５ｇ／ｄＬのＰＥＧ化抗体を得た。
ＰＥＧ化試薬として、CH３O（CH２CH２O)nCOCH２CH２CO−OSｕ（ただし、OSｕは、ＨＯＳｕ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）のＨが除去された残基である）で表される試薬（NOF 社製、商品名：SUNBRIGHT ME-020CS PEG 分子量 2000）を用いて行った。抗体のＰＥＧ化は以下のように行った。
まず、抗体として抗ヒトアルブミンヤギ血清γフラクション溶液（International Immunology Corporation 製、総タンパク濃度 6.5g/dL）１０ｍＬを用いた。それとは別に１ｇのＰＥＧ化試薬をりん酸緩衝液１０ｍＬに添加溶解しＰＥＧ化溶液として調製した。続いて、これら抗体溶液とＰＥＧ化溶液を１：１で混合し、室温にて1晩放置し、蛋白濃度３．２５ｇ／ｄＬのＰＥＧ化抗体を得た。
３）血清アルブミン測定試薬の調製
アルブミンを吸着させたラテックス粒子およびＰＥＧ化した抗体を用いて、第一試薬および第二試薬を調製した。
第一試薬は、ヒトアルブミン感作ラテックス粒子懸濁液２０ｍLに、りん酸緩衝液５ｍLを加え、ラテックス濃度４％の懸濁液として用いた。第二試薬は、蛋白濃度３．２５ｇ／ｄＬのＰＥＧ化抗ヒトアルブミンヤギ血清γフラクション溶液１０ｍＬに、りん酸緩衝液１５ｍＬを加え、蛋白濃度１．３ｇ／ｄＬの溶液として用いた。この溶液は、当該γフラクション２０％濃度にあたる。
また、対照試薬として、ＰＥＧ化を施していない抗ヒトアルブミンヤギ血清γフラクションをりん酸緩衝液にて、蛋白濃度１．３ｇ／ｄＬとなるように希釈して使用した。
さらに、比較例１として、ＰＥＧ化を施していない抗ヒトアルブミンヤギ血清γフラクションに、免疫反応を抑止するために塩化ナトリウムを１０００ｍＭ添加し、蛋白濃度１．３ｇ／ｄＬのγフラクション溶液を調製した。
試料は、アルブミン濃度既知の血清を生理食塩水で適宜希釈して使用した。
アルブミンを吸着させたラテックス粒子およびＰＥＧ化した抗体を用いて、第一試薬および第二試薬を調製した。
第一試薬は、ヒトアルブミン感作ラテックス粒子懸濁液２０ｍLに、りん酸緩衝液５ｍLを加え、ラテックス濃度４％の懸濁液として用いた。第二試薬は、蛋白濃度３．２５ｇ／ｄＬのＰＥＧ化抗ヒトアルブミンヤギ血清γフラクション溶液１０ｍＬに、りん酸緩衝液１５ｍＬを加え、蛋白濃度１．３ｇ／ｄＬの溶液として用いた。この溶液は、当該γフラクション２０％濃度にあたる。
また、対照試薬として、ＰＥＧ化を施していない抗ヒトアルブミンヤギ血清γフラクションをりん酸緩衝液にて、蛋白濃度１．３ｇ／ｄＬとなるように希釈して使用した。
さらに、比較例１として、ＰＥＧ化を施していない抗ヒトアルブミンヤギ血清γフラクションに、免疫反応を抑止するために塩化ナトリウムを１０００ｍＭ添加し、蛋白濃度１．３ｇ／ｄＬのγフラクション溶液を調製した。
試料は、アルブミン濃度既知の血清を生理食塩水で適宜希釈して使用した。
各試薬の組成は以下の通りである。
りん酸緩衝液組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
第一試薬組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
ヒトアルブミン感作ラテックス粒子 ４％（ｖ／ｖ）
第二試薬組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
ＰＥＧ化抗ヒトアルブミンヤギ血清
γフラクション １．３ｇ／ｄＬ（蛋白濃度）
りん酸緩衝液組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
第一試薬組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
ヒトアルブミン感作ラテックス粒子 ４％（ｖ／ｖ）
第二試薬組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
ＰＥＧ化抗ヒトアルブミンヤギ血清
γフラクション １．３ｇ／ｄＬ（蛋白濃度）
第二試薬組成（対照試薬）
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
抗ヒトアルブミンヤギ血清
γフラクション（未処理） １．３ｇ／ｄＬ（蛋白濃度）
第二試薬組成（比較例１）
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
抗ヒトアルブミンヤギ血清
γフラクション（未処理） １．３ｇ／ｄＬ（蛋白濃度）
塩化ナトリウム １０００ ｍＭ
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
抗ヒトアルブミンヤギ血清
γフラクション（未処理） １．３ｇ／ｄＬ（蛋白濃度）
第二試薬組成（比較例１）
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
抗ヒトアルブミンヤギ血清
γフラクション（未処理） １．３ｇ／ｄＬ（蛋白濃度）
塩化ナトリウム １０００ ｍＭ
４）吸光度測定
血清アルブミンの測定は日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い、試料として血清２μＬに対し第一試薬２７０μＬ、第二試薬２７０μＬを反応させ、波長８００ｎｍにて１９〜３０測光ポイント間（Ｒ２添加後１分後から４分後に相当）において、２ポイントエンド法による吸光度変化量を測定した。
血清アルブミンの測定は日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い、試料として血清２μＬに対し第一試薬２７０μＬ、第二試薬２７０μＬを反応させ、波長８００ｎｍにて１９〜３０測光ポイント間（Ｒ２添加後１分後から４分後に相当）において、２ポイントエンド法による吸光度変化量を測定した。
５）測定結果
上記試薬を用いて、血清アルブミンを測定した際の吸光度変化量を表１に示した。
上記試薬を用いて、血清アルブミンを測定した際の吸光度変化量を表１に示した。
表１に示したように、ＰＥＧ化抗体を使用した場合には、アルブミン濃度が高くなるにしたがって、吸光度が減少する。これは、検体中のアルブミンと試薬に添加したラテックス粒子に結合したアルブミンの競争反応によるものである。
さらに、本発明法では反応に用いる抗体がＰＥＧ化されているため、反応吸光度が測定可能なレベルに抑えられている。これは、抗体をＰＥＧ化することにより、抗体に結合しようとするアルブミンが、立体障害を受け、吸光度が適切にコントロールされた結果と考えられる。しかし、抗体をＰＥＧ化することにより反応吸光度を自在にコントロールしうる知見は、本発明が初めてのものであり、まったく予測されがたいものであった。
一方、ＰＥＧ化していない抗体を使用した場合には、抗体とアルブミン感作ラテックス粒子との反応が制御されずに、自動分析装置の吸光度測定限界値を超えてしまい、全く測定できなくなってしまう。同様に塩化ナトリウムなどの免疫反応抑制剤を用いた場合においても、測定限界値を超えてしまい測定できなかった。
さらに、本発明法では反応に用いる抗体がＰＥＧ化されているため、反応吸光度が測定可能なレベルに抑えられている。これは、抗体をＰＥＧ化することにより、抗体に結合しようとするアルブミンが、立体障害を受け、吸光度が適切にコントロールされた結果と考えられる。しかし、抗体をＰＥＧ化することにより反応吸光度を自在にコントロールしうる知見は、本発明が初めてのものであり、まったく予測されがたいものであった。
一方、ＰＥＧ化していない抗体を使用した場合には、抗体とアルブミン感作ラテックス粒子との反応が制御されずに、自動分析装置の吸光度測定限界値を超えてしまい、全く測定できなくなってしまう。同様に塩化ナトリウムなどの免疫反応抑制剤を用いた場合においても、測定限界値を超えてしまい測定できなかった。
実施例２
血清アルブミンの測定
アルブミンを吸着させたラテックス粒子およびＰＥＧ化した抗体を用いて、血清アルブミンの測定を行った。
１）ヒトアルブミン感作ラテックス粒子の調製
１％濃度とした粒径６７ｎｍのポリスチレン製ラテックス粒子懸濁液２００ｍLに、ヒト血清アルブミンをりん酸緩衝液に１０％となるように溶解した溶液２００ｍLを混合し、室温にて２時間攪拌した。その後の遠心分離操作は、実施例１と同様に行った。遠心分離後の沈殿物に、りん酸緩衝液４０ｍＬを加え、沈殿物を懸濁後、超音波処理を行いラテックス粒子を分散させ、実施例１と同じく、ラテックス濃度５％のヒトアルブミン感作ラテックス粒子懸濁液を得た。
血清アルブミンの測定
アルブミンを吸着させたラテックス粒子およびＰＥＧ化した抗体を用いて、血清アルブミンの測定を行った。
１）ヒトアルブミン感作ラテックス粒子の調製
１％濃度とした粒径６７ｎｍのポリスチレン製ラテックス粒子懸濁液２００ｍLに、ヒト血清アルブミンをりん酸緩衝液に１０％となるように溶解した溶液２００ｍLを混合し、室温にて２時間攪拌した。その後の遠心分離操作は、実施例１と同様に行った。遠心分離後の沈殿物に、りん酸緩衝液４０ｍＬを加え、沈殿物を懸濁後、超音波処理を行いラテックス粒子を分散させ、実施例１と同じく、ラテックス濃度５％のヒトアルブミン感作ラテックス粒子懸濁液を得た。
２）ＰＥＧ化抗ヒトアルブミンヤギ血清γフラクションの調製
ＰＥＧ化抗ヒトアルブミンヤギ血清γフラクションは、実施例１の２）と同様にして調製した。
３）血清アルブミン測定試薬の調製
アルブミンを吸着させたラテックス粒子およびＰＥＧ化した抗体を用いて、実施例１と同様、第一試薬および第二試薬を調製した。
第一試薬は、ヒトアルブミン感作ラテックス粒子懸濁液４０ｍLに、りん酸緩衝液１０ｍLを加え、ラテックス濃度４％の懸濁液として用いた。第二試薬は、ＰＥＧ化抗ヒトアルブミンヤギ血清γフラクション溶液２０ｍＬに、りん酸緩衝液３０ｍＬを加え、蛋白濃度１．３ｇ／ｄＬの溶液として用いた。
ＰＥＧ化抗ヒトアルブミンヤギ血清γフラクションは、実施例１の２）と同様にして調製した。
３）血清アルブミン測定試薬の調製
アルブミンを吸着させたラテックス粒子およびＰＥＧ化した抗体を用いて、実施例１と同様、第一試薬および第二試薬を調製した。
第一試薬は、ヒトアルブミン感作ラテックス粒子懸濁液４０ｍLに、りん酸緩衝液１０ｍLを加え、ラテックス濃度４％の懸濁液として用いた。第二試薬は、ＰＥＧ化抗ヒトアルブミンヤギ血清γフラクション溶液２０ｍＬに、りん酸緩衝液３０ｍＬを加え、蛋白濃度１．３ｇ／ｄＬの溶液として用いた。
各試薬の組成は以下の通りである。
第一試薬組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
ヒトアルブミン感作ラテックス粒子 ４％（ｖ／ｖ）
第二試薬組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
ＰＥＧ化抗ヒトアルブミンヤギ血清
γフラクション １．３ｇ／ｄＬ（蛋白濃度）
第一試薬組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
ヒトアルブミン感作ラテックス粒子 ４％（ｖ／ｖ）
第二試薬組成
りん酸二水素ナトリウム二水和物 ２０ ｍＭ ｐＨ ７．５０
ＥＤＴＡ・２Ｎａ １ ｍＭ
ＰＥＧ化抗ヒトアルブミンヤギ血清
γフラクション １．３ｇ／ｄＬ（蛋白濃度）
４）吸光度測定
血清アルブミン濃度の測定は日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い、試料として血清２μＬに対し第一試薬２７０μＬ、第二試薬２７０μＬを反応させ、波長８００ｎｍにて１９〜３０測光ポイント間（Ｒ２添加後１分後から４分後に相当）において、２ポイントエンド法による吸光度変化量を測定した。
アルブミン濃度は、蛋白標準血清ＣＲＭ４７０にて値付けされた血清を標準液とし、当該機種の多点検量線作成機能を用いて作成された検量線より算出させた。また、ＴＩＡ法の「Ｎ−アッセイ ＴＩＡ Ｍｉｃｒｏ Ａｌｂ」（日東紡績）を対照試薬として相関性の確認を行った。なお、ＴＩＡ法試薬の試料は、血清を生理食塩水で１００倍に希釈したものを使用した。測定は同様に日立７１７０Ｓ型自動分析装置を使用し、指定パラメーターにしたがって行った。測定された結果を１００倍して血清アルブミン値とした。
血清アルブミン濃度の測定は日立７１７０Ｓ型自動分析装置を用い、試料として血清２μＬに対し第一試薬２７０μＬ、第二試薬２７０μＬを反応させ、波長８００ｎｍにて１９〜３０測光ポイント間（Ｒ２添加後１分後から４分後に相当）において、２ポイントエンド法による吸光度変化量を測定した。
アルブミン濃度は、蛋白標準血清ＣＲＭ４７０にて値付けされた血清を標準液とし、当該機種の多点検量線作成機能を用いて作成された検量線より算出させた。また、ＴＩＡ法の「Ｎ−アッセイ ＴＩＡ Ｍｉｃｒｏ Ａｌｂ」（日東紡績）を対照試薬として相関性の確認を行った。なお、ＴＩＡ法試薬の試料は、血清を生理食塩水で１００倍に希釈したものを使用した。測定は同様に日立７１７０Ｓ型自動分析装置を使用し、指定パラメーターにしたがって行った。測定された結果を１００倍して血清アルブミン値とした。
５）測定結果
Ａ）本発明の測定法の検量線
各標準液の吸光度変化量を表２に、また検量線を図１に示した。
Ａ）本発明の測定法の検量線
各標準液の吸光度変化量を表２に、また検量線を図１に示した。
表２および図１に示したように、ラテックス粒子へのアルブミン吸着量およびＰＥＧ化抗体をコントロールすることによって、血清検体を無希釈で測定可能となる。また、本発明法では、競争反応を利用するため、アルブミン濃度が高くなるにしたがって吸光度が減少する。このため、免疫反応を利用した測定試薬で問題となるプロゾーン現象の回避が可能となった。
これまでの免疫法による血清アルブミン測定は、検体を測定可能な濃度まで希釈する必要があるが、本発明法は無希釈のまま測定に供することができる。このため、検体希釈の正確性や操作性の面から本発明法は非常に有益な方法であるといえる。
これまでの免疫法による血清アルブミン測定は、検体を測定可能な濃度まで希釈する必要があるが、本発明法は無希釈のまま測定に供することができる。このため、検体希釈の正確性や操作性の面から本発明法は非常に有益な方法であるといえる。
Ｂ）ＴＩＡ法との相関性
血清アルブミン測定による本発明法とＴＩＡ法との相関性の結果を図２に示した。
ＴＩＡ法をＸ、本発明法をＹとして、相関性を確認したところ、Ｙ＝０．９７Ｘ＋０．０５、相関係数 ０．９７４（Ｎ＝３０）と良好な結果が得られた。血清アルブミン測定において免疫法は唯一正確に測定できる方法として知られており、免疫法の一つであるＴＩＡ法との相関性が確認されたことは、本発明法が血清アルブミンを正確に測定できるといえる。
血清アルブミン測定による本発明法とＴＩＡ法との相関性の結果を図２に示した。
ＴＩＡ法をＸ、本発明法をＹとして、相関性を確認したところ、Ｙ＝０．９７Ｘ＋０．０５、相関係数 ０．９７４（Ｎ＝３０）と良好な結果が得られた。血清アルブミン測定において免疫法は唯一正確に測定できる方法として知られており、免疫法の一つであるＴＩＡ法との相関性が確認されたことは、本発明法が血清アルブミンを正確に測定できるといえる。
本発明の測定法により、測定試薬である高価な抗体を少なく用い、プロゾーン現象を発現することなく、かつ、試料を無希釈のまま、アルブミン等の生体試料中に高濃度で存在する蛋白質である抗原を免疫測定することができる。
Claims (9)
- 測定すべき抗原を含む試料と、該抗原に対する抗体と、該抗原と同じ抗原または該抗原の類似物であって該抗体と抗原抗体反応し得る類似物に担持した微細粒子とを混合して、該抗体と、試料中の抗原および微細粒子が担持した該抗原と同じ抗原または該抗原の類似物との間で、抗原抗体反応を競合させて、該抗体と微細粒子が担持した該抗原と同じ抗原または該抗原の類似物との抗原抗体反応による凝集の度合いから、測定すべき抗原を定量する競合的均一系免疫凝集測定法において、該抗体は水溶性ポリマーが共有結合した抗体であることを特徴とする、抗原の測定法。
- 水溶性ポリマーがポリエチレングリコール類、ポリプロピレングリコール単独重合体またはポリビニルアルコールである請求項１の測定法。
- 水溶性ポリマーがポリエチレングリコール類である請求項１の測定法。
- 測定すべき抗原が生体試料中に高濃度に存在する蛋白質である請求項１から３のいずれかの測定法。
- 測定すべき抗原がアルブミンである請求項４の測定法。
- 測定すべき抗原を含む試料を希釈することなく実施する請求項１から５のいずれかの測定法。
- 測定すべき抗原に対する抗体であってかつ水溶性ポリマーが共有結合した抗体と、測定すべき抗原と同じ抗原またはその抗原の類似物であって該抗体と抗原抗体反応し得る類似物に担持した微細粒子を含む、競合的均一系免疫凝集測定法により抗原を測定するための抗原測定用キット。
- 水溶性ポリマーがポリエチレングリコール類、ポリプロピレングリコール単独重合体またはポリビニルアルコールである請求項６のキット。
- 水溶性ポリマーがポリエチレングリコール類である請求項７のキット。
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| JP2007545223A JP5239340B2 (ja) | 2005-11-18 | 2006-11-10 | 抗原の測定法およびそれに用いるキット |
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