JPH09304389A - 免疫測定試薬および免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】低濃度領域の反応性を低下させることなく、地
帯現象を抑制することにより、測定すべき抗原または抗
体が検体中に高濃度に含まれる場合であっても、検体を
希釈することなく検体を原液のままで用いることができ
る免疫測定試薬、およびこれを用いた免疫測定法を提供
する。 【解決手段】本発明による免疫測定試薬は、被測定物質
である抗原または抗体に対応する抗体または抗原を担持
した不溶性担体と、平均分子量１００，０００以上のポ
リビニルピロリドン、平均分子量４０，０００以上のデ
キストリンおよび平均分子量１００，０００以上のポリ
エチレングリコールからなる群より選ばれた少なくとも
１つの高分子物質とから構成されたものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、不溶性担体を使用
した免疫凝集反応に基づいて被測定物質を測定するため
に用いられ、検出感度が高く、測定領域が広い免疫測定
試薬および免疫測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】体液中の微量成分等の測定法のひとつと
して、目的とする被測定物質である抗原または抗体に対
応する抗体または抗原を不溶性担体に担持させ、被測定
物質との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の
度合いを検出することにより、被測定物質を測定する方
法がある。このような測定法としては、ラテックス凝集
反応、赤血球凝集反応等が知られている。

【０００３】この凝集の程度を検出する方法としては、
凝集の有無を肉眼で判定する方法と、反応液に光を照射
して散乱光あるいは透過光を測定する方法がある。光学
的な測定方法は試料中の抗原または抗体の定量に用いら
れている。

【０００４】検体中に高濃度に含まれる抗原または抗体
をこれらの凝集反応の測定により定量する場合には、検
体を希釈し、この検体希釈液中の抗原または抗体を測定
しなければならない。検体原液を希釈することなくその
まま用いると、いわゆる地帯現象を引き起こし、不溶性
担体の凝集が生じないために抗原または抗体を測定する
ことができない。地帯現象は、不溶性担体の表面に結合
された抗体または抗原の数に対し、過剰の抗原または抗
体が混合物中に存在すると、不溶性担体表面上の抗体ま
たは抗原がそれぞれ対応する抗原または抗体を独占して
しまい、混合物中の抗原または抗体を介して不溶性担体
どうしが架橋されることがなくなるので、不溶性担体の
凝集が生じなくなるために起きると考えられている。

【０００５】また、ＨＢＳ抗原の測定のような感染症関
連の項目等では、凝集の程度を測定することによって、
検体中の抗原または抗体を定量し、測定値が予め定めら
れたカットオフポイント以下であれば陰性、以上であれ
ば陽性と判定される。この測定においても、検体中に非
常に高濃度の抗原が存在すると、測定値がカットオフポ
イントより低値となり陰性と判定される場合があるた
め、大きな問題となる。

【０００６】このように、従来の測定法では、測定すべ
き抗原または抗体が検体中に高濃度に含まれる場合に
は、検体原液のままでは定量できないので、検体を希釈
して用いなければならない。大きい病院等では、検体の
数が数千、数万にも昇る場合があり、これらをいちいち
正確に希釈するには多大な時間と労力を要することにな
る。

【０００７】上記のような問題を解決するために、例え
ば、特開昭６２−２１８８６６号公報には、トリアルキ
ルアミン、その塩および第４級アンモニウム塩から選ば
れる水溶性化合物を抗原抗体反応系に添加する方法が提
案されている。しかし、この方法は反応性、すなわち吸
光度変化量を全体的に低下させることによって測定範囲
を広げており、したがって低濃度領域の感度も低下して
しまう難点がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、低濃
度領域の反応性を低下させることなく、地帯現象を抑制
することにより、測定すべき抗原または抗体が検体中に
高濃度に含まれる場合であっても、検体を希釈すること
なく検体を原液のままで用いることができるようになさ
れた免疫測定試薬、およびこれを用いた免疫測定法を提
供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
を解決するために鋭意研究した結果、不溶性担体浮遊液
と検体との混合物中に特定の高分子物質を存在せしめる
ことによって、低濃度域の反応性をそのまま保持し、地
帯現象を低減させることができることを見い出し、本発
明を完成するに至った。

【００１０】すなわち、本発明による免疫測定試薬は、
被測定物質である抗原または抗体に対応する抗体または
抗原を担持した不溶性担体と、平均分子量１００，００
０以上のポリビニルピロリドン、平均分子量４０，００
０以上のデキストランおよび平均分子量１００，０００
以上のポリエチレングリコールからなる群より選ばれた
少なくとも１つの高分子物質とから構成されたものであ
る。

【００１１】また、本発明による免疫測定法は、被測定
物質である抗原または抗体に対応する抗体または抗原を
不溶性担体に担持させ、被測定物質との抗原抗体反応に
より生じた不溶性担体の凝集の度合いを検出することに
より、被測定物質を測定するに当たり、該抗原抗体反応
の反応系に平均分子量１００，０００以上のポリビニル
ピロリドン、平均分子量４０，０００以上のデキストラ
ンおよび平均分子量１００，０００以上のポリエチレン
グリコールからなる群より選ばれた少なくとも１つの高
分子物質を存在させる方法である。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の用いられる高分子物質の
うち、平均分子量１００，０００以上のポリビニルピロ
リドン（以下、ＰＶＰと略す）とは、Ｎ−ビニル−２−
ピロリドンの重合体である。ＰＶＰの平均分子量は好ま
しくは１００，０００〜２，０００，０００、より好ま
しくは１５０，０００〜２，０００，０００である。

【００１３】また、デキストランの平均分子量は好まし
くは４０，０００〜２，０００，０００、より好ましく
は６０，０００〜２，０００，０００である。

【００１４】また、ポリエチレングリコール（以下、Ｐ
ＥＧと略す）としては、好ましくは１００，０００〜
５，０００，０００、より好ましくは１５０，０００〜
２，０００，０００の平均分子量を有するものが用いら
れる。

【００１５】平均分子量の測定方法は、ゲル透過クロマ
トグラフィー（ＧＰＣ）法、末端基定量法、粘度法等よ
り適宜選ばれる。例えば、ＧＰＣ法による分子量の測定
の１例を示す。サンプルをＴＨＦに溶かし、この溶液を
メンブレンフィルターで濾過し、得られた濾液をカラム
に注入する。カラムはＨＳＧ−３０（積水ファインケミ
カル社製、径７．９mm×長さ５００mm）を３本直列に繋
ぐ。キャリアとしてＴＨＦを流量１．０／ｍｉｎで流
し、検出機としては示差屈折計を用いる。

【００１６】本発明で用いられる不溶性担体としては、
有機高分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球および細
胞膜片等が挙げられる。有機高分子粉末としては、不溶
性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等が例
示でき、好ましくはラテックス懸濁液が用いられる。ラ
テックスとしては、例えばポリスチレン、スチレン−ス
チレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、ア
クリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチ
レン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合
体、ポリ酢酸ビニルアクリレート等がある。用いるラテ
ックスの平均粒径は、測定対象物の検出濃度あるいは測
定機器によって０．０５〜１．０μｍの範囲で適宜選択
される。無機物質粉末としてはシリカ、アルミナ等や、
金、チタン、鉄、ニッケルのような金属片等が例示され
る。

【００１７】本発明により測定されるべき物質は特に限
定されず、一般に抗原抗体反応を利用して測定し得る生
理活性物質はいずれも測定可能である。被測定物質とし
ては、タンパク、脂質等があり、より詳しくは、例え
ば、各種抗原、抗体、レセプター、酵素等が挙げられ
る。具体的には、ヒトＣ反応性たんぱく（ＣＲＰ）、ヒ
トフィブリノーゲン、リウマチ因子、ヒトα−フェトプ
ロティン（ＡＦＰ）、抗ストレプトリジンＯ抗体、梅毒
トレポネーマ抗体、梅毒脂質抗原に対する抗体、ＨＢＳ
抗体、ＨＢＳ抗原、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗体等が例示さ
れる。

【００１８】本発明により被測定物質を測定する方法に
おいて、測定系は、例えば、ラテックス凝集反応や血球
凝集法等の凝集法である。試薬の調製は、まず公知の方
法により、不溶性担体に抗原または抗体を物理的あるい
は化学的結合により感作させる。用いる抗体は、免疫グ
ロブリン分子自体のほか、Ｆａｂ' やＦ（ａｂ）₂ のよ
うな断片であってもよい。

【００１９】次に、反応系に上記高分子物質を存在させ
ておく方法について述べる。例えば、ラテックス試薬を
用いた抗原抗体反応により、被測定物質を測定する場合
には、被測定物質である抗原または抗体に対応する抗体
または抗原を感作したラテックス試薬に予め上記高分子
物質を添加しておく。別法としては、上記高分子物質を
含まないラテックス試薬を使用することも可能であり、
この場合には抗原抗体反応時に上記高分子物質が該反応
系に存在するようにすればよい。例えば、検体に予め上
記高分子物質を添加しておく方法；使用する緩衝液にこ
れを加えておく方法等があり、特に限定されない。言い
換えれば、本発明の測定試薬は、例えば、抗体または抗
原を感作した不溶性担体と上記高分子物質との両方を含
む１液系の試薬；抗体または抗原を感作した不溶性担体
を含む第１試薬と、上記高分子物質を含む緩衝液である
第２試薬とで構成される２液系の試薬；等種々の形態で
ありうる。

【００２０】測定系においては、上記のような試薬を用
いて凝集反応を行い、生じた凝集の度合いを光学的に観
察もしくは目視観察することにより被測定物質が測定さ
れ得る。具体的には、不溶性担体の凝集の程度を光学的
に検出する方法においては、散乱光強度、吸光度または
透過光強度を測定する光学機器を用いて測定を行う。好
ましい測定波長は３００〜２４００ｎｍである。測定方
法は、公知の方法に従い、用いる不溶性担体の大きさ、
あるいは濃度の選択、反応時間の設定により散乱強度、
吸光度または透過光強度の増加もしくは減少を測定する
ことにより行われる。また、これらの方法を併用するこ
とも可能である。

【００２１】不溶性担体の凝集の程度を肉眼で判定する
試薬においては、通常、試料と感作不溶性担体を含む溶
液を判定板上で混合し、１〜５分間揺り動かした後、凝
集の有無を判定する。凝集判定には、単に肉眼判定以外
に、凝集状態をビデオカメラで撮影し、画像処理を施す
ことも可能である。

【００２２】この免疫測定法において、抗原抗体反応の
反応系に存在させる上記高分子物質の濃度は、上記高分
子物質の分子量、共存する塩、タンパク、糖類等の添加
物の濃度によって適宜選ばれる。

【００２３】上記高分子物質の濃度は、一般には、該反
応系に、上記ＰＶＰが好ましくは０．０１〜３重量％、
より好ましくは０．０５〜１．５重量％、上記デキスト
ランが好ましくは０．０１〜７重量％、より好ましくは
０．０５〜５重量％、および上記ＰＥＧが好ましくは
０．０１〜３重量％、より好ましくは０．０５〜１．５
重量％になるように、それぞれ調整される。上記高分子
物質濃度が低すぎると、上記高分子物質と抗原または抗
体との相互作用が小さくなる結果、増感効果が得られ
ず、逆に高すぎると、不溶性担体が非特異的に凝集し易
くなる。

【００２４】上記抗原抗体反応の条件は通常の条件と同
様であってよく、反応媒体としては、被測定物質の種類
に応じた各種緩衝液が適宜選ばれる。この緩衝液は、被
測定物質を失活させることがなく、かつ抗原抗体反応を
阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであれ
ばよい。例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリ
ス緩衝液が使用される。反応のｐＨは、５〜１０、特に
６〜８が好ましい。反応温度は０〜５０℃、特に２０〜
４０℃が好ましい。反応時間は適宜決められる。反応時
には、さらに測定系の特異性を高めるために、塩化コリ
ン等の第４級アンモニウム塩、ＥＤＴＡ、ポリアニオ
ン、カオトロピックイオン（Ｃ１^- 、Ｉ^-、ＳＣＮ
^- 等）、ゼラチン等を添加することも可能である。

【００２５】本発明によれば、上記特定の高分子物質の
働きにより、高感度かつ広い測定範囲で測定が可能であ
る。

【００２６】以下に、本発明の実施例を述べ、その効果
を具体的に説明する。

【００２７】

【実施例】本発明を以下の実施例にて説明する。

【００２８】実施例１ ヒトＣＲＰの測定試薬および測定法（凝集像の肉眼観察
による検出方法） (1) 抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液の調製 抗ヒトＣＲＰ抗体を０．５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で
０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．８）に溶解した液１
０ｍｌに、平均粒径０．６６μｍのポリスチレンラテッ
クス（固形分１０％、積水化学社製）１ｍｌを添加し、
３７℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にウシ血
清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記する）を１重量％含
有するグリシン緩衝液（ｐＨ８．８）を添加し、３７
℃、６０分間攪拌した後、この混合物を４℃にて６０分
間、１８，０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈澱
物にＢＳＡを０．５重量％含有する０．１Ｍグリシン緩
衝液（ｐＨ８．８）１０ｍｌを添加し、ラテックスを懸
濁させ、抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を調製した。

【００２９】(2) ＰＶＰ溶液の調製 平均分子量２２０，０００のＰＶＰ（ＢＡＳＦ社製、Ｐ
ＶＰ、Ｋ６０）を、ＢＳＡを１重量％含有するリン酸−
食塩緩衝液（０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、
０．１Ｍ ＮａＣｌ）に、１．５重量％の濃度になるよ
うに溶解した。

【００３０】(3) ヒトＣＲＰ測定試薬 本実施例のヒトＣＲＰ測定試薬は、上記(1) 項の抗ＣＲ
Ｐ抗体感作ラテックスからなる第１試薬と、上記(2) 項
のＰＶＰ溶液からなる第２試薬とから構成される２液系
の試薬である。

【００３１】(4) 標準ＣＲＰ液 ＣＲＰを０、０．１、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍ
ｌ濃度で含むヒト血清を上記(2) 項のＰＶＰ溶液でそれ
ぞれ１：１に希釈して、ＣＲＰ濃度０．０〜１．０μｇ
／ｍｌを含む標準ＣＲＰ液を調製した。

【００３２】(5) 高ＣＲＰ検体血清 ＣＲＰを４０ｍｇ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を上記(2)
項のＰＶＰ溶液で１：１に希釈して、ＣＲＰ濃度２０ｍ
ｇ／ｍｌを含む標準ＣＲＰ液を調製した。

【００３３】(6) 抗原抗体反応 標準ＣＲＰ液を５０μｌを判定板上に採り、これに上記
(1) 項の抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液５０μｌを滴下
し混和する。判定板を手に持ち、緩やかに揺動し２分後
に凝集の度合いを肉眼で観察した。

【００３４】実施例２ 実施例１におけるＰＶＰ溶液の調製の項を、次のように
して行ったことを除いては、実施例１と同様にして、ヒ
トＣＲＰ測定試薬を作成した。

【００３５】ＰＶＰ溶液の調製：平均分子量１，２０
０，０００のＰＶＰ（ＢＡＳＦ社製、ＰＶＰ Ｋ９０）
を、実施例１の(2) 項で使用したものと同じ緩衝液に
１．２重量％の濃度になるように溶解した。

【００３６】標準ＣＲＰ液は次のように調製した。

【００３７】標準ＣＲＰ液の調製：ＣＲＰを０、０．
１、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍｌ濃度で含むヒト
血清を上記のＰＶＰ溶液でそれぞれ１：１に希釈して、
ＣＲＰ濃度０〜１．０μｇ／ｍｌを含む標準ＣＲＰ液を
調製した。

【００３８】高ＣＲＰ検体血清は次のように調製した。

【００３９】高ＣＲＰ検体血清の調製：ＣＲＰを４０ｍ
ｇ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を上記のＰＶＰ溶液で１：
１に希釈して、ＣＲＰ濃度２０ｍｇ／ｍｌを含む標準Ｃ
ＲＰ液を調製した。

【００４０】上記の標準ＣＲＰおよび高ＣＲＰ検体血清
を使用し、実施例１と同様に抗原抗体反応を行った。

【００４１】比較例１ 実施例１におけるＰＶＰ溶液の調製の項を、次のように
して行ったことを除いては、実施例１と同様にして、ヒ
トＣＲＰ測定試薬を作成した。

【００４２】ＰＶＰ溶液の調製：平均分子量４０，００
０のＰＶＰ（ＢＡＳＦ社製、ＰＶＰＫ３０）を、実施例
１の(2) 項で使用したものと同じ緩衝液に３．０重量％
の濃度になるように溶解した。

【００４３】標準ＣＲＰ液は次のように調製した。

【００４４】標準ＣＲＰ液の調製：ＣＲＰを０、０．
１、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍｌ濃度で含むヒト
血清を上記のＰＶＰ溶液でそれぞれ１：１に希釈して、
ＣＲＰ濃度０〜１．０μｇ／ｍｌを含む標準ＣＲＰ液を
調製した。

【００４５】高ＣＲＰ検体血清は次のように調製した。

【００４６】高ＣＲＰ検体血清の調製：ＣＲＰを４０ｍ
ｇ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を上記のＰＶＰ溶液で１：
１に希釈して、ＣＲＰ濃度２０ｍｇ／ｍｌを含む標準Ｃ
ＲＰ液を調製した。

【００４７】上記の標準ＣＲＰ液および高いＣＲＰ検体
血清を使用し、実施例１と同様に抗原抗体反応を行っ
た。

【００４８】実施例１、２および比較例１の結果を表１
に示す。

【００４９】

【表１】

【００５０】表１より明らかなように、平均分子量４
０，０００のＰＶＰでは、高ＣＲＰ検体血清は凝集を示
さず陰性と判定されるが、平均分子量２２０，０００以
上のＰＶＰを使用した場合、ＣＲＰの濃度０．０５μｇ
／ｍｌまで検出可能で、かつ高ＣＲＰ検体血清陽性と判
定され、地帯現象は認められない。

【００５１】実施例３ ヒトＨＢＳ抗原測定試薬および測定法（光学的な検出方
法） (1) 抗ＨＢＳ抗体感作ラテックス液の調製 抗ＨＢＳ抗体を１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．０３６Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解した液１．２５ｍｌ
に、平均粒径０．４６４μｍのポリスチレンラテックス
（固形分１０％、積水化学社製）１ｍｌを添加し、４０
℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にＢＳＡを１
重量％含有するリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、
４０℃にて６０分間攪拌した後、この混合液を１８，０
００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にＢＳＡ
０．５重量％含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）２０ｍｌを添加し、ラテックスを懸濁させ、抗ＨＢ
Ｓ抗体感作ラテックス液を調製した。

【００５２】(2) ＰＶＰ溶液の調製 平均分子量２２０，０００のＰＶＰ（ＢＡＳＦ社製、Ｐ
ＶＰ、Ｋ６０）を、１重量％ＢＳＡを含有する０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、１．５重量％の濃度
になるように溶解した。

【００５３】(3) ヒトＨＢＳ抗原測定試薬 本実施例のヒトＨＢＳ抗原測定試薬は、上記(1) 項の抗
ＨＢＳ抗体感作ラテックスからなる第１試薬と、上記
(2) 項のＰＶＰ溶液からなる第２試薬とから構成される
２液系の試薬である。

【００５４】(4) 標準ＨＢＳ抗原液 ＨＢＳ抗原を０、５０、１００、３００、５００ＩＵ／
ｍｌ濃度で含むヒト血清を使用した。

【００５５】(5) 高ＨＢＳ抗原検体血清 ＨＢＳ抗原を６２５，０００ＩＵ／ｍｌ濃度で含むヒト
血清を使用した。

【００５６】(6) 測定方法 標準ＨＢＳ抗原液２０μｌに、上記(2) 項のＰＶＰ液１
５０μｌを混合し、３７℃で適時保持した後、上記(1)
項の抗ＨＢＳ抗体感作ラテックス液１５０μｌを添加攪
拌し、この後、１分後および５分後の波長７００ｎｍで
の吸光度を測定した。この間の吸光度の変化量を吸光度
変化量（ΔAbs ）とする。測定は日立自動分析装置７０
５０形を用いて行った。

【００５７】実施例４ 実施例３におけるＰＶＰ溶液の調製の項を、次のように
して行ったことを除いては、実施例３と同様にして、Ｈ
ＢＳ抗原測定試薬を作成した。

【００５８】ＰＶＰ溶液の調製：平均分子量１，２０
０，０００のＰＶＰ（ＢＡＳＦ社製、ＰＶＰ Ｋ９０）
を、実施例３の(2) 項で使用したものと同じ緩衝液に
１．２重量％の濃度になるように溶解した。

【００５９】比較例２ 実施例３におけるＰＶＰ溶液の調製の項を、次のように
して行ったことを除いては、実施例３と同様にして、Ｈ
ＢＳ抗原測定試薬を作成した。

【００６０】ＰＶＰ溶液の調製：平均分子量４０，００
０のＰＶＰ（ＢＡＳＦ社製、ＰＶＰＫ３０）を、実施例
３の(2) 項で使用したものと同じ緩衝液に３．０重量％
の濃度になるように溶解した。

【００６１】実施例３、４および比較例２の結果を表２
および図１に示す。

【００６２】

【表２】

【００６３】実施例３、４および比較例２におけるカッ
トオフポイントは２５ＩＵ／ｍｌであるため、高値検定
を測定した場合、実施例３、４では陽性と判定される
が、比較例２では陰性と判定される。

【００６４】表２および図１から明らかなように、平均
分子量２２０，０００以上のＰＶＰを使用した場合、平
均分子量４０，０００のものと比較し、反応性が高く、
かつ地帯現象が抑制されるため、高値検体でも陽性と判
定され、高感度で広い濃度範囲で測定が可能である。

【００６５】実施例５ ヒトＣＲＰの測定試薬および測定法（凝集像の肉眼観察
による検出方法） (1) 抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液の調製 抗ヒトＣＲＰ抗体を０．５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で
０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．８）に溶解した液１
０ｍｌに、平均粒径０．６６μｍのポリスチレンラテッ
クス（固形分１０％、積水化学社製）１ｍｌを添加し、
３７℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にウシ血
清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記する）を１重量％含
有するグリシン緩衝液（ｐＨ８．８）を添加し、３７
℃、６０分間攪拌した後、この混合物を４℃にて６０分
間、１８，０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈澱
物にＢＳＡを０．５重量％含有する０．１Ｍグリシン緩
衝液（ｐＨ８．８）１０ｍｌを添加し、ラテックスを懸
濁させ、抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を調製した。

【００６６】(2) デキストラン溶液の調製 平均分子量７９，０００のデキストラン（ＳＩＧＭＡ社
製、デキストラン、平均分子量６０，０００〜９０，０
００）を、ＢＳＡを１重量％含有するリン酸−食塩緩衝
液（０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１Ｍ
ＮａＣｌ）に、３．０重量％の濃度になるように溶解
した。

【００６７】(3) ヒトＣＲＰ測定試薬 本実施例のヒトＣＲＰ測定試薬は、上記(1) 項の抗ＣＲ
Ｐ抗体感作ラテックスからなる第１試薬と、上記(2) 項
のデキストラン溶液からなる第２試薬とから構成される
２液系の試薬である。

【００６８】(4) 標準ＣＲＰ液 ＣＲＰを０、０．１、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍ
ｌ濃度で含むヒト血清を上記(2) 項のデキストラン溶液
でそれぞれ１：１に希釈して、ＣＲＰ濃度０．０〜１．
０μｇ／ｍｌを含む標準ＣＲＰ液を調製した。

【００６９】(5) 高ＣＲＰ検体血清 ＣＲＰを４０ｍｇ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を上記(2)
項のデキストラン溶液で１：１に希釈して、ＣＲＰ濃度
２０ｍｇ／ｍｌを含む標準ＣＲＰ液を調製した。

【００７０】(6) 抗原抗体反応 標準ＣＲＰ液を５０μｌを判定板上に採り、これに上記
(1) 項の抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液５０μｌを滴下
し混和する。判定板を手に持ち、緩やかに揺動し２分後
に凝集の度合いを肉眼で観察した。

【００７１】実施例６ 実施例５におけるデキストラン溶液の調製の項を、次の
ようにして行ったことを除いては、実施例５と同様にし
て、ヒトＣＲＰ測定試薬を作成した。

【００７２】デキストラン溶液の調製：平均分子量５０
２，０００のデキストラン（ＳＩＧＭＡ社製、平均分子
量５００，０００）を、実施例５の(2) 項で使用したも
のと同じ緩衝液に１．５重量％の濃度になるように溶解
した。

【００７３】標準ＣＲＰ液は次のように調製した。

【００７４】標準ＣＲＰ液の調製：ＣＲＰを０、０．
１、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍｌ濃度で含むヒト
血清を上記のデキストラン溶液でそれぞれ１：１に希釈
して、ＣＲＰ濃度０〜１．０μｇ／ｍｌを含む標準ＣＲ
Ｐ液を調製した。

【００７５】高ＣＲＰ検体血清は次のように調製した。

【００７６】高ＣＲＰ検体血清の調製：ＣＲＰを４０ｍ
ｇ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を上記のデキストラン溶液
で１：１に希釈して、ＣＲＰ濃度２０ｍｇ／ｍｌを含む
標準ＣＲＰ液を調製した。

【００７７】上記の標準ＣＲＰおよび高ＣＲＰ検体血清
を使用し、実施例５と同様に抗原抗体反応を行った。

【００７８】比較例３ 実施例５におけるデキストラン溶液の調製の項を、次の
ようにして行ったことを除いては、実施例５と同様にし
て、ヒトＣＲＰ測定試薬を作成した。

【００７９】デキストラン溶液の調製：平均分子量１
７，０００のデキストラン（ＳＩＧＭＡ社製、平均分子
量１５，０００〜２０，０００）を、実施例５の(2) 項
で使用したものと同じ緩衝液に３．５重量％の濃度にな
るように溶解した。

【００８０】標準ＣＲＰ液は次のように調製した。

【００８１】標準ＣＲＰ液の調製：ＣＲＰを０、０．
１、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍｌ濃度で含むヒト
血清を上記のデキストラン溶液でそれぞれ１：１に希釈
して、ＣＲＰ濃度０〜１．０μｇ／ｍｌを含む標準ＣＲ
Ｐ液を調製した。

【００８２】高ＣＲＰ検体血清は次のように調製した。

【００８３】高ＣＲＰ検体血清の調製：ＣＲＰを４０ｍ
ｇ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を上記のデキストラン溶液
で１：１に希釈して、ＣＲＰ濃度２０ｍｇ／ｍｌを含む
標準ＣＲＰ液を調製した。

【００８４】上記の標準ＣＲＰ液および高いＣＲＰ検体
血清を使用し、実施例５と同様に抗原抗体反応を行っ
た。

【００８５】実施例５、６および比較例３の結果を表３
に示す。

【００８６】

【表３】

【００８７】表３より明らかなように、平均分子量１
７，０００のデキストランでは、高ＣＲＰ検体血清は凝
集を示さず陰性と判定されるが、平均分子量７９，００
０以上のデキストランを使用した場合、ＣＲＰの濃度
０．０５μｇ／ｍｌまで検出可能で、かつ高ＣＲＰ検体
血清陽性と判定され、地帯現象は認められない。

【００８８】実施例７ ヒトＨＢＳ抗原測定試薬および測定法（光学的な検出方
法） (1) 抗ＨＢＳ抗体感作ラテックス液の調製 抗ＨＢＳ抗体を１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．０３６Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解した液１．２５ｍｌ
に、平均粒径０．４６４μｍのポリスチレンラテックス
（固形分１０％、積水化学社製）１ｍｌを添加し、４０
℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にＢＳＡを１
重量％含有するリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、
４０℃にて６０分間攪拌した後、この混合液を１８，０
００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にＢＳＡ
０．５重量％含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）２０ｍｌを添加し、ラテックスを懸濁させ、抗ＨＢ
Ｓ抗体感作ラテックス液を調製した。

【００８９】(2) デキストラン溶液の調製 平均分子量７９，０００のデキストラン（ＳＩＧＭＡ社
製、平均分子量６０，０００〜９０，０００）を、１重
量％ＢＳＡを含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に、３．０重量％の濃度になるように溶解し
た。

【００９０】(3) ヒトＨＢＳ抗原測定試薬 本実施例のヒトＨＢＳ抗原測定試薬は、上記(1) 項の抗
ＨＢＳ抗体感作ラテックスからなる第１試薬と、上記
(2) 項のデキストラン溶液からなる第２試薬とから構成
される２液系の試薬である。

【００９１】(4) 標準ＨＢＳ抗原液 ＨＢＳ抗原を０、５０、１００、３００、５００ＩＵ／
ｍｌ濃度で含むヒト血清を使用した。

【００９２】(5) 高ＨＢＳ抗原検体血清 ＨＢＳ抗原を６２５，０００ＩＵ／ｍｌ濃度で含むヒト
血清を使用した。

【００９３】(6) 測定方法 標準ＨＢＳ抗原液２０μｌに、上記(2) 項のデキストラ
ン液１５０μｌを混合し、３７℃で適時保持した後、上
記(1) 項の抗ＨＢＳ抗体感作ラテックス液１５０μｌを
添加攪拌し、この後、１分後および５分後の波長７００
ｎｍでの吸光度を測定した。この間の吸光度の変化量を
吸光度変化量（ΔAbs ）とする。測定は日立自動分析装
置７０５０形を用いて行った。

【００９４】実施例８ 実施例７におけるデキストラン溶液の調製の項を、次の
ようにして行ったことを除いては、実施例７と同様にし
て、ＨＢＳ抗原測定試薬を作成した。

【００９５】デキストラン溶液の調製：平均分子量５０
２，０００のデキストラン（ＳＩＧＭＡ社製、平均分子
量５００，０００）を、実施例７の(2) 項で使用したも
のと同じ緩衝液に１．５重量％の濃度になるように溶解
した。

【００９６】比較例４ 実施例７におけるデキストラン溶液の調製の項を、次の
ようにして行ったことを除いては、実施例７と同様にし
て、ＨＢＳ抗原測定試薬を作成した。

【００９７】デキストラン溶液の調製：平均分子量１
７，０００のデキストラン（ＳＩＧＭＡ社製、平均分子
量１５，０００〜２０，０００）を、実施例７の(2) 項
で使用したものと同じ緩衝液に３．５重量％の濃度にな
るように溶解した。

【００９８】実施例７、８および比較例４の結果を表４
および図２示す。

【００９９】

【表４】

【０１００】実施例７、８および比較例４におけるカッ
トオフポイントは２５ＩＵ／ｍｌであるため、高値検定
を測定した場合、実施例７、８では陽性と判定される
が、比較例４では陰性と判定される。

【０１０１】表４および図２から明らかなように、平均
分子量７９，０００以上のデキストランを使用した場
合、平均分子量１７，０００のものと比較し、反応性が
高く、かつ地帯現象が抑制されるため、高値検体でも陽
性と判定され、高感度で広い濃度範囲で測定が可能であ
る。

【０１０２】実施例９ ヒトＣＲＰの測定試薬および測定法（凝集像の肉眼観察
による検出方法） (1) 抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液の調製 抗ヒトＣＲＰ抗体を０．５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度で
０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．８）に溶解した液１
０ｍｌに、平均粒径０．６６μｍのポリスチレンラテッ
クス（固形分１０％、積水化学社製）１ｍｌを添加し、
３７℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にウシ血
清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記する）を１重量％含
有するグリシン緩衝液（ｐＨ８．８）を添加し、３７
℃、６０分間攪拌した後、この混合物を４℃にて６０分
間、１８，０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈澱
物にＢＳＡを０．５重量％含有する０．１Ｍグリシン緩
衝液（ｐＨ８．８）１０ｍｌを添加し、ラテックスを懸
濁させ、抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液を調製した。

【０１０３】(2) ＰＥＧ溶液の調製 平均分子量１５０，０００のＰＥＧを、ＢＳＡを１重量
％含有するリン酸−食塩緩衝液（０．０５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）、０．１Ｍ ＮａＣｌ）に、１．５重
量％の濃度になるように溶解した。

【０１０４】(3) ヒトＣＲＰ測定試薬 本実施例のヒトＣＲＰ測定試薬は、上記(1) 項の抗ＣＲ
Ｐ抗体感作ラテックスからなる第１試薬と、上記(2) 項
のＰＥＧ溶液からなる第２試薬とから構成される２液系
の試薬である。

【０１０５】(4) 標準ＣＲＰ液 ＣＲＰを０、０．１、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍ
ｌ濃度で含むヒト血清を上記(2) 項のＰＥＧ溶液でそれ
ぞれ１：１に希釈して、ＣＲＰ濃度０．０〜１．０μｇ
／ｍｌを含む標準ＣＲＰ液を調製した。

【０１０６】(5) 高ＣＲＰ検体血清 ＣＲＰを４０ｍｇ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を上記(2)
項のＰＥＧ溶液で１：１に希釈して、ＣＲＰ濃度２０ｍ
ｇ／ｍｌを含む標準ＣＲＰ液を調製した。

【０１０７】(6) 抗原抗体反応 標準ＣＲＰ液を５０μｌを判定板上に採り、これに上記
(1) 項の抗ＣＲＰ抗体感作ラテックス液５０μｌを滴下
し混和する。判定板を手に持ち、緩やかに揺動し２分後
に凝集の度合いを肉眼で観察した。

【０１０８】実施例１０ 実施例９におけるＰＥＧ溶液の調製の項を、次のように
して行ったことを除いては、実施例９と同様にして、ヒ
トＣＲＰ測定試薬を作成した。

【０１０９】ＰＥＧ溶液の調製：平均分子量５００，０
００のＰＥＧを、実施例９の(2) 項で使用したものと同
じ緩衝液に０．５重量％の濃度になるように溶解した。

【０１１０】標準ＣＲＰ液は次のように調製した。

【０１１１】標準ＣＲＰ液の調製：ＣＲＰを０、０．
１、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍｌ濃度で含むヒト
血清を上記のＰＥＧ溶液でそれぞれ１：１に希釈して、
ＣＲＰ濃度０〜１．０μｇ／ｍｌを含む標準ＣＲＰ液を
調製した。

【０１１２】高ＣＲＰ検体血清は次のように調製した。

【０１１３】高ＣＲＰ検体血清の調製：ＣＲＰを４０ｍ
ｇ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を上記のＰＥＧ溶液で１：
１に希釈して、ＣＲＰ濃度２０ｍｇ／ｍｌを含む標準Ｃ
ＲＰ液を調製した。

【０１１４】上記の標準ＣＲＰおよび高ＣＲＰ検体血清
を使用し、実施例９と同様に抗原抗体反応を行った。

【０１１５】比較例５ 実施例９におけるＰＥＧ溶液の調製の項を、次のように
して行ったことを除いては、実施例９と同様にして、ヒ
トＣＲＰ測定試薬を作成した。

【０１１６】ＰＥＧ溶液の調製：平均分子量５０，００
０のＰＥＧを、実施例９の(2) 項で使用したものと同じ
緩衝液に３．０重量％の濃度になるように溶解した。

【０１１７】標準ＣＲＰ液は次のように調製した。

【０１１８】標準ＣＲＰ液の調製：ＣＲＰを０、０．
１、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍｌ濃度で含むヒト
血清を上記のＰＥＧ溶液でそれぞれ１：１に希釈して、
ＣＲＰ濃度０〜１．０μｇ／ｍｌを含む標準ＣＲＰ液を
調製した。

【０１１９】高ＣＲＰ検体血清は次のように調製した。

【０１２０】高ＣＲＰ検体血清の調製：ＣＲＰを４０ｍ
ｇ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を上記のＰＥＧ溶液で１：
１に希釈して、ＣＲＰ濃度２０ｍｇ／ｍｌを含む標準Ｃ
ＲＰ液を調製した。

【０１２１】上記の標準ＣＲＰ液および高いＣＲＰ検体
血清を使用し、実施例９と同様に抗原抗体反応を行っ
た。

【０１２２】実施例９、１０および比較例５の結果を表
５に示す。

【０１２３】

【表５】

【０１２４】表５より明らかなように、平均分子量５
０，０００のＰＥＧでは、高ＣＲＰ検体血清は凝集を示
さず陰性と判定されるが、平均分子量１５０，０００以
上のＰＥＧを使用した場合、ＣＲＰの濃度０．０５μｇ
／ｍｌまで検出可能で、かつ高ＣＲＰ検体血清陽性と判
定され、地帯現象は認められない。

【０１２５】実施例１１ ヒトＨＢＳ抗原測定試薬および測定法（光学的な検出方
法） (1) 抗ＨＢＳ抗体感作ラテックス液の調製 抗ＨＢＳ抗体を１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．０３６Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解した液１．２５ｍｌ
に、平均粒径０．４６４μｍのポリスチレンラテックス
（固形分１０％、積水化学社製）１ｍｌを添加し、４０
℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にＢＳＡを１
重量％含有するリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、
４０℃にて６０分間攪拌した後、この混合液を１８，０
００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にＢＳＡ
０．５重量％含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）２０ｍｌを添加し、ラテックスを懸濁させ、抗ＨＢ
Ｓ抗体感作ラテックス液を調製した。

【０１２６】(2) ＰＥＧ溶液の調製 平均分子量１５０，０００のＰＥＧを、１重量％ＢＳＡ
を含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、
１．５重量％の濃度になるように溶解した。

【０１２７】(3) ヒトＨＢＳ抗原測定試薬 本実施例のヒトＨＢＳ抗原測定試薬は、上記(1) 項の抗
ＨＢＳ抗体感作ラテックスからなる第１試薬と、上記
(2) 項のＰＥＧ溶液からなる第２試薬とから構成される
２液系の試薬である。

【０１２８】(4) 標準ＨＢＳ抗原液 ＨＢＳ抗原を０、５０、１００、３００、５００ＩＵ／
ｍｌ濃度で含むヒト血清を使用した。

【０１２９】(5) 高ＨＢＳ抗原検体血清 ＨＢＳ抗原を６２５，０００ＩＵ／ｍｌ濃度で含むヒト
血清を使用した。

【０１３０】(6) 測定方法 標準ＨＢＳ抗原液２０μｌに、上記(2) 項のＰＥＧ液１
５０μｌを混合し、３７℃で適時保持した後、上記(1)
項の抗ＨＢＳ抗体感作ラテックス液１５０μｌを添加攪
拌し、この後、１分後および５分後の波長７００ｎｍで
の吸光度を測定した。この間の吸光度の変化量を吸光度
変化量（ΔAbs ）とする。測定は日立自動分析装置７０
５０形を用いて行った。

【０１３１】実施例１２ 実施例１１におけるＰＥＧ溶液の調製の項を、次のよう
にして行ったことを除いては、実施例１１と同様にし
て、ＨＢＳ抗原測定試薬を作成した。

【０１３２】ＰＥＧ溶液の調製：平均分子量５００，０
００のＰＥＧを、実施例１１の(2)項で使用したものと
同じ緩衝液に０．５重量％の濃度になるように溶解し
た。

【０１３３】比較例６ 実施例１１におけるＰＥＧ溶液の調製の項を、次のよう
にして行ったことを除いては、実施例１１と同様にし
て、ＨＢＳ抗原測定試薬を作成した。

【０１３４】ＰＥＧ溶液の調製：平均分子量５０，００
０のＰＥＧを、実施例１１の(2) 項で使用したものと同
じ緩衝液に３．０重量％の濃度になるように溶解した。

【０１３５】実施例１１、１２および比較例６の結果を
表６および図３示す。

【０１３６】

【表６】

【０１３７】実施例１１、１２および比較例６における
カットオフポイントは２５ＩＵ／ｍｌであるため、高値
検定を測定した場合、実施例１１、１２では陽性と判定
されるが、比較例６では陰性と判定される。

【０１３８】表６および図３から明らかなように、平均
分子量１５０，０００以上のＰＥＧを使用した場合、平
均分子量５０，０００のものと比較し、反応性が高く、
かつ地帯現象が抑制されるため、高値検体でも陽性と判
定され、高感度で広い濃度範囲で測定が可能である。

【０１３９】

【発明の効果】本発明によれば、以上の如く、不溶性担
体を使用し免疫凝集反応に基づく被測定物質の測定にお
いて、高い検出感度を有し、地帯現象を抑制することに
より測定範囲の広い免疫測定試薬および免疫測定法が提
供される。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年７月１６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】追加

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３、４および比較例２の結果を示すグラ
フである。

【図２】実施例７、８および比較例４の結果を示すグラ
フである。

【図３】実施例１１、１２および比較例６の結果を示す
グラフである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被測定物質である抗原または抗体に対応
   する抗体または抗原を担持した不溶性担体と、平均分子
   量１００，０００以上のポリビニルピロリドン、平均分
   子量４０，０００以上のデキストランおよび平均分子量
   １００，０００以上のポリエチレングリコールからなる
   群より選ばれた少なくとも１つの高分子物質とから構成
   された免疫測定試薬。
2. 【請求項２】 被測定物質である抗原または抗体に対応
   する抗体または抗原を不溶性担体に担持させ、被測定物
   質との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度
   合いを検出することにより、被測定物質を測定するに当
   たり、該抗原抗体反応の反応系に平均分子量１００，０
   ００以上のポリビニルピロリドン、平均分子量４０，０
   ００以上のデキストランおよび平均分子量１００，００
   ０以上のポリエチレングリコールからなる群より選ばれ
   た少なくとも１つの高分子物質を存在させる免疫測定
   法。