KR20070114765A - 생물학적 활성을 조절하기 위한 이특이성 결합제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이특이성(bispecific) 결합 조성물의 특이적 결합 능력을 개선시키는 방법을 제공한다. 이특이성 결합 조성물은 표적 세포 표면 마커에 대한 고친화도 표적화 도메인 및 제 2의 세포 표면 마커에 특이적으로 결합하는 저친화도 결합 도메인에 의해 세포를 표적화할 수 있는데, 여기서 각각의 도메인이 이의 각각의 세포 표면 마커에 결합되면 소망에 따라 각각의 세포 표면 마커의 생물학적 활성을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 사용되는 이특이성 결합제 뿐만 아니라 이러한 결합제의 용도를 제공한다.

Description

생물학적 활성을 조절하기 위한 이특이성 결합제{BISPECIFIC BINDING AGENTS FOR MODULATING BIOLOGICAL ACTIVITY}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2005년 2월 23일에 출원된 미국 가출원 제 60/655,836호를 우선권으로 주장하며, 상기 가출원의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

연방정부 후원을 받은 연구 및 개발하에 이루어진 발명의 권리에 관한 진술

적용되지 않음

컴팩트 디스크로 제출되는 "서열 목록," 표, 또는 컴퓨터 프로그램 목록 부록에 대한 언급

적용되지 않음

많은 질병 및 장애는 세포 표면 수용체의 활성화에 의해 야기되는, 예를 들어 수용체-특이적 리간드의 결합에 의해 야기되는 신호 전달 경로의 부적절한 또는 과도한 활성화에 의해 생긴다. 암 및 자가면역질환와 같은 질병 및 장애의 개시 또는 진행에 관련된 수용체는 수용체 활성화를 줄이거나 막는 치료제의 개발을 위한 주된 표적으로서 나타났다. 표적 수용체의 예는 예를 들어 표피 성장 인자 수용체("EGFR"), 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체("IGFl-R"), 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체("PDGFR")를 포함하며, 이들은 비 소세포성 폐암 및 유방, 전립선 및 결장 암을 포함하는 가장 통상적인 고형 종양과 같은 많은 질병 상태 및 중증근육무력증, 전신홍반루푸스, 및 류마티스 관절염과 같은 많은 자가면역 질병에서 과발현되거나 비정상적으로 활성화되는 경향이 있다. 수용체의 활성화는 질병 진행을 초래하는 신호 전달 경로를 구동하는 자가인산화를 야기한다.

수용체 억제제를 사용한 정액 연구는 질병 상태와 관련된 수용체의 활성화를 막음에 의해 그 질병 상태의 발달을 바꿀수 있음을 분명하게 증명하였다. 그러나, 일반적으로 질병 상태를 초래하는 있는 수용체 또는 수용체들은 질병 세포 또는 조직 이외에 많은 상이한 세포 및 조직에서 발현된다. 수용체 억제제, 예를 들어 ErbB2 ("HER-2")를 표적화하는 헤르셉틴®(Herceptin®)은 임상적 용도로 유용한 것이 되고 있지만, 새로운 도전은 질병에 걸리지 않은 세포 및 조직을 표적화함이 없이 질병 세포 또는 조직을 효과적으로 표적화하는 치료제를 확인하는 것을 포함한다.

작용제를 질병 세포에 특이적으로 표적화하는 하나의 방법은 "bsBA"로 본원에서 때때로 지칭되는 이특이성 결합제의 사용이다. 이특이성 결합제는 두 개의 결합 도메인을 포함하며, 이의 각각은 특이적으로 개개의 분자를 인식하고 이러한 분자에 결합한다(편의를 위해, 각 개개의 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합된 분자는 그 결합 도메인을 위한 "리간드"로 지칭될 수 있다). 이특이성 결합제는 문헌 [Schmidt M, et al., "A bivalent single-chain antibody-toxin specific for ErbB-2 and the EGF receptor," Int J Cancer, 65(4):538-46 (1996), Lu D, et al., "Simultaneous blockade of both the epidermal growth factor receptor and the insulin-like growth factor receptor signaling pathways in cancer cells with a fully human recombinant bispecific antibody," J Biol Chem. 279(4):2856-65 (2004), 및 Francois C, et al., "Antibodies directed at mouse IL-2-R alpha and beta chains act in synergy to abolish T-cell proliferaton in vitro and delayed type hypersensitivity reaction in vivo," Transpl Int. 9(l):46-50 (1996)]에 의해 예증되는 바와 같이, 어느 정도 시도되었다. bsBA는 종종 결합 도메인 중 하나 또는 둘 모두로서 항체를 사용하기 때문에, bsBA는 때때로 면역치료제로서 언급되는 작용제의 부류에 포함된다.

불운하게도, bsBA를 위한 표적으로서 사용될 수 있는 분자의 영역은 제한된다. 단지 상대적으로 적은 수의 분자만이 정상 세포가 아닌 질병 세포에서 발현되고, 따라서 이러한 분자가 작용제를 질병 세포에 배타적으로 표적화시키기 위해 사용될 수 있다. 추가의 분자들은 정상 세포에 보다 질병 세포에서 더 많은 수로 발현된다. 이 분자들은 정상 세포에 비해 질병 세포에 작용제의 어느 정도의 우선적 전달을 가능하게 할 수 있으며, 이는 분자가 정상 세포에 비해 질병 세포에서 과발현되는 정도에 의존한다.

그러나, 표적 세포상에서의 표적 분자의 상당한 과발현으로도, 표적화된 치료제의 전달은 표적 분자를 발현하는 정상 세포에 대한 작용제의 결합으로 인하여 해로운 부작용을 종종 수반한다. 예를 들어, FDA 승인된 면역치료제인 헤르셉틴®(Herceptin®)를 위한 표적인 HER2(erbB2) 수용체는 비-암세포에서 HER2 수용체의 발현보다 약 10 내지 100배 높은 수준으로 과발현된다. 그럼에도 불구하고, 일 부의 환자들은 정상 세포에 대한 헤르셉틴®의 결합 때문에 심부정맥 및 다른 해로운 부작용을 일으킨다.

따라서, 정상 세포에 결합함이 없이 질병 세포에 결합하는 개선된 능력을 가진 bsBA를 개발함으로써 면역치료제의 치료 적용범위를 증가시키는 것이 바람직하다.

발명의 요약

본 발명은 표적 세포상에서 표적 분자의 생물학적 활성(들)을 조절하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 표적 세포의 표면상의 제 1 표적 분자에 대해 10^-7 M 이상의 해리 상수 ("Kd")를 지닌 제 1 결합 도메인 및 상기 세포의 표면상의 제 2 표적 분자에 대해 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 10배 이상 낮은 친화도를 지닌 제 2 결합 도메인을 지니는 이특이성(bispecific) 결합제로서, 여기서 상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자는 각각 동일하거나 상이할 수 있는 생물학적 활성을 지니는 것인 이특이성 결합제를 제공하고, 제 1 결합 도메인 및 제 2 결합 도메인이 각각 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자에 결합할 수 있게 하는 조건하에서 상기 이특이성 결합제를 표적 세포와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자에 결합되는 경우 표적 분자의 생물학적 활성(들)이 조절된다. 몇몇 구체예에서, 이특이성 결합제는 두 개의 항체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 항체는 디아바디(diabody), 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이의 조합물이다. 몇몇 구체예에서, 표적 세 포는 암세포이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자는 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체 또는 성장 인자 수용체이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자는 EGFR 및 ErbB2로 구성되는 군으로부터 선택된 티로신 키나아제 수용체이다. 몇몇 구체예에서, 제 2 표적 분자는 ErbB3(HER3), 인슐린 유사 성장 인자-1 수용체 (IGF1-R), FGF 수용체 1-4 중 어느 하나, HGF 수용체, 인슐린 수용체, PDGF 수용체 알파 및 베타 중 어느 하나, C-KIT, 또는 ErbB4이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd는 10^-8 내지 10^-12 M 이다. 몇몇 구체예에서, 제 2 표적 분자에 대한 제 2 결합 도메인의 Kd는 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd보다 20배 이상 낮다.

구체예의 또 다른 군에서, 본 발명은 표적 및 비표적 세포를 가지는 생물체에서 표적 세포상의 표적 분자의 요망되는 생물학적 활성(들)을 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 표적 세포는 이의 외부에 제 1 표적 분자를 가지고 이의 외부 표면에 제 2 표적 분자를 가지며, 여기서 (i) 상기 제 1 및 제 2 표적 분자는 공통 리간드를 공유하지 않고, (ii) 상기 제 1 표적 분자는 제 2 표적 분자를 또한 지니는 비표적 세포상에서 보다 표적 세포의 표면상에서 10배 이상 더 풍부하며, (iii) 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자는 각각 동일하거나 상이할 수 있는 생물학적 활성을 지닌다. 이러한 방법은 10^-7 M 이상의 제 1 표적 분자에 대한 Kd를 가지는 제 1 결합 도메인 및 제 2 표적 분자에 대해 제 1 결합 도메인의 Kd보다 10배 이상 낮은 Kd를 가지는 제 2 결합 도메인을 가지는 이특이성 결합제를 제공하고; 제 1 및 제 2 결합 도메인이 제 1 및 제 2 표적 분자에 각각 결합하도록 하는 조건 하에서 이특이성 결합제를 표적 세포와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서, 제 1 및 제 2 결합 도메인이 결합되면 각각 제 1 및 제 2 표적 분자의 생물학적 활성(들)이 조절된다. 몇몇 구체예에서, 이특이성 결합제는 두 개의 항체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 항체는 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이의 조합물이다. 몇몇 구체예에서, 표적 세포는 암세포이다. 몇몇 구체예에서, 표적 분자는 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체일 수 있다. 제 1 표적 분자는 EGFR 및 ErbB2로 구성되는 군으로부터 선택된 티로신 키나아제 수용체이다. 몇몇 구체예에서, 제 2 표적 분자는 ErbB3(HER3), 인슐린 유사 성장 인자-1 수용체 (IGF1-R), FGF 수용체 1-4 중 어느 하나, HGF 수용체, 인슐린 수용체, PDGF 수용체 알파 및 베타 중 어느 하나, C-KIT, 또는 ErbB4이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd는 10^-8 내지 10^-12 M 이다. 몇몇 구체예에서, 제 2 표적 분자에 대한 제 2 결합 도메인의 Kd는 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd보다 20배 이상 낮지만, 다른 경우에는 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 50배 이상 낮다. 몇몇 구체예에서, 생물학적 활성을 조절한다는 것은 티로신 키나아제 수용체의 활성을 감소시키는 것을 포함한다.

구체예의 또 다른 군에서, 본 발명은 표적 세포상의 제 1 표적 분자에 대하여 10^-7 M 이상의 Kd를 가지는 제 1 결합 도메인 및 표적 세포상의 제 2 표적 분자 에 대해 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd보다 10배 이상 낮은 Kd를 가지는 제 2 결합 도메인을 포함하는 이특이성 결합제(bsBA)를 제공하며, 여기서 (i) 제 1 및 제 2 표적 분자는 동일한 천연 리간드를 가지지 않고, (ii) 제 1 표적 분자 및 제 2 표저 분자는 각각 동일하거나 상이할 수 있는 생물학적 활성을 가지며, (iii) 제 1 및 제 2 결합 도메인은 이들이 제 1 및 제 2 표적 분자에 결합되는 경우 각각 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자의 생물학적 활성(들)을 조절한다. 몇몇 구체예에서, 제 2 결합 도메인의 Kd는 제 1 결합 도메인의 Kd보다 50배 이상 낮으며, 다른 경우에는 제 2 결합 도메인의 Kd가 제 1 결합 도메인의 Kd보다 100배 이상 낮다. 몇몇 구체예에서, bsBA는 두 개의 항체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 항체는 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이의 조합물이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 결합 도메인은 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체에 결합된다. 몇몇 구체예에서, 제 1 결합 도메인은 EGFR 및 ErbB2로 구성되는 군으로부터 선택된 티로신 키나아제 수용체에 결합된다. 몇몇 구체예에서, 제 2 결합 도메인은 ErbB3(HER3), 인슐린 유사 성장 인자-1 수용체 (IGF1-R), FGF 수용체 1-4 중 어느 하나, HGF 수용체, 인슐린 수용체, PDGF 수용체 알파 및 베타 중 어느 하나, C-KIT, 또는 ErbB4에 결합된다. 몇몇 구체예에서, 제 1 결합 도메인은 EGFR에 결합되고, 상기 제 2 결합 도메인은 ErbB3(HER3)와 결합된다. 몇몇 구체예에서, 제 1 결합 도메인의 Kd는 10^-8 내지 10^-12 M 이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자는 정상 세포상에서의 이의 발현에 비해 표적 세포상에서 10배 이상 과발현된다.

구체예의 또 다른 군에서, 본 발명은 10^-7 M 이상의 표적 세포상의 제 1 표적 분자에 대한 Kd를 가지는 제 1 결합 도메인 및 표적 세포상의 제 2 표적 분자에 대해 제 1 결합 도메인의 Kd보다 10배 이상 낮은 Kd를 가지는 제 2 결합 도메인을 포함하는 이특이성 결합제(bsBA) (a) 및 약제학적으로 허용되는 담체 (b)의 조성물로서, 제 1 및 제 2 표적 분자가 동일한 천연 리간드를 가지지 않고, (i) 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자는 각각 동일하거나 상이할 수 있는 생물학적 활성을 지니며, (ii) 제 1 및 제 2 결합 도메인은 이들이 제 1 및 제 2 표적 분자에 결합되는 경우 각각 제 1 및 제 2 표적 분자의 생물학적 활성(들)을 조절한다. 몇몇 구체예에서, 제 2 결합 도메인의 Kd는 제 1 결합 도메인의 Kd보다 50배 이상 낮고, 몇몇 구체예에서는 제 2 결합 도메인의 Kd가 제 1 결합 도메인의 Kd보다 100배 이상 낮다. 몇몇 구체예에서, bsBA는 두 개의 항체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 항체는 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이의 조합물이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 결합 도메인은 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체에 결합된다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자는 정상 세포상에서의 이의 발현에 비해 표적 세포상에서 10배 이상 과발현된다.

구체예의 또 다른 군에서, 본 발명은 10^-7 M 이상의 표적 세포상의 제 1 표적 분자에 대한 Kd를 가지는 제 1 결합 도메인 및 표적 세포상의 제 2 표적 분자에 대해 제 1 결합 도메인의 Kd보다 10배 이상 낮은 Kd를 가지는 제 2 결합 도메인을 포함하는 이특이성 결합제(bsBA)의 약제 제조용 용도를 제공하며, 여기서 제 1 및 제 2 표적 분자는 동일한 천연 리간드를 가지지 않고, 또한 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자는 각각 동일하거나 상이할 수 있는 생물학적 활성을 지니며, 제 1 및 제 2 결합 도메인은 이들이 제 1 및 제 2 표적 분자에 결합되는 경우 각각 제 1 및 제 2 표적 분자의 생물학적 활성(들)을 조절한다. 몇몇 구체예에서, 상기 제 2 결합 도메인의 Kd는 제 1 결합 도메인의 Kd보다 50배 이상 낮고, 다른 경우에는 제 1 결합 도메인의 Kd보다 100배 이상 낮다. 몇몇 구체예에서, bsBA는 두 개의 항체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 항체는 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이의 조합물이다. 몇몇 구체예에서, 제 1 결합 도메인 및 제 2 결합 도메인에 의해 결합된 표적 분자는 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 및 성장 인자 수용체로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되고, 단, 제 1 결합 도메인 및 제 2 결합 도메인은 동일한 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체와 결합되지 않는다. 몇몇 구체예에서, 제 1 표적 분자는 정상 세포상에서의 이의 발현에 비해 표적 세포상에서 10배 이상 과발현된다. 몇몇 구체예에서, 약제는 암세포의 증식을 억제하기 위한 것이다.

도 1은 293T 세포에서 C225-A5 이특이성 항체를 발현시키기 위해 사용되는 두 개의 발현 플라스미드인 A5CH/pSTH 및 C225Ck/pSTZ를 도시한다.

도 2는 흐름 세포측정에 의해 C225-A5 이특이성 항체가 A431 암세포에 결합하는 것을 도시한다. A431 세포를 얼음상에서 30분간 1 ug/mL의 C225-A5와 인큐베이션시키거나 항체없이 인큐베이션시키고, 알렉사 플루오르®(Alexa Fluor®) 488로 표지된 항-인간 IgG 항체에 의해 검출하고, FACS칼리버 (FACSCalibur) 장치로 정량하였다.

도 3은 AKT 인산화에 대한 이특이성 항체 농도의 효과를 도시한다. 투여량-반응 실험은 고친화도로 EGFR에 결합하고 저친화도로 ErbB3에 결합하는 C225-A5 이특이성 항체상에서 수행하였다. A431 세포를 30분간 증가하는 농도의 C225-A5 이특이성 항체와 인큐베이션시킨 후, 헤레귤린(heregulin)으로 5분간 자극시켰다. 그 후, 종양 세포를 세정제로 용해시키고, AKT 인산화에 대해 분석하였다. 실험으로부터의 데이터는 항체 농도에 대한 세포 용해물 중의 AKT 인산화 비로서 플로팅된다. 이러한 비는 항체 마이크로어레이를 사용하여 측정된 샘플 중의 전체 AKT의 양으로 나누어진 인산화된 AKT의 양을 나타낸다.

서론

현재의 면역치료제가 가진 하나의 문제점은 질병 세포 뿐만 아니라 정상 세포에 결합하려는 이들의 경향이 유해한 부작용을 유발한다는 것이다. 따라서, 학계의 하나의 목적은 비표적 세포(즉, 정상 세포)에 또한 결합하는 것 없이 표적 세포(예를 들어, 질병 세포)에 결합하는 개선된 능력을 가지는 면역치료제를 개발하는 것이다.

본 발명은 표적 세포에 결합하는 것에 대해 한 부류의 면역치료제의 특이성을 개선하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 놀랍게도, 이특이성 결합제("bsBAs")로 알려진 면역치료제에 의해 질병 세포를 표적화하는 특이성은 bsBAs의 두 개의 결합 도메인의 결합 친화도에서의 차이를 조절함에 의해 증가될 수 있다는 것이 발견되었다. 본 발명의 bsBAs는 그 다음에 표적 세포에 표적 분자의 생물학적 활성을 증가시키거나 감소시키기 위해 사용될 수 있고, 이로써 존재하는 경우 비표적 세포의 대응하는 활성에 대한 효과를 감소시키며, 표적 세포의 생물학적 활성을 조절하는 개선된 능력을 제공한다.

명칭이 함축하는 바와 같이, bsBA는 상이한 표적 분자에 각각 특이적인 두 개의 결합 도메인을 가진다. 제 1 결합 도메인은 때때로 "표적 세포"로서 지칭되는 선택된 세포에 bsBA를 표적화시키 위해 일반적으로 사용된다. 제 2 결합 도메인은 표적 세포상의 제 2 표적 분자에 결합한다. 결합 도메인이 이들의 표적 분자에 결합되면 전형적은 특정한 생물학적 효과를 조절(다시 말해, 생물학적 활성을 증가시키거나 억제)할 것으로 의도된다. 상이한 방법으로 생물학적 활성을 조절하는 능력을 가진 결합 도메인이 당 분야에 알려져 있다.

종종, 생물학적 활성은 결합 도메인이 이의 표적 분자에 결합됨으로써 억제된다. 예를 들어, 결합 도메인에 의해 결합된 분자가 사이토카인 수용체의 부분이라면, 결합 도메인의 그 수용체와의 결합은 수용체에 대한 사이토카인의 접근을 차단할 수 있고, 이로써 그렇지 않은 경우 그 결합에 의해 유발될 수 있는 생물학적 활성을 억제한다. 유사하게는, 결합 도메인의 수용체와의 결합은 수용체가 인터루킨 ("IL")-2 수용체와 같은 몇몇 사이토카인 수용체의 완전한 활성화를 위해 요구되는 이종이합체를 형성하는 것을 막을 수 있다. 또한 결합 도메인의 결합은 수용체의 형태를 변화시킬 수 있어, 이의 천연 리간드와 결합할 수 없고 이로써 활성화될 수 없다. 반대로 말하면, 결합 도메인은 수용체에 결합함에 의해 생물학적 활성을 증가시키는 이의 능력을 위해 선택된 것일 수 있다. 예를 들어, 결합 도메인의 수용체와의 결합은 수용체에 대한 천연 리간드의 효과를 흉내낼 수 있어서, 결합은 수용체를 활성화시키거나, 결합 도메인의 결합은 형태적 변화를 유도시켜서 저친화도 수용체가 이의 천연 리간드에 대해 고친화도 수용체가 되게 할 수 있다.

본 발명의 bsBA는 두 개의 결합 도메인을 지니므로, 이들은 요망되는 효과를 달성하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 도메인은 이들 둘 모두가 티로신 키나아제 수용체의 생물학적 활성을 억제하도록 선택될 수 있다. 혹은, 하나는 키나아제 수용체의 활성을 억제하도록 선택되고 나머지 하나는 활성이 요망되는 또 다른 수용체를 향상시키거나 활성화시키도록 선택된다. 표적 세포상의 표적 분자의 활성에 대해 요망되는 효과를 지닌 결합 도메인을 선택하는 능력은 본 발명의 방법의 유연성을 증가시킨다.

본 발명의 bsBA 중의 둘 모두의 결합 도메인이 표적 세포의 생물학적 활성을 조절하도록 의도되지만, 본 발명의 bsBA의 제 1 결합 도메인은 또한 bsBA를 표적 세포에 표적화시키도록 작용하고, 제 2 결합 도메인은 주로 표적 세포에 대한 효과를 유발하도록 작용한다. 따라서, 두 도메인을 구별하는데 있어서, 제 1 결합 도메인은 종종 본원에서 "표적화 도메인"으로 지칭되며, 제 2 결합 도메인은 종종 본원에서 "이펙터 도메인"으로 지칭된다. 유사하게는, 편의상 두 결합 도메인에 의해 결합되는 분자를 구별하는데 있어서, 이펙터 도메인에 대한 표적 분자는 종종 본원에서 "이펙터 표적 분자"로 지칭되고, 용어 "표적 분자" 그것만으로 표적화 도메인의 표적을 지칭한다.

종래 bsBA는 각 표적 분자의 각각에 대해 최대 이용가능한 친화도를 가진 결합 도메인을 사용하여 전형적으로 만들어진다. 당업자는 하나의 도메인이 이의 각 표적에 대해 나머지 도메인의 친화도와 정확하게 같은 친화도를 지닐 가능성이 없는 것으로 인식할 것이다. 그러나, 그러한 차이는 전형적으로 크지않고, 결합에 대한 실제 영향의 관점에서 중요하거나 중요하지 않을 수 있다.

그러나, 본 발명의 방법 및 조성물에서, 표적화 도메인은 선택되고 이의 리간드에 대한 결합 친화도가 이펙터 도메인이 이의 리간드에 대해 지닌 친화도 보다 적어도 10배 높은 결합 친화도 크기를 지닌다. 다시 말해, 표적화 도메인은 그것이 인식하고 결합하는 분자에 대해, 이펙터 도메인이 이것이 인식하고 결합하는 분자에 대해 지니는 친화도보다 10배 이상 더 큰 친화도를 가진다. 몇몇 구체예에서, 이의 리간드에 대한 표적화 도메인의 친화도는 이펙터 도메인의 친화도보다 15배 더 높고, 다른 구체예에서는 이의 표적에 대한 이펙터 도메인의 친화도보다 20배 이상 높고, 몇몇 다른 구체예에서는 25배 이상 높고, 몇몇 구체예에서는 20, 40, 50 또는 100배 이상까지 높은 친화도를 가지며, 각 개개의 더 높은 결합 친화도가 더욱 바람직하다. 본 발명의 bsBA의 두 개의 결합 도메인 사이에 결합 친화도에 적어도 10배의 차이가 있기 때문에, bsBA는 때때로 본원에서 "hi-lo" bsBA로 지칭된다.

표적 결합 도메인과 이펙터 결합 도메인 사이의 결합 친화도에서 계획된 및 실제적 차이는 종래의 이특이성 분자보다 우수한 놀랍고 종전에 인식되지 않은 장점을 제공한다. 상기 내용과 같이, 종래에 공지된 이특이성 작용제는 표적 리간드에 대해 가능한 한 높은 친화도를 가진 결합 부분을 지녔다. 그러나, 유사한 친화도를 가진 결합 부분을 가진 이특이성 분자는, 본 발명의 조성물 및 방법에 비해, 이들이 표적화될 수 있는 분자 및 이들이 사용될 수 있는 상황이 제한된다. 본 발명의 몇몇 장점은 가정적 실시예를 참조하여 인식될 수 있다.

두 개의 수용체, 정상 세포에 비해 암세포에 과발현되는 수용체 A, 및 암세포에 존재하는 것과 거의 같은 복사체 수로 정상 세포에서 발현되는 수용체 B를 가지는 암세포의 경우를 생각해 보자. 두 수용체에 대한 거의 같은 친화도를 가진 결합 도메인을 가진 이특이성 결합제는 암세포 및 정상인 비-암세포에 대해 대체로 동등한 효과를 가지는 경향이 있을 것이다. 이는 특히 bsBA가 얻어지는 경우에 그러한데, 그것은 bsBA가 1가 결합에 의해 두 수용체를 포화시키는 경향이 있기 때문이다.

대조적으로, 수용체 A에 표적화되는 더 높은 친화도 표적화 도메인, 수용체 B에 표적화되는 더 낮은 친화도 이펙터 도메인을 지니고 수용체 B에 대한 것보다 수용체 A에 대해 10, 20, 30배 이상 더 높은 친화도를 가지는 본 발명의 bsBA는 암세포에 우선적으로 결합하고, 정상적인 속도론적 상호작용에 의해, 정상 세포에 비해 암세포에 더 많은 수로 결합할 것이다. 따라서, 상당히 큰 수의 정상 세포를 포함하는 수용체 B를 지니는 세포에 불규칙적으로 결합하는 대신에, 이펙터 도메인은 암세포에 선택적으로 전달될 것이다. 따라서, 본 발명은 이펙터 도메인을 표적 세포에 더욱 선택적으로 표적화시키는 것을 가능하게 한다.

추가로, 수용체 A에 대한 보다 높은 친화도 결합 도메인의 결합은 보다 낮은 친화도 이펙터 도메인을 세포 표면 근처로 구속시키고, 여기서 이것은 시간이 흐르면서 수용체 B와 상호작용이 가능하게 된다. 이는 이펙터 도메인이 수용체 B와 결합할 수 있게 하지만, 수용체 B에 대한 이의 상대적으로 낮은 친화도는 보통 수용체에 이를 고정시킬 정도로 충분할 수 없으며, 여기서 이러한 이펙터 도메인은 "지지대가 없는(free standing)" 1가(또는 "일가") 본체(entity)로서 제공된다.

항체 또는 다른 리간드의 해리 상수("Kd")가 리간드의 kon 및 koff 둘 모두에 의해 결정된다는 것을 당업자는 인식할 것이다. 다시 말해, Kd는 항체 또는 다른 리간드가 표적 분자에 결합하는 시간과 결합되지 않는 시간 사이의 균형을 나타낸다. 따라서, 낮은 친화도 결합 도메인은 종종 낮은 친화도를 가지며, 이는 정확하게는 이것이 이의 표적 분자로부터 해리되는 높은 경향을 가지기 때문이다. 이러한 기간 동안, 구속되지 않은 결합 도메인은 브라운 운동, 유체 흐름 또는 결합 도메인 분자에 작용하는 다른 운동적 힘에 의해 멀어질 수 있다. bsBA의 높은 친화도 도메인에 의한 낮은 친화도 도메인의 구속은 낮은 친화도 도메인에 의해 표적화된 수용체 근처에 낮은 친화도 결합 도메인을 유지하도록 돕고, 따라서 임의의 시점에서 낮은 친화도 도메인이 이의 표적 분자에 결합할 수 있는 가능성을 증가시키는 경향이 있다. 본 발명의 bsBA의 낮은 친화도 도메인의 표적 분자가 수용체 키나아제이기 때문에, 이는 표적 수용체 키나아제에 결합하는 bsBA의 능력을 증가시키고 따라서, 표적 세포에 대한 이들의 생물학적 효과를 증가시키는 경향이 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 bsBA의 두 결합 도메인은 동일한 리간드에 의해 정상적으로는 결합되지 않는 표적 분자와 결합한다. 당업자는 몇몇 리간드, 예를 들어 인터루킨 IL-2가 두 개의 상이한 수용체 사슬에 의해 결합되고, (IL-2가 결합된) 두 개의 사슬이 그 다음에 완전한 생물학적 활성 단위를 형성하도록 상호작용함을 인식한다. 따라서, 두 개의 수용체 사슬에 대해 유도된 bsBA가 이러한 수용체의 완전한 활성화를 억제할 수 있지만, 이러한 bsBA의 결합 도메인 둘 모두는 물론 동일한 수용체에 대해 유도된다.

또한, 동일한 수용체의 2개의 사슬에 표적화된 bsBA가 그러한 수용체에 의해 매개되는 생물학적 활성을 간섭하지만, 2개의 상이한 수용체에 표적화된 bsBA는 둘 모두의 수용체의 생물학적 활성을 조절할 수 있다. 두 개의 수용체의 활성에 동시에 영향을 주는 것은 단지 하나의 활성을 간섭하는 효과 보다 표적 세포에 대해 더욱 강력한 효과를 제공하는 것으로 믿어진다.

마지막으로는, bsBA와 결합 도메인에 결합된 두 개의 표적 분자 사이에 삼합체의 형성은 서로에 대해 매우 근접해 있는 표적 분자와 결합하고 이들의 세포막의 지질 이중층을 통한 정상적 확산을 억제하는 추가적인 장점이 있다. bsBA에 의한 상이한 수용체의 가교는 그 자체로 표적 세포에 대한 bsBA의 세포독성 또는 세포증식억제성 효과에 기여하는 것으로 믿어진다.

구체예의 한 군에서, bsBA의 표적화 도메인은 질병 또는 장애(예를 들어, 유방암세포)에 연관되어 있는 표적 세포상에서 우선적으로 발현되거나 과발현되는 세포 표면 수용체에 결합하고, 이펙터 도메인은 표적 세포 및 비표적 세포에서 무질서하게 또는 도처에서 발현되는 세포 표면 수용체에 결합한다. 본 발명의 bsBA에 의해 표적화될 수 있는 예시적인 세포 표면 수용체는 하기 기재되어 있다. 바람직한 구체예에서, 표적화 도메인에 의해 결합되는 분자는 표적 세포에서 이펙터 도메인에 의해 결합되는 분자의 수준보다 더 높은 수준으로 발현된다. 따라서, 본 발명의 bsBA 및 방법은 통상적 항체 또는 이특이성 작용제 또는 이 둘 모두에 의해 불규칙적으로 결합되는 표적 분자를 가진 세포에 대한 이펙터 분자의 특이적 전달을 개선하는데 특히 유용하다. 당업자에게는 다양한 암 세포가 상이한 암 유형의 세포에서 발현되는 것과 다른 정도로 상이한 항원을 과발현시키거나 같은 항원을 과발현시킬 수 있음은 인식된다. 따라서, 본 발명의 bsBA의 고안에서, 실시 담당자는 특정 bsBA에 의해 표적화되는 특정 세포에서 과발현되는 세포 표면 수용체를 표적화하는 표적화 도메인을 선택할 것으로 고려된다.

몇몇 구체예에서, bsBA의 표적화 도메인은 질병 또는 장애(예를 들어 암세포)와 연관되어 있는 표적 세포에서 우선적으로 발현되거나 과발현되는 첫 번째 세포 표면 수용체에 결합되고, 이펙터 도메인은 정상 세포에 비해 질병 세포(예를 들어 암세포)에서 과발현되지만 첫 번째 세포 표면 수용체에서 발현되는 것보다 더 낮은 수준으로 발현되는 두 번째 세포 표면 수용체에 결합된다. 이 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 세포 표면 수용체 사이의 발현 수준에서의 차이는 표적 분자를 가진 세포에 대한 이펙터 분자의 특이적 전달을 개선한다.

배경 기술에서 제시된 바와 같이, HER2가 정상 세포에서의 이의 발현의 약 10 내지 100 배의 수준으로 유방암세포에서 과발현되지만, 몇몇 유해한 부작용은 정상 세포에 대한 면역치료제인 헤르셉틴®의 결합으로부터 환자에게 보여진다. 따라서, 표적 분자의 실질적 과발현조차도 높은 친화도 결합제가 정상 세포에 결합하지 못하도록 하여 유해한 부작용을 억제하는데 반드시 충분하지 않다.

대조적으로, 본 발명의 bsBA는 이펙터 도메인의 친화도보다 10 배 이상 더 높고 종종 훨씬 더 높은 이의 표적 분자에 대한 친화도를 가지도록 선택되는 표적화 도메인을 가진다. 바람직하게는 이의 표적 분자에 대한 표적화 도메인의 해리 상수는 10^-8 내지 10^-12 M 범위이다. 표적 분자는 정상 세포에 존재하지 않거나 정상 세포에서보다 암세포에서 더 높게, 바람직하게는 정상 세포에서 발현되는 것보다 20 배 이상 및 더욱 바람직하게는 100 배 이상 과발현되기 때문에 선택된다. 제시된 바와 같이, 표적 분자에 대한 표적화 도메인의 높은 친화도 때문에, 이는 표적 세포에 우선적으로 bsBS가 결합하게 한다. 따라서, 이펙터 도메인은 정상 세포에 발현되는 표적 분자를 표적화할 수 있고, 여전히 통상적인 bsBA의 것보다 더 큰 치료 적용범위를 제공하는 선택적인 결합을 달성할 것으로 예상된다.

당업자는 특히 암세포가 많은 정상적인 단백질, 예를 들어 정상 세포에서 항상성을 유지하는 역할을 가지는 많은 것의 발현을 상향조절하는 경향이 있음을 인식할 것이다. 따라서, 암 또는 종양 항원으로 보통 간주되지 않는 단백질 조차도 암세포에서 상향조절되는 경향이 있다. 예를 들어, 종양 항원으로 간주되지 않는 인슐린 수용체는 종종 정상 세포에 비해 종양 세포에서 3 내지 5배 상향조절된다(참조, 예를 들어, 문헌 [Milazzo et al., Cancer Res. 52(14):3924-30 (1992)])

예로서, ErbB3 수용체는 정상 세포에서의 이의 발현에 비해 몇몇 암세포에서 다소 과발현된다. 그러나, 이것은 표적화 도메인이 더욱 더 고도로 발현되는 표적 분자에 대해 유도되는 경우에, bsBA의 이펙터 표적 분자로서 사용될 수 있다. 실시예는 본 발명의 예시적 bsBA를 나타내며 여기서 표적화 도메인은 EGFR에 대해 유도되고, 이펙터 도메인은 ErbB 3를 표적화한다.

표적화 도메인은 표적 세포에서 과발현되는 표적 분자(예를 들어 티로신 수용체)에 대해 유도되지만, 반면에 이펙터 도메인이 표적화 도메인을 위한 표적 분자보다 더 낮은 수준으로 발현되는 분자(예를 들어, 제 2 티로신 키나아제)에 대해 유도되는 것이 바람직하다. 표적 분자가 이펙터 도메인에 의해 표적화되는 분자보다 더 높은 수준으로 발현되는 것이 단지 필요하지만, 일반적으로 표적 분자의 발현과 이펙터 분자의 발현 사이의 큰 차이가 이로우며, 이는 이펙터 분자가 표적화 도메인의 Kd 보다 낮은 bsBA 농도에서 포화될 수 있기 때문이다.

일반적으로, 표적화 도메인을 위한 표적 분자가 비표적 세포상의 이러한 분자의 발현보다 10, 20, 50, 100배 또는 더 높은 배수의 수준으로 과발현되는 것이 바람직하며, 더 높은 수준은 더욱 바람직하다. 일반적으로, 이펙터 분자가 비표적 세포에서 발현되는 수준으로 발현되거나 과발현되는 경우, 비표적 세포의 2 내지 5 배의 수준으로 과발현되는 수준으로 발현되는 것이 더 바람직하다. 다시 말해, 표적화 분자가 이펙터 도메인에 의해 결합되는 분자에 비해 높은 수준으로 발현 (또는 과발현)되는 것이 바람직하다.

표적 세포가 질병 세포, 예를 들어 암세포인 경우, 표적 분자의 발현 수준은 암세포가 유래하는 것과 같은 조직 형태의 세포상의 동일한 분자의 발현에 대해 측정된다. 다시 말해, 질병 세포가 유방암세포라면, 발현 수준은 유방 세포에 대해 측정되지만, 난소암세포의 분자의 발현 수준은 정상 난소 세포상의 발현 수준에 대해 측정된다. 일반적으로는, 세포의 집단이 사용되고 발현 수준(예를 들어 세포당 발현되는 분자의 수)의 평균치가 측정된다.

더욱이, 몇몇 바람직한 구체예에서, 표적화 도메인 및 이펙터 도메인에 의해 인식되고 결합되는 세포 표면 항원은 도메인의 결합에 의해 조절될 수 있는 생물학적 활성을 가지도록 선택된다. 예를 들어, 각각의 도메인에 의해 표적화되는 세포 표면 항원은 사이토카인 또는 성장 인자 수용체일 수 있고, 도메인에 의한 이의 차단은 표적 세포의 정상 표현형으로의 회복에 기여할 것이다. 이러한 방식으로, bsBA의 치료 효과는 하나의 도메인 단독의 작용으로 인한 효과 보다 증가한다. 상기 논의된 예시적 bsBA의 경우, 두 개의 도메인 각각은 상이한 사이토카인 수용체를 차단한다. 두 수용체의 차단은 이러한 수용체에 의해 활성화되는 경로를 하향조절할 것이고, 이는 세포의 증식 속도를 감소시킬 것이다.

상기 제시된 바와 같이, 항체는 사이토카인 수용체 등의 효능제로서 작용할 수 있는 것으로 또한 알려져 있고, 다시 말해, 이들은 표적 분자의 활성을 높이는 역할을 한다. 따라서, 실시 담당자에 의해 선택되는 표적 분자 및 결합제에 의존하여, 본 발명의 bsBA의 하나의 결합 도메인은 표적 분자의 활성을 억제할 수 있으며, 나머지 결합 도메인은 이의 표적 분자의 활성을 향상시킨다. 다른 구체예에서, 둘 모두의 결합 도메인은 이들의 각각의 분자의 활성을 억제시키도록 선택될 수 있으며, 다른 구체예에서, 결합 도메인은 동일하거나 상이할 수 있는 이들의 각각의 표적 분자의 활성을 향상시키도록 선택될 수 있다. 각각의 표적 분자의 활성을 증가시키거나 감소시키는 결합 도메인을 독립적으로 선택하는 능력은 실시 담당자에게 조건의 범위에 효과적인 bsBA를 고안하는데 상당한 유연성을 제공한다. 표적 분자의 활성이 증가될 수 있거나 감소될 수 있음을 나타내는 것은 실시 담당자의 선택에서, 결합제의 현명한 선택에 의해, 표적 분자에 대한 bsBA의 효과는 본원에서 표적 분자의 활성을 "조절하는" 것으로 종종 지칭된다.

예를 들어, 몇몇 암은 티로신 키나아제로서 작용하는 수용체를 엔코딩하는 유전자의 변이로부터 기인하고, 이는 수용체가 항상적으로 활성화 또는 과발현되도록 하여, 세포가 정상 수용체의 경우 또는 정상량으로 발현되는 수용체의 경우 보다 더 많이 증식한다. 수용체의 활성을 감소시키기 위해, 실시 담당자는 이 예에서 결합제를 선택할 수 있으며, 이 결합제의 결합은 항상적으로 활성인 수용체의 형태를 변화시켜 이의 활성을 줄이거나, 과발현된 수용체의 경우에 이의 천연 리간드에 의해 결합되는 것으로부터 이를 간단하게 차단하는 것으로 알려져 있고, 따라서 과발현이 표적 세포 내에서의 신호전달의 부적절한 증가를 야기하지 않게 한다. 반대로 말하면, 표적 분자가 이의 활성을 높이는 것이 바람직한 것이라면, 실시 담당자는 결합이 활성의 효능제로서 작용하는 결합제를 선택할 수 있다.

하나의 높은 친화도 결합 도메인을 가지는 bsBA의 사용은 특이적 결합을 관심있는 세포에 제공하기에 충분하다. 연구 결과, 하나의 표적 분자에 대해 유도된 두 개의 높은 친화도 결합 도메인을 가진 결합제가 동일한 결합 도메인을 가진 일가 결합제에 비해 단지 약 3배의 표적 분자에 대한 친화도를 지니는 것으로 밝혀졌다. 문헌 [Nielsen, U. et al., Cancer Res. 60(22):6434-40 (2000)]. 따라서, 일가 결합제는 전형적으로 여전히 나노몰 범위에서 Kd를 가질 것이다. 치료제가 전형적으로 결합제의 Kd의 1000배인 마이크로몰 농도 이하를 제공하는 양으로 투여되기 때문에, 높은 친화도 표적화 도메인의 Kd에 비해 고농도의 결합제는 결합제가 표적 분자를 지니는 표적 세포에 결합할 수 있게 하는 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 bsBA의 높은 친화도 표적화 도메인은 이들이 투여될 조건 하에서 bsBA의 특이적 결합을 제공할 것으로 예상된다.

실시 담당자가 표적화 도메인 및 이펙터 도메인을 위해 표적 분자의 적절한 조합을 선택할 수 있다는 것이 예상된다. 다수의 바람직한 표적 분자 및 이펙터 표적 분자가 하기 기재되어 있지만, 몇몇 바람직한 표적 분자 및 이펙터 표적 분자를 목록으로 만드는 것이 도움이 될 수 있다. 몇몇 바람직한 표적 분자는 EGFR 및 ErbB2이다. 몇몇 바람직한 이펙터 표적 분자는 ErbB3, ErbB4, 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 수용체 1-4 중의 어느 하나, 간세포 성장 인자 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체 (IGFl-R), 인슐린 수용체, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 수용체 알파 및 베타, 및 C-KIT이다. 이들 분자의 각각은 당 분야에 공지되어 있고, 뒤 부분에서 SWISS-PROT 데이터베이스에 있는 이의 참조 번호에 의해 확인된다.

정의

단위, 접두사 및 기호는 이들이 표준 국제 단위(SI) 허용 형태로 표시되어 있다. 수치 범위는 범위를 한정하는 수를 포함한다. 다르게 표시되지 않는다면, 헥산은 5' 내지 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기재되어 있고; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기재되어 있다. 본원에서 제공되는 표제는 본 발명의 다양한 측면 또는 구체예의 제한은 아니며, 이는 전체로서 상세한 설명에 참조로서 여겨질 수 있다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 상세한 설명에 참조에 의해 그대로 더욱 완전하게 정의된다. 본원에 정의되지 않는 용어는 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 보통의 의미를 가진다.

결합제의 "친화도"은 이들의 해리 상수 또는 "Kd"에 의해 전형적으로 기재된다. 전형적으로, 유용한 결합제는 나노몰 농도로 기재되는 Kd를 가진다. 당업자는 10^-8M 의 Kd를 가진 항체가 10^-7의 Kd를 가진 것의 10 배 정도 높은 친화도 및 10^-6의 Kd를 가진 항체의 100배의 친화도를 가짐을 인식할 것이다. 따라서, 더 높은 친화도 작용제는 더 낮은 수로 기재된 Kd를 가진다(즉, 10^-8은 10^-6보다 더 작은 수이다).

"항체"는 온전한 면역글로불린 또는 다양한 펩티다아제로 분해됨으로써 생성된 다수의 잘 특성화된 단편으로서 존재한다. 따라서, 예를 들어 펩신은 힌지 영역의 이황화물 결합 아래에서 항체를 분해하여 그 자체로 이황화물 결합에 의해 V_H--C_H에 결합된 경쇄인 Fab의 이합체인 F(ab)'₂를 생성시킨다. F(ab)'₂는 온화한 조건하에서 환원되어 힌지 영역의 이황화물 결합을 분해함으로써 (Fab')₂ 이합체를 Fab' 단량체로 전환시킨다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 부분을 지닌 Fab이다 (이러한 단편 및 다른 항체 단편의 보다 상세한 설명에 대한 참조: W. E. Paul, ed., Fundamental Immunology, Raven Press, N. Y. (1993)). 다양한 항체 단편이 온전한 항체의 분해의 관점에서 규정되지만, 당업자는 이러한 Fab' 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법을 이용함으로써 새로이 합성될 수 있음을 인식할 것이다.

참조의 편의성을 위해, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 전체 항체, 전체 항체의 변경에 의해 생산되거나 재조합 DNA 방법을 사용하여 새로이 합성되던지 간에 항원 인식 및 결합 능력을 보유하는 항체 단편, 단클론성 항체, 다중클론성 항체, 및 항체 모사물(mimic)을 본문에서 다르게 요구되지 않는다면 포함한다. 항체는 IgM, IgG (예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄), IgD, IgA 또는 IgE일 수 있다.

용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 부분, 일반적으로는 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함하는 분자이다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂, 도메인 항체 (dAb) 및 Fv 단편; 나선-안정화된 항체(참조 예를 들어, 문헌[Arndt et al., J MoI Biol 312:221-228 (2001)]; 디아바디(아래 참조); 단일 사슬 항체 분자 ("scFv," 참조 미국 특허 제 5,888,773호); 이황화물 안정화된 항체("dsFv", 참조, 미국 특허 제 5,747,654호), 및 도메인 항체("dAbs," 참조, [Holt et al., Trends Biotech 21(11):484-490 (2003), Ghahroudi et al., FEBS Lett. 414:521-526 (1997), Lauwereys et al, EMBO J 17:3512-3520 (1998), Reiter et al., J. MoI. Biol. 290:685-698 (1999), Davies and Riechmann, Biotechnology, 13:475-479 (2001)])을 포함한다.

용어 "디아바디"는 두 개의 항원 결합 부위를 가지고 있는 작은 항체 단편을 지칭하며, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬(V_H-V_L)에서 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결되어 있는 중쇄 가변 도메인(V_H)를 포함한다. 너무 짧아서 동일한 사슬상의 두 영역 사이에서 쌍을 형성할 수 없는 링커를 사용하여, 도메인 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루어, 두 개의 항원-결합 부위를 생성시키도록 된다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 더욱 완전히 기재되어 있다.

전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가진다. 각 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역를 포함한다(영역(region)은 또한 도메인(domain)으로 알려져 있다). 경쇄 및 중쇄 가변 부위는 또한 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"로 불리는 세 개의 과가변 영역에 의해 중단된 "프레임워크" 영역을 포함한다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위가 규정되었다. 문헌[Kabat and Wu, infra]을 참조할 수 있다. 상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 비교적 종 내에서 보존된다. 항체의 프레임워크 영역, 즉 구성적 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역은 3차원 공간에서 CDR을 정위시키고 배열하는 기능을 한다.

CDR는 주로 항원의 에피토프와의 결합을 담당한다. 각 사슬의 CDR은 전형적으로 CDRl, CDR2, 및 CDR3로 지칭되며, N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 번호가 매겨지고, 또한 전형적으로 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해 확인된다. 따라서, V_H CDR3는 이것이 발견되는 항체의 중쇄의 가변 영역에 위치하며, 반면에 V_L CDRl는 이것이 발견되는 항체의 경쇄의 가변 영역으로부터의 CDR1이다.

"V_H" 또는 "V_L"이라 함은 Fv, scFv , dAb, dsFv 또는 Fab를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. "V_L" 또는 "V_L"이라 함은 Fv, scFv , dsFv, dAb, or Fab을 포함하는 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.

"단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는 전통적 2 사슬 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인이 하나의 사슬을 형성하도록 연결된 항체를 지칭한다. 선택적으로는, 링커(일반적으로 펩티드)는 두 개의 사슬 사이에 삽입되어 적절한 폴딩 및 활성 결합 부위의 생성을 가능하게 한다.

"이특이성 결합제", 또는 "bsBA"는 하나 이상의 표적 분자에 동시에 특이적으로 결합할 수 있는 결합성 분자이다.

"결합제"는 특이적으로 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자이고, 항체, 항체 단편, 앱타머(aptamer), 펩티드(예를 들어, [Williams et al., J Biol Chem 266:5182-5190 (1991)]) 및 항체 모사물, 예를 들어 10번째 피브로넥틴 도메인 III 영역으로부터 만들어질 수 있는 것(참조, 예를 들어, [Xu, L., et al., Chem Biol. 9(8):933-42 (2002), Koide et al., J MoI Biol 284:1141-1151, Skerra, J MoI Recognit 13:167-187 (2000), Main et al., Cell, 71:671-678 (1992), 및 Dickinson et al., J MoI Biol, 236:1079-1092 (1994)])을 포함하고, 천연 단백질 및 비-천연 잔기을 포함하도록 변형되거나 조작된 단백질을 포함하 ㄹ수 있다. 다소 덜 바람직한 구체예의 한 군에서, bsBA의 하나의 결합 도메인 또는 둘 모두의 결합 도메인에 대한 결합제는 수용체에 대한 천연 리간드 또는 수용체와 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 천연 리간드의 단편일 수 있다 (예를 들어, IL-13은 IL- 13 수용체를 위한 결합제로서 사용될 수 있다).

일반적으로 "앱타머"는 하나의 규정된 서열의 올리고뉴클레오티드이거나 상기 올리고뉴클레오티드들의 혼합물을 지칭하며, 여기서 혼합물은 표적 분자에 특이적으로 결합하는 특성을 지닌다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "앱타머"는 올리고뉴클레오티드의 단일 또는 복수의 서열을 가리킨다. 구조적으로는, 본 발명의 앱타머는 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드는 통상적인 염기, 당 잔기 및 뉴클레오티드간 연결을 지닌 것들 뿐만 아니라, 이들 세 부분 중 전부 또는 어느 하나의 변경을 포함하는 것을 포함한다. 본원에서 참조로서 통합된 미국 특허 제 5,756,291호는 앱타머의 설명, 앱타머를 제조하고 시험하는 방법, 및 이의 용도를 제공한다.

"표적 분자"는 본 발명의 이특이성 결합제의 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합되는 분자를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 용어 "제 1 표적 분자" 및 "제 2 표적 분자"는 같은 분자 종의 두 개의 분자보다, 두 개의 별개의 분자 종의 분자를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 이러한 분자 종은 예를 들어 두 개의 상이한 수용체 티로신 키나아제(예를 들어, 염기성 섬유모세포 성장 인자 수용체 1 및 간세포 성장 인자 수용체)일 수 있다. 몇몇 사이토카인 수용체 및 다른 수용체는 "사슬"로 알려진 서브유닛으로 구성되고, 몇몇 경우에 수용체는 수용체를 위한 리간드가 사슬 중 하나에 결합되는 경우 사슬을 보충함으로써 완전히 활성화된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 특정 수용체 (예를 들어, IL-2 수용체)의 모든 사슬은 같은 분자 종을 지니는 것으로 간주되고; 따라서, 주어진 수용체의 사슬이 본 발명의 bsBA의 제 1 결합 도메인에 의해 결합되는 "제 1 표적 분자"인 경우, "제 2 표적 분자"는 같은 수용체의 두 번째 사슬일 수 없다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "생물학적 활성"은 표적 분자에 의해 수행되는 규정된 공지의 활성을 지칭한다. 가장 일반적으로는, 본 발명의 bsBA에 의해 표적화된 분자의 생물학적 활성은 신호 전달이다. 예를 들어, 이 상세한 설명의 후반부에 표적 분자일 수 있는 분자로서 다수의 성장 인자 수용체의 목록을 나열하였다. 이들 수용체는 전형적으로 티로신 키나아제 효소 활성을 가지는 세포질 도메인, 막투과 도메인 및 세포의 세포외 표면상의 리간드 결합 도메인을 가진다. 전형적으로는, 티로신 키나아제 활성은 리간드 결합 도메인에 대한 리간드의 결합에 의해 활성화된다. 그 후, 수용체 키나아제 활성은 신호 캐스케이드를 시작한다. 따라서, 이들 표적 분자의 생물학적 활성은 신호 전달이다. 당업자는 표적 분자의 생물학적 활성이 표적 분자가 위치하는 세포에 궁극적으로 영향을 미침을 인식할 것이다. 예를 들어, 수용체를 과발현시키는 암세포에 있는 성장 인자 수용체를 활성화시킴에 의해 시작되는 신호 전달 캐스케이드가 세포의 성장 및 증식을 증가시키는 것으로 여겨지지만, 수용체의 활성화를 억제하는 것은 증식을 억제하거나 지연시키는 것으로 여겨진다. 따라서, 용어 "생물학적 활성"은 본원에서 세포의 활성과 관련하여 표적 분자의 활성과 대조적으로 또한 더욱 광범위하게 사용될 수 있다. 의미가 의도되는 바는 본문에 명백할 것이다.

세포 표면상의 임의의 주어진 분자가 본 발명의 목적을 위한 생물학적 활성을 가지던지 아니던지를 결정하는 것은 하기 수단에 의해 수행될 수 있다. 세포 표면 분자를 지니는 인간 세포의 배양물은 두 개의 별도의 배양물을 형성하도록 나눠질 수 있다. 첫 번째 배양물은 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하고, 분자를 위한 임의의 천연 리간드의 결합을 차단하는 것이 기대되는 결합 도메인에 접촉한다. 다른 군은 그렇지 않다. 두 개의 군은 그 다음에 그렇지 않다면 동일한 조건 하에서 배양된다. 본 발명의 목적을 위해, 표적 분자는 결합제에 의한 분자의 결합이 세포 증식, 세포 생존능, 아폽토시스(apoptosis), 다운스트림 키나아제의 활성화, 전사 활성화, 표면에의 부착, 또는 연질 한천에서 콜로니를 성장시키는 능력에서 관찰가능한 차이를 일으키지 않는다면, "생물학적 활성"을 가지지 않는 것으로 간주된다. 이러한 특성들에서 관해 배양물 사이에 차이가 있는 지의 여부는 당 분야에 공지된 표준 검정에 의해 측정될 수 있고, 이들 중 일부는 더욱 상세하게 아래에서 논의되고 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 생물학적 활성의 "조절"은 실시 담당자의 요망에 따라 표적 분자의 생물학적 활성을 증가시키거나 억제하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 표적 분자가 암세포의 증식을 증가시키도록 간주된 수용체(예를 들어, EbrB3 수용체)라면, 실시 담당자는 결합 도메인을 사용하여 수용체에 결합하고, 수용체의 천연 리간드에 의해 수용체의 결합을 차단함에 의해 수용체의 활성을 억제하고자 할 수 있다. 종종, 이 표적 분자들은 천연 리간드의 결합시에 티로신 키나아제로서 역할을 하는 수용체이다. 반대로, 표적 분자의 생물학적 활성이 실시 담당자가 증가시키기를 바라는 것이라면, 예를 들어, 실시 담당자는 표적 분자의 효능제로서 작용하도록 당 분야에 알려진 항체를 결합 도메인으로서 사용할 수 있다. 그 결과는 치료되는 질병 또는 질병 상태에 이롭도록 의도되며, 예를 들어, 악성 및 몇몇 자기면역 장애의 치료를 위해, 요망되는 효과가 일반적으로 세포 성장의 억제 또는 아폽토시스의 유도일 수 있거나, 특정 세포 형태, 예를 들어 자가면역질환의 치료를 위한 T-조절 T-세포의 증식의 유도일 수 있다.

세포 표면 수용체는 이 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드를 가지는 것으로 이해된다. 따라서, 주어진 수용체에 대하여, 용어 "천연 리간드"는 정상 생리학의 과정에서 그 수용체에 결합하는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 인터루킨("IL")-13은 IL-13 수용체를 위한 천연 리간드이고, IL-2는 IL-2 수용체를 위한 천연 리간드이며, 표피 성장 인자는 EGF 수용체를 위한 천연 리간드이다.

용어 "유효량" 또는 "유효한 양" 또는 "치료적 유효량"은 50% 이상 세포 단백질 합성을 억제하는 것 또는 세포를 죽이는 것과 같은 요망되는 결과를 생성하기에 충분한 작용제의 용량에 관한 것을 포함한다.

"이펙터 분자"는 본 발명의 bsBA의 이펙터 도메인과 같은 결합성 분자에 의해 접촉되는 경우, 예를 들어 신호전달, 인산화, 증식 유도 또는 세포사멸 유도에 의해, 세포의 행동을 조절하기 위해 사용될 수 있는 세포 표면 수용체로서 정의된다.

"Kd"는 하기 형태의 반응을 위한 역반응 및 정반응 속도 상수의 비이다:

A + B = AB.

평형에서, 평형 상수(K)는 생성물의 농도에 의해 나눠진 반응물의 농도의 적(product)과 동일하고, 농도의 차원을 가진다.

Kd = (농도 A x 농도 B) / (농도 AB)

"일가 결합제" 및 "일가 결합 조성물"은 세포 표면 마커에 결합하기 위한 단일 도메인을 가진 결합 분자로 정의되고, 예를 들어 두 개의 결합 도메인을 가진 온전한 면역글로불린 G 분자에 대조된다. 일가 결합제는 전형적으로 scFv, Fab', 단일 도메인 항체 등과 같은 이특이성 항체를 형성하는 두 개의 결합 도메인 중 하나의 분리된 단편이다.

"표적 세포"는 본 발명의 이특이성 항체 결합제가 이의 높은 친화도 표적화 도메인을 통해 우선적으로 결합되도록 의도되는 세포이다.

용어 "접촉"은 직접적 물리적 결합 상태의 배치에 관한 것을 포함한다.

세포는 여러 가지 단백질, 예를 들어 운반자, 이온 채널, 및 사이토카인 수용체가 위치하고 있는 지질 이중층을 포함하는 (통상적으로 "세포 막"으로 지칭되는) 원형질 막에 의해 결합되는 것으로 일반적으로 당 분야에서 이해되고 있다. 일반적으로, [Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., New York (3rd Ed., 1994), Chapter 10]이 참조된다. 세포 막은 세포질, 또는 세포의 내부를 마주보고 있는 표면, 및 세포의 외부, 또는 세포외 공간을 마주보고 있는 표면을 가지는 것으로 간주될 수 있다. 막투과 단백질은 종종 양친매성, 즉 이들은 소수성 및 친수성 영역을 가진다. 막을 통과하는 영역은 소수성이고 이중층을 포함하는 지질 분자의 소수성 꼬리와 상호작용한다. 친수성 영역은 막의 세포외 또는 세포질 면상의 물에 노출되어 있다. 막투과 단백질의 막투과 도메인은 알파 나선 또는 다중 베타 가닥으로 존재한다. 예를 들어, [Lodish et al., Molecular Cell Biology, W.E. Freeman and Co., New York (4th Ed., 2000), at chapter 3]가 참조된다.

"사이토카인"은 세포간 매개체로서 동일한 세포 집단(자가분비) 또는 또 다른 세포 집단(주변분비)에서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출된 단백질을 위한 일반 용어를 의미한다. 이러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인, 및 전통적인 폴리펩타이드 호르몬을 포함한다. 성장 호르몬 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소의 성장 호르몬; 부갑상샘 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 글리코단백질 호르몬 예를 들어 난포 자극 호르몬(FSH), 갑상샘 자극 호르몬(TSH), 황체형성 호르몬(LH); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토젠(lactogen); 종양 괴사 인자-α 및 β; 뮬러리안(Mullerian)-억제 물질; 마우스 생식샘자극호르몬-관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자 예를 들어 NGF-β; 혈소판 유래 성장 인자(PDGF); 전환 성장 인자(TGF) 예를 들어 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 예를 들어, IGF-I 및 IGF-II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론 예를 들어 인터페론-α, -β, 및 -γ; 집락 자극 인자(CSF) 예를 들어 마크로파지-CSF(M-CSF); 과립구-마크로파지-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터루킨(IL) 예를 들어 IL-I, IL-lα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL9, IL-11, IL-12; 및 다른 폴리펩타이드 인자 예를 들어 LIF 및 키트 리간드(KL, "스틸 인자 (steel factor)"로 또한 알려짐)이 사이토카인에 포함된다.

다르게 가리키지 않는다면, 본원에서 항체 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 위치에 대한 참조는 "카바트 앤 우"("Kabat and Wu") 시스템 하에서 아미노산의 번호 매김을 지칭한다. 본원에서 참조로서 통합되는 [Kabat, E., et al., Sequences of proteins of Immunological Interest, U.S. Government Printing Office, NIH Publication No. 91-3242 (1991)]에서 참조된다(Kabat and Wu 데이터베이스 및 번호 매김 시스템은 또한 "카바트(Kabat)"시스템 및 번호매김으로서 본원에서 지칭된다). 카바트 앤 우 데이터베이스는 당분야에서 항체의 아미노산 잔기의 번호 매김을 위해 가장 넓게 사용되는 시스템이고, 너무 커서 편의적으로 인쇄되지 않는다. 현재는 "http://"를 입력하고 "immuno.bme.nwu.edu/"이 후속하는 것에 의해 찾아질 수 있는 지시서 서비스 온라인으로서 유지되고 있다. 카바트 앤 우 시스템 하에서 잔기에 따른 번호는 그 사슬의 아미노 말단으로부터 매겨짐에 의해 주어진 중쇄 또는 경쇄에 있는 잔기를 위해 얻을 수 있는 수에 필연적으로 일치하지 않는다.

용어 "잔기" 또는 "아미노산 잔기" 또는 "아미노산"은 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩티드 (집합적으로 "펩티드")에 통합되는 아미노산에 대한 것을 포함한다. 아미노산은 자연적 발생 아미노산일 수 있고, 다르게 제한되지 않는다면, 자연 발생 아미노산과 유사한 방법으로 기능할 수 있는 자연 아미노산의 유사체를 포함한다.

단백질을 기재하는 경우에, "보존성 치환"은 단백질의 활성화에 실질적으로 변화를 주지 않는 단백질의 아미노산 조성에서의 변화를 지칭한다. 따라서, 특징 아미노산 서열의 "보전적으로 변경된 변이"는 결정적인 아미노산의 치환이 활성을 실질적으로 바꾸지 않는 유사한 특성(예를 들어, 산성, 염기성, 양하전 또는 음하전, 극성 또는 비극성 등)을 가지는 다른 아미노산으로 아미노산의 치환 또는 아미노산의 단백질 활성에 결정적인 이 아미노산들의 아미노산 치환을 지칭한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존성 치환 테이블은 당 분야에 잘 알려져 있다. 테이블 A에 있는 하기 6개의 군은 각각 서로에 대해 보존성 치환인 아미노산을 포함한다.

테이블 A

1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).

또한, [Creighton, Proteins, W.H. Freeman and Company, New York(1984)]가 참조된다.

용어 "선택적으로 반응성" 및 "선택적으로 결합"은, 항원에 대해, 항체가 항원이 없는 세포 또는 조직이 아닌 항원을 지니는 세포 또는 조직과 전체 또는 부분적으로 우선적으로 결합함을 지칭한다. 물론, 비특이적 상호작용의 특정 정도는 분자와 비표적 세포 또는 조직 사이에서 발생할 수 있는 것으로 인식된다. 그럼에도 불구하고, 선택적 반응성은 항원의 특이적 인식을 통해 중개되는 경우 구별될 수 있다. 비록 선택적 반응성 항체가 항원과 결합하지만, 이들은 낮은 친화도를 가지고 그렇게 할 수 있다. 반면에, 특이적 결합은 결합된 항체와 항원이 없는 세포 사이보다 항원을 지니는 항체와 세포 사이에 매우 강한 결합을 일으킨다. 특이적 결합은 전형적으로 항원 또는 마커가 없는 세포 또는 조직에 비해 표적 항원 또는 마커를 가지는 세포 또는 조직에 대한 결합된 항체의 양을 2배, 바람직하게는 5배, 더욱 바람직하게는 10배 및 가장 바람직하게는 100배 이상 증가시킨다. 이러한 조건 하에서 단백질에의 특이적 결합은 특정 단백질에 대한 특이성에 대해 선택되는 항체를 요구한다. 다양한 면역검정 포맷은 특정 단백질에 특이적으로 면역반응성이 있는 항체를 선택하는데 적합하다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역검정은 단백질에 특이적 면역반응성이 있는 단클론 항체를 선택하기 위해 보통 사용된다. 특이적 면역반응성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 면역검정 포맷과 조건의 설명을 위해 [Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988)]가 참조된다.

용어 "면역학적 반응성 조건"은 특정 에피토프에 대해 생성된 항체가 실질적으로 모든 다른 에피토프에 결합하는 것보다 검출할 수 있을 만큼 더 큰 정도로 및/또는 그러한 결합을 실질적으로 배제하도록 그 에피토프에 결합할 수 있게 하는 조건에 대한 것을 포함한다. 면역학적 반응성 조건은 항체 결합 반응의 포맷에 의존하고, 전형적으로 생체 내에서 만나게 되는 면역검정 프로토콜 또는 이의 조건에 활용되는 것이다. 면역검정 포맷 또는 조건에 대한 설명을 위해, [Harlow & Lane, supra]가 참조된다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 사용되는 면역학적 반응성 조건은 살아있는 포유류 또는 포유류의 세포 내의 전형적인 조건(예를 들어, 온도, 삼투몰농도, pH)에 대한 것을 포함하는 "생리적 조건"이다. 몇몇 기관은 극한 조건을 받는 것으로 인식되지만, 개체 내 및 세포 내 환경은 일반적으로 약 pH 7(즉, pH 6.0 내지 pH 8.0, 더욱 전형적으로는 pH 6.5 내지 7.5)이고, 주된 용매로서 물을 함유하고, 0℃ 보다 높고 50℃ 보다 낮은 온도로 존재한다. 삼투몰농도는 세포 생존능 및 증식을 지탱하는 범위 내이다.

치료제 또는 표지에 대한 bsBA의 결합

bsBA의 이들의 리간드 그 자체에 대한 결합이 예를 들어, 사이토카인의 이들의 수용체로의 접근을 차단함에 의해 표적 세포의 생물학적 활성을 조절하도록 의도되지만, 생물학적 활성에 대한 bsBA의 효과는 bsBA에 치료제를 결합함에 의해 증가될 수 있다. 따라서, 몇몇 구체예에서, bsBA는 생물학적으로 해제가능한 결합을 통한 치료제의 부착을 허용하는 작용기를 도입하도록 유도체화된다. bsBA는 예를 들어 하이드라지드, 하이드라진, 일차 아민 또는 이차 아민기에서 종결되는 측쇄를 도입하도록 유도체화된다. 치료제는 예를 들어 쉬프 염기 연결(Schiffs base linkage), 하이드라존 또는 아실 하이드라존 결합 또는 하이드라지드 링커를 통해 컨쥬게이션될 수 있다(예를 들어, 특히 본원에서 참조로서 통합된 미국 특허 제 5,474,765 및 5,762,918가 참조된다). 본 발명의 bsAB에 치료제를 결합하는데 적절한 다수의 다른 화학은 당 분야에 잘 알려져 있고, [Hermanson, G., Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA (1996)]에 의해 예시되고 있다.

치료제는 항신생물제, 항대사제, 방사능제, 세포독성제, 및 화학요법제로부터 선택될 수 있다.

세포독성제는 하기와 같은 항암제가 있다: 젬시타빈(gemcitabine); 메토트렉세이트(methotrexate); 5-FU; FUDR; FdUMP; 하이드록시우레아(hydroxyurea); 도세탁셀(docetaxel); 디스코데르몰리드(discodermolide); 에포틸론(epothilones); 빈크리스틴(vincristine); 빈블라스틴(vinblastine); 비노렐빈(vinorelbine); 메타-팩(meta-pac); 이리노테칸(irinotecan); SN-38; 10-OH 캄프토(campto); 토포테칸( topotecan); 에토포시드(etoposide); 아드리아미신(adriamycn); 플라보피리돌(flavopiridol); 시스플라틴(cisplatin); 카르보플라틴(carboplatin); 블레오미신(bleomycin); 미토미신(mitomycin) C; 미트라미신(mithramycin); 카페시타빈(capecitabine); 시타라빈(cytarabine); 2-Cl-2'데옥시아데노신(deoxyadenosine); 미톡산트론(mitoxantrone); 미토졸로미드(mitozolomide); 펜토스타틴(pentostatin); 및 랄티트렉시드(raltitrexed).

본 발명의 bsBA는 진단 또는 치료적 용도를 촉진하기 위해 추가로 변경되거나 표지될 수 있다. 예를 들어, 방사성, 형광성, 중금속, 또는 다른 표지와 같은 검출할 수 있는 표지는 본 발명의 bsBA에 컨쥬게이션될 수 있다. bsBA의 단일, 이중, 또는 다중 표지화가 이로울 수 있다. 예를 들어 bsBA는 하나 이상의 잔기의 방사성 요오드화 및 킬레이팅 기를 통한 아민-함유 측부 또는 반응 기에 예를 들어 ⁹⁰Y의 결합 둘 모두로 이중으로 표지될 수 있다. 이 조합 표지화는 넓게 퍼진 작은 신생 세포 덩어리의 확인과 같은 특별한 진단 필요에 유용할 수 있다.

본 발명의 bsBA를 방사능 표지화하기 위한 방사성 동위원소는 bsBA의 잔기에 컨쥬게이션되거나 결합될 수 있는 임의의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성 동위원소는 베타 또는 감마 방사선을 방출하는 방사성 동위원소로부터 선택될 수 있거나, 대안적으로는, 펩티드 작용제가 예를 들어 유사체의 리신 잔기(들)에 공유결합될 수 있는 킬레이팅 기를 함유하도록 변경될 수 있다. 킬레이팅 기는 그 다음에 변경되어 임의의 다양한 방사성 동위원소, 예를 들어 갈륨, 인듐, 테크네튬, 이터비엄, 레늄, 또는 탈륨 (예를 들어, ¹²⁵I, ⁶⁷Ga, ¹¹¹In, ⁹⁹mTc, ¹⁶⁹Yb, ¹⁸⁶Re)를 함유할 수 있다.

킬레이팅 기는 검출할 수 있는 표지 또는 다른 분자를 본 발명의 bsBA에 간접적으로 결합하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이작용성 안정 킬레이터는 에드만 분해를 막는 이소티오시아네이트 베타-알파 또는 적절한 비 알파-아미노산 링커를 통해 하나 이상의 말단 또는 내부 아미노산 반응 기에 연결될 수 있다. 당 분야에 알려진 킬레이터의 예는 예를 들어, 이니노카르복실 및 폴리아미노폴리카르복실 반응 기, DTPA(N,N-비스[2-[비스(카르복시메틸)아미노]에틸]글리신), 및 DOTA (l,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-l,4,7,10-테트라아세트산)를 포함한다.

암 진단 및 치료의 견지에서, 본 발명의 bsBA는 진단 및 영상 조성물, 및 진단 및 영상 방법(예를 들어, 생체 내 및 시험관 내에서의 방법)에서 bsBA을 활용하는 키트를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 혈관 종양은 생체내 진단 영상 작용제가 부착되어 있는 종양 세포, 종양 혈관계, 또는 종양 기질의 접근가능한 성분에 결합되는 제 1 결합 분자를 적어도 포함하는 bsBA의 진단적 유효량을 사용하여 영상화될 수 있다.

질병 또는 장애가 암인 또 다른 바람직한 구체예에서, 암치료 전 사전 영상화는 (a) 종양 세포, 또는 종양 혈관계 또는 종양 기질의 특징인 높게 발현된 수용체에 높은 친화도로 결합하는 첫 번째 결합 분자, 및 제 2의 편재적으로 발현되는 수용체(예를 들어, ErbB3 또는 ErbB4)에 적어도 10배 낮은 친화도로 결합하는 두 번째 결합 분자를 가지는 본 발명의 검출가능하게 표지화된 bsBA를 포함하는약제학적 조성물의 진단적 유효량을 동물 또는 환자에 투여하고, (b) 계속해서 종양 세포, 종양 혈관, 또는 종양 기질에 결합되어 있는 검출할 수 있게 표지화된 bsBA를 검출함으로써 수행될 수 있고, 이로써 종양, 종양 혈관계, 및/또는 종양 기질의 영상을 얻는다.

이론에 의해 제한하고자 하는 것은 아니지만, bsBA는 세포 표면 수용체에 결합하기 위해 천연 리간드와 경쟁함에 의해 세포 신호전달을 줄이거나, 막거나, 억제할 수 있다. 이러한 상황에서, bsBA는 리간드 결합시에 유도되는 세포 신호전달을 차단함에 의해 작용을 한다. bsBA는 또한 세포 표면 수용체의 내재화/하향조절을 유도함에 의해 역할을 할 수 있다. 내재화/하향조절에 의해 야기되는 세포 표면에서서 수용체의 수의 감소는 수용체 활성화의 감소를 일으키며, 이는 수용체를 위한 신호 전달 경로에 따른 세포 신호전달을 줄이거나 막는다. 마지막으로는, 수용체 이합체화가 신호 전달에 요구되는 경우에, bsBA는 두 개의 세포 표면 수용체의 이합체화를 막음에 의해 역할을 할 수 있다.

표적으로서 용도 및 이펙터를 위한 세포 마커의 선택

bsBA를 표적화하기 위해 사용되는 세포 마커는 전형적으로는 비표적 세포에서보다 표적 세포에서 더 높은 수준으로 발현되거나, 비표적 세포에서 발현되지 않는다. 예를 들어, 표적 마커는 비표적 세포에서의 이의 발현에 비해 특히 암에서 높게 발현될 수 있거나, 암성이지 않은 세포에 의해 발현되지 않을 수 있다. 바람직하게는, 표적 마커는 요망되는 생물학적 효과와 관련된 세포에서 생물학적 기능에 관여한다.

이펙터로서 사용되는 세포 마커는 전형적으로 주어진 병리학 조건에서 조절에 유리한 성장 인자, 사이토카인, 또는 케모카인 수용체와 같은 세포 신호전달에 관여한다. 본 발명의 hi-lo bsBA에 의해 제공되는 선택성 때문에, bsBA 이펙터 도메인에 의해 결합되는 마커의 발현은 표적 세포로 제한될 필요가 없고, 생물체의 다른 세포에서 발현될 수 있다.

Kd 측정

bsBA의 결합 분자의 결합 친화도는 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어 본원에 참조로서 통합되는 미국 특허 제 6,703,020호에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 결정될 수 있다. bsBA의 첫 번째 및 두 번째 결합 분자의 이의 표적 수용체에 대한 결합 친화도, 및 bsBA-수용체 복합체의 오프-속도 (off-rate)는 경쟁적 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 경쟁적 결합 검정의 한 예는 증가하는 양의 표지되지 않은 수용체의 존재하에서 예를 들어 ³H 또는 ¹²⁵I로 표지된 하나 또는 두 개의 수용체를 관심 bsBA와 인큐베이션하고, 표지된 수용체에 연결된 bsBA를 검출하는 것을 포함하는 방사성면역검정법이다. 특정 수용체에 대한 관심 bsBA의 친화도 및 결합 오프-속도는 예를 들어, 스카트차드(Scatchard) 플롯 분석에 의한 데이타로부터 결정될 수 있다. Kd는 또한 예를 들어, 문헌 [Nielsen et al. (Cancer Res. 60(22): 6434-40 (2000))]에 기재된 바와 같이 흐름 세포측정법에 의해 결정될 수 있다. Kd를 측정하기 위한 예시적인 검정은 실시예에서 설명된다.

바람직한 방법에서, bsAB의 수용체 결합 친화도는 비아코어 표면 플라스몬 공명 시스템(BIAcore surface plasmon resonance system)(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용하여 측정되는 결합 및 해리 속도 상수로부터 결정된다. 전형적으로는, bsBA의 리간드 분자에 대한 친화도는 바이오센서 칩(BIAcore)상에 적당한 양(예를 들어, 500 공명 단위)을 고정시킴에 의해 결정된다. bsBA의 온(on) 및 오프(off) 속도는 전형적으로는 PBS에서 5분 동안 칩 표면 위에 25 μg/ml bsBA를 주입한 후, 칩 위에 완충 용액을 흐르게 하여 결합된 물질이 5분 동안 해리되도록 함으로써 측정된다. 결합 속도론은 예를 들어 BIAevaluation 2.1 소프트웨어(BIAcore)를 사용하여 분석될 수 있다. 특정 bsBA가 본 발명의 범위 내에 속하는 지를 결정하기 위한 목적을 위해, bsBA의 결합 도메인의 친화도가 bsBA의 형성 후에 결정되어(bsBA에 이들을 배치하기 이전에 개별적으로 도메인의 친화도를 측정하는 것에 반대됨), 결합 도메인의 상대적 친화도가 결정될 수 있다.

요망되는 생물학적 효과의 측정

본 발명의 bsBA는 요망되는 치료적 또는 예방적 활성에 대해 시험관 내에서 바람직하게는 먼저 시험된다. 예를 들어, bsBA의 치료적 또는 예방적 활용을 설명하기 위해 사용될 수 있는 시험관 내 검정은 세포주 또는 환자 조직 샘플에 대한 bsBA의 효과를 포함한다.

세포주 및/또는 조직 샘플에 있는 bsBA의 효과는 예를 들어, 세포 증식 검정, 세포 생존능 검정, 단백질 인산화 검정, 단백질 키나아제 활성, 아폽토시스 검정, 및 단백질 합성 억제 연구를 포함하는 당업자에 알려진 기술을 활용하여 측정될 수 있다. 항체 마이크로어레이가 단백질 경로에 있는 다중 단백질에 대한 효과를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 검정은 예를 들어 문헌[Nielsen et al. (Proc Natl Acad Sci USA., 100(16):9330-5. (2003)) ("Nielsen 2003")]에 기재되어 있다. 그 후, bsBA는 인간 임상 실험을 시작하기 전에 비 인간 동물에 효율을 위해 생체 내에서 시험된다.

일가 결합 조성물의 제조

bsBA가 화학적 가교에 의해 만들어지는 경우, 가교되지 않은 단편은 그 자체로 일가 결합 단편이다. 유전적으로 연결된 (다시 말해, 재조합 발현된) bsBA의 경우에, 일가 결합 조성물은 개개의 결합 단백질을 1가 결합 단백질의 발현 및 분리를 가능하게 하는 발현 벡터로 클로닝함에 의해 제조될 수 있다. 그 후, 개개의 1가 결합 조성물의 친화도가 위에 설명된 바와 같이 결정될 수 있다.

당량(equivalent) Kd의 테스트

당량 Kd는 위에서 설명된 방법에 의해 1가 결합 조성물을 사용하여 결정될 수 있다.

bsBA의 결합 및 1가 결합 조성물의 비교

1가 결합 조성물 및 bsBA는 예를 들어, 치료제로서의 이의 효율성을 평가하고 bsBA의 효율성을 비교하기 위해 생물학적 활성 검정을 받을 수 있다. 이러한 검정은 당분야에 공지되어 있고 표적 항원에 의존한다. 예는 헤레귤린 또는 다른 성장 인자에 의한 활성화에 이은 면역블로팅함 또는 ELISA에 의한 AKT 인산화의 측정, 성장 억제 측정(예를 들어, WO 89/06692에 기재되어 있음); 또는 아폽토시스의 검정을 포함한다.

인산화의 경우, 표준 면역블로팅은 예를 들어 이펙터 분자 그 자체 또는 다운스트림 키나아제의 활성화에 대한 결합 분자의 효과를 결정하기 위해 사용될 수 있거나, 항체 검사가 [Nielsen 2003, supra]에 상세히 기재되어 있는 바와 같이 사용될 수 있다.

아폽토시스의 경우, DNA 단편화는 아폽토시스 세포에서 DNA 닉(nick)을 검출하는 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 검사 또는 표준 전기영동을 사용하여 시험관 내에서 검출될 수 있다. 세포가 고정된 경우, DNA 가닥 파쇄가 주형-비의존 방식으로 이러한 DNA 단편의 3'-하이드록실 말단에 표지된 뉴클레오티드를 공유적으로 첨가하는 포유류 말단 디옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT)를 사용하여 인 시튜 (in situ) 검출될 수 있다.

세포 생존능 및 증식은 여러가지 화학적 생물학적 시약으로 감시될 수 있다. 예를 들어, 세포 주기 관련 마커에 대한 항체 또는 형광 기초 세포 생존능 및 증식 검정, 예를 들어 삼중수소화 티미딘 검정, 트립판 블루 배제 검정, ATCC 바이오프로덕츠(Bioproducts™) MTT 세포 증식 검정 (American Type Culture Collection, Manassas, VA), 또는 셀타이터-블루 (CellTiter-Blue®) 세포 생존능 검정 (Promega, Madison, WI).

성장 인자 수용체를 결합하기 위한 bsBA의 용도

다수의 분자들은 본 발명의 bsBA의 이펙터 도메인에 의해 결합될 수 있다. 하나의 중요한 일련의 구체예에서, 이펙터 도메인은 티로신 키나아제 수용체와 같은 세포 표면상의 성장 인자 수용체와 결합한다. 다수의 중요한 성장 인자 수용체 및 이들의 리간드, 예를 들어 표피 성장 인자(EGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF-I), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 과에 속하는 것의 과발현 또는 부적절한 활성화는 질병 및 장애, 예를 들어 암 및 자기면역 질병의 개시 및 진행에 연관되어 있거나 이를 초래하는 것으로 알려져 있다. 이 성장 인자들은 질병 세포의 생존, 증식, 또는 이주를 자극하도록 자가분비 및/또는 주변분비 방식로 작용하는 것으로 생각된다. 이러한 수용체들에 대한 성장 인자의 결합은 예를 들어, 수용체의 활성화를 야기하며, 이는 상이한 신호전달 분자의 배열을 통한 수용체 자가인산화 및 후속 신호 전달을 일으킨다.

이러한 세포에서 티로신 키나아제 수용체의 활성화 또는 성장 인자의 결합 활성을 간섭하는 것은 비암성 표현형을 회복하거나 침범된 세포의 증식 속도를 줄일 수 있다. 다시 말해, 수용체의 본 발명의 bsBA와의 접촉은 리간드, 예를 들어, 성장 인자의 이들의 세포 표면 수용체에 대한 결합시에 생성된 신호를 차단한다. bsBA는 수용체에 대한 리간드 결합을 막거나 줄임에 의해, 또는 리간드-유발된 수용체 이합체화를 막거나 줄임에 의해 신호 전달 경로의 활성화를 막거나 줄인다.

본 발명의 방법에서 유용한 결과를 이루기 위해 bsBA의 이펙터 도메인에 의해 결합될 수 있는 (또 다른 명칭이 괄호에서 보여지는) 예시적인 티로신 키나아제 수용체는,

ALK (역행성(anaplastic) 림프종 키나아제), 역행성 큰 세포 림프종(ALCL)에서 키메라 NPM-ALK 단백질의 부분으로서 발현된 티로신 키나아제 수용체;

디스코이딘 도메인 수용체 (DDR), 렉틴 디스코이딘 I (디스코이딘 수용체 티로신 키나아제) (티로신-단백질 키나아제 CAK) (세포 유착 키나아제) (TRK E) (단백질-티로신 키나아제 RTK 6) (CD 167a 항원)과 동종인 독특한 세포외 도메인에 의해 구별되는 수용체 티로신 키나아제;

디스코이딘 도메인 수용체 2 전구체 (수용체 단백질-티로신 키나아제 TKT) (티로신- 단백질 키나아제 TYRO 10) (향신경성 티로신 키나아제, 수용체-관련 3);

표피 성장 인자 수용체 (수용체 단백질-티로신 키나아제 ErbB-1);

수용체 단백질-티로신 키나아제 erbB-2 (pl85erbB2) (NEU 원종양유전자(proto-oncogene)) (C-erbB-2);

수용체 단백질-티로신 키나아제 erbB-3 전구체 (c-erbB3) (티로신 키나아제-형 세포 표면 수용체);

수용체 단백질-티로신 키나아제 erbB-4 (pl80erbB4) (티로신 키나아제-형 세포 표면 수용체);

염기성 섬유모세포 성장 인자 수용체 1 (FGFR-I) (bFGF-R) (Fms 유사 티로신 키나아제-2) (c-fgr);

FL 사이토카인 수용체 (티로신-단백질 키나아제 수용체 FLT3) (줄기 세포 티로신 키나아제 1) (STK-1) (CD135 항원);

비만/줄기 세포 성장 인자 수용체 (SCFR) (원종양유전자 티로신-단백질 키나아제 키트) (c-키트) (CD117 항원);

백혈구 티로신 키나아제 수용체 (단백질 티로신 키나아제-1);

간세포 성장 인자 수용체 (Met 원종양유전자 티로신 키나아제) (c-met) (HGF 수용체) (HGF-SF 수용체);

단백질-티로신 포스파타제 eta (R-PTP-eta) (HPTP eta) (단백질-티로신 포스파타제 수용체 타입 J) (밀도 증강 포스파타제-1) (DEP-I) (CD148 항원);

원종양유전자 티로신-단백질 키나아제 수용체 ret (C-ret);

티로신-단백질 키나아제 막투과 수용체 RORl (향신경성 티로신 키나아제, 수용체-관련 1);

티로신-단백질 키나아제 막투과 수용체 ROR2 (향신경성 티로신 키나아제, 수용체-관련 2);

티로신-단백질 키나아제 수용체 Tie-1 ;

안지오포이에틴(Angiopoietin) 1 수용체 (티로신-단백질 키나아제 수용체 TIE-2) (티로신-단백질 키나아제 수용체 TEK) (P140 TEK) (튜니카 인터나 (Tunica interna) 내피 세포 키나아제) (CD202b 항원);

높은 친화도 신경 성장 인자 수용체 (TRKl 전환 티로신 키나아제 단백질) (p140-TrkA) (Trk-A);

BDNF/NT-3 성장 인자 수용체 (TrkB 티로신 키나아제) (GP145-TrkB) (Trk-B);

NT-3 성장 인자 수용체 (TrkC 티로신 키나아제) (GP145-TrkC) (Trk-C);

혈관 내피 성장 인자 수용체 1 (VEGFR-1) (혈과 투과 인자 수용체) (티로신-단백질 키나아제 수용체 FLT) (Flt-1) (티로신-단백질 키나아제 FRT) (Fms 유사 티로신 키나아제 1);

혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR-2) (키나아제 삽입 도메인 수용체) (단백질-티로신 키나아제 수용체 Flk-1); 및

혈관 내피 성장 인자 수용체 3 전구체 (EC 2.7.1.112) (VEGFR-3) (티로신-단백질 키나아제 수용체 FLT4)을 포함한다.

아래 논의는 이펙터 도메인과 결합하기에 특별히 유용한 수용체 티로신 키나아제 뿐만 아니라 본 발명의 방법에 의해 유용하게 조절될 수 있는 다른 수용체 과에 대한 더욱 특이적 정보를 설명한다.

표피 성장 인자 수용체 (EGFR)/ErbB 수용체

단일 스패닝(single-spanning), 수용체 티로신 키나아제의 EGFR/ErbB 과는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), ErbB2 (HER2/neu), ErbB3 (HER3) 및 ErbB4 (HER4)의 4개의 일원으로 구성된다. ErbB 수용체와 결합하여 활성화시키는 전부 상이한 유전자 생성물인 다수의 리간드가 확인되었다. 이러한 수용체 및 리간드는 정상 세포 성장 및 분화에서 중요한 역할을 한다.

ErbB 수용체 단백질의 비정상적 신호전달 및/또는 비조절된 활성화는 많은 암의 발달 및 진행에 연결되어 있다. 기능장애 ErbB 수용체 경로를 통해 매개된 제어되지 않은 세포 증식은 상피 기원의 많은 종류의 고형 암에서 발견될 수 있고, 데이타는 종양 ErbB 수용체 발현, 과발현 및/또는 조절이상을 진행된 질병, 전이 표현형, 화학요법에 대한 내성 및 및 전반적으로 더 나빠진 예후에 연결시킨다. 또한, 또한 데이타는 ErbB 수용체를 증가된 종양 침입, 세포성 아폽토시스의 억제, 증가된 세포 부착 및 혈관 생성에 연루시킨다. 특히, EGFR의 증가된 발현은 유방, 방광, 폐 및 위의 더욱 공격적인 암종(carcinomas)에서 관찰된다(Modjtahedi and Dean, Int. J. Oncol. 4:277-296, (1994)). 인간 ErbB2의 과발현은 유방 및 난소 암(Slamon et al., Science 235:177- 182 (1987) 및 Slamon et al., Science 244:707-712 (1989)), 및 위의 암종, 자궁 내막, 침샘, 폐, 신장, 결장 및 방광의 암종에 연관되어 있다. ErbB3의 현저하게 증가된 수준은 특정 인간 유방 종양 세포주과 연관되어 있으며, 이는 ErbBl 및 ErbB2와 같은 ErbB3가 인간 악성 종양에서 중요한 역할을 하는 것을 가리킨다. 상세하게는, ErbB3는 유방암(Lemoine et al., Br. J. Cancer 66:1116-1121, 1992), 위장암(Poller et al., J. Pathol. 168:275-280, 1992; Rajkumer et al., J. Pathol. 170:271-278, 1993; and Sanidas et al., Int. J. Cancer 54:935-940, 1993), 및 췌장암(Lemoine et al., J. Pathol. 168:269-273, 1992, and Friess et al., Clinical Cancer Research 1:1413-1420, 1995)에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다. 마지막으로, 증가된 ErbB4 발현은 또한 유방 샘암종를 포함하는 인간 암종 예를 들어 표피 기원의 암종에 밀접하게 서로 연관되어 있다.

단백질 수용체의 ErbB 과에 의해 매개되는 신호 전달은 리간드-유발 수용체 이종이합체화시에 많은 경우에 발생된다. 이종이합체화에 이은 "수용체 혼선(cross-talking)"은 ErbB 수용체 키나아제 도메인의 활성화 및 ErbB 수용체의 교차-인산화를 야기하며, 이는 예를 들어 EGFR과 ErbB2, ErbB2와 ErbB3, 및 ErbB2와 ErbB4 사이에서 발생되는 것으로 알려져 있다(예를 들어, [Wada et al., Cell 61 :1339- 1347 (1990); Plowman et al., Nature 336:473-475 (1993); Carraway and Cantley, Cell 78:5-8 (1994); Riese et al., Oncogene 12:345-353 (1996); Kokai et al., Cell 58:287-292 (1989); Stern et al., EMBO J. 7:995-1001 (1988); and King et al., Oncogene 4:13-18 (1989)]에서 참조된다). 하나의 결합 도메인이 ErbB2에 결합하고 나머지 하나가 ErbB3에 결합하는 bsBA는 다소 덜 바람직하다.

본 발명의 bsBA를 제조에서 사용을 위한 바람직한 결합 분자는 예를 들어, 미국 특허 제 5,183,884, 5,480,968, 5,968,511, 5,977,322, 및 6,512,097호; [Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9193-9197 (1989)]; 유럽 특허 출원 No. 444,961 Al; 및 [Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2900-2904 (1993)]에 기재되어 있고, 이는 본원에 참조로서 통합된다. 치료 방법의 구체예는 질병 상태 또는 암 이외의 상태들, 예를 들어 면역 장애, 신경섬유종증 및 말초신경병증과 같은 신경 장애, 및 심장 비대와 같은 심장 장애를 포함한다.

인슐린 수용체 (IR) 및 인슐린 유사 성장 인자 수용체 (IGF-R)

인슐린 수용체 및 IGF-1 수용체는 두 개의 주된 질병, 당뇨 및 암을 위한 새로운 치료제의 개발을 위해 중요한 표적인 매우 관련된 단백질이다. 당뇨병은 중요성이 증가하고 있는 전지구의 건강 문제이다. 이는 유행병으로서 세계 건강 기구에 의해 분류된 단지 비-감염성 질병이다. 당뇨병의 세계적 발생율은 2 내지 3%이고, 미국 및 다른 서부 국가에서 6% 증가하고 있다.

인슐린 유사 성장 인자 수용체가 특정 암 및 건선에서 중요한 역할을 한다는 증거가 계속 증가되고 있다. 이러한 수용체에 의한 조절되지 않는 신호전달은 예를 들어, 방사능요법 및 화학요법에 대한 내성을 가진 윌스 종양형성(Wilm's tumorigenesis), 간모세포종, 간세포암종, 결장직장암, 유방암, 아데노코르티칼 카르시노마, 다발 골수종, 림프종, 백혈병, 전립샘 암, 및 폐암의 발병기전에 관련되어 있다. 인슐린 및 IGF 수용체는 ErbB 수용체 과에 밀접하게 관련되어 있다.

인슐린 유사 성장 인자 수용체(IGFR)는 신체의 많은 세포의 정상 기능의 유지에 관련되어 있다. IGF-II 수용체는 종양 세포에 의해 공통적으로 발현되고, 자가분비 성장 인자로서 역할을 할 수 있고; 경우에 따라서는 표적 조직에 도달하며; 종양-유발 저혈당증을 일으킨다. IGF-I 수용체는 공통적으로 많은 암에서 과발현되고, 많은 최근 연구는 암세포 증식, 부착, 이동, 및 세포 사멸에 영향이 있는 IGF-I 수용체로부터 생겨나는 새로운 신호 경로; 암세포 생존 및 전이에 중요한 기능들을 확인하였다(예를 들어, [LeRoith et al., Cancer Lett. 195:127-137 (2003)]가 참조된다.). IGF-I 수용체는 많은 정상 세포가 또한 이 수용체를 발현하기 때문에, 암 치료법을 위한 유망한 표적으로서 보여지지 않는다. 과학적 증거는 IGF-I 수용체 억제가 세포 증식 또는 종양 발달에 관련된 다수의 세포내 신호전달에 영향을 미치고 어떻게 IGF-I 수용체 억제가 통상적 화학요법 또는 다른 항암제에 더욱 민감하게 종양 세포를 만드는지를 설명하기 위한 가능한 메카니즘을 제공함을 제안한다. 아마 가장 중요하게는 IGF-I 수용체의 신호전달을 억제하는 것은 종양 성장을 억제하고, 환자 생존을 지속시키고, 다발 골수종 및 다른 혈액 악성종양의 임상적으로 관련된 마우스 모델에서 화학요법의 항종양 효과를 높인다. 따라서, bsBA의 낮은 친화도 결합 분자가 IGF-I 수용체에 결합되는 bsBA가 우선적으로 IGF-I 수용체를 표적화하는 종래의 치료제의 결점을 극복할 것으로 고려된다(다시 말해, 비표적, 비질졍 세포에서의 IGF-I 수용체 신호전달의 억제를 피함에 의해). 이러한 경우, bsBA의 높은 친화도 결합 분자가 특이적으로 질병 세포(예를 들어, IGF-I 수용체의 과자극의 억제가 요망되는 세포)에 bsBA를 표적화하는 세포 표면 수용체에 결합하는 것이 바람직하다. 우선적으로 질병 세포에 표적화되는 경우, bsBA의 낮은 친화도 결합 분자는 그 다음에 IGF-I에 결합될 수 있고 질병 상태에 관련된 부적절한 세포 신호전달을 억제할 수 있다.

유방의 진행된 단계의 샘암종을 가진 환자를 위한 치료 전략은 세포독성 화학요법의 사용을 종종 포함한다. 세포 주기 조절에서 주요한 인자인 IGF-I 수용체는 종종 높은 등급 유방암에서 과발현되고 이 암들에서 주된 표적을 대표한다. ErbB2-과발현 유방암세포의 성장을 억제하는 항-HER2/neu 수용체 단클론 항체(Trastuzumab, 또한 Herceptin®로 알려짐)를 사용하여 유방암 치료를 받는 환자가 공통적으로 항체에 대한 내성이 발달함이 또한 주목되었다. 세포 생존 신호를 활성화시키는 인슐린 유사 성장 인자-I(IGF-I)가 트라스투주맵(trastuzumab)의 성장 억제 작용을 방해함이 관찰된다. 본 발명의 bsBA를 사용하여 IGF-I 수용체를 통한 세포 신호전달을 막거나, 줄이거나 억제함에 의해, 트라스투주맵-유발 성장 억제가 회복될 수 있다(예를 들어, [Lu et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:1852-1857, 2001]가 참조된다). 따라서, 본 발명의 bsBA의 하나의 가능한 용도는 IGF-I 수용체 신호전달을 표적화하여 트라스투주맵 또는 다른 현재 또는 미래의 항암 치료제 대한 내성의 발달을 막거나 지연하는 것이다.

중추신경계(CNS) 비정형 기형/횡문근양 종양(ATT/RhT)은 가장 나쁜 예후 및 치명적 결과를 가지는 소아 악성 종양 중 하나이다. 세포증식억제성 약물 및 방사선치료에 대한 이들의 주목할만한 내성을 위한 설명은 현재까지 없다. IGF-I 수용체는 세포 생존, 증식, 변형 및 아폽토시스의 조절에서 중요한 역할을 한다. IGF-I 수용체는 다양한 항암 약 및 방사선에 의해 유발된 아폽토시스로부터 암세포를 보호하지만, 억제제, 예를 들어 안티센스 전략, 우세한 음성 변이, 또는 삼중-나선 형태에 의해 악화되는 경우에, 종양 세포는 대량 아폽토시스를 겪고, 시험적 동물 모델에서 종양형성 및 전이를 억제한다. IGF-I 수용체를 표적화하는 본 발명의 bsBA는 IGF-I 수용체의 활성화를 통해 신호 전달을 막거나 줄이기 위해 사용될 수 있고, 이로써 암과 같은 질병 상태를 치료한다.

인슐린 유사 성장 인자(IGF)- 및 에스트로겐 수용체(ER)- 신호전달 경로 사이의 혼선은 상승적 성장을 일으킨다. 에스트로겐은 IGF-I 수용체 및 이의 다운스르림 신호전달 분자, 및 인슐린 수용체 기질 (IRS)-1 및 IRS-2의 발현을 유발함에 의해 IGF 신호전달을 높인다. IGF-I 수용체 및 IRS 발현의 에스트로겐 유발은 IGF-I 자극 후에 IRS-I의 높아진 티로신 인산화를 야기하고, 후속하여 높아진 미토겐-활성 단백질 키나아제 활성화를 야기한다. 이는 IGF-I 수용체의 활성화가 에스트로겐-매개 성장 및 유방암 발병기전에 관련됨을 나타낸다(예를 들어, [Lee et al., MoI. Endocrinol. 13:787-796, 1999]가 참조된다). 따라서, IGF-I 수용체를 표적화하는 본 발명의 bsBA는 IGF-I 수용체의 활성화를 통해 신호 전달을 막거나 줄이기 위해 사용될 수 있고, 이로써 에스트로겐-유발 유방암 질병 상태를 치료할 수 있다.

혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR)

혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 저산소증 및 발암성 변이에 의해 유발되는 다기능성 사이토카인이다. VEGF는 배아발생에서 혈관 망의 발달 및 유지의 주된 자극제이다. 이는 효력있는 투과성-유발 작용제, 내피 세포 화학주성 작용제, 내피 생존 인자, 및 내피 세포 증식 인자로서 기능한다(Thomas, J. Biol. Chem. 271 :603- 606, 1996; and Neufeld et al., FASEB J. 13:9-22, 1999). VEGF는 중요한 인자이며, 상처 치료(Frank et al., 1995; Burke et al., 1995), 당뇨망막병증(Alon et al., 1995; Malecaze et al., 1994), 건선(Detmar et al., 1994), 죽상동맥경화증(Inoue et al., 1998), 류마티스 관절염(Harada et al., 1998; Nagashima et al., 1999), 및 고형 종양 성장(Plate et al., 1994; Claffey et al., 1996)을 포함하는 많은 생물학적 및 병리학적 과정에서 혈관생성 또는 혈관형성을 이끈다.

매우 다양한 세포 및 조직이 VEGF을 생산한다. VEGF 이합체는 높은 친화도로 두 개의 잘 특징된 수용체, VEGFRl(FLT-1) 및 VEGFR2(KDR/Flk-1)에 결합하며, 이는 내피 세포에서 선택적으로 발현된다(Flt-1 및 Flk-1는 마우스 동족체이다). VEGFRl 및 VEGFR2에 결합하는 VEGF의 Kd는 각각 15-100 pM 및 400-800 pM이다(Terman et al., 1994). 최근에 확인된 제 3 세포 표면 단백질인 뉴로필린-1은 또한 높은 친화도로 VEGF와 결합한다(예를 들어, Soker et al., Cell. 92(6):735-45 (1998)).

VEGFRl 및 VEGFR2은 7 개의 세포외 IgG 유사 반복체, 단일 스패닝 막투과 영역, 및 세포내 스플릿(split) 티로신 키나아제 도메인에 의해 특징되는 형태 III 수용체 티로신 키나아제(RTK III) 과의 일원이다(Mustonen and Alitalo, J Cell Biol 129: 895-898 (1995)). 매우 최근까지, VEGFRl 및 VEGFR2은 내피 세포에서 거의 배제적으로 발현되는 것으로 생각되었다 (Mustonen 및 Alitalo, 1995). 최근 연구는 각 VEGF, VEGFRl, 및 VEGFR2가 혈관형성, 혈관생성, 및 배아 발달에 필수적인 것으로 밝혀졌다. VEGFRl는 비록 더 낮은 티로신 키나아제 활성을 가지지만, VEGFR2보다 VEGF에 대해 더 높은 친화도를 가진다.

VEGF 수용체에 대한 VEGF 이합체의 결합은 수용체 이합체화를 유발하는 것으로 여겨진다. 그 후, 수용체의 이합체화는 신호 전달 캐스케이드를 이끄는 특정 티로신 잔기의 자가인산화를 일으킨다. VEGF-유발 신호전달의 추가의 다운스트림에서 세포내 사건은 덜 명백하지만, 다수의 기가 산화질소(NO)가 VEGFR2의 VEGF의 활성화 후에 생산됨을 나타내었다 (Kroll and Waltenberger, Biochem Biophys Res Commun. 252(3):743-6 (1998)). VEGF에 의한 VEGFR1이 아닌 VEGFR2의 활성화는 MAP 키나아제, ERK 1 및 2를 포함하는 Src 및 Ras-MAP 키나아제 캐스케이드를 활성화시킴을 또한 보여주고 있다(Kroll and Waltenberger, J Biol Chem. 272(51):32521-7 (1997)).

본 발명의 bsBA를 제조에서 사용을 위한 바람직한 결합 분자는 예를 들어, 미국 특허 제 5,840,301, 5,874,542, 6,703,020호, 및 WO 99/40118에 기재되어 있으며, 이는 각각 본원에 참조로서 통합된다. bsBA를 제조하는데 사용하기 위한 바람직한 결합 분자는 단클론 항체 2C3(ATCC PTA 1595)이다. VEGF 수용체에 대한 RNA 앱타머, 안티센스 분자 및 리보자임이 또한 bsBA에서 결합 분자로서 사용될 수 있다. 바람직한 RNA 안티센스 분자, 앱타머 및 리보자임은 예를 들어, [Saleh et al., Cancer Res. 56(2):393-401 (1996); Cheng et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 93(16):8502-7 (1996); Ke et al., Int J Oncol. 12(6):1391-6 (1998); 및Parry et al., Nucleic Acids Res. 27(13):2569-77. (1999)]에 기재되어 있으며, 이는 각각 참조로서 본원에 통합된다.

본 발명의 조성물 및 방법은 VEGF 수용체의 부적절한 또는 과다 활성화와 관련 있는 임의의 형태의 혈관 종양; 황반 변성, 예를 들어 연령-관련 황반 변성; 관절염, 예를 들어 류마티스 관절염; 죽상동맥경화증 및 죽상경화 플라크; 당뇨망막병증 및 다른 망막병증; 갑상샘 과다형성, 예를 들어 그레이브스 병; 혈관종; 신생혈관녹내장; 및 건선을 가지거나 발생될 위험이 있는 동물 및 환자(예를 들어, 인간 환자)에 사용을 위해 특히 의도된다.

본 발명의 조성물 및 방법은 VEGF 수용체의 부적절한 또는 과다 활성화와 또한 관련 있는 동정맥기형(AVM), 수막종, 및 혈관 재협착, 예를 들어 혈관성형술에 따른 재협착, 질환을 가지거나 발생될 위험이 있는 동물 및 환자의 치료를 위해 추가로 의도된다. 치료적 방법 및 용도의 다른 의도된 표적은 하기 VEGF 수용체-관련 질환: 혈관섬유종, 피부염, 자궁내막증, 혈우병성 관절증, 비대 흉터, 염증성 질병 및 장애, 고름 육아종, 공피증, 윤활막염, 트라코마 및 혈관 유착을 가지거나 발생될 위험이 있는 동물 및 환자이다.

상기 목록된 치료 군은 본 발명의 bsBA에 의해 치료될 수 있는 모든 질환은 아니다. 참조로서 본원에 통합되는 미국 특허 제 5,712,291호는 이펙터 도메인이 VEGF 수용체 중 하나에 대해 유도되는 경우에 본 발명의 bsBA를 사용하여 효과적으로 치료될 수 있는 많은 다른 질환을 확인하는 방법에 대해 기재하고 있다. 또한, VEGFR와 결합하는 이펙터 도메인을 가지는 본 발명의 bsBA를 사용하여 치료될 수 있는 추가적 질환은 본원에 참조로서 통합되는 예를 들어 미국 특허 제 6,703,020호에서 찾을 수 있다.

종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)

종양 괴사 인자(TNF) 알파 및 베타는 많은 생물학적 과정, 예를 들어 감염에 대한 보호 및 쇼크 및 염증성 질병의 유도를 조절하기 위해 TNF 수용체를 통해 작용하는 사이토카인이다. TNF 분자는 "TNF- 리간드" 상과에 속하고, 이들의 수용체 또는 역-리간드인 "TNF- 수용체" 상과와 함께 작용한다. 지금까지, TNF 리간드 상과의 9개 일원이 확인되었고 TNF-수용체 상과의 10개 일원이 특징화되었다. 리간드 중에는 TNF-, 림포톡신(lymphotoxin)-(LT-, TNF-β로서 또한 알려짐), LT-β(복합 이종삼합체 LT-2-β에서 발견됨), FasL, CD40L, CD27L, CD30L, 4-1BBL, OX40L 및 신경 성장 인자(NGF)가 포함된다. TNF 수용체의 상과는 p55TNF 수용체, p75TNF 수용체, TNF 수용체-관련 단백질, FAS 항원 또는 APO-1, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, OX40, 낮은 친화도 p75 및 NGF-수용체를 포함한다(예를 들어, A. Meager, Biologicals 22:291-295, 1994).

TNF-리간드 상과의 많은 일원은 활성화된 T-세포에 의해 발현되며, 이는 이들이 세포 개체 발생 및 기능의 기초를 이루는 다른 세포 형태와 T-세포 상호작용을 위해 필요함을 암시한다(Meager 1994, supra). TNF 수용체 과의 여러 일원의 본질적 작용의 상당한 관찰은 이 단백질들의 발현을 폐지하는 변종의 확인 및 생성으로부터 얻어진다. 예를 들어, FAS 항원 및 이의 리간드에서의 자연 발생 변이는 림프세포증식성 질병을 일으키며(예를 들어, Watanabe-Fukunaga et al., Nature 356:314, 1992), 이는 아마도 세포예정사멸의 실패를 반영한다. CD40 리간드의 변이는 원형질에서 높은 수준의 면역글로불린 M 및 낮은 수준의 면역글로불린 G에 의해 특징되는 X-연관 면역결핍증 상태를 일으키며, 이는 오류 T-세포-의존 B-세포 활성화를 나타낸다(예를 들어, R. C. Allen et al., Science 259:990, 1993). 낮은 친화도 신경 성장 인자 수용체의 표적된 변이는 말초 구조의 오류 감각 쇄신에 의해 특징되는 장애를 일으킨다(예를 들어, Lee et al., Cell 69:737, 1992).

TNFR 리간드, TNF 및 LT-는 두 개의 TNF 수용체(55- 및 75-kd TNF 수용체)에 결합할 수 있다. TNF 및 LT-에 의해 유도된 이들의 수용체를 통해 작용하는 다수의 생물학적 효과는 이식된 종양의 출혈 괴사, 세포독성, 내독소성 쇼크에서의 역할, 염증, 면역조절, 증식 및 항바이러스 반응뿐만 아니라 이온화방사선의 해로운 효과에 대한 보호를 포함한다. TNF 및 LT-는 넓은 범위의 질병, 예를 들어 내독소성 쇼크, 뇌 말라리아, 종양, 자가면역 질병, AIDS 및 이식편-숙주 거부의 발병기전에 관련된다(Beutler and Von Huffel, Science 264:667-668, 1994). ρ55 수용체에서 변이는 미생물 감염에 대한 감수성을 증가시킨다.

또 다른 TNFR, TNF-관련 아폽토시스-유발 리간드 또는 "TRAIL"는 많은 인간 조직(예를 들어, 비장, 폐, 전립선, 흉선, 난소, 소장, 대장, 말초 혈관 림프구, 태반, 신장)에서 발현된다. TRAIL이 FAS 리간드로부터 독립적으로 작용하고, Fas/Apo-1L에 의한 사망 신호전달과 유사한 시간 프레임 내에서, 그러나 TNF-유발 아폽토시스보다 훨씬 더 빠르게 아폽토시스를 신속히 활성화시키는 것으로 밝혀졌다.

종양 괴사 인자(TNF)와 리간드는 세포독성, 항바이러스 활성, 면역조절 활성, 및 여러 유전자의 전사 조절을 포함하는 대다수의 세포성 반응을 유도하는 대부분의 다양성발현(pleiotropic) 사이토카인에 속하는 것으로 알려져 있다. TNF-과 리간드에 대한 세포성 반응은 정상 생리적 반응은 물론 증가된 아폽토시스 또는 아폽토시스의 억제에 관련된 질병을 포함한다. 아폽토시스-세포예정사멸은 면역 시스템의 말초성 T 림프구의 결실에 관련된 생리적 메카니즘이고, 이의 조절이상은 다수의 상이한 병원성 과정을 이끌 수 있다. 증가된 세포 생존 또는 아폽토시스의 억제에 관련된 질병은 암, 자가면역질환, 바이러스 감염증, 염증, 이식편대숙주 질병, 급성 이식 거부, 및 만성 이식 거부를 포함한다. 증가된 아폽토시스에 관련된 질병은 AIDS, 신경변성 장애, 골수형성이상증후군, 허혈손상, 독성-유발 간 질병, 패혈쇼크, 악액질, 및 식욕부진을 포함한다.

본 발명의 bsBA는 두 개의 결합 도메인 중 하나 이상이 특이적으로 TNFR에 결합하도록 제조될 수 있다. 그 후, 이러한 bsBA는 TNFR를 활성화시킴에 의해, 예를 들어, TNFR와 결합하고, 이로써 아폽토시스를 촉진하여 부적절한 세포 성장(예를 들어, 암의 경우)을 막거나 줄임에 의해, 암, 자가면역질환, 바이러스 감염, 염증, 이식편 대 숙주 질병, 급성 이식 거부, 및 만성 이식 거부를 치료하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, bsBA의 결합 분자 중 하나는 TNFR과 결합하고 두 번째 결합 분자는 표적 세포에서 발현되는 것으로 알려진 두 번째 수용체에 결합한다(예를 들어, 두 번째의 상이한 TNFR, 또는 질병-특이적 수용체). 암의 경우에, 바람직한 두 번째 수용체는 ErbB2과 같은 ErbB 과의 수용체이다. 바람직하게는 TNFR과 결합하는 bsBA의 결합분자는 두 번째 결합 분자가 이의 수용체에 대해 가지는 친화도보다 더 낮은 친화도를 가진다.

대안적으로는, 본 발명의 bsBA는 bsBA의 두 개의 결합 분자 중 하나 이상이, 예를 들어, TNFR에 대한 리간드 결합을 차단함에 의해 특이적으로 TNFR에 결합하여 TNFR의 활성화를 막거나 줄이도록 제조될 수 있다. 그 후, 이러한 bsBA는 TNFR의 활성화를 막거나 줄임에 의해, 예를 들어 TNFR에 리간드 결합을 막거나 줄이고, 이로써 아폽토시스를 막거나 줄임에 의해 AIDS, 신경변성 장애, 골수형성이상증후군, 허혈손상, 독성-유발 간 질병, 폐혈 쇼크, 악액질, 및 식욕부진을 치료하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 바람직하게는 두 개의 결합 분자 중 하나 이상이 특이적으로 TNFR에 결합하는 bsBA가 증가된 아폽토시스가 나타나는(예를 들어, 허혈손상) 질병 치료를 위해 사용된다. 바람직한 구체예에서, bsBA의 표적화 도메인은 표적 세포에서 발현되는 항원 또는 두 번째 수용체 (다시 말해, TNFR이 아닌 수용체)에 대해 유도되고, 이는 표적 세포에 bsBA를 표적화시키기 위해 사용된다.

섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGFR)

섬유모세포 성장 인자(FGF) 신호전달 경로는 정상 발달 및 상처 치유의 중요한 부분이다. FGF는 티로신 키나아제 과의 일원버인 세포 표면 수용체를 통해 이들의 효과를 일으킨다. 인간에서, 4개의 다른 섬유모세포 성장 인자 수용체(FGFR)가 확인되었다(FGFRl-FGFR4).

FGFR은 이합체화에 이은 자가인산화에 의해 활성화된다. 이합체화는 헤파란황산염의 존재하에서 리간드 결합 후에 발생하고 FGFR의 세포질 영역 내 여러가지 티로신 잔기의 인산화를 야기한다. FGFR의 인산화는 키나아제 활성을 촉진하고 MAPK, PI3 키나아제, 및 Stat1/3 경로의 활성화를 이끈다.

FGFR 유전자에서 변이는 전형적으로 수용체의 부적절한 활성화로 인해 질병 또는 장애를 일으키는 기능 획득(gain-of-function) 변이를 일으킨다. FGFR 변이는 예를 들어, 파이퍼(Pfeiffer) 증후군, 잭슨- 바이스 (Jackson-Weiss) 증후군, 크로존(Crouzon) 증후군, 에이퍼트(Apert) 증후군, 베레-스티븐슨 큐티스 기라타 (Beare-Stevenson Cutis Gyrata) 증후군, 새트르-코트젠 (Saethre-Chotzen) 증후군, 연골발육부전, 치사성 형성이상, 히포콘드로플라시아(Hypochondroplasia), 뮤엔케(Muenke) 증후군, 및 발달 지체와 아칸토시스 니그리칸스 (Acanthosis Nigricans)를 동반한 중증 연골발육부전(SADDAN) 이형성을 포함하는 여러 발달 장애에 연관되어 있다. FGFR은 또한 면역조직화학에 의해 정상 조직에 비교되는 경우에, 많은 종양 샘플에서 과발현되는 것으로 밝혀져 있다. 예를 들어, FGFR 과발현은 원발성 결장직장 암, 췌장암, 유방암, 및 결장암에서 확인된다. FGF 분자는 발암에 관련되는 것으로 여겨지는 미토겐, 혈관형성, 및 항-아폽토시스 인자로서 작용한다.

본 발명의 bsBA는 bsBA의 두 개의 결합 분자 중 하나 이상이 예를 들어, FGFR에 대한 리간드 결합을 차단함에 의하거나 FGFR 이합체화를 막거나 줄임에 의해 특이적으로 FGFR에 결합하고 FGFR의 활성화를 막거나 줄이도록 제조될 수 있다. 그 후, 이러한 bsBA는 FGFR의 활성화를 막거나 줄임에 의해 파이퍼 증후군, 잭슨-바이스 증후군, 크로존 증후군, 에이퍼트 증후군, 베레-스티븐슨 큐티스 기라타 (Beare-Stevenson Cutis Gyrata) 증후군, 새트르-코트젠 (Saethre-Chotzen) 증후군, 연골발육부전, 치사성 형성이상, 히포콘드로플라시아(Hypochondroplasia), 뮤엔케(Muenke) 증후군, 및 발달 지체와 아칸토시스 니그리칸스 (Acanthosis Nigricans)를 동반한 중증 연골발육부전(SADDAN) 이형성, 원발성 결장직장암, 췌장암, 유방암, 및 결장암을 치료하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, bsBA의 표적화 도메인은 표적 세포에 발현되는 두 번째 수용체 (다시 말해, FGFR이 아닌 수용체)에 대해 유도되고, 이는 표적 세포에 bsBA를 표적화하기 위해 사용된다.

혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR)

PDGFR 과는 맥관성 평활근세포(VSMCs), 희소돌기아교세포(조직 인케이싱 신경 섬유(tissue encasing nerve fiber)의 세포), 및 콘드로사이트(연골 세포)와 같은 결합 조직 세포의 운동성 및 성장을 자극하는 다운스트림 신호전달 효소를 활성화시킨다. PDGF 베타 수용체는 VSMC의 분화를 유도하는데 필수적이다.

PDGFR 경로의 과발현은 PDGFR의 부적절하거나 증가된 활성화에 연관된 죽상동맥경화증 및 암을 포함하는 다양한 중대한 질병에 연관되어 있다. 대안적으로는, 뼈, 치주, 인대, 및 연골의 복구를 촉진하기 위해 PDGFR의 활성화를 촉진하는데 바람직할 수 있다.

본 발명의 bsBA는 bsBA의 두 개의 분자 중 하나 이상이 예를 들어 PDGFR에 대한 리간드 결합을 차단함에 의해 특이적으로 PDGFR에 결합하고 PDGFR의 활성화를 막거나 줄이도록 제조될 수 있다. 그 후, 이러한 bsBA는 PDGFR의 활성화를 막거나 줄임에 의해 예를 들어, 죽상경화증 및 암을 치료하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, bsBA의 두 번째 결합 분자는 표적 세포에 발현되는 두 번째 수용체 (즉, PDGFR이 아닌 수용체)에 대해 유도되고, 이는 표적 세포에 bsBA를 표적화시키기 위해 사용된다. 바람직하게는 PDGFR을 결합하는 bsBA의 결합 분자는 두 번째 결합 분자가 이의 수용체에 대해를 가지는 친화도보다 더 낮은 친화도를 가진다.

대안적으로는, 본 발명의 bsBA는 bsBA의 두 개의 결합 분자 중 하나 이상이 특이적으로 PDGER을 활성화시키고 이에 결합하도록 제조될 수 있다. 그 후, 이러한 bsBA는 그 다음에 PDGFR을 활성화시킴에 의해 뼈, 치주, 인대, 및 연골의 손상을 조장하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, bsBA의 이펙터 도메인이 PDGFR과 결합하고, 표적화 도메인이 표적 세포에서 발현되는 것으로 알려진 두 번째 수용체 또는 항원에 결합한다(예를 들어, 두 번째의 상이한 PDGFR, 또는 뼈-, 치주-, 인대-, 또는 연골-특이 수용체).

C-Kit 수용체 (또한 스틸 인자(Steel Factor) 수용체로 알려짐)

c-Kit 원종양유전자는 멜라닌세포 발달 및 증식에 중요한 막투과 티로신 키나아제 형태 수용체이다. 원종양유전자 c-키트는 혈소판 유래 성장 인자 PDGF/CSF-1 (c-fms) 수용체 아과에 관련된 막투과 티로신 키나아제 수용체를 엔코딩한다. C-KIT은 배아 멜라닌모세포의 정상 성장 및 분화에 중추적 역할을 하는 것으로 발견되었다. 멜라닌세포의 악성 변형 및 인간 멜라닌종의 진행은 c-키트 원종양유전자의 발현의 손실에 관련된다. c-키트 원종양유전자에 의해 엔코딩된 티로신 키나아제 수용체의 발현은 인간 멜라닌종의 침입 및 종양 성장 동안 점차적으로 쇠퇴한다.

본 발명의 bsBA는 bsBA의 두 개의 결합 분자 중 하나 이상이 특이적으로 c-키트 수용체를 활성화시키고 이에 결합하도록 제조될 수 있다. 그 후, 이러한 bsBA는 예를 들어 흑색종을 치료하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, bsBA의 표적화 도메인은 표적 세포에 발현되는 두 번째 수용체 또는 항원 (다시 말해, c-키트 수용체가 아닌 수용체)에 대해 유도되고, 이는 표적 세포에 bsBA를 표적화하기 위해 사용된다.

Fc 수용체(FcR)

Fc 수용체는 면역글로불린 분자의 Fc 부분의 부위와 결합하고 특정 면역글로불린 부류를 위한 특이성을 나타낼 수 있는 응집된 면역글로불린 또는 항원-항체 복합체를 위한 특이적 세포-표면 수용체이다. FcR는 B 세포, K 세포, 마크로파지, 호중구, 및 호산구에서 발견되고, 몇몇 발달 단계 중에서는 T 세포에서 발견되며; K 세포, 마크로파지, 및 호중구에 있는 것들은 항원에 결합된 식균 항체에 결합하여 항원의 포식를 일으킨다.

인간 FcR는 자가면역 질병 (예를 들어, 전신홍반루푸스, 자가면역 혈소판감소자색반, 중증근육무력증, 다발경화증, 포도막염, 및 갑상샘-연관 눈병증) 및 알레르기 항원에 알레르기 반응의 발달 또는 진행에 관련되어 있음이 알려져 있다. FcR의 자연적 억제는 말초 내성을 유지하고, 이로써 자가면역 및 자가면역 질병의 발달을 막는 것을 담당한다. 반대로, 활성화 FcR의 부족은 보호적 표현형, 자가면역 질병으로부터 언커플링(uncoupling) 자가면역을 일으킨다.

본 발명의 bsBA는 bsBA의 두 개의 결합 분자 중 하나 이상이 면역 세포상의 Ig 분자에 대한 이의 결합을 차단함에 의해, FcR에 특이적으로 결합하고 FcR의 활성화를 막거나 줄이도록 제조될 수 있다. 그 후, 이러한 bsBA는 전신홍반루푸스, 자가면역 혈소판감소자색반, 중증근육무력증, 다발경화증, 포도막염, 및 갑상샘-연관 눈병증와 같은 예를 들어, 자가면역 질병을 치료하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 전형적으로는, bsBA의 표적화 도메인은 표적 세포에 발현되는 두 번째 수용체 또는 항원 (다시 말해, FcR이 아닌 수용체)에 대해 유도되고, 이는 표적 세포에 bsBA를 표적화하기 위해 사용된다.

사이토카인 수용체와 결합하기 위한 bsBA의 사용

구체예의 중요한 군에서, 표적화 도메인 또는 이펙터 도메인은 세포 표면상의 사이토카인 수용체와 결합하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에서 유용한 결과를 초래하기 위한 bsBA의 표적화 도메인 또는 이펙터 도메인에 의해 요망되는 바와 경우 결합될 수 있는 예시적인 사이토카인 수용체는:

사이토카인 수용체 공통 감마 사슬 (감마-C) (인터루킨-2 수용체 감마 사슬) (IL-2R 감마 사슬) (P64) (CD 132 항원);

인터루킨-10 수용체 알파 사슬 (IL-IOR-A) (IL-IORl);

인터루킨-10 수용체 베타 사슬 (IL-IOR-B) (IL-10R2) (사이토카인 수용체 뷰류-II CRF2-4);

인터루킨-12 수용체 베타-1 사슬 (IL-12R-베타l) (인터루킨-12 수용체 베타) (IL- 12 수용체 베타 성분) (IL-12RB1);

인터루킨-12 수용체 베타-2 사슬 (IL-12 수용체 베타-2) (IL-12R-베타2);

인터루킨-13 수용체 알파-1 사슬 (IL-13R-알파-l) (IL-13RA-1) (CD213al 항원);

인터루킨-13 수용체 알파-2 사슬 (인터루킨-13 결합 단백질);

인터루킨-17 수용체 (IL- 17 수용체);

인터루킨-17B 수용체 (IL-17B 수용체) (IL-17 수용체 동족체 1) (IL-17Rh1) (IL17Rh1) (사이토카인 수용체 CRL4) (UNQ2501/PRO19612);

인터루킨 21 수용체 전구체 (IL-21R);

인터루킨-1 수용체, 형태 I (IL-lR-1) (IL-lR-알파) (P80) (항원 CD121a);

인터루킨-1 수용체, 형태 II (IL-1R-2) (IL-lR-베타) (항원 CDwl21b);

인터루킨-1 수용체 길항제 단백질 (IL-lra) (IRAP) (ILl 억제제) (IL-1RN) (ICIL-1RA);

인터루킨-2 수용체 알파 사슬 (IL-2 수용체 알파 서브유닛) (P55) (TAC 항원) (CD25 항원);

인터루킨-2 수용체 베타 사슬 (IL-2 수용체) (P70-75) (높은 친화도 IL-2 수용체 베타 서브유닛) (CD122 항원);

인터루킨-3 수용체 알파 사슬 (IL-3R-알파) (CD123 항원);

인터루킨-4 수용체 알파 사슬 (IL-4R-알파) (CD124 항원);

인터루킨-5 수용체 알파 사슬 (IL-5R-알파) (CD125 항원);

인터루킨-6 수용체 알파 사슬 (IL-6R-알파) (IL-6R 1) (CD 126 항원);

인터루킨-6 수용체 베타 사슬 (IL-6R-베타) (인터루킨 6 신호 전달물질) (막 글리코단백질 130) (gpl30) (온코스타틴(Oncostatin) M 수용체) (CDwl30) (CD130 항원);

인터루킨-7 수용체 알파 사슬 (IL-7R-알파) (CDwl27) (CD127 항원);

높은 친화도 인터루킨-8 수용체 A (IL-8R A) (IL-8 수용체 형태 1) (CXCR-I) (CDwl28a);

높은 친화도 인터루킨-8 수용체 B (IL-8R B) (CXCR-2) (GRO/MGSA 수용체) (IL-8 수용체 형태 2) (CDw128b);

인터루킨-9 수용체 (IL-9R);

인터루킨-18 수용체 1 (ILl 수용체-관련 단백질) (IL-lRrp);

인터루킨-1 수용체 유사 1 전구체 (ST2 단백질);

인터루킨-1 수용체 유사 2 (IL-lRrp2) (인터루킨-1 수용체 관련 단백질 2) (ILlR-rp2);

톨(Toll) 유사 수용체 1 (톨/인터루킨-1 수용체 유사) (TIL);

톨 유사 수용체 2 (톨/인터루킨 1 수용체 유사 단백질 4);

톨 유사 수용체 5 (톨/인터루킨-1 수용체 유사 단백질 3);

CX3C 케모카인 수용체 1 (C-X3-C CKR-I) (CX3CR1) (프락탈킨(Fractalkine) 수용체) (GPR13) (V28) (베타 케모카인 수용체 유사 1) (CMK-BRL-1) (CMKBLRl);

C-X-C 케모카인 수용체 형태 3 (CXC-R3) (CXCR-3) (CKR-L2) (CD 183 항원);

C-X-C 케모카인 수용체 형태 4 (CXC-R4) (CXCR-4) (기질(Stromal) 세포 유래 인자 1 수용체) (SDF-1 수용체) (후신(Fusin)) (백혈구 유래 7 막투과 도메인 수용체) (LESTR) (LCRl) (FB22) (NPYRL) (HM89) (CD 184 항원);

C-X-C 케모카인 수용체 형태 5 (CXC-R5) (CXCR-5) (버킷 림프종 수용체 1) (단핵구 유래 수용체 15) (MDR15);

C-X-C 케모카인 수용체 형태 6 (CXC-R6) (CXCR-6) (G 단백질-커플링된 수용체 본조(bonzo)) (G 단백질-커플링된 수용체 STRL33);

케모카인 결합 단백질 2 (케모카인-결합 단백질 D6) (C-C 케모카인 수용체 D6) (케모카인 수용체 CCR-9) (CC-케모카인 수용체 CCRlO);

C-C 케모카인 수용체 형태 1 (C-C CKR-1) (CC-CKR-1) (CCR-1) (CCRl) (마크로파지 염증성 단백질-1 알파 수용체) (MIP-l알파-R) (RANTES-R) (HM145) (LD78 수용체);

C-C 케모카인 수용체 형태 2 (C-C CKR-2) (CC-CKR-2) (CCR-2) (CCR2) (단핵구 화학유인물질 단백질 1 수용체) (MCP-1-R);

C-C 케모카인 수용체 형태 3 (C-C CKR-3) (CC-CKR-3) (CCR-3) (CCR3) (CKR3) (호산구 에오탁신 수용체);

C-C 케모카인 수용체 형태 4 (C-C CKR-4) (CC-CKR-4) (CCR-4) (CCR4) (K5-5);

C-C 케모카인 수용체 형태 5 (C-C CKR-5) (CC-CKR-5) (CCR-5) (CCR5) (HIV-1 융합 보조수용체) (CHEMRl 3) (CD195 항원);

C-C 케모카인 수용체 형태 6 (C-C CKR-6) (CC-CKR-6) (CCR-6) (LARC 수용체) (GPR-CY4) (GPRCY4) (케모카인 수용체 유사 3) (CKR-L3) (DRY6);

C-C 케모카인 수용체 형태 7 전구체 (C-C CKR-7) (CC-CKR-7) (CCR-7) (MIP-3 베타 수용체) (EBV-유발 G 단백질-커플링된 수용체 1) (EBIl) (BLR2);

C-C 케모카인 수용체 형태 8 (C-C CKR-8) (CC-CKR-8) (CCR-8) (GPR-CY6) (GPRCY6) (케모카인 수용체 유사 1) (CKR-Ll) (TERl) (CMKBRL2) (CC-케모카인 수용체 CHEMRl);

C-C 케모카인 수용체 형태 9 (C-C CKR-9) (CC-CKR-9) (CCR-9) (GPR-9-6);

C-C 케모카인 수용체 형태 10 (C-C CKR-1O) (CC-CKR-10) (CCR-1O) (G-단백질 커플링된 수용체 2);

C-C 케모카인 수용체 형태 11 (C-C CKR-11) (CC-CKR-11) (CCR-11) (케모카인 수용체 유사 1) (CCRLl) (CCX CKR);

케모카인 수용체 유사 1 (G-단백질 커플링된 수용체 DEZ) (G 단백질-커플링된 수용체 ChemR23);

케모카인 수용체 유사 2 (IL8-관련 수용체 DRYl2) (흐름-유발 내피 G 단백질-커플링된 수용체) (FEG-1) (G 단백질-커플링된 수용체 GPR30) (GPCR-BR);

케모카인 XC 수용체 1 (XC 케모카인 수용체 1) (림포탁틴(Lymphotactin) 수용체) (G 단백질-커플링된 수용체 5)를 포함한다.

종양 관련 항원과 결합하기 위한 bsBA의 사용

구체예의 특별히 중요한 군에서, bsBA의 표적화 도메인은 종양 관련 항원에 결합한다. 이름이 함축하는 바와 같이, 종양 관련 항원(TAA)은 전형적으로 특정 종양의 세포에서 발현되지만, 정상 세포에서 전형적으로 발현되지 않는 항원이다. 종종, TAA는 생물체의 발달에서 특정 시점에서만(예를 들어 태아 발달 중에) 세포에서 정상적으로 발현되고, 발달의 현 시점에서 유기체에서 부적절히 발현되는 항원이거나, 정상 조직에서 또는 현재 항원을 발현시키는 기관의 세포에서 발현되지 않는 항원이다. 다수의 TAA는 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, MART-1, 암배아 항원 ("CEA"), gplOO, MAGE-1, HER-2, 및 Lewis^Y 항원, 및 미국 특허 제 5,922,566 및 6,020,478호 및 WO 2004/016643 A2에서 확인되는 항원을 포함한다.

본 발명의 bsBA로 표적화하기에 적합한 다른 종양 관련 항원은:

- 조혈 분화 항원 -- CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD45, CD52, 및 CD147와 같은 군집 분화 (CD) 군과 일반적으로 관련된 글리코단백질;

-세포 표면 분화 항원, 예를 들어 글리코단백질, 예를 들어 암배아 항원 (CEA, Swiss-Prot ID No. P06731), 시알릴 Tn 항원 (TAG-72), 다형 상피 무신(PEM), 상피 세포 유착 분자(Ep-CAM), MUC-1, A33, G250, E-카드헤린, 전립샘-특이 막 항원 (PSMA, Swiss-Prot ID No. Q04609) 및 전립샘-특이 항원(PSA), 당지질, 예를 들어 강글리오시드, 예를 들어, GD2, GD3, GM2) 및 카르보하이드레이트, 예를 들어 혈액 군-관련 항원, 예를 들어 LE^Y 및 LE^b (LE^Y는 "Lewis^Y", 또한 "CD174"로 알려짐); 당지질 및 글리코단백질의 형태 2 혈액 군 올리고당류에서 발견되는 이중푸코실화된(difucosylated) 테트라당류;

- 성장 인자 수용체, 예를 들어 표피 성장 인자 수용체 (EGFR, ErbBl, Swiss- Prot ID P00533) 및 이의 변이 형태 EGFRvIII, ErbB2 (HER-2/neu, Swiss-Prot ID No. P04626), ErbB3 (HER-3, Swiss-Prot ID No. P21860) 및 IL-2 수용체.

- 혈관생성 및 기질 항원, 예를 들어 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 테나스신 및 인테그린; 및,

- 프리즐드(Frizzled) 수용체 과 (예를 들어 Fz-2)를 포함한다.

몇몇 구체예에서, bsBA의 표적화 도메인은 TAA와 결합하도록 표적화되고, 이펙터 도메인은 성장 인자 수용체에 결합한다.

몇몇 바람직한 구체예에서, 표적화 도메인은 CEA (Swiss-Prot ID No. P06731), ErbB2 (Swiss-Prot ID No. P04626 ), EGFR (Swiss-Prot ID No. P00533), LewisY, MUC-1 (Swiss-Prot ID No. P15941), EpCAM (mAb 17-1A의 표적 (edrecolomab, Panorex®, Glaxo Wellcome GmbH)), CA125 (Swiss-Prot ID No. Q96RK2), PSMA (Swiss-Prot ID No. Q04609), TAG72 항체의 표적, CD20 (Swiss-Prot ID No. Pl 1836), CD19 (Swiss-Prot ID No. P15391), CD22 (Swiss-Prot ID No. P20273), 및CD36 (Swiss-Prot ID No. P16671)으로부터 선택되는 분자에 표적화된다.

몇몇 바람직한 구체예에서, 이펙터 도메인은 ErbB3 (Swiss-Prot ID No. P21860), ErbB4 (Swiss-Prot ID No. Q15303), FGF 수용체 1-4 (Swiss-Prot ID Nos. P22455, Pl1362, P21802, P22607), HGF 수용체 (Swiss-Prot ID No. P08581), IGFl-R (Swiss-Prot ID No. P08069), 인슐린 수용체 (Swiss-Prot ID No. P06213), PDGF 수용체 알파 및 베타 (각각 Swiss-Prot ID Nos. P16234, P09619) 및 C-KIT (Swiss-Prot ID No. P 10721)로부터 선택된 분자에 결합한다. 몇몇 특별히 바람직한 구체예에서, 표적화 도메인은 이전 단락에 기술된 분자에 결합하고 이펙터 도메인은 본 단락에 기재된 분자에 결합한다.

앱타머

결합 분자의 하나 또는 둘 모두가 앱타머인 bsBA는 본원에서 참조로서 통합된 미국 특허 제 5,756,291호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 앱타머는 일반적으로 "SELEX"(지수 강화에 의한 리간드의 체계적 진화 "systematic evolution of ligands by exponential enrichment") 방법에 의해 제조된다. 이는 선택된 분자 표적에 대한 앱타머를 확인하기 위해 사용되는 반복적 과정이다. 시작을 위해, 헥산 분자의 큰 "라이브러리"가 만들어진다. 선택 단계에서, 중요한 표적을 위한 가장 큰 친화도를 가진 분자가 분리된다. 뉴클레오타이드 서열의 라이브러리는 세포 표면 단백질에 노출되고 일정 시간 동안 인큐베이션된다. 표적을 위해 약하거나 친화도가 없는 라이브러리에 있는 분자는 세척되고, 표적-결합 분자 중 가장 높은 친화도 앱타머는 표적으로부터 정제되고, SELEX 과정에서 후속하는 단계를 위해 사용된다.

획득되고, 정제된 서열은 효소처리로 복제되거나, "증폭"되어 표적에 결합할 수 있는 이들을 위해 실질적으로 강화된 분자의 새로운 라이브러리를 생성한다. 강화된 라이브러리는 선택, 분배 및 증폭의 새로운 순환을 시작하기 위해 사용된다. 완전한 방법의 5회 내지 15회 순환 후에, 분자의 라이브러리는 독특한 서열의 10¹⁵로부터 관심있는 세포 표면 단백질에 단단히 결합되는 적은 수로 줄어든다. 그 후, 혼합물에서 개개 분자가 분리되고, 이들의 뉴클레오티드 서열이 결정되며, 결합 친화도에 대한 이들의 특성이 본질적으로 항체에 대해 측정된다. 종종 앱타머는 표적 결합 또는 앱타머 구조에 기여하지 않는 임의의 뉴클레오티드를 제거하도록 추가로 정제된다. 이들의 코어 결합영역에 대해 끝이 잘린 앱타머는 전형적으로 15 내지 60 뉴클레오티드 길이 범위이다. 두 개의 앱타머는 뉴클레오티드 링커에 의해 연결되거나 화학적으로 가교되어 이특성성 앱타머를 형성할 수 있거나, 단일 앱타머가 항체 또는 항체 단편에 유사하게 연결되어 키메라 항체-DNA 분자를 형성할 수 있다.

화학적 가교에 의한 이특이성 BA의 제조

이특이성 차단제, 예를 들어 이특이성 항체의 두 개의 결합 분자는 문헌 [Hermanson, supra]에 기재된 것과 같은 당업자에 공지된 통상적인 컨쥬게이션 방법을 사용하여 결합될 수 있다. 몇몇 구체예에서, bsBA의 두 개의 결합 분자는 화학적 결합을 사용하여 결합된다. 화학적 결합을 사용하여 제조된 종래 이특이성 항체의 하나의 예는 문헌[Brennan et al., (Science, 229: 81 (1985))]에 기재되어 있고, 본 발명의 bsBA를 제조하기 위해 또한 사용될 수 있다. 온전한 항체는 단백질 분해효소에 의해 분해되어 F(ab')₂ 단편을 생성한다. 이 단편들은 디티올 복합 작용제 소듐 아비산염(arsenite)의 존재하에서 환원되어 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 이황화물 형성을 막는다. 그 후, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. 그 후, Fab'-TNB 유도체 중 하나는 Fab'-티올로 머캅토에틸아민에 의한 환원에 의해 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이특이성 항체를 형성한다. 생산된 이특이성 항체는 효소의 선택적 고정를 위한 작용제로서 사용될 수 있다.

또 다른 바람직한 화학적 결합은 가교를 위해 비스-말레이미도헥산 또는 비-말레이미도에탄을 사용한다. 가교를 위해 -SH를 함유하는 항체 단편은 또한 재조합(예를 들어 Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992))적으로 제조되어 완전한 길이의 항체의 단백질 분해효소에 의한 절단을 피할 수 있다.

재조합 또는 합성 기술에 의한 bsBA의 제조

bsBA는 재조합 기술에 의해 또한 제조될 수 있다. bsBA를 엔코딩하는 헥산 서열은 예를 들어, 적당한 서열의 클로닝 또는 [Narang, et al., Meth. Enzymol. 68:90-99 (1979)]의 포스포트리에스터 방법; [Brown, et al., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979)]의 포스포디에스터 방법; [Beaucage, et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862 (1981)]의 디에틸포스포라미디트 방법; 예를 들어, [Needham-VanDevanter, et al. Nucl. Acids Res. 12:6159-6168 (1984)]에서 기재된 자동 합성기를 사용하여, [described by Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20): 1859-1862 (1981)]에 의해 기술된 고체 상 포스포라미디트 트리에스터 방법; 및 미국 특허 제 4,458,066호의 고체 지지 방법과 같은 방법에 의한 직접 화학적 합성에 의한 방법을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 화학적 합성은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드을 생산한다. 이는 상보적 서열에 의한 하이브리드 형성에 의해 또는 주형으로서 단일 가닥을 사용하는 DNA 중합효소에 의한 중합반응에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다. 당업자는 DNA의 화학적 합성이 약 100개의 염기 서열로 제한되지만, 보다 긴 서열이 더 짧은 서열의 연결에 의해 얻어질 수 있음을 인식할 것이다.

바람직한 구체예에서, bsBA를 엔코딩하는 핵산 서열은 클로닝 기술에 의해 제조될 수 있다. 적당한 클로닝 및 서열분석 기술의 예, 및 많은 클로닝 연습을 통해 당업자를 지도하기에 충분한 지시는 [Sambrook, et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)], [Berger and Kimmel (eds.), GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, Academic Press, Inc., San Diego CA (1987)], 또는 [Ausubel, et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing and John Wiley & Sons, Inc., (1987, 1995 Supplement) (Ausubel)]에서 발견된다. 생물학적 시약 및 실험 장치의 제조자로부터의 생성물 정보는 또한 유용한 정보를 제공한다. 이러한 제조자는 시그마 케미칼 컴페니(SIGMA chemical company)(Saint Louis, MO), R&D systems (Minneapolis, MN), 파마시아 아메르샴(Pharmacia Amersham)(Piscataway, NJ), 크론테크 라보라토리스 인크(CLONTECH Laboratories, Inc.)(Palo Alto, CA), 켐 젠 코프(Chem Genes Corp.), 알드리치 케미칼 컴페니(Aldrich Chemical Company)(Milwaukee, WI), 글렌 리서치 인크(Glen Research, Inc.), 지브코 BRL 라이프 테크놀로지 인크(GIBCO BRL Life Technologies, Inc.)(Gaithersburg, MD), 훌루카 케미카-바이오케미타 아날리티카(Fluka Chemica-Biochemika Analytika)(Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland), 인비트로젠(Invitrogen)(San Diego, CA), 및 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems)(Foster City, CA)뿐만 아니라 당 분야에 알려진 많은 다른 상업적 공급원을 포함한다.

bsBA를 엔코딩하는 헥산이 클로닝되는 경우, 박테리아, 식물, 효모, 곤충 및 포유류 세포와 같은 재조합적으로 조작된 세포에서 요망되는 단백질을 발현시킬 수 있다. 당업자 E. coli, 다른 박테리아 숙주, 효모 및 다양한 고등 진핵세포, 예를 들어 COS, CHO, HeLa 및 골수종 세포주를 포함하는 단백질의 발현에 유용한 많은 발현 시스템을 인식하는 것으로 기대된다. 원핵생물 또는 진핵생물에서 단백질의 발현을 위해 알려진 다양한 방법을 상세히 설명하지는 않을 것이다.

당업자는 bsBA를 엔코딩하는 핵산에 대해 이의 생물학적 활성을 감소시킴 없이 변경이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 표적화 분자의 클로닝, 발현, 또는 융합 단백질내로의 혼입을 가속화하기 위해 몇몇의 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 당업자에 잘 알려져 있고, 예를 들어 종결 코돈, 개시 부위를 제공하기 위해 아미노 말단에 첨가된 메티오닌 및 편의적으로 위치된 제한 부위를 만들기 위해 말단에 위치하는 추가적 아미노산을 포함한다.

재조합 방법 이외에, bsBA는 또한 표준 펩티드 합성을 사용하여 전체 또는 부분적으로 만들어질 수 있다. 길이가 약 50 아미노산 미만인 본 발명의 폴리펩타이드의 고체상 합성은 서열의 C-말단 아미노산을 불용성 지지체에 부착시킨 후 그 서열에서 남아있는 아미노산의 순차적 첨가에 의해 달성될 수 있다. 고체상 합성을 위한 기술은 [Barany & Merrifield, The Peptidess: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A. pp. 3-284; Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963), 및 Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984)에 기재되어 있다. 더 긴 길이의 단백질은 더 짧은 단편의 아미노 및 카르복실 말단의 축합에 의해 합성될 수 있다. (예를 들어 커플링 시약 N,N'-디사이사이클로헥실카르보디이미드의 사용에 의한) 카르복실 말단의 활성화에 의해 펩티드 결합을 형성하는 방법이 당업자에 알려져 있다.

발현되는 경우, 재조합 bsBA는 암모늄 설페이드 침전, 친화도 칼럼, 칼럼 크로마토그래피 등(일반적으로 [R. Scopes, Protein Purification, Springer- Verlag, N. Y. (1982)]에서 참조됨)을 포함하여 당 분야의 표준 과정에 따라 정제될 수 있다. 약제학적 용도를 위해 균질성이 약 90 내지 95% 이상인 실질적으로 순수한 조성물이 바람직하고, 98 내지 99% 또는 그 이상의 균질성이 가장 바람직하다. 부분적으로 또는 요망되는 균질성으로 정제되는 경우, 치료적으로 사용된다면, 폴리펩타이드는 내독소가 실질적으로 없어야 한다.

E.coli와 같은 박테리아로부터의 단일 사슬 항체를 포함하는 단일 사슬 항체의 발현 및/또는 적당한 활성 형태로의 리폴딩을 위한 방법은 공지되어 있고 잘 알려져 있으며, 본 발명의 bsBA에, 특히 항체를 사용하는 것들에 적용가능하다. 모두 본원에 참조로서 통합되는 [Buchner, et al., Anal. Biochem. 205:263-270 (1992); Pluckthun, Biotechnology 9:545 (1991); Huse, et al., Science 246:1275 (1989) 및 Ward, et al., Nature 341:544 (1989)]가 참조된다.

종종, E.coli 또는 다른 박테리아로부터 기능적 이종 단백질은 봉입체(inclusion body)로부터 분리되고 강 변성제를 사용하는 용해화 및 후속 리폴딩을 요구한다. 용해화 단계 동안, 당 분야에 잘 알려진 바와 같이, 환원제가 이황화물 결합을 분리하도록 존재해야 한다. 환원제를 가진 예시적인 완충액은 0.1 M Tris pH 8, 6 M 구아니딘, 2 mM EDTA, 0.3 M DTE (디티오에리트리톨)이다. 이황화물 결합의 재산화는 저분자량 티올 시약의 존재에서 환원 및 산화된 형태로 발생할 수 있고, 이는 본원에 참조로서 통합된 [Saxena, et al., Biochemistry 9: 5015-5021 (1970)]에 기재된 바와 같고 특히 [Buchner, et al., supra]에 기재된 바와 같다.

재생은 전형적으로 변성되고 환원된 단백질의 리폴딩 완충액으로의 희석(예를 들어 100배)에 의해 달성된다. 예시적인 완충액은 0.1 M Tris, pH 8.0, 0.5 M 1-아르기닌, 8 mM 산화 글루타티온(GSSG), 및 2 mM EDTA이다.

두 개 사슬 항체 정제 프로토콜의 변경으로서, 중쇄 및 경쇄 영역이 개별적으로 용해되고 환원된 후, 리폴딩 용액에서 합쳐진다. 바람직한 수율은 이 두 개의 단백질이 다른 것에 대해 하나의 단백질의 5배 몰 초과량을 넘지않는 몰 비로 혼합되는 때 달성된다. 레독스-셔플링 (redox-shuffling)이 완결된 후에 초과 산화된 글루타티온 또는 다른 산화성 저분자량 화합물을 리폴딩 용액에 첨가하는 것이 바람직하다.

bsBA-기재 치료적 용도

본 발명은 본 발명의 bsBA를 동물, 바람직하게는 포유류, 및 가장 바람직하게는 인간 환자에 하나 이상의 기재된 질병 또는 장애를 치료하기 위해 투여하는 것을 포함하는 bsBA-기재된 치료를 추가로 가리킨다. 본 발명의 치료적 화합물은 제한되지 않지만 본 발명의 bsBA를 포함한다. 본 발명의 bsBA는 세포 표면 수용체의 비정상적 발현 및/또는 활성에 관련된 본원에 기재된 질병 및 장애를 치료, 억제, 또는 방지하기 위해 사용될 수 있다. 세포 표면 수용체의 비정상적 발현 및/또는 활동에 관련된 질병 및 장애의 치료 및/또는 방지는 제한되지는 않지만, 이러한 질병 및 장애에 관련된 징후를 줄이는 것을 포함한다. 본 발명의 bsBA는 본원에 기재된 바와 같은 또는 당 분야에 알려진 바와 같은 약제학적으로 허용되는 조성물에서 제공될 수 있다. 본원에서 제공된 교시내용을 숙지한 당업자는 과도한 실험 없이 진단, 모니터링, 또는 치료적 목적을 위한 본 발명의 bsBA를 사용하는 방법을 알 것이다.

본 발명의 bsBA는 단독으로 또는 다른 형태의 치료제(예를 들어, 방사선 치료. 화학요법, 호르몬 치료, 면역치료 및 항종양 작용제)와 조합되어 투여될 수 있다.

bsBA-기재 치료/예방 조성물 및 이의 투여

본 발명은 유효량의 본 발명의 bsBA, 바람직하게는 본 발명의 이특이성 항체를 피검체에 투여함에 의해 치료, 억제, 및 예방의 방법을 제공한다. 바람직한 측면에서, bsBA는 (예를 들어 이의 효과를 제한하거나 바라지 않는 부작용을 만드는 물질이 없게) 실질적으로 정제된다. 피검체는 바람직하게는 제한되지 않고 소, 돼지, 말, 닭, 고양이 및 개와 같은 동물을 포함하는 동물이며, 바람직하게는 포유류, 및 가장 바람직하게는 인간이다.

여러가지 전달 시스템, 예를 들어, 리포좀내 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, bsBA의 발현이 가능한 재조합 세포, 수용체-매개 엔도시토시스(예를 들어, [Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432, 1987] 참조됨), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 부분으로서 헥산의 구조물 등은 공지되어 있고 본 발명의 bsBA를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 도입의 방법은 제한되지는 않지만 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 비강내, 경막외, 및 경구 방법을 포함한다. bsBA는 편의적 방법, 예를 들어 융합 또는 덩어리 주입에 의해, 상피 또는 점막 피부 내층을 통한 흡수(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 창자 점막 등)에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 전신 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 추가로, 뇌실내 및 경막내 주입을 포함하는 적합한 경로에 의해 본 발명의 bsBA를 중추 신경계에 도입하는 것이 바람직할 수 있고; 뇌실내 주입은 예를 들어 옴마야(Ommaya) 저장소와 같은 저장소에 붙어있는 뇌실내 카테터(catheter)에 의해 촉진될 수 있다. 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸제의 제형의 이용에 의한 폐 투여가 또한 이용될 수 있다.

특정 구체예에서, 국부적으로 치료에 필요한 부위에 본 발명의 bsBA를 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이는 예를 들어 제한되지 않고, 수술 중 국부 주입, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 함께 국부적인 적용에 의해, 주입에 의해, 카테터를 통해, 좌약을 통해 또는 이식물을 통해 달성될 수 있고, 상기 이식물 기공, 비-기공 또는 젤라틴 물질, 예를 들어 시알라스틱(sialastic) 막과 같은 막, 또는 섬유이다. 바람직하게는 본 발명의 bsBA, 예를 들어 항체가 투여되는 경우에, bsBA가 흡수되지 않는 물질을 사용하도록 주의를 기울여야 한다.

또 다른 구체예에서, bsBA는 소낭으로 특히 리포좀으로 전달될 수 있다([Langer, Science 249:1527-1533, 1990; 및 Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365, 1989]가 참조됨).

또 다른 구체예에서, bsBA는 조절된 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 하나의 구체예에서, 펌프가 사용될 수 있다([Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507, 1980; Saudek et al, N. Engl. J. Med. 321:574, 1989]가 참조됨). 또 다른 구체예에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다([Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FIa. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, N. Y. (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; 또한 Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105]가 참조됨). 또 다른 구체예에서, 조절된 방출 시스템은 치료 표적의 인근, 예를 들어, 뇌, 폐, 신장, 간, 난소, 정소, 콜론, 췌장, 유방, 및 피부와 같은 신체의 침범된 기관의 근처에 배치될 수 있고, 따라서 전신 투여량의 일부만을 요구한다([Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)]가 참조됨)

본 발명은 또한 약제학적 조성물에 제공된 bsBA를 제공한다. 이러한 조성물은 약제학적 유효량의 bsBA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 특정 구체예에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 연방정부 또는 주정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 동물 및 더욱 특별하게는 인간에 사용을 위한 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식되는 약전에 목록되어 있음을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 운반체를 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 살균한 액체, 예를 들어 물 및 오일, 예를 들어 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래된 것들, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등일 수 있다. 물은 약제학적 조성물이 정맥 내에 투여되는 경우 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 덱스트로즈 및 글리세롤 수용액이 또한 용액 담체, 특별하게는 주사용 용액을 위해 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코즈, 락토오즈, 수크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 젤, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탤크, 염화나트륨, 건조된 스킴 우유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 요망되는 경우 또한 소량의 습윤제 또는 에멀젼화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지연 방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 바인더(binder) 및 담체, 예를 들어 트리글리세리드를 사용하여 좌약으로서 제형화될 수 있다. 경구 제형은 약제학적 등급의 맨니톨, 락토오즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로즈, 마그네슘 카르보네이트 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," A.R. Gennaro, ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (20th Ed., 2003)에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 적합한 양의 담체와 함께, 환자에게 적당한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 바람직하게는 정제된 형태의 치료적 유효량의 화합물을 포함할 것이다. 제형은 투여의 방법에 적합해야 한다.

바람직한 구체예에서, 조성물은 통상적 절차에 따라 인간의 정맥 내 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 제형화된다. 전형적으로는 정맥 내 투여를 위한 조성물은 살균된 등장 수성 완충액 내 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 용해제 및 주입 부위에 고통을 덜기 위해 국부 마취제 예를 들어 리그노카인(lignocaine)을 포함할 수 있다. 일반적으로는, 성분은 개별적으로 제공되거나 단위 용량 형태로 함께 혼합되는데, 예를 들어 동결 건조 분말 또는 물이 없는 농축물로서, 완전히 밀봉된 용기, 예를 들어 활성제의 양을 지시하는 샤세 또는 앰플 내에서 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 살균된 약제학적 등급 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병에 의해 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사를 위한 살균된 물 또는 식염수의 앰플이 제공되어 성분은 투여 전에 혼합될 수 있다.

bsBA는 약제학적 조성물로 제형화되는 경우에, 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것과 같은 음이온으로 형성된 것 그리고 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 수산화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 또는 프로카인으로부터 유래된 것과 같은 양이온으로 형성된 것을 포함한다.

세포 표면 수용체의 비정상적 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 또는 장애의 치료, 억제 및 예방에 효과적일 본 발명의 bsBA의 양은 표준 임상적 기술에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 시험관 내 검사는 선택적으로 최적 용량 범위의 확인을 돕기 위해 사용될 수 있다. 제형화에 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 질병 또는 장애의 심각도에 의존할 것이고, 실시 담당자의 판단 및 각 환자의 환경에 따라 결정되어 한다. 효과적인 양은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래되는 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.

bsBA에 대해, 환자에게 투여되는 용량은 전형적으로 환자 몸무게의 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg이다. 바람직하게는, 환자에게 투여되는 용량은 환자 몸무게의 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg, 더욱 바람직하게는 환자 몸무게의 1 mg/kg 내지 10 mg/kg이다. 일반적으로는 인간 항체는 외래 폴리펩타이드에 대한 면역 반응 때문에 다른 종으로부터의 항체보다 인간 신체내에서 더 긴 반감기를 가진다. 따라서, 인간 항체로부터 유래되는 bsBA는 더 작은 투여량으로 더 적은 빈도수의 투여로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 bsBA의 투여 용량 및 빈도수는 예를 들어 지질화(lipidation)와 같은 변경에 의해 항체의 흡수 및 조직 투과를 높임에 의해 줄어들 수 있다.

키트

본 발명은 추가로 생체내 또는 생물학적 샘플에서 표적 분자를 발현하거나 과발현하는 세포를 검출하는데 사용하기 위한 키트를 포함한다. 몇몇 바람직한 구체예에서, 키트는 이특이성 scFv 항체에 의해 표적화된 bsBA를 함유한다. 용도에 의존하여, 항체는 본원에서 설명된 바화 같이 이펙터(예를 들어, 방사성 부분, 리포좀, 사이토톡신, 또 다른 항체 등)에 커플링하기 위해 링커 또는 킬레이터 또는 둘 모두로 기능화될 수 있다. 키트는 선택적으로는 bsBA의 검출을 위해 사용되도록 완충액 및 조성물을 추가로 포함한다.

키트는 또한 예를 들어 암세포를 검출하기 위한 항체의 사용 및/또는 기능화 시약을 항체와 조합하는 것 또는 영상 및/또는 치료적 적용을 위한 기능화된 항체의 사용을 교시하는 지시 자료를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, bsBA는 링커 및/또는 킬레이터로 (하나의 용기에서) 하나 이상의 이펙터, 예를 들어 사이톡신, 방사성 표지와 함께 (두 번째 용기에서) 기능화된 채로 제공되어, 두 개의 성분이 개별적으로 투여(예를 들어 사전 표적화 방법)될 수 있거나 두 개의 성분이 사용 직전에 투여될 수 있게 한다.

특정 지시 자료는 권고된 용량 요법, 금기증 등을 제공할 것이다. 지시 자료가 전형적으로 기재된 또는 인쇄된 자료를 포함하지만, 이러한 지시 및 최종 사용자에 이들을 전달할 수 있는 임의의 매체가 본 발명에 의해 고려된다. 이러한 매체는 비제한적으로 전자 저장 매체(예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광 매체 (예를 들어, CD ROM) 등 또는 지시를 제공하는 인터넷 주소를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 채워져 있는 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 선택적으로 약제학적 또는 생물학적 생성물의 제조, 용도 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 지시된 형태의 통지문이 이러한 용기에 결합될 수 있고, 이 통지문은 인간 투여를 위한 제조, 용도 또는 판매의 기관에 의해 승인을 반영한다.

실시예 1

디아바디 및 (scFv)₂

디아바디의 생산은 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 [Hollinger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))]에 기재되어 있다. 디아바디는 항체 단편으로부터, 일반적으로는 두 개의 scFv로부터, 너무 짧아서 같은 사슬상의 두 개의 도메인 사이에 쌍을 이루게 할 수 없는 링커를 사용함에 의해 만들어지며; 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루어 두 개의 항원 결합 부위를 생성하도록 된다. 대안적으로는, 두 개의 scFv가 두 개의 분자를 공유결합하는 유전적으로 엔코딩된 링커에 의해 연결되어, 이로써 이가 항체인 (ScFv)₂ 를 형성할 수 있다.

실시예 2

다양한 형태의 "이합체화 영역"을 두 개의 항체 단편을 이종이합체화하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 이특이성/이가 디아바디를 IgG의 CH(3) 도메인의 N-말단에 힌지 영역을 통해 유전적으로 융함함에 의해(Lu et al. J Immunol Methods. 279(l-2):219-32 (2003)), "디-디아바디(di-diabody)"로 명명되는 구조물을 만들었다. 그 결과는 힌지 영역과 CH(3) 영역 사이의 이합체화로부터 초래되는 4가 디아바디 이합체가다.

항체의 천연 CH1 도메인은 또한 단일-사슬 Fv(scFV)를 상이한 항원-결합 특이성의 Fab 단편의 경쇄 또는 중쇄의 C-말단에 유전적으로 융함합에 의해 두 개의 항체 단편을 이종이합체화하기 위해 사용될 수 있다(Lu et al. Immunol Methods. 267(2):213-26 (2002)). IgG 중쇄과 경쇄 사이의 자연 이합체화 메카니즘이 또한 사용될 수 있다. 상이한 특이성의 두 개의 단일-사슬 Fv(scFv)은 인간 카파 사슬의 불변 영역 (C(L)) 및 인간의 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (C(H1))에 융합되어, 두 개의 폴리펩타이드, (scFv)(l)-C(L) 및 (scFv)(2)-C(Hl)-C(H2)-C(H3) 각각을 형성할 수 있다. 포유 동물 세포에 있는 두 개의 폴리펩타이드의 공동 발현은 이중 특이성을 가진 공유 결합된 IgG 유사 헤테로-4량체, Bs(scFv)(4)-IgG의 형성을 야기한다([Zuo et al. Protein Eng. 13 (5) :361-7 (2000), Lu et al. J. Biol Chem. 23;279(4):2856-65 (2004)]).

또한, 예를 들어 두 개의 상이한 Fab' 단편에 개별적으로 융합되는 경우에 이특이성 F(ab')₂의 형성을 매개할 수 있는 이종이합체-형성 류신 지퍼스(zippers ) 포스 앤 준(Fos and Jun)을 사용하여, 두 개의 항체 단편의 이종이합체 형성이 이합체화 영역에서 비공유 상호작용을 통해 이루어질 수 있다([Tso et al J Hematother. 4(5):389-94 (1995)]).

실시예 3 적합한 표적 및 이펙터 마커의 결정

적합한 표적 마커는 표적 조직에서 과발현되는 표적 분자를 확인하기 위해 표적 및 비 표적 조직의 mRNA 프로파일링(profiling)에 의해, 또는 단백질 발현 수준의 비교 및 질량 측정법에 의한 후속적 확인을 위한 표적 및 비표적 세포의 2D 전기영동과 같은 프로테오믹(proteomic) 방법에 의한 것과 같은 다수의 방법으로 결정될 수 있다.

예를 들어, mRNA 프로파일링은 전형적으로 아피메트릭스 마이크로어레이(Affymetrix microarray)를 사용하고 표적 및 비 표적 조직(예를 들어 종양 및 인접한 정상 조직)으로부터 준비된 cRNA를 비교함에 의해 [Cao et al (BMC Genomics. 27;5(1):26 (2004))]에서 기재된 바와 같이 수행된다.

프로테오믹 방법에서, 표적 및 비표적 세포는 전형적으로 용해되거나 균질화되고 그 다음에 2 차원 전기영동법을 받게 된다. 단백질은 그 다음에 젤에 고정되고 시각화를 위해 염색된다. 표적 및 비표적 세포로부터 젤의 영상 분석은 차별적으로 발현된 단백질 점(spot)을 드러낸다. 그 후, 이 점들은 단백질 점의 절개, 젤 내 트립신 소화, 및 질량 분광광도계에 의한 분석에 의해 확인될 수 있다. 과정은 예를 들어, [Van Greevenbroek et al. 45, 1148-1154 (2004)]에 기재되어 있다.

적합한 이펙터 마커는 추정 인산화 부위를 지닌 수용체를 확인함에 의한 것과 같은 많은 방법으로 확인될 수 있다. 단백질 또는 DNA 서열은 젠뱅크(GenBank) 또는 다른 공공 데이터베이스로부터 얻어질 수 있고 잠재적 인산화 부위는 공중에 이용가능한 검색 엔진, 예를 들어 스캔사이트(ScanSite)("http://"를 입력하고 후속하여 "scansite.mit.edu/"를 입력함에 의한 온라인) 또는 네트포스(NetPhos)("www"를 입력하고 후속하여 "cbs.dtu.dk/services/NetPhos/"를 입력함에 의한 웹)에 의해 예측될 수 있다. 인산화 부위를 가진 수용체는 이들이 종종 신호전달에 관여하기 때문에 좋은 이펙터 마커일 가능성이 더 많다. 대안적으로는, 적합한 이펙터 마커는 표적 세포를 세포상의 마커에 대한 항체와 접촉시킨 후, 상기 기재된 바와 같이 요망되는 생물학적 활성에 대해 검정함으로써 확인될 수 있다.

실시예 4: 1가 및 2가 결합 도메인 시험

결합 도메인의 또는 이특이성 결합 분자의 1가 친화도를 테스트하기 위해, bsBA를 상기와 같이 생산한다. 표면 플라스몬 공명에 의한 결합 속도론을 측정하기 위해, 바이오센서 칩을 제조자(BIAcore)의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)을 사용하여 수용체의 공유 커플링을 위해 활성화시킬 수 있다. 그 후, 마커를 예를 들어 10 mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 4.5)에 주입에 의해 커플링시켜서 고정된 물질의 이상적으로 400 공명 단위(RU) 미만의 신호를 얻는다. 속도론 측정을 위해, 일가 또는 이특이성 결합 도메인의 2배 연속 희석액을 PBS/Tween 완충액(포스페이트 완충 염수 내 0.05% Tween-20) 중에서 항원 칩 위에 25℃에서 20μl/분의 흐름 속도를 사용하여 주입하였다. 그 후, 해리 데이터를 k_off를 얻기에 하나의 부위 모델에 적합시키고 위(pseudo)-일차 속도 상수(ks)를 각 결합 곡선에 대해 계산하고, 단백질 농도에 따라 플롯팅하여 k_on +/- s.e를 얻었다. 그 후, 평형 해리 상수 Kd를 SPR 측정법으로부터 k_off/k_on로서 계산할 수 있다. 실험적 인공산물의 부재는, 예를 들어 해리된 bsBA의 재결합을 상이한 밀도, 예를 들어, 100, 200, 및 400 RU의 여러 표면에 대한 상기 측정을 수행함에 의해 결정하여야 한다.

대안적으로는, 이들의 친화도는 또한 예를 들어, [Nielsen et al. (Cancer Res. 60(22):6434-40 (2000)]에 기재된 바와 같이 흐름 세포측정에 의해 결정될 수 있다.

실시예 5: 세포내 이펙터 기능 측정

결합 도메인의 이펙터 기능은 예를 들어 30분 동안 상이한 농도에서 이펙터 결합 도메인과 배양액에서 성장된 표적 세포 성장을 접촉시킴에 의해 결정할 수 있다. 이 시점에서, 세포는 몇몇 경우에 외인 성장 인자로 자극되어 분자가 변경시키고자 하는 생물학적 효과를 촉진한다. 6- 또는 12-웰 조직 배양 플레이트에서 성장된, 처리된 세포의 추출물은 세포를 얼음상에서 단백질분해효소 억제제 (1 mM PMSF, 1 μg/mL 류펩틴, 1 μg/mL 펩스타틴)을 함유하는 용해 완충액(20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA3 1% Triton X-100, 0.5% NP40, 10 mM β-글리세롤포스페이트, 10 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄)에서 27G 니들을 통해 5번 통과시킴에 의해 제조된다. 용해 전에, 세포를 차가운 PBS에서 2회 세척된다. 그 후, 용해물을 예를 들어 인(phospho)-특이적 항체로 면역블롯(immunoblotting)에 의해 분석한다: 총 세포 단백질 추출물(50 μg의 총 단백질/레인(lane))을 7.5% SDS-PAGE 프리캐스트(precast) 젤(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 전기영동에 의해 분해하고, 니트로셀룰로즈(nitrocellulose) 필터로 이동시키고, 마커 또는 다운스트림 관련 단백질의 활성화를 검출하는 항체와 인큐베이션시킨다. 대안적으로는, 용해물은 [Nielsen et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 100(16):9330-5 (2003)]에 기재된 바와 같이 항체 마이크로어레이에 의해 분석될 수 있다.

결합 도메인의 이펙터 기능은 또한 요망되는 생물학적 기능의 다른 판독, 예를 들어 세포 증식 검정에 의해 결정될 수 있다. 표적 세포는 DMEM 및 5% FCS 및 다양한 농도의 결합 도메인을 함유하는 96-웰 접시에서 웰 당 5 x 10³로 시딩할 수 있다. 72시간 후에, 세포가 용해되고 ATP의 양은 제조자의 프로토콜에 따라 셀티터-글로(CellTiter-Glo) 발광성(Luminescent) 세포 생존능 검정(Promega, Madison, WI)에 의해 결정할 수 있다.

인산화 및 증식 검정의 결과는 하기 공식에 맞추어 이펙터 및 표적화 도메인에 대해 추정된 IC₅₀ 및 농도의 로그값에 따라 억제 정도로 플롯팅될 수 있다

실시예 6: bsBA 시험

ErbB 수용체에 의해 매개되는 세포 신호전달을 막거나, 줄이거나, 억제하는 능력을 위한 bsBA의 효과를 시험하기 위해, A431 (에스트로겐 의존 유방암세포주, National Center for Biotechnology Information Accession GDS 121)과 같은 암세포를 다양한 농도에서 bsBA와 30분간 인큐베이션한 후, 성장 인자(예를 들어, 헤레귤린 또는 EGF)로 세포를 2시간 이하의 시간 동안 자극하였다. 세포는 그 다음에 트리톤 완충액에서 용해되고 후속하여 초음파처리된다. 그 후, 용해물은 면역 블롯팅(immunoblotting) 또는 단백질의 인산화에 민감한 항체 마이크로어레이를 사용함에 의해 인산화에 변화에 대해 분석한다(예를 들어, [Nielsen et al., 2003, PNAS 100:9330]가 참조됨).

bsBA는 적절한 항원을 발현하는 암의 성장의 억제를 위해 사용될 수 있다. bsBA의 효과는 작은 분자 약물을 bsBA에 컨쥬게이션시킴에 의해 증진될 수 있다. 약물은 예를 들어 표준 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 또는 티로신 키나아제 억제제, 예를 들어 글리벡(Gleevec)® (이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate))일 수 있다.

실시예 7: ErbB BsBA

A431 세포에서 헤레귤린(HRG)-유발 ERK 및 AKT 활성화의 컴퓨터 시뮬레이션은은 bsBA의 ErbB 수용체 결합 분자 중 하나가 다른 ErbB 결합 분자가 이의 수용체에 대해 가지는 것보다 이의 수용체에 대해 더 낮은 친화도를 가진다면 ErbB bsBA가장 효과적임을 보여준다.

본 발명의 bsBA의 낮은 친화도 결합 분자가 ErbB3 또는 ErbB4에 대해 유도되고 bsBA의 높은 친화도 결합 분자가 또 다른 ErbB 수용체(예를 들어, ErbBl 또는 ErbB2)에 대해 유도되는 경우, bsBA는 ErbB 수용체에 의해 매개되는 세포 신호전달 을, ErbB3 또는 ErbB4를 ErbB3 또는 ErbB4 수용체, bsBA, 및 ErbBl 또는 ErbB2 수용체로 구성되는 삼합체 복합체(다시 말해, ErbB3/4:bsBA:ErbBl/2)로 격리시킴에 의해 줄이거나 막거나 억제한다.

bsBA의 결합 분자는 또한 ErbB3 및 ErbB4에 대해 유도될 수 있다. 이러한 bsBA는 ErbBl 또는 ErbB2에 의한 이러한 ErbB 수용체의 이합체화를 억제하는 것으로 여겨진다. ErbBl 또는 ErbB2에 의한 ErbB3 또는 ErbB4의 이합체화가 신호 전달에 필요하기 때문에, bsBA는 이합체의 형성을 차단함에 의해 세포 신호전달을 효율적으로 막거나, 줄이거나 억제한다. 바람직하게는, 이러한 bsBA의 낮은 친화도 결합 분자가 ErbB3에 결합된다.

또한, bsBA의 결합분자는 이들이 ErbBl 및 ErbB2에 결합되고, 이로써 이 두 개의 수용체를 가교하도록 제조될 수 있다. ErbB3 또는 ErbB4로 ErbBl 및 ErbB2의 이합체화를 줄이거나 막거나 또는 억제에 의한 이 bsBA 기능은 상기 논의된 바와 같이 신호 전달에 필요하다. 바람직하게는, 이 bsBA의 낮은 친화도 결합 분자는 ErbBl에 결합한다. 예시적인 bsBA는 EGFR, ErbB2 또는 ErbB4에 대한 높은 결합 분자와 ErbB3에 결합하는 낮은 친화도 결합 분자를 포함한다.

bsBA는 또한 세포독성 또는 화학요법 작용제를 ErbB 수용체를 발현하는 세포에 국한하도록 하기 위해 사용될 수 있다. 이 작용제는 두 개의 결합 분자를 가지며, 이 각각은 상이한 ErbB 수용체에 대한 특이적이며, bsBA에 컨쥬게이션된 세포독성제 또는 화학요법제(예를 들어 사포린(saporin), 안티-인터페론-α, 빈카(vinca) 알카로이드, 린신(ricin) A 사슬, 메토트렉세이트(methotrexate) 또는 방사성 동위 원소 합텐(hapten))이다. bsBA는 완전한 길이 항체 또는 항체 단편(예를 들어 F(ab')₂ 또는 (Fv)₂ 이특이성 항체), 디아바디, 또는 두 개의 상이한 결합 분자를 가진 앱타머로서 제조될 수 있다.

모델은 수용체의 ErbB 과를 사용하여 시험하였다. EGF 또는 HRG에 의한 ErbB 수용체의 자극은 신호 캐스케이드 내 여러 수준에서 혼선이 되는 ERK 및 AKT의 인산화를 이끄는 경로의 동시 활성화를 이끈다. 분석의 민감성은 본 발명자들이 모델 입력에서의 불확실성의 상이한 공급원으로 모델 출력의 불확실성을 할당하도록 할 수 있다. 종양 세포가 구별되는 수용체 발현 수준에 의해 특징화되므로, 본 발명자들은 HRG가 리간드인 경우에 매우 민감한 표적으로서 ErbB3 및 ErbB4를 확인했다.

일반적으로, bsBA의 결합 분자가 항체 또는 이의 단편인 경우에, 이 결합 분자들은 이들의 해리 상수 또는 결합 및 해리 속도가 쉽게 결정될 수 있기 때문에 생화학적으로 잘 특징될 수 있다. 마찬가지로, 항체의 작용 메카니즘은 수학적 모델을 사용하여 쉽게 설명될 수 있고, 억제제로서 알려진 항체를 사용하는 효과는 인실리코(in silico)로 시험될 수 있다. 본 발명자들의 계산 모델을 사용하여, 본 발명자들은 ErbB 세포 신호전달 경로를 차단하기 위해 이특이성 항체(즉, 각 결합 도메인이 상이한 ErbB 수용체와 결합하는 두 개의 별개의 결합 분자를 가지는 항체)를 사용하는 개념을 시험하였다. 인실리코 결과는 하나의 ErbB 수용체에 대한 결합 친화도가 다른 ErbB 수용체에 대한 결합 친화도보다 큰 두개의 상이한 ErbB 수용체에 대한 결합 특이성을 가지는 항체가 ErbB 경로을 통한 세포 신호전달을 차단하거나 막기에 이상적임을 확인한다.

인실리코 접근을 사용하여, 본 발명자들은 단지 하나의 ErbB 수용체를 표적화하는 통상적 억제제의 능력에 대해 ErbB 수용체의 차별적 발현을 나타내는 (표 1) 세 개의 상이한 세포주에서 ErbB 신호전달 경로의 활성화를 차단하거나 막기 위해 두 개의 상이한 ErbB 수용체를 표적화하는 이특이성 항체의 능력을 비교하였다. 각 세포주에서 신호 억제는 이특이성 뿐만 아니라 현재의 치료적 단일특이성 항체에 대해 인실리코 모델링된다. 본 발명자들의 모델은 두 개의 상이한 ErbB 수용체에 대해 차별적 친화도를 가지는 이특이성 항체에 의한 세포 신호전달의 억제가 전통적 단일 수용체 억제제에 의해 매개되는 세포 신호전달의 억제보다 훨씬 높다는 것을 예측하였다. 본 발명자들의 컴퓨터 모델링에 의해 만들어진 데이타는 표 2에서 보여진다. 종양에 존재하는 수용체 비에 의존하여, 높은 친화도 결합 분자 및 낮은 친화도 결합 분자를 가지는 별개의 bsAB는 두 개의 결합 분자가 같은 결합 친화도를 가지는 이들의 각 항원에 결합하는 단일특이적 항체 또는 이특이성 항체보다 실질적으로 더 효능있는 억제제임이 예측된다.

표 1: 상이한 세포주에서 ErbB 수용체의 수용체 발현 프로파일

	세포 형태 A	세포 형태 B	세포 형태 C
ErbB 1 ErbB 2 ErbB 3 ErbB 4	XXX XX X -	XX XXX XX XX	X XX X X

표 2: 전통적인 단일특이성 수용체 억제제와 비교되는 bsBA에 의한 억제

본 발명자들은 모든 자극 조건 하에서 ErbB 경로의 활성화로 인한 세포 신호전달을 차단하기 위한 가장 효과적인 차단제로서 ErbBl (높은 친화도) 및 ErbB3 또는 ErbB4 (낮은 친화도)에 대한 이특이성 항체를 확인했다. ErbBl-ErbB2 bsAB는 또한 모든 자극 조건 하에서 ErbB 세포 신호 차단제로서 꽤 효과적이다. HRG가 활성제로서 사용되는 경우에, ErbB3-ErbB4 또는 ErbB2-ErbB3/4 bsAb는 ErbB 경로의 매우 효과적인 차단제이다. 따라서, 바람직한 bsBA는 차단제의 하나 이상의 특징이 (낮은 친화도 결합 분자를 사용하여) ErbB3 또는 ErbB4 수용체를 표적화하는 능력인 것이다. 사실, 컴퓨터 모델의 도움으로, 본 발명자들은 ErbB3/4의 강한 신호전달 특성을 확인했다. ErbB3/4를 그들 자신 또는 더욱 전형적인 암 항원, 예를 들어 ErbBl 또는 ErbB2에 가교하는 것은 두 개의 수용체의 동시 억제 또는 수용체의 격리에 의해 ErbB3/4 신호전달를 억제하는 메카니즘으로 기능한다.

단일특이성 항체와 같은 전통적인 단일특이성 차단제에 비해 bsBA를 사용하는 것과 관련된 장점 중 하나는 이특이성 차단제가 안정한 삼합체(다시 말해, ErbB 수용체-이특이성 차단제-ErbB 수용체)를 형성한다는 것이다. 따라서, bsBA의 효율 성은 표 2에서 있는 바와 같이 전통적인 단일 수용체 억제제의 효율성보다 훨씬 높다.

두 개의 상이한 ErbB 수용체에 결합함에 의해, 본 발명의 bsBA는 동일하거나 상이한 ErbB 수용체와의 상호작용으로부터 ErbB 수용체를 격리한다. bsBA는 결합된 ErbB 수용체의 세포 신호전달 활성을 막거나, 줄이거나, 억제하는 매우 안정한 (비가역적) 삼합체 복합체를 형성한다. ErbBl, ErbB2, ErbB3, 또는 ErbB4에 대한 bsBA의 초기 결합 단계는 가역적 단계일 수 있고, 남아있는 ErbB 수용체에 대한 두 번째 결합 단계는 매우 안정한 삼합체의 형성을 이끈다. 대안적으로는 ErbBl, ErbB2, ErbB3, 또는 ErbB4에 대한 bsBA의 첫 번째 결합 단계는 비가역적일 수 있고, 두 번째 결합 단계가 가역적일 수 있어, 이로써 bsBA가 다수의 상이한 삼합체 복합체를 형성하도록 한다. ErbB 수용체:bsBA:ErbB 수용체 삼합체의 형성은 세포 신호전달을 유발할 수 없는 복합체를 야기한다. 또한, ErbBl, ErbB2, ErbB3, 및 ErbB4를 격리함에 의해, bsBA가 동일하거나 상이한 ErbB 수용체에 의한 이들 ErbB 수용체의 이합체화를 막거나, 줄이거나 억제한다. 바람직하게는, bsBA는 ErbBl 또는 ErbB2에 대한 더 높은 친화도를 가지고 ErbB3 또는 ErbB4에 대한 더 낮은 친화도를 가진다.

bsBA의 두 개의 결합 분자 중 단지 하나가 관계되는 불완전한 bsBA-ErbB 수용체 이합체의 형성은 세포 신호전달을 손상시키는 복합체를 야기하지 않고; 단지 삼합체 복합체(다시 말해, ErbB 수용체:bsBA:ErbB 수용체)의 형성은 세포 신호를 막는다. 또한, 삼합체 형성은 bsBA에 의해 결합되는 두 개의 ErbB 수용체 사이에 서 가능하지 않다.

bsBA의 다른 특성은 HRG와 같은 ErbB 수용체를 위한 천연 리간드와 경쟁함에 의해 세포 신호전달을 줄이거나 막거나 차단하는 하나 또는 둘 모두의 결합 도메인의 능력을 포함한다.

본 발명자들의 인실리코 데이타는 ErbB3-ErbB4 bsBA가 단일특이성 ErbB3 또는 ErbB4 억제제보다 세포 신호를 차단하는데 더욱 효율적임을 증명한다. ErbB3 또는 ErbB4에 대해서만 유도된 단일특이성 억제제는 주로 ErbB3 및 ErbB4의 높은 세포 표면 발현 수준 때문에 ErbB3-ErbB4 bsBA만큼 효과적인 AKT 인산화를 억제하지 않는다. AKT 인산화는 ErbB3 및 ErbB4 둘 모두의 단일특이성 억제제가 사용되는 경우에만 억제된다.

본 발명자들의 인실리코 분석은 또한 ErbB2 및 ErbB3 수용체와 결합하는 bsBA의 효과를 확인해준다. ErbB2-ErbB3 bsBA는 세포가 HRG로 자극되는 경우 단일특이성 ErbB2 또는 ErbB3 억제제 보다 세포 신호전달을 억제하는 데에 있어서 더욱 효과적이다. 삼합체 형성의 안정화의 부재하에서 ErbB2-ErbB3 bsBA 삼합체 복합체의 효과는 감소된다. bsBA의 둘 모두의 결합 분자가 이들의 수용체에 대해 동등한 결합 친화도를 지니는 경우 AKT 인산화를 차단하는 데에 있어서 ErbB2-ErbB3 bsBA 삼합체가 덜 효과적이다.

bsBA가 결합되지 않은 상태 또는 단지 하나의 ErbB 수용체를 가진 이합체 복합체로서 임의의 억제제 효과를 가지지 않기 때문에, ErbB 수용체가 bsBA로 포화되게 하는 억제제 농도의 증가는 bsBA의 억제제 효과의 감소를 야기한다. 이 결과는 ErbB2에 대한 증가된 친화도를 가지는 bsBA를 제공함에 의해 역전될 수 있고, 이로써 bsBA의 결합 친화도는 ErbB3 또는 ErbB4에 대한 것보다 ErbB2에 대해서 더 크다(다시 말해 KdErbB2> Kd ErbB3 또는 ErbB4)).

상기 논의된 bsBA는 HRG 지배 영역에서 특별히 효과가 있다. 일반적으로 bsBA는 단지 하나의 수용체를 표적화하는 ErbB 수용체 억제제에 비해 훨씬 낮은 용량에서 효과가 있다. 예를 들어, 0.1nM의 농도에서, 본 발명의 ErbB2/ErbB3 bsBA는 AKT 인산화의 억제를 촉진시키는 반면, bsBA와 동일한 Kd를 지닌 ErbB2 또는 ErbB3 단일 특이성 억제제는 0.1nM의 농도에서 효과적이지 않다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예는 bsBA의 하나의 결합 분자가 ErbBl (높은 친화도 결합)에 대한 결합 특이성을 가지고 다른 결합 분자가 ErbB3 또는 ErbB4 (낮은 친화도 결합)에 대한 결합 특이성을 가지는 bsBA이다. 일반적으로, 종양 세포는 높은 양의 ErbB1을 발현하지만(다시 말해, 종종 100,000 수용체/세포 이상), 반면에, ErbB3 및 ErbB4에 대한 수용체 발현은 5,000 내지 20,000 수용체/세포 범위이다. 리간드 결합을 길항하는 bsBA는 수용체 신호전달을 성공적으로 억제하지만, 수용체 발현 수준이 10배 이상 차이가 난다.

본 발명자들의 인실리코 분석은 이특이성 ErbBl/ErbB3 및 ErbBl/ErbB4 bsBA의 효과를 확인한다. ErbB1의 경우, 이특이성 scFv 항체와 같은 bsBA는 동일한 결합 도메인에 대한 천연 ErbB1 리간드와 경합할 수 있으며, 이는 EGF 또는 TGF-α 우세 방법에서 bsBA를 매우 효과적이 되게 한다. ErbB3 수용체의 억제는 HRG 우세 영역에서 신호전달을 억제한다.

ErbB 세포 신호 경로의 본 발명자들의 인실리코 분석에 기초하여, 본 발명자들은 낮은 해리 상수 KD < 1nM를 가진 높은 친화도 결합 부위로서 비록 이는 비가역적이지는 않은 ErbBl 결합 분자를 확인했다. ErbB3 및 ErbB4 수용체는 ErbBl 수용체보다 훨씬 더 낮은 수준에서 발현된다. bsBA가 ErBl 및 ErbB3/ErbB4 수용체 둘 모두에 결합하기 때문에, 그리고 bsBA가 더욱 많은 ErbBl 수용체에 더 높은 친화도를 가지기 때문에, bsBA는 통상적 단일특이성 ErbB 억제제보다 훨씬 낮은 농도에서 ErbB3 또는 ErbB4에 대한 ErbB1의 이합체화에 의해 매개되는 세포 신호전달을 효과적으로 차단할 수 있다. ErbB1에 대한 bsBA의 높은 친화도는 낮은 bsBA 농도에서 높은 효율성으로 이끈다.

본 발명자들의 방법은 가교를 위한 최적의 수용체 뿐만 아니라 두 개의 결합 분자의 요망되는 친화도를 확인하기 위해 컴퓨터 모델링을 이용한다. bsBA의 두 개의 결합 분자의 차별적 친화도는 암세포에 특이적이지 않은 것으로 여겨지는 ErbB3와 같은 수용체에 bsBA를 효과적으로 표적화한다. ErbBl와 같은 더욱 전형적인 암 항원에 ErbB3를 가교함은 특이적으로 암세포를 표적하고 이 세포들내에서 ErbB3 수용체 활성을 조절하는 수단을 제공한다.

본 발명자들의 컴퓨터 모델을 사용하여, 본 발명자들은 bsBA의 두 개의 결합 분자의 차별적 친화도의 필요성을 확인했다. 차별적 친화도는 bsBA 삼합체 복합체의 안정화를 촉진한다. 일반적으로 말해서, bsBA의 활성 결합 분자는 불활성 또는 더 낮은 활성 결합 분자에 비해 더 낮은 친화도를 가져야 한다. bsBA의 두 결합 분자가 불활성 또는 덜 활성이라면, 더 높게 발현되거나 더 강한 신호전달 수용체 를 표적화하는 결합 분자는 더 높은 친화도를 가져야 한다. 표적화된 수용체 중 하나에 대한 차별적 친화도를 가지는 것은 하기를 야기한다: bsBA가 더 높은 친화도 상호 작용(예를 들어 ErbB1)의 Kd 보다 높지만 더 낮은 친화도 상호작용(예를 들어 ErbB3)의 Kd 보다 낮은 농도로 투여된다면, bsBA는 더 높은 친화도 상호작용을 위한 항원을 발현하는 세포상으로만 축적되어야 한다. bsBA의 다른 단부은 이의 생물학적 기능(예를 들어 다운스트림 신호전달을 막는 ErbB3)를 방해하는 이 세포들상의 낮은 친화도 항원과 상호작용하는데 유용하다. 어느 수용체가 낮거나 높은 친화도 상호작용인지의 여부는 수용체의 특이적 신호 강도(표적으로서 중요) 및 bsBA의 작용 모드에 의존한다.

실시예 8

본 실시예에는 상기 기술된 특징을 지닌 예시적인 항-EGFR/ErbB3 bsBA을 생성시키는 것이 기재되어 있다.

재료 및 방법

세포주. 마우스 하이브리도마 세포주 225, 293T 세포주 및 인간 유방암 세포주 A431을 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (American Type Culture Collection) (Manassas, VA)으로부터 입수하였다. 모든 세포주를 10% 우태아 혈청 또는 IgG 저함량 우태아 혈청 (FBS) (Invitrogen)이 보충된 DMEM 배지, 또는 2mM 글루타민, 100 U/mL 페니실린 및 100㎍/mL 스트렙토마이신이 보충된 CD293 무혈청 배지 (Invitrogen) ("성장 배지")에서 배양하였다.

마우스 항-EGFR 항체의 클로닝

RNA를 제조업자에 의해 설명된 바와 같이 RNA이지 (RNAeasy) 키트 (QIAGEN)를 사용하여 세포주 ATCC No. HB-8508로부터 추출하였다. 제 1 사슬 cDNA를 제조업자에 의해 설명된 바와 같이 cDNA 합성 키트 (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ)를 사용하여 이러한 키트에 제공된 RT-프라이머 pd(N)6에 의해 합성하였다. C225 항체의 중쇄는 하기 마우스 프라이머의 혼합물을 사용하여 cDNA로부터 증폭시켰다:

그 후, 프라이머 Hind3-C225-VH-5' (5'-CTA GCT AGC GGG AAG CTT CAG GTA CAA CTG CAG GAG TCA-3' (SEQ ID NO:20)) 및 C225-VH-3' (5'-AGA GGA AAC GGT GAC CGT GGT-3' (SEQ ID NO:21))을 사용하여 증폭된 생성물을 2차 PCR 시켰다. C225 항체의 경쇄는 하기 프라이머의 혼합물을 사용하여 cDNA로부터 증폭시켰다:

그 후, 프라이머 C225-VH-링크-VL-UP (ACC ACG GTC ACC GTT TCC TCT GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC CAG CTG ACC CAG TCT (SEQ ID NO:33)) 및 C225-VL-Xho-His6-NotI (CCC GCC TGC GGC CGC TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTC GAG TTT GAT CTC CAG CTT GGT CCC AGC ACC GAA (SEQ ID NO:34))을 사용하여 증폭된 생성물을 2차 PCR 시켰다. 모든 PCR은 표준 PCR 방법 및 장치의 사용하에 수행하였다. PCR 생성물을 제조업자에 의해 설명된 바와 같이 QIA퀵 (QIAquick)을 사용하여 정제하고, 100ng의 각각의 정제된 중쇄 및 경쇄 생성물을 혼합하고 프라이머없이 7회의 PCR 사이클을 수행한 후 프라이머 Nco1-C225 (CAG CCG GCC ATG GCC cag gta caa ctg cag gag tc (SEQ ID NO:35)) 및 C225-Xho1-3' (GAT CTC GAG CTT GGT CCC AGC (SEQ ID NO:36))을 사용하여 25회의 PCR 사이클을 수행함으로써 scFv C225로 조립하였다. ~750 bp 밴드를 제조업자에 의해 설명된 바와 같이 QIA퀵을 사용하여 아가로오스 겔로부터 정제한 후, 또한 제조업자에 의해 설명된 바와 같이 TOPO TA 클로닝 키트 (Invitrogen)을 사용하여 클로닝하였 다. 클로닝된 생성물을 표준 방법을 이용하여 대장균 균주 XL1내로 형질전환시키고, 표준 DNA 서열분석 기술을 이용하여 서열분석하였다. Ckappa (카파 불변)를 프라이머 5'-Xho-Ck (GAG CTC GAG ATC AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA (SEQ ID NO:37)) 및 Ck-Apal-3' (CGC GGG CCC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GC (SEQ ID NO:38))을 사용하여 인간 백혈구로부터 수득된 (상기 기재된 바와 같이 수득됨) cDNA로부터 클로닝하였다. CH (중쇄 불변)를 프라이머 5'-CH1-감마1 (CCAAGAGCACCTCTGGGG (SEQ ID NO:39)) 및 HuIgG-Xho-Xba-3 (GGCCCTCTAGACTCGAGTAATTCATTTACCCGGAGACAGGG (SEQ ID NO:40))를 사용하여 클로닝하였다. 이의 생성물을 프라이머 (5'-Not1 Nhe1 CH1 gtg gcg gcc gct agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg g (SEQ ID NO:41)) 및 HuIgG-Xho-Xba-3' (GGCCCTCTAGACTCGAGTAATTCATTTACCCGGAGACAGGG (SEQ ID NO:42))를 사용하는 2차 PCR에서 주형으로서 사용하였다. 생성물을 제조업자에 의해 권고된 바와 같이 QIA퀵 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 정제한 후, TOPO TA 클로닝 키트를 사용하여 클로닝하고, 최종 구성물을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 그 후, CH 생성물을 Not1 및 Xho1 부위에서 pSecTaq2A 히그로(Hygro) 벡터 (Invitrogen)내로 서브클로닝하여 CH/pSecTaq2A 히그로 (CH/pSTH)를 생성시키고, Xho1 및 Apa1 부위에서 Ck를 pSecTaq2A 벡터내로 서브클로닝하여 Ck/pSecTaq2A (Ck/pSTZ)를 생성시켰다. 최종적으로, A5 항-ErbB3 scFv (제임스 막스 (James Marks) 박사 (University of California, San Francisco)의 호의로 제공받음)를 Sfi1 및 Not1 부위를 사용하여 CH/pSTH 구성물내로 서브클로닝하여 A5CH/pSTH를 형 성시키고, C225 scFv를 Sfi1 및 Xho1 부위에서 CK/pSTZ내로 서브클로닝하여 C225Ck/pSTZ를 형성시켰다.

재조합 bsAb의 발현

293T 세포의 일시적 트랜스펙션. 293T 세포주를 제조업자에 의해 설명된 바와 같이 FuGene^TM 트랜스펙션 시약 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)을 사용하여 A5CH/pSTH 및 C225Ck/pSTZ로 코-트랜스펙션(co-transfection)시켰다 (세포를 초저함량 IgG FBS를 지닌 DMEM에서 트랜스펙션시킨 후, 트랜스펙션후 1일째에 CD293 무혈청 배지로 옮김). 트랜스펙션된 세포를 제조업자에 의해 권고된 바와 같이 단백질 G (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL)상에서 정제하기 전에 5일간 성장 배지에서 배양하여 C225-A5 Ig-scFv 융합체를 형성시켰다.

항체 결합의 흐름 세포측정 분석

A431 세포를 얼음상에서 30분간 1 ug/mL의 C225-A5 Ig-scFv 융합체와 인큐베이션시킨 후, 세척 완충액 (포스페이트 완충 식염수, 2%FBS, 0.1% 아지드)으로 2회 세척하고, 결합을 알렉사 플루오르® (Alex Fluor®) 488 (Invitrogen)로 표지된 항-인간 IgG 항체를 사용하여 검출하고, FACS칼리버 (FACSCalibur) 장치 (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ)로 정량하였다.

bsAB에 의한 성장 인자 유도된 AKT 인산화의 억제 시험

항체 투여량-반응 실험을 위해, A431 세포를 DMEM (무혈청)에서 30분간 다양한 양의 C225-A5 Ig-scFv 융합체와 인큐베이션시킨 후, 세포를 50 ng/ml의 헤레귤 린-베타 (heregulin-beta) (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) 또는 50 ng/mL의 EGF (PeproTech, Inc., Rocky Hill, NJ)로 5분간 자극시켰다. 세포를 용해 완충액 (20 mM Tris, pH7.4; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1 mM NaF; 10 mM 베타-글리세로포스페이트; 1% 트리톤 X-100; 프로테아제 억제제 칵테일 (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO); 1 mM 나트륨 오르토바나데이트; 50 μM 페닐아르신; 10 μM bpV 및 100ug/ml DNase)에서 용해시키고, AKT의 성장 인자 자극된 인산화의 감소를 닐슨(Nielsen) 등의 문헌 [Proc Nat1 Acad Sci USA 100(16):9330-9335 (2003)]에 기재된 항체 마이크로어레이 검정을 이용하여 측정하였다. AKT 항체는 셀 시그널링 테크놀로지 (Cell Signaling Technology) (Beverly, MA)로부터 입수하였다.

실시예 9

본 실시예에는 상기 기술된 특징을 지닌 예시적인 항-EGFR/ErbB3 bsBA의 시험 결과가 기재되어 있다.

결과

293T 세포에서 2개의 발현 플라스미드인 A5CH/pSTH 및 C225Ck/pSTZ (도 1에 도시되어 있음)를 코-트랜스펙션시킴으로써 이특이성 항체 C225-A5 Ig-scFv 융합체를 발현시켰다. 발현된 C225-A5 Ig-scFv 융합체를 상층액으로부터 정제하고, 생성물을 흐름 세포측정에 의해 암 세포주 A431에 결합하는 것에 대해 평가하였다. A431 세포는 EGF 수용체를 과발현하였고, 예상대로 C225-A5 Ig-scFv 융합체는 도 2에 도시된 바와 같이 이들 세포에 잘 결합하였다.

후속하여, 발현된 C225-A5-Ig-scFv를 암 세포주 A431에서 성장 인자 유도된 AKT 인산화의 억제에 대해 시험하였다. 세포를 다양한 농도에서 30분간 C225-A5 Ig-scFv 융합체와 사전 인큐베이션시킨 후, 헤레귤린 (HRG) 또는 EGF로 5분간 자극시켰다. 그 후, 세포를 세정제를 함유하는 완충액에서 용해시키고, AKT 인산화에 대해 검정하였다. 결과는 도 3에 도시되어 있다. C225-A5 Ig-scFv 융합체는 약 2 nM의 근사 IC₅₀로 EGF에 반응하여 AKT의 인산화를 억제하였다. 헤레귤린은 AKT를 포함하는 수 개의 세포내 키나아제의 활성화를 초래하는 ErbB3 수용체의 리간드이다. 항-ErbB3 항체 A5의 비교적 낮은 친화도 (약 700 nM)에도 불구하고, C225-A5 Ig-scFv 융합체는 0.2 nM의 근사 IC₅₀로 헤레귤린 유도된 활성화를 억제하였다. 이는 "하이-로 (hi-lo)" 이특이성 약물 (제 1 항원에 대해 고친화도를 지니고 제 2 항원에 대해 저친화도를 지닌 약물)이 항체에 의해 표적화된 키나아제의 활성을 매우 효능있게 억제할 수 있음을 입증해준다.

본원에 기재된 실시예 및 구체예는 단지 예시적 목적을 위한 것이고 이의 관점에서 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 암시될 것이고, 이러한 변형 또는 변화는 본 출원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그대로 참조로서 본원에 통합된다.

Claims (56)

1. (a) 표적 세포의 표면상의 제 1 표적 분자에 대해 10^-7 M 이상의 해리 상수 ("Kd")를 지닌 제 1 결합 도메인 및 상기 세포의 표면상의 제 2 표적 분자에 대해 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 10배 이상 낮은 친화도를 지닌 제 2 결합 도메인을 지니는 이특이성(bispecific) 결합제로서, 여기서 상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자는 각각 동일하거나 상이할 수 있는 생물학적 활성을 지니는 것인 이특이성 결합제를 제공하고,

   (b) 제 1 결합 도메인 및 제 2 결합 도메인이 각각 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자에 결합할 수 있게 하는 조건하에서 상기 이특이성 결합제를 표적 세포와 접촉시키는 것을 포함하여 표적 세포상의 표적 분자의 생물학적 활성(들)을 조절하는 방법으로서, 상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자에 결합되는 경우 표적 분자의 생물학적 활성(들)이 조절되는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 이특이성 결합제가 두 개의 항체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 항체가 디아바디(diabody), 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이들의 조합물임을 특 징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 표적 세포가 암세포임을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 제 1 표적 분자가 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체 또는 성장 인자 수용체임을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 제 1 표적 분자가 수용체로서의 티로신 키나아제임을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 제 2 표적 분자가 ErbB3, ErbB4, FGF 수용체 1 내지 4 중 어느 하나, HGF 수용체, IGF1-R, PDGF, 수용체 알파 및 베타, 및 C-KIT로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd가 10^-8 내지 10^-12 M 임을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 제 2 표적 분자에 대한 제 2 결합 도메인의 Kd가 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 20배 이상 낮음을 특징으로 하는 방 법.
10. 비표적(non-target) 세포 및 외부에 제 1 표적 분자를 지니고 외부 표면에 제 2 표적 분자를 지닌 표적 세포를 지닌 생물체에서 표적 세포상의 표적 분자의 생물학적 활성(들)을 조절하는 방법으로서, 이러한 방법은

    (a) 제 1 표적 분자에 대해 10^-7 M 이상의 Kd를 지닌 제 1 결합 도메인 및 제 2 표적 분자에 대해 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 10배 이상 낮은 Kd를 지닌 제 2 결합 도메인를 지닌 이특이성 결합제를 제공하고;

    (b) 제 1 결합 도메인 및 제 2 결합 도메인이 각각 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자에 결합할 수 있게 하는 조건하에서 상기 이특이성 결합제를 표적 세포와 접촉시키는 것을 포함하며,

    여기서 (i) 상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자는 공통적인 리간드를 공유하지 않고, (ii) 상기 제 1 표적 분자는, 제 2 표적 분자를 또한 함유하는 비표적 세포상에서 보다 표적 세포의 표면상에서 10배 이상 더 풍부하고, (iii) 상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자는 각각 동일하거나 상이할 수 있는 생물학적 활성을 지니고,

    상기 제 1 결합 도메인 및 제 2 결합 도메인이 결합하는 경우 상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자의 생물학적 활성(들)이 각각 조절되는, 표적 세포 및 비표적 세포를 지닌 생물체에서 표적 세포상의 표적 분자의 생물학적 활성(들)을 조절하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 이특이성 결합제가 두 개의 항체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 항체가 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이들의 조합물임을 특징으로 하는 방법.
13. 제 10 항에 있어서, 표적 세포가 암세포임을 특징으로 하는 방법.
14. 제 10 항에 있어서, 제 1 표적 분자가 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체 또는 성장 인자 수용체임을 특징으로 하는 방법.
15. 제 10 항에 있어서, 제 1 표적 분자가 수용체로서의 티로신 키나아제임을 특징으로 하는 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 제 2 표적 분자가 ErbB3 (HER3), 인슐린 유사 성장 인자-1 수용체 (IGF1-R), FGF 수용체 1 내지 4 중 어느 하나, HGF 수용체, 인슐린 수용체, PDGF 수용체 알파 및 베타 중 어느 하나, C-KIT, 또는 ErbB4임을 특징으로 하 는 방법.
17. 제 10 항에 있어서, 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd가 10^-8 내지 10^-12 M 임을 특징으로 하는 방법.
18. 제 10 항에 있어서, 제 2 표적 분자에 대한 제 2 결합 도메인의 Kd가 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 20배 이상 낮음을 특징으로 하는 방법.
19. 제 10 항에 있어서, 제 2 표적 분자에 대한 제 2 결합 도메인의 Kd가 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 50배 이상 낮음을 특징으로 하는 방방법.
20. 제 10 항에 있어서, 조절이 수용체로서의 티로신 키나아제의 활성을 감소시키는 것임을 특징으로 하는 방법.
21. 표적 세포상의 제 1 표적 분자에 대하여 10^-7 M 이상의 Kd를 지닌 제 1 결합 도메인 및 표적 세포상의 제 2 표적 분자에 대해 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 10배 이상 낮은 Kd를 가지는 제 2 결합 도메인을 포함하는 이특 이성 결합제 (bsBA)로서,

    (i) 상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자가 동일한 천연 리간드를 지니지 않고, (ii) 상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자가 각각 동일하거나 상이할 수 있는 생물학적 활성을 지니며, (iii) 상기 제 1 결합 도메인 및 제 2 결합 도메인이 상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자에 결합되는 경우 각각 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자의 생물학적 활성(들)을 조절하는 이특이성 결합제 (bsBA).
22. 제 21 항에 있어서, 상기 제 2 결합 도메인의 상기 Kd가 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 50배 이상 낮음을 특징으로 하는 bsBA.
23. 제 21 항에 있어서, 상기 제 2 결합 도메인의 상기 Kd가 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 100배 이상 낮음을 특징으로 하는 bsBA.
24. 제 21 항에 있어서, 상기 bsBA가 두 개의 항체를 포함함을 특징으로 하는 bsBA.
25. 제 24 항에 있어서, 항체가 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이들의 조합물임을 특징으로 하는 bsBA.
26. 제 21 항에 있어서, 제 1 결합 도메인이 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체 또는 성장 인자 수용체에 결합함을 특징으로 하는 bsBA.
27. 제 21 항에 있어서, 제 1 결합 도메인이 수용체 티로신 키나아제에 결합함을 특징으로 하는 bsBA.
28. 제 21 항에 있어서, 제 2 결합 도메인이 ErbB3 (HER3), 인슐린 유사 성장 인자-1 수용체 (IGF1-R), FGF 수용체 1 내지 4 중 어느 하나, HGF 수용체, 인슐린 수용체, PDGF 수용체 알파 및 베타 중 어느 하나, C-KIT, 또는 ErbB4와 결합함을 특징으로 하는 bsBA.
29. 제 21 항에 있어서, 상기 제 1 결합 도메인이 EGFR에 결합하고, 상기 제 2 결합 도메인이 ErbB3 (HER3)와 결합함을 특징으로 하는 bsBA.
30. 제 21 항에 있어서, 제 1 결합 도메인의 Kd가 10^-8 내지 10^-12 M임을 특징으로 하는 bsBA.
31. 제 21 항에 있어서, 상기 제 1 표적 분자가 정상 세포상에서의 이의 발현과 비교하여 표적 세포상에서 10배 이상 과발현됨을 특징으로 하는 bsBA.
32. 표적 세포상의 제 1 표적 분자에 대해 10^-7 M 이상의 Kd를 지니는 제 1 결합 도메인 및 표적 세포상의 제 2 표적 분자에 대해 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 10배 이상 낮은 Kd를 가지는 제 2 결합 도메인을 포함하는 이특이성 결합제 (bsBA) (a) 및 약제학적으로 허용되는 담체 (b)의 조성물로서,

    상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자가 동일한 천연 리간드를 지니지 않고, (i) 상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자가 각각 동일하거나 상이할 수 있는 생물학적 활성을 지니며, (ii) 상기 제 1 결합 도메인 및 제 2 결합 도메인이 상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자에 결합되는 경우 각각 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자의 생물학적 활성(들)을 조절하는 조성물.
33. 제 32 항에 있어서, 상기 제 2 결합 도메인의 상기 Kd가 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 50배 이상 낮음을 특징으로 하는 조성물.
34. 제 32 항에 있어서, 상기 제 2 결합 도메인의 상기 Kd가 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 100배 이상 낮음을 특징으로 하는 조성물.
35. 제 32 항에 있어서, 상기 bsBA가 두 개의 항체를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
36. 제 35 항에 있어서, 상기 항체가 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이들의 조합물임을 특징으로 하는 조성물.
37. 제 32 항에 있어서, 제 1 결합 도메인이 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 성장 인자 수용체 또는 수용체 티로신 키나아제에 결합함을 특징으로 하는 조성물.
38. 제 32 항에 있어서, 상기 제 1 표적 분자가 제 2 표적 분자를 또한 함유하는 비표적 세포상에서 보다 표적 세포상에서 10배 이상 과발현됨을 특징으로 하는 조성물.
39. 표적 세포상의 제 1 표적 분자에 대해 10^-7 M 이상의 Kd를 지니는 제 1 결합 도메인 및 표적 세포상의 제 2 표적 분자에 대해 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 10배 이상 낮은 Kd를 지니는 제 2 결합 도메인을 포함하는 이특이성 결합제 (bsBA)의 약제 제조용 용도로서,

    상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자가 동일한 천연 리간드를 가지지 않고, 상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자가 각각 동일하거나 상이할 수 있는 생 물학적 활성을 지니며, 상기 제 1 결합 도메인 및 제 2 결합 도메인이 상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자에 결합되는 경우 각각 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자의 생물학적 활성(들)을 조절하는 이특이성 결합제 (bsBA)의 약제 제조용 용도.
40. 제 39 항에 있어서, 상기 제 2 결합 도메인의 상기 Kd가 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 50배 이상 낮음을 특징으로 하는 용도.
41. 제 39 항에 있어서, 상기 제 2 결합 도메인의 상기 Kd가 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 100배 이상 낮음을 특징으로 하는 용도.
42. 제 39 항에 있어서, 상기 bsBA가 두 개의 항체를 포함함을 특징으로 하는 용도.
43. 제 42 항에 있어서, 상기 항체가 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이들의 조합물임을 특징으로 하는 용도.
44. 제 39 항에 있어서, 제 1 결합 도메인에 의해 결합되는 표적 분자 및 제 2 결합 도메인에 의해 결합되는 표적 분자가 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 및 성장 인자 수용체로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되고, 단, 제 1 결합 도메인 및 제 2 결합 도메인이 동일한 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 또는 성장 인자 수용체와 결합하지 않음을 특징으로 하는 용도.
45. 제 39 항에 있어서, 약제가 암세포의 증식을 억제하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
46. 제 39 항에 있어서, 상기 제 1 표적 분자가 제 2 표적 분자를 또한 함유하는 비표적 세포상에서 보다 표적 세포상에서 10배 이상 과발현됨을 특징으로 하는 용도.
47. 용기 (a), 및 표적 세포상의 제 1 표적 분자에 대해 10^-7M 이상의 해리 상수(Kd)를 지니는 제 1 결합 도메인 및 표적 세포상의 제 2 표적 분자에 대해 제 1 표적 분자에 대한 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 10배 이상 낮은 Kd를 지니는 제 2 결합 도메인을 포함하는 이특이성 결합제 (bsBA) (b)를 포함하는 키트로서,

    (i) 상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자가 동일한 천연 리간드를 가지지 않고, (ii) 상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자가 각각 동일하거나 상이할 수 있는 생물학적 활성을 지니며, (iii) 상기 제 1 결합 도메인 및 제 2 결합 도메인이 상기 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자에 결합되는 경우 각각 제 1 표적 분자 및 제 2 표적 분자의 생물학적 활성(들)을 조절하는 키트.
48. 제 47 항에 있어서, 상기 제 2 결합 도메인의 상기 Kd가 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 50배 이상 낮음을 특징으로 키트.
49. 제 47 항에 있어서, 상기 제 2 결합 도메인의 상기 Kd가 제 1 결합 도메인의 Kd 보다 100배 이상 낮음을 특징으로 키트.
50. 제 47 항에 있어서, 상기 bsBA가 두 개의 항체를 포함함을 특징으로 하는 키트.
51. 제 47 항에 있어서, 항체가 디아바디, 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된 두 개의 단일 사슬 Fv, 이황화물 안정화된 Fv, 또는 이들의 조합물임을 특징으로 하는 키트.
52. 제 47 항에 있어서, 제 1 결합 도메인이 종양 관련 항원, 사이토카인 수용체, 성장 인자 수용체 또는 수용체 티로신 키나아제에 결합함을 특징으로 하는 키트.
53. 제 47 항에 있어서, 제 2 결합 도메인이 ErbB3 (HER3), 인슐린 유사 성장 인 자-1 수용체 (IGF1-R), FGF 수용체 1-4 중 어느 하나, HGF 수용체, 인슐린 수용체, PDGF 수용체 α 및 베타 중 어느 하나, C-KIT, 또는 ErbB4과 결합함을 특징으로 하는 키트.
54. 제 47 항에 있어서, 상기 제 1 결합 도메인이 EGFR에 결합하고, 상기 제 2 결합 도메인이 ErbB3 (HER3)와 결합함을 특징으로 하는 키트.
55. 제 47 항에 있어서, 제 1 결합 도메인의 Kd가 10^-8 내지 10^-12 M임을 특징으로 하는 키트.
56. 제 47 항에 있어서, 상기 제 1 표적 분자가 정상 세포상에서의 이의 발현과 비교하여 표적 세포상에서 10배 이상 과발현됨을 특징으로 하는 키트.

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