KR20070069140A - ＴＮＦＲ-Ｉｇ 융합 단백질의 제조 - Google Patents

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KR20070069140A
KR20070069140A KR1020077004810A KR20077004810A KR20070069140A KR 20070069140 A KR20070069140 A KR 20070069140A KR 1020077004810 A KR1020077004810 A KR 1020077004810A KR 20077004810 A KR20077004810 A KR 20077004810A KR 20070069140 A KR20070069140 A KR 20070069140A
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Abstract

본 발명은 세포 배양물, 특히 i) 아미노산 누적 농도가 약 70mM 초과이고; ii) 아스파라긴에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 2 미만이며; iii) 총 아미노산에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 0.2 미만이고; iv) 총 아미노산에 대한 무기 이온의 누적 몰비가 약 0.4 내지 1이며; v) 글루타민 및 아스파라긴 농도의 누적 합계 양이 약 16mM 내지 36mM인 특징 중 하나 이상을 특징으로 하는 배지에서 IgGI의 Fc 부분에 결합된 사람 (p75) 종양괴사인자 수용체(TNFR)의 세포외 리간드 결합 부분으로 이루어진 이량체 융합 단백질을 대량 생산하는 개량된 시스템에 관한 것이다. 이러한 시스템의 사용으로, 단백질 생산량을 높이고, 암모늄 및/또는 락테이트과 같은 바람직하지 않은 특정 인자의 축적을 감소시킬 수 있다. 또한, 배양물이 최대 세포 밀도의 약 20 내지 80%에 도달했을 때, 일반적으로 온도 감소 등의 온도 전이를 포함하는 배양 방법도 제공된다. 대안적으로 또는 부가적으로, 본 발명은 최고 밀도에 도달한 후, 배양물 중의 락테이트 및/또는 암모늄 농도를 감소시키는 방법을 제공한다.
세포 배양물, 폴리펩타이드 대량 생산, 배양 방법, 글루타민

Description

ＴＮＦＲ-Ｉｇ 융합 단백질의 제조{Production of TNFR-Ig fusion protein}
본 출원은 2004년 8월 27일에 출원된 미국 가출원 제60/605,397호(이의 전문이 본원에 참고인용됨)의 우선권을 주장한다.
단백질 및 폴리펩타이드는 치료제로서 더욱 더 중요시되고 있다. 대부분, 치료용 단백질과 폴리펩타이드는 목적하는 특정 단백질 또는 폴리펩타이드를 현저하게 다량으로 생산하도록 유전자조작되고(되거나) 선발된 세포로부터 세포 배양을 통해 생산한다. 세포 배양 조건의 조절 및 최적화는 단백질 및 폴리펩타이드의 상업적 생산의 성공에 절대적으로 중요하다.
세포 배양으로 생산되는 많은 단백질과 폴리펩타이드는 세포를 소정 시간 동안 배양한 뒤, 배양을 종결한 후 생산된 단백질 또는 폴리펩타이드를 분리하는 회분식 또는 유가 회분식 방법으로 제조된다. 생산된 단백질 또는 폴리펩타이드의 최종 함량 및 품질은 세포 배양 조건에 따라 극적으로 영향받을 수 있다. 예를 들어, 통상의 회분식 및 유가 회분식 배양 방법은 종종 대사 노폐물을 생산하며, 이것은 세포 증식, 생존성 및 당해 단백질 또는 폴리펩타이드의 생산 또는 안정성에 유해 영향을 미친다. 회분식 및 유가 회분식 배양 방법을 통한 단백질 및 폴리펩타이드 의 생산을 개선하려는 노력은 이루어졌지만 또 다른 개선의 여지가 남아 있다.
게다가, 세포, 특히 동물 세포 배양 시 사용되는 합성 배지(즉, 혈청 또는 다른 동물 부산물이 없고 공지된 각 성분이 조합된 배지)의 개발에도 상당한 노력이 이루어졌다. 합성배지에서의 세포 증식 특성은 혈청 유래 배지에서와 대조적일 만큼 매우 다를 수 있다. 따라서, 특히 합성 배지에서 세포 배양을 통해 단백질 및 폴리펩타이드를 생산하기 위한 개선된 시스템의 개발의 여지가 남아 있다.
발명의 개요
본 발명은 세포 배양으로 단백질 및/또는 폴리펩타이드를 대량 생산하는 개선된 시스템을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 상업적 규모(예컨대, 500L 이상)의 배양 방법으로서, i) 단위 부피당 아미노산 누적 양이 약 70mM 초과이고; ii) 아스파라긴에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 2 미만이며; iii) 총 아미노산에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 0.2 미만이고; iv) 총 아미노산에 대한 무기 이온의 누적 몰비가 약 0.4 내지 1이며; v) 단위 부피당 글루타민 및 아스파라긴 농도의 누적 합계 양이 약 16mM 초과인 특징 중 하나 이상의 특징을 특징으로 하는 배지를 이용하는 배양 방법을 제공한다. 당업자라면, 앞에 사용된 "누적"이란 용어가 세포 배양 과정 동안 첨가된 특정 성분 또는 성분, 예컨대 배양 초기에 첨가된 성분 및 후속 첨가된 성분들의 총 함량을 의미한다는 것을 잘 알 것이다. 본 발명의 특정 바람직한 양태에 따르면, 시간이 경과함에 따라 배양물의 "추가공급(feed)"은 최소화하는 것이 바람직하고, 따라서 초기 제공되는 양을 최대화하는 것이 바람직하다. 물론, 배지 성분은 배양동안 대사되어, 배양물에 존재하는 소정 성분의 누적 양은 동일해도, 그 성분들이 다른 시기에 첨가되면(예컨대 초기에 모두 첨가되는 경우 와 추가공급을 통해 약간씩 첨가하는 경우), 절대 농도는 다를 것이다.
본 발명에 따르면, 그러한 배지의 사용으로, 단백질 생산 농도는 높이고, 암모늄 및/또는 락테이트과 같은 불필요한 특정 인자의 축적은 최소화할 수 있다.
당업자라면 본 발명의 배지 조성물이 합성 배지는 물론 비합성 배지도 포함한다는 것을 잘 알 것이다. 본 발명의 바람직한 특정 양태에 따르면, 배양 배지는 배지의 조성이 공지되어 있고 조절되는 합성 배지이다.
본 발명의 바람직한 특정 양태에 따르면, 배양 방법은 세포의 대사 전이(metabolic shift)가 달성되도록 제1 세트의 배양 조건에서부터 제2 세트의 배양 조건으로 배양물을 변화시키는 것을 포함한다. 일부 양태에 따르면, 이러한 변화는 배양물의 세포 밀도가 최대 세포 밀도의 약 20 내지 80%에 도달할 때 수행된다. 일부 양태에 따르면, 이러한 변화는 배양물이 유지되는 온도(또는 온도 범위)의 변화를 수반한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 본 발명은 배양물 중의 락테이트 및/또는 암모늄 농도가 피크에 도달한 후 시간이 경과함에 따라 감소하도록 조정된 방법을 제공한다. 다른 양태에 따르면, 대사 전이에는 pH, 삼투질 농도 또는 화학 유도제(예컨대, 알칸산 또는 이의 염)의 농도의 전이가 포함된다.
본 발명의 세포 배양물은 경우에 따라 영양소 및/또는 다른 배지 성분, 예컨대 호르몬 및/또는 다른 성장인자, 구체적으로 이온(예, 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액, 비타민, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이 드, 미량원소(보통 존재하는 최종 농도가 극미량인 무기 화합물), 아미노산, 지질, 또는 글루코스 또는 다른 에너지원이 보충되기도 한다. 본 발명의 특정 양태에 따르면, 배지에 화학 유도제, 예컨대 헥사메틸렌-비스(아세트아미드)("HMBA") 및 부티르산나트륨("NaB") 등을 보충하는 것이 유리한 경우도 있다. 이러한 선택적인 보충물은 배양 초기에 첨가하거나 또는 고갈된 양양소의 보충을 위해 또는 다른 이유로 인해 이후 시점에서 첨가할 수도 있다. 일반적으로, 본 발명에 따르면 보충이 최소화되도록 초기 배지 조성물을 선택하는 것이 바람직하다.
pH, 세포 밀도, 세포 생존성, 락테이트 농도, 암모늄 농도, 몰삼투압농도 또는 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질의 역가를 비롯한 다양한 배양 조건은 본 발명에 따라 모니터될 수 있다.
도 1은 항GDF-8 세포를 이용한 진탕 플라스크 배양에서 배지 1과 배지 2의 비교 결과를 도시한 것이다.
도 2는 배지 1에서 항GDF-8 세포의 세포 증식 및 생존성을 도시한 것이다.
도 3은 대조군 및 글루타민 추가공급 없는 배양 조건에서의 항GDF-8 세포 배양물의 세포 증식을 도시한 것이다.
도 4는 대조군 및 글루타민 추가공급 없는 배양 조건에서의 항GDF-8 세포 배양물의 세포 생존성을 도시한 것이다.
도 5는 대조군 및 글루타민 추가공급 없는 배양 조건에서의 항GDF-8 세포 배 양물의 암모늄 농도를 도시한 것이다.
도 6은 대조군 및 글루타민 추가공급 없는 배양 조건에서의 항GDF-8 세포 배양물의 락테이트 농도를 도시한 것이다.
도 7은 대조군 및 글루타민 추가공급 없는 배양 조건에서의 항GDF-8 역가를 도시한 것이다.
도 8은 대조군 및 글루타민 결핍 추가공급 배양 조건에서의 항GDF-8 세포 배양물의 세포 밀도를 도시한 것이다.
도 9는 대조군 및 글루타민 결핍 추가공급 배양 조건에서의 항GDF-8 세포 배양물의 세포 생존성을 도시한 것이다.
도 10은 대조군 및 글루타민 결핍 배양 조건에서의 항GDF-8 세포 배양물의 암모늄 농도를 도시한 것이다.
도 11은 대조군 및 글루타민 결핍 배양 조건에서의 항GDF-8 세포 배양물의 락테이트 농도를 도시한 것이다.
도 12는 대조군 및 글루타민 결핍 배양 조건에서의 항GDF-8 역가를 도시한 것이다.
도 13은 배지 1 및 배지 2에서 항GDF-8 세포의 철 용량 반응을 도시한 것이다.
도 14는 글루타메이트 및 글루타민 공급 배양물의 세포 밀도를 도시한 것이다.
도 15는 글루타메이트 및 글루타민 공급 배양물의 세포 생존성을 도시한 것 이다.
도 16은 글루타메이트 및 글루타민 공급 배양물의 항루이스 Y(anti-Lewis Y) 역가를 도시한 것이다.
도 17은 글루타메이트 및 글루타민 공급 배양물에서의 락테이트 농도를 도시한 것이다.
도 18은 글루타메이트 및 글루타민 공급 배양물에서의 암모늄 농도를 도시한 것이다.
도 19는 글루타메이트 및 글루타민 공급 배양물의 몰삼투압농도를 도시한 것이다.
도 20은 항루이스 Y 세포의 세포 밀도를 도시한 것이다. 각 플롯은 동일한 조건 하에 증식된 2개의 진탕 플라스크의 평균값이다.
도 21은 항루이스 Y 세포의 세포 생존성을 도시한 것이다. 각 플롯은 동일한 조건 하에 증식된 2개의 진탕 플라스크의 평균값이다.
도 22는 항루이스 Y 세포의 평균 역가를 도시한 것이다. 각 플롯은 동일한 조건 하에 증식된 2개의 진탕 플라스크의 평균값이다.
도 23은 항루이스 Y 세포의 암모늄 농도를 도시한 것이다. 각 플롯은 동일한 조건 하에 증식된 2개의 진탕 플라스크의 평균값이다.
도 24는 유가 회분식 배양에 사용된 임펠러 점프(impeller jump)를 도시한 것이다.
도 25는 다양한 실험 조건 하에서의 항GDF-8 세포의 세포 증식을 도시한 것 이다.
도 26은 다양한 실험 조건 하에서의 항GDF-8 세포의 생존성을 도시한 것이다.
도 27은 다양한 실험 조건 하에서의 항GDF-8 역가를 도시한 것이다.
도 28은 다양한 실험 조건 하에서의 항GDF-8 배양물의 락테이트 농도를 도시한 것이다.
도 29는 다양한 실험 조건 하에서의 항GDF-8 배양물의 암모늄 농도를 도시한 것이다.
도 30은 다양한 실험 조건 하에서의 항GDF-8 세포의 세포 증식을 도시한 것이다.
도 31은 다양한 실험 조건 하에서의 항GDF-8 역가를 도시한 것이다.
도 32는 다양한 실험 조건 하에서의 항GDF-8 배양물의 락테이트 농도를 도시한 것이다.
도 33은 다양한 실험 조건 하에서의 항GDF-8 배양물의 암모늄 농도를 도시한 것이다.
도 34는 다양한 농도의 글루타민 및 아스파라긴을 함유한 개량 배지 9에서의 항GDF-8 세포의 세포 증식을 도시한 것이다.
도 35는 다양한 농도의 글루타민 및 아스파라긴을 함유한 개량 배지 9에서의 항GDF-8 세포의 세포 생존성을 도시한 것이다.
도 36은 다양한 농도의 글루타민 및 아스파라긴을 함유한 개량 배지 9에서의 항GDF-8 배양물의 락테이트 농도를 도시한 것이다.
도 37는 다양한 농도의 글루타민 및 아스파라긴을 함유한 개량 배지 9에서의 항GDF-8 배양물의 암모늄 농도를 도시한 것이다.
도 38은 다양한 농도의 글루타민 및 아스파라긴을 함유한 개량 배지 9에서의 항GDF-8 배양물의 글루타민 농도를 도시한 것이다.
도 39는 다양한 농도의 글루타민 및 아스파라긴을 함유한 개량 배지 9에서의 항GDF-8 역가를 도시한 것이다.
도 40은 다양한 농도의 글루타민 및 아스파라긴을 함유한 개량 배지 9에서의 항GDF-8 배양물의 몰삼투압농도를 도시한 것이다.
도 41은 다양한 농도의 아스파라긴 및 시스테인 함유한 배지에서의 항GDF-8 세포의 세포 증식을 도시한 것이다.
도 42는 다양한 농도의 아스파라긴 및 시스테인을 함유한 배지에서의 항GDF-8 배양물의 락테이트 농도를 도시한 것이다.
도 43은 다양한 농도의 아스파라긴 및 시스테인을 함유한 배지에서의 항GDF-8 배양물의 암모늄 농도를 도시한 것이다.
도 44는 다양한 농도의 아스파라긴 및 시스테인을 함유한 배지에서의 항GDF-8 배양물의 글루타민 농도를 도시한 것이다.
도 45는 다양한 농도의 아스파라긴 및 시스테인을 함유한 배지에서의 항GDF-8 배양물의 글루타메이트 농도를 도시한 것이다.
도 46은 다양한 농도의 아스파라긴 및 시스테인을 함유한 배지에서의 항GDF- 8 역가를 도시한 것이다.
도 47은 다양한 농도의 아스파라긴 및 시스테인을 함유한 배지에서의 항GDF-8 배양물의 몰삼투압농도를 도시한 것이다.
도 48은 다양한 농도의 아미노산 및 비타민을 함유한 배지에서의 항GDF-8 세포의 세포 증식을 도시한 것이다.
도 49는 다양한 농도의 아미노산 및 비타민을 함유한 배지에서의 항GDF-8 배양물의 락테이트 농도를 도시한 것이다.
도 50은 다양한 농도의 아미노산 및 비타민을 함유한 배지에서의 항GDF-8 배양물의 암모늄 농도를 도시한 것이다.
도 51은 다양한 농도의 아미노산 및 비타민을 함유한 배지에서의 항GDF-8 배양물의 글루타민 농도를 도시한 것이다.
도 52는 다양한 농도의 아미노산 및 비타민을 함유한 배지에서의 항GDF-8 역가를 도시한 것이다.
도 53은 다양한 농도의 비타민, 미량원소 E 및 철을 함유한 배지에서의 항GDF-8 세포의 세포 증식을 도시한 것이다.
도 54는 다양한 농도의 비타민, 미량원소 E 및 철을 함유한 배지에서의 항GDF-8 배양물의 락테이트 농도를 도시한 것이다.
도 55는 다양한 농도의 비타민, 미량원소 E 및 철을 함유한 배지에서의 항GDF-8 배양물의 암모늄 농도를 도시한 것이다.
도 56은 다양한 농도의 비타민, 미량원소 E 및 철을 함유한 배지에서의 항 GDF-8 역가를 도시한 것이다.
도 57은 배지 1, 3 및 9에서의 항GDF-8 세포의 세포 증식을 도시한 것이다.
도 58은 배지 1, 3 및 9에서의 항GDF-8 역가를 도시한 것이다.
도 59는 다양한 농도의 글루타민 단독 및 총 글루타민과 아스파라긴 혼합물마다 외삽법으로 추정된 항GDF-8 역가를 도시한 것이다.
도 60은 검사된 다양한 배지 조건 하에서의 항ABeta 세포의 세포 증식을 도시한 것이다.
도 61은 검사된 다양한 배지 조건 하에서의 항ABeta 세포의 세포 생존성을 도시한 것이다.
도 62는 검사된 다양한 배지 조건 하에서의 항ABeta 배양물의 락테이트 농도를 도시한 것이다.
도 63은 검사된 다양한 배지 조건 하에서의 항ABeta 배양물의 암모늄 농도를 도시한 것이다.
도 64는 검사된 다양한 배지 조건에서의 항ABeta 역가를 도시한 것이다.
도 65는 검사된 다양한 배지 조건 하에서의 항ABeta 배양물의 몰삼투압농도를 도시한 것이다.
도 66은 다양한 실험 조건 하에서 TNFR-Ig을 발현하는 세포의 세포 증식을 도시한 것이다.
도 67은 다양한 실험 조건 하에서 TNFR-Ig을 발현하는 세포의 세포 생존성을 도시한 것이다.
도 68은 다양한 실험 조건 하에서 TNFR-Ig을 발현하는 세포 배양물에 존재하는 글루코스 잔류량을 도시한 것이다.
도 69는 다양한 실험 조건 하에서 TNFR-Ig을 발현하는 세포 배양물에 존재하는 글루타민 농도를 도시한 것이다.
도 70은 다양한 실험 조건 하에서 TNFR-Ig을 발현하는 세포 배양물에 존재하는 락테이트 농도를 도시한 것이다.
도 71은 다양한 실험 조건 하에서 TNFR-Ig을 발현하는 세포 배양물에 존재하는 암모늄 농도를 도시한 것이다.
도 72는 다양한 실험 조건 하에서의 TNFR-Ig 상대 역가를 도시한 것이다.
도 73은 6000L 및 1L 생물반응기에서 증식된 항GDF-8 세포의 역가를 도시한 것이다.
도 74는 6000L 및 1L 생물반응기에서 증식된 항GDF-8 세포의 역가를 도시한 것이다.
도 75는 6000L 및 1L 생물반응기에서 증식된 항GDF-8 세포의 락테이트 농도를 도시한 것이다.
도 76은 6000L 및 1L 생물반응기에서 증식된 항GDF-8 세포의 암모늄 농도를 도시한 것이다.
정의
"약", "대략": 본 명세서에 사용된 "약" 및 "대략"이란 용어는 1 이상의 특정 세포 배양 조건에 사용된 경우에는 그 배양 조건 또는 조건들에 대해서 기술된 참고 수치와 유사한 수치 범위를 의미한다. 특정 양태에 따르면, "약"이란 용어는 그 배양 조건 또는 조건들에 대해서 기술된 참조 수치의 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 또는 그 미만 안에 속하는 수치 범위를 의미한다.
"아미노산": 본 명세서에 사용된 "아미노산"이란 용어는 폴리펩타이드의 형성에 일반적으로 사용되는 20개의 천연 아미노산 중 임의의 아미노산, 또는 이러한 아미노산의 유사체 또는 유도체를 의미한다. 본 발명의 아미노산은 세포 배양을 위해 배지에 제공된다. 배지에 제공된 아미노산은 염 형태 또는 수화물 형태로 제공될 수 있다.
"항체": 본 명세서에 사용된 "항체"란 용어는 면역글로불린 분자 또는 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부, 예컨대 Fab 또는 F(ab')2 단편을 의미하는 것으로서, 이것은 항원에 특이적으로 결합(면역반응)하는 하나 이상의 항원 결합 부위를 함유한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "모노클로날 항체" 및 "모노클로날 항체 조성물"이란 용어는 항원의 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위 1종만을 함유하는 항체 분자의 클론 집단을 의미하는 반면, "폴리클로날 항체" 및 "폴리클로날 항체 조성물"이란 용어는 특정 항원과 상호작용할 수 있는 항원 결합 부위 다수 종을 함유하는 항체 분자 집단을 의미한다. 모노클로날 항체의 정의에는 통상의 기술을 통해 유도된 클론 분자는 물론 특정 잔기의 조작 또는 돌연변이를 통해 유도된 합성 서열의 분자, 예컨대 사람화된 항체가 포함된다.
"회분식 배양": 본 명세서에 사용된 "회분식 배양"이란 용어는 세포 배양에 궁극적으로 사용되는 모든 성분, 예컨대 배지(이하, "배지" 정의 참조)뿐만 아니라 세포 그 자체를 배양 과정 초기에 제공하는 세포 배양 방법을 의미한다. 회분식 배양은 일반적으로 어떤 시점에서 정지되고, 배지의 세포 및/또는 성분이 수거되어 경우에 따라 정제된다.
"생물반응기": 본 명세서에 사용된 "생물반응기"란 용어는 포유동물 세포 배양물의 증식에 사용되는 임의의 용기를 의미한다. 생물반응기의 크기는 포유동물 세포의 배양에 유용하기만 하다면 임의의 크기일 수 있다. 일반적으로, 생물반응기는 적어도 1리터일 수 있고, 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 120,000 리터 또는 그 이상, 또는 언급된 수치 사이의 임의의 부피인 경우도 있다. 생물반응기의 내부 조건, 예컨대 pH 및 온도(이에 국한되지 않는다) 등은 배양 기간 동안 일반적으로 조절된다. 생물반응기는 본 발명의 배양 조건 하에서 배지에 현탁된 포유동물 세포 배양물을 수용하기에 적합한 임의의 재료, 예컨대 유리, 플라스틱 또는 금속으로 제조된 것일 수 잇다. 본 명세서에 사용된 "생산용 생물반응기"란 용어는 대상 폴리펩타이드 또는 단백질의 생산에 사용되는 최종 생물반응기를 의미한다. 대량 세포 배양 생산용 생물반응기의 부피는 일반적으로 적어도 500리터이고, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,000리터 또는 그 이상, 또는 각 수치 사이의 임의의 부피인 경우도 있다. 당업자라면, 본 발명의 실시에 사용하기에 적합한 생물반응기를 쉽게 알 수 있고 선택할 수 있을 것이다.
"세포 밀도": 본 명세서에 사용된 "세포 밀도"란 용어는 소정 부피의 배지에 존재하는 세포의 수를 의미한다.
"세포 생존성": 본 명세서에 사용된 바와 같이 "세포 생존성"이란 용어는 소정 배양 조건 세트 또는 실험 변동 하에 세포물의 세포가 생존하는 능력을 의미한다. 본 명세서에 사용되었듯이 이 용어는 특정 시점에서 배양물에 생존 및 사멸된 세포의 총 수에 대한 그 특정 시점에서의 생존 세포의 부도 의미한다.
"배양물", "세포 배양물" 및 "포유동물 세포 배양물": 본 명세서에 사용되었듯이 이 용어들은 세포 집단의 생존 및/또는 증식에 적합한 조건 하에서 배지(이하 "배지" 정의 참조)에 현탁된 포유동물 세포 집단을 의미한다. 당업자에게 분명하듯이 본 명세서에 사용된 바와 같이 상기 용어들은 포유동물 세포 집단과 이 집단이 현탁된 배지를 함유하는 혼합물을 의미하기도 한다.
"유가 회분식 배양": 본 명세서에 사용된 바와 같이 "유가 회분식 배양"이란 용어는 배양 과정의 초기 이후에 임의의 시점에서 배양물에 추가 성분이 제공되는 세포 배양 방법을 의미한다. 제공되는 성분은 일반적으로 배양 과정 동안 고갈된 세포의 영양 보충물을 포함한다. 유가 회분식 배양은 일반적으로 어느 시점에서 정지되고 배지의 세포 및/또는 성분은 수거되어 경우에 따라 정제된다.
"단편": 본 명세서에 사용된 바와 같이 "단편"이란 용어는 폴리펩타이드를 의미하며, 그 폴리펩타이드에 고유하거나 특징적인 소정 폴리펩타이드의 임의의 분리된 부분으로 정의된다. 또한, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이 용어는 전장 폴리펩타이드의 활성 중 적어도 일부를 보유하는 소정 폴리펩타이드의 임의의 분리된 부분을 의미한다. 보유된 활성의 일부는 전장 폴리펩타이드 활성의 적어도 10%인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 보유된 활성의 일부가 전장 폴리펩타이드 활 성의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%인 것이다. 더욱 바람직하게는, 보유된 활성 일부가 전장 폴리펩타이드 활성의 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 것이다. 가장 바람직하게는 보유된 활성 일부가 전장 폴리펩타이드 활성의 100%인 것이다. 본 명세서에 사용되었듯이, 이 용어는 전장 폴리펩타이드에서 발견되는 확립된 서열 부재를 최소한 함유하는 소정 폴리펩타이드의 임의의 일부를 의미한다. 이 서열부재는 전장 폴리펩타이드의 적어도 4 내지 5개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 이상의 아미노산에 해당하는 것이 바람직하다.
"유전자": 본 명세서에 사용된 바와 같이, "유전자"란 용어는 세포 대사 또는 발달의 일부 측면에서 작용하는 독립된 최종 산물, 일반적으로 폴리펩타이드(이에 국한되지 않는다)를 암호화하는 임의의 뉴클레오타이드, DNA 또는 RNA, 이의 적어도 일부를 의미한다. 이 용어는 폴리펩타이드 또는 다른 독립된 최종 산물을 암호화하는 암호화 서열만을 의미하는 것은 아니며, 각 암호화 분절("엑손") 사이의 게재 서열("인트론")뿐만 아니라 기본적인 발현 수준을 조절하는 암호화 서열 전후의 영역을 포함할 수도 있다.
"유전자 조절 인자": 본 명세서에 사용된 바와 같은 "유전자 조절 인자"는 작동가능하게 결합된 유전자의 발현을 조절하는 임의의 서열 인자를 의미한다. 유전자 조절 인자는 발현 수준을 증가 또는 감소시켜 작용할 수 있고, 암호화 서열 이전, 그 안에 또는 그 이후에 위치할 수 있다. 유전자 조절 인자는 전사의 개시, 신장 또는 종결, mRNA 스플라이싱, mRNA 편집, mRNA 안정성, 세포 내부에 mRNA 국 재화, 해독 개시, 신장 또는 종결 또는 다른 유전자 발현의 임의의 단계 등을 조절하여 임의의 유전자 발현 단계에 작용할 수 있다. 유전자 조절 인자는 각각 작용하거나 함께 작용할 수 있다.
"하이브리도마": 본 명세서에 사용된 바와 같이, "하이브리도마"란 용어는 면역원 유래 무한증식성 세포와 항체 생산 세포의 융합을 통해 창조된 세포를 의미한다. 그 결과 수득되는 하이브리도마는 항체를 생산하는 무한증식성 세포이다. 하이브리도마 창조에 사용된 각 세포는 임의의 포유동물원에서 유래될 수 있으며, 그 예로는 래트, 돼지, 토끼, 양, 돼지, 염소 및 사람이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 이 용어는 사람 세포와 쥐 골수종 세포주 사이의 융합 산물인 헤테로하이브리드 골수종 융합체 자손을 이어서 혈장 세포와 융합시킬 때 생성되는 트리오마(trioma) 세포주도 포함한다. 더욱이, 이 용어는 쿼드로마(quadroma)와 같은 항체를 생산하는 임의의 무한증식성 하이브리드 세포도 포함하기도 한다(예, Milstein et al., Nature, 537: 3053(1983)).
"적분 생존 세포 밀도": 본 명세서에 사용된 바와 같이, "적분 생존 세포 밀도"란 배양이 진행된 시간의 양을 곱한 배양 과정 동안의 생존 세포 평균 밀도를 의미한다. 생산된 폴리펩타이드 및/또는 단백질의 양이 배양 과정 동안 존재하는 생존 세포의 수에 비례한다고 가정하면, 적분 생존 세포 밀도는 배양 과정 동안에 생산되는 폴리펩타이드 및/또는 단백질의 양을 추정하는데 유용한 도구이다.
"배지", "세포 배양 배지", "배양 배지": 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이용어들은 증식성 포유동물 세포에 영영을 공급하는 영양소 함유 용액을 의미한다. 이러한 용액은 일반적으로 세포가 최소 증식 및/또는 생존하는데 필요한 필수 및 비필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 지질 및 미량원소를 제공한다. 또한, 이 용액은 호르몬 및 성장 인자를 비롯하여, 증식 및/또는 생존을 최소 속도 이상으로 증강시키는 성분을 추가로 함유할 수도 있다. 이 용액은 세포 생존 및 증식에 최적인 pH 및 염 농도로 제조되는 것이 바람직하다. 또한, 배지는 "합성 배지", 즉 미지 조성물의 성분, 단백질, 또는 가수분해물이 전혀 없는 무혈청 배지일 수 있다. 합성 배지는 동물 유래의 성분이 없고, 모든 성분이 공지된 화학적 구조를 가진 성분이다.
"대사 노폐물": 본 명세서에 사용된 바와 같이 "대사 노폐물"이란 용어는 세포 배양물에 어느 정도 유해한, 특히 목적한 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 발현 또는 활성에 비해 유해한 정상 또는 비정상 대사 과정의 결과로서 세포 배양에 의해 생산된 화합물을 의미한다. 예를 들어, 대사 노폐물은 세포 배양물의 증식 또는 생존성에 유해하거나, 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 생산 양을 감소시키거나, 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질의 폴딩, 안정성, 당화 또는 다른 해독후 변형을 변경시키거나, 또는 임의의 수의 다른 방식으로 세포 및/또는 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 발현 또는 활성에 유해할 수 있다. 대사 노폐물의 예에는 글루코스 대사의 결과로서 생산되는 락테이트 및 글루타민 대사의 결과로서 생산되는 암모늄이 있다. 본 발명의 목표 중 하나는 포유동물 세포 배양물에서 대사 노폐물의 생산을 지연시키거나 감소 또는 심지어 제거하는 것이다.
"몰삼투압농도(osmolarity)" 및 "삼투질 농도(osmolality)": "삼투질 농도" 는 수용액에 용해된 용질 입자의 삼투압 척도이다. 용질 입자는 이온 및 비이온 분자를 모두 포함한다. 삼투질 농도는 용액 1kg에 용해된 삼투압 활성 입자의 농도(즉, 오스몰)로 나타낸다(38℃에서의 1mOsm/kg H2O는 19mmHg 삼투압에 해당한다). 이에 반해, "몰삼투압 농도"는 용액 1리터에 용해된 용질 입자의 수를 의미한다. 본 명세서에 사용된, "mOsm"이란 약어는 "밀리오스몰/kg 용액"을 의미한다.
"관류 배양": 본 명세서에 사용된 바와 같이 "관류 배양"이란 용어는 배양 과정 초기 이후에 추가 성분이 연속 또는 반연속적으로 제공되는 세포 배양 방법을 의미한다. 제공되는 성분은 일반적으로 배양 과정 동안 고갈된 세포의 영양 보충물을 포함한다. 배지에 존재하는 세포 및/또는 성분의 일부는 일반적으로 연속 또는 반연속식으로 수거되고 경우에 따라 정제된다.
"폴리펩타이드": 본 명세서에 사용된 바와 같이 "폴리펩타이드"란 용어는 펩타이드 결합을 통해 함께 결합된 아미노산의 연속 사슬을 의미한다. 이 용어는 임의의 길이의 아미노산 사슬을 나타내는데 사용되지만, 당업자라면 이 용어가 긴 사슬에 국한되지 않고 펩타이드 결합을 통해 함께 결합된 2개의 아미노산을 함유하는 최소 사슬을 의미할 수도 있음을 잘 알 것이다.
"단백질": 본 명세서에 사용된 바와 같이 "단백질"이란 용어는 독립된 단위로서 작용하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 의미한다. 하나의 폴리펩타이드가 독립된 작용 단위이고, 독립된 작용 단위를 형성하기 위하여 다른 폴리펩타이드와 영구적인 물리적 결합을 필요로 한다면, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "폴리펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 서로 바꾸어 사용될 수 있다. 독립된 작용 단위가 서로 물 리적 결합을 이룬 하나 이상의 폴리펩타이드로 구성된 경우에는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, "단백질"이란 용어는 물리적으로 커플링되어 독립된 단위로서 함께 작용하는 복수의 폴리펩타이드를 의미하는 것이다.
"재조합 발현 폴리펩타이드" 및 "재조합 폴리펩타이드": 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이 용어들은 그 폴리펩타이드를 발현하도록 유전자 조작된 포유동물 숙주 세포에서 발현된 폴리펩타이드를 의미한다. 재조합 발현 폴리펩타이드는 포유동물 숙주 세포에서 정상 발현되는 폴리펩타이드와 동일하거나 유사한 것일 수 있다. 또한, 재조합 발현 폴리펩타이드는 숙주 세포에 대해 외인성인, 즉 포유동물 숙주 세포에서 정상 발현되는 펩타이드와 이종성인 것일 수 있다. 또는, 재조합 발현 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 일부는 포유동물 숙주 세포에서 정상 발현되는 폴리펩타이드와 동일하거나 유사한 반면, 다른 일부는 숙주 세포에 대해 외인성인 아미노산 서열을 함유한다는 점에서 키메라성(chimeric)일 수 있다.
"씨딩": 본 명세서에 사용된 바와 같이 "씨딩"이란 용어는 세포 배양물을 생물반응기 또는 다른 용기로 제공하는 과정을 의미한다. 이 때, 세포는 다른 생물반응기 또는 용기에서 사전에 전파된 것일 수 있다. 또는, 세포는 동결되어 있어서, 생물반응기 또는 용기에 제공하기 직전 해동된 것일 수 있다. 이 용어는 단세포뿐만 아니라 임의의 수의 세포를 의미한다.
"역가": 본 명세서에 사용된 바와 같이 "역가"란 용어는 포유동물 세포 배양물에 의해 생산된 재조합 발현 폴리펩타이드 또는 단백질의 총 함량을 제공된 양의 배지 부피로 나눈 값을 의미한다. 역가는 일반적으로 배지 1ml당 폴리펩타이드 또 는 단백질 mg 단위로 표현된다.
본 발명은 세포 배양에 의해 단백질 및/또는 폴리펩타이드를 생산하는 개량된 시스템을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 세포 증식, 생존성 및/또는 단백질 생산 또는 품질에 유해한 1종 이상의 대사 산물의 생산을 최소화하는 시스템을 제공한다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 세포 배양은 회분식 또는 유가 회분식 배양이다. 다른 바람직한 특정 양태의 본 발명은 이하에 상세히 논한다. 하지만, 이러한 바람직한 양태의 다양한 변형이 첨부되는 청구의 범위 안에 포함된다는 것도 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 즉, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 청구의 범위 및 이의 등가물이지, 이하 바람직한 특정 양태의 설명이 아니며 이로 한정되어서도 아니 된다.
폴리펩타이드
숙주 세포에서 발현될 수 있는 임의의 폴리펩타이드는 본 발명에 따라 생산될 수 있다. 폴리펩타이드는 숙주 세포에 내인성인 유전자로부터 발현되거나, 또는 유전자 조작을 통해 숙주 세포로 도입된 유전자로부터 발현될 수도 있다. 이러한 폴리펩타이드는 천연의 폴리펩타이드이거나 또는 인위적으로 조작되거나 선발된 서열을 보유할 수도 있다. 조작된 폴리펩타이드는 각각 천연의 다른 폴리펩타이드 분절들로부터 조립되거나 또는 천연이 아닌 분절 하나 이상을 함유할 수도 있다.
본 발명에 따라 바람직하게 발현될 수 있는 폴리펩타이드는 종종 당해의 생물학적 또는 화학적 활성에 기초하여 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 임의의 약학적 또는 상업적 관련 효소, 수용체, 항체, 호르몬, 조절 인자, 항원, 결합 인자 등의 발현에 이용될 수 있다.
항체
약제 또는 다른 상업적 제제로서 현재 사용중이거나 연구 중인 다수의 항체가 있다면, 항체 생산은 본 발명에 따라 특히 유용하게 사용되는 것이다. 항체는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 능력이 있는 단백질이다. 숙주 세포에서 발현될 수 있는 임의의 항체는 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 바람직한 양태에 따르면 발현될 항체는 모노클로날 항체이다.
다른 바람직한 양태에 따르면, 모노클로날 항체는 키메라 항체이다. 키메라 항체는 하나 이상의 유기체 유래의 아미노산 단편을 함유한다. 키메라 항체 분자는 예컨대 마우스, 래트 또는 다른 종의 항체에서 유래하는 항원 결합 도메인과 사람 불변 영역을 함유할 수 있다. 키메라 항체를 제조하는 다양한 시도는 게시된 바 있다[예컨대, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851 (1985); Takeda et al, Nature 314, 452 (1985), Cabilly et al, 미국특허번호 4,816,567; Boss et al, 미국특허번호 4,816,397; Tanaguchi et al, 유럽특허공보 EP171496; 유럽특허공보 0173494, 영국특허 GB 2177096B 참조].
다른 바람직한 양태에 따르면, 모노클로날 항체는, 예컨대 리보솜 디스플레이 또는 파지 디스플레이 라이브러리(예컨대, Winter et al, 미국 특허 6,291,159 및 Kawasaki, 미국 특허 5,658,754 참조)의 사용 또는 고유 항체 유전자는 실활시키거나 사람 항체 유전자로 기능적 치환시키면서 고유 면역계의 다른 성분은 본래 상태로 유지시킨 이종이식체 종의 사용(예컨대, Kucherlapati et al, 미국 특허 6,657,103 참조)을 통해 유도된 사람 항체이다.
다른 바람직한 양태에 따르면, 모노클로날 항체는 사람화된 항체이다. 사람화된 항체는 대부분의 아미노산 잔기가 사람 항체에서 유래되어, 사람 검체에게 전달될 때 임의의 잠재적인 면역 반응을 최소화하는 키메라 항체이다. 사람화된 항체에서, 상보성 결정 영역의 아미노산 잔기는 적어도 부분적으로 원하는 항원 특이성 또는 친화성을 부여하는 사람을 제외한 종 유래의 잔기로 치환된다. 이와 같이 변화된 면역글로불린 분자는 당업계에 공지된 임의의 여러 기술로 제조할 수 있고(예, Teng et al, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 80, 7308-7312 (1983); Kozbor et al, Immunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson et al, Meth. Enzymol, 92, 3-16 (1982) 참조), 바람직하게는 PCT 공개번호 WO92/06193 또는 EO 0239400의 교시에 따라 제조하는 것이 좋다(모든 문헌은 본 발명에 모두 참고인용된 것임). 사람화된 항체는 예컨대, 스코트젠 리미티드(영국 미들섹스 트위켄햄 홀리 로드 2 소재) 등에서 시판되는 것일 수 있다. 추가 참고자료로서, 문헌[Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조할 수 있으며, 이들 모두 본 발명에 참고인용된 문헌이다.
또 다른 바람직한 양태에 따르면, 전술한 모노클로날, 키메라 또는 사람화된 항체는 천연의 임의의 종에서 임의의 항체 중에 천연에 존재하지 않는 아미노산 잔기를 함유할 수도 있다. 이러한 외인성 잔기는, 예를 들어 상기 모노클로날, 키메라 또는 사람화된 항체에 신규 또는 변형된 특이성, 친화성 또는 작동인자(effector) 기능을 부여하기 위해 활용될 수 있다. 다른 바람직한 양태에 따르면, 전술한 항체는 전신 약물요법용 약물, 예컨대 독소, 저분자량 세포독성 약물, 생물 반응 개량제 및 방사성핵종에 접합될 수 있다(예, Kunz et al., Calicheamicin derivative-carrier conjugates, US20040082764 A1).
일 양태에 따르면, 항체는 아밀로이드 전구체 단백질의 Aβ 단편 또는 아밀로이드판의 다른 성분에 특이적으로 결합하는 항체이며, 알쯔하이머병에 특징적인 뇌에 아밀로이드판의 축적을 제거하는데 유용하다(예컨대, 미국 가특허출원 60/636,684 참조).
다른 양태에 따르면, 본 발명의 항체는 암과 같은 증식성 장애의 표적 세포 및/또는 조직에서 발현되는 세포 표면 항원에 대한 것이다. 일 양태에 따르면, 항체는 IgG1 항루이스 Y 항체이다. 루이스 Y는 구조 Fucα1→ 2Galβ1→4[Fucα1→3]GlcNacβ1→3R로 표시되는 탄수화물 항원이다(Abe et al.(1983) J.Biol.Chem., 258 11793-11797). 루이스 Y 항원은 사람 상피 종양(예컨대, 유방, 결장, 폐 및 전립선 종양)의 60 내지 90% 표면에서 발현되고, 이 중 적어도 40%는 상기 항원을 과잉발현하며 정상 조직에서는 발현이 제한적이다.
이상적으로, Ley를 표적화하고 종양을 효과적으로 표적화 하는데 필요한 것은 항원에 대해 독점적인 특이성이 있는 항체이다. 즉, 본 발명의 항루이스 Y 항체는 타입 1 구조(즉, 혈액 그룹의 락토류(Lea 및 Leb)와 교차반응하지 않는 것이 바람직하고, Lex 및 H 타입 2 구조와 같은 다른 타입 2 에피토프(즉, 신락토 구조)에 결합하지 않는 것이 바람직하다. 바람직한 항루이스 Y 항체의 일 예는 hu3S193(미국 특허, 6,310,185; 6,518,415; 5,874,060, 전문이 참고인용됨)이다. 사람화된 항체 hu3S193(Attia, M.A., et al. 1787-1800)은 Ley에 대해 특별한 특이성이 있는 샘암종 세포에 대하여 유발된 쥐 모노클로날 항체인 3S193으로부터 CDR 접목을 통해 수득되었다. Hu3S193은 Ley에 대한 3S193의 특이성을 보유할 뿐만 아니라 보체 의존적 세포독성(이하, CDC라 한다) 및 항체 의존적 세포 세포독성(이하, ADCC라 한다)을 매개하는 능력을 통해 수득되었다(Attia, M.A., et al. 1787-1800). 이 항체는 125I, 111In 또는 18F 뿐만 아니라 킬레이트제를 필요로 하는 다른 방사성표지, 예컨대 111In, 99mTc 또는 90Y로 표지된 hu3S193을 이용한 생물분포 연구에서 확인되는 바와 같이 누드 마우스에서 이종이식체를 발현하는 Ley를 표적으로 한다(Clark, et al., 4804-4811).
다른 양태에 따르면, 항체는 Myo29, Myo28 및 Myo22라는 사람 항GDF-8 항체 중, 및 이들 유래의 항체 및 항원 결합 단편 중 하나이다. 이러한 항체들은 성숙 GDF-8과 고친화도로 결합하고, 예컨대 ActRIIB 결합 억제 및 리포터 유전자 분석법을 통해 확인되는 바와 같이 시험관내 및 생체내 GDF-8 활성을 억제하며, 골격근 질량 및 골밀도의 억제 조절과 관련 있는 GDF-8 활성을 억제할 수 있다(예컨대, Veldman, et al., 미국 특허 출원 20040142382 참조).
수용체
약제 및/또는 상업적 제제로서 효과적으로 밝혀진 다른 폴리펩타이드 군으로는 수용체가 있다. 수용체는 일반적으로 세포외 시그널링 리간드를 인식하여 작용하는 경막 당단백질이다. 수용체는 일반적으로 리간드 인식 도메인외에 단백질 키나제 도메인을 보유하여, 리간드 결합 시 표적 세포내 분자를 인산화하여 시그널링 경로를 개시시키고, 이로써 세포내 발달 또는 대사 변화를 유도한다. 일 양태에 따르면, 당해의 수용체는 경막 및/또는 세포내 도메인을 제거하도록 변형되고, 그 위치에 경우에 따라 Ig 도메인이 부착될 수 있다. 바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 따라 생산되는 수용체는 수용체 티로신 키나제(RTK)이다. RTK 군에는 수많은 세포 종류의 다양한 기능에 중요한 수용체가 포함된다(예, Yarden and Ullrich, Ann.Rev.Biochem., 57: 433-478, 1988; Ullrich and Schlessinger, Cell 61: 243-254, 1990, 본원에 참고인용됨). RTK의 비제한적 예에는 섬유아세포 성장인자(FGF) 수용체 군의 구성원, 상피성장인자 수용체(EGF) 군의 구성원, 혈소판 유래 성장인자(PDGF) 수용체, 면역글로불린 보유 티로신 키나제 및 EGF 상동성 도메인-1(TIE-1) 및 TIE-2 수용체(Sato et al., Nature 376(6535): 70-74(1995), 본원에 참고인용됨) 및 c-Met 수용체가 있으며, 이 중 일부는 혈관형성(angiogenesis)을 직접 또는 간접적으로 촉진하는 것으로 제안된 바 있다(Mustonen and Alitalo, J.Cell Biol. 129: 895-898, 1995). 다른 RTK의 비제한적 예에는 태아 간 키나제 1(FLK-1)(때로 키나제 삽입 도메인 함유 수용체(KDR)(Terman et al., Oncogene 6:1677-83, 1991) 또는 혈관내피세포 성장인자 수용체 2(VEGFR-2)라고도 불림), fms 유사 티로신 키나제-1(Flt-1)(DeVries et al. Science 255; 989-991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5: 519-524, 1990)(때로, 혈관 내피세포 성장인자 수용체 1(VEGFR-1)이라고도 불림), 뉴로필린-1, 엔도글린, 엔도시알린 및 Axl 이 있다. 당업자라면, 본 발명에 따라 바람직하게 발현될 수 있는 다른 수용체를 쉽게 인식할 수 있을 것이다.
특히 바람직한 양태에 따르면, 종양 괴사 인자 알파 및 베타 수용체 형태의 종양 괴사 인자 억제제(TNFR-1; EP 417,563, 1991.3.20 공개; TNFR-2, EP417,014, 1991.3.20 공개)는 본 발명에 따라 발현된다(검토를 위해 본원에 참고인용된 Naismith and Sprang, J Inflamm. 47(1-2): 1-7(1995-96) 참조). 일 양태에 따르면, 종양 괴사 인자 억제제는 가용성 TNF 수용체 및 바람직하게는 TNFR-Ig을 함유한다. 일 양태에 따르면, 본 발명의 바람직한 TNF 억제제는 TNFRI 및 TNFRII의 가용성 형태 뿐만 아니라 가용성 TNF 결합 단백질이고, 다른 양태에 따르면 TNFR-Ig 융합체는 본 명세서에 사용된 바와 같이 "이태너셉트(etanercept)"를 의미하는 용어인 TNFR:Fc이며, 이것은 사람 IgG1의 235개 아미노산 Fc 부로 각각 이루어진 분자인 p75 TNF-α 수용체의 세포외 부분의 2분자로 이루어진 이량체이다.
성장인자 및 다른 시그널링 분자
약제 및/또는 상업적 제제로서 효과적인 것으로 밝혀져 있는 다른 폴리펩타이드 군에는 성장인자 및 다른 시그널링 분자가 있다. 성장인자는 일반적으로 세포에 의해 분비되어, 다른 세포 상의 수용체에 결합하여 활성화시키고, 수용체 세포의 대사 또는 발달 변화를 개시시키는 당단백질이다. 일 양태에 따르면, 당해의 단백질은 ActRIIB 수용체의 세포외 도메인과 항체의 Fc 부를 함유하는 ActRIIB 융합 폴리펩타이드이다(예컨대, Wolfman, et al., ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor. US2004/0223966 A1 참조). 다른 양태에 따르면, 성장인자는 변형된 GDF-8 폴리펩타이드일 수 있다(예컨대, Wolfman, et al., Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof, US 2003/0104406 A1). 또는, 당해의 단백질은 홀리스타틴(follistatin) 도메인 함유 단백질일 수 있다(예컨대, Hill, et al., GASP1: a follistatin domain containing protein, US20030162714 A1, Hill et al., Follistatin domain containing proteins, US 2003/0180306 A1).
포유동물 성장인자 및 다른 시그널링 분자의 비제한적 예에는 사이토킨; 표피 성장인자(EGF); 혈소판 유래 성장인자(PDGF); 섬유아세포 성장인자(FGF), 예컨대 aFGF 및 bFGF; 형질전환 성장인자(TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β, 예컨대 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5; 인슐린 유사 성장인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); 데스(1-3)-IGF-1(뇌 IGF-1), 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD-3, CD-4, CD-8 및 CD-19; 적혈구생성인자; 골유도 인자; 면역독소; 뼈 형태형성 단백질(BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자(CSF), 예컨대 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨(TL), 예, IL-1 내지 IL-10; 종양 괴사 인자(TNF) 알파 및 베타; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사실; 전구인슐린; 난포자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고인자, 예컨대 VIIIC 인자, IX 인자; 조직 인자 및 혈우병 인자; 항응고 인자, 예컨대 프로테인 C; 심방 나트륨이뇨인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성인자, 예컨대 유로키나제 또는 사람 소변 또는 조직별 플라스미노겐 활성인자(t-PA); 봄베신; 트롬빈, 조혈 성장인자; 엔케팔리나제; RANTES(regulated in activation normally T-cell expressed and secreted); 사람 대식세포 염증 단백질(MIP-1-알파); 뮬러관 억제 물질; 릴랙신 A 사슬; 릴랙신 B 사슬; 전구릴랙신; 마우스 고나도트로핀 관련 단백질; 신경친화 인자, 예컨대 뼈 유래 신경친화 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6) 또는 신경 성장인자, 예컨대 NGF-베타가 있다. 당업자라면, 본 발명에 따라 발현될 수 있는 다른 성장인자 또는 시그널링 분자도 쉽게 인식할 수 있을 것이다.
G-단백질 커플링된 수용체
약제 및/또는 상업적 제제로서 효과적인 것으로 밝혀진 다른 폴리펩타이드 군에는 성장 인자 및 다른 시그널링 분자가 있다. G-단백질 커플링된 수용체(GPCR)는 7개의 경막 도메인을 갖는 단백질이다. GPCR에 리간드의 결합 시, 시그널이 세포 내에 형질도입되어, 세포의 생물학적 또는 생리학적 성질에 변화를 초래한다.
GPCR은 G-단백질 및 작동인자(G-단백질에 의해 조절되는 세포내 효소 및 채널)와 함께, 세포내 제2 메신저의 상태를 세포외 유입물에 연결하는 모듈형 시그널링 시스템 성분이다. 이러한 유전자 및 유전자 산물은 질병의 잠재적인 원인 인자이다.
로돕신 유전자 및 V2 바소프레신 수용체 유전자의 특정 결함은 다양한 형태의 상염색체 우성 및 상염색체 열성 색소성 망막염, 신성 요붕증을 유발하는 것으로 밝혀져 있다. 이러한 수용체는 중추신경계는 물론 말초신경의 생리적 과정에 중대한 중요성이 있다. GPCR 단백질 상과(superfamily)는 현재, 다른 종 유래의 동일 수용체인 오르토로그(orthologue)와 대조적으로, 유전자 중복(또는 다른 과정)에 의해 발생된 변형체를 나타내는 수용체인 파라로그(paralogue)를 250 종류 이상 함유한다. 상과는 다음과 같은 5가지 과로 나뉘어질 수 있다: I과, 로돕신 및 베타2-아드레날린성 수용체가 대표적이며, 현재 고유 구성원이 200개 이상인 수용체; II과, 최근 특성규명된 파라티로이드 호르몬/칼시토닌/세크레틴 수용체 과; III과, 포유동물의 대사성 글루타메이트 수용체 과; IV과, D.디스코이듐의 주화성 및 발달에 중요한 cAMP 수용체 과; 및 V과, STE2와 같은 진균 교배 페로몬 수용체.
GPCR에는 생물기원 아민의 수용체, 염증의 지질 매개인자의 수용체, 펩티드 호르몬 수용체 및 감각 시그널 매개인자 수용체가 있다. GPCR은 그 수용체가 이의 세포외 리간드에 결합할 때 활성화된다. 리간드-수용체 상호작용에 의한 GPCR의 형태 변화는 GPCR 세포내 도메인에 대한 G 단백질의 결합 친화성에 영향을 미친다. 이것은 GTP가 증강된 친화성으로 G 단백질에 결합할 수 있게 한다.
GTP에 의해 G 단백질의 활성화는 G 단백질 α 서브유닛과 아데닐레이트 사이클라제 또는 다른 제2 메신저 분자 생성인자와의 상호작용을 유도한다. 이러한 상호작용은 아데닐레이트 사이클라제의 활성을 조절하고, 이로써 제2 메신저 분자, cAMP의 생산을 조절한다. cAMP는 다른 세포내 단백질의 인산화 및 활성화를 조절한다. 또는, 다른 제2 메신저 분자, 예컨대 cGMP 또는 에이코시노이드(eicosinoid)의 세포내 농도는 GPCR의 활성에 의해 상승조절 또는 억제조절될 수 있다. G 단백질 α 서브유닛은 GTP의 GTPase에 의한 가수분해에 의해 실활되고, α, β 및 γ 서브유닛이 재결합한다. 그 다음, 이러한 이종삼량체 G 단백질은 아데닐레이트 사이클라제 또는 다른 제2 메신저 분자 생성인자로부터 해리된다. GPCR의 활성은 또한 세포내 및 세포외 도메인 또는 루프의 인산화에 의해 조절되기도 한다.
글루타메이트 수용체는 신경전달에 중요한 GPCR 그룹을 형성한다. 글루타메이트는 CNS의 주요 신경전달인자이며 신경세포의 가소성, 인식, 기억, 학습 및 일부 신경계 장애, 예컨대 간질, 발작 및 신경변성에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되고 있다(Watson, S. and S. Arkinstall(1994) The G-Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego, CA, p.130-132). 이러한 글루타메이트의 효과는 이온성 및 대사성이라는 2가지 다른 수용체 군에 의해 매개된다. 이온성 수용체는 고유의 양이온 채널을 함유하고, 글루타메이트의 고속 여기 작용을 매개한다. 대사성 수용체는 조절성이고, 칼슘 의존적 칼륨 전도성을 억제하여 신경세포의 말 여기성을 증가시키고, 이온성 수용체의 여기성 전달을 억제 및 증가시킨다. 대사성 수용체는 작동제(agonist) 약물학 및 시그널 도입 경로를 기초로 할 때, 5가지 서브타입으로 나뉘며, 뇌 조직에 널리 분포되어 있다.
혈관작용성 장 폴리펩타이드(VIP) 과는 또한 GPCR에 의해 작용이 매개되는 관련 폴리펩타이드 군이다. 이 과의 주요 구성원에는 VIP 자체, 세크레틴 및 성장호르몬 방출 인자(GRF)가 있다. VIP는 평활근의 이완, 다양한 조직에서의 분비 자극 또는 억제, 다양한 면역세포 활성 조절 및 CNS에서의 다양한 여기 및 억제 활성을 비롯한 다양한 프로필의 생리적 작용을 한다. 세크레틴은 췌장 및 소장에서 효소 및 이온의 분비를 자극하고, 뇌에 소량으로 존재하기도 한다. GRF는 뇌하수체 전엽으로부터 성장 호르몬의 합성 및 방출을 조절하는 중요한 신경내분비 인자이다(Watson, S. and S. Arkinstall 상기 문헌설명 참조, pp.278-283).
GPCR에 리간드 결합 후, 형태 변화는 G 단백질로 전달되어, α서브유닛이 결합된 GDP 분자 대신 GTP 분자를 취하여, βγ 서브유닛으로부터 해리되게 한다. α 서브유닛의 GTP 결합된 형태는 일반적으로 작동인자 조절 잔기(moiety)로서 작용하여 제2 메신저, 예컨대 고리형 AMP(예, 아데닐레이트 사이클라제의 활성화에 의해), 디아실글리세롤 또는 이노시톨 포스페이트의 생산을 유도한다. 사람 중에 알려진 α 서브유닛에는 β 및 γ 서브유닛의 작은 푸울과 결합하는 20가지가 넘는 종류가 있다. 포유동물 G 단백질의 예에는 Gi, Go, Gq, Gs 및 Gt가 있다. G 단백질은 본 발명에 참고인용된 문헌[Lodish H. et al. Molecular Cell Biology, Scientific American Books Inc., New York, N.Y., 1995]에 상세히 설명되어 있다.
GPCR은 약물 작용 및 개발의 주요 표적이다. 실제, 수용체는 현재 공지된 약물의 절반이 넘고(Drews, Nature Biotechnology, 1996, 14: 1516), GPCR은 임상 처방 약물의 30%가 GPCR에 길항작용하거나 효능작용하는 치료 개입에 사용되는 가장 중요한 표적이다(Milligan, G. and Rees, S., (1999) TIPS, 20: 118-124). 이것은 그 수용체가 치료 표적으로서 증명된 기정 이력이 있음을 증명한다.
일반적으로, 본 발명의 실시자는 자신의 대상 폴리펩타이드를 선택하고, 이의 정확한 아미노산 서열을 알고 있을 것이다. 본 발명의 기술은 다양한 폴리펩타이드, 예컨대 성장 및 분화 인자 8에 대한 사람 모노클로날 항체(실시예 1, 3, 4, 7-14), 사람화된 항루이스 Y 항체(실시예 5 및 6), 항ABeta(실시예 15) 및 종양 괴사 인자 수용체의 이량체 Fc 융합 단백질(실시예 16)의 생산에 성공적으로 적용되었고, 이것은 본 발명이 다양한 여러 폴리펩타이드 및 단백질의 발현에 유용하다는 것을 시사한다. 본 발명에 따라 발현되어야 하는 임의의 소정 단백질은 특유의 특성을 갖고 있어서, 세포 밀도 또는 배양된 세포의 생존성에 영향을 미칠 수 있고, 동일한 배양 조건 하에서 증식 시, 다른 폴리펩타이드 또는 단백질보다 낮은 농도로 발현되기도 한다. 당업자라면 세포 성장 및/또는 제시된 임의의 발현 폴리펩타이드 또는 단백질의 생산을 최적화하기 위해 본 발명의 단계 및 조성을 적당히 변형시킬 수 있을 것이다.
유전자 조절 인자
당업자라면 분명히 알고 있듯이, 유전자 조절 인자는 폴리펩타이드 또는 단백질의 유전자 발현을 조절하는데 이용될 수 있다. 이러한 유전자 조절 인자는 적절한 숙주 세포에서 활성인 것으로 선택되어야 한다. 조절 인자는 구성적 활성이거나 또는 일정 환경에서 유도성일 수 있다. 유도성 조절 인자는 독성이거나 세포증식 및/또는 생존성에 다른 유해 효과가 있는 경우에 특히 유용하다. 이러한 경우에, 유도성 조절 인자에 의한 폴리펩타이드 또는 단백질의 발현 조절은 세포 생존성, 세포 밀도 및/또는 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질의 총 수율에 증진시킬 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 조절 인자는 당업계에 다수가 공지되어 있고 입수용이하다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 대표적인 항상성 포유동물 프로모터에는 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPTR) 프로모터, 아데노신 디아미나제 프로모터, 피루베이트 키나제 프로모터, 베타-액틴 프로모터 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 다른 항상성 프로모터가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 진핵생물 세포에서 암호화 서열의 항상성 발현을 유도하는 것으로 밝혀진 바이러스 프로모터에는 예컨대 원숭이 바이러스 프로모터, 단순헤르페스 바이러스 프로모터, 파필로마 바이러스 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 프로모터, 루스 육종 바이러스 프로모터, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 및 다른 레트로바이러스의 장말단 반복체(LTR), 단순헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 다른 바이러스 프로모터가 있다.
유도성 프로모터는 유도제의 존재 하에서 작동적으로 결합된 암호화 서열의 발현을 유도하며, 역시 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 포유동물 세포의 경우, 메탈로티오네인 프로모터는 특정 금속 이온의 존재 하에서 하류 암호화서열의 전사를 유도한다. 다른 유도성 프로모터는 당업자라면 잘 알 수 있을 것이며(것이거나) 공지되어 있다.
일반적으로, 유전자 발현 서열에는 전사 및 해독의 개시와 각각 관련 있는 5' 비전사 및 5' 비해독 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등이 있다. 인핸서 인자가 발현될 폴리펩타이드 또는 단백질의 발현 농도를 증가시키기 위해 경우에 따라 사용될 수도 있다. 포유동물 세포에서 작용하는 것으로 밝혀져 있는 인핸서 인자의 예에는 문헌(Dijkema et la., EMBO J.(1985) 4: 761)에 설명되어 있는 바와 같은 SV40, 및 문헌(Gorman et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b) 79:6777)에 설명되어 있는 바와 같은 루스 육종 바이러스(RSV)의 장말단 반복체(LTR) 유래의 인핸서/프로모터, 및 문헌(Boshart et al., Cell(1985) 41:521)에 설명되어 있는 바와 같은 사람 시토메갈로바이러스의 장말단 반복체 유래의 인핸서/프로모터가 있다.
조절 인자를 암호화 서열에 결합시키는 시스템은 당업계에 공지되어있다(일반 분자생물학 및 재조합 DNA 기술은 본 발명에 참고인용된 문헌[Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, 본 발명에 참고인용됨]에 공지되어있다. 또한, 다양한 성장 및 유도 조건 하에서 다양한 포유동물 세포에서의 발현에 바람직한 암호화 서열을 삽입하기에 적당한 시판 벡터 역시 당업계에 공지되어 있다.
숙주 세포에 암호화 서열 및 관련 조절 인자의 도입
당해 단백질 또는 폴리펩타이드의 발현을 달성하기에 충분한 핵산을 포유동물 숙주 세포에 도입시키기에 적당한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예컨대, Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281 :40-46 (1979); Levinson et al.; EP 117,060; 및 EP 117,058, 모두 본 발명에 참고인용됨) 참조).
포유동물 세포의 경우에, 바람직한 형질전환 방법에는 그래함과 반 데르 에르브(Graham and van der Erb, Virology, 52:456-457 (1978))의 인산칼슘 침전법 또는 lipofectamine™. (Gibco BRL) (Method of Hawley-Nelson, Focus 15:73 (1193))이 있다. 포유동물 세포 숙주계의 형질전환에 대한 일반적으로 관점들은 1983년 8월에 허여된 미국 특허 4,399,216(Axel)에 설명되어있다. 포유동물 세포의 형질전환에 사용되는 다양한 기술은 문헌[Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al ., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990), and Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조할 수 있다. 포유동물 세포에서 단백질 또는 폴리펩타이드의 발현에 적당한 벡터의 대표적인 비제한적 예에는 pCDNAl; pCD[Okayama, et al. (1985) MoI. Cell Biol. 5:1136-1142]; pMClneo PoIy-A[ Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512]; 및 pAC 373 또는 pAC 610과 같은 바큘로바이러스 벡터가 있다.
바람직한 양태에 따르면, 폴리펩타이드 또는 단백질은 숙주 세포에 안정적으로 형질감염된다. 하지만, 당업자라면 본 발명이 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염된 포유동물 세포를 이용하여 사용될 수 있음을 잘 알고 있을 것이다.
세포
세포 배양 및 폴리펩타이드 발현에 민감한 포유동물 세포 또는 세포 종류라면 어떠한 세포 또는 세포 종류라도 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 포유동물 세포의 비제한적 예에는 BALB/c 마우스 골수종 주(NSO/l, ECACC No. 85110503); 사람 망막모세포(PER.C6(CruCell, Leiden, NL); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주(COS-7, ATCC CRL 1651); 사람 태아 신장 세포주(293 세포 또는 현탁 배양으로의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J.Gen Virol., 36: 59(1977)); 어린 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포 +/- DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77:4216(1980)); 마우스 세르토리 세포(TM4, Mather, Biol.Reprod., 23: 243-251(1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1 587); 사람 경부 암종 세포(HeLa, ATCC CCL2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방종양(MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y.Acad.Sci., 383: 44-68(1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 사람 간암 세포주(Hep G2)가 있다. 특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 CHO 세포주 유래 폴리펩타이드 및 단백질의 배양 및 발현에 사용된다.
또한, 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현하는 임의의 수의 시판 및 비시판 하이브리도마 세포주도 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 당업자는 하이브리도마 세포주가 영양 필요조건이 다르고(다르거나) 최적 성장 및 폴리펩타이드 또는 단백질 발현에 필요한 배양 조건이 다를 수 있음을 잘 알고 있을 것이며, 따라서 필요한 경우에 조건을 변경시킬 수 있을 것이다.
앞에서 언급한 바와 같이, 대부분의 경우에 세포는 단배질 또는 폴리펩타이드를 높은 농도로 생산하는 것으로 선택되거나 유전자조작된다. 종종, 세포는 예컨대 당해 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자의 도입 및/또는 당해 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자(내인성인지 또는 도입된 것이의 여부에 관계없이)의 발현을 조절하는 조절 인자의 도입에 의해 단백질을 고농도로 생산하도록 유전자 조작된다.
특정 폴리펩타이드는 세포 성장, 세포 생존성 또는 결과적으로 폴리펩타이드 또는 단백질의 생산을 일부 방식에 따라 제한하는 세포의 일부 다른 특성에 유해한 영향을 미칠 수 있다. 특정 폴리펩타이드를 발현하도록 유전자 조작된 1가지 특정 유형의 세포 집단 중에서도, 세포 집단 안에서 가변성이 존재하여 특정한 개별 세포가 더 잘 성장하고(하거나) 당해의 폴리펩타이드를 더 잘 생산할 것이다. 본 발명의 바람직한 특정 양태에 따르면, 세포주는 세포 배양을 위해 선택한 특정 조건 하에서 확실하게 성장하는 것으로 실험 실시자가 실험적으로 선택한다. 특히 바람직한 양태에 따르면, 특정 폴리펩타이드를 발현하도록 유전자 조작된 각 세포는 세포성장, 최종 세포 밀도, 세포 생존성 백분율, 발현된 폴리펩타이드 역가 또는 이 조건들의 조합 또는 실험 실시자가 중요하다고 생각하는 다른 임의의 조건을 기초로 하여 대량 생산용으로 선택한다.
세포 배양 단계
당해 폴리펩타이드를 생산하는 전형적인 절차에는 회분식 배양 및 유가 회분식 배양이 있다. 회분식 배양 방법은 통상 특정 세포 밀도의 씨딩 배양물을 대량 생산 배양물에 접종하는 단계, 그 세포를 세포 성장 및 생존성에 도움이 되는 조건 하에서 성장시키는 단계, 세포가 특정 세포 밀도에 도달하면 배양물을 수거하는 단계 및 발현된 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함한다. 유가 회분식 배양 절차는 회분식 배양물에 세포 성장 동안 소비된 영양소 및 다른 성분을 보충하는 추가 단계(들)를 포함한다. 통상의 회분식 및 유가 회분식 배양의 지속적인 미해결 문제점은 세포 성장, 생존성 및 발현된 폴리펩타이드의 생산에 유해한 영향을 미치는 대사 노폐물의 생산이다. 특히 유해한 영향을 미치는 2가지 대사 노폐물은 락테이트과 암모늄으로서, 각각 글루코스 및 글루타민 대사의 결과로서 생산된다. 글루타민 대사의 결과로서 효소적 생산되는 암모늄 외에도, 암모늄은 또한 경시적으로 비대사적 분해의 결과로서 세포 배양물에 축적된다. 본 발명은 세포 배양물 중의 상기 노폐물의 축적을 지연시키며 심지어 감소시켜 암모늄 및 락테이트의 유해 영향을 최소화하는 폴리펩타이드의 개량된 대량 생산 방법을 제공한다. 당업자는 본 발명이 세포를 배양하는 시스템, 예컨대 회분식 시스템, 유가 회분식 시스템 및 관류 시스템 등, 이에 국한되지 않는 모든 시스템에서 이용될 수 있다는 것을 잘 알 것이다. 본 발명의 바람직한 특정 양태에 따르면, 세포는 회분식 또는 유가 회분식 시스템으로 증식되는 것이 좋다.
배지
시중에서 입수할 수 있는 배지를 비롯한 통상의 배지 조성물, 예컨대 Ham's F10(Sigma), 최소 필수 배지(MEM, Sigma), RPMI-1640(Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Sigma)는 다른 아미노산에 비해 글루코스와 글루타민의 농도가 비교적 높다. 이 성분들은 세포의 1차 대사 에너지원이기 때문에 다량으로 필요할 것으로 생각되었다. 하지만, 이 영양소의 빠른 소비는 전술한 바와 같이 락테이트과 암모늄의 축적을 유도한다. 더욱이, 글루코스와 글루타민의 높은 초기 농도 및 후속되는 락테이트과 암모늄의 축적은 종종 세포 성장, 세포 생존성 및 폴리펩타이드의 생산에 유해한 조건인 높은 몰삼투압농도를 초래한다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 다른 배양 단계에 따라 사용되는 경우에 락테이트과 암모늄의 축적을 최소화하며 심지어 저하시키기도 하는 다양한 배지 조성물을 제공한다. 이와 같이 세포 성장 및/또는 생존성이나, 폴리펩타이드 또는 단백질의 발현에 유리한 영향을 미치는 것으로 밝혀진 본 발명의 배지 조성물은 다음 중 하나 이상의 조건을 포함한다: i) 단위 부피당 아미노산 누적 양이 약 70mM 초과이고, (ii) 아스파라긴에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 2 미만이며, (iii) 총 아미노산에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 0.2 미만이고, (iv) 총 아미노산에 대한 무기 이온의 누적 몰비가 약 0.4 내지 1이며, (v) 단위 부피당 글루타민 및 아스파라긴 농도의 누적 합계 양이 약 16mM 보다 많다. 당업자라면, 앞에서 사용된 바와 같이 "누적"이란 용어가 세포 배양 과정 동안 첨가된 성분 또는 성분들, 예컨대 배양 초기에 첨가된 성분 및 후속 첨가된 성분의 총 함량을 의미한다는 것을 잘 알 것이다. 또한, 당업자는 본 발명의 배지 조성물이 합성 배지는 물론 비합성 배지도 포함한다는 것을 잘 알 것이다.
통상의 배지 조성물은 본 발명의 배지 조성물에 비해 비교적 낮은 농도의 총 아미노산 함량을 사용하기 시작한다. 예를 들어, DME-F12(둘베코 변형 이글 배지와 햄 F12 배지의 50:50 혼합물)로 공지된 통상의 세포 배양 배지는 총 아미노산 함량이 7.29mM이고, RPMI-1640으로 알려진 통상의 세포 배양물은 총 아미노산 함량이 6.44mM이다(예컨대, H.J.Morton, In Vitro, 6:89-108(1970), R.G.Ham, Proc.Nat.Assoc.Sci(USA), 53:288-293(1965), G.E.Moore et al., J.Am.Medical Assn., 199: 519-24(1967), 모든 문헌은 본 발명에 참고인용된 것임). 본 발명의 특정 양태에 따르면, 배양 배지의 아미노산 농도는 약 70mM초과인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 배지 조성물에 함유된 아미노산 농도는 초기 배지에서 약 70mM초과인 것이 좋다. 초기 배지의 아미노산 농도가 이러한 범위인 경우에, 배양 성장 기간을 통해 세포 밀도와 역가가 증가하는 것으로 확인되었다(실시예 13 참조).
더욱이, 본 발명의 특정 양태에 따르면, 배양 배지 중의 아스파라긴에 대한 글루타민의 몰비는 다른 시판 배지는 물론 비시판 배지에 비해 감소된 것이다. 배양 배지 중의 아스파라긴에 대한 글루타민의 몰비는 약 2 미만인 것이 바람직하다.
더욱이, 본 발명의 특정 양태에 따르면, 배양 배지 중의 총 아미노산에 대한 글루타민의 몰비는 다른 시판 배지는 물론 비시판 배지에 비해 감소된 것이다. 배양 배지 중의 총 아미노산에 대한 글루타민의 몰비는 약 0.2 미만인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 초기 배지에서 글루타민 대 아스파라긴 또는 총 아미노산의 몰비를 저하시킨 경우 수득되는 재미있고 놀라운 결과는 관찰된 암모늄 축적 감소외에, 락테이트 축적의 감소가 역시 관찰되었다는 점이다. 특정 양태에 따르면, 암모늄과 락테이트의 축적 농도는 대조 배양물의 축적 농도보다도 낮을 뿐만 아니라, 사실상 초기 축적 이후 실질적으로 감소했다(예컨대, 실시예 3 및 7 참조).
보라스톤(Boraston, 미국 특허 5,871,999)은 총 무기 이온 대 총 아미노산의 몰비가 1 내지 10인 배양 배지를 게시했다. 보라스톤은 총 무기 이온 대 총 아미노산의 몰비가 상기 범위인 배양 배지를 제공하면, 배지에서 증식된 CHO 세포의 응집이 감소된다는 것을 보여주었다. 본 발명의 다른 바람직한 양태에 따르면, 배양 배지 중의 총 아미노산에 대한 총 무기 이온의 몰비는 약 0.4 내지 1 사이로, 더욱 더 감소된다. 실시예 13에서 보여주는 바와 같이, 이 비율을 1.75에서 약 0.7까지 감소시킨 결과, 배양물의 전 증식 기간 동안 세포 밀도 및 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질 생산이 현저하게 증가했다.
본 발명의 다른 바람직한 양태에 따르면, 배양 배지는 글루타민과 아스파라긴 합계 농도가 약 16 내지 36mM이다. 실시예 14, 표 22에 제시된 바와 같이, 이 범위에 속하는 글루타민과 아스파라긴의 합계 총 농도를 함유한 배지는 이 범위를 벗어난 글루타민과 아스파라긴의 합계 총 농도를 함유한 배지보다 발현된 폴리펩타이드의 역가가 더 높았다. 당업자는 세포 성장 및/또는 생존성의 최적화 및 발현된 폴리펩타이드 생산의 최적화를 위해 상기 범위 중에서 정확한 글루타민과 아스파라긴 합계 총 농도를 선택할 수 있을 것이다.
더욱이, 당업자라면 전술한 임의의 조건들이 단독으로 사용되거나, 서로 다양한 조합으로 사용될 수 있음을 잘 알 것이다. 전술한 특징 하나, 일부 또는 전부를 나타내는 배지 조성물을 이용하여, 당업자는 세포 성장 및/또는 생존성을 최적화하고 발현된 폴리펩타이드의 생산을 최대화할 수 있을 것이다.
본 발명에 게시된 이러한 배지 조성물은 모두 경우에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장인자, 특히 이온(예, 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액, 비타민, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드, 미량원소(보통 극히 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 아미노산, 지질, 단백질 가수분해물 또는 글루코스 또는 다른 에너지원이 필요한 경우 보충될 수도 있다. 본 발명의 특정 양태에 따르면, 헥사메틸렌-비스(아세트아미드)("HMBA") 및 부티르산나트륨("NaB")과 같은 화학 유도제를 배지에 보충하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 선택 보충물은 배양 초기에 첨가할 수도 있고, 또는 고갈된 영양소 보충을 위해 또는 다른 이유로 차후에 첨가할 수도 있다. 당업자라면 게시된 배지 조성물에 포함될 수 있는 임의의 바람직한 또는 필요한 보충물을 잘 알 것이다.
포유동물 세포 배양물 제공
회분식 및 유가 회분식 배양을 통해 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산하기 위한 포유동물 세포의 준비 방법에는 다양한 종류가 당업계에 공지되어 있다. 앞에서 언급한 바와 같이, 발현을 달성하기에 충분한 핵산(일반적으로 당해 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 유전자와 임의의 작동가능하게 결합된 조절 인자를 함유하는 벡터)을 임의의 다수의 공지된 기술을 사용하여 숙주 세포주 내로 도입시킬 수 있다. 일반적으로, 세포를 선별하여, 벡터를 실제 흡수하여 당해 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 확인한다. 포유동물 세포에 의해 발현된 당해 특정 폴리펩타이드 또는 단백질을 검출하는 통상의 방법에는 면역조직화학, 면역침전, 유동세포분석법, 면역형광 현미경법, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, 효소 결합된 면역흡착분석법(ELISA), 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 기술, 생물 활성 분석법 및 친화성 크로마토그래피 등이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 당업자라면 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질을 검출하는 다른 적당한 기술을 잘 알 것이다. 다수의 숙주 세포가 당해의 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현한다면, 전술한 기술 중 일부 또는 전부를 사용하여 가장 높은 농도로 당해 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현하는 세포를 확인할 수 있다.
당해 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현하는 세포가 확인되면, 그 세포를 당업자에게 공지된 다양한 임의의 방법으로 배양을 통해 증식시킨다. 당해 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현하는 세포는 일반적으로 세포의 생존, 성장 및 생존성에 바람직한 배지 및 온도에서 배양하여 증식시킨다. 초기 배양 부피는 임의의 크기일 수 있으나, 종종 당해 폴리펩타이드 단백질의 최종 생산에 사용되는 생산용 생물반응기의 배양 부피보다는 작고, 생산용 생물반응기에 접종하기 전에 생물반응기의 용량을 증가시키면서 세포를 여러번 계대배양하는 경우가 많다. 세포 배양물은 배지의 산소화 및 세포에 영양소의 분산을 증가시키기 위해 교반 또는 진탕시킬 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 배양물의 산소화를 증가 및 조절하기 위해 당해 기술 분야에 공지된 특수 살포 장치를 사용할 수도 있다. 본 발명에 따르면, 생물반응기의 내부 특정 조건, 예컨대 pH, 온도, 산소화 등(이에 국한되지 않는다)을 조절 또는 제어하는 것이 유리할 수 있음을 당업자라면 잘 알 것이다.
생산용 생물반응기의 초기 세포 밀도는 당업자라면 쉽게 선택할 수 있다. 본 발명에 따르면, 생산용 생물반응기의 초기 세포밀도는 배양물 부피당 단세포 정도의 낮은 함량일 수도 있다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 생산용 생물반응기의 초기 세포 밀도는 약 2 x 102 생존 세포/ml 내지 약 2 x 103, 2 x 104, 2 x 105, 2 x 106, 5 x 106, 10 x 106 생존 세포/ml 이상의 범위일 수 있다.
초기 및 중간 세포 배양물은 다음 중간 또는 최종 생산용 생물반응기에 접종하기 전에 임의의 바람직한 밀도로 증식될 수 있다. 접종 전에 세포의 대부분은 살아있는 것이 바람직하지만, 완전한 또는 거의 완전한 생존성은 필요하지 않다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 세포는 저속 원심분리 등을 통해 상청액으로부터 분리될 수 있다. 또한, 분리된 세포를 임의의 불필요한 대사 노폐산 또는 배지 성분의 제거를 위해 다음 생물반응기에 접종하기 전에 배지로 세척하는 것이 바람직할 수도 있다. 이 때, 배지는 세포가 이전에 증식된 배지이거나 또는 본 발명의 실시자가 선택한 다른 배지 또는 세척 용액일 수도 있다.
그 다음, 세포는 생산용 생물반응기에 접종하기 위해 적당한 밀도로 희석될 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 세포는 생산용 생물반응기에 사용될 배지와 같은 배지로 희석한다. 또는, 본 발명의 실시자의 필요 및 희망에 따라 또는 세포 자체의 특수 조건을 맞춰주기 위해, 예컨대 생산용 생물반응기에 접종하기 전에 단기간 동안 보관되어야 한다면, 세포를 다른 배지 또는 용액으로 희석할 수도 있다.
초기 성장 단계
생산용 생물반응기가 전술한 바와 같이 접종되면, 세포 배양물은 세포배양물의 생존, 증식 및 생존성에 바람직한 조건 하에서 초기 증식 단계로 유지된다. 정확한 조건은 세포 종류, 세포가 유래된 유기체, 및 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질의 본성 및 특성에 따라 달라질 것이다.
본 발명에 따르면, 생산용 생물반응기의 부피는 폴리펩타이드 또는 단백질의 대량 생산에 적당한 임의의 부피일 수 있다. 바람직한 양태에 따르면, 생산용 생물반응기의 부피는 적어도 500리터이다. 다른 바람직한 양태에 따르면, 생산용 생물반응기의 부피는 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,000 리터 이상이거나 이들 부피 사이의 임의의 부피이다. 당업자라면, 본 발명의 실시에 사용하기에 적당한 생물반응기를 잘 알아서 선택할 수 있을 것이다. 생산용 생물반응기는 세포 성장 및 생존성에 바람직하고, 생산 폴리펩타이드 또는 단백질의 발현 또는 안정성을 방해하지 않는 임의의 재료로 제작될 수 있다.
초기 성장 단계에서 세포 배양물의 온도는 주로 세포 배양물이 생존성을 유지하는 온도 범위에 기초하여 선택한다. 예를 들어, 초기 성장 단계 동안 CHO 세포는 37℃에서 잘 성장한다. 일반적으로, 대부분의 포유동물 세포는 약 25℃ 내지 42℃ 범위 내에서 잘 성장한다. 바람직하게는, 포유동물 세포가 약 35℃ 내지 40℃ 범위에서 잘 성장하는 것이 좋다. 당업자는 세포의 필요성 및 실시자의 생산 조건에 따라 세포 성장에 적당한 온도 또는 온도들을 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 초기 성장 단계의 온도는 일정한 단일 온도로 유지된다. 다른 양태에 따르면, 초기 성장 단계의 온도는 일정 범위의 온도 내에서 유지된다. 예를 들어, 온도는 초기 성장 단계 동안 일정하게 증가 또는 감소시킬 수 있다. 또는, 온도는 초기 성장 단계 동안 다양한 시점마다 다른 정도로 감소또는 증가시킬 수도 있다. 당업자는 단일 온도가 사용되어야 하는지, 복수의 온도가 사용되어야 하는지를 결정할 수 있고, 온도가 일정하게 조정되어야 하는지 또는 다른 정도로 조정되어야 하는지를 결정할 수 있을 것이다.
세포는 실시자의 필요 및 세포 자체의 조건에 따라 더 많은 시간 동안 또는 더 적은 시간 동안 초기 성장 단계로 증식될 수 있다. 일 양태에 따르면, 세포는 생존 세포 밀도, 즉 세포가 방해받지 않고 증식하게 둔 경우 사실상 도달할 수 있는 최대 생존 세포 밀도의 일정 백분율인 밀도에 도달하기에 충분한 기간 동안 증식된다. 예를 들어, 최대 생존 세포 밀도의 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%의 바람직한 생존 세포 밀도를 달성하기에 충분한 시간 동안 증식될 수 있다.
다른 양태에 따르면, 세포는 일정 기간 동안 증식되게 한다. 예를 들어, 세포 배양물의 초기 농도, 세포 증식 온도, 세포 고유의 증식 속도에 따라, 세포는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일 또는 그 이상 동안 증식시킬 수 있다. 일부 경우에는 1개월 이상 세포를 증식시킬 수도 있다. 초기 증식 단계 온도에서 접종용 생물반응기에서의 증식이 충분하여, 접종 시, 생산용 생물반응기에 제공된 생존 세포 밀도가 이미 최대 생존 세포 밀도의 원하는 백분율 상태이면 생산용 생물반응기에서는 0일 동안 세포를 증식시킬 수 있다. 본 발명의 실시자는 폴리펩타이드 또는 단백질 생산 조건 및 세포 자체의 필요에 따라서 초기 증식 단계 기간을 선택할 수 있을 것이다.
세포 배양물은 세포에 영양소 분산 및 산소화를 증가시키기 위해 초기 배양 단계 동안 교반 또는 진탕될 수 있다. 본 발명에 따르면, 초기 증식 단계 동안 생물반응기의 특정 내부 조건, 예컨대 pH, 온도, 산소화 등(이에 국한되지 않는다)은 조절 또는 제어하는 것이 유익할 수 있음을 당업자라면 잘 알 것이다. 예를 들어, pH는 산 또는 염기의 적당량을 공급하여 조절할 수 있고, 산소화는 당업계에 공지된 살포 장치로 조절할 수 있다.
배양 조건 전이
본 발명의 교시에 따르면, 초기 증식 단계의 말기에 하나 이상의 배양 조건은 제2 배양 조건 세트가 적용되어 배양물에 대사 전이가 일어나도록 전이될 수 있다. 억제 대사산물, 주로 락테이트 및 암모니아의 축적은 증식을 억제한다. 세포 배양물의 온도, pH, 삼투질 농도 또는 화학적 유도인자 농도의 변화 등에 동반하여 일어나는 대사 전이로는 특정 락테이트 생산 속도 대 특정 글루코스 소비 속도의 비의 감소가 특징적으로 나타날 수 있다. 비제한적인 일 양태에 따르면, 배양물의 온도전이에 따라 배양 조건이 전이되기도 한다. 하지만, 당업계에 공지된 바와 같이, 온도 전이가 적당한 대사 전이를 달성할 수 있는 유일한 기작은 아니다. 예를 들어, 이러한 대사 전이는 pH, 삼투질농도 및 부티르산나트륨 농도를 비롯한 다른 배양 조건의 전이를 통해서도 달성될 수 있다. 앞에서 논한 바와 같이, 배양 전이의 시기는 폴리펩타이드 또는 단백질 생산 조건 또는 세포 자체의 필요에 근거하여 본 발명의 실시자가 결정할 수 있을 것이다.
배양물의 온도를 전이시킬 때, 온도 전이는 비교적 점진적일 수 있다. 예를 들어, 온도 변화가 완료되기까지는 수시간 또는 수일이 걸릴 수 있다. 또는, 온도 전이는 비교적 급진적일 수 있다. 예를 들어, 온도 변화는 수시간 이내에 완료되기도 한다. 심지어, 적당한 생산 및 조절 장치, 예컨대 폴리펩타이드 또는 단백질의 상업적인 대량 생산에 일반적인 장치가 제공되면, 온도 변화는 1시간 이내에 완료되기도 한다.
후속 증식 단계에서의 세포 배양물의 온도는 세포 배양물이 생존 상태를 유지하고 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질을 상업적으로 적당한 농도로 발현하는 온도 범위에 주로 기초하여 선택한다. 일반적으로, 약 25℃ 내지 42℃의 범위에서 대부분의 포유동물 세포는 생존성을 유지하고 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질을 상업적으로 적당한 농도로 발현한다. 특히, 약 25℃ 내지 35℃ 범위에서 포유동물 세포가 생존성을 유지하고 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질을 상업적으로 적당한 농도로 발현하는 것이 바람직하다. 이러한 세포 증식에 적당한 온도 또는 온도들은 세포에 필요한 것 및 실시자의 생산 조건에 따라서 당업자가 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 후속 증식 단계의 온도는 일정한 단일 온도에서 유지된다. 다른 양태에 따르면, 후속 증식 단계의 온도는 일정 범위의 온도에서 유지된다. 예를 들어, 온도는 후속 증식 단계 동안 일정하게 증가 또는 감소시킬 수 있다. 또는, 온도는 후속 증식 단계 동안 다양한 시점마다 다른 수준으로 증가 또는 감소시킬 수 있다. 이러한 복수의 다른 온도 전이가 본 발명의 양태에 포함되는 것을 당업자라면 잘 알 것이다. 예를 들어, 온도는 한번 전이하면, 이 온도에서 또는 온도범위에서 세포는 일정 시간 동안 유지되며, 그 다음 온도는 다시 더 고온 또는 더 저온으로 전이시킬 수 있다. 각 전이 후에 배양물의 온도는 일정 온도로 유지되거나 일정 범위의 온도 내에서 유지될 수 있다.
실시예 16에는 2회 연속 온도 변화를 이용한 효과를 입증하는 데이터를 보여주었다. 하지만, 본 발명에 따라 3회 이상의 연속 온도 변화를 이용하여 세포 생존성 또는 밀도 증가 및/또는 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 발현 증가를 실시할 수도 있음을 당업자라면 잘 알 것이다. 각 연속 온도 전이 후 세포 배양물의 온도 또는 온도 범위는 전이 전의 온도 또는 온도 범위보다 높거나 낮을 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 각 연속 온도 또는 온도 범위는 이전 온도 또는 온도 범위보다 낮은 것이 좋다.
후속 생산 단계
본 발명에 따르면, 세포 배양물의 조건이 앞에서 논한 바와 같이 일단 전이한 후에는 세포 배양물을 세포 배양물의 생존 및 생존성에 도움이 되고 원하는 폴리펩타이드 또는 단백질의 상업적으로 적당한 농도로의 발현에 적합한 제2 배양 조건 세트 하에서 후속 생산 단계 동안 유지시킨다.
앞에서 논한 바와 같이, 배양물의 조건 전이는 온도, pH, 삼투질 농도 및 부티르산나트륨 농도(이에 국한되지 않는다)를 비롯한 다수의 배양 조건 중 하나 이상을 전이시켜 실시할 수 있다. 일 양태에 따르면, 배양 온도가 전이된다. 이러한 양태에 따르면, 후속 생산 단계 동안에 배양물은 초기 증식 단계의 온도 또는 온도 범위보다 낮은 온도 또는 온도 범위로 유지된다. 예를 들어, CHO 세포는 후속 생산 단계 동안 25℃ 내지 35℃ 범위에서 재조합 폴리펩타이드 및 단백질을 양호하게 발현한다. 전술한 바와 같이, 복수의 다른 온도 전이가 세포 밀도 또는 생존성 증가 또는 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질의 발현 증가에 이용될 수도 있다.
본 발명에 따르면 원하는 세포 밀도 또는 생산 역가가 달성될 때까지 후속 생산 단계에서 유지될 수 있다. 일 양태에 따르면, 세포는 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질에 대한 역가가 최대에 도달할 때까지 후속 생산 단계를 유지한다. 다른양태에 따르면, 배양물은 실시자의 생산 조건 또는 세포의 필요성에 따라, 그 시점 이전에 수거될 수도 있다. 예를 들어, 세포는 최대 생존 세포 밀도의 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%의 생존 세포 밀도를 달성하기에 충분한 시간 동안 유지될 수 있다. 일부 경우에는 생존 세포 밀도를 최대에 이르게 한 다음, 배양물 수거 전에 일정 수준으로 생존 세포 밀도를 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 극단적인 예로서, 배양물 수거 전에 생존 세포 밀도를 0에 가깝게 하거나 0이 되게 하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 세포는 후속 생산 단계 동안 일정 기간 동안 증식시킨다. 예를 들어, 후속 증식 단계의 초기에 세포 배양물의 농도, 세포 증식 온도 및 세포 고유 증식 속도에 따라서 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일 또는 그 이상 동안 증식시킬 수 있다. 일부 경우에는 1개월 이상 세포를 증식시킬 수도 있다. 본 발명의 실시자는 폴리펩타이드 또는 단백질 생산 조건 및 세포 자체의 필요성에 따라서 후속 증식 단계 기간을 선택할 수 있을 것이다.
일부 경우에는, 세포에 의해 고갈되거나 대사된 영양소 또는 다른 배지 성분을 후속 생산 단계 동안 세포 배양물에 보충하는 것이 유익하거나 필요할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양물의 모니터링 동안 고갈된 것으로 관찰된 영양소 또는 다른 배지 성분을 세포 배양물에 보충하는 것이 바람직할 것이다(예컨대, 이하 '배양 조건 모니터링' 참조). 대안적으로 또는 부가적으로, 후속 생산 단계 전에 세포 배양물을 보충하는 거이 유익하거나 필요할 수 있다. 비제한적 예로서, 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, 특히 이온(예, 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액, 비타민, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드, 미량원소(보통 극미량의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 아미노산, 지질, 또는 글루코스 또는 다른 에너지원이 보충되는 것이 유익하거나 필요할 수 있다.
이러한 보충 성분은 모두 한번에 세포 배양물에 첨가되기도 하고, 또는 연속 첨가로 세포 배양물에 제공되기도 한다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 보충 성분은 비례적인 함량으로 수회 세포 배양물에 제공된다. 다른 양태에 따르면, 오로지 특정 보충 성분은 초기에 제공하고, 나머지 성분은 이후에 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 보충 성분은 세포 배양물에 지속적으로 공급된다.
본 발명에 따르면, 세포 배양물에 첨가되는 총 부피는 가장 바람직하게는 최소 함량으로 유지되어야 한다. 예를 들어, 세포 배양물에 첨가되는, 보충 성분을 함유한 배지 또는 용액의 총 부피는 보충 성분을 제공하기 전의 세포 배양물 부피의 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50%일 수 있다.
세포 배양물은 배지의 산소화 및 세포에 영양소의 분산을 증가시키기 위해 후속 생산 단계 동안 교반 또는 진탕시킬 수 있다. 본 발명에 따르면, 후속 생산 단계 동안 생물반응기의 내부 특정 조건, 예컨대 pH, 온도, 산소화 등(이에 국한되지 않는다)을 조절 또는 제어하는 것이 유리할 수 있음을 당업자라면 잘 알 것이다. 예를 들어, pH는 적당한 함량의 산 또는 염기를 공급하여 조절할 수 있고, 산소화는 당업계에 공지된 살포 장치로 조절할 수 있다.
배양 조건의 모니터링
본 발명의 특정 양태에 따르면, 실시자가 증식 세포 배양물의 특정 조건을 주기적으로 모니터하는 것이 유익하거나 필요하다는 것을 알 수 있다. 세포 배양물 조건의 모니터링은 세포 배양물이 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질을 최적이하 수준으로 생산하는지 여부 또는 배양물이 대략 최적이하 생산 단계가 되는지의 여부를 측정할 수 있게 해준다. 특정 세포 배양 조건을 모니터하기 위하여 분석 배양물의 소량을 분리하는 것이 필요할 수 있다. 당업자는 이러한 분리가 세포 배양물에 오염을 일으킬 가능성을 제공할 수 있고, 따라서 이러한 오염의 위험을 최소화하기 위해 적당한 주의가 필요하다는 것을 잘 알 것이다.
비제한적 예로서, 온도, pH, 세포 밀도, 세포 생존성, 통합 생존 세포 밀도, 락테이트 농도, 암모늄 농도, 몰삼투압 농도 또는 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질의 역가를 모니터하는 것이 유익하거나 필요할 수 있다. 당업자가 이러한 조건을 측정하기 위한 기술에는 다수가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 세포 밀도는 혈구계, 쿨터(Coulter) 계수기 또는 세포 밀도 검사(CEDEX)를 이용하여 측정할 수 있다. 생존 세포 밀도는 배양물 시료를 트립판 블루로 염색하여 측정할 수 있다. 트립판 블루는 오로지 사세포에만 흡수되기 때문에, 세포의 총 수를 계수하고, 염료를 흡수한 세포 수를 상기 총 세포 수로 나눈 다음, 역수를 구하면 생존 세포 밀도를 얻을 수 있다. 락테이트, 암모늄 또는 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질의 농도를 측정하는 데에는 HPLC를 사용할 수 있다. 대안적으로, 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질의 농도는 SDS-PAGE 겔의 쿠마시 염색, 웨스턴 블롯팅, 브래드포드 분석법, 로우리 분석법, 뷰렛 분석법 및 UV 흡광도와 같은 표준 분자생물학 기술을 통해 측정할 수 있다. 또한, 인산화 및 당화와 같은 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질의 해독후 변형을 모니터하는 것이 유익하거나 필요할 수 있다.
발현된 폴리펩타이드의 분리
일반적으로, 본 발명에 따라 발현된 단백질 또는 폴리펩타이드는 분리 및/또는 정제하는 것이 바람직하다. 바람직한 양태에 따르면, 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질은 배지로 분비되는 바, 세포 및 다른 고형물은 예컨대 정제 과정의 제1 단계로서 원심분리 또는 여과 등을 통해 제거할 수 있다. 이러한 양태는 본 발명에 따라 사용될 때 특히 유용한데, 그 이유는 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물이 세포 생존성을 증가시키기 때문이다. 결과적으로, 배양 과정 동안 더 적은 수의 세포가 죽고, 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질의 수율을 잠재적으로 감소시킬 수 있는 단백분해 효소가 더 적게 배지로 방출된다.
대안적으로, 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질은 숙주 세포의 표면에 결합한다. 이러한 양태에서는 배지를 분리한 후, 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 정제 과정의 제1 단계로서 용해시킨다. 포유동물 숙주 세포의 용해(lysis)는 유리 비드에 의한 물리적 붕괴 및 높은 pH 조건에 노출 등을 비롯하여 당업자에게 공지된 임의의 수의 수법을 이용하여 달성할 수 있다.
그 다음, 폴리펩타이드 또는 단백질은 표준 방법, 예컨대 크로마토그래피(예, 이온 교환, 친화성, 크기 배제 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피), 겔 여과, 원심분리 또는 차등 용해도, 에탄올 침전 또는 단백질 정제에 이용할 수 있는 임의의 다른 기술(이에 국한되지 않는다) 등을 통해 분리 및 정제할 수 있다(예컨대, Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higginss, S.J. and Hames, B.D.(eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; and Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N.(eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology(Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic Press, 1997, 모두 본원에 참고인용된 것임). 특히 면역친화성 크로마토그래피를 위해, 단백질은 이 단백질에 대항하여 유발되고 고정 지지체에 부착된 항체를 함유하는 친화성 컬럼에 결합시켜 분리할 수 있다. 대안적으로, 인플루엔자 외피 서열, 폴리히스티딘 또는 글루타치온-S-트랜스퍼라제와 같은 친화성 태그를 표준 재조합 기술에 따라 단백질에 부착하여, 적당한 친화성 컬럼을 통과할 때 용이한 정제를 도모할 수도 있다. 또한, 정제 과정 동안 폴리펩타이드 또는 단백질의 분해를 감소 또는 제거하기 위하여 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF), 류펩틴, 펩스타틴 또는 아프로티닌과 같은 프로테아제 억제제를 임의의 단계에 또는 모든 단계마다 첨가할 수도 있다. 프로테아제 억제제는 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질을 분리 및 정제하기 위해 세포를 용해해야만 할 때 특히 바람직하다. 당업자는 정제되어야 하는 폴리펩타이드 또는 단백질의 특성, 그 폴리펩타이드 또는 단백질이 발현되는 세포의 특성 및 세포가 증식되는 배지의 조성에 따라 정확한 정제 기술이 달라질 수 있음을 잘 알 것이다.
약제학적 조성물
본 발명의 바람직한 특정 양태에 따르면, 생산된 폴리펩타이드 또는 단백질은 약리학적 활성을 보유하여 약제 제조에 유용할 수 있다. 전술한 바와 같이 본 발명의 조성물은 검체에게 투여될 수도 있고, 또는 이용가능한 경로, 예컨대 비경구(예, 정맥내), 피내, 피하, 경구, 비측, 기관지, 안구, 경피(국소), 점막내, 직장 및 질 경로 등, 이에 국한되지 않는 임의의 경로로 전달하기 위해 먼저 조제화할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 일반적으로 포유동물 세포주에서 발현된 정제된 폴리펩타이드 또는 단백질, 전달제(즉, 전술한 바와 같이, 양이온 중합체, 펩타이드 분자 수송인자, 계면활성제 등)와 함께 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"란 용어는 약제 투여에 적합한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보조 활성 화합물이 조성물에 첨가될 수도 있다.
약제학적 조성물은 계획한 투여 경로에 적합하게 조제한다. 비경구, 피내 또는 피하 투여에 사용되는 용액 또는 현탁액는 다음과 같은 성분을 함유할 수 있다: 주사용수, 식염수 용액, 고정용 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트화제; 아세트산염, 구연산염 또는 포스페이트과 같은 완충액 및 염화나트륨 또는 수산화나트륨과 같은 강직성 조정제. 비경구 제조물은 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱제 다회 용량 바이엘에 포장될 수 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위한 적당한 담체에는 생리적 식염수, 정균 수, Cremophor EL™(BASF, Parsippanu, NJ) 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS)가 있다. 모든 경우마다 조성물은 멸균되어야 하고 용이한 주사능이 존재하도록 유동성이어야 한다. 바람직한 약제학적 조성물은 제조 및 보관 조건 하에서 안정하고 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 일반적으로, 적절한 담체는 용매 또는 분산 매질, 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적당한 혼합물일 수 있다. 적당한 유동성은 예컨대 레시틴과 같은 코팅재의 사용, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용을 통해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 억제는 다양한 항균제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등을 사용하여 달성할 수 있다. 대부분의 경우에는 조성물에 등장제, 예컨대 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 함유하는 것이 바람직할 것이다. 주사성 조성물의 연장 흡수는 흡수 지연 제제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 첨가하여 달성할 수 있다.
멸균 주사 용액은 앞에 열거한 성분 중 하나 또는 그 혼합물을 필요에 따라 보유하는 적당한 용매에, 필요한 함량의 정제된 폴리펩타이드 또는 단백질을 혼합한 후, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 포유동물 세포주로부터 발현된 정제된 폴리펩타이드 또는 단백질을, 기본 분산 매질과 앞에서 열거한 다른 필요한 성분을 함유하는 멸균 매개제(vehicle)에 혼합하여 제조한다. 멸균 주사성 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조방법은 전술한 멸균 여과된 용액으로부터, 활성 성분과 필요한 임의의 추가 성분을 함유하는 분말을 생산하는 진공 건조 및 동결 건조이다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 함유한다. 경구 치료 투여를 위한 정제된 폴리펩타이드 또는 단백질은 부형제와 혼합하여 정제, 트로키 또는 캡슐, 예컨대 젤라틴 캡슐 형태로 사용할 수 있다. 또한, 경구 조성물은 구강청정제로서 사용하기 위해 유동 담체를 이용하여 제조할 수도 있다. 약학적 상용성 결합제 및/또는 보강제도 조성물의 일부로서 첨가될 수 있다. 정제, 환약, 캡슐, 트로키 등은 다음과 같은 임의의 성분 또는 이와 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 미세결정형 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토스와 같은 부형제, 알긴산, Primogel 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘 또는 Sterotes와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 활제(glidant); 슈크로스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향과 같은 향미제. 경구 전달용 조성물은 위장관내 안정성 향상 및/또는 흡수 향상용 제제를 함유하는 것이 바람직할 수 있다.
흡입 투여용인 경우, 포유동물 세포주에서 발현된 정제된 폴리펩타이드 또는 단백질과 전달제를 함유하는 본 발명의 조성물은 적당한 추진제, 예컨대 이산화탄소와 같은 기체를 함유하는 가압 용기 또는 분배기, 또는 분무기 유래의 에어로졸 스트레이 형태로 전달하는 것이 바람직하다. 본 발명은 특히 비측 스프레이, 흡입기를 이용하는 조성물의 전달 또는 여타 상기도 및/또는 하기도로의 직접 전달도 포함한다. 인플루엔자 바이러스에 대항한 DNA 백신의 비내 투여는 CD8 T 세포 반응을 유도하는 것으로 밝혀져 있고, 이는 기도의 적어도 일부 세포가 기도로 전달될 때 DNA를 흡수할 수 있고, 본 발명의 전달제가 세포 흡수를 향상시킬 것임을 나타낸다. 본 발명의 특정 양태에 따르면, 포유동물 세포주로부터 발현된 정제된 폴리펩타이드와 전달제를 함유하는 조성물은 에어로졸 투여용의 큰 다공성 입자로서 조제한다.
또한, 점막내 또는 경피 수단을 이용하여 전신 투여할 수도 있다. 점막 또는 경피 투여용의 경우, 침투해야 하는 장벽에 적당한 침투제가 조성물에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 그 예에는 점막 투여용의 경우 계면활성제, 담즙산염 및 푸시딘산 유도체가 있다. 경점막 투여는 비측 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 달성할 수 있다. 경피 투여용의 경우에는, 정제된 폴리펩타이드 또는 단백질과 전달제가 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 연고, 고약, 겔 또는 크림에 혼합된다.
또한, 조성물은 좌약(예, 코코아 버터 및 다른 글리세라이트와 같은 통상적인 좌약용 기제 보유) 또는 직장 전달용 정체 관장제 형태로 제조할 수도 있다.
일 양태에 따르면, 폴리펩타이드 또는 단백질이 신체에서 급속히 제거되지 않게 하는 담체로 조성물이 제조되며, 그 예로는 조절 방출형 조성물, 예컨대 임플란트 및 미세캡슐화된 전달 시스템이 있다. 생체분해성, 생체적합한 폴리머, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 조성물의 제조방법은 당업자라면 명백히 알 수 있을 것이다. 또한, 이 재료는 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼스, 인크(Nova Pharmaceutical, Inc.)에서 입수할 수도 있다. 리포솜 현탁액(예컨대, 바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체를 갖는 감염 세포를 표적으로 하는 리포솜)도 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이의 제조는 미국 특허 4,522,811에 기술된 바와 같이, 당업계에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.
용이한 투여 및 균일한 투약을 위해 경구 또는 비경구 조성물은 투약 단위 형태로 조제하는 것이 바람직하다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 투약 단위 형태는 치료할 검체에게 단위 투약량으로서 작당한 물리적으로 분리된 단위를 의미한다. 즉, 각 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 목적한 치료 효과를 제공하는 것으로 계산된 소정량의 활성 폴리펩타이드 또는 단백질을 함유한다.
본 발명에 따라 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질은 다양한 간격으로, 필요에 따라 다양한 기간 동안, 예컨대 1주에 1회씩 약 1 내지 10주 동안, 2 내지 8주 동안, 약 3 내지 7주 동안, 약 4주, 5주 또는 6주 등의 기간 동안 투여할 수 있다. 당업자라면, 검체를 효과적으로 치료하는데 필요한 투약량 및 타이밍에 특정 요인, 예컨대 질병 또는 장애의 병도, 이전 치료 이력, 검체의 전반적인 건강 및/또는 연령 및 다른 존재하는 질병(이에 국한되지 않는다)이 영향을 미칠 수 있음을 잘 알 것이다. 일반적으로, 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 단백질을 이용한 검체의 치료는 단독 치료를 포함할 수도 있고, 또는 대부분 연속 치료를 포함할 수 있다. 더욱이, 적당한 용량은 폴리펩타이드 또는 단백질의 효능에 따라 달라질 수 있고, 경우에 따라서는 특정 수용체에게 조정 투여될 수 있는데, 예컨대 사전선택된 원하는 반응이 달성될 때까지 증가 용량을 투여할 수 있음은 너무나 명백한 것이다. 또한, 임의의 특정한 동물 검체에게 구체적인 용량 수준은 다양한 요인, 예컨대 사용된 특정 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성, 연량, 체중, 전반적인 건강, 성별 및 검체의 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도, 임의의 약물 조합 및 조절되어야 하는 발현 또는 활성의 정도 등에 따라 달라질 수 있다.
본 발명은 사람을 제외한 동물의 치료에 사용되는 본 발명에 따른 조성물의 용도를 제공한다. 따라서, 투여 용량 및 방식은 수의 약리학 및 의학의 공지된 원리에 따라 선택할 수 있다. 예컨대, 문헌[Adams, R.(ed)., Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 8th edition, Iowa State University Press; ISBN: 0813817439; 2001]을 참조할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 투여 지침과 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함되어 있을 수 있다.
이상의 설명은 오로지 대표적인 설명으로 이해되어야 하며, 한정하는 설명으로서 간주되어서는 아니 된다. 본 발명을 수행하기 위한 대안적인 방법 및 재료는 물론 다른 용도들도 당업자라면 잘 알 수 있을 것이며, 첨부되는 청구의 범위에 포함되는 것으로 간주되어야 한다.
실시예 1: 항GDF-8 유가 회분식 방법용 증강 배지 1
세포주를 배양하는 통상의 유가 회분식 방법은 예컨대 추가 공급물 투여에 소요되는 시간 및 노력과 대량 생물반응기에서의 특수 장비의 필요 등과 같은 여러 가지 단점이 있다. 이에, 추가공급 필요량이 최소인 대량 생물반응기에서 당해 단백질을 생산하기 위한 회분식 배지를 개발하고자 한다.
재료 및 방법
세포주 및 배지: 성장 및 분화 인자 8에 대한 모노클로날 항체를 발현하도록 중국햄스터난소("CHO") 세포를 유전자조작했다("항GDF-8 세포")(Veldman et al., Neutralizing Antibodies Against GDF-8 and Uses Therefor, US20040142382 A1). 항GDF-8 세포를 이용하여 새로운 회분식 배지를 검사했다. 배지 1 및 배지 2를 이용하여 세포 밀도와 생존성을 높게 유지시키는 능력에 대해 비교했다. 이러한 배지의 조성물과 함께 배지 3을 표 1에 정리했다. 배지는 FeSO4·7H2O를 제외한 모든 성분을 첨가하여 제조했다. 그 다음, 배지의 pH를 7.25로 조정하고 몰삼투압농도를 기록한 뒤, FeSO4·7H2O를 첨가했다.
배양 조건: 플라스크 실험을 위해서는 항GDF-8 세포를 진탕 플라스크에서 증식시킨 후 3회 계대배양했다. 생물반응기 실험을 위해서는 항GDF-8 세포를 배지에서 12일 동안 증식시키되, 날마다 20X 배지 4 추가공급 배지(표 3) 2용적%를 보충하거나 또는 5일 후 16X 배지 4(표 4) 3용적%를 보충하여 증식시켰다. 처음 4일 동안은 세포를 37℃에서 증식시켰다. 5일째, 세포는 31℃로 전이시켰다.
시료 분석: 날마다 배양물로부터 시료를 채취하여 아미노산, 비타민, 철, 포스페이트, 글루코스 및 글루타민 농도를 분석했다.
Figure 112007017090345-PCT00001
Figure 112007017090345-PCT00002
결과 및 결론
도 1은 항GDF-8 세포의 증식 속도가 진탕 실험 시 배지 1과 배지 2 모두에서 유사함을 보여준다.
도 2는 생물반응기에서는 배지 1이 최종 세포 밀도 및 생존성에 배지 3보다 유의적 증가가 있음을 보여준다. 또한, 최종 역가도 플랫폼법의 경우 551mg/L에서 배지 1의 경우 976mg/L로 크게 증가했다(데이터는 미제시). 온도는 5일째 37℃에서 31℃로 전이시켰다. 예상치 않은 높은 세포 증식으로 인하여, 5일 후부터 2용적%의 20X 배지 4 또는 3용적%의 16X 배지 4를 배양물에 매일 공급했다. 즉, 이것은 처음 의도한 진정한 회분식 실험은 아니다. 아스파라긴 및 티아민은 10일째부터 추가공급 배지에 보충했다.
농축 회분식 배지의 개발 시에는 가능한 여러 문제점을 고찰해봐야 한다. 먼저, 농축 영양소는 세포에 독성이 있을 수 있다. 본 실시예에서 개발된 배지에서는 모든 영양소와 성분이 독성 한도 인하인 것으로 측정되었다(데이터는 미제시).
둘째, 농축 회분식 배지는 비농축 배지보다 몰삼투압농도가 필연적으로 더 높다. 이것은 세포 증식 및 생존성에 유해한 영향을 미치는 것으로 밝혀져 있다. 이러한 문제점은 초기 배지에 NaCl의 함량을 저하시킴으로써 해소될 수 있다. 더욱이, 농축된 회분식 배지는 배양 전 기간 동안 증식을 유지시키기에 충분하지 않은 글루코스 농도를 함유한다. 따라서, 배양물은 5일 후 글루코스 원료를 매일 보충했다.
셋째, 인슐린 및 글루타민은 12일 간의 배양 기간 동안 분해에 민감하다. 즉따라서, 이 성분들을 글루코스와 함께 배양물에 보충했다.
마지막으로, 철은 높은 pH에서 고농도의 포스페이트 함유 용액으로부터 석출될 것이다. 이 문제점은 배지 제조 과정 마지막에 철을 첨가하여 피할 수 있고, 그 후 pH를 적당한 수준으로 조정했다.
실시예 2: 유가 회분식 방법에서 항GDF-8 세포를 위한 농축 추가공급 배지(배지 5)의 개발
실시예 1에서는 배지 1을 이용하여 항GDF-8 세포를 배양하는 회분식 방법을 개발했다. 이 방법 동안 초래되는 높은 세포 밀도로 인해 글루코스 및 글루타민뿐만 아니라 영양소의 보충이 여전히 유익할 것으로 판단되었다. 하지만, 8X 배지 4 추가공급 배지를 회분식에 보충하는 것은 배양물을 지나치게 희석시킬 수 있다. 이러한 문제점을 피하기 위하여 더 많이 농축된 추가공급 배지를 개발했다.
재료, 방법 및 결과
표 2는 표 3 내지 7의 조성물에 사용된 배지 4A-1, 배지 4B, 미량원소 B 및 미량원소 D의 조성을 정리한 것이다.
Figure 112007017090345-PCT00003
Figure 112007017090345-PCT00004
20X 배지 4.
1차 농축 배지는 20X 배지 4로 개발했다. 20X 배지 4의 배지 조성물은 표 3에 제시했다.
Figure 112007017090345-PCT00005
주: Nucellin™은 Eli Lilly(미국 인디애나 인디애나폴리스 소재) 제품이다; H/P 스톡 = 0.036mg/ml 하이드로코르티손, 1.08mg/ml Putrescine·2HCl.
배지 조성물은 3 부분, I, II 및 III으로 이루어진다. 부분 I은 폴산(이 비타민의 용해성 문제로 인해)을 제외한 배지 4B의 각 성분을 갖는 8X 배지 4의 농축 형태이다. 부분 II는 부분 I에 첨가 시 철의 가능한 침전을 피하기 위한 철 스톡, 미량원소 D 및 산성 시스테인이다. 부분 III은 폴산 스톡이다. 부분 I은 5일째부터 날마다 2용적%씩 첨가하고, 부분 II와 III은 부분 I와 함께 5일째에 한번 첨가했다.
추가공급 배지의 최종 pH는 7.0으로 조정하고 몰삼투압농도는 약 1064mOsm이었다. 2% 추가공급은 배양물에 2g/L 글루코스, 2mM 글루타민 및 14mOsm 몰삼투압농도 증가를 제공할 것이다.
2. 16X 배지 4
몰삼투압 농도의 증가를 감소시키기 위해, 추가공급 배지를 20X 배지 4(매일 2용적%)에서 16X 배지 4(매일 3용적%)로 변화시켰다. 16X 배지 4의 배지 조성물은 표 4에 제시했다.
Figure 112007017090345-PCT00006
주: Nucellin™은 Eli Lilly(미국 인디애나 인디애나폴리스 소재) 제품이다; H/P 스톡 = 0.036mg/ml 하이드로코르티손, 1.08mg/ml Putrescine·2HCl.
이러한 개량 16X 배지 4에서는 글루코스를 추가로 제거하여 몰삼투압농도를 더욱 감소시키고 글루코스 추가공급의 약간의 유연성을 제공했다. 추가공급 배지의 총 몰삼투압농도는 이제 295mOsm이었다.
3. 16X 배지 4
16X 배지 4 조성물에 변화를 주었다. 이 배지에 철 스톡 용액을 첨가하여, 각 추가공급마다 0.45μM씩 첨가되게 했다. 더욱이, 다시 글루코스를 첨가하여 매 추가공급마다 1.5g/L씩 첨가했다. 이러한 개량 16X 배지 4의 배지 조성은 표 5에 정리했다.
Figure 112007017090345-PCT00007
주: Nucellin™은 Eli Lilly(미국 인디애나 인디애나폴리스 소재) 제품이다; H/P 스톡 = 0.036mg/ml 하이드로코르티손, 1.08mg/ml Putrescine·2HCl.
4. 16X 배지 4
마지막 몇몇 회분식에서와 같이 3가지 분리 추가공급 배지 대신에 혼합 배지로 추가공급 배지(16X 배지 4)를 제조했다. 폴산이 필요한 농도로 용해될 수 있고 4℃ 또는 실온에서 6일 동안 보관 후 철이나 폴산이 용액으로부터 석출되지 않도록 검사를 수행했다. 혼합 16X 배지 4의 배지 조성물은 표 6에 정리했다.
Figure 112007017090345-PCT00008
주: Nucellin™은 Eli Lilly(미국 인디애나 인디애나폴리스 소재) 제품이다; H/P 스톡 = 0.036mg/ml 하이드로코르티손, 1.08mg/ml Putrescine·2HCl.
이 배지의 최종 몰삼투압농도는 매일 2g/L의 글루코스와 1.5mM 글루타민을 첨가 시 724mOsm이다.
5. 12X 배지 4
이제, 추가공급 배지에 여러 변화를 시도했다. 배지 4B의 각 성분을 첨가하는 대신에 배지 4B 분말을 사용했다. 배지 4B 분말은 글루코스와 혼합하고, 이 용액을 pH 10.25로 적정하여 염기성 조건 하에서 각각 용해시켰다. 아미노산 및 비타민 분석 결과, 유가 회분식 방법 말기에 아스파라긴 및 티아민이 고갈된 것으로 확인되어 이 두 성분을 추가로 첨가했다. 12X 배지 4의 사용은 배양물에 첨가 시 몰삼투압 농도의 증가를 더욱 감소시켰다. 12X 배지 4의 배지 조성물은 표 7에 정리했다.
Figure 112007017090345-PCT00009
주: Nucellin™은 Eli Lilly(미국 인디애나 인디애나폴리스 소재) 제품이다; H/P 스톡 = 0.036mg/ml 하이드로코르티손, 1.08mg/ml Putrescine·2HCl.
최종 몰삼투압농도는 566mOsm이었다. 날마다 4용적%의 추가공급은 대략 8.6의 몰삼투압농도 증가, 2g/L의 글루코스 증가 및 1.5mM의 글루타민 증가를 초래한다. 12X 배지 4 배지 조성물은 또한 배지 5로도 알려져 있다. 배지 5는 20X 배지 4 또는 16X 배지 4에 비해 제조하기 쉽고, 실온이나 4℃에서 10일 이상 동안 안정하다(데이터 미제시).
실시예 3: 항GDF-8 세포 배양물의 글루타민 결핍 유가 회분식 방법
CHO 세포는 생존하기 위해 초기 배지에 글루타민을 필요로 한다. 통상, 초기 글루타민 농도는 높고, 5일 후부터 유가 회분식 방법 마지막까지 날마다 글루타민을 추가공급했다. 통상의 유가 회분식 방법은 보통 세포 배양물에 높은 락테이트 및 암모늄 농도를 제공하며, 이것은 세포 증식, 세포 밀도 및 재조합 단백질 발현에 억제 효과를 미치는 것으로 알려져 있다. 글루코스가 배양물에 서서히 첨가되는 유가 회분식 방법은 락테이트 생산을 낮추고 세포 증식, 세포 밀도 및 재조합 단백질 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 하지만, 글루코스 첨가하기 위한 종래 기술의 조작 방법은 대량 제작에 실용적이지 않다. 이에, 글루타민의 초기 농도를 저하시킨 배양 배지를 이용하고 추가공급물에서 글루타민을 제외시킨 결과, 암모늄 및 락테이트의 생산이 더 저하되고, 이로써 세포 생존성이 증가되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 글루타민 결핍 배양물에서는 재조합 단백질 발현이 증가하고 최종 몰삼투압농도가 감소되었다.
재료 및 방법
세포주 및 배지: 항GDF-8 세포는 1L 생물반응기의 배지 1에서 유가 회분식으로 배양했다.
배양 조건: 세포는 1L 생물반응기에서 12일 동안 증식시켰다. 온도는 세포 증식에 따라 4일 또는 5일째 37℃에서 31℃로 전이시켰다. 3회의 유가 회분식 방법을 검사했다: 정상(대조) 방법, 글루타민 추가공급 부재 방법 및 글루타민 결핍 방법. 이 방법에 적절한 세부사항은 표 8과 표 9에 정리했다.
Figure 112007017090345-PCT00010
Figure 112007017090345-PCT00011
시료 분석: 날마다 배양물로부터 시료를 채취하여 세포 밀도, 세포 생존성, 락테이트, 글루타민 및 암모늄 농도에 대해 분석했다. 또한, 발현된 항GDF-8 항체의 역가도 매일 측정했다.
결과 및 결론
도 3은 글루타민 추가공급 부재 또는 대조군 유가 회분식 조건 하에서 증식된 배양물의 세포 밀도를 도시한 것이다. 두 경우 모두, 세포 밀도는 실험 과정 동안 유사했다.
도 4는 글루타민 추가공급 부재 또는 대조군 유가 회분식 조건 하에서 증식된 배양물의 세포 생존성%를 도시한 것이다. 글루타민 추가공급 부재 배양물은 실험 6일째부터 실험 마지막으로 갈수록 현저하게 높아진 세포 생존성을 보여주었다.
도 5는 글루타민 추가공급 부재 또는 대조군 유가 회분식 조건 하에서 증식된 배양물의 암모늄 농도를 도시한 것이다. 글루타민 추가공급 부재 배양물은 4일째부터 실험 마지막으로 갈수록 현저하게 감소된 암모늄 농도를 보여주었다.
도 6은 글루타민 추가공급 부재 또는 대조군 유가 회분식 조건 하에서 증식된 배양물의 락테이트 농도를 도시한 것이다. 락테이트 농도는 실험 전 과정 동안 글루타민 추가공급 부재 배양 조건에서 약간 낮았다.
도 7은 글루타민 추가공급 부재 또는 대조군 유가 회분식 조건 하에서 증식된 배양물의 항GDF-8 항체 역가를 도시한 것이다. 최종 항GDF-8 항체 역가는 글루타민 추가공급 부재 배양물에서 더 높았다.
도 8은 글루타민 결핍 조건 또는 대조군 유가 회분식 조건 하에서 증식된 배양물의 세포 밀도를 도시한 것이다. 두 경우 모두, 세포 밀도는 실험 전 과정 동안 유사했다.
도 9는 글루타민 결핍 조건 또는 대조군 유가 회분식 조건 하에서 증식된 배양물의 세포 생존성을 도시한 것이다. 두 경우 모두, 세포 생존성은 실험 전 과정 동안 유사했다.
도 10은 글루타민 결핍 조건 또는 대조군 유가 회분식 조건 하에서 증식된 배양물의 암모늄 농도를 도시한 것이다. 글루타민 결핍 배양물은 실험 전 과정 동안 암모늄 농도의 현저한 감소를 나타냈다.
도 11은 글루타민 결핍 조건 또는 대조군 유가 회분식 조건 하에서 증식된 배양물의 락테이트 농도를 도시한 것이다. 글루타민 결핍 배양물은 4일째부터 실험 마지막으로 갈수록 락테이트 농도의 현저한 감소르 나타냈다.
도 12는 글루타민 결핍 조건 또는 대조군 유가 회분식 조건 하에서 증식된 배양물의 항GDF-8 항체 역가를 도시한 것이다. 최종 항GDF-8 항체 역가는 글루타민 결핍 배양물에서 더 높았다.
종합해보면, 이러한 결과들은 글루타민 농도 감소가 암모늄 생산 함량을 감소시키고, 세포 생존성을 증가시키며 발현된 항GDF-8 항체의 역가를 증가시켜 세포 배양물에 유익하다는 것을 보여준다. 또한, 글루타민 결핍 배양물에서 낮은 락테이트 농도가 관찰되었고, 이것은 아마도 글루코스 소비율의 감소때문인 것으로 생각된다. 암모늄 및 락테이트 농도의 감소 역시 총 몰삼투압농도의 감소에 영향을 미친다. 몰삼투압농도의 상승은 세포 증식 및 생존성에 억제 효과를 미치는 것으로 알려져 있다. 낮은 초기 글루타민 농도와 함께 글루타민 추가공급의 제거는 보관된 배지에서 글루타민의 비효소적 분해로 인해 생성되는 암모늄을 감소시키는 긍정적인 효과를 나타낸다. 추가공급물 중의 글루타민의 제거는 또한 항GDF-8 세포의 배양 과정을 간단하게 한다.
실시예 4. 배지 1 및 배지 2에서 항GDF-8 세포의 철 용량 반응
배지 1은 배지 2보다 영양소가 더욱 더 농축된 배지이다. 배지 1에서 세포 증식에 최적인 철 농도를 측정하여 세포 배양 동안 철 결핍의 문제점을 해소하고자 했다.
재료 및 방법
항GDF-8 세포는 배지 1 또는 배지 2에서 1회 계대배양으로 접시에서 배양했다. 이 배지의 철 농도는 다른 양의 철 스톡 용액을 첨가하여 조작했다. 최종 세포 밀도는 CEDEX로 측정했다.
결과 및 결론
도 13은 다른 철 농도를 함유하는 배지 1 및 배지 2에서의 항GDF-8 세포의 Fe 용량 반응을 도시한 것이다. 배지 2에서는 세포 밀도가 3μM 내지 15μM 범위의 철 농도에서 비교적 일정했다. 배지 1에서는 세포 밀도가 철 농도의 증가와 함께 증가하지만 약 5μM 후에 최대에 도달했다. 이러한 차이는 배지 1의 높은 영양소 함량 때문일 수 있으며, 이것은 배지에서 철의 킬레이트화로 인해 세포가 이용할 수 있는 철을 감소시킬 수 있기 때문이다. 이러한 결과는 철 농도가 배지 1에서는 철 결핍의 문제점을 해소하기 위해 5μM 이상으로 유지되어야 한다는 것을 보여준다.
실시예 5. 생물반응기 방법에서 글루타민 대신 글루타메이트의 사용
본 실험은 항루이스 Y 세포 배양 방법에서 글루타민 대신에 글루타메이트를 사용한 효과를 검사하기 위한 것이다.
재료 및 방법
본 실험은 pH 7.1, 30% 용존 산소 및 초기 온도 37℃에서 5일째 31℃로 전이 하에 10L 생물반응기에서 실시했다. 살포 기체 및 헤드스페이스 기체는 93% 공기/7% CO2 혼합물 88%와 산소 12%였다. 모든 실험의 초기 배지는 글루타민을 함유하는 배지 1였다. 추가공급 배지 및 추가공급 계획, 예컨대 보충 글루코스 및 글루타민 추가공급은 표 10에 제시했다. "글루타메이트"로 나타낸 컬럼에는 글루타민을 함유하지 않고 표준 배지 5의 글루타민 몰 농도와 같은 몰 농도의 글루타메이트를 함유하는 개량 배지 5를 공급했다. 글루타민으로 나타낸 컬럼에는 표준 배지 5를 공급했다.
Figure 112007017090345-PCT00012
결과 및 결론
각 실험마다 세포 밀도는 도 14에 제시한 바와 같이 유사하다. 세포 밀도는 배양 3일 째 약 6.7로의 pH 편차로 인해 글루타민 2 및 글루타메이트 2 실험에서 낮았다. 글루타민 3 및 글루타메이트 3 실험에서 6일과 7일 사이의 밀도 저하는 6일째 29% 배지 추가공급 때문이다.
도 15는 글루타메이트 및 글루타민 공급 배양물의 세포 생존성을 도시한 것이다. 생존성은 글루타메이트 공급 배양물을 함유하는 생물반응기에서 배양 후반에 더 높게 유지되었다.
실험 1에서 항루이스 Y 역가는 글루타메이트 및 글루타민 공급 배양물마다 유사하다. 도 16은 실험 2와 3에서 항루이스 Y 역가가 글루타민 공급 반응기에서 더 낮은 결과를 보여준다. 이러한 반응기에서 관찰된 낮은 항루이스 Y 역가는 도 17에서 도시된 바와 같이 높은 락테이트 생산량 때문일 수 있다.
추가공급 배지에 글루타메이트를 첨가한 생물반응기는 더 낮은 암모늄 농도(도 18) 및 더 낮은 몰삼투압농도(도 19)를 나타낸다.
결합 ELISA 분석을 이용하여 글루타민 1 및 글루타메이트 1 실험 유래 시료의 활성을 검사했다. 활성은 유사했다: 글루타민 1 시료의 경우 대조군의 110%, 글루타메이트 1 시료의 경우 대조군의 122%(데이터는 미제시).
이러한 실험에서 글루타민의 글루타메이트로의 치환은 세포 밀도에 유의적인 영향을 미치지 않는다. 하지만, 세포 생존성은 글루타민을 공급한 생물반응기에서 더 낮았다. 암모늄, 락테이트 및 몰삼투압농도는 글루타민을 공급한 생물반응기보다 글루타메이트를 공급한 생물반응기에서 더 낮았다. 평균적으로, 항루이스 Y 역가는 글루타메이트를 공급한 생물반응기에서 더 높았고, 활성은 두 조건 하에서 거의 동일했다.
실시예 6. 항루이스 Y 세포 배양법에서 글루코스 및 글루타민의 치환
본 실험은 목적은 항루이스 Y 세포의 배양 시 이하 표 11에 열거한 추가공급 배지로 글루코스와 글루타민을 치환한 효과를 검사하는 것이다(예, Bogheart et al., Antibody-targeted chemotherapy with the calicheamicin conjugate hu3S193-N-acetyl gamma calicheamicin dimethyl hydrazide targets Lewisy and eliminates Lewisy-positive human carcinoma cells and xenografts, Clin.Can.Res. 10:4538-49(2004)). 세포 밀도, 세포 생존성, 항루이스 Y 역가 및 암모늄 농도를 측정했다.
재료 및 방법
본 실험은 초기 부피 75ml 하에 250ml 진탕 플라스크에서 실시했다. 모든 진탕 플라스크에는 배지 2 중의 0.25x 106 세포/ml를 접종했다. 이 플라스크 배양은 37℃, 7% CO2 배양기에서 14일 동안 항온배양했다. 3일 및 4일째, 플라스크에 5용적%의 배지 6 추가공급 배지를 공급했다. 배지 6의 조성은 표 11에 정리했다. 5일 내지 13일째, 플라스크에는 표 12에 정리한 추가공급 용액 중 하나를 5용적%씩 공급했다. 각 조건마다 2회 반복으로 실험했다. 시료는 매일 채취하여 CEDEX로 세포수를 계수하고 암모늄, 글루코스 및 락테이트에 대해 분석했다.
Figure 112007017090345-PCT00013
Figure 112007017090345-PCT00014
결과 및 결론
가장 높은 세포 밀도는 추가공급 배지에 글루코스 또는 갈락토스의 존재 하에, 글루타민 대신에 글루타메이트 또는 글리실글루타민을 사용한 경우에 관찰되었다. 세포 밀도는 글루코스/글루타민, 갈락토스/글루타민 또는 글루코스만 공급된 배양물에서 일반적으로 더 낮았다(도 20). 최종 생존성은 글루코스만 공급된 배양물에서 가장 높았고, 그 다음은 글루코스/글루타메이트가 공급 배양물이었다. 가장 낮은 생존성은 글루코스 또는 갈락토스와 함께 글루타민 또는 아스파라긴이 공급된 배양물에서 관찰되었다(도 21).
14일 역가는 약 700㎍/ml로 글루코스/글리실글루타민 및 글루코스/글루타메이트가 공급된 배양물에서 가장 높았다. 역가는 약 500㎍/ml로 갈락토스/글리실글루타민 및 갈락토스/아스파라긴 공급된 배양물에서 가장 낮았다. 이러한 글루코스/글루타민 대조군의 역가는 약 570㎍/ml였다(도 22).
가장 낮은 암모늄 농도는 글루코스/글루타메이트 또는 글루코스만이 공급된 플라스크에서 관찰되었다. 갈락토스/글루타메이트, 글루코스/글루타민, 글루코스/글리실글루타민 및 글루코스/아스파라긴이 공급된 플라스크는 중간 농도의 암모늄을 나타냈다. 갈락토스/아스파라긴, 갈락토스/글리실글루타민 및 갈락토스/글루타민이 공급된 플라스크는 가장 높은 암모늄 농도를 나타냈다(도 23).
글루코스 농도는 갈락토스가 공급된 모든 플라스크에서 11일째까지 1g/L 이상으로 유지되었다. 11일에서 14일까지는, 이 배양물의 글루코스가 완전하게 고갈되지는 않았지만, 0.6 내지 1g/L 사이를 유지했고, 다른 배양물 간의 유의적인 차이도 없었다.
글루코스 농도는 글루코스 공급된 또는 다른 기질과 혼합된 글루코스 공급된 모든 플라스크에서 10일째까지 증가했다. 이 배양물에서 10일부터 14일까지는 글루코스 농도가 서로 상당히 일정하고 유사하게 유지되었다. 14일째, 글루코스/글루타메이트 공급 배양물에서는 약 8.4g/L 글루코스가 남아 있었고, 글루코스만 공급된 배양물에서는 약 10.8g/L 글루코스가 남아 있었다.
락테이트 농도는 모든 세포마다 동일한 조건일 때 5일째 약 2.4g/L의 높은 농도에 도달했고, 14일까지 모든 배양물에서 거의 0으로 떨어졌다. 락테이트 농도는 글루코스/글루타민 대조군에서 10일부터 14일까지 가장 높았지만, 이 기간 동안 1g/L 미만이었다(데이터는 미제시).
본 실험에서 검사된 모든 조건은 대조군 글루코스/글루타민 조건보다 세포 밀도가 더 높았다. 갈락토스/아스파라긴 조건을 제외한 모든 검사 조건은 글루코스/글루타민 대조군 또는 갈락토스/글루타민 공급 조건보다 최종 생존성이 더 높았다. 글루코스/글루타민 대조군에서의 역가는 약 570㎍/ml인데 반해, 글루코스/글리실글루타민 공급 조건 및 글루코스/글루타메이트 공급 조건에서의 역가는 약 700㎍/ml로 높았다.
실시예 7. 항GDF-8 생산을 위한 글루타민 결핍 회분식 방법의 평가
전형적인 유가 회분식 생산 방법은 배양 기간 동안 복수의 추가공급을 필요로 한다. 이러한 추가공급은 회분식 배양 동안 분해되었을 수도 있고 또는 세포에 의해 고갈되었을 수도 있는 배지의 영양소를 보충하기 위한 것이다. 이러한 추가공급은 그 방법이 더 큰 반응기에서 용량이 증대되어 사용될 때, 임펠러 점프의 필요성과 같은 문제점을 일으킨다(도 24 참조). 더욱이, 추가공급물은 배양물로 이미 분비된 항GDF-8의 함량을 희석시키고, 이에 따라 수확 역가에 영향을 미친다. 회분식 방법의 사용은 추가공급물을 수용하기 위한 부분 부피가 아닌, 최대 부피 상태에서 생물반응기에 접종이 이루어지게 할 것이며, 따라서 임펠러 점프가 필요없고 생산성에 미치는 임의의 희석 효과를 크게 감소시킬 것이다.
글루타민은 유가 회분식 시도가 사용되는 가장 중요한 이유 중 하나는 37℃에서 안정하지 않기 때문이며, 따라서 회분식 배양 동안에는 보충되어야 하는 것으로 생각되었다. 하지만, 글루타민 결핍 전략이 검사된 실시예 2, 5 및 6의 결과를 보면, 글루타민이 공급된 대조 반응기에 비해 생산성이 현저하게 증가되었다. 이러한 결과를 회분식 방법과 병합하여 본 실시예에서는 글루타민 결핍 회분식 방법을 구성하여 검사했다.
재료 및 방법
항GDF-8 세포는 다음과 같은 4가지 증식 조건에 따라 12일 동안 1L 생물반응기에서 증식시켰다. 모든 조건마다 생물반응기의 매개변수는 동일하게 유지시켰다. 용존 산소는 공기 살포를 통해 공기 포화도의 23% 이상으로 유지하고 pH는 0.58M 중탄산나트륨과 0.71M 탄산나트륨을 함유하는 용액을 첨가하여 7.00으로 유지시켰다. 모든 배양물의 온도는 회분식 배양 처음 4일 동안 37℃에서 유지시켰다. 회분식 배양 4일째, 모든 생물반응기의 온도는 31℃로 낮추었고, 남은 회분식 배양 기간 동안 이 온도를 유지했다. 대조군 및 유가 회분식 배양물은 5일, 7일 및 10일째 각각의 추가공급 배지를 총 반응기 부피의 8%, 12% 및 8%로 공급했다.
1) 대조군.
- 접종 배지, 배지 7(표 13 참조).
- 추가공급 배지 8, 5일, 7일 및 10일째 공급(표 13 참조).
- 4일째 5mM 글루타민 추가공급.
- 4일째 31℃로 온도 저하.
2) 유가 회분식 글루타민 결핍.
- 접종 배지, 글루타민 4mM 만을 갖는 배지 7(표 13 참조).
- 5일, 7일 및 10일째 공급된, 글루타민 없는 추가공급 배지 8(표 13 참조).
- 4일째 글루타민 추가공급 없음.
- 4일째 31℃로 온도 저하.
3) 회분식 글루타민 결핍.
- 접종 배지, 글루타민 4mM만을 갖는 신규 회분식 배지(표 13 참조).
- 추가공급 배지 없음.
- 글루타민 추가공급 없음.
- 4일째 온도 31℃로 저하.
- 8일째 글루코스 5g/L 첨가.
4) 8일째 보충된 회분식 글루타민 결핍.
- 접종 배지, 글루타민 4mM만을 갖는 신규 회분식 배지(표 13 참조).
- 추가공급 배지 없음.
- 글루타민 추가공급 없음.
- 4일째 31℃까지 온도 저하.
- 8일째 글루코스 4g, 아스파라긴 375mg, 1mM FeSO4 스톡 3ml, 5g/L Nuvellin™ 스톡 3.33ml, 36mg/L 하이드로코르티손 2.57ml 및 Putrescine 스톡 용액 1.0g/L, 50mg/L 소듐 셀레나이트 스톡 0.23ml 및 티아민 13.1mg 첨가.
Figure 112007017090345-PCT00015
Figure 112007017090345-PCT00016
결과 및 결론
처음 4일 동안의 세포 증식은 대조군 및 회분식 방법에서 유사한 반면, 글루타민 결핍 유가 회분식 방법에서는 세포 밀도가 약간 낮았고, 나머지 회분식 방법에서도 약간 낮게 유지되었다. 두 회분식 방법에서는 회분식 배양 기간 동안 세포 밀도가 더 높게 유지되었는데, 이것은 어떠한 유의적인 희석이 없었기 때문인 것으로 생각된다(도 25 참조). 모든 배양물의 생존성은 8일까지 동일했다. 하지만, 11일째, 보충되지 않은 회분식 방법의 생존성은 다른 3개의 생물반응기보다 낮았고 마지막 날에는 현저하게 낮았다. 이것은 보충된 회분식 방법에서의 생존성이 유가 회분식 생물반응기에서와 동일한 바, 회분식 배지에 최적화될 수 있는 여지가 있음을 암시한다(도 26).
글루타민 결핍 회분식 방법 또는 글루타민 결핍 유가 회분식 방법에서 배양된 세포는 대조군 유가 회분식 방법에서 배양된 동일 세포보다 생산성이 우월했다. 대조군 유가 회분식 방법은 예상한 바와 같이 수거 일의 역가가 685㎍/ml였고, 글루타민 결핍된 유가 회분식 방법의 수거 일 역가는 1080㎍/ml로서 대조군보다 약 58% 더 높았다. 이것은 앞에서 관찰된 결과와 유사하다. 글루타민 결핍된 보충이 없는 회분식 방법은 수거 일 역가가 960㎍/ml로서, 대조군보다 40% 높고, 글루타민 결핍된 유가 회분식 방법과 유사한 반면, 글루타민 결핍 보충 회분식 방법은 1296㎍/ml로 가장 높은 역가를 나타냈다. 이것은 대조군보다 89% 증가된 결과이다(도 27 참조).
4가지 조건의 억제제 농도를 분석한 결과, 글루타민 결핍된 3가지 방법에서는 모두 락테이트 및 암모니아 농도가 대조군보다 훨씬 낮았다. 실제, 4일 후에 3가지 조건은 생산을 멈추거나 락테이트를 소비하기 시작했고, 이에 반해 대조군은 전 회분 배양 동안 락테이트를 지속적으로 생산했다(도 28 참조). 예상한 바와 같이, 암모니아 농도는 글루타민 결핍 방법에서 훨씬 낮았고 4일 후에는 감소한 반면, 대조군은 암모니아를 계속적으로 생산했다(도 29 참조).
본 실시예에서, 글루타민 결핍 전략과 회분식 방법의 병합은 항GDF-8 세포의 대조군 유가 회분식 방법에 비해 생산성을 40% 증가시켰다. 또한, 검사 결과, 회분식 배지의 일부 최적화 시, 생산성이 거의 2배가 개선될 수 있는 것이 암시되었다. 이러한 생산성 개선은 2가지 요인에 기인할 수 있다. 첫째, 글루타민 결핍은 직접 또는 암모니아 및 락테이트 농도를 매우 낮게 유지시켜 생산성을 증가시킨다. 둘째, 추가공급의 부재로 인해, 역가는 회분 배양 중에 희석되지 않는다. 회분식 방법 고유의 작업 용이성과 더불어 생산성 증가는 재조합 폴리펩타이드 생산의 바람직한 방법이 될 수 있게 한다.
실시예 8. 항GDF-8 세포 배양 방법에서 회분식 배지 중의 글루타민 및 아스파라긴 농도의 효과
실시예 2, 5 및 6에서는 글루타민 결핍이 두 세포주의 유가 회분식 배양물에 유익함, 예컨대 세포 증식, 세포 생존성 및 역가의 증가는 물론 락테이트 및 암모늄 생산 감소를 제공한다는 것을 보여주었다. 또한, 아스파라긴도 회분식 배지에서 일 역할을 하는 것으로 보인다.
재료 및 방법
항GDF-8 세포는 1L 생물반응기에서 다른 농도의 글루타민과 아스파라긴을 갖는 개량 배지 9에서 12일 동안 배양했다. 기본 배지 9 조성은 표 14에 정리했다. 이 기본 조성물에 대한 실험 변동을 표 15에 정리했다. 배양물은 처음 5일 동안에는 37℃에서 배양했고, 단 반응기 4만은 온도 조절 문제로 인해 1일째 30℃였다. 배양물의 온도는 6일째 31℃로 전이시켰다. 7일째, 배양물에 글루타민 결핍 배지 5를 5용적%로 1회 공급했다. 배양물의 세포 밀도, 항GDF-8 역가, 락테이트 및 암모늄 농도는 매일 측정했다.
Figure 112007017090345-PCT00017
Figure 112007017090345-PCT00018
Figure 112007017090345-PCT00019
결과 및 결론
도 30, 31, 32 및 33은 다양한 실험 조건 하에서 실험 전 과정을 통해 검사된 항GDF-8 세포의 세포 증식, 항GDF-8 역가, 락테이트 농도 및 암모늄 농도를 도시한 것이다.
모든 실험 조건 하에서, 4mM 글루타민은 검사된 모든 아스파라긴 농도에서 1mM 글루타민보다 양호했다. 비슷한 글루타민 농도에서, 12mM과 20mM 아스파라긴 조건은 8mM 아스파라긴 조건보다 양호했다. 락테이트 및 NH4 농도의 감소는 검사된 모든 조건의 최종 배양물에서 관찰되었다.
실시예 9. 항GDF-8 세포 배양 방법의 회분식 배지에서 글루타민 및 아스파라긴 농도의 효과
실시예 8에서는 4mM 글루타민의 초기 농도를 함유하는 배지 9가 아스파라긴 농도에 관계없이 1mM 글루타민을 함유하는 배지보다 성능이 양호하다는 것을 보여주었다. 본 실시예는 13mM 글루타민 농도와 다양한 아스파라긴 농도를 함유하는 배지 효과를 증명한다.
재료 및 방법
항GDF-8 세포는 1L 생물반응기에서 표 16에 열거된 바와 같이 글루타민 및 아스파라긴의 여러 농도를 갖는 개량 배지 9에서 12일 동안 배양했다. 그 다음, 4일째 배양물을 31℃로 전이시켰다. 7일째, 배양물에는 글루타민 결핍된 배지 5를 5용적%로 1회 공급했다. 배양물의 세포 밀도, 세포 생존성, 락테이트, 암모늄 농도 및 글루타민 농도, 항GDF-8 역가 및 몰삼투압 농도를 주기적으로 측정했다.
Figure 112007017090345-PCT00020
결과 및 결론
도 34, 35, 36, 37, 38, 39 및 40은 다양한 실험 조건하에서 전 실험 과정 동안의 항GDF-8 세포의 세포 증식, 항GDF-8 세포의 생존성%, 락테이트 농도, 암모늄 농도, 글루타민 농도, 항GDF-8 역가 및 몰삼투압 농도를 각각 도시한 것이다.
검사된 모든 조건 중에서, 13mM 글루타민 및 20mM 아스파라긴을 함유한 배지 9만이 세포 증식 및 역가에 상당한 역효과를 보여주었다. 글루타민은 배양물이 4mM 또는 13mM 글루타민에서부터 시작하는 지의 여부에 관계없이 모든 배양물에서 거의 동시에 고갈되었다. 가장 높은 항GDF-8 역가는 13mM 글루타민과 12mM 아스파라긴을 함유하는 배양물에서 수득되었다. 모든 배양 조건은 배양 말기로 갈수록 젖선염 및 암모늄 농도의 감소를 나타냈다. 암모늄 농도는 13mM 글루타민과 20mM 아스파라긴을 함유하는 배양물에서 가장 높았다.
실시예 10. 배지 9에서 배양된 항GDF-8 세포에서 관찰된 락테이트 및 암모늄 농도 감소에 미치는 아스파라긴 및 시스테인 농도의 효과
실시예 2, 5 및 6에 따르면, 글루타민 결핍 조건 하에서 증식된 배양물은 배양 공정 마지막에 락테이트 및 암모늄 농도의 감소를 나타내는 것으로 관찰되었다. 하지만, 비글루타민 결핍 조건하에서 배지 9에서 증식된 배양물 역시 배양 공정 마지막에 락테이트 및 암모늄 농도의 감소를 나타낸다. 이러한 효과는 배지 1과 같은 다른 배지에서는 관찰되지 않았고, 이것은 글루타민 결핍이 락테이트 및 암모늄 농도의 감소에 필수적인 것임을 보여준다. 배지 9 및 배지 1은 아스파라긴의 농도(배지 9에서는 20mM이고 배지 1 + 추가공급에서는 11mM이다)와 산성 시스틴의 농도(배지 9에서는 1.5mM이고 배지 1에서는 0.95mM이다)가 다르다. 본 실시예는 이러한 두 성분이 배양 말기에 관찰되는 락테이트 및 암모늄 농도의 감소를 일으키는 원인인지의 여부를 검사하기 위한 것이다.
재료 및 방법
항GDF-8 세포를 1L 생물반응기에서 12일 동안 배양했다. 배양 초기에는 세포를 37℃에서 배양했고, 8-10x106/ml인 4일 또는 5일째에는 31℃로 전이했다. 표 17은 검사된 다양한 실험 조건을 정리한 것이다. 시료는 매일 채취하여 프로테인 A HPLC에 의한 역가 분석을 위해 보관해 두었다.
Figure 112007017090345-PCT00021
결과 및 결론
배지 9에서 증식된 항GDF-8 세포는 배양물 초기의 글루타민 농도가 4mM 또는 13mM인지의 여부에 관계없이 배양 공정 말기에 락테이트 및 암모늄 농도의 감소를 나타냈다(도 42 및 43 참조). 이에 반해, 배지 1은 오로지 배양물의 초기 글루타민 농도가 4mM인 경우에 배양 공정 말기에 락테이트 및 암모늄 농도의 감소를 나타냈다(도 42 및 43 참조). 글루타민 13mM을 함유한 배지 1에 과잉 아스파라긴 및 시스틴을 첨가한 경우에는 배양 공정 말기의 락테이트 및 암모늄 농도의 감소가 일어나지 않았다(도 42 및 43 참조).
배양 공정 말기에 락테이트 및 암모늄 농도의 감소를 나타내는 배양물(글루타민 4mM인 배지 1, 글루타민 4mM인 배지 9 및 글루타민 13mM인 배지 9)은 또한 배양 공정 말기의 총 몰삼투압농도가 저하된 것으로 관찰되었다(도 47 참조).
글루타민 4mM인 배지 9는 최고의 항GDF-8 역가를 나타냈고, 그 다음은 4일째 13mM 글루타민이 공급된 배지 9였다(도 46 참조). 추가공급물의 희석 효과를 고려하면, 글루타민 4mM인 배지 9와 글루타민 13mM 함유 배지 9의 항GDF-8 역가는 동등한 것이다.
실시예 11. 배지 9에서 배양된 항GDF-8 세포에서 관찰되는 락테이트 및 암모늄 농도의 감소에 미치는 아미노산 및 비타민 농도의 효과
실시예 10은 배지 1과 배지 9 사이의 아스파라긴 및 시스테인 농도의 차이가 글루타민이 결핍되지 않은 배지 9에서 배양 공정 말기에 관찰되는 락테이트 및 암모늄 농도의 감소에 원인인지를 검사했다. 검사 결과, 그 요인들은 관찰된 감소의 원인이 아닌 것으로 측정되었다. 배지 1 및 배지 9는 또한 아미노산 및 비타민 농도가 달랐다. 이에 본 실시예는 두 배지 사이의 아미노산 및 비타민 농도의 차이가 관찰된 감소의 원인인지의 여부를 검사한다.
재료 및 방법
항GDF-8 세포를 12일 동안 1L 생물반응기에서 배양했다. 배양 초기에는 세포를 37℃에서 배양했고, 8-10x106/ml인 4일째에는 31℃로 전이했다. 표 18은 검사된 다양한 실험 조건을 정리한 것이다. 아미노산, 비타민, 하이드로코르티손 및 푸트레신, 미량원소 E(조성은 표 19에 정리했다) 및 철은 이 성분들의 농도가 배지 9에서의 농도와 동일하도록 다양한 실험 배지 1 조건에 첨가했다. 시료는 매일 채취하여 프로테인 A HPLC에 의한 역가 분석을 위해 보관해 두었다.
Figure 112007017090345-PCT00022
주: AA = 아미노산, H/P = 0.036mg/ml 하이드로코르티손, 1.08mg/ml 프투레신·2HCl, E: 미량원소 E.
Figure 112007017090345-PCT00023
결과 및 결론
검사된 모든 조건은 아미노산이 첨가된 배지 1을 제외하고는 배양 공정 말기의 락테이트 및 암모늄 농도의 감소를 나타냈다. 이것은 배지 1과 비교했을 때 배지 9에서 증가된 아미노산 농도가 락테이트 및 암모늄 농도의 감소에 원인일 가능성이 없다는 것을 시사한다(도 49 및 50 참조). 하지만, 비타민, 하이드로코르티손 및 푸트레신, 미량원소 E 및 철이 첨가된 배지 1은 아미노산이 첨가된 배지 1에 비하여 배양 공정 말기의 락테이트 및 암모늄 농도가 더 낮은 것으로 나타났다(도 49 및 50 참조). 이것은 이러한 성분들이 배지 9에서 관찰된 감소에 원인일 수 있음을 시사한다.
비타민, 하이드로코르티손 및 푸트레신, 미량원소 E 및 철이 첨가된 배지 1에서 증식된 배양물은 초기 배지 중에 존재하는 아스파라긴 및 글루타민의 총 함량이 더 낮은 이유로 인해 전 실험 동안 암모늄 농도가 가장 낮았다(도 50 참조).
실시예 12. 배지 9에서 배양된 항GDF-8 세포에서 관찰되는 락테이트 및 암모늄 농도의 감소에 미치는 비타민, 미량원소 E 및 철 농도의 효과
실시예 11에서는 배지 1에 비해 배지 9에서 증가된 비타민, 하이드로코르티손 및 푸트레신, 미량원소 E 및 철의 농도가 배양 공정 말기에 관찰된 락테이트 및 암모늄 농도의 감소에 원인일 수 있는 것으로 측정되었다. 이제, 이러한 성분들이 존재한다면 관찰된 감소의 원인인지를 측정하기 위해 각각, 그리고 조합하여 검사했다.
재료 및 방법
항GDF-8 세포를 1L 생물반응기에서 12일 동안 배양했다. 배양 초기에는 세포를 37℃에서 배양했고, 8-10x106/ml인 4일째에는 31℃로 전이시켰다. 단, 미량원소 E를 함유하는 배지 1에서는 약 6x106 세포/ml인 4일째 전이시켰다. 표 20은 검사된 다양한 실험 조건을 정리한 것이다. 하이드로코르티손과 푸트레신은 배지 9에서의 이 성분들의 농도와 동등하도록 모든 배지 1 조건에 첨가했다. 비타민, 미량원소 E(조성물은 표 19에 정리했다) 및 철은 이 성분들의 농도가 배지 9의 농도와 동등하도록 다양한 실험 배지 1 조건에 첨가했다. 시료는 매일 채취하여 프로테인 A HPLC에 의한 역가 분석을 위해 보관해 두었다.
Figure 112007017090345-PCT00024
주: E: 미량원소 E.
결과 및 결론
검사된 모든 조건 중에서, 글루타민 13mM을 함유하는 배지 9 및 미량원소 E를 함유하는 배지 1만이 오로지 배양 공정 말기의 락테이트 및 암모늄 농도의 감소를 나타냈다(도 54 및 55 참조). 미량원소 E를 함유하는 배지 1에서 관찰되는 농도 감소는 이 배양물이 세포 농도가 약 6x106 세포/ml일 때 온도가 전이되었다는 사실 때문일 수 있음을 간과해서는 아니 된다.
13mM 글루타민을 함유하는 배지 9는 어떠한 배지 1 조성물보다도 더 높은 항GDF-8 역가를 나타냈다.
실시예 13. 세포 증식 및 항GDF-8 역가에 미치는 배지 1, 3 및 9의 비교
본 실험은 배지 1, 3 및 9를 이용하여 세포 증식 및 항GDF-8 역가의 차이를 측정하기 위한 것이다.
재료 및 방법
항GDF-8 세포는 표 21에 정리된 바와 같은 다양한 배지에서 추가공급 조건 하에 배양했다. 세포는 1L 생물반응기에서 12일 동안 증식시키고 4일째 37℃에서 31℃로 전이시켰다.
Figure 112007017090345-PCT00025
주: 배지 5-Gln - 글루타민 결실된 배지 5
Figure 112007017090345-PCT00026
주: 배지 5-Gln - 글루타민 결실된 배지 5
결과 및 결론
배지 9에서 배양된 항GDF-8 세포는 가장 높은 세포 밀도와 항GDF-8 역가를 나타낸 반면, 배지 3에서 배양된 항GDF-8 세포는 가장 낮은 세포 밀도와 항GDF-8 역가를 나타냈다(도 57 및 도 58 참조). 배지 9가 배지 1보다 우수한 결과를 나타낸다는 사실은 배지 성분을 복수의 추가공급을 통해 공급하는 것보다 배지 성분을 초기 배지에 제공하는 것이 낫다는 것을 보여준다. 또한, 배지 1과 배지 9가 둘다 배지 3보다 더 양호한 결과를 제공한다는 사실은 아미노산을 약 70mM 미만의 농도로 제공하는 것보다 아미노산을 약 70mM초과의 농도로 제공하는 것이 우수한 결과를 나타낸다는 것을 보여준다. 마지막으로, 초기 배지에 약 70mM 초과 농도의 아미노산을 제공하는 경우가 가장 높은 세포 밀도와 역가를 산출했다(배지 9 vs. 배지 1 비교).
실시예 14. 생물반응기의 항GDF-8 세포 배양물에서 배지 9의 최적 글루타민 및 아스파라긴 총 농도에 대한 통계 분석
재료 및 방법
항GDF-8 세포는 1L 생물반응기에서 증식시키고 표 23에 제시된 날짜에 37℃에서 31℃로 온도 전이시켰다. 최종 역가는 글루타민 단독물의 최적 농도 및 글루타민과 아스파라긴 총 조합물의 최적 농도를 측정하기 위해 T 검정으로 처리했다. 표 23은 배지 9에서 증식된 항GDF-8 세포의 몇가지 적절한 실험 조건 및 최종 결과를 정리한 것이다.
Figure 112007017090345-PCT00027
주: 배지 5-Gln : 글루타민 결실된 배지 5
결과 및 결론
도 59는 다양한 농도의 글루타민 단독물과 글루타민 및 아스파라긴 총 조합물에 대하여 추정된 항GDF-8 역가를 도시한 것이다. 표 24는 2 내지 15mM 사이의 글루타민 농도에서의 규정 역가 및 이 범위외의 글루타민 농도에서의 규정 역가를 비교한 T 검정 결과를 나타낸다. 표 25는 16 내지 36mM 사이의 글루타민 및 아스파라긴 조합 농도에 대한 규정 역가와 이 범위외의 글루타민 및 아스파라긴 조합 농도의 규정 역가를 비교한 T 검정 결과를 도시한 것이다.
T 검정 결과는 모두 비교된 두 그룹 간의 항GDF-8 역가가 유의적인 차이가 있음을 보여주었다. 글루타민 2 내지 15mM 사이 및 글루타민과 아스파라긴 조합물 16 내지 36mM 사이를 함유하는 배지 9에서 증식된 배양물은 이 범위외의 글루타민 농도 및 글루타민과 아스파라긴 합계 농도를 함유한 배지에서 증식된 배양물보다 더 높은 항GDF-8 역가를 나타냈다. 모든 실험에서, 아스파라긴 농도는 9mM보다 높았다.
Figure 112007017090345-PCT00028
Figure 112007017090345-PCT00029
실시예 15. 세포 배양에 미치는 배지의 효과.
본 실시예는 고밀도 접종 배양물을 이용하여 중간 규모의 다양한 3가지 세포 배양 배지의 성능을 연구한 것이다. 검사된 모든 배지는 소규모 생물반응기 데이터를 기초로 할 때 단계 1 배지(배지 11 추가공급 배지가 공급된 배지 10)보다 개선된 결과를 나타낼 것으로 예상되었다.
재료 및 방법
사람화된 항Abeta 펩타이드 IgG1 모노클로날 항체("항ABeta 세포")를 발현하는 CHO 세포는 표 26에 제시한 바와 같은 다양한 배지에서 검사했다(Basi et al., Humanized Antibodies that Recognize Beta Amyloid Peptide, WO 02/46237). pH 하한 설정점은 0.95M Na2CO3 + 0.05M K2CO3로 조절한 7.0이었고, 예외적으로 단계 1에서는 0.58M 중탄산나트륨과 0.71M 탄산나트륨을 함유한 용액으로 조절했다. 용존 산소는 필요에 따라 공기를 살포하여 30%로 조절하고, 교반은 60rpm에서 실시했으며, 추가공급 배지는 배지 5(제시된 바와 같이 글루타민 존재 또는 부재 하에)였다. 모든 배양물은 130L 규모로 증식시켰고, 단 03P49B501은 500L 규모로 증식시켰다. 간략히 설명하면, 배지 1은 상대적 흡수 속도를 고려하지 않고 모든 영양소가 농후한 배지이며, 배지 12는 무분별하게 농후한 배지로부터 분명하게 불필요한 영양소를 제거하여 균형을 맞춘 배지이다. 배지 10, 11 및 12의 조성은 표 27에 정리했다.
Figure 112007017090345-PCT00030
* 단계 1 방법에는 배지 5만큼 고영양 배지는 아닌 배지 12를 공급했다.
Figure 112007017090345-PCT00031
Figure 112007017090345-PCT00032
Figure 112007017090345-PCT00033
결과 및 결론
배지 변화는 본 실험 과정 동안 안정적인 개선을 유도했다. 세포 증식, 생존성, 락테이트 농도의 감소, 암모늄 농도의 감소 및 역가로 볼 때, 글루타민 농도는 상승된 경우보다 감소된 경우가 개선되었고(도 60 내지 64 참조), 균형(회분식) 배지는 고영양 배지(배지 1)보다 개선된 결과를 제공했다(도 60 내지 64 참조). 고밀도 접종물로부터 개시된 배양물은 저말도 접종물로부터 개시된 배양물보다 더 높은 최종 역가를 나타냈다(도 64 참조).
소규모 생물반응기에서 관찰된 결과와 달리, 1차 배지(고 Gln 함유 배지 1)는 원 공정보다 낮은 역가를 나타냈다(도 64 참조). 또한, 온도 변화 후 락테이트 흡수에 어떠한 전이도 없었다(도 62 참조). 이것은 이 배지가 약간의 규모 민감성이 있을 수 있음을 암시한다. 이러한 결론은 본 중간 규모 실험과 함께 수행한 소규모(2L) 병행 실험을 통해 지지되었다. 글루타민이 감소된 2차 배지 조성물은 적어도 본 실험에서는 규모에 민감하지 않았다(도 60 내지 65 참조). 이반복 공정(회분식 2와 3, 그리고 회분식 5와 6)은 매우 양호한 실험간 재현성을 나타내어(도 60 내지 65 참조), 본 연구에서 모인 모든 데이터에 신뢰도를 증가시켰다.
실시예 16. 배지 9를 이용한 TNFR-Ig의 생산
재료 및 방법
IgG1의 Fc 부분에 결합된 사람 75킬로달턴(p75) 종양괴사인자 수용체(TNFR)의 세포외 리간드 결합 부분으로 이루어진 이량체 융합 단백질("TNFR-Ig 세포")을 발현하는 CHO 세포를 관류 생물반응기 유래 고밀도 배양물로 접종하여, 생산용 생물반응기 단계용 배지 9에 3x106 생존 세포/ml가 되게 희석했다.
결과 및 결론
도 66, 67, 68, 69, 70, 71 및 72는 각각 세포 증식, 세포 생존성, 잔류 글루코스, 글루타민 농도, 락테이트 농도, 암모늄 농도 및 상대적 산물 역가를 나타낸다. 공정에 적은 변형 범위 하에서, 모든 조건은 양호한 세포 증식, 높은 세포 생존성 및 높은 총 최종 역가를 제공했다.
본 실험의 모든 조건에서, 대사 억제성 부산물인 락테이트는 소모되거나 또는 농도 정제 상태였고, 이는 락테이트 생산이 정지되었음을 암시한다. 이와 마찬가지로, 억제성 대사산물인 암모늄도, 초기에는 농도가 상승했지만 온도 전이 후 어느 시점부터는 암모늄이 세포에 의해 소비되기 시작했다. 본 실시예에서는, TNFR-Ig 세포 배양물이 화학 유동제인 부티르산나트륨 및 HMBA로 처리되었다.
실시예 17. 대규모 및 소규모 배양 조건의 비교
재료 및 방법
배양물의 크기가 적절한 배양 특성에 영향을 미치는지의 여부를 측정하기 위하여, 항GDF-8 세포를 소규모 1리터 생물반응기 또는 대규모 6000리터 생물반응기에서 증식시켰다. 세포는 37℃에서 증식시킨 다음, 4일째 31℃로 온도 전이시켰다.
결과 및 결론
도 73, 74, 75 및 76에서 볼 수 있는 바와 같이(각각 세포 밀도, 역가, 락테이트 농도 및 암모늄 농도를 나타낸다), 6000리터 대규모 배양물과 1리터 소규모 배양물 사이에 상기 특성들에 대한 관련성 있는 차이는 전혀 없었다. 락테이트 농도와 암모늄 농도는 모두 4일째 온도 전이 후 감소하기 시작했다. 본 실시예는 배양물이 동일한 증식 조건으로 처리될 때 배양물 크기가 세포 밀도, 세포 생존성, 락테이트 농도 및 암모늄 농도에 영향을 미치지 않음을 입증해준다.

Claims (108)

  1. 대상 TNFR-Ig를 암호화하고 세포 배양 조건 하에서 발현되는 유전자를 함유한 포유동물 세포; 및
    글루타민을 함유하고, (i) 단위 부피당 아미노산 누적 양이 약 70mM 초과이고, (ii) 아스파라긴에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 2 미만이며, (iii) 총 아미노산에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 0.2 미만이고, (iv) 총 아미노산에 대한 무기 이온의 누적 몰비가 약 0.4 내지 1이며, (v) 단위 부피당 글루타민 및 아스파라긴 농도의 누적 합계 양이 약 16mM 초과인 특징, 및 이의 조합된 특징으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 배지 특징을 갖는 배지
    를 함유하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
    상기 배양물을 제1 배양 조건 세트 하에서 유지시킨 경우 수득될 수 있는 최대 생존 세포 밀도의 약 20% 내지 80% 범위의 생존 세포 밀도로 상기 세포를 증식시키기에 충분한 제1 기간 동안 상기 제1 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 초기 성장 단계로 유지시키는 단계;
    하나 이상의 배양 조건을 변화시켜 제2 배양 조건 세트를 적용하는 단계; 및
    상기 세포 배양물에 TNFR-Ig가 축적될 정도의 제2 기간 동안 상기 제2 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 유지시키는 단계
    를 포함하는, 대량 생산용 세포 배양물에서 TNFR-Ig를 생산하는 방법.
  2. 대상 TNFR-Ig를 암호화하고 세포 배양 조건 하에서 발현되는 유전자를 함유한 포유동물 세포; 및
    단위 부피당 아미노산 누적 양이 약 70mM초과인 배지로서,
    글루타민을 함유하며,
    (i) 아스파라긴에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 2 미만이며, (ii) 총 아미노산에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 0.2 미만이고, (iii) 총 아미노산에 대한 무기 이온의 누적 몰비가 약 0.4 내지 1이며, (iv) 단위 부피당 글루타민 및 아스파라긴 농도의 누적 합계 양이 약 16mM 초과인 특징, 및 이의 조합된 특징으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 2가지 배지 특징을 갖는 배지
    를 함유하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
    상기 배양물을 제1 배양 조건 세트 하에서 유지시킨 경우 수득될 수 있는 최대 생존 세포 밀도의 약 20% 내지 80% 범위의 생존 세포 밀도로 상기 세포를 증식시키기에 충분한 제1 기간 동안 상기 제1 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 초기 성장 단계로 유지시키는 단계;
    하나 이상의 배양 조건을 변화시켜 제2 배양 조건 세트를 적용하는 단계; 및
    상기 세포 배양물에 TNFR-Ig가 축적될 정도의 제2 기간 동안 상기 제2 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 유지시키는 단계
    를 포함하는, 대량 생산용 세포 배양물에서 TNFR-Ig를 생산하는 방법.
  3. 대상 TNFR-Ig를 암호화하고 세포 배양 조건 하에서 발현되는 유전자를 함유 한 포유동물 세포; 및
    아스파라긴에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 2 미만인 배지로서,
    글루타민을 함유하며,
    (i) 단위 부피당 아미노산 누적 양이 약 70mM초과이고, (ii) 총 아미노산에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 0.2 미만이고, (iii) 총 아미노산에 대한 무기 이온의 누적 몰비가 약 0.4 내지 1이며, (iv) 단위 부피당 글루타민 및 아스파라긴 농도의 누적 합계 양이 약 16mM 초과인 특징, 및 이의 조합된 특징으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 2가지 배지 특징을 갖는 배지
    를 함유하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
    상기 배양물을 제1 배양 조건 세트 하에서 유지시킨 경우 수득될 수 있는 최대 생존 세포 밀도의 약 20% 내지 80% 범위의 생존 세포 밀도로 상기 세포를 증식시키기에 충분한 제1 기간 동안 상기 제1 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 초기 성장 단계로 유지시키는 단계;
    하나 이상의 배양 조건을 변화시켜 제2 배양 조건 세트를 적용하는 단계; 및
    상기 세포 배양물에 TNFR-Ig가 축적될 정도의 제2 기간 동안 상기 제2 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 유지시키는 단계
    를 포함하는, 대량 생산용 세포 배양물에서 TNFR-Ig를 생산하는 방법.
  4. 대상 TNFR-Ig를 암호화하고 세포 배양 조건 하에서 발현되는 유전자를 함유한 포유동물 세포; 및
    총 아미노산에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 0.2 미만인 배지로서,
    글루타민을 함유하며,
    (i) 단위 부피당 아미노산 누적 양이 약 70mM초과이고, (ii) 아스파라긴에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 2 미만이고, (iii) 총 아미노산에 대한 무기 이온의 누적 몰비가 약 0.4 내지 1이며, (iv) 단위 부피당 글루타민 및 아스파라긴 농도의 누적 합계 양이 약 16mM 초과인 특징, 및 이의 조합된 특징으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 2가지 배지 특징을 갖는 배지
    를 함유하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
    상기 배양물을 제1 배양 조건 세트 하에서 유지시킨 경우 수득될 수 있는 최대 생존 세포 밀도의 약 20% 내지 80% 범위의 생존 세포 밀도로 상기 세포를 증식시키기에 충분한 제1 기간 동안 상기 제1 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 초기 성장 단계로 유지시키는 단계;
    하나 이상의 배양 조건을 변화시켜 제2 배양 조건 세트를 적용하는 단계; 및
    상기 세포 배양물에 TNFR-Ig가 축적될 정도의 제2 기간 동안 상기 제2 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 유지시키는 단계
    를 포함하는, 대량 생산용 세포 배양물에서 TNFR-Ig를 생산하는 방법.
  5. 대상 TNFR-Ig를 암호화하고 세포 배양 조건 하에서 발현되는 유전자를 함유한 포유동물 세포; 및
    총 아미노산에 대한 무기 이온의 누적 몰비가 약 0.4 내지 1인 배지로서,
    글루타민을 함유하며,
    (i) 단위 부피당 아미노산 누적 양이 약 70mM초과이고, (ii) 아스파라긴에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 2 미만이고, (iii) 총 아미노산에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 0.2 미만이며, (iv) 단위 부피당 글루타민 및 아스파라긴 농도의 누적 합계 양이 약 16mM 초과인 특징, 및 이의 조합된 특징으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 2가지 배지 특징을 갖는 배지
    를 함유하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
    상기 배양물을 제1 배양 조건 세트 하에서 유지시킨 경우 수득될 수 있는 최대 생존 세포 밀도의 약 20% 내지 80% 범위의 생존 세포 밀도로 상기 세포를 증식시키기에 충분한 제1 기간 동안 상기 제1 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 초기 성장 단계로 유지시키는 단계;
    하나 이상의 배양 조건을 변화시켜 제2 배양 조건 세트를 적용하는 단계; 및
    상기 세포 배양물에 TNFR-Ig가 축적될 정도의 제2 기간 동안 상기 제2 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 유지시키는 단계
    를 포함하는, 대량 생산용 세포 배양물에서 TNFR-Ig를 생산하는 방법.
  6. 대상 TNFR-Ig를 암호화하고 세포 배양 조건 하에서 발현되는 유전자를 함유한 포유동물 세포; 및
    단위 부피당 글루타민 및 아스파라긴 농도의 누적 합계 양이 약 16mM 초과인 배지로서,
    글루타민을 함유하며,
    (i) 단위 부피당 아미노산 누적 양이 약 70mM초과이고, (ii) 아스파라긴에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 2 미만이고, (iii) 총 아미노산에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 0.2 미만이며, (iv) 총 아미노산에 대한 무기 이온의 누적 몰비가 약 0.4 내지 1인 특징, 및 이의 조합된 특징으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 2가지 배지 특징을 갖는 배지
    를 함유하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
    상기 배양물을 제1 배양 조건 세트 하에서 유지시킨 경우 수득될 수 있는 최대 생존 세포 밀도의 약 20% 내지 80% 범위의 생존 세포 밀도로 상기 세포를 증식시키기에 충분한 제1 기간 동안 상기 제1 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 초기 성장 단계로 유지시키는 단계;
    하나 이상의 배양 조건을 변화시켜 제2 배양 조건 세트를 적용하는 단계; 및
    상기 세포 배양물에 TNFR-Ig가 축적될 정도의 제2 기간 동안 상기 제2 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 유지시키는 단계
    를 포함하는, 대량 생산용 세포 배양물에서 TNFR-Ig를 생산하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 하나 이상의 배양 조건 단계가 변화될 때의 세포 배양 조건이 (i) 온도, (ii) pH, (iii) 삼투질 농도, (iv) 화학 유도제 농도, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 배지의 초기 글루타민 농도가 13mM 이하인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 배지의 초기 글루타민 농도가 10mM 이하인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 배지의 초기 글루타민 농도가 7mM 이하인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 배지의 초기 글루타민 농도가 4mM 이하인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 단위 부피당 배지의 글루타민 총 누적 양이 13mM 이하인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 단위 부피당 배지의 글루타민 총 누적 양이 10mM 이하인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 단위 부피당 배지의 글루타민 총 누적 양이 7mM 이하인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 단위 부피당 배지의 글루타민 총 누적 양이 4mM 이하인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 글루타민이 세포 배양을 시작할 때 초기 배지에만 제공되는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 배지에 가용성 철의 농도가 5μM 초과인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 배양물의 생존 세포 밀도가 주기적으로 측정되는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 배양물의 생존성이 주기적으로 측정되는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 배양물의 락테이트 농도가 주기적으로 측정되는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 배양물의 암모늄 농도가 주기적으로 측정되는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 배양물의 역가가 주기적으로 측정되는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 배양물의 삼투질 농도가 주기적으로 측정되는 방법.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 측정이 매일 실시되는 방법.
  25. 제1항에 있어서, 포유동물 세포의 초기 밀도가 2x102 세포/ml 이상인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 포유동물 세포의 초기 밀도가 2x103 세포/ml 이상인 방법.
  27. 제1항에 있어서, 포유동물 세포의 초기 밀도가 2x104 세포/ml 이상인 방법.
  28. 제1항에 있어서, 포유동물 세포의 초기 밀도가 2x105 세포/ml 이상인 방법.
  29. 제1항에 있어서, 포유동물 세포의 초기 밀도가 2x106 세포/ml 이상인 방법.
  30. 제1항에 있어서, 포유동물 세포의 초기 밀도가 5x106 세포/ml 이상인 방법.
  31. 제1항에 있어서, 포유동물 세포의 초기 밀도가 10x106 세포/ml 이상인 방법.
  32. 제1항에 있어서, 배양물을 제공하는 단계가 배양물 약 1000L 이상을 제공함을 포함하는 방법.
  33. 제1항에 있어서, 배양물을 제공하는 단계가 배양물 약 2500L 이상을 제공함 을 포함하는 방법.
  34. 제1항에 있어서, 배양물을 제공하는 단계가 배양물 약 5000L 이상을 제공함을 포함하는 방법.
  35. 제1항에 있어서, 배양물을 제공하는 단계가 배양물 약 8000L 이상을 제공함을 포함하는 방법.
  36. 제1항에 있어서, 배양물을 제공하는 단계가 배양물 약 10,000L 이상을 제공함을 포함하는 방법.
  37. 제1항에 있어서, 배양물을 제공하는 단계가 배양물 약 12,000L 이상을 제공함을 포함하는 방법.
  38. 제1항에 있어서, 제1 배양 조건 세트가 약 30 내지 42℃인 제1 온도 범위를 포함하는 방법.
  39. 제1항에 있어서, 제1 배양 조건 세트가 약 32 내지 40℃인 제1 온도 범위를 포함하는 방법.
  40. 제1항에 있어서, 제1 배양 조건 세트가 약 34 내지 38℃인 제1 온도 범위를 포함하는 방법.
  41. 제1항에 있어서, 제1 배양 조건 세트가 약 36 내지 37℃인 제1 온도 범위를 포함하는 방법.
  42. 제1항에 있어서, 제1 배양 조건 세트가 약 37℃인 제1 온도 범위를 포함하는 방법.
  43. 제1항에 있어서, 제2 배양 조건 세트가 약 25 내지 41℃인 제2 온도 범위를 포함하는 방법.
  44. 제1항에 있어서, 제2 배양 조건 세트가 약 27 내지 38℃인 제2 온도 범위를 포함하는 방법.
  45. 제1항에 있어서, 제2 배양 조건 세트가 약 29 내지 35℃인 제2 온도 범위를 포함하는 방법.
  46. 제1항에 있어서, 제2 배양 조건 세트가 약 29 내지 33℃인 제2 온도 범위를 포함하는 방법.
  47. 제1항에 있어서, 제2 배양 조건 세트가 약 30 내지 32℃인 제2 온도 범위를 포함하는 방법.
  48. 제1항에 있어서, 제2 배양 조건 세트가 약 31℃인 제2 온도 범위를 포함하는 방법.
  49. 제1항에 있어서, 하나 이상의 배양 조건을 변화시키는 것을 포함하는 하나 이상의 배양 조건을 변화시키는 제1 변화 단계에 이어서 제2 변화 단계를 추가로 포함하고, 제3 배양 조건 세트를 배양물에 적용하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 제2 변화 단계가 (i) 온도, (ii) pH, (iii) 삼투질 농도, (iv) 화학 유도제 농도, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 배양 조건을 변화시키는 것을 포함하는 방법.
  51. 제49항에 있어서, 제3 배양 조건 세트가 약 25 내지 40℃인 제3 온도 범위를 포함하는 방법.
  52. 제49항에 있어서, 제3 배양 조건 세트가 약 27 내지 37℃인 제3 온도 범위를 포함하는 방법.
  53. 제49항에 있어서, 제3 배양 조건 세트가 약 29 내지 34℃인 제3 온도 범위를 포함하는 방법.
  54. 제49항에 있어서, 제3 배양 조건 세트가 약 30 내지 32℃인 제3 온도 범위를 포함하는 방법.
  55. 제1항에 있어서, 제1 기간이 0 내지 8일인 방법.
  56. 제1항에 있어서, 제1 기간이 1 내지 7일인 방법.
  57. 제1항에 있어서, 제1 기간이 2 내지 6일인 방법.
  58. 제1항에 있어서, 제1 기간이 3 내지 5일인 방법.
  59. 제1항에 있어서, 제1 기간이 약 4일인 방법.
  60. 제1항에 있어서, 제1 기간이 약 5일인 방법.
  61. 제1항에 있어서, 제1 기간이 약 6일인 방법.
  62. 제1항에 있어서, 제1 기간과 제2 기간의 총 합이 5일 이상인 방법.
  63. 제1항에 있어서, 배양물을 제2 기간 동안 유지시키는 단계에서, 배양물 중의 락테이트 농도가 최대 농도에 도달한 후에 감소하는 방법.
  64. 제1항에 있어서, 배양물을 제2 기간 동안 유지시키는 단계에서, 배양물 중의 암모늄 농도가 최대 농도에 도달한 후에 감소하는 방법.
  65. 제1항에 있어서, 생산된 TNFR-Ig의 총 함량이, 명시된 배지 특징이 결여된 것 이외에는 동일한 배지에서 동일한 조건 하에서 생산된 TNFR-Ig 함량보다 1.5배 이상 높은 방법.
  66. 제1항에 있어서, 생산된 TNFR-Ig의 총 함량이, 명시된 배지 특징이 결여된 것 이외에는 동일한 배지에서 동일한 조건 하에서 생산된 TNFR-Ig 함량보다 2배 이상 높은 방법.
  67. 제1항에 있어서, 세포 배양물에 보충 성분이 추가로 제공되는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 보충 성분이 다수의 간격으로 제공되는 방법.
  69. 제67항에 있어서, 보충 성분이 호르몬 및/또는 기타 성장 인자, 특정 이온(예, 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액, 비타민, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드, 미량원소(보통 매우 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 아미노산, 지질 또는 글루코스 또는 다른 에너지원으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  70. 대상 TNFR-Ig를 암호화하고 세포 배양 조건 하에서 발현되는 유전자를 함유한 포유동물 세포; 및
    글루타민을 함유하고, (i) 초기 아미노산 농도가 약 70mM초과이고, (ii) 아스파라긴에 대한 글루타민의 몰비가 약 2 미만이며, (iii) 총 아미노산에 대한 글루타민의 몰비가 약 0.2 미만이고, (iv) 총 아미노산에 대한 무기 이온의 몰비가 약 0.4 내지 1이며, (v) 글루타민 및 아스파라긴의 합계 농도가 약 16mM 초과인 특징으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 2개 이상의 배지 특징을 갖는 합성 배지
    를 함유하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
    상기 배양물을 제1 배양 조건 세트 하에서 유지시킨 경우 수득될 수 있는 최대 생존 세포 밀도의 약 20% 내지 80% 범위의 생존 세포 밀도로 상기 세포를 증식시키기에 충분한 제1 기간 동안 상기 제1 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 초기 성장 단계로 유지시키는 단계;
    하나 이상의 배양 조건을 변화시켜 제2 배양 조건 세트를 적용하는 단계; 및
    상기 세포 배양물에 TNFR-Ig가 축적될 정도의 제2 기간 동안 상기 제2 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 유지시키는 단계
    를 포함하는, 대량 생산용 세포 배양물에서 TNFR-Ig를 생산하는 방법.
  71. 대상 TNFR-Ig를 암호화하고 세포 배양 조건 하에서 발현되는 유전자를 함유한 포유동물 세포; 및
    글루타민을 함유하고, (i) 초기 아미노산 농도가 약 70mM초과이고, (ii) 아스파라긴에 대한 글루타민의 몰비가 약 2 미만이며, (iii) 총 아미노산에 대한 글루타민의 몰비가 약 0.2 미만이고, (iv) 총 아미노산에 대한 무기 이온의 몰비가 약 0.4 내지 1이며, (v) 글루타민 및 아스파라긴의 합계 농도가 약 16mM 초과인 특징으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 3개 이상의 배지 특징을 갖는 합성 배지
    를 함유하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
    상기 배양물을 제1 배양 조건 세트 하에서 유지시킨 경우 수득될 수 있는 최대 생존 세포 밀도의 약 20% 내지 80% 범위의 생존 세포 밀도로 상기 세포를 증식시키기에 충분한 제1 기간 동안 상기 제1 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 초기 성장 단계로 유지시키는 단계;
    하나 이상의 배양 조건을 변화시켜 제2 배양 조건 세트를 적용하는 단계; 및
    상기 세포 배양물에 TNFR-Ig가 축적될 정도의 제2 기간 동안 상기 제2 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 유지시키는 단계
    를 포함하는, 대량 생산용 세포 배양물에서 TNFR-Ig를 생산하는 방법.
  72. 대상 TNFR-Ig를 암호화하고 세포 배양 조건 하에서 발현되는 유전자를 함유한 포유동물 세포; 및
    글루타민을 함유하고, (i) 초기 아미노산 농도가 약 70mM초과이고, (ii) 아스파라긴에 대한 글루타민의 몰비가 약 2 미만이며, (iii) 총 아미노산에 대한 글루타민의 몰비가 약 0.2 미만이고, (iv) 총 아미노산에 대한 무기 이온의 몰비가 약 0.4 내지 1이며, (v) 글루타민 및 아스파라긴의 합계 농도가 약 16mM 초과인 특징으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 4개 이상의 배지 특징을 갖는 합성 배지
    를 함유하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
    상기 배양물을 제1 배양 조건 세트 하에서 유지시킨 경우 수득될 수 있는 최대 생존 세포 밀도의 약 20% 내지 80% 범위의 생존 세포 밀도로 상기 세포를 증식시키기에 충분한 제1 기간 동안 상기 제1 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 초기 성장 단계로 유지시키는 단계;
    하나 이상의 배양 조건을 변화시켜 제2 배양 조건 세트를 적용하는 단계; 및
    상기 세포 배양물에 TNFR-Ig가 축적될 정도의 제2 기간 동안 상기 제2 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 유지시키는 단계
    를 포함하는, 대량 생산용 세포 배양물에서 TNFR-Ig를 생산하는 방법.
  73. 대상 TNFR-Ig를 암호화하고 세포 배양 조건 하에서 발현되는 유전자를 함유한 포유동물 세포; 및
    글루타민을 함유하고, (i) 초기 아미노산 농도가 약 70mM초과이고, (ii) 아스파라긴에 대한 글루타민의 몰비가 약 2 미만이며, (iii) 총 아미노산에 대한 글루타민의 몰비가 약 0.2 미만이고, (iv) 총 아미노산에 대한 무기 이온의 몰비가 약 0.4 내지 1이며, (v) 글루타민 및 아스파라긴의 합계 농도가 약 16mM 초과임을 특징으로 하는 합성 배지
    를 함유하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
    상기 배양물을 제1 배양 조건 세트 하에서 유지시킨 경우 수득될 수 있는 최대 생존 세포 밀도의 약 20% 내지 80% 범위의 생존 세포 밀도로 상기 세포를 증식시키기에 충분한 제1 기간 동안 상기 제1 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 초기 성장 단계로 유지시키는 단계;
    하나 이상의 배양 조건을 변화시켜 제2 배양 조건 세트를 적용하는 단계; 및
    상기 세포 배양물에 TNFR-Ig가 축적될 정도의 제2 기간 동안 상기 제2 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 유지시키는 단계
    를 포함하는, 대량 생산용 세포 배양물에서 TNFR-Ig를 생산하는 방법.
  74. 대상 TNFR-Ig를 암호화하고 세포 배양 조건 하에서 발현되는 유전자를 함유한 포유동물 세포; 및
    글루타민을 함유하고, 단위 부피당 글루타민 및 아스파라긴의 합계 누적량이 약 16mM 초과인 배지
    를 함유하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
    상기 배양물을 제1 배양 조건 세트 하에서 유지시킨 경우 수득될 수 있는 최대 생존 세포 밀도의 약 20% 내지 80% 범위의 생존 세포 밀도로 상기 세포를 증식시키기에 충분한 제1 기간 동안 상기 제1 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 초기 성장 단계로 유지시키는 단계;
    하나 이상의 배양 조건을 변화시켜 제2 배양 조건 세트를 적용하는 단계; 및
    상기 세포 배양물에 TNFR-Ig가 축적될 정도의 제2 기간 동안 상기 제2 배양 조건 세트 하에서 상기 배양물을 유지시키는 단계
    를 포함하는, 대량 생산용 세포 배양물에서 TNFR-Ig를 생산하는 방법.
  75. 제1항에 있어서, 배지가 글루타민을 함유하고, (i) 초기 아미노산 농도가 약 70mM초과이고, (ii) 초기 아스파라긴에 대한 초기 글루타민의 몰비가 약 2 미만이며, (iii) 초기 총 아미노산에 대한 초기 글루타민의 몰비가 약 0.2 미만이고, (iv) 초기 총 아미노산에 대한 초기 무기 이온의 몰비가 약 0.4 내지 1이며, (v) 초기 글루타민 및 초기 아스파라긴의 합계 농도가 약 16mM 초과인 특징, 및 이의 조합된 특징으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 배지 특징을 갖는 방법.
  76. 제1항 내지 제6항 또는 제70항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
    락테이트 농도가 상기 배지 특징이 결여된 것 이외에는 동일한 배지에서 동일 조건 하에 관찰되는 농도보다 낮고,
    암모늄 농도가 상기 배지 특징이 결여된 것 이외에는 동일한 배지에서 동일 조건 하에 관찰되는 농도보다 낮으며,
    생산된 TNFR-Ig의 총 함량이 상기 배지 특징이 결여된 것 이외에는 동일한 배지에서 동일 조건 하에 관찰되는 함량보다는 높은 방법.
  77. 제1항에 있어서, 배양물이 TNFR-Ig의 생산 과정 동안에 추가 성분으로 보충되지 않는 방법.
  78. 제1항에 있어서, 배양물이 TNFR-Ig의 생산 과정 동안에 추가 글루타민으로 보충되지 않는 방법.
  79. 제1항에 있어서, 배양물의 글루타민 농도가 제2 배양 조건 세트로 변화시키는 단계 이전에 실질적으로 고갈된 방법.
  80. 제1항에 있어서, 배양물의 글루타민 농도가 제2 배양 조건 세트로 변화시키는 단계와 거의 동시에 실질적으로 고갈된 방법.
  81. 제1항에 있어서, 배양물의 글루타민 대신에 글리실글루타민이 사용되는 방법.
  82. 제1항에 있어서, 배지가 (i) 단위 부피당 아미노산 누적 양이 약 70mM 초과 이고, (ii) 아스파라긴에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 2 미만이며, (iii) 총 아미노산에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 0.2 미만이고, (iv) 총 아미노산에 대한 무기 이온의 누적 몰비가 약 0.4 내지 1이며, (v) 단위 부피당 글루타민 및 아스파라긴의 누적 합계 양이 약 16mM 초과인 방법.
  83. 제1항에 있어서, 배지가 (i) 단위 부피당 아미노산 누적 양이 약 70mM 초과이고, (ii) 총 아미노산에 대한 글루타민의 누적 몰비가 약 0.2 미만이고, (iii) 총 아미노산에 대한 무기 이온의 누적 몰비가 약 0.4 내지 1이며, (iv) 단위 부피당 글루타민 및 아스파라긴의 누적 합계 양이 약 16mM 초과인 방법.
  84. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 히스티딘, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 프롤린의 누적 총 함량이 약 25mM초과인 방법.
  85. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 히스티딘, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 프롤린의 누적 총 함량이 약 35mM초과인 방법.
  86. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 히스티딘, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 프롤린의 초기 총 함량이 약 25mM초과인 방법.
  87. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 히스티딘, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 프롤린의 초기 총 함량이 약 35mM초과인 방법.
  88. 제1항에 있어서, 배지가,
    (i) 단위 부피당 히스티딘의 누적 총 함량이 약 1.7mM초과이고;
    (ii) 단위 부피당 이소류신의 누적 총 함량이 약 3.5mM초과이며;
    (iii) 단위 부피당 류신의 누적 총 함량이 약 5.5mM초과이고;
    (iv) 단위 부피당 메티오닌의 누적 총 함량이 약 2.0mM초과이고;
    (v) 단위 부피당 페닐알라닌의 누적 총 함량이 약 2.5mM초과이며;
    (vi) 단위 부피당 프롤린의 누적 총 함량이 약 2.5mM초과이고;
    (vii) 단위 부피당 트립토판의 누적 총 함량이 약 1.0mM초과이며;
    (viii) 단위 부피당 티로신의 누적 총 함량이 약 2.0mM초과이고;
    (ix) 단위 부피당 프롤린의 누적 총 함량이 약 2.5mM초과인 특징으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 배지 특징을 갖는 방법.
  89. 제1항에 있어서, 배지가,
    (i) 단위 부피당 히스티딘의 초기 함량이 약 1.7mM초과이고;
    (ii) 단위 부피당 이소류신의 초기 함량이 약 3.5mM초과이며;
    (iii) 단위 부피당 류신의 초기 함량이 약 5.5mM초과이고;
    (iv) 단위 부피당 메티오닌의 초기 함량이 약 2.0mM초과이고;
    (v) 단위 부피당 페닐알라닌의 초기 함량이 약 2.5mM초과이며;
    (vi) 단위 부피당 프롤린의 초기 함량이 약 2.5mM초과이고;
    (vii) 단위 부피당 트립토판의 초기 함량이 약 1.0mM초과이며;
    (viii) 단위 부피당 티로신의 초기 함량이 약 2.0mM초과이고;
    (ix) 단위 부피당 프롤린의 초기 함량이 약 2.5mM초과인 특징으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 배지 특징을 갖는 방법.
  90. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 세린의 누적 총 함량이 약 7mM초과인 방법.
  91. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 세린의 누적 총 함량이 약 10mM초과인 방법.
  92. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 아스파라긴의 누적 총 함량이 약 8mM초과인 방법.
  93. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 아스파라긴의 누적 총 함량이 약 12mM 초과인 방법.
  94. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 아스파라긴의 초기 총 함량이 약 8mM초과인 방법.
  95. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 아스파라긴의 초기 총 함량이 약 12mM초과인 방법.
  96. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 인의 누적 총 함량이 약 2.5mM초과인 방법.
  97. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 인의 누적 총 함량이 약 5mM초과인 방법.
  98. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 글루타메이트의 누적 총 함량이 약 1mM 미만인 방법.
  99. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 칼슘 판토테네이트의 누적 총 함량이 약 8mg/L초과인 방법.
  100. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 칼슘 판토테네이트의 누적 총 함량이 약 20mg/L초과인 방법.
  101. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 니코틴아미드의 누적 총 함량이 약 7mg/L초과인 방법.
  102. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 니코틴아미드의 누적 총 함량이 약 25mg/L초과인 방법.
  103. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 피리독신 및 피리독살의 누적 총 함량이 약 5mg/L초과인 방법.
  104. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 피리독신 및 피리독살의 누적 총 함량이 약 35mg/L초과인 방법.
  105. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 리보플라빈의 누적 총 함량이 약 1.0mg/L초과인 방법.
  106. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 리보플라빈의 누적 총 함량이 약 2.0mg/L초과인 방법.
  107. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 티아민 하이드로클로라이드의 누적 총 함량이 약 7mg/L초과인 방법.
  108. 제1항에 있어서, 배지에 단위 부피당 티아민 하이드로클로라이드의 누적 총 함량이 약 35mg/L초과인 방법.
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