发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种重组人抗体融合蛋白的制备方法,它包括如下步骤:
取基础培养基,接种转染了重组人抗体融合蛋白表达载体的细胞培养;从培养的第4天起补加补料培养基培养;从培养的第4或第5天起开始补加铵根离子培养;
培养至细胞活率低于80%,收获培养液制备得到重组人抗体融合蛋白。
进一步地,所述基础培养基选自通常用于培养CHO细胞的基础培养基,包括EX-Advanced、FortiCHO、Actipro;所述补料培养基包括F201、CD FortiCHO、Cell.Boost7。
更进一步地,所述基础培养基由Gln和体积比2:1的培养基B、培养基C混合而成;
所述基础培养基中Gln的浓度为2~6mmol/L;
所述培养基B包括注射用水、22.09g/L的Ex-Advanced CHO干粉、0.877g/L的L-Glutamine、1.5g/L的Poloxamer、1.9g/L的NaHCO3,其pH为5.0;
所述培养基C包括注射用水、24.60g/L CD FortiCHO干粉;
所述补料培养基包括注射用水、24.60g/L的CD FortiCHO干粉、35.00g/L的Glucose粉末,其pH 7.20±0.20。
进一步地,从培养的第4天起开始补加铵根离子使培养液中铵根离子的浓度为5~9mmol/L。
进一步地,所述补加铵根离子是通过补加NH4Cl溶液的方式添加,所述NH4Cl溶液的浓度为1~5mol/L,优选2mol/L。
进一步地,所述补料培养基每次加入量为培养液的5~10%。
进一步地,所述基础培养基的pH7.20±0.20,渗透压300±20mOsm/kg。
更进一步地,所述培养的条件为:温度37.0℃,溶解氧40%,转速70~200rpm,表层通气2.00lpm,接种当天培养液pH:7.00±0.15;所述培养期间监测Gln浓度,使之浓度维持在1mmol/L及以上。
进一步地,所述接种细胞后活细胞密度为0.25-0.35×106cells/ml。
更进一步地,所述细胞是转染了重组人抗体融合蛋白表达载体的CHO DG44细胞株;所述重组人抗体融合蛋白为重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
本发明一种重组人抗体融合蛋白的制备方法,通过在转染了重组人抗体融合蛋白表达载体的细胞培养阶段,第4或5天开始补加NH4 +,使培养液中NH4 +浓度维持在5~9mmol/L,进而达到保持整个培养过程中细胞生长的活细胞密度和活率,同时又能够大幅度降低酸性峰比例,提高了重组人抗体融合蛋白的药效,具有实际推广应用价值。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品,其中Ex-Advanced CHO、L-Glutamine、Poloxamer、CD FortiCHO、Glucose、Gln等都是商用的细胞培养基成分,均可通过购买市售产品获得。
实施例1、本发明重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的制备
1)培养基的制备
a、基础培养基
培养基B:由注射用水、22.09g/L的Ex-Advanced CHO干粉、0.877g/L的L-Glutamine、1.5g/L的Poloxamer、1.9g/L的NaHCO3组成,其pH为5.0;
培养基C:由注射用水、24.60g/L CD FortiCHO干粉组成;
将培养基C与培养基B混合,加入Gln使之浓度为4mM,搅拌10-20min即得pH7.20±0.20,渗透压300±20mOsm/kg的基础培养基。
b、补液培养基
由注射用水、24.60g/L的CD FortiCHO干粉、35.00g/L的Glucose粉末组成,其pH7.20±0.20;
c、其他液体
NH4Cl溶液:NH4Cl溶解在注射用水中制得2mol/L的NH4Cl溶液;
S66:S61(50mM)的配制:取250ml烧杯,加入180.00g注射用水,开启磁力搅拌,加入1.98g MnCl2·4H2O粉末(10mmol),搅拌10-15min,用注射用水定容200.00g,搅拌10-15min,待用;
取2L烧杯,加入1020.00g注射用水,开启磁力搅拌,加入188.03g N-Acetyl-D-mannosamine粉末(0.85mol);加入已经配制好的S61 17.00g,搅拌30-40min。用注射用水定容至1700.00g,搅拌10-20min;
2)重组人抗体融合蛋白的制备
①取基础培养基,接种转染了重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白表达载体的CHO DG44细胞株,接种后基础培养基中活细胞密度为0.25-0.35×106cells/ml,在pH:7.00±0.15(接种当天),温度37.0℃,溶解氧40%,转速70rpm,空气流速1.50lpm,表层通气2.00lpm的条件下培养;
②培养至第4天,补加培养液体积5%的补液培养基,以及培养液体积1%的S66,之后每隔一日补加补液培养基,其加入量除第8日为培养液体积10%外,其余时间加入量为培养液体积5%;
③培养至第5天,补加NH4Cl溶液,之后每日通过补加NH4Cl溶液的方式控制培养液中铵根离子的浓度5~9mmol/L。
④培养至细胞活率低于80%,即可。
实施例2、本发明重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的制备
1)培养基的制备
a、基础培养基
培养基B:由注射用水、22.09g/L的Ex-Advanced CHO干粉、0.877g/L的L-Glutamine、1.5g/L的Poloxamer、1.9g/L的NaHCO3组成,其pH为5.0;
培养基C:由注射用水、24.60g/L CD FortiCHO干粉组成;
将培养基C与培养基B混合,加入Gln使之浓度为4mM,搅拌10-20min即得pH7.20±0.20,渗透压300±20mOsm/kg的基础培养基。
b、补液培养基
由注射用水、24.60g/L的CD FortiCHO干粉、35.00g/L的Glucose粉末组成,其pH7.20±0.20;
c、其他液体
NH4Cl溶液:NH4Cl溶解在注射用水中制得2mol/L的NH4Cl溶液;
2)重组人抗体融合蛋白的制备
①取基础培养基,接种转染了重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白表达载体的CHO DG44细胞株,接种后基础培养基中活细胞密度为0.25-0.35×106cells/ml,在pH:7.00±0.15(接种当天),温度37.0℃,溶解氧40%,转速200rpm,空气流速15mlpm,表层通气2.00lpm的条件下培养;
②培养至第4天,补加培养液体积5%的补液培养基,以及NH4Cl溶液至培养液中铵根离子的浓度为5~9mmol/L;之后每隔一日补加补液培养基,其加入量除第8日为培养液体积10%外,其余时间加入量为培养液体积5%,以及每日通过补加NH4Cl溶液的方式控制培养液中铵根离子的浓度5~9mmol/L;补加液体时监测Gln浓度,使之浓度维持在1mmol/L及以上;
③培养至细胞活率低于80%,即可。
实施例3、本发明重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的制备
1)培养基的制备
a、基础培养基
培养基B:由注射用水、22.09g/L的Ex-Advanced CHO干粉、0.877g/L的L-Glutamine、1.5g/L的Poloxamer、1.9g/L的NaHCO3组成,其pH为5.0;
培养基C:由注射用水、24.60g/L CD FortiCHO干粉组成;
将培养基C与培养基B混合,加入Gln使之浓度为4mM,搅拌10-20min即得pH7.20±0.20,渗透压300±20mOsm/kg的基础培养基。
b、补液培养基
由注射用水、24.60g/L的CD FortiCHO干粉、35.00g/L的Glucose粉末组成,其pH7.20±0.20;
c、其他液体
NH4Cl溶液:NH4Cl溶解在注射用水中制得2mol/L的NH4Cl溶液;
2)重组人抗体融合蛋白的制备
①取基础培养基,接种转染了重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白表达载体的CHO DG44细胞株,接种后基础培养基中活细胞密度为0.25-0.35×106cells/ml,在pH:7.00±0.15(接种当天),温度37.0℃,溶解氧40%,转速200rpm,空气流速15mlpm,表层通气2.00lpm的条件下培养;
②培养至第4天,补加培养液体积5%的补液培养基,以及NH4Cl溶液至培养液中铵根离子的浓度为5~9mmol/L;之后每隔一日补加补液培养基,其加入量除第8日为培养液体积10%外,其余时间加入量为培养液体积5%,以及每日通过补加NH4Cl溶液的方式控制培养液中铵根离子的浓度5~9mmol/L;
③培养至细胞活率低于80%,即可。
实施例4、本发明重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的制备
1)培养基的制备
a、基础培养基
培养基B:由注射用水、22.09g/L的Ex-Advanced CHO干粉、0.877g/L的L-Glutamine、1.5g/L的Poloxamer、1.9g/L的NaHCO3组成,其pH为5.0;
培养基C:由注射用水、24.60g/L CD FortiCHO干粉组成;
将培养基C与培养基B混合,加入Gln使之浓度为4mM,搅拌10-20min即得pH7.20±0.20,渗透压300±20mOsm/kg的基础培养基。
b、补液培养基
由注射用水、24.60g/L的CD FortiCHO干粉、35.00g/L的Glucose粉末组成,其pH7.20±0.20;
c、其他液体
NH4Cl溶液:NH4Cl溶解在注射用水中制得2mol/L的NH4Cl溶液;
2)重组人抗体融合蛋白的制备
①取基础培养基,接种转染了重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白表达载体的CHO DG44细胞株,接种后基础培养基中活细胞密度为0.25-0.35×106cells/ml,在pH:7.0±0.3(接种当天)、6.9±0.1(培养第5天),温度37.0℃,溶解氧40%,转速200rpm,空气流速15mlpm,表层通气2.00lpm的条件下培养;
②培养至第4天,补加培养液体积5%的补液培养基,以及NH4Cl溶液至培养液中铵根离子的浓度为5~9mmol/L;之后每隔一日补加补液培养基,其加入量除第8日为培养液体积10%外,其余时间加入量为培养液体积5%;以及每日通过补加NH4Cl溶液的方式控制培养液中铵根离子的浓度5~9mmol/L;
③培养至细胞活率低于80%,即可。
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
试验例1本发明重组表达融合蛋白rhVEGFR-Fc制备方法研究
一、重组人抗体融合蛋白基因的工程细胞株构建
pCHO 1.0载体经AvrII(CCTAGG)和PacI(TTAATTAA)双酶切后,与重组人抗体融合蛋白基因片段连接,连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,涂布于含有氨苄抗性的LB琼脂培养板上,通过抗性筛选,平板上获得单菌落转化子。
挑选单克隆菌落培养后提取重组质粒,提取的重组质粒AvrII/PacI双酶切进行DNA测序,重组质粒测序结果与预期序列比对一致。
将克隆正确的重组质粒Pvu I单酶切处理后转化到处于对数生长期的CHO-DG44宿主细胞(购自Invitrogen公司),获得工程菌株,将工程菌接种到含MTX(氨甲喋呤,500nM/L)的培养基中,培养到对数生长期,根据细胞状态和表达量选定本发明试验重组人抗体融合蛋白产品的工程细胞株(表达重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的重组CHODG44细胞株)。选定表达水平大于3.0g/L,远远高于现有CHO-K1和CHO-S细胞的表达量;经原位杂交技术分析鉴定表明重组人抗体融合蛋白表达载体已经完全整合到工程细胞株的染色体内得到工程细胞株。其中,所述重组人抗体融合蛋白氨基酸序列为SEQ ID No.:1所示的序列。
SEQ ID No:1氨基酸序列:
SDTGRPFVEM YSEIPEIIHM TEGRELVIPC RVTSPNITVT LKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNAT YKEIGLLTCE ATVNGHLYKT NYLTHRQTNTIIDVVLSPSH GIELSVGEKL VLNCTARTELNVGIDFNWEY PSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSP G
二、三级细胞库建立
复苏工程细胞株,建立三级细胞库。
三、培养
1、不同补加液体研究
取WCB 37.0℃水浴解冻,接种到装有C/B种子培养基的摇瓶中,复苏细胞活率>85%,复苏细胞后依次进行摇瓶种子扩增、WAVE扩增,WAVE扩增培养活细胞密度达3.0-5.0×106cells/ml范围内,得种子液。
1.1补液方法
取种子液进行100ml的摇瓶培养实验1-4,接种密度(0.3*e6),实验1-4中的基础培养基与实施例1相同,其补料液体不同,实验1为补Cu2+和Zn2+和C5,实验2为补加EGCG和C5,实验3为补加S66和C5,实验4补加C5和控制铵根离子浓度,控制策略为:从D4开始,维持培养液的铵根离子浓度在5-9mmol/L。
摇床培养条件:37℃、110rpm、5.0%CO2、80%湿度,具体补料方案见表1
表1不同补料方案
注:EGCG(Epigallocatechin gallate),表没食子儿茶素没食子酸酯,市售产品。
S66制备:S61(50mM)的配制:取250ml烧杯,加入180.00g注射用水,开启磁力搅拌,加入1.98g MnCl2·4H2O粉末(10mmol),搅拌10-15min,用注射用水定容200.00g,搅拌10-15min,待用。
取2L烧杯,加入1020.00g注射用水,开启磁力搅拌,加入188.03g N-Acetyl-D-mannosamine粉末(0.85mol);加入已经配制好的S61 17.00g,搅拌30-40min。用注射用水定容至1700.00g,搅拌10-20min。
C5(补液培养基)制备:由注射用水、24.60g/L的CD FortiCHO干粉、35.00g/L的Glucose粉末组成,其pH 7.20±0.20;
1.2不同补加液得到的蛋白检测结果
具体见表2
表2不同补加液的蛋白检测结果
从上述结果可见:实验1补Cu2+和Zn2+和C5,培养过程中细胞活率下降过快,中途结束培养;实验2补加EGCG和C5,虽然其酸性峰有一些下降,但是其在D10时,其细胞密度仅为9.38*106,细胞活率下降到76.77%,不满足生产要求;实例3中,补加补加S66和C5,虽然细胞密度和活率都符合要求,但是其酸性峰为9.1%,偏离标准品(约4%)5%多;实验4即控制铵根离子的实验组酸性峰比例为3.1%,比例明显下降,且细胞密度和细胞活率都符合要求。
2、不同补液工艺研究
2.1补液方法
方法①
取种子液接入200L反应器,通过基础培养和补料培养获得重组人抗体融合蛋白,其中培养方法同实施例1,培养至D11天,即细胞活率低于80%,结束培养,无菌取样检测细胞密度、活率和最终表达量;其中第5天的NH4+在培养液中的浓度为5.03mmol/L,第6天为8.2mmol/L,第7天为6.8mmol/L,第8天为6.4mmol/L,第9天为6.5mmol/L,第10天为6.8mmol/L,第11天为8.8mmol/L。
方法②
取种子液接入2L反应器,按实施例2培养至D11天,即细胞活率低于80%,结束培养,无菌取样检测细胞密度、活率和最终表达量;
方法③
取种子液接入2L反应器,按实施例3培养至D11天,即细胞活率低于80%,结束培养,无菌取样检测细胞密度、活率和最终表达量;
方法④
取种子液接入2L反应器,按实施例4培养至D11天,即细胞活率低于80%,结束培养,无菌取样检测细胞密度、活率和最终表达量;
对比方法
a、取种子液接入2L反应器,接种入与实施例1相同的基础培养基中,接种后基础培养基中活细胞密度为0.25-0.35×106cells/ml,在pH:7.0±0.15(接种当天),温度37.0℃,溶解氧40%,转速70rpm,空气流速15mlpm,表层通气2.00lpm的条件下培养;
b、培养至第4天,补加培养液体积5%的补液培养基,以及培养液体积1%的S66,之后每隔一日补加补液培养基,其加入量除第8日为培养液体积10%外,其余时间加入量为培养液体积5%;
c、培养至细胞活率低于80%,即可;
上述方法②~④以及对比方法与方法①的区别在于:在方法①的基础上,将补加铵根离子的开始日期调整到培养的第4天,同时选择添加S66,以及是否控制Gln浓度,具体培养条件比较见表3。
表3培养条件比较
2.2不同方法得到的蛋白检测结果
具体见表4
表4不同培养方法得到的蛋白检测结果
从上述结果可见:方法①~④的酸性峰比例均低于对比方法,其中方法②,pH控制在7.0±0.15、Gln浓度低于1mM时补至1mM以及从D4开始铵根离子维持培养液的铵根离子浓度在5-9mmol/L的条件下,酸性峰比例最低。
综上,本发明重组人抗体融合蛋白的制备方法,通过在转染了重组人抗体融合蛋白表达载体的细胞培养阶段,补加NH4 +,使培养液中NH4 +浓度维持在5~9mmol/L,进而达到保持整个培养过程中细胞生长的活细胞密度和活率,同时又能够大幅度降低酸性峰比例,提高了重组人抗体融合蛋白的药效,具有实际推广应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 景泽生物医药(合肥)有限公司
上海景泽生物技术有限公司
成都景泽生物制药有限公司
<120> 一种重组人抗体融合蛋白的制备方法
<130> GYKH1285-2021P0114481CC
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr
195 200 205
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
210 215 220
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
225 230 235 240
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
245 250 255
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
260 265 270
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
275 280 285
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
290 295 300
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
305 310 315 320
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
325 330 335
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
340 345 350
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
355 360 365
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
370 375 380
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
385 390 395 400
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
405 410 415
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
420 425 430