KR101439195B1 - 에셰리키아 콜리 a-53 균주를 이용하여 섬유소 분해효소의 생산성을 향상시키는 공정 - Google Patents

에셰리키아 콜리 a-53 균주를 이용하여 섬유소 분해효소의 생산성을 향상시키는 공정 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에셰리키아 콜리 A-53 균주를 생육에 적합한 환경에서 배양하는 과정에서 특정 시간에 배지의 pH와 온도를 변화시킴으로써 섬유소 분해효소의 생산성을 극대화시킬 수 있는 공정에 관한 것이다.
본 발명은 에셰리키아 콜리 A-53 균주를 이용하여 섬유소 분해효소를 생산할 수 있는 최적의 조건을 제공하여 섬유소 분해 효소의 생산량을 2.12배까지 향상시키는 효과를 발휘한다. 한편, 본 발명은 섬유소 분해효소 생산을 위한 액체배양 공정을 향상시킨 것인바 대량생산 공정에 적용하기 위한 부가적인 장치가 필요 없는 경제적인 공정이라는 장점이 있다.

Description

에셰리키아 콜리 A-53 균주를 이용하여 섬유소 분해효소의 생산성을 향상시키는 공정{Advanced process for enhanced production of cellulase by Escherichia coli A-53 }
본 발명은 에셰리키아 콜리 A-53 균주를 이용하여 섬유소 분해효소의 생산성을 향상시키는 공정에 관한 것으로, 더 상세하게는 에셰리키아 콜리 A-53 균주를 생육에 적합한 환경에서 배양 후 특정 시간에 배지의 pH와 온도를 변화시킴으로써 섬유소 분해효소의 생산성을 극대화시킬 수 있는 공정에 관한 것이다.
식물의 다당류는 중요한 에너지 자원으로, 이를 효율적으로 활용할 필요성이 있다. 섬유소(cellulose)는 포도당이 β-1,4 결합으로 이루어진 중합체로서 식물 생체 건조중량의 약 40% 이상을 차지하고 있다. 섬유소 분해효소란 이와 같은 포도당의 β-1,4 결합에 의하여 축합된 섬유소의 가수분해를 촉매하는 효소로, 고등식물의 싹, 푸른곰팡이, 누룩곰팡이 또는 목재부패균 등의 진균류 및 수많은 토양세균에서 찾아볼 수 있다.
섬유소 분해효소는 1,4-β-D-클루칸 글루카노하이드로라아제(endoglucanase, EG), 1,4-β-D-클루칸 셀로비오하이드로라아제(exoglucanase, CBH), β-D-클루코사이드 글루코하이드로라아제(β-glucosidase) 세 종류의 효소로 구성되어 있다. 1,4-β-D-클루칸 글루카노하이드로라아제(endoglucanase, EG), 1,4-β-D-클루칸 셀로비오하이드로라아제(exoglucanase, CBH)가 단독으로 작용할 때에는 아비셀(avicel)과 같은 결정형 섬유소를 분해하지 못하나 이들 세 효소가 공동으로 작용하면 섬유소를 효과적으로 분해할 수 있다.
대부분의 섬유소 분해효소는 아스퍼길러스(Aspergillus) 및 트리코더마(Trichoderma) 속의 균주를 이용하여 고체 배양법으로 생산하고 있으나, 바실러스(Bacillus ), 셀로모나스(Cellomoans ) 및 클로스트리디윰(Clostridium ) 속의 세균을 사용하여 액체 배양법으로 생산하고 있기도 하다.
본 발명자들은 액체 배양이 가능하도록 제조된 균주인 에셰리키아 콜리 A-53(Escherichia coli A-53; KACC 91334P)를 이용하여 상기 균주의 증식에 최적인 조건에서 특정 시간에 배지의 배양온도, pH를 변화시켜 섬유소 분해효소를 생산성을 향상시키는 공정을 발명하였다.
대한민국 등록특허 10-0652186
따라서, 본 발명의 목적은 에셰리키아 콜리 A-53 (Escherichia coli A-53; KACC 91334P) 균주를 사용하여 섬유소 분해효소를 생산하는 최적의 공정을 제공하는 것이다.
이를 위하여 본 발명은 에셰리키아 콜리 A-53 (Escherichia coli A-53; KACC 91334P) 균주를 사용하여 섬유소 분해효소를 생산하는 방법에 있어서, 섬유소 분해효소의 생산성을 향상시키기 위하여 배지의 초기 pH를 7.0으로 배양하다 pH를 8.0으로 변화시키는 섬유소 분해효소 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 섬유소 분해효소 생산 방법은 배지의 초기 pH를 7.0으로 하여 36 시간 배양 후 상기 배지의 pH를 8.0으로 변화시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 에셰리키아 콜리 A-53 (Escherichia coli A-53; KACC 91334P) 균주를 사용하여 섬유소 분해효소를 생산하는 방법에 있어서, 섬유소 분해효소의 생산성을 향상시키기 위하여 초기 배양 온도를 40℃로 배양하다 배양 온도를 35℃로 변화시키는 섬유소 분해효소 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기 섬유소 분해효소 생산 방법은 초기 배양 온도를 40℃로 하여 36시간 배양 후 상기 배양 온도를 35℃로 변화시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 에셰리키아 콜리 A-53 (Escherichia coli A-53; KACC 91334P) 균주를 사용하여 섬유소 분해효소를 생산하는 방법에 있어서, 섬유소 분해효소의 생산성을 향상시키기 위하여 배지의 초기 pH를 7.0, 초기 배양온도를 40℃로 배양하다 pH를 8.0, 배양온도로 변화시키는 섬유소 분해효소 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기 섬유소 분해효소 생산 방법은 배지의 초기 pH를 7.0, 초기 배양온도를 40℃로 하여 36시간 배양 후 pH를 8.0, 배양온도를 35℃로 변화시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기 섬유소 분해효소 생산 방법에서 사용되는 배지의 조성은 125 g/L 미강, 7.5 g/L 염화암모늄(ammonium chloride), 5.0 g/L 이인산칼륨(K2HPO4), 1.0 g/L 염화나트륨(NaCl), 0.2 g/L 황산마그네슘 수화물(MgSO4ㆍ7H2O) 및 0.6 g/l 황산 암모늄((NH4)2SO4)인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기 배양은 교반속도 400 rpm, 통기량 0.5 vvm인 7L 생물 배양기 내에서 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명은 에셰리키아 콜리 A-53 균주를 사용하여 섬유소 분해효소를 생산함에 있어서 균주를 생육하는 과정 중 온도 및 pH를 변화시킴으로써 섬유소 분해 효소의 생산량을 2.12배까지 향상시키는 효과를 발휘한다. 한편, 본 발명은 섬유소 분해효소 생산을 위한 액체배양 공정을 향상시킨 것인바 대량생산 공정에 적용하기 위한 부가적인 장치가 필요 없는 경제적인 공정이다.
도 1은 배양 중에 배지의 pH 변화가 균체의 생육 (A) 및 섬유소 분해효소 생산 (B)에 미치는 영향에 대한 결과이다 (●, pH 7.0으로 고정; ■, pH 7.0에서 pH 8.0으로 12시간 후에 변화; ▲, pH 7.0에서 pH 8.0으로 24시간 후에 변화; , pH 7.0에서 pH 8.0으로 36시간 후에 변화; □, pH 8.0으로 고정)
도 2은 배양 중에 배양온도의 변화가 균체의 생육 (A) 및 섬유소 분해효소 생산 (B)에 미치는 영향에 대한 결과이다 (●, 40℃로 고정; ■, 40℃에서 35℃로 12시간 후에 변화; ▲, 40℃에서 35℃로 24시간 후에 변화; , 40℃에서 35℃로 36시간 후에 변화; □, 35℃로 고정)
도 3은 배양 중에 배지의 pH와 배양온도의 변화가 균체의 생육 (A) 및 섬유소 분해효소 생산 (B)에 미치는 영향에 대한 결과이다 (●, pH 7.0 및 40℃ 로 고정; ■, pH 7.0에서 pH 8.0 및 40℃에서 35℃로 12시간 후에 변화; ▲, pH 7.0에서 pH 8.0 및 40℃에서 35℃로 24시간 후에 변화; , pH 7.0에서 pH 8.0 및 40℃에서 35℃로 36시간 후에 변화; □, 35℃로 고정)
본 발명은 에셰리키아 콜리 A-53 균주를 사용하여 섬유소 분해효소를 생산하는 최적의 섬유소 분해효소 생산방법을 제공한다.
이를 위하여 본 발명자들은 액체 배양이 가능한 재조합 균주인 에셰리키아 콜리 A-53 (Escherichia coli A-53; KACC 91334P)를 사용하였으며, 상기 균주의 최적 생육 조건인 pH 7.0, 온도 40℃에서 36시간 배양 후 pH 8.0, 온도 35℃로 변화시켜 배양하면 섬유소 분해효소 생산량이 약 2.12배까지 향상된다는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에서 섬유소 분해효소는 배지 속의 탄소원을 당으로 전환시키므로, 환원당의 생성량 증가는 섬유소 분해효소의 활성이 높은 것을 의미한다.
본 발명에서 섬유소 분해효소의 활성은 유닛(unit)을 계산하였으며 1 unit은 섬유소를 가수분해하여 20분 동안 1μmol의 환원당을 생산하는 효소의 양을 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시 예 1 : 섬유소 분해효소를 생산하는 배지의 최적 pH 확립
에셰리키아 콜리 A-53 균주를 사용하여 섬유소 분해효소를 생산하기 위한 배지의 조성은 125 g/L 미강, 7.5 g/L 염화암모늄(ammonium chloride), 5.0 g/L K2HPO4, 1.0 g/L NaCl, 0.2 g/L MgSO4ㆍ7H2O 및 0.6 g/l (NH4)2SO4이다. 섬유소 분해효소의 생산은 7 L 생물배양기를 사용하였으며, 배양기의 교반속도 및 통기량은 각각 400 rpm 및 0.5 vvm이었다. 배지의 초기 pH를 각각 6.5, 7.0, 7.5, 8.0 및 8.5로 제조하고 72시간 배양하여 섬유소 분해효소를 생산한 결과는 표 1과 같다. 에셰리키아 콜리 A-53 균주의 생육에 최적인 배지의 초기 pH는 7.0이었으며 섬유소 분해효소 생산에 최적인 배지의 초기 pH는 8.0이었다. (표 1 참조)
배지의 초기 pH에 따른 섬유소 분해효소의 생산성
initial pH DCW (g/L) CMCase (u/mL)
6.5 3.36 ± 0.31 463.1 ± 24.2
7.0 3.68 ± 0.38 480.4 ± 26.8
7.5 3.63 ± 0.32 492.1 ± 27.2
8.0 3.54 ± 0.33 511.9 ± 29.4
8.5 3.12 ± 0.32 510.9 ± 28.5
실시 예 2 : 섬유소 분해효소를 생산하는 최적 배양온도 확립
에셰리키아 콜리 A-53 균주를 사용한 섬유소 분해효소의 생산은 7 L 생물배양기를 사용하였으며, 배양기의 교반속도 및 통기량은 각각 400 rpm 및 0.5 vvm이었다. 배양온도를 각각 25℃, 30℃, 35℃, 40℃ 및 45℃로 72시간 배양하여 섬유소 분해효소를 생산한 결과는 표 2와 같다. 에셰리키아 콜리 A-53 균주의 생육에 최적인 배양온도는 40℃이었으며, 섬유소 분해효소 생산에 최적인 배양온도는 35℃이었다. 에셰리키아 콜리 A-53 균주를 사용하여 섬유소 분해효소를 생산할 때, 균주의 생육에 최적인 배지의 초기 pH 및 배양온도와 섬유소 분해효소의 생산에 최적인 배지의 초기 pH 및 배양온도가 다르다는 사실을 확인하였다. (표 2 참조)
배양 온도에 따른 섬유소 분해효소의 생산성
temperature (℃) DCW (g/L) CMCase (u/mL)
25 3.68 ± 0.25 235.6 ± 27.4
30 3.82 ±0.30 384.6 ± 41.5
35 3.97 ±0.26 584.0 ± 33.4
40 4.05 ±0.38 517.7 ± 31.0
45 3.86 ±0.33 360.5 ± 37.9
실시 예 3: 섬유소 분해효소를 생산할 때 배지의 pH 를 변화시키는 최적 시간 확립
에셰리키아 콜리 A-53 균주를 사용한 섬유소 분해효소의 생산은 7 L 생물배양기를 사용하였으며, 배양기의 교반속도 및 통기량은 각각 400 rpm 및 0.5 vvm이었다. 또한 배양온도는 35℃이었다. 섬유소 분해효소의 생산을 위한 배양 방법으로 1) 배지의 초기 pH를 7.0으로 고정하여 배양, 2) 배지의 초기 pH를 7.0에서 12시간 지난 후에 8.0으로 변화시켜 배양, 3) 배지의 초기 pH를 7.0에서 24시간 지난 후에 8.0으로 변화시켜 배양, 4) 배지의 초기 pH를 7.0에서 36시간 지난 후에 8.0으로 변화시켜 배양 및 5) 배지의 초기 pH를 7.0으로 고정하여 배양한 후에 균체의 증식과 섬유소 분해효소의 생산성을 비교한 결과는 표 3과 같다. 에셰리키아 콜리 A-53 균주를 사용하여 섬유소 분해효소를 생산할 때, 균체의 증식은 배지의 초기 pH를 7.0으로 고정하여 배양할 때 가장 높았으나, 섬유소 분해효소의 생산은 배지의 초기 pH를 7.0에서 36시간 지난 후에 8.0으로 변화시켜 배양하였을 때 가장 높았다. (표 3과 도 1 참조)
배양 중에 배지의 pH 변화에 따른 섬유소 분해효소 생산성
Shift DCW
(g/L)		 CMCase (u/mL)
pH Temperature (℃) Time (h)
7.0 35 - 4.55 513.1
7.0 → 8.0 35 12 3.54 652.2
7.0 → 8.0 35 24 4.08 695.4
7.0 → 8.0 35 36 4.28 720.1
8.0 35 - 3.48 604.4
실시 예 4: 섬유소 분해효소를 생산할 때 배양온도를 변화시키는 최적 시간 확립
에셰리키아 콜리 A-53 균주를 사용한 섬유소 분해효소의 생산은 7 L 생물배양기를 사용하였으며, 배양기의 교반속도 및 통기량은 각각 400 rpm 및 0.5 vvm이었다. 또한 배지의 초기 pH를 8.0으로 고정하여 배양하였다. 섬유소 분해효소의 생산을 위한 배양 방법으로 1) 배양온도를 40℃로 고정하여 배양, 2) 배양온도를 40℃에서 12시간 지난 후에 35℃로 변화시켜 배양, 3) 배양온도를 40℃에서 24시간 지난 후에 35℃로 변화시켜 배양, 4) 배양온도를 40℃에서 36시간 지난 후에 35℃로 변화시켜 배양 및 5) 배양온도를 35℃로 고정하여 배양한 후에 균체의 증식과 섬유소 분해효소의 생산성을 비교한 결과는 표 4와 같다. 에셰리키아 콜리 A-53 균주를 사용하여 섬유소 분해효소를 생산할 때, 균체의 증식은 배양온도를 40℃로 고정하여 배양할 때 가장 높았으나, 섬유소 분해효소의 생산은 배양온도를 40℃에서 36시간 지난 후에 35℃로 변화시켜 배양하였을 때 가장 높았다. (표 4와 도 2 참조)
배양 중에 배양온도의 변화에 따른 섬유소 분해효소 생산성
Shift DCW
(g/L)		 CMCase (u/mL)
pH Temperature (℃) Time (h)
8.0 40 - 4.45 517.2
8.0 40 → 35 12 3.47 643.1
8.0 40 → 35 24 4.18 687.3
8.0 40 → 35 36 4.38 743.1
8.0 40 - 3.86 588.5
실시 예 5: 섬유소 분해효소를 생산할 때 배지의 pH 와 배양온도를 변화시키는 최적 시간 확립
에셰리키아 콜리 A-53 균주를 사용한 섬유소 분해효소의 생산은 7 L 생물배양기를 사용하였으며, 배양기의 교반속도 및 통기량은 각각 400 rpm 및 0.5 vvm이었다. 섬유소 분해효소의 생산을 위한 배양 방법으로 1) 배지의 pH 7.0 및 배양온도를 40℃로 고정하여 배양, 2); 배지의 pH를 7.0에서 pH 8.0 및 배양온도를 40℃에서 35℃로 12시간 지난 후에 변화시켜 배양, 3) 배지의 pH를 7.0에서 pH 8.0 및 배양온도를 40℃에서 35℃로 24시간 지난 후에 변화시켜 배양, 4) 배지의 pH를 7.0에서 pH 8.0 및 배양온도를 40℃에서 35℃로 36시간 지난 후에 변화시켜 배양 및 5) 배지의 pH 8.0 및 배양온도를 35℃로 고정하여 배양한 후에 균체의 증식과 섬유소 분해효소의 생산성을 비교한 결과는 표 5와 같다. 에셰리키아 콜리 A-53 균주를 사용하여 섬유소 분해효소를 생산할 때, 균체의 증식은 배지의 pH를 7.0 및 배양온도를 40℃로 고정하여 배양할 때 가장 높았으나, 섬유소 분해효소의 생산은 배지의 pH를 7.0에서 pH 8.0 및 배양온도를 40℃에서 35℃로 36시간 지난 후에 변화시켜 배양하였을 때 가장 높았다. 섬유소 분해효소의 생산성은 배지의 pH와 배양온도를 변화시켜 배양하였을 때에 783.1 u/mL이었으며, 이는 균체의 증식에 최적인 조건으로 배양하였을 때에 비하여 2.12배 향상된 것이다. 또한, 섬유소 분해효소의 생산에 최적인 배지의 pH와 배양온도인 8.0 및 35℃로 배양하였을 때에 비하여 1.27배 향상된 것이다. (표 5와 도 3 참조)
배양 중에 배지의 pH와 배양온도의 변화에 따른 섬유소 분해효소 생산성
Shift DCW
(g/L)		 CMCase (u/mL)
pH Temperature (℃) Time (h)
7.0 40 - 5.45 367.9
7.0 → 8.0 40 → 35 12 4.17 543.1
7.0 → 8.0 40 → 35 24 4.89 647.3
7.0 → 8.0 40 → 35 36 5.25 783.1
8.0 35 - 3.66 618.5
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

  1. 에셰리키아 콜리 A-53 (Escherichia coli A-53; KACC 91334P) 균주를 사용하여 섬유소 분해효소를 생산하는 방법에 있어서, 섬유소 분해효소의 생산성을 향상시키기 위하여 배지의 초기 pH를 7.0으로 배양하다가 pH를 8.0으로 변화시켜 배양하는 것을 특징으로 하는, 섬유소 분해효소 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 배지의 초기 pH를 7.0으로 하여 36 시간 배양 후, 상기 배지의 pH를 8.0으로 변화시켜 배양하는 것을 특징으로 하는 섬유소 분해효소 생산 방법.
  3. 에셰리키아 콜리 A-53 (Escherichia coli A-53; KACC 91334P) 균주를 사용하여 섬유소 분해효소를 생산하는 방법에 있어서, 섬유소 분해효소의 생산성을 향상시키기 위하여 초기 배양 온도를 40℃로 배양하다가 35℃로 배양 온도를 변화시켜 배양하는 것을 특징으로 하는, 섬유소 분해효소 생산 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 초기 배양 온도를 40℃로 하여 36시간 배양 후 상기 배양 온도를 35℃로 변화시켜 배양하는 것을 특징으로 하는 섬유소 분해효소 생산 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 배지의 조성은 125 g/L 미강, 7.5 g/L 염화암모늄(ammonium chloride), 5.0 g/L 이인산칼륨(K2HPO4), 1.0 g/L 염화나트륨(NaCl), 0.2 g/L 황산마그네슘 수화물(MgSO4ㆍ7H2O) 및 0.6 g/l 황산 암모늄((NH4)2SO4)인 것을 특징으로 하는 섬유소 분해효소 생산 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 배양은 교반속도 400 rpm, 통기량 0.5 vvm인 7L 생물 배양기 내에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 섬유소 분해효소 생산 방법.
KR1020130042742A 2013-04-18 2013-04-18 에셰리키아 콜리 a-53 균주를 이용하여 섬유소 분해효소의 생산성을 향상시키는 공정 KR101439195B1 (ko)

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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPH0654679A (ja) * 1992-06-12 1994-03-01 Sankyo Co Ltd 微生物菌体の培養生産方法
KR100988451B1 (ko) 2004-08-27 2010-10-18 와이어쓰 리서치 아일랜드 리미티드 ＴＮＦＲ-Ｉｇ 융합 단백질의 제조
WO2011134919A2 (en) 2010-04-26 2011-11-03 Novartis Ag Improved cell cultivation process

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