KR20040070237A - 연장된 작용 시간을 갖는 인슐린 분자 - Google Patents

연장된 작용 시간을 갖는 인슐린 분자 Download PDF

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KR20040070237A
KR20040070237A KR10-2004-7009431A KR20047009431A KR20040070237A KR 20040070237 A KR20040070237 A KR 20040070237A KR 20047009431 A KR20047009431 A KR 20047009431A KR 20040070237 A KR20040070237 A KR 20040070237A
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존 미첼 벌스
미첼 로사리오 데페리피스
리차드 데니스 디마치
웨인 데이비드 콘
라드밀라 미카노빅
샤론 루쓰 마이어스
킹맨 엔지
리안산 장
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일라이 릴리 앤드 캄파니
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Abstract

본 발명은 연장된 작용 기간 (심지어, 기저 지속 기간)을 제공하는 인슐린 분자를 제공한다. 상기 인슐린 분자는 A-쇄의 N-말단에서의 변형, 임의로는 B-쇄의 N-말단에서의 변형, B-쇄 리신에서의 변형, 및 임의로는 A-쇄의 C-말단에서의 변형을 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 인슐린 분자를 투여하는 것을 포함하는 진성 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

연장된 작용 시간을 갖는 인슐린 분자 {Insulin Molecule Having Protracted Time Action}
본 출원은 미국 가출원 제60/344,310호 (2001년 12월 20일 출원) 및 미국 가출원 제60/414,604호 (2002년 9월 27일 출원)를 우선권으로 주장한다 (상기 문헌은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된 것으로 간주함).
인슐린에 대한 생리학적 요구는 (a) 식사-관련된 혈당 급증 증상을 진정시키는 양의 인슐린을 필요로 하는 영양소 흡수 단계; (b) 최적 공복 혈당은 유지하기 위한 간 글루코스 방출을 조절하는 인슐린 지연 전달 ("기저" 인슐린 분비로도 공지되어 있음)을 필요로 하는 흡수후 단계의 2 단계로 나누어질 수 있다.
일반적으로, 당뇨병을 앓고 있는 사람들에게 효과적인 인슐린 치료는 두 가지 유형의 외인성 인슐린 제제 (속효성 인슐린 제제: 식사 시간에 인슐린을 볼루스 (bolus) 주사에 의해 공급함; 및 지효성 인슐린 제제: 식사 사이에 혈당 수준을 조절하기 위해 인슐린을 주사에 의해 일일 1회 또는 2회 투여함)의 조합 사용과 관련되어 있다.
이상적인 외인성 기저 인슐린은 연장된 작용 시간 및 "평탄한" 작용 시간을 제공할 것이다. 즉, 상기 인슐린은 고혈당증의 유의한 위험없이 적어도 12시간 (바람직하게는, 24시간) 동안 혈당 수준을 조절할 것이다.
상업적으로 사용되는 지효성 인슐린 분자는 24시간 동안 인슐린 효과를 제공하지는 못한다. 따라서, 인슐린 효과를 24시간까지 제공하는 인슐린 분자가 요망되고 있다.
<발명의 개요>
본 발명은
(a) 하기 식 I의 A-쇄
(식 I의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 나열되어 있음), 및
(b) 하기 식 II의 B-쇄
(식 II의 아미노산 서열은 서열 번호 2에 나열되어 있음)
를 갖는 인슐린 분자를 제공한다.
상기 식에서,
위치 A-1의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, α-메틸 아르기닌이거나, 결여되어 있고;
위치 A0의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, 또는 α-메틸 아르기닌이고;
위치 A21의 Xaa는 유전자에 의해 코딩가능한 아미노산이고;
위치 B-1의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, α-메틸 아르기닌이거나, 결여되어 있고;
위치 B0의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, α-메틸 아르기닌이거나, 결여되어 있고;
위치 B28의 Xaa는 Lys 또는 Pro이고;
위치 B29의 Xaa는 Lys 또는 Pro이고;
위치 B30의 Xaa는 Thr 또는 Ala이거나, 결여되어 있고;
위치 B28의 Xaa 또는 위치 B29의 Xaa 중 어느 하나는 Lys이고;
위치 B28의 Xaa와 위치 B29의 Xaa 둘 모두가 Lys은 아니며;
위치 B28 또는 B29 Lys의 ε-아미노기는 양하전된 아미노산의 α-카르복실기에 공유 결합하여 Lys-Nε-아미노산 유도체를 형성한다.
또한, 본 발명은 혈당 농도를 조절하기에 충분한 양의 본 발명의 인슐린 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 진성 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다..
또한, 본 발명은 본 발명의 인슐린 분자를 포함하는 미세결정, 이 미세결정의 제조 방법, 및 이 미세결정을 투여함으로써 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 미세결정을 포함하는 불용성 상 및 물을 포함하는 용액 상을 포함하는 현탁액 제제를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 현탁액 제제의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 대상체에서 혈당을 조절하기에 충분한 양의 상기 현탁액 제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 진성 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 현탁액 제제의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 대상체에서 혈당 농도를 조절하기에 충분한 양의 상기 현탁액 제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 진성 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
(a) 인슐린 주형의 각 유리 아미노기를 보호된 아미노산 또는 보호된 아미노산 유도체로 아실화시켜 아실화된 인슐린 분자를 형성하는 단계,
(b) 상기 아실화된 인슐린 분자를 정제하는 단계,
(c) 각각의 보호된 아미노산 또는 보호된 아미노산 유도체로부터 보호기를 제거하여 탈보호되고 아실화된 인슐린 분자를 형성하는 단계, 및
(d) 상기 탈보호되고 아실화된 인슐린 분자를 정제하는 단계
를 포함하는, 인슐린 분자의 제조 방법을 제공한다. 한 바람직한 실시양태에서, 보호된 아미노산은 보호된 Arg이고, 아미노산은 Arg이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 보호된 아미노산은 보호된 Lys이고, 아미노산은 Lys이다.
본 발명은 진성 당뇨병을 특징으로 하는 고혈당증의 치료에 유용한 인슐린 분자에 관한 것이다.
도 1은 Lys의 ε-아미노기와 Arg의 α-카르복실기 사이에 공유 결합을 형성시킴으로써 수득한 Lys-Nε-Arg 유도체를 도시하고 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인슐린 A-쇄의 N-말단, 인슐린 A-쇄의 C-말단, 인슐린 B-쇄의 N-말단 및 B-쇄 리신 중 하나 이상에서의 변형을 포함하는 인슐린 분자를 제공한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인슐린 분자는 A-쇄 N-말단의 변형, B-쇄 N-말단의 변형, B-쇄 리신의 변형, 및 임의로는 A-쇄 C-말단의 변형을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 인슐린 분자는 Arg이 A-쇄의 N-말단에 공유 결합하고, Arg이 B-쇄의 N-말단에 공유 결합하고, B-쇄 Lys이 변형되며, 임의로는 A-쇄의 C-말단 아미노산이 다른 아미노산 (예를 들어, Gly)으로 치환된 분자이다.
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인슐린 분자는 A-쇄 N-말단의 변형, B-쇄 리신의 변형, 및 임의로는 A-쇄 C-말단의 변형을 포함한다. 예를 들어, 인슐린 분자는 Arg이 A-쇄 N-말단에 공유 결합하고, B-쇄 Lys이 변형되며, 임의로는 A-쇄의 C-말단 아미노산이 다른 아미노산 (예를 들어, Gly)으로 치환된 분자이다.
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 하기 식 I의 A-쇄
(식 I의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 나열되어 있음), 및
(b) 하기 식 II의 B-쇄
(식 II의 아미노산 서열은 서열 번호 2에 나열되어 있음)
를 갖는 인슐린 분자를 제공한다.
상기 식에서,
위치 A-1의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, α-메틸 아르기닌이거나, 결여되어 있고;
위치 A0의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, 또는 α-메틸 아르기닌이고;
위치 A21의 Xaa는 유전자에 의해 코딩가능한 아미노산이고;
위치 B-1의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, α-메틸 아르기닌이거나, 결여되어 있고;
위치 B0의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, α-메틸 아르기닌이거나, 결여되어 있고;
위치 B28의 Xaa는 Lys 또는 Pro이고;
위치 B29의 Xaa는 Lys 또는 Pro이고;
위치 B30의 Xaa는 Thr 또는 Ala이거나, 결여되어 있고;
위치 B28의 Xaa 또는 위치 B29의 Xaa 중 어느 하나는 Lys이고;
위치 B28의 Xaa와 위치 B29의 Xaa 둘 모두가 Lys은 아니며;
위치 B28 또는 B29 Lys의 ε-아미노기는 양하전된 아미노산의 α-카르복실기에 공유 결합한다.
한 바람직한 실시양태에서, 위치 A-1의 Xaa는 결여되어 있고, 위치 A0의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, α-구아니디노호모아르기닌, 또는 α-메틸 아르기닌이고, 위치 B-1의 Xaa는 결여되어 있으며, 위치 B0의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, α-구아니디노호모아르기닌, α-메틸 아르기닌이거나, 결여되어 있다.
다른 바람직한 실시양태에서, 위치 A-1의 Xaa는 결여되어 있고, 위치 A0의 Xaa의 Arg이고, 위치 B-1의 Xaa는 결여되어 있으며, 위치 B0의 Xaa는 결여되어 있다.
다른 바람직한 실시양태에서, 위치 A-1의 Xaa는 결여되어 있고, 위치 A0의 Xaa는 유도체화된 Lys이고, 위치 B-1의 Xaa는 결여되어 있으며, 위치 B0의 Xaa는 결여되어 있다.
"식 I"은
이며, 식 I의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 나열되어 있다. 식 I에서 위치 A-1 내지 A21의 아미노산은 각각 서열 번호 1에서 위치 1 내지 23의 아미노산에 해당된다. 식 I에서 위치 A1 내지 A20의 아미노산, 및 서열 번호 1에서 위치 3 내지 22의 아미노산은 인간 인슐린의 A-쇄 (서열 번호 3)에서 위치 1 내지 20의 아미노산에 해당된다.
"식 II"은
이며, 식 II의 아미노산 서열은 서열 번호 2에 나열되어 있다. 식 II에서 위치 B-1 내지 B30의 아미노산은 각각 서열 번호 2에서 위치 1 내지 32의 아미노산에 해당된다. 식 II에서 위치 B1 내지 B27의 아미노산, 및 서열 번호 2에서 위치 3 내지 29의 아미노산은 인간 인슐린의 B-쇄 (서열 번호 4)에서 위치 1 내지 27의 아미노산에 해당된다.
다수의 다른 종으로부터 유래한 인슐린 분자의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 당업자에게 공지되어 있다. 바람직하게는, "인슐린"은 인간 인슐린을 의미한다. "인간 인슐린"은 21개 아미노산의 A-쇄 (Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (서열 번호 3)), 및 30개 아미노산의 B-쇄 (Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (서열 번호 4))를 갖는다.
인간 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄는 이황 결합에 의해 교차 결합되어 있다. 쇄간 이황 결합 중 하나는 식 I 위치 A7의 Cys와 식 II 위치 B7의 Cys 사이에 존재하고,다른 쇄간 이황 결합은 식 I 위치 A20의 Cys와 식 II 위치 B19의 Cys 사이에 존재한다. 쇄간 이황 결합이 식 I 위치 A6의 시스테인과 식 I 위치 A11의 시스테인 사이에 존재한다.
용어 "숙주 세포"는 단일 숙주 세포 및 하나 이상의 숙주 세포를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "인슐린 분자"는 야생형 인슐린, 인슐린 유도체 및 인슐린 유사체를 포함한다.
"양하전된 아미노산"은 pH 6.0에서 순 양전하를 갖는 천연 또는 비천연 아미노산이다. 한 바람직한 실시양태에서, 양하전된 아미노산은 Arg이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 양하전된 아미노산은 Lys이다.
본원에 사용된 용어 "인슐린 유도체"는 Lys이 유도체화되어 Lys의 ε-아미노기 (-Nε)와 다른 잔기 사이에 공유 결합이 형성된 인슐린 분자를 의미한다. 한 바람직한 실시양태에서, A-쇄 Lys이 유도체화되어 Lys의 ε-아미노기와 다른 잔기 사이에 공유 결합이 형성된다. 다른 바람직한 실시양태에서, B-쇄 Lys이 유도체화되어 Lys의 ε-아미노기와 다른 잔기 사이에 공유 결합이 형성된다. 다른 바람직한 실시양태에서, A-쇄 Lys 및 B-쇄 Lys 둘 모두가 유도체화되어 각각의 Lys ε-아미노기와 다른 잔기 사이에 공유 결합이 형성된다.
다른 바람직한 실시양태에서, 공유 결합은 양하전된 아미노산과의 아실화 반응에 의해 형성된다. 이 실시양태에서, 아미노산과 Lys 사이에 공유 결합이 형성될 때 Lys ε-아미노기로부터의 수소와 아미노산 α-카르복실기의 히드록실 부분이 분리되어 물을 형성하는 경우, Lys의 ε-아미노기와 아미노산 α-카르복실기의 탄소 사이에 공유 결합이 형성된다.
다른 바람직한 실시양태에서, 공유 결합은 Lys의 ε-아미노기와 Arg α-카르복실기의 탄소 사이에 형성된다 ("Lys-Nε-Arg" 유도체 형성). Lys-Nε-Arg 유도체는 도 1에 도시되어 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, Lys-Nε-Arg 인슐린 유도체는 식 II 위치 B28의 Lys으로부터 형성된다. 다른 바람직한 실시양태에서, Lys-Nε-Arg 인슐린 유도체는 식 II 위치 B29의 Lys (서열 번호 4의 위치 29의 Lys)으로부터 형성된다.
다른 바람직한 실시양태에서, 공유 결합은 Lys의 ε-아미노기와 Lys α-카르복실기의 탄소 사이에 형성된다 ("Lys-Nε-Lys" 유도체 형성). 다른 바람직한 실시양태에서, Lys-Nε-Lys 인슐린 유도체는 식 II 위치 B28의 Lys으로부터 형성된다. 다른 바람직한 실시양태에서, Lys-Nε-Lys 인슐린 유도체는 식 II 위치 B29의 Lys (서열 번호 4의 위치 29의 Lys)으로부터 형성된다.
본원에 사용된 용어 "프로인슐린 유도체"는 Lys이 유도체화되어 Lys의 ε-아미노기와 다른 잔기 사이에 공유 결합이 형성된 프로인슐린 분자를 의미한다. 한 바람직한 실시양태에서, 공유 결합은 양하전된 아미노산과의 아실화 반응에 의해 형성된다. 이 실시양태에서, 공유 결합은 Lys의 ε-아미노기와 양하전된 아미노산 α-카르복실기의 탄소 사이에 형성된다 ("Lys-Nε-아미노산" 유도체 형성). 한 바람직한 실시양태에서, 공유 결합은 Lys의 ε-아미노기와 Arg α-카르복실기의 탄소 사이에 형성된다 ("Lys-Nε-Arg" 유도체 형성). 다른 바람직한 실시양태에서, Lys-Nε-Arg 인슐린 유도체는 식 II 위치 B28의 Lys으로부터 형성된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 다른 바람직한 실시양태에서, Lys-Nε-Arg 인슐린 유도체는 식 II 위치 B29의 Lys (서열 번호 4의 위치 29의 Lys)으로부터 형성된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 공유 결합은 Lys의 ε-아미노기와 Lys α-카르복실기의 탄소 사이에 형성된다 ("Lys-Nε-Lys" 유도체 형성). 다른 바람직한 실시양태에서, Lys-Nε-Lys 인슐린 유도체는 식 II 위치 B28의 Lys으로부터 형성된다. 다른 바람직한 실시양태에서, Lys-Nε-Lys 인슐린 유도체는 식 II 위치 B29의 Lys (서열 번호 4의 위치 29의 Lys)으로부터 형성된다.
본원에 사용된 용어 "인슐린 유사체"는 본원에 사용된 "인슐린 유도체"와는 구별된다. "인슐린 유도체"는 Lys이 유도체화되어 Lys의 ε-아미노기와 다른 잔기 사이에 공유 결합이 형성된 인슐린 분자이다. "인슐린 유도체"와는 다르게, "인슐린 유사체"는 야생형 인슐린 분자와는 다른 변형된 인슐린 분자이지만, Lys가 유도체화되어 Lys의 ε-아미노기와 다른 잔기 사이에 공유 결합을 형성시키지는 않는다. 따라서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 A-쇄 및(또는) B-쇄를 가질 수 있으나, A-쇄 및(또는) B-쇄에서 하나 이상의 아미노산이 결실되고(결실되거나), A-쇄 및(또는) B-쇄에서 하나 이상의 아미노산이 치환되고(치환되거나), 하나 이상의 아미노산이 A-쇄 및(또는) B-쇄의 N-말단 및(또는) C-말단에 공유 결합한다는 점에서 인간 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄와 구별된다.
따라서, 예를 들어 A0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린 및 A0Lys-Nε-Arg-인슐린, 및 A0Lys-Nε-ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린은 각각의 상기 분자에서 Lys이 유도체화되어 Lys의 ε-아미노기와 다른 잔기 (Arg) 사이에 공유 결합이 형성되었기 때문에 인슐린 유도체이다. 인슐린 유도체와는 다르게, A0Arg-인슐린는 Lys이 유도체화되어 Lys의 ε-아미노기와 다른 잔기 사이에 공유 결합이 형성되지 않았기 때문에 인슐린 유사체이다.
본원에 사용된 용어 "프로인슐린 유사체"는 본원에 사용된 용어 "프로인슐린 유도체"와 구별된다. "프로인슐린 유도체"는 Lys이 유도체화되어 Lys의 ε-아미노기와 다른 잔기 사이에 공유 결합이 형성된 프로인슐린 분자이다. "프로인슐린 유사체"는 야생형 인슐린 분자와는 다른 변형된 프로인슐린 분자이지만, "프로인슐린 유도체"와는 다르게 Lys가 유도체화되어 Lys의 ε-아미노기와 다른 잔기 사이에 공유 결합을 형성시키지는 않는다.
따라서, 프로인슐린 유사체는 인간 인슐린의 A-쇄, B-쇄 및 C-펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 A-쇄, B-쇄 및(또는) C-펩티드를 가질 수 있지만, A-쇄, B-쇄 또는 C-펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 결실되고(결실되거나), A-쇄, B-쇄 또는 C-펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 치환되고(치환되거나), 하나 이상의 아미노산이 A-쇄, B-쇄 또는 C-펩티드의 N-말단 및(또는) C-말단에 공유 결합한다는 점에서 인간 프로인슐린의 A-쇄, B-쇄 및 C-펩티드와 구별된다. 예를 들어, A0ArgB29Lys-Nε-Arg-프로인슐린은 인슐린 유도체이나, B28LysB29Pro-프로인슐린은 프로인슐린 유사체이다.
식 I 위치 A-1의 Xaa 아미노산은 존재하거나 부재할 수 있다. 존재하는 경우, 상기 아미노산은 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌 또는 α-메틸 아르기닌인 것이 바람직하다.
위치 A0의 Xaa 아미노산은 존재해야만 한다. 바람직한 실시양태에서, 위치 A0의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌 또는 α-메틸 아르기닌이다. 바람직한 실시양태에서, 위치 A0의 Xaa는 양하전된 아미노산으로 유도체화된 Lys이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 위치 A0의 Xaa는 Lys-Nε-Arg이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 위치 A0의 Xaa는 Lys-Nε-Lys이다.
위치 A21의 Xaa 아미노산은 알라닌 (Ala), 아르기닌 (Arg), 아스파라긴 (Asn), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루탐산 (Glu), 글루타민 (Gln), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 리신 (Lys), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 티로신 (Tyr) 및 발린 (Val)으로 구성된 군으로부터 선택된, 유전자에 의해 코딩가능한 아미노산이다. 한 바람직한 실시양태에서, 위치 A21의 Xaa 아미노산은 글리신이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 위치 A21의 Xaa 아미노산은 세린이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 위치 A21의 Xaa 아미노산은 트레오닌이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 위치 A21의 Xaa 아미노산은 알라닌이다.
식 II 위치 B-1의 Xaa 아미노산은 존재하거나 부재할 수 있다. 존재하는 경우, 상기 아미노산은 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌 또는 α-메틸 아르기닌인 것이 바람직하다. 위치 B0의 Xaa 아미노산은 존재하거나 부재할 수 있다. 존재하는 경우, 상기 아미노산은 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌 또는 α-메틸 아르기닌인 것이 바람직하다. 위치 B0의 Xaa 아미노산이 결여되어 있는 경우, 위치 B-1의 Xaa 아미노산 또한 결여되어 있다.
위치 B28의 Xaa 아미노산은 Lys 또는 Pro이다.
위치 B29의 Xaa 아미노산은 Lys 또는 Pro이다.
위치 B30의 Xaa 아미노산은 Thr 또는 Ala이거나, 결여되어 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 위치 B28의 Xaa 또는 위치 B29의 Xaa 중 하나가 Lys이며 (위치 B28의 Xaa와 위치 B29의 Xaa 둘 모두가 Lys은 아님), 위치 B28 또는 위치 B29 Lys의 ε-아미노기가 양하전된 아미노산의 α-카르복실기에 공유 결합하여 Lys-Nε-아미노산 유도체를 형성한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 위치 B28 또는 위치 B29 Lys의 ε-아미노기가 Arg의 α-카르복실기에 공유 결합하여 Lys-Nε-Arg 유도체를 형성한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 위치 B28 또는 위치 B29 Lys의 ε-아미노기가 Lys의 ε-카르복실기에 공유 결합하여 Lys-Nε-Lys 유도체를 형성한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 인슐린 분자의 아미노산은 추가로 유도체화된다. 한 바람직한 실시양태에서, 아미노산 유도체화 반응은 아실화 반응이다. 보다 바람직하게는, 식 II 위치 B29의 Lys이 아미노산으로 아실화된다.
다른 바람직한 실시양태에서, 아미노산 유도체화 반응은 카르바밀화 반응이다. 바람직하게는, Lys은 유도체화되어 호모아르기닌을 형성한다. 보다 바람직하게는, 호모아르기닌은 식 II 위치 B29의 Lys으로부터 형성된다.
"폴리펩티드 쇄"는 펩티드 결합을 통해 연결된 두 개 이상의 아미노산을 의미한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명 인슐린 분자의 A-쇄는 2개의 이황 결합을 통해 B-쇄에 교차 결합되어 있으며, A-쇄는 쇄간 이황 교차 결합을 함유한다. 보다 구체적으로, "적절하게 결합된"은 (1) 식 I 위치 A6의 Cys와 위치 A11의 Cys 사이의 이황 결합, (2) 식 I 위치 A7의 Cys와 식 II 위치 B7의 Cys 사이의 이황 결합, 및 (3) 식 I 위치 A20의 Cys와 식 II 위치 B19의 Cys 사이의 이황 결합을 의미한다.
인슐린 및 프로인슐린 분자를 표기하기 위하여 간단한 축약 표기법을 본원에 사용하였으며, 식 I의 A-쇄 (서열 번호 1) 및 식 II의 B-쇄 (서열 번호 2)를 참고로 나열하였다. 상기 표기법에서, 인슐린 분자의 축약 명칭에서 위치 A-1, B-1 또는 B0의 Xaa를 언급하지 않은 경우, 그 위치의 Xaa는 결여된 것이다. 인슐린 분자의 축약 명칭에서 위치 A21의 Xaa 아미노산을 언급하지 않은 경우, 그 위치의 Xaa는 Asn (야생형 인슐린 A-쇄 (서열 번호 3)에서 위치 A21의 아미노산)이다. 인슐린 분자의 축약 명칭에서 위치 B28의 Xaa 아미노산을 언급하지 않은 경우, 그 위치의 Xaa는 Pro (야생형 인슐린 B-쇄 (서열 번호 4)에서 위치 B28의 아미노산)이다. 인슐린 분자의 축약 명칭에서 위치 B29의 Xaa 아미노산을 언급하지 않은 경우, 그 위치의 Xaa는 Lys (야생형 인슐린 B-쇄에서 위치 B29의 아미노산)이다. 인슐린 분자의 축약 명칭에서 위치 B30의 Xaa 아미노산을 언급하지 않은 경우, 그 위치의 Xaa는 Thr (야생형 인슐린 B-쇄에서 위치 B30의 아미노산)이다. "데스(B30)"은 위치 B30의 Xaa가 결여되어 있음을 나타낸다. 프로인슐린 분자의 축약 명칭에서 프로인슐린 아미노산이 언급되지 않은 경우, 그 위치의 아미노산은 야생형 인간 프로인슐린 분자에서 동일한 위치에 존재하는 아미노산이다.
축약 표기법의 비제한적인 예로는 "A0ArgA21XaaB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린"이 있으며, 이는 식 I 위치 A-1의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 A0의 Xaa가 Arg이고, 위치 A21의 Xaa가 유전자에 의해 코딩가능한 아미노산이고, 식 II 위치 B-1의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 B0의 Xaa가 Arg이고, 위치 B28의 Xaa가 Pro이고, 위치 B29의 Xaa가 Lys-Nε-Arg이며, 위치 B30의 Xaa가 Thr인 인슐린을 의미한다.
다른 축약 표기법의 비제한적인 예에서, 축약 표기 "A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린"은 식 I 위치 A-1의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 A0의 Xaa가 Lys-Nε-Arg이고, 위치 A21의 Xaa가 Gly이고, 식 II 위치 B-1의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 B0의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 B28의 Xaa가 Pro이고, 위치 B29의 Xaa가 Lys-Nε-Arg이며, 위치 B30의 Xaa가 Thr인 인슐린을 의미한다.
다른 축약 표기법의 비제한적인 예에서, 축약 표기 "A21Xaa-인슐린"은 식 I 위치 A-1의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 A0의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 A21의 Xaa가 유전자에 의해 코딩가능한 아미노산이고, 식 II 위치 B-1의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 B0의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 B28의 Xaa가 Pro이고, 위치 B29의 Xaa가 Lys이며, 위치 B30의 Xaa가 Thr인 인슐린을 의미한다. "A21Gly-인슐린"은 위치 A21의 Xaa가 Gly이라는 것만 제외하고는 A21Xaa-인슐린과 동일하다. "A21Ser-인슐린"은 위치 A21의 Xaa가 Ser이라는 것만 제외하고는 A21Xaa-인슐린과 동일하다.
다른 축약 표기법의 비제한적인 예에서, 축약 표기 "B28LysB29Pro-인슐린"은 식 I 위치 A-1의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 A0의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 A21의 Xaa가 유전자에 의해 코딩가능한 아미노산이고, 식 II 위치 B-1의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 B0의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 B28의 Xaa가 Lys이고, 위치 B29의 Xaa가 Pro이며, 위치 B30의 Xaa가 Thr인 인슐린을 의미한다.
다른 축약 표기법의 비제한적인 예에서, 축약 표기 "A0Arg-인슐린"은 식 I 위치 A-1의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 A0의 Xaa가 Arg이고, 위치 A21의 Xaa가 Asn이고, 식 II 위치 B-1의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 B0의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 B28의 Xaa가 Pro이고, 위치 B29의 Xaa가 Lys이며, 위치 B30의 Xaa가 Thr이 인슐린을 의미한다. 미국 특허 제5,506,202호 및 미국 특허 제5,430,016호를 참조한다.
"gHR"은 알파-구아니딜 호모아르기닌을 의미한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인슐린 분자는
으로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 인슐린 분자는 A-쇄 N-말단 및 B-쇄 N-말단의 변형을 포함한다. 예를 들어, 이러한 인슐린 분자는 Arg이 인슐린 A-쇄 N-말단에 공유 결합하고, Arg이 인슐린 B-쇄에 공유 결합한 인슐린 분자이다. 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 하기식 I의 A-쇄
(식 I의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 나열되어 있음), 및
(b) 하기 식 II의 B-쇄
(식 II의 아미노산 서열은 서열 번호 2에 나열되어 있음)
를 갖는 인슐린 분자를 제공한다.
상기 식에서,
위치 A-1의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, α-메틸 아르기닌이거나, 결여되어 있고;
위치 A0의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, 또는 α-메틸 아르기닌이고;
위치 A21의 Xaa는 유전자에 의해 코딩가능한 아미노산이고;
위치 B-1의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, α-메틸 아르기닌이거나, 결여되어 있고;
위치 B0의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, 또는 α-메틸 아르기닌이고;
위치 B28의 Xaa는 Lys 또는 Pro이고;
위치 B29의 Xaa는 Lys 또는 Pro이고;
위치 B30의 Xaa는 Thr 또는 Ala이거나, 결여되어 있고;
위치 B28의 Xaa 또는 위치 B29의 Xaa 중 어느 하나는 Lys이며;
위치 B28의 Xaa와 위치 B29의 Xaa 둘 모두가 Lys은 아니다.
또한, 본 발명은 인슐린 유사체 및 아연을 포함하는 미세결정을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 미세결정은 인슐린 유사체, 아연 및 프로타민을 포함한다.
또한, 본 발명은 인슐린 분자의 헥사머 형성을 허용하는 pH 값에서 수용액 중에 인슐린 분자 및 2가 금속 양이온을 포함하는 성분을 접촉시키는 것을 포함하는, 미세결정의 제조 방법을 제공한다. "접촉시키는"은 용액에 성분을 첨가하는 것을 광범위하게 나타낸다. 덜 광범위하게는, "접촉시키는"은 성분을 포함하는 용액을 전도, 회전, 진탕 또는 진동시키는 것을 의미한다. 보다 구체적으로는, "접촉시키는"은 성분의 혼합을 나타낸다.
다른 바람직한 실시양태에서, 인슐린 유사체는
으로 구성된 군으로부터 선택된다.
"인슐린 주형"은 변형되어 본 발명의 인슐린 유사체 또는 유도체를 형성하는 인슐린 분자를 의미한다. 추후의 화학 변형에 대한 주형으로 사용할 수 있는 인슐린 분자로는 임의의 한 자연 발생 인슐린 (바람직하게는, 인간 인슐린); 인간 인슐린의 유사체; B28Lys, B29Pro-인슐린; A0Arg-인슐린; A21Xaa-인슐린; A0ArgA21aXaa-인슐린, B0Arg-인슐린; B28Asp-인슐린; B3LysB29Glu-인슐린 및 추후의 아실화 반응 단계의 반응 특이성을 증가시키기 위해 1개 또는 2개의 아미노기를 보호기 (바람직하게는, tert-부틸옥시카르보닐(Boc))로 미리 유도체화시킨 인슐린 분자가 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 인슐린 주형은 재조합 인슐린이다. 보다 바람직하게는, 인슐린 주형은 재조합 인간 인슐린 또는 그의 유사체이다. 가장 바람직하게는, 인슐린 주형은 제조합 인간 인슐린이다.
인슐린 분자 탈아미드화의 감소 또는 방지, 및(또는) 분자의 인슐린 효과 기간 연장을 위해 식 I 위치 21의 야생형 아스파라긴 (서열 번호 2에서 위치 23에 해당됨)을 다른 아미노산으로 치환시키는 것이 바람직한 경우, A21Xaa-인슐린을 인슐린 주형으로 사용할 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, A21Asn은 A21Gly로 치환되어 A21Gly-인슐린을 형성한다. 다른 바람직한 실시양태에서, A21Asn은 A21Thr로 치환되어 A21Thr-인슐린을 형성한다. 바람직한 실시양태에서, A21Asn는 A21Ala로 치환되어 A21Ala-인슐린을 형성한다. 다른 바람직한 실시양태에서, A21Asn은 A21Ser로 치환되어 A21Ser-인슐린을 형성한다.
"재조합 단백질"은 진핵 또는 원핵 세포에서 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터로부터 발현되는 단백질을 의미한다. 바람직하게는, 재조합 단백질은 재조합 인슐린 분자이다.
"재조합 인슐린 분자"는 진핵 또는 원핵 세포에서 인슐린 분자의 A-쇄 및 B-쇄, 임의로는 프로인슐린 분자의 C-펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터로부터 발현되는 인슐린 분자이다. 한 바람직한 실시양태에서, 재조합 단백질은 재조합 인슐린 또는 프로인슐린 유도체이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 재조합 단백질은 재조합 인슐린 또는 프로인슐린 유사체이다.
"재조합 인간 인슐린"은 야생형 인간 A-쇄 (서열 번호 3) 및 B-쇄 (서열 번호 4) 아미노산 서열을 갖는 재조합 인슐린을 의미한다.
"유전자에 의해 코딩가능한 아미노산"은 유전자 코돈 (데옥시리보핵산의 3개 염기 군)에 의해 코딩되는 아미노산을 의미한다. 문헌 [Biochemistry, L. Stryer, Ed., Third Edition, W.H. Freeman and Co., New York, p. 99-107 (1988)]을 참조한다. 유전자에 의해 코딩가능한 아미노산으로는 알라닌 (Ala), 아르기닌 (Arg), 아스파라긴 (Asn), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루탐산 (Glu), 글루타민 (Gin), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 리신 (Lys), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 티로신 (Tyr) 및 발린 (Val)이 있다.
임상적으로 정상적인 공복 혈장 글루코스 수준은 70-110mg/dl이다. 임상적으로 정상적인 식후 혈장 글루코스 수준은 140mg/dl 미만이다. "대상체에서 혈당을 조절하기에 충분한"은 임상적으로 정상적인 혈장 글루코스 수준을 초래하는 인슐린 분자의 투여를 의미한다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 인슐린 효과는 "글루코스 클램프 (glucose clamp)" 기술을 이용하여 정량할 수 있으며, 이 기술은 미리 결정된 혈장 글루코스 수준을 유지하기 위해 작용 시간에 걸쳐 요구되는 외인성 글루코스의 양을 인슐린 분자에 의해 유발되는 인슐린 효과의 정도 및 지속 기간의 척도로서 사용한다. 예를 들어, 문헌 [Burke et al., Diabetes Research, 4:163-167 (1987)]을 참조한다.글루코스 클램프 조사에서, 글루코스는 통상적으로 정맥내로 주입된다. 인슐린 분자가 혈장 글루코스 수준의 감소를 유발시키는 경우, 글루코스 주입 속도를 증가시켜 미리 결정된 혈장 글루코스 수준을 유지한다. 인슐린 분자 효과가 감소된 경우, 글루코스 주입 속도를 감소시켜 미리 결정된 혈장 글루코스 수준을 유지한다.
"인슐린 효과"는 글루코스 클램프 조사에서 글루코스 클램프 실험이 지속되는 동안 대상체에서 미리 결정된 혈장 글루코스 수준을 유지시키기 위하여 정맥내 혈당 투여 속도의 증가를 필요로 하는 인슐린 분자의 투여를 의미한다. 한 바람직한 실시양태에서, 미리 결정된 글루코스 수준은 공복 혈장 글루코스 수준이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 미리 결정된 글루코스 수준은 식사후 혈장 글루코스 수준이다.
인슐린 분자가 고혈당증 (예를 들어, 당뇨병) 환자에게 인간 인슐린보다 요래 지속되는 인슐린 효과를 제공하는 경우, 인슐린 분자는 "연장된 작용 지속 기간"을 갖는다. 바람직하게는, 인슐린 분자는 인슐린 분자를 단일 투여한 후에 약 8 내지 약 24시간 동안 인슐린 효과를 제공한다. 보다 바람직하게는, 인슐린 효과는 약 10 내지 약 24시간 동안 지속된다. 보다 더 바람직하게는, 효과는 약 12 내지 약 24시간 동안 지속된다. 보다 더 바람직하게는, 효과는 약 16 내지 약 24시간 동안 지속된다. 가장 바람직하게는, 효과는 약 20 내지 약 24시간 동안 지속된다.
인슐린 분자가 인슐린 분자를 단일 투여한 후에 대상체에서 약 24시간 동안지속되는 글루코스 저하 효과를 제공하는 경우, 이 인슐린 분자는 "기저 인슐린 효과"를 갖는다.
본원에 사용된 "단리된 단백질"은 제조 환경으로부터 분리된 단백질을 의미한다. 자연 발생 단백질은 이 단백질이 존재하는 세포 환경으로부터 분리될 때 단리된다. 재조합 단백질은 이 단백질이 발현되는 세포 환경으로부터 분리될 때 단리된다. 화학적으로 변형된 단백질 (자연 발생 단백질 또는 재조합 단백질)은 이 단백질이 화학적으로 변형되었던 반응 혼합물로부터 분리될 때 단리된다. 바람직하게는, 단리된 단백질은 다른 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로부터 분리된다. 단백질 단리 방법으로는 원심분리법, 크로마토그래피, 동결건조법 또는 전기영동법이 있다. 상기 단백질 단리 방법 및 다른 방법들이 당업자에게 공지되어 있다. 바람직하게는, 본 발명의 인슐린 분자는 단리된다.
단백질의 "변형"은 아미노산이나 유도체화된 아미노산을 부가하거나, 한 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하거나, 또는 아미노산을 결실시키는 것을 나타낸다. 재조합 DNA 방법을 통해 단백질 변형을 달성시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,506,202호, 제5,430,016호 및 제5,656,782호를 참조한다. 별법으로, 인슐린 주형의 화학적 변형 (예를 들어, 인슐린 주형에 1종 이상의 화합물 잔기를 첨가하거나, 인슐린 주형으로부터 1종 이상의 화합물 잔기을 제거함) 통해 단백질 변형을 달성시킬 수 있다. 인슐린 주형 아미노산 측쇄기에서의 화학적 변형으로는 카르바밀화, 아미드화, 구아니딜화, 술포닐화, 1종 이상의 아미노기의 아실화, ε-아미노기 (예를 들어, 리신 ε-아미노기)의 아실화, 아르기닌, 히스티딘 또는 리신의 N-알킬화, 글루탐산 또는 아스파르트산 기의 알킬화, 및 글루타민 또는 아스파라긴의 탈아미드화가 있다. 말단 아미노기 (예를 들어, α-아미노기)의 변형으로는 데스-아미노, N-저급 알킬, N-디-저급 알킬 및 N-아실 변형이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 말단 카르복실기의 변형으로는 아미드, 저급 알킬 아미드, 디알킬 아미드 및 저급 알킬 에스테르 변형이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 1종 이상의 측쇄기, 또는 말단기는 단백질 화학자에게 공지된 보호기에 의해 보호될 수 있다.
본 발명의 인슐린 유사체 또는 인슐린 유도체 제조에 사용되는 아미노산은 D-형태 또는 L-형태일 수 있으며, 자연-발생 아미노산 또는 인공 아미노산일 수 있다.
"유도체화된 Arg"은 합성 화학 접근법을 통해 변형된 아르기닌을 의미한다. 바람직한 Arg 유도체는 아실화 및(또는) 카르바밀화 반응을 통해 수득된다. 바람직한 실시양태에서, Arg은 양하전된 아미노산으로 유도체화된다. 다른 바람직한 실시양태에서, Arg은 ε(-Nε) 아미노기에서 Arg으로 유도체화되어 Arg-Nε-Arg를 형성한다. 다른 바람직한 실시양태에서, Arg은 -Nε 아미노기에서 Lys으로 유도체화되어 Arg-Nε-Lys을 형성한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 유도체화된 Arg은 아르긴 (dArg 또는 dR)이며, 이 때 Arg은 α-탄소에서 전도된 입체화학을 갖는다.
"유도체화된 Lys"은 합성 화학 접근법을 통해 변형된 리신을 의미한다. 바람직한 Lys 유도체는 아실화 및(또는) 카르바밀화 반응을 통해 수득된다. 바람직한 실시양태에서, Lys은 양하전된 아미노산으로 유도체화된다. 다른 바람직한 실시양태에서, Lys은 ε(-Nε) 아미노기에서 Arg으로 유도체화되어 Lys-Nε-Arg을 형성한다. 다른 바람직한 실시양태에서, Lys은 ε-아미노기에서 Lys으로 유도체화되어 Lys-Nε-Lys을 형성한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 유도체화된 Lys은 호모아르기닌 (호모Arg 또는 hR)이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 유도체화된 Lys은 d리신 (dLys 또는 dL)이며, 여기서 Lys은 α-탄소에서 전도된 입체화학을 갖는다. 다른 바람직한 실시양태에서, 유도체화된 Lys은 α-구아니디노호모아르기닌 (gHR)이다.
인간 인슐린은 세 개의 유리 아미노기 (A-쇄의 N-말단 α-아미노기, B-쇄의 N-말단 α-아미노기 및 B-쇄 리신 측쇄의 ε-아미노기)를 함유한다. 일반적으로, 단백질의 α-아미노기 및(또는) ε-아미노기는 활성화된 카르복실산으로 아실화될 수 있다. 본원에서, 아실화 반응은 아민과 카르복실산 사이에 아미드 결합이 형성되는 반응을 나타낸다.
인슐린 A-쇄의 N-말단 아미노산을 아미노산으로 아실화시키면 펩티드 결합이 형성된다. 이와 마찬가지로, 인슐린 B-쇄의 N-말단 아미노산을 아미노산으로 아실화시키면 펩티드 결합이 형성된다. Lys의 ε-아미노기를 아미노산으로 아실화시켜 Lys-Nε-아미노산 유도체를 형성한다.
"아실화된 Arg"은 아실-함유 화합물의 산기와 Arg의 ε-아미노기 사이에 형성된 공유 결합을 통해 Arg에 공유 결합된 아실 잔기를 나타낸다.
"아실화된 Lys"은 아실-함유 화합물의 산기와 Lys 사이에 형성된 공유 결합을 통해 Lys에 공유 결합된 아실 잔기를 나타낸다.
"카르바밀화된 인슐린"은 카르바밀-함유 화합물 카르바밀 기의 카로보닐 탄소와 인슐린의 아미노기 사이에 형성된 공유 결합을 통해 인슐린에 공유 결합된 카르바밀 잔기를 나타낸다.
"카르바밀화된 Arg"은 카르바밀-함유 화합물 카르바밀 기의 카로보닐 탄소와 Arg의 α-아미노기 사이에 형성된 공유 결합을 통해 Arg에 공유 결합된 카르바밀 잔기를 나타낸다.
"카르바밀화된 Lys"은 카르바밀-함유 화합물 카르바밀 기의 카로보닐 탄소와 Lys 사이에 형성된 공유 결합을 통해 Lys에 공유 결합된 카르바밀 잔기를 나타낸다.
"제약상 허용되는"은 인간에게 투여하기에 임상적으로 적합하다는 것을 의미한다. 제약상 허용되는 제제는 독성 성분, 바람직하지 못한 오염 물질 등을 함유하지 않으며, 함유된 활성 화합물의 활성을 방해하지 않는다.
"제약 조성물"은 인간 대상체에게 투여하기에 임상적으로 허용되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 인슐린 분자는 단백질이 1종 이상의 무기 염기, 및 무기 및 유기 산과 상호작용하여 염을 형성하도록 제약 조성물로 제제화될 수 있다. 산 부가염 형성에 통상적으로 사용되는 산은 무기산 (예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 인산 등) 및 유기산 (예를 들어, p-톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 옥살산, p-브로모페닐-술폰산, 탄산, 숙신산, 시트르산, 벤조산, 아세트산, 트리플루오로아세트산 등)이다. 상기 염의 예로는 술페이트, 피로술페이트, 비술페이트, 술파이트, 비술파이트, 포스페이트, 일수소 포스페이트, 이수소 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아실레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프로에이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 술포네이트, 크실렌술포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이드, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, γ-히드록시부티레이트, 글리콜레이트, 타르트레이트, 메탄술포네이트, 프로판술포네이트, 나프탈렌-1-술포네이트, 나프탈렌-2-술포네이트, 만델레이트 등이 있다.
염기 부가염으로는 무기 염기로부터 유래된 염 (예를 들어, 암모늄, 또는 알칼리 또는 알칼리 토금속의 수산화물, 탄산염, 중탄산염 등)이 있다. 본 발명의 염을 제조하는 데 유용한 상기 염기로는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 탄산칼륨 등이 있다.
"미세결정"은 대부분이 결정 상태이며 미세단위 크기 (통상적으로, 최대 치수가 1 내지 100 미크론의 범위임)를 갖는 물질을 포함하는 고체를 의미한다. "미정질"은 미세결정이 된 상태를 나타낸다.
"무정형 침전물"은 결정 형태가 아닌 불용성 물질을 나타낸다. 당업자는 결정과 무정형 침전물을 구별할 수 있다.
"현탁액"은 콜로이드 크기보다 큰 불용성 또는 약 가용성 입자로 구성된 액체 상과 고체 상의 혼합물을 의미한다. 예를 들어, NPH 미세결정과 수성 용매의혼합물이 현탁액을 형성한다.
"현탁액 제제"는 활성 제제가 수성 용매에 미세 분산된 고체 상 (예를 들어, 미정질 고체, 무정형 침전물, 또는 둘 다)으로 존재하는 제약 조성물을 의미한다. 미세 분산된 고체는 혼합물을 부드럽게 교반함으로써 수성 용매 전반에 걸쳐 균일하게 현탁된 고체이며, 따라서 매우 균일한 현탁액을 제공하고, 이 현탁액으로부터 투여 부피를 추출해 낼 수 있다. 상업적으로 시판되는 인슐린 현탁액 제제의 예로는 NPH, PZI 및 울트라렌테 (Ultralente)가 있다. 미정질 현탁액 제제의 고체 물질 중 일부가 무정형 상태일 수 있다. 바람직하게는, 무정형 물질의 비율이 미정질 현탁액의 고체 물질 중 10％ 미만이고, 가장 바람직하게는, 미정질 현탁액 중 고체 물질의 1％ 미만이다. 이와 마찬가지로, 무정형 침전물 현탁액 중 고체 물질 중 일부가 미정질일 수 있다.
"프로타민"은 물고기 정자로부터 수득한 강염기성 단백질의 혼합물을 의미한다. 프로타민에 포함된 단백질의 평균 분자량은 약 4,200이다 (문헌 [Hoffmann, J.A., et al., Protein Expression and Purification, 1:127-133 (1990)]). "프로타민"은 상대적으로 염을 포함하지 않는 단백질 제제 ("프로타민 염기"로도 지칭됨)를 나타낼 수 있다. 프로타민은 또한 단백질 염 (예를 들어, 프로타민 술페이트)을 포함하는 제제를 나타낸다. 상업적인 제제는 그의 염 함량이 매우 광범위하다.
"수성 용매"는 물을 함유하는 액체 용매를 의미한다. 수성 용매 시스템은 물만을 포함할 수도, 물과 1종 이상의 혼화가능한 용매를 포함할 수도, 또는 용질을 포함할 수도 있다. 통상적으로 사용되는 혼화가능한 용매는 단쇄 유기 알콜 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올); 단쇄 케톤 (예를 들어, 아세톤); 및 폴리알콜 (예를 들어, 글리세롤)이다.
"등장성 제제"는 생리학적으로 허용되며, 투여하는 제제와 접촉하는 세포막을 통한 물의 흐름을 방지하기 위해 제제에 적합한 장성을 제공하는 화합물을 의미한다. 글리세롤 (글리세린으로도 공지되어 있음) 및 만니톨이 통상적으로 사용되는 등장성 제제이다. 다른 등장성 제제로는 염 (예를 들어, 염화나트륨) 및 모노사카라이드 (예를 들어, 덱스트로스 및 락토스)가 있다. 바람직하게는, 등장성 제제는 글리세롤이다.
"헥사머-안정화 화합물"은 헥사머 결합 상태의 본 발명의 인슐린 분자를 안정화시키는, 비-단백질성이며 소분자량을 갖는 화합물을 의미한다. 페놀 화합물 (특히, 페놀 보존제)은 가장 잘 알려진 인슐린 분자 안정화 화합물이다. 바람직하게는, 헥사머-안정화 화합물은 페놀, m-크레졸, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 메틸파라벤, 또는 상기 화합물 2 개 이상의 혼합물 중 하나이다. 보다 바람직하게는, 헥사머-안정화 화합물은 페놀 또는 m-크레졸, 또는 이들의 혼합물이다.
"보존제"는 항-미생물 제제로서 작용시키기 위해 제약 제제에 첨가하는 화합물을 나타낸다. 본 발명의 제제에 사용되는 보존제는 페놀 보존제일 수 있으며, 헥사머-안정화 화합물과 동일하거나 상이할 수 있다. 비경구 제제는 상업적으로 사용가능한 다용도 제품이 되기 위해 보존 효과에 대한 기준을 만족시켜야 한다. 당업계에 공지된 보존제 중 비경구 제제로 효과적이며 허용되는 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄, 클로로헥시딘, 페놀, m-크레졸, 벤질 알콜, 메틸파라벤, 클로로부탄올, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 페닐머큐릭 니트레이트, 티메로살, 벤조산, 부틸 파라벤, 에틸 파라벤, 페녹시 에탄올, 페닐 에틸알콜, 프로필 파라벤, 벤질클로로크레졸, 클로로크레졸, 및 이들의 다양한 혼합물이다.
"페놀 보존제"로는 화합물 페놀, m-크레졸, o-크레졸, p-크레졸, 클로로크레졸, 메틸파라벤, 및 이들의 혼합물이 있다. 특정 페놀 보존제 (예를 들어, 페놀 및 m-크레졸)는 인슐린-유사 분자에 결합하여 물리적 또는 화학적 안정성, 또는 둘다를 증가시키는 형태 변화를 유도한다고 공지되어 있다. 바람직하게는, 페놀 보존제는 m-크레졸 또는 페놀이다. "완충액" 또는 "제약상 허용되는 완충액"은 인슐린 제제에 사용하기에 안전하며, 상기 제제에 바람직한 pH값에서 제제의 pH를 조절하는 효과를 갖는 화합물을 나타낸다. 본 발명 결정 제제의 pH는 약 6.0 내지 약 8.0이다. 본 발명 용액 제제의 pH는 약 3.5 내지 약 6.0이다.
적당한 산성 pH 내지 적당한 염기성 pH에서 pH를 조절하는 제약상 허용되는 완충액으로는 락테이트; 타르타레이트; 포스페이트 (특히, 나트륨 포스페이트); 아세테이트 (특히, 나트륨 아세테이트); 시트레이트 (특히, 나트륨 시트레이트); 아르기닌; TRIS; 및 히스티딘과 같은 화합물이 있다. "TRIS"는 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올, 및 그의 임의의 제약상 허용되는 염을 나타낸다. 유리 염기 및 염산 형태는 TRIS의 두가지 통상적인 형태이다. TRIS는 또한 당업계에 트리메틸롤 아미노메탄, 트로메타민, 및 트리스(히드록시-메틸)아미노메탄으로 공지되어 있다. 바람직한 수준에서 pH를 조절하기에 적합한 다른 제약상 허용되는 완충액은화학자에게 공지되어 있다.
"속효성 인슐린 유사체"는 a) 피하 투여 후에 인간 인슐린보다 먼저 시작되고/또는 (b) 피하 투여 후에 인간 인슐린보다 짧은 작용 기간을 나타내는 저혈당 효과를 제공한다. B28LysB29Pro-인슐린 ("리스프로 (lispro)" 인슐린으로도 불림)은 속효성 인슐린 유사체이며, 이는 야생형 인슐린 B-쇄 (서열 번호 4) 위치 28의 Pro와 야생형 인슐린B-쇄 (서열 번호 4) 위치 29의 Lys이 교환된 것이다. 예를 들어, 미국 특허 제5,504,188호 및 제5,700,662호를 참조한다. 다른 속효성 인슐린 유사체는 B28Asp-인슐린이며, 이는 B-쇄 위치 28의 야생형 Pro가 Asp에 의해 치환된 것이다. 미국 특허 제6,221,633호를 참조한다. 다른 속효성 인슐린 유사체는 B3LysB29Glu- 인슐린이다. 미국 특허 제6,221,633호를 참조한다.
또한, 본원에서는 본 발명의 인슐린 분자를 포함하는 미세결정을 제공한다. 한 실시양태에서, 미세결정은 프로타민을 함유하지 않는다. 본 발명의 다른 측면에서, 미세결정은 프로타민을 함유하지 않으며, 2가 양이온 (예를 들어, 아연)을 함유한다. 상기 결정은 특히 용액 중 벌크 결정, 또는 이후의 제제화를 위한 건조 형태의 제조에 적합하다.
다른 실시양태에서, 미세결정은 프로타민을 함유한다.
다른 실시양태에서, 미세결정은 본 발명의 인슐린 분자 및 인간 인슐린 둘 모두를 함유한다. 한 바람직한 실시양태에서, 미세결정은 용액 제제 제조에 사용된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 미세결정은 현탁액 제제 제조에 사용된다.
또한, 본 발명의 인슐린 분자를 포함하는 현탁액 제제가 제공된다. 또한 상기 현탁액 제제를 포함하는 조성물이 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 현탁액 제제는 불용성 상 (본 발명의 미세결정 포함)과 용액 상 (물 포함)을 함유한다. 바람직하다면, 용액 상은 인간 인슐린 또는 속효성 인슐린 유사체 (예를 들어, B28LysB29Pro-인슐린, B28Asp-인슐린, 또는 B3LysB29Glu-인슐린)를 함유한다.
현탁액 제제는 진성 당뇨병 치료용 의약 제조에 사용될 수 있다. 현탁액 제제는 또한 대상체에서 혈당 농도를 조절하기에 충분한 양의 현탁액 제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법으로 진성 당뇨병 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 인슐린 분자는 적합한 2가 금속 양이온과 복합체를 형성할 수 있다. "2가 금속 양이온"은 단백질 분자 다수와 복합체를 형성하는데 참여하는 이온 또는 이온들을 의미한다. 전이 금속, 알칼리 금속 및 알칼리 토금속은 인슐린과 복합체를 형성하는 것으로 공지된 금속의 예이다. 전이 금속이 바람직하다. 바람직하게는, 2가 금속 양이온은 아연, 구리, 코발트, 망간, 칼슘, 카드뮴, 니켈 및 철로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 양이온이다. 보다 바람직하게는, 아연이 2가 금속 양이온이다. 바람직하게는, 아연이 염 (예를 들어, 황산아연, 염화아연, 산화아연 또는 아세트산 아연)으로서 제공된다. 인슐린 분자의 2가 금속 복합체는 일반적으로 생리학적 pH 부근의 pH값을 갖는 수용액에 불용성이다. 따라서, 이러한 복합체는 현탁액 제제로 피하 투여될 수 있으며, 이로 인하여 화합물의 생체 내 방출 속도가 감소되어 화합물의 작용 시간을 연장시킨다.
본 발명의 인슐린 분자와 2가 금속 양이온의 복합체를 수득하기 위해, 단백질을 금속 염의 존재 하에서 적합한 완충액에 용해시킨다. 혼합물을 상온에서 인큐베이션하여 복합체가 침전되도록 한다. 적합한 완충액은 약 3.0 내지 약 9.0 범위의 pH에서 혼합물을 유지시키며, 복합체화 반응을 방해하지 않는다. 상기 완충액의 예로는 포스페이트 완충액, 아세테이트 완충액, 시트레이트 완충액 및 구데스 (Goode's) 완충액 (예를 들어, HEPES), 트리스 및 트리스 아세테이트가 있다. 적합한 금속 염은 복합체화 반응에 사용가능한 금속의 염이다. 적합한 아연 염의 예로는 염화아연, 아세트산 아연, 산화아연 및 황산아연이 있다.
"보호된 아미노산"은 모든 반응성 관능기를 가지지만 이 중 하나가 역으로 유도체화되어 오직 하나의 관능기만이 반응성인 아미노산이다. 예를 들어, 보호되고 활성화된 카르복실산의 경우, α-카르복실레이트 기가 반응성이고, 활성화된 카르복실산의 다른 모든 관능기는 비-반응성이다. 보호 관능기가 제거되는 경우에 보호된 아미노산은 "탈보호화"된다. 바람직하게는, 보호된 아미노산은 보호된 아르기닌이다.
"보존적 치환"은 아미노산이 자신과 동일한 순 전기 전하를 가지며 대략 동일한 크기 및 형태를 갖는 다른 아미노산으로 치환되는 것이다. 지방족 또는 치환된 지방족 아미노산 측쇄를 갖는 아미노산은 이들의 측쇄에 존재하는 탄소 및 헤테로 원자의 총수 차이가 4이하인 경우 대략 동일한 크기를 갖는다. 이들은 이들의 측쇄 분지 수 차이가 1이하인 경우에 대략 동일한 형태를 갖는다. 측쇄에 페닐 또는 치환된 페닐 기를 포함하는 아미노산을 대략 동일한 크기 및 형태를 갖는 것으로 간주한다. 아미노산 5개 군을 하기에 나열하였다. 인슐린의 한 아미노산을 동일한 군으로부터의 다른 아미노산으로 치환하는 것이 보존적 치환을 초래한다:
I 군: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 및 C1-C4 지방족 또는 C1-C4 치환된 지방족 측쇄를 갖는 비-자연 발생 아미노산 (직쇄 또는 단일분지형).
II 군: 글루탐산, 아스파르트산, 및 카르복실산 치환된 C1-C4 지방족 측쇄를 갖는 비-자연 발생 아미노산 (비분지형이거나, 하나의 분지점을 가짐).
III 군: 리신, 오르니틴, 아르기닌, 호모아르기닌, 및 아민 또는 구아니디노 치환된 C1-C4 지방족 측쇄를 갖는 비-자연 발생 아미노산 (비분지형이거나, 하나의 분지점을 가짐).
IV 군: 글루타민, 아스파라긴, 및 아미드 치환된 C1-C4 지방족 측쇄를 갖는 비-자연 발생 아미노산 (비분지형이거나, 하나의 분지점을 가짐)
V 군:페닐알라닌, 페닐글리신, 티로신 및 트립토판.
본원에서 달리 구체적으로 제공되는 경우 이외에는, 보존적 치환은 자연 발생 아미노산으로 수행하는 것이 바람직하다.
"고도의 보존적 치환"은 아미노산이 측쇄에 동일한 관능기를 가지며, 거의 동일한 크기 및 형태를 갖는 다른 아미노산으로 치환되는 것이다. 지방족 또는 치환된 지방족 아미노산 측쇄를 갖는 아미노산은 이들의 측쇄에 존재하는 탄소 및 헤테로 원자의 총수 차이가 2이하인 경우 거의 동일한 크기를 갖는다. 이들은 이들의 측쇄 분지 수가 동일한 경우 거의 동일한 형태를 갖는다. 고도의 보존적 치환의 예로는 류신을 발린으로, 세린을 트레오닌으로, 글루탐산을 아스파르트산으로, 및 페닐알라닌을 페닐글리신으로 치환하는 것이 있다. 고도로 보존적이지 않은 치환의 예로는 발린을 알라닌으로, 세린을 알라닌으로, 및 세린을 아스파르트산으로 치환하는 것이 있다.
본 발명의 인슐린 분자에서, A-쇄는 A-쇄 C-말단에 1-3개의 아미노산을 더 포함할 수 있으며, 이들은 식 I의 A22, A23 및 A24에 위치할 것이다. 바람직하게는, A22, A23 및 A24의 각각의 위치의 아미노산은 Xaa이며, 여기서 Xaa는 유전자에 의해 코딩가능한 아미노산이다.
B-쇄는 B-쇄 C-말단에서 추가의 아미노산 1-6개를 가질 수 있으며, 이들은 식 II의 B31, B32, B33, B34, B35 및 B36에 위치할 것이다. 한 바람직한 실시양태에서, B-쇄는 위치 B31에 Ala, 위치 B32에 Arg, 위치 B33에 Arg을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, B-쇄는 위치 B31에 Ala, 위치 B32에 Ala, 위치 B33에 Ala, 위치 B34에 Ala, 위치 B35에 Arg, 위치 B35에 Arg을 포함한다.
본 발명의 인슐린 분자, 미세결정, 현탁액, 용액, 무정형 침전물 또는 조성물의 "유효량"은 인슐린 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하였을 때 허용되지 않는 부작용을 유발하지 않고 원하는 인슐린 효과를 나타내는 양이다. 대상체에게 투여되는 본 발명 인슐린 분자의 "유효량"은 또한 질환의 유형 및 중증도, 대상체의 특성 (예를 들어, 일반적인 건강 상태, 연령, 성별, 체중 및 약물에 대한 허용성)에 따라 달라질 것이다. 당업자는 상기 인자 및 다른 인자에 따라 적절한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 통상적으로, 본 발명의 인슐린 분자의 치료 유효량은 성인의 경우 약 0.01mg/일 내지 약 1000mg/일의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 투여량은 약 0.1mg/일 내지 약100mg/일의 범위이고, 보다 바람직하게는 약 1.0mg/일 내지 약 10mg/일의 범위이다.
"원하는 치료 효과"는 1) 진성 당뇨병과 연관된 증상(들)의 완화, 2) 당뇨병과 연관된 증상 개시의 지연, 3) 치료를 받지 않을 때보다 증가한 수명, 및 4) 치료를 받지 않을 때보다 향상된 삶의 질 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 당뇨병 치료에 사용되는 본 발명 인슐린 분자의 "유효량"은 치료를 받지 않을 때보다 혈당 조절 능력이 향상되고, 이로 인해 망막증, 신경 장애 또는 신장 질환과 같은 당뇨병 합병증의 개시를 지연시키는 양이다.
투여량, 투여 경로, 및 일일 투여 횟수는 치료 목적, 환자 질환의 특성 및 원인, 환자의 성별 및 체중, 운동 수준, 식습관, 투여 방법, 및 전문의에게 공지된 다른 인자를 고려하여 전문의에 의해 결정될 것이다. 넓은 범위에서, 일일 투여량은 약 1nmol/kg(체중) 내지 약 6nmol/kg(체중) (6 nmol을 인슐린 활성의 약 1 단위와 동일한 것으로 간주함)의 범위이다. 통상적으로, 현존하는 인슐린 치료의 투량은 약 2 내지 약 3nmol/kg이다.
당뇨병 치료 전문의는 본 발명의 제제를 투여하기에 치료상 가장 유리한 방법을 선정할 수 있을 것이다. 비경구 경로 투여가 바람직하다. 인슐린의 용액 제제 및 현탁액 제제를 비경구 투여하는데 이용되는 통상적인 경로는 피하 및 근육내 경로이다. 본 발명의 조성물 및 제제는 비강, 구강, 폐, 또는 안구 경로로 투여할 수도 있다.
본 발명의 인슐린 분자 및 그의 조성물은 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여 방법으로는, 예를 들어 근육내, 정맥내, 피하 또는 복막내 주사와 같은 전신 투여 방법이 있다. 바람직하게는, 투여 경로는 피하 경로이다.
본 발명의 인슐린 분자 및 그의 조성물은 고혈당증 치료에 사용되는 제약 조성물의 일부분으로서 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제와 함께 대상체에게 투여할 수 있다.
본 발명의 인슐린 분자 및 그의 조성물은 용액제일 수 있다. 별법으로, 본 발명의 인슐린 분자 및 그의 조성물은 본 발명의 인슐린 분자의 현탁액 제제 또는 2가 금속 양이온과 복합체를 형성한 단백질 화합물의 현탁액 제제일 수 있다.
또한, 본원에서는 본 발명의 인슐린 분자, 및 등장성 제제, 2가 양이온, 헥사머-안정화 화합물, 보존제 및 완충액으로 구성된 군으로부터 선택된 성분을 하나 이상 포함하는 조성물이 제공된다.
적합한 제약 담체는 본 발명의 인슐린 분자와 상호작용하지 않는 비활성 성분을 함유할 수 있다. 표준 제약 제제 기술은 문헌 [Remington's Phamaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA]에 기재된 것과 같은 것을 이용할 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제약 담체로는, 예를 들어 멸균수, 생리학적 염수, 세균 발육 저지 염수 (0.9％ mg/ml 벤질 알콜을 함유하는 염수), 포스페이트-완충된 염수, 행크 (Hank) 용액, 링거 (Ringer)-락테이트 등이 있다. 적합한 부형제의 몇몇 예로는 글리세롤, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 트레할로스, 소르비톨 및 만니톨이 있다.
"대상체"는 포유동물 (바람직하게는, 인간)이지만, 동물 (예를 들어, 애완 동물 (예를 들어, 개, 고양이 등), 사육 동물 (예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험용 동물 (예를 들어, 래트 (rat), 마우스, 기니아 피그 (guinea pig) 등))일 수도 있다.
인슐린 주형 및 인슐린 유사체는 재조합 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, 재조합 프로인슐린 또는 프로인슐린 유사체가 사용될 수 있다. 별법으로, 재조합 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄는 숙주 세포에서 발현된 후에 재조합될 수 있다. 별법으로, 인슐린 전구체가 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 각각 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,421,685호, 제4,569,791호, 제4,569,792호, 제4,581,165호, 제4,654,324호, 제5,304,473호, 제5,457,066호, 제5,559,094호, 유럽 특허 출원 EP 741188 A1을 참조한다. 또한, 문헌 [Chance et al., Diabetes Care 16 (Suppl 3): 133-142 (1993)]; [Chance et al., "Peptide: Synthesis-Structure-Function," in: Proceedings of the 7th American Peptide Symposium, Rich, D. H. et al., eds., Pierce Chemical Company, Rockford, IL, pp. 721-738 (1981)]; 및 [Frank et al., Munch med Wsch 125 (Suppl. 1):S14-20 (1983)]을 참조한다.
한 바람직한 실시양태에서, A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린은 A0LysA21GlyB29Lys-인슐린의 ε-아미노기를 선택적으로 아실화시켜 제조된다. ε-아미노기의 선택적인 아실화 반응은 당업자에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제5,646,242호를 참조한다. 다른 바람직한 실시양태에서, A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린은 A21GlyC64ArgC65Lys-인간 프로인슐린의 ε-아미노기를 선택적으로 아실화시키고, 아실화된 프로인슐린 유도체를 프로테아제로 분해하여 원치 않은 아미노산을 제거함으로써 제조하는데, 이 때 C65Lys-Nε-Arg및 B29Lys-Nε-Arg를 손상시키지 않으면서 A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 유도체를 형성해야 한다.
재조합 인슐린 분자는 인슐린 분자 또는 그의 전구체를 코딩하는 DNA 서열을 함유하며, 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 숙주 세포를 상기 펩티드를 발현시키는 조건 하에 적합한 영양 배지에서 배양하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있으며, 후에 생성된 펩티드는 숙주 세포 및(또는) 배양 배지로부터 회수한다.
세포 배양에 사용되는 배지는 숙주 세포 증식에 적합한 임의의 통상적인 배지 (예를 들어, 적절한 보충물을 함유하는 최소 또는 복합 배지)일 수 있다. 적합한 배지는 상업 공급자로부터 시판되거나, 공개된 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 아메라칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection) 카달로그의 방법). 이어서, 세포에 의해 생성된 펩티드는 당해 펩티드의 유형에 따라 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 숙주 세포를 분리하고, 염 (예를 들어, 암모늄 술페이트)에 의해 상층액 또는 여액의 단백질성 성분을 침전시키고, 다양한 크로마토그래피 방법 (예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등)에 의해 정제하는 것을 포함하는 통상적인 방법에의해 배양 배지로부터 회수된다.
따라서, 본원에서는 숙주 세포의 증식 및 인슐린 분자의 발현에 적합한 조건 하에서 인슐린 분자를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본 발명의 인슐린 분자를 발현시키는 방법이 제공된다. 한 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 숙주 세포로부터 인슐린 분자를 정제하는 것을 더 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 배양 배지로부터 인슐린 분자를 정제하는 것을 더 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 숙주 세포 및 배양 배지로부터 인슐린 분자를 정제하는 것을 더 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 바람직하게는, 진핵 세포는 진균 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 또는 포유동물 세포주의 무한증식 세포이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 바람직하게는, 원핵 세포는 박테리아 세포이고, 보다 바람직하게는 대장균 (E. coli) 세포이다.
인슐린 분자 또는 그의 전구체를 코딩하는 핵산 서열은 DNA 재조합 방법에 편리하게 사용할 수 있는 벡터에 삽입될 수 있으며, 선택되는 벡터는 벡터가 도입되는 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 따라서, 벡터는 자가 복제 벡터일 수 있다 (즉, 백터는 염색체외 물질로 존재하며, 복제는 염색체 복제에 독립적이다; 예를 들어, 플라스미드). 별법으로, 벡터는 숙주 세포에 도입된 경우에 숙주 세포 게놈에 통합되어 이 통합된 벡터가 염색체와 함께 복제되는 벡터일 수 있다.
바람직하게는, 벡터는 펩티드를 코딩하는 DNA 서열이 DNA의 전사에 필요한추가 부위 (예를 들어, 프로모터)와 작동가능하게 연결된 발현 벡터이다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 DNA 서열일 수 있으며, 숙주 세포에 동종 또는 이종인 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유래될 수 있다. 다양한 숙주 세포에서 본 발명의 펩티드를 코딩하는 DNA의 전사를 유도하는 적합한 프로모터의 예는 당업계에 공지되어 있다.
또한, 펩티드를 코딩하는 DNA 서열은, 필요하다면, 적합한 종결자, 폴리아데닐화 신호, 전사 인헨서 (enhancer) 서열 및 번역 인헨서 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 당해 숙주 세포에서 벡터 복제를 가능하게 하는 DNA 서열을 더 포함할 수 있다.
또한, 벡터는 선별가능한 마커 (예를 들어, 숙주 세포에서 결핍된 부분을 보완하거나, 약물 (예를 들어, 암피실린, 카나마이신, 테트라시클린, 클로람페니콜, 네오마이신, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트)에 대한 내성을 부여하는 생성물을 제공하는 유전자))를 포함할 수 있다.
본 발명의 모 펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 유도하기 위하여, 분비 신호 서열 (리더 서열, 프리프로 (prepro) 서열 또는 프리 (pre) 서열로도 공지되어 있음)을 재조합 벡터에 제공할 수 있다. 분비 신호 서열은 펩티드를 코딩하는 DNA 서열에 정확한 리딩 프레임으로 연결된다. 통상적으로, 분비 신호 서열은 펩티드를 코딩하는 DNA 서열의 5'에 위치한다. 통상적으로, 분비 신호 서열은 펩티드와 연관될 수 있거나, 다른 분비 단백질을 코딩하는 유전자로부터의 서열일 수 있다.
본 발명의 인슐린 분자는 고상 펩티드 합성 기술의 표준 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 펩티드 합성기는, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems, 캘리포니아주, 포스터 시티)로부터 시판된다. 고상 합성에 사용되는 시약은, 예를 들어 미드웨스트 바이오텍 (Midwest Biotech) (인디애나주, 피셔 (Fishers))으로부터 시판된다. 고상 펩티드 합성기는 간섭기를 차단시키고, 반응하는 아미노산을 보호하고, 커플링시키고, 탈커플링시키고, 반응하지 않는 아미노산을 캡핑 (capping)시키는 제조 지침에 따라 이용될 수 있다.
통상적으로, 수지 상에서 신장되는 펩티드 쇄의 α-N-카르바밀 보호된 아미노산 및 N-말단 아미노산은 실온에서 커플링제 (예를 들어, 디시클로헥실카르보디이미드 및 1-히드록시카르보디이미드) 및 염기 (디이소프로필에틸아민)의 존재하에 비활성 용매 (예를 들어, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리딘 또는 염화메틸렌) 중에서 커플링시킨다. α-N-카르바밀 보호기를 트리플루오로아세트산 (TFA) 또는 피페리딘과 같은 시약을 이용하여 생성된 펩티드 수지로부터 제거하고, 커플링 반응을 펩티드 쇄에 첨가되는 차선의 N-보호된 아미노산으로 반복한다. 적합한 아민 보호기는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Green and Wuts, "Protectinggroups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, 1991] (전 교시내용이 본원에 참고문헌으로 포함된 것으로 간주함)에 기재되어 있다. 이들의 예로는 t-부틸옥시카르보닐 (tBOC) 및 플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc)가 있다.
펩티드는 적절한 측쇄 보호 반응과 함께 t-부톡시카르보닐-α-아미노산 또는 플루오레닐메톡시카르보닐-α-아미노산을 이용하는 표준 자동화 고상 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 합성이 종결된 후에, 표준 불화수소 또는 TFA 방법을이용하는 동시 측쇄 탈보호 반응으로 펩티드를 고상 지지체로부터 절단한다. 이어서, 조 펩티드를 물-아세토니트릴 선형 구배를 이용하는 비닥 (Vydac) C18 컬럼 상 (모든 용매는 0.1％ TFA를 함유함)에서 역상 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제한다. 아세토니트릴과 물을 제거하기 위하여, 펩티드를 0.1％ TFA, 아세토니트릴 및 물을 함유하는 용액으로부터 동결건조시킨다. 순도는 분석용 역상 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 펩티드의 정체는 질량 분광법으로 측정될 수 있다. 펩티드는 중성 pH에서 수성 완충액에 용해될 수 있다.
본 발명의 인슐린 분자는 재조합 인슐린 주형을 화학적으로 변형시켜 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 재조합 인슐린 주형을 활성화된 카르복실산 잔기를 이용하여 1종 이상의 보호된 아미노산으로 아실화된다. 바람직하게는, 활성화된 에스테르 또는 아미드가 사용된다. 보다 바람직하게는, 활성화된 에스테르가 사용된다. 보다 더 바람직하게는, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르가 사용된다.
본 발명의 방법에서, 인슐린 분자는 인슐린 주형을 화학적으로 변형 (인슐린 주형을 활성화된 카르복실산 잔기를 사용하여 보호된 아미노산으로 아실화시킴)시켜 제조된다. 바람직하게는, 활성화된 에스테르 또는 아미드가 사용된다. 보다 바람직하게는, 활성화된 에스테르가 사용된다. 보다 더 바람직하게는, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르가 사용된다. 인슐린 A-쇄 및(또는) B-쇄 Lys의 N-말단 을 아실화시키는 기술이 당업자에게 공지되어 있다.
따라서, 한 바람직한 실시양태에서 재조합 A21Xaa-인슐린은 위치 A1 및 B29에서 아실화되어 A0ArgA21XaaB29Lys-Nε-Arg-인슐린을 형성한다. 다른 바람직한 실시양태에서, A21Gly-인슐린은 위치 A1 및 B29에서 아실화되어 A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린을 형성한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 재조합 A0ArgA21Xaa-인슐린은 위치 B29에서 아실화되어 A0ArgA21XaaB29Lys-Nε-Lys-인슐린을 형성한다. 다른 바람직한 실시양태에서, A0ArgA21Gly-인슐린은 위치 B29에서 아실화되어 A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Lys-인슐린을 형성한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 재조합 A0LysA21Xaa-인슐린은 위치 A0 및 B29에서 아실화되어 A0Lys-Nε-ArgA21XaaB29Lys-Nε-Arg-인슐린을 형성한다. 바람직하게는, A0LysA21Gly-인슐린이 위치 A0 및 B29에서 아실화되어 A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린을 형성한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 프로인슐린 유사체가 본 발명의 인슐린 분자 제조에 사용된다. 야생형 인간 프로인슐린에서, Lys은 위치 64의 아미노산이고, Arg은 위치 65의 아미노산이다. 위치 64의 아미노산이 Arg이고, 위치 65의 아미노산이 Lys인 프로인슐린 유사체는 A0LysA21Xaa-인슐린 제조에 사용되며, 이는 이어서 위치 A0 및 B29에서 아실화되어 A0Lys-Nε-ArgA21XaaB29Lys-Nε-Arg-인슐린을 형성한다. 바람직하게는, A0LysA21Gly-인슐린이 위치 B29에서 아실화되어 A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린을 형성한다.
단백질 아실화 반응은 물과 유기 용매의 혼합물에서 수행하는 것이 바람직하지만, 반응물의 용해도에 따라 순수한 유기 조건 또는 순수하게 수성인 조건에서 수행될 수 있다. 하기 실시예에서, 반응은 유기 성분으로서 MeOH, DMF 또는 CH3CN를 포함하는 40 내지 60％의 유기물을 함유하는 혼합물에서 수행하였다. 활성화된 카르복실산 잔기는, ε-아미노기 및 모든 측쇄 관능기가 적절한 보호기로 유도체화된 (바람직하게는, 단백질 유도체화가 완결된 후에 상기 보호기는 제거됨) 아미노산, 디펩티드 또는 단쇄 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 카르복실레이트 활성화 기는 N-히드록시-숙신이미드 (NHS)이다 (수성 혼합물에 잘 용해되고, 생성된 NHS-에스테르와 단백질 아미노기와의 반응성이 높기 때문임). 인슐린 주형에 대한 NHS-에스테르의 비는 2 내지 20 사이에서 달라질 수 있으나, 바람직하게는 3 내지 5이다. 상기 비는 모노-, 디- 및 트리-아실화된 생성물(들)의 요구되는 양 뿐만 아니라 도입되는 NHS-에스테르 시약의 상대적인 반응성에 따라 조정된다.
일반적으로 반응은 반응물을 자기 교반 바 (bar)에 의해 교반하거나, 로티서리 (rotisserie) 상에서 혼합하면서 실온에서 (20-25 ℃)에서 수행한다. 반응은 1/2시간 내지 6시간 동안 진행되는 것이 바람직하다.
반응 혼합물은 원하는 수준의 아실화 반응이 일어난 후 (LC-MS 모니터링에 의해 측정)에 아세트산 또는 트리플루오로아세트산으로 산성화시켜 켄칭한다. 추가 후처리/정제 과정은 (1) 반응 혼합물을 역상 HPLC에 의해 직접 정제한 후, 보호기를 제거하여 생성된 단리되고 탈보호된 생성물을 역상 HPLC에 의해 재정제하거나, (2) 반응 혼합물을 물로 희석하여 유기물 함량은 25％ 미만으로 낮추고, 동결건조시킨 후에 보호기를 제거하고, 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하고, 역상 HPLC 또는 겔 여과로 최종 정제/탈염화함으로써 수행할 수 있다.
보호기는 단백질 및 펩티드가 양립할 수 있는 조건 (즉, 단백질/펩티드를 분해할 만큼 엄격하지는 않은 조건)에서 수행되는 탈보호 반응에 사용되는 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, tert-부틸옥시카르보닐 (Boc) 또는 트리플루오로아세틸 (tfa) 기는 아미노 관능기를 보호하는 데 사용될 수 있다. 보호기는 예를 들어 각각 트리플루오로아세트산 (TFA) 및 수성 수산화암모늄 (NH40H)으로 제거될 수 있다. 구아니디노 잔기는 Boc, Pmc (2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐), 또는 Pbf (2,2,4,6,7-펜타메틸벤조푸란-5-술포닐) 기를 통해 보호될 수 있다. Pmc 및 Pbf 기는 또한 TFA로 제거될 수 있지만, 하기 실시예에 추가로 기재한 바와 같이 스캐빈저 (scavenger)의 존재를 필요로 한다.
아미노기는 아실화 반응에서 적절하게 반응하기 위해 반드시 중성 (탈양성자화된) 형태로 존해하여야 하기 때문에, 반응이 수행되는 pH값은 반응 속도에 매우 큰 영향을 미친다. 일반적으로, 수성 혼합물에서, 특정 아미노기의 반응 속도는 매우 높은 pH를 제외하고는 그의 pKa에 반비례한다. 반응 속도는 또한 근접한 잔기의 입체 및 근접 효과, 및 용매에 대한 측쇄의 접근용이성 정도에 의해 영향을받을 수 있다. 인슐린의 경우에서, 3개의 아민은 특징적인 pKa 값을 가지며, 달성해야 하는 특정 특이성을 허용하는 반응성에 대해 주위 환경에 미치는 효과가 다르다 (문헌 [Lindseyet al., in Biochem. J. 121:737-745 (1971)] 참조). 구체적으로, B29:리신 측쇄의 ε-아미노기는 10이 넘는 pH에서 아실화 반응을 조절한다 (베이커 등 (Baker et al.)의 미국 특허 제5,646,242호 참조). 하기 실시예에서, 반응은 원하는 특정 생성물에 따라 반응 특이성의 미세-조정을 허용하는 pH값 (대락 6 내지 11의 범위)에서 수행하였다.
하기 실시예에서, 최종 생성물의 정체는 LC-MS (분자량 확인), N-말단 단백질 서열분석, 및 에스 아우레우스 (S. aureus) V8 프로테아제 분해 산물의 LC-MS 분석 (상기 효소에 의해 Glu 잔기 카르복실 측쇄 상의 펩티드 결합이 특이적으로 절단되어 특징적인 인슐린 단편을 생성함)을 비롯한 기술들의 조합에 의해 확인하였다 (문헌 [Nakagawa, S.H. ＆ Tager, H.S. in J. Biol. Chem. 266:11502-11509 (1991)] 참조).
실시예 1
Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르를 사용한 B28LysB29Pro-인슐린 W의 물/CH3CN 중에서의 아실화 반응에 의한 A0ArgB0ArgB28Lys-Nε-ArgB29Pro인슐린의 생성
B28LysB29Pro-인슐린-Zn 결정 (320mg; 0.055mmol)을 CH3CN:PBS-완충액 (1:1)30mL에 용해시켰다. 5M KOH 용액 (50㎕)을 첨가하여 결정을 pH 10에서 용해시켰다. 이어서, 5M 인산을 사용하여 pH를 대략 7.5로 조정하였다. Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르를 디클로로메탄 중에서 30분 동안 함께 혼합한 Boc-Arg(Boc)2-OH (1mmol), NHS (1mmol) 및 디시클로헥실카르보-디이미드 (DCC) (1mmol)로부터 제조하였다. 이어서, 혼합물을 여과하고, 회전 증발기 상에서 농축 건조시켰다. 이어서, Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르를 MeOH 4mL에 용해시켰다. Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르 용액 2mL를 인슐린 용액에 첨가하고, 용액을 실온에서 2시간 동안 혼합하였다. 이 때 pH가 대략 6.4로 떨어졌다. 5M KOH 용액 40 ㎕를 첨가하여 pH를 다시 7.1로 상승시켰다. 나머지 Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르를 인슐린 혼합물에 첨가하고, 반응을 추가로 2.5시간 동안 계속 진행시켰다. 이어서, 혼합물을 트리플루오로아세트산 (TFA) 100 ㎕로 산성화시키고, 물 30mL로 희석하고, 밤새 동결건조시켰다. 잉여량의 아실화 시약 및 PBS 완충액으로부터 유래한 염이 존재하기 때문에, 탈보호된 생성물을 수득하기 위해서 상기 동결건조된 물질 (대략 총 900mg)을 TFA 20mL에 용해시키고, 실온에서 1시간 동안 정치하였다. 이어서, 혼합물을 회전 증발기 상에서 거의 건조되도록 증발시키고, CH3CN:물 (1:9) 20mL에 재용해시켰다.
15분에 걸친 10에서 100％ B의 선형 AB 구배를 이용하여 조르백스 이클립스 (Zorbax Eclipse) XDB-C8 4.6mm 내경×15cm 컬럼 상에서 분석용 역상 HPLC에 의해 샘플을 분석하였다 (여기서, A는 0.05％ TFA/H2O이고, B는 CH3CN:H2O (60:40) 중0.05％ TFA이며, 유속은 1mL/분임). 이러한 조건 하에서, 주요 피크를 나타내는 샘플이 LC-MS에 의해 트리-아실화된 인슐린의 MW인 것으로 확인되었으며, 주요 피크 바로 앞과 뒤에서 각각 소량의 테트라-아실화된 인슐린 및 디-아실화된 인슐린이 용출되었다. 생성물들의 상대적인 양은 이들이 상기 크로마토그래피 조건 하에서는 완전하게 분리되지 않기 때문에 측정하지는 않았지만, 상기 물질 중 대략 70％가 트리-아실화된 종인 것으로 나타났다.
아실화된 조 물질 중 절반을 SP-세파로스 물질로 패킹된 유리 2cm 내경×30cm 컬럼 상에서 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 0에서 40％ B의 선형 AB 구배를 3mL/분의 유속으로 100분에 걸쳐 수행하였다. 용매 성분은 A가 H20:CH3CN (70:30) 중 70mM 나트륨 아세테이트 (pH 4.0)이고, B가 H20:CH3CN (70:30) 중 70mM 나트륨 아세테이트, 1M 염화나트륨 (pH 4.0)이었다. 트리-아실화된 인슐린 생성물을 함유하는 분획을 모으로, 이 용액을 대략 96mL에서 75mL로 농축하고, 다시 H20를 사용하여 100mL로 희석하고, 비닥 (Vydac) C182.0cm 내경×25cm 정제용 컬럼에 20mL/분으로 로딩하였다. 샘플을 15분에 걸친 0에서 15％ B의 선형 AB 구배에 이은 100분에 걸친 15에서 65％ B의 선형 AB 구배의 2-단계 선형 AB 구배를 이용하여 10mL/분의 유속으로 용출하였다 (여기서, A는 0.05％ TFA/H2O이고, B는 0.05％ TFA/CH3CN임). 정제된 물질을 합하여 동결건조시켜 생성물 52mg (전체 수율: 대략 34％)을 수득하였다.
실시예 2
Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르를 사용한 A0Arg-인슐린의 물/CH3CN 중에서의 아실화 반응에 의한 A0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린 생성
Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르 (0.5mmol)를 제조하고, MeOH 5mL에 용해시켰다. A0Arg-인슐린 (0.017mmol) 104mg을 PBS 완충액/CH3CN (1:1) 10mL에 용해시키고, 5M KOH 용액을 사용하여 pH를 11로 조정하였다. Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르 용액 0.52mL (0.052mmol)를 인슐린 용액에 첨가하였다. pH가 대략 9로 떨어졌고, 즉시 5M KOH 용액을 사용하여 다시 11로 조정하였다.
실온에서 30분 동안 반응을 진행시킨 후, 아세트산 200 ㎕로 산성화시켰다. LC-MS에 의해 측정된 모노-아실화된 생성물의 정확한 MW를 갖는 하나의 주요 피크가 분석용 HPLC (상기 실시예 1에서와 같이 수행함) 상에 나타났다. 샘플을 상기 기재된 바와 같이 비닥 C18정제용 컬럼 상에서 15분에 걸친 0에서 18％ B의 선형 AB 구배에 이은 160분에 걸친 18에서 100％의 선형 AB 구배의 2-단계 선형 AB 구배를 이용하여 역상 HPLC에 의해 직접 정제하였다. 생성물을 함유하는 추출 분획을 모아 동결건조시켜 총 약 61mg을 수득하였다. 동결건조된 샘플을 TFA 10mL에 용해시키고, 30분 동안 정치시킨 후, 거의 건조되도록 농축시키고, CH3CN:H2O (10:90) 20mL에 재용해시켰다. 이어서, 마지막으로 샘플을 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 역상 정제하였다. 동결건조된 물질의 최종 질량은 31mg (전체 수율: 대략 30％)이었다.
실시예 3
Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS 에스테르를 사용한 재조합 인간 인슐린의 물/DMF 중에서의 아실화 반응에 의한 A-1ArgA0Arg-인슐린 생성
Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS 에스테르 (0.2mmol)를 디클로로메탄 중에서 60분 동안 혼합한 Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-OH (0.2mmol), NHS (0.2mmol) 및 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) (0.2mmol)로부터 제조하였다. 이어서, 샘플을 여과하고, 증발 건조시키고, DMF 4mL에 재용해시켰다. 재조합 인간 인슐린-Zn 결정 (320mg; 0. 055mmol)을 DMF:PBS-완충액 (1:1) 20mL에 용해시켰다. 5M KOH 용액 (50 ㎕)을 첨가하여 결정을 pH 10에서 용해시켰다. 5M 인산을 사용하여 pH를 8.2로 조정하고, Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS 에스테르 용액 3mL (0.15mmol)를 첨가하였다. 대략 1시간 동안 혼합한 후, 분석용 HPLC (상기 실시예 1에서와 같이 수행함)는 LC-MS에 의해 확인된 모노아실화된 생성물 때문에 두 개의 피크를 나타내었다. 상기 피크는 대략 70:30 비로 존재하였다.
추후의 에스 아우레스 (S.aureus) V8 프로테아제 분해물의 LC-MS 분석은 A-쇄 N 말단의 아실화 반응 때문에 보다 큰 피크가 존재하며, 보다 작은 피크는 B-쇄 N 말단 또는 B29:Lys의 측쇄 아민에서 아실화된 종의 혼합물을 함유한다는 것을 증명하였다. 실시예 1에서와 같이 비닥 C18컬럼 상에서 정제하여 보호된 A-쇄 아실화 생성물 49mg을 수득하였다. 이 물질을 TFA:아니솔:MeOH:트리이소프로필실란(TIPS) (94:2:2:2)의 혼합물 10mL로 실온에서 1시간 동안 탈보호화시켰다.
이어서, 혼합물을 거의 건조되도록 농축시키고, CH3CN:H20 (20:80) 6mL에 재용해시키고, 이를 디에틸 에테르 10mL로 2회 추출하였다. 마지막으로 역상 HPLC로 (실시예 1에서와 같이) 정제하여 A-1ArgA0Arg-인슐린 생성물 34mg (전체 수율: 대략 10％)을 수득하였다.
실시예 4
Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS 에스테르를 사용한 재조합 인간 인슐린의 물/DMF 중에서의 아실화 반응에 의한 B-1ArgB0Arg-인슐린의 생성
B-쇄 N 말단 또는 B29Lys의 측쇄 아민에서 모노아실화된 생성물이 동시에 용출되기 때문에 (상기 실시예 3 참조), 재조합 인간 인슐린을 A-쇄 N 말단 또는 B29Lys측쇄 아민 상에서 tert-부틸옥시카르보닐(Boc)기로 1차 보호화시켰다. 재조합 인간 인슐린 (320mg)을 CH3CN:PBS 완충액 (1:1) 20mL에 용해시키고, pH를 10.6으로 조정하였다. 디-tert-부틸 디카르보네이트 (2.5 당량) ((Boc)20)를 첨가하였다 (CH3CN 270㎕ 중 55mg). 30 분 후에, pH가 대략 8.7로 떨어졌다. 5M KOH를 사용하여 pH를 다시 대략 11로 조정하고, 반응을 추가로 2.5시간 동안 계속 진행시켰다. 이 때, LC-MS 분석은 각각 모노-, 디- 및 트리-Boc 유도체화된 종의 질량을 갖는 세 개의 주요 생성물이 존재한다는 것을 나타내었다.
HPLC 피크 영역은 모노-, 디- 및 트리-Boc 유도체가 각각 대략 15:60:25의 상대적인 비로 존재한다는 것을 나타내었다. 물질을 실시예 1에서와 같이 C18 정제용 컬럼 상에서 (1) 0 내지 20분에 걸친 0에서 20％ B의 선형 AB 구배; (2) 20 내지 30분에 걸친 20에서 25％ B의 선형 AB 구배; (3) 30 내지 230분에 걸친 25에서 75％ B의 선형 AB 구배의 3-단계 선형 AB 구배를 이용하여 정제하였다. 동결건조시킨 후에 디-Boc 유도된 생성물 (Boc2-인슐린) 82mg을 수득하였다. 에스 아우레스 (S.aureus) V8 프로테아제 분해물의 LC-MS 분석은 결과적으로 생성물이 A-쇄 N 말단 및 B29:Lys 측쇄에서 Boc기를 함유한다는 것을 증명하였다.
Boc2-인슐린 82mg (0.014mmol)을 DMF:PBS 완충액 (1:1) 10mL에 용해시키고, pH를 대략 8로 조정하였다. Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS 에스테르를 상기 실시예 3에서와 같이 제조하고, 0.05mmol/mL의 농도로 DMF에 용해시켰다. NHS 에스테르 용액 1.4mL (0.07mmol)를 Boc2-인슐린에 첨가하고, 1시간 동안 반응시켰다. Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS 에스테르 용액 0.6mL (0.03mmol)를 추가로 첨가하고, 반응을 추가로 1시간 동안 계속 진행시켰다. 생성물을 실시예 1에서와 같이 분석용 HPLC에 의해 분석하였다 (단, 25분에 걸친 25에서 100％ B의 선형 AB 구배 및 1mL/분의 유속을 사용함; 여기서 A는 0.05％ TFA/H2O이고, B는 0.05％ TFA/CH3CN임). Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-Boc2-인슐린 생성물의 정확한 MW를 갖는 하나의 피크가 관찰되었다.
정제 과정은 실시예 1에서와 같이 비닥 C18컬럼 상에서 (1) 0 내지 20분에 걸친 0에서 25％ B의 선형 AB 구배; (2) 20 내지 40분에 걸친 25에서 40％ B의 선형 AB 구배; (3) 40 내지 100분에 걸친 40에서 100％ B의 선형 AB 구배의 3-단계 선형 AB 구배를 이용하여 수행하였다. 동결건조시킨 후, 정제되고 완전하게 보호된 생성물 36mg을 수득하였다. 이 물질을 실온에서 1시간 동안 TFA:아니솔:MeOH:TIPS (94:2:2:2) 10mL로 처리하여 완전하게 탈보호된 생성물을 수득하였다. 이어서 혼합물을 거의 건조되도록 농축시키고, CH3CN:H20 (10:90) 10mL에 재용해시키고, 이를 15mL 디에틸 에테르로 2회 추출하였다. 마지막으로 역상 HPLC로 (실시예 1에서와 같이) 정제하여 B-1ArgB0Arg-인슐린 생성물 24mg (전체 수율: 대략 8％)을 수득하였다.
실시예 5
Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS 에스테르를 사용한 A0Arg-인슐린의 H2O/CH3CN 중에서의 아실화 반응에 의한 A0ArgB-1ArgB0Arg-인슐린 생성
실시예 3에서와 같이 Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS 에스테르 (0.5mmol)를 제조하고, MeOH 4mL에 용해시켰다. A0Arg-인슐린 (320mg, 0.054mmol)을 CH3CN:PBS 완충액 (1:1) 40mL에 pH 10에서 용해시켰다. pH를 대략 7로 감소시켰다. 이 단백질의 pI가 대략 6.3에 근접하면서 용액이 탁해지기 시작하였다. Boc-Arg(Pbf)Arg(Pbf)-NHS 에스테르 용액 (0.25mmol; 대략 4.7 당량)의 절반을 첨가하고, 용액을 15분 동안 초음파처리한 후 로티서리 상에서 75분 동안 혼합하였다. HPLC 분석에서 대략 85:15의 비로 존재하는 두 개의 피크가 나타났으며, 이는 LC-MS에 의해 모노아실화된 생성물로 확인되었다. 샘플을 TFA 100㎕로 산성화시킨 후, H2O 20mL로 희석하였다. 실시예 2에서와 같이 역상 정제 과정을 수행한 후에 동결건조시켜 주요 모노-아실화된 생성물 55mg을 수득하였다. 펩티드를 실시예 3에 기재된 TFA 칵테일 20mL로 2시간 동안 탈보호화시키고, 거의 건조되도록 증발시키고, CH3CN:H2O (10:90) 20mL에 재용해시키고, 헥산 20mL로 추출하였다. 마지막으로 실시예 1에서와 같이 역상 HPLC로 정제하여 생성물 38mg (수율 12％)을 수득하였다. 이 물질은 후에 원하는 A0ArgB-1ArgB0Arg-인슐린인 것으로 확인되었다.
실시예 6
Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르를 사용한 재조합 인간 인슐린의 물/CH3CN 중에서의 아실화 반응에 의한 A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린 생성
재조합 인간 인슐린-Zn 결정 (307mg; 0.053mmol)을 CH3CN:PBS-완충액 (1:1) 30mL에 용해시켰다. 5M KOH 용액 (50㎕)을 첨가하여 결정을 pH 10에서 용해시켰다. 이어서, 5M 인산을 사용하여 pH를 대략 7.5로 감소시켰다. 실시예 1에서와 같이 Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르 (1mmol)를 제조하고, MeOH 4mL에 용해시켰다.Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르 용액 2mL (0.5mmol)를 인슐린 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 혼합하였다. 이 때, pH가 대략 6.6으로 떨어졌다. 5M KOH 용액 50 ㎕을 첨가하여 pH를 다시 7.2로 상승시켰다.
이어서, 나머지 Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르를 인슐린 혼합물에 첨가하고, 반응을 추가로 3시간 동안 계속 진행시켰다. 이어서, 혼합물을 TFA 100㎕로 산성화시키고, 물 30mL으로 희석하고, 밤새 동결건조시켰다. 잉여량의 아실화 시약 및 PBS 완충액으로부터의 염이 존재하기 때문에, 동결건조된 물질 (대략 총 1.07g)을 TFA 20mL에 용해시키고, 실온에서 1.5시간 동안 정치하여 탈보호된 생성물을 수득하였다. 이어서, 혼합물을 회전 증발기 상에서 거의 건조되도록 증발시키고, CH3CN:H20 (1:9) 20mL에 재용해시켰다.
샘플을 실시예 1에서와 같이 분석용 역상 HPLC에 의해 분석하였고, 여기서 트리-아실화된 생성물에 의한 주요 피크가 나타났으며, 이 주요 피크 바로 앞과 뒤에서 각각 소량의 테트라-아실화된 인슐린 및 디-아실화된 인슐린이 용출되는 유사한 크로마토그래피 프로파일이 나타났다. 생성물의 상대적인 양은 이들이 이러한 크로마토그래피 조건 하에서는 완전하게 분리되지 않기 때문에 측정하지 않았지만, 물질 중 대략 70％가 트리-아실화된 종인 것으로 나타났다 (실시예 1에서 관찰된 바와 같음).
아실화된 조 물질을 실시예 1에서와 같이 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제된 트리-아실화 인슐린을 합하여 대략 96mL에서 75mL로 농축하고, H20를 사용하여 다시 100mL로 희석하고, 비닥 C18정제용 컬럼에 로딩하고, 실시에 1에서와 같이 정제하였다. 정제된 물질을 합하여 동결건조시켜 생성물 96mg (전체 수율: 대략 31％)을 수득하였다.
실시예 7
Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르를 사용한 A21Gly-인슐린의 H2O/CH3CN 중에서의 아실화 반응에 의한 A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-ArgA21Gly-인슐린의 생성
동결건조된 A21Gly-인슐린 (65mg; 0.011mmol)을 CH3CN:PBS-완충액 (1:1) 8mL에 용해시켰다. 5M KOH 용액을 사용하여 pH를 7.5로 조정하였다. Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르 (0.4mmol)를 실시예 1에서와 같이 제조하고, MeOH 2mL에 용해시켰다. Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르 용액 (1mL, 0.2mmol; 17 당량)을 A21:G-인슐린 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 혼합하였다. 이 때 pH가 대략 6.4로 떨어졌다. 5M KOH 용액 20 ㎕를 첨가하여 pH를 다시 7.5로 증가시켰다. 이어서, 나머지 0.2mmol Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르를 인슐린 혼합물에 첨가하고, 반응을 추가로 3시간 동안 계속 진행시켰다. 이어서, 혼합물을 TFA 50㎕로 산성화시키고, 물 10mL로 희석하고, 밤새 동결건조시켰다. 펩티드, 잉여량의 아실화 시약, 및 PBS 완충액으로부터의 염을 함유하는 동결건조된 물질을 TFA 20mL에 용해시키고, 실온에서 1시간 동안 정치하여 탈보호된 생성물을 수득하였다. 혼합물을 회전증발기 상에서 거의 증발되도록 건조시키고, CH3CN:H20 (1:9) 20mL에 재용해시키고, 이를 헥산 20mL으로 추출하였다. 샘플을 실시예 1에서와 같이 분석용 역상 HPLC에 의해 분석하였고, 여기서 트리-아실화된 생성물에 의한 주요 피크가 나타났으며, 이 주요 피크 바로 앞과 뒤에서 각각 소량의 테트라-아실화된 인슐린 및 디-아실화된 인슐린이 용출되는 유사한 크로마토그래피 프로파일이 나타났다. 생성물의 상대적인 양은 이들이 이러한 크로마토그래피 조건 하에서는 완전하게 분리되지 않기 때문에 측정하지 않았지만, 물질 중 대략 60-70％가 트리-아실화된 종인 것으로 나타났다.
아실화된 조 물질을 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 실시예 1에서와 같이 정제하였다. 합한 정제된 트리-아실화된 인슐린을 합하여 대략 96mL에서 75mL로 농축하고, H2O를 사용하여 다시 100mL로 희석하고, 비닥 C18반-정제용 컬럼 (10mm 내경×250mm)에 로딩하였다. 샘플을 15분에 걸친 0에서 25％ B의 선형 AB 구배에 이은 100분에 걸친 25에서 75％ B의 선형 AB 구배의 2-단계 선형 AB 구배를 이용하여 4mL/분의 유속으로 용출하였다 (여기서, A는 0.05％ TFA/H2O이고, B는 0.05％ TFA/CH3CN임). 정제된 물질을 동결건조시켜 생성물 21mg (전체 수율: 대략 32％)을 수득하였다.
실시예 8
Boc-Lys(Boc)-NHS 에스테르를 사용한 인슐린의 물/CH3CN 중에서의 아실화 반응에 의한 A0LysB0LysB29Lys-Nε-Lys-인슐린의 생성, 및 N,N'-비스-Boc-1-구아닐피라졸(Boc2-구아닐피라졸)을 사용한 구아니딜화 반응에 의한 A0gHRB0gHRB29Lys-Nε-gHR-인슐린의 생성
"gHR"은 α-구아니디닐 호모아르기닌을 의미한다. 재조합 인간 인슐린-Zn 결정 (300mg, 0.052mmol)을 CH3CN:PBS 완충액 (1:1) 20mL에 pH 10에서 용해시킨 후, pH를 대략 7로 조정하였다. 10 당량의 Boc-Lys(Boc)-NHS 에스테르를 첨가하고 (CH3CN 2mL 중 230mg), 용액을 실온에서 2시간 동안 혼합하였다. 이 때, Boc-Lys(Boc)-NHS 에스테르 230mg을 추가로 첨가하고, 반응을 2.5시간 동안 계속 진행시켰다. LC-MS 분석은 다량의 트리-아실화된 종 및 소량의 디-아실화된 종이 존재함을 나타내었다. 혼합물을 H2O를 사용하여 50mL로 희석하고, 동결건조시켰다. TFA 20mL에서 1시간 동안 탈보호화시킨 후, LC-MS 분석은 다시 트리-아실화된 형태의 인슐린이 대략 70％ 존재하고, 주요 생성물 바로 앞에서 테트라-아실화된 생성물이 용출되고 (약 10％), 주요 생성물 바로 뒤에서 디-아실화된 생성물이 용출된다 (20％)는 것을 나타내었다. 샘플을 거의 건조되도록 증발시키고, CH3CN:H20 (30:70) 30mL에 재용해시키고, 동일량의 두 개의 부분으로 나누고, 동결건조시켰다. 동결건조된 부분 (0.026mmol) 중 하나를 MeOH:H20 (9:1) 10mL에 용해시키고, 트리에틸아민 0.5mL를 첨가하였다. 겉보기 pH는 9.3이었다. Boc2-구아닐피라졸 (160mg, 0.52mmol)을 첨가하고, 1시간 동안 반응시켰다. Boc2-구아닐피라졸 160mg을 추가로 첨가하고, 반응을 추가로 1시간 동안 계속 진행시켰다 이 때, LC-MS 분석은 1 내지 4개의 Boc2-구아닐 기가 첨가된 생성물의 존재를 나타내었다.
Boc2-구아닐피라졸 800mg (2.6mmol)을 추가로 첨가하고, 반응을 추가로 4시간 동안 계속 진행시켰다. Boc2-구아닐피라졸 총 3.6mmol (최초 아실화 단계에서 첨가된 과량의 리신 아미노기와 반응할 것으로 예상되는 양보다 적은 양 (1mmol))을 첨가하여 트리Lys-인슐린과 반응할 수 있는 농도 2.6mmol (아미노기 당 시약 대략 15당량의 과량)을 수득하였다.
6시간 동안의 반응 후, 샘플을 회전 증발기 상에서 거의 건조되도록 농축시키고, CH3CN:H20 (60:40) 10mL에 재용해시키고, 동결건조시켰다. 동결건조된 샘플을 TFA 20mL로 2시간 동안 처리하여 탈보호된 생성물을 수득하였고, 이를 농축 건조시키고, CH3CN:H2O (15:85) 20mL에 재용해시켰다. 이 때, LC-MS 분석은 예상된 질량의 헥사-구아니딜화된 생성물의 주요 피크 (물질의 대략 60％)를 나타내었으며, 또한 소량의 펜타-구아니딜화된 생성물이 동시에 용출됨을 나타내었다.
정제 과정을 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 실시예 1에서와 같이 수행하였다 (단, 다른 선형 AB 구배 (100분에 걸친 25에서 70％ B의 선형 AB 구배, 4mL/분의 유속; 및 8mL 분획을 사용함). 모아진 분획 (총 부피 88mL)을 회전 증발기 상에서 대략 65mL로 농축한 후, H2O를 사용하여 다시 90mL로 희석하였다. 마지막으로 샘플을 실시예 1에서와 같이 RP-HPLC로 정제하여 최종 생성물 43mg (전체수율: 대략 29％)을 수득하였다.
실시예 9
Boc-Lys(tfa)-NHS 에스테르를 사용한 재조합 인간 인슐린의 물/CH3CN 중에서의 아실화 반응에 의한 A0LysB0LysB29Lys-Nε-Lys-인슐린의 생성
재조합 인간 인슐린-Zn 결정 (200mg, 0.034mmol)을 CH3CN:H20 (1:1) 10mL에 pH 10에서 용해시킨 후, 6M 인산을 사용하여 pH를 대략 7로 조정하였다. Boc-Lys(tfa)-NHS 에스테르 (1mmol)를 실시예 1에서와 같이 Boc-Lys(tfa)-OH, NHS 및 DCC로부터 제조하고, MeOH 10mL에 용해시켰다. 인슐린 용액에 Boc-Lys(tfa)-NHS 에스테르 용액 1.7mL (0.17mmol; 5 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 75분 동안 반응시킨 후, TFA 0.5mL로 산성화시키고, 30mL로 희석하였다. 분석용 HPLC 및 LC-MS에 의해 세 개의 모노아실화된 피크 (두 개의 피크는 디아실화된 생성물, 한 개의 피크는 트리아실화된 생성물을 나타냄)가 존재함을 확인하였다.
실시예 2에서와 같이 역상 HPLC로 정제한 후 분리된 종을 동결건조시켜 보호된 생성물을 하기와 같이 수득하였다: A0LysB0LysB29Lys-Nε-Lys-인슐린 33mg; A0LysB0Lys-인슐린 36mg; B0LysB29Lys-Nε-Lys-인슐린 23mg; A0Lys-인슐린 12mg; 및 B0Lys-인슐린 31mg.
탈보호화 반응을 두 단계로 수행하였다. 첫째, 각각의 5개의 샘플을 TFA 5mL로 30분 동안 처리하여 리신 α-아미노기로부터 Boc 기를 제거하였다. 이어서,용액을 거의 건조되도록 증발시키고, 잔류 TFA를 샘플 튜브에 질소를 통과시켜 제거하였다. 이어서, 15％ NH40H/H20 (부피:부피) 6mL를 첨가하여 TFA 기를 리신-아미노기로부터 제거하고, 샘플을 실온에 3-4시간 동안 방치하였다. 이어서, 샘플을 H2O를 사용하여 40mL로 희석하고, 아세트산 (1.5mL)으로 pH 4로 산성화시켰다. 샘플을 실시예 1에서와 같이 최종 정제하여 생성물을 하기와 같이 수득하였다 (최종량): A0LysB0LysB29Lys-Nε-Lys-인슐린 14mg; A0LysB0Lys-인슐린 17mg; B0LysB29Lys-Nε-Lys-인슐린 8mg; A0Lys-인슐린 5mg; 및 B0Lys-인슐린 16mg.
실시예 10
Boc-Arg(Pbf)-NHS 에스테르를 사용한 A21Gly-인슐린의 물/CH3CN 중에서의 아실화 반응에 의한 A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린의 생성
A21Gly-인슐린 (230mg; 0.040mmol)을 CH3CN:물 (1:1) 24mL에 용해시켰다. NaH2PO4ㆍH2O 200mg을 첨가하였다. 5M KOH 용액 (대략 50 ㎕)을 첨가하여 pH를 10.5로 조정하였다. Boc-Arg(Pbf)-NHS 에스테르를 디클로로메탄 (DCM) 중에서 30분 동안 혼합한 Boc-Arg(Pbf)-OH (0.4mmol), N-히드록시숙신이미드 (NHS) (0.4mmol), 및 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) (0.4mmol)로부터 제조하였다. 이어서, 혼합물을 여과하고, 회전 증발기 상에서 농축 건조시켰다. 생성된0.4mmol의 Boc-Arg(Pbf)-NHS 에스테르를 MeOH 4mL에 용해시켰다. Boc-Arg(Pbf)-NHS 에스테르 용액 1mL (0.1mmol; 2.5 당량)를 인슐린 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이 때, pH가 대략 9.8로 떨어졌다. pH를 6M H3P04를 이용하여 9.0으로 추가 감소시켰다. 추가로 Boc-Arg(Pbf)-NHS 에스테르 용액 1mL (0.1mmol; 2.5 당량)를 인슐린 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가의 1시간 동안 교반하였다. 이 때, 혼합물이 주로 모노아실화된 생성물과 디아실화된 생성물을 대략 57:43의 비로 포함한다는 것이 역상 HPLC (조르백스 이클립스 XDB-C8 4.6mm 내경×15cm 컬럼 상에서 15분에 걸친 10에서 100％ B의 선형 AB 구배를 이용하여 1mL/분의 유속으로 수행함; 여기서 A는 0.05％ TFA/H2O이고, B는 CH3CN:H2O (60:40) 중 0.05％ TFA임)에 의해 밝혀졌다. Boc-Arg(Pbf)-NHS 에스테르 용액 0.5mL (0.05mmol; 1.25 당량)를 추가로 인슐린 용액에 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. Boc-Arg(Pbf)-NHS 에스테르 용액 0.5mL를 2번째로 추가하고, 혼합물을 10분 동안 교반한 후, 트리플루오로아세트산 (TFA)을 사용하여 pH 3으로 산성화시켰다. 용액을 CH3CN:물 (50:50) 20mL로 희석하고, 여과하였다. 최종 반응 혼합물은 220nm에서의 UV 검출로부터의 HPLC 피크 영역에 의해 측정시 주요 모노아실화된 생성물 및 디아실화된 생성물을 30:70의 비로 함유하였다.
아실화된 조 물질을 비닥 C182.2cm 내경×25cm 정제용 컬럼 상에서 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 샘플을 (a) 15분에 걸친 0에서 18％ B의 선형 AB 구배에이은 (b) 100분에 걸친 18에서 65％의 선형 AB 구배의 2-단계 선형 AB 구배를 이용하여 12mL/분의 유속으로 용출하였다 (여기서, A는 0.05％ TFA/H2O이고, B는 0.05％ TFA/CH3CN임). 디아실화된 인슐린을 함유하는 분획을 모으고, 동결건조시켜 보호된 생성물 134mg을 수득하였다. 이 물질을 TFA:아니솔:MeOH:트리이소프로필실란 (TIPS) (91:3:3:3)의 혼합물 20mL로 실온에서 1.5시간 동안 탈보호화시킨 후, 회전 증발기 상에서 거의 건조되도록 농축시키고, CH3CN:H20 (10:90) 25mL에 재용해시키고, 이를 디에틸 에테르 20mL로 2회 추출하였다. 최종 역상 HPLC 정제를 상기 기재된 것과 동일한 비닥 C18컬럼 상에서 (a) 15분에 걸친 0에서 15％ B의 선형 AB 구배에 이은 (b) 100분에 걸친 15에서 55％ B의 선형 AB 구배의 2-단계 선형 AB 구배를 이용하여 12mL/분의 유속으로 수행하였다 (여기서, A는 0.05％ TFA/H20이고, B는 0.05％ TFA/CH3CN임). 그 결과, A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 생성물 77mg (전체 수율: 대략 33％)을 수득하였다.
실시예 11
(1) Boc-Arg(Pbf)-NHS 에스테르를 사용한 A21Gly-인슐린의 물/CH3CN 중에서의 아실화 반응 및 (2) Boc-Lys(Boc-Arg(Pbf))-NHS 에스테르를 사용한 A0Lys-Nε-ArgB29Lys-Nε-ArgA21Gly-인슐린의 생성
Boc-Lys(Boc-Arg(Pbf))-OH를 Cl-(2'-클로로)트리틸 폴리스티렌 폴리머 상에서 합성하였다. 폴리머를 디메틸포름아미드 (DMF):디이소프로필에틸아민 (DIEA) (90:10) 혼합물에 Boc-Lys(Fmoc)-OH의 2배 과량으로 로딩하였다. 추후에 DMF 중 피페리딘의 20％ 용액을 사용하여 Fmoc 기를 리신 ε-아미노기로부터 제거하였다. 이어서, O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄-헥사플루오로-포스페이트 (HBTU) 및 DIEA (DMF 용액 중 아미노산:HBTU:DIEA=1:0.95:3)를 사용한 활성화에 의해 Fmoc-Arg(Pbf)-OH (4배 과량)의 α-카르복실에이트를 유리 아미노기에 커플링시켰다. DMF 중 피페리딘의 20％ 용액을 사용하여 Fmoc 기를 Arg의 ε-아미노기로부터 제거한 후, 유리 아민을 5배 과량의 디-tert-부틸-디카르보네이트 (Boc-무수물) 및 DIEA (DMF 용액 중 1:2의 비)로 캡핑하였다. 화합물을 40분 동안 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP):디클로로메탄 (DCM) (1:2) 30mL로 2회 처리하여 화합물을 폴리머로부터 절단하였다. 합한 용액을 여과하고, 회전 증발기 상에서 증발시켰다. Boc-Arg(Pbf)-NHS 에스테르 및 Boc-Lys(Boc-Arg(Pbf))-NHS 에스테르를 실시예 1에 기재된 바와 같이, 동일한 농도의 NHS 및 DCC를 DCM 중에서 각각의 산과 혼합하여 제조하였다.
A21Gly-인슐린 (230mg; 0.040mmol)을 CH3CN:물 (1:1) 24mL에 용해시켰다. NaH2PO4ㆍH2O 200mg을 첨가하였다. 5M KOH 용액 (대략 50㎕)을 첨가하여 pH를 10.5로 조정하였다. Boc-Arg(Pbf)-NHS 에스테르 (0.4mmol)를 MeOH 4mL에 용해시켰다. Boc-Arg(Pbf)-NHS 에스테르 용액 1mL (0.1mmol; 2.5 당량)를 인슐린 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 40분 동안 교반하였다. 이 때, 혼합물이 주로 출발 물질 및 모노아실화된 생성물을 40:60의 비로 포함한다는 것이 역상 HPLC (조르백스 이클립스 XDB-C8 4.6mm 내경×15cm 컬럼 상에서 15분에 걸친 10에서 100％ B의 선형 AB 구배를 이용하여 1mL/분의 유속으로 수행함; 여기서, A는 0.05％ TFA/H20이고, B는 CH3CN:H2O (60:40) 중 0.05％ TFA임)에 의해 밝혀졌다. Boc-Arg(Pbf)-NHS 에스테르 용액 0.6mL (0.06mmol; 1.5 당량)를 추가로 인슐린 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 15분 동안 교반하고, 이 때 인슐린은 대부분 모노아실화된 종으로 전환되었다. 이 때 6 M H3PO4를 첨가하여 pH를 10.2에서 9.0으로 감소시켰다. Boc-Lys(Boc-Arg(Pbf))-NHS 에스테르 (0.12mmol)를 MeOH 2mL에 용해시키고, 인슐린 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후에 CH3CN:물 (50:50) 20mL로 희석하고, TFA 300㎕로 산성화시키고, 여과하였다. 역상 HPLC에 의해 관찰된 주요 피크는, HPLC-질량 스펙트럼 분석에 의해 확인시 각각 Boc-Arg(Pbf) 및 Boc-Lys(Boc-Arg(Pbf))으로 유도체화된 생성물에 해당하는 것이었다.
아실화된 조 물질을 비닥 C182.2cm 내경×25cm 정제용 컬럼 상에서 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 샘플을 (a) 20분에 걸친 0에서 30％ B의 선형 AB 구배에 이은 (b) 100분에 걸친 30에서 80％ B의 선형 AB 구배의 2-단계 선형 AB 구배를 이용하여 13mL/분의 유속으로 용출하였다 (여기서, A는 0.05％ TFA/H20이고, B는 0.05％ TFA/CH3CN임). 디아실화된 인슐린을 함유하는 분획을 모으고, 동결건조시켜 보호된 생성물 105mg을 수득하였다. 이 물질을 TFA:아니솔:MeOH:트리이소프로필실란 (TIPS) (91:3:3:3)으로 실온에서 2시간 동안 탈보호화시킨 후, 거의 건조되도록 농축시키고, CH3CN:H2O (10:90) 25mL에 재용해시키고, 이를 디에틸 에테르 20mL로 3회 추출하였다. 최종 역상 HPLC 정제를 상기 기재된 것과 동일한 비닥 C18컬럼 상에서 (a) 15분에 걸친 0에서 15％ B의 선형 AB 구배에 이은 (b) 100분에 걸친 15에서 55％ B의 선형 AB 구배의 2-단계 선형 AB 구배를 이용하여 수행하였다 (여기서, A는 0.05％ TFA/H2O이고, B=0.05％는 TFA/CH3CN임). 그 결과, A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 생성물 60mg (전체 수율: 대략 25％)을 수득하였다.
실시예 12
A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린의 제조
인간 프로인슐린 유사체 (A21GlyC64ArgC65Lys-인간 프로인슐린)를 코딩하는 서열을 함유하는 플라스미드를 대장균에서 발현시켰다. 프로인슐린 유사체를 정제하고, 폴딩시킨 후, 하기와 같이 아실화시켰다. Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르를 디클로로메탄 (DCM) 3mL에서 40분 동안 혼합한 Boc-Arg(Boc)2-OH (0.4mmol), N-히드록시숙신이미드 (NHS) (0.4mmol), 및 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) (0.4mmol)로부터 제조하였다. 이어서, 혼합물을 여과하고, 회전 증발기 상에서 농축 건조시켰다. 이어서, 생성된 Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르 (0.4mmol)를 MeOH 4mL에 용해시켰다.
10mm HCl 용액 180mL 중 A21GlyC64ArgC65Lys-인간 프로인슐린 대략 108mg을 두 개의 동일한 부분으로 나누고, 동결건조시켰다. 하나의 프로인슐린 부분을 물/CH3CN (50/5O) 12mL으로 재용해시켰다. NaH2PO4(80mg)를 첨가하여 대략 50mM 농도의 PO4를 수득하였다. 5M KOH 용액을 사용하여 pH를 8.2로 조정하였다. Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르 1mL (0.1mmol; 대략 20 당량)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반하고, 그 후에 pH가 7.4로 떨어졌다. pH를 다시 8.2로 조정하고, 추가의 Boc-Arg(Boc)2-NHS 에스테르 용액 1mL를 첨가하였다. 용액을 추가로 3시간 동안 혼합한 후, 물을 사용하여 50mL로 희석하고, 트리플루오로아세트산 (TFA) 200㎕로 산성화시키고, 동결건조시켰다. 동결건조된 반응 혼합물을 TFA:물 (95:5) 20mL에 재용해시키고, 실온에 1.5시간 동안 방치하였다. TFA 혼합물을 회전 증발기 상에서 거의 건조되도록 증발시킨 후, 10％ CH3CN/물 25mL로 희석하고, 디에틸 에테르 20mL로 2회 추출하였다. 탈보호된 혼합물을 질량 스펙트럼 검출, 및 조르백스 이클립스 XDB-C8 4.6mm 내경×15cm 컬럼 상에서 15분에 걸친 10에서 100％ B의 선형 AB 구배를 이용하여 역상 HPLC에 의해 분석하였고 (여기서, A는 0.05％ TFA/H2O이고, B는 CH3CN:H2O (60:40)중 0.05％ TFA이며, 유속은 0.9mL/분임), 그 결과 소량의 "과아실화된" 생성물 (예상된 3개 (각각 N 말단 아민, 및 B29:Lys 및 C65:Lys의 리신 측쇄 아민에 하나씩) 보다 많은 Arg 잔기가 추가로 결합된 생성물)을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이는 Tyr의 측쇄 페놀 기, His 측쇄의 이미다졸 기 또는 다른 반응 측쇄 잔기에 Arg 잔기가 결합하기 때문일 것이다. 이러한 결합의 염기-촉매성 가수분해에 의해 과아실화 생성물의 양을 감소시키기 위해 프로인슐린 용액의 pH를 30분 동안 10.5까지 상승시켰다. 과아실화된 종의 양은 이 pH 변화 과정에 의해 실질적으로 감소하였다. 30분 동안 높은 pH로 처리한 후에, TFA를 사용하여 pH를 다시 대략 3으로 낮추고, 용액을 -20 ℃에 보관하였다.
화학적 변형, 탈보호화 반응 및 pH 변화 방법을 A21GlyC64ArgC65Lys-인간 프로인슐린의 두번째 부분에 대하여 반복 시행하였다. A21GlyB29Lys-Nε-ArgC64ArgC65Lys-Nε-Arg-인간 프로인슐린 유도체의 생성된 용액을 합하고, 동결건조시켰다. 탈보호된 조 물질의 순도는 대략 65％이었다 (역상 HPLC 피크 영역에 의해 판단함).
아실화된 프로인슐린 유도체를, C65Lys-Nε-Arg과 B29Lys-Nε-Arg 잔기를 손상되지 않도록 유지하면서, 트립신 및 카르복시 펩티다제 B로 분해함으로써 C31Arg 내지 C64Arg의 잔기로부터 리더 서열 및 "C펩티드"를 제거하여, A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 유도체를 형성하였다. 데스-30 인슐린 생성물의 형성은 B29Lys상에서의 변형에 의해 효과적으로 차단되었다. 정제된 A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린을 시험관 내 및 생체 내 실험에서 하기와 같이 사용하였다.
실시예 13
시험관 내 수용체 친화성
인슐린 분자의 인간 인슐린 수용체 (IR)에 대한 친화성을 방사선 표지된 리간드 ([125I] 인슐린)를 사용하는 경쟁 결합 분석으로 측정하였다. 인간 인슐린 수용체 막을, 수용체를 과다발현시키는 안정하게 형질감염된 293EBNA 세포의 P1 막 제제로서 제조하였다. 분석법을 진행하였고, 필적할만한 결과를 나타내는 여과 및 SPA (섬광 근접 분석) 방식 둘 모두로 확인하였으며, 단 SAP 방식은 맥아 아글루티닌-커플링된 SPA 비드로 처리한 PVT PEI (아머샴 파마시아 바이오텍 (Amersham Pharmacia Biotech)으로부터 시판되는 타입 A 비드 (WGA PVT PEI SPA))를 사용하여 수행하였다.
방사선 표지된 리간드 ([125I] 재조합 인간 인슐린)는 통상적으로 제조되거나 아머샴 파마시아 바이오텍으로부터 구입하였다 (기준일에 비(比)활성이 2000Ci/mmol임). SPA 분석 완충액은 50mm Tris-HCL, pH 7.8, 150mM NaCl, 0.1％ BSA이었다. 상기 분석은 96-웰 마이크로플레이트 (코스타 (Costar), ＃3632)에서 고처리량 분석을 위해 구성하였고, 방사선 리간드로 자동화하였으며, 막 및 SPA 비드를 Titertec/Plus (ICN 파마슈티칼스 (Pharmaceuticals))에 의해 첨가하였다.
시약을 하기 순서대로 플레이트 웰에 첨가하였다:
플레이트를 접착성 플레이트 커버로 밀봉하고 랩라인 인스트루먼츠 (LabLine Instruments) 계층 플레이트 진탕기에서 1시간 동안 진탕하였다. 플레이트를 발락 마이크로베타 (Wallac Microbeta) 섬광 계수기에 넣고 타이머를 12 시간 동안 세팅함으로써 플레이트를 실온 (22 ℃)에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. [125I]에 대하여 표준화된 방법을 이용하여 웰 당 1 분씩 계수하였다.
각각의 인슐린 분자에 대한 IC50은 4-파라미터 로지스틱 비-선형 회귀 분석으로부터 측정하였다. 데이터는 평균±SEM으로 기록하였다. 상대적인 친화성은 각각의 실험에서 각각의 인슐린 분자를 재조합 인간 인슐린 대조군과 비교한 후, 실험 시행 횟수에 대해 평균을 산출함으로써 결정하였다. 따라서, 인슐린 분자에 대한 평균 IC50값을 인슐린에 대한 평균 IC50값과 비교하는 것은 동일한 수치를 도출해내지 못하였다.
각각의 인슐린 분자 및 재조합 인간 인슐린의 인슐린 증식 인자 수용체 (IGF1-R)에 대한 친화성을 [125I]IGF-1 방사선 표지된 리간드를 사용하는 경쟁 결합분석으로 측정하였다. 인간 IGF-1 수용체 막을, 수용체를 과다발현시키는 안정하게 형질감염된 293EBNA 세포의 P1 막 제제로서 제조하였다. 분석법을 진행하였고, 필적할만한 결과를 나타내는 여과 및 SPA (섬광 근접 분석) 방식 둘 모두로 확인하였으며, 단 SAP 방식은 맥아 아글루티닌-커플링된 SPA 비드로 처리한 PVT PEI (아머샴 파마시아 바이오텍으로부터 시판되는 타입 A 비드 (WGA PVT PEI SPA))를 사용하여 통상적을 수행하였다. [125I]IGF-1 방사선 표지된 리간드는 통상적으로 제조하거나 아머샴 파마시아 바이오텍으로부터 구입하였다 (기준일에 비활성이 2000Ci/mmol임). SPA 분석 완충액은 50mM Tris-HCL, pH 7.8, 150mM NaCl, 0.1％BSA이었다. 상기 분석은 96-웰 마이크로플레이트 (코스타 (Costar), ＃3632)에서 고처리량 분석을 위해 구성하였고, 방사선 리간드로 자동화하였으며, 막 및 SPA 비드를 Titertec/Plus (ICN 파마슈티칼스 (Pharmaceuticals))에 의해 첨가하였다.
시약을 하기 순서대로 플레이트 웰에 첨가하였다:
플레이트를 접착성 플레이트 커버로 밀봉하고 랩라인 인스트루먼츠 계층 플레이트 진탕기에서 1시간 동안 진탕하였다. 플레이트를 발락 마이크로베타(Wallac Microbeta) 섬광 계수기에 넣고 타이머를 12 시간 동안 세팅함으로써 플레이트를 실온 (22 ℃)에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. [125I]에 대하여 표준화된 방법을 이용하여 웰 당 1 분씩 계수하였다.
각각의 인슐린 분자에 대한 IC50은 4-파라미터 로지스틱 비-선형 회귀 분석으로부터 측정하였다. 데이터는 평균±SEM으로 기록하였다. 상대적인 친화성은 각각의 실험에서 각각의 인슐린 분자를 재조합 인간 인슐린 대조군과 비교한 후, 실험 시행 횟수에 대해 평균을 산출함으로써 결정하였다. 따라서, 인슐린 분자에 대한 평균 IC50값을 인슐린에 대한 평균 IC50값과 비교하는 것은 동일한 수치를 도출해내지 못하였다.
선택성 인덱스는 IR의 상대적인 친화성 대 IGF-1R의 상대적인 친화성의 비로 계산하였다. 1을 초과하는 범위의 선택성 인덱스는 인슐린 분자가 상대적으로 HIR에 대하여 훨씬 더 선택적이라는 것을 나타낸다. 1 미만의 선택성 인덱스는 인슐린 분자가 상대적으로 IGF-1R에 대하여 훨씬 더 선택적이라는 것을 나타낸다.
표 1은 각각의 인슐린 분자 및 재조합 인간 인슐린에 대한 인슐린 수용체 (IR)의 친화성, 인슐린-유사 증식 인자 1 (IGF1-R) 수용체의 친화성, 및 수용체의 선택성 인덱스 (IR/IGF1-R)를 나타내고 있다.
실시예 14
시험관 내 대사 효능
각각의 인슐린 분자 및 재조합 인간 인슐린의 대사 효능 (글루코스 흡수) 분화된 마우스 3T3-L1 지방 세포를 사용하는 글루코스-흡수 분석법으로 측정하였다. 비분화된 마우스 3T3 세포를 웰 당 증식 배지 (DMEM, 고 농도의 글루코스 (L-글루타민은 제외), 10％ 소 혈청, 2mM L-글루타민, 1％ 항생/항진균 용액 포함) 100㎕ 중 25,000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다.
분화 배지 (DMEM, 고 농도의 글루코스, 10％ FBS, 2mM L-글루타민 (L-글루타민은 제외), 1％ 항생/항진균 용액, 10mM HEPES, 0.25mM 덱사메타존, 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 5mg/ml 인슐린 포함)를 첨가하여 플레이팅 한 지 3일 후에 분화가 시작되었다. 48 시간 후에 (3일 째), 분화 배지를 인슐린을 포함하나, IBMX 또는 덱사메타존은 포함하지 않는 배지로 교환하고, 6일 째에 세포를 인슐린, IBMX 또는 덱사메타존을 함유하지 않는 배지로 옮겨주었다. 세포를 FBS 배지에 보관하고, 매일 배지를 교환하여 주었다.
글루코스 수송 분석은 시토스타트 (Cytostar) T96 웰 플레이트를 이용하여 수행하였다. 분석하기 24시간 전에, 세포를 혈청을 포함하지 않는 배지 (0.1％ BSA를 함유)로 옮겨주었다. 분석 당일에, 상기 배지를 제거하고, 분석 완충액 (소위 KRBH 또는 크렙스-링거 (Krebs-Ringer) 완충액; HEPES, pH 7.4 (118mM NaCL, 4.8mM KCl, 1.2mM MgS04×7H2O, 1.3mM CaCl2H20, 1.2mM KH2PO4, 15mM HEPES)를 함유함) 50 ㎕를 첨가하였다. 인슐린 희석액을 0.1％ BSA를 포함하는 동일한 완충액으로 제조하고, 2X로 첨가하였다. 블랭크 (blank)는 KRBH, 0.1％ BSA 및 20mM 2×2-데옥시-D-글루코스, 2-데옥시-D-(U-14C) 글루코스 (0.2μCi/웰) 및 2×10-7인슐린을 포함하였다. 세포를 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 사이토칼라신 (cytochalasin) B 10㎕를 첨가하여 최종 농도를 KRBH 중에서 200μM로 맞추고, 플레이트를 마이크로베타 (Microbeta) 플레이트 판독기로 판독하였다. 상대적인 친화성은 각각의 실험에서 각각의 인슐린 분자를 재조합 인간 인슐린 대조군과 비교한 후, 실험 시행 횟수에 대해 평균을 산출함으로써 결정하였다. 따라서, 인슐린 분자에 대한 평균 IC50값을 인슐린에 대한 평균 IC50값과 비교하는 것은 동일한 수치를 도출해내지 못하였다.
표 2는 각각의 인슐린 분자 및 재조합 인간 인슐린에 대한 시험관 내 대사 효능을 나타내고 있다.
실시예 15
시험관 내 유사분열 촉진도
각 인슐린 분자의 유사분열 촉진 효능을, 배양액에서 인간 유선 상피 세포 (HMEC)의 증식을 측정함으로써 결정하였다. HMEC는 클로네틱스 코포레이션 (Clonetics Corporation) (캘리포니아주, 샌디에고)으로부터 7회 계대배양 상태로 수득하였으며, 이를 확장시키고, 7회 계대배양 상태에서 냉동시켰다. 신선한 앰풀을 각각의 시험 시간 동안 사용하여 모든 실험이 동일한 10회 계대배양의 HMEC로 수행되도록 하였다. 세포를 바이오 위태커 (Bio Whittaker)사의 지침에 따라 배양액에서 유지시켰다. 세포 배양액을 유지시키기 위하여, 증식 배지를 2일에 1회씩 교환하고, 배양액을 매일 검사하였다.
바이오 위태커사로부터의 시판되는 두 가지 제품을 증식 배지로 사용하였다:
1. 하기 성분을 포함하는 완전하게 보충된 MEGM (CC-3051) (BPE를 제외한 모든 양은 최종 농도를 나타냄):
10ng/ml hEGF (인간 재조합 상피 증식 인자),
5㎍/ml 인슐린
0.5㎍/ml 히드로코르티존 (Hydrocortisone)
50㎍/ml 젠타마이신 (Gentamicin), 50 ng/ml 암포테리신 (Amphotericin)-B
13mg/ml BPE (소 뇌하수체 추출물) 2ml (첨부됨); 및
2. 하기에 나열한 모든 보충물을 포함하는 기초 배지 (MEBM, CC-3151) (SingleQuots, CC-3150):
13mg/ml BPE (소 뇌하수체 추출물 (CC-4009) 2ml
10㎍/ml hEGF (CC-4017) 0.5ml
5㎍/ml 인슐린 (CC-4031) 0.5ml
0.5mg/ml 히드로코르티존 (CC-4031) 0.5ml
50mg/ml 젠타마이신, 50mg/ml 암포테리신-B (CC-4081) 0.5ml.
증식 실험의 경우, 분석 배지는 5 ㎍/ml 인슐린을 포함하지 않으며, 0.1％ BSA를 포함하는 증식 배지였다. 분석을 96웰 시토스타트 섬광 마이크로플레이트 (아머샴 파마시아 바이오텍, RPNQ0162)에서 수행하였다. 재조합 인간 인슐린 및 IGF-1은 각각의 분석에 사용되는 대조군이이었으며, 재조합 인간 인슐린을 각각의 분석 플레이트에 포함시켰다.
분석은 하기 방법에 따라 수행하였다. 1일째, HMEC를 웰당 분석 배지 100 ㎕ 중 4000 개 세포의 밀도로 시딩하였다. 증식 배지에 포함된 인슐린을 최종 농도 0 내지 1000 nM의 재조합 인간 인슐린 또는 다른 인슐린 분자의 등급별 투여량으로 교체하였다. 4 시간 동안 배양한 후에, 분석 배지 10 ㎕ 중14C-티미딘 (0.1 μCi)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 트릴럭스 (Trilux) 상에서 48 및(또는) 72시간째에 판독하였다.
통상적으로, 최대 증식 반응은 기준에 비하여 3-4배 범위의 자극이었다. 반응 데이터는 0 내지 100％으로 표준화시켰다: 반응=100×(농도 X에서의 반응 - 농도 0에서의 반응)/(최대 농도에서의 반응-농도 0에서의 반응). 농도-반응 데이터는 JMP 소프트웨어를 사용하는 비-선형 회귀에 의해 보정되었다.
상대적인 유사 분열 촉진 효능은 각각의 실험에서 각각의 인슐린 분자의 효능을 인슐린 대조군과 비교한 후, 실험 시행 횟수에 대하여 평균을 산출함으로써 결정하였다. 따라서, 인슐린 분자에 대한 평균 EC50값을 인슐린에 대한 평균 EC50값과 비교하는 것은 동일한 수치를 도출해내지 못하였다.
표 3은 각각의 인슐린 분자의 경우에 세포 증식에 의해 측정된 시험관 내 유사분열 촉진도를 나타낸다. 표 3의 데이터는 각각의 인슐린 분자가 재조합 인간 인슐린보다 유사분열 촉진 정도가 낮다는 것을 나타낸다.
실시예 16
포스페이트 완충된 염수의 용해도
생체 내 작용 기간 연장 성향의 지표가 되는 시험관 내 침전 분석법을 하기와 같이 진행하였다. pH를 4로 조정하고, 인슐린 분자의 약학상 투여량 (100 국제 단위), Zn2+30㎍/ml, m-크레졸 2.7mg/ml 및 글리세롤 17mg/ml을 함유하는 수용액을, 포스페이트 완충된 염수 (PBS)로 중성화시켜 2 국제 단위가 되도록 하고, 5분 동안 14,000rpm 및 RT에서 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 대략 상층액의 1/10을 분석용 대칭 실드 (Symmetry Shield) RP8 RP-HPLC 시스템 (워터스, 인크.; Waters, Inc.)에 주입하였다. 용출된 피크 아래의 면적을 통합하고, 이를 참고 표준 피크 아래의 면적과 비교한 결과, 0.1N HCl에 포함된 재조합 인간 인슐린으로 확인되었다. 면적비에 100을 곱하여 PBS 중의 ％용해도를 산출하였다.
재조합 인간 인슐린 제제 및 각각의 인슐린 분자에 대한 PBS 용해도를 표 4에 나타내었다.
실시예 17
등전점
등전점 집속법 (isoelectric focusing)은 단백질의 등전점 (pI)을 기준으로 단백질을 분리하는 전기영동 기술이다. pI값은 단백질의 전하가 순수하게 0일 때의 pH이며, pI값에서 단백질은 전기장 내를 이동하지 못한다. IEF 겔은 효과적으로 pH 구배를 형성하여 단백질을 이들의 독특한 pI값에 따라 분리시킨다. 단백질 밴드 검출은 민감성 염료 염색법 (노벡스 콜로이드성 쿠마시 염색 키트 (Novex Collodial Coomassie Staining Kit))에 의해 수행될 수 있다. 별법으로, 겔을 폴리비닐리덴 디플루오리드 (PVDF) 막에 블랏팅 (blotting)시키고, 이를 폰시유 레드 (Ponceau Red)로 염색하여 검출할 수도 있다. 단백질의 pI값은 이를 공지된 표준 pI값과 비교하여 결정한다. IEF 단백질 표준은 균일한 염색을 제공하도록 혼합된 잘-특성화된 pI값을 갖는 단백질의 조합체이다. pI값을 측정하는 다른 방법은 모세관 전기영동에 의한 IEF (clEF) 방법이다. pI값은 공지된 마커의 pI값과 비교하여 결정한다.
재조합 인간 인슐린 및 각 인슐린 분자의 등전점 (pI)은 3.5-8.5의 pI값의 수행 범위를 제공하는 pH 3-10의 노벡스 IEF 겔을 이용하는 등전점 집속 겔 전기영동법에 의해 측정되었다. 등전점을 표 5에 나타내었다.
실시예 18
개에서의 생체 내 연구
만성적으로 밤새-공복 상태로 사육한 수컷 및 암컷 비글 (대퇴부 동맥 및 정맥에 캐뉼라를 삽입함) (마셀 팜즈 (Marshall Farms), 뉴욕주 노쓰 로즈 (North Rose))로 실험을 수행하였다. 실험 당일에, 내재 혈관 접근 포트 (어세스 테크놀로지 (Access Technologies), 노르로크 메디컬 (Norfolk Medical), 일리노이주 스코키 (Skokie))를 접근시켜 세척하고, 동물을 3'×3' 연구 케이지에 넣었다. 공복 상태에서의 인슐린 및 글루코스 농도를 측정 (시간=30분)하기 위해 동맥 혈액 샘플을 채취하기 전에, 개들을 적어도 15분 동안 케이지 환경이 적응하도록 하였다. 이 때부터 시클릭 소마토스타틴 (BACHEM, Torrence, CA)을 연속적으로 정맥내로 주입 (0.65pg/kg/분)하기 시작하고, 그 후 24.5시간 동안 계속 주입하였다. 주입 시작 (시간=0) 30분 후에, 동맥 샘플을 채취하고, 염수 또는 인슐린 제제의 피하 볼루스 (2nmol/kg)를 경부 후측면에 주사하였다. 동맥 혈액 샘플을 주기적으로 채취하여, 혈장 글루코스 및 인슐린 농도를 측정하였다.
혈장 글루코스 농도를 글루코스 옥시다제 방법 (베크만 (Beckman) 글루코스 분석기 II) (베크만 인스트루먼츠 인크., 캘리포니아주 브레아 (Brea))을 이용하여 측정하였다. 혈장 샘플을 -80 ℃에 인슐린 분석을 시작할 때까지 보관하였다. 인슐린 농도를 상업적으로 시판되는 인간 인슐린 및 인슐린 분자에 민감한 방사성면역분석 키트를 이용하여 측정하였다.
A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린 및 NPH 인슐린은 각각 염수 대조군보다 양호한 작용 시간을 나타내었다. A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린 용액은 NPH 인슐린과 필적할만한 작용 시간을 나타내었다.
A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 및 A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린을 염수 및 인슐린 글라르긴 (A21GlyB31ArgB32Arg-인슐린)과 비교하였다. 각각의 두 가지 연구에서, A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린, A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 및 글라르긴 (glargin)은 염수 대조군보다 연장된 작용 시간을 나타내었다. 1차 연구에서, A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 및 A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린을 글라르긴과 필적할만한 작용 시간을 나타내었다. 2차 연구에서, A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 및 A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린은 글라르긴보다 짧은 작용 시간을 나타내었다.
실시예 19
래트에서의 시험관 내 연구
밤새 먹이를 공급하여 사육한 수컷 스프라그 돌리 (Sprague Dawley) 래트 (대퇴부 동맥 및 정맥에 캐뉼라를 삽입함)로 실험을 수행하였다. 실험 당일 오전에, 카테터의 내용물을 흡인기로 빨아내고; 카테터 말단을 연장 선에 연결시키고; 동물을 12"×12" 연구 케이지에 넣었다. 30분 동안 순응시킨 후에, 동맥 혈액 샘플을 채취하고, 비히클 (0.3％ 래트 알부민을 함유하는 염수)의 정맥내 볼루스 또는 인슐린 분자 (인슐린 분자 제제를 0.3％ 래트 알부민을 함유하는 염수로 희석함; 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 또는 1.2nmol/kg; n=5/투여량)를 투여하였다. 정맥내 주사 후 10, 20, 30, 45 및 60 분에 혈액을 채취하였다.
모든 혈액 샘플을 이나트륨 EDTA를 함유하는 튜브에 수집하고, 얼음에 올렸다. 샘플을 원심분리하고; 혈장을 수집하고; 혈장 글루코스 농도를 모나크 임상 화학 분석기 (Monarch Clinical Chemistry Analyzer)를 이용하여 연구일을 결정하였다.
글루코스 곡선 (0-30 분) 아래의 면적을 사다리꼴 공식을 이용하여 계산하였다. 다양한 투여량에 대한 측정치를 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism)을 이용하여 그래프로 나타내었다. 2.45gㆍ분/dL의 곡선 아래의 글루코스 면적에 해당되는 투여량을 결정하고, 이를 인슐린 제제의 상대적인 효능을 직접 비교하는데 사용하였다.
한 실험에서, 재조합 인간 인슐린의 경우에 측정된 효능은 0.160nmol/kg이었고, A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린의 경우에 측정된 효능은 0.158nmol/kg이었다.
다른 실험에서, 재조합 인간 인슐린의 경우에 측정된 효능은 0.162nmol/kg이고, A0ArgA21GlyB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린의 경우에 측정된 효능은 0.200nmol/kg이었다.
다른 실험에서, 재조합 인간 인슐린의 경우에 측정된 효능은 0.207nmol/kg이었고, A0ArgA21SerB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린의 경우에 측정된 효능은 0.226nmol/kg이었고, A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린의 경우에 측정된 효능은 0.268nmol/kg이었다.
다른 실험에서, 재조합 인간 인슐린의 경우에 측정된 효능은 0.317nmol/kg이었고, A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린의 경우에 측정된 효능은 0.320nmol/kg이었다.
다른 실험에서, 재조합 인간 인슐린의 경우에 측정된 효능은 0.217nmol/kg이었고, A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린의 경우에 측정된 효능은 0.275nmol/kg이었고, A0ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린의 경우에 측정된 효능은 0.258nmol/kg이었다.
실시예 20
A0ArgB0Arg-인슐린 아연 결정 및 프로타민-아연 결정
원액 A를, 멸균수 대략 350mL에 합성 글리세린 16.1g, 페놀 0.73g 및 m-크레졸 1.6mL을 교반시키면서 용해시켜 제조하였다. 용해시킨 후에, 최종 용액 중량이 503g이 되도록 멸균수를 첨가하였다. 프로타민 술페이트 원액은 멸균수 10mL에 프로타민 술페이트 0.0366g을 용해시켜 제조하였다. A0ArgB0Arg-인슐린 원액은 원액 A1.28mL에 A0ArgB0Arg-인슐린 0.0121g을 용해시켜 제조하였다. 산화아연 원액은 25mg/mL 산화아연 용액 1mL를 최종 부피 25mL가 되도록 희석하여 1mg/mL의 최종 산화아연 농도를 수득함으로써 제조하였다. 인산나트륨 원액은 멸균수 15mL에 이염기성 인산나트륨 0.0577g을 용해시켜 제조하였다. 염화나트륨 원액은 멸균수 10mL에 염화나트륨 1.1067g을 용해시켜 제조하였다.
A0ArgB0Arg-인슐린 아연 결정 실험의 경우, A0ArgB0Arg-인슐린, 산화아연 및 원액 A를 산성 pH에서 혼합하였다. 염화나트륨을 또한 샘플의 일부에 첨가하였다. 모든 샘플을 최종 부피가 0.1mL이 되도록 혼합하였다. 인산나트륨 원액 0.1mL를 첨가하자, 침전물이 형성되었다. 최종 pH를 7.4 내지 9.3으로 조정하였다. A0ArgB0Arg-인슐린 프로타민-아연 결정을 동일한 방법으로 제조하였다 (단, 프로타민 술페이트도 A0ArgB0Arg-인슐린, 산화아연, 염화나트륨 및 원액 A과 혼합시키는 것은 상이함).
이어서, 각각의 샘플을 두 부분으로 나누었다. 한 샘플은 30 ℃에서 인큐베이션하고, 다른 샘플은 실온에 방치하였다. 시험 조건을 표 6에 나타내었으며, 각각의 시험 조건에서 결정이 관찰되었다. 모든 농도는 공칭 농도이다.
실시예 21
A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린 아연 결정 및 프로타민-아연 결정
원액 A, 및 산화아연, 인산나트륨 및 염화나트륨의 원액을 실시예 20에서와 같이 제조하였다.
프로타민 술페이트 원액은 원액 A 10mL에 프로타민 술페이트 0.0332g을 용해시켜 제조하였다. A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린 원액은 원액 A 1.25mL에 A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린 0.0112g을 용해시켜 제조하였다.
A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린 아연 결정 실험의 경우, A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린, 산화아연 및 원액 A를 산성 pH에서 혼합하였다. 또한 염화나트륨을 샘플의 일부에 첨가하였다. 모든 샘플을 최종 부피가 0.1mL가 되도록 혼합하여 상이한 조건을 수득하였다. 인산나트륨 원액 0.1mL를 첨가하자, 침전물이 형성되었다. 최종 pH를 7.4 내지 9.3으로 조정하였다.
A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린 프로타민-아연 결정을 동일한 방법으로 제조하였다 (프로타민 술페이트도 A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린, 산화아연, 염화나트륨 및 원액 A와 혼합시키는 것은 상이함).
이어서, 각각의 샘플을 두 부분으로 나누었다. 한 샘플은 30 ℃에서 인큐베이션하고, 다른 샘플은 실온에 방치하였다. 시험 조건을 표 7에 나타내었으며, 각각의 시험 조건에서 결정이 관찰되었다. 모든 농도는 공칭 농도이다.
염화나트륨의 농도 및 pH를 최적화시키기 위하여 추가의 실험을 수행하였다. 원액 A는 멸균수 대략 300g에 합성 글리세린 12.8g, 페놀 0.59g 및 m-크레졸 1.28g을 용해시켜 제조하였다. 용해시킨 후에, 용액의 최종 총중량이 403g이 될 때까지 멸균수를 교반하면서 첨가하였다. 프로타민 술페이트 원액은 원액 A 10mL에 프로타민 술페이트 0.033g을 용해시켜 제조하였다. A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린 원액은 원액 A 0.3mL에 A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린 0.0042g을 용해시켜 제조하였다. 산화아연 원액은 5N 염산 1mL에 산화아연 0.0308g을 용해시켜 제조하고, 최종 부피가25mL가 되도록 멸균수를 첨가하였다. 인산나트륨 원액은 멸균수에 이염기성 인산나트륨 0.1893g을 교반하면서 용해시켜 제조하고, 최종 용액의 부피는 50mL가 되도록 하였다. 염화나트륨 원액은 멸균수 10mL에 염화나트륨 1.173g을 교반하면서 용해시켜 제조하였다.
A0ArgB0ArgB29Lys-Nε-Arg-인슐린, 프로타민 술페이트, 산화아연, 염화나트륨 및 원액 A를 최종 부피 0.1mL가 되도록 혼합하였다. 인산나트륨 원액 0.1mL를 첨가하자, 침전물이 형성되었다. 최종 pH를 7.4 내지 9.3으로 조정하였다.
이어서, 각각의 샘플을 두 부분으로 나누었다. 한 샘플은 30 ℃에서 인큐베이션하고, 다른 샘플은 실온에 방치하였다. 시험 조건을 표 8에 나타내었으며, 각각의 시험 조건에서 결정이 관찰되었다. 모든 농도는 공칭 농도이다.
실시예 22
A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 아연 결정
하기 실험의 경우에는 원액 A, 및 염화나트륨, 인산나트륨, 산화아연 및 나트륨 시트레이트의 원액을 하기와 같이 제조하였다.
원액 A는 밀리-큐 (milli-Q) 물 대략 3500mL에 합성 글리세린 128.2g, 페놀 5.9g, m-크레졸 12.9g 및 이염기성 인산나트륨 30.3g을 용해시켜 제조하였다. 용해시킨 후에, 밀리-큐 물을 최종 용액 중량이 4000g이 되도록 첨가하였다.
염화나트륨 원액은 멸균수 10mL에 염화나트륨 1.1614g을 교반하면서 용해시켜 제조하였다.
인산나트륨 원액은 멸균수 10mL에 이염기성 인산나트륨 0.7538g을 용해시켜 제조하였다. 이 인산 용액 0.5mL를 멸균수 9.5mL로 희석하였다.
산화아연 원액은 멸균수 9.6mL에 25mg/mL의 산화아연 원액 0.4mL를 용해시켜 최종 농도가 1mg/mL인 산화아연을 수득함으로써 제조하였다 .
나트륨 시트레이트 원액은 멸균수 10mL에 나트륨 시트레이트 2.9597g을 용해시켜 제조하였다.
다른 실험에서, A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 원액은 원액 A 0.65mL에 A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 0.00335g을 용해시켜 제조하였다. 용액이 탁해졌고, pH는 대략 7.1이었다. pH를 3.7로 조정하여 용액을 맑게하였다.
결정화 반응은 우선 A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린을 산화아연과 혼합하고, 원액 A 및 염화나트륨 원액을 첨가함으로써 개시되었다. 용액의 pH를 4 미만으로 유지시켰다. 이어서, 인산나트륨 원액을 첨가하자, 침전물이 형성되었다. 최종 pH를 6.5 내지 9.5로 조정하였다. 이어서, 각각의 샘플을 세 개의 부분으로 나누었다. 한 샘플은 5 ℃에서 인큐베이션하고, 한 샘플은 30 ℃에서 인큐베이션하고, 다른 샘플은 실온에 방치하였다. 시험 조건 및 관찰 결과를 표 9에 나타내었다. 모든 농도는 공칭 농도이다.
다른 실험에서, A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 원액은 원액 A 0.65mL에A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 0.0032g을 용해시켜 제조하였다. 용액이 탁해졌고, pH는 대략 7.1이었다. pH를 3.7로 조정하여 용액을 맑게하였다.
결정화 반응은 우선 A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린을 산화아연과 혼합하고, 원액 A, 염화나트륨 및(또는) 나트륨 시트레이트 원액을 첨가함으로써 개시되었다. 용액의 pH를 4 미만으로 유지시켰다. 이어서, 인산나트륨 원액을 첨가하자, 침전물이 형성되었다. 최종 pH를 6.5 내지 9.5로 조정하였다. 이어서, 각각의 샘플을 세 개의 부분으로 나누었다. 한 샘플은 5 ℃에서 인큐베이션하고, 한 샘플은 30 ℃에서 인큐베이션하고, 다른 샘플은 실온에 방치하였다. 시험 조건 및 관찰 결과를 표 10에 나타내었다. 모든 농도는 공칭 농도이다.
다른 실험에서, 나트륨 아세테이트 원액은 멸균수 10mL에 나트륨 아세테이트0.8203g을 용해시켜 제조하였다. A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 원액은 원액 A 0.63mL에 A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 0.003g을 용해시켜 제조하였다. 용액이 탁해졌고, pH는 대략 7.1이었다. pH를 3.7로 조정하여 용액을 맑게하였다.
결정화 반응은 A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린을 우선 산화아연과 혼합하고, 원액 A, 염화나트륨 및(또는) 나트륨 아세테이트 원액을 첨가함으로써 개시되었다. 용액의 pH를 4 미만으로 유지시켰다. 이어서, 인산나트륨 원액을 첨가하자, 침전물이 형성되었다. 최종 pH를 6.5 내지 9.5로 조정하였다. 이어서, 각각의 샘플을 세 개의 부분으로 나누었다. 한 샘플은 5 ℃에서 인큐베이션하고, 한 샘플은 30 ℃에서 인큐베이션하고, 다른 샘플은 실온에 방치하였다.
시험 조건 및 관찰 결과를 표 11에 나타내었다. 모든 농도는 공칭 농도이다.
다른 실험에서, 산화아연 원액은 10mg/mL 산화아연 용액 1.0mL를 멸균수1.0mL로 희석하여 제조하였다. 최종 산화아연 농도는 5mg/mL이었다.
A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 원액은 멸균수 0.43mL에 A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 0.00221g을 용해시켜 제조하였다. 상기 용액은 거의 투명하며, pH는 대략 3.7로 확인되었다. pH를 대략 3.0으로 조정하여 용액을 맑게하였다.
결정화 반응은 A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린을 산화아연, 및 염화나트륨이나 나트륨 시트레이트나 나트륨 아세테이트의 원액 중 하나를 1차 혼합함으로써 개시되었다. 이 용액의 pH를 약 3 부근 미만으로 유지시켰다. 이어서, 인산나트륨 원액은 첨가하자, 침전물이 형성되었다. 최종 pH를 6.5 내지 8.5로 조정하였다. 각각의 샘플을 실온에 방치하였다. 시험 조건 및 관찰 결과를 표 12에 나타내었다. 모든 농도는 공칭 농도이다.
실시예 23
A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 프로타민-아연 결정
원액 A를 멸균수 대략 350mL에 합성 글리세린 16.1g, 페놀 0.73g 및 m-크레졸 1.6mL를 용해시켜 제조하였다. 용해시킨 후에 멸균수를 첨가하여 최종 용액의 중량이 503g이 되게 하였다. 프로타민 술페이트 원액은 멸균수 10mL에 프로타민 술페이트 0.0366g을 용해시켜 제조하였다.
A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 원액은 원액 A 1.28mL에 A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린 0.0121g을 용해시켜 제조하였다. 산화아연 원액은 25mg/mL 산화아연 용액 1mL를 최종 부피가 25mL가 되도록 희석하여 최종 농도가 1mg/mL인 산화아연을 수득함으로써 제조하였다. 인산나트륨 원액은 멸균수 15mL에 이염기성 인산나트륨 0.0577g을 용해시켜 제조하였다. 염화나트륨 원액은 멸균수 10mL에 염화나트륨 1.1607g을 용해시켜 제조하였다.
A0Lys-Nε-ArgA21GlyB29Lys-Nε-Arg-인슐린, 산화아연, 프로타민 술페이트, 염화나트륨 및 원액 A를 최종 부피가 0.1mL이 되도록 합하여 상이한 조건을 수득하였다. 인산나트륨 원액 0.1mL을 첨가하자 침전물이 형성되었다. 최종 pH를 7.4 내지 9.3으로 조정하였다.
이어서, 각각의 샘플을 두 개로 나누었다. 하나의 샘플은 30 ℃에서 인큐베이션하고, 다른 샘플은 실온에 방치하였다. 시험 조건을 표 13에 나타내었으며,결정이 관찰되었다.
본 발명의 바람직한 실시양태를 언급하여 본 발명을 구체적으로 설명하고 기재하였지만, 본 발명은 하기 첨부된 청구항에 의해 정의된 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 그 형태 및 세부 사항이 다양하게 변화할 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 당업자는 일상적인 실험만을 이용해서도 본원에 구체적으로 기재된 본 발명의 구체적인 실시양태와 동등한 여러 동등물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 상기 동등물은 청구 범위에 포함되는 것으로 간주한다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 논문, 서적 및 다른 공개문은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된 것으로 간주한다.
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> Insulin Molecule Having Protracted Time Action <130> X-16004M <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Arg, derivatized Arg, homoarginine, desamino homoarginine, desaminoarginine, Lys, derivatized Lys, desaminolysine, alpha gua nidino homoarginine, alpha methyl arginine, or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Arg, derivatized Arg, homoarginine, desamino homoarginine, desaminoarginine, Lys, derivatized Lys, desaminolysine, alpha gua nidino homoarginine, or alpha methyl arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa = a genetically encodable amino acid <400> 1 Xaa Xaa Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr 1 5 10 15 Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa 20 <210> 2 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 is Lys or Xaa at position 31 is Lys but not both <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa at position 30 is Pro or Xaa at position 31 is Pro but not both <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa = Lys or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa = Lys or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa = Thr, Ala or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Arg, derivatized arg, homoarginine, desamino homoarginine, desaminoarginine, Lys, derivatized Lys, desaminolysine, alpha gua nidino homoarginine, alpha methyl arginine, or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Arg, derivatized arg, homoarginine, desamino homoarginine, desaminoarginine, Lys, derivatized Lys, desaminolysine, alpha gua nidino homoarginine, alpha methyl arginine, or is absent <400> 2 Xaa Xaa Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala 1 5 10 15 Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Xaa 20 25 30 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30

Claims (53)

  1. (a) 하기 식 I의 A-쇄
    (식 I의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 나열되어 있음), 및
    (b) 하기 식 II의 B-쇄
    (식 II의 아미노산 서열은 서열 번호 2에 나열되어 있음)
    (상기 식에서,
    위치 A-1의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, α-메틸 아르기닌이거나, 결여되어 있고;
    위치 A0의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, 또는 α-메틸 아르기닌이고;
    위치 A21의 Xaa는 유전자에 의해 코딩가능한 아미노산이고;
    위치 B-1의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, α-메틸 아르기닌이거나, 결여되어 있고;
    위치 B0의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, α-메틸 아르기닌이거나, 결여되어 있고;
    위치 B28의 Xaa는 Lys 또는 Pro이고;
    위치 B29의 Xaa는 Lys 또는 Pro이고;
    위치 B30의 Xaa는 Thr 또는 Ala이거나, 결여되어 있고;
    위치 B28의 Xaa 또는 위치 B29의 Xaa 중 어느 하나는 Lys이고;
    위치 B28의 Xaa와 위치 B29의 Xaa 둘 모두가 Lys은 아니며;
    위치 B28 또는 B29 Lys의 ε-아미노기는 양하전된 아미노산의 α-카르복실기에 공유 결합하여 Lys-Nε-아미노산 유도체를 형성함)
    를 갖는 인슐린 분자.
  2. 제1항에 있어서, 위치 B28 또는 B29 Lys의 ε-아미노기가 Arg의 α-카르복실기에 공유 결합하여 Lys-Nε-Arg를 형성하는 인슐린 분자.
  3. 제1항에 있어서, 위치 B28 또는 B29 Lys의 ε-아미노기가 Lys의 α-카르복실기에 공유 결합하여 Lys-Nε-Lys를 형성하는 인슐린 분자.
  4. 제1항에 있어서, 위치 A-1의 Xaa 및 위치 B-1의 Xaa가 결여되어 있는 인슐린 분자.
  5. 제1항에 있어서, 위치 B-1의 Xaa 및 위치 B0의 Xaa가 결여되어 있는 인슐린 분자.
  6. 제1항에 있어서, 위치 A-1의 Xaa, 위치 B-1의 Xaa 및 위치 B0의 Xaa가 결여되어 있는 인슐린 분자.
  7. 제4항에 있어서,
    위치 A0의 Xaa가 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌 또는 α-메틸 아르기닌이고;
    위치 B0의 Xaa가 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, α-메틸 아르기닌이거나, 결여되어 있는
    인슐린 분자.
  8. 제7항에 있어서, 위치 A0의 Xaa가 Arg이고, 위치 B0의 Xaa가 결여되어 있는 인슐린 분자.
  9. 제7항에 있어서, 위치 A0의 Xaa가 Arg이고, 위치 B0의 Xaa가 Arg인 인슐린 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 분자의, 진성 당뇨병 치료용 의약 제조에 있어서의 용도.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 인슐린 분자를 포함하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 조성물이 제약 조성물인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 더 포함하는 조성물.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 2가 금속 양이온을 더 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 2가 금속 양이온이 아연인 조성물.
  16. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 인슐린을 더 포함하는 조성물.
  17. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 속효성 인슐린 유사체를 더 포함하는 조성물.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 조성물의, 진성 당뇨병 치료용 의약 제조에 있어서의 용도.
  19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 인슐린 분자 및 2가 금속 양이온을 포함하며, 프로타민은 함유하지 않는 미세결정.
  20. 제19항에 있어서, 2가 금속 양이온이 아연인 미세결정.
  21. 제4항 및 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 인슐린 분자, 2가 금속 양이온 및 프로타민을 포함하는 미세결정.
  22. 제19항에 있어서, 2가 금속 양이온이 아연인 미세결정.
  23. 인슐린 분자를 포함하는 성분과 2가 금속 양이온을, 인슐린 분자의 헥사머 형성을 허용하는 pH의 수성 용매에서 접촉시키는 것을 포함하는, 제19항의 미세결정의 제조 방법.
  24. 제23항에 있어서, 2가 금속 양이온이 아연인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 성분들을, 헥사머 형성을 용이하게 하는 농도로 존재하는 헥사머-안정화 화합물과 접촉시키는 것을 더 포함하는 방법.
  26. 제19항에 따른 미세결정의, 진성 당뇨병 치료용 의약 제조에 있어서의 용도.
  27. (a) 인슐린 주형의 각 유리 아미노기를 보호된 아미노산 또는 보호된 아미노산 유도체로 아실화시켜 아실화된 인슐린 분자를 형성하는 단계;
    (b) 아실화된 인슐린 분자를 정제하는 단계;
    (c) 각각의 보호된 아미노산 또는 보호된 아미노산 유도체로부터 보호기를 제거하여 탈보호된 아실화 인슐린 분자를 형성하는 단계;
    (d) 탈보호된 아실화 인슐린 분자를 정제하는 단계
    를 포함하는, 인슐린 분자의 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서, 보호된 아미노산이 활성화된 카르복실산인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 활성화된 카르복실산이 N-히드록시숙신이미드인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 인슐린 주형이 재조합 인간 인슐린 또는 그의 유사체인 방법.
  31. 제27항에 있어서, 인슐린 주형이 A21Xaa-인슐린인 방법.
  32. 대상체에서 혈당 농도를 조절하기에 충분한 양의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 고혈당증을 치료하는 방법.
  33. 대상체에서 혈당 농도를 조절하기에 충분한 양의 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 고혈당증을 치료하는 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 대상체가 진성 당뇨병 치료를 받는 대상체인 방법.
  35. 대상체에서 혈당 농도를 조절하기에 충분한 양의 제19항에 따른 미세결정을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 진성 당뇨병을 치료하는 방법.
  36. (a) 하기 식 I의 A-쇄
    (식 I의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 나열되어 있음), 및
    (b) 하기 식 II의 B-쇄
    (식 II의 아미노산 서열은 서열 번호 2에 나열되어 있음)
    (상기 식에서,
    위치 A-1의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, α-메틸 아르기닌이거나, 결여되어 있고;
    위치 A0의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, 또는 α-메틸 아르기닌이고;
    위치 A21의 Xaa는 유전자에 의해 코딩가능한 아미노산이고;
    위치 B-1의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, α-메틸 아르기닌이거나, 결여되어 있고;
    위치 B0의 Xaa는 Arg, 유도체화된 Arg, 호모아르기닌, 데스아미노호모아르기닌, 데스아미노아르기닌, Lys, 유도체화된 Lys, 데스아미노리신, α-구아니디노호모아르기닌, 또는 α-메틸 아르기닌이고;
    위치 B28의 Xaa는 Lys 또는 Pro이고;
    위치 B29의 Xaa는 Lys 또는 Pro이고;
    위치 B30의 Xaa는 Thr 또는 Ala이거나, 결여되어 있고;
    위치 B28의 Xaa 또는 위치 B29의 Xaa 중 어느 하나는 Lys이며;
    위치 B28의 Xaa와 위치 B29의 Xaa 둘 모두 Lys이 아님)
    를 갖는 인슐린 분자.
  37. 제36항에 있어서, 위치 A-1의 Xaa가 결여되어 있고, 위치 B-1의 Xaa가 결여되어 있는 인슐린 분자.
  38. 제37항에 있어서, 위치 A0의 Xaa가 Arg 또는 Lys이고, 위치 B0의 Xaa가 Arg 또는 Lys인 인슐린 분자.
  39. 제38항에 있어서, 위치 A0의 Xaa가 Arg이고, 위치 B0의 Xaa가 Arg인 인슐린 분자.
  40. 제36항의 인슐린 분자 및 2가 양이온을 포함하는 미세결정.
  41. 제40항에 있어서, 2가 금속 양이온이 아연인 미세결정.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 프로타민을 더 포함하는 미세결정.
  43. 제36항의 인슐린 분자를 포함하는 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 2가 금속 양이온을 더 포함하는 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 2가 금속 양이온이 아연인 조성물.
  46. 제44항에 있어서, 조성물이 제약 조성물인 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 더 포함하는 조성물.
  48. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 분자의, 진성 당뇨병 치료용 의약 제조에 있어서의 용도.
  49. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 조성물의, 진성 당뇨병 치료용 의약 제조에 있어서의 용도.
  50. 대상체에서 혈당 농도를 조절하기에 충분한 양의 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 고혈당증을 치료하는 방법.
  51. 대상체에서 혈당 농도를 조절하기에 충분한 양의 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 고혈당증을 치료하는 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 대상체가 진성 당뇨병 치료를 받는 대상체인 방법.
  53. 대상체에서 혈당 농도를 조절하기에 충분한 양의 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 미세결정을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 진성 당뇨병을 치료하는 방법.
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