CN103119057B - 基于酰胺的胰岛素前药 - Google Patents

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Abstract

提供了胰岛素和胰岛素类似物的前药制剂，其中胰岛素肽已通过酰胺键连接二肽前药元件来修饰。本文公开的前药具有至少10小时、更通常大于2小时、20小时和小于70小时的延长的半衰期，并且在生理条件下通过由化学不稳定性驱动的非酶促反应转化成活性形式。

Description

基于酰胺的胰岛素前药
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年6月24日提交的美国临时专利申请号61/358,192的优先权，其特此通过引用整体并入。
通过引用电子形式提交的材料的并入
通过引用整体并入计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表，所述序列表与本文一并提交并如下标识：于2011年6月23日创建的名称为“IN216461”的一个27KBACII(文本)文件。
背景技术
胰岛素是一种由二链异源二聚体组成的肽激素，所述异源二聚体以生物合成的方式由低效能单链胰岛素原前体通过酶加工获得。人胰岛素由通过二硫键结合在一起的两条肽链(“A链”(SEQIDNO:1)和“B链”(SEQIDNO:2))组成，共有51个氨基酸。B链的C末端区和A链的两个末端区以三维结构缔合装配成以高亲和力结合胰岛素受体的部位。
对于几乎所有形式的糖尿病，胰岛素都显示出无以伦比的降低葡萄糖的能力。遗憾的是，其药理学并不是葡萄糖敏感性的，以至于它能够产生可导致危及生命的低血糖症的过度作用。不一致的药理学是胰岛素疗法的标志，使得要使血糖正常化而又不发生低血糖症极为困难。此外，天然胰岛素的作用持续时间短，而且天然胰岛素需要经过修饰使之适用于基础葡萄糖的控制。已确立的延迟胰岛素起效的方法包括降低溶解度和白蛋白结合。
例如，已制备了两种市售的胰岛素衍生物以提供较长的作用特征。更具体地讲，制备了胰岛素衍生物[GlyA21，ArgB31，ArgB32]胰岛素，以使胰岛素的pI由5.4变为6.7，导致该肽在生理pH下沉淀，由此迟缓吸收和作用时间(参见Bolli等，Diabetologia1999，42，1151-1167)。然而，这种胰岛素衍生物的IGF-1亲和力升高，导致增殖作用增强和肿瘤发生的可能性增加。另一种市售的胰岛素衍生物是[LysB29-十四烷酰基，des(B30)]胰岛素，其中LysB29已经用C14脂肪酸酰化(Mayer等，PeptideScience，88，5，687-713)。脂肪酸链的存在促进肽与血清白蛋白的结合，导致血浆半衰期延长。然而，这种衍生物具有体内效能降低的缺点。另外，两种胰岛素衍生物的生物学作用在一名患者与另一患者之间表现出差异。
前药化学法为在从给药部位清除并在血浆中以高度限定的浓度平衡后精确控制胰岛素作用的开始和持续时间提供了机会。与现有的长效胰岛素类似物和制剂相比，该方法的主要优点是胰岛素贮库不是其中进行注射的皮下脂肪组织，而是血液隔室。这就排除了现有技术延迟起效胰岛素衍生物所遇到的吸收变化性。这还使通过皮下注射以外的途径施用该肽激素成为可能。
胰岛素与其受体结合将引起生物刺激，但也将通过胰岛素肽的酶促降解而引发胰岛素诱导的药理学的后续失活。使用胰岛素前药衍生物的额外优势是这类方法还基于抑制前药被相应受体识别的策略来延长胰岛素的生物半衰期。尽管存在与前药衍生物相关的这些优势，但是制备这类前药的复杂特性至今一直妨碍有效胰岛素前药衍生物的制备。为了开发成功的前药激素，需要活性部位结构地址(structuraladdress)，其可形成用于前药结构元件可逆附着的基础。该结构地址需提供两个关键特征；(1)选择性化学修饰的潜力，和(2)在脱去前药结构元件时以天然形式提供高度活性的能力。将本文公开的胰岛素前药以化学法转化为可被受体识别的结构，其中该化学转化的速度将决定体内生物作用的开始和持续时间。本申请公开的前药化学法有赖于分子内的化学反应，该反应不依赖其它化学添加剂或者酶或酶抑制剂。
理想的前药在生理条件(例如pH7.2和37℃)下应可溶于水，并且以粉末形式长期保存时应保持稳定。与母体药物相比，前药还应是免疫沉默的，并显示出低活性。通常，前药将显示出不超过母体药物活性的10%，在一个实施方案中，与母体药物相比，前药显示出小于10%、小于5%、约1%或小于1%的活性。此外，当注射到体内时，前药应在规定时段内定量转化为活性药物。申请人首次公开了符合这些目标中的每一项的胰岛素前药类似物。
发明内容
基于肽的药物是十分有效的药物，其作用持续时间相对较短并且治疗指数可变。本公开内容涉及胰岛素前药，其中将前药衍生物设计成延迟起效，而且药物半衰期延长。起效延迟是有利的，因为允许前药在其活化前***分布。因此，施用前药排除了在给药时由峰值活性引起的并发症，并提高母体药物的治疗指数。
根据一个实施方案，将二肽通过酰胺键与胰岛素肽的活性部位共价连接来制备胰岛素的前药衍生物。在一个实施方案中，二肽在干扰胰岛素与胰岛素受体和IGF-1受体相互作用的能力的位置上与胰岛素肽共价结合。随后在生理条件下且缺乏酶活性时，通过导致二酮哌嗪或二酮吗啉形成的分子内反应除去二肽，恢复多肽的完整活性。
在一个实施方案中，提供具有U-O-胰岛素的通用结构的胰岛素前药，其中U为氨基酸或羟酸，O为通过在U-O和胰岛素肽的胺之间形成酰胺键而与胰岛素肽连接的N-烷基化氨基酸。在一个实施方案中，U-O二肽在A链或B链各自的N端或与A链或B链各自的A19、B16或B25位对应的氨基酸侧链上通过酰胺键结合。在一个实施方案中，选择U-O的结构，其中在生理条件下的PBS中，在约1小时至约720小时内U-O自胰岛素肽的化学裂解完成至少约90%。在一个实施方案中，在生理条件下的PBS中，U-O自胰岛素肽的化学裂解半衰期(t1/2)为至少约1小时至约1周。
在一个实施方案中，选择U和O以抑制存在于哺乳动物血清中的酶从胰岛素肽上酶促切割U-O二肽。在一个实施方案中，选择U和/或O，使得在生理条件下的PBS中，从胰岛素肽对U-O的裂解半衰期不大于在包含DPP-IV蛋白酶的溶液中从胰岛素肽对U-O的裂解半衰期的两倍(即在DPP-IV蛋白酶存在和生理条件下从胰岛素前药中裂解U-O不会以超过2倍的更快速率发生（与不存在该酶的相同条件相比）)。在一个实施方案中，U、O或U-O与之连接的胰岛素肽的氨基酸为非编码氨基酸。在一个实施方案中，U和/或O为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈D立体异构体构型的氨基酸，而O为呈L立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈L立体异构体构型的氨基酸，而O为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈D立体异构体构型的氨基酸，而O为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一个实施方案中，O为N-烷基化氨基酸，但不是脯氨酸。
在一个实施方案中，二肽前药元件包含具有以下式I通用结构的化合物：
其中
R1、R2、R4和R8独立地选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基(heterocyclic))、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W)C1-C12烷基，其中W为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自H和OH。
在一个实施方案中，二肽前药元件包含具有以下式I通用结构的化合物：
其中
R1、R2、R4和R8独立地选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
在一个实施方案中，二肽延伸物（dipeptideextension）包含以下通用结构的化合物：
其中R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C8环烷基环；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH。在一个实施方案中，R3为C1-C8烷基，并且R4选自H、C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环。
根据一个实施方案，提供包含A链和B链的胰岛素前药类似物，其中A链包含序列Z-GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)，并且B链包含序列J-X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)。A链和B链式中的指称Z和J独立地为H(形成N端胺)或包含以下通用结构的二肽：
，其中
X14为将“J”元件与X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)序列的N端连接的键，或者X14表示将“J”元件与X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)序列的N端连接的选自以下的1-4个氨基酸的序列：FVNQ(SEQIDNO:11)、VNQ、NQ和Q。
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH、NH2、NHR10和OCH3，其中R10为包含以下通用结构的二肽：
；
X3选自天冬酰胺、鸟氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
其中X12选自OH、NH2、NHR11和OCH3，其中R11为包含以下通用结构的二肽：
；
X8为组氨酸、天冬酰胺或以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH、NH2、NHR12和OCH3，其中R12为包含以下通用结构的二肽：
；
其中R1选自H和C1-C8烷基；
R2和R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH，前提条件是，X、X12、X13、J和Z中的一个并且只有一个包含以下通用结构的二肽：
。在一个实施方案中，胰岛素类似物包含紧接着上文鉴别的序列，但是X8为组氨酸或天冬酰胺。在一个实施方案中，如果J或Z包含式I的二肽，且R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环，则R1和R2两者都不为氢。
根据一个实施方案，存在于Z、J、R10、R11或R12上的二肽包含具有下式I的通用结构的化合物：
其中
R1、R2、R4和R8独立地选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
根据一个实施方案，存在于Z、J、R10、R11或R12上的二肽包含具有下式I通用结构的化合物：
其中
R1和R8独立地为H或C1-C8烷基；
R2和R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C3-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；
R3为C1-C18烷基；
R5为NHR6；
R6为H或C1-C8烷基；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代。
根据一个实施方案，提供胰岛素类似物，其中胰岛素肽的A链包含序列Z-GIVEQCCTSICSLYQLENX2CN(SEQIDNO:6)，并且B链包含选自以下的序列：HLCGSHLVEALYLVCGERGFF(SEQIDNO:7)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQIDNO:8)和FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQIDNO:9)，其中
Z为H或包含以下通用结构的二肽：
；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中R10为H或包含以下通用结构的二肽：
，
前提条件是Z和R10不同时为H，且不同时为包含以下通用结构的二肽：
。
根据一个实施方案，提供单链胰岛素前药类似物。在这个实施方案中，人胰岛素B链或其功能类似物的羧基端与人胰岛素A链或其功能类似物的N端共价连接，其中具有以下通用结构的二肽前药部分在肽的N端或者在与A链或B链各自的A19、B16或B25位对应的氨基酸侧链上通过酰胺键共价结合：
。在一个实施方案中，B链通过4-12个或4-8个氨基酸的肽接头与A链连接。
在另一个实施方案中，通过将亲水部分与肽共价连接，提高胰岛素前药类似物的溶解度。在一个实施方案中，亲水部分通过接头与胰岛素类似物连接。在一个实施方案中，亲水部分与B链的N端α胺或与SEQIDNO:9的28位氨基酸的侧链或SEQIDNO:8的29位氨基酸的侧链连接(直接地或通过接头间接地)。在一个实施方案中，亲水部分为分子量范围为约500至约40,000道尔顿的聚乙二醇(PEG)链。在一个实施方案中，聚乙二醇链的分子量范围选自约500至约5,000道尔顿。在另一个实施方案中，聚乙二醇链的分子量为约10,000至约20,000道尔顿。
酰化或烷基化可增加胰岛素肽在循环中的半衰期。在前药活化时，酰化或烷基化可有利地延迟对胰岛素受体的起效和/或延长对胰岛素受体的作用持续时间。胰岛素类似物可以在与亲水部分所连接氨基酸位置相同的氨基酸位置上酰化或烷基化，或者在不同的氨基酸位置上酰化或烷基化。
根据一个实施方案，提供包含本文公开的任何新的胰岛素前药类似物和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，优选所述胰岛素前药类似物的纯度水平为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。这类组合物可含有本文公开的A19胰岛素类似物，其浓度为至少0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml或更高。在一个实施方案中，药物组合物包含经过灭菌并任选装入各种包装容器中保存的含水溶液剂。在其它实施方案中，药物组合物包含冻干粉末。药物组合物可进一步作为试剂盒的部分包装，所述试剂盒包括用于将组合物施用给患者的一次性装置。容器或试剂盒可贴上在环境室温下保存或在冷冻温度下保存的标签。
根据一个实施方案，提供调节胰岛素依赖性患者的血糖水平的改进方法。该方法包括按对控制糖尿病治疗有效的量施用本公开内容的胰岛素前药类似物的步骤。在一个实施方案中，将胰岛素前药类似物用分子量范围为约5,000至约40,000道尔顿的PEG链聚乙二醇化。
附图说明
图1是制备人胰岛素的两步合成策略的示意图。该方法的详情提供于实施例1中。
图2是比较合成人胰岛素相对于经纯化的天然胰岛素的胰岛素受体特异性结合的曲线图。图中所提供的数据表明，两种分子具有相似的结合活性。
图3是比较天然胰岛素和A19胰岛素类似物(胰岛素(p-NH2-F)19)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图中所提供的数据表明，两种分子具有相似的结合活性。
图4是比较天然胰岛素和IGF1(YL)B16B17类似物的相对胰岛素受体结合的曲线图。图中所提供的数据表明，两种分子具有相似的结合活性。
图5是制备IGF1(YB16LB17)(p-NH2-F)A19类似物所用的合成方案示意图。
图6是比较IGF1(YB16LB17)(p-NH2-F)A19和IGF1(YB16LB17)(p-NH2-F)A19的二肽延伸形式的相对胰岛素受体结合的曲线图，其中二肽AibAla在A19位上结合(即IGF1(YB16LB17)A19-AibAla)。
图7A-7C给出按照本公开内容制备的二聚体的活性。图7A显示IGF-1单链二聚体的结构，该二聚体包含通过B链氨基端的侧链间的二硫键连接在一起的2条单链IGFB16B17衍生肽(IGF-1B链[C0H5Y16L17O22]-A链[O9,14,15N18,21]；SEQIDNO:68)。图7B为显示胰岛素、IGF-1、单链IGFB16B17衍生肽二聚体和二链IGFB16B17衍生肽二聚体的相对胰岛素受体结合的曲线图。图7C为显示胰岛素、IGF-1和二链IGFB16B17衍生肽二聚体诱导胰岛素受体磷酸化的相对活性的曲线图。
图8A-8C显示前药形式的IGFB16B17衍生肽(IGF1A(Ala)6,7,11,20酰胺的(pNH2-F)19上的Aib-Pro)的降解。将二肽在PBS(pH7.4，37℃)中温育预定长度的时间。在开始温育后20分钟(图8A)、81分钟(图8B)和120分钟(图8C)取出等分量，用0.1%TFA淬灭并用分析型HPLC测定。用LC-MS鉴定a峰(IGF1A(Ala)6,7,11,20(pNH2-F)1酰胺)和b峰(IGF1A(Ala)6,7,11,20(Aib-Pro-pNH-F)19酰胺)，并通过峰面积积分来定量。数据表明IGF1A(Ala)6,7,11,20(Aib-Pro-pNH-F)19酰胺随时间自发非酶促地转化成IGF1A(Ala)6,7,11,20(pNH2-F)1酰胺。
图9A和图9B为表示前药Aib,dPro-IGF1YL(通过A194-氨基Phe连接的二肽)的体外活性的曲线图。图9A是比较在PBS中温育的天然胰岛素(于4℃下在1小时时测定)和A19IGF前药类似物(Aib,dPro-IGF1YL)随时间变化(0小时、2.5小时和10.6小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图9B是比较在20%血浆/PBS中温育的天然胰岛素(于4℃下在1.5小时时测定)和A19IGF前药类似物(Aib,dPro-IGF1YL)随时间变化(0小时、1.5小时和24.8小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图中所提供的数据表明，随着前药形式转化成活性IGF1YL肽，从A19IGF前药类似物样品恢复的活性渐增。
图10A和图10B为描述前药dK,(N-异丁基G)-IGF1YL(其中二肽dK,(N-异丁基G)经由酰胺键与胰岛素类似物的A194-氨基Phe连接)的体外活性的曲线图。图10A是比较在PBS中温育的天然胰岛素(在4℃下于1小时时测定)和A19IGF前药类似物(IGF1YL:dK,(N-异丁基G)随时间变化(0小时、5小时和52小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图10B是比较在20%血浆/PBS中温育的天然胰岛素(于4℃下在1.5小时时测定)和A19IGF前药类似物(IGF1YL:dK,(N-异丁基G)随时间变化(0小时、3.6小时和24.8小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图中所提供的数据表明，随着前药形式转化成活性IGF1YL肽，从A19IGF前药类似物样品恢复的活性渐增。
图11A和图11B为描述前药dK(e-乙酰基),Sar)-IGF1YL(其中酰化二肽dK(e-乙酰基),Sar)经由酰胺键与胰岛素类似物的A194-氨基Phe连接)的体外活性的曲线图。图11A是比较在PBS中温育的天然胰岛素(于4℃下在1小时时测定)和A19IGF前药类似物(IGF1YL:dK(e-乙酰基),Sar)随时间变化(0小时、7.2小时和91.6小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图11B是比较在20%血浆/PBS中温育的天然胰岛素(于4℃在1.5小时时测定)和A19IGF前药类似物(IGF1YL:dK(e-乙酰基),Sar)随时间变化(0小时、9小时和95小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图中所提供的数据表明，随着前药形式转化成活性IGF1YL肽，从A19IGF前药类似物样品恢复的活性渐增。
图12的曲线图对比了天然胰岛素异源双链体、和IGF-1A和B链异源双链体、和单链IGF-1类似物的相对胰岛素受体结合，其中B链的羧基端与IGF-1A链的N端直接连接。
图13的曲线图对比了天然胰岛素异源双链体、IGF-1、IGF-1δ异源双链体、和单链IGF-1δ单链类似物的相对胰岛素受体结合，其中B链的羧基端通过肽接头与IGF-1A链的N端连接，所述肽接头由序列GYGSSSOR(SEQIDNO:69)组成，其中所述IGF-1δ类似物包含具有下述氨基酸置换的天然IGF-1序列：HA8、OA9、OA14、OA15、QA17、NA21、YB16、LB17、OB22。
图14的条形图描绘了单链胰岛素类似物在IGF-1受体或A或B亚型胰岛素受体处的相对体外结合活性，其中天然胰岛素B链的羧基端经由IGF-1C肽或IGF-1C肽的不同衍生物与天然胰岛素A链的氨基端连接。在B0C1A0胰岛素类似物命名法中，B0和A0命名表示A和B链的胰岛素序列，而C1是指IGF-1C肽。数据表明，经由IGF-1C肽将B链连接至A链的单链胰岛素类似物是一种有效的胰岛素激动剂。此外，2位修饰(例如，用丙氨酸置换天然酪氨酸)，或可替换地删除IGF-1C连接肽的最后4个氨基酸，会产生高效能的胰岛素选择性的单链胰岛素类似物。
图15的条形图描绘了式B0C1A0的单链胰岛素类似物在IGF-1受体或A或B亚型胰岛素受体处的相对体外结合活性，其中IGF-1C连接肽的天然序列已经通过在1、2、3、4或8位处的指定氨基酸置换进行修饰。在B0C1A0胰岛素类似物命名法中，B0和A0命名表示A和B链的胰岛素序列，而C1是指IGF-1C肽。
图16的条形图描绘了单链B0C1A0胰岛素类似物在A亚型胰岛素受体处的相对体外结合活性和磷酸化活性。相对于不同的氨基酸置换或缺失，对比了天然IGF-1C肽(010)的活性。在B0C1A0胰岛素类似物命名法中，B0和A0命名表示A和B链的胰岛素序列，而C1是指IGF-1C肽。
图17的曲线图表明，与包含胰岛素A链的胰岛素类似物相比，包含IGF-1A链的胰岛素类似物对特定胰岛素降解酶(IDE)的降解的抗性增强。
图18的曲线图显示了IGF-1、胰岛素和胰岛素/IGF嵌合体的诱导体外细胞增殖的相对活性。结果表明，IGF-1单链胰岛素类似物的相关胰岛素活性与天然IGF-1的相关增殖活性没有关联。
图19A-19B显示了前药MIU-29（B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(aF19-dLys(Ac),NLeu)）的活性。图19A表明，体外胰岛素受体结合随着在37℃的PBS缓冲液中离体温育MIU-29的时间增加而增加，并表现出约4.4小时的半衰期。图19B的曲线图显示了在二肽前药元件处酰化的前药二链胰岛素类似物(MIU-29:[B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(aF19-dLys(Ac),NLeu)]与它的母体胰岛素类似物(MIU-27:[B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(aF19-NH2)]相比在正常小鼠中进行的比较性胰岛素耐量试验的结果。前药衍生物MIU-29包含在A19位处的4-氨基-苯丙氨酸置换，其中二肽dLys(Ac),NLeu已经共价连接在A19残基的4-氨基位置处，且所述二肽元件的赖氨酸的侧链已经被C14脂肪酸酰化。该二肽将在生理条件下自发裂解（auto-cleave），半衰期为大约4.4小时。在离体温育MIU-2924小时以后，将得到的化合物(命名为“MIU-29c”)施用给小鼠，并将它的降血糖能力与母体化合物进行对比。图12表明，两种化合物的表现几乎相同。
图20A和图20B显示了从胰岛素前药类似物MIU-30a（B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(dLys(Ac),Sar-aF19)(其中酰化二肽dLys(Ac),Sar经由酰胺键与胰岛素类似物的A194-氨基Phe连接)）的比较性胰岛素耐量试验得到的结果。据估测，所述前药的半衰期为大约20小时。图20A所示的数据揭示，母体化合物具有低效能，但是在20%血浆中温育48小时(产生“MIU-30c”)以后，效能增加。●=媒介物对照，▼=MIU30a，90nm/kg；▽=MIU30c，90nm/kg；◆=MIU30a，270nm/kg；◇=MIU30c，270nm/kg。类似地，图20B显示了在C57黑鼠（C57/Blkmice）中8小时以后的血糖AUC，表明化合物的效能随施用之前在体外温育的时间增加而增加。
图21的曲线图描绘了酰化胰岛素类似物MIU46（B1(H5,10Y16,L17,Y25,K29-C14)28a:A1(N18,21,aF19NH2)）与它的未酰化对应物(MIU-45)和天然胰岛素相比的体外活性。所述酰化胰岛素包含在A19位处的4-氨基-苯丙氨酸置换和在B29位处的赖氨酸置换，其中B29赖氨酸的侧链已经被C14脂肪酸酰化。所述酰化类似物具有比母体化合物降低的效能。
图22的曲线图描绘了酰化的前药MIU42（B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(dLys(rE-C14),Sar-aF19)(其中二肽前药元件的氨基酸被酰化，连接在谷氨酸接头的γ位“rE”处)）相对于在30%ACN/PBS（pH7.4，37℃）中离体温育的时间的体外活性。数据表明，随着离体温育时间增加，活性恢复至母体化合物MIU42。
图23A-23D提供了得自Detemir和酰化胰岛素类似物MIU-46的比较性胰岛素耐量试验的数据，所述试验使用C57黑鼠。酰化衍生物MIU46（B1(H5,10Y16,L17,Y25,K29-C14)28a:A1(N18,21,aF19NH2)）包含在29位处的赖氨酸置换，其已经通过γ谷氨酸间隔物被C14脂肪酸酰化。图23A-23D表明，酰化类似物MIU-46与Detemir相比不是非常有效。
图24是一个聚乙二醇化胰岛素前药实施方案的一般结构，其中20kDaPEG通过接头与B链的N端α胺连接，且A链包含在A19位处的4-氨基苯丙氨酸置换，其中二肽(AA1,AA2)经由酰胺键与4-氨基苯丙氨酸的4-氨基连接。在一个实施方案中，二肽(AA1,AA2)是正亮氨酸、d赖氨酸(酰化)。
图25是用于制备图24的一般结构的合成方案的示意图。该合成的详情提供于实施例15中。
图26和图27的曲线图显示了基于磷酸化测定法的不同前药化合物(具有图24的通用结构)在胰岛素A亚型受体(图26)和B亚型受体(图27)受体处的体外活性。试验化合物是：天然胰岛素(■)，B1Aoa2(H5,H10,Y16,L17)25a:A1(pNH2-F19,N18,N21(●，具有氨基氧乙酰基(Aoa)接头，但是没有PEG，也没有在A19处的二肽)，B1PEG-Aoa2(H5,H10,Y16,L17)25a:A1(pNH2-F19dLys(rE-C14),Sar-aF19,N18,N21(▲，具有N端20kDaPEG，但是没有在A19处的二肽)，B1PEGAoa2(H5,H10,Y16,L17)25a:A1(dLys(rE-C14),βAla-aF19,N18,N21(▼，具有N端20kDaPEG和在A19处的难以裂解的二肽(dLys(rE-C14),βAla))，B1PEGAoa2(H5,H10,Y16,L17)25a:A1(dLys(rE-C14),Nleu-aF19,N18,N21(◆，具有N端20kDaPEG和在A19处的自裂解的二肽(dLys(rE-C14),Nleu)，在没有温育步骤的情况下施用)，和B1PEGAoa2(H5,H10,Y16,L17)25a:A1(dLys(rE-C14),Nleu-aF19,N18,N21(t，具有N端20kDaPEG和在A19处的自裂解的二肽(dLys(rE-C14),Nleu)，在PBS中温育78小时以后施用)。图19A和图19B表明，二肽dLys(rE-C14),Nleu将在生理条件下自发裂解，半衰期为大约4.4小时。
发明详述
定义
在描述和要求保护本发明时，将根据下文给出的定义使用下列术语。
将本文使用的术语“前药”定义为在显示其药理作用之前经历化学修饰的任何化合物。
“生物活性多肽”是指能够在体外和/或体内施加生物作用的多肽。
本文使用的术语“氨基酸”包括既含氨基官能团又含羧基官能团的任何分子，其中氨基和羧酸基连接至同一碳(α碳)上。α碳任选可具有一个或两个其它的有机取代基。未说明其立体化学的情况下对氨基酸的命名意在包括L型或D型氨基酸或外消旋混合物。然而，在氨基酸通过其三个字母代码命名并包括上标数字的情况下，通过在三个字母代码和上标数字之前加上小写字母d来指定D型氨基酸(例如dLys-1)，其中缺乏小写字母d的命名(例如Lys-1)意在说明天然L型氨基酸。在该命名法中，加上上标数字表明氨基酸在IGF肽序列中的位置，其中位于IGF序列内的氨基酸用从N端起连续编号的正的上标数字标示。在N端或通过侧链与IGF肽连接的其它氨基酸从0开始编号，并随着其更远离IGF序列，以负整数值递增。例如，与IGF的N端连接的二肽前药内的氨基酸位置标为aa-1-aa0-IGF，其中aa0表示二肽的羧基端氨基酸，并且aa-1表示二肽的氨基端氨基酸。
本文使用的术语“羟酸”是指已经修饰以用羟基代替α碳氨基的氨基酸。
本文使用的术语“非编码氨基酸”包括不是任何下列20种氨基酸的L-异构体的任何氨基酸：Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr。
“二肽”是α氨基酸或α羟酸通过肽键与另一个氨基酸连接形成的化合物。
本文使用的不存在任何其它指称的术语“化学裂解”包括导致共价化学键断裂的非酶促反应。
“生物活性多肽”是指能够在体外和/或体内施加生物作用的多肽。
本文所用对肽的一般提及意在包括具有修饰的氨基端和羧基端的肽。例如，标明标准氨基酸的氨基酸序列意在包括在N端和C端处的标准氨基酸以及在N端处相应的羟酸和/或经修饰包含替换末端羧酸的酰胺基的相应的C端氨基酸。
本文使用的“酰化的”氨基酸是包含对天然存在的氨基酸而言是非天然的酰基的氨基酸，与其制备方法无关。产生酰化氨基酸和酰化肽的示例性方法是本领域已知的，该方法包括在包含入肽前使氨基酸酰化或在肽合成之后接着对肽进行化学酰化。在一个实施方案中，酰基导致肽具有一种或多种以下性质：(i)循环中的半衰期延长、(ii)起效延迟、(iii)作用持续时间延长、(iv)对蛋白酶(例如DPP-IV)的抗性改进，和(v)对胰岛素肽受体的效能增加。
本文使用的“烷基化的”氨基酸是包含对天然存在的氨基酸而言是非天然的烷基的氨基酸，与其制备方法无关。产生烷基化氨基酸和烷基化肽的示例性方法是本领域已知的，该方法包括在包含入肽前使氨基酸烷基化或肽合成之后接着对肽进行化学烷基化。在不固守任何特定理论的情况下，据信肽的烷基化将获得与肽的酰化相似(如果不是相同的话)的作用，例如循环中的半衰期延长、起效延迟、作用持续时间延长、对蛋白酶(例如DPP-IV)的抗性改进和对胰岛素肽受体效能增加。
本文使用的术语“药学上可接受的载体”包括任何标准的药用载体，例如磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂(例如水包油或油包水乳剂)和各种类型的润湿剂。该术语还包括美国联邦政府管理机构批准或美国药典录入的用于动物(包括人)的任何试剂。
本文使用的术语“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的生物活性的化合物的盐，并且其在生物学或其它方面不是不合乎需要的。本文公开的许多化合物能够通过氨基和/或羧基或其类似基团的存在而形成酸式盐和/或碱式盐。
可由无机和有机碱制备药学上可接受的碱加成盐。仅作为实例，由无机碱得到的盐包括钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐和镁盐。由有机碱得到的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐。
可由无机和有机酸制备药学上可接受的酸加成盐。由无机酸得到的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等的盐。由有机酸得到的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等的盐。
本文使用的术语“治疗”包括预防特定的病症或病况，或减轻特定病症或病况的相关症状和/或防止或消除所述症状。例如，本文使用的术语“治疗糖尿病”总的来说是指保持葡萄糖血液水平接近正常水平，并可根据既定情况，包括提高或降低血糖水平。
本文使用的“有效的”量或“治疗有效量”的前药是指无毒但足量的前药以提供所需作用。例如一种所需要的作用将会是预防或治疗高血糖症。“有效”量在受试者之间不同，这取决于个体的年龄和一般状况、给药方式等。因此，并非总是能指定确切的“有效量”。然而，在任何个体情况下，本领域普通技术人员采用常规实验可确定合适的“有效”量。
术语“胃肠外”意指不通过消化道但通过某些其它途径，例如鼻内、吸入、皮下、肌内、脊柱内或静脉内。
本文使用的术语“天然胰岛素肽”意在表示包含A链SEQIDNO:1和B链SEQIDNO:2的51个氨基酸异源二聚体以及包含SEQIDNO:1和2的单链胰岛素类似物。本文使用的缺乏更多描述性语言的术语“胰岛素肽”意在包括包含A链SEQIDNO:1和B链SEQIDNO:2的51个氨基酸异源二聚体及其单链胰岛素类似物(包括例如已公布的国际申请WO96/34882和美国专利号6,630,348中公开的单链胰岛素类似物，其公开内容通过引用结合到本文中)，以及包括包含天然A链和/或B链的修饰衍生物的异源二聚体和单链类似物，所述修饰衍生物包括A19、B16或B25位上的氨基酸被修饰成4-氨基苯丙氨酸，或者一个或多个选自以下位置的氨基酸置换：A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B21、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30，或者B1-4和B26-30位置中的任何或全部的缺失。本文使用的“胰岛素前药类似物”是指在干扰胰岛素的活性或基于IGF1的胰岛素类似物的活性(例如与胰岛素和IGF-1受体相互作用的能力)的位置上，已经通过经由酰胺键共价连接二肽来修饰的胰岛素肽(或实施例9中公开的基于IGF1的胰岛素类似物)。
本文使用的术语“单链胰岛素类似物”包括一组结构上相关的蛋白质，其中胰岛素A和B链共价连接。
本文使用的氨基酸“修饰”是指氨基酸的置换、添加或缺失，或者通过在/从氨基酸上添加和/或除去化学基团而对氨基酸的衍生，包括用任何通常存在于人蛋白质中的20种氨基酸以及非典型的或非天然存在的氨基酸置换或添加。非典型氨基酸的商业来源包括Sigma-Aldrich(Milwaukee,WI),ChemPepInc.(Miami,FL)和GenzymePharmaceuticals(Cambridge,MA)。非典型氨基酸可购自商业供应商、从头合成、或者由天然存在的氨基酸进行化学修饰或衍生化。
本文使用的氨基酸“置换（或取代）”是指一种氨基酸残基被不同的氨基酸残基置换（或取代）。在本申请全文中，所有通过字母和数字提及的具体氨基酸位置(例如A5位)是指在各自天然人胰岛素A链(SEQIDNO:1)或B链(SEQIDNO:2)中A链(例如A5位)或B链(例如B5位)的该位置上的氨基酸，或其任何类似物中相应的氨基酸位置。例如，本文缺乏任何更多详尽描述提及的“B28位”将意指其中已经缺失了SEQIDNO:2的第一个氨基酸的胰岛素类似物B链相应的B27位。
将本文使用的术语“保守氨基酸置换”在此定义为在下列5组之一内的互换：
I.小的脂族非极性或略有极性的残基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II.极性带负电荷的残基及其酰胺：
Asp、Asn、Glu、Gln；
III.极性带正电荷的残基：
His、Arg、Lys、鸟氨酸(Orn)；
IV.大的脂族非极性残基：
Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮氨酸(Nle)、高半胱氨酸；
V.大的芳族残基：
Phe、Tyr、Trp、乙酰基苯丙氨酸。
本文使用的通用术语“聚乙二醇链”或“PEG链”是指呈支链或直链的环氧乙烷和水的缩聚物的混合物，用通式H(OCH2CH2)nOH表示，其中n至少为9。缺乏任何更多描述的该术语意在包括平均总分子量范围为500-80,000道尔顿的乙二醇聚合物。“聚乙二醇链”或“PEG链”与数字后缀联用以表示其大致平均分子量。例如，PEG-5,000是指总分子量平均为约5,000道尔顿的聚乙二醇链。
本文使用的术语“聚乙二醇化的”和类似术语是指已通过将聚乙二醇链与化合物连接对其天然状态进行修饰的化合物。“聚乙二醇化多肽”是具有与多肽共价结合的PEG链的多肽。
本文使用的“接头”是使两个独立的实体彼此结合的键、分子或分子的基团。接头可为两个实体提供最佳间隔，或者还可提供使两个实体彼此分开的不稳定连接。不稳定连接包括光可裂解基团、酸不稳定部分、碱不稳定部分和酶可切割基团。
本文使用的“胰岛素二聚体”是包含2个胰岛素肽通过接头彼此共价结合的复合体。在缺乏任何限定性语言下使用时，术语胰岛素二聚体既包括胰岛素同源二聚体又包括胰岛素异源二聚体。胰岛素同源二聚体包含2个相同的亚基(各自包含A链和B链)，而胰岛素异源二聚体包含2个不同的亚基，尽管2个亚基彼此大致相似。
本文使用的术语“C1-Cn烷基”(其中n可为1-6)表示具有一个至指定数目的碳原子的支链或直链烷基。通常C1-C6烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。
本文使用的术语“C2-Cn烯基”(其中n可为2-6)表示具有2个至指定数目的碳原子和至少一个双键的烯属不饱和支链或直链基团。这类基团的实例包括但不限于1-丙烯基、2-丙烯基(-CH2-CH=CH2)、1,3-丁二烯基、(-CH=CHCH=CH2)、1-丁烯基(-CH=CHCH2CH3)、己烯基、戊烯基等。
术语“C2-Cn炔基”(其中n可为2-6)是指具有2-n个碳原子和至少一个三键的不饱和支链或直链基团。这类基团的实例包括但不限于1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基等。
本文使用的术语“芳基”是指具有一个或两个芳环的单环或二环碳环***，包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。通过指明碳存在的数目来表示芳环的大小和取代基或连接基团的存在。例如，术语“(C1-C3烷基)(C6-C10芳基)”是指通过1-3元烷基链与母体部分连接的5-10元芳基。
本文使用的术语“杂芳基”是指含有一个或两个芳环并在芳环中含有至少一个氮、氧或硫原子的单环或二环环系。通过指明碳存在的数目来表示杂芳环的大小和取代基或连接基团的存在。例如，术语“(C1-Cn烷基)(C5-C6杂芳基)”是指通过1-“n”元烷基链与母体部分连接的5或6元杂芳基。
术语“C3-Cn环烷基”是指包含碳和氢原子的非芳族单环或多环，其下标数字表示碳原子存在的数目。例如术语C3-C8环烷基表示环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基化合物。
术语“C3-Cn杂环基”是指含有1-“n-1”个杂原子的环烷基环系，其中杂原子选自氧、硫和氮。例如措词“5元杂环”或“C5杂环”包括但不限于具有一个杂原子的5元杂环(例如噻吩、吡咯、呋喃)；在1、2或1、3位具有两个杂原子的5元杂环(例如噁唑、吡唑、咪唑、噻唑、嘌呤)；具有3个杂原子的5元杂环(例如***、噻二唑)。
本文使用的术语“C3-Cn元环”是指包含共3-“n”个数目的彼此连接形成环的元素的饱和或不饱和烃环结构，其中环元素选自C、O、S和N。该术语意在包括环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。
本文使用的术语“卤素”是指由氟、氯、溴和碘组成的群组中的一个或多个成员。
本文使用的无更多规定的术语“患者”意在包括任何家养的温血脊椎动物(包括例如但不限于家畜、马、猫、狗和其它宠物)和人。
实施方案
本公开内容提供配制成延迟起效和延长胰岛素肽的半衰期，从而改进基础胰岛素肽的治疗指数的胰岛素前药衍生物。本文公开的胰岛素前药化学允许通过非酶促降解机制活化前药。所公开的前药化学可与活性部位胺化学缀合形成酰胺，酰胺在二酮哌嗪形成时复原成为母体胺并释放前药元件。这种新的生物友好型前药化学在生理条件(例如pH约7，在37℃，在水性环境中)下自发降解，而且不依赖于酶促降解。前药衍生物的持续时间取决于二肽前药序列的选择，因此为前药制剂提供了灵活性。
在一个实施方案中，提供在生理条件下非酶促活化半衰期(t1/2)介于1-100小时之间的前药。本文公开的生理条件意在包括温度为约35-40℃，pH为约7.0至约7.4，更通常包括水性环境中pH为7.2-7.4，温度为36-38℃。在一个实施方案中，在生理条件下能够经历二酮哌嗪形成的二肽通过酰胺键与胰岛素肽共价连接。
有利的是，裂解(并且由此活化前药)速率取决于二肽前部分(pro-moiety)的结构和立体化学，还取决于亲核体的强度。本文公开的前药最终将以化学法转化成可被该药物的天然受体识别的结构，其中该化学转化的速度将决定体内生物作用的开始时间和持续时间。本申请公开的前药化学有赖于不依赖额外化学添加剂或酶的分子内化学反应。转化速度受二肽取代基的化学性质及其在生理条件下的裂解的控制。由于生理pH和温度紧紧地在严格限定的范围内调节，因此前药至药物的转化速度将表现出高的患者内和患者间再现性。
如本文所公开，提供前药，其中生物活性多肽具有至少1小时、更通常大于20小时但小于100小时的延长半衰期，并且在生理条件下，通过由固有的化学不稳定性驱动的非酶促反应而转变为活性形式。在一个实施方案中，前药的非酶促活化t1/2时间介于1-100小时之间，更通常介于12小时和72小时之间，而在一个实施方案中，通过将前药在37℃和pH7.2下的磷酸盐缓冲溶液(例如PBS)中温育测定的t1/2介于24-48小时之间。运用公式t1/2=.693/k，其中‘k’为前药降解的一级速率常数，来计算各种前药的半衰期。在一个实施方案中，前药的活化在酰胺键连接的二肽裂解，并形成二酮哌嗪或二酮吗啉和活性胰岛素肽之后发生。
已经证实由天然或合成氨基酸组成的特定二肽在生理条件下促进分子内分解以释放活性胰岛素肽。二肽可与存在于天然胰岛素上的氨基或者与通过天然胰岛素肽修饰而引入胰岛素肽中的氨基连接(通过酰胺键)。在一个实施方案中，选择抗存在于哺乳动物血清中的肽酶(包括例如二肽基肽酶IV(DPP-IV))切割的二肽结构。因此，在一个实施方案中，与蛋白酶不存在时进行的反应相比，在血清蛋白酶存在下利用生理条件进行反应时，二肽前药元件从生物活性肽(例如，胰岛素肽(Q))中的裂解速率不显著提高(例如大于2X)。因此二肽前药元件自胰岛素肽的裂解半衰期(在生理条件下的PBS中)不超过在包含DPP-IV蛋白酶的溶液中二肽前药元件自胰岛素肽的裂解半衰期的2、3、4或5倍。在一个实施方案中，包含DPP-IV蛋白酶的溶液为血清，更具体地讲为哺乳动物血清，包括人血清。
根据一个实施方案，二肽前药元件包含结构U-O，其中U为氨基酸或羟酸，并且O为N-烷基化氨基酸。在一个实施方案中，U、O或U-O与之连接的胰岛素肽的氨基酸为非编码氨基酸。在一个实施方案中，U和/或O为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈D立体异构体构型的氨基酸，而O为呈L立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈L立体异构体构型的氨基酸，而O为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一些示例性的实施方案中，U为呈D立体异构体构型的氨基酸，而O为呈D立体异构体构型的氨基酸。在一个实施方案中，O为N-烷基化氨基酸但不是脯氨酸。在一个实施方案中，氨基酸O的N-烷基化基团为C1-C18烷基，并且在一个实施方案中，N-烷基化基团为C1-C6烷基。在一个实施方案中，U-O为包含本文定义的式I结构的二肽。
在一个实施方案中，二肽在选自A链或B链的N端氨基的氨基上或者在存在于胰岛素肽活性部位的氨基酸的侧链氨基上与胰岛素肽连接。根据一个实施方案，二肽延伸物通过存在于或接近活性部位的赖氨酸残基的侧链胺与胰岛素肽共价连接。在一个实施方案中，二肽延伸物通过合成氨基酸或修饰氨基酸连接，其中合成氨基酸或修饰氨基酸具有适于二肽延伸物共价连接的官能团(例如氨基-苯丙氨酸的芳族胺)。根据一个实施方案，二肽在选自A链或B链的N端氨基的氨基上或者在存在于A19、B16或B25位的芳族胺(例如4-氨基-苯丙氨酸残基)的侧链氨基上与胰岛素肽连接。在一个实施方案中，U-O二肽通过存在于A19位的4-氨基苯丙氨酸在A19位连接。
将二肽前药元件设计成在生理条件下和在缺乏酶活性时自发裂解其酰胺键形成胰岛素类似物。在一个实施方案中，二肽延伸物的N端氨基酸包含C-烷基化氨基酸(例如氨基异丁酸)。在一个实施方案中，二肽的C端氨基酸包含N-烷基化氨基酸(例如脯氨酸或N-甲基甘氨酸)。在一个实施方案中，二肽包含N端C-烷基化氨基酸和随后的N-烷基化氨基酸的序列。
申请人已经发现，在A链19位上的天然酪氨酸上可以容纳选择性***的4-氨基苯基氨基酸部分而又不损失胰岛素肽的效能(参见图3)。该活性部位氨基随后用本文公开的二肽前药部分进行的化学酰胺化显著降低胰岛素受体结合活性，从而提供胰岛素的合适前药(参见图6，给出IGF1Y16L17(p-NH2-F)A19类似物的数据，已证实该类似物具有与胰岛素(p-NH2-F)A19相当的活性，参见图4)。因此，在一个实施方案中，二肽前药元件通过酰胺键与A194-氨基苯丙氨酸的芳环连接，其中二肽的C端氨基酸包含N-烷基化氨基酸，而二肽的N端氨基酸为任何氨基酸。
二肽前药部分还可与胰岛素肽的其它部位连接以制备胰岛素的前药或长效类似物(depotanalog)。根据一个实施方案，提供胰岛素前药/长效类似物，其包含A链、B链和通过酰胺键与选自以下的一个或多个位点连接的二肽：A链或B链的N端氨基或者内部氨基酸的侧链氨基，包括例如与存在于A19、B16或B25位上的4-氨基-苯丙氨酸残基的芳族胺连接的二肽。在一个实施方案中，胰岛素肽包含两个二肽元件，其中二所述肽元件任选聚乙二醇化、烷基化、酰化或与长效聚合物(depotpolymer)连接。在一个实施方案中，二肽包含后接N-烷基化氨基酸的N端C-烷基化氨基酸。
包含胰岛素前药类似物的A链和B链可包含各自肽的天然序列(即SEQIDNO:1和SEQIDNO:2)，或者可包含SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2的衍生物，其中所述衍生物包括将A19、B16或B25位上的氨基酸修饰成4-氨基苯丙氨酸和/或一个或多个选自以下位置的氨基酸置换：A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18、A19和A21、B1、B2、B3、B4、B5、B9、B10、B13、B14、B17、B20、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30；或者在B1-4和B26-30位置中的任何或全部的缺失。在一个实施方案中，二肽前药元件与A链或B链的N端氨基连接，其中二肽前药元件的C端氨基酸包含N-烷基化氨基酸，而二肽前药元件的N端氨基酸为任何氨基酸，前提条件是，如果二肽的C端氨基酸为脯氨酸，则二肽的N端氨基酸包含C-烷基化氨基酸。
在一个实施方案中，二肽前药元件包含下式I的通用结构：
其中
R1、R2、R4和R8独立地选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W)C1-C12烷基，其中W为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自H和OH，前提条件是，如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环，则R1和R2两者都不为H。
在另一个实施方案中，二肽前药元件包含以下通用结构：
其中
R1和R8独立地为H或C1-C8烷基；
R2和R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C3-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)SH、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代，前提条件是，如果式I的二肽通过某一肽的N端胺连接，且R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环，则R1和R2两者都不为H。在一个实施方案中，二肽前药元件的第一氨基酸和/或第二氨基酸为呈D立体异构体构型的氨基酸。
在一个实施方案中，提供式I的前药元件，其中R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C8环烷基环；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R7选自H和OH，并且R8为H。在一个实施方案中，R3为C1-C8烷基，并且R4选自H、C1-C6烷基、CH2OH、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环。在另一个的实施方案中，R5为NHR6，并且R8为H。
在另一个实施方案中，提供式I的前药元件，其中
R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C8环烷基环；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代；并且R8为H，前提条件是，如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环，则R1和R2两者都不为H。在一个实施方案中，二肽前药元件的第一氨基酸和/或第二氨基酸为非编码氨基酸，并且在一个实施方案中为呈D立体异构体构型的氨基酸。
在其它实施方案中，二肽前药元件具有式I的结构，其中
R1和R8独立地为H或C1-C8烷基；
R2和R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C3-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；
R3为C1-C18烷基；
R5为NHR6；
R6为H或C1-C8烷基；
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代，并且R8为H。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式I的结构，其中
R1和R2独立地为C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；或R1和R2通过-(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NH2；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式I的结构，其中
R1和R2独立地选自氢、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或者R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立地选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2；和
R7选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代，前提条件是，R1和R2两者都不为氢，且前提条件是R4或R8中的至少一个为氢。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式I的结构，其中
R1和R2独立地选自氢、C1-C8烷基和(C1-C4烷基)NH2，或者R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C8烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4选自氢和C1-C8烷基；
R8为氢；和
R5为NH2，前提条件是，R1和R2两者都不为氢。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式I的结构，其中
R1和R2独立地选自氢、C1-C8烷基和(C1-C4烷基)NH2；
R3为C1-C6烷基；
R4和R8各自为氢；和
R5为NH2，前提条件是，R1和R2两者都不为氢。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式I的结构，其中
R1和R2独立地选自氢和C1-C8烷基、(C1-C4烷基)NH2，或者R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C8烷基；
R4为(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2；
R7选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)OH；和
R8为氢，前提条件是，R1和R2两者都不为氢。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式I的结构，其中
R1选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R2为氢；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代，前提条件是，如果R1为烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，则R1和R5与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环。
根据一个实施方案，提供包含胰岛素肽和酰胺连接的二肽的胰岛素前药类似物。更具体地讲，胰岛素前药类似物包含A链序列和B链序列，其中A链包含序列Z-GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3-R13(SEQIDNO:3)或者其类似物，该类似物包含因1-9、1-5或1-3个选自以下位置的氨基酸修饰而不同于SEQIDNO:3的序列：A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18(相对于天然胰岛素A链)，并且B链序列包含序列J-X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)或者其类似物，该类似物包含因1-10、1-5或1-3个选自以下位置的氨基酸修饰而不同于SEQIDNO:14序列的序列：B1、B2、B3、B4、B5、B13、B14、B17、B20、B22、B23、B26、B27、B28、B29和B30(相对于天然胰岛素B链；即SEQIDNO:14的氨基酸X4相当于天然胰岛素的B5位)。Z和J独立地为H或包含下式I的通用结构的二肽：
。
X14或为将“J”元件与X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)序列连接的键，或者X14表示选自以下的将“J”元件与X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)序列连接的1-4个氨基酸的序列：X9VNQ(SEQIDNO:21)、VNQ、NQ和Q。
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中m为选自0-3的整数，并且X选自OH、NH2、NHR10和OCH3，其中R10为H或包含下式I的通用结构的二肽：
；
X3选自天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
其中m为选自0-3的整数，并且X12选自OH、NH2、NHR11和OCH3，其中R11为H或包含下式I的通用结构的二肽：
；
X8为组氨酸、精氨酸或以下通用结构的氨基酸
其中m为选自0-3的整数，并且X13选自H、OH、NH2、NHR12和OCH3，其中R12为H或包含下式I的通用结构的二肽：
；
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；其中
R1、R2、R4和R8独立地选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W)C1-C12烷基，其中W为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自H和OH；和
R13为COOH或CONH2。在一个实施方案中X8为组氨酸、精氨酸或酪氨酸。在另一个实施方案中，X8为以下通用结构的氨基酸
。在一个实施方案中，R13为COOH，并且B链的羧基端氨基酸具有替代天然α碳羧基的酰胺(CONH2)。在一个实施方案中，X、X12、X13、J和Z中的一个或多个为包含下式I通用结构的二肽：
，而在一个实施方案中，X、X12、X13、J和Z中的两个包含下式I通用结构的二肽：
。根据一个实施方案，X、X12、X13、J和Z中的至少一个为包含下式I通用结构的二肽：
，而在一个实施方案中，X、X12、X13、J和Z中的一个并且只有一个包含下式I通用结构的二肽：
(即只有一个二肽前药元件与胰岛素肽连接)。此外，如果二肽前药元件与A链或B链的N端连接(即J或Z中的任一个包含二肽)，且R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环，则R1和R2中的至少一个不为H，而在一个实施方案中，R1和R2两者都不为H。在一个实施方案中，J和Z两者都为H，X12为OH，X13为H或OH，并且X为NHR10，其中R10为包含式I通用结构的二肽。在另一个实施方案中，A链包含序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3-R13(SEQIDNO:3)，B链序列包含序列X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)，m为1，X12为OH，X13为H或OH，X为NHR10，其中R10为包含式I通用结构的二肽，R13为COOH，并且B链的羧基端氨基酸具有替代天然α碳羧基的酰胺(CONH2)，其余指称如紧接的上文中所定义。
在一个实施方案中，存在于X、X12、X13、J和Z上的二肽为包含下式I通用结构的二肽：
其中
R1、R2、R4和R8独立地选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代，前提条件是，如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环，则R1和R2两者都不为H。本领域技术人员理解，如果W1为N，在生理条件下，氮原子也与H连接。在一个实施方案中，如果J或Z包含式I的二肽，且R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环，则R1和R2两者都不为氢。
在一个实施方案中，R1选自H和C1-C8烷基；
R2和R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R7选自H和OH，并且R8为H。根据另一个实施方案，m为1，R8为H，R3为C1-C6烷基，并且R4选自H、C1-C4烷基、(C3-C6)环烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH和(C0-C4烷基)(C6芳基)R7，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。在一个实施方案中，m为1，R8为H，R3为C1-C6烷基，并且R4选自H、C1-C4烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。在另一个实施方案中，X9为苯丙氨酸，且单个二肽延伸物通过与A链或B链N端连接的酰胺与胰岛素肽连接。在一个可替换的实施方案中，胰岛素肽包含在A链19位上的4氨基苯丙氨酸置换，且单个二肽延伸物通过在4氨基苯丙氨酸的芳族胺上形成的酰胺键与胰岛素肽连接。在一个实施方案中，本文公开的胰岛素类似物在A链和/或B链上包含C端酰胺或酯（替换C端羧酸酯（carboxylate））。
根据一个实施方案，将式I的二肽进一步修饰以包含大的聚合物，其干扰胰岛素类似物与胰岛素或IGF-1受体相互作用的能力。二肽随后裂解从二肽复合体中释放出胰岛素类似物，其中释放的胰岛素类似物具有完整活性。根据一个实施方案，J包含式I的二肽，其中将式I的二肽进一步修饰以包含大的聚合物，其干扰结合的胰岛素类似物与胰岛素或IGF-1受体相互作用的能力。根据一个实施方案，X、X12、X13、J和Z之一包含下式I通用结构的二肽：
，其中将式I的二肽聚乙二醇化、烷基化或酰化。在一个实施方案中，J、Z或X中的任一个包含式I的酰化或聚乙二醇化二肽，而在一个实施方案中，J包含式I的酰化或聚乙二醇化二肽。
在一个实施方案中，二肽前药元件在A链或B链的N端通过酰胺键与胰岛素肽共价结合，或者与携带内部氨基酸侧链的胺连接，其中二肽还包含与二肽连接的长效聚合物。在一个实施方案中，胰岛素肽的天然氨基酸被适于与式I的二肽形成酰胺键的氨基酸置换。在一个实施方案中，携带长效物（depot）的二肽在选自以下的位置上连接：A14、A19、B16、B28和B29。在一个实施方案中，两个或更多个长效聚合物与单个二肽元件连接。选择长效聚合物以具有生物相容性和足够大小，使得通过共价连接二肽修饰的胰岛素肽在施用患者时在注射部位保持屏蔽(sequestered)和/或不能够与其相应受体发生相互作用。二肽随后裂解释放出胰岛素肽以与预期靶标相互作用。
根据一个实施方案，长效聚合物选自本领域技术人员已知的生物相容性聚合物。长效聚合物的大小通常约为20,000-120,000道尔顿。在一个实施方案中，长效聚合物的大小为约40,000-100,000或约40,000-80,000道尔顿。在一个实施方案中，长效聚合物的大小为约40,000、50,000、60,000、70,000或80,000道尔顿。合适的长效聚合物包括但不限于葡聚糖、聚丙交酯、聚乙交酯、基于己内酯的聚合物、聚(己内酯)、聚酐、聚胺、聚酯酰胺（polyesteramides）、聚原酸酯、聚二氧杂环己酮、聚缩醛、聚缩酮、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸丁二酯、聚原碳酸酯、聚磷腈、琥珀酸酯、聚(苹果酸)、聚(氨基酸)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚羟基纤维素、多糖、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸及其共聚物、三元共聚物和混合物，以及生物可降解聚合物及其共聚物，包括基于己内酯的聚合物、聚己内酯和包括聚对苯二甲酸丁二酯的共聚物。在一个实施方案中，长效聚合物选自聚乙二醇、葡聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和乳酸与乙醇酸的共聚物，而在一个具体实施方案中，长效聚合物为聚乙二醇。在一个实施方案中，长效聚合物为聚乙二醇，且与二肽元件连接的长效聚合物（诸长效聚合物）的总的分子量为约40,000-80,000道尔顿。
根据一个实施方案，式I的二肽还包含聚环氧乙烷、烷基或酰基。在一个实施方案中，一条或多条聚环氧乙烷链与式I的二肽连接，其中聚环氧乙烷链的总的分子量为约20,000至约80,000道尔顿，或40,000-80,000道尔顿或40,000-60,000道尔顿。在一个实施方案中，聚环氧乙烷为聚乙二醇。在一个实施方案中，至少一条分子量约40,000道尔顿或约20,000道尔顿的聚乙二醇链与该式的二肽直接地或通过接头/间隔物连接。在另一个实施方案中，将式I的二肽用具有对于结合血清白蛋白而言足够大小的酰基酰化，从而在给药时使胰岛素类似物失活。酰基可以是直链或支链的，并且在一个实施方案中是C16-C30脂肪酸。例如，酰基可以是C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸或C30脂肪酸中的任一种。在一个实施方案中，酰基是C16-C20脂肪酸，例如C18脂肪酸或C20脂肪酸。
根据一个实施方案，提供提供包含A链序列和B链序列的胰岛素前药类似物，其中A链包含序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3-R13(SEQIDNO:3)，并且B链序列包含序列X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)，其中
X14选自将“J”元件与X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8-R14(SEQIDNO:14)序列连接的N端胺、X9VNQ(SEQIDNO:21)、VNQ、NQ和Q。
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中U为氨基酸或羟酸，并且O为通过酰胺键连接的N-烷基化氨基酸；
X3选自天冬酰胺、鸟氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
其中m为选自0-3的整数，并且X12选自OH、NH2和OCH3；
X8为以下通用结构的氨基酸
其中m为选自0-3的整数，并且X13选自H、OH、NH2和OCH3；
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；并且R13和R14独立地为COOH或CONH2。在一个实施方案中，X7和X8两者都为酪氨酸，R13为COOH，并且B链的羧基端氨基酸具有替代天然α碳羧基的酰胺(CONH2)。
根据一个实施方案，提供包含序列Z-GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)或其类似物的化合物，该类似物包含因1-3个选自以下位置的氨基酸修饰而不同于SEQIDNO:3的序列：A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18(相对于天然胰岛素A链序列)。在这个实施方案中，X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH、NH2、NHR10和OCH3，
而且其中R10和Z独立地为H或结构U-O的二肽，其中U为氨基酸或羟酸，并且O为N-烷基化氨基酸，其中O通过形成酰胺键与SEQIDNO:3的肽连接，前提条件是，R10和Z不同，且U、O或U-O与之连接的SEQIDNO:3的氨基酸为非编码氨基酸。在一个实施方案中，在生理条件下的PBS中，二肽从SEQIDNO:3中的化学裂解在约1小时至约720小时内完成至少约90%。在另一个实施方案中，在生理条件下的PBS中，U-O自SEQIDNO:3的化学裂解半衰期(t1/2)为至少约1小时至约1周。在一个实施方案中，化合物还包含通过分子间二硫键或作为重组单链多肽与SEQIDNO:3的A链连接的胰岛素B链。
二肽元件上的取代基和二肽前药元件的连接位点的选择可影响二肽前药元件从胰岛素肽上的化学裂解的速率。在一个实施方案中，提供包含A链序列和B链序列的胰岛素前药，其中A链包含序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)，并且B链序列包含序列X14-X4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFF(SEQIDNO:4)，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH、NH2和OCH3；
X3选自天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；和
X14选自键、X9VNQ(SEQIDNO:21)、VNQ、NQ和Q，并且X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸，而且其中包含以下结构的二肽前药元件与肽SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的N端氨基酸的α氨基连接：
前提条件是如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环，则R1和R2两者都不为氢。在这个实施方案中，提供在生理条件下的PBS中t1/2为约1小时的化合物，其中
R1和R2独立地为C1-C18烷基或芳基；或者R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；和
R5为胺。
在其它实施方案中，具有在N端连接的前药元件且t1/2为例如约1小时的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：
其中
R1和R2独立地为C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；或者R1和R2通过-(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NH2；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代。
可替换地，提供包含GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)的A链序列和X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)的B链序列的胰岛素前药，其中二肽前药元件与肽SEQIDNO:3或SEQIDNO:14的N端氨基酸的α氨基连接，且在生理条件下的PBS中显示介于约6至约24小时之间的t1/2。在一个实施方案中，这类化合物包含式I的前药元件，其中
R1和R2独立地选自氢、C1-C18烷基和芳基，或者R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立地选自氢、C1-C8烷基和芳基；和
R5为胺，前提条件是，R1和R2两者都不为氢，且前提条件是R4或R8之一为氢。
在另一个实施方案中，提供包含GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)的A链序列和X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)的B链序列的胰岛素前药，其中二肽前药元件与肽SEQIDNO:3或SEQIDNO:14的N端氨基酸的α氨基连接，且在生理条件下的PBS中显示约72至约168小时的t1/2。在一个实施方案中，这类化合物包含式I的前药元件，其中
R1选自氢、C1-C8烷基和芳基；
R2为H；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；和
R5为胺或N-取代的胺或羟基；
前提条件是，如果R1为烷基或芳基，则R1和R5与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环。
在一个实施方案中，具有与胰岛素A链或B链肽的N端α氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如介于约12至约72小时之间或者在一个实施方案中介于约12至约48小时之间的前药，包含具有以下结构的二肽前药元件：
其中R1和R2独立地选自氢、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或者R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立地选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2；和
R7选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代；前提条件是R1和R2两者都不为氢，且前提条件是R4或R8中的至少一个为氢。
在一个实施方案中，具有与胰岛素A链或B链肽的N端氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如介于约12至约72小时之间，或者在一个实施方案中介于约12至约48小时之间的前药，包含具有以下结构的二肽前药元件：
其中R1和R2独立地选自氢、C1-C8烷基和(C1-C4烷基)NH2，或者R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C8烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4选自氢和C1-C8烷基；和
R5为NH2，前提条件是，R1和R2两者都不为氢。
在其它实施方案中，具有与胰岛素A链或B链肽的N端氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如介于约12至约72小时之间，或者在一个实施方案中介于约12至约48小时之间的前药，包含具有以下结构的二肽前药元件：
其中
R1和R2独立地选自氢、C1-C8烷基和(C1-C4烷基)NH2；
R3为C1-C6烷基；
R4为氢；和
R5为NH2，前提条件是，R1和R2两者都不为氢。
在一个实施方案中，具有与胰岛素A链或B链肽的N端氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如介于约12至约72小时之间，或者在一个实施方案中介于约12至约48小时之间的前药，包含具有以下结构的二肽前药元件：
其中
R1和R2独立地选自氢和C1-C8烷基、(C1-C4烷基)NH2，或者R1和R2通过(CH2)p连接，其中p为2-9；
R3为C1-C8烷基；
R4为(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2；和
R7选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)OH，前提条件是，R1和R2两者都不为氢。
另外，提供具有与胰岛素A链或B链肽的N端α氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如约72至约168小时的前药，其中二肽前药元件具有以下结构：
其中R1选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代，前提条件是，如果R1为烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，则R1和R5与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环。
在一个实施方案中，二肽前药元件与胰岛素肽内部氨基酸的侧链胺连接。在这个实施方案中，t1/2为例如约1小时的前药具有以下结构：
其中
R1和R2独立地为C1-C8烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；或者R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NH2；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代。
此外，t1/2为例如介于约6至约24小时之间且具有与内部氨基酸侧链连接的二肽前药元件的前药包含具有以下结构的二肽前药元件：
其中R1和R2独立地选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或者R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立地为氢、C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NHR6；
R6为H或C1-C8烷基，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代，前提条件是，R1和R2两者都不为氢，且前提条件是R4或R8中的至少一个为氢。
另外，提供t1/2为例如约72至约168小时且具有与胰岛素肽的内部氨基酸侧链连接的二肽前药元件的前药，其中所述二肽前药元件具有以下结构：
其中R1选自氢、C1-C18烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H或C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代；前提条件是，如果R1和R2两者均独立地为烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，则R1或R2中的任一个通过(CH2)p与R5连接，其中p为2-9。
在一个实施方案中，二肽前药元件与胰岛素肽内部氨基酸的侧链胺连接，其中内部氨基酸包含下式IV的结构：
其中
n为选自1-4的整数。在一个实施方案中，n为3或4，而在一个实施方案中，内部氨基酸为赖氨酸。在一个实施方案中，二肽前药元件与位于胰岛素肽B链28或29位的氨基酸侧链上的伯胺连接。
在一个实施方案中，提供包含A链序列和B链序列的胰岛素前药，其中A链包含序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)，并且B链序列包含序列X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH、NH2、NHR10和OCH3，其中R10为H或包含以下通用结构的二肽：
；
其中
R1和R2独立地选自氢、C1-C8烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或者R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立地为氢、C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NHR6；
R6为H或C1-C8烷基，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代；
X3选自天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
其中X12选自OH、NH2、NHR11和OCH3，其中R11为H或包含以下通用结构的二肽：
；
X8为以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH、NH2、NHR12和OCH3，其中R12为H或包含以下通用结构的二肽：
X14选自氢(形成N端胺)、X9VNQ(SEQIDNO:21)、VNQ、NQ和Q，并且X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸，前提条件是，R10、R11和R12中的一个并且只有一个为包含以下通用结构的二肽：
。
根据其中二肽前药元件与芳族氨基酸芳基的氨基取代基连接的一个实施方案，可提供具有所需活化时间的前药制剂。例如，提供包含下式III结构且在生理条件下的PBS中t1/2为约1小时的胰岛素前药：
其中m为0-3的整数。在其中胰岛素前药包含式III结构并具有这类半衰期的一个实施方案中，
R1和R2独立地为C1-C18烷基或芳基；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立地选自氢、C1-C18烷基和芳基；和
R5为胺或羟基。在一个实施方案中，m为1。
在一个实施方案中，二肽前药元件通过胰岛素肽芳族氨基酸芳基上存在的胺与胰岛素肽连接，其中t1/2为例如约1小时的前药具有以下结构的二肽：
其中R1和R2独立地为C1-C18烷基或(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立地选自氢、C1-C18烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NH2或OH；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代。
在另一个实施方案中，提供包含式III结构且在生理条件下的PBS中t1/2为约6至约24小时的胰岛素前药，其中m为0-3的整数。在其中胰岛素前药包含式III结构并具有这类半衰期的一个实施方案中，
R1和R2独立地选自氢、C1-C18烷基和芳基，或者R1和R2通过-(CH2)p-连接，其中p为2-9；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4和R8独立地选自氢、C1-C18烷基和芳基；和
R5为胺或N-取代的胺。在一个实施方案中，m为1。
在一个实施方案中，提供具有通过存在于芳族氨基酸芳基上的胺连接的二肽前药元件且t1/2为例如约6至约24小时的前药，其中所述二肽包含以下结构：
其中
R1选自氢、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4和R8独立地选自氢、C1-C18烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7；
R5为NHR6；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代。
在另一个实施方案中，提供包含式III结构且在生理条件下的PBS中t1/2为约72至约168小时的胰岛素前药，其中m为0-3的整数。在其中胰岛素前药包含式III结构并具有这类半衰期的一个实施方案中，
R1和R2独立地选自氢、C1-C8烷基和芳基；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4和R8各自为氢；和
R5选自胺、N-取代的胺和羟基。在一个实施方案中，m为1。
在一个实施方案中，提供具有通过芳族氨基酸连接的二肽前药元件且t1/2为例如约72至约168小时的前药，其中所述二肽包含以下结构：
其中R1选自氢、C1-C8烷基、(C1-C4烷基)COOH和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或者R1和R5与它们所连接的原子一起形成4-11元杂环；
R3为C1-C18烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4为氢或与R3形成4-6元杂环；
R8为氢；
R5为NHR6或OH；
R6为H或C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代。
在一个实施方案中，胰岛素前药类似物包含GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3-R13(SEQIDNO:3)的A链序列和X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)的B链序列，其中
X1选自苏氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH、NH2和OCH3；
X3为天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸。
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X7为酪氨酸；
X8为酪氨酸或苯丙氨酸；
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
X10为天冬氨酸-赖氨酸二肽、赖氨酸-脯氨酸二肽或脯氨酸-赖氨酸二肽；
X11为苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽；而且其中B链包含1-4个氨基酸的羧基端延伸物，其中所述羧基端延伸物包含具有以下结构的氨基酸：
或
其中m为0-3的整数；
n为1-4的整数；
R12为包含以下通用结构的二肽：
；
R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代；和
R13为COOH或CONH2。
在一个实施方案中，胰岛素前药类似物包含A链序列和B链序列，所述A链序列包括序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3-R13(SEQIDNO:3)，所述B链序列包括序列J-X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)或J-X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTX10X11-R14(SEQIDNO:5)，其中J为H(形成N端胺)或包含以下通用结构的二肽：
其中X14或是将“J”元件与SEQIDNO:14连接的键，或者X14表示选自以下的将“J”元件与SEQIDNO:14连接的1-4个氨基酸的序列：FVNQ(SEQIDNO:11)、VNQ、NQ和Q；
X1选自苏氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH、NH2和OCH3；
X3为天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸。
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
其中X12选自OH、OCH3、NH2和NHR11，其中R11为包含以下通用结构的二肽：
；
X8为以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH、OCH3、NH2和NHR12，其中R12为包含以下通用结构的二肽：
；
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
X10为天冬氨酸-赖氨酸二肽、赖氨酸-脯氨酸二肽或脯氨酸-赖氨酸二肽；
X11为苏氨酸、丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽；
其中R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R7选自H和OH；和
R13和R14独立地为COOH或CONH2，前提条件是，X12、X13或J中的一个并且只有一个为包含以下通用结构的二肽：
(即只有一个二肽前药元件与胰岛素肽连接)。在一个实施方案中，J为包含以下通用结构的二肽：
，并且X和X12各自为OH，并且X13为H，进一步的前提条件是如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成5元杂环，则R1和R2两者都不为H。在一个可替换的实施方案中，X12为NHR11，J和X13各自为H，并且X为OH。在另一个可替换的实施方案中，X13为NHR12，X和X12各自为OH，并且J为H。在一个实施方案中，B链包含序列J-X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTPKT(SEQIDNO:15)或J-X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTKPT(SEQIDNO:16)，其中J、X4、X5、X6、X7、X8和X9如紧接的上文中所定义。在另一个实施方案中，R3为C1-C6烷基，并且R4选自H、C1-C4烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。在另一个实施方案中，X4为组氨酸，X5为丝氨酸，并且X6为组氨酸。
在另一个实施方案中，提供包含Z-GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)的A链序列和包含序列X4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFF(SEQIDNO:4)的B链序列的胰岛素前药类似物，其中
Z为H或包含以下通用结构的二肽：
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH、NH2、NHR10和OCH3，其中R10为包含以下通用结构的二肽：
；
X3选自天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；
其中R1选自H和C1-C8烷基；
R2和R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、CH2(C5-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH，前提条件是，X和Z不同时为二肽且X为OH时Z不为H。在一个实施方案中，如果Z为包含以下通用结构的二肽：
且R4和R3与它们所连接的原子一起形成5元杂环，则R1和R2中的至少一个不为H。在一个实施方案中，A链包含序列Z-GIVEQCCX1SICSLYQLENYCX3(SEQIDNO:17)，并且B链序列包含序列X9VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQIDNO:12)或X9VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQIDNO:13)。
在一个可替换的实施方案中，提供包含GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)的A链序列和包含序列X9VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQIDNO:12)或X9VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQIDNO:13)的B链序列的胰岛素前药类似物，其中X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中U为氨基酸或羟酸，并且O为N-烷基化氨基酸；
X3为天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸。在一个实施方案中，U-O表示以下通用结构的二肽：
其中R1选自H和C1-C8烷基；
R2和R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、CH2(C5-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH。在另一个实施方案中，X7为酪氨酸，X8为苯丙氨酸，并且X9为苯丙氨酸，而在又一个实施方案中，X4为组氨酸，X5为丝氨酸，并且X6为组氨酸。在另一个实施方案中，U-O表示以下通用结构的二肽：
其中
R1、R2、R4和R8独立地选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；或者R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代。
在另一个实施方案中，提供包含Z-GIVEQCCTSICSLYQLENX2CX3-R13(SEQIDNO:18)的A链序列和包含序列X4LCGSHLVEALYLVCGERGFF-R14(SEQIDNO:19)的B链序列的胰岛素前药类似物，其中
Z为H或包含以下通用结构的连接酰胺的二肽：
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH和NHR10；
其中R10为包含以下通用结构的二肽：
；
X3为丝氨酸、天冬酰胺或甘氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
R1选自H和C1-C8烷基；
R2和R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、CH2(C5-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R7选自H和OH；和
R13和R14独立地为COOH或CONH2；前提条件是如果Z为H，则X不为OH，且如果X为OH，则Z不为H。在一个实施方案中，R13为COOH，并且R14为CONH2。在另一个实施方案中，X2为下式III通用结构的氨基酸：
Z为H，X3为丝氨酸，X4为组氨酸，R13为COOH，并且R14为CONH2。在又一个实施方案中，
R1选自H和C1-C4烷基；
R2选自H、C1-C6烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)，或者R2和R6与它们所连接的原子一起形成5元杂环；
R3为C1-C6烷基；
R4选自H和C1-C4烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。在另一个实施方案中，R3为CH3，R4为H，并且R5为NH2，或者可替换地，R5为NH2，并且R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。根据一个实施方案，胰岛素前药类似物的B链包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT-R14(SEQIDNO:8)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT-R14(SEQIDNO:9)或FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR-R14(SEQIDNO:10)，其中R14为COOH或CONH2，而在一个实施方案中，R14为CONH2。
在一个实施方案中，提供包含序列Z-GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)的多肽的胰岛素前药类似物，其中
Z为包含以下通用结构的二肽：
；
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH、NH2和OCH3；
X3为天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸；
R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、CH2(C5-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH。在一个实施方案中，X1为苏氨酸，并且X3为天冬酰胺或甘氨酸，而在另一个实施方案中，R3为C1-C6烷基，并且R4选自H、C1-C4烷基、(C3-C6)环烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH和(C0-C4烷基)(C6芳基)R7，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环，前提条件是，如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环，则R1和R2两个都不为H。
在一个实施方案中，提供包含序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)的多肽的胰岛素前药类似物，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
X3为天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸；
R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、CH2(C5-C9杂芳基)，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH。在一个实施方案中，如紧接的上文中所定义的GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)的A链通过二硫键或作为单链多肽与包含序列X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)的B链连接，其中
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X7为酪氨酸；和
X8为苯丙氨酸。
在另一个实施方案中，二肽前药元件具有式I的结构，其中
R1、R2和R4独立地选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或者R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤代。在另一个实施方案中，R3为C1-C6烷基，并且R4选自H和C1-C4烷基，或者可替换地，R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。在一个实施方案中，X1为苏氨酸，并且X3为天冬酰胺或甘氨酸。
在一个实施方案中，R1选自H和C1-C6烷基，R2选自H、C1-C6烷基、(C1-C4烷基)C(O)NH2、CH2OH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6环烷基)和CH2(C6芳基)R7，或者R2和R6与它们所连接的原子一起形成5元杂环；
R3为C1-C6烷基；
R4选自H、C1-C4烷基、(C3-C6)环烷基和(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH。
根据一个实施方案，提供单链胰岛素前药类似物，其中人胰岛素B链或其功能类似物的羧基端与人胰岛素A链或其功能类似物的N端共价连接，且其中具有以下通用结构的二肽前药部分在肽的N端或在氨基酸侧链(包括例如在对应于天然胰岛素A链或B链的各自的A19、B16或B25的位置)通过酰胺键共价结合：
。根据一个实施方案，单链胰岛素类似物包含式B-P-A的化合物，其中：B表示人胰岛素的B链或者本文公开的B链的功能类似物或前药类似物之一，A表示人胰岛素的A链或者本文公开的A链的功能类似物或前药类似物之一，并且P表示包括肽接头在内的接头，其使A链与B链共价连接。在一个实施方案中，接头为约5至约18个、或约10至约14个、或约4至约8个或约6个氨基酸的肽接头。在一个实施方案中，B链通过4-12或4-8个氨基酸的肽接头与A链连接。在一个实施方案中，单链类似物的肽接头选自：GYGSSSRRAPQT;SEQIDNO:23,GYGSSSRR(SEQIDNO:66),GYGSSSOR(SEQIDNO:69),GYGSSSX7X8(SEQIDNO:71)或GAGSSSRRAPQT(SEQIDNO:70)，或与SEQIDNO:89、90或79相差1-3个氨基酸置换或1-2个氨基酸置换的序列，其中X7和X8独立地为鸟氨酸、精氨酸或赖氨酸。任选地，单链类似物的连接部分还可以充当二肽元件的连接部位，且在一个实施方案中，连接部分是包含具有适合经由酰胺键连接本发明的二肽元件的侧链基团的氨基酸的肽接头。
在一个实施方案中，式B-P-A的单链胰岛素前药类似物包含具有序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)的A链和包括序列J-X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)的B链序列，其中J为H或包含以下通用结构的二肽：
其中X14为键或选自以下的1-4个氨基酸的序列：FVNQ(SEQIDNO:11)、VNQ、NQ和Q。
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
；
其中X选自OH、NHR10和OCH3；其中R10为H或包含以下通用结构的二肽：
；
X3为天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
其中X12选自OH、OCH3和NHR11，其中R11为H或包含以下通用结构的二肽：
；
X8为以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH、OCH3和NHR12，其中R12为H或包含以下通用结构的二肽：
；
其中R1选自H和C1-C8烷基；和
R2和R4独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和CH2(C5-C9杂芳基)；
R3选自C1-C8烷基、(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH、(C1-C4烷基)NH2、(C3-C6)环烷基，或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H，或者R6和R2与它们所连接的原子一起形成5或6元杂环；和
R7选自H和OH，前提条件是，Z、J、R10、R11或R12中的一个并且只有一个为包含以下通用结构的二肽：
(即只有一个二肽前药元件与胰岛素肽连接)。
在一个实施方案中，J为包含以下通用结构的二肽：
，并且X和X12各自为OH，且X13为H，前提条件是，如果R4和R3与它们所连接的原子一起形成5元杂环，则R1和R2两者都不为H。在一个可替换的实施方案中，X12包含式I的二肽，J和X13各自为H，并且X为OH。在另一个可替换的实施方案中，X13包含式I的二肽，X和X12各自为OH，并且J为H。在另一个实施方案中，X包含式I的二肽，J和X13各自为H，并且X12为OH。在一个实施方案中，B链包含序列J-X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTPKT(SEQIDNO:15)或J-X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTKPT(SEQIDNO:16)，其中J、X4、X5、X6、X7、X8和X9如紧接的上文中所定义。在另一个实施方案中，R3为C1-C6烷基，并且R4选自H、C1-C4烷基，或者R3和R4与它们所连接的原子一起形成5元杂环。在又一个实施方案中，X4为组氨酸，X5为丝氨酸，并且X6为组氨酸。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包含式B-P-A的化合物，其中：
B表示包含序列X4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFF(SEQIDNO:4)的B链序列或其功能类似物，
A表示包含序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)的A链序列或其功能类似物，且“P”表示包括例如8-12个氨基酸接头的接头，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
；
X3为天冬酰胺或甘氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸。
P表示包括肽接头在内的接头，其将A链的氨基端与B链的羧基端共价连接。在一个可替换的实施方案中，单链胰岛素类似物包含式A-P-B的化合物，其中：A表示人胰岛素A链或其功能类似物，B表示人胰岛素B链或其功能类似物，并且P表示包括肽接头在内的接头，其将B链的氨基端与A链的羧基端共价连接。在一个实施方案中，肽接头包含4-8个氨基酸。
根据一个实施方案，肽接头长度为5-18个氨基酸，且包含选自以下的序列：Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQIDNO:22)、Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr(SEQIDNO:23)、Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQIDNO:32)、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQIDNO:24)、Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQIDNO:25)、Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQIDNO:26)、Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQIDNO:27)、Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQIDNO:28)、Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQIDNO:29)、Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQIDNO:30)和Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQIDNO:31)。在一个实施方案中，肽接头的长度为7-12个氨基酸且包含序列Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQIDNO:22)或Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr(SEQIDNO:23)。
在另一个实施方案中，肽接头包含选自以下的序列：AGRGSGK(SEQIDNO:35)、AGLGSGK(SEQIDNO:36)、AGMGSGK(SEQIDNO:37)、ASWGSGK(SEQIDNO:38)、TGLGSGQ(SEQIDNO:39)、TGLGRGK(SEQIDNO:40)、TGLGSGK(SEQIDNO:41)、HGLYSGK(SEQIDNO:42)、KGLGSGQ(SEQIDNO:43)、VGLMSGK(SEQIDNO:44)、VGLSSGQ(SEQIDNO:45)、VGLYSGK(SEQIDNO:46)、VGLSSGK(SEQIDNO:47)、VGMSSGK(SEQIDNO:48)、VWSSSGK(SEQIDNO:49)、VGSSSGK(SEQIDNO:50)、VGMSSGK(SEQIDNO:51)、TGLGSGR(SEQIDNO:52)、TGLGKGQ(SEQIDNO:53)、KGLSSGQ(SEQIDNO:54)、VKLSSGQ(SEQIDNO:55)、VGLKSGQ(SEQIDNO:56)、TGLGKGQ(SEQIDNO:57)SRVSRRSR(SEQIDNO:65)、GYGSSSRRAPQT(SEQIDNO:23)和VGLSKGQ(SEQIDNO:58)。在一个实施方案中，接头包含GSSSRRAP(SEQIDNO:67)或SRVSRRSR(SEQIDNO:65)。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物具有以下氨基酸序列：
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Xaa-Cys-Asn(SEQIDNO:33)或
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Xaa-Cys-Asn(SEQIDNO:34)，其中Xaa是以下通用结构的氨基酸
。
本文公开的胰岛素肽可以为包含通过接头结合的至少2、3或更多个肽的二聚体、三聚体或更高级次的多聚体的部分，其中至少一个或两个肽包含与胰岛素肽连接的二肽前药元件。二聚体可以是同源二聚体或异源二聚体，包含选自天然胰岛素、天然IGF-1、天然IGF-II和本文公开的胰岛素类似物肽的肽。在一个实施方案中，接头选自双官能硫醇交联剂和双官能胺交联剂。在某些实施方案中，接头为PEG，例如5kDaPEG、20kDaPEG。在一些实施方案中，接头为二硫键。
例如，二聚体的每个单体可包含Cys残基(例如位于末端的Cys或位于内部的Cys)，且每个Cys残基的硫原子参与二硫键的形成。二聚体的每个单体代表A链和B链的异源二聚体。A链和B链通过二硫键连接，或制备成单链肽。在本发明的一些方面，单体通过末端氨基酸(例如N端或C端)、通过内部氨基酸或通过至少一个单体的末端氨基酸和至少一个其它单体的内部氨基酸连接起来。在具体的方面，单体不通过N端氨基酸连接。在一些方面，多聚体的单体以“尾对尾(tail-to-tail)”方向连接在一起，其中每个单体的C端氨基酸连接在一起。缀合物部分可与本文所述的任何胰岛素肽(包括二聚体、三聚体或更高级次多聚体)共价连接。
还可修饰本文公开的前药以改进肽在生理pH下肽在水性溶液中的溶解度，同时通过防止肽的肾清除而提高肽的有效持续时间。因为与血浆蛋白质相比，肽的分子大小相对较小，因此容易被清除掉。将肽的分子量增加到40kDa以上超过了肾阈，从而显著延长了在血浆中的持续时间。因此，在一个实施方案中，对肽前药作进一步修饰以包含共价连接的亲水部分。在一个实施方案中，亲水部分为血浆蛋白聚环氧乙烷链或免疫球蛋白的Fc部分。因此，在一个实施方案中，对本发明公开的前药作进一步修饰以包含一个或多个与氨基酸的侧链共价连接的亲水基团。
根据一个实施方案，通过将亲水部分与B链的N端氨基酸或位于B链羧基端的赖氨酸氨基酸(包括例如SEQIDNO:9/SEQIDNO:13的28位或SEQIDNO:8/SEQIDNO:12的29位)的侧链连接，来进一步修饰本文公开的胰岛素前药。在一个实施方案中，提供单链胰岛素前药类似物，其中通过将亲水部分与肽接头的侧链连接来修饰肽接头的一个氨基酸。在一个实施方案中，修饰氨基酸为半胱氨酸、赖氨酸或乙酰基苯丙氨酸。在一个实施方案中，肽接头选自TGLGSGQ(SEQIDNO:39)、VGLSSGQ(SEQIDNO:45)、VGLSSGK(SEQIDNO:47)、TGLGSGR(SEQIDNO:52)、TGLGKGQ(SEQIDNO:53)、KGLSSGQ(SEQIDNO:54)、VKLSSGQ(SEQIDNO:55)、VGLKSGQ(SEQIDNO:56)、TGLGKGQ(SEQIDNO:57)和VGLSKGQ(SEQIDNO:58)，且亲水部分(例如聚乙二醇)与肽接头的赖氨酸侧链连接。
在另一个实施方案中，通过将修饰氨基酸加至胰岛素前药B链的羧基端，来进一步修饰本文公开的胰岛素前药类似物，其中对C端加入的氨基酸进行修饰以包含与该氨基酸连接的亲水部分。在一个实施方案中，加到C端的氨基酸为修饰的半胱氨酸、赖氨酸或乙酰基苯丙氨酸。在一个实施方案中，亲水部分选自血浆蛋白、聚环氧乙烷链和免疫球蛋白的Fc部分。
在一个实施方案中，亲水基团为聚环氧乙烷链，而在一个实施方案中，两个或更多个聚环氧乙烷链与胰岛素前药类似物的两个或更多个氨基酸侧链共价连接。根据一个实施方案，亲水部分在选自以下的位置与本文公开的胰岛素前药类似物的氨基酸侧链共价连接：A9、A14、A15、B22、B28、B29和B链的C端或N端。对于具有多个聚环氧乙烷链的胰岛素前药类似物，聚环氧乙烷链可以在B链的N端氨基酸上连接，或者与位于B链羧基端的赖氨酸氨基酸的侧链连接，或者通过在肽的C端添加单个氨基酸而连接，其中所添加的氨基酸具有与其侧链连接的聚环氧乙烷链。根据一个实施方案，聚环氧乙烷链或其它亲水部分与包含二肽前药元件的两个氨基酸之一的侧链连接。在一个实施方案中，二肽前药元件包含具有与其侧链胺连接的聚环氧乙烷链的赖氨酸(D或L构型)。
亲水部分的连接
在另一个实施方案中，通过将亲水部分与肽共价连接来提高本文公开的胰岛素类似物的溶解度。可在用于使蛋白质与活化聚合物分子反应的任何合适的条件下，将亲水部分与胰岛素类似物连接。可采用本领域已知的任何方法，包括通过酰化、还原烷基化、迈克尔加成(Michaeladdition)、巯基烷基化或通过PEG部分上的反应基(例如醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基（maleimido）或肼基)与目标化合物上的反应基(例如醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚氨基或肼基)进行的其它化学选择性缀合/连接方法。可用于将水溶性聚合物与一个或多个蛋白质连接的活化基团包括而不限于砜、马来酰亚胺、硫氢基、巯基、三氟甲磺酸基、三氟乙磺酸基（triflate）、氮丙啶(azidirine)、环氧乙烷和5-吡啶基。如果通过还原烷基化与肽连接，则所选择的聚合物应具有单一反应性醛，使得聚合程度受到控制。参见例如Kinstler等，Adv.Drug.DeliveryRev.54:477-485(2002)；Roberts等，Adv.DrugDeliveryRev.54:459-476(2002)；以及Zalipsky等，Adv.Drug.DeliveryRev.16:157-182(1995)。
合适的亲水部分包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇(例如POG)、聚氧乙烯化山梨醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油(POG)、聚氧化烯、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇共聚物、单甲氧基聚乙二醇（monomethoxy-polyethyleneglycol）、单-(C1-C10)烷氧基-聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、聚缩醛、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(均聚物或无规共聚物)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物(propropyleneglycolhomopolymers，PPG)和其它聚环氧烷（polyakyleneoxides）、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、肠菌酸(colonicacid)或其它多糖聚合物、菲柯尔(Ficoll)或葡聚糖及其混合物。
根据一个实施方案，亲水部分(例如聚乙二醇链)的分子量选自约500至约40,000道尔顿。在一个实施方案中，亲水部分(例如PEG)的分子量选自约500至约5,000道尔顿、或约1,000至约5,000道尔顿。在另一个实施方案中，亲水部分(例如PEG)的分子量为约10,000至约20,000道尔顿。在其它示例性的实施方案中，亲水部分(例如PEG)的分子量为约20,000至约40,000道尔顿。
在一个实施方案中，将葡聚糖用作亲水部分。葡聚糖是主要通过α1-6键连接的葡萄糖亚基的多糖聚合物。可获得许多分子量范围的葡聚糖，例如，约1kDa至约100kDa，或约5、10、15或20kDa至约20、30、40、50、60、70、80或90kDa。
考虑了直链或支链聚合物。缀合物的所得制备物可以是基本单分散性的或多分散性的，且每个肽可具有约0.5、0.7、1、1.2、1.5或2个聚合物部分。
根据一个实施方案，本文公开的胰岛素前药类似物被氨基酸置换进一步修饰，其中置换的氨基酸包含适于与亲水部分(包括例如聚乙二醇)交联的侧链。在一个实施方案中，在待亲水部分连接的胰岛素前药类似物位置上的氨基酸被天然或合成氨基酸置换(或加在C端上)，以引入亲水部分或使亲水部分容易连接。例如，在一个实施方案中，在选自A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、B1、B2、B3、B4、B5、B13、B14、B17、B21、B22、B26、B27、B28、B29和B30的位置上的天然氨基酸被赖氨酸、半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基置换(或将赖氨酸、半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基加在C端上)，以供聚乙二醇链共价连接。
在一个实施方案中，胰岛素前药类似物具有单个加在B链的羧基端上的半胱氨酸残基，或者胰岛素前药类似物被至少一个半胱氨酸残基取代，其中将所述半胱氨酸残基的侧链用巯基反应性试剂进一步修饰，所述巯基反应性试剂包括例如马来酰亚氨基、乙烯基砜、2-吡啶基硫代（2-pyridylthio）、卤代烷基和卤代酰基。这些巯基反应性试剂可含有羧基、酮基（keto）、羟基和醚基团以及其它亲水部分，例如聚乙二醇单元。在一个可替换的实施方案中，胰岛素前药类似物具有单个加到B链的羧基端上的赖氨酸残基，或者胰岛素前药类似物被赖氨酸置换，并且使用胺反应性试剂例如羧酸的活性酯(琥珀酰亚胺基、酐等)或亲水部分(例如聚乙二醇)的醛对置换的赖氨酸残基的侧链进行进一步修饰。
在其中胰岛素前药类似物包含聚乙二醇链的实施方案中，聚乙二醇链可呈直链的形式，或者其可以是支链的。根据一个实施方案，聚乙二醇链的平均分子量为约20,000至约60,000道尔顿。多条聚乙二醇链可与胰岛素前药类似物连接以提供具有最佳溶解度和血液清除特征的胰岛素前药类似物。在一个实施方案中，胰岛素前药类似物与平均分子量为约20,000至约60,000道尔顿的单一聚乙二醇链连接。在另一个实施方案中，胰岛素前药类似物与两条聚乙二醇链连接，其中两条链总的平均分子量为约40,000至约80,000道尔顿。在一个实施方案中，平均分子量为20,000或60,000道尔顿的单一聚乙二醇链与胰岛素前药类似物连接。在另一个实施方案中，单一聚乙二醇链与胰岛素前药类似物连接，且平均分子量为约40,000至约50,000道尔顿。在一个实施方案中，两条聚乙二醇链与胰岛素前药类似物连接，其中第一条和第二条聚乙二醇链各自的平均分子量为20,000道尔顿。在另一个实施方案中，两条聚乙二醇链与胰岛素前药类似物连接，其中第一条和第二条聚乙二醇链各自的平均分子量为40,000道尔顿。
在另一个实施方案中，提供包含与肽共价结合的两条或更多条聚乙二醇链的胰岛素前药类似物，其中聚乙二醇链的总分子量为约40,000至约60,000道尔顿。在一个实施方案中，聚乙二醇化胰岛素前药类似物包含与选自B链N端和/或SEQIDNO:9的28位或SEQIDNO:8的29位的一个或多个氨基酸连接的聚乙二醇链，其中PEG链(诸PEG链)总的分子量为约40,000至约80,000道尔顿。
根据一个实施方案，胰岛素肽或其前药/长效衍生物与辅助肽（accessorypeptide）融合，所述辅助肽能够形成类似于化学性PEG(例如重组PEG(rPEG)分子)的延伸构象，例如国际专利申请公开号WO2009/023270和美国专利申请公开号US2008/0286808中披露的辅助肽。rPEG分子不是聚乙二醇。在一些方面，rPEG分子是包含一个或多个甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸或脯氨酸的多肽。在一些方面，rPEG是均聚物，例如聚甘氨酸、聚丝氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚丙氨酸或聚脯氨酸。在其它实施方案中，rPEG包含两种类型的重复的氨基酸，例如聚(Gly-Ser)、聚(Gly-Glu)、聚(Gly-Ala)、聚(Gly-Asp)、聚(Gly-Pro)、聚(Ser-Glu)等。在一些方面，rPEG包含三种不同类型的氨基酸，例如聚(Gly-Ser-Glu)。在具体的方面，rPEG延长胰岛素肽的半衰期。在一些方面，rPEG包含净的正电荷或净的负电荷。在一些方面，rPEG缺乏二级结构。在一个实施方案中，rPEG的长度大于或等于10个氨基酸，而在一个实施方案中，长度为约40至约50个氨基酸。在一些方面，辅助肽通过肽键或蛋白酶切割位点与本发明肽的N端或C端融合，或者***本发明肽的环中。在一些方面，rPEG包含亲和标记物（affinitytag）或与大于5kDa的PEG连接。在一个实施方案中，rPEG赋予本发明的肽增加的流体动力学半径、血清半衰期、蛋白酶抗性或溶解度，而在一些方面赋予肽降低的免疫原性。
根据一个实施方案，提供胰岛素前药类似物，其中血浆蛋白已经与该肽的氨基酸侧链共价连接以改进胰岛素前药类似物的溶解度、稳定性和/或药代动力学。例如，血清白蛋白可与本文提供的胰岛素前药类似物共价结合。在一个实施方案中，血浆蛋白与B链的N端和/或与SEQIDNO:9的28位或SEQIDNO:8的29位对应的氨基酸共价结合。
根据一个实施方案，提供胰岛素前药类似物，其中代表免疫球蛋白分子的Fc部分的线性氨基酸序列已经与本文公开的胰岛素前药类似物的氨基酸侧链共价连接，以改进胰岛素前药类似物的溶解度、稳定性和/或药代动力学。例如，代表免疫球蛋白分子的Fc部分的氨基酸序列可与B链的N端、或者A链或B链的C端、或者已末端延伸的A链或B链的C端共价结合。例如，代表免疫球蛋白分子的Fc部分的氨基酸序列可与B链的C端共价结合，包括例如与相当于SEQIDNO:9的28位或SEQIDNO:8的29位的氨基酸连接。Fc部分通常自IgG中分离，但是来自任何免疫球蛋白的Fc肽片段应起等同作用。
在本发明的一个具体方面，通过对胰岛素前药类似物的氨基酸侧链的胺、羟基或巯基进行直接烷基化或酰化，来对胰岛素前药类似物进行修饰以包含烷基或酰基。在一个实施方案中，通过氨基酸的侧链胺、羟基或巯基对胰岛素前药类似物进行直接酰化。在一个实施方案中，在选自以下的一个或多个位置上进行酰化：A9、A14、A15、B22、B28或B29。在这点上，酰化胰岛素前药类似物可包含SEQIDNO:3的A链氨基酸序列和SEQIDNO:5的B链，或者SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:5的修饰氨基酸序列，其中A9、A14、A15、B22、B28或B29位上的至少一个氨基酸被修饰成为包含侧链胺、羟基或巯基的任何氨基酸。在一些具体的实施方案中，通过B28或B29位氨基酸的侧链胺、羟基或巯基进行胰岛素前药类似物的直接酰化。在又一个的实施方案中，胰岛素前药类似物包含与存在于B28或B29位上的Lys的ε-氨基结合并具有1-24个碳原子的羧酸的酰基。在一个实施方案中，提供单链胰岛素前药类似物，其中通过对肽接头的氨基酸侧链的胺、羟基或巯基进行直接酰化，来修饰肽接头的氨基酸之一以包含酰基。根据一个实施方案，单链胰岛素类似物的肽接头选自AGRGSGK(SEQIDNO:35)、AGLGSGK(SEQIDNO:36)、AGMGSGK(SEQIDNO:37)、ASWGSGK(SEQIDNO:38)、TGLGSGQ(SEQIDNO:39)、TGLGRGK(SEQIDNO:40)、TGLGSGK(SEQIDNO:41)、HGLYSGK(SEQIDNO:42)、KGLGSGQ(SEQIDNO:43)、VGLMSGK(SEQIDNO:44)、VGLSSGQ(SEQIDNO:45)、VGLYSGK(SEQIDNO:46)、VGLSSGK(SEQIDNO:47)、VGMSSGK(SEQIDNO:48)、VWSSSGK(SEQIDNO:49)、VGSSSGK(SEQIDNO:50)、VGMSSGK(SEQIDNO:51)、TGLGSGR(SEQIDNO:52)、TGLGKGQ(SEQIDNO:53)、KGLSSGQ(SEQIDNO:54)、VKLSSGQ(SEQIDNO:55)、VGLKSGQ(SEQIDNO:56)、TGLGKGQ(SEQIDNO:57)和VGLSKGQ(SEQIDNO:58)，其中A链中、B链中或连接肽中的至少一个赖氨酸残基已经通过酰化被化学修饰。在一个实施方案中，酰化基团包含1-5个、10-12个或12-24个碳的链。
根据一个实施方案，进一步修饰本文公开的胰岛素前药类似物以将其它化合物与该类似物的前药二肽部分连接。在一个实施方案中，将包含二肽前药元件的氨基酸侧链聚乙二醇化、酰化或烷基化。在一个实施方案中，二肽用包含1-5个、10-12个或12-24个碳的链的基团酰化。在一个实施方案中，二肽用40-80KDa聚乙二醇链进行聚乙二醇化。在一个实施方案中，二肽前药元件是聚乙二醇化的，且与二肽连接的胰岛素肽是酰化的，包括例如B链C端赖氨酸的酰化。根据一个实施方案，亲水部分或屏蔽大分子（sequesteringmacromolecule）与包含以下通用结构的二肽的R2侧链共价连接：
，其中R2选自(C1-C4烷基)OH、(C1-C4烷基)SH和(C1-C4烷基)NH2。在一个实施方案中，R2为(C3-C4烷基)NH2。屏蔽大分子为本领域技术人员所知，包括葡聚糖和大分子量聚乙二醇(即大于或等于80KDa)。通过将屏蔽大分子与二肽部分连接，前药将保持屏蔽，同时活性胰岛素肽根据二肽酰胺键裂解的动力学缓慢释放。
本公开内容还包括其它缀合物，其中本发明的胰岛素前药类似物任选通过共价结合和任选通过接头与缀合物连接。可通过共价化学键；诸如静电、氢、离子、范德华或者疏水或亲水相互作用等物理力实现连接。可采用各种非共价偶联***，包括生物素-抗生物素蛋白、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、细胞黏着分子配偶体；或彼此具有亲和力的其任何结合配偶体或片段。
示例性缀合物包括但不限于异源肽或多肽(包括例如血浆蛋白)、靶向试剂、免疫球蛋白或其部分(例如可变区、CDR或Fc区)、诊断标记物(例如放射性同位素、荧光团或酶标记物)、聚合物(包括水溶性聚合物)或其它治疗剂或诊断剂。在一个实施方案中，提供包含本公开内容的胰岛素前药类似物和血浆蛋白的缀合物，其中所述血浆蛋白选自白蛋白、运铁蛋白和血纤蛋白原。在一个实施方案中，缀合物的血浆蛋白部分是白蛋白或运铁蛋白。在一个实施方案中，接头包含长为1至约60个原子、或1-30个原子或更长、2-5个原子、2-10个原子、5-10个原子或10-20个原子的链。在一个实施方案中，链原子全部为碳原子。在一个实施方案中，接头骨架中的链原子选自C、O、N和S。可以根据其预计的溶解度(亲水性)来选择链原子和接头，使得提供更易溶解的缀合物。在一个实施方案中，接头提供受到存在于靶组织或器官或细胞中的酶或其它催化剂或水解条件裂解的官能团。在一个实施方案中，接头的长度足够长以减小位阻的可能性。如果接头为共价键或肽基键，且缀合物为多肽，则整个缀合物可为融合蛋白。这类肽基接头可以为任何长度。示例性接头的长度为约1-50个氨基酸、5-50、3-5、5-10、5-15或10-30个氨基酸。可替换地，这类融合蛋白可通过本领域普通技术人员已知的重组遗传工程方法生产。
缀合物和融合物
本公开内容还包括其它缀合物，其中本文公开的胰岛素类似物任选通过共价结合和任选通过接头与缀合物部分连接。可以通过共价化学键；诸如静电、氢、离子、范德华或疏水或亲水相互作用等物理力实现连接。可以采用各种非共价偶联***，包括生物素-抗生物素蛋白、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、细胞黏着分子配偶体；或彼此具有亲和力的其任何结合配偶体或片段。
可以通过使肽的靶定氨基酸残基与有机衍生剂反应将肽与缀合物部分经由直接共价连接连接，所述有机衍生剂能够与这些靶定氨基酸的选定侧链或N端或C端残基反应。肽或缀合物上的反应基包括例如醛、氨基、酯、巯基、α-卤代乙酰基、马来酰亚氨基或肼基。衍生剂包括例如马来酰亚氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐或本领域已知的其它试剂。可替换地，缀合物部分可以通过中间载体(例如多糖或多肽载体)与肽间接连接。多糖载体的实例包括氨基葡聚糖。合适的多肽载体的实例包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、其共聚物以及这些氨基酸和其它氨基酸(例如丝氨酸)的混合聚合物，以给所得到的负载载体（loadedcarrier）提供所需要的溶解度性质。
半胱氨酰基残基最常与诸如氯乙酸或氯乙酰胺等α-卤代乙酸酯(和相应的胺)反应，得到羧基甲基或羧基酰氨基甲基衍生物。还通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯(chloroacetylphosphate)、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化合物、对氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑反应，来使半胱氨酰基残基衍生化。
通过在pH5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应使组氨酰残基衍生化，因为该衍生剂对组氨酰基侧链具有相对特异性。对溴代苯甲酰甲基溴也是可用的；该反应优选在0.1M二甲胂酸钠中在pH6.0进行。
使赖氨酰残基和氨基端残基与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。与这些试剂的衍生化具有逆转赖氨酰残基的电荷的作用。用于使含有α-氨基的残基衍生化的其它合适试剂包括亚氨酸酯例如甲基吡啶亚胺甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢化物(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、邻甲基异脲、2,4-戊二酮和转氨酶催化的与乙醛酸的反应。
通过与一种或若干种常用试剂(其中有苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮)反应来修饰精氨酰残基。因胍官能团的高pKa所致，精氨酸残基的衍生化需要在碱性条件下进行反应。此外，这些试剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基反应。
可对酪氨酰残基进行特异修饰，其中特别关注的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入酪氨酰残基。最常见的是分别使用N-乙酰基咪唑(N-acetylimidizole)和四硝基甲烷以形成O-乙酰基酪氨酰基类和3-硝基衍生物。
通过与诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺等碳二亚胺(R-N=C=N-R')(其中R和R'为不同的烷基)反应，选择性地修饰羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)。此外，通过与铵离子反应，将天冬氨酰残基和谷氨酰残基转化成天冬酰胺酰残基和谷氨酰胺酰残基。
其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰残基或苏氨酰残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,第79-86页(1983))、天冬酰胺或谷氨酰胺的脱酰胺化；N端胺的乙酰化和/或C端羧酸基的酰胺化或酯化。
另一种类型的共价修饰包括将糖苷与肽进行化学偶联或酶促偶联。可将糖（诸糖）连接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离硫氢基(例如半胱氨酸的那些)，(d)游离羟基(例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些)，(e)芳族残基(例如酪氨酸或色氨酸的那些)，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于1987年9月11日公布的WO87/05330以及Aplin和Wriston,CRCCrit.Rev.Biochem.,第259-306页(1981)中。
可与本文所述的任何胰岛素类似物连接的示例性缀合物部分包括但不限于异源肽或多肽(包括例如血浆蛋白)、靶向试剂、免疫球蛋白或其部分(例如可变区、CDR或Fc区)、诊断标记(例如放射性同位素、荧光团或酶标记)、聚合物(包括水溶性聚合物)或其它治疗剂或诊断剂。在一个实施方案中，提供包含本文公开的胰岛素类似物和血浆蛋白的缀合物，其中血浆蛋白选自白蛋白、运铁蛋白、血纤蛋白原和球蛋白。
在一个实施方案中，接头包含长为1至约60个原子、或1-30个原子或更长、2-5个原子、2-10个原子、5-10个原子或10-20个原子的链。在一个实施方案中，链原子全部为碳原子。在一个实施方案中，接头骨架中的链原子选自C、O、N和S。可根据其预期的溶解度(亲水性)来选择链原子和接头，以提供更易溶解的缀合物。在一个实施方案中，接头提供受到存在于靶组织或器官或细胞中的酶或其它催化剂或水解条件裂解的官能团。在一个实施方案中，接头的长度足够长以减小位阻的可能性。如果接头为共价键或肽基键，且缀合物为多肽，则整个缀合物可为融合蛋白。这类肽基接头可以为任何长度。示例性接头的长度为约1-50个氨基酸、5-50、3-5、5-10、5-15或10-30个氨基酸。可替换地，这类融合蛋白可通过本领域普通技术人员已知的重组遗传工程方法生产。
如上所述，在一个实施方案中，胰岛素类似物是缀合的，例如与免疫球蛋白或其部分(例如可变区、CDR或Fc区)融合。已知的免疫球蛋白(Ig)类型包括IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc区是Ig重链的C端区，其负责与发挥诸如再循环(其导致半衰期延长)、依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和依赖补体的细胞毒性(CDC)等活性的Fc受体结合。
例如，根据某些定义，人IgG重链Fc区自Cys226延伸到重链的C端。“铰链区”通常自人IgG1的Glu216延伸到Pro230(可通过对准（align）参与半胱氨酸结合的半胱氨酸，来将其它IgG同种型的铰链区与IgG1序列进行对准)。IgG的Fc区包括2个恒定结构域CH2和CH3。人IgGFc区的CH2结构域通常自氨基酸231延伸至氨基酸341。人IgGFc区的CH3结构域通常自氨基酸342延伸至氨基酸447。所提及的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或者区段的氨基酸编号都基于Kabat等，1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,U.S.DepartmentofPublicHealth,Bethesda,Md。在一个相关的实施方案中，Fc区可包含免疫球蛋白重链的一个或多个天然或修饰的恒定区(除CH1以外)，例如IgG和IgA的CH2和CH3区，或者IgE的CH3和CH4区。
合适的缀合物部分包括包含FcRn结合部位的免疫球蛋白序列的部分。FcRn，一种救援受体（salvagereceptor），负责使免疫球蛋白再循环，并将其送回血液循环中。已经根据X-射线晶体学描述了结合FcRn受体的IgG的Fc部分的区域(Burmeister等,1994,Nature372:379)。Fc与FcRn的主要接触区域接近CH2和CH3结构域的连接点。Fc-FcRn接触处全都在单一Ig重链内。主要接触部位包括CH2结构域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436。
一些缀合物部分可包括或者可不包括FcγR结合部位（诸FcγR结合部位）。FcγR负责ADCC和CDC。与FcγR进行直接接触的Fc区内的位置的实例为氨基酸234-239(下铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299(C'/E环)和氨基酸327-332(F/G)环(Sondermann等，Nature406:267-273，2000)。IgE的下铰链区还涉及FcRI结合(Henry等，Biochemistry36，15568-15578，1997)。参与IgA受体结合的残基描述于Lewis等(JImmunol.175:6694-701，2005)中。参与IgE受体结合的氨基酸残基描述于Sayers等(JBiolChem.279(34):35320-5，2004)中。
可对免疫球蛋白的Fc区进行氨基酸修饰。这类变体Fc区在Fc区的CH3结构域(残基342-447)中包含至少一个氨基酸修饰和/或在Fc区的CH2结构域(残基231-341)中包含至少一个氨基酸修饰。被认为赋予对FcRn提高的亲和力的突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等，2001，J.Biol.Chem.276:6591)。其它突变可减少Fc区与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合而又不显著降低对FcRn的亲和力。例如，Fc区297位的Asn用Ala或另一个氨基酸置换去除高度保守的N-糖基化位点，并可导致Fc区的免疫原性降低伴随半衰期延长，以及与FcγR的结合减少(Routledge等，1995，Transplantation60:847；Friend等，1999，Transplantation68:1632；Shields等，1995，J.Biol.Chem.276:6591)。已进行了减少与FcγR结合的IgG1233-236位上的氨基酸修饰(Ward和Ghetie1995，TherapeuticImmunology2:77和Armour等1999，Eur.J.Immunol.29:2613)。一些示例性的氨基酸置换描述在美国专利7,355,008和7,381,408中，通过引用以其整体各自结合到本文中。
酰化和烷基化
根据一个实施方案，对本文公开的胰岛素类似物进行修饰以包含酰基或烷基。酰化或烷基化可以延长胰岛素类似物在循环中的半衰期。酰化或烷基化可有利地延迟起效和/或延长在胰岛素受体和/或IGF-1受体上的作用持续时间和/或提高对蛋白酶(例如DPP-IV)的抗性和/或提高溶解度。可以在连接亲水部分的同一氨基酸位置上，或在不同的氨基酸位置上对胰岛素类似物进行酰化或烷基化。
在一个实施方案中，本发明提供胰岛素类似物，其经修饰以包含与在相当于天然胰岛素A10、B28、B29的位置上，或者在A链或B链的C端或N端上的氨基酸共价连接的酰基或烷基。胰岛素类似物在胰岛素类似物氨基酸与酰基或烷基之间还可包含间隔物。在一个实施方案中，酰基为脂肪酸或胆汁酸或其盐，例如C4-C30脂肪酸、C8-C24脂肪酸、胆酸、C4-C30烷基、C8-C24烷基，或包含胆汁酸的类固醇部分的烷基。间隔物是具有用于连接酰基或烷基的合适反应基的任何部分。在示例性的实施方案中，间隔物包含氨基酸、二肽或三肽，或亲水双官能间隔物。在一个实施方案中，间隔物选自：Trp、Glu、Asp、Cys和包含NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH的间隔物，其中m为1-6的任何整数，并且n为2-12的任何整数。这类酰化或烷基化胰岛素肽还可另包含亲水部分，任选为聚乙二醇。前述胰岛素类似物中的任一种可包含两个酰基或两个烷基，或其组合。
可以在胰岛素类似物内的任何位置上进行酰化，前提条件是保持胰岛素类似物胰岛素激动剂活性。酰基可直接与胰岛素类似物的氨基酸共价连接，或通过间隔物间接与胰岛素类似物的氨基酸共价连接，其中所述间隔物位于胰岛素肽的氨基酸与酰基之间。在本发明的一个具体方面，通过对胰岛素肽的氨基酸侧链的胺、羟基或巯基的直接酰化，将胰岛素类似物修饰成包含酰基。在一个实施方案中，胰岛素类似物通过氨基酸的侧链胺、羟基或巯基直接酰化。在一个实施方案中，酰化位于相当于天然胰岛素的A10、B28、B29或者A链或B链的C端或N端。在这点上，酰化胰岛素类似物可包含SEQIDNO:9和SEQIDNO:10的氨基酸序列，或其修饰氨基酸序列，该序列包含一个或多个本文所述氨基酸修饰，其中在相当于天然胰岛素的A10、B28、B29的位置上或者在A链或B链的C端或N端上的至少一个氨基酸被修饰成包含侧链胺、羟基或巯基的任何氨基酸。在一些具体的实施方案中，通过在相当于天然胰岛素的A10、B28、B29位上的氨基酸的侧链胺、羟基或巯基进行胰岛素肽的直接酰化。根据一个实施方案，二肽元件的氨基酸侧链之一被酰化。
在一个实施方案中，待酰化的氨基酸为下式IV的氨基酸：
其中n=1-4
[式IV]
在一些示例性的实施方案中，式IV的氨基酸是其中n为4(Lys)或n为3(Orn)的氨基酸。
在其它实施方案中，包含侧链羟基的氨基酸为下式V的氨基酸：
其中n=1-4
[式V]
在一些示例性的实施方案中，式V氨基酸是其中n为1的氨基酸(Ser)。
在其它实施方案中，包含侧链巯基的氨基酸为下式VI的氨基酸：
其中n=1-4
[式VI]
在一些示例性的实施方案中，式VI氨基酸为其中n为1的氨基酸(Cys)。
在一些示例性的实施方案中，通过对间隔物的胺、羟基或巯基的酰化来修饰胰岛素类似物以包含酰基，所述间隔物与在A10、B28或B29位(按照野生型胰岛素的氨基酸编号)上的氨基酸的侧链连接。间隔物与之连接的氨基酸可以是包含允许与间隔物连接的部分的任何氨基酸。例如包含侧链NH2、-OH或-COOH的氨基酸(例如Lys、Orn、Ser、Asp或Glu)是适宜的。在一个实施方案中，间隔物是包含侧链胺、羟基或巯基的氨基酸，或者是包含含有侧链胺、羟基或巯基的氨基酸的二肽或三肽。
当通过间隔物的胺基团进行酰化时，酰化可通过氨基酸的α胺或侧链胺进行。在其中α胺被酰化的情况下，间隔物氨基酸可以是任何氨基酸。例如，间隔物氨基酸可以是疏水氨基酸，例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr。可替换地，间隔物氨基酸可以是酸性残基，例如Asp和Glu。在其中间隔物氨基酸的侧链胺被酰化的情况下，间隔物氨基酸是包含侧链胺的氨基酸，例如式I氨基酸(例如Lys或Orn)。在这种情况下，间隔物氨基酸的α胺和侧链胺两个都可能被酰化，使得胰岛素肽是二酰化的。本公开内容还考虑二酰化胰岛素类似物。
当酰化通过间隔物的羟基进行时，所述氨基酸或者二肽或三肽的氨基酸之一可以为式II氨基酸。在一个具体的示例性实施方案中，该氨基酸为Ser。
当酰化通过间隔物的巯基进行时，所述氨基酸或者二肽或三肽的氨基酸之一可为式III氨基酸。在一个具体的示例性实施方案中，该氨基酸为Cys。
在一个实施方案中，间隔物包含亲水双官能间隔物。在一个具体的实施方案中，间隔物包含氨基聚(烷基氧基)羧酸酯。在这点上，间隔物可包含例如NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH，其中m为1-6的任何整数，并且n为2-12的任何整数，例如8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，其可购自PeptidesInternational,Inc.(Louisville,KY)。
通过胺、羟基和巯基进行肽酰化的合适方法是本领域已知的。参见例如Miller,BiochemBiophysResCommun218:377-382(1996)；Shimohigashi和Stammer,IntJPeptProteinRes19:54-62(1982)；Previero等,BiochimBiophysActa263:7-13(1972)(用于通过羟基进行酰化的方法)；San和Silvius,JPeptRes66:169-180(2005)(用于通过巯基进行酰化的方法)；BioconjugateChem.“ChemicalModificationsofProteins:HistoryandApplications”第1,2-12页(1990)；Hashimoto等,PharmacueticalRes.“SynthesisofPalmitoylDerivativesofInsulinandtheirBiologicalActivity”第6卷,第2期第171-176页(1989)。
酰化胰岛素肽的酰基可为任何大小，例如任何长度的碳链，并且可以是直链或支链的。在本发明的一些具体实施方案中，酰基为C4-C30脂肪酸。例如，酰基可为以下脂肪酸中的任一种：C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸或C30脂肪酸。在一个实施方案中，酰基为C8-C20脂肪酸，例如C14脂肪酸或C16脂肪酸。
在一个可替换的实施方案中，酰基为胆汁酸。胆汁酸可以是任何合适的胆汁酸，包括但不限于胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘胆酸和胆固醇酸(cholesterolacid)。
在一个具体的实施方案中，胰岛素类似物包含胆固醇酸，其通过烷基化脱氨基Cys间隔物(即烷基化3-巯基丙酸间隔物)与胰岛素类似物的Lys残基连接。烷基化脱氨基Cys间隔物可以为例如包含十二乙二醇部分的脱氨基-Cys间隔物。在一个实施方案中，胰岛素类似物包含以下结构：
或
。
本文所述的酰化胰岛素类似物可进一步修饰以包含亲水部分。在一些具体的实施方案中，亲水部分可包含聚乙二醇(PEG)链。亲水部分的掺入可通过任何合适的方法，例如本文所述的任何方法来完成。
可替换地，酰化胰岛素肽可包含间隔物，其中对间隔物进行酰化并且修饰以包含亲水部分。合适间隔物的非限制性实例包括包含选自Cys、Lys、Orn、高Cys和Ac-Phe中的一个或多个氨基酸的间隔物。
根据一个实施方案，对胰岛素类似物进行修饰以包含通过酯、醚、硫醚、酰胺或烷基胺键与胰岛素类似物连接的烷基，用于延长循环中的半衰期和/或延迟起效和/或延长作用持续时间和/或提高对蛋白酶(例如DPP-IV)的抗性。
烷基化胰岛素肽的烷基可以是任何大小，例如任何长度的碳链，且可以是直链或支链的。在本发明的一个实施方案中，烷基为C1-C30烷基。例如，烷基可以是以下烷基中的任一种：C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C6烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、C14烷基、C16烷基、C18烷基、C20烷基、C22烷基、C24烷基、C26烷基、C28烷基或C30烷基。在一个实施方案中，烷基为C8-C20烷基，例如C14烷基或C16烷基。
在一些具体的实施方案中，烷基包含胆汁酸的类固醇部分，所述胆汁酸例如为胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、牛磺胆酸、甘胆酸和胆固醇酸。
根据一些实施方案，二肽前药元件可以进一步修饰成包含亲水部分。在有些实施方案中，亲水部分是聚乙二醇链。根据一些实施方案，40k或更大的聚乙二醇链与二肽前药元件的A或B氨基酸的侧链共价结合。在另一个实施方案中，二肽前药元件额外地或可替换地被下述物质酰化或烷基化：脂肪酸或胆汁酸或其盐(例如C4-C30脂肪酸、C8-C24脂肪酸、胆酸)、C4-C30烷基、C8-C24烷基或包含胆汁酸的类固醇部分的烷基。二肽前药元件的‘A’氨基酸可以包括，例如，通过它的侧链氨基与酰基或烷基共价结合的d-赖氨酸，或通过它的侧链硫氢基与PEG分子共价结合的d-半胱氨酸。二肽前药元件可以与亲水部分、酰基或烷基直接结合，或通过如本文中所述的间隔物与亲水部分、酰基或烷基结合。可替换地，二肽前药元件可与长效蛋白质(例如葡聚糖或大的PEG分子(大于或等于80,000道尔顿))连接，所述长效蛋白质用于使前药屏蔽（sequester）在注射部位，直到二肽的裂解释放出活性胰岛素肽(Q)。
二肽前药元件结构对裂解速率的影响
如前文所述，二肽前药元件A-B从生物活性肽(例如，胰岛素肽(Q))裂解并从而活化前药的速率，取决于二肽前药元件的氨基酸的结构(包括N-烷基化、取代基数目、长度或体积)和立体化学。二肽前药元件A-B从生物活性肽(例如，胰岛素肽(Q))裂解的速率也取决于在二酮哌嗪形成过程中Q的离去基团的位阻、亲核性和稳定性。一些这样的结构特征描述在下面的类别I、类别II和类别III中，它们形成本发明的部分内容。从这些类别中的任一个中明确地排除：在国际申请号PCT/US2009/68745（于2009年12月18日提交）或它的序列表中公开的肽序列，和在国际申请号PCT/US2009/68745（于2009年12月18日提交）中公开的(1)二肽前药元件、(2)A氨基酸和/或(3)B氨基酸的子类别，前提条件是，它们完全落入本文所述的任一个子类别内和/或与本文所述的任一个子类别的部分内容重叠，并且仅在赋予要求保护的主题新颖性所必需的范围内。
根据一个实施方案，自发裂解的二肽元件(A-B)通过酰胺键与胰岛素肽(Q)共价连接，所述酰胺键在A-B和Q的脂族氨基之间。例如，A-B连接的脂族氨基可以是在A链或B链的N端氨基酸上的α氨基。可替换地，A-B连接的脂族氨基可以是在Q的侧链上的脂族氨基。在一个实施方案中，A-B与赖氨酸的侧链胺连接，包括例如在下述位置处的赖氨酸：b链序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQIDNO:8)的B29位，或B链序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQIDNO:9)的B28位。
在一个实施方案中，Q是包含A链和B链的胰岛素肽，其中所述A链包含序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)，且所述B链包含序列X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)，
其中
X14是键，或选自下述的1-4个氨基酸的序列：FVNQ(SEQIDNO:11)、VNQ、NQ和Q；
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH、NH2和OCH3；
X3选自天冬酰胺、鸟氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X7为酪氨酸；
X8为组氨酸、天冬酰胺或酪氨酸，其中A-B通过在A-B和Q的脂族氨基之间的酰胺键与Q连接。
在一个实施方案中，Q是包含A链和B链的胰岛素肽，其中Q是包含A链和B链的胰岛素肽，其中所述A链包含序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)，且所述B链包含序列X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)，
其中
X14是键，或选自下述的1-4个氨基酸的序列：FVNQ(SEQIDNO:11)、VNQ、NQ和Q；
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH、NH2、NHR10和OCH3，其中R10是具有通用结构A-B的二肽；
X3选自天冬酰胺、鸟氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
其中X12选自OH、NH2、NHR11和OCH3，其中R11是具有通用结构A-B的二肽；
X8为组氨酸、天冬酰胺或以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH、NH2、NHR12和OCH3，其中R12是具有通用结构A-B的二肽，其中A-B通过在A-B和Q的氨基酸侧链上的芳族氨基之间的酰胺键与Q连接。
类别I：二肽前药元件的氨基酸B的组成
在有些实施方案中，前药的半衰期（例如，在生理条件下的PBS中，A-B从Q化学裂解的半衰期(t1/2)为至少约1小时至约1周）取决于N-烷基取代基在B氨基酸上的存在和长度。例如，与具有在B氨基酸上的更长N-烷基取代基(例如，Gly(N-己基))的前药相比，具有在B氨基酸上的更短N-烷基取代基(例如Gly(N-甲基))的前药将经历更缓慢速率的A-B裂解，并具有更长的半衰期。
在有些实施方案中，前药的半衰期取决于二肽前药元件的B氨基酸的烷基侧链的存在与否和烷基侧链β位处的取代度。例如，与具有在β位处被单取代的N-烷基化的B氨基酸(例如，N-烷基化的亮氨酸)的前药相比，具有在β位处被二取代的N-烷基化的B氨基酸(例如，N-烷基化的异亮氨酸)的前药将经历更缓慢的A-B裂解，并具有更长的半衰期。进一步，与具有在β位处未被取代的N-烷基化的B氨基酸(例如，N-烷基化的丙氨酸)的前药相比，具有在β位处被单取代的N-烷基化的B氨基酸(例如，N-烷基化的亮氨酸)的前药将经历更缓慢的A-B裂解，并具有更长的半衰期。再进一步，与具有甘氨酸或N-烷基化的甘氨酸作为B氨基酸的前药相比，具有未被取代的β位的N-烷基化的B氨基酸(例如，N-烷基化的丙氨酸)的前药将经历更缓慢的A-B裂解，并具有更长的半衰期。
在有些实施方案中，前药的半衰期取决于B氨基酸的侧链的体积。例如，与具有在B氨基酸(例如，N-烷基化的丙氨酸)上的体积更小的侧链的前药相比，具有在B氨基酸(例如，N-烷基化的苯丙氨酸)上的更庞大侧链的前药将经历更缓慢的A-B裂解，并具有更长的半衰期。通过二肽所连接的药物(例如，胰岛素)的胺，可以进一步区分二肽的裂解速率。更具体地，与连接N端胺相比，与芳族胺连接的相同的二肽将以更快的速率裂解，而与二肽连接赖氨酸残基的侧链胺时相比，与N-端胺连接的二肽将以更快的速率裂解。
二肽前药元件的B氨基酸的组成可以分类为以下的子类别：IA、IB和IC。一般而言，在子类别IA中的二肽前药元件经历最快的裂解，并且在子类别IC中的二肽前药元件经历最慢的裂解。
子类别IA：二肽前药元件的氨基酸B是N-烷基化的甘氨酸
在有些实施方案中，前药包含结构：
A-B-Q；
其中Q是生物活性肽(例如，胰岛素肽)；
其中A-B包含结构：
其中
R1和R2独立地选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；
R3为C1-C18烷基；
R4和R8各自为H；
R5为NHR6；
R6为H或C1-C4烷基，或者R5和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和，
R7选自H和OH。
在有些实施方案中，B氨基酸选自甘氨酸(N-甲基)、甘氨酸(N-乙基)、甘氨酸(N-丙基)、甘氨酸(N-丁基)、甘氨酸(N-戊基)、甘氨酸(N-己基)、甘氨酸(N-庚基)和甘氨酸(N-辛基)。例如，B氨基酸可以是甘氨酸(N-甲基)或甘氨酸(N-己基)。
在有些实施方案中，当R1和R2都为氢时，R3为C1-C4烷基。在有些实施方案中，当R1或R2之一不为氢时，R3为C1-C4烷基。
子类别IB：二肽前药元件的氨基酸B是未被取代的或是在β位处被单取代的
在有些实施方案中，前药包含结构：
A-B-Q；
其中Q是生物活性肽(例如，胰岛素肽)；
其中A-B包含结构：
其中
R1和R2独立地选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；
R3为C1-C18烷基；
R4选自CH3、CH2(C1-C10烷基)、CH2(C2-C10烯基)、CH2(C0-C10烷基)OH、CH2(C0-C10烷基)SH、CH2(C0-C3烷基)SCH3、CH2(C0-C3烷基)CONH2、CH2(C0-C3烷基)COOH、CH2(C0-C3烷基)NH2、CH2(C0-C3烷基)NHC(NH2 +)NH2、CH2(C0-C3烷基)(C3-C6环烷基)、CH2(C0-C3烷基)(C2-C5杂环基)、CH2(C0-C3烷基)(C6-C10芳基)R7、CH2(C1-C3烷基)(C3-C9杂芳基)和CH2(C0-C12烷基)(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子；或者R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R8是H，
R5为NHR6，或者R5和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R6为H或C1-C4烷基；和，
R7选自H和OH。
在有些实施方案中，R4选自CH3、CH2(C1-C4烷基)、CH2(C1-C4)烯基、CH2(C0-C4烷基)OH、CH2(C0-C4烷基)SH、CH2(C0-C3烷基)SCH3、CH2(C0-C3烷基)CONH2、CH2(C0-C3烷基)COOH、CH2(C0-C4烷基)NH2和CH2(C0-C3烷基)NHC(NH2 +)NH2。
在这些实施方案中的B氨基酸的非限制性实例包括丙氨酸(N-C1-C10烷基)、亮氨酸(N-C1-C10烷基)、甲硫氨酸(N-C1-C10烷基)、天冬酰胺(N-C1-C10烷基)、谷氨酸(N-C1-C10烷基)、天冬氨酸(N-C1-C10烷基)、谷氨酰胺(N-C1-C10烷基)、组氨酸(N-C1-C10烷基)、赖氨酸(N-C1-C10烷基)、精氨酸(N-C1-C10烷基)、丝氨酸(N-C1-C10烷基)和半胱氨酸(N-C1-C10烷基)。
在有些实施方案中，B氨基酸选自丙氨酸(N-C1-C6烷基)、亮氨酸(N-C1-C6烷基)、甲硫氨酸(N-C1-C6烷基)、天冬酰胺(N-C1-C6烷基)、谷氨酸(N-C1-C6烷基)、天冬氨酸(N-C1-C6烷基)、谷氨酰胺(N-C1-C6烷基)、组氨酸(N-C1-C6烷基)、赖氨酸(N-C1-C6烷基)、精氨酸(N-C1-C6烷基)、丝氨酸(N-C1-C6烷基)和半胱氨酸(N-C1-C6烷基)。
例如，B氨基酸可以包括丙氨酸(N-甲基)、亮氨酸(N-甲基)、甲硫氨酸(N-甲基)、天冬酰胺(N-甲基)、谷氨酸(N-甲基)、天冬氨酸(N-甲基)、谷氨酰胺(N-甲基)、组氨酸(N-甲基)、赖氨酸(N-甲基)、精氨酸(N-甲基)、丝氨酸(N-甲基)和半胱氨酸(N-甲基)。
在有些实施方案中，R4选自CH2(C0-C3烷基)(C3-C6环烷基)、CH2(C0-C3烷基)(C2-C5杂环基)、CH2(C0-C3烷基)(C6-C10芳基)R7、CH2(C1-C3烷基)(C3-C9杂芳基)和CH2(C0-C12烷基)(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，且其中R7选自H和OH。
在这些实施方案中的B氨基酸的非限制性实例包括苯丙氨酸(N-C1-C10烷基)、酪氨酸(N-C1-C10烷基)和色氨酸(N-C1-C10烷基)。在有些实施方案中，B氨基酸选自苯丙氨酸(N-C1-C6烷基)、酪氨酸(N-C1-C6烷基)和色氨酸(N-C1-C6烷基)。例如，B氨基酸可以包括苯丙氨酸(N-甲基)、酪氨酸(N-甲基)和色氨酸(N-甲基)。
在有些实施方案中，B氨基酸为脯氨酸。在有些实施方案中，从子类别IB中排除脯氨酸。
子类别IC：二肽前药元件的氨基酸B在β位处被二取代
在有些实施方案中，前药包含结构：
A-B-Q；
其中Q是生物活性肽(例如，胰岛素肽)；
其中A-B包含结构：
其中
R1和R2独立地选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基；
R3为C1-C18烷基；
R4独立地选自CH(C1-C8烷基)2、CH(C2-C8烯基)2、CH(C1-C8烷基)(OH)、CH(C1-C8烷基)((C1-C8烷基)SH)、CH(C1-C3烷基)((C1-C8烷基)(NH2))；
R8是H；
R5为NHR6，或者R5和R2与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R6为H或C1-C4烷基；和，
R7选自H和OH。
在有些实施方案中，R4是CH(C1-C8烷基)2或CH(C1-C8烷基)OH。B氨基酸的非限制性实例包括异亮氨酸(N-C1-C10烷基)、缬氨酸(N-C1-C10烷基)和苏氨酸(N-C1-C10烷基)。在有些实施方案中，B氨基酸选自异亮氨酸(N-C1-C6烷基)、缬氨酸(N-C1-C6烷基)和苏氨酸(N-C1-C6烷基)。例如，B氨基酸可以包括异亮氨酸(N-甲基)、缬氨酸(N-甲基)和苏氨酸(N-甲基)。
类别II：二肽前药元件的氨基酸A的组成
在有些实施方案中，前药的半衰期取决于在A氨基酸的α位处的取代基的数目。例如，与包含作为α,α-二取代的氨基酸(例如，Aib)的A氨基酸的前药相比，包含作为α-单取代的氨基酸(例如，Ala)的A氨基酸的前药将经历更缓慢的裂解，并具有更长的半衰期。
在有些实施方案中，前药的半衰期取决于在A氨基酸的α氨基上的烷基化程度。通常，烷基化程度越大，裂解速率越慢，并且前药的半衰期越长。例如，与Ala相比，具有N-烷基化的Ala的二肽前药元件将以更慢的速率裂解，并具有更长的半衰期。
二肽前药元件的A氨基酸的组成可以分类为以下子类别IIA和IIB。通常，子类别IIA中的二肽前药元件比在子类别IIB中的二肽前药元件更快地裂解。
子类别IIA：二肽前药元件的氨基酸A在α位处被二取代
在有些实施方案中，二肽前药元件的A氨基酸在α位处被二取代。在这些实施方案中，在子类别IA、IB和IC中描述的结构的R1和R2独立地选自C1-C10烷基、C2-C10烯基、(C1-C10烷基)OH、(C1-C10烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基，且其中R7选自H和OH。
例如，A氨基酸可以包括氨基异丁酸(Aib)。
子类别IIB：二肽前药元件的氨基酸A是未被取代的或是在α位处被单取代的
在有些实施方案中，二肽前药元件的A氨基酸是未被取代的或是在α位处被单取代的。在这些实施方案中，在子类别IA、IB和IC中描述的结构的R1为H，且在子类别IA、IB和IC中描述的结构的R2选自H、C1-C10烷基、C2-C10烯基、(C1-C10烷基)OH、(C1-C10烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2 +)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中R7选自H和OH，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或者R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基，或者R2和R5与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环。
在有些实施方案中，二肽前药元件的A氨基酸具有‘d’立体化学。在这些实施方案中的A氨基酸的非限制性实例包括赖氨酸、半胱氨酸和丙氨酸。例如，d-赖氨酸、d-半胱氨酸和d-丙氨酸。在有些实施方案中，d-立体化学可以通过减慢前药肽的蛋白水解性降解而增加半衰期。
在有些实施方案中，A氨基酸被具有1-4个碳原子的基团N-烷基化，例如Ala(N-C1-C4烷基)、Lys(N-C1-C4烷基)和Cys(N-C1-C4烷基)。例如，A氨基酸可以是Ala(N-甲基)、Lys(N-甲基)和Cys(N-甲基)。A氨基酸的N-烷基化会降低二肽前药元件从Q裂解的速率，并提供更长的半衰期。
类别III：二肽前药元件(A-B)与肽药物(Q)的缀合位点
在有些实施方案中，前药的半衰期取决于在二酮哌嗪形成过程中在Q上的离去基团的位阻、亲核性和稳定性。离去基团的位阻越小，离去基团的亲核性越小，或裂解以后离去基团的稳定性越高，前药的半衰期越短。在Q上的离去基团的类型可以由A-B和Q的氨基之间的连接的类型（如在下面的子类别IIIA和IIIB中所述）决定。一般而言，与在子类别IIIA中的二肽前药元件相比，在子类别IIIB中的二肽前药元件从Q更快地裂解，且具有更短的半衰期。
子类别IIIA：A-B与Q的脂族氨基连接
在有些实施方案中，A-B通过在A-B和Q的脂族氨基之间的酰胺键与Q连接，以得到这样的前药：在生理条件下的PBS中，A-B从Q化学裂解的半衰期(t1/2)为至少约1小时至约1周，如前文所述。
在有些实施方案中，A-B通过在A-B和Q的N端氨基酸的α氨基之间的酰胺键与Q连接。例如，具有来自子类别IA、IB和IC中任一个的B氨基酸和来自子类别IIA和IIB中任一个的A氨基酸的二肽前药元件可以与Q的N端氨基酸连接，以得到这样的前药：在生理条件下的PBS中，A-B从Q化学裂解的半衰期(t1/2)为至少约1小时至约1周。
在有些实施方案中，A-B通过在A-B和Q的氨基酸的侧链的脂族氨基之间的酰胺键与Q连接。例如，具有来自子类别IA、IB和IC中任一个的B氨基酸和来自子类别IIA和IIB中任一个的A氨基酸的二肽前药元件可以与Q的氨基酸的侧链的脂族氨基连接，以得到这样的前药：在生理条件下的PBS中，A-B从Q化学裂解的半衰期(t1/2)为至少约1小时至约1周。
在有些实施方案中，当A-B通过在A-B和Q的脂族氨基之间的酰胺键与Q连接时，要么A应当是α,α-二取代的氨基酸(子类别IIA)，要么B应当是N-烷基化的(子类别IA、IB或IC中的任一个)，要么前二者都成立。例如，当A是α-单取代的氨基酸(例如，Ala)、B是未N-烷基化的、并且A-B通过Q的脂族氨基与Q连接时，那么A-B将不会显著裂解。
在其它实施方案中，当A-B通过在A-B和Q的脂族氨基之间的酰胺键与Q连接、A是在α位未被取代的氨基酸(例如甘氨酸)、并且B是来自子类别IA的氨基酸(N-烷基化的甘氨酸)时，B氨基酸的N-烷基取代基具有至少5个碳原子的长度(例如，N-C5-C8烷基)。
在其它实施方案中，当A-B通过在A-B和Q的脂族氨基之间的酰胺键与Q连接、并且A氨基酸是未被取代的或是在α位被单取代的(子类别IIB)时，B氨基酸不是脯氨酸。
子类别IIIB：A-B与Q的芳族氨基连接
在有些实施方案中，A-B通过酰胺键与Q连接，所述酰胺键在A-B和Q的氨基酸的侧链的芳族氨基之间，以得到这样的前药：在生理条件下的PBS中，A-B从Q化学裂解的半衰期(t1/2)为至少约1小时至约1周，如前文所述。例如，具有来自子类别IA、IB和IC中任一个的B氨基酸和来自子类别IIA和IIB中任一个的A氨基酸的二肽前药元件可以与Q的氨基酸的侧链的芳族氨基连接，以得到这样的前药：在生理条件下的PBS中，A-B从Q化学裂解的半衰期(t1/2)为至少约1小时至约1周。
由类别I定义的任意B氨基酸可以与由类别II定义的任意A氨基酸相组合，以形成二肽前药元件。该二肽前药元件可以与在类别III中描述的任意位置相连。通过选择下述参数，可以调节前药的半衰期：
(i)在A氨基酸的α位上的取代基的数目；
(ii)A氨基酸和B氨基酸的N-烷基化程度；
(iii)在B氨基酸的β位上的取代基的数目；
(iv)B氨基酸的侧链的体积；和，
(iii)在二酮哌嗪形成过程中在Q上的离去基团的位阻、亲核性和稳定性。
二肽前药元件A-B的修饰
可以进一步修饰上述的二肽前药元件以包含如前文所述的亲水部分、酰基或烷基。在有些实施方案中，二肽前药元件包括赖氨酸，所述赖氨酸通过它的侧链氨基与酰基或烷基缀合。在有些实施方案中，二肽前药元件包括半胱氨酸，所述半胱氨酸通过侧链硫氢基与亲水部分(例如，40kDPEG)缀合。亲水部分、酰基或烷基可以与二肽前药元件直接缀合，或通过间隔物缀合。在有些示例性的实施方案中，亲水基团、烷基和/或酰基与二肽前药元件的A氨基酸缀合。
在有些实施方案中，将下述二肽前药元件聚乙二醇化：dCys-Gly(N-己基)dCys-Gly(N-甲基)和dCys-Phe(N-甲基)。在有些实施方案中，下述二肽前药元件包括酰基：dLys-Gly(N-己基)、dLys-Gly(N-甲基)和dLys-Phe(N-甲基)。在有些实施方案中，下述二肽前药元件包括烷基：dLys-Gly(N-己基)、dLys-Gly(N-甲基)和dLys-Phe(N-甲基)。
示例性的实施方案
本发明的二肽前药元件可以包括来自类别I的任意B氨基酸与来自类别II的任意A氨基酸的组合。适用于二肽前药元件的A氨基酸和B氨基酸的氨基酸的非限制性实例列出在下表中：
氨基酸编号 氨基酸‘A’ 氨基酸‘B’
1 Aib Gly(N-C1-C8烷基)
2 Gly Ala(N-C1-C8烷基)
3 Ala Leu(N-C1-C8烷基)
4 Leu Met(N-C1-C8烷基)
5 Met Asn(N-C1-C8烷基)
6 Asn Glu(N-C1-C8烷基)
7 Glu Asp(N-C1-C8烷基)
8 Asp Gln(N-C1-C8烷基)
9 Gln His(N-C1-C8烷基)
10 His Lys(N-C1-C8烷基)
11 Lys Arg(N-C1-C8烷基)
12 Arg Ser(N-C1-C8烷基)
13 Ser Cys(N-C1-C8烷基)
14 Cys Pro
15 Pro Phe(N-C1-C8烷基)
16 Phe Tyr(N-C1-C8烷基)
17 Tyr Trp(N-C1-C8烷基)
18 Trp Ile(N-C1-C8烷基)
19 Ile Val(N-C1-C8烷基)
20 Val Thr(N-C1-C8烷基)
21 Thr d-Ala(N-C1-C8烷基)
22 d-Ala d-Leu(N-C1-C8烷基)
23 d-Leu d-Met(N-C1-C8烷基)
24 d-Met d-Asn(N-C1-C8烷基)
25 d-Asn d-Glu(N-C1-C8烷基)
26 d-Glu d-Asp(N-C1-C8烷基)
27 d-Asp d-Gln(N-C1-C8烷基)
28 d-Gln d-His(N-C1-C8烷基)
29 d-His d-Lys(N-C1-C8烷基)
30 d-Lys d-Arg(N-C1-C8烷基)
31 d-Arg d-Ser(N-C1-C8烷基)
32 d-Ser d-Cys(N-C1-C8烷基)
33 d-Cys d-Pro
34 d-Pro d-Phe(N-C1-C8烷基)
35 d-Phe d-Tyr(N-C1-C8烷基)
36 d-Tyr d-Trp(N-C1-C8烷基)
37 d-Trp d-Ile(N-C1-C8烷基)
38 d-Ile d-Val(N-C1-C8烷基)71 -->
39 d-Val d-Thr(N-C1-C8烷基)
40 d-Thr Gly(N-甲基)
41 Gly(N-甲基) Ala(N-甲基)
42 Ala(N-甲基) Leu(N-甲基)
43 Leu(N-甲基) Met(N-甲基)
44 Met(N-甲基) Asn(N-甲基)
45 Asn(N-甲基) Glu(N-甲基)
46 Glu(N-甲基) Asp(N-甲基)
47 Asp(N-甲基) Gln(N-甲基)
48 Gln(N-甲基) His(N-甲基)
49 His(N-甲基) Lys(N-甲基)
50 Lys(N-甲基) Arg(N-甲基)
51 Arg(N-甲基) Ser(N-甲基)
52 Ser(N-甲基) Cys(N-甲基)
53 Cys(N-甲基) Phe(N-甲基)
54 Phe(N-甲基) Tyr(N-甲基)
55 Tyr(N-甲基) Trp(N-甲基)
56 Trp(N-甲基) Ile(N-甲基)
57 Ile(N-甲基) Val(N-甲基)
58 Val(N-甲基) Thr(N-甲基)
59 Thr(N-甲基) d-Ala(N-甲基)
60 d-Ala(N-甲基) d-Leu(N-甲基)
61 d-Leu(N-甲基) d-Met(N-甲基)
62 d-Met(N-甲基) d-Asn(N-甲基)
63 d-Asn(N-甲基) d-Glu(N-甲基)
64 d-Glu(N-甲基) d-Asp(N-甲基)
65 d-Asp(N-甲基) d-Gln(N-甲基)
66 d-Gln(N-甲基) d-His(N-甲基)
67 d-His(N-甲基) d-Lys(N-甲基)
68 d-Lys(N-甲基) d-Arg(N-甲基)
69 d-Arg(N-甲基) d-Ser(N-甲基)
70 d-Ser(N-甲基) d-Cys(N-甲基)
71 d-Cys(N-甲基) d-Phe(N-甲基)
72 d-Phe(N-甲基) d-Tyr(N-甲基)
73 d-Tyr(N-甲基) d-Trp(N-甲基)
74 d-Trp(N-甲基) d-Ile(N-甲基)
75 d-Ile(N-甲基) d-Val(N-甲基)
76 d-Val(N-甲基) d-Thr(N-甲基)
77 d-Thr(N-甲基) Gly(N-己基)72 -->
78 Ala(N-己基)
79 Leu(N-己基)
80 Met(N-己基)
81 Asn(N-己基)
82 Glu(N-己基)
83 Asp(N-己基)
84 Gln(N-己基)
85 His(N-己基)
86 Lys(N-己基)
87 Arg(N-己基)
88 Ser(N-己基)
89 Cys(N-己基)
90 Phe(N-己基)
91 Tyr(N-己基)
92 Trp(N-己基)
93 Ile(N-己基)
94 Val(N-己基)
95 Thr(N-己基)
96 d-Ala(N-己基)
97 d-Leu(N-己基)
98 d-Met(N-己基)
99 d-Asn(N-己基)
100 d-Glu(N-己基)
101 d-Asp(N-己基)
102 d-Gln(N-己基)
103 d-His(N-己基)
104 d-Lys(N-己基)
105 d-Arg(N-己基)
106 d-Ser(N-己基)
107 d-Cys(N-己基)
108 d-Phe(N-己基)
109 d-Tyr(N-己基)
110 d-Trp(N-己基)
111 d-Ile(N-己基)
112 d-Val(N-己基)
113 d-Thr(N-己基)
在有些实施方案中，二肽前药元件包括A1-A77中任一个与B1-B113中任一个的组合。例如，二肽前药元件的A氨基酸和B氨基酸的组合可以包括：
在有些实施方案中，二肽前药元件包括A1-A154中任一个与B1-B113中任一个的组合。例如，二肽前药元件的A氨基酸和B氨基酸的组合可以包括：
。
子类别IA：二肽前药元件的氨基酸B是N-烷基化的甘氨酸
在有些实施方案中，二肽前药元件的B氨基酸是N-烷基化的甘氨酸。具有N-烷基化的甘氨酸作为B氨基酸的二肽前药元件的非限制性实例显示在下表中：
二肽前药元件编号 氨基酸‘A’ 氨基酸‘B’
1 Aib Gly(N-C1-C8烷基)
2 d-Ala Gly(N-C1-C8烷基)
3 d-Lys Gly(N-C1-C8烷基)
4 d-Cys Gly(N-C1-C8烷基)
5 Aib Gly(N-甲基)
6 d-Ala Gly(N-甲基)
7 d-Lys Gly(N-甲基)
8 d-Cys Gly(N-甲基)
9 Aib Gly(N-己基)
10 d-Ala Gly(N-己基)
11 d-Lys Gly(N-己基)
12 d-Cys Gly(N-己基)
子类别IB：二肽前药元件的氨基酸B是未被取代的或是在β位处被单取代的
在有些实施方案中，二肽前药元件的B氨基酸是未被取代的或是在β位处被单取代的，且具有相对不庞大的侧链。具有未被取代的或在β位处被单取代的且具有相对不庞大的侧链的B氨基酸的二肽前药元件的非限制性实例显示在下表中：
二肽前药元件编号 氨基酸‘A’ 氨基酸‘B’
13 Aib Ala(N-C1-C8烷基)
14 d-Ala Ala(N-C1-C8烷基)
15 d-Lys Ala(N-C1-C8烷基)
16 d-Cys Ala(N-C1-C8烷基)
17 Aib Leu(N-C1-C8烷基)
18 d-Ala Leu(N-C1-C8烷基)
19 d-Lys Leu(N-C1-C8烷基)
20 d-Cys Leu(N-C1-C8烷基)
21 Aib Met(N-C1-C8烷基)
22 d-Ala Met(N-C1-C8烷基)
23 d-Lys Met(N-C1-C8烷基)
24 d-Cys Met(N-C1-C8烷基)
25 Aib Asn(N-C1-C8烷基)
26 d-Ala Asn(N-C1-C8烷基)
27 d-Lys Asn(N-C1-C8烷基)
28 d-Cys Asn(N-C1-C8烷基)
29 Aib Glu(N-C1-C8烷基)
30 d-Ala Glu(N-C1-C8烷基)
31 d-Lys Glu(N-C1-C8烷基)
32 d-Cys Glu(N-C1-C8烷基)150 -->
33 Aib Asp(N-C1-C8烷基)
34 d-Ala Asp(N-C1-C8烷基)
35 d-Lys Asp(N-C1-C8烷基)
36 d-Cys Asp(N-C1-C8烷基)
37 Aib Gln(N-C1-C8烷基)
38 d-Ala Gln(N-C1-C8烷基)
39 d-Lys Gln(N-C1-C8烷基)
40 d-Cys Gln(N-C1-C8烷基)
41 Aib His(N-C1-C8烷基)
42 d-Ala His(N-C1-C8烷基)
43 d-Lys His(N-C1-C8烷基)
44 d-Cys His(N-C1-C8烷基)
45 Aib Lys(N-C1-C8烷基)
46 d-Ala Lys(N-C1-C8烷基)
47 d-Lys Lys(N-C1-C8烷基)
48 d-Cys Lys(N-C1-C8烷基)
49 Aib Arg(N-C1-C8烷基)
50 d-Ala Arg(N-C1-C8烷基)
51 d-Lys Arg(N-C1-C8烷基)
52 d-Cys Arg(N-C1-C8烷基)
53 Aib Ser(N-C1-C8烷基)
54 d-Ala Ser(N-C1-C8烷基)
55 d-Lys Ser(N-C1-C8烷基)
56 d-Cys Ser(N-C1-C8烷基)
57 Aib Cys(N-C1-C8烷基)
58 d-Ala Cys(N-C1-C8烷基)
59 d-Lys Cys(N-C1-C8烷基)
60 d-Cys Cys(N-C1-C8烷基)
61 Aib Pro
62 d-Ala Pro
63 d-Lys Pro
64 d-Cys Pro
65 Aib Ala(N-甲基)
66 d-Ala Ala(N-甲基)
67 d-Lys Ala(N-甲基)
68 d-Cys Ala(N-甲基)
69 Aib Leu(N-甲基)
70 d-Ala Leu(N-甲基)
71 d-Lys Leu(N-甲基)151 -->
72 d-Cys Leu(N-甲基)
73 Aib Met(N-甲基)
74 d-Ala Met(N-甲基)
75 d-Lys Met(N-甲基)
76 d-Cys Met(N-甲基)
77 Aib Asn(N-甲基)
78 d-Ala Asn(N-甲基)
79 d-Lys Asn(N-甲基)
80 d-Cys Asn(N-甲基)
81 Aib Glu(N-甲基)
82 d-Ala Glu(N-甲基)
83 d-Lys Glu(N-甲基)
84 d-Cys Glu(N-甲基)
85 Aib Asp(N-甲基)
86 d-Ala Asp(N-甲基)
87 d-Lys Asp(N-甲基)
88 d-Cys Asp(N-甲基)
89 Aib Gln(N-甲基)
90 d-Ala Gln(N-甲基)
91 d-Lys Gln(N-甲基)
92 d-Cys Gln(N-甲基)
93 Aib His(N-甲基)
94 d-Ala His(N-甲基)
95 d-Lys His(N-甲基)
96 d-Cys His(N-甲基)
97 Aib Lys(N-甲基)
98 d-Ala Lys(N-甲基)
99 d-Lys Lys(N-甲基)
100 d-Cys Lys(N-甲基)
101 Aib Arg(N-甲基)
102 d-Ala Arg(N-甲基)
103 d-Lys Arg(N-甲基)
104 d-Cys Arg(N-甲基)
105 Aib Ser(N-甲基)
106 d-Ala Ser(N-甲基)
107 d-Lys Ser(N-甲基)
108 d-Cys Ser(N-甲基)
109 Aib Cys(N-甲基)
110 d-Ala Cys(N-甲基)152 -->
111 d-Lys Cys(N-甲基)
112 d-Cys Cys(N-甲基)
113 Aib Ala(N-己基)
114 d-Ala Ala(N-己基)
115 d-Lys Ala(N-己基)
116 d-Cys Ala(N-己基)
117 Aib Leu(N-己基)
118 d-Ala Leu(N-己基)
119 d-Lys Leu(N-己基)
120 d-Cys Leu(N-己基)
121 Aib Met(N-己基)
122 d-Ala Met(N-己基)
123 d-Lys Met(N-己基)
124 d-Cys Met(N-己基)
125 Aib Asn(N-己基)
126 d-Ala Asn(N-己基)
127 d-Lys Asn(N-己基)
128 d-Cys Asn(N-己基)
129 Aib Glu(N-己基)
130 d-Ala Glu(N-己基)
131 d-Lys Glu(N-己基)
132 d-Cys Glu(N-己基)
133 Aib Asp(N-己基)
134 d-Ala Asp(N-己基)
135 d-Lys Asp(N-己基)
136 d-Cys Asp(N-己基)
137 Aib Gln(N-己基)
138 d-Ala Gln(N-己基)
139 d-Lys Gln(N-己基)
140 d-Cys Gln(N-己基)
141 Aib His(N-己基)
142 d-Ala His(N-己基)
143 d-Lys His(N-己基)
144 d-Cys His(N-己基)
145 Aib Lys(N-己基)
146 d-Ala Lys(N-己基)
147 d-Lys Lys(N-己基)
148 d-Cys Lys(N-己基)
149 Aib Arg(N-己基)153 -->
150 d-Ala Arg(N-己基)
151 d-Lys Arg(N-己基)
152 d-Cys Arg(N-己基)
153 Aib Ser(N-己基)
154 d-Ala Ser(N-己基)
155 d-Lys Ser(N-己基)
156 d-Cys Ser(N-己基)
157 Aib Cys(N-己基)
158 d-Ala Cys(N-己基)
159 d-Lys Cys(N-己基)
160 d-Cys Cys(N-己基)
在有些实施方案中，二肽前药元件的B氨基酸在β位处被单取代，且具有想对庞大的侧链，如下表所示：
二肽前药元件编号 氨基酸‘A’ 氨基酸‘B’
161 Aib Phe(N-C1-C8烷基)
162 d-Ala Phe(N-C1-C8烷基)
163 d-Lys Phe(N-C1-C8烷基)
164 d-Cys Phe(N-C1-C8烷基)
165 Aib Tyr(N-C1-C8烷基)
166 d-Ala Tyr(N-C1-C8烷基)
167 d-Lys Tyr(N-C1-C8烷基)
168 d-Cys Tyr(N-C1-C8烷基)
169 Aib Trp(N-C1-C8烷基)
170 d-Ala Trp(N-C1-C8烷基)
171 d-Lys Trp(N-C1-C8烷基)
172 d-Cys Trp(N-C1-C8烷基)
173 Aib Phe(N-甲基)
174 d-Ala Phe(N-甲基)
175 d-Lys Phe(N-甲基)
176 d-Cys Phe(N-甲基)
177 Aib Tyr(N-甲基)
178 d-Ala Tyr(N-甲基)
179 d-Lys Tyr(N-甲基)
180 d-Cys Tyr(N-甲基)
181 Aib Trp(N-甲基)
182 d-Ala Trp(N-甲基)
183 d-Lys Trp(N-甲基)
184 d-Cys Trp(N-甲基)154 -->
185 Aib Phe(N-己基)
186 d-Ala Phe(N-己基)
187 d-Lys Phe(N-己基)
188 d-Cys Phe(N-己基)
189 Aib Tyr(N-己基)
190 d-Ala Tyr(N-己基)
191 d-Lys Tyr(N-己基)
192 d-Cys Tyr(N-己基)
193 Aib Trp(N-己基)
194 d-Ala Trp(N-己基)
195 d-Lys Trp(N-己基)
196 d-Cys Trp(N-己基)
子类别IC：二肽前药元件的氨基酸B在β位处被二取代
在有些实施方案中，二肽前药元件的B氨基酸在β位处被二取代。具有在β位处被二取代的B氨基酸的二肽前药元件的非限制性实例显示在下表中：
二肽前药元件编号 氨基酸‘A’ 氨基酸‘B’
197 Aib Ile(N-C1-C8烷基)
198 d-Ala Ile(N-C1-C8烷基)
199 d-Lys Ile(N-C1-C8烷基)
200 d-Cys Ile(N-C1-C8烷基))
201 Aib Val(N-C1-C8烷基)
202 d-Ala Val(N-C1-C8烷基)
203 d-Lys Val(N-C1-C8烷基)
204 d-Cys Val(N-C1-C8烷基)
205 Aib Thr(N-C1-C8烷基)
206 d-Ala Thr(N-C1-C8烷基)
207 d-Lys Thr(N-C1-C8烷基)
208 d-Cys Thr(N-C1-C8烷基)
209 Aib Ile(N-甲基)
210 d-Ala Ile(N-甲基)
211 d-Lys Ile(N-甲基)
212 d-Cys Ile(N-甲基))
213 Aib Val(N-甲基)
214 d-Ala Val(N-甲基)
215 d-Lys Val(N-甲基)
216 d-Cys Val(N-甲基)
217 Aib Thr(N-甲基)
218 d-Ala Thr(N-甲基)155 -->
219 d-Lys Thr(N-甲基)
220 d-Cys Thr(N-甲基)
221 Aib Ile(N-己基)
222 d-Ala Ile(N-己基)
223 d-Lys Ile(N-己基)
224 d-Cys Ile(N-己基)
225 Aib Val(N-己基)
226 d-Ala Val(N-己基)
227 d-Lys Val(N-己基)
228 d-Cys Val(N-己基)
229 Aib Thr(N-己基)
230 d-Ala Thr(N-己基)
231 d-Lys Thr(N-己基)
232 d-Cys Thr(N-己基))
在有些示例性的实施方案中，Aib-Gly(N-己基)、dLys-Gly(N-己基)、dCys-Gly(N-己基)、dAla-Gly(N-己基)、Aib-Gly(N-甲基)、dLys-Gly(N-甲基)、dCys-Gly(N-甲基)、dAla-Gly(N-己基)、Aib-Phe(N-甲基)、dLys-Phe(N-甲基)、dCys-Phe(N-甲基)或dAla-Phe(N-甲基)与肽药物的N端α氨基缀合。
根据一个实施方案，二肽元件包含在A-B二肽的B处的3种氨基酸之一：Gly(N-己基)、Gly(N-甲基)或Phe(N-甲基)。
选自这3组二肽之一的二肽具有下述相对裂解速率：其中Gly(N-己基)>Gly(N-甲基)>Phe(N-甲基)，所有其它因素相同。在一个实施方案中，Cys或Lys提供在第1个位置(即，A氨基酸)，以提供用于酰化或聚乙二醇化的位置。在不需要酰化或聚乙二醇化的一个实施方案中，将Ala用作A氨基酸。在一个实施方案中，与诸如Ala、Cys和Lys等天然氨基酸相比，在第1个位置(即，A氨基酸)的Aib会增加裂解速率。
示例性的二肽包括：
dAla-Phe(N-甲基)
dCys-Phe(N-甲基)
dLys-Phe(N-甲基)
Aib-Phe(N-甲基)
dAla-Gly(N-甲基)
dCys-Gly(N-甲基)
dLys-Gly(N-甲基)
Aib-Gly(N-甲基)
dAla-Gly(N-己基)
dCys-Gly(N-己基)
dLys-Gly(N-己基)
Aib-Gly(N-己基)。
根据一个实施方案，提供包含本文公开的任何新的胰岛素前药类似物和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，优选所述胰岛素前药类似物的纯度水平为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。这类组合物可含有本文公开的A19胰岛素类似物，其浓度为至少0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml或更高。在一个实施方案中，药物组合物包含经过灭菌的水溶液剂，任选装入各种包装容器中保存。在其它实施方案中，药物组合物包含冻干粉末。药物组合物还可作为试剂盒的部分包装，所述试剂盒包括用于将所述组合物施用给患者的一次性装置。容器或试剂盒可标上在环境室温下保存或在冷冻温度下保存的标签。
在一个实施方案中，提供包含第一和第二胰岛素前药类似物的混合物的组合物，其中第一和第二胰岛素前药类似物根据前药元件结构而彼此不同。更具体地讲，第一胰岛素前药类似物可包含半衰期与第二胰岛素前药类似物的二肽前药元件的半衰期显著不同的二肽前药元件。因此，选择二肽元件上取代基的不同组合将可供制备以下组合物，其包含在所需时帧和特定的时间间隔内以受控方式活化的胰岛素前药类似物的混合物。例如，可将组合物配制成餐时释放活性胰岛素，接着在夜间根据活化时间释放出适当剂量的活化胰岛素。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文公开的胰岛素前药类似物和天然胰岛素或胰岛素的已知生物活性衍生物的混合物。
所公开的胰岛素前药类似物被认为适于之前已对胰岛素肽所述的任何用途。因此，本文所述的胰岛素前药类似物可用于治疗高血糖症，或治疗由高血糖水平所致的其它代谢病。因此，本发明包括包含本公开内容的胰岛素前药类似物和药学上可接受的载体的药物组合物，其用于治疗患有高血糖水平的患者。根据一个实施方案，待使用本文公开的胰岛素前药类似物治疗的患者为家养动物，而在另一个实施方案中，待治疗的患者为人。
按照本公开内容治疗高血糖症的一种方法包括采用任何标准给药途径将本发明公开的胰岛素前药类似物施用给患者的步骤，所述给药途径包括胃肠外，例如静脉内、腹膜内、皮下或肌内、鞘内、透皮、直肠、口服、经鼻或通过吸入。在一个实施方案中，皮下或肌内施用组合物。在一个实施方案中，胃肠外施用组合物，且将胰岛素前药类似物组合物预先包装在注射器中。
本发明的胰岛素前药类似物可单独或与其它抗糖尿病药组合施用。本领域已知的或正在研究中的抗糖尿病药包括天然胰岛素；天然胰高血糖素及其功能衍生物；磺酰脲类，例如甲苯磺丁脲(Orinase)、醋酸己脲(Dymelor)、妥拉磺脲(Tolinase)、氯磺丙脲(Diabinese)、格列吡嗪(Glucotrol)、格列本脲(Diabeta、Micronase、Glynase)、格列美脲(Amaryl)或格列齐特(Diamicron)；氯茴苯酸类，例如瑞格列奈(repaglinide)(Prandin)或那格列奈(nateglinide)(Starlix)；双胍类，例如二甲双胍(Glucophage)或苯乙双胍；噻唑烷二酮类，例如罗格列酮(Avandia)、吡格列酮(pioglitazone)(Actos)或曲格列酮(Rezulin)或其它PPARγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的α葡糖苷酶抑制剂，例如米格列醇(Glyset)、阿卡波糖(Precose/Glucobay)；艾塞那肽(Byetta)或普兰林肽；二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，例如维格列汀或西他列汀；SGLT(钠依赖性葡萄糖载体1)抑制剂；或FBP酶(果糖1,6-二磷酸酶)抑制剂。
可采用标准的药学上可接受的载体和本领域技术人员已知的给药途径，配制包含本文公开的胰岛素前药类似物的药物组合物并将其施用给患者。因此，本公开内容还包括包含一种或多种本文公开的胰岛素前药类似物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含在磷酸盐缓冲***中的pH为约4.0至约7.0、浓度为1mg/ml的胰岛素前药类似物。药物组合物可包含作为唯一的药学活性组分的胰岛素前药类似物，或者胰岛素前药类似物可与一种或多种其它活性剂组合。根据一个实施方案，提供包含本文公开的胰岛素前药类似物之一和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物，所述胰岛素前药类似物优选为无菌的，且优选纯度水平为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。这类组合物可含有胰岛素前药类似物，其中所得活性肽存在的浓度为至少0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、15mg/ml、16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml或更高。在一个实施方案中，药物组合物包含经过灭菌的水溶液剂，任选保存在各种容器内。根据一个实施方案，可使用本发明的化合物制备可即用于注射的预制溶液剂。在其它实施方案中，药物组合物包含冻干粉末。药物组合物还可作为试剂盒的部分包装，所述试剂盒包括用于将组合物施用给患者的一次性装置。容器或试剂盒可标上在环境室温下保存或在冷冻温度下保存的标签。
本文描述的所有治疗方法、药物组合物、试剂盒和其它类似实施方案均考虑胰岛素前药类似物包括其所有的药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，提供具有将胰岛素前药类似物组合物施用给患者的装置的试剂盒。试剂盒还可包括各种容器，例如小瓶、管、瓶等。优选试剂盒还将包括使用说明书。根据一个实施方案，试剂盒的装置为气雾剂分配装置，其中组合物预包装在气雾剂装置内。在另一个实施方案中，试剂盒包含注射器和针，而在一个实施方案中，胰岛素类似物组合物预包装在注射器中。
可通过标准合成方法、重组DNA技术或制备肽和融合蛋白的任何其它方法制备本发明的化合物。虽然通过标准重组DNA技术无法表达某些非天然氨基酸，但其制备技术是本领域已知的。除标准肽化学反应以外，适用时可通过标准有机化学反应合成包含非肽部分的本发明化合物。
实施例1
胰岛素A链和B链的合成
采用Boc化学法，在4-甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂或4-羟基甲基-苯基乙酰氨基甲基(PAM)树脂上合成胰岛素A链和B链。使用95:5HF/对甲酚于0℃达1小时，使肽从树脂上裂解。在除去HF且***沉淀后，将肽溶于50%乙酸水溶液，然后冻干。可替换地，用Fmoc化学法合成肽。使用三氟乙酸(TFA)/三异丙基甲硅烷(TIS)/H2O(95:2.5:2.5)于室温达2小时，使肽从树脂上裂解。通过加入过量的***使肽沉淀，并将沉淀溶于酸性缓冲水溶液。用RP-HPLC监测肽的质量，并通过质谱法(ESI或MALDI)证实。
合成在氨基酸7上具有一个游离半胱氨酸且所有其它半胱氨酸作为乙酰氨基甲基A-(SH)7(Acm)6,11,20保护起来的胰岛素A链。合成在7位上具有一个游离半胱氨酸且其它半胱氨酸作为乙酰氨基甲基B-(SH)7(Acm)19保护起来的胰岛素B链。粗制肽通过常规RP-HPLC纯化。
按照图1所示通用方法，将合成的A链和B链通过其天然二硫键连接彼此连接起来。在室温下，通过溶于DMF或DMSO，并按1:1摩尔比率与2,2’-二硫代双(5-硝基吡啶)(Npys)反应，使相应的B链活化成Cys7-Npys衍生物。活化用RP-HPLC监测，且产物用ESI-MS证实。
通过以1:1摩尔比率，使A-(SH)7(Acm)6,11,20和B-(Npys)7(Acm)19分别溶解至总的肽浓度为10mg/ml，来形成第一个B7-A7二硫键。当链结合反应完成时，将混合物稀释至50%乙酸水溶液的浓度。通过加入碘，同时形成最后的两个二硫键。将40倍摩尔过量的碘加入溶液中，并将混合物在室温下再搅拌1小时。加入抗坏血酸水溶液终止反应。混合物用RP-HPLC纯化，最终的化合物用MALDI-MS证实。如图2和表1数据所示，对于胰岛素受体结合，按照该方法制备的合成胰岛素与纯化的胰岛素不相上下。
还可以采用允许将非编码氨基酸掺入蛋白质中的***，在体内合成包含修饰氨基酸(例如A19位上的4-氨基苯丙氨酸)的胰岛素肽，所述***包括例如美国专利号7,045,337和7,083,970教导的***。
表1：合成胰岛素相对于天然胰岛素的活性
。
实施例2
通过还原性烷基化进行的胺基(N端和赖氨酸)的聚乙二醇化
a.合成
以1:2:30摩尔比率，将胰岛素(或胰岛素类似物)、mPEG20k-醛(Aldyhyde)和NaBH3CN溶于乙酸缓冲液(pH4.1-4.4)。反应溶液由0.1NNaCl、0.2N乙酸和0.1NNa2CO3组成。胰岛素肽浓度约为0.5mg/ml。反应在室温下历时6小时进行。反应程度用RP-HPLC监测，反应的收率约为50%。
b.纯化
将反应混合物用0.1%TFA稀释2-5倍，并上样至制备型RP-HPLC柱中。HPLC条件：C4柱；流速10ml/分钟；A缓冲液：含10%ACN和0.1%TFA的水溶液；B缓冲液：含0.1%TFA的ACN溶液；线性梯度：B%0-40%(0-80分钟)；将PEG-胰岛素或类似物在约35%缓冲液B中洗脱。所需化合物用MALDI-TOF证实，接着通过亚硫酸盐解(sulftolysis)或胰蛋白酶降解进行化学修饰。
通过N-羟基琥珀酰亚胺酰化进行的胺基(N端和赖氨酸)的聚乙二醇化
a.合成
将胰岛素(或胰岛素类似物)与mPEG20k-NHS以1:1的摩尔比率一起溶于0.1NN,N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH8.0)。胰岛素肽浓度约为0.5mg/ml。反应进程用HPLC监测。在室温下2小时后，反应的收率约为90%。
b.纯化
将反应混合物稀释2-5倍，并加样至RP-HPLC。HPLC条件：C4柱；流速10ml/分钟；A缓冲液：含10%ACN和0.1%TFA的水溶液；B缓冲液：含0.1%TFA的ACN溶液；线性梯度：B%0-40%(0-80分钟)；在约35%B时收集PEG-胰岛素或类似物。所需化合物通过MAIDI-TOF证实，接着通过亚硫酸盐解或胰蛋白酶降解进行化学修饰。
苯丙氨酸芳环上乙酰基的还原性胺化聚乙二醇化
a.合成
将胰岛素(或胰岛素类似物)、mPEG20k-酰肼和NaBH3CN按1:2:20的摩尔比率溶于乙酸缓冲液(pH4.1-4.4)。反应溶液由0.1NNaCl、0.2N乙酸和0.1NNa2CO3组成。在室温下经过24小时，胰岛素或胰岛素类似物的浓度约为0.5mg/ml。反应进程用HPLC监测。反应的转化约为50%。(通过HPLC计算)
b.纯化
将反应混合物稀释2-5倍，并加样至RP-HPLC。HPLC条件：C4柱；流速10ml/分钟；A缓冲液：含10%ACN和0.1%TFA的水溶液；B缓冲液：含0.1%TFA的ACN溶液；线性梯度：B%0-40%(0-80分钟)；在约35%B时收集PEG-胰岛素或PEG-胰岛素类似物。所需化合物通过MAIDI-TOF证实，接着通过亚硫酸盐解或胰蛋白酶降解进行化学修饰。
实施例3
胰岛素受体结合测定：
在竞争结合测定中，采用闪烁迫近技术（scintillationproximitytechnology），测定了每种肽对胰岛素或IGF-1受体的亲和力。在Tris-Cl缓冲液(0.05MTris-HCl(pH7.5)、0.15MNaCl、0.1%w/v牛血清白蛋白)中对肽进行连续的3倍稀释，并在96孔板(CorningInc.，Acton，MA)中与0.05nM(3-[125I]-碘酪氨酰基)ATyrA14胰岛素或(3-[125I]-碘酪氨酰基)IGF-1(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)混合。将从过量表达人胰岛素或IGF-1受体的细胞中制备的等分量的1-6微克质膜片段加入各孔中，并加入0.25mg/孔的聚乙烯亚胺处理的麦胚凝集素A型闪烁迫近测定珠粒(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)。以800rpm振摇5分钟后，将板于室温温育12小时，并用MicroBeta1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer,Wellesley,MA)测量放射性。在各孔中，用浓度比试验样品最高浓度高4倍的过量“非放射性”天然配体测量非特异性结合(NSB)的放射性。在无竞争剂的各孔中检测总的结合放射性。如下计算百分比特异性结合：%特异性结合=(结合的NSB/总的结合的NSB)x100。应用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)求出IC50值。
实施例4
胰岛素受体磷酸化测定：
为了测量胰岛素或胰岛素类似物的受体磷酸化，将受体转染的HEK293细胞接种到96孔组织培养板(Costar#3596，Cambridge，MA)中，并在补充了100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10mMHEPES和0.25%牛生长血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(HyCloneSH30541，Logan，UT)中在37℃、5%CO2和90%湿度下培养16-20小时。在补充了0.5%牛血清白蛋白的DMEM(RocheAppliedScience#100350，Indianapolis，IN)中制备连续稀释的胰岛素或胰岛素类似物，并加入到具有贴壁细胞的各孔中。在潮湿环境与5%CO2下于37℃温育15分钟后，细胞用5%低聚甲醛于室温固定20分钟，用磷酸缓冲盐水(pH7.4)洗涤两次，并用2%牛血清白蛋白在PBS中的溶液封闭（block）1小时。然后，将板洗涤三次，并按照生产商的建议加入在PBS（含有2%牛血清白蛋白）中复溶的抗磷酸酪氨酸的辣根过氧化物酶缀合的抗体(Upstatebiotechnology#16-105，Temecula，CA)。在室温下温育温3小时后，将板洗涤4次，并将0.1mlTMB单一溶液底物(Invitrogen，#00-2023，Carlbad，CA)加入各孔中。5分钟后通过加入0.05ml1NHCl停止显色。在TitertekMultiscanMCC340(ThermoFisher，Pittsburgh，PA)中测量450nm下的吸光度。绘制吸光度相对于肽浓度的剂量反应曲线，并应用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)求出EC50值。
实施例5
确定模型二肽裂解(在PBS中)的速率
将一种特殊的六肽(HSRGTF-NH2；SEQIDNO:59)用作模型肽，在该模型肽上可研究二肽N端延伸物的裂解速率。制备二肽延伸的模型肽，将Boc保护的肌氨酸和赖氨酸相继加入模型肽结合的树脂上以产生肽A(Lys-Sar-HSRGTF-NH2；SEQIDNO:60)。通过HF使肽A裂解，并用制备型HPLC纯化。
测定各个前肽的裂解速率。通过其各自的峰面积求出前肽和模型母体肽的浓度。通过绘制不同时间间隔下前药浓度的对数曲线图，来求出前药的一级解离速率常数。该曲线的斜率给出速率常数‘k’。用式t1/2=.693/k计算各种前药裂解的半衰期。测出该模型肽HSRGTF-NH2(SEQIDNO:59)的Lys-Sar延伸物的半衰期为14.0小时。
实施例6
用全d-同工型模型肽测定的血浆中二肽裂解半衰期的速率
使用另外的模型六肽(dHdTdRGdTdF-NH2SEQIDNO:63)测定血浆中二肽裂解的速率。使用各氨基酸的d-异构体以防止除前药延伸物以外的模型肽的酶促切割。这种模型d-异构体六肽以类似于l-异构体的方式合成。如先前对肽A所报道，将肌氨酸和赖氨酸相继加至N端以制备肽B(dLys-dSar-dHdTdRGdTdF-NH2SEQIDNO:64)。
测定各个前肽的裂解速率。通过其各自的峰面积求出前肽和模型母体肽的浓度。通过绘制不同时间间隔下前药浓度的对数曲线图，来求出前药的一级解离速率常数。该曲线的斜率给出速率常数‘k’。测出这个模型肽dHdTdRGdTdF-NH2(SEQIDNO:63)的Lys-Sar延伸物的半衰期为18.6小时。
实施例7
采用实施例5中所述方法，测定与模型六肽(HSRGTF-NH2；SEQIDNO:59)连接的其它二肽的裂解速率。在这些实验中得到的结果见表2和表3。
表2：在PBS中与N端对氨基-Phe侧链连接的二肽O-U自模型六肽(HSRGTF-NH2；SEQIDNO:59)的裂解
化合物 U (氨基酸) O (氨基酸) t?
1 F P 58h161 -->
2 羟基-F P 327h
3 d-F P 20h
4 d-F d-P 39h
5 G P 72h
6 羟基-G P 603h
7 L P 62h
8 叔-L P 200h
9 S P 34h
10 P P 97h
11 K P 33h
12 dK P 11h
13 E P 85h
14 Sar P ≈1000h
15 Aib P 69min
16 羟基-Aib P 33h
17 环己烷 P 6min
18 G G 不裂解
19 羟基-G G 不裂解
20 S N-甲基-Gly 4.3h
21 K N-甲基-Gly 5.2h
22 Aib N-甲基-Gly 7.1min
23 羟基-Aib N-甲基-Gly 1.0h
表3：在PBS中与1位(X)上的组氨酸(或组氨酸衍生物)连接的二肽U-O自模型六肽(XSRGTF-NH2；SEQIDNO:59)的裂解
NH2-U-O-XSRGTF-NH2
化合物 U (氨基酸) O (氨基酸) X (氨基酸) t?
1 F P H 不裂解
2 羟基-F P H 不裂解
3 G P H 不裂解
4 羟基-G P H 不裂解
5 A P H 不裂解
6 C P H 不裂解
7 S P H 不裂解
8 P P H 不裂解
9 K P H 不裂解
10 E P H 不裂解
11 脱氢V P H 不裂解
12 P d-P H 不裂解162 -->
13 d-P P H 不裂解
14 Aib P H 32h
15 Aib d-P H 20h
16 Aib P d-H 16h
17 环己基- P H 5h
18 环丙基- P H 10h
19 N-Me-Aib P H >500h
20 α, α-二乙基-Gly P H 46h
21 羟基-Aib P H 61
22 Aib P A 58
23 Aib P N-甲基-His 30h
24 Aib N-甲基-Gly H 49min
25 Aib N-己基-Gly H 10min
26 Aib 氮杂环丁烷-2-甲酸 H >500h
27 G N-甲基-Gly H 104h
28 羟基-G N-甲基-Gly H 149h
29 G N-己基-Gly H 70h
30 dK N-甲基-Gly H 27h
31 dK N-甲基-Ala H 14h
32 dK N-甲基-Phe H 57h
33 K N-甲基-Gly H 14h
34 F N-甲基-Gly H 29h
35 S N-甲基-Gly H 17h
36 P N-甲基-Gly H 181h
另外，已经制备了IGF1YL胰岛素类似物的各种前药衍生物，其中二肽元件已经经由酰胺键连接至存在于IGF1YL的A19处的4-氨基-苯丙氨酸残基。使用实施例5的方法对这些化合物的体外分析揭示，这些化合物的活性随着在PBS缓冲液中或在20%血浆中温育的时间增加而增加。参见图8-11。另外，测量了IGF类似物前药MIU30:A1(aF19‐dLys(Ac),Sar)(二肽通过酰胺键与A194-氨基Phe连接)在胰岛素受体结合方面相对于天然胰岛素的体外活性随着在20%血浆中温育的时间(1小时、3小时、6小时、9小时和10.5小时)的变化。表3A对比了随着在37℃的20%血浆/PBS中温育的时间而变化的相对胰岛素受体结合。如在体外结合测定（参见表3A）和体外磷酸化测定（参见表3B）中呈现的数据所示，随着前药形式转化成活性IGF1YL肽，从A19IGF前药衍生物样品恢复的活性随时间增加。
表3A
时间(小时) %胰岛素活性
0 34.44%
9 100.09%
95 115.42%
表3B
时间(小时) %胰岛素活性
1 23.0
3 26.8
6 32.5
9 41.1
10.5 43.2
体内葡萄糖耐量试验使用施用过胰岛素类似物MIU-30a（B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(dLys(Ac),Sar-aF19)(二肽通过酰胺键与A194-氨基Phe连接)）的C57黑鼠，将MIU30溶解在含有20%血浆的PBS(pH7.4)中，并在37℃温育48小时(产生“MIU-30c”)。抽取温育0小时(MIU30a)和48小时(MIU30c)的样品，并以90nmol/kg和270nmol/kg注射给C57黑鼠，以测量葡萄糖降低(胰岛素耐量试验)。在图20A中显示了MIU30a和MIU30c在8小时内的不同时间的葡萄糖降低曲线。母体化合物具有低效能，但是在20%血浆中温育48小时(产生“MIU-30c”)以后，效能增加(参见图20A)。在图20B中，将MIU30a和MIU30c的总血糖与媒介物的对比报告为有差别的曲线下面积(AUC)。在90nmol/kg，MIU30a指示葡萄糖几乎没有变化，而MIU30c造成相当大的下降。在270nmol/kg，MIU30a和MIU30c都表现出葡萄糖降低，但是后一样品具有显著更高的降血糖效能。总之，在注射后，在生理条件下离体转化成母体胰岛素类似物之前，胰岛素类似物MIU30的前药形式显示出明显更低的葡萄糖降低效能。这些体内结果与体外分析相一致。据估测，所述前药的半衰期为大约20小时。
实施例8
鉴定具有适于前药构建的结构的胰岛素类似物
已知A链的19位是胰岛素活性的重要部位。因此，在该部位进行修饰以允许前药元件的连接是理想的。已合成了胰岛素在A19上的特定类似物，并表征了其对胰岛素受体的活性。已经在A19上鉴定出两种高活性结构类似物，其中在第二活性部位芳族残基(B24)上的相当结构变化在鉴定类似完整活性的胰岛素类似物方面是不成功的。
表4和表5阐述了对于针对胰岛素受体的完整活性而言，A19位具有高度结构保守性(用实施例3所述测定法测定受体结合)。表4表明只有两种在A19上具有修饰的胰岛素类似物具有类似于天然胰岛素的受体结合活性。对于4-氨基胰岛素类似物而言，提供了三个单独实验的数据。标示“活性(试验中)”的一栏比较了同时进行的两个单独实验的胰岛素类似物相对于天然胰岛素的结合百分比。标示“活性(0.60nM)”的一栏是胰岛素类似物相对于使用该测定法得到的胰岛素结合的历史平均值的相对结合百分比。在任一种分析中，两种A19胰岛素类似物(4-氨基苯丙氨酸和4-甲氧基苯丙氨酸)显示大致等于天然胰岛素的受体结合。图3表示显示天然胰岛素和A19胰岛素类似物对胰岛素受体的各自特异性结合的曲线图。表5提供的数据表明，具有与天然胰岛素相当的结合活性的两种A19胰岛素类似物(4-氨基和4-甲氧基)还显示对胰岛素受体相当的活性(采用实施例4所述测定法测定受体活性)。
表4：A19胰岛素类似物的胰岛素受体结合活性
。
表5：A19胰岛素类似物的胰岛素受体磷酸化活性
。
实施例9
***(IGF)类似物
用于分离胰岛素A链的典型纯化方案使用NH4HCO3缓冲液(pH=7.8)。在这些条件下，二肽前药元件快速从A链上裂解。为了简化前药的纯化以研究其对胰岛素受体的活性，申请人使用IGF类似物进行了这类研究，所述IGF类似物显示与天然胰岛素的活性类似的对胰岛素受体的活性。更具体地讲，IGF类似物(IGF1(YB16LB17)包含天然IGFA链和B链(分别为SEQIDNO:61和SEQIDNO:62)，其中天然IGFB链的15和16位(分别相当于天然胰岛素B链的16和17位)上的天然谷氨酰胺和苯丙氨酸已分别用酪氨酸和亮氨酸残基置换。如图4和下表6所示，IGF1(YB16LB17)的结合活性表明所述化合物是十分有效的胰岛素类似物。
表6
。
实施例10
IGF前药衍生物
根据A19胰岛素类似物的活性(参见实施例5)，对IGF1A:B(YB16LB17)类似物进行了类似修饰，并研究了其结合和刺激胰岛素受体活性的能力。图5提供以下通用合成方案，其用于制备IGF1A:B(YB16LB17)(其中天然酪氨酸用4-氨基苯丙氨酸置换[IGF1A:B(YB16LB17)(p-NH2-F)A19酰胺])，以及用于制备其二肽延伸的衍生物[IGF1A:B(YB16LB17)A19-AibAla酰胺](其中包含Aib和Ala的二肽通过与A194-氨基苯丙氨酸的酰胺键与所述肽连接)。如图6和表7所示，IGF类似物IGF1(YB16LB17)A(p-NH2-F)19与胰岛素受体特异性结合，其中该类似物的二肽延伸衍生物不能与胰岛素受体特异性结合。注意到二肽延伸物缺乏可供自发裂解二肽的适当结构(在二肽的第二个位置上不存在N-烷基化氨基酸)，因此不存在胰岛素受体结合的恢复。
表7
。
制备IGFB16B17衍生肽的又一种前药衍生物，其中二肽前药元件(丙氨酸-脯氨酸)通过酰胺键与A链氨基端连接(IGF1(YB16LB17)(AlaPro)A-1,0)。如表8所示，IGF1(YB16LB17)(AlaPro)A-1,0对胰岛素受体的亲和力显著下降。根据表3数据，注意到二肽前药元件缺乏可供自发裂解二肽前药元件的适当结构，因此检测到的胰岛素受体结合不是前药元件裂解的结果。
表8
。
实施例11
其它的IGF胰岛素类似物。
IGF1(YB16LB17)(YL)B16B17肽序列的进一步修饰揭露了对胰岛素和IGF-1受体的效能不同的其它IGF胰岛素类似物。这些类似物中每种的结合数据见表9(采用实施例3的测定法)，其中修饰的位置根据天然胰岛素肽(DPI=desB26-30)的相应位置指定。例如，本文提及的缺乏任何更多详尽描述的“位置B28”将意指其中SEQIDNO:2的第一氨基酸已缺失的胰岛素类似物B链的相应B27位。因此，一般提及的“B(Y16)”是指天然IGF-1序列B链15位上的酪氨酸残基的取代。有关胰岛素和IGF类似物的相对受体结合的数据提供在表9中，且有关IGF类似物刺激的磷酸化(采用实施例4的测定法)的数据提供在表10中。
实施例12
自IGFB16B17衍生肽的前药形式的二肽裂解
测定了(pNH2-Phe)酰胺连接的二肽AibPro从不同IGF-1肽上的裂解以确定肽序列或异源双链体对二肽裂解的影响。受测试肽的结果见表11，数据表明，仅IGF1-A链就代表了研究IGF1B:A(YL)B16,17肽的前药半衰期的良好模型。
表11
。
对于前药形式，IGFA链的前药衍生物与二硫化物结合的A链和B链构建体(IGF1A:B(YB16LB17)的比较显示，两种化合物具有类似的半衰期。因此，仅测定IGF1A链就是研究IGF1B:A(YB16LB17)的前药半衰期的良好模型。注意，AibAla衍生物不裂解，因此不是前药，但用来表明修饰可使胰岛素类似物IGF1A:B(YB16LB17)(p-NH2-F)A19酰胺失活。为简单起见，使用不存在B链的仅IGF1A链来测定前药半衰期。各前肽的半衰期按实施例5所述方法测定。数据见表12：
表12：在IGF1二肽延伸的(p-NH2-F)A19酰胺上的二肽半衰期
。
数据表明，通过改变二肽前药元件上的取代基，前药的半衰期可从2小时到>100小时不等。
使用IGF1-A(pNH2-F)19型肽并改变通过A19位上4-氨基苯丙氨酸连接的二肽前药元件的氨基酸组成，来制备其它前药衍生肽。在PBS和在20%血浆/PBS(即存在血清酶时)中测定不同构建体的二肽半衰期。结果提供在表13中。结果表明经测定的4种肽中有3种不受血清酶的影响。
表13：在IGF1-A(pNH2-F)19上的二肽半衰期
。
实施例13
IGFB16B17衍生肽随时间变化的受体结合
制备IGFB16B17衍生肽的前药制剂，并使用实施例3的胰岛素受体结合测定法测定其随时间变化的降解。如下制备用于该测定法的肽：
二肽-IGF1A类似物
如无具体说明，则Boc-化学法用于指定肽类似物的合成。将选定的二肽H2N-AA1-AA2-COOH加到IGF1A(Ala)6,7,11,20上的(pNH2-Phe)19。在MBHA树脂上合成IGF-1A链C端三肽Boc(Fmoc-pNH-Phe)-Ala-Ala。用20%哌啶/DMF于室温处理30分钟脱去Fmoc后，使用3倍过量的氨基酸、PyBop、DIEA和催化量的吡啶，使Fmoc-AA2与在A19上的对氨基苄基侧链偶联。采用AppliedBiosystems430A肽合成仪，完成其余IGF-1A链(Ala)6,7,11,20序列的Boc-合成，得到IGF-1A链(Boc)0(Ala)6,7,11,20(Fmoc-AA2-pNH-Phe)19-MBHA。在从AA2的N端脱去Fmoc基团后，使用3倍过量的氨基酸、DEPBT和DIEA使Boc-AA1与胺偶联。通过TFA脱去余留在A链上的两个Boc基团，随后进行HF裂解，得到IGF-1A链(Ala)6,7,11,20(H2N-AA1-AA2-pNH-Phe)19酰胺。在AA1为d-赖氨酸的情况下，在ε-胺上的乙酰化在脱去Boc之前进行。二肽-IGF-1A链类似物用半制备型RP-HPLC纯化，并用通过分析型RP-HPLC和MALDI质谱法表征。
二肽-IGF-1(YL)类似物
如紧接的上文中所述但将PAM树脂用于合成IGF-1A链，将选定的二肽H2N-AA1-AA2-COOH加到IGF-1A链(Acm)6,11,20上的(pNH2-Phe)19，以在HF裂解时得到C端酸。在MBHA树脂上合成IGF-1B链(YL)16,17(Acm)19，得到C端酰胺。在100%DMSO中通过与DTNP按1:1摩尔比率反应，用Npys修饰CysB7上的游离巯基。采用方案1所示的“1+2”两步链组合策略，装配经纯化的二肽-IGF-1A链和IGF-1B链(YL)16,17衍生物。在半制备型RP-HPLC进行中间纯化和最终纯化，并用分析型RP-HPLC和MALDI质谱法表征。
将IGFB16B17衍生肽前药在PBS(pH7.4，37℃)中温育，在预定的时间间隔内取出等分量且进一步的降解用0.1%TFA淬灭，并对等分量进行分析型HPLC分析。用LC-MS鉴定代表IGFB16B17衍生肽的前药形式和活性形式的a峰和b峰，并通过HPLC峰面积的积分进行量化。图8A-8C显示IGFB16B17衍生肽前药：IGF1A(Ala)6,7,11,20(Aib-Pro-pNH-F)19降解的HPLC分析输出结果。在开始将前药于PBS中温育后20分钟(图8A)、81分钟(图8B)和120分钟(图8C)内取出等分量。数据表明IGF1A(Ala)6,7,11,20(Aib-Pro-pNH-F)19酰胺随时间自发性非酶促地转化为IGF1A(Ala)6,7,11,20(pNH2-F)1酰胺。
根据化合物结合胰岛素受体的能力（用实施例3的体外测定法测量），还测定了IGFB16B17衍生肽的前药形式向其活性形式的降解。图9A和图9B曲线图表示前药Aib,dPro-IGF1YL(通过A194-氨基Phe连接的二肽)的体外活性。图9A曲线图比较了在PBS中温育的天然胰岛素(于4℃在1小时时测定)和A19IGF前药类似物(Aib,dPro-IGF1YL)随时间变化(0小时、2.5小时和10.6小时)的相对胰岛素受体结合。图9B曲线图比较了在20%血浆/PBS中温育的天然胰岛素(于4℃在1.5小时时测定)和A19IGF前药类似物(Aib,dPro-IGF1YL)随时间变化(0小时、1.5小时和24.8小时)的相对胰岛素受体结合。图中所提供的数据表明，随着前药形式转化为活性IGF1YL肽，从A19IGF前药类似物样品恢复的活性渐增。针对胰岛素受体结合测定了IGFB16B17衍生肽的活性，由于潜在的IGFB16B17衍生肽的活性比天然胰岛素的活性高，因此相对于胰岛素大于100%的活性是可能的。
图10A和图10B曲线图表示前药dK,(N-异丁基G)-IGF1YL(通过A194-氨基Phe连接的二肽)的体外活性。图10A曲线图比较了在PBS中温育的天然胰岛素(于4℃在1小时时测定)和A19IGF前药类似物(IGF1YL:dK,(N-异丁基G)随时间变化(0小时、5小时和52小时)的相对胰岛素受体结合。图10B曲线图比较了在20%血浆/PBS中温育的天然胰岛素(于4℃在1.5小时时测定)和A19IGF前药类似物(IGF1YL:dK,(N-异丁基G)随时间变化(0小时、3.6小时和24.8小时)的相对胰岛素受体结合。图中所提供的数据表明，随着前药形式转化为活性IGF1YL肽，从A19IGF前药类似物样品恢复的活性渐增。
图11A和图11B曲线图表示前药dK(e-乙酰基),Sar)-IGF1YL(通过A194-氨基Phe连接的二肽)的体外活性。图11A曲线图比较了在PBS中温育的天然胰岛素(于4℃在1小时时测定)和A19IGF前药类似物(IGF1YL:dK(e-乙酰基),Sar)随时间变化(0小时、7.2小时和91.6小时)的相对胰岛素受体结合。图11B曲线图比较了在20%血浆/PBS中温育的天然胰岛素(于4℃在1.5小时时测定)和A19IGF前药类似物(IGF1YL:dK(e-乙酰基),Sar)随时间变化(0小时、9小时和95小时)的相对胰岛素受体结合。图中所提供的数据表明，随着前药形式转化为活性IGF1YL肽时，从A19IGF前药类似物样品恢复的活性渐增。
实施例14
胰岛素前药类似物的比较性胰岛素耐量
给正常小鼠施用胰岛素异源二聚体类似物[B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(aF19-NH2)]或其前药衍生物。前药衍生物MIU-29:[B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(aF19-dLys(Ac),NLeu)]包含在A19位处的4-氨基-苯丙氨酸置换，其中二肽dLys(Ac),NLeu已经共价连接在A19残基的4-氨基位置处。该二肽将在生理条件下自发裂解，半衰期为大约4.4小时(参见图19A)。离体温育前药衍生物[B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(aF19-dLys(Ac),NLeu)]24小时以后，将得到的化合物施用给小鼠，并将它的降血糖能力与母体化合物进行对比。图19B表明，两种化合物的表现几乎相同。
研究了胰岛素前药类似物的酰化，以确定是否可以增加体内保留时间。与未酰化的前药相比，具有酰化二肽前药元件的MIU42[B1(Y16,L17,Y25)29a:A1(dLys(rE-C14),Sar-aF19)]的体外活性随着在30%ACN/PBS（pH7.4，37℃）中离体温育时间(提供用于前药转化的时间)增加而增加(参见图21)。使用在没有预温育步骤下施用的MIU42前药进行的比较性胰岛素效能试验(图22)表明，所述前药与非前药母体化合物(MIU-27)相比不是非常有效。就具有在B29位处的酰化的酰化胰岛素类似物MIU-46[B1(H5,10Y16,L17,Y25,K29-C14)28a:A1(N18,21,aF19NH2)]而言，也是如此。当在小鼠中体内试验时，所述化合物没有表现出希望的体内效能或基础特性(图23C)。因此，至少在小鼠中，酰化不会产生期望的特性。
实施例15
聚乙二醇化胰岛素前药类似物的生物合成和纯化
使用固相Boc-化学法，在MBHA树脂上合成了IGF1B链(2-25)H5,10Y16L17SH7Acm19酰胺。在从树脂上裂解肽并同时除去氨基酸侧链保护以后，在DMSO中将粗制的B链与2,2’-二硫代双(5-硝基吡啶)混合，得到在Cys7处的半胱氨酸-NpyS衍生物。通过B链和Boc-Aoa-OSu之间的反应，将Boc-氨基氧基乙酰基(Aoa)添加至B链的N-端。使用本文所述的“1+2”方法(参见图1)，将纯化的IGF1B链(2-25)(BocAoa)0H5,10Y16L17SH7Acm19酰胺与IGF1A链Acm6,7,11N18,21(aa1aa2)-pNH-F19酸相混合，得到具有在B链的N端处的Boc-Aoa的胰岛素类似物。通过在有作为清除剂的O-(羧甲基)羟胺半盐酸盐存在下用6NHCl短暂地处理肽，除去Boc。除去Boc并纯化以后，将所述肽以3mg/ml的浓度溶解在1%苯胺/30%ACN/0.2MNaOAc(pH4.6)中。将2倍过量的量的20KDPEG-丙醛加入该溶液中，在搅拌下在室温进行反应1小时，随后最终纯化，得到聚乙二醇化胰岛素类似物。
如图26和图27所示，20kDaPEG向二链胰岛素类似物的氨基端的添加（图24）会降低胰岛素类似物的效能（对比未聚乙二醇化的母体化合物（●）和聚乙二醇化的化合物（▲））。可自发裂解的二肽前药元件（dLys（rE-C14）,Nleu）在A19位的添加，使化合物的效能进一步降低了大约100倍（参见图26和图27，◆）。但是，将前药在37℃的PBS中预温育78小时（二肽具有大约4.4小时的半衰期），会将效能恢复至与聚乙二醇化的母体化合物接近的值。参见表14，该表列出了通过体外磷酸化测定法测得的所述类似物在胰岛素受体A和b亚型处的EC50。
表14.聚乙二醇化胰岛素前药的活性
。
实施例16
单链胰岛素类似物的生物合成和纯化
将包含经由IGF-IC链(B0-C1-A0)相连的天然胰岛素B链和A链的胰岛素-IGF-I微基因克隆进在GAP启动子(甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的启动子)控制下的表达载体pGAPZαA(购自Invitrogen)中，用于在酵母巴氏毕赤酵母（Pichiapastoris）中组成型表达和纯化重组蛋白。为了将重组蛋白分泌进培养基中，使所述微基因与编码酿酒酵母α-交配因子前导信号的N-端肽融合。使用在所述微基因和α-交配因子前导序列之间的Kex2切割位点来切割所述前导序列，以便分泌具有天然氨基端的微基因。将单位点丙氨酸突变引入在B0-C1-A0微基因的1位(G1A)、2位(Y2A)、3位(G3A)、4位(S4A)、5位(S5A)、6位(S6A)、7位(R7A)、8位(R8A)、10位(P10A)、11位(Q11A)和12位(T12A)处的C肽中。
通过电穿孔，将包括B0-C1-A0、11种丙氨酸突变体和其它选择的衍生物的微基因转化进酵母巴氏毕赤酵母中。在最低限度甲醇平板上选择阳性的转化体，并制备每个毕赤酵母分离物的基因组，通过PCR证实所述构建体向酵母基因组中的整合。使833个碱基对的PCR产物在琼脂糖DNA凝胶上显影。通过发酵对应的酵母系，生产胰岛素类似物。通过在500mlBeckman离心管中在5K离心20分钟，沉淀出酵母细胞，并保留培养基用于随后的蛋白纯化。
通过0.2μmMillipore滤器，过滤生长培养基上清液。将乙腈(ACN)加入上清液中，至20%的终体积。在得自Sigma的AmberliteXAD7HP树脂上纯化上清液，所述树脂用20%ACN水溶液预平衡。然后用30ml20%ACN水溶液冲洗树脂2次，并用含有0.1%TFA的30%ACN水溶液除去污染物。用含有0.1%TFA的54%ACN水溶液从柱洗脱部分纯化的胰岛素类似物，并低压冻干。将低压冻干的样品再悬浮于0.025MNH3HCO3（pH8）中，并在LunaC18柱(10μm粒度,300?孔径)上纯化。使用20-60%ACN水溶液的线性梯度，从柱洗脱蛋白。合并MALDI-MS阳性级分，并转移至一次用弃的闪烁瓶中，用于随后的低压冻干。然后将低压冻干的样品再悬浮于含有0.1%TFA的20%ACN水溶液中，并在LunaC18柱(10μm粒度,300?孔径)上纯化。使用18-54%ACN水溶液（含有0.1%TFA）的线性梯度，从柱洗脱蛋白。在吸光度280nm监测蛋白洗脱。通过C8分析柱，分析MALDI-TOFMS阳性级分，以确保纯度。
图14解释了单链胰岛素类似物的效能。B0-C1-A0类似物表现出在胰岛素受体亚型（isoforms）和IGF-1受体处同样有效的效能。在2位处的酪氨酸向丙氨酸的突变，或通过删除C9-12使C-肽缩短至8个氨基酸，会通过显著降低的IGF-1受体活性来提供在胰岛素作用特异性方面的选择性增强。也参见在表14A和14B中提供的数据：
表14A
。
表14B
。
图15表明，C-肽中的2位和3位对在IGF-1受体处的修饰最敏感，而胰岛素受体被证实对修饰相对不敏感。最后，图16将单链胰岛素突变体的体外分析显示为结合亲和力(IC50)和经由酪氨酸磷酸化的生化信号传递(EC50)之比。两种独立的测量表现出极大一致性，从而验证了该体外途径能够用于结构-功能分析。所有类似物维持单单位纳摩尔活性，某些特定类似物被证实具有轻微增强的效能(较低的单单位纳摩尔)。最具有胰岛素选择性的类似物是下述的那些类似物：我们给删除了C-肽的最后4个残基，具有在C-肽的2位处的丙氨酸突变，或2种变化的组合。
通过将胰岛素类似物暴露于胰岛素特异性的降解酶(IDE)并测定活性，研究了胰岛素/IGF嵌合体的稳定性。
胰岛素降解测定：从EMDChemicalsInc.得到rDNA大鼠IDE。在碳酸氢铵缓冲液中，将肽制成15mM等分试样。基于在276nm的紫外吸光度，估测初始浓度，并使用内部标准品通过HPLC分析进一步确认。使溶液的pH保持在7.8-8.4之间。加入IDE，并在37℃消化一段时间(12-48小时)。根据实验，使用比率1:350-450(酶:底物)。按照时间间隔取出等分试样放入含有内部参照肽的TFA缓冲溶液中，用于HPLC分析。取出额外的等分试样放入DMEM测定培养基中，用于活性评价。立即在干冰上冷冻所有等分试样，并在分析之前在-55℃保存。
HPLC测定：在HPLC测定中评价了研究的肽的降解特性。对于每个等分试样，使用TFA缓冲液，在与Beckman-Coulter***相连的AgilantZorbaxC8柱上运行2次(历时10min的梯度20-60%B，其中B=90%AcN)。
生物活性：将与IDE一起温育以后的类似物的残余效能确定为在胰岛素受体磷酸化ELISA测定法中的半数最大有效浓度(EC50)。当通过胰岛素受体磷酸化对在酶促降解过程中制备的肽进行生物活性测定时，我们观察到所有胰岛素和IGF-2A-链类似物丧失基本上所有的活性，而所有IGF-1A-链类似物保留活性。具体地，如图17所示，胰岛素特异性的降解酶(IDE)对胰岛素类似物的裂解是非常稳健的，且可以在其中的A-链源自天然胰岛素序列的那些胰岛素类似物中容易地检测出。相反，其中的A-链源自IGF-1序列的那些类似物似乎非常耐受蛋白酶解。
探究了增加的稳定性可能引起增加的促有丝***性的展望，并且结果报道于图18中。并未显示出更高的胰岛素效能的类似物与增加的增殖之间存在关联。此外，且对于蛋白水解稳定性特别重要的是，最耐受IDE的类似物未显示出具有任何更大的促有丝***的潜力。
对一组胰岛素类似物进行在正常小鼠(MeliorResearchLabs)中的体内试验。与标准的胰岛素治疗相比，所有的目标肽表现出类似的或增强的葡萄糖降低效能。但是，当对比含有相同B-链且含有胰岛素A或IGF1A-链的类似物时，没有观察到效能的显著差异。这支持了下述结论：IDE降解和胰岛素的清除不是主要的或生理学上相关的机理。
序列表
<110>DiMarchi,Richard
Kou,Binbin
Cheng,Shujiang
<120>基于酰胺的胰岛素前药
<130>32993-216461
<140>61358192
<141>2010-06-24
<160>71
<170>PatentIn3.3版
<210>1
<211>21
<212>PRT
<213>智人
<400>1
GlyIleValGluGlnCysCysThrSerIleCysSerLeuTyrGlnLeu
151015
GluAsnTyrCysAsn
20
<210>2
<211>30
<212>PRT
<213>智人
<400>2
PheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyr
151015
LeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrProLysThr
202530
<210>3
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素A链的类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>在8位处的Xaa是苏氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>在19位处的Xaa是酪氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、4-氨基苯丙氨酸
或经修饰的4-氨基苯丙氨酸(具有经由酰胺键连接在芳族环胺处的二肽)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>在21位处的Xaa是天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸谷氨酰胺、
谷氨酸、苏氨酸或丝氨酸
<400>3
GlyIleValGluGlnCysCysXaaSerIleCysSerLeuTyrGlnLeu
151015
GluAsnXaaCysXaa
20
<210>4
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素B链的类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>在1位处的Xaa是组氨酸或苏氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>在5位处的Xaa是丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>在6位处的Xaa是组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、
高半胱氨酸或磺基丙氨酸
<400>4
XaaLeuCysGlyXaaXaaLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGly
151015
GluArgGlyPhePhe
20
<210>5
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素B链的类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>在1位处的Xaa是苯丙氨酸或脱氨基-苯丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>在5位处的Xaa是组氨酸、苏氨酸或丝氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>在9位处的Xaa是苏氨酸或丝氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>在10位处的Xaa是组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、
高半胱氨酸或磺基丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>在16位处的Xaa是酪氨酸或4-羟甲基苯丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>在25位处的Xaa是酪氨酸、苯丙氨酸或4-羟甲基苯丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>在28位处的Xaa是天冬氨酸、赖氨酸-脯氨酸二肽或
脯氨酸-赖氨酸二肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>在29位处的Xaa是苏氨酸或精氨酸-精氨酸二肽
<400>5
XaaValAsnGlnXaaLeuCysGlyXaaXaaLeuValGluAlaLeuXaa
151015
LeuValCysGlyGluArgGlyPheXaaTyrThrXaaXaa
2025
<210>6
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素a链的类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>在19位处的Xaa是4-氨基苯丙氨酸
<400>6
GlyIleValGluGlnCysCysThrSerIleCysSerLeuTyrGlnLeu
151015
GluAsnXaaCysAsn
20
<210>7
<211>21
<212>PRT
<213>智人
<400>7
HisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGly
151015
GluArgGlyPhePhe
20
<210>8
<211>30
<212>PRT
<213>智人
<400>8
PheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyr
151015
LeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrProLysThr
202530
<210>9
<211>30
<212>PRT
<213>智人
<400>9
PheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyr
151015
LeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrLysProThr
202530
<210>10
<211>32
<212>PRT
<213>智人
<400>10
PheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyr
151015
LeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrProLysThrArgArg
202530
<210>11
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素类似物的B链的N-端
<400>11
PheValAsnGln
1
<210>12
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素B链的类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>在1位处的Xaa是苯丙氨酸或脱氨基-苯丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>在5位处的Xaa是组氨酸或苏氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>在9位处的Xaa是丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>在10位处的Xaa是组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、
高半胱氨酸或磺基丙氨酸
<400>12
XaaValAsnGlnXaaLeuCysGlyXaaXaaLeuValGluAlaLeuTyr
151015
LeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrProLysThr
202530
<210>13
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素B链的类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>在1位处的Xaa是苯丙氨酸或脱氨基-苯丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>在5位处的Xaa是组氨酸或苏氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>在9位处的Xaa是丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>在10位处的Xaa是组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、
高半胱氨酸或磺基丙氨酸
<400>13
XaaValAsnGlnXaaLeuCysGlyXaaXaaLeuValGluAlaLeuTyr
151015
LeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrLysProThr
202530
<210>14
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素B链的类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>在1位处的Xaa是组氨酸、苏氨酸或丝氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>在5位处的Xaa是苏氨酸或丝氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>在6位处的Xaa是组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、
高半胱氨酸或磺基丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>在12位处的Xaa是酪氨酸、4-羟甲基苯丙氨酸、
4-氨基苯丙氨酸或经修饰的4-氨基苯丙氨酸(具有
经由酰胺键连接在芳族环胺处的二肽)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>在21位处的Xaa是酪氨酸、苯丙氨酸、4-羟甲基
苯丙氨酸、4-氨基苯丙氨酸或经修饰的4-氨基
苯丙氨酸(具有经由酰胺键连接在芳族环胺处的二肽)
<400>14
XaaLeuCysGlyXaaXaaLeuValGluAlaLeuXaaLeuValCysGly
151015
GluArgGlyPheXaa
20
<210>15
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素B链的类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>在1位处的Xaa是苯丙氨酸或脱氨基-苯丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>在5位处的Xaa是组氨酸、苏氨酸或丝氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>在9位处的Xaa是苏氨酸或丝氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>在10位处的Xaa是组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、
高半胱氨酸或磺基丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>在16位处的Xaa是酪氨酸、4-羟甲基苯丙氨酸、
4-氨基苯丙氨酸或经修饰的4-氨基苯丙氨酸(具有
经由酰胺键连接在芳族胺处的二肽)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>在25位处的Xaa是酪氨酸、苯丙氨酸、4-羟甲基
苯丙氨酸、4-氨基苯丙氨酸或经修饰的4-氨基
苯丙氨酸(具有经由酰胺键连接在芳族环胺处的二肽)
<400>15
XaaValAsnGlnXaaLeuCysGlyXaaXaaLeuValGluAlaLeuXaa
151015
LeuValCysGlyGluArgGlyPheXaaTyrThrProLysThr
202530
<210>16
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素B链的类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>在1位处的Xaa是苯丙氨酸或脱氨基-苯丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>在5位处的Xaa是组氨酸、苏氨酸或丝氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>在9位处的Xaa是苏氨酸或丝氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>在10位处的Xaa是组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、
高半胱氨酸或磺基丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>在16位处的Xaa是酪氨酸、4-羟甲基苯丙氨酸、
4-氨基苯丙氨酸或经修饰的4-氨基苯丙氨酸(具有
经由酰胺键连接在芳族环胺处的二肽)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>在25位处的Xaa是酪氨酸、苯丙氨酸、4-羟甲基
苯丙氨酸、4-氨基苯丙氨酸或经修饰的4-氨基
苯丙氨酸(具有经由酰胺键连接在芳族环胺处的二肽)
<400>16
XaaValAsnGlnXaaLeuCysGlyXaaXaaLeuValGluAlaLeuXaa
151015
LeuValCysGlyGluArgGlyPheXaaTyrThrLysProThr
202530
<210>17
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素A链的类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>在8位处的Xaa是苏氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>在21位处的Xaa是天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸谷氨酰胺、
谷氨酸、苏氨酸或丝氨酸
<400>17
GlyIleValGluGlnCysCysXaaSerIleCysSerLeuTyrGlnLeu
151015
GluAsnTyrCysXaa
20
<210>18
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素A链的类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>在19位处的Xaa是酪氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、4-氨基
苯丙氨酸或经修饰的4-氨基苯丙氨酸(具有
经由酰胺键连接在芳族环胺处的二肽)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>在21位处的Xaa是天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸谷氨酰胺、
谷氨酸、苏氨酸或丝氨酸
<400>18
GlyIleValGluGlnCysCysThrSerIleCysSerLeuTyrGlnLeu
151015
GluAsnXaaCysXaa
20
<210>19
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素B链的类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>在1位处的Xaa是组氨酸、苏氨酸或丝氨酸
<400>19
XaaLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGly
151015
GluArgGlyPhePhe
20
<210>20
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素B链的类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>在1位处的Xaa是苯丙氨酸或脱氨基-苯丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>在5位处的Xaa是组氨酸、苏氨酸或丝氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>在9位处的Xaa是苏氨酸或丝氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>在10位处的Xaa是组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、
高半胱氨酸或磺基丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>在16位处的Xaa是酪氨酸或4-羟甲基苯丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>在25位处的Xaa是酪氨酸、苯丙氨酸或4-羟甲基苯丙氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>在28位处的Xaa是天冬氨酸、赖氨酸-脯氨酸二肽或
脯氨酸-赖氨酸二肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>在29位处的Xaa是苏氨酸或精氨酸-精氨酸二肽
<400>20
XaaValAsnGlnXaaLeuCysGlyXaaXaaLeuValGluAlaLeuTyr
151015
LeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrXaaXaa
2025
<210>21
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰岛素类似物的B链的N端
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>在1位处的Xaa是苯丙氨酸或脱氨基-苯丙氨酸。
<400>21
XaaValAsnGln
1
<210>22
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>22
GlyGlyGlyProGlyLysArg
15
<210>23
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>23
GlyTyrGlySerSerSerArgArgAlaProGlnThr
1510
<210>24
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>24
GlyGlyGlyGlyGlyLysArg
15
<210>25
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>25
ArgArgGlyGlyGlyGlyGly
15
<210>26
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>26
GlyGlyAlaProGlyAspValLysArg
15
<210>27
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>27
ArgArgAlaProGlyAspValGlyGly
15
<210>28
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>28
GlyGlyTyrProGlyAspValLysArg
15
<210>29
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>29
ArgArgTyrProGlyAspValGlyGly
15
<210>30
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>30
GlyGlyHisProGlyAspValLysArg
15
<210>31
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>31
ArgArgHisProGlyAspValGlyGly
15
<210>32
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>32
ArgArgGlyProGlyGlyGly
15
<210>33
<211>51
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>单链人胰岛素类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(49)..(49)
<223>在49位处的Xaa是4-氨基苯丙氨酸或经修饰的4-氨基
苯丙氨酸(具有经由酰胺键连接在芳族环胺处的二肽)
<400>33
PheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyr
151015
LeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrProLysThrGlyIle
202530
ValGluGlnCysCysThrSerIleCysSerLeuTyrGlnLeuGluAsn
354045
XaaCysAsn
50
<210>34
<211>63
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>单链人胰岛素类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(61)..(61)
<223>在61位处的Xaa是4-氨基苯丙氨酸或经修饰的4-氨基
苯丙氨酸(具有经由酰胺键连接在芳族环胺处的二肽)
<400>34
PheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyr
151015
LeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrProLysThrGlnPro
202530
LeuAlaLeuGluGlySerLeuGlnLysArgGlyIleValGluGlnCys
354045
CysThrSerIleCysSerLeuTyrGlnLeuGluAsnXaaCysAsn
505560
<210>35
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>35
AlaGlyArgGlySerGlyLys
15
<210>36
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>36
AlaGlyLeuGlySerGlyLys
15
<210>37
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>37
AlaGlyMetGlySerGlyLys
15
<210>38
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>38
AlaSerTrpGlySerGlyLys
15
<210>39
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>39
ThrGlyLeuGlySerGlyGln
15
<210>40
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>40
ThrGlyLeuGlyArgGlyLys
15
<210>41
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>41
ThrGlyLeuGlySerGlyLys
15
<210>42
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>42
HisGlyLeuTyrSerGlyLys
15
<210>43
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>43
LysGlyLeuGlySerGlyGln
15
<210>44
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>44
ValGlyLeuMetSerGlyLys
15
<210>45
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>45
ValGlyLeuSerSerGlyGln
15
<210>46
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>46
ValGlyLeuTyrSerGlyLys
15
<210>47
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>47
ValGlyLeuSerSerGlyLys
15
<210>48
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>48
ValGlyMetSerSerGlyLys
15
<210>49
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>49
ValTrpSerSerSerGlyLys
15
<210>50
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>50
ValGlySerSerSerGlyLys
15
<210>51
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>51
ValGlyMetSerSerGlyLys
15
<210>52
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>52
ThrGlyLeuGlySerGlyArg
15
<210>53
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>53
ThrGlyLeuGlyLysGlyGln
15
<210>54
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>54
LysGlyLeuSerSerGlyGln
15
<210>55
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>55
ValLysLeuSerSerGlyGln
15
<210>56
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>56
ValGlyLeuLysSerGlyGln
15
<210>57
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>57
ThrGlyLeuGlyLysGlyGln
15
<210>58
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<400>58
ValGlyLeuSerLysGlyGln
15
<210>59
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于测试二肽前药元件的裂解的合成肽
<400>59
HisSerArgGlyThrPhe
15
<210>60
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>用于测试二肽前药元件的裂解的合成肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>在2位处的Xaa是肌氨酸
<400>60
LysXaaHisSerArgGlyThrPhe
15
<210>61
<211>21
<212>PRT
<213>智人
<400>61
GlyIleValAspGluCysCysPheArgSerCysAspLeuArgArgLeu
151015
GluMetTyrCysAla
20
<210>62
<211>29
<212>PRT
<213>智人
<400>62
GlyProGluThrLeuCysGlyAlaGluLeuValAspAlaLeuGlnPhe
151015
ValCysGlyAspArgGlyPheTyrPheAsnLysProThr
2025
<210>63
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰高血糖素类似物
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>d-组氨酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)..(2)
<223>d-苏氨酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)..(3)
<223>d-精氨酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)..(5)
<223>d-苏氨酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)..(6)
<223>d-苯丙氨酸
<400>63
XaaXaaXaaGlyXaaXaa
15
<210>64
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>胰高血糖素类似物
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>d-赖氨酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)..(2)
<223>d-肌氨酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)..(3)
<223>d-组氨酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)..(4)
<223>d-苏氨酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)..(5)
<223>d-精氨酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(7)..(7)
<223>d-苏氨酸
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>d-苯丙氨酸
<400>64
XaaXaaXaaXaaXaaGlyXaaXaa
15
<210>65
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>65
SerArgValSerArgArgSerArg
15
<210>66
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>66
GlyTyrGlySerSerSerArgArg
15
<210>67
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>67
GlySerSerSerArgArgAlaPro
15
<210>68
<211>48
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IGF1B和A链类似物
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>在22位处的Xaa是鸟氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(36)..(36)
<223>在36位处的Xaa是鸟氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(41)..(41)
<223>在41位处的Xaa是鸟氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(42)..(42)
<223>在42位处的Xaa是鸟氨酸
<400>68
CysGlyProGluHisLeuCysGlyAlaGluLeuValAspAlaLeuTyr
151015
LeuValCysGlyAspXaaGlyPheTyrPheAsnGlyIleValAspGlu
202530
CysCysPheXaaSerCysAspLeuXaaXaaLeuGluAsnTyrCysAsn
354045
<210>69
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>在7位处的Xaa是鸟氨酸
<400>69
GlyTyrGlySerSerSerXaaArg
15
<210>70
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>70
GlyAlaGlySerSerSerArgArgAlaProGlnThr
1510
<210>71
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽接头
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>在7位处的Xaa是鸟氨酸、精氨酸或赖氨酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>在8位处的Xaa是鸟氨酸、精氨酸或赖氨酸
<400>71
GlyTyrGlySerSerSerXaaXaa
15

Claims (19)

1.一种具有以下结构的前药：
A-B-Q；
其中Q是具有通过二硫键结合在一起的A链和B链的胰岛素肽，其中所述A链为序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)，且所述B链为序列X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTPKT(SEQIDNO:15)或X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTKPT(SEQIDNO:16)，
其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH、NH2和OCH3；
X3选自天冬酰胺、鸟氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X7为酪氨酸；
X8为组氨酸、天冬酰胺或酪氨酸；
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
其中A-B选自Aib-Gly(N-己基)、dLys-Gly(N-己基)、dCys-Gly(N-己基)、dAla-Gly(N-己基)、Aib-Gly(N-甲基)、dLys-Gly(N-甲基)、dCys-Gly(N-甲基)、dAla-Gly(N-己基)、Aib-Phe(N-甲基)、dLys-Phe(N-甲基)、dCys-Phe(N-甲基)或dAla-Phe(N-甲基)，其中A-B通过在A-B和Q的脂族氨基之间的酰胺键与Q连接；
其中在生理条件下的PBS中A-B从Q化学裂解的半衰期(t1/2)是至少1小时至1周。
2.一种具有以下结构的前药：
A-B-Q；
其中Q是具有通过二硫键结合在一起的A链和B链的胰岛素肽，其中所述A链为序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)，且所述B链为序列X14-X4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8(SEQIDNO:14)，
其中
X14是键，或选自下述的1-4个氨基酸的序列：FVNQ(SEQIDNO:11)、VNQ、NQ和Q；
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH、NH2和OCH3；
X3选自天冬酰胺、鸟氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X7为酪氨酸；
X8为组氨酸、天冬酰胺或酪氨酸；
其中A-B选自Aib-Gly(N-己基)、dLys-Gly(N-己基)、dCys-Gly(N-己基)、dAla-Gly(N-己基)、Aib-Gly(N-甲基)、dLys-Gly(N-甲基)、dCys-Gly(N-甲基)、dAla-Gly(N-己基)、Aib-Phe(N-甲基)、dLys-Phe(N-甲基)、dCys-Phe(N-甲基)或dAla-Phe(N-甲基)；
其中A-B通过在A-B和Q的脂族氨基之间的酰胺键与Q连接；
其中在生理条件下的PBS中A-B从Q化学裂解的半衰期(t1/2)是至少1小时至1周。
3.根据权利要求2所述的前药，其中所述B链为序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQIDNO:8)或FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQIDNO:9)。
4.根据权利要求1所述的前药，其中所述脂族氨基是在A链或B链的N端氨基酸上的α氨基。
5.根据权利要求1所述的前药，其中所述脂族氨基是在Q的侧链上的脂族氨基。
6.根据权利要求5所述的前药，其中所述B链为序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQIDNO:8)或FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQIDNO:9)，且所述脂族氨基是赖氨酸的侧链氨基。
7.一种具有以下结构的前药：
A-B-Q；
其中Q是包含通过二硫键结合在一起的A链和B链的胰岛素肽，其中所述A链为序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)，且所述B链为序列X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTPKT(SEQIDNO:15)或X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTKPT(SEQIDNO:16)，
其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH、NH2、NHR10和OCH3，其中R10是具有通用结构A-B的二肽；
X3选自天冬酰胺、鸟氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
其中X12选自OH、NH2、NHR11和OCH3，其中R11是具有通用结构A-B的二肽；
X8为组氨酸、天冬酰胺或以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH、NH2、NHR12和OCH3，其中R12是具有通用结构A-B的二肽；
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
其中A-B选自Aib-Gly(N-己基)、dLys-Gly(N-己基)、dCys-Gly(N-己基)、dAla-Gly(N-己基)、Aib-Gly(N-甲基)、dLys-Gly(N-甲基)、dCys-Gly(N-甲基)、dAla-Gly(N-己基)、Aib-Phe(N-甲基)、dLys-Phe(N-甲基)、dCys-Phe(N-甲基)或dAla-Phe(N-甲基)，
其中A-B通过在A-B和Q的氨基酸侧链上的芳族氨基之间的酰胺键与Q连接；
其中在生理条件下的PBS中A-B从Q化学裂解的半衰期(t1/2)是至少1小时至1周。
8.根据权利要求7所述的前药，其中
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X是NHR10，其中R10是具有通用结构A-B的二肽；
X7为以下通用结构的氨基酸
其中X12是OH；并且
X8为组氨酸、天冬酰胺或以下通用结构的氨基酸
其中X13是H或OH。
9.一种具有以下结构的前药：
A-B-Q；
其中Q是包含通过二硫键结合在一起的A链和B链的胰岛素肽，其中所述A链为序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQIDNO:3)，且所述B链为序列X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTPKT(SEQIDNO:15)或X9VNQX4LCGX5X6LVEALX7LVCGERGFX8YTKPT(SEQIDNO:16)，
其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2为以下通用结构的氨基酸
其中X选自OH、NH2、NHR10和OCH3，其中R10是具有通用结构A-B的二肽；
X3选自天冬酰胺、鸟氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸和磺基丙氨酸；
X7为以下通用结构的氨基酸
其中X12选自OH、NH2、NHR11和OCH3，其中R11是具有通用结构A-B的二肽；
X8为组氨酸、天冬酰胺或以下通用结构的氨基酸
其中X13选自H、OH、NH2、NHR12和OCH3，其中R12是具有通用结构A-B的二肽；
X9选自苯丙氨酸和脱氨基-苯丙氨酸；
其中
A选自赖氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和氨基异丁酸；
B选自异亮氨酸(N-C1-C6烷基)、缬氨酸(N-C1-C6烷基)和苏氨酸(N-C1-C6烷基)，
其中A-B通过在A-B和Q的氨基酸侧链上的芳族氨基之间的酰胺键与Q连接；
其中在生理条件下的PBS中A-B从Q化学裂解的半衰期(t1/2)是至少1小时至1周。
10.根据权利要求9所述的前药，其中A具有d-立体化学。
11.根据权利要求1、2、7、8或9所述的前药，所述前药另外具有与所述前药共价连接的亲水部分。
12.根据权利要求11所述的前药，其中所述亲水部分是聚乙二醇。
13.根据权利要求12所述的前药，其中所述聚乙二醇与A-B共价连接。
14.根据权利要求13所述的前药，其中所述聚乙二醇通过间隔物与A-B共价连接。
15.根据权利要求1、2、7、8或9所述的前药，所述前药另外具有与所述前药共价连接的酰基或烷基。
16.根据权利要求15所述的前药，其中所述酰基或烷基与A-B共价连接。
17.根据权利要求16所述的前药，其中B为用具有1-5个、10-12个或12-24个碳的链的基团酰化的赖氨酸。
18.根据权利要求1、2、7、8或9所述的前药，其中B链羧基端经由8-12个氨基酸的肽接头与A链的氨基端连接，以形成单链胰岛素类似物。
19.根据权利要求18所述的前药，其中所述肽接头选自：GYGSSSRRAPQT；SEQIDNO:23、GYGSSSX7X8(SEQIDNO:71)或GAGSSSRRAPQT(SEQIDNO:70)，其中X7和X8独立地为鸟氨酸、精氨酸或赖氨酸。
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