KR20060129393A - ＨＬＡ－Ａ2402-제한 Ｅｐ－ＣＡＭ 특이적 ＣＴＬ에인식되는 에피토프/펩티드 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드；서열 번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드；적어도 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환에 의해 서열번호 1 또는 2에 기재되는 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열로 구성된 HLA－A2402 분자와 복합체를 형성하여 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구에 인식 또는 이를 유도할 수 있는 돌연변이 펩티드는 HLA－A2402를 가지는 표피성 암 환자에 대한 암 백신으로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구에 인식되는 에피토프 펩티드, 항원 제시 세포 및 주요 조직 적합 항원 복합체, 이를 활성 성분으로 포함하는 암 백신 또는 세포 독성 T 임파구 유도제, 상기 세포 독성 T 임파구 유도제를 활성 성분으로 포함하는 표피성 암에 대한 수동 면역 치료제, 이를 이용한 암 치료 또는 개선 방법, 및 암 특이적인 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구의 정량 방법에 관한 것이다.
세포 독성 T 임파구(Cytotoxic T Lymphocyte：하기, "CTL" 라 칭함)는 암에 대한 저항에 있어서 중요 인자로 간주되고 있다.
암 환자의 종양 국소에는 종양 세포에 대한 세포 독성 활성을 나타내는 CTL의 침윤이 관찰된다. 상기 종양 특이적인 CTL의 표적 분자인 종양 항원은 세포 내에서 분해되어 8 ~ 11개의 아미노산으로 구성되는 펩티드(종양 에피토프 펩티드)가 되며, 주요 조직 적합성 항원인 인간 백혈구 항원(하기, "HLA"라 칭함) 분자와 결합하여 종양 세포 표면 상에 제시된다. CTL은 HLA와 종양 항원 펩티드를 포함하는 복합체를 인식하여 종양 세포를 공격한다. 이와 같이 CTL은 종양 항원의 HLA-제한을 통해 종양 세포를 인식한다.
HLA는 대부분의 세포 상에 발현되는 세포막 항원이며, 클래스 I 항원과 클래스 II 항원으로 분류된다. CTL에 의하여 에피토프 펩티드와 함께 인식되는 HLA는 클래스 I 항원으로 분류된다. HLA 클래스 I 항원은 한층 더 HLA－A, HLA－B, HLA－C등으로 분류되고, 상기 유전자들은 서브타입을 가진다. 예를 들면 HLA－A는 다형이며, A1, A2, A24, 및 A26 등의 서브타입을 가진다. 이 때문에 인간 개개인이 가지는 HLA의 서브타입은 항상 동일하지 않으며, CTL은 HLA 클래스 I 항원과 종양 에피토프 펩티드의 복합체를 인식할 때 HLA의 서브타입도 인식한다. 또한 HLA에 결합 가능한 에피토프 펩티드에는 HLA의 서브타입마다 결합할 수 있는 펩티드 서열 모티프(규칙적 서열)가 있음이 알려져 있다. 따라서 CTL을 유도 및/또는 활성화하기 위해서는 환자마다 다른 HLA 서브타입에 결합할 수 있는 모티프로 구성된 펩티드를 선택하는 것이 필수적이다.
Ep－CAM은 표피 세포 유래 암 세포의 표면에 넓게 발현하는 분자이며, 칼슘 비이온 의존성 세포-세포 접합을 매개한다. Ep－CAM은 EGP－2, 17－1A, GA733－2 또는 KSA 라고도 알려져 있다. Ep－CAM은 대장, 폐, 머리 경부, 유선 등 다양한 조직학적 기원에서 유래한 다양한 종양에서 고발현하며, 정상 표피 세포에서 발현이 국한되어 있다. 또한 종양 진전 정도와 Ep－CAM의 발현량이 관련되어 있으므 로, Ep－CAM의 발현 검출은 종양의 미소 전이의 진단 또는 환자의 생존 예측을 위한 마커로서 유용하게 이용될 수 있다.
Ep－CAM은 표피 세포 유래 암 세포에 광범위하게 발현되고 있지만 정상세포에서는 발현이 국한되어 있다. 그러므로 모노클로날 항체를 이용하는 면역 요법 및 유전자 치료에서 Ep-CAM은 주요 표적이다.
예를 들면, 외과 수술로 종양을 제거한 환자에게 Ep－CAM-특이적 쥐 모노클로날 항체(17-1A)를 투여시, 원격 전이가 예방되는 동시에, 7년간 연속 투여하여 환자의 생존율을 높이는데 효과적임이 보고되었다. 또한 Ep－CAM 특이적 모노클로날 항체인 17-1A를 대장암 환자의 치료에 이용하여 사망률과 재발율 저하에 효과적임이 보고되었다.
그에 더불어 HLA-제한 Ep－CAM를 표적으로 하는 CTL을 이용한 암 치료의 가능성을 보여주는 연구 결과가 최근 보고되고 있다.
예를 들면 특허 문헌 1은 HLA－A0201-제한 Ep－CAM-특이적 CTL이 표피 종양 세포를 파괴하지만, 정상세포에 영향을 주지 않는다고 보고하였다. 특허 문헌 1은 HLA－A0201-제한 CTL이 인식하는 Ep－CAM174－184 에피토프 펩티드로서 서열 번호 12로 기재되는 YQLDPKFITSI 서열로 구성된 펩티드를 제시한다.
또한 Ep－CAM에 대한 T 세포 응답이 면역 치료를 받지 않은 결장 및 대장암 환자에 있어 관찰되었다. 그에 더하여, 대장암 환자에 Ep－CAM를 발현하는 재조합 카나리 폭스 바이러스(recombinant canary pox virus)로 면역시 항 Ep－CAM-특이적 CTL 응답이 자기 면역 응답을 일으키지 않고 유도되었다.
HLA 클래스 I 항원의 HLA－A 타입 중, 일본인 중에 가장 많이 발현하는 것은 HLA－A24이다. 따라서 HLA－A24-제한 Ep－CAM 에피토프 펩티드는 암 백신으로서 매우 적합하게 사용할 수 있다. 상기 에피토프 펩티드는 하기의 내용이 예로서 보고되었다.
특허 문헌 2는 HLA－A2402-제한 CTL 에피토프 펩티드로 SART－2 종양 항원 단백질에서 유래된 9개 아미노산 서열로 구성되는 5 종의 에피토프 펩티드를 제시한다.
특허 문헌 3은 폐선암 환자 유래 HLA－A2402-제한 CTL 에피토프 펩티드로 ART－4 종양 항원 단백질에서 유래된 8 ~ 11개 아미노산 서열로 구성되는 6 종의 에피토프 펩티드를 제시한다.
특허 문헌 4는 식도암 환자로부터 수립된 세포주로부터 수득한 HLA－A2402-제한 CTL 에피토프 펩티드로, 대장암 세포와 소세포성 폐암 세포에서 비정상적으로 발현하는 p56luk 단백질(luk 유전자가 암호화하는 종양 항원 단백질)의 8 ~ 11개 아미노산 서열로 구성되는 7 종의 에피토프 펩티드를 제시한다.
특허 문헌 5는 식도암 환자로부터 수립한 세포주로부터 수득한 HLA－A2402-제한 CTL 에피토프 펩티드로, KE4 종양 세포주 유래의 cDNA 라이브러리로부터 수득한 9 ~ 10개 아미노산 서열로 구성되는 4 종의 PI-9 유래 펩티드를 제시한있다.
특허 문헌 6은 폐암 환자에서 수립된 세포주로부터 수득한 HLA－A2402-제한 CTL 에피토프 펩티드로, 11 ~ 18 종의 폐선암 세포주의 cDNA 라이브러리로부터 수득한 9 ~ 10개의 아미노산 서열로 구성된 17 종의 PI-9 유래 펩티드의 에피토프 펩 티드를 제시한다.
특허 문헌 7은 HLA－A24. 1(HLA－A2402) 결합 모티프를 가지며, N 말단 부분에 Y, F, W의 제 1 보존 잔기를 가지고, C 말단 부분에 F, I, W, M의 제 2 보존 잔기를 가지며, 제1 보존 잔기와 제2 보존 잔기가 6 ~ 7 잔기 떨어져 있는, 9 ~ 10 아미노산 잔기로 구성된 펩티드를 제시한다.
상기와 같이 종양 관련 항원 중 여러 가지 HLA－A2402-제한 CTL 에피토프가 동정되고 있지만 종양 항원의 발현은 조직학적인 기원, 암 환자간 및 개개인의 병변 간에 따라 변화하므로, 이 후 신규 에피토프는 특이적일 것이 요구된다.
또한 HLA－A2402 분자에 결합할 수 있는 Ep－CAM 에피토프 펩티드에 의한 CTL 유도는 아직 확인되지 않음으로 HLA－A2402 분자에 결합할 수 있으며 CTL을 유도할 수 있는 신규 암 세포 특이 Ep－CAM 에피토프 펩티드를 개발할 필요가 있다.
특허 문헌 1
국제공개공보 WO97/15597호
특허 문헌 2
일본특허공개공보 1999-318455호
특허 문헌 3
일본특허공개공보 2000-116383호
특허 문헌 4
국제공개공보 WO2000-06595호
특허 문헌 5
일본특허공개공보 2001-245675호
특허 문헌 6
일본특허공개공보 2003-270호
특허 문헌 7
일본특허공개공보 1996-500103호(청구항 11 등)
발명이 해결하려고 하는 과제
본 발명은 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구를 유도할 수 있는 Ep－CAM 에피토프 펩티드, 항원 제시 세포 및 주요 조직 적합 항원 복합체, 이를 유효 성분으로 포함하는 암 백신 또는 세포 독성 T 임파구 유도제, Ep－CAM 특이적 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구, 이를 포함하는 수동 면역 치료제, 이를 이용한 암 치료 또는 개선 방법, 및 표피성 암 특이적 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구의 정량 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
상기 과제를 달성하기 위해서 본 발명자들은 HLA－A2402 분자에 결합 능력을 가진 에피토프 펩티드 서열을 찾아내기 위하여, 바이오인포메틱스 조사에 의해 Ep－CAM 중 7 개의 펩티드 서열을 예측하였고, 이를 합성하였다. 상기 펩티드 서열은 일본인 중 가장 많은 HLA－A 타입이며(60%이상), 유럽인의 약 20%에도 존재하며, 바이오인포매틱스 조사에 의해 특정 HLA 분자에 결합할 수 있는 펩티드를 예측한 경우, 상기 예측된 펩티드로 유도된 세포 독성 T 임파구가 실제로 상기 펩티드를 포함하는 항원을 인식하지 못하는 경우도 많다.
이러한 사정 때문에, 이에 본 발명자들은 예측된 7 개의 펩티드 가운데 2 개의 에피토프 펩티드에 특이적인 CTL 클론이 실제 HLA－A2402 양성 Ep－CAM 발현 암 세포에서 세포 독성을 나타내지만, HLA－A2402 음성 암 세포에 대해서는 세포 독성을 나타내지 않음을 발견하였다.
또한 콜드 타겟 인히비션 어세이(Cold target inhibition assay)는 상기 에피토프 펩티드가 HLA－A2402 양성 Ep－CAM 양성 암 세포 상에서 처리되고, 항원 제시됨을 보여주었다.
이러한 결과로 상기 2 개의 에피토프 펩티드는 HLA－A2402를 보유한 인간을 위한 암 백신으로 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 결과를 근거하여 완성된 것이며, 하기의 에피토프 펩티드 등을 제공한다.
1. 하기의 (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 펩티드:
(1) 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩티드;
(2) 서열 번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩티드;
(3) 적어도 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환에 의해 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열로 구성된, HLA－A2402 분자와 복합체를 형성하여 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구에 인식 또는 이를 유도할 수 있는 돌연변이 펩티드; 및
(4) 적어도 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환에 의해 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열로 구성된, HLA－A2402 분자와 복합체를 형성하여 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구에 인식 또는 이를 유도할 수 있는 돌연변이 펩티드.
2. 하기의 (1) 또는 (2) 의 펩티드:
(1) 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드; 및
(2) 서열 번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드.
3. 상기 1 또는 2의 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 암 백신.
4. 상기 3에 있어서, 암은 표피성 암인 것을 특징으로 하는 암 백신.
5. 상기 3 또는 4에 있어서, 암은 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 구강암, 췌암, 식도암, 비 인두암, 자궁암, 전립선암 및 담낭암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암인 것을 특징으로 하는 암 백신.
6. 상기 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 백혈구 항원으로 HLA－A2402를 가지는 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 암 백신.
7. 상기 1 또는 2의 펩티드를 활성 성분으로 포함하는 세포 독성 T 임파구 유도제.
8. 상기 7에 있어서, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 세포 독성 T 임파구 유도제.
9. 하기의 (5) 내지 (8) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드:
(5) 서열 번호 10으로 기재되는 염기 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
(6) 서열 번호 11로 기재되는 염기 서열로부 구성되는 폴리뉴클레오티드;
(7) 서열 번호 10으로 기재되는 염기 서열로 구성되는 되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, HLA－A2402 분자와 복합체를 형성하여 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구에 인식 또는 이를 유도할 수 있는 펩티드를 암호화하는 돌연변이 폴리뉴클레오티드; 및
(8) 서열 번호 11로 기재되는 염기 서열로 구성되는 되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구에 인식되도록 HLA－A2402 분자와 복합체를 형성하거나 또는 상기 임파구를 유도할 수 있는 펩티드를 암호화하는 돌연변이 폴리뉴클레오티드.
10. 상기 9의 폴리뉴클레오티드를 활성 성분으로 포함하는 표피성 암의 유전자 치료제.
11. 상기 9의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
12. 상기 11의 재조합 벡터를 도입한 형질전환체.
13. 상기 12의 형질전환체를 배양하는 단계와 배양액으로부터 상기 1 또는 2의 펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 상기 1 또는 2의 펩티드 제조 방법.
14. 상기 1 또는 2의 펩티드로 펄스된 항원 제시 세포.
15. 상기 14의 항원 제시 세포를 활성 성분으로 포함하는 암 백신.
16. 상기 15에 있어서, 암은 표피성 암인 것을 특징으로 하는 암 백신.
17. 상기 15 또는 16에 있어서, 암은 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 구강암, 췌암, 식도암, 비 인두암, 자궁암, 전립선암 및 담낭암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 백신.
18. 상기 15 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 암 백신.
19. 상기 14의 항원 제시 세포를 활성 성분으로 포함하는 세포 독성 T 임파구 유도제.
20. 상기 19에 있어서, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간의 치료에 이용되는 것을 특징으로 하는 세포 독성 T 임파구 유도제.
21. 주요 조직 적합 항원 및 상기 1 또는 2의 펩티드 또는 상기 14의 항원 제시 세포 상에 제시된 종양 항원 에피토프 펩티드를 포함하는 주요 조직 적합 항원 복합체.
22. 상기 21에 있어서, HLA－A2402 분자와 β2 마이크로글로블린, 상기 1 또는 2의 펩티드 또는 상기 14의 항원 제시 세포 상에 제시된 종양 항원 에피토프 펩티드를 포함하는 주요 조직 적합 항원 복합체.
23. 상기 21 또는 22의 주요 조직 적합 항원 복합체를 활성 성분으로 포함하는 암 백신.
24. 상기 23에 있어서, 암은 표피성 암인 것을 특징으로 하는 암 백신.
25. 상기 23 또는 24에 있어서, 암은 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 구강암, 췌암, 식도암, 상 인두암, 자궁암, 전립선암 및 담낭암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 백신.
26. 상기 23 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간의 치료에 이용하는 것을 특징으로 하는 암 백신.
27. 상기 21 또는 22의 주요 조직 적합 항원 복합체를 활성 성분으로 포함하는 세포 독성 T 임파구 유도제.
28. 상기 27에 있어서, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간의 치료에 이용하는 것을 특징으로 하는 세포 독성 T 임파구 유도제.
29. 주요 조직 접합 항원, 상기 1 또는 2의 펩티드 또는 상기 14의 항원 제시 세포 상에 제시된 종양 항원 에피토프 펩티드를 포함하는 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머.
30. 하기 (a) 내지 (d) 중 적어도 하나 이상을 이용하여 말초혈액 임파구를 자극하여 수득되는 세포 독성 T 임파구:
(a) 상기 1 또는 2의 펩티드;
(b) 상기14의 항원 제시 세포;
(c) 상기 21 또는 22의 주요 조직 적합 항원 복합체; 및
(d) 상기 29의 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머.
31. 상기 30에 있어서, 상기 (a) 내지 (d) 중 적어도 하나 이상을 이용하여 말초혈액 임파구를 자극하여 주요 조직 적합 항원 복합체 및/또는 그의 테트라머와 세포 독성 T 임파구와의 결합체를 형성하는 단계 및 상기 결합체로부터 분리하는 단계에 의해 수득되는 세포 독성 T 임파구.
32. 상기 30 또는 31의 세포 독성 T 임파구를 활성 성분으로 포함하는 암 수동 면역 치료제.
33. 상기 32에 있어서, 암은 표피성 암인 것을 특징으로 하는 수동 면역 치료제.
34. 상기 32 또는 33에 있어서, 암은 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 구강암, 췌암, 식도암, 상 인두암, 자궁암, 전립선암 및 담낭암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 수동 면역 치료제.
35. 상기 32 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 수동 면역 치료제.
36. 1) 말초혈액에 작용하는 하기 (a)~(d) 중 적어도 하나 이상을 제작하는 단계; 및
(a) 상기 1 또는 2의 펩티드,
(b) 상기 14의 항원 제시 세포,
(c) 상기 21 또는 22의 주요 조직 적합 항원 복합체,
(d) 상기 29의 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머,
2) 말초혈액 중의 세포 독성 T 세포 또는 상기 세포가 생산하는 싸이토카인을 정량하는 단계를 포함하는 말초혈액 중의 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구 정량 방법.
37. 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간에게 하기의 (a)~(d) 중 적어도 하나 이상을 투여하는 암 치료 및/또는 개선 방법:
(a) 상기 1 또는 상기 2의 펩티드,
(b) 상기 14의 항원 제시 세포,
(c) 상기 21 또는 22의 주요 조직 적합 항원 복합체,
(d) 상기 29의 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머.
38. 1) 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간의 말초혈액으로부터 단핵세포분획을 수득하는 단계;
2) 단계 1)의 단핵세포분획을 하기의 (a)~(d) 중 적어도 어느 하나와 함께 배양하는 단계:
(a) 상기 1 또는 2의 펩티드,
(b) 상기 14의 항원 제시 세포,
(c) 상기 21 또는 22의 주요 조직 적합 항원 복합체,
(d) 상기 29의 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머,
3) 세포 독성 T 임파구가 유도 및/또는 활성화된 단핵세포분획을 환자의 혈액으로 되돌리는 단계를 포함하는 암 치료 또는 개선방법.
39. 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간을 대상으로, 하기 (a)~(d) 중 적어도 어느 하나 이상을 투여하는 세포 독성 T 임파구의 유도 방법:
(a) 상기 1 또는 2의 펩티드;
(b) 상기 14의 항원 제시 세포;
(c) 상기 21 또는 22의 주요 조직 적합 항원 복합체; 및
(d) 상기 29의 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머.
40. 상기 30 또는 31의 세포 독성 T 임파구를 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간에게 투여하는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 개선방법.
41. 상기 21에 있어서, 테트라머는 HLA－A2402 분자, β2 마이크로글로블린 및 상기1 또는 2의 펩티드 또는 상기 14의 항원 제시 세포 상에 제시된 종양 항원 에피토프 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머.
42. 상기 41의 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머를 활성 성분으로 포함하는 암 백신.
43. 상기 42에 있어서, 암은 표피성 암인 것을 특징으로 하는 암 백신.
44. 상기 42 또는 43에 있어서, 암은 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 구강암, 췌암, 식도암, 비 인두암, 자궁암, 전립선암 및 담낭암으로 구성되는 군보다 선택되는 것을 특징으로 하는 암 백신.
45. 상기 42 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간의 치료에 이용하는 것을 특징으로 하는 암 백신.
46. 상기 41의 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머를 활성 성분으로 포함하는 세포 독성 T 임파구 유도제.
47. 상기 46에 있어서, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간의 치료에 이용하는 것을 특징으로 하는 세포 독성 T 임파구 유도제.
발명의 효과
본 발명은 표피성 암 세포에 광범위하게 발현되고 있는 Ep－CAM 분자로 유도되며, HLA－A2402에 제한적인 세포 독성 T 임파구에 인식될 수 있는 에피토프 펩티드를 제공한다. 상기 HLA-A2402는 일본인의 백혈구 항원 중 가장 보편적인 타입이다. 따라서 상기 에피토프 펩티드는 광범위한 HLA－A2402를 가지는 인간의 표피성 암에 대한 암 백신으로 사용될 수 있다.
발명을 실시하기
위한 최선의 형태
하기, 본 발명을 상세하게 설명한다.
(I) 에피토프 펩티드
구성
본 발명의 펩티드는 에피토프 펩티드를 검색할 수 있는 참조 싸이트인 월드·와이드·웹 사이트·바이오인포메틱스 & 분자 분석 섹션(BioInformatics & Molecular Analysis Section (BIMAS)의 HLA 펩티드 결합 예측(HLA Peptide Binding Predictions) (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html.)을 참조하여 에피토프 펩티드가 될 수 있는 펩티드를 스크리닝 한 결과, 세포 독성 T 임파구(이후, "CTL"이라 칭함)에 의해 인식되는 에피토프 펩티드로서 확인되었다. 상기 검색 싸이트를 통해 표피성 세포 유래 암에 광범위하게 발현되는 Ep-CAM 단백질에서 유래된 아미노산 서열 중 HLA-A2402 결합 모티브를 가지는 9 ~ 10개의 아미노산으록 구성된 펩티드 서열을 검색하였다.
더욱 상세하게는 본 발명의 펩티드는 하기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 펩티드이다:
(1) 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩티드;
(2) 서열 번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩티드;
(3) 적어도 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환에 의해 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열로 구성된 HLA－A2402 분자와 복합체를 형성하여 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구에 인식 또는 이를 유도할 수 있는 돌연변이 펩티드; 및
(4) 적어도 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환에 의해 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열로 구성된 HLA－A2402 분자와 복합체를 형성하여 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구에 인식 또는 이를 유도할 수 있는 돌연변이 펩티드.
본 발명에 있어서, 펩티드란, 인접한 아미노산 잔기의α－아미노기와 카르보키실가 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 생활성 아미노산 분자 사슬을 의미한다.
또한, 상기 펩티드에 추가적으로 이들의 생활성을 저해시키지 않는 범위에서 염과 그의 유도체를 포함한다. 예를 들면, 유도체로는 이들의 글리코실화, 아미드화, 인산화, 카르복실화, 인산염화, 포르밀화, 아실화 등을 들 수 있다. 바람직한 염은 산부가염이다. 예를 들면, 산부가염으로는 염산-, 인산-, 황산- 등의 무기산부가염 및 포름산, 초산, 프로피온산, 타르타르산 등의 유기산부가염을 들 수 있다.
(1) 내지 (4)로 정의된 각각의 펩티드는 표피성 세포 유래 암 세포 상에서 광범위하게 발현되는 Ep－CAM에서 유래하며, HLA－A2402-제한 CTL에 의해 인식되고 또는 유도 또는 CTL을 더욱 활성화할 수 있다. 그러므로 상기 펩티드는 CTL 유도 또는 종양 항원 활성화, 즉 HLA－A2402를 가지는 인간의 암 치료 또는 개선에 적합한 암 백신으로 이용될 수 있다. 또한 상기 펩티드는 다양한 종양 항원 에피토프 특이 펩티드를 제작하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 펩티드의 용도는 이후에 상술한다.
(3) 및 (4)로 정의된 돌연변이 펩티드의 아미노산의 최소수는 통상 약 5개, 바람직하게는 약 7개이다. 아미노산의 최고수는 HLA－A2402-제한 CTL에 인식되는 한 특별히 한정되지 않지만, 통상 약 12개이며, 약 9 ~ 약 11개의 아미노산으로 구성된 돌연변히 펩티드가 바람직하다.
상기 돌연변이 펩티드는 상기 HLA 펩티드 결합 예측을 참조하여 HLA－A2402 결합 모티프를 위해 서열을 설계하여 얻을 수 있으며, 이 중 실제로 HLA－A2402-제한 CTL로 인식 또는 CTL을 유도하는 펩티드를 선택할 수 있다.
HLA－A2402 양성 Ep－CAM 에피토프 펩티드는 하기의 방법으로 동정될 수 있다.
HLA－A2402 양성의 성인으로부터 임파구를 분리하고 10% 인간 혈청을 함유하는 RPMI1640 배양배지에 2x106/㎖의 세포 농도로 분주한다. 상기 배양세포에 에피토프 후보 펩티드 중 1종을 1 ㎍/㎖의 농도로 첨가한다. 이를 CO2 배양기에서 37℃으로 7 일간 배양하고 7 일째에 IL－2를 첨가한다. 이후 후보 펩티드와 IL－2에 의한 자극 주기를 1 주일에 1 회 반복하여 Ep-CAM-특이적 CTL을 유도한다.
ELISPOT 어세이(Kuzushima, K., et al ., The Journal of Clinical Investigation 104:163-171, 1999)를 수행하여 상기 유도한 표피성 암 특이적 CTL가 에피토프 후보 펩티드에 의해 자극되는지 판정한다.
상기 후보 펩티드를 이용하여 Ep-CAM 단백질 전체를 망라하는 20개 전후의 아미노산으로 구성되는 펩티드 라이브러리를 합성하고, 합성된 펩티드에 대하여 ELISPOT 어세이를 수행하고, CTL에 응답하는 펩티드는 순차적으로 짧게 제작하여 최종적으로 9 ~ 10개 정도의 아미노산으로 구성되는 펩티드는 본 발명의 에피토프 펩티드로 이용된다.
또한 아미노산 치환의 경우, 단백질의 구조를 보존하기 위해 전하, 가용성, 친수성/소수성, 극성 등이 치환 전의 아미노산과 유사한 성질을 가지는 아미노산으로 치환하여 동일한 활성을 가지는 돌연변이 펩티드를 획득한다.
결실, 부가(삽입 포함) 또는 치환 방법은 예를 들면 Wurmer의 방법(Science, 219:666, 1983)을 포함하는 당해 업계에 알려진 방법이다.
본 발명의 펩티드는, 당류, 폴리에틸렌 글리콜, 지방질 등이 부가된 복합체, 방사성 동위 원소 등 유도체 또는 중합체 등의 형태로 이용될 수 있다.
(
II
) 폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드이며, 구체적으로는, 하기 (5) 내지 (8)의 폴리뉴클레오티드이다:
(5) 서열 번호 10으로 기재되는 염기 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
(6) 서열 번호 11로 기재되는 염기 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;
(7) 서열 번호 10으로 기재되는 염기 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 제어 아래에서 혼성화하고, HLA－A2402 분자와 복합체를 형성하여 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구로 인식 또는 이를 유도할 수 있는 펩티드를 암호화하는 돌연변이 폴리뉴클레오티드; 및
(8) 서열 번호 11로 기재되는 염기 서열로 구성되는폴리뉴클레오티드와 엄격한 제어 아래에서 혼성화하고, HLA－A2402 분자와 복합체를 형성하여 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구로 인식 또는 이를 유도할 수 있는 펩티드를 암호화하는 돌연변이 폴리뉴클레오티드.
특별히 언급하지 않는 한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA 모두 포함한다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함한다. RNA는 mRNA, rRNA 및 합성 RNA를 포함한다. 또한 상기 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드와 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드도 포함된다.
서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들 중 하나인 서열 번호 10으로 기재되는 염기 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드들 중 하나인 서열 번호 11로 기재되는 염기 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 인간 암 관련 항원 GA733－2(Szala, S., et . al ., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 87(9):3542-3546, 1990)에서 얻을 수 있는 Ep－CAM 유전자의 부분 서열이다.
본 발명의 에피토프 펩티드의 영역 코딩에서, (7) 또는 (8)로 정의된 돌연변이 폴리뉴클레오티드는 약 15개 이상, 바람직하게는 약 21개 이상이며, 통상적으로 약 45개 이하의 뉴클레오티드로 구성되는 것이 바람직하다. 이 중 약 27 ~ 약 33개 폴리뉴클레오티드로 구성되는 것이 바람직하다.
폴리뉴클레오티드 분자로의 대표예로서 DNA 분자의 경우, "엄격한 제어 아래에서 DNA 분자와 혼성화하는 DNA 분자"는 Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Sambrook, et al., Cold Spring Harber Laboratory Press, Cold Spring Harber, NewYo가, 1989)등에 기재의 방법에 따라 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, "엄격한 제어 아래에서 혼성화한다"의 조건은 6×SSC, 0.5% SDS 및 50% 포름아마이드 용액을 42℃로 가온한 후, 0.1×SSC, 0.5% SDS 용액을 68℃으로 세척했을 경우, 양성 혼성화 신호가 관찰되는 조건이다.
(7) 또는 (8)의 돌연변이 폴리뉴클레오티드는 공지의 단백질 발현 시스템을 이용하여 HLA－A2402를 가지는 세포에서 발현된 펩티드가 CTL에 의해 인식 또는 CTL 유도 능력을 가지는 것을 하기의 방법으로 확인함으로써 선택할 수 있다.
또한 돌연변이 폴리뉴클레오티드는 3´ 말단에 폴리(A) 구조를 가지며, 폴리(A)의 뉴클레오티드 수는 종양 항원으로서 작용하는 아미노산의 코딩 부위에 영향을 주는 것은 아니므로 상기 폴리뉴클레오티드가 가지는 폴리(A)의 뉴클레오티드 수는 특별히 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 기술을 이용하여 본 발명의 에피토프 펩티드를 제조할 때 유용한 유전자 정보를 제공할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드를 또한 핵산 시약 또는 표준 뉴클레오티드로 이용할 수 있다.
(
III
) 재조합 벡터
본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 적합한 벡터 DNA에 삽입하여 얻을 수 있다.
벡터 DNA는 숙주 세포의 종류 및 사용 목적에 맞게 적합하게 선택할 수 있다. 벡터 DNA는 자연에 존재하거나 또는 자연 존재하나, 증식에 필요한 부분 이외의 DNA 부분이 일부 결핍된 DNA이다. 벡터 DNA의 예는 염색체, 에피솜 또는 바이러스 등에 유래하는 벡터를 포함한다. 구체적으로, 벡터 DNA는 박테리아 플라스미드, 박테리오파아지, 트렌스포솜, 효모 에피솜, 삽입 엘리먼트, 효모 염색체 엘리먼트, 바이러스(예를 들면 바쿠로 바이러스, 파포바 바이러스, SV40, 우두 바이러스, 아데노 바이러스, 계두 바이러스, 가성 광견병 바이러스 및 레트로바이러스 등) 등에서 유래하는 벡터 및 이를 조합한 벡터, 플라스미드 및 박테리오파지의 유전학적 엘리먼트 유래의 벡터(예를 들면 코스미드 및 파지미드 등)를 포함한다.
또한 발현 벡터 또는 클로닝 벡터는 본 발명의 펩티드의 생합성을 위해서 이용될 수 있다.
재조합 벡터는 목적 폴리뉴클레오티드 및 복제 및 제어 정보를 암호화하는 유전자 서열(예를 들면 프로모터, 리보솜 결합 부위, 터미네이터, 신호 서열, 인핸서 등)을 구성요소로 가지고 있으며, 공지의 방법으로 상기 서열을 조합하여 제작할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 공지의 방법으로 벡터 DNA에 삽입될 수 있다. 예를 들면, DNA 및 벡터 DNA의 특정 부위를 적합한 제한 효소를 이용하여 특정 부위를 절단하여, 리가제를 이용하여 재결합하기 위해 혼합한다. 벡터 DNA는 선택적으로 적합한 링커를 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 결합하고, 벡터 DNA의 멀티 클로닝 싸이트에 삽입함으로써 얻어질 수 있다.
(
IV
) 형질전환체
본 발명의 형질전환체는 상기 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 벡터를 공지의 숙주 세포에 공지의 방법으로 도입하여 얻을 수 있다. 공지된 숙주세포로는, 예를 들면 대장균(예: K12), 바실러스속 박테리아(예 : MI114)과 같은 박테리아, 효모(예 : AH22), 곤충 세포(예 : Sf 세포) 또는 동물세포(예 : COS-7 세포, Vero 세포, CHO 세포 등)등이 있다.
유전자의 안정성을 고려한 관점에서, 염색체 내 유전자 통합 방법은 유전자 전달 방법이 바람직하다. 핵외 유전자를 이용한 자율 복제 시스템은 단순 적합 방법이다. 벡터 DNA의 숙주 세포로의 전달은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork, 1989) 등에 기재되어 있는 표준 방법으로 실시될 수 있다. 구체적인 예로는 칼슘 포스페이트 형질전환, DEAE－덱스트란 매개 형질전환, 현미경하주사법, 양이온 지질 매개 형질전환, 전기 천공법, 형질 도입, 스크렙 로딩(Scrape loading), 발리스틱 도입(ballistic introduction) 및 감염 등이 있다.
(V) 에피토프 펩티드의 제조 방법
본 발명의 펩티드는 고상 펩티드 합성법과 같은 공지의 방법에 의해 합성될 수 있다. 이러한 펩티드 합성법으로서는, 예를 들면 "펩티드 합성"(마루젠；1975년 발행) 또는 "펩티드 합성"(Interscience, NewYork, 1996)에 기재된 방법을 포함한다. 또한, 본 발명의 펩티드는 선택적으로 Applied Biosystems사의 펩티드 합성 장치와 같은 공지의 화학 합성 장치를 이용하여 제조될 수 있다.
또한 본 발명의 펩티드는 상기 본 발명의 형질전환체를 배양하는 단계와 상기 배양액으로부터 본 발명의 펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
이와 같은 배양은 계대 배양 또는 배치 배양에 의해 숙주 세포에 적합한 배양배지를 이용하여 실시될 수 있다. 배양은 형질전환체의 내부 및 외부의 펩티드 생산량 및/또는 형질전환체의 내외에 펩티드 생산량이나 형질전환체가 생산하는 본 발명의 펩티드 작용 중 하나인 CTL 유도 능력을 지표로 하여 본 발명의 펩티드가 적당량 얻을 수 있을 때까지 실시할 수 있다.
배양액로부터 본 발명의 펩티드를 회수한 후, 이를 정제하는 것이 바람직하다. 정제는 분자 체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 크로마토그래피 방법; 황산 암모니움(ammonium sulfate) 또는 알코올 등을 이용한 용해도 차이에 의한 분획 평균을 조합한 공지의 방법에 의해 실시될 수 있다. 이와 같은 정제는 CTL에 의한 펩티드 인식 또는 펩티드에 의한 CTL의 유도, 구체적으로 예를 들면 CTL에 의한 IFN－γ 생산량을 지표로 하여 실시할 수 있다.
선택적으로, 배양액 내의 본 발명의 펩티드는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체을 이용하여 특이적으로 흡수-회복될 수 있다. 상기 항체는 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열을 기초로 하여 생산되며, 아미노산 서열에 특이적이다.
(
VI
) 항원 제시 세포
본 발명의 항원 제시 세포는 수지상 세포(Ddendritic cells), 대식세포(marcophage) 또는 B 임파구와 같은 항원 제시 세포에 본 발명의 펩티드를 펄스하여 얻을 수 있는 세포이다. 본 발명의 항원 제시 세포는 표면 상에서 본 발명의 펩티드와 결합한 HLA를 발현할 수 있는 세포이며, CTL 자극 능력을 가진다.
"펄스"는 이에 한정되지 않지만, 예를 들면 상기 항원 제시 세포를 농도 1 ~ 10 ㎍/㎖의 본 발명의 펩티드가 포함된 배양배지에서 20~30℃, 30분 ~ 1시간 정도 배양하는 것으로 실시할 수 있다. HLA-A2402에 의해 인식되는 종양 항원이 항원 제시 세포 표면에 제시된다.
종양 항원은 종양 특이적 CTL에 인식 또는 CTL을 유도 또는/및 CTL을 활성화할 수 있는 종양세포에서 제시되는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 의미한다.
또한 종양 항원 펩티드란 상기 종양 항원이 종양 세포 내에서 분해되어 생기는 펩티드이며, HLA 분자와 결합해 세포 표면상에 제시되는 것으로 CTL에 인식되어 CTL 유도 또는/및 CTL을 활성화할 수 있는 펩티드를 의미한다.
또한 종양 항원의 아미노산 서열 부분에서 유래하며, 종양 특이적인 CTL에 인식되거나 또는 한층 더 CTL을 유도 또는 이를 활성화할 수 있는 에피토프 서열을 종양 항원 에피토프(종양 항원 결정)라 한다.
본 명세서에 있어서, "인식된다"란 인식하는 대상이 인식되는 대상을 다른 것과 인지하고 분별한다는 뜻으로, 인지한 대상으로 결합하는 것을 의미한다. 본 명세서에 있어서, "CTL이 종양 세포 또는 종양 항원 에피토프 펩티드를 인식한다"는 뜻은 인간 백혈구 항원(HLA) 또는 종양 항원 펩티드에 CTL이 T세포 수용체를 통해 결합하는 것을 의미한다.
또한 "활성화한다"란 어느 활성 혹은 작용을 가지는 대상 또는 그 상태를 한층 더 증강하는 또는 작동시키는 것을 의미한다. 특히 "CTL을 활성화한다"란 CTL이 HLA에 의해 제시된 에피토프 펩티드를 인식하는 것으로써, 예를 들면 IFN－γ와 같은 작동자를 생산하는 것 또는 HLA에 의해 제시된 에피토프 펩티드를 인식할 때 표적 세포에 대해서 세포 독성을 나타내는 것을 의미한다.
"유도한다" 란 어느 활성 또는 작용을 대부분 갖지 않는 대상 또는 상태로부터 그의 활성 또는 작용을 발생시키는 것을 의미한다. 특히 "항원 특이적인 CTL을 유도한다"란 생체 외 또는 생체 내에서 특정 항원을 특이적으로 인식하는 CTL을 분화 및/또는 증식시키는 것을 의미한다.
본 발명의 에피토프 펩티드가 펄스된 항원 제시 세포는 암 백신으로서 사용할 수 있다. 또한, 표피성 암 특이적인 CTL의 생산, 인간의 말초혈액 중의 상기 CTL의 정량 등을 위해서 이용될 수 있다.
(
VII
) 주요 조직 적합 항원 복합체
본 발명의 주요 조직 적합 항원 복합체는 주요 조직 적합 항원 및 본 발명의 펩티드 또는 본 발명의 펩티드가 펄스된 항원 제시 세포 표면에 제시된 종양 항원 에피토프 펩티드와의 복합체이다.
본 발명에 있어서, 주요 조직 적합 항원이란 T 임파구 항원 수용체로 T 임파구가 인식하는 펩티드를 제시하는 분자이며, CTL에 의해 에피토프 펩티드와 함께 인식되는 인간 백혈구 항원(HLA)을 말한다.
더욱 상세하게는 본 발명의 주요 조직 적합 항원 복합체(이하 "MHC"라 칭함)는 에피토프 펩티드와 함께 CTL에 의해 인식되며, 표적 세포 표면에 발현하고 있는 MHC 클래스 I 분자인 인간 백혈구 항원(HLA)과 CTL에 인식 또는 CTL을 유도할 수 있는 에피토프 펩티드가 결합한 복합체이다. 이 복합체에는 β2 마이크로글로블린이 결합하는 것도 포함된다.
Ep－CAM-특이적 CTL 에피토프 펩티드란 Ep－CAM 단백질 중 특정 부위의 펩티드이며, CTL에 인식되어 CTL의 항원 수용체와 면역적으로 결합하는 항원 결정을 가리킨다. Ep－CAM-특이적 CTL 에피토프 펩티드는 면역학적으로 CTL의 항원 수용체에 결합한다. 그에 더하여 CTL 에피토프 펩티드는 Ep－CAM 분자를 발현하는 세포를 직접 공격하므로 암 세포를 제거할 수 있다.
특히 본 발명의 MHC는 표적 세포 상에 발현하는 HLA－A2402 분자와 CTL에 인식될 수 있는 Ep－CAM 단백질 중 특정 에피토프 펩티드가 결합한 복합체, 또는 상기 β2 마이크로글로블린이 결합한 복합체를 가리킨다.
또한, 본 발명에 있어서 HLA－A2402란 인간 백혈구 항원 중 클래스 I 항원의 서브 클래스인 A24 다형을 말하며, HLA－A2402 분자는 항원 제시 세포 표면 상에 HLA－A2402의 유전자 발현 생산물을 말한다.
이용되는 HLA－A2402 분자로는 HLA－A2402 발현용 대장균의 배양으로부터 정제된 HLA－A2402 분자, 표적 세포에 유전자 도입하여 임의로 발현시킨 HLA－A2402 분자 및 표적 세포 상에 자연적으로 발현된 HLA－A2402 분자가 있다. 그에 더하여 본 발명의 HLA－A2402 분자에는 HLA－A2402 분자 단편 및 중쇄도 포함된다.
본 발명의 MHC는 구성요소에 의해 여러 가지의 방법으로 제작할 수 있으며, 예를 들면 본 발명의 펩티드, HLA－A2402 분자 및 β2 마이크로글로블린을 트리스 등의 완중액으로 현탁하고 4 ~ 10℃ 온도로 24 ~ 72시간 동안 배양함으로써 형성될 수 있다.
MHC는 테트라머일 수 있다. MHC 테트라머는 CTL이 인식할 수 있는 Ep－CAM 에피토프 펩티드와 HLA－A2402 분자(통상은 β2 마이크로글로블린이 결합한 HLA－A2402 분자) 4개의 복합체들의 다중결합 복합체이다.
MHC 테트라머는 MHC를 바이오틴화하여 얻을 수 있으며, 스트렙트아비딘과 바이오틴화 NHC를 1：4로 혼합한다. 선택적으로 MHC 테트라머는 HLA 분자의 C 말단에 미리 바이오틴 결합 부위를 부가하고, MHC의 형성 후, 상기 부위에 바이오틴을 결합시키고, 스트렙트아비딘과 바이오틴화 MHC를 1：4로 혼합하여 얻을 수 있다.
더욱 구체적으로 예를 들면 하기와 같은 방법으로 상기 MHC 테트라머를 제조할 수 있다. MHC 제조를 위하여, HLA-A2402 중쇄 및 β2 마이크로글로블린을 E.coli 발현 시스템을 이용하여 대량 생산하고, 정제한다. 바이오틴 리가제에 인식되는 아미노산 서열을 HLA-A2402 중쇄 C-말단에 미리 부가한다. 정제된 HLA－A2402 중쇄 및 β2 마이크로글로블린을 각각 8 M 우레아에 용해한다. 200 ㎖ 재접힘 완충액(pH8.0 ; 100 mM Tris-HCl, 400 mM L-arginine-HCl, 2 mM EDTA, 0.5 mM oxidative glutathione, 5 mM reduced glutathione)에 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열(Arg Tyr Gln Leu Asp Pro Lys Phe Ile)을 가지는 본 발명 펩티드 12 mg, HLA－A2402 중쇄 18.6 mg, β2 마이크로글로블린 13.2 mg 각각을 27 게이지-주사기를 이용하여 첨가한다. 혼합물을 10℃의 항온조에서 48 ~ 72 시간 동안 교반하여 MHC 형성을 촉진한다. MHC를 포함한 재접힘 완충액을 1.8 ℓ 증류수에서 4℃ 항온조에서 24시간 동안 투석을 실시하고, 투석 후 재접힘 완충액을 Centriprep 10(MILLIPORE, Bedford, MA)을 이용해 2 ㎖로 농축한다. 이후 분자 45KD의 MHC 용출물을 Superdex 200 HR(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) 컬럼을 이용한 겔 여과 크로마토그래피로 분리하여 MHC 테트라머를 제조할 수 있다.
이후, 바이오틴화 MHC의 제조는 바이오틴 리가제(AVIDITY, Denver, CO)를 이용하여 HLA－A2402 중쇄 C 말단의 특이적 부위에 바이오틴을 결합시킨다. 바이오틴 결합 MHC를 Superdex 200 HR 컬럼을 이용한 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 정제한다.
PE-표지 스트렙토아비딘(Molecular Probe, Eugene, OR)과 정제된 바이오틴화 MHC를 1：4 몰비로 혼합하여 분자량 480 KD로 용출되는 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열(Arg Tyr Gln Leu Asp Pro Lys Phe Ile)을 포함한 MHC 테트라머를 Superdex 200HR을 이용한 겔 크로마토그레피를 수행하여 분리한다. Centricon 10(MILLIPORE)을 이용해 약 3 mg/㎖로 농축하고, 4℃에 보존한다. 보존제로서는 소디움 아지드(Sodium azide), EDTA, 루펩틴(leupeptin), 펩스타틴(pepstatin)을 첨가하는 것이 바람직하다.
상기 제조 단계 중 단백질 또는 펩티드는 겔 여과 크로마토그래피 같은 공지의 방법으로 정제하는 것이 바람직하다.
본 발명의 MHC는 암 백신으로 이용될 수 있다. 또한 표피성 암 특이적 CTL의 제조, 인간의 말초혈액 중의 상기 CTL의 정량 등을 위해서 이용될 수 있다.
(
VIII
) 암 백신·
CTL
유도제
·유전자 치료제
암 백신·
CTL
유도제
본 발명의 펩티드는 수동 면역 백신 요법으로 사용하는 암 백신의 활성 성분으로 유용하게 이용될 수 있다. 상기 암 백신은 HLA－A2402를 가지는 인간을 대상으로 이용될 수 있다.
즉, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 암 환자에게 본 발명의 펩티드를 투여시 Ep－CAM를 특이적으로 인식하는 HLA－A2402-제한 CTL을 유도 또는 활성화할 수 있으며 이를 통해 표피성 암 등을 치료 또는 개선할 수 있다.
암 환자의 CTL은 둘 또는 그 이상의 종양 항원을 인식하는 세포 집단이기 때문에, 암 백신으로 다수의 에피토프 펩티드를 사용하는 것이 보다 높은 효과를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 1종 단독으로 또는 다수(2종 이상)를 조합하여 이용할 수 있다.
본 발명의 펩티드를 포함한 Ep－CAM의 mRNA는 폐암 세포주(QG56, LU99, LC99A, LC1－sq, LC65A, 및 PC－9), 대장암 세포주, 위암 세포주(MKN28, MKN45), 구강 암 세포주(HSC－2), 유방암 세포주 및 백혈병 세포주(K562) 등에서 발현된다. 또한, Ep-CAM의 발현은 폐암, 대장암, 위암, 유방암 및 구강암의 각 환자 유래의 여러 가지 조직에서 관찰되었다. 그러므로 본 발명의 펩티드는 상기 암의 치료 또는 개선에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 단독으로 또는 각종 담체와 함께 제제화할 수 있다. 제형은 경구 또는 비경구 제형이 가능하며, 일반적으로는 비경구 제형이 바람직하다. 비경구 제제로는 피하 주사제, 근육 내 주사제, 정맥 내 주사제, 좌제 등을 들 수 있다.
경구 제제의 경우, 약학적으로 허용되는 한편 본 발명의 에피토프 펩티드의 활성을 방해하지 않아야 한다. 예를 들면, 녹말, 만니톨, 락토스, 스테아린산 마그네슘, 셀룰로오스, 중합 아미노산, 알부민 등의 첨가제와 함께 제제화하는 것이 바람직하다.
비경구 제제의 하는 경우, 약학적으로 허용되는 한편 본 발명의 에피토프 펩티드의 활성을 방해하지 않는 담체를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 물, 식염, 데스트로스, 에탄올, 글리세롤, DMSO 등과 함께 제제화하는 것이 바람직하다. 그 외, 필요에 따라서 알부민, 습윤제, 유화제 등을 포함할 수 있다. 또한, 세포 매개 면역의 활성화를 위해서, 에피토프 펩티드는 적합한 어주번트와 함께 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 펩티드는 중성 또는 염의 형태로 사용할 수 있다. 약학적으로 허용되는 염으로서는, 염산, 인산과 같은 무기산의 염, 초산, 타르타르산과 같은 유기산의 염을 들 수 있다.
본 발명의 펩티드의 활성도는 그 자체 또는 HLA－A2402와 상호작용하여 CTL에 의한 상기 펩티드의 인식을 증강하는 화합물, 또는 상기 펩티드를 면역적으로 인식하는 항체 등과 함께 제제화하여 조절할 수 있다.
본 발명의 펩티드를 펄스한 항원 제시 세포 및 주요 조직 적합 항원 복합체도 이와 같은 상기 암 백신으로서 매우 적합하게 사용할 수 있다. 제형, 투여 대상, 적용 가능한 암의 종류, 효과 등은 본 발명의 펩티드로 구성되는 암 백신과 동일하다.
치료 방법
본 발명의 펩티드, 항원 제시 세포 및 주요 조직 적합 항원 복합체는 백혈구 항원으로 HLA－A2402를 가지는 인간에 투여할 때 Ep－CAM 특이적 HLA－A2402-제한 CTL의 유도 또는 활성화하여 표피성 암을 치료 또는 개선할 수 있다.
본 발명의 펩티드 투여량은 CTL에 의한 상기 펩티드의 인식 정도에 의해 변화한다. 예를 들어, 인간 성인에 대해서는 활성 에피토프 펩티드 본체의 투여량은 0.01 ~ 100 mg/일, 바람직하게는 0.1 ~ 30 mg/일이다. 투여 간격은 환자와 투여 목적에 따라 적합하게 선택할 수 있다.
선택적으로 효과적인 암 백신 효과는 환자의 말초혈액에서 단핵세포분획을 채취하여 본 발명의 펩티드와 함께 배양하고 CTL 유도 및/또는 활성화된 단핵세포분획을 환자의 혈액으로 재도입함으로써 얻을 수 있다. 단핵세포의 농도 및 본 발명의 펩티드와 같은 배양 조건은 인간 성인에게 108~1010개/일의 CTL을 투여할 수 있는 조건으로 선택할 수 있다. 이러한 조건은 간단한 실험에 의해 용의하게 결정될 수 있다. 또한, 인터루킨 2 등과 같은 임파구 증식 능력을 가지는 물질을 배양 중에 첨가할 수 있다.
또한 항원 제시 세포 투여량은 인간 성인에 대해서 106~109개/일, 바람직하게는 107~108개/일이다. 유효한 암 백신의 효과는 환자의 말초혈액에서 채취한 단핵세포분획과 본 발명의 항원 제시 세포를 함께 배양하여 환자의 혈액 중에 재도입함으로써 얻을 수 있다.
또한 주요 조직 적합 항원 복합체는 인간 성인에 대해서 1 ~ 100 mg/일, 바람직하게는 5 ~ 50 mg/일이다. 또한, 유효한 암 백신의 효과는 환자의 말초혈액에서 채취한 단핵세포분획과 본 발명의 주요 조직 적합 항원 복합체를 함께 배양하여 환자의 혈액에 재도입함으로써 얻을 수 있다.
암의 유전자 치료제
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드(상보 가닥 포함)는 폐암, 대장암, 위암, 유방암 및 구강암 등의 유전자 치료제로서 이용될 수 있다.
암 치료에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 직접 체내에 도입하거나, 또는 인간으로부터 세포를 채취하여 벡터를 도입한 후 체내에 재도입할 수 있다. 벡터로서는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 우두 바이러스 등을 사용할 수 있으며, 이 중 레트로바이러스를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 바이러스는 복제 결핍이다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 리포솜에 봉입하여 전달하는 현미경하주사법 등을 사용하여 세포에 도입될 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 암의 유전자 치료제는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한 재조합 벡터, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 봉입된 리포솜 등 어느 형태도 가능하다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 투여량은 CTL에 의한 상기 폴리뉴클레오티드로 암호화된 펩티드 인식 정도에 의해 변화한다. 예를 들면 본 발명의 에피토프 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티 양을 기초로 할 때 인간 성인에서 적합한 투여량은 0.1 ㎍ ~ 100 mg/일, 바람직하게는 1 ㎍ ~ 50 mg/일이다. 상기 투여량으로 수일로부터 수개월에 1회 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 IL－2와 같은 싸이토카인 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 상호작용하여 그 발현을 증강하는 물질과 조합하여 이용될 수 있다.
(
IX
) 세포 독성 T
임파구
본 발명의 세포 독성 T 임파구는 하기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나 이상을 이용하여 말초혈액 임파구를 자극함으로 얻을 수 있다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 항원 제시 세포;
(c) 본 발명의 주요 조직 적합 항원 복합체; 및
(d) 본 발명의 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머.
본 발명의 CTL은 바람직하게는 인간 혈청을 포함한 RPMI1640 배양배지에서 말초혈액 임파구를 상기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나 이상과 함께 37℃로 7 ~ 14일간 정도 배양함으로 유도된다. 말초혈액 임파구를 주요 조직 적합 항원 복합체(이하 "MHC"라 칭함) 또는 그의 테트라머를 이용하여 자극하는 경우, CTL이 유도되어 MHC 또는 테트라머와 결합한다. 따라서, CTL을 MHC 또는 테트라머로부터 적합한 방법으로 분리한다.
구체적으로는, CTL은 하기의 제조 방법에 따라 얻을 수 있다.
에피토프
펩티드 또는 항원 제시 세포를 이용해 자극하는 경우
말초혈액으로부터 분리한 임파구를 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 펄스한 항원 제시 세포와 함께 CO2 배양기에서 37℃로, 7 ~ 10일간 배양한다. 이후 바람직하게는 IL－2, PHA, 항-CD3 항체 등을 첨가한 후 7 ~ 14일간 배양함으로 CTL을 자극 및 증식시킨다.
IL-2 또는 이와 같은 자극 후에 선택적으로 상기 펩티드 또는 항원 제시 세포에 의한 자극은 선택적으로 IL-2와 같은 자극을 계속 하면서 3 사이클 정도 반복하여 필요한 CTL의 세포수를 확보한다.
이와 같이 상기에서 얻을 수 있는 표피성 암 특이적 CTL은 인간 알부민 함유 PBS 등으로 현탁한 형태로 표피성 암에 대한 수동 면역 치료제 등으로 사용할 수 있다. 수동 면역 치료제의 제형은 통상적으로 근육내 주사제, 피하 주사제, 정맥내 주사제 등의 주사제인 것이 바람직하다.
MHC
또는 그
테트라머에
의해 자극하는 경우
＜염색에 의한 분리 방법＞
임파구를 말초혈액 등으로부터 분리하여 PBS에서 적정한 농도의 MHC 또는 MHC－테트라머와 4 ~ 25℃ 온도에서 30 ~ 60분간 반응시킨다. 반응액에 FITC 또는 PE와 같은 표지 색소를 첨가하여 MHC 또는 MHC－테트라머와 결합한 CTL을 염색한다. 이후 유세포분석기(flow cytometer) 또는 현미경 등을 이용해 염색된 CTL을 분리한다.
＜
MHC
고정화에 의한 분리 방법＞
표면에 MHC 또는 MHC－테트라머를 고정화한 무균 플레이트를 이용하여 플라스크 중에서 말초혈액으로부터 분리한 임파구와 고정화 MHC 또는 그 테트라머를 4 ~ 25℃ 온도에서 30 ~ 60분간 반응시킨다. 이후 결합되지 않고 부유하는 다른 세포를 세척한 후, 플레이트 상에 남은 표피성 암 특이적 CTL을 새로운 배양배지에 현탁한다. 이와 같이 상기 분리한 표피성 암에 특이적인 CTL은 항-CD3 항체, PHA, IL－2 등의 T 세포 자극제로 자극하여, 수동 면역 치료제로서 사용하는데 필요한 세포 수까지 증식시키는 것이 바람직하다.
＜마그네틱
비즈
이용 방법＞
상기와 같은 방법으로 제조된 바이오틴화 MHC를 스트렙트아비딘 표지 마그네틱 비즈와 결합시켜, 결합체(이하, "MHC-마그네틱 비즈"라 칭함)를 제작한다. 이후 임파구를 말초혈액 등으로부터 분리하여 이를 적합한 농도의 MHC－마그네틱 비즈와 임파구：비즈의 비가 1：5 ~ 20가 되도록 첨가하여 반응시킨다.
MHC－마그네틱 비즈와 결합한 표피성 암 특이적 CTL이 포함된 시험관을 자장에 두면 비즈와 결합한 CTL은 자석 측의 시험관 내벽으로 유인된다.
이와 같이 상기 비즈와 결합한 CTL을 시험관 내벽에 부착시킨 상태로 그 이외의 세포를 세척한 후, 시험관을 자장으로부터 제외하고, 시험관 내에 남은 항원 특이적 CTL을 새로운 배양배지에 현탁한다.
상기와 같이 분리된 표피성 암 특이적 CTL은 항-CD3 항체, PHA, IL－2 등의 T 임파구 자극제로 자극하여 면역 치료제로서 사용하는데 필요한 세포 수까지 증식시키는 것이 바람직하다.
＜암의 치료 또는 개선방법＞
본 발명의 CTL은 수동 면역 치료제로서 표피성 암의 환자에게 투여함으로써, 암을 치료 또는 개선할 수 있다.
투여량은 환자 및 투여 목적에 따라 다르지만, 인간 성인에 대해서 107 ~ 1011개/일, 바람직하게는 108 ~ 1010개/일이다. 상기 투여량을 수일 ~ 수개월에 1회 간격으로 투여하는 것이 바람직하다.
(X)
CTL
정량 방법
항암제나 화학치료제의 적정한 사용을 포함한 함치료 사후 관리에서, 표피성 암에 특이적인 CTL은 위험성이 높은 암 환자(암 세포 또는 암 조직에서 유래한 원인에 의해 면역 능력이 저하된 환자, 합병증을 가지는 환자, 고령자, 유소아, 임산부 등)의 말초혈액에 존재하는지 여부는 중요하다. 표피성 암 특이적 HLA－A2402-제한 CTL의 정량은 하기의 방법에 의해 실시할 수 있다.
즉, 말초혈액에서 하기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나를 작용시키는 단계와 말초혈액 중의 CTL 또는 상기 생산된 싸이토카인을 정량하는 단계를 포함한 방법이다:
(a) 본 발명의 펩티드;
(b) 본 발명의 항원 제시 세포;
(c) 본 발명의 MHC; 및
(d) 본 발명의 MHC 테트라머.
얻어진 값을 기존 농도의 HLA－A2402-제한 CTL을 포함하는 용액을 이용하여 같은 방법에 의한 정량 수치와 비교하는 것으로, 피검말초혈액 중의 HLA－A2402-제한 CTL 농도를 산출할 수 있다.
상기 (a) ~ (d) 중 어느 하나 이상으로 유도된 HLA－A2402-제한 CTL 또는 이로 인하여 생산되는 싸이토카인의 정량 방법으로서는 하기의 방법을 들 수 있다.
에피토프
펩티드를 이용하는 경우
말초혈액으로부터 분리된 임파구를 본 발명의 펩티드로 자극하여 이를 통해 유도되는 CTL 수 또는 이를 통해 생산되는 인터페론-γ(IFN-γ), 인터루킨 등의 싸이토카인(케모카인을 포함)의 양을 정량한다. 하기에서 IFN－γ로 예를 들어 구체적인 방법을 설명한다.
＜
세포내
IFN
－γ 생산 세포의 정량＞
말초혈액으로부터 분리한 임파구를 2 x106/㎖ 세포 농도로 10% 인간 혈청 함유 RPMI1640 배양배지에 현탁시키고 본 발명의 CTL 에피토프 펩티드를 1 ㎍/㎖의 농도로 첨가한다. 이후 Brefeldin A 같은 세표내 단백질 수송 저해제를 첨가하여 CO2 배양기에서 37℃로 5 ~ 6 시간 배양한다. 배양 후, 세포를 고정하고 막투과 처리를 실시하여 형광 표지 항-IFN－γ 항체와 반응시킨다. 유세포분석기 등을 이용하여 CD8 양성 임파구 중 IFN－γ양성 세포를 정량한다.
＜
CD8
양성 세포의 정량＞
상기 세포 내 IFN－γ 생산 세포의 정량 방법에 있어서, 형광 표지 항-IFN－γ항체를 대신하여 항-CD8 항체를 이용하는 방법으로, 표지된 CD8 양성세포를 정량 할 수 있다.
＜
싸이토카인의
정량(
ELISPOT
어세이
)＞
96 웰 MultiScreen-HA 플레이트(Mi11ipore)를 항-IFN－γ모노클로날 항체로 4℃ 온도로 하룻밤 동안 코팅하였다. 각 웰을 PBS로 세척한 후, 말초혈액으로부터 분리한 임파구를 각 웰에 접종한다. 에피토프 펩티드를 각 웰에 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기로 20시간 배양한다. 다음날, 0. 05% 트윈-20 첨가된 PBS로 플레이트를 세척한 후, 항-IFN－γ토끼 혈청, 퍼옥시데이즈 표지 항-토끼 IgG 염소 혈청의 순서로 각각 90분씩 실온으로 반응시킨다. 또한 3－아미노-9－에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbasole ：Sigma, USA)과 0. 015% 과산화수소 용액을 포함한 0. 1 M 초산 나트륨 완충액(pH 5.0)을 각 웰에 분주하여 실온에서 40분간 반응시킨다. IFN－γ 스팟을 시각화하여 실체 현미경으로 개수한다.
＜
배양상층액
중 분비된
싸이토카인
정량 방법＞
말초혈액으로부터 분리한 임파구를 2 x106/㎖ 세포 농도로 10% 인간 혈청 함유 RPMI1640 배양배지에 현탁시켜고 본 발명의 CTL 에피토프 펩티드를 1 ㎍/㎖ 농도로 첨가한다. CO2 배양기에서 37℃로 24 ~ 48시간 동안 배양한다. 배양 후, 상층액을 회수하여 그 중 포함되는 IFN－γ농도를 시판된 ELISA KIT(ENDOGEN사의 HUMAN IFN gamma ELISA)를 사용하여 정량한다.
MHC
테트라머를
이용하는 경우
말초혈액 등에서 임파구를 분리하여 1 ~ 100 ㎍/㎖의 MHC 테트라머(스트렙트아비딘으로 형광 표지)와 37℃ 온도에서 15분간 반응시킨다. MHC와 결합하는 CTL은 MHC와 결합하는 CTL에 결합하며, 다른 형광으로 표지된 항체를 첨가하여 염색한다. 염색한 CTL은 유세포분석기 또는 현미경 등을 이용해 개수하는 것이 바람직하다.
도 1은 폴리클로날 펩티드 활성화 CTL 세포주의 ELISPOT 어세이 평가 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 Ep－CAM 펩티드 특이적 폴리클로날(A) 및 모노클로날(B) CTL의 테트라머 염색의 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 Ep173 특이적 CTL 클론의 특성을 나타내는 도면이다.
도면 3A는 펩티드 Ep173 및 대조군 펩티드 EBV－LMP419이 존재하는 T2－A24 세포에 대한 C27(Ep73-특이적 CTL 클론)의 세포 독성 결과를 나타내는 51Cr 방출 어세이 결과를 나타내는 도면이다.
도면 3B는 HLA－A2402 양성 세포주(PC9)에 대한 Ep173 특이적 CTL 클론(C27)의 세포 독성에 항 HLA－A24 모노클로날 항체의 억제 효과를 나타내는 도면이다.
도면 3C는 콜드 타겟 인히비션 어세이에서 Ep173 존재시 C27의 세포 독성을 나타내는 도면이다.
도 4는 Ep－CAM의 PCR 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 각종 암 세포주에 대한 Ep173 특이적 CTL 클론(C27)의 세포 독성을 나타내는 도면이다.
하기의 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
1) 공여자 및 세포주
전체 공여자는 아이치현 암센터의 윤리 위원회에 의해 허가된 연구 계획과 목적에 따라 제작되었다. 고지에 입각한 동의(informed consent)하에 5명의 HLA－A2402 양성인 건강 공여자로부터 시험용 말초혈액 시료를 얻었다. 즉, 각 공여자로부터 채취한 말초혈액으로부터 피콜 밀도 구배 원심분리법에 의해 말초혈단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 분리하였다.
인간 폐암 세포주인 대세포암 세포주 LU99(JCRB0080)；인간의 편평 표피암 세포주 HSC－2(JCRB0622)；인간 위암 세포주인 편평 표피암 세포주 MKN28(JCRB0253) 및 MKN45(JCRB0254)；및 인간 대장암 세포주인 편평 표피암 세포주 COLO320DM(JCRB0225 또는 ATCC：CCL-220)는 JCRB 세포 뱅크(후생노동성 :http//Cellbank.nihs.go.jp/)에서 구입하였다. 인간 폐암 세포주인 편평 표피암 세포주 LC－1/sq(RCB0455)는 Riken 세포 뱅크에서 구입하였다.
LC/sq세포는 10% FCS, L－글루타민, 페니실린, 스트렙토마이신, 및 카나마이신을 첨가한 45% RPMI1640 배양배지(Sigma 제품) 및 45% Ham's F12(Sigma 제품)로 유지하였다. COLO320DM 세포 및 MKN28 세포는 DMEM 배양배지(Sigma 제품)로 유지하였다. K562 세포는 10% FCS(소 태아 혈청：Life Technology 제품), L－글루타민, 페니실린, 스트렙토마이신, 및 카나마이신을 첨가한 IMDM 배양배지(Sigma 제품)로 유지하였다.
그 외의 암 세포주는 10% FCS, 2 x10－3 M L－글루타민, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100 ㎍/㎖ 카나마이신 및 5 x10－5 M β－머캅토에탄올(완전 배지로서)을 첨가한 RPMI1640 배양배지를 이용하여 배양하였다.
펩티드 제시용 세포로서 174 CEM.T2(이하, "T2세포"라 칭함)에 HLA－A2402 유전자를 도입하여, HLA－A2402 결합 펩티드를 제시하는 세포(이하, "T2－24 세포"라 칭함)를 얻었다. T2－24 세포는 10% 소태아 혈청, L-글루타민, 페니실린, 스트렙토마이신, G418(Gibco 제품)을 첨가한 IMDM 배양배지(Iscove's modified Dulbecco's medium：Gibco 제품)를 이용하여 배양하였다.
Tissue antigens, 59:502-511, 2002에 기재된 방법에 의해, HLA－A2402를 암호화하는 레트로바이러스를 HLA－A2402 음성 QG56 세포주 및 HLA－A2402 음성 A549(JCRB0076) 세포주 각각에 감염시켰다. 감염된 세포를 선택하기 위하여, 감염된 QG56 세포를 최종 농도 0.6 ㎍/㎖ 퓨로마이신을 포함한 완전 배지로 유지하였고, "QG56－A24"라 명명하였다. 함께 감염시킨 A549를 최종 농도 0.9 ㎍/㎖ 퓨로 마이신을 포함한 완전 배지로 유지하고, "A549－A24"라 명명하였다.
2) 펩티드 합성
월드·와이드·웹 사이트·바이오 인포메틱스＆분자 분석 섹션(BIMAS:BioInfomatics and molecular analysis section)의 HLA 펩티드 복합체의 해리 반감 시간의 평가를 근거로 HLA 펩티드 결합 예측 프로그램에 따른 컴퓨터 예측에 의해 Ep－CAM 단백질(접근 번호：M33011) 내의 잠재적인 HLA－A2402 결합 펩티드 분류하였다(http://bimas.dcrt.gov/molbio/hla_bind/).
Ep－CAM의 에피토프 펩티드 예측 결과에 따라 선택된 7개의 펩티드를 PepSet(Mimotope 제품)으로 합성하였다. 필요에 따라 100 ㎕ 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)에 용해하여 40% 아세트니트릴 0. 1 M(pH7. 4)로 희석하였다.
각 펩티드의 생산량은 1 μmol로 추정되었다.
합성된 7개의 펩티드는 "Ep31", "Ep173", "Ep185", "Ep250", "Ep225", "Ep296" 및 "Ep304"로 명명하였다. 합성된 Ep－CAM의 펩티드 서열은 표 1에서 나타내었다.
| 펩티드 이름 | 아미노산 서열 | 아미노산 위치 | 아미노산 길이 | 스코어a | %MFI 상승b |
| Ep31 | NYKLAVNCF | 31-39 | 9 | 120 | 85 |
| Ep173 | RYQLDPKFI | 173-181 | 9 | 150 | 102 |
| Ep185 | LYENNVITI | 185-193 | 9 | 75 | 79 |
| Ep225 | LFHSKKMDL | 225-233 | 9 | 20 | 29 |
| Ep250 | YYVDEKAPEF | 250-259 | 10 | 198 | 57 |
| Ep296 | KYEKAEIKEM | 296-305 | 10 | 83 | 24 |
| Ep304 | EMGEMHREL | 304-312 | 9 | 5 | 16 |
a : 월드 와이드 웹 사이트 바이오인포메틱스 & 분자 분석 세션(BIMAS) HLA 펩티드 결합 예측에 의한 HLA-A24 분자로부터의 해리 반감기(minutes).
b : 합성 펩티드는 MHC 안정화 어세이를 기초로 HLA-A24 분자에 대한 이들의 결합 활성화로 평가되었다. %MFI는 평균형광 강도를 뜻한다.
이와는 별도로 대조군으로서 인간 면역 결핍 바이러스-1(HIV-1) 외피 펩티드 RYLRDQQLL(J.Immunol, 159:6242-6252, 1997：584 ~ 592 잔기, ENV584로 명명) 및 EBV 잠복 막단백 2 펩티드(EBV latent membrane)(J. Immnol, 158:3325-3334, 1997：419 ~ 427 잔기, EBV－LMP419로 명명)를 합성하였다(Toray Industries research center company).
3) 세포 염색 및
유세포분석
세포 표면에서 발현되는 HLA－A2402에 대한 모노클로날 항체(One Lambda, Inc 제품)와 FITC 표지 항-마우스 IgG(ab＇)2 단편(Immunotech 제품)을 이용한 간접 면역형광 항체 분석법에 따라 시험을 수행하였다. MHC/펩티드·테트라머는 공지의 방법(Blood 98:1872-1881, 2001; Science 274:94-96, 1996)으로 제조하였다.
CD8 양성 T 세포주 또는 그 클론을 Ep－CAM 펩티드, Ep173(이하 "HLA－A2402/Ep173 테트라머"라 칭함) 또는 HIV－1 펩티드, ENV584(이하 "HLA－A2402/ENV584 테트라머" 라 칭함)를 포함하는 피코에리스린(phycoerythrin: PE)-표지된 HLA－A2402 테트라머로 염색하였다.
염색된 세포의 유세포분석은 FACS Calibur(Becton, Dickinson and Company 제품)를 이용하여 실시하였고, 결과는 CellQuest 소프트웨어(Becton, Dickinson and Company 제품)를 이용하여 분석하였다.
4)
MHC
안정화
어세이
합성된 펩티드의 HLA－A2402 결합 효율을 시험하기 위하여, Kuzushima 등의 방법(Blood 98:1872-1881, 2001)으로 T2－A24 세포(T2[174 x CEM.T2：ATCC 접근 번호：CRL-1992]에 HLA－A2402 분자를 발현하는 플라스미드가 형질전환된 세포주)를 이용하여 MHC 안정화 어세이를 실시하였다.
즉, T2－A24 세포(2 x105개)를 0.1% FCS, 5 x10－5 M β－머캅토에탄올을 포함한 200 ㎕ RPMI1640 배양배지에 분주하고, 10 μM의 농도로 각각의 펩티드를 첨가하여 26℃으로 16시간 동안 배양하였고, 이후 37℃으로 3시간 배양하였다. 배양 후, 세포 표면 HLA－A2402 분자를 항-HLA－A2402 모노클로날 항체 및 상기 (3)의 FITC 표지 항체로 염색하였다. 발현은 FACS Calibur로 측정하였고, 평균 형광 강도(MFI：mean fluorescence intensity)를 기록하였다.
%MIF 상승은 하기의 방법으로 계산하였다：
%MIF 상승 = 100 x(펩티드 투여군의 MIF－펩티드 비투여군의 MIF)/(펩티드 비투여군의 MIF).
표 1은 %MFI이 상승한 결과를 나타낸다. 표 1에 나타나듯이 대부분의 펩티드에서, 세포 표면상의 HLA-A2402 발현 레벨이 증가하였는데, 이는 상기 펩티드들이 세포 표면에 결합함을 나타내며 이에 따라 안정화된다.
그 중 펩티드 Ep173(RYQLDPKFI)가 HLA－A2402 분자에 대해서 가장 높은 친화성을 나타냈다. Ep304(EMGEMHREL)는 가장 낮은 친화성을 나타냈으므로, 이후 실험에서 배제하였다.
5)
Ep
－
CAM
펩티드 특이적
CTL
및 그의 클론 생산
말초혈액단핵구에서 유래된 수지상 세포(Dendritic cell: DC)는 Dauer 등의 방법으로 생산되었다(J. Immnol , 170:4069-4076).
더욱 상세하게는, 플라스틱에 점착하는 세포를 HLA－A2402 양성 공여자의 말초혈액단핵구 세포로부터 분리하여 5% 가열 불활성화 인간 혈청, 10 ㎍/㎖ 재조합 인간·인터루킨 4(hIL－4：R＆D systems 제품), 및 50 ng/㎖ 재조합 인간·과립구-대식세포 클론 자극 인자(hGM－CSF：R＆D systems 제품)가 첨가된 RPMI1640 배양배지로 배양하였다. 배양 1일 후 50 ng/㎖ IL-1β(PeproTech, Inc. 제품), 50 ng/㎖ 재조합 인간·종양괴사 인자-α(hTNF－α：PeproTech, Inc. 제품) 및 1 μM 프로스타글란딘 E2(Cayman Chemical Company 제품)를 세포 성숙을 위해 첨가하였다. 2 ~ 3일 경과 후, 세포를 수득하여 단구-유래 수지상 세포에서 항원 제시를 위하여 이용하였다.
생산된 세포는 CD1a, CD80, CD83, CD86, HLA 클래스 II 분자와 같은 수지상 세포 관련 항원을 발현한다.
별도로, CD8 마이크로 비즈(Milteny Biotec 제품)를 이용하여 CD6 양성 T 임파구를 동일한 공여자로부터 분리하였다.
이후, 5 x10－5M β－머캅토에탄올을 첨가한 AIM－V 배양배지(Gibco 제품)에 10 μM 농도의 Ep－CAM 합성 펩티드로 자가-유래 수지상 세포를 실온에서 2 ~ 4시간 동안 각각 펄스한 후, 방사선(33 Gy)을 조사하였다.
그 후, 수지상 세포(1 x105개)는 10% 인간 혈청, 25 ng/㎖ 재조합 인간 IL－7(R＆D systems 제품), 5 ng/㎖ 재조합 인간 IL－12(R＆D systems 제품)를 포함하는 RPMI1640 배양배지를 이용하여 CD8 양성 T 임파구(1 x106개)와 함께 공배양 하였다.
7일간 배양 후, 세포는 상기와 같이 제조된 1 x105개의 펩티드가 펄스된 자가-유래 수지상 세포를 첨가하여 자극하였다. 이 후 7일간 배양하고, 세포를 동일한 방법으로 3회 자극하였다. 각각의 재자극 후, 인간 재조합 IL－2(Takeda Pharmaceutical Company, Ltd. 제품)를 20 unit/㎖ 농도로 첨가하였다. 필요시 활발하게 증식하는 세포를 2 ~ 3개 튜브로 분주하고, 20 unit/㎖ IL－2를 포함하는 신선한 배양배지에서 배양하였다.
T 세포의 특이성은 ELISPOT 어세이로 시험하였다.
T세포 클론을 확립하기 위해서, 폴리클로날 CTL의 한계 희석법(Blood 98:1872-1881, 2001)을 수행하였다. 더욱 상세하게는, 폴리클로날 CD8 양성 T 세포를 항-CD3 모노클로날 항체(30 ng/㎖, Orth Diagonostic Inc., 제품), IL－2(50 U/㎖), γ선-방사된(33 Gy) 1 x105개 PBMC 및 γ선-방사된(55 Gy) 2 x104개의 EBV로 형질전환된 B 림프아세포(공여자의 말초혈액 B 임파구를 95.8 세포(JCRB9123) 상층액으로 형질전환하여 얻은 세포), 배양배지(0.2 ㎖)를 포함하는 96 웰 플레이트(1, 3, 10 세포/웰)로 분주하였다.
2주간 배양 후, 증식하고 있는 세포의 특이성을 Lee 등의 방법(J. Immnol, 158:3325-3334, 1997)으로 CTL－CTL 치사(CTL-CTL killing) 어세이로 시험하였다.
CTL 클론을 100 ㎕ 완전 배지에서 하룻밤 배양하거나 Ep－CAM로부터 유래한 동일한 기원의 펩티드 또는 대조군 펩티드 ENV584를 최종 농도 2 μM를 포함하는 96 웰 플레이트(세포 300 개/웰)에서 하룻밤 배양하였다.
CTL 세포의 세포 치사 능력은 역상 현미경을 이용하여 다음날 측정하였다. Ep－CAM로 펄스했을 때만 세포 치사 능력을 나타내는 클론은 플라스크 안으로 옮겨 상기와 같이 증식시켰다.
6)
IFN
－γ의
ELISPOT
어세이
니트로셀룰로오스막이 있는 평저 96 웰 MultiScreen-HA 플레이트(Milipore Coorp. 제품)에 10 ㎍/㎖ 항-IFN－γ 모노클로날 항체(R＆D systems 제품)를 코팅하고 4℃로 하룻밤 방치하였다. PBS(phosphate buffered saline)로 세척 후, 플레이트를 37℃으로 1시간 동안 배양배지로 차단하였다. T2－A24 세포(5 x104개)는 플레이트의 각 웰에 0.1% FCS 및 5 x105 M β－머캅토에탄올이 첨가된 100 ㎕ RPMI1640 배양배지로 분주하고, 에피토프 후보인 합성 펩티드 각각을 실온에서 30분간 펄스시켰다. 20% FCS를 포함하는 배양배지에 1×105개 양성 T 세포를 현탁시키고 각 웰에 분주하였다.
너무 많은 스팟이 개수될 경우, 1 x104개 CD8 양성 T세포를 응답 세포로 이용하였고, 전체 측정 과정은 2회 실시하였다.
상기 플레이트를 37℃으로 20시간, 5% CO2 배양기에서 배양하고, 0.05% 트윈-20을 포함한 PBS로 철저히 세척하였다. 이후, 폴리클로날 토끼 항-IFN－γ항체(Genzyme 제품)를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 90분간 방치하였다. 이 후 90분간 퍼옥시나아제-결합 양 항-토끼 항-면역글로블린 G(Genzyme 제품)에 노출하였다. IFN－γ 특이적 스팟의 시각화를 위해서, 3－아미노-9－에틸카바졸(Sigma 제품) 및 0.015% 과산화수소 용액를 포함한 0.1 M 소디움 아세테이트 완충액(pH5. 0)을 각 웰에 첨가하였다. 40 분 후, 증류수로 세척하여 반응을 정지시키고, 플레이트를 건조시켰다. 이후 확산된 큰 스팟을 현미경 하에서 개수하였다.
상기 결과를 도 1 및 도 2에 나타냈다.
도 1은 5명의 HLA－A2402 양성이며 건강한 공여자의 CD8 양성 T세포를 6개의 펩티드 중 하나로 펄스한 자가-유래 수지상 세포로 자극시킬 때 폴리클로날·펩티드 활성화 세포 독성 임파구 세포주의 ELISPOT 어세이 결과를 나타낸다.
도 1에서 나타난 바와 같이 5명의 HLA－A2402 양성인 건강한 공여자의 CD8 양성 T 세포를 6개의 펩티드로 펄스한 자가-유래 수지상 세포로 자극시킨 결과, 4명의 공여자로부터의 T세포주는 Ep173로 펄스된 T2－A24 세포로 배양했을 때 IFN－γ 스팟의 탁월한 생산을 보여주었다.
또한, 공여자 번호 3에서 채취한 Ep250로 자극된 CTL는 특이적으로 Ep250과 배양시 IFN－γ 스팟을 생성하였다.
도 2는 Ep－CAM 펩티드 특이적인 폴리클로날 및 모노클로날 CTL의 테트라머 염색 결과를 나타낸다.
도 2A는 Ep173로 4회 자극한 폴리클로날 CD8 양성 T 세포를 FITC 표지된 항- CD8 항체 및 Ep173를 포함된 PE로 표지된 HLA－A24 테트라머, 또는 대조군·펩티드 ENV584로 염색하여 유세포분석기로 분석한 결과이다. 전체 CD8 양성 T 세포 중 테트라머 양성 세포의 비율은 상단 오른쪽에 %로 나타냈다.
도 2A에서 볼 수 있듯이 대부분의 대조군 펩티드 ENV584에서는 IFN-γ 스팟 생성이 관찰되지 않았다. 4회 자극 후 공여자 번호 4에서 확립된 CTL 세포주는 HLA-A24/Ep173 테트라머에 의해 특이적으로 염색되었지만, HLA-A2402/ENV584 테트라머(37.2%: 전체 CD8 양성 T 세포로 반복되는 0.6%, 도 2A)로는 염색되지 않았다.
도 2B는 Ep173-특이적 CTL 클론인 C27dl 상기와 같은 방법으로 염색되었음을 나타낸다. 전체 CD8 양성 T 세포 중 테트라머 양성 세포의 비율은 오른쪽 상단에 %로 나타냈다.
도 2B에서 볼 수 있듯이 대수 계산시 테트라머 양성 세포의 강도는 테트라머 음성 세포와 동등하거나 2 ~ 3배 정도 높다. 본 발명자들은 공여자 번호 4의 Ep173 특이적인 폴리클로날 CTL 세포주의 한계 희석 배양배지로부터 T 세포 클론인 C27를 확립하였다.
테트라머를 이용한 연구에서는 폴리클로날 및 모노클로날 Ep173－특이적 CD8 양성 T 세포는 HLA－A2402/Ep173 복합체에 특이적인 고친화성 세포 수용체를 가짐을 나타냈다.
그러므로 Ep173－특이적 CTL 클론은 상기 CTL 세포주로부터 확립되었다.
<실시예 2>
펩티드
Ep173
특이적
CTL
클론의 특성 1
7)
CTL
어세이
본 발명자들은 더 나아가 C27이 HLA－A24의 전후관계에 대해 종양 세포의 표면상에 자발적으로 제시된 펩티드를 인식할지를 확인하기 위하여 시험하였다.
C27을 첨가하기 전에 크롬-표지 세포는 전체 HLA 클래스 I, HLA－A24, 또는 HLA－A2 분자 중 어느 하나에 특이적인 모노클로날 항체와 함께 배양하였고, CTL 어세이는 표적에 대한 작동자의 비를 10으로 실시하였다.
표적 세포(PC9 세포)를 크롬(51Cr)이 첨가된 100 ㎕ 배양배지에서 37℃에서 1시간 동안 배양하여 표지하였다. 반복된 실험에서, 차단항체인 W6/32(항-HLA 클래스 I), MA2.1(항-HLA－A2) 및 A11.1(항LA－A24)의 미리 계산된 양을 특이적 HLA-제한을 위하여 작동자 세포를 첨가하기 30분 전에 세포에 분주하였다.
플레이트를 37℃에서 4시간 동안 배양하였고, 상층액을 γ―카운터를 이용하여 개수하였다.
특이적 51Cr 방출 퍼센트는 하기와 같은 식으로 계산하였다:
100 x (실험적 방출-자연 방출)/(최대 방출-자연 방출).
상기 결과를 도 3 및 도 5로 나타내었다.
도 3A는 표적에 대한 작동자의 비가 1일 때, 51Cr 방출 분석에 의해 측정된 펩티드 Ep173 및 대조군 펩티드 EBV－LMP419의 적정 농도에서 T2－A24 세포에 대한 C27(Ep173 특이적 CTL 클론)의 세포 독성을 나타낸다.
그 결과로 Ep173－특이적 CTL 클론인 C27는 100 pM의 낮은 펩티드 농도에서 Ep173로 펄스한 T2－A24 세포에 대해서 세포 독성을 나타냈지만, 대조군 펩티드인 EBV－LMP419에서는 그러한 세포 독성이 관찰되지 않았다.
도 5와 표 2는 여러 가지 암 세포주에 대한 C27의 세포 독성의 결과를 나타냈다.
a : HLA-A24mAb와 FITC 표지된 항-쥐 IgG 항체 F(ab')2 단편을 이용한 면역형광법에 의한 형광 강도를 의미한다.
b : 실시되지 않음
표적 세포로서 HLA－A24 양성인 8종 암 세포주 및 HLA－A24 음성인 암 세포주에 대한 C27, Ep173－특이적 CTL 클론의 세포 독성 결과를 표 2에서 나타낸다.
폐 선암 세포주 11－18, COLO320DM 및 A549를 제외한 모든 세포주는 Ep－CAM를 발현하고 있었다. HLA－A2402 유전자는 A549 및 QG56에 레트로바이러스처럼 형질전환하였고, "A549－A24" 및 "QG56－A24"로 명명된 각각의 형질전환체는 표적 세포로 사용되었다. 세포 독성은 각각의 작동자:표적비(40:1,20:1,10,1,5:1)에서 51 Cr 방출 어세이에 의해 특정하였다. K562는 자연 살해 세포에 대하여 민감한 대표적인 세포주이다.
도 3 및 표 2에서 나타난 바와 같이, C27은 폐암 세포주인 PC9, LU99, LC－1/sq 및 LC99A; 구강 편평 표피 세포 종양 세포주인 HSC－2; 또는 HLA－A24 및 Ep－CAM 모두를 발현하는 위암 세포주인 MKN45에 대해 효율적으로 세포 독성을 나타내었다. 그러나 HLA－A24 양성 Ep－CAM 음성 세포주(A549-A24 및 COLO320DM), 또는 HLA－A24 음성 및 Ep－CAM 양성 세포주 또는 Ep－CAM 음성 세포주(OG56, A549, MNK28)에 대해서는 세포 독성을 보이지 않았다. HLA－A2402 유전자를 HLA－A24 음성 QG56 세포주(QG56-A24)에 도입했을 때, C27는 표적 세포를 죽였다. K562 세포에 대한 독성은 낮았다.
상기 결과는 Ep173－특이적 CTL이 HLA－A24 및 Ep－CAM 모두를 발현하는 종양 세포를 죽인다는 것을 입증한다.
도 3b는 HLA－A2402 양성 세포주인 PC9에 대한 Ep173－특이적 CTL 클론, C27의 세포 독성에 관한 항-HLA－A24 모노클로날 항체의 억제 효과를 보여준다.
폐암 세포주의 PC9 세포(HLA－A24 양성 Ep－CAM 양성 폐암 세포주)에 대한 C27의 세포 독성은 HLA－A24 또는 클래스 I분자(W6/32)에 대해 특이적인 모노클로날 항체에 의해 차단되었지만, 항-HLA－A2 모노클로날 항체에 대해서는 세포 독성이 차단되지 않았다.
8) 콜드 타겟 인히비션 어세이(
cold
target
inhibition
assay
)
콜드 타겟 인히비션 어세이는 Arai 등(Blood 97:2903-2907, 2001)의 방법으로 실시하였다.
T2－A24 세포를 에피토프 펩티드 Ep173, 또는 EBV－LMP419 최종 농도 1 x10－5 M와 1시간 동안 배양하였다.
몇 차례 세척한 후, 상기 결과물은 표적 세포에 대한 펩티드-펄스된 T-A24 세포의 비가 40：1, 20：1, 10：1, 5：1이 되도록 1시간 동안 2 x104개의 작동 세포와 배양하였다. 2 x103개의 51Cr 표지된 PC9 세포를 각 웰에 첨가하였다.
세포 독성은 7)에 기재된 대로 CTL 어세이로 측정하였다.
도 3C는 콜드 타겟 인히비션 어세이 결과를 보여준다. 도 3C에서, 크롬 표지 PC9 세포(표지) Ep173(●) 또는 대조군 EBV－LMP419(■) 펩티드로 펄스된 T2－A24 세포(비표지)와 의 비율을 횡축에 나타내었다. PC29 세포에 대한 C27 매개세포독성을 %로 종축에 나타내었다. 오픈 써클은 크롬 비표지 표적이 제외된 세포 독성을 나타낸다.
그 결과, PC9 세포에 대한 C27 매개 세포 독성은 Ep173이 펄스된 T2－A24 세포의 존재에 의해 특이적으로 억제되었지만, 관련이 없는 않은 펩티드에 의해서는 억제되지 않았다.
이와 같이, PC9에 대한 C27 매개 세포 독성은 항-HLA－A24 모노클로날 항체 또는 Ep173－펄스된 콜드 타겟 세포에 의해 저해되었다. 따라서, CTL 클론은 종양 세포의 표면상에 자연적으로 제시되는 Ep173에 대해 탁월한 특이성을 갖는다는 것을 보여준다.
<실시예 3>
펩티드
Ep173
－특이적
CTL
클론의 특성 2
9)
RT
－
PCR
모든 RNA는 GenElute mRNA Miniprep kit(Sigma 제품)을 사용하여 배양된 세포주로부터 추출하였다. 유전자 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Proligo(Proligo Japan 제작)로 합성하여, Ep－CAM의 mRNA 발현을 평가하기 위해서 사용하였다. RT－PCR에 이용한 프라이머는 하기와 같다：
전방향·프라이머：ATGGCGCCCCCGCAGGTCCT (서열 번호 8)
역방향 프라이머 ：TTATGCATTGAGTTCCCTATGCATCTCACC (서열 번호 9).
RT－PCR은 유전자 증폭기(Perkin-Elmer 제품)를 이용하여 실시하였으며, PCR 산물은 1. 5% 겔 전기 영동과 에티듐 브로마이드 시각화를 통해 분석하였다.
PCR은 94℃로 5분간 1 회, 94℃로 30초간, 58℃으로 30초간, 72℃로 1분간을 30호 반복하였고, 72℃로 7분간 1 회 조건으로 수행하였다.
10)
웨스턴
블롯
분석
웨스턴·블롯 분석은 schwartz 등(J. Immnol,165:768-778, 2000)의 방법을 약간 변형하여 수행하였다. 더욱 구체적으로, 세포는 4℃에서 30분간 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, pH7. 5, 5 mM magnesium chloride, 1 mM EDTA, 0. 5% triton X－100, 10 μM leupeptin, 2. 8 μM pepstain, 및 0.85 mM phenylmethanesulfonyl fluoride)을 이용하여 용해하였다. 용해된 세포 상층액은 단백질 농도를 측정하기 위해서 280/260 nm의 파장에서 정량하였다. 이후 단백질 130 ㎍을 12% SDS－PAGE에 로딩하였다. 단백지은 Immobilon－P membrane(Millipore 제품) 상에 블롯팅하였고, 100 % 저지방 건조 밀크 및 0.1% 트윈-20을 포함하는 PBS로 4℃ 조건에서 차단하였다.
이 후 Ep－CAM 특이적 모노클로날 항체(LabVision 제품)로 찾아내고 퍼옥시다아제-접합된 양 항-쥐 IgG(Zymed 제품)를 이용하여 검출하였다.
단백질은 ECL 웨스턴 블롯 검출 시스템(Amersham bio-science company 제품)을 이용하여 시각화하였다.
암 세포주의 Ep－CAM 발현의 RT－PCR 및 웨스턴·블롯 분석 결과를 도 4에 나타내었다.
15종의 암 세포주 중 12 종(80%)이 Ep－CAM를 발현되었다. HLA－A24의 발현은 항-HLA－A24 모노클로날 항체를 사용하는 간접 면역 형광분석법을 이용하여 실험하였다. 실험한 15종의 암 세포주 가운데 10종이 HLA－A24 발현 양성이었다.
상기 실시예에 나타난 것처럼 본 발명자들은 Ep－CAM로부터 유도된 신규 HLA－A2402-제한 에피토프를 획득하였다. 최소한 에피토프 펩티드 Ep173(RYQLDPKFI；서열 번호 1)은 HLA－A2402/펩티드 복합체에 특이적인 고친화성 T세포 수용체를 포함하는 CTL을 유도하는 능력을 가지고 있으므로 상기 펩티드를 이용한 면역 치료법을 기대할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 HLA－A2402를 갖는 광범위한 인간의 암에 대한 암 백신으로서 매우 적합하게 사용될 수 있다.
<110> Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
<120> epitope peptide which is recognized by HLA-A2402-restricted and
Ep-CAM-specific CTL
<130> 6fpi-07-01
<150> PCT/JP2005/000587
<151> 2005-01-19
<160> 12
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducing
HLA-A2402-restricted CTL
<400> 1
Arg Tyr Gln Leu Asp Pro Lys Phe Ile
1 5
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducing
HLA-A2402-restricted CTL
<400> 2
Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe
1 5 10
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducing
HLA-A2402-restricted CTL
<400> 3
Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducing
HLA-A2402-restricted CTL
<400> 4
Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducing
HLA-A2402-restricted CTL
<400> 5
Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducing
HLA-A2402-restricted CTL
<400> 6
Lys Tyr Glu Lys Ala Glu Ile Lys Glu Met
1 5 10
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducing
HLA-A2402-restricted CTL
<400> 7
Glu Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu
1 5
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide used as PCR primer
<400> 8
atggcgcccc cgcaggtcct 20
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide used as PCR primer
<400> 9
ttatgcattg agttccctat gcatctcacc 30
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide used as PCR primer
<400> 10
cgttatcaac tggatccaaa atttatc 27
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide used as PCR primer
<400> 11
tattatgttg atgaaaaagc acctgaattc 30
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducing
HLA-A0201-restricted CTL
<400> 12
Tyr Gln Leu Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile
1 5 10
Claims (47)
- 하기의 (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 펩티드:(1) 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩티드;(2) 서열 번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 펩티드;(3) 적어도 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환에 의해 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열로 구성된, HLA－A2402 분자와 복합체를 형성하여 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구에 인식 또는 이를 유도할 수 있는 돌연변이 펩티드; 및(4) 적어도 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환에 의해 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열로 구성된, HLA－A2402 분자와 복합체를 형성하여 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구에 인식 또는 이를 유도할 수 있는 돌연변이 펩티드.
- 하기의 (1) 또는 (2) 의 펩티드:(1) 서열 번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드; 및(2) 서열 번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드.
- 제 1항 또는 제 2항의 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 암 백신.
- 제 3항에 있어서, 암은 표피성 암인 것을 특징으로 하는 암 백신.
- 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 암은 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 구강암, 췌암, 식도암, 비 인두암, 자궁암, 전립선암 및 담낭암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암인 것을 특징으로 하는 암 백신.
- 제 3항 내지 제 5항 중 어느 하나에 있어서, 백혈구 항원으로 HLA－A2402를 가지는 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 암 백신.
- 제 1항 또는 제 2항의 펩티드를 활성 성분으로 포함하는 세포 독성 T 임파구 유도제.
- 제 7항에 있어서, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 세포 독성 T 임파구 유도제.
- 하기의 (5) 내지 (8) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드:(5) 서열 번호 10으로 기재되는 염기 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;(6) 서열 번호 11로 기재되는 염기 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드;(7) 서열 번호 10으로 기재되는 염기 서열로 구성되는 되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, HLA－A2402 분자와 복합체를 형성하여 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구에 인식 또는 이를 유도할 수 있는 펩티드를 암호화하는 돌연변이 폴리뉴클레오티드; 및(8) 서열 번호 11로 기재되는 염기 서열로 구성되는 되는 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구에 인식되도록 HLA－A2402 분자와 복합체를 형성하거나 또는 상기 임파구를 유도할 수 있는 펩티드를 암호화하는 돌연변이 폴리뉴클레오티드.
- 제 9항의 폴리뉴클레오티드를 활성 성분으로 포함하는 표피성 암의 유전자 치료제.
- 제 9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
- 제 11항의 재조합 벡터를 도입한 형질전환체.
- 제 12항의 형질전환체를 배양하는 단계와 배양액으로부터 제 1항 또는 제 2항의 펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 제 1항 또는 제 2항의 펩티드 제조 방법.
- 제 1항 또는 제 2항의 펩티드로 펄스된 항원 제시 세포.
- 제 14항의 항원 제시 세포를 활성 성분으로 포함하는 암 백신.
- 제 15항에 있어서, 암은 표피성 암인 것을 특징으로 하는 암 백신.
- 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 암은 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 구강암, 췌암, 식도암, 비 인두암, 자궁암, 전립선암 및 담낭암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 백신.
- 제 15항 내지 제 17항 중 어느 하나에 있어서, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 암 백신.
- 제 14항의 항원 제시 세포를 활성 성분으로 포함하는 세포 독성 T 임파구 유도제.
- 제 19항에 있어서, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간의 치료에 이용되는 것을 특징으로 하는 세포 독성 T 임파구 유도제.
- 주요 조직 적합 항원 및 제 1항 또는 제 2항의 펩티드 또는 제 14항의 항원 제시 세포 상에 제시된 종양 항원 에피토프 펩티드를 포함하는 주요 조직 적합 항원 복합체.
- 제 21항에 있어서, HLA－A2402 분자와 β2 마이크로글로블린, 제 1항 또는 제 2항의 펩티드 또는 제 14항의 항원 제시 세포 상에 제시된 종양 항원 에피토프 펩티드를 포함하는 주요 조직 적합 항원 복합체.
- 제 21항 또는 제 22항의 주요 조직 적합 항원 복합체를 활성 성분으로 포함하는 암 백신.
- 제 23 항에 있어서, 암은 표피성 암인 것을 특징으로 하는 암 백신.
- 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 암은 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 구강암, 췌암, 식도암, 상 인두암, 자궁암, 전립선암 및 담낭암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 백신.
- 제 23항 또는 제 25항 중 어느 하나에 있어서, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간의 치료에 이용하는 것을 특징으로 하는 암 백신.
- 제 21항 또는 제 22항의 주요 조직 적합 항원 복합체를 활성 성분으로 포함하는 세포 독성 T 임파구 유도제.
- 제 27항에 있어서, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간의 치료에 이용하는 것을 특징으로 하는 세포 독성 T 임파구 유도제.
- 주요 조직 접합 항원, 제 1항 또는 제 2항의 펩티드 또는 제 14항의 항원 제시 세포 상에 제시된 종양 항원 에피토프 펩티드를 포함하는 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머.
- 하기 (a) 내지 (d) 중 적어도 하나 이상을 이용하여 말초혈액 임파구를 자극하여 수득되는 세포 독성 T 임파구:(a) 제 1항 또는 제 2항의 펩티드;(b) 제 14항의 항원 제시 세포;(c) 제 21항 또는 제 22항의 주요 조직 적합 항원 복합체; 및(d) 제 29항의 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머.
- 제 30항에 있어서, 상기 (a) 내지 (d) 중 적어도 하나 이상을 이용하여 말초혈액 임파구를 자극하여 주요 조직 적합 항원 복합체 및/또는 그의 테트라머와 세포 독성 T 임파구와의 결합체를 형성하는 단계 및 상기 결합체로부터 분리하는 단계에 의해 수득되는 세포 독성 T 임파구.
- 제 30항 또는 제 31항의 세포 독성 T 임파구를 활성 성분으로 포함하는 암 수동 면역 치료제.
- 제 32항에 있어서, 암은 표피성 암인 것을 특징으로 하는 수동 면역 치료제.
- 제 32항 또는 제 33항에 있어서, 암은 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 구강암, 췌암, 식도암, 상 인두암, 자궁암, 전립선암 및 담낭암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 수동 면역 치료제.
- 제 32항 내지 제 34항 중 어느 하나에 있어서, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 수동 면역 치료제.
- 1) 말초혈액에 작용하는 하기 (a)~(d) 중 적어도 하나 이상을 제작하는 단계; 및(a) 제 1항 또는 제 2항의 펩티드,(b) 제 14항의 항원 제시 세포,(c) 제 21항 또는 제 22항의 주요 조직 적합 항원 복합체,(d) 제 29항의 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머,2) 말초혈액 중의 세포 독성 T 세포 또는 상기 세포가 생산하는 싸이토카인을 정량하는 단계를 포함하는 말초혈액 중의 HLA－A2402-제한 세포 독성 T 임파구 정량 방법.
- 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간에게 하기의 (a)~(d) 중 적어도 하나 이상을 투여하는 암 치료 및/또는 개선 방법:(a) 제 1항 또는 제 2항의 펩티드,(b) 제 14항의 항원 제시 세포,(c) 제 21항 또는 제 22항의 주요 조직 적합 항원 복합체,(d) 제 29항의 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머.
- 1) 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간의 말초혈액으로부터 단핵세포분획을 수득하는 단계;2) 단계 1)의 단핵세포분획을 하기의 (a)~(d) 중 적어도 어느 하나와 함께 배양하는 단계:(a) 제 1항 또는 제 2항의 펩티드,(b) 제 14항의 항원 제시 세포,(c) 제 21항 또는 제 22항의 주요 조직 적합 항원 복합체,(d) 제 29항의 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머,3) 세포 독성 T 임파구가 유도 및/또는 활성화된 단핵세포분획을 환자의 혈액으로 되돌리는 단계를 포함하는 암 치료 또는 개선방법.
- 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간을 대상으로, 하기 (a)~(d) 중 적어도 어느 하나 이상을 투여하는 세포 독성 T 임파구의 유도 방법:(a) 제 1항 또는 제 2항의 펩티드;(b) 제 14항의 항원 제시 세포;(c) 제 21항 또는 제 22항의 주요 조직 적합 항원 복합체; 및(d) 제 29항의 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머.
- 제 30항 또는 제 31항의 세포 독성 T 임파구를 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간에게 투여하는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 개선방법.
- 제 21항에 있어서, 테트라머는 HLA－A2402 분자, β2 마이크로글로블린 및 제 1항 또는 제 2항의 펩티드 또는 제 14항의 항원 제시 세포 상에 제시된 종양 항원 에피토프 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머.
- 제 41항의 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머를 활성 성분으로 포함하는 암 백신.
- 제 42항에 있어서, 암은 표피성 암인 것을 특징으로 하는 암 백신.
- 제 42항 또는 제 43항에 있어서, 암은 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 구강암, 췌암, 식도암, 비 인두암, 자궁암, 전립선암 및 담낭암으로 구성되는 군보다 선택되는 것을 특징으로 하는 암 백신.
- 제 42항 내지 제 44항 중 어느 하나에 있어서, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간의 치료에 이용하는 것을 특징으로 하는 암 백신.
- 제 41항의 주요 조직 적합 항원 복합체 테트라머를 활성 성분으로 포함하는 세포 독성 T 임파구 유도제.
- 제 46항에 있어서, 백혈구 항원으로서 HLA－A2402를 가지는 인간의 치료에 이용하는 것을 특징으로 하는 세포 독성 T 임파구 유도제.
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