KR20020062361A - 개변된 α1,2-푸코오스 전이효소 유전자 및α1,2-푸코오스 전이효소와 푸코오스 함유 당질의 제조법 - Google Patents

개변된 α1,2-푸코오스 전이효소 유전자 및α1,2-푸코오스 전이효소와 푸코오스 함유 당질의 제조법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헬리코박터 필로리 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 유전자의 염기 서열을 개변한 유전자, 이 유전자를 사용한 α1,2-푸코오스 전이효소의 제조 방법 및, 이 효소를 발현시키고 있는 미생물을 사용한 푸코오스 함유 당질의 제조법에 관한 것이다. 본 발명에 의해, GTP 전구물질로부터 GTP 를 생산하는 능력을 갖는 미생물, 당과 GTP 로부터 GDP-푸코오스를 생산하는 능력을 갖는 미생물 및 수용체 당질을 수성 매체 중에서 접촉시킴으로써, 푸코오스 함유 당질을 염가이면서 대량으로 생산할 수 있다.

Description

개변된 α1,2-푸코오스 전이효소 유전자 및 α1,2-푸코오스 전이효소와 푸코오스 함유 당질의 제조법 {MODIFIED α-1,2-FUCOSYLTRANSFERASE GENE AND PROCESS FOR PRODUCING α-1,2-FUCOSYLTRANSFERASE AND FUCOSE-CONTAINING SUGAR CHAIN}
α1,2-푸코오스 전이효소 유전자에 관해서는 동물유래의 유전자 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6674 (1990), Immunogenetics, 44, 76 (1996), J. Biol. Chem., 264, 3436 (1989), J. Biol. Chem., 264, 11158 (1989), J. Biol. Chem., 267, 2737 (1992), J. Biol. Chem., 270, 8844 (1995), J. Biol. Chem., 270, 4640 (1995), J. Biochem., 118, 541 (1995), J. Biol. Chem., 271, 16975 (1996)] 가 취득되어 있지만, 이 유전자를 대장균 등과 같은 미생물을 사용하여 활성이 있는 단백질로서 발현시킨 예는 없다.
한편, 미생물에서는 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori) 로부터 α1,2-푸코오스 전이효소 유전자가 취득되고, 이 유전자를 사용하여 대장균에서 α1,2-푸코오스 전이효소를 발현시켰다는 보고가 있지만, 이 유전자는 강력한 프로모터 지배하에서도 효소 활성이 매우 미약하다 [Microbiology, 145, 3245 (1999)].
푸코오스 함유 당사슬은 혈액형 항원 당사슬로서 알려져 있는데, 최근 세포의 암화(癌化)에 따라 그 구조가 변화됨이 밝혀져 [Anal. Biochem., 251, 89 (1997)] 종양 마커나 의약품으로서의 응용이 기대된다. 또 인유(人乳) 중에는 올리고당이 풍부하게 함유되어 있어, 푸코오스 함유 당사슬 (푸코실락토오스가 주요 성분의 하나) 은 전체 올리고당 중 70% 이상을 차지하고 있다 [Glycobiology, 8, 615 (1998)]. 이 올리고당에도 함유되는 Fuc α1-2 Gal 구조를 갖는 당사슬은 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 의 감염을 저해함이 알려져 있는 점에서 [Infect. Immun., 59. 1650 (1991)], 푸코오스 함유 당사슬은 안전한 감염 예방약의 유력한 후보로 여겨진다.
그러나, 푸코실락토오스 등의 푸코오스 함유 당사슬의 제조에 관해서는, 인유로부터의 추출법 [J. Chromatogr., 211, 170 (1981)] 이나 트랜스제닉 동물을 사용한 생산법 [J. Biol. Chem., 270, 29515 (1995), 미국 특허 5,700,671], 효소를 사용한 방법 [미국 특허 5,583,042] 이 보고되어 있지만, 모두 비용면이나 생산성면에서 문제가 있어 공업적인 제조법은 아직 확립되어 있지 않다.
본 발명은 개변된 α1,2-푸코오스 전이효소 유전자, 이 유전자를 사용한 α1,2-푸코오스 전이효소의 제조법 및 푸코오스 함유 당질의 제조법에 관한 것이다.
도 1 은, α1,2-푸코오스 전이효소 유전자 발현 플라스미드 pGT35 의 구조를 나타낸다. 도면 중, Ampr은 앰피실린 내성 유전자를, Ptrp는 trp 프로모터를, FTS 는 α1,2-푸코오스 전이효소 유전자를 나타낸다.
도 2 는, glk, manB, manC 발현 플라스미드 pNK11 의 작성 공정을 나타낸다. 도면 중, Ampr은 앰피실린 내성 유전자를, PL은 PL프로모터를, cI857 은 cI857 리프레서를, glk 는 글루코키나아제 유전자를, manB 는 포스포만노뮤타아제 유전자를, manC 는 만노오스-1-인산 구아닐릴 트랜스퍼라아제 유전자를 나타낸다.
도 3 은, gmd 발현 플라스미드 pGE19 의 작성 공정을 나타낸다. 도면 중, Ampr은 앰피실린 내성 유전자를, Ptrp는 trp 프로모터를, Plac는 lac 프로모터를, gmd 는 GDP-만노오스 4,6-디히드라타아제 유전자를 나타낸다.
도 4 는, wcaG 발현 플라스미드 pGE8 의 작성 공정을 나타낸다. 도면 중, Ampr은 앰피실린 내성 유전자를, PL은 PL프로모터를, cI857 은 cI857 리프레서를, wcaG 는 GKDM 에피머라아제/리덕타아제 유전자를 나타낸다.
이하에 본 발명의 실시예를 나타내는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
발명의 개시
본 발명은 푸코오스 함유 당질의 공업적 제조법을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 실시하여, 지금까지 대장균 등과 같은 미생물에서는 활성이 있는 단백질로서 대량 발현시키기 곤란한 α1,2-푸코오스 전이효소를, 이 효소를 코드하는 DNA 의 염기 서열을 개변함으로써 미생물을 사용한 대량 생산에 성공하고, 이 효소를 사용한 푸코오스 함유 당질의 공업적 제법을 확립하였다. 또한 이 효소의 성질을 다양하게 검토함으로써 이 효소가 루이스 X 나 N-아세틸락토사민을 수용체 당사슬로 할뿐만 아니라, 락토오스도 수용체로 함을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 (1) ∼ (29) 에 관한 것이다.
(1) 헬리코박터 필로리 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 에서, 이 DNA서열에 존재하는
[a] 폴리 C 서열,
[b] TAA 유사 리피트 서열,
[c] AAAAAAG 서열,
에서 선택되는 염기 서열 중 하나 이상의 염기 서열에서 1 개 이상의 염기가 결실,치환 또는 부가된 염기 서열을 갖는 DNA 이며, 또한 이 DNA 가 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
(2) 치환이 청구항 1 에 기재된 DNA 를 발현시키는 숙주세포에서의 사용빈도가 높은 코돈으로 개변되는 치환인 (1) 에 기재된 DNA.
(3) 헬리코박터 필로리 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 에서, 하나 이상의 코돈을 이 DNA 를 발현시키는 숙주세포에서 사용빈도가 높은 코돈으로 개변하여 얻어지는 염기 서열을 갖는 DNA.
(4) 개변이 헬리코박터 필로리 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는단백질을 코드하는 DNA 중에 존재하는
[a] 폴리 C 서열,
[b] TAA 유사 리피트 서열,
[c] AAAAAAG 서열,
에서 선택되는 염기 서열 중 하나 이상의 염기 서열에서의 개변인 (3) 에 기재된 DNA.
(5) 헬리코박터 필로리 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 에서, 전체 코돈을 이 DNA 를 발현시키는 숙주세포에서 사용빈도가 높은 코돈으로 개변하여 얻어지는 염기 서열을 갖는 DNA 인 (3) 에 기재된 DNA.
(6) 서열번호 1 에 기재된 염기 서열로 표시되는 DNA.
(7) 서열번호 1 에 기재된 염기 서열로 표시되는 DNA 에서 1 개 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 또한 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
(8) (1) ∼ (7) 중 어느 한 항에 기재된 DNA 에서 선택되는 DNA 를 벡터에 연결하여 얻어지는 재조합체 DNA.
(9) (8) 에 기재된 재조합체 DNA 를 숙주세포에 도입하여 얻어지는 형질전환체.
(10) 숙주세포가 미생물인 것을 특징으로 하는 (9) 에 기재된 형질전환체.
(11) 미생물이 에쉐리키아속에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 형질전환체.
(12) 에쉐리키아속에 속하는 미생물이 대장균인 것을 특징으로 하는 (11) 에 기재된 형질전환체.
(13) (9) ∼ (12) 중 어느 한 항에 기재된 형질전환체에서 선택되는 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 생성 축적시켜, 이 배양물에서 이 단백질을 채취하는 것을 특징으로 하는 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질의 제조법.
(14) (9) ∼ (12) 중 어느 한 항에 기재된 형질전환체에서 선택되는 형질전환체의 배양액 또는 이 배양액의 처리물을 효소원으로 사용하여 이 효소원, 수용체 당질 및 구아노신이인산 푸코오스 (이하, GDP-푸코오스로 약기함) 를 수성 매체 중에 존재시키고, 이 수성 매체 중에서 푸코오스를 α1,2 결합으로 수용체 당질로 전이시킴으로써 푸코오스 함유 당질을 생성 축적시키고, 이 수성 매체 중에서 푸코오스 함유 당질을 채취하는 것을 특징으로 하는 푸코오스 함유 당질의 제조법.
(15) 구아노신-5'-삼인산 (이하, GTP 로 약기함) 의 전구물질로부터 GTP 를 생성하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 이 배양액의 처리물, 당과 GTP 로부터 GDP-푸코오스를 생성하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 이 배양액의 처리물 및, (9) ∼ (12) 중 어느 한 항에 기재된 형질전환체에서 선택되는 형질전환체의 배양액 또는 이 배양액의 처리물을 효소원으로 사용하여, 이들 효소원, 상기 전구물질, 당 및 수용체 당질을 수성 매체 중에 존재시키고, 이 수성 매체 중에서 푸코오스 함유 당질을 생성 축적시켜, 이 수성 매체 중에서 푸코오스 함유 당질을 채취하는 것으로 이루어지는 (14) 에 기재된 푸코오스 함유 당질의 제조법.
(16) 수용체 당질이 비환원 말단에 갈락토오스를 갖는 10 당 이하의 올리고당을 함유하는 당질인 (14) 또는 (15) 에 기재된 푸코오스 함유 당질의 제조법.
(17) 올리고당이 락토오스, N-아세틸락토사민, 루이스 X, 또는 루이스 a 인 것을 특징으로 하는 (16) 에 기재된 푸코오스 함유 당질의 제조법.
(18) 푸코오스 함유 당질이 푸코실락토오스, 푸코실 N-아세틸락토사민, 루이스 Y, 또는 루이스 b 인 것을 특징으로 하는 (14) 또는 (15) 에 기재된 푸코오스 함유 당질의 제조법.
(19) 배양액의 처리물이 배양액의 농축물, 배양액의 건조물, 배양액을 원심분리하여 얻어지는 균체, 이 균체의 건조물, 이 균체의 동결 건조물, 이 균체의 계면활성제 처리물, 이 균체의 초음파 처리물, 이 균체의 기계적 마쇄 처리물, 이 균체의 용매 처리물, 이 균체의 효소 처리물, 이 균체의 단백질 분획물, 이 균체의 고정화물 또는 이 균체에서 추출하여 얻어지는 효소 표품인 (14) 또는 (15) 에 기재된 푸코오스 함유 당질의 제조법.
(20) 전구물질이 구아닌, 크산틴, 히포크산틴, 구아노신, 크산토신, 이노신, 구아노신-5'-일인산, 크산토신-5'-일인산 또는 이노신-5'-일인산인 (15) 에 기재된 푸코오스 함유 당질의 제조법.
(21) 당이 글루코오스, 프룩토오스 및 만노오스에서 선택되는 당인 (15) 에 기재된 푸코오스 함유 당질의 제조법.
(22) GTP 의 전구물질로부터 GTP 를 생성하는 능력을 갖는 미생물이 코리네박테리움속에 속하는 미생물에서 선택되는 미생물인 (15) 에 기재된 푸코오스 함유당질의 제조법.
(23) 코리네박테리움속에 속하는 미생물이 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) 인 (22) 에 기재된 푸코오스 함유 당질의 제조법.
(24) 당과 GTP 로부터 GDP-푸코오스를 생성하는 능력을 갖는 미생물이 하나 이상의 미생물로 구성되는 (15) 에 기재된 푸코오스 함유 당질의 제조법.
(25) 미생물이 에쉐리키아속 또는 코리네박테리움속에 속하는 미생물에서 선택되는 미생물인 (24) 에 기재된 푸코오스 함유 당질의 제조법.
(26) 에쉐리키아속에 속하는 미생물이 대장균인 (25) 에 기재된 푸코오스 함유 당질의 제조법.
(27) 코리네박테리움속에 속하는 미생물이 코리네박테리움 암모니아게네스인 (25) 에 기재된 푸코오스 함유 당질의 제조법.
(28) 당과 GTP 로부터 GDP-푸코오스를 생성하는 능력을 갖는 미생물이 글루코키나아제, 포스포만노뮤타아제, 만노오스-1-인산 구아닐릴 트랜스퍼라아제, 포스포글루코뮤타아제, 포스포프룩토키나아제, GDP-만노오스 4,6-디히드라타아제 및 GKDM 에피머라아제/리덕타아제에서 선택되는 하나 이상의 효소 활성이 강한 미생물인 (15) 에 기재된 푸코오스 함유 당질의 제조법.
(29) 미생물이 글루코키나아제를 코드하는 유전자 (이하, glk 유전자로 약기함), 포스포만노뮤타아제를 코드하는 유전자 (이하, manB 유전자로 약기함), 만노오스-1-인산 구아닐릴 트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자 (이하, manC 유전자로 약기함), 포스포글루코뮤타아제를 코드하는 유전자 (이하, pgm 유전자로 약기함), 포스포프룩토키나아제를 코드하는 유전자 (이하, pfk 유전자로 약기함), GDP-만노오스 4,6-디히드라타아제를 코드하는 유전자 (이하, gmd 유전자로 약기함) 및 GKDM 에피머라아제/리덕타아제를 코드하는 유전자 (이하, wcaG 유전자로 약기함) 에서 선택되는 하나 이상의 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터의 재조합체 DNA 를 보유하는 하나 이상의 미생물로 구성되는 (28) 에 기재된 푸코오스 함유 당질의 제조법.
(30) glk 유전자, manB 유전자, manC 유전자, pgm 유전자, pfk 유전자, gmd 유전자 및 wcaG 유전자가 대장균 유래의 유전자인 (29) 에 기재된 푸코오스 함유 당질의 제조법.
본 발명의 DNA 는 헬리코박터 필로리 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 를 개변한 DNA 로서, 예컨대
(1) 헬리코박터 필로리 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 에서, 이 DNA 중에 존재하는
(a) 고변이성 부위 (hyper mutable region) 로 간주되는 폴리 C 서열,
(b) 돌연변이 핫스팟 (Mutation hot-spot) 으로 간주되는 TAA 유사 리피트 서열,
(c) 프레임시프트가 발생되기 쉬운 것으로 간주되는 AAAAAAG 서열,
에서 선택되는 염기 서열 중 하나 이상의 염기 서열에서 1 개 이상의 염기가 결실,치환 또는 부가된 염기 서열을 갖는 DNA 이며, 또한 이 DNA 가 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA,
(2) 치환이 (1) 에 기재된 DNA 를 발현시키는 숙주세포에서 사용빈도가 높은 코돈으로 개변되는 치환인 상기 (1) 에 기재된 DNA,
(3) 헬리코박터 필로리 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 에서, 하나 이상의 코돈을 이 DNA 를 발현시키는 숙주세포에서 사용빈도가 높은 코돈으로 개변하여 얻어지는 염기 서열을 갖는 DNA,
(4) 개변이 헬리코박터 필로리 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 중에 존재하는
(a) 고변이성 부위로 간주되는 폴리 C 서열,
(b) 돌연변이 핫스팟으로 간주되는 TAA 유사 리피트 서열,
(c) 프레임시프트가 발생되기 쉬운 것으로 간주되는 AAAAAAG 서열,
에서 선택되는 염기 서열 중 하나 이상의 염기 서열에서의 개변인 상기 (3) 에 기재된 DNA,
(5) 헬리코박터 필로리 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 에서, 전체 코돈을 이 DNA 를 발현시키는 숙주세포에서 사용빈도가 높은 코돈으로 개변하여 얻어지는 염기 서열을 갖는 DNA 인 상기 (3) 에 기재된 DNA,
(6) 상기 (1) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 염기 서열로 이루어지는 DNA 의 염기 중 1 개 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 또한 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 로, 헬리코박터 필로리 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 유전자의 염기 서열과는 다른 염기 서열을갖는 DNA 등을 들 수 있다.
상기 (a) 에 기재된 폴리 C 서열이란, 적어도 8 개 이상 연속해서 C 가 계속되는 염기 서열이며, (b) 에 기재된 TAA 유사 리피트 서열이란, TAA, GAA, AAA, TAG 또는 TGA 서열에서 선택되는 서열이 임의의 순서로 적어도 3 회 이상 연속해서 존재하는 염기 서열이다.
또 상기 (2) ∼ (5) 에 기재된 숙주세포로서는 세균, 효모, 동물, 곤충세포, 식물세포 등, 본 발명의 DNA 를 발현시킬 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있다. 사용빈도가 높은 코돈이란, 이 숙주세포에서 각 아미노산에 대응하는 코돈의 사용빈도가 적어도 10% 이상인 코돈이며, 바람직하게는 20% 이상인 코돈을 들 수 있다.
또 상기 1 개 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 DNA 는 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition. (1989)] (이하, 몰레큘러 클로닝 제 2 판으로 약기함) 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)] (이하, 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올러지로 약기함) 등에 기재된 부위특이적 변이도입법을 사용함으로써 가능하다. 이 변이도입 DNA 로 코드되는 단백질에 발생되는 아미노산의 결실, 치환 또는 부가되는 수는 특별히 한정되지 않지만, 상기 부위특이적 변이법 등과 같은 주지된 방법에 의해 결실, 치환 또는 부가될 수 있을 정도의 수이며, 예컨대 1 개 내지 20 개, 바람직하게는 1 개 내지 15 개, 보다 바람직하게는 1 개 내지 5 개를 들 수 있다.
또, 본 발명의 DNA 가 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하기 위해서는, BLAST [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)] 나 FASTA (Method inEnzymology, 183, 63-69) 등의 해석 소프트를 사용하여 계산했을 때에, 이 변이도입 DNA 가 서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 통상 80 % 이상의 상동성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 인 것이 바람직하다.
본 발명의 DNA 의 제조 방법으로서는, 헬리코박터 필로리 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 를 사용하며, 예컨대 몰레큘러 클로닝 제 2 판, 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올러지, Nucl. Acids Res., 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucl. Acids Res., 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) 등에 기재된 부위특이적 변이도입법을 사용하여 제조하는 방법을 들 수 있다. 또 합성 DNA 를 사용한 방법으로서는, 예컨대 (1) 통상법 [PCR Protocols, Humana Press, (1993) 등] 에 따라 PCR 법에 의해 인공적으로 DNA 를 합성하는 방법, (2) 목적으로 하는 DNA 의 전체 길이를 커버하도록 100bp 정도의 합성 DNA 를 센스 사슬, 안티센스 사슬 모두 제조하여 어닐링 후, DNA 리가아제로 연결하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 DNA 를 사용하여 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 제조하는 방법으로서는, 예컨대 상기 방법에 의해 제조한 이 단백질을 코드하는 DNA 를 몰레큘러 클로닝 제 2 판에 기재된 방법에 따라 벡터 DNA 와 연결함으로써 재조합체 DNA 를 제조하고, 이 재조합체 DNA 를 사용하여 몰레큘러 클로닝 제 2 판에 기재된 방법에 따라 세포를 형질전환하고, 이 형질전환세포를 이 형질전환세포가 생육될 수 있는 적당한 배지 중에서 배양하고, 이 배양액 중에 이 단백질을 축적시켜 이 배양액에서 이 단백질을 얻는 방법을 들 수 있다. 또 이 배양액에서 이 단백질을 채취하기 위해서는, 이 단백질을 가용화 후 이온교환, 겔 여과 또는 소수성 크로마토그래피법 등이나, 이들 크로마토그래피법을 조합함으로써 단리 정제시키는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 푸코오스 함유 당질은 이 단백질을 생산하는 형질전환체의 배양액이나 배양액의 처리물, 또는 정제된 이 단백질을 효소원으로 사용하여, 수용체 당질, GDP-푸코오스를 수성 매체 중에 공존시킴으로써 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 푸코오스 함유 당질은 전구체로부터 GTP 를 생산하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 배양액 처리물과, 당과 GTP 로부터 GDP-푸코오스를 생산하는 능력을 갖는 하나 이상의 미생물로 구성되는 미생물의 배양액 또는 배양액 처리물을 수성 매체 중에 공존시킴으로써 취득되는 GDP-푸코오스를 사용하여 얻을 수도 있다. 여기에서 말하는 전구체는 미생물에 의해 GTP 로 변환되는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 구아닌, 크산틴, 히포크산틴, 구아노신, 크산토신, 이노신, 구아노신-5'-일인산, 크산토신-5'-일인산, 이노신-5'-일인산을 들 수 있다. 당은 GDP-푸코오스로의 변환이 가능한 것이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 글루코오스, 프룩토오스 및 만노오스에서 선택되는 당을 들 수 있다. 수용체 당질은 본 발명의 DNA 가 코드하는 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질의 기질이 되는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 비환원 말단에 갈락토오스를 갖는 당을 들 수 있고, 보다 바람직한 기질로서는 락토오스, N-아세틸락토사민, 루이스 X, 또는 루이스 a 를 들 수 있다.
전구체로부터 GTP 를 생산하는 능력을 갖는 미생물로서는, 이 능력을 갖는 미생물이면 한정되지 않지만, 바람직하게는 코리네박테리움속에 속하는 미생물, 보다 바람직하게는 코리네박테리움 암모니아게네스를 들 수 있다. 당과 GTP 로부터 GDP-푸코오스를 생성하는 능력을 갖는 미생물로서는, 글루코키나아제, 포스포만노뮤타아제, 만노오스-1-인산 구아닐릴 트랜스퍼라아제, 포스포글루코뮤타아제, 포스포프룩토키나아제, GDP-만노오스 4,6-디히드라타아제 및 GKDM 에피머라아제/리덕타아제에서 선택되는 하나 이상의 효소 활성이 강한 미생물을 들 수 있고, 바람직하게는 글루코키나아제, 포스포만노뮤타아제, 만노오스-1-인산 구아닐릴 트랜스퍼라아제, 포스포글루코뮤타아제, 포스포프룩토키나아제, GDP-만노오스 4,6-디히드라타아제 및 GKDM 에피머라아제/리덕타아제에서 선택되는 1 종류 이상의 효소 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터와의 재조합체 DNA 를 보유하는 1 이상의 미생물로 구성되는 미생물이며, 보다 바람직하게는 대장균 유래의 glk 유전자, manB 유전자, manC 유전자, pgm 유전자, pfk 유전자, gmd 유전자 및 wcaG 유전자를 유지하는 1 종류 이상의 재조합 대장균을 들 수 있다.
생성된 푸코오스 함유 당질은 활성탄이나 이온교환수지 등을 사용하는 통상적인 크로마토그래피법에 의해 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
[1] α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 발현시키는 형질전환주의 제조
(1) 본 발명의 DNA 의 제조
본 발명의 DNA 는 이하에 나타내는 방법으로 제조할 수 있다. 우선, α1,2-푸코오스 전이효소의 아미노산 서열을 선택한다. 이 효소의 아미노산 서열로서는 이 효소 활성을 갖는 아미노산 서열이면 어떤 것이어도 사용할 수 있는데, 예컨대 서열번호 2 로 표시되는 GenBank 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 헬리코박터 필로리 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소의 아미노산 서열을 들 수 있다. 이어서, 이 효소 활성을 발현시키는 숙주세포에서 사용빈도가 높은 코돈을 사용하여 이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 를 설계한다. 예컨대 숙주세포로 대장균을 사용하는 경우는, 선택된 이 효소의 아미노산 서열을 대장균 유전자의 염기 서열에 나타내는 코돈의 사용빈도 [Codon Usage database at kazusa (http://www.kazusa.or.jp/codon/)] 를 고려하여 가장 사용빈도가 높은 코돈을 갖도록 하는 DNA 서열로 변환함으로써 본 발명의 DNA 를 설계할 수 있다.
또, 선택된 α1,2-푸코오스 전이효소의 아미노산 서열이 헬리코박터 필로리 유래인 경우, 이 아미노산 서열을 코드하는 DNA 에 나타내는 (ⅰ) 폴리 C 서열, (ⅱ) TAA 유사 리피트 서열, (ⅲ) AAAAAAG 서열에서 선택되는 염기 서열 중 하나 이상의 염기 서열에서 1 개 이상의 염기를 결실, 치환 또는 부가하여 얻어지는 DNA 이며, 또한 이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 를 설계할 수도 있다. 예컨대, 상기 헬리코박터 필로리가 헬리코박터 필로리 UA802 인 경우, 상기 서술한 (ⅰ), (ⅱ) 및 (ⅲ) 에 대응하는 서열로서 서열번호 27 에 기재된 염기 서열에서 염기번호 397 ∼ 408, 411 ∼ 434 및 430 ∼ 436 과 552 ∼ 558 로 표시되는 염기 서열을 들 수 있다.
상기 치환은 (ⅰ), (ⅱ) 및 (ⅲ) 에서 선택되는 염기 서열 중의 코돈을 본 발명의 DNA 를 발현시키는 숙주세포에서 가장 사용빈도가 높은 코돈으로 변환하여서도 가능하며, 예컨대 서열번호 1 에 기재된 염기 서열에서 염기번호 397 ∼ 408 및 411 ∼ 434 로 표시되는 염기 서열로의 치환을 들 수 있다.
상기와 같이 설계한 DNA 로서는, 예컨대 헬리코박터 필로리 UA802 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 유전자를 기초로 설계한 서열번호 1 에 기재된 염기 서열을 갖는 DNA 를 들 수 있다.
이어서, 설계된 염기 서열에 기초하여, 이웃하는 합성 DNA 가 서로 10 ∼ 100 염기의 중복서열을 갖고, 또한 이들이 센스 사슬, 안티센스 사슬과 교대로 되도록 5'말단측에서 40 ∼ 150 염기의 길이로 이루어지는 합성 DNA 를 자동 DNA 합성기 (퍼셉티브 바이오시스템즈사 제조 8905 형 DNA 합성장치) 를 사용하여 합성한다. 이와 같은 합성 DNA 로서, 예컨대 서열번호 1 에 기재된 염기 서열로 이루어지는 DNA 를 기초로 설계한 서열번호 3 ∼ 16 에 기재된 염기 서열을 갖는 DNA 를 들 수 있다. 상기 합성 DNA 를 사용하여 통상법 [예컨대, PCR Protocols, Humana Press, (1993) 등] 에 따라 PCR 법에 의해 본 발명의 DNA 를 인공적으로 합성한다. PCR 의 조건은 이 합성 DNA 를 사용하여 PCR 반응했을 때, 이 합성 DNA 의 설계의 기초가 된 본 발명의 DNA 와 동일한 길이의 증폭단편을 부여하는 조건이면 한정되지 않지만, 예컨대 서열번호 3 ∼ 16 에 기재된 염기 서열을 갖는 DNA 를 사용한 경우, 94℃ 에서 30 초간, 50℃ 에서 30 초간, 74℃ 에서 60 초간의 사이클을 30 사이클 실시하는 조건을 들 수 있다.
또, 양단에 위치하는 합성 DNA 의 5'말단에 적당한 제한효소의 인식서열을 도입함으로써 본 발명의 DNA 를 벡터로 용이하게 클로닝할 수도 있다. 이와 같은 합성 DNA 로서, 예컨대 상기 서열번호 3 ∼ 16 에 기재된 염기 서열을 갖는 DNA 를 사용한 PCR 시에 사용할 수 있는, 서열번호 17 및 서열번호 18 에 기재된 염기 서열을 갖는 DNA 의 세트를 들 수 있다.
(2) 본 발명의 DNA 의 클로닝과 염기 서열의 확인
상기 (1) 에서 제조한 본 발명의 DNA 를 그대로, 또는 적당한 제한효소 등으로 절단 후, 통상법에 의해 벡터에 연결한다.
이 DNA 를 연결하는 벡터로서는, 대장균 K12 주 중에서 자립복제가 가능한 벡터이면 파지 벡터, 플라스미드 벡터 등이 모두 사용가능하지만, 구체적으로는 ZAP Express [Stratagene 사 제조, Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript Ⅱ SK(+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], λzap Ⅱ (Stratagene 사 제조), λgt10, λgt11 [DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)], λTriplEx (클론테크사 제조), λBlueMid (클론테크사 제조), λExCell (파마시아사 제조), pT7T318U (파마시아사 제조), pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)], pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)] 등을 들 수 있다.
이 벡터에 (1) 에서 취득한 본 발명의 DNA 를 연결하여 얻어지는 재조합체 DNA 를 숙주에 사용하는 대장균은, 대장균에 속하는 미생물이면 모두 사용할 수 있지만, 구체적으로는 대장균 (Escherichia coli) XL1-Blue MRF' [Stratagene 사 제조, Strategies, 5, 81 (1992)], 대장균 C600 [Genetics, 39, 440, (1954)], 대장균 Y1088 [Science, 222, 778 (1983)], 대장균 Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], 대장균 NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)], 대장균 K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)], 대장균 JM105 [Gene, 38, 275 (1985)] 등을 들 수 있다.
재조합체 DNA 의 도입방법으로서는, 상기 숙주세포로 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있고, 예컨대 칼슘 이온을 사용하는 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], 프로토플라스트법 (일본 공개특허공보 소 63-2483942), 일렉트로포레이션법 [Nucleic Acids Research, 16, 6127 (1988)] 등을 들 수 있다.
상기와 같이 하여 얻어진 형질전환체에서 재조합체 DNA 를 추출하여, 이 재조합 DNA 에 함유된 본 발명의 DNA 의 염기 서열을 결정할 수 있다. 염기 서열의 결정에는 통상 사용되는 염기 서열 해석방법, 예컨대 디옥시법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] 또는 373A DNA 시퀀서 (퍼킨 엘머사 제조) 등의 염기 서열 분석장치를 사용할 수 있다. 이와 같이 하여 (1) 에서 취득한 본 발명의 DNA 가 이 DNA 합성의 기초로 설계된 DNA 와 동일함을 확인할 수 있다.
상기와 같이 하여 취득한 재조합체 DNA 를 보유하는 형질전환주로서, 예컨대 서열번호 1 로 표시되는 염기 서열을 갖는 플라스미드 DNA 를 보유하는 대장균 NM522/pGT35 를 들 수 있다.
[2] 본 발명의 DNA 를 사용한 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질의 제조
본 발명의 DNA 가 코드하는 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질은몰레큘러 클로닝 제 2 판이나 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올러지 등에 기재된 방법 등을 사용하며, 예컨대 이하의 방법에 의해 본 발명의 DNA 를 숙주세포 중에서 발현시켜 제조할 수 있다.
즉, 본 발명의 DNA 를 기초로 하여 필요에 따라 이 단백질을 코드하는 부분을 함유하는 적당한 길이의 DNA 단편을 제조하고, 이 DNA 단편을 적당한 발현벡터의 프로모터 하류에 삽입한 재조합체 DNA 를 제조한다. 이 재조합체 DNA 를, 이 발현벡터에 적합한 숙주세포에 도입하여 형질전환주를 취득하여, 이 형질전환주를 배지 중에서 배양하고, 이 배양액에 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 축적시킴으로써 제조할 수 있다.
숙주세포로서는, 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등, 목적하는 유전자를 발현시킬 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있다.
발현벡터로서는, 상기 숙주세포에서 자립복제가 가능하거나 염색체 DNA 중으로의 삽입이 가능하여 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA 를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다.
세균 등의 원핵생물을 숙주세포로서 사용하는 경우는, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA 를 함유하여 이루어지는 재조합체 DNA 는 원핵생물 중에서 자립복제가 가능함과 동시에, 프로모터, 리포솜 결합서열, 본 발명의 DNA, 전사종결서열로 구성된 벡터인 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 함유되어 있어도 된다.
발현벡터로서는, 예컨대 pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (모두 베링거만하임사에서시판), pKK233-2 (Pharmacia 사 제조), pSE280 (Invitrogen 사 제조), pGEMEX-1 (Promega 사 제조), pQE-8 (QIAGEN 사 제조), pKYP10 (일본 공개특허공보 소 58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript Ⅱ SK(-) (Stratagene 사 제조), pTrs30 [대장균 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407) 에서 제조], pTrs32 [대장균 JM109/pTrS32 (FERM BP-5408) 에서 제조], pGHA2 [대장균 IGHA2 (FERM B-400) 에서 제조, 일본 공개특허공보 소60-221091], pGKA2 [대장균 IGKA2 (FERM BP-6798) 에서 제조, 일본 공개특허공보 소60-221091], pTerm2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)], pGEX (Pharmacia 사 제조), pET 시스템 (Novagen 사 제조) 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 숙주세포 중에서 기능하는 것이면 어떤 것이어도 된다. 예컨대, trp 프로모터 (Ptrp), lac 프로모터, PL프로모터, PR프로모터, T7 프로모터 등의, 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또 Ptrp를 2 개 직렬시킨 프로모터 (Ptrp×2), tac 프로모터, lacT7 프로모터, letⅠ 프로모터와 같이 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.
리포솜 결합서열인 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 서열과 개시 코돈 사이를 적당한 거리 (예컨대 6 ∼ 18 염기) 로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 재조합체 DNA 에서는, 본 발명의 DNA 의 발현에 전사종결서열은 반드시 필요하지는 않지만, 구조 유전자의 바로 아래에 전사종결서열을 배치하는 것이 바람직하다.
숙주세포로서는, 에쉐리키아속, 세라티아속, 바실루스속, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속, 미크로박테리움속, 슈도모나스속 등에 속하는 미생물, 예컨대 대장균 XL1-Blue, 대장균 XL2-Blue, 대장균 DH1, 대장균 MC1000, 대장균 KY3276, 대장균 W1485, 대장균 JM109, 대장균 HB101, 대장균 No. 49, 대장균 W3110, 대장균 NY49, 대장균 GI698, 대장균 TB1, 세라티아 피카리아 (Serratia ficaria), 세라티아 폰티콜라 (Serratia fonticola), 세라티아 리퀴에파시엔스 (Serratia liquefaciens), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 고초균 (Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 (Bacillus amyloliquefacines), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 브레피박테리움 임마리오필럼 (Brevibacterium immariophilum) ATCC14068, 브레비박테리움 사카롤리티쿰 (Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066, 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC14067, 브레비박테리움 락토페르멘텀 (Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13869, 코리네박테리움 아세토아시도필럼 (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 미코박테리움 암모니아필럼 (Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354, 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonasputida), 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) D-0110 등을 들 수 있다.
재조합체 DNA 의 도입방법으로서는, 상기 숙주세포로 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있고, 예컨대 칼슘 이온을 사용하는 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], 프로트플라스트법 (일본 공개특허공보 소 63-248394), 또는 Gene, 17, 107 (1982) 나 Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979) 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
효모를 숙주세포로서 사용하는 경우에는 발현벡터로서, 예컨대 YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 효모균주 중에서 발현될 수 있는 것이면 어느 것을 사용해도 되고, 예컨대 헥소스키나아제 등의 해당계 (glycolytic) 유전자의 프로모터, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 히트 쇼크 폴리펩티드 프로모터, MFα1 프로모터, CUP 1 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주세포로서는, 사라코미세스 (Saccharomyces) 속, 스키조사카로미세스 (Schizosaccharomyces) 속, 클루이베로미세스 (Kluyveromyces) 속, 트리코스포론 (Trichosporon) 속, 슈와니오미세스 (Schwanniomyces) 속, 피치아 (Pichia) 속, 칸디다 (Candida) 속 등에 속하는 미생물, 예컨대 빵 효모 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로미세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 플루란스 (Trichosporonpullulans), 슈와니오미세스 알루비우스 (Schwanniomyces alluvius), 칸디다 유틸리스 (Candida utilis) 등을 들 수 있다.
재조합체 DNA 의 도입방법으로서는, 효모에 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있고, 예컨대 일렉트로포레이션법 [Methods Enzymol., 194, 182 (1990)], 스피로플라스트법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)], 아세트산리튬법 [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)], Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
동물세포를 숙주로서 사용하는 경우에는 발현벡터로서, 예컨대 pcDNAI, pcDM8 (후나코시사 제조), pAGE107 [일본 공개특허공보 평 3-22979, Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3 (일본 공개특허공보 평 2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI/Amp (Invitrogen 사 제조), pREP4 (Invitrogen 사 제조), pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], pAGE210 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 동물세포 중에서 기능하는 것이면 모두 사용할 수 있고, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV) 의 IE (immediate early) 유전자의 프로모터, SV40 의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα프로모터 등을 들 수 있다. 또, 인체 CMV 의 IE 유전자의 인헨서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.
숙주세포로서는, 인체 세포인 나말바 (Namalwa) 세포, 원숭이 세포인 COS 세포, 차이니즈 햄스터 세포인 CHO 세포, HBT 5637 (일본 공개특허공보 소 63-299) 등을 들 수 있다.
동물세포로의 재조합체 DNA 의 도입방법으로서는, 동물세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있고, 예컨대 일렉트로포레이션법 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], 인산칼슘법 (일본 공개특허공보 평 2-227075), 리포펙션법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], Virology, 52, 456 (1973) 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
곤충세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 예컨대 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올러지, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992), Bio/Technology, 6, 47 (1988) 등에 기재된 방법에 의해 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.
즉, 재조합 유전자 도입 벡터 및 배큘로바이러스를 곤충세포에 공도입 (cotransfection) 하여 곤충세포 배양상청 중에 재조합 바이러스를 얻은 후, 다시 재조합 바이러스를 곤충세포에 감염시켜 단백질을 발현시킬 수 있다.
이 방법에서 사용되는 유전자 도입 벡터로서는, 예컨대 pVL1392, pVL1393, pBlueBacⅢ (모두 Invitrogen 사 제조) 등을 들 수 있다.
배큘로바이러스로서는, 예컨대 야행성 나방과 곤충에 감염되는 바이러스인 오토그라파 캘리포니아 뉴클리아 폴리헤드로시스 바이러스 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 사용할 수 있다.
곤충세포로서는, 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 의 난소세포인 Sf9, Sf21 [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)], 트리코플러시아 니 (Trichoplusia ni) 의난소세포인 High 5 (Invitrogen 사 제조) 등을 사용할 수 있다.
재조합 바이러스를 제조하기 위한, 곤충세포로의 상기 재조합 유전자 도입 벡터와 상기 배큘로바이러스의 공도입 방법으로서는, 예컨대 인산칼슘법 (일본 공개특허공보 평 2-227075), 리포펙션법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] 등을 들 수 있다.
식물세포를 숙주세포로서 사용하는 경우에는 발현벡터로서, 예컨대 Ti 플라스미드, 타바코 모자이크 바이러스 등을 들 수 있다.
프로모터로서는 식물세포 중에서 발현시킬 수 있는 것이면 어느 것을 사용해도 되고, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 의 35S 프로모터, 벼 액틴 1 프로모터 등을 사용할 수 있다.
숙주세포로서는, 담배, 감자, 토마토, 당근, 대두, 유채, 알팔파, 벼, 소맥, 대맥 등의 식물세포 등을 들 수 있다.
재조합체 DNA 의 도입방법으로서는 식물세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있고, 예컨대 아그로박테리움 (Agrobacterium) (일본 공개특허공보 소59-140885, 일본 공개특허공보 소 60-70080, WO94/00977), 일렉트로포레이션법 (일본 공개특허공보 소 60-251887), 버티컬 건 (유전자 총) 을 사용하는 방법 (일본 특허 제 2606856 호, 일본 특허 제 2517813 호) 등을 들 수 있다.
이상과 같이 하여 얻어지는 본 발명의 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 본 발명의 단백질을 생성 축적시켜 이 배양물에서 채취함으로써 본 발명의 단백질을 제조할 수 있다.
본 발명의 형질전환체를 배지에 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다.
본 발명의 형질전환체가 대장균 등의 원핵생물 또는 효모 등의 진핵생물을 숙주로서 얻어진 형질전환체인 경우, 이 형질전환체를 배양하는 배지로서, 이 형질전환체가 자화(資化)될 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고 이 형질전환체의 배양을 효율적으로 실시할 수 있는 배지이면 천연배지, 합성배지 중 어느 배지를 사용해도 된다.
탄소원으로서는, 이 형질전환체가 자화될 수 있는 것이면 되고, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알콜류 등을 사용할 수 있다.
질소원으로서는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 그 외의 질소함유 화합물 및, 펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 콘 스팁 리커, 카제인 가수분해물, 대두찌꺼기 및 대두찌꺼기 가수분해물, 각종 발효균체 및 그 소화물 등을 사용할 수 있다.
무기염으로서는, 인산 제 1 칼륨, 인산 제 2 칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산 제 1 철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.
배양은 진탕배양 또는 심부 통기 교반배양 등의 호기적 조건하에서 실시한다. 배양 온도는 15 ∼ 40℃ 가 양호하며, 배양시간은 통상 16 시간 ∼ 7 일간이다. 배양 중의 pH 는 3.0 ∼ 9.0 으로 유지하는 것이 바람직하다. pH 의 조정은 무기 또는 유기 산, 알칼리 용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 실시한다.
또, 배양 중 필요에 따라 앰피실린, 테트라사이클린이나 클로람페니콜 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.
프로모터로서 유도성 프로모터를 사용한 재조합체 DNA 로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예컨대, lac 프로모터를 사용한 재조합체 DNA 로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 사용한 재조합체 DNA 로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 사용해도 된다.
동물세포를 숙주로서 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지 [J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)], Eagle 의 MEM 배지 [Science, 122, 501 (1952)], 둘베코 개변 MEM 배지 [Virology, 8, 396 (1959)], 199 배지 [Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)] 또는 이들 배지에 소 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상 pH 6 ∼ 8, 30 ∼ 40℃, 5% CO2존재하 등의 조건하에서 1 ∼ 7 일간 실시한다.
또, 배양 중 필요에 따라 카나마이신, 페니실린 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.
곤충세포를 숙주로서 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지 (Pharmingen 사 제조), Sf-900 Ⅱ SFM 배지 (Life Technologies 사 제조), ExCell400, ExCell405 (모두 JRH Biosciences 사 제조), Grace's Insect Medium [Nature, 195, 788 (1962)] 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상 pH 6 ∼ 7, 25 ∼ 30℃ 등의 조건하에서 1 ∼ 5 일간 실시한다.
또, 배양 중 필요에 따라 겐타마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.
식물세포를 숙주로서 얻어진 형질전환체는, 세포로서 또는 식물세포나 기관으로 분화시켜 배양할 수 있다. 이 형질전환체를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 무라시게 앤드 스쿠그 (MS) 배지, 화이트 (White) 배지, 또는 이들 배지에 옥신, 시토키닌 등, 식물호르몬을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상 pH 5 ∼ 9, 20 ∼ 40℃ 의 조건 하에서 3 ∼ 60 일간 실시한다.
또, 배양 중 필요에 따라 카나마이신, 하이그로마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.
상기와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 삽입한 재조합체 DNA 를 보유하는 미생물, 동물세포, 또는 식물세포 유래의 형질전환체를 통상적 배양방법에 따라 배양하고, 이 단백질을 생성 축적시켜 이 배양물에서 이 단백질을 채취함으로써 이 단백질을 제조할 수 있다.
유전자의 발현방법으로서는, 직접 발현 이외에 몰레큘러 클로닝 제 2 판에 기재되어 있는 방법 등에 준하여 분비 생산, 융합단백질 발현 등을 실시할 수 있다.
본 발명의 단백질의 생산방법으로서는, 숙주세포 내에 생산시키는 방법, 숙주세포 밖에 분비시키는 방법, 또는 숙주세포 밖 막상에 생산시키는 방법이 있고, 사용되는 숙주세포나, 생산시키는 단백질의 구조를 바꿈으로써 이 방법을 선택할 수 있다.
본 발명의 단백질이 숙주세포 내 또는 숙주세포 밖 막상에 생산되는 경우, 펄슨 외의 방법 [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], 로우 외의 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], 또는 일본 공개특허공보 평 5-336963, 일본 공개특허공보 평 6-823021 등에 기재된 방법을 준용함으로써 이 단백질을 숙주세포 밖에 적극적으로 분비시킬 수 있다.
즉, 유전자 재조합의 수법을 사용하여, 본 발명의 단백질의 활성부위를 함유하는 폴리펩티드의 바로 앞에 시그널펩티드를 부가한 형태로 발현시킴으로써, 본 발명의 단백질을 숙주세포 밖에 적극적으로 분비시킬 수 있다.
또, 일본 공개특허공보 평 2-227075 에 기재되어 있는 방법에 준하여, 디히드로엽산 환원효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수도 있다.
또한, 유전자 도입된 동물 또는 식물 세포를 재분화시킴으로써, 유전자가 도입된 동물 개체 (트랜스제닉 비인체 동물) 또는 식물 개체 (트랜스제닉 식물) 를 작성하고, 이들 개체를 사용하여 본 발명의 단백질을 제조할 수도 있다.
형질전환체를 동물 개체 또는 식물 개체의 경우는 통상적인 수법에 따라 사육 또는 재배하고, 이 단백질을 생성 축적시켜, 이 동물 개체 또는 식물 개체에서 이 단백질을 채취함으로써 이 단백질을 제조할 수 있다.
동물 개체를 사용하여 본 발명의 단백질을 제조하는 방법으로서는, 예컨대 공지된 방법 [Am. J. Clin. Nutr., 63, 639S (1996), Am. J. Clin. Nutr., 63, 627S (1996), Bio/Technology, 9, 830 (1991)] 에 준하여 유전자를 도입하여 작성한 동물 중에 본 발명의 단백질을 생산하는 방법을 들 수 있다.
동물 개체의 경우는, 예컨대 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 비인체 동물을 사육하고, 이 단백질을 이 동물 중에 생성ㆍ축적시켜 이 동물 중에서 이 단백질을 채취함으로써 이 단백질을 제조할 수 있다. 이 동물 중의 생성ㆍ축적 장소로서는, 예컨대 이 동물의 젖 (일본 공개특허공보 소 63-309192), 알 등을 들 수 있다. 이 때에 사용되는 프로모터로서는 동물에서 발현시킬 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있지만, 예컨대 유선세포 특이적 프로모터인 α카제인 프로모터, β-카제인 프로모터, β락토글로블린 프로모터, 유장 산성 프로테인 프로모터 등이 적합하게 사용된다.
식물 개체를 사용하여 본 발명의 단백질을 제조하는 방법으로서는, 예컨대 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 식물을 공지된 방법 [조직배양, 20 (1994), 조직배양, 21 (1995), Trends Biotechnol., 15, 45 (1997)] 에 준하여 재배하고, 이 단백질을 이 식물 중에 생성ㆍ축적시켜 이 식물 중에서 이 단백질을 채취함으로써 이 단백질을 생산하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 형질전환체에 의해 제조된 단백질을 단리 정제하기 위해서는 통상적인 효소의 단리 정제법을 사용할 수 있다. 예컨대 본 발명의 단백질이 세포 내에 용해상태에서 발현된 경우에는, 배양종료 후 세포를 원심분리에 의해 회수하여 수계 완충액에 현탁 후, 초음파 파쇄기, 프렌치프레스, 만톤 가울린 (Manton Gaulin) 호모게니저, 다이노 밀 (Dyno Mill) 등에 의해 세포를 파쇄하여 무세포 추출액을 얻는다. 이 무세포 추출액을 원심분리함으로써 얻어지는 상청에서 통상적인 효소의 단리 정제법, 즉 용매 추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸 (DEAE)-세파로오스, DIAION HPA-75 (미츠비시카세이사 제조) 등의 레진을 사용한 음이온교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF (Pharmacia 사 제조) 등의 레진을 사용한 양이온교환 크로마토그래피법, 부틸 세파로오스, 페닐 세파로오스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자 체를 사용한 겔 여과법, 어피니티 크로마토그래피, 크로마토포커싱법, 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 수법을 단독 또는 조합하여 사용하여 정제 표품을 얻을 수 있다.
또, 이 단백질이 세포 내에 불용체를 형성하여 발현된 경우는 마찬가지로 세포를 회수 후, 파쇄하여 원심분리함으로써 침전획분으로서 단백질의 불용체를 회수한다. 회수된 단백질의 불용체를 단백질 변성제로 가용화시킨다. 이 가용화액을 희석 또는 투석하여 이 가용화액 중의 단백질 변성제의 농도를 낮춤으로써 이 단백질을 정상적인 입체구조로 복귀시킨다. 이 조작 후, 상기와 동일한 단리 정제법에 의해 이 단백질의 정제 표품을 얻을 수 있다.
본 발명의 단백질, 또는 이 단백질에 당질이 부가된 단백질 등의 유도체가세포 밖에 분비된 경우에는 배양상청에서 이 단백질 또는 이 단백질의 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 이 배양물을 상기와 동일한 원심분리 등의 수법에 의해 처리함으로써 배양상청을 취득하고, 이 배양상청에 상기와 동일한 단리 정제법을 사용함으로써 정제 표품을 얻을 수 있다.
이와 같이 하여 취득되는 단백질로서, 예컨대 서열번호 2 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 들 수 있다.
또, 본 발명의 단백질은 Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학합성법에 의해 제조할 수 있다. 또, Advanced ChemTech 사, 퍼킨 엘머사, Pharmacia 사, Protein Technology Instrument 사, Synthecell-Vega 사, PreSeptive 사, 시마즈세이사쿠쇼 등의 펩티드합성기를 이용하여 화학합성할 수도 있다.
[3] 푸코오스 함유 당질의 제조
상기 [2] 에 기재된 배양에 의해 얻어진 형질전환체의 배양액 및 이 배양액을 다양하게 처리한 배양액의 처리물을 효소원으로서 사용하여, 수성 매체 중에서 푸코오스 함유 당질을 제조할 수 있다.
배양액의 처리물로서는, 배양액의 농축물, 배양액의 건조물, 배양액을 원심분리하여 얻어지는 균체, 이 균체의 건조물, 이 균체의 동결 건조물, 이 균체의 계면활성제 처리물, 이 균체의 초음파 처리물, 이 균체의 기계적 마쇄 처리물, 이 균체의 용매 처리물, 이 균체의 효소 처리물, 이 균체의 단백질 분획물, 이 균체의 고정화물 또는 이 균체에서 추출하여 얻어지는 효소 표품 등을 들 수 있다.
푸코오스 함유 당질의 생성에서 사용되는 효소원은, 37℃ 에서 1 분간에 1μ몰의 푸코오스 함유 당질을 생성할 수 있는 활성을 1 단위 (U) 로서, 0.1mU/L ∼ 10,000U/L 이며, 바람직하게는 1mU/L ∼ 1,000U/L 의 농도로 사용한다.
푸코오스 함유 당질의 생성에서 사용되는 수성 매체로서는, 물, 인산염, 탄산염, 아세트산염, 붕산염, 시트르산염, 트리스 등의 완충액, 메탄올, 에탄올 등의 알콜류, 아세트산에틸 등의 에스테르류, 아세톤 등의 케톤류, 아세트아미드 등의 아미드류 등을 들 수 있다. 또, 효소원으로서 사용한 미생물의 배양액을 수성 매체로서 사용할 수 있다.
푸코오스 함유 당질의 생성에서 필요에 따라 계면활성제 또는 유기용매를 첨가해도 된다. 계면활성제로서는, 폴리옥시에틸렌 옥타데실아민 (예컨대 나이민 (Nymeen) S-215, 닛폰유시사 제조) 등의 비이온 계면활성제, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드나 알킬디메틸 벤질암모늄 클로라이드 (예컨대 양이온 (Cation) F2-40E, 닛폰유시사 제조) 등의 양이온계 계면활성제, 라우로일 사르코시네이트 등의 음이온계 계면활성제, 알킬디메틸아민 (예컨대 3 급 아민 FB, 닛폰유시사 제조) 등의 3 급 아민류 등, 푸코오스 함유 당질의 생성을 촉진시키는 것이면 어느 것이어도 되며, 1 종 또는 복수 종을 혼합하여 사용할 수도 있다. 계면활성제는 통상 0.1 ∼ 50g/L 의 농도로 사용된다. 유기용제로서는, 자일렌, 톨루엔, 지방족 알콜, 아세톤, 아세트산에틸 등을 들 수 있고, 통상 0.1 ∼ 50㎖/L 의 농도로 사용된다.
푸코오스 함유 당질의 생성에서 사용되는 당뉴클레오티드 기질인 구아노신 이인산 푸코오스 (GDP-Fuc) 로서는, 시판품 외에 미생물 등의 활성을 이용하여 생성된 반응액 또는 이 반응액에서 정제된 것을 사용할 수 있다.
이 당뉴클레오티드 기질은 0.1 ∼ 500m㏖/L 의 농도로 사용된다.
푸코오스 함유 당질의 생성에서 사용되는 수용체 당질로서는, 당전이효소 기질로 되는 것이면 모두 사용할 수 있고, 예컨대 락토오스, N-아세틸락토사민, 루이스 X, 루이스 a, Galβ1-4[Fucα1,3]GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(LNFPⅢ) 외에, 비환원 말단에 갈락토오스 또는 N-아세틸락토사민구조를 갖는 10 당 이하의 올리고당 등을 예시할 수 있다.
이 수용체 당질은 0.1 ∼ 500m㏖/L 의 농도로 사용된다.
이 생성반응에 필요에 따라 MnCl2등의 무기염, β-메르캅토에탄올 등을 첨가할 수 있다.
푸코오스 함유 당질의 생성반응은 수성 매체 중, pH 5 ∼ 10, 바람직하게는 pH 6 ∼ 8, 20 ∼ 50℃ 의 조건에서 1 ∼ 96 시간 실시한다.
수성 매체 중에 생성된 푸코오스 함유 당질의 정량은 공지된 방법에 준하여 실시할 수 있다 [화학과 공업, 43, 953 (1990)].
반응액 중에 생성된 푸코오스 함유 당질의 채취는 활성탄이나 이온교환수지 등을 사용하는 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있고, 예컨대 2'-푸코실락토오스에서는 J. Org. Chem., 47, 5416 (1982) 에 기재된 방법에 준하여 실시할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어지는 푸코오스 함유 당질로서는, 푸코실락토오스, 푸코실 N-아세틸락토사민, 루이스 Y, 루이스 b 등을 예시할 수 있다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
실시예 1. α1,2-푸코오스 전이효소 발현주의 작성
α1,2-푸코오스 전이효소의 아미노산 서열로서, 서열번호 2 에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 헬리코박터 필로리 (UA802) 의 α1,2-푸코오스 전이효소 아미노산 서열 (GenBank: AF076779) 을 선택하고, 대장균 코돈의 사용빈도 [Codon Usage database at kazusa (http://www.kazusa.or.jp/codon/)] 를 고려하여 가장 사용빈도가 높은 코돈으로 구성되는 DNA 서열로 변환하고, 서열번호 1 에 나타내는 DNA 서열을 설계하였다. 설계된 염기 서열에 기초하여, 이웃하는 합성 DNA 가 서로 20 염기의 중복서열을 가지며, 또한 이들이 센스 사슬, 안티센스 사슬로 교대로 되도록 서열번호 3 내지 서열번호 16 에 기재된 DNA 를 퍼셉티브 바이오시스템즈사 제조 8905 형 DNA 합성장치를 사용하여 합성하였다. 또 말단에 벡터에 클로닝하기 위한 제한효소 인식서열을 함유하는 서열번호 17 및 18 에 기재된 DNA 도 동일하게 합성하였다.
각 DNA 를 최종 농도가 0.02μ㏖/L 가 되도록 50㎕ 의 16m㏖/L 황산암모늄, 10m㏖/L 염화칼륨, 1m㏖/L 염화마그네슘, 20m㏖/L 트리스-염산 (pH 8.0), 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 200μ㏖/L dNTPs 및, 2.5 단위의 KOD DNA 폴리머라아제 (도요보사 제조) 로 이루어지는 완충액에 첨가하고, 50㎕ 의 광유로 덮어 DNA 서멀 사이클러 (PJ480, PERKIN ELMER 사 제조) 에 세트하고, 94℃ 에서 30 초간, 50℃ 에서 30 초간, 74℃ 에서 60 초간의 사이클을 30 사이클 실시하여, 약 0.9kb 의 PCR 산물을 취득하였다.
이 PCR 산물 0.5㎍ 을 제한효소 ClaⅠ 및 HindⅢ 로 절단 후, 제한효소 ClaⅠ 및 HindⅢ 로 절단한 pBluescriptⅡ SK(+) DNA 0.2㎍ (Stratagene 사 제조) 과 함께 라이게이션 키트 (다카라슈조사 제조) 를 사용하여 16℃, 16 시간, 연결반응하였다.
이 연결반응액을 이용하여 대장균 nm522 주를 전술한 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 이 형질전환체를 앰피실린 50㎍/㎖ 를 함유하는 LB 한천배지 [박토트립톤 (디푸코사 제조) 10g/L, 효모 추출물 (디푸코사 제조) 5g/L, NaCl 5g/L (pH 7.2), 한천 15g/L] 에 도포 후, 30℃ 에서 하룻밤 배양하였다.
생육된 형질전환체의 콜로니에서, 통상법에 의해 플라스미드를 추출하여 플라스미드 pGT32 를 얻었다.
이어서, 얻어진 플라스미드 pGT32 0.5㎍ 을 제한효소 ClaⅠ 및 SacⅠ로 절단 후, 아가로오스 겔 전기영동으로 분리시킨 약 0.9kb 의 ClaⅠ- SacⅠ DNA 단편을, 제한효소 ClaⅠ 및 SacⅠ로 절단한 pTrS30 0.2㎍ (다카라슈조사 제조) 과 함께 라이게이션 키트 (다카라슈조사 제조) 를 사용하여 16℃ 에서 16 시간, 연결반응하였다.
이 연결반응액을 이용하여 대장균 nm522 주를 전술한 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 이 형질전환체를 앰피실린 50㎍/㎖ 를 함유하는 LB 한천배지 [박토트립톤 (디푸코사 제조) 10g/L, 효모 추출물 (디푸코사 제조) 5g/L, NaCl 5g/L (pH 7.2), 한천 15g/L] 에 도포 후, 30℃ 에서 하룻밤 배양하였다.
생육된 형질전환체의 콜로니에서, 통상법에 의해 플라스미드를 추출하여 플라스미드 pGT35 를 얻었다. 이 플라스미드의 구조를 해석한 결과, 플라스미드 pTrS30 의 ClaⅠ 과 SacⅠ 부위에 0.9kb 가 전체 합성된 DNA 단편이 삽입된 도 1 에 나타내는 구조를 나타냈다.
이 0.9kb 삽입 단편의 DNA 염기 서열을 결정한 결과, 서열목록의 서열번호 1 에 나타내는 바와 같은 오픈 리딩 프레임 (ORF) 이 발견되었다.
상기에서 얻은 플라스미드 pGT35 를 사용하여 대장균 nm522 주를 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 이 형질전환체를 앰피실린 50㎍/㎖ 를 함유하는 LB 한천배지에 도포 후, 30℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 생육된 형질전환체를 선택함으로써 α1,2-푸코오스 전이효소 유전자 발현주인 대장균 NM522/pGT35 를 얻었다.
실시예 2. glk, manB, manC, pgm, pfkB 유전자 발현주의 작성
서열번호 19 에 기재된 DNA 프라이머와 서열번호 20 에 기재된 DNA 를 퍼셉티브 바이오시스템즈사 제조 8905 형 DNA 합성기를 사용하여 합성하였다.
상기 합성 DNA 를 프라이머 세트로서 사용하고, glk 유전자를 함유하는 플라스미드 pNT46 (WO98/12343) DNA 를 주형으로서 PCR 을 실시하였다. PCR 은 pNT46 DNA 1ng, 프라이머 각 0.5μ㏖/L, Pfu DNA 폴리머라아제 (스트라타진사 제조) 2.5 단위, Pfu DNA 폴리머라아제용 ×10 완충액 (스트라타진사 제조) 4㎕, 디옥시 NTP 각 200μ㏖/L 를 함유하는 반응액 40㎕ 를 사용하여, 94℃ 에서 1 시간, 42℃ 에서 2 분간, 72℃ 에서 3 분간의 공정을 30 회 반복하여 실시하였다.
이 반응액의 1/10 양을 아가로오스 겔 전기영동하여 목적하는 단편이 증폭하고 있음을 확인 후, 나머지 반응액과 등량의 TE [10m㏖/L Tris-HCl (pH 8.0),1m㏖/L EDTA] 포화 페놀/클로로포름 (1 vol/1 vol) 을 첨가하여 혼합하였다.
이 혼합액을 원심분리 후, 얻어진 상층에 2 배 용량의 냉에탄올을 첨가하여 혼합하고, -80℃ 에 30 분간 방치하였다. 이 방치액을 원심분리하여 DNA 의 침전을 얻었다.
이 DNA 의 침전을 20㎕ 의 TE 에 용해시켰다. 이 용해액 5㎕ 를 사용하여 DNA 를 제한효소 BglⅡ 및 SalⅠ 로 절단하고, 아가로오스 겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 분리시킨 후, 진 클린 (Gene Clean) Ⅱ 키트에 의해 glk 유전자를 함유하는 1.3kb 의 DNA 단편을 회수하였다.
manB 및 manC 발현 플라스미드인 pNK7 (WO98/12343) 0.2㎍ 을 제한효소 BamHⅠ 및 SalⅠ 로 절단 후, 아가로오스 겔 전기연동에 의해 DNA 단편을 분리하여 동일하게 8.2kb 의 단편을 회수하였다.
이 1.3kb 및 8.2kb 의 단편을 라이게이션 키트를 사용하여 16℃ 에서 16 시간, 연결반응하였다. 이 연결반응액을 사용하여 대장균 nm522 주를 전술한 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 이 형질전환체를 앰피실린 50㎍/㎖ 를 함유하는 LB 한천배지에 도포 후, 30℃ 에서 하룻밤 배양하였다.
생육된 형질전환체의 콜로니에서 전술한 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하여 glk, manB, manC 유전자 발현 플라스미드인 pNK11 를 얻었다. 이 플라스미드의 구조를 제한효소 소화에 의해 확인하였다 (도 2).
상기에서 얻은 플라스미드 pNK11 DNA 를 사용하여 대장균 NM522/pNT55 주 (WO98/12343) 를 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 이 형질전환체를 앰피실린 50㎍/㎖ 및 클로람페니콜 10㎍/㎖ 를 함유하는 LB 한천배지에 도포 후, 30℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 생육된 형질전환체를 선택함으로써 glk, manB, manC, pgm, pfkB 유전자 동시 발현주인 대장균 NM522/pNK11/pNT55 를 얻었다.
실시예 3. 대장균 유래 gmd 유전자 발현주의 작성
대장균 W3110 (ATCC27325) 주를 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올러지에 기재된 방법에 따라 배양 후, 이 미생물의 염색체 DNA 를 단리 정제하였다.
퍼셉티브 바이오시스템즈사 제조 8905 형 DNA 합성기를 사용하여 합성된 서열번호 21 및 22 에 기재된 DNA 를 프라이머 세트로서 사용하고, 대장균 W3110 (ATCC27325) 주의 염색체 DNA 0.1㎍ 을 주형으로서 실시예 1 에 기재된 방법에 따라 PCR 반응을 실시하였다.
이 반응액의 1/10 양을 아가로오스 겔 전기영동하여 목적으로 하는 단편이 증폭하고 있음을 확인 후, 나머지 반응액과 등량의 TE 포화 페놀/클로로포름을 첨가하여 혼합하였다.
이 혼합액을 원심분리 후, 얻어진 상층에 2 배 용량의 냉에탄올을 첨가하여 혼합하고, -80℃ 에 30 분간 방치하였다. 이 방치액을 원심분리하여 DNA 의 침전을 얻었다.
이 DNA 의 침전을 20㎕ 의 TE 에 용해시켰다. 이 용해액 5㎕ 를 사용하여 DNA 를 제한효소 HindⅢ 및 XbaⅠ 로 절단하고, 아가로오스 겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 분리한 후, 진 클린Ⅱ 키트에 의해 gmd 유전자를 함유하는 1.1kb 의 DNA 단편을 회수하였다.
퍼셉티브 바이오시스템즈사 제조 8905 형 DNA 합성기를 사용하여 합성된 서열번호 23 및 24 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 를 프라이머 세트로서 사용하고, trp 프로모터를 함유하는 플라스미드인 pTrS30 (FERM BP-5407) 을 주형으로서 실시예 1 에 기재된 방법에 따라 PCR 반응을 실시하였다.
이 반응액의 1/10 양을 아가로오스 겔 전기영동하여 목적으로 하는 단편이 증폭하고 있음을 확인 후, 나머지 반응액과 등량의 TE 포화 페놀/클로로포름을 첨가하여 혼합하였다.
이 혼합액을 원심분리 후, 얻어진 상층에 2 배 용량의 냉에탄올을 첨가하여 혼합하고, -80℃ 에 30 분간 방치하였다. 이 방치액을 원심분리하여 DNA 의 침전을 얻었다.
이 DNA 의 침전을 20㎕ 의 TE 에 용해시켰다. 이 용해액 5㎕ 를 사용하여 DNA 를 제한효소 EcoRⅠ 및 XbaⅠ 로 절단하고, 아가로오스 겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 분리한 후, 동일하게 0.4kb 의 DNA 단편을 회수하였다.
pBluescriptⅡ SK+ 0.2㎍ 을 제한효소 EcoRⅠ 및 HindⅢ 로 절단 후, 아가로오스 겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 분리하여 동일하게 3.0kb 의 DNA 단편을 회수하였다.
이 1.1kb, 0.4kb 및 3.0kb 의 단편을 라이게이션 키트를 사용하여 16℃ 에서 16 시간, 연결반응하였다.
이 연결반응액을 사용하여 대장균 nm522 주를 전술한 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 이 형질전환체를 앰피실린 50㎍/L 를 함유하는 LB 한천배지에 도포후, 30℃ 에서 하룻밤 배양하였다.
생육된 형질전환체의 콜로니에서 전술한 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하여 발현 플라스미드인 pGE19 를 얻었다. 이 플라스미드의 구조를 제한효소 소화에 의해 확인하였다 (도 3).
실시예 4. 대장균 유래의 wcaG 유전자 발현주의 작성
퍼셉티브 바이오시스템즈사 제조 8905 형 DNA 합성기를 사용하여 합성된 서열번호 25 및 26 에 기재된 DNA 를 프라이머 세트로서 사용하고, 대장균 W3110 (ATCC27325) 주의 염색체 DNA 를 주형으로서 실시예 1 에 기재된 방법에 따라 PCR 반응을 실시하였다.
이 반응액의 1/10 양을 아가로오스 겔 전기영동하여 목적으로 하는 단편이 증폭하고 있음을 확인 후, 나머지 반응액과 등량의 TE 포화 페놀/클로로포름을 첨가하여 혼합하였다.
이 혼합액을 원심분리 후, 얻어진 상층에 2 배 용량의 냉에탄올을 첨가하여 혼합하고, -80℃ 에 30 분간 방치하였다. 이 방치액을 원심분리하여 DNA 의 침전을 얻었다.
이 DNA 의 침전을 20㎕ 의 TE 에 용해시켰다. 이 용해액 5㎕ 를 사용하여 DNA 를 제한효소 ClaⅠ 및 XhoⅠ 로 절단하고, 아가로오스 겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 분리한 후, 진 클린Ⅱ 키트에 의해 wcaG 유전자를 함유하는 1.0kb 의 DNA 단편을 회수하였다.
pPAC31 0.2㎍ 을 제한효소 ClaⅠ 및 SalⅠ 로 절단 후, 아가로오스 겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 분리하여 동일하게 5.2kb 의 DNA 단편을 회수하였다.
이 1.0kb 및 5.2kb 의 단편을 라이게이션 키트를 사용하여 16℃ 에서 16 시간, 연결반응하였다.
이 연결반응액을 사용하여 대장균 nm522 주를 전술한 공지된 방법에 따라 형질전환하고, 이 형질전환체를 앰피실린 50㎍/L 를 함유하는 LB 한천배지에 도포 후, 30℃ 에서 하룻밤 배양하였다.
생육된 형질전환체의 콜로니에서 전술한 공지된 방법에 따라 플라스미드를 추출하여 발현 플라스미드인 pGE8 을 얻었다. 이 플라스미드의 구조를 제한효소 소화에 의해 확인하였다 (도 4).
실시예 5. 2'-푸코실락토오스의 생산 (1)
실시예 1 에서 얻어진 대장균 NM522/pGT35 주를 앰피실린 50㎍/㎖ 를 함유하는 LB 배지 8㎖ 가 들어 있는 큰 형태의 시험관에 접종하여 28℃ 에서 17 시간 배양하였다. 이 배양액을 앰피실린 50㎍/㎖ 를 함유하는 LB 배지 8㎖ 가 들어 있는 큰 형태의 시험관에 1% 접종하여 37℃ 에서 5 시간 배양하였다. 이 배양액 0.1㎖ 분을 원심분리하여 습균체를 취득하였다. 이 습균체는 필요에 따라 -20℃ 에서 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동하여 사용할 수 있다.
이 습균체 (0.1㎖ 분), 50mM 시트르산버퍼 (pH 7.0), 10m㏖/L MnCl2, 10m㏖/L 락토오스, 10m㏖/L GDP-Fuc, 0.4% 나이민 S-215 로 이루어지는 0.1㎖ 의 반응액 중에서 37℃ 에서 24 시간 반응시켰다.
반응 종료 후, 반응 생성물을 다이오넥스사 제조 당분석장치 (DX-500) 를 사용하여 분석하고, 반응액 중에 0.82m㏖/L (400㎎/L) 의 2'-푸코실락토오스가 생성 축적되어 있음을 확인하였다.
실시예 6. 2'-푸코실락토오스의 생산 (2)
실시예 1 에서 얻어진 대장균 NM522/pGT35 주를 앰피실린 50㎍/㎖ 를 함유하는 LB 배지 125㎖ 가 들어 있는 1L 용량의 배플이 부착된 삼각 플라스크에 접종하여 28℃ 에서 220rmp 의 조건에서 17 시간 배양하였다. 이 배양액 125㎖ 를 앰피실린 50㎎/L 를 함유하는 M9 배지 2.5L 가 들어 있는 5L 용량의 배양조에 접종하여 37℃ 에서 6 시간, 600rmp, 통기량 2.5L/분의 조건에서 배양하였다. 배양 중, 28% 암모니아수를 사용하여 배양액의 pH 를 7.0 으로 유지하고, 필요에 따라 글루코오스를 첨가하였다. 이 배양액을 원심분리하여 습균체를 취득하였다. 이 습균체는 필요에 따라 -20℃ 에서 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동하여 사용할 수 있다.
실시예 2 에서 얻어진 대장균 NM522/pNK11/pNT55 주를 앰피실린 50㎍/㎖ 및 클로람페니콜 10㎍/㎖ 를 함유하는 LB 배지 [박토트립톤 (디푸코사 제조) 10g/L, 효모 추출물 (디푸코사 제조) 5g/L, NaCl 5g/L (pH 7.3)] 125㎖ 가 들어 있는 1L 용량의 배플이 부착된 삼각 플라스크에 접종하여 28℃ 에서 220rpm 의 조건에서 17 시간 배양하였다. 이 배양액 125㎖ 를 앰피실린 50㎎/L 및 클로람페니콜 10㎎/L 를 함유하는 TB 배지 [글루코오스 10g/L, 박토트립톤 (디푸코사 제조)12g/L, 효모 추출물 (디푸코사 제조) 24g/L, KH2PO42.3g/L, K2HPO412.5g/L (pH 무조정)] 2.5L 가 들어 있는 5L 용량의 배양조에 접종하여 600rpm, 통기량 2.5L/분의 조건에서 30℃ 에서 4 시간 배양한 후, 40℃ 에서 3 시간 배양하였다. 배양 중, 28% 암모니아수를 사용하여 배양액의 pH 를 7.0 으로 유지하고, 필요에 따라 글루코오스를 첨가하였다. 이 배양액을 원심분리하여 습균체를 취득하였다. 이 습균체는 필요에 따라 -20℃ 에서 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동하여 사용할 수 있다.
실시예 3 에서 얻어진 대장균 NM522/pGE19 주를 앰피실린 50㎍/㎖ 를 함유하는 LB 배지 125㎖ 가 들어 있는 1L 용량의 배플이 부착된 삼각 플라스크에 접종하여 28℃ 에서 220rpm 의 조건에서 17 시간 배양하였다. 이 배양액 125㎖ 를 앰피실린 50㎍/㎖ 를 함유하는 TB 배지 2.5L 가 들어 있는 5L 용량의 배양조에 접종하여 37℃ 에서 6 시간, 600rpm, 통기량 2.5L/분의 조건에서 배양하였다. 배양 중, 28% 암모니아수를 사용하여 배양액의 pH 를 7.0 으로 유지하고, 필요에 따라 글루코오스를 첨가하였다. 이 배양액을 원심분리하여 습균체를 취득하였다. 이 습균체는 필요에 따라 -20℃ 에서 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동하여 사용할 수 있다.
실시예 4 에서 얻어진 대장균 NM522/pGE8 주를 앰피실린 50㎍/㎖ 를 함유하는 LB 배지 125㎖ 가 들어 있는 1L 용량의 배플이 부착된 삼각 플라스크에 접종하여 28℃ 에서 220rpm 의 조건에서 17 시간 배양하였다. 이 배양액 125㎖ 를 앰피실린 50㎍/㎖ 를 함유하는 TB 배지 2.5L 가 들어 있는 5L 용량의 배양조에 접종하여 600rpm, 통기량 2.5L/분의 조건에서 30℃ 에서 4 시간 배양한 후, 40℃ 에서 3 시간 배양하였다. 배양 중, 28% 암모니아수를 사용하여 배양액의 pH 를 7.0 으로 유지하고, 필요에 따라 글루코오스를 첨가하였다. 이 배양액을 원심분리하여 습균체를 취득하였다.
코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC21170 주를 글루코오스 50g/L, 폴리펩톤 (닛폰세이야쿠사 제조) 10g/L, 효모 추출물 (오리엔탈코보사 제조) 10g/L, 요소 5g/L, (NH4)2SO45g/L, KH2PO41g/L, K2HPO43g/L, MgSO4ㆍ7H2O 1g/L, CaCl2ㆍ2H2O 0.1g/L, FeSO4ㆍ7H2O 10㎎/L, ZnSO4ㆍ7H2O 10㎎/L, MnSO4ㆍ4 ∼ 6 H2O 20㎎/L, L-시스테인 20㎎/L, D-판토텐산칼슘 10㎎/L, 비타민 B1 5㎎/L, 니코틴산 5㎎/L, 및 비오틴 30㎍/L (10㏖/L NaOH 로 pH 7.2 로 조정) 의 조성으로 이루어지는 액체 배지 25㎖ 가 들어 있는 300㎖ 용량의 배플이 부착된 삼각 플라스크에 접종하여 28℃, 220rpm 의 조건에서 24 시간 배양하였다.
이 배양액 20㎖ 를 상기와 동일 조성의 액체 배지 250㎖ 가 들어 있는 2L 용 량의 배플이 부착된 삼각 플라스크에 접종하여 28℃, 220rpm 의 조건에서 24 시간 배양하였다. 얻은 배양액을 종(種)배양액으로서 사용하였다.
이 종배양액 250㎖ 를 글루코오스 150g/L, 고기 추출물 (교쿠도세이야쿠사 제조) 5g/L, KH2PO410g/L, K2HPO410g/L, MgSO4ㆍ7H2O 10g/L, CaCl2ㆍ2H2O 0.1g/L, FeSO4ㆍ7H2O 20㎎/L, ZnSO4ㆍ7H2O 10㎎/L, MnSO4ㆍ4 ∼ 6 H2O 20㎎/L (별도 멸균),β-알라닌 15㎎/L (별도 멸균), L-시스테인 20㎎/L, 비오틴 100㎍/L, 요소 2g/L, 및 비타민 B1 5㎎/L (별도 멸균) (10㏖/L NaOH 로 pH 7.2 로 조정) 의 조성으로 이루어지는 액체 배지 2.25L 가 들어 있는 5L 용량의 배양조에 접종하여 32℃, 600rpm, 통기량 2.5L/분 의 조건에서 24 시간 배양하였다. 배양 중, 28% 암모니아수를 사용하여 배양액의 pH 를 6.8 로 유지하였다.
이 배양액을 원심분리하여 습균체를 취득하였다. 이 습균체는 필요에 따라 -20℃ 에서 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동하여 사용할 수 있다.
대장균 NM522/pNK11/pNT55 주 습균체 25g/L, 대장균 NM522/pGE19 주 습균체 15g/L, 대장균 NM522/pGE8 주 습균체 15g/L, 대장균 NM522/pGT35 주 습균체 50g/L, 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC21170 주 습균체 150g/L, 프룩토오스 100g/L, 만노오스 30g/L, 락토오스 100g/L, GMP 30g/L, KH2PO425g/L, MgSO4ㆍ7H2O 5g/L, 피틴산 (phytic acid) 5g/L, 나이민 S-215 4g/L, 자일렌 10㎖/L 의 조성으로 이루어지는 반응액 30㎖ 를 200㎖ 용 비커에 넣어, 이 반응액을 마그네틱 스터러로 교반 (900rmp) 하고, 32℃ 에서 48 시간 반응시켰다. 반응중, 4㏖/L NaOH 를 사용하여 이 반응액의 pH 를 7.2 로 유지하고, 필요에 따라 프룩토오스, KH2PO4를 첨가하였다.
반응 종료 후, 반응 생성물을 HPLC 를 사용하여 분석하여, 반응액 중에 13.4g/L 의 2'-푸코실락토오스가 생성 축적되어 있음을 확인하였다.
실시예 7. 락토-N-네오디푸코헥사오스Ⅰ 의 생산
실시예 1 에서 얻어진 대장균 NM522/pGT35 주를 앰피실린 50㎍/㎖ 를 함유하는 LB 배지 8㎖ 가 들어 있는 큰 형태의 시험관에 접종하여 28℃ 에서 17 시간 배양하였다.
이 배양액을 앰피실린 50㎍/㎖ 를 함유하는 LB 배지 8㎖ 가 들어 있는 큰 형태의 시험관에 1% 접종하여 37℃ 에서 5 시간 배양하였다.
이 배양액을 0.1㎖ 분을 원심분리하여 습균체를 취득하였다. 이 습균체는 필요에 따라 -20℃ 에서 보존할 수 있으며, 사용 전에 해동하여 사용할 수 있다.
이 습균체 (0.1㎖ 분), 50m㏖/L 시트르산버퍼 (pH 7.0), 10m㏖/L MnCl2, 10m㏖/L GDP-Fuc, 0.4% 나이민 S-215 및 락토-N-네오푸코펜타오스Ⅲ (LNFPⅢ) 을 10m㏖/L 함유하는 반응액 0.1㎖ 중에서 37℃, 24 시간 반응시켰다.
반응 종료 후 반응 생성물을 다이오넥스사 제조 당분석장치 (DX-500) 를 사용하여 분석하여, 반응액 중에 2.9m㏖/L (1.4g/L) 의 락토-N-네오디푸코헥사오스Ⅰ 이 생성 축적되어 있음을 확인하였다.
본 발명에 의해 α1,2-푸코오스 전이효소를 유전자 재조합 수법에 의해 대량으로 생산할 수 있게 된다. 또, 이 효소를 사용함으로써, 2'-푸코실락토오스 등의 푸코오스 함유 당질을 효율적으로 제조할 수 있다.
「서열 프리 텍스트」
서열번호 1-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 3-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 4-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 5-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 6-인공서열의 설명: 합성 DNA
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서열번호 10-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 11-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 12-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 13-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 14-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 15-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 16-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 17-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 18-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 19-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 20-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 21-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 22-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 23-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 24-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 25-인공서열의 설명: 합성 DNA
서열번호 26-인공서열의 설명: 합성 DNA

Claims (30)

  1. 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori) 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 에 있서, 이 DNA 중에 존재하는
    (a) 폴리 C 서열,
    (b) TAA 유사 리피트 서열,
    (c) AAAAAAG 서열에서 선택되는 염기 서열 중 하나 이상의 염기 서열에서, 1 개 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열을 갖는 DNA 이며, 또한 이 DNA 가 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
  2. 제 1 항에 있어서, 치환이 청구항 1 에 기재된 DNA 를 발현시키는 숙주세포에서 사용빈도가 높은 코돈으로 개변되는 치환인 DNA.
  3. 헬리코박터 필로리 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 에 있어서, 하나 이상의 코돈을 이 DNA 를 발현시키는 숙주세포에서 사용빈도가 높은 코돈으로 개변하여 얻어지는 염기 서열을 갖는 DNA.
  4. 제 3 항에 있어서, 개변이 헬리코박터 필로리 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 중에 존재하는
    (a) 폴리 C 서열,
    (b) TAA 유사 리피트 서열,
    (c) AAAAAAG 서열에서 선택되는 염기 서열 중 하나 이상의 염기 서열에서의 개변인 DNA.
  5. 제 3 항에 있어서, 헬리코박터 필로리 유래의 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 에서, 전체 코돈을 이 DNA 를 발현시키는 숙주세포에서 사용빈도가 높은 코돈으로 개변하여 얻어지는 염기 서열을 갖는 DNA 인 DNA.
  6. 서열번호 1 에 기재된 염기 서열로 표시되는 DNA.
  7. 서열번호 1 에 기재된 염기 서열로 표시되는 DNA 에서 1 개 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 또한 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 에서 선택되는 DNA 를 벡터에 연결하여 얻어지는 재조합체 DNA.
  9. 제 8 항에 기재된 재조합체 DNA 를 숙주세포에 도입하여 얻어지는 형질전환체.
  10. 제 9 항에 있어서, 숙주세포가 미생물인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  11. 제 10 항에 있어서, 미생물이 에쉐리키아속에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  12. 제 11 항에 있어서, 에쉐리키아속에 속하는 미생물이 대장균 (Escherichia coli) 인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  13. 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 형질전환체에서 선택되는 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질을 생성 축적시켜, 이 배양물에서 이 단백질을 채취하는 것을 특징으로 하는 α1,2-푸코오스 전이효소 활성을 갖는 단백질의 제조법.
  14. 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 형질전환체에서 선택되는 형질전환체의 배양액 또는 이 배양액의 처리물을 효소원으로 사용하여, 이 효소원, 수용체 당질 및 구아노신이인산 푸코오스 (이하, GDP-푸코오스로 약기함) 를 수성 매체 중에 존재시키고, 이 수성 매체 중에서 푸코오스를 α1,2 결합으로 수용체 당질로 전이시킴으로써 푸코오스 함유 당질을 생성 축적시켜, 이 수성 매체 중에서 푸코오스 함유 당질을 채취하는 것을 특징으로 하는 푸코오스 함유 당질의 제조법.
  15. 제 14 항에 있어서, 구아노신-5'-삼인산 (이하, GTP 로 약기함) 의 전구물질로부터 GTP 를 생성하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 이 배양액의 처리물, 당과 GTP 로부터 GDP-푸코오스를 생성하는 능력을 갖는 미생물의 배양액 또는 이 배양액의 처리물, 및 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 형질전환체에서 선택되는 형질전환체의 배양액 또는 이 배양액의 처리물을 효소원으로 사용하여, 이들 효소원, 상기 전구물질, 당 및 수용체 당질을 수성 매체 중에 존재시키고, 이 수성 매체 중에서 푸코오스 함유 당질을 생성 축적시켜, 이 수성 매체 중에서 푸코오스 함유 당질을 채취하는 것으로 이루어지는 푸코오스 함유 당질의 제조법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 수용체 당질이 비환원 말단에 갈락토오스를 갖는 10 당 이하의 올리고당을 함유하는 당질인 푸코오스 함유 당질의 제조법.
  17. 제 16 항에 있어서, 올리고당이 락토오스, N-아세틸락토사민, 루이스 X, 또는 루이스 a 인 것을 특징으로 하는 푸코오스 함유 당질의 제조법.
  18. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 푸코오스 함유 당질이 푸코실락토오스, 푸코실 N-아세틸락토사민, 루이스 Y, 또는 루이스 b 인 것을 특징으로 하는 푸코오스 함유 당질의 제조법.
  19. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 배양액의 처리물이 배양액의 농축물, 배양액의 건조물, 배양액을 원심분리하여 얻어지는 균체, 이 균체의 건조물, 이 균체의 동결 건조물, 이 균체의 계면활성제 처리물, 이 균체의 초음파 처리물, 이 균체의 기계적 마쇄 처리물, 이 균체의 용매 처리물, 이 균체의 효소 처리물, 이 균체의 단백질 분획물, 이 균체의 고정화물 또는 이 균체에서 추출하여 얻어지는 효소 표품인 푸코오스 함유 당질의 제조법.
  20. 제 15 항에 있어서, 전구물질이 구아닌, 크산틴, 히포크산틴, 구아노신, 크산토신, 이노신, 구아노신-5'-일인산, 크산토신-5'-일인산 또는 이노신-5'-일인산인 푸코오스 함유 당질의 제조법.
  21. 제 15 항에 있어서, 당이 글루코오스, 프룩토오스 및 만노오스에서 선택되는 당인 푸코오스 함유 당질의 제조법.
  22. 제 15 항에 있어서, 전구물질로부터 GTP 를 생성하는 능력을 갖는 미생물이 코리네박테리움속에 속하는 미생물에서 선택되는 미생물인 푸코오스 함유 당질의 제조법.
  23. 제 22 항에 있어서, 코리네박테리움속에 속하는 미생물이 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) 인 푸코오스 함유 당질의 제조법.
  24. 제 15 항에 있어서, 당과 GTP 로부터 GDP-푸코오스를 생성하는 능력을 갖는 미생물이 하나 이상의 미생물로 구성되는 푸코오스 함유 당질의 제조법.
  25. 제 24 항에 있어서, 미생물이 에쉐리키아속 또는 코리네박테리움속에 속하는 미생물에서 선택되는 미생물인 푸코오스 함유 당질의 제조법.
  26. 제 25 항에 있어서, 에쉐리키아속에 속하는 미생물이 대장균인 푸코오스 함유 당질의 제조법.
  27. 제 25 항에 있어서, 코리네박테리움속에 속하는 미생물이 코리네박테리움 암모니아게네스인 푸코오스 함유 당질의 제조법.
  28. 제 15 항에 있어서, 당과 GTP 로부터 GDP-푸코오스를 생성하는 능력을 갖는 미생물이 글루코키나아제, 포스포만노뮤타아제, 만노오스-1-인산 구아닐릴 트랜스퍼라아제, 포스포글루코뮤타아제, 포스포프룩토키나아제, GDP-만노오스 4,6-디히드라타아제 및 GKDM 에피머라아제/리덕타아제에서 선택되는 하나 이상의 효소 활성이 강한 미생물인 푸코오스 함유 당질의 제조법.
  29. 제 28 항에 있어서, 미생물이 글루코키나아제를 코드하는 유전자 (이하, glk유전자로 약기함), 포스포만노뮤타아제를 코드하는 유전자 (이하, manB 유전자로 약기함), 만노오스-1-인산 구아닐릴 트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자 (이하, manC 유전자로 약기함), 포스포글루코뮤타아제를 코드하는 유전자 (이하, pgm 유전자로 약기함), 포스포프룩토키나아제를 코드하는 유전자 (이하, pfk 유전자로 약기함), GDP-만노오스 4,6-디히드라타아제를 코드하는 유전자 (이하, gmd 유전자로 약기함) 및 GKDM 에피머라아제/리덕타아제를 코드하는 유전자 (이하, wcaG 유전자로 약기함) 에서 선택되는 1 종 이상의 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터의 재조합체 DNA 를 보유하는 하나 이상의 미생물로 구성되는 푸코오스 함유 당질의 제조법.
  30. 제 29 항에 있어서, glk 유전자, manB 유전자, manC 유전자, pgm 유전자, pfk 유전자, gmd 유전자 및 wcaG 유전자가 대장균 유래의 유전자인 푸코오스 함유 당질의 제조법.
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