JP4188561B2 - 糖転移酵素および該酵素をコードするｄｎａ - Google Patents
糖転移酵素および該酵素をコードするｄｎａ Download PDFInfo
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Description
技術分野
本願発明は、β１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いたβ１，４−ガラクトース転移酵素の製造法、および該形質転換体を用いたガラクトース含有糖質の製造法に関する。
背景技術
β１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子に関して、動物由来の遺伝子〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１０４２０（１９８８）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．，１５７，６５７（１９８８）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８３，２１１（１９８９）〕、ナイセリア・ガナリーア由来の遺伝子〔ＷＯ ９６／１００８６〕およびストレプトコッカス・ニューモニエ由来の遺伝子〔Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２６，１９７（１９９７）〕が取得されている。
また、ヘリコバクター・ピロリのリポ多糖のＯ抗原は哺乳動物のルイスＸ〔Ｇａｌ β １−４（Ｆｕｃ α １−３）ＧｌｃＮＡｃ〕およびルイスＹ〔Ｆｕｃ α １−２Ｇａｌ β １−４（Ｆｕｃ α １−３）ＧｌｃＮＡｃ〕エピトープと同じ構造を有しており、ヘリコバクター・ピロリにおいてβ１，４−ガラクトース転移酵素活性の存在が予測されている〔Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，６８３（１９９５）］。該微生物において、既知のβ１，４−ガラクトース転移酵素と相同性の高いタンパク質は知られておらず、β１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子は特定されていない〔Ｎａｔｕｒｅ，３８８，５３９（１９９７）〕。
発明の開示
本願発明の目的は、β１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを用いたβ１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質の製造法、および該蛋白質を用いたガラクトース含有糖質の製造法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ヘリコバクター・ピロリのゲノムライブラリーからβ１，４−ガラクトース転移酵素の活性を指標にしたスクリーニングを行うことにより、これまで特定されていなかった該糖転移酵素遺伝子を取得し、その配列決定をして、本願発明を完成するに至った。
即ち、本願発明の第１の発明は、
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質：
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）（ａ）の蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質である。
上記のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができ、また、１若しくは数個のアミノ酸とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換若しくは付加できる程度の数のアミノ酸を意味する。
かかる１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することができる。
本願発明の第２の発明は、上記蛋白質をコードするＤＮＡ、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡからなるＤＮＡである。
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本願発明の第３の発明は、上記ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡである。
本願発明の第４の発明は、上記組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体である。
本願発明の第５の発明は、上記形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法である。
本願発明の第６の発明は、上記形質転換体の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該酵素源、糖基質およびウリジン二リン酸ガラクトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でガラクトースをβ１，４結合で糖基質に転移させることによりガラクトース含有糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中からガラクトース含有糖質を採取することを特徴とするガラクトース含有糖質の製造法である。
以下に本願発明を詳細に説明する。
［１］本願発明のＤＮＡの調製
（１）ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
本願発明のＤＮＡはヘリコバクター属に属する微生物より調製することができる。
ヘリコバクター属に属する微生物としては、例えばヘリコバクター・ピロリをあげることができ、具体的にはヘリコバクター・ピロリＮＣＴＣ１１６３７株等をあげることができる。
ヘリコバクター属に属する微生物を公知の方法〔例えば、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０，８３３（１９９６）〕により培養する。
培養後、公知の方法（例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。
得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、シュークロース密度勾配超遠心分離等の手法によりＤＮＡ断片を分画し、２〜６ｋｂのＤＮＡ断片を回収する。
常法〔例えば、モレキュラー・クローニング第２版等〕に準じて、該回収ＤＮＡ断片を、大腸菌用発現ベクターのプロモーターの下流に挿入した組換え体ＤＮＡを作成し、該組換え体ＤＮＡを大腸菌に導入することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製することができる。
発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社）、ｐＧＥＭＥＸ−１〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕、ｐＱＥ−８（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋（ストラタジーン社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。
大腸菌としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）〕等をあげることができる。
（２）スクリーニングおよび本願発明のＤＮＡの調製
上記で作製したゲノムＤＮＡライブラリーの大腸菌を通常の方法［例えば、ＬＢ培地〔バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ（ｐＨ７．２）〕を用い、２０〜４５℃で５〜２４時間］培養する。
培養後、培養液を遠心分離し、湿菌体を取得する。
該湿菌体を用い、β１，４−ガラクトース転移酵素活性を指標として、β１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子を有する大腸菌をスクリーニングする。該スクリーニング法は公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，，２８２７１（１９９６）〕に準じて、あるいは下記の方法で行うことができる。
該湿菌体、５０ｍＭ ＭＥＳ〔２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ〕（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭウリジン二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）、０．４％ナイミーンＳ−２１５および後述の参考例１に準じた方法で調製したＬＮＴ−２（ＧｌｃＮＡｃ β １−３Ｇａｌ β １−４Ｇｌｃ）の蛍光標識体を０．２ｍＭ含む反応液０．０２ｍｌ中で３７℃で１６時間反応を行う。
反応終了後、遠心分離により菌体を除去し、上清を取得する。
該上清をシリカゲル−６０ＴＬＣプレート（メルク社製）上に乗せ、酢酸エチル：メタノール：水：酢酸＝７：２：１：０．１で展開し、展開終了後プレートを乾燥し、ＵＶ３６５ｎｍによりスポットの確認を行う。
大腸菌湿菌体の代わりにβ１，４−ガラクトース転移酵素（シグマ社製）を用い同様の操作を行い、該操作により生じたラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ：Ｇａｌ β １−４ＧｌｃＮＡｃ β １−３Ｇａｌ β １−４Ｇｌｃ）の蛍光標識体（蛍光標識ＬＮｎＴ）に相当するＴＬＣ上のスポットを確認する。
大腸菌湿菌体を用いた操作において、該ＴＬＣプレート上で蛍光標識ＬＮｎＴと同じ位置にスポットの現われる大腸菌をβ１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子を有する菌株として選択する。
選択されたクローンより常法（例えば、モレキュラー・クローニング第２版等）により目的とするＤＮＡを取得することができる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
該ＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，６０６９（１９９０）〕、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲＩＩ（インビトロジェン社製）、ｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）およびｐＮｏＴＡＴ７（５プライム→３プライム社製）などをあげることができる。
上記のようにして取得された新規な塩基配列を有するＤＮＡとして、例えば、配列番号２で表される配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
配列番号２で表される配列を有するＤＮＡを保有するプラスミドを保有する大腸菌として、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２２６）をあげることができる。
また、上記により決定された塩基配列に基づいたプライマーを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕により目的とするＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
［２］本願発明の蛋白質の調製
本願発明の蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記［１］に記載の方法により取得した本願発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
本願発明のＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本願発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本願発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本願発明の蛋白質遺伝子発現ベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本願発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋（ストラタジーン社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０〔大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒＳ３２〔大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本願発明の組換え体ＤＮＡにおいては、本願発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）〕等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、’ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ等を用いることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞またはＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、２９３等、ヒト白血病細胞としては、ＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本願発明の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本願発明の蛋白質を製造することができる。
本願発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ファーミンジェン社製〕、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ＥｘＣｅｌ１４００、ＥｘＣｅｌ１４０５〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製］、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本願発明の蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
本願発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる蛋白質の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本願発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本願発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本願発明の蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本願発明の蛋白質を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
動物個体を用いて本願発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法〔Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）〕に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本願発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本願発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、該蛋白質を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本願発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本願発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。
本願発明の形質転換体により製造された蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本願発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本願発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
また、本願発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１に記載の方法に準じて、本願発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
また、本願発明のポリペプチドをＦｌａｇペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕。更に、該ポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
上記で取得された蛋白質のアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本願発明の蛋白質を製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
［３］ガラクトース含有糖質の調製
上記［２］記載の培養により得られた形質転換体の培養液および該培養液を種々処理した培養液の処理物を酵素源として用い、水性媒体中でガラクトース含有糖質を製造することができる。
培養液の処理物としては、培養液の濃縮物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。
ガラクトース含有糖質の生成において用いられる酵素源は、３７℃で１分間に１μモルのガラクトース含有糖質を生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、０．１ｍＵ／ｌ〜１０，０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１ｍＵ／ｌ〜１，０００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
ガラクトース含有糖質の生成において用いられる水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
ガラクトース含有糖質の生成において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ガラクトース含有糖質の生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
ガラクトース含有糖質の生成において用いられる糖ヌクレオチド基質であるウリジン二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）としては、市販品の他、微生物等の活性を利用して生成した反応液あるいは該反応液から精製したものを用いることができる。
該糖ヌクレオチド基質は０．１〜５００ｍＭの濃度で用いる。
ガラクトース含有糖質の生成において用いられる糖基質としては、糖転移酵素の基質となるものであればいずれも用いることができ、例えば、グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ＧｌｃＮＡｃ β １−３Ｇａｌ β １−４Ｇｌｃ（ＬＮＴ−２）の他、非還元末端の糖がＧｌｃまたはＧｌｃＮＡｃであるオリゴ糖などを例示することができる。
該糖基質は０．１〜５００ｍＭの濃度で用いる。
該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２等の無機塩、β−メルカプトエタノール等を添加することができる。
ガラクトース含有糖質の生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。
水性媒体中に生成したガラクトース含有糖質の定量は公知の方法に準じて行うことができる〔化学と工業，４３，９５３（１９９０）〕。
反応液中に生成したガラクトース含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができ、例えば、Ｎ−アセチルラクトサミンにおいてはＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４７，５４１６（１９８２）記載の方法に準じて行うことができる。
以下に本願発明の実施例を示すが、本願発明はこれら実施例に限定されるものではない。
以下に本願発明の実施例を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例１ ヘリコバクター・ピロリゲノムライブラリーの作製
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（ＮＣＴＣ１１６３７，ＡＴＣＣ４３５０４）をＭｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０．８３３（１９９６）に記載の方法で培養した。
培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
該染色体ＤＮＡ １０μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解後、シュークロース密度勾配超遠心分離によりＤＮＡ断片を分画し、２〜６ｋｂの断片を回収した。
該ＤＮＡ断片０．５μｇおよび制限酵素ＢａｍＨＩで切断後ホスファターゼ処理したｐＵＣ１１８ ＤＮＡ ０．２μｇ（宝酒造社製）をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地〔バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ（ｐＨ７．２）、寒天１５ｇ／ｌ〕に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換株をβ１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子のスクリーニングに供した。
実施例２．スクリーニング
実施例１で作製したヘリコバクター・ピロリ由来のＤＮＡ断片を保有する大腸菌株を１０株ずつまとめてアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地０．８ｍｌの入った４８穴マイクロ・プレートに接種し、３７℃で１７時間培養した。
該培養液１５０μｌ分を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
スクリーニングの反応は該大腸菌湿菌体、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌ、０．４％ナイミーンＳ−２１５および後述の参考例１で調製したＦＣＨＡＳＥ−ＬＮＴ−２を０．２ｍＭ含む反応液０．０２ｍｌ中で３７℃で１６時間反応を行った。
反応終了後、遠心分離により菌体を除去し、上清を取得した。
該上清をシリカゲル−６０ＴＬＣプレート（メルク社製）上に乗せ、酢酸エチル：メタノール：水：酢酸＝７：２：１：０．１で展開し、展開終了後プレートを乾燥し、ＵＶ３６５ｎｍによりスポットの確認を行った。
大腸菌湿菌体の代わりにβ１，４−ガラクトース転移酵素（シグマ社製）を用い同様の操作を行い、該操作により生成された蛍光標識ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＦＣＨＡＳＥ−ＬＮｎＴ）のＴＬＣ上の位置を確認した。
ＦＣＨＡＳＥ−ＬＮｎＴと同じＴＬＣ上の位置にスポットの現われる大腸菌湿菌体の集団から単集落分離した菌株について、同様のスクリーニングを実施して、β１，４−ガラクトース転移酵素活性を示す菌株である（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ１）を選択した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ１株は平成１０年１月２０日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５００４６）にＦＥＲＭ ＢＰ−６２２６として寄託されている。
この菌株の保有するプラスミドｐＰＴ１について、その構造を解析したところプラスミドｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ部位にヘリコバクター・ピロリ由来の２ｋｂ断片が挿入した図１に示すような構造を有していた。
該２ｋｂ挿入断片のＤＮＡ塩基配列を決定したところ配列表の配列番号２に示すようなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が見い出された。該ＯＲＦに対応するアミノ酸配列を配列番号１に示した。
実施例３．Ｎ−アセチルラクトサミンの生産
実施例２で得たＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ１株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養液をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に１％接種し３７℃で５時間培養した。該培養液０．１ｍｌ分を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
該湿菌体（０．１ｍｌ分）、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、０．２ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌ、０．４％ナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液中で、３７℃、１６時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて分析し、反応液中に１２．７ｍｇ／ｌのＮ−アセチルラクトサミンが生成蓄積していることを確認した。
実施例４．ラクト−Ｎ−ネオテトラオースの生産
実施例２で得たＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ１株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。
該培養液をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に１％接種し３７℃で５時間培養した。
該培養液０．１ｍｌ分を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
該湿菌体（０．１ｍｌ分）、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌ、０．４％ナイミーンＳ−２１５および参考例２で調製したＬＮＴ−２を０．２ｍＭ含む反応液０．１ｍｌ中で、３７℃、１６時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて分析し、反応液中に６１．６ｍｇ／ｌのラクト−Ｎ−ネオテトラオースが生成蓄積していることを確認した。
実施例５．β１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子高発現プラスミドの造成
配列番号３記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番号４記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーをパーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
該合成ＤＮＡをプライマーとして、実施例２記載のプラスミドｐＰＴ１のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲはｐＰＴ１ ＤＮＡ １ｎｇ、プライマー各０．５μＭ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）４μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μＭを含む反応液４０μｌを用い、９４℃−１分、４２℃−２分、７２℃−３分の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより０．９ｋｂの断片を回収した。参考例１に示したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
該０．９ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、β１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子高発現プラスミドであるｐＰＴ７を得た。
実施例６．Ｎ−アセチルラクトサミンの生産
実施例５で得た大腸菌ＮＭ５２２／ｐＰＴ７株および大腸菌ＮＭ５２２／ｐＮＴ２５／ｐＮＴ３２（ＷＯ９８／１２３４３）を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１２５ｍｌの入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養した。
該培養液１２５ｍｌをグルコース１０ｇ／ｌ、バクトトリプトン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）２４ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４２．３ｇ／ｌ（別殺菌）、Ｋ２ＨＰＯ４１２．５ｇ／ｌ（別殺菌）、アンピシリン５０μｇ／ｍｌの組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３０℃で４時間、更に４０℃で３時間、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件で培養を行った。
該培養中、２８％アンモニア水を用いて、培養液をｐＨ７．０に維持した。また、培養途中で必要に応じてグルコースを５ｇ／ｌから３０ｇ／ｌ添加した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１１７０株を、グルコース５０ｇ／ｌ、ポリペプトン（日本製薬社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（オリエンタル酵母社製）１０ｇ／ｌ、尿素５ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ３ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２０ｍｇ／ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ、ニコチン酸５ｍｇ／ｌ、およびビオチン３０μｇ／ｌ（１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の組成からなる液体培地２０ｍｌの入った３００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃、２２０ｒｐｍの条件で、２４時間培養した。
該培養液２０ｍｌを上記と同一組成の液体培地２４０ｍｌの入った２Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃、２２０ｒｐｍの条件で、２４時間培養した。得られた培養液を種培養液として用いた。
該種培養液２５０ｍｌを、グルコース１５０ｇ／ｌ、肉エキス（極東製薬社製）５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １０ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ／ｌ（別殺菌）、β−アラニン１５ｍｇ／ｌ（別殺菌）、Ｌ−システイン２０ｍｇ／ｌ、ビオチン１００μｇ／ｌ、尿素２ｇ／ｌ、およびビタミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ（別殺菌）（１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の組成からなる液体培地２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３２℃、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／ｍｉｎの条件で２４時間培養を行った。培養中、２８％アンモニア水を用いて、培養液のｐＨを６．８に維持した。
該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
大腸菌ＮＭ５２２／ｐＰＴ７株湿菌体５０ｇ／ｌ、大腸菌ＮＭ５２２／ｐＮＴ２５／ｐＮＴ３２株湿菌体４０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１１７０株湿菌体１５０ｇ／ｌ、ガラクトース５０ｇ／ｌ、フラクトース５０ｇ／ｌ、ＧｌｃＮＡｃ５０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩）１０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、２２時間反応を行った。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持した。
該反応により、反応液中に６０．０ｇ／ｌのＮ−アセチルラクトサミンが生成した。
参考例１ 蛍光標識ＬＮＴ−２（ＦＣＨＡＳＥ−ＬＮＴ−２）の調製
［１］蛍光標識ラクトース（ＦＣＨＡＳＥ−Ｌａｃ）の調製
蛍光標識したラクトース（ＦＣＨＡＳＥ−Ｌａｃ）の調製は、アミノフェニルラクトース（シグマ社製）と６−（５−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）−ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（ＦＣＨＡＳＥ，モレキュラー・プローブ社製）から公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１９１６６（１９９６）〕により調製した。
［２］Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素発現菌株の造成
（１）発現ベクターｐＰＡＣ３１の造成
トリプトファンプロモーターを含むプラスミドｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）およびＰＬプロモーターを含むプラスミドｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＰＡＣ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５４）については、これらのプラスミドを保有する菌株から公知の方法によりプラスミドＤＮＡを単離精製した。
ｐＴｒＳ３０ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキット（バイオ１０１社製）により３．４ｋｂの断片を回収した。ｐＰＡ１ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に１．０ｋｂの断片を回収した。
該３．４ｋｂの断片および１．０ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ＰＬプロモーターによる発現ベクターであるｐＰＡ３１を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図２）。
ｐＰＡ３１ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより３．４ｋｂの断片を回収した。ｐＰＡＣ１ ＤＮＡ０．５μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に２．３ｋｂの断片を回収した。
該３．４ｋｂの断片および２．３ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｃＩ８５７リプレッサーを含むＰＬプロモーターによる発現ベクターであるｐＰＡＣ３１を取得した。
該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図２）。
（２）ｌｇｔＡ発現プラスミドの造成
ナイセリア・ガナリーア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＡＴＣＣ３３０８４株の染色体ＤＮＡを実施例１と同様の方法により単離精製した。
配列番号５記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番号６記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーをパーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
該合成ＤＮＡをプライマーとして、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＡＴＣＣ３３０８４株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー各０．５μＭ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）４μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μＭを含む反応液４０μｌを用い、９４℃−１分、４２℃−２分、７２℃−３分の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより１．０ｋｂの断片を回収した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの断片を回収した。
該１．０ｋｂおよび４．２ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇｔＡ発現プラスミドであるｐＮＴ５９Ｐを得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図３）。
該ｐＮＴ５９Ｐ ＤＮＡ０．５μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し１．０ｋｂの断片を回収した。上記で造成したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
該１．０ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇｔＡ発現プラスミドであるｐＮＴ５９を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図３）。
［３］蛍光標識ＬＮＴ−２（ＦＣＨＡＳＥ−ＬＮＴ−２）の調製
上記で得たＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＮＴ５９株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に１％接種し、２８℃で４時間培養後、温度を４０℃に上げてさらに３時間培養した。
該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
該湿菌体２０ｍｇ、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、２０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、０．４％ナイミーンＳ−２１５および上記［１］で調製したＦＣＨＡＳＥ−Ｌａｃを２０ｍＭ含む反応液０．１ｍｌ中で、３７℃、１６時間反応を行った。
反応終了後、遠心分離により菌体を除去した上清をＴＬＣにより分離した。
ＴＬＣによる分離はシリカゲル−６０ＴＬＣプレート（メルク社製）を用い、酢酸エチル：メタノール：水：酢酸＝７：２：１：０．１で展開することにより行った。
展開終了後、該ＴＬＣプレートを乾燥し、ＵＶ３６５ｎｍによりスポットの確認を行った。
該ＴＬＣ上のＦＣＨＡＳＥ−ＬＮＴ−２に対応するスポットの部分をかきとり、水を用いて抽出した後、遠心分離・フィルターろ過によりシリカゲルを除いたものを凍結乾燥し、基質であるＦＣＨＡＳＥ−ＬＮＴ−２を取得した。
参考例２ ＬＮＴ−２基質の調製
ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（オックスフォード・グライコシステムズ社製）にβ−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製）を作用させ、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースの非還元末端のガラクトースを完全に除去した後、１００℃で５分間熱処理することによりβ−ガラクトシダーゼ活性を失活させた反応液をＬＮＴ−２基質として、上記実施例で用いた。
産業上の利用可能性
本願発明により、β１，４−ガラクトース転移酵素を遺伝子組換え手法により大量に生産することが可能となる。また、該酵素を用いることにより効率的にガラクトース含有糖質を製造できる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第１図 第１図はβ１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子発現プラスミドｐＰＴ１の構造を示す。
第２図 第２図は発現プラスミドｐＰＡ３１およびｐＰＡＣ３１の造成工程を示す。
第３図 第３図はｌｇｔＡ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ５９の造成工程を示す
【符号の説明】
Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子
Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモーター
ＰＬ：ＰＬプロモーター
ｃＩ８５７：ｃＩ８５７リプレッサー
ｌｇｔＡ：β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子
Ｇａｌ Ｔａｓｅ：β１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子
本願発明は、β１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いたβ１，４−ガラクトース転移酵素の製造法、および該形質転換体を用いたガラクトース含有糖質の製造法に関する。
背景技術
β１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子に関して、動物由来の遺伝子〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１０４２０（１９８８）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．，１５７，６５７（１９８８）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８３，２１１（１９８９）〕、ナイセリア・ガナリーア由来の遺伝子〔ＷＯ ９６／１００８６〕およびストレプトコッカス・ニューモニエ由来の遺伝子〔Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２６，１９７（１９９７）〕が取得されている。
また、ヘリコバクター・ピロリのリポ多糖のＯ抗原は哺乳動物のルイスＸ〔Ｇａｌ β １−４（Ｆｕｃ α １−３）ＧｌｃＮＡｃ〕およびルイスＹ〔Ｆｕｃ α １−２Ｇａｌ β １−４（Ｆｕｃ α １−３）ＧｌｃＮＡｃ〕エピトープと同じ構造を有しており、ヘリコバクター・ピロリにおいてβ１，４−ガラクトース転移酵素活性の存在が予測されている〔Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，６８３（１９９５）］。該微生物において、既知のβ１，４−ガラクトース転移酵素と相同性の高いタンパク質は知られておらず、β１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子は特定されていない〔Ｎａｔｕｒｅ，３８８，５３９（１９９７）〕。
発明の開示
本願発明の目的は、β１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを用いたβ１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質の製造法、および該蛋白質を用いたガラクトース含有糖質の製造法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ヘリコバクター・ピロリのゲノムライブラリーからβ１，４−ガラクトース転移酵素の活性を指標にしたスクリーニングを行うことにより、これまで特定されていなかった該糖転移酵素遺伝子を取得し、その配列決定をして、本願発明を完成するに至った。
即ち、本願発明の第１の発明は、
以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質：
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）（ａ）の蛋白質の有するアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質である。
上記のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができ、また、１若しくは数個のアミノ酸とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換若しくは付加できる程度の数のアミノ酸を意味する。
かかる１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することができる。
本願発明の第２の発明は、上記蛋白質をコードするＤＮＡ、配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡからなるＤＮＡである。
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本願発明の第３の発明は、上記ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡである。
本願発明の第４の発明は、上記組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体である。
本願発明の第５の発明は、上記形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法である。
本願発明の第６の発明は、上記形質転換体の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該酵素源、糖基質およびウリジン二リン酸ガラクトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でガラクトースをβ１，４結合で糖基質に転移させることによりガラクトース含有糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中からガラクトース含有糖質を採取することを特徴とするガラクトース含有糖質の製造法である。
以下に本願発明を詳細に説明する。
［１］本願発明のＤＮＡの調製
（１）ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
本願発明のＤＮＡはヘリコバクター属に属する微生物より調製することができる。
ヘリコバクター属に属する微生物としては、例えばヘリコバクター・ピロリをあげることができ、具体的にはヘリコバクター・ピロリＮＣＴＣ１１６３７株等をあげることができる。
ヘリコバクター属に属する微生物を公知の方法〔例えば、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０，８３３（１９９６）〕により培養する。
培養後、公知の方法（例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー）により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。
得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、シュークロース密度勾配超遠心分離等の手法によりＤＮＡ断片を分画し、２〜６ｋｂのＤＮＡ断片を回収する。
常法〔例えば、モレキュラー・クローニング第２版等〕に準じて、該回収ＤＮＡ断片を、大腸菌用発現ベクターのプロモーターの下流に挿入した組換え体ＤＮＡを作成し、該組換え体ＤＮＡを大腸菌に導入することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製することができる。
発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社）、ｐＧＥＭＥＸ−１〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕、ｐＱＥ−８（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋（ストラタジーン社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。
大腸菌としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）〕等をあげることができる。
（２）スクリーニングおよび本願発明のＤＮＡの調製
上記で作製したゲノムＤＮＡライブラリーの大腸菌を通常の方法［例えば、ＬＢ培地〔バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ（ｐＨ７．２）〕を用い、２０〜４５℃で５〜２４時間］培養する。
培養後、培養液を遠心分離し、湿菌体を取得する。
該湿菌体を用い、β１，４−ガラクトース転移酵素活性を指標として、β１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子を有する大腸菌をスクリーニングする。該スクリーニング法は公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，，２８２７１（１９９６）〕に準じて、あるいは下記の方法で行うことができる。
該湿菌体、５０ｍＭ ＭＥＳ〔２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ〕（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭウリジン二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）、０．４％ナイミーンＳ−２１５および後述の参考例１に準じた方法で調製したＬＮＴ−２（ＧｌｃＮＡｃ β １−３Ｇａｌ β １−４Ｇｌｃ）の蛍光標識体を０．２ｍＭ含む反応液０．０２ｍｌ中で３７℃で１６時間反応を行う。
反応終了後、遠心分離により菌体を除去し、上清を取得する。
該上清をシリカゲル−６０ＴＬＣプレート（メルク社製）上に乗せ、酢酸エチル：メタノール：水：酢酸＝７：２：１：０．１で展開し、展開終了後プレートを乾燥し、ＵＶ３６５ｎｍによりスポットの確認を行う。
大腸菌湿菌体の代わりにβ１，４−ガラクトース転移酵素（シグマ社製）を用い同様の操作を行い、該操作により生じたラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ：Ｇａｌ β １−４ＧｌｃＮＡｃ β １−３Ｇａｌ β １−４Ｇｌｃ）の蛍光標識体（蛍光標識ＬＮｎＴ）に相当するＴＬＣ上のスポットを確認する。
大腸菌湿菌体を用いた操作において、該ＴＬＣプレート上で蛍光標識ＬＮｎＴと同じ位置にスポットの現われる大腸菌をβ１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子を有する菌株として選択する。
選択されたクローンより常法（例えば、モレキュラー・クローニング第２版等）により目的とするＤＮＡを取得することができる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
該ＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，６０６９（１９９０）〕、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲＩＩ（インビトロジェン社製）、ｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）およびｐＮｏＴＡＴ７（５プライム→３プライム社製）などをあげることができる。
上記のようにして取得された新規な塩基配列を有するＤＮＡとして、例えば、配列番号２で表される配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。
配列番号２で表される配列を有するＤＮＡを保有するプラスミドを保有する大腸菌として、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２２６）をあげることができる。
また、上記により決定された塩基配列に基づいたプライマーを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕により目的とするＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
［２］本願発明の蛋白質の調製
本願発明の蛋白質は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記［１］に記載の方法により取得した本願発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
本願発明のＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本願発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本願発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本願発明の蛋白質遺伝子発現ベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本願発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋（ストラタジーン社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０〔大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒＳ３２〔大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本願発明の組換え体ＤＮＡにおいては、本願発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２）、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）〕等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、’ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ等を用いることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞またはＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、２９３等、ヒト白血病細胞としては、ＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本願発明の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本願発明の蛋白質を製造することができる。
本願発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ファーミンジェン社製〕、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ＥｘＣｅｌ１４００、ＥｘＣｅｌ１４０５〔いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製］、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本願発明の蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
本願発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる蛋白質の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本願発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本願発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本願発明の蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本願発明の蛋白質を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
動物個体を用いて本願発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法〔Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）〕に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本願発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本願発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、該蛋白質を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本願発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本願発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。
本願発明の形質転換体により製造された蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本願発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本願発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
また、本願発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１に記載の方法に準じて、本願発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
また、本願発明のポリペプチドをＦｌａｇペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕。更に、該ポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
上記で取得された蛋白質のアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本願発明の蛋白質を製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
［３］ガラクトース含有糖質の調製
上記［２］記載の培養により得られた形質転換体の培養液および該培養液を種々処理した培養液の処理物を酵素源として用い、水性媒体中でガラクトース含有糖質を製造することができる。
培養液の処理物としては、培養液の濃縮物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。
ガラクトース含有糖質の生成において用いられる酵素源は、３７℃で１分間に１μモルのガラクトース含有糖質を生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、０．１ｍＵ／ｌ〜１０，０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１ｍＵ／ｌ〜１，０００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
ガラクトース含有糖質の生成において用いられる水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
ガラクトース含有糖質の生成において、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ガラクトース含有糖質の生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
ガラクトース含有糖質の生成において用いられる糖ヌクレオチド基質であるウリジン二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）としては、市販品の他、微生物等の活性を利用して生成した反応液あるいは該反応液から精製したものを用いることができる。
該糖ヌクレオチド基質は０．１〜５００ｍＭの濃度で用いる。
ガラクトース含有糖質の生成において用いられる糖基質としては、糖転移酵素の基質となるものであればいずれも用いることができ、例えば、グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ＧｌｃＮＡｃ β １−３Ｇａｌ β １−４Ｇｌｃ（ＬＮＴ−２）の他、非還元末端の糖がＧｌｃまたはＧｌｃＮＡｃであるオリゴ糖などを例示することができる。
該糖基質は０．１〜５００ｍＭの濃度で用いる。
該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２等の無機塩、β−メルカプトエタノール等を添加することができる。
ガラクトース含有糖質の生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。
水性媒体中に生成したガラクトース含有糖質の定量は公知の方法に準じて行うことができる〔化学と工業，４３，９５３（１９９０）〕。
反応液中に生成したガラクトース含有糖質の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができ、例えば、Ｎ−アセチルラクトサミンにおいてはＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４７，５４１６（１９８２）記載の方法に準じて行うことができる。
以下に本願発明の実施例を示すが、本願発明はこれら実施例に限定されるものではない。
以下に本願発明の実施例を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例１ ヘリコバクター・ピロリゲノムライブラリーの作製
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（ＮＣＴＣ１１６３７，ＡＴＣＣ４３５０４）をＭｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０．８３３（１９９６）に記載の方法で培養した。
培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
該染色体ＤＮＡ １０μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解後、シュークロース密度勾配超遠心分離によりＤＮＡ断片を分画し、２〜６ｋｂの断片を回収した。
該ＤＮＡ断片０．５μｇおよび制限酵素ＢａｍＨＩで切断後ホスファターゼ処理したｐＵＣ１１８ ＤＮＡ ０．２μｇ（宝酒造社製）をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地〔バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ（ｐＨ７．２）、寒天１５ｇ／ｌ〕に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換株をβ１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子のスクリーニングに供した。
実施例２．スクリーニング
実施例１で作製したヘリコバクター・ピロリ由来のＤＮＡ断片を保有する大腸菌株を１０株ずつまとめてアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地０．８ｍｌの入った４８穴マイクロ・プレートに接種し、３７℃で１７時間培養した。
該培養液１５０μｌ分を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
スクリーニングの反応は該大腸菌湿菌体、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌ、０．４％ナイミーンＳ−２１５および後述の参考例１で調製したＦＣＨＡＳＥ−ＬＮＴ−２を０．２ｍＭ含む反応液０．０２ｍｌ中で３７℃で１６時間反応を行った。
反応終了後、遠心分離により菌体を除去し、上清を取得した。
該上清をシリカゲル−６０ＴＬＣプレート（メルク社製）上に乗せ、酢酸エチル：メタノール：水：酢酸＝７：２：１：０．１で展開し、展開終了後プレートを乾燥し、ＵＶ３６５ｎｍによりスポットの確認を行った。
大腸菌湿菌体の代わりにβ１，４−ガラクトース転移酵素（シグマ社製）を用い同様の操作を行い、該操作により生成された蛍光標識ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＦＣＨＡＳＥ−ＬＮｎＴ）のＴＬＣ上の位置を確認した。
ＦＣＨＡＳＥ−ＬＮｎＴと同じＴＬＣ上の位置にスポットの現われる大腸菌湿菌体の集団から単集落分離した菌株について、同様のスクリーニングを実施して、β１，４−ガラクトース転移酵素活性を示す菌株である（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ１）を選択した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ１株は平成１０年１月２０日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５００４６）にＦＥＲＭ ＢＰ−６２２６として寄託されている。
この菌株の保有するプラスミドｐＰＴ１について、その構造を解析したところプラスミドｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ部位にヘリコバクター・ピロリ由来の２ｋｂ断片が挿入した図１に示すような構造を有していた。
該２ｋｂ挿入断片のＤＮＡ塩基配列を決定したところ配列表の配列番号２に示すようなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が見い出された。該ＯＲＦに対応するアミノ酸配列を配列番号１に示した。
実施例３．Ｎ−アセチルラクトサミンの生産
実施例２で得たＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ１株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。該培養液をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に１％接種し３７℃で５時間培養した。該培養液０．１ｍｌ分を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
該湿菌体（０．１ｍｌ分）、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、０．２ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌ、０．４％ナイミーンＳ−２１５からなる０．１ｍｌの反応液中で、３７℃、１６時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて分析し、反応液中に１２．７ｍｇ／ｌのＮ−アセチルラクトサミンが生成蓄積していることを確認した。
実施例４．ラクト−Ｎ−ネオテトラオースの生産
実施例２で得たＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＰＴ１株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に接種し２８℃で１７時間培養した。
該培養液をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に１％接種し３７℃で５時間培養した。
該培養液０．１ｍｌ分を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
該湿菌体（０．１ｍｌ分）、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．２ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌ、０．４％ナイミーンＳ−２１５および参考例２で調製したＬＮＴ−２を０．２ｍＭ含む反応液０．１ｍｌ中で、３７℃、１６時間反応を行った。
反応終了後、反応生成物をダイオネックス社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて分析し、反応液中に６１．６ｍｇ／ｌのラクト−Ｎ−ネオテトラオースが生成蓄積していることを確認した。
実施例５．β１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子高発現プラスミドの造成
配列番号３記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番号４記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーをパーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
該合成ＤＮＡをプライマーとして、実施例２記載のプラスミドｐＰＴ１のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲはｐＰＴ１ ＤＮＡ １ｎｇ、プライマー各０．５μＭ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）４μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μＭを含む反応液４０μｌを用い、９４℃−１分、４２℃−２分、７２℃−３分の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより０．９ｋｂの断片を回収した。参考例１に示したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
該０．９ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、β１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子高発現プラスミドであるｐＰＴ７を得た。
実施例６．Ｎ−アセチルラクトサミンの生産
実施例５で得た大腸菌ＮＭ５２２／ｐＰＴ７株および大腸菌ＮＭ５２２／ｐＮＴ２５／ｐＮＴ３２（ＷＯ９８／１２３４３）を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１２５ｍｌの入った１Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で１７時間培養した。
該培養液１２５ｍｌをグルコース１０ｇ／ｌ、バクトトリプトン（ディフコ社製）１２ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）２４ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４２．３ｇ／ｌ（別殺菌）、Ｋ２ＨＰＯ４１２．５ｇ／ｌ（別殺菌）、アンピシリン５０μｇ／ｍｌの組成からなる液体培地（ｐＨ無調整）２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３０℃で４時間、更に４０℃で３時間、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／分の条件で培養を行った。
該培養中、２８％アンモニア水を用いて、培養液をｐＨ７．０に維持した。また、培養途中で必要に応じてグルコースを５ｇ／ｌから３０ｇ／ｌ添加した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１１７０株を、グルコース５０ｇ／ｌ、ポリペプトン（日本製薬社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（オリエンタル酵母社製）１０ｇ／ｌ、尿素５ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ３ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２０ｍｇ／ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ、ニコチン酸５ｍｇ／ｌ、およびビオチン３０μｇ／ｌ（１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の組成からなる液体培地２０ｍｌの入った３００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃、２２０ｒｐｍの条件で、２４時間培養した。
該培養液２０ｍｌを上記と同一組成の液体培地２４０ｍｌの入った２Ｌ容バッフル付き三角フラスコに接種し、２８℃、２２０ｒｐｍの条件で、２４時間培養した。得られた培養液を種培養液として用いた。
該種培養液２５０ｍｌを、グルコース１５０ｇ／ｌ、肉エキス（極東製薬社製）５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １０ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ／ｌ（別殺菌）、β−アラニン１５ｍｇ／ｌ（別殺菌）、Ｌ−システイン２０ｍｇ／ｌ、ビオチン１００μｇ／ｌ、尿素２ｇ／ｌ、およびビタミンＢ１ ５ｍｇ／ｌ（別殺菌）（１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）の組成からなる液体培地２．５Ｌの入った５Ｌ容培養槽に接種し、３２℃、６００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／ｍｉｎの条件で２４時間培養を行った。培養中、２８％アンモニア水を用いて、培養液のｐＨを６．８に維持した。
該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
大腸菌ＮＭ５２２／ｐＰＴ７株湿菌体５０ｇ／ｌ、大腸菌ＮＭ５２２／ｐＮＴ２５／ｐＮＴ３２株湿菌体４０ｇ／ｌ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１１７０株湿菌体１５０ｇ／ｌ、ガラクトース５０ｇ／ｌ、フラクトース５０ｇ／ｌ、ＧｌｃＮＡｃ５０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５ｇ／ｌ、フィチン酸５ｇ／ｌ、オロット酸（カリウム塩）１０ｇ／ｌ、ナイミーンＳ−２１５ ４ｇ／ｌ、キシレン１０ｍｌ／ｌの組成からなる反応液３０ｍｌを２００ｍｌ容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（９００ｒｐｍ）し、２２時間反応を行った。反応中、４Ｎ ＮａＯＨを用いて、該反応液のｐＨを７．２に維持した。
該反応により、反応液中に６０．０ｇ／ｌのＮ−アセチルラクトサミンが生成した。
参考例１ 蛍光標識ＬＮＴ−２（ＦＣＨＡＳＥ−ＬＮＴ−２）の調製
［１］蛍光標識ラクトース（ＦＣＨＡＳＥ−Ｌａｃ）の調製
蛍光標識したラクトース（ＦＣＨＡＳＥ−Ｌａｃ）の調製は、アミノフェニルラクトース（シグマ社製）と６−（５−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）−ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（ＦＣＨＡＳＥ，モレキュラー・プローブ社製）から公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１９１６６（１９９６）〕により調製した。
［２］Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素発現菌株の造成
（１）発現ベクターｐＰＡＣ３１の造成
トリプトファンプロモーターを含むプラスミドｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）およびＰＬプロモーターを含むプラスミドｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＰＡＣ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５４）については、これらのプラスミドを保有する菌株から公知の方法によりプラスミドＤＮＡを単離精製した。
ｐＴｒＳ３０ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキット（バイオ１０１社製）により３．４ｋｂの断片を回収した。ｐＰＡ１ ＤＮＡ ０．５μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に１．０ｋｂの断片を回収した。
該３．４ｋｂの断片および１．０ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ＰＬプロモーターによる発現ベクターであるｐＰＡ３１を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図２）。
ｐＰＡ３１ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩキットにより３．４ｋｂの断片を回収した。ｐＰＡＣ１ ＤＮＡ０．５μｇを制限酵素ＰｓｔＩおよびＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に２．３ｋｂの断片を回収した。
該３．４ｋｂの断片および２．３ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３７℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｃＩ８５７リプレッサーを含むＰＬプロモーターによる発現ベクターであるｐＰＡＣ３１を取得した。
該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図２）。
（２）ｌｇｔＡ発現プラスミドの造成
ナイセリア・ガナリーア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＡＴＣＣ３３０８４株の染色体ＤＮＡを実施例１と同様の方法により単離精製した。
配列番号５記載のセンス鎖ＤＮＡプライマーと、配列番号６記載のアンチセンス鎖ＤＮＡプライマーをパーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
該合成ＤＮＡをプライマーとして、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＡＴＣＣ３３０８４株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは染色体ＤＮＡ０．１μｇ、プライマー各０．５μＭ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）２．５ｕｎｉｔｓ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（ストラタジーン社製）４μｌ、ｄｅｏｘｙＮＴＰ各２００μＭを含む反応液４０μｌを用い、９４℃−１分、４２℃−２分、７２℃−３分の工程を３０回繰り返すことにより行った。
該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、目的の断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のＴＥ〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）を添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分放置した。該放置液を遠心分離しＤＮＡの沈殿を得た。
該ＤＮＡの沈殿を２０μｌのＴＥに溶解した。該溶解液５μｌを用い、ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキットにより１．０ｋｂの断片を回収した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に３．０ｋｂの断片を回収した。
該１．０ｋｂおよび４．２ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇｔＡ発現プラスミドであるｐＮＴ５９Ｐを得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図３）。
該ｐＮＴ５９Ｐ ＤＮＡ０．５μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し１．０ｋｂの断片を回収した。上記で造成したｐＰＡＣ３１ ＤＮＡ０．２μｇを制限酵素ＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、同様に５．５ｋｂの断片を回収した。
該１．０ｋｂおよび５．５ｋｂの断片をライゲーションキットを用いて、１６℃、１６時間、連結反応を行った。該連結反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２株を前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｌｇｔＡ発現プラスミドであるｐＮＴ５９を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認した（図３）。
［３］蛍光標識ＬＮＴ−２（ＦＣＨＡＳＥ−ＬＮＴ−２）の調製
上記で得たＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２／ｐＮＴ５９株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に接種し、２８℃で１７時間培養した。該培養液をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地８ｍｌの入った太型試験管に１％接種し、２８℃で４時間培養後、温度を４０℃に上げてさらに３時間培養した。
該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−２０℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
該湿菌体２０ｍｇ、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、２０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、０．４％ナイミーンＳ−２１５および上記［１］で調製したＦＣＨＡＳＥ−Ｌａｃを２０ｍＭ含む反応液０．１ｍｌ中で、３７℃、１６時間反応を行った。
反応終了後、遠心分離により菌体を除去した上清をＴＬＣにより分離した。
ＴＬＣによる分離はシリカゲル−６０ＴＬＣプレート（メルク社製）を用い、酢酸エチル：メタノール：水：酢酸＝７：２：１：０．１で展開することにより行った。
展開終了後、該ＴＬＣプレートを乾燥し、ＵＶ３６５ｎｍによりスポットの確認を行った。
該ＴＬＣ上のＦＣＨＡＳＥ−ＬＮＴ−２に対応するスポットの部分をかきとり、水を用いて抽出した後、遠心分離・フィルターろ過によりシリカゲルを除いたものを凍結乾燥し、基質であるＦＣＨＡＳＥ−ＬＮＴ−２を取得した。
参考例２ ＬＮＴ−２基質の調製
ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（オックスフォード・グライコシステムズ社製）にβ−ガラクトシダーゼ（生化学工業社製）を作用させ、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースの非還元末端のガラクトースを完全に除去した後、１００℃で５分間熱処理することによりβ−ガラクトシダーゼ活性を失活させた反応液をＬＮＴ−２基質として、上記実施例で用いた。
産業上の利用可能性
本願発明により、β１，４−ガラクトース転移酵素を遺伝子組換え手法により大量に生産することが可能となる。また、該酵素を用いることにより効率的にガラクトース含有糖質を製造できる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第１図 第１図はβ１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子発現プラスミドｐＰＴ１の構造を示す。
第２図 第２図は発現プラスミドｐＰＡ３１およびｐＰＡＣ３１の造成工程を示す。
第３図 第３図はｌｇｔＡ遺伝子発現プラスミドｐＮＴ５９の造成工程を示す
【符号の説明】
Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子
Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモーター
ＰＬ：ＰＬプロモーター
ｃＩ８５７：ｃＩ８５７リプレッサー
ｌｇｔＡ：β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子
Ｇａｌ Ｔａｓｅ：β１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子
Claims (2)
- 以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを、宿主細胞に導入して得られる形質転換体の培養液または該培養液の処理物を酵素源として用い、該酵素源、糖基質およびウリジン二リン酸ガラクトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中でガラクトースをβ1,4結合で糖基質に転移させることによりガラクトース含有糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中からガラクトース含有糖質を採取することを特徴とするガラクトース含有糖質の製造法。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の蛋白質の有するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｄ）（ｃ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ１，４−ガラクトース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ - ガラクトース含有糖質が、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースおよびＮ−アセチルラクトサミンから選ばれるガラクトース含有糖質である、請求項１記載の製造法。
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