KR101152876B1 - 구아노신-이노신 키나아제의 추가 발현에 의한 재조합 대장균에서 ｇｄｐ-푸코즈의 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 GDP-푸코즈의 합성 경로를 매개하는 관련 효소의 과발현에 덧붙여, 글루코오스-6-포스페이트-데하이드로지나아제 또는/및 구아노신-이노신 키나아제를 특이적으로 추가하여 과발현하도록 재조합한 대장균을 이용하여 GDP-푸코즈를 생산하는 방법에 관한 것으로,
대장균 내에 존재하는 대표적인 NADPH 재생산효소인 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로지나아제(glucose-6-phosphate dehydrogenase; G6PDH)와 ManB, ManC, Gmd 및 WcaG를 동시발현한 재조합 대장균을 이용하여, pH-스탯(pH-stat) 방식의 유가식 배양에서 최대 235.2±3.3mg/L의 GDP-푸코즈를 생산하였는데, 이는 G6PDH를 추가발현하지 않은 재조합 대장균에 비해 21% 향상한 결과이다.
또한, 구아노신-이노신 키나아제(guanosine-inosine kinase; Gsk)를 추가발현한 재조합 대장균을 이용하여, pH-스탯 방식의 유가식 배양에서 최대 305.5±5.3mg/L의 GDP-푸코즈를 생산하였는데, 이는 Gsk를 추가발현하지 않은 재조합대장균보다 58% 향상된 결과이다.

Description

구아노신-이노신 키나아제의 추가 발현에 의한 재조합 대장균에서 ＧＤＰ-푸코즈의 생산방법{Method for production of GDP-L-fucose by overexpression of guanosine-inosine kinase in recombinant Escherichia coli}
본 발명은 대장균에서 GDP-푸코즈를 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 GDP-푸코즈의 합성 경로를 매개하는 관련 효소의 과발현에 덧붙여, 글루코오스-6-포스페이트-데하이드로지나아제 또는/및 구아노신-이노신 키나아제를 특이적으로 추가하여 과발현하도록 재조합한 대장균을 이용하여 GDP-푸코즈를 생산하는 방법에 관한 것이다.
현재 기능성 당류에 대한 기술적 및 경제적 가치에 대한 인식이 세계적으로 점차 고조되고 있는데, 특히 모유(human milk) 혹은 초유(colostrum)에 존재하는 기능성 당류들의 생리활성의 규명 및 의약적 활용에 대한 연구가 증가하고 있는 추세이다.
모유에는 락토오스(lactose), 글루코오스(glucose), 갈락토오스(galactose), N-아세틸글루코스아민(N-acetylglucosamine), 푸코즈(fucose), 시알릭산(sialic acid)으로 이루어진 약 120여 종 이상의 기능성 당류 복합체들이 존재하고 있으며, 최근 모유의 기능성 당류들의 각종 기능적, 생리활성적 특성으로 인하여 이러한 기능성 당류 및 그 전구체를 생명공학적 방법을 통하여 생산하고자 하는 연구 역시 활발히 진행되고 있다.
모유 당류복합체들의 기능으로는 병원성 미생물의 감염 억제, 면역시스템의 반응 촉진, 비피도박테리아와 같은 유산균의 활성 촉진 등을 예로 들 수 있는데, 모유에 존재하는 당류들 중에서 특히 푸코즈(fucose)를 전구체로 하는 푸코실소당체(fucosyloligosaccharide)는 유아의 초기 발육단계에서 특정 항체의 형성과 설사 등을 유발하는 각종 병원성 미생물에 대한 내성을 부여하는 기능을 가지고 있는 중요한 물질로 알려져 있다.
한편, 구아노신 다이포스페이트-L-푸코즈(Guanosine diphosphate L-fucose; 이하, 영어로는 'GDP-L-fucose'라 하고, 한글로는 'GDP-푸코즈'라 함)는 각종 푸코실트랜스퍼라아제(fucosyltransferase)가 매개하는 당전이 반응의 공여체(donor)로 이용되는 핵산 함유 당질이며, 대사공학이나 효소공학적 기법을 이용하여 푸코실소당체를 생산하는 과정에서 필수적 물질로서 산업적 가치가 매우 높다.
이에, GDP-푸코즈를 경제적으로 생산하고자 하는 노력이 많이 있어 왔다. 일 예로 화학적 합성 방법(참고문헌: Carbohyd. Res., 242: 69(1993))이 알려져 있는데, 이 방법은 입체 선택성의 문제 및 기질의 공급에 있어 난점이 있다.
또한, 효소를 사용하는 GDP-푸코즈의 생산 방법(참고문헌: Agric. Biol. Chem., 48: 823(1984), WO 93/08205, 및 WO 99/09180)이 알려져 있는데, 이 방법은 고가인 효소를 원료로 사용하기 때문에, 경제적이지 않은 문제점이 있다.
또한, 재조합 미생물, 일 예로 대장균을 이용한 GDP-푸코즈의 생산방법(대한민국 공개특허 특2001-0050030, 공개일자 2001년 06월 15일)이 공개되어 있는데, 이 방법은 최근 유전공학 및 대사공학의 발전에 따라 그 생산성 및 수율이 향상될 여지가 아직 많이 남아 있는 실정이다.
이에 본 발명은 대장균 내 GDP-푸코즈의 합성 경로 재해석을 통해, 고 생산성 및 고 수율로 GDP-푸코즈를 생산할 수 있는 방법을 개발하여 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 대장균을 배양함으로써 GDP-푸코즈를 생산하는 방법에 있어서, 대장균으로, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제, GDP-4-케토-6-데옥시만노오스 3,5-에피머라아제-4-리덕타아제, 포스포만노뮤타아제, 만노오스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제 및 글루코오스-6-포스페이트-데하이드로지나아제가 과발현되도록 재조합된 대장균을 사용하는 것을 특징으로 하는 GDP-푸코즈의 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 대장균을 배양함으로써 GDP-푸코즈를 생산하는 방법에 있어서, 대장균으로, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제, GDP-4-케토-6-데옥시만노오스 3,5-에피머라아제-4-리덕타아제, 포스포만노뮤타아제, 만노오스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제 및 구아노신-이노신 키나아제가 과발현되도록 재조합된 대장균을 사용하는 것을 특징으로 하는 GDP-푸코즈의 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 대장균을 배양함으로써 GDP-푸코즈를 생산하는 방법에 있어서, 대장균으로, GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제, GDP-4-케토-6-데옥시만노오스 3,5-에피머라아제-4-리덕타아제, 포스포만노뮤타아제, 만노오스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제, 글루코오스-6-포스페이트-데하이드로지나아제 및 구아노신-이노신 키나아제가 과발현되도록 재조합된 대장균을 사용하는 것을 특징으로 하는 GDP-푸코즈의 생산방법을 제공한다.
한편, 본 발명의 GDP-푸코즈 생산방법에 있어서, 관련 효소의 과발현은 유도 프로모터에 의해 조절되는 것이 좋다. 유도 프로모터에 의한 과발현의 조절은 유도 물질의 첨가에 의해 효소의 과발현을 개시시키는 것으로서, 배양에 있어서 발현 시점을 적절하게 조절할 수 있는 특징이 있다.
한편, 본 발명의 GDP-푸코즈 생산방법에 있어서, 배양은 pH-스탯(stat) 방식의 유가식 배양인 것이 좋다. 이때, 더욱 바람직하게 pH-스탯 방식의 유가식 배양은 배양액의 pH를 6.8로 유지하면서 포도당을 제한적으로 공급하는 것이 좋다. pH-스탯은 발효조의 pH가 미리 설정된 수치보다 높아지는 경우 자동적으로 포도당을 공급하게 되는 방식으로, 포도당 주입속도를 고정하는 포도당 제한 공급 방식(glucose limited feeding)의 유가식 배양보다 포도당을 원활하게 공급할 수 있는 장점이 있다.
대장균 내에 존재하는 대표적인 NADPH 재생산효소인 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로지나아제(glucose-6-phosphate dehydrogenase; G6PDH)와 ManB, ManC, Gmd 및 WcaG를 동시발현한 재조합 대장균을 이용하여, pH-스탯 방식의 유가식 배양에서 최대 235.2±3.3mg/L의 GDP-푸코즈를 생산하였는데, 이는 G6PDH를 추가발현하지 않은 재조합 대장균에 비해 21% 향상한 결과이다.
또한, 구아노신-이노신 키나아제(guanosine-inosine kinase; Gsk)를 추가 발현한 재조합 대장균을 이용하여, pH-스탯 방식의 유가식 배양에서 최대 305.5±5.3mg/L의 GDP-푸코즈를 생산하였는데, 이는 Gsk를 추가발현하지 않은 재조합대장균보다 58% 향상된 결과이다.
도 1은 대장균에서 GDP-L-푸코즈의 생합성 경로를 보여준다.
도 2는 대장균의 개괄적인 탄소대사경로 및 NADPH 재생산에 관련된 효소들을 보여준다.
도 3은 대장균에서 GDP-L-푸코즈의 생합성 경로와 구아노신 누클레오타이드의 생합성 경로를 보여준다.
도 4는 본 실험에서 사용된 플라스미드를 보여준다.
도 5는 GDP-푸코즈 생합성 효소들을 발현하는 균주인 이 콜라이(E. coli) BL21 star(DE3)/pmBCGW의 pH-스탯 방식의 유가식 배양 결과이다. 건조균체량(●), 포도당 농도(□), 아세트산 농도(■), GDP-푸코즈 농도(▲) 및 IPTG 첨가에 의한 GDP-푸코즈 생합성 효소의 발현유도(화살표).
도 6은 GDP-푸코즈 생합성 효소들과 G6PDH를 동시발현하는 균주인 이 콜라이(E. coli) BL21 star(DE3)/pmBCGW+pMWzwf의 pH-스탯 방식의 유가식 배양 결과이다. 건조균체량(●), 포도당 농도(□), 아세트산 농도(■), GDP-푸코즈 농도(▲) 및 IPTG 첨가에 의한 GDP-푸코즈 생합성 효소의 발현유도(화살표).
도 7은 GDP-푸코즈 생합성 효소들과 GuaA 및 GuaB를 동시발현하는 균주인 이 콜라이(E. coli) BL21 star(DE3)/pmBCGW+pHguaBA의 pH-스탯 방식의 유가식 배양 결과이다. 건조균체량(●), 포도당 농도(□), 아세트산 농도(■), GDP-푸코즈 농도(▲) 및 IPTG 첨가에 의한 GDP-푸코즈 생합성 효소의 발현유도 (화살표).
도 8은 GDP-푸코즈 생합성 효소들과 GuaC를 동시발현하는 균주인 이 콜라이(E. coli) BL21 star(DE3)/pmBCGW+pHguaC의 pH-스탯 방식의 유가식 배양 결과이다. 건조균체량(●), 포도당 농도(□), 아세트산 농도(■), GDP-푸코즈 농도(▲) 및 IPTG 첨가에 의한 GDP-푸코즈 생합성 효소의 발현유도(화살표).
도 9는 GDP-푸코즈 생합성 효소들과 Gsk를 동시발현하는 균주인 이 콜라이(E. coli) BL21 star(DE3)/pmBCGW+pHgsk의 pH-스탯 방식의 유가식 배양 결과이다. 건조균체량(●), 포도당 농도(□), 아세트산 농도(■), GDP-푸코즈 농도(▲) 및 IPTG 첨가에 의한 GDP-푸코즈 생합성 효소의 발현유도(화살표).
도 10은 재조합 대장균의 세포 내 구아노신 누클레오타이드 농도 분석결과이다. (a) 이 콜라이(E. coli) BL21 star(DE3)/pACYCDuet-1, (b) 이 콜라이(E. coli) BL21 star(DE3)/pHgsk.
도 11은 본 발명의 실시예 1 및 2에서 수행한 대조군 및 실험군의 pH-스탯 방식에 의한 유가식 배양 결과의 요약이다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지 포함한다.
도 1에서 보듯이, GDP-D-만노오스(GDP-D-mannose)는 포도당으로부터 푸룩토오스-6-포스페이트(fructose-6-phosphate), 만노오스-6-포스페이트(mannose-6-phosphate) 및 만노오스-1-포스페이트(mannose-1-phosphate)를 거쳐 생성이 되며, 이를 촉매하는 효소는 만노오스-6-포스페이트 아이소머라아제(mannose-6-phosphate isomerase; ManA), 포스포만노뮤타아제(phosphomannomutase; ManB) 및 만노오스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제(mannose-1-phosphate guanyltransferase; ManC)이다.
생성된 GDP-D-만노오스는 GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제(GDP-D-mannose-4,6-dehydratase; Gmd) 및 NADPH를 보효소로 사용하는 GDP-4-케토-6-데옥시만노오스-3,5-에피머라아제-4-리덕타아제(GDP-4-keto-6-deoxymannose-3,5-epimerase-4-reductase; WcaG)에 의해 GDP-푸코즈로 최종 전환된다.
따라서, GDP-푸코즈 생산의 중요한 요소로서, 'de novo GDP-L-fucose biosynthetic pathway'의 기질로 사용이 되는 GDP-D-만노오스의 효율적인 공급 및 NADPH의 원활한 재생산과 GTP의 충분한 공급이 우선 고려될 수 있다.
이에, 본 발명에서는 대장균 내의 대표적인 NADPH 재생산효소인 글루코오스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate; G6PDH, 유전자 명은 'zwf'임)를 동시발현하여 NADPH 재생산 성능을 향상시키고, 구아노신 누클레오타이드(guanosine nucleotide)의 생합성 경로를 적절히 조절하여 GTP를 비롯한 GMP, GDP와 같은 구아노신 누클레오타이드의 농도를 증가시켜 GDP-푸코즈 생산을 향상시키고자 하였다.
한편, 하기 실시예 1 및 실시예 2에서 사용한 본 발명 관련 효소의 발현 시스템은 하기와 같이 구축되었다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) K-12 유래의 포스포만노뮤타아제(ManB), 만노오스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제(ManC), GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제(Gmd) 및 GDP-4-케토-6-데옥시만노오스-3,5-에피머라아제-4-리덕타아제(WcaG)를 각각 암호화하는 유전자인 manB, manC, gmd 및 wcaG의 유전정보를 데이터 베이스(GeneBanK, Blast, SGD)등을 이용하여 획득하고 적절한 프라이머들(표 1)을 이용한 PCR 및 기타 유전 공학기법을 통하여 유전자를 확보하였다.
또한, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) K-12 유래의 글루코오스-6-포스페이트(이하 'G6PDH'라 명명. 다만, 유전자 명은 이하 'zwf'라 명명), 이노신 5'-모노포스페이트 데하이드로지나아제(inosine 5'-monophosphate(IMP) dehydrogenase, 이하 'GuaB'라 명명), 구아노신 5'-모노포스페이트 신세타아제(guanosine 5'-monophosphate(GMP) synthetase, 이하 'GuaA'라 명명), GMP 리덕타아제(GMP reductase, 이하 'GuaC'라 명명) 및 구아노신-이노신 키나아제(guanosine-inosine kinase, 이하 'Gsk'라 명명)를 각각 암호화하는 유전자인 zwf, guaB, guaA, guaC 및 gsk의 유전정보를 데이터 베이스(GeneBanK, Blast, SGD)등을 이용하여 획득하고 적절한 프라이머들(표 1)을 이용한 PCR 및 기타 유전 공학기법을 통하여 유전자를 확보하였다.
실험에 사용된 프라이머들은 다음과 같았다.
GDP-푸코즈, NADPH 및 구아노신 누클레오타이드 생합성 관련 효소의 발현을 위해 제작된 프라이머 염기서열
PCR 프라이머 서열(5'->3') 비고
manC_F (NcoI) ACATGCCATGGATGGCGCAGTCGAAACTCTAT manC와 manB는 클로스터(cluster)로 나란히 존재하기 때문에 함께 PCR 됨
manB_R (EcoRI) ACCGGAATTCTTACTCGTTCAGCAACGTCAG
zwf_F (NcoI) CATGCCATGGCGGTAACGCAAACAGC
zwf_R (EcoRI) ACCGGAATTCTTACTCAAACTCATTCCAGGAAC
guaBA_F (NdeI) GGAATTCCATATGCTACGTATCGCTAAAGAA guaB와 guaA는 클로스터(cluster)로 나란히 존재하기 때문에 함께 PCR 됨
guaBA_R (XhoI) CCGCTCGAGTCATTCCCACTCAATGGTAGC
guaC_F ACATGCCATGGGCATGCGTATTGAAGAAGATCTG
guaC_R (SacI) AAAACTGCAGTTACAGGTTGTTGAAGATGCG
gsk_F (NcoI) ACATGCCATGGGCATGAAATTTCCCGGTAAACGT
gsk_R (SacI) AAAACTGCAGTTAACGATCCCAGTAAGACTC
이후, T7 프로모터에 의해 단백질의 발현이 유도되는 플라스미드인 pETDuet-1 및 pACYCDuet-1(Invitrogen)에 각각의 유전자를 삽입하여 발현용 플라스미드를 제조하였다. 발현용 플라스미드들을 이 콜라이(E. coli ) BL21 star(DE3) [F- ompT hsdSB(rBmB) gal dcm rne131(DE3)] 균주에 'Sambrook's method'에 따라 형질전환하여 GDP-푸코즈 생산용 균주를 구축하였다. 실험에 사용된 균주와 플라스미드들은 표 2와 도 4에 정리하였다.
GDP-푸코즈, NADPH 및 구아노신 누클레오타이드 생합성 관련 효소의 발현 및 GDP-푸코즈 생산을 위해 제작된 플라스미드
유전자 비고
pETDuet-1 - 2개의 T7 프로모터 및 MCS, pBR322 replicon, Ampr
pACYCDuet-1 - 2개의 T7 프로모터 및 MCS, p15A replicon, Cmr
pmBCGW manB , manC , gmd , wcaG pETDuet-1 + gmd - wcaG (NdeI/XhoI) + manB - manC (NcoI/SacI)
pMWzwf zwf pACYCDuet-1 + zwf (NcoI/EcoRI)
pHguaBA guaA , guaB pACYCDuet-1 + guaA - guaB (NdeI/XhoI)
pHguaC guaC pACYCDuet-1 + guaC (NcoI/SacI)
pHgsk gsk pACYCDuet-1 + gsk (NcoI/SacI)
한편, 본 발명에서는 대장균 배양으로 하기의 실시예 1 및 2에서 회분식 배양(종균배양 및 전배양) 및 유가식 배양(본배양)을 수행하였다.
종균배양 및 전배양을 위한 회분식 배양은 Luria-Bertani(LB) 배지(10g/L tryptone, 5g/L yeast extract, 10g/L sodium chloride)를 이용하여 수행하였으며, 플라스미드 DNA를 얻을 수 있고, 순수배양을 할 수 있도록 적절한 항생제를 사용하였다. 200mL의 LB 배지를 포함한 500mL 플라스크에서 배양온도는 25℃, 교반속도는 250rpm으로 세포배양을 수행하였다.
본 배양을 위한 유가식 배양은 고농도 세포배양을 위해 20g/L의 포도당을 포함하는 제한배지[13.5g/L KH2PO4, 4.0g/L (NH4)2PO4, 1.7g/L citric acid, 1.4g/L MgSO47H2O, 10ml/L trace metal solution(10.0g/L FeSO47H2O, 2.0g/L CaCl2, 2.2g/L ZnSO47H2O, 0.5g/L MnSO44H2O, 1.0g/L CuSO45H2O, 0.1g/L (NH4)6Mo7O244H2O, 0.02g/L Na2B4O710H2O) 및 pH 6.8]가 사용되었으며, 온도는 25℃로 유지되었다.
초기에 투입된 포도당을 모두 소비한 후 유가식 배양을 위한 포도당 공급을 원활하게 하기 위하여 'pH-스탯(pH-stat)' 공급 방식이 도입되었다. pH-스탯 방법은 포도당이 소모된 후 pH가 미리 설정된 수치 이상으로 상승하게 되면 일정부피의 공급용액 (800g/L glucose, 20g/L MgSO47H2O)을 자동으로 반응기 내로 공급하는 배양방법이다. 반응기 내의 pH는 28% 암모니아 수용액을 이용하여 6.8로 유지하였으며, 교반속도는 용존산소량을 높이기 위하여 1000rpm에서 1300rpm으로 점진적으로 증가시켰다. 통기속도는 약 1vvm으로 유지하였다. 건조 균체량 농도가 대략 35g/L에 도달하였을 때 0.1mM IPTG로 GDP-푸코즈 생합성 관련 효소의 발현을 유도하여 GDP-푸코즈 생산을 수행하였다.
한편, 하기 실시예 1 및 2에서 건조 균체량 농도는 분광광도계를 이용하여 600nm에서 측정하였다. 또한, 포도당과 초산은 'HPX-87X' 컬럼이 장착된 영린기기 'M930 high performance liquid chromatography'를 이용하여 측정하였다.
한편, 하기 실시예 1 및 2에서 GDP-푸코즈의 정량과 단백질 발현 확인을 위해서는 하기와 같은 방법을 사용하였다. 배양 중 회수한 세포를 13000rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액은 제거한 후 침전된 세포를 추출 용액(50mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 150mM NaCl, 10mM MgCl2, 5mM βmercaptoethanol and 5mM EDTA)에 현탁하였다. 소니케이션(sonication)을 통하여 세포를 파쇄한 후 4℃에서 30분간 13000rpm으로 원심분리하여 세포추출물(crude enzyme extract)을 분리하였다. 세포추출물은 세포 내 GDP-푸코즈 정량 및 단백질 발현 확인에 사용되었다. GDP-푸코즈 정량은 'CAPCELL PAK C18' 컬럼이 장착된 'Agilent 1200 series HPLC'를 사용하여 정량하였다. 이동상으로 98~96%(v/v) 20mM TEAA와 2~4%(v/v) 아세토니트릴(acetonitrile)을 농도 구배를 주어 사용하였으며, 254nm에서 GDP-푸코즈의 흡광을 관찰하였다. 세포 내 단백질 농도는 단백질 정량 키트를 이용하였고, 단백질 발현 확인을 위해 'Laemmli method'에 기초한 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electrophoresis) 분석을 수행하였다. 겔(gel)은 'Coomasie blue R-250' 용액을 사용하여 염색하였으며, 탈색을 위해 탈색 용액(20% 메탄올, 10% 아세트산)을 사용하였다.
한편, 하기 실시예 1 및 2에서 세포 내 구아노신 누클레오타이드를 정량하기 위해서는 하기와 같은 방법을 사용하였다. 배양 중 회수한 세포를 13000rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후 침전된 세포를 추출 용액(50mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 150mM NaCl, 10mM MgCl2, 5mM βmercaptoethanol and 5mM EDTA)에 현탁하였다. 소니케이션(sonication)을 통하여 세포를 파쇄한 후 4℃에서 30분간 13000rpm으로 원심분리하여 세포추출물(crude enzyme extract)을 분리하였다. 구아노신 누클레오타이드 정량은 'Partisil 10 SAX' 컬럼이 장착된 'Agilent 1200 series HPLC'를 사용하여 정량하였다. 이동상으로 100~0%(v/v) 7mM KH2PO4(pH 4.0)와 0~100%(v/v) 250mM KH2PO4(pH 4.5, 500 mM KCl 함유)를 농도 구배를 주어 사용하였다. 254nm에서 GMP, GDP 및 GTP의 흡광을 관찰하여 구아노신 누클레오타이드의 정량을 수행하였다.
실시예 1: pH - 스탯 방식의 유가식 발효공정에서 NADPH 재생산 효소 도입에 따른 GDP - 푸코즈의 생산 증대 효과
도 2에서 보듯이 대장균의 오탄당 경로(pentose phosphate pathway)에서 NADPH 대사에 관련된 효소인 글루코오스-6-포스페이트-데하이드로지나아제(G6PDH)를 암호화하는 유전자(zwf)를 클로닝하고, 발현시스템을 구축하여 GDP-푸코즈 생산용 재조합 대장균에 도입하였다. 그리고 유가식 배양 공정을 통하여 GDP-푸코즈의 생산 패턴을 관찰하였다.
본 발명자가 예비 실험의 일환으로 수행한, NADPH 재생산 효소(zwf)를 도입한 재조합 대장균의 포도당 제한 공급 방식에 의한 유가식 발효공정에서는 GDP-푸코즈의 생산의 향상이 미미했는데, 그 이유로는 유가식 배양에서의 포도당 주입속도가 너무 낮았기 때문으로 분석되었다. 예비 실험에서는 유가식 배양시, 포도당을 시간당 7g/L의 속도로 넣어주어 포도당과 아세트산이 배지 내에 쌓이지 않고, 용존산소량이 비교적 높게 유지되게 하였으나, 이는 NADPH의 재생산에 필요한 충분한 포도당을 공급하지 못한다는 단점이 있었다.
따라서, 낮은 포도당 주입속도는 GDP-푸코즈의 생산을 저해할 수 있다는 가정 하에 포도당 주입속도를 2배 가까이 높인 발효 방법으로 공정을 개선하여 본 실시예에서는 pH-스탯 공급 방식의 유가식 배양을 사용하였다.
pH-스탯은 발효조의 pH가 미리 설정된 수치보다 높아지는 경우 자동적으로 포도당을 공급하게 되는 방식이므로, 기존의 포도당 주입속도를 고정한 포도당 제한 공급 방식보다 원활하게 포도당을 공급할 수 있는 장점이 있다.
본 실시예에서 대조군으로는 ManB, ManC, Gmd 및 WcaG를 과발현하는 균주인 이 콜라이(E. coli) BL21 star(DE3)/pmBCGW를, 실험군으로는 ManB, ManC, Gmd, WcaG 및 G6PDH를 과발현하는 균주인 이 콜라이(E. coli) BL21 star(DE3)/pmBCGW+pMWzwf를 이용하여 pH-스탯 방식의 유가식 발효를 수행하였다.
도 5는 대조군인 이 콜라이(E. coli) BL21 star(DE3)/pmBCGW의 유가식 배양공정 및 공정시간에 따른 단백질 발현 경향의 결과를 나타내고 있다. 빨라진 포도당 공급속도로 인하여 기존의 공정보다 약 2~3시간 빠르게 35 g/L의 균체농도에서 IPTG에 의한 단백질 발현유도를 실시하였다.
발효 후 19.5시간에서 단백질 발현이 유도되었는데, 약 11시간 동안 GDP-푸코즈의 농도가 급격하게 상승하였다. 그러나, 이 후 아세트산의 축적으로 인하여 GDP-푸코즈의 생산속도가 감소하였으며, 발효 30시간 이후로는 GDP-푸코즈의 생산은 더 이상 증가하지 않았다.
배양 결과, 총 193.6 mg/L의 GDP-푸코즈가 생산되었으며, 생산성은 10.2 mg/L?h였다. 이는 포도당 주입속도를 시간 당 7g/L로 고정했던 기존의 포도당 제한 공급 방식의 유가식 배양의 결과보다 생산량은 14%, 생산성은 52% 증가한 결과이다. 다만, 균주 개량 여부를 판단할 때 중요한 척도로 작용하는 비 GDP-푸코즈 함량(specific GDP-L-fucose content)의 차이는 보이지 않았다. 4가지의 효소는 발효 후반부까지 안정적으로 발현되었다(효소 발현에 대한 데이터의 제시는 생략함).
한편, 도 6는 실험군인 G6PDH를 추가적으로 발현한 균주인 이 콜라이(E. coli) BL21 star(DE3)/pmBCGW+pMWzwf의 유가식 배양공정 및 공정시간에 따른 단백질 발현 경향의 결과를 나타내고 있다.
플라스미드 pmBCGW를 도입한 대조군의 재조합 대장균과는 다르게 GDP-푸코즈 농도는 급격하게 증가하지는 않았지만, 발효후반부까지 선형적으로 증가함을 알 수 있었다. 아세트산의 축적은 거의 이루어지지 않았는데, 이는 G6PDH의 추가 발현으로 인한 결과로 보인다.
배양 결과, 총 235.2 mg/L의 GDP-푸코즈가 생산되었으며, 생산성은 12.7 mg/L?h이었다. 이는 포도당 주입속도를 시간 당 7g/L로 고정했던 기존의 포도당 제한 공급 방식의 유가식 배양의 결과보다 생산량은 66%, 생산성은 120% 증가한 결과였다.
또한, 균주 개량 여부를 판단할 때 중요한 척도로 작용하는 '비 GDP-푸코즈 함량'은 포도당 제한 공급 방식의 유가식 배양의 1.9mg/g cell에서 2.8mg/g cell로 47% 증가한 결과를 나타냈다.
또한, 이 결과는 G6PDH를 과발현하지 않은 대조군에 비해서 생산량은 21%, 생산성은 25% 증가한 결과이기도 하다. G6PDH를 포함한 5가지의 효소는 발효 후반부까지 안정적으로 발현되었다(데이터 생략). G6PDH의 비효소역가는 2U/mg cellular protein 이상으로 발현이 유지되었다(데이터 생략).
이상의 도 6에서 제시된 결과로부터 충분한 포도당의 공급이 원활한 NADPH의 재생산에 중요한 요소라는 것을 알 수 있었고, 궁극적으로 이것들이 GDP-푸코즈의 생산성 증대에 중요한 요소라는 것을 파악할 수 있었다.
한편, 소모된 포도당에 대한 GDP-푸코즈의 수율은 1.3mg GDP-L-fucose/g glucose로서 G6PDH를 과발현하지 않은 대조군보다 30% 증가한 결과를 보였다. 이는 G6PDH의 추가 발현으로 인하여 당 대사가 보다 효율적으로 이루어져서 GDP-푸코즈의 생산이 향상되었기 때문인 것으로 분석된다.
실시예 2: pH - 스탯 방식의 유가식 발효공정에서 구아노신 누클레오타이드 생합성 효소의 도입에 따른 GDP - 푸코즈의 생산 증대 효과
도 3에서 보는 바와 같이, 포도당은 오탄당 경로를 통하여 리보오스-5-포스페이트(ribose-5-phosphate)를 거쳐 포스포리보실파이로포스페이트(phosphoribosylpyrophosphatel; PRPP)로 전환되며, 이 PRPP를 시작 물질로 하여 11가지의 단계를 거쳐 이노신 5'-모노포스페이트(inosine 5'-monophosphate; IMP)가 생성된다. 생성된 IMP는 IMP 데하이드로지나아제(IMP dehydrogenase; GuaB)와 GMP 신세타아제(GMP synthetase GuaA)에 의하여 GMP로 전환되고, 이후 일련의 인산화를 통하여 GDP, GTP로 전환되는 것으로 알려져 있다(de novo pathway).
또한, 외부의 이노신(inosine), 구아닌(guanine) 혹은 구아노신(guanosine)이 세포 내로 유입이 되면서 이노신-구아노신 키나아제(inosine-guanosine kinase; Gsk)에 의하여 IMP 혹은 GMP가 생성이 되는 것으로 알려져 있다(salvage pathway).
GMP 및 GDP 등과 같은 구아노신 누클레오타이드(guanosine nucleotide)를 생합성하기 위해서는 GMP 합성의 시작물질인 IMP 혹은 구아노신 및 이노신으로부터의 대사경로를 조절해야 할 필요가 있다.
일본의 'Ajinomoto' 그룹에서 발표한 선행 연구결과에 따르면, GuaB, GuaA, Gsk, XapA 등의 효소를 파쇄한 재조합 대장균에서 이노신의 생산성이 향상된 것을 보고한 바 있다(참고문헌: Biosci. Biotechnol. Biochem., 65: 570(2001), Biosci. Biotechnol. Biochem., 65: 1230(2001), Biosci. Biotechnol. Biochem., 70: 3069(2006)). 또한, GuaB와 GuaA가 GTP 생산에 주요한 효소임이 밝혀진바 있다(참고문헌: Appl. Environ. Microbiol., 34: 337(1977)).
따라서, 본 실험에서는 이노신 혹은 IMP로부터 구아노신 누클레오타이드의 전환을 유도하기 위하여 앞서 발표되었던 연구결과를 반대로 적용하고자 하였다. 즉, 이노신으로부터 IMP로의 전환을 증가시키거나 IMP로부터 GMP로의 대사속도를 높여서 세포 내 구아노신 풀(pool)을 증가시키고자 한 것이다. 이에 구아노신 누클레오타이드의 생합성에 관여하는 여러 가지 효소 중 'de novo guanosine nucleotide biosynthetic pathway'에 관여하는 효소인 GuaA, GuaB, GuaC 및 'salvage pathway'에 관여하는 효소인 Gsk를 암호화하는 유전자를 선택적으로 GDP-푸코즈 생산용 재조합 대장균에 도입하여 GDP-푸코즈의 생산성 및 효율이 가장 좋은 효소를 선별하고자 하였다.
먼저, GuaB와 GuaA는 IMP로부터 GMP를 생합성하는 경로에 관여하는 효소들이며, 클러스터로 존재하므로 두 효소를 동시에 발현할 수 있도록 플라스미드를 설계하였다(pHguaBA). 그리고, IMP와 GMP의 세포 내 농도를 높이고자 이노신 혹은 구아노신으로부터 IMP 및 GMP를 합성하는 효소인 Gsk를 발현하는 플라스미드를 설계하였다(pHgsk). 비교실험을 위해서 GMP로부터 IMP로의 환원을 유도하는 효소인 GuaC를 발현하는 플라스미드를 설계하여 위의 두 시스템과 비교하고자 하였다(pHguaC).
도 7은 GuaB와 GuaA를 추가발현한 GDP-푸코즈 생산균주인 이 콜라이(E. coli) BL21 star(DE3)/pmBCGW+pHguaBA의 유가식 배양공정 및 공정시간에 따른 단백질 발현 경향의 결과를 나타내고 있다. 발효 약 22시간에 0.1mM IPTG로 단백질 발현을 유도한 후, 세포 생장 및 GDP-푸코즈의 생산은 지속적으로 증가하였다. 세포 농도는 100g/L까지 증가하였으며, 이는 GuaB와 GuaA를 추가 발현하지 않은 경우보다 세포농도가 20% 증가한 결과였다. 지속적인 세포생장에 힘입어 총 261.7mg/L의 GDP-푸코즈가 생산되었으며, 생산성은 13.8mg/L?h이었다(GuaB와 GuaA를 추가 발현하지 않은 경우보다 생산량 및 생산성 모두 35% 증가). 한편, 아세트산은 거의 쌓이지 않았으며, 소모된 포도당에 대한 GDP-푸코즈의 수율은 1.5mg GDP-L-fucose/g glucose로서 GuaB와 GuaA를 과발현하지 않은 경우보다 50% 증가한 결과를 보였다. 이는 GuaB와 GuaA의 추가발현으로 인하여 당 대사가 구아노신 누클레오타이드 생산에 효율적으로 사용되어, GDP-푸코즈 생산 향상에 도움이 되었기 때문인 것으로 풀이된다.
그러나, 도 8에서 보듯이, GuaC를 추가 발현한 GDP-푸코즈 생산균주의 유가식 발효공정에서는 상기와 같은 GDP-푸코즈 생산의 향상이 이루어지지 않았다. 171.9mg/L의 GDP-L-fucose가 생산되었으며, 생산성은 9.8mg/L?h이었다(GuaC를 추가발현하지 않은 경우 대비 생산량 11%, 생산성 4% 감소). 이는 GuaC가 GMP로부터 IMP로의 환원에 관여하는 효소로서 구아노신 누클레오타이드의 불충분한 공급을 불러일으켜 GDP-푸코스 생산의 감소로 이어졌기 때문에 나타난 현상으로 사료되었다.
한편, 도 9는 Gsk를 추가발현한 GDP-푸코즈 생산균주인 이 콜라이(E. coli) BL21 star(DE3)/pmBCGW+pHgsk의 유가식 배양공정 및 공정시간에 따른 단백질 발현 경향의 결과를 나타내고 있다. 발효 약 21시간에 IPTG에 의한 단백질 유도 후, GDP-푸코즈 농도가 급격하게 상승하는 것을 관찰하였다. 약 20시간 동안 305.5mg/L의 GDP-L-fucose가 생산되었으며, 그 생산성은 15.7mg/L?h이었다. Gsk를 추가발현하지 않은 재조합 대장균에 비해서 생산성은 58%, 생산성은 54% 증가한 결과를 보였다. 다만, GuaB와 GuaC를 추가 발현한 균주와는 달리, 세포생장은 잘 이루어지지 않았다. 건조 균체량이 약 80 g/L에 이르렀을 때부터, 세포생장이 더디어지기 시작하였으며, 배지 내에 포도당이 축적되는 경향이 나타났다. 소모된 포도당에 대한 GDP-푸코즈의 수율은 1.5mg GDP-L-fucose/g glucose로서 Gsk를 과발현하지 않은 유가식 배양보다 50% 증가한 결과를 보였다. 이는 GuaB와 GuaA를 추가 발현한 재조합 대장균의 유가식 배양 결과와 비슷한 수치이며, Gsk의 추가 발현 역시 구아노신 누클레오타이드 생산에 효율적인 역할을 하여 GDP-푸코즈 생산 향상에 도움을 주었기 때문에 발생한 현상으로 판단되었다.
특이할 만한 것은, 균주 개량 여부를 판단할 때 중요한 척도로 작용하는 비 GDP-푸코즈 함량(specific GDP-L-fucose content)이 3.5 mg/g cell로 높은 수치를 보였다는 점이다. 이는 GuaB와 GuaA를 추가발현한 경우와는 다르게 세포 내에 구아노신 누클레오타이드 풀(pool)이 향상되었음을 알려주기 때문이다. 선행 연구 결과에 따르면, 생성된 GMP에 의해 되먹임 저해(feedback inhibition)를 받지 않는 Gsk 돌연변이 유전자를 대장균 내에서 발현시켰을 때, 세포 내에 구아노신 누클레오타이드 풀은 급격하게 증가하지만 심각한 세포생장 저해를 일으키는 것으로 알려져 있다(참고문헌: J. Biol. Chem., 274:5348(1999)). 본 실험 결과도 이 선행 연구결과처럼 유가식 배양공정에서 Gsk의 과발현으로 인해 세포 내 구아노신 누클레오타이드의 농도가 올라가며, 이로 인하여 GDP-푸코즈의 생산은 증가하나, 세포의 생장과 포도당 대사는 저해하는 것으로 나타났다.
도 10은 Gsk를 과발현한 재조합 대장균 이 콜라이(E. coli) BL21 star(DE3)/pHgsk의 세포 내 구아노신 누클레오타이드 함량의 HPLC 분석 결과를 보여준다. 모벡터인 pACYCDuet-1을 과발현한 재조합 대장균(a)의 경우 '비 GMP 함량(specific GMP content)'이 1.54 mg/g cell인 반면, pHgsk를 과발현한 재조합 대장균(b)의 경우는 2.44 mg/g cell로 세포 내 GMP 농도가 58% 증가하였다. 이와 같이 세포 내 GMP 농도가 상승하였기 때문에 GDP-푸코즈 생산에 필요한 GTP의 공급이 원활하게 되었고, 궁극적으로 GDP-푸코즈의 생산성 향상이 이루어진 것으로 판단된다.
한편, GuaB와 GuaA를 과발현하거나 GuaC를 과발현한 재조합 대장균의 '비GMP 함량'는 증가하지 않았다(데이터 생략).
한편, 도 11은 이상의 실시예 1 및 실시예 2에서 수행한 pH-스탯 방식의 유가식 배양공정의 결과 요약이다.

Claims (4)

  1. 대장균을 배양함으로써 GDP-푸코즈를 생산하는 방법에 있어서,
    대장균으로,
    GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제, GDP-4-케토-6-데옥시만노오스 3,5-에피머라아제-4-리덕타아제, 포스포만노뮤타아제, 만노오스-1-포스페이트 구아닐트랜스퍼라아제 및 구아노신-이노신 키나아제가 과발현되도록 재조합된 대장균을 사용하는 것을 특징으로 하는 GDP-푸코즈의 생산방법
  2. 제1항에 있어서,
    상기 과발현은,
    유도 프로모터에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 GDP-푸코즈의 생산방법
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 배양은,
    pH-스탯 방식의 유가식 배양인 것을 특징으로 하는 GDP-푸코즈의 생산방법
  4. 삭제
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