DE202011111144U1 - Metabolisch veränderte Organismen für die Herstellung von Bioprodukten mit Mehrwert - Google Patents

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Abstract

Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe für die Herstellung eines Kohlenhydrat-Spezialproduktes, dadurch gekennzeichnet, dass das Bakterium oder die Hefe:
a) gentechnisch modifiziert worden ist durch die Einführung eines heterologen Gens, das eine Saccharose-Phosphorylase codiert, die in der Lage ist, Saccharose in Glucose-1-phosphat und Fructose aufzuspalten, oder eines heterologen Gens, das eine Kohlenhydrat-Hydrolase codiert, die in der Lage ist, Saccharose in Glucose und Fructose aufzuspalten;
b) eine Fructokinase umfasst, um die Umwandlung von Fructose zu Fructose-6-phosphat zu katalysieren; und
c) gentechnisch weiter modifiziert worden ist, um den Verlust von Fructose-6-phosphat über die Glykolyse zu verhindern, und zwar aufgrund der Zerstörung eines endogenen Gens, das eine Phosphofructokinase, eine Phosphoglucose-Isomerase oder eine Kombination davon codiert.

Description

  • Technisches Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf genetisch veränderte Organismen, insbesondere Mikroorganismen wie Bakterien und Hefen, für die Herstellung von Bioprodukten mit Mehrwert wie Spezialsaccharide, -glycolipide und -glycoproteinen. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Wirtszellen, welche metabolisch verändert sind, so dass sie die wertvollen Spezialprodukte in großen Mengen und mit einer hohen Rate erzeugen können, und zwar durch die Umgehung klassischer technischer Probleme, welche in biokatalytischen oder fermentativen Herstellungsverfahren auftreten.
  • Allgemeiner Stand der Technik
  • Die steigenden Kosten von Erdölressourcen tragen zu einem wachsenden Bewusstsein für das Potential von biologischen Produktionsprozessen bei. Dies hat die Forschungsbemühungen von Unternehmen und Forschungszentren hin zur Entwicklung von wirtschaftlich tragbaren und umweltfreundlichen Technologien für die Herstellung einer zunehmenden Zahl von Bioprodukten, z. B. Biokraftstoffe, Biochemikalien und Biopolymere, verstärkt. Diese sind leicht abbaubar und werden mit minimalen Energieanforderungen und Abfallströmen produziert. Trotz des günstigen Kontextes für Produktionsprozesse auf der Basis der industriellen Biotechnologie, ist die Entwicklung von Alternativen für gut etablierte chemische Syntheserouten oft zu zeitintensiv und zu teuer, um wirtschaftlich tragbar zu sein. Folglich gibt es eine klare Nachfrage nach einer schnelleren und billigeren Entwicklung von neuen Produktionsstämmen.
  • Heutzutage werden Oligosaccharide typischerweise mittels Biokonversionsprozessen synthetisiert. Isolierte und gereinigte Enzyme (so genannte In-vitro-Biokonversionen) und Ganzzell-Biokatalysatoren kommen üblicherweise zum Einsatz. Im Wesentlichen wandeln sie einen oder mehrere Vorläufer zu einem gewünschten Bioprodukt um.
  • Jedoch wird die Anwendung der In-vitro-Biokonversionen häufig behindert, weil die Synthese des Produkts mehrere enzymatische Schritte erfordern kann oder weil zusätzliche Kofaktoren erforderlich sind (NADH, NADPH, UTP,...), die teuer sind.
  • Ein weiterer Nachteil von In-vitro-Synthese ist die Tatsache, dass die Expression und Reinigung von zahlreichen Enzymen aufwändig ist und ihr Reinigungsprozess zu einer herabgesetzten enzymatischen Aktivität führen kann. Darüber hinaus hat jedes Enzym in einem solchen Multi-Enzym-Biokonversionsprozess seine eigenen optimalen Prozessparameter, was zu sehr komplizierten Optimierungsschemata führt. In einem solchen Prozess spielen die Reaktionsgleichgewichte ebenfalls eine bedeutende Rolle. Zum Beispiel ist bei der Verwendung einer Phosphorylase ein festes Substrat/Produkt-Verhältnis, das die Produktausbeute begrenzt, zur Hand. Dies führt zu komplizierten nachgelagerten Prozessierungsschemata, um das Produkt von dem Substrat zu trennen (33, 35).
  • Metabolische Veränderung ist ein weiterer Ansatz zur Optimierung der Herstellung von Bioprodukten mit Mehrwert, wie von Spezialkohlehydraten. Üblicherweise sind ganze Zellen metabolisch verändert worden zur Herstellung von Bioprodukten mit Mehrwert, ausgehend von einem bereitgestellten Vorläufer. In diesem Kontext werden die Zellen verändert, so dass alle metabolischen Stoffwechselwege, die am Abbau des/der Vorläufer beteiligt sind, eliminiert werden (3, 45, 70, 77, 100). Dadurch ist der/sind die Vorläufer effizient und wird/werden direkt zu dem gewünschten Produkt umgewandelt.
  • Ein Hauptnachteil des letztgenannten Ansatzes ist die Tatsache, dass die Biomassensynthese und die ins Auge gefasste Bioprodukt-Biosynthese unterschiedliche Ausgangsmetabolite erfordern. Zum Beispiel wurde E. coli metabolisch für die effiziente Produktion von 2-Desoxy-scyllo-inosose, ausgehend von Glucose, verändert. Diese Strategie macht die metabolisch veränderten E. coli unbrauchbar zum Wachsenlassen auf Glucose, was die Hinzufügung von anderen Substraten, z. B. Glycerol, erfordert, um eine Biomassensynthese zu ermöglichen (45).
  • Ein zweiter Nachteil von Ganzzell-Produktionssystemen ist, dass ein Bedarf an zwei Phasen besteht, einer Wachstumsphase, in der Biomasse gebildet wird (oder Biomassensynthese), gefolgt von einer Produktionsphase des ins Auge gefassten Produkts. Dies bedeutet, dass die Wachstumsphase und die Produktionsphase zeitlich getrennt sind (aufeinanderfolgende Phasen). Dies führt zu sehr niedrigen Gesamtproduktionsraten des gewünschten Produkts/der gewünschten Produkte. Darüber hinaus ist dieser Prozesstyp schwer zu optimieren. In der Tat sind Fermentationsprozesse entwickelt worden, die von metabolisch veränderten Zellen Gebrauch machen, die Herstellungs-Stoffwechselweg-Gene überexprimieren. Eine große Menge des Substrats wird zu Biomasse umgewandelt, was lediglich zu einem kleineren Fluss des Substrats in Richtung des Produkts (13) führt.
  • Die vorliegende Erfindung überwindet die oben beschriebenen Nachteile, da sie metabolisch veränderte Organismen bereitstellt, die zur Produktion von gewünschten Produkten mit einer hohen Produktivität und einer garantierten hohen Ausbeute in der Lage sind (1). Dies wird durch klares Aufteilen des Stoffwechsels des Organismus in zwei Teile bewerkstelligt: 1) einen so genannten ‚Herstellungsteil‘ oder ‚Herstellungs-Stoffwechselweg‘ und 2) einen ‚Biomassen- und Kofaktor-Ergänzungs-‘ Teil oder ‚Biomassen- und/oder biokatalytischen Enzymbildungs-Stoffwechselweg‘. Die zwei Teile werden durch Aufspalten eines Zuckers in: a) ein aktiviertes Saccharid und b) ein (nichtaktiviertes) Saccharid erzeugt. Jedes von den Sacchariden a) oder b) ist - oder kann sein - die erste Vorstufe von entweder dem Herstellungs-Stoffwechselweg a) oder Biomassen- und/oder den biokatalytischen Enzymbildungsstoffwechselwegen b), was einen Pull/Push- bzw. Zug/Schub-Mechanismus in der Zelle ermöglicht.
  • De facto wandelt die Biomassensynthese, die das Hauptziel der Zelle ist, das aktivierte Saccharid oder das Saccharid zu Biomasse um und verschiebt das Gleichgewicht der Reaktion, die den Zucker zu dem aktivierten Saccharid und Saccharid aufspaltet. Auf diese Weise fungiert der lebenserhaltende Antrieb der Zelle als ein Zug-Mechanismus für den Produktstoffwechselweg. Dieser Zugeffekt wird durch die Biomassensynthese erzeugt, da er die Akkumulation des ersten Substratmoleküls des Herstellungs-Stoffwechselwegs sicherstellt, der, als solcher und seinerseits, ebenfalls den Herstellungs-Stoffwechselweg anschiebt. Diese Strategie löst das Produktionsratenproblem, das in den Zweiphasen-Herstellungsstrategien auftritt, wie im Stand der Technik beschrieben. Außerdem wird durch Katabolisieren von einem Teil der Zuckergruppierung die Zelle immer mit den notwendigen Kofaktoren und den benötigten Energieanforderungen für die Herstellung des Spezialbioprodukts versorgt. Die aktuelle Strategie löst somit auch das Problem der Kofaktorergänzung, die in der biokatalytischen Herstellung benötigt wird, wie im Stand der Technik beschrieben. Darüber hinaus werden die erforderlichen Enzyme in dem Herstellungs-Stoffwechselweg stets effizient synthetisiert und leicht mittels der Veränderungs-Strategie der vorliegenden Erfindung aufrechterhalten.
  • Darüber hinaus offenbart die vorliegende Erfindung die Verwendung einer 2-Fucosyltransferase, die aus Dictyostellium discoideum stammt, zur Herstellung von 2-Fucosyllactose durch die metabolisch veränderten Organismen der vorliegenden Erfindung.
  • Figurenliste
    • 1: (a) Eine normale Gleichgewichtsreaktion, die in den aktuellen Herstellungstechnologien auftritt (b) Pull/Push- bzw. Zug/Schub-Prinzip: das Gleichgewicht wird hin zum Saccharid und aktivierten Saccharid verschoben. Das Hauptziel einer Zelle ist zu wachsen; von daher zieht sie an dem Saccharid (beispielsweise), um Biomasse zu bilden („Biomasse und/oder biokatalytischer Enzymbildungs-Stoffwechselweg“) und ergänzt die notwendigen Kofaktoren für den Herstellungs-Stoffwechselweg neben dem Lebenserhalt. Infolge dieses Zugeffekts akkumuliert das aktivierte Saccharid in der Zelle und schiebt den Herstellungs-Stoffwechselweg an.
    • 2: Wachstumsrate von E. coli-Transformanten auf Minimalmedium, das ein Plasmid trägt, das für eine Saccharose-Phosphorylase codiert. (Abkürzungen sind in der Tabelle 2 angegeben)
    • 3: Projizierter Kohlenstofffluss im Wildtyp-Stamm. Kleiner Pfeil: Gibt Reaktionen im Stoffwechsel an. Fettgedruckter Pfeil: Gibt verstärkte oder neu eingeführte Reaktionen an. Kreuz: Gibt das Knocking-out bzw. Ausschalten eines Gens oder das Weniger-Funktional-Machen davon an.
    • 4: Projizierter Kohlenstofffluss im Basisstamm 1. Der αGlucose-1-phosphat (αG1P)-Pool im Basisstamm 1 nimmt zu, weil die Hauptreaktionen, die αG1P in Zellkomponenten umwandeln, eliminiert werden. Kleiner Pfeil: Gibt Reaktionen im Stoffwechsel an. Fettgedruckter Pfeil: Gibt verstärkte oder neu eingeführte Reaktionen an. Kreuz: gibt das Knocking-out bzw. Ausschalten eines Gens oder das Weniger-Funktional-Machen von diesem an.
    • 5: Der αGlucose-1-phosphat-Pool in Wildtyp-E. coli MG1655 (WT), wachsen gelassen auf Glucose, E. coli MG1655 P22-BaSP, wachsen gelassen auf Saccharose, und im Plug-Stamm MG1655 ΔglgC Δpgm ΔlacZ P22-BaSP, wachsen gelassen auf Saccharose: SchüttelkolbenExperimente und 1,5 L-Chargen-Experimente
    • 6: Entwicklung von Saccharose, Acetat und der Biomassenkonzentration während einer Kultur von ΔpgmΔlacZΔglgC (3KO) P22-BaSP auf gepuffertem LB-Medium.
    • 7: Entwicklung von αGlucose-1-phosphat-, Fructose-, Glucose- und Pyruvatkonzentration während einer Kultur von ΔpgmΔlacZΔglgC (3KO) P22-BaSP auf gepuffertem LB-Medium.
    • 8: Schematische Ansicht des Cellobiose-Produzenten ΔpgmΔlacZΔglgC (3KO) P22-BaSP-CuCP.
    • 9: Cellobiose-Produktion und Ausbeute von ΔpgmΔlacZΔglgCΔagp (4KO) P22-BaSP-CuCP. Phosphatreich gibt eine Phosphatkonzentration von 0,2 M Phosphat an, phosphatarm gibt eine Konzentration von 13 mM Phosphat an.
    • 10: Ausgehend vom Basisstamm 5, können fucosylierte Zuckerderivate, wie Fucosyllactose und insbesondere 1,2-Fucosyllactose hergestellt werden. Der Stamm wird modifiziert, um die Zelle zur Produktion von Frucose-6-phosphat zu zwingen, was ein Intermediat bzw. Zwischenprodukt in der Synthese von GDP-Fucose ist. Glucose oder Glucose-1-phosphat (falls das Ausgangsenzym entweder eine Sucrase oder eine Saccharose-Phosphorylase ist) wird dann dem zentralen Kohlenstoffmetabolismus über den Pentosephosphatweg zugeführt. Die 10 zeigt die Route zum Produkt und die Biomasse und die benötigten Knockouts, um dies zu erreichen, der linke Stoffwechselweg gibt die optimale Route mit einer Saccharose-Phosphorylase an und der rechte Stoffwechselweg gibt die optimale Route mit einer Invertase, kombiniert mit Glucokinase, an.
    • 11: Genom-Teilsequenz von Wildtyp-Chromosom an der Stelle des pgm-Gens. Die pgm-Gensequenz ist fett/kursiv markiert.
    • 12: Genom-Teilsequenz eines mutanten Stamms, in dem nur eine Narbe an der Stelle des pgm-Gens zurückbleibt. Die Narbensequenz ist fett/kursiv markiert.
    • 13: Genom-Teilsequenz eines mutanten pgm-Stamms, in dem das pgm-Gen durch einen Teil einer GFP-Proteinsequenz ersetzt ist. Die neu eingeführte Sequenz ist fett/kursiv markiert.
    • 14: Genom-Teilsequenz eines mutanten pgm-Stamms, in dem das pgm-Gen durch eine Kanamycin-Kassette ersetzt ist. Die neu eingeführte Sequenz ist fett/kursiv markiert.
    • 15: Die Menge an Glucose, die nach einer Polysaccharid-Hydrolyse für die Wildtyp-Stämme freigesetzt wurde, die mit einer heterologen Saccharose-Phosphorylase, die von Bifidobacterium adolescentis stammt, und einem mutanten Stamm ΔpgmΔagpΔglgCΔlacZΔglkΔptsG mit einer heterologen Saccharose-Phosphorylase, die von Bifidobacterium adolescentis stammt, und einem heterologen Gen tts, das von Streptococcus pneumoniae stammt, transformiert wurden.
    • 16: Kojibiose-, Maltose- und optische Dichte-Entwicklung im Laufe der Zeit eines Kojibioseproduzierenden Stamms mit dem Genotyp ΔlacZΔglgCΔagpΔptsGΔmalPQΔycjU pCXp22MPp22KP.
    • 17: Wachstumsprofil und F6P-Akkumulation eines ΔpgiΔpfkAΔpfkB-mutanten Stamms in einem Saccharose-basierten Medium.
    • 18: Stammbaum der Fucosyltransferasen von den verschiedenen Glycosyltransferase-Familien, der Baum wurde mit MCoffee erstellt (58)
    • 19: Alignment von Dictyostelium discoideum- und Helicobacter pylori-Fucosyltransferase, die in Farbe markierten Aminosäuren sind konservierte Motive, die in den 2-Fucosyltransferasen der GT-Familie 11 zu finden sind. Fettdruck gibt Motiv 1 an, unterstrichen Motiv 2 und kursiv Motiv 3 (67).
    • 20: LC-MS-Resultate des Fucosyltransferase-Assays mit Phenol-Rot. Das obere Chromatogramm ist blanc ohne GDP-Fucose, das untere ist eine Probe des D. discoideum-Fucosyltransferase-Assays. Nach 13,5 min erschien ein Peak von 2FL im Chromatogramm.
    • 21: 2-Fucosyllactose LC MSMS-Analyse des partiellen Fucosyltransferaseenzyms. Das obere Chromatogramm zeigt einen 100 mg/L-Standard von 2-Fucosyllactose, das untere Chromatogramm zeigt den 2-Fucosyllactose-Peak des Enzymassays. In dieser Analyse wurde nur die Masse von 2-Fucosyllactose mit dem Massenspektrometer gescannt.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung offenbart metabolisch veränderte Organismen, besonders Mikroorganismen, die zur Herstellung von Bioprodukten mit Mehrwert mit einer hohen Produktivität und einer garantierten hohen Ausbeute fähig sind. Die Organismen der vorliegenden Erfindung sind metabolisch verändert, so dass zwei eigenständige Routen aufgebaut werden, die zum Produkt und zu Wachstum/Biomasse führen. Dies wird erreicht durch Reduzieren oder Eliminieren der Aktivität von Enzymen, die Reaktionen katalysieren, Umwandeln von Metaboliten aus der ‚Biomasse und/oder biokatalytischem Enzym und/oder Kofaktor-Ergänzungsteil‘ zu Metaboliten aus dem ‚Herstellungs-Stoffwechselweg‘-Teil und umgekehrt, z. B. durch Reduzieren oder Eliminieren/Ausschalten von wenigstens einem, einigen oder allen Genen, die für Enzyme codieren, die Reaktionen durchführen, die die Herstellungs-Stoffwechselweg-Intermediate zu Biomassevorstufen umwandeln, und/oder Reduzieren oder Eliminieren/Ausschalten von wenigstens einem, einigen oder allen Genen, die für Enzyme codieren, die die Reaktionen vollziehen, die die Herstellungs-Stoffwechselweg-Intermediate abbauen. Außerdem beeinträchtigen diese metabolischen/genetischen Veränderungen nicht das Wachstum der veränderten Zellen. Zum Beispiel: Kohlenhydrat-Hydrolasen in Kombination mit Kohlenhydrat-Kinasen, Kohlenhydrat-Synthasen, und, Kohlenhydrat-Phosphorylasen können in die Zelle eingeführt werden. Die letztgenannten Enzyme wandeln die Substrate, die ein Saccharid, ein Oligosaccharid, ein Polysaccharid oder eine Mischung davon umfassen, in eine Zuckergruppierung und eine aktivierte Zuckergruppierung (z. B. eine phosphorylierte Saccharidgruppierung, UDP, CMP, GDP, ADP, TDP oder dTDP... aktivierte Zuckergruppierung) um. Eine weitere metabolische Veränderung der Zellen beinhaltet das Blockieren des Stoffwechselwegs, ausgehend von der aktivierten Zuckergruppierung gegenüber den Biomassebestandteilen. Auf diese Weise wird die (nicht-aktivierte) Zuckergruppierung als ein ‚Brennstoff‘ (oder eine Energiequelle) und ein Baustein für die Synthese von Biomasse von den zahlreichen biokatalytischen Enzymen genutzt, die die Umwandlung der aktivierten Zuckergruppierung zu dem gewünschten Produkt (= z. B. ein Spezialkohlenhydrat) und der erforderlichen Kofaktoren (NADH, ATP, UTP ...) vollziehen. Umgekehrt kann die aktivierte Zuckergruppierung auch als ein ‚Brennstoff‘ verwendet werden, während die Zuckergruppierung durch eine Kohlenhydrat-Kinase aktiviert wird und in die Herstellungsroute des gewünschten Spezialprodukts ‚geschoben‘ wird.
  • Unter Verwendung der veränderten Organismen der vorliegenden Erfindung kann die Produktbildung durch die Umwandlung des aktivierten Zuckers mit Wachstum verknüpft werden, das durch die andere Zuckergruppierung befeuert wird (oder umgekehrt). Auf diese Weise wird der natürliche Antrieb der Zelle zu einer Vermehrung als eine vorteilhafte Eigenschaft genutzt, um die Herstellung des gewünschten Bioprodukts anzuschieben. Dies bedeutet, dass der erstgenannte Nachteil, dass Biomasse hergestellt werden muss, bevor die eigentliche Herstellung des Bioprodukts beginnen kann, nun zu einem Vorteil wird. Diese Methodik führt zu hohen Produktionsraten, ohne die inhärenten Probleme, die Multienzymsysteme und Zweiphasen-Fermentationssysteme mit sich zu bringen. Darüber hinaus können die Organismen der vorliegenden Erfindung das/die gleiche(n) Substrat(e), wie oben angegeben sowohl für das Wachstum als auch die Biomasseherstellung nutzen, und die Herstellung des gewünschten Produkts mit einer hohen Rate, das Gesamtprinzip hinter dieser Stoffwechselveränderungsstrategie, ist somit ein Pull/Push- bzw. Zug/Schub-Prinzip, wie es auch weiter oben erläutert wird. Der zentrale Kohlenstoffmetabolismus, der zu Biomasse und Kofaktoren führt, zieht an einem Teil der Zuckergruppierung für das Wachstum, während der andere Teil in der Zelle akkumuliert, was den Herstellungs-Stoffwechselweg anschiebt.
  • Der letztere Ansatz kann nicht nur zur Herstellung der gewünschten Spezialkohlenhydrate oder aktivierten Kohlenhydrate genutzt werden, sondern kann auch für die Synthese einer breiten Vielzahl an glycosylierten Verbindungen, z. B., Sacchariden, Nucleosiden, Glycosylphosphaten, Glycoproteinen und Glycolipiden, angewandt werden.
  • Mehrere Ausgangsenzyme können zur Aufspaltung des Metabolismus in zwei Teile in Kombination mit Gen-Knockouts bzw. -Ausschaltungen in eine Zelle eingeführt werden. Nicht-beschränkende Beispiele von Enzymen, die zum Aufspalten von Zuckern in ein aktiviertes Saccharid und ein Saccharid verwendet werden können, sind Saccharose-Phosphorylasen, Saccharose-Synthasen, Sucrasen (Invertasen), kombiniert mit einer Glucokinase und/oder Fructokinase, eine Trehalase, kombiniert mit einer Glucokinase, eine Maltase, kombiniert mit einer Glucokinase, eine Saccharose-6-phosphat-Hydrolase, kombiniert mit einer Fructokinase, eine Maltose-Phosphorylase, eine Maltose-Synthase, eine Amylase, kombiniert mit einer Phosphorylase oder Synthase oder Hydrolase, eine Lactose-Synthase, eine Lactose-Phosphorylase, eine Lactase (oder beta-Galactosidase), kombiniert mit einer Galactokinase und/oder einer Glucokinase.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen metabolisch veränderten Organismus für die Herstellung von wenigstens einem Spezialprodukt, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus einem Saccharid, einem aktivierten Saccharid, einem Nucleosid, einem Glycosid, einem Glycolipid und einem Glycoprotein besteht, dadurch gekennzeichnet, dass:
    1. a) der Organismus genetisch modifiziert ist durch die Einführung von wenigstens: i) einem Gen, das eine Kohlenhydrat-Hydrolase codiert, in Kombination mit einem Gen, das eine Kohlenhydrat-Kinase codiert, ii) einem Gen, das eine Kohlenhydrat-Synthase codiert, oder, iii) einem Gen, das eine Kohlenhydrat-Phosphorylase codiert, so dass der Organismus in der Lage ist, ein Disaccharid, Oligosaccharid, Polysaccharid oder eine Mischung davon in ein aktiviertes Saccharid und ein Saccharid aufzuspalten, und
    2. b) der Organismus genetisch weiter modifiziert ist, so dass wenigstens ein anderes Gen als beliebiges der in Schritt a) eingeführten Gene des Organismus weniger funktional oder nicht-funktional gemacht worden ist, und wobei das andere Gen ein Enzym, welches das aktivierte Saccharid in Biomasse umwandelt, und/oder bio-katalytische Enzyme codiert.
  • Der Begriff ‚Saccharid‘ bezieht sich auf Monosaccharide wie, aber nicht beschränkt auf, Aldosen, Ketosen, Pentosen, Methylpentosen, Hexosen, Polyole mit oder ohne entweder Carbonyl-, Carboxyl- , Aminogruppen oder in denen eine Hydroxylgruppe ersetzt wird durch, aber nicht beschränkt auf, eine Wasserstoff-, Amino-, Thiol-, Phosphat- und/oder ähnliche Gruppe oder ein Derivat von diesen Gruppen. Der Begriff ‚Saccharid‘ bezieht sich auch auf Di-, Oligo- und Polysaccharid, die aus einem oder mehreren Monosacchariden wie oben beschrieben bestehen, verknüpft miteinander durch eine glycosidische Bindung.
  • Der Begriff ‚Nucleosid‘ bezieht sich auf jedes Monosaccharid, das mit einem Nucleotid substituiert ist, das zum Beispiel UDP, GDP, ADP, TDP, CMP oder dTDP ist, ohne hierauf beschränkt zu sein.
  • Der Begriff ‚Glycosid‘ bezieht sich auf ein Saccharid, das eine glycosidische Bindung mit anderen chemischen Verbindungen bildet, wie, aber nicht beschränkt auf, Sterole, Phenole, Fettsäuren, Phosphatidylinositole, Vitamin C, Kartenoide und Artimisinin.
  • Der Begriff ‚Glycolipid‘ bezieht sich auf ein Saccharid, welches eine glycosidische Bindung mit einer Fettsäure oder einem Lipid bildet.
  • Der Begriff ‚Glycoprotein‘ bezieht sich auf ein Saccharid, welches eine glycosidische Bindung mit einem Protein bildet.
  • Der Begriff ‚Glycosylphosphat‘ bezieht sich auf ein phosphoryliertes Saccharid.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf einen Organismus, wie oben angegeben, wobei der Organismus genetisch weiter modifiziert ist durch die Einführung von wenigstens einem anderen Gen, welches das aktivierte Saccharid in ein Spezialprodukt umwandelt, oder wobei wenigstens ein anderes endogenes Gen des Organismus, welches das aktivierte Saccharid in ein Spezialprodukt umwandelt, überexprimiert wird.
  • Darüber hinaus bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Organismus, wie oben angegeben, wobei der Organismus in der Lage ist, auf einem Disaccharid, Oligosaccharid, Polysaccharid oder einer Mischung davon als die hauptsächliche Kohlenstoffquelle zu wachsen. Mit dem Begriff ‚hauptsächlich‘ ist die wichtigste Kohlenstoffquelle für die Biomassenbildung gemeint, d. h. 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 % von dem gesamten erforderlichen Kohlenstoff stammt von der oben angegebenen Kohlenstoffquelle. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die besagte Kohlenstoffquelle die einzige Kohlenstoffquelle für den Organismus, d. h. 100 % von dem gesamten Kohlenstoff stammen von der oben angegebenen Kohlenstoffquelle.
  • Der Begriff ‚metabolisches Verändern‘ bezieht sich auf die Praxis der Optimierung von genetischen und regulatorischen Prozessen innerhalb des Organismus, um die Produktion des Organismus einer gewissen erwünschten Substanz oder eines Produkts zu steigern. Das letztgenannte Produkt wird hiermit als ein ‚Spezialprodukt‘ bezeichnet und bezieht sich insbesondere auf ein gewünschtes Saccharid (aktiviert oder nicht-aktiviert), ein Nucleosid, ein Glycosid, ein Glycolipid oder ein Glycoprotein. Einige nicht-beschränkende Beispiele von solchen Produkten sind Zuckerderivate, wie 1,2-Fucosyllactose, 1,3-Fucosyllactose, 1,4-Fucosyllactose, 1,6-Fucosyllactose, Galactinol, Stachyose, Globotriose, Galactose(beta1-4)rhamnose, Sophorose, Cellobiose, UDP-Glucose, Sophorolipide, Myo-Inositol, L-Arabinose, Scyllo-Inosose, Glycosylphosphatidylinositol, Lacto-N-biose, Lacto-N-tetraose, Lactosamine, fucosylierte Galactosyloligosaccharide, L-Fucose, N-Ac-Glucosamin, Sialsäure, Sialyllactose, Chitosan und Chitin.
  • Der Begriff ‚Verändern‘ bezieht sich auf jede allgemein bekannte Technik, die angewandt werden kann, um einen Organismus genetisch zu modifizieren, wie zum Beispiel beschrieben in (9, 17, 19, 21, 22, 42).
  • Die Begriffe ‚ein Organismus, der auf einem Disaccharid, Oligosaccharid, Polysaccharid oder einer Mischung davon als die hauptsächliche Kohlenstoffquelle wachsen kann‘, bedeutet, dass Organismen der vorliegenden Erfindung das gleiche Disaccharid, Oligosaccharid, Polysaccharid oder eine Mischung davon sowohl für das Wachstum (oder die Biomassenherstellung) als auch die Herstellung des gewünschten Produkts verwenden können und dass sie die letztgenannten Saccharide als die einzige Kohlenstoffquelle verwenden können, um sich zu vermehren und/oder um metabolisch aktiv zu sein. Kurzum, die Organismen der vorliegenden Erfindung können sich vermehren und in oder auf einem Medium metabolisieren, welches die Saccharide als die einzige Kohlenstoffquelle umfasst.
  • Mit den Begriffen ‚Aufspalten (oder Umwandlung) in ein aktiviertes Saccharid und ein Saccharid‘ ist gemeint, dass die letztgenannten Saccharide, die als Kohlenstoffquelle verwendet werden, durch den Organismus der vorliegenden Erfindung in eine aktivierte Zuckergruppierung aufgespalten werden (oder umgewandelt werden) , einige nicht-beschränkende Beispiele für aktivierte Zuckereinheiten sind Zuckereinheiten, die eine Phosphat-, eine UDP-, GDP-, ADP-, TDP- oder dTDP-Gruppe tragen, und eine nicht aktivierte Zuckereinheit, die die letzteren Gruppen nicht trägt oder nicht an diese gebunden ist.
  • Der Begriff ‚biokatalytische Enzyme‘ bezieht sich auf alle Enzyme, die für die Herstellung des Spezial-kohlenhydrats benötigt werden.
  • Der Begriff ‚Biomasse‘ bezieht sich auf alle Zellkomponenten (d. h. Proteine, DNA, RNA, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Cardiolipin, Phosphatidylglycerol, Putrescin, Spermidin, Peptidoglycan, Glycogen und/oder Lipopolysacharid (63), die in dem modifizierten Spezialkohlenhydrat-Herstellungsstamm von der Zuckergruppierung synthetisiert werden können, die nicht in der Spezialkohlenhydrat- (und anderen Produkten mit Mehrwert)-Herstellungsroute verwendet wird.
  • Die Begriffe ‚Gene, die weniger funktional oder nicht-funktional gemacht werden‘, beziehen sich auf die allgemein bekannten Technologien für eine Person mit Fachkenntnissen (wie die Verwendung von siRNA, RNAi, miRNA, asRNA, mutierende Gene, Knocking-out-Gene, Transposon-Mutagenese, ..), die zum Verändern der Gene angewandt werden in einer solchen Weise, so dass sie weniger fähig (d. h. statistisch signifikant ‚weniger fähig‘ sind im Vergleich zu einem funktionalen Wildtyp-Gen) oder völlig unfähig (wie knocked-out Gene) sind, um funktionale Endprodukte herzustellen (2, 4, 5, 7, 8, 14, 19, 37, 40, 47, 73, 79, 80, 85, 93, 98).
  • Der Begriff ‚(Gen)-Knockout bzw. -Ausschaltung‘ bezieht sich somit auf ein Gen, das nicht-funktional gemacht ist.
  • Der Begriff ‚Polysaccharid‘ bezieht sich auf ein Saccharid, das 6 oder mehr Monosaccharidunterheiten enthält.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf einen metabolisch veränderten Organismus, wie oben angegeben, wobei die genetische Modifizierung von Schritt a) optional ist oder ersetzt wird durch Überexprimieren von wenigstens: i) einem endogenen Gen, das für eine Kohlenhydrat-Hydrolase in Kombination mit einem endogenen oder heterologen Gen codiert, das für Kohlenhydrat-Kinase codiert, ii) einem endogenen Gen, das für eine Kohlenhydrat-Synthase codiert, oder, iii) einem endogenen Gen, das für eine Kohlenhydrat-Phosphorylase codiert, und wobei der Organismus in der Lage ist, ein Disaccharid, Oligosaccharid, Polysaccharid oder eine Mischung davon in ein aktiviertes Saccharid und ein Saccharid aufzuspalten.
  • Eine bevorzugte Kohlenhydrat-Hydrolase der vorliegenden Erfindung ist eine Lactase, Invertase, Saccharose, Trehalase, Saccharose-6-phosphat-Hydrolase, Maltase oder Amylase. Eine bevorzugte Kohlenhydrat-Kinase der vorliegenden Erfindung ist Galactokinase, eine Fructokinase, eine Glucokinase oder eine Mannokinase.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf einen metabolisch veränderten Organismus, wie oben angegeben, wobei das aktivierte Saccharid in Schritt b) ersetzt wird durch das Saccharid. Daher wird die ‚aktivierte Zuckergruppierung‘ in dieser Ausführungsform als ‚Kraftstoff‘ genutzt, wohingegen die ‚Zuckergruppierung‘ durch eine Kinase aktiviert wird und in die Produktionsroute des gewünschten Spezialprodukts geschoben wird.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf einen metabolisch veränderten Organismus, wie oben angegeben, wobei das Gen in Schritt a) ein Disaccharid, Oligosaccharid oder Polysaccharid in zwei ähnliche oder verschiedene aktivierte Saccharide oder in zwei ähnliche oder verschiedene Saccharide aufspaltet.
  • Der Begriff ‚Organismus‘, wie oben angegeben, bezieht sich auf einen Mikroorganismus, der aus der Auflistung, bestehend aus einem Bakterium, einer Hefe- oder einer Pilzzelle, gewählt ist oder bezieht sich auf eine Pflanzen- oder Tierzelle. Das letztgenannte Bakterium gehört bevorzugterweise der Spezies Escherichia coli an. Die letztgenannte Hefe gehört bevorzugt der Spezies Saccharomyces cerevisiae an.
  • Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen metabolisch veränderten Organismus, wie oben angegeben, wobei das aktivierte Saccharid aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus alpha-Glucose-1-phosphat, alpha-Galactose-1-phosphat, beta-Glucose-1-phospat, beta-Galactose-1-phosphat, Fructose-6-phosphat, Glucose-6-phosphat, UDP-Glucose und UDP-Galactose, und wobei das Saccharid aus der Gruppe gewählt ist, die aus Fructose, Glucose und/oder Galactose besteht.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner, wie oben angegeben, einen metabolisch veränderten Organismus, wie oben angegeben, wobei die Kohlenhydrat-Hydrolase eine Lactase, Invertase, Sucrase, Maltase, Trehalase, Saccharose-6-phosphat-Hydrolase und/oder Amylase ist, und, wobei die Kohlenhydrat-Kinase eine Galactokinase, eine Fructokinase, eine Glucokinase und/oder Mannokinase ist.
  • Noch spezifischer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen metabolisch veränderten Organismus, wie oben angegeben, wobei:
    • - das Gen in Schritt a) eine Saccharose-Phosphorylase codiert, und/oder
    • - die folgenden Gene in Schritt b) nicht-funktional gemacht werden: ein Gen, das eine beta-Galactosidase codiert, und/oder ein Gen, das eine Phosphoglucomutase codiert, und/oder ein Gen, das eine Glucose-1-phosphat-Adenylyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine Phosphatase (wie, aber nicht beschränkt auf, eine Glucose-1-phosphatase) codiert, und/oder ein Gen, das eine Glucose-1-phosphat-Uridyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucose-4-epimerase codiert, und/oder ein Gen, das UDP-Glucose : Galactose-1-phosphat-Uridyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das UDP-Galactopyranose-Mutase codiert, und/oder ein Gen, das UDP-Galactose:(Glucosyl)lipopolysaccharid-1,6-Galactosyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Galactosyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucosyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucuronat-Transferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucose-Lipidträger-Transferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Zucker-Hydrolase codiert, und/oder ein Gen, das eine Invertase codiert, und/oder ein Gen, das eine Maltase codiert, und/oder ein Gen, das eine Trehalase codiert, und/oder ein Gen, das eine Zucker transportierende Phosphotransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine Hexokinase codiert.
  • Ein Beispiel des letzteren metabolisch veränderten Organismus ist ein Organismus wobei:
    • - das Gen in Schritt a) das Gen ist, welches eine Saccharose-Phosphorylase codiert, die möglicherweise (aber nicht nur) aus einem Milchsäurebakterium wie Bifidobacterium adolescentis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus acidophilus und/oder Streptococcus mutans stammt, und/oder
    • - die Gene in Schritt b) Folgende sind: Gen lacZ, das Gen pgm, das Gen ycjU, das Gen glgC, das Gen agp, das Gen ptsG, das Gen glk, das Gen glf, das Gen waaB, das Gen ushA, das Gen wcaA, das Gen wcaC, das Gen wcaE, das Gen wcaI, das Gen wcaL, das Gen wcaJ, das Gen galU, das Gen galF, das Gen galE, das Gen malP, das Gen malQ und/oder das Gen galT (20, 25, 27, 28, 32, 46, 48, 49, 52, 54, 62, 82, 86, 87, 96, 97).
  • Ein anderes Beispiel eines metabolisch veränderten Organismus, wie oben angegeben, ist ein Organismus, bei dem:
    • - das Gen in Schritt a) eine Saccharose-Phosphorylase codiert, welche möglicherweise (aber nicht nur) aus einem Milchsäurebakterium wie Bifidobacterium adolescentis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus acidophilus und/oder Streptococcus mutans stammt, und/oder
    • - die Gene in Schritt b) Folgende sind: das Gen PGM1, das Gen PGM2, das Gen GLG1, das Gen GLG2, das Gen INM1, das Gen INM2, das Gen GLK1, das Gen HXK1, das Gen HXK2, das Gen GAL10, das Gen GAL7, das Gen YHL012W, das Gen UGP1, das Gen GSY1, das Gen GSY2, das Gen DIE2, das Gen ALG8, das Gen ATG26, das Gen SUC2, das Gen MAL32, das Gen MAL12, das Gen YJL216C und/oder das Gen YGR287C und/oder FEN1 und/oder FKS1 und/oder GSC2 und/oder TPS1 (10, 12, 15, 16, 18, 24, 30, 31, 36, 41, 51, 56, 57, 59, 61, 66, 76, 81, 84, 89-91, 99).
  • Die letztgenannten veränderten Organismen können zum Beispiel zur Herstellung von Cellobiose, Kojibiose, Trehalose, L-Arabinose, Myo-Inositol, Raffinose, Stachyose, L-Rhamnose oder L-Ribose als ein Spezialprodukt verwendet werden, ohne hierauf beschränkt zu sein.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf einen metabolisch veränderten Organismus, wie oben angegeben, wobei die Saccharose-Phosphorylase von Schritt a) ersetzt wurde durch eine Saccharose-Synthase, eine Maltose-Phosphorylase oder eine Maltose-Synthase, oder wobei die Saccharose-Phosphorylase von Schritt a) ersetzt wurde durch eine Lactose-Phosphorylase oder eine Lactose-Synthase.
  • Die letztgenannten Organismen können zum Beispiel zur Herstellung von Sophorose, UPD-Glucose, Glycolipiden, Flavon-3-O-β-D-glucosid (Saccharose-Synthase in Schritt a), Galactose(beta1-4)rhamnose (Lactose-Phosphorylase in Schritt a), oder von UDP-Galactose, Galactinol, Stachyose oder Globotriose, Psychosin (Lactose-Synthase in Schritt a) als Spezialprodukte verwendet werden, ohne hierauf beschränkt zu sein.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf einen metabolisch veränderten Organismus, wie oben angegeben, wobei das aktivierte Saccharid in Schritt b) durch das Saccharid ersetzt wird und wobei:
    • - das Gen in Schritt a) eine Saccharose-Phosphorylase codiert, und/oder
    • - die folgenden Gene in Schritt b) nicht-funktional gemacht werden: ein Gen, das eine beta-Galactosidase codiert, und/oder ein Gen, das eine Glucose-6-phosphat-Isomerase codiert, und/oder ein Gen, das eine Glucose-1-phosphat-Adenylyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine Phosphatase (zum Beispiel Glucose-1-phosphatase) codiert, und/oder ein Gen, das eine Phosphofructokinase A codiert, und/oder ein Gen, das eine Phosphofructokinase B codiert, und/oder ein Gen, das Phosphogluconat-Dehydratase codiert, und/oder ein Gen, das 2-Keto-3-deoxygluconat-6-phosphat-Aldolase codiert, und/oder ein Gen, das eine Glucose-1-phosphat-Uridyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucose-4-Epimerase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucose:Galactose-1-phosphat-Uridyltransferase codiert und/oder ein Gen, das eine UDP-Galactopyranose-Mutase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Galactose:(Glucosyl)lipopolysaccharid-1,6-Galactosyl-Transferase codiert und/oder ein Gen, das eine UDP-Galactosyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glycosyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucuronat-Transferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucose-Lipidträger-Transferase codiert, und/oder ein Gen, das GDP-Mannose-Hydrolase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Zucker-Hydrolase codiert, und/oder ein Gen, das eine Mannose-6-phosphat-Isomerase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-N-Acetylglucosamin-enoylpyruvoyl-Transferase codiert und/oder ein Gen, das eine UDP-N acetylglucosamin-Acetyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-N-acetylglucosamin-2-Epimerase codiert, und/oder ein Gen, das eine Undecaprenyl-phosphat-alfa-N-acetylglucosaminyl-Transferase und/oder Glucose-6-phosphat-1-Dehydrogenase codiert, und/oder ein Gen, das eine L-Glutamin : D-Fructose-6-phosphat-Aminotransferase codiert und/oder ein Gen, das eine Mannose-6-phosphat-Isomerase codiert, und/oder ein Gen, das eine Sorbitol-6-phosphat-Dehydrogenase codiert, und/oder ein Gen, das eine Mannitol-1-phosphat-5-Dehydrogenase codiert, und/oder ein Gen, das eine Allulose-6-phosphat-3-Epimerase codiert, und/oder ein Gen, das eine Invertase codiert und/oder ein Gen, das eine Maltase codiert, und/oder ein Gen, das eine Trehalase codiert, und/oder ein Gen, das eine Zucker transportierende Phosphotransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine Hexokinase codiert.
  • Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen metabolisch veränderten Organismus, wie oben angegeben, wobei:
    • - das Gen in Schritt a) die Saccharose-Phosphorylase ist, die aus einem Milchsäurebakterium wie Bifidobacterium adolescentis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus acidophilus oder Streptococcus mutans stammt und/oder
    • - die Gene in Schritt b) Folgende sind: das Gen lacZ, das Gen pgi, das Gen glgC, das Gen agp, das Gen pfkA, das Gen pfkB, das Gen waaB, das Gen ushA, das Gen eda, das Gen edd, das Gen wcaA, das Gen wcaC, das Gen wcaE, das Gen wcaI, das Gen wcaL, das Gen wcaJ, das Gen wcaB, das Gen wcaF, das Gen wcaK, das Gen wcaD, das Gen galU, das Gen galF, das Gen galE, das Gen gmm, das Gen galT, das Gen manA, das Gen murA, das Gen IpxA, das Gen rffE und/oder das Gen rfe, das Gen glmS, das Gen srlD, das Gen mtlD, das Gen alsE und/oder zwf (6, 20, 25, 28, 29, 32, 43, 44, 46, 49, 52-55, 62, 65, 75, 78, 82, 86, 87, 96, 97, 101).
  • Ein anderer metabolisch veränderten Organismus gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Organismus, bei dem:
    • - das Gen in Schritt a) ein Gen ist, das eine Saccharose-Phosphorylase codiert, die aus einem Milchsäurebakterium wie Bifidobacterium adolescentis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus acidophilus oder Streptococcus mutans stammt, und/oder
    • - die Gene in Schritt b) Folgende sind: das Gen PGI1, das Gen PFK1, das Gen PFK2, das Gen PFK26, das Gen PFK26, das Gen PFK27, das Gen GND1, das Gen GND2, das Gen PMI40, das Gen ZWF1, das Gen GFA1, das Gen GLG1, das Gen GLG2, das Gen INM1, das Gen INM2, das Gen GLK1, das Gen HXK1, das Gen HXK2, das Gen GAL10, das Gen GAL7, das Gen YHL012W, das Gen UGP1, das Gen GSY1, das Gen GSY2, das Gen DIE2, das Gen ALG8, das Gen ATG26, das Gen SUC2, das Gen MAL32, das Gen MAL12, das Gen YJL216C und/oder das Gen YGR287C und/oder FEN1 und/oder FKS1 und/oder GSC2 und/oder TPS1 (12, 15, 16, 24, 26, 30, 31, 34, 36, 38, 39, 41, 51, 56, 57, 59-61, 64, 66, 74, 76, 83, 84, 89, 90, 95, 99).
  • Der letztgenannte veränderte Organismus kann zum Beispiel zur Herstellung von fucosylierten Zuckerderivaten, wie Fucosyllactose und insbesondere α-1,2-Fucosyllactose, α-1,3-Fucosyllactose, α-1,4-Fucosyllactose, α-1,6-Fucosyllactose, als Spezialprodukte mit spezifischen Fucosyltransferasen, die zum Beispiel von Helicobacter pylori, Bacteroides sp., Homo sapiens, Mus musculus, Bos taurus und Dictyostelium discoideum stammen, ohne hierauf beschränkt zu sein, verwendet werden. Darüber hinaus kann der veränderte Organismus zur Herstellung von Chitosanen durch eine Chitin-Synthase und Chitin-Deacetylase oder zur Herstellung von Myo-Inositol durch Einführen von Inositol-1-phosphat-Synthase in Kombination mit Inositol-Monophosphatase verwendet werden.
  • Spezifische Beispiele von Genen, die das aktivierte Saccharid in ein Spezialprodukt umwandeln, sind Gene, die für eine Epimerase, eine Transferase, eine Reduktase, eine (Pyro)phosphorylase, eine (De)carboxylase, eine Dehydratase, eine Permease, eine Synthase und/oder eine Isomerase codieren. Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen metabolisch veränderten Organismus, wie oben angegeben, wobei die Gene, die das aktivierte Saccharid in ein Spezialprodukt umwandeln, für eine Epimerase, Transferase, Reduktase, Dehydrogenase, Oxidase, Pyrophosphorylase, (De)carboxylase, Dehydratase, Permease, Synthase und/oder Isomerase codieren. Die vorliegende Erfindung bezieht sich sogar noch spezifischer auf die letztgenannten, metabolisch veränderten Organismen, wobei die Epimerase UDP-Galactose-4-Epimerase oder UDP-N-acetylglucosamin-Epimerase ist und/oder wobei die Transferase eine Glycosyltransferase, eine Sialyltransferase oder eine Sulfotransferase ist.
  • Die Erfindung bezieht sich ferner auf einen metabolisch veränderten Organismus, wie oben angegeben, wobei das Spezialprodukt ein Monosaccharid, ein Disaccharid, ein Trisaccharid, ein Tetrasaccharid, ein Pentasaccharid, ein Oligosaccharid, ein Polysaccharid, ein Nucleosid, ein O-Glycosid, ein S-Glycosid, ein N-Glycosid, ein C-Glycosid, ein Glycoprotein, ein Glycolipid oder ein aktiviertes Kohlenhydrat ist, wie, aber nicht beschränkt auf, Myo-Inositol, L-Arabinose, Scyllo-Inosose, Glycosylphosphatidylinositol, Lacto-N-biose, Lacto-N-tetraose, Lactosamin, fucosylierte GalactosylOligosaccharide (GOS), L-Fucose, N-Ac-Glucosamin, Sialsäure, Sialyllactose, Chitosan, Chitin, 1,2-Fucosyllactose, 1,3-Fucosyllactose, 1,4-Fucosyllactose, 1,6-Fucosyllactose, Galactinol, Stachyose, Globotriose, Galactose(beta1-4)rhamnose, Sophorose, Cellobiose, UDP-Glucose und Sophorolipide.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Herstellung eines Spezialprodukts, wie weiter oben beschrieben, das Folgendes umfasst:
    • i) metabolisches Verändern eines Mikroorganismus wie oben beschrieben, und
    • ii) Kultivieren des genetisch veränderten Mikroorganismus, und
    • iii) Extrahieren und Reinigen des Spezialprodukts.
  • Es ist klar, dass jede im Fachbereich bekannte Methodik zum Kultivieren von Mikroorganismen und zum Extrahieren und Reinigen von Spezialprodukten von der Kultivierung in der vorliegenden Erfindung angewandt werden kann.
  • Darüber hinaus bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer 2-Fucosyltransferase, die von Dictyostelium discoideum stammt und die eine Aminosäuresequenz, angegeben durch SEQ ID N° 1 oder ein Fragment davon mit 2-Fucosyltransferase-Aktivität, oder eine Variante davon mit einer Sequenzidentität von wenigstens 75 % und mit 2-Fucosyltransferase-Aktivität zur Herstellung von 2-Fucosyllactose (α1,2-Fucosyllactose) aufweist. Ein spezifisches Fragment mit 2-Fucosyltransferase-Aktivität, wie oben angegeben, ist durch SEQ ID N° 4 dargestellt.
  • Auch die Verwendung einer Nukleinsäure, die für eine 2-Fucosyltransferase codiert, wie oben angegeben und insbesondere wobei die Nukleinsäure durch SEQ ID N° 2 oder SEQ ID N° 3 dargestellt ist (die beide für SEQ ID N° 1 codieren), zur Herstellung von Fucosyllactose ist Teil der vorliegenden Erfindung. Nukleinsäuren, die für SEQ ID N° 4 codieren, sind durch SEQ ID N° 5 und SEQ ID N° 6 angegeben und sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
  • Der Begriff ‚Fragment‘ bezieht sich auf ein Protein (oder Peptid oder Polypeptid), das weniger Aminosäuren enthält als die Aminosäuresequenz, wie durch SEQ ID N° 1 dargestellt und die die 2-Fucosyltransferase-Aktivität beibehält. Ein solches Fragment kann zum Beispiel ein Protein mit einer Deletion von 10% oder weniger der Gesamtzahl von Aminosäuren am C- und/oder N-Terminus sein oder kann SEQ ID N° 4 entsprechen. Der Begriff „Variante“ bezieht sich auf ein Protein mit wenigstens 75 % Sequenzidentität, bevorzugterweise mit wenigstens 76 - 85 % Sequenzidentität, stärker bevorzugt mit wenigstens 86 - 90% Sequenzidentität oder am meisten bevorzugt mit wenigstens 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99 % Sequenzidentität mit SEQ ID N° 1 oder mit einem Fragment davon und das für ein Protein codiert, das die 2-Fucosyltransferase-Aktivität beibehält.
  • Von daher sind Orthologa oder Gene in anderen Gattungen und Spezies (als Dictyostellium discoideum, von denen SEQ ID N° 1 abgeleitet ist) mit wenigstens 75% Identität auf Aminosäureebene und mit der beschriebenen Funktion Teil der vorliegenden Erfindung. Die Prozent Aminosäure-Sequenzidentität werden durch Alignment der zwei Sequenzen und Identifikation der Anzahl von Positionen mit identischen Aminosäuren, geteilt durch die Zahl der Aminosäuren in der kürzeren der Sequenzen x 100, bestimmt. Die letztgenannte ‚Variante‘ kann auch von dem Protein wie durch SEQ ID N° 1 dargestellt nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen differieren, so dass die Fähigkeit des Proteins, 2-Fucosyltransferase-Aktivität zu haben, beibehalten wird. Eine „konservative Substitution“ ist eine, in der eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure substituiert wird, die ähnliche Eigenschaften hat, so dass eine Person mit Fachkenntnissen auf dem Gebiet der Proteinchemie erwarten würde, dass die Natur des Proteins im Wesentlichen unverändert ist. Im Allgemeinen repräsentieren die folgenden Gruppen von Aminosäuren konservative Veränderungen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; und (5) phe, tyr, trp, his.
  • Varianten können auch (oder alternativ) Proteine sein, wie hierin beschrieben, modifiziert zum Beispiel durch die Deletion oder Addition von Aminosäuren, die minimalen Einfluss auf die 2-Fucosyltransferase-Aktivität wie oben definiert, die Sekundärstruktur und die hydropathische Natur des Enzyms haben.
  • Die folgenden spezifischen Sequenzen, wie oben angegeben, sind Teil der vorliegenden Erfindung:
    Figure DE202011111144U1_0001
    Figure DE202011111144U1_0002
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    Figure DE202011111144U1_0004
  • Die vorliegende Erfindung ist nachfolgend durch spezifische Arbeitsbeispiele veranschaulicht.
  • Beispiele
  • Beispiel 1 Materialien und Methoden
  • Medien
  • Das Luriabrühe (LB)-Medium bestand aus 1% Tryptonpepton (Difco, Erembodegem, Belgien), 0,5 % Hefeextrakt (Difco) und 0,5 % Natriumchlorid (VWR, Leuven, Belgien). Das Medium für die Schüttelkolbenexperimente enthielt 2,00 g/L NH4Cl, 5,00 g/L (NH4)2SO4, 2,993 g/L KH2PO4, 7,315 g/L K2HPO4, 8,372 g/L MOPS, 0,5 g/L NaCl, 0,5 g/L MgSO4·7H2O, 14,26 g/L Saccharose oder eine weitere Kohlenstoffquelle, wenn es in den Beispielen spezifiziert ist, 1 ml/l Vitaminlösung, 100 µl/l Molybdatlösung und 1 ml/l Selenlösung. Das Medium wurde auf einen pH-Wert von 7 mit 1M KOH eingestellt.
  • Die Vitaminlösung bestand aus 3,6 g/L FeCl2 · 4H2O, 5 g/L CaCl2 · 2H2O, 1,3 g/L MnCl2 · 2H2O, 0,38 g/L CuCl2 · 2H2O, 0,5 g/L CoCl2 · 6H2O, 0,94 g/L ZnCl2, 0,0311 g/L H3BO4, 0,4 g/L Na2EDTA· 2H2O und 1,01 g/L Thiamin · HCl. Die Molybdatlösung enthielt 0,967 g/L Na2MoO4 · 2H2O. Die Selenlösung enthielt 42 g/L SeO2.
  • Das Minimal-Medium für die Fermentationen enthielt 6,75 g/L NH4Cl, 1,25 g/L (NH4)2SO4, 1,15 g/L KH2PO4 (Medium mit niedriger Phosphatmenge) oder 2,93 g/L KH2PO4 und 7,31 g/L KH2PO4 (Medium mit hoher Phosphatmenge), 0,5 g/L NaCl, 0,5 g/L MgSO4·7H2O, 14,26 g/L Saccharose, 1 ml/l Vitaminlösung, 100 µl/l Molybdatlösung und 1 ml/l Selenlösung mit der gleichen Zusammensetzung, wie oben beschrieben.
  • Das Komplexmedium wurde durch Autoklavieren (121 °C, 21') und das Minimal-Medium durch Filtration (0,22 µm Sartorius) sterilisiert. Wenn notwendig, wurde das Medium durch Hinzusetzen eines Antibiotikums (Ampicillin, Chloramphenicol, Kanamycin) selektiv gemacht.
  • Kuitivierungsbedingungen
  • Eine Vorkultur aus einer einzelnen Kolonie auf einer LB-Platte in 5 mL LB-Medium wurde während 8 Stunden bei 37°C auf einem Orbitalschüttler bei 200 U/min inkubiert. Aus dieser Kultur wurden 2 mL in 100 mL Minimal-Medium in einem 500 mL Schüttelkolben übertragen und für 16 Stunden bei 37 °C auf einem Orbitalschüttler bei 200 U/min inkubiert. 4%-iges Inokulum wurde in einem 2-L-Biostat-B-Plus-Kulturgefäß mit 1,5 L Arbeitsvolumen (Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Deutschland) verwendet. Die Kulturbedingungen waren: 37 °C, Rühren bei 800 U/min und eine Gasflussrate von 1,5 L/min. Aerobe Bedingungen wurden durch Durchperlen mit Luft aufrechterhalten. Der pH-Wert wurde bei 7 mit 0,5 M H2SO4 und 4 M KOH gehalten. Das Abgas wurde auf 4 °C durch einen Abgaskühler (Frigomix 1000, Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Deutschland) heruntergekühlt. 10%-ige Lösung von Silikon-Antischaummittel (BDH 331512K, VWR Int Ltd., Poole, England) wurde hinzugesetzt, wenn ein Aufschäumen während der Fermentation zunahm (ungefähr 10 µL). Das entweichende Gas wurde mit einem EL3020-Gasanalysator (ABB Automation GmbH, 60488 Frankfurt am Main, Deutschland) gemessen. Alle Daten wurden mit dem Sartorius MFCS/Win v3.0 System (Sartorius Stedim Biotech, Melsungen, Deutschland) aufgezeichnet.
  • Alle Stämme wurden wenigstens zweimal kultiviert, und die angegebenen Standardabweichungen über den Erträgen und Raten basieren auf wenigstens 10 Datenpunkten, die während wiederholter Experimente gemessen wurden.
  • Sampling bzw. Probenahme
  • Der Bioreaktor enthält in seinem Inneren ein Entnahmerohr („harvest pipe“) (BD Spinal Needle, 1,2x152 mm (BDMedical Systems, Franklin Lakes, NJ - USA), das mit einem Reaktoranschluss verbunden ist, der außen mit einer Masterflex-14 Verschlauchung (Cole-Parmer, Antwerpen, Belgien) gefolgt von einem Entnahmeanschluss („harvest port“) mit einem Septum für die Probenahme verknüpft ist. Die andere Seite dieses Entnahmeanschlusses ist zurück zum Reaktorgefäß mit einer Masterflex-16 Verschlauchung verbunden. Dieses System wird auch als Rapid Sampling Loop (rasche Probenahmeschleife) bezeichnet. Während der Probenahme wird die Reaktorbrühe in dem Sampling Loop umhergepumpt. Es ist geschätzt worden, dass bei einer Flussrate von 150 mL/min die Reaktorbrühe 0,04 s benötigt, um den Entnahmeanschluss zu erreichen und 3,2 s benötigt, um in den Reaktor wiedereinzutreten. Bei einem pO2-Niveau von 50% gibt es etwa 3 mg/L Sauerstoff in der Flüssigkeit bei 37 °C. Das pO2-Niveau sollte niemals unter 20% fallen, um mikro-aerobe Bedingungen zu vermeiden. Daher können 1,8 mg/L Sauerstoff während dem Transit durch die Entnahmeschleife verbraucht werden. Wird eine Sauerstoffaufnahmerate von 0,4 g Sauerstoff/g Biomasse /h (die maximale Sauerstoffaufnahmerate, die bei µmax gefunden wird) angenommen, ergibt dies für 5g/L Biomasse eine Sauerstoffaufnahmerate von 2g/L/h oder 0,56 mg/L/s, was mit 3,2s multipliziert (Verweildauer in der Schleife) 1,8 mg/L Sauerstoffverbrauch ergibt.
  • Um den Metabolismus von Zellen während der Probenahme zu quenchen, wurde die Reaktorbrühe durch den Ernteanschluss in eine Spritze eingesaugt, die mit 62g rostfreien Edelstahl-Kügelchen gefüllt ist, die auf -20°C vorgekühlt sind, um 5 mL Brühe unmittelbar auf 4 °C herunter zu kühlen. Der Probenahme folgte unmittelbar eine Kaltzentrifugation (15000 g, 5 min, 4 °C). Während der Batch-Experimente wurden Proben für OD600nm, CDW und extrazelluläre Metabolite jede Stunde unter Verwendung des Rapid Sampling Loops und der Kalte-rostfreie-Edelstahlkügelchen-Methode genommen. Wenn das exponentielle Wachstum erreicht war, wurde die Sampling- bzw. Probenahme-Frequenz auf alle 20 bis 30 Minuten erhöht.
  • Brühen-Samplina bzw. -Probenahme
  • Unter Verwendung eines Rapid Sampling bzw. einer raschen Probenahme, welches mit dem Fermenter gekoppelt wurde, wurden Proben von 1 mL Brühe aus dem Fermenter innerhalb von 0,5 s entnommen. Die Proben wurden direkt in Röhrchen entnommen, die 5 mL Quenchlösung enthielten, welche auf -40°C vorgekühlt war, wobei die Röhrchen unmittelbar nach der Probenahme durch Vortexen gemischt wurden. Die exakte Probengrößen wurden gravimetrisch durch Abwiegen der Röhrchen vor und nach der Probenahme quantifiziert.
  • Filtrat-Samplina bzw. -Probenahme
  • Proben von extrazellulärer Kulturflüssigkeit wurden mit Spritzenfiltern (Porengröße 0,45 µm, Celluloseacetat) bei Raumtemperatur ohne Kügelchen erhalten - Direktfiltration der Brühenprobe. Nach der Entfernung der Zellen wurde das erhaltene Filtrat oder der Überstand sofort mit 5 mL Quenchlösung vermischt, um diese Proben auf die gleiche Art wie die Brühenproben zu verarbeiten. In diesem Fall wurde die exakte Menge der erhaltenen Probe ebenfalls gravimetrisch quantifiziert.
  • Quench(ing)- Verfahren
  • Die Quenchlösung, die verwendet wurde, war ein 60% (v/v) wässriges Methanol. Nach dem Quenchen der Brühenproben in der Quenchlösung, die auf -40°C vorgekühlt war, wurde die Probe/Quenchlösung-Mischung für 5 min bei 8000g in einer gekühlten Zentrifuge (-20°C) unter Verwendung eines Rotors zentrifugiert, der auf -40°C vorgekühlt war. Nach dem Dekantieren wurde der Überstand (QS) bei -40°C bis zur Extraktion gelagert. Anschließend wurden die Zellpellets in 5 mL -40°C kalter Quenchlösung resuspendiert und erneut zentrifugiert. Dieser zweite Überstand (WS) wurde ebenfalls bei -40°C bis zur Extraktion gelagert. Für die Messung der Metabolite in der Gesamtbrühe sowie dem Kulturfiltrat wurde das gleiche Quench-Verfahren angewandt; allerdings wurden die gequenchten Gesamtbrühen-Mischungen (B) oder gequenchten Kulturfiltrate (F) nicht zentrifugiert, allerdings wurden nach gründlichem Vortexen 500 µL dieser Mischungen für die Metabolit-Extraktion entnommen.
  • Metabolit-Extraktionsverfahren
  • Die Extraktion der Metabolite aus den Zellpellets sowie aus den 500-µL-Proben aus der gequenchten Gesamtbrühe wurde mit dem Heißes-Ethanol-Verfahren [34] durchgeführt. Die Metabolite wurde in 75%-igem kochenden Ethanol (3 min, 90 °C) extrahiert. Nach dem Kühlen wurden die so erhaltenen Extrakte bis zur Trockne in einem RapidVap (Labconco Corporation, Kansas, Missouri, USA) während 110 min unter Vakuum abgedampft. Nach der Resuspension jedes Rests in 500 µL H2O wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugieren über 5 min bei 5000g entfernt. Nach dem Dekantieren wurden die Überstände bei -80°C bis zur weiteren Analyse gelagert.
  • Analytische Verfahren
  • Die Zelldichte der Kultur wurde häufig durch Messen der optischen Dichte bei 600 nm überwacht (Uvikom 922 spectrophotometer, BRS, Brüssel, Belgien). Das Zelltrockengewicht wurde durch Zentrifugieren erhalten (15 min, 5000 g, GSA Rotor, Sorvall RC-5B, Goffin Meyvis, Kapellen, Belgien) und zwar von 20 g Reaktorbrühe in vorgetrockneten und gewichteten Falcons. Die Pellets wurden anschließend einmal mit 20 mL physiologischer Lösung (9 g/L NaCl) gewaschen und bei 70 °C auf ein konstantes Gewicht getrocknet. Um in der Lage zu sein, OD600nm-Messungen in Biomassen-Konzentrationen umzuwandeln, wurde eine Korrelationskurve von OD600nm-zu-BiomassenKonzentration angefertigt. Die Konzentrationen von Glucose und organischen Säuren wurde auf einem Varian Prostar HPLC System (Varian, Sint-Katelijne-Waver, Belgien) unter Verwendung einer Aminex HPX-87H Säule (Bio-Rad, Eke, Belgien) bestimmt, die auf 65 °C erhitzt ist und die mit einer 1 cm Vorsäule ausgestattet ist, die 5 mM H2SO4 (0,6 ml/min) als die Mobile Phase verwendet. Ein Dual-Wave UV-VIS (210 nm und 265 nm) Detektor (Varian Prostar 325) und ein Differential-Brechungsindex-Detektor (Merck LaChrom L-7490, Merck, Leuven, Belgien) wurden für den Peak- bzw. Maximum-Nachweis verwendet. Durch Division der Absorptionen der Peaks bei sowohl 265 nm als auch 210 nm könnten die Peaks identifiziert werden. Die Division resultiert in einer Konstante, die typisch für eine bestimmte Verbindung ist (Formel von Lambert-Beer).
  • Kohlenhvdratmessungen
  • Glucose, Fructose, Saccharose und Glucose-1-phoshat wurden durch HPLC mit einer Hypercarb-Säule (100x4,6 mm; 5µm Partikelgröße) gemessen und wurden mit einem ELSD-Detektor oder Massenspektrometer nachgewiesen (Antonio et al., 2007; Nielsen et al., 2006). Der LOQ von Saccharose und G1P betrug 30 beziehungsweise 20 mg/L. Alle Proben wurden innerhalb der linearen Reichweite des Detektors verdünnt, der zwischen dem LOQ und ungefähr 100 mg/L des Metabolits liegt. Wenn mehrere phosphorylierte und Nukleotid-Zucker in der Brühe vorlagen, wurde eine Adaption der Methode von Bucholz et al. angewandt (11). In diesem Fall wurde ein Gradient von miliQ Wasser (A) und 20 mM Ammoniumacetat (B) verwendet, um die Analyten zu trennen. Der Gradient startete bei 100% A mit einem Fluss von 1 mL/min und veränderte sich auf 100% B bei 1 mL/min über 10 Minuten. Die Eluent-Zusammensetzung von 100% B wurde dann für 4 Minuten bei 1 mL/min gehalten und dann auf 100% A bei 1 mL/min über 1 Minute verändert, wonach der Fluss auf 1,2 mL/min erhöht wurde und für 3 Minuten gehalten wurde, um die Äquilibrierungszeit bzw. Zeit bis zum Gleichgewicht der Säule zu verringern. Nach diesen drei Minuten wurde der Fluss erneut in 2 Minuten auf 1 mL/min verringert. Alle Analyten wurden mit entweder einem ELSD-Detektor oder Massenspektrometer nachgewiesen.
  • Für die Analyse von Mono-, Di- und Oligosacchariden wurde eine Prevail Carbohydrate ES (5µ; 250 x 4,6 mm) Säule mit einem Gradienten von 100% Aceton (A), 100% Acetonitril (B) und 100% Wasser (C) verwendet. Der Gradient wird bei 20% A, 60% B und 20% C begonnen. Dies wird über 15 Minuten auf 15%A, 45%B und 40%C verändert und dann zurück auf 20% A, 60% B und 20% C innerhalb von 1 Minute verändert. Die Säule wird dann bei seinen Ausgangsbedingungen für 6 Minuten äquilibriert. Alle Analyten wurden entweder mit ELSD oder Massenspektrometer gemessen.
  • Messung des Zelltrockengewichts
  • Aus einer Brühenprobe wurden 4 × 10 g in Zentrifugenröhrchen übertragen, die Zellen wurden abgesetzt (5000g, 4 °C, 5 min) und die Zellen wurden zweimal mit 0,9% NaCI-Lösung gewaschen. Die Zentrifugenröhrchen, welche die Zellpellets enthielten, wurden in einem Ofen bei 70 °C für 48h bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet. Das Zelltrockengewicht wurde gravimetrisch erhalten; die Röhrchen wurden in einem Exsikkator vor dem Wiegen gekühlt.
  • Sophorose-Poivsaccharid-Messung
  • Um die Menge an Sophorose-Polysaccharid zu bestimmen, die durch einen Mutantenstamm hergestellt wurde, in welchem das heterologe tts Gen (50) exprimiert wurde, wurde eine 100 mL Kultur dieser Mutante und des Wildtyp-Stammes bei ungefähr OD 6 zentrifugiert (5500 U/min, 4°C, 5 Minuten, Heraus Biofuge Stratos). 80ml an Überstand wurde dann mit 2 Volumina an kaltem Ethanol (100% bei -20°C) ausgefällt und über Nacht bei 6°C gelagert. Das Präzipitat wurde von dem Überstand durch Zentrifugation abgetrennt (5500 U/min, 4°C, 5 min, Hereaus Biofuge Stratos) und in 25 mL destilliertem Wasser (88) resuspendiert. 2 mL dieser Polysaccharidlösung wurde dann in Pyrex-Borosilicatröhrchen (26 × 100 mm) bei 105°C mit 2,25 M HCl (Endkonzentration) für 4h hydrolysiert. Um die Lösung für die Glucosemessung zu neutralisieren, wurden äquimolare Mengen an NaOH zu der Lösung nach der Inkubation und dem Kühlen hinzugefügt. Die Menge an Glucose in der Lösung wurde mit einem YSI-Biochemie-Analysator (YSI (UK) Ltd.) bestimmt.
  • Stämme und Plasmide, die für die Dictvostellium discoideum α1,2-Fucosvltransferase-Charakterisierung verwendet wurden
  • Ein Codon, der für α1,2-Fucosyltransferase optimiert war, der aus Dictyostellium discoideum stammt, wurde heterolog in E. coli exprimiert, welches den Genotyp ΔlacZΔglgCΔmanAΔCA auf einem Plasmid aufweist, welches wie durch Aerts et al. (1) beschrieben konstruiert wurde. CA gibt alle Gene in dem Gen-Cluster an, der für den Colansäure-Biosynthese-Stoffwechselpfad codiert, der durch Stevenson et al. (86) beschrieben worden ist.
  • Enzvm-Isolationsmethodologie
  • Die Stämme wurden in LB (10 g/L Trypton, 5g/L Hefeextrakt und 10 g/L NaCL) in einer Übernacht-Kultur (100 mL in 500 mL Schüttelkolben) bei 37°C und 200 U/min angezogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (15 Minuten bei 7500 U/min und 4°C) geerntet. Dieses Pellet wurde in 5 mL PBS-Puffer resuspendiert und 3-mal für 4 Minuten auf Eiswasser im Ultraschallbad behandelt („sonicated“) (Zyklus 50%, Intensität 3). Die Zelltrümmer wurden erneut 15 Minuten bei 7500 U/min und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde als roher Zellextrakt verwendet.
  • Proteinbestimmung
  • Der Proteingehalt des Enzymextrakts wurde mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo) wie im Produkthandbuch spezifiziert gemessen.
  • Plasmidkonstruktion für die Expression heteroloaer und homologer Gene
  • Das Plasmid, welches wie durch Aerts et al. (1) beschrieben konstruiert wurde.
  • Genetische Verfahren
  • Die Plasmide wurden in dem Wirt E. coli DH5α (F-, φ80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, λ-, thi-1, gyrA96, relA1) aufrechterhalten.
  • Plasmide. Die pKD46- (Red-Helper-Plasmid, bzw. Rotes-Helferplasmid, Ampicillinresistenz), pKD3-(enthält ein FRT-flankiertes Chloramphenicolresistenz (cat) -Gen), pKD4- (enthält ein FRT-flankiertes Kanamycinresistenz (kan) -Gen) und pCP20- (exprimiert FLP-Rekombinaseaktivität) -Plasmide wurden von Prof. Dr. J-P Hernalsteens (Vrije Universiteit Brussel, Belgien) erhalten. Das Plasmid pBluescript (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) wurde verwendet, um die Derivate von pKD3 und pKD4 mit einer Promotorbibliothek oder mit Allelen, die eine Punktmutation tragen, zu konstruieren.
  • Mutationen. Die Mutationen bestanden aus Gendisruption (Knock-out, KO) beziehungsweise Ersetzen eines endogenen Promotors durch einen künstlichen Promotor (Knock-in, KI). Sie wurden unter Verwendung des Konzepts von Datsenko und Wanner (19) eingebracht.
  • Transformanten, welche ein Red-Helper-Plasmid trugen, wurden in 10 mL LB-Medien mit Ampicillin (100 mg/L) und L-Arabinose (10 mM) bei 30 °C bis zu einem OD600nm von 0,6 angezogen. Die Zellen wurden elektrokompetent gemacht und zwar durch Waschen dieser mit 50 mL eiskaltem Wasser ein erstes Mal und mit 1 mL eiskaltem Wasser ein zweites Mal. Dann wurden die Zellen in 50 µL eiskaltem Wasser resuspendiert. Die Elektroporation wurde mit 50 µL an Zellen und 10-100 ng an linearem, doppelsträngigem DNA-Produkt durch Verwendung eines Gene Pulser™ (BioRad) (600 Ω, 25 µFD und 250 Volt) durchgeführt.
  • Nach der Elektroporation wurden die Zellen zu 1 mL LB-Medien hinzugefügt, inkubiert für 1h bei 37°C und schließlich auf LB-Agar ausgebreitet, welches 25mg/L Chloramphenicol oder 50 mg/L Kanamycin enthielt, um die Antibiotikaresistenz-Transformanten auszuwählen. Die ausgewählten Mutanten wurden durch PCR mit Primern stromaufwärts bzw. upstream und stromabwärts bzw. downstream der modifizierten Region verifiziert und wurden in LB-Agar bei 42 °C, um einen Verlust des Helferplasmids zu erreichen, angezogen. Die Mutanten wurden auf eine Ampicillinsensibilität getestet.
  • Eliminierung des Antibiotikaresistenz-Gens
  • Die ausgewählten Mutanten (Chloramphenicol- oder Kanamycin-resistent) wurden mit pCP20-Plasmid transformiert, welches ein Ampicillin- und Chloramphenicol-resistentes Plasmid ist, das eine temperatursensible Replikation und thermische Induktion der FLP-Synthese zeigt. Die Ampicillinresistenten Transformanten wurden bei 30°C ausgewählt, wonach einige Kolonie-aufgereinigt wurden in LB bei 42°C und dann auf einen Verlust aller antibiotischer Resistenzen und des FLP-Helferplasmids getestet wurden. Die Gen-Knock-outs und -Knock-ins werden mit Kontroll-Primern überprüft und sequenziert.
  • Die Primer, welche verwendet wurden, um die verschiedenen Knock-out- und Knock-in-Mutanten zu konstruieren sind in der Tabelle 1 aufgelistet. Tabelle 1: Primer, die für die Konstruktion des Gen-Knock-outs verwendet wurden
    Gen Fw-P1-H1 Rv-P2-H2
    lacZ CATAATGGATTTCCTTACGCGAAATAC GGGCAGACATGGCCTGCCCGGTTATT Agtgtaggctggagctgcttc GTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT AACAATTTCACACAGGAAACAGCTcatat gaatatcctccttag
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    agp CATATTTCTGTCACACTCTTTAGTGATT GATAACAAAAGAGGTGCCAGGAgtgtag gctggagctgcttc TAAAAACGTTTAACCAGCGACTCCCCC GCTTCTCGCGGGGGAGTTTTCTGcatat gaatatcctccttag
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    pfkA GACTTCCGGCAACAGATTTCATTTTGC ATTCCAAAGTTCAGAGGTAGTCgtgtagg ctggagctgcttc GCTTCTGTCATCGGTTTCAGGGTAAAG GAATCTGCCTTTTTCCGAAATCcatatgaa tatcctccttag
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    pgm via D&W TGAGAAGGTTTGCGGAACTATCTAAAA CGTTGCAGACAAAGGACAAAGCAgtgta ggctggagctgcttc CATACGTAAAAAAGGGCGATCTTGCGA CCGCCCTTTTTTTATTAAATGTGTcatatg aatatcctccttag
    pgm::kan TGAGAAGGTTTGCGGAACTATCTAAAA CGTTGCAGACAAAGGACAAAGCAACG AAAGGCTCAGTCGAAAG CATACGTAAAAAAGGGCGATCTTGCGA CCGCCCTTTTTTTATTAAATGTGTAGAA CTCCAGCATGAGATCC
    pgm::GFP TGAGAAGGTTTGCGGAACTATCTAAAA CGTTGCAGACAAAGGACAAAGCAgtgta ggctggagctgcttc CATACGTAAAAAAGGGCGATCTTGCGA CCGCCCTTTTTTT ATT AAA TGTGTCA TC CGTCAGGATGGCCTTC
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    glk CGAGAAGGCCCGGATTGTCATGGACG ATGAGATACACCGGAATATCATGGgtgt aggctggagctgcttc CCAGGTATTTACAGTGTGAGAAAGAAT TATTTTGACTTTAGCGGAGCAGTTGAA GAcatatgaatatcctccttag
    malPQ ATATCCAGCCAGTCTTCCGGCTGTAGT CCTAACAGAGCACTGTTACTGTCagcatt acacgtcttgagcg GCTTTAAGTGGTTGAGATCACATTTCC TTGCTCATCCCCGCAACTCCTCCcatatg aatatcctccttag
    MP KI ATATCCAGCCAGTCTTCCGGCTGTAGT CCTAACAGAGCACTGTTACTGTC GTAAAACGACGGCCAGTG CAACGGCCATTTTTTGCACTTAGATAC AGATTTTCTGCGCTGTATTGCATTGCC GGGATCCGATGCATATGG
    ycjU TTTTATTTTGCCCTTCAATGGGACCGC TACCAAACATCAGGAGGATGAATGAAA Cagcattacacgtcttg agcg TTCCGTTGAAGGCAACAGTAATTGCGC CCCGGTTAAGCCCGCGCCGATCCcatat gaatatcctccttag
    CA via D&W GTAGCATTGTTCCTAAGTATGACTCCA TTTTTCCAGGAATGGTCGCAAATCgtgta ggctggagctgcttc TTCACGCCGCATCCGGCAAGCAAACC AGCTCATAAGCCGGGAGAACAACCcat atgaatatcctccttag
    CA via sacB TTCACGCCGCA TCCGGCAAGCAAACC AGCTCA T AAGCCGGGAGAACAACCccg cttacagacaagctgtg GT AGCA TTGTTCCT AAGT A TGACTCCA TTTTTCCAGGAA TGGTCGCAAA TCagcc atgacccgggaattac
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    wcaJ via sacB und Fusion PCR GGGGGCCCCCGGGGGTATGAGCTTA CGTGAAAAAACCATCAG GGGCCCGGGCCCGGGCGTTGTTCCT GTTATTAGCCCCTTACCC
    wcaJ via D&W ATCGCCGACCACTTCGCGCCGCTGAT GGTTTTTTCACGTAAGCTCATATCgtgta ggctggagctgcttc GGATCTTCCCTTACCCCACTGCGGGT AAGGGGCTAATAACAGGAACAACGcata tgaatatcctccttag
    wcaJ via D&W_2 TTTTGATATCGAACCAGACGCTCCATT CGCGGATGTACTCAAGGTCGAACgtgta ggctggagctgcttc TCTATGGTGCAACGCTTTTCAGATATC ACCATCATGTTTGCCGGACTATGcatatg aatatcctccttag
    galET-H1-P22-RBS TAGCCAAATGCGTTGGCAAACAGAGA TTGTGTTTTTTCTTTCAGACTCATCTTT GTTTCCTCCGAATTCG CGGTTCGACGCATGCAGGCATGAAAC CGCGTCTTTTTTCAGATAAAAAGCcatat gaatatcctccttag
    galET extended homology ACCAATCAAATTCACGCGGCCAGGCG CCTGAATGGTGTGAGTGGCAGGGTAG CCAAATGCGTTGGCAAAC GTCGGTAGTGCTGACCTTGCCGGAGG CGGCCTTAGCACCCTCTCCGGCCAAC GGTTCGACGCATGCAGGC
  • Beispiel 2 Veränderung („engineering“) und Verwendung von Basis-Stamm 1 (Kohlenstoffquelle: Saccharose; umgewandelt in Glucose-1-phoshat und Fructose durch Saccharose-Phosphorvlase) - Screening unterschiedlicher Saccharose-Phosphorvlasen
  • Eine wichtige Anforderung für den Erfolg von „Basis-Stamm 1“ ist die Existenz einer potenten Saccharose-Phosphorylase. Allerdings wächst, obwohl E. coli eine vermeintliche Saccharose-Phosphorylase (SP) aufweist, er nicht auf einem Minimal-Medium mit Saccharose als einziger Kohlenstoffquelle. Deshalb wurden 6 Saccharose-Phosphorylasen aus einer Vielzahl mikrobieller Quellen gescreent (Tabelle 2).
  • Zu diesem Zweck wurden 6 Transformanten vom Wildtyp-E. coli konstruiert, wobei jede ein Plasmid [pCX-Promotor-SP] trägt, das für eine der Saccharose-Phosphorylasen (SP), die in Tabelle 2 aufgelistet sind, codiert. Die Leistungsfähigkeit dieser Stämme wurde in Schüttelkolben ausgewertet, wobei Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle verwendet wurde. Der Wildtyp (WT)-Stamm wurde in das Studiendesign als eine Kontrolle eingebaut (µWT = 0). Tabelle 2: Gescreente Saccharose-Phosphorylasen
    Quelle Saccharose-Phosphorylase Abkürzung
    BifidoBakterium adolescentis BA
    Lactobacillus acidophilus LA
    Streptococcus mutans SM
    Leuconostoc mesenteroides B742 LM B742
    Leuconostoc mesenteroides B1149 LM B1149
    Leuconostoc mesenteroides B1355 LM B1355
  • In diesem Screening-Experiment wurde die Wachstumsrate der verschiedenen Transformanten überwacht und mit der Leistungsfähigkeit der Saccharose-Phosphorylasen verknüpft. Gemäß dieser Argumentation besitzt demnach der am besten wachsende Stamm die Saccharose-Phosphorylase mit der besten Leistungsfähigkeit.
  • Die Wachstumsrate der verschiedenen Transformanten wird in der 2 dargestellt, das Prinzip, das für die Herstellung eines Spezial-Kohlenhydrats angewandt wird, wird in der 1 dargestellt: (a) Eine normale Gleichgewichtsreaktion, die in den derzeitigen Herstellungstechnologien auftritt, (b) Pull/Push- bzw. Zug/Schub-Prinzip: Das Gleichgewicht ist hin zu dem Saccharid und dem aktivierten Saccharid verschoben. Das Hauptziel einer Zelle ist es, zu wachsen, weshalb es in dieser Figur an dem Saccharid „zieht“ („pull“), um Biomasse zu bilden. Aufgrund dieses Zieh-Effekts wird sich das aktivierte Saccharid in der Zelle ansammeln und schiebt den Herstellungs-Stoffwechselweg an.
  • Beispiel 3. Charakterisierung der Saccharose-Phosphorylase von Bifidobacterium adolescentis
  • Verschiedene künstliche konstitutive Promotoren sind eingebracht worden, um den Einfluss der Promotorstärke auf die Wachstumsrate auszuwerten. Zu diesem Zweck wurden ein schwacher, ein mittelstarker und ein starker Promotor aus einer Promotorbibliothek, die am The Centre of Expertise - Industrial Biotechnology and Biocatalysis (Ghent University) verfügbar waren, eingebracht. Der mittelstarke Promotor, der die höchste Wachstumsrate ergab, wurde schließlich beibehalten.
  • Die Affinitätskonstante und die maximale Wachstumsrate des E. coli-Stamms, der ein Plasmid trägt, welches für die Saccharose-Phosphorylase von Bifidobacterium adolescentis codiert, wurden bestimmt. Zu diesem Zweck wurden Batch- und Chemostatexperimente durchgeführt. Der Einfluss der Phosphatkonzentration auf diese Parameter wurde ebenfalls überprüft (Tabelle 3).
  • Die kinetischen Eigenschaften des veränderten Stamms sind in der Tabelle 3 aufgelistet. Es ist klar, dass die kinetischen Eigenschaften des veränderten Stammes im Hinblick auf zukünftige industrielle Anwendungen angemessen sind. Tabelle 3: Wachstumscharakteristiken von einem E. coli, welcher die Bifidobacterium adolescentis Saccharose-Phosphorylase trägt. Hoher Gehalt an PO4 3" = 64 mM; Niedriger Gehalt an PO4 3" = 8,5 mM.
    Hoher Gehalt an PO4 3- Niedriger Gehalt an PO4 3-
    µmax (h-1) 0,5 0,46
    Ks (mg/L) < 10 +/- 10
  • Beispiel 4. Veränderungs-Strateaie für eine erhöhte Versorgung mit α-Glucose-1-phosphat
  • Um den Grundgedanken der Veränderungs-Strategie zu validieren ist es wichtig, einen erhöhten Pool an α-Glucose-1-phosphat in dem mutanten Stamm zu zeigen (3) und zwar verglichen mit dem α-Glucose-1-phosphat-Pool im Wildtyp (4). Im ‚Basisstamm 1‘ ist der mikrobielle Metabolismus in zwei getrennte Teile aufgeteilt, weil die Hauptreaktionen, die in der Lage sind, α-Glucose-1-phosphat in Biomassenproduktion umzuwandeln, eliminiert wurden. Ein Teil des Metabolismus wandelt den Fructoseanteil in Biomasse und zahlreiche biokatalytische Enzyme (klassischer zentraler Metabolismus) um. Der andere Teil wandelt den α-Glucose-1-phosphat-Anteil in Saccharose um. Die α-Glucose-1 -phosphat-Konzentration wurde sowohl für den Wildtyp als auch für einige veränderte Stämme bestimmt. Zu diesem Zweck wurden Batch-Experimente durchgeführt, die Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle verwenden.
  • Der α-Glucose-1-phosphat-Pool: Ein Vergleich des Wildtyp- und des Plug-Stammes
  • Um das Potential der vorgesehenen metabolischen Veränderungs-Strategie auszuwerten, wurde der α-Glucose-1-phosphat-Pool bestimmt in:
    • • der Wildtyp E. coli MG1655, gezogen auf Glucose,
    • • E. coli MG1655 p22BaSP, gezogen auf Saccharose,
    • • E. coli MG1655 ΔglgC Δpgm ΔlacZ p22BaSP, gezogen auf Saccharose
  • Die Größe dieses Pools ist von größter Wichtigkeit, da die metabolisch veränderten Reaktionswege bzw. Pathways der verschiedenen Spezial-Kohlenhydrate, die hergestellt werden sollen, alle α-Glucose-1-phosphat als den primären Vorläufer verwenden. Je größer der α-Glucose-1-phosphat-Pool ist, desto mehr Vorläufer sind daher für die Herstellung der verschiedenen Spezial-Kohlenhydrate verfügbar.
  • Die Schüttelkolbenergebnisse sind in der 5 abgebildet. Die intrazelluläre Glucose-1-phosphat-Konzentration beträgt 4,03 10-3 mmol/gcDW, 0,26 mmol/gcDW bzw. 1,27 mmol/gcDW. Ein >20000% Anstieg im G1P-Pool wird daher bereits erreicht. Dieser erhöhte Pool ermöglicht die wirksame Herstellung einer Vielzahl von Spezial-Kohlenhydraten.
  • In dem Wildtyp- E. coli MG1655-Stamm ist Glucose-1-phosphat ein Vorläufer von mit der Zellwand in Verbindung stehenden Komponenten, Glycogen etc. Ein begrenzter Fluss an Kohlenstoff, der typischerweise von α-Glucose-6-phosphat kommt, reicht aus, um die Zelle mit ausreichend α-Glucose-1-phosphat zu versorgen, um diese geringfügigen Biomassen-Bruchteile herzustellen. Daher ist der α-Glucose-1-phosphat-Pool von begrenzter Größe (4,03 10-3 mmol/gcDW).
  • Dies steht im Kontrast zu der vorgeschlagenen Strategie, Saccharose als Kohlenstoffquelle zu verwenden. Verglichen mit dem Wildtyp- E. coli MG1655-Stamm ist ein erhöhter Glucose-1-phosphat-Pool in den mutanten Stämmen, welche eine potente Saccharose-Phosphorylase enthalten, die wirksam den günstigen Zucker Saccharose in Fructose und α-Glucose-1-phosphat spaltet, gezeigt worden.
  • Die in einem 1,5-L-Batchreaktor erhaltenen Ergebnisse werden in der 6 dargestellt. Die intrazelluläre α-Glucose-1-phosphat-Konzentration beträgt 4,03 10-3 mmol/gcDW, 0,65 mmol/gcDW bzw. 0,89 mmol/gcDW.
  • Produktion von α-Glucose-1-phosphat durch ΔpamΔlacZΔglgC(3KO) P22-BaSP auf gepuffertem LB-Medium im Reaktormaßstab
  • Die Fähigkeit von ΔpgmΔlacZΔglgC P22-BaSP, α-Glucose-1-phosphat zu produzieren, wurde verifiziert. Zu diesem Zweck wurde eine Kultur mit gepuffertem LB-Medium mit etwa 15 g/L Saccharose durchgeführt. Bei etwa 15h wurde eine konzentrierte Saccharoselösung, die Phosphat enthielt, hinzugefügt. In der 7 und der 6 sind die Konzentrationen der wichtigsten (Neben)produkte abgebildet. Die maximale Wachstumsrate während der Batch-Phase war etwa 0,552 h-1.
  • Während der Batch-Phase werden pro Mol an Saccharose, welches abgebaut wird, 0,74 Mol Glucose-1-phosphat erzeugt. Idealerweise kann 1 Mol α-Glucose-1-phosphat erzeugt werden. Allerdings enthielt das studierte 3KO immer noch Gene, deren Produkte in der Lage sind, α-Glucose-1-phosphat umzuwandeln, z. B., agp.
  • Von dem Moment an, wo alle Saccharose verbraucht ist, verringert sich die Konzentration an Glucose-1 -phosphat und die Konzentration an Glucose erhöht sich, was aufgrund der Aktivität von Agp der Fall ist.
  • Nachfolgend wird bei etwa 15h zusätzliche Saccharose hinzugefügt, die erneut in Glucose-1 -phosphat umgewandelt wird und welches sich im Medium akkumuliert. Fructose akkumuliert sich ebenfalls im Medium, was andeutet, dass die Zelle begrenzte Mittel zur weiteren Metabolisierung dieser Verbindung hat (0,64 Mol Fructose pro Mol Saccharose).
  • In einem nachfolgenden Experiment wurden Saccharose und Phosphat zu regulären Zeitintervallen während des Verlaufs der Fermentation hinzugefügt. Eine maximale α-Glucose-1-phosphat-Konzentration von etwa 57 g/L wurde erreicht.
  • Beispiel 5. Inaktivieruna des Gens, das für Phosphoglucomutase codiert
  • Um den Metabolismus gemäß Beispiel 1-4 aufzuspalten, muss das Gen, das für Phosphoglucomutase codiert, ausgeknockt werden. Über die klassische Methodologie, die durch Datsenko und Wanner (19) beschrieben worden ist, resultiert ein Knock-out in einer chromosomalen Vernarbung („scar“) von ungefähr 84 Basenpaaren. Die Stämme, in welchen dieses Gen auf diese Art und Weise deletiert wurde, scheinen auf einem Komplexmedium zu wachsen, sie wuchsen aber, zu unserer Überraschung, nicht auf einem Minimalmedium, wie in dem „Materialien und Methoden“-Abschnitt beschrieben. Allerdings wuchs der Stamm doch auf einem Minimalmedium, wenn die Kanamycin-Kassette zurückgelassen wurde. Anscheinend schien die Entfernung der originalen Sequenz an diesem chromosomalen Locus das Wachstum auf einem Minimalmedium zu beeinträchtigen, der Ersatz dieser spezifischen Sequenz (pgm-Gen), die für Phosphoglucomutase codiert, mit einer Sequenz mit ähnlicher Länge tat dies aber nicht. Dieser Fakt wurde durch Ersetzen des pgm-Gens mit einem Teil des GFP-Gens, welches exakt die gleiche Größe wie das pgm-Gen hat, validiert. Dies resultierte ebenfalls in einem mutanten Stamm, der auf Minimalmedium wachsen konnte. Die Sequenzen dieser Stämme an dem chromosomalen Locus von pgm werden in der 11, der 12, der 13 und der 14 gezeigt.
  • Beispiel 6. Cellobioseherstellung in E. coli
  • Cellobiose herstellende Stämme sind ausgehend von „Basisstamm 1“ (8) konstruiert worden. Zu diesem Zweck ist ein Plasmid, welches sowohl eine Saccharose-Phosphorylase (Bifidobacterium adolescentis) als auch Cellobiose-Phosphorylase (Cellulomonas uda) enthält, in den Wildtyp, in E. coli MG1655 Δ ΔglgC Δpgm ΔlacZ (3KO) und in E. coli MG1655 Δagp ΔglgC Δpgm ΔlacZ (4KO) (Tabelle 4) insertiert worden. Zusätzliche Gene, die ausgeknockt bzw. ausgeschaltet werden sollen, sind glk und ptsG, da beide Glucose in Glucose-6-phosphat umwandeln. Tabelle 4 Cellobiose herstellender Stamm
    Knock -out Reaktion
    lacZ Glu +Gal ↔ Lactose
    pgm G1P ↔ G6P
    glgC G1P + ATP + H ↔ ADP-Glucose + PPi
    agp G1P + H2O → Glu + Pi
    ycjM Suc → G1P + Fruc
    ptsG Glu + PEP → G6P + Pyr
    glk Glu + ATP → G6P + ADP
    Knock -out Reaktion
    Saccharose-Phosphorylase Saccharose + Pi → G1P + Fruc
    Cellobiose-Phosphorylase G1P + Glu → Cellobiose + Pi
  • Vergleich des Wildtyps und des Piug-Stammes
  • Um das Potential der angestrebten metabolischen Veränderungs-Strategie, Spezial-Kohlenhydrate herzustellen, auszuwerten, wurde die Cellobioseherstellung in verschiedenen veränderten Stämmen untersucht:
    • • E. coli MG1655 (WT) P22-BaSP P22-CuCP
    • • E. coli MG1655 ΔglgC Δpgm ΔlacZ (3KO) P2- BaSP P22-CuCP
    • • E. coli MG1655 ΔglgC Δpgm ΔlacZ Δagp (4KO) P22-BaSP P22-CuCP
  • Zu diesem Zweck wurden Schüttelkolbenexperimente durchgeführt. Das Medium enthielt gepuffertes LB-Medium, und Saccharose und Glucose wurden in gleichen Mengen zu den Schüttelkolben hinzugefügt, so dass die Endkonzentration von 1,978 g Cellobiose/L in dem Schüttelkolben erreicht wurde (Tabelle 5). Die Schüttelkolbenergebnisse werden in der 5 abgebildet. Die (extrazelluläre) Konzentration des gewünschten Produkts Cellobiose steigt mit der Zahl an Mutationen, die eingebracht worden sind. Tabelle 5 Cellobioseproduktion von verschiedenen veränderten Stämmen
    Stamm Abkürzung Cellobiose (g/L)
    E. coli MG1655 P22-BaSP P22-CuCP WT CuCP P22-BaSP P22- 0
    E. coli MG1655 ΔglgC Δpgm ΔlacZ P22-BaSP P22-CuCP 3KO CuCP P22-BaSP P22- 0,539
    E. coli MG1655 ΔglgC Δpgm ΔlacZ Δagp P22-BaSP P22-CuCP 4KO CuCP P22-BaSP P22- 1,978
  • Produktion von Cellobiose durch ΔpgmΔlacZΔglgCΔago (4KO) P22-BaSP P22-CuCP auf gepuffertem LB-Medium im Reaktormaßstab.
  • Die Fähigkeit von ΔpgmΔlacZΔglgCΔagp P22-BaSP P22-CuCP, Cellobiose herzustellen, wurde im Reaktormaßstab in einem vorläufigen Experiment verifiziert. Zu diesem Zweck wurde eine Kultur mit gepuffertem LB-Medium durchgeführt. Bei etwa 9h und an spezifischen Zeitpunkten wurde eine Lösung, die 500 g/L Saccharose und 250 g/L Glucose enthielt, zu der Kultur hinzugefügt.
  • Ein Umwandlungswirkungsgrad von etwa 30% (mol hergestellter Cellobiose/ mol verbrauchter Saccharose) wurde erreicht, und etwa 40% des Glucoseanteils von Saccharose endete in der Cellobiose oder in Glucose-1-Phosphat. Ein Titer von etwa 15g/L Cellobiose wurde am Ende der Kultur erreicht.
  • Zweitens wurde die Cellobioseherstellung in einer Batch-Kultur verifiziert, beginnend von 70 g/L Saccharose mit einer hohen Konzentration an Phosphat und geringen Konzentration von Phosphat. Hohes Phosphat gibt eine Phosphatkonzentration von 0,2 M Phosphat an, geringes bzw. niedriges Phosphat gibt eine Konzentration von 13 mM Phosphat an. Dies beeinträchtigte die Herstellung signifikant. Die hohe Konzentration an Phosphat resultierte in einem finalen Titer von ungefähr 20 g/L und einer Ausbeute von 0,33 g/g, während eine geringe Phosphatkonzentration in einem finalen Titer von 42 g/L und einer Ausbeute über der verbrauchten Saccharose von 0,84 g/g resultierte (9).
  • Beispiel 7. Veränderung von Basisstamm 2 (Saccharose-Saccharosesvnthase) und dessen Verwendungen
  • Durch metabolische Veränderung von E. coli wird ein Basisstamm konstruiert, der ein wirksamer Produzent von Spezial-Kohlenhydraten und deren Derivaten ist, deren Pathway von UDP-Glucose ausgeht.
  • Durch ein Einbringen von Saccharosesynthase (z. B. kommend von Solanum tuberosum) wird Saccharose in Fructose und UDP-Glucose gespalten. Durch zusätzliches Knock-out von Genen, die für UDP-Glucose-4-Epimerase (galE), UDP-Glucose Galactose-1-P-Uridilyltransferase (galT), Glucose-1-P-Uridilyltransferase (galU, galF), 5'-Nukleotidase / UDP-Zucker-Hydrolase (ushA), UDP-Glucose-6-Dehydrogenase (ugd), die zu dem Colansäure-Operon (ca) gehören, codieren, wird eine Mutante konstruiert, die UDP-Glucose akkumuliert (Tabelle 6). Tabelle 6 Basisstamm UDP-Glucose
    Knock -out Reaktion
    ca → Colansäure
    galU G1P +UTP ↔ UDP-Glc + PPi
    galF G1P +UTP ↔ UDP-Glc + PPi
    galE UDP-Glc ↔ UDP-Gal
    galT UDP-Glc + Gal1P ↔ UDP-Gal + G1P
    ushA UDP-Zucker + H2O ↔ Uridin-5'-phosphat + 2H++ ein Aldose-1-phosphat
    ugd 2 NAD +UDP-Zucker + H2O ↔ 2 NADH + UDP-Glucuronat + 3H+
    Knock -out Reaktion
    Saccharose-Synthase Suc + UDP → UDP Glu + Fruc
  • Beispiel 8 Expression von Saccharosesynthase in E. coli
  • Die Aktivität von Saccharosesynthase wurde unter Verwendung eines In-vitro-Assays bestimmt. Eine Saccharosesynthase von Solanum tuberosum wurde heterolog in E. coli BL21 exprimiert. Aus dieser Kultur wurde ein Enzymextrakt hergestellt, der mit 500 mM Saccharose und 2mM UDP inkubiert wurde. Die Entwicklung dieser Menge an UDP-Glucose, die hergestellt wird, ist in der Tabelle 7 angegeben. Tabelle 7 Saccharosesynthaseenzymassay, der die Aktivität der Spaltungsreaktion von Saccharosesynthase (Mischung enthielt 500 mM Saccharose und 2mM UDP) demonstriert.
    Probennahmezeit Gebildete UDP-Glucose
    0h 10 min 5 mg/L
    1h 40 min 64 mg/L
    24h 300 mg/L
  • Beispiel 9 Sophoroseproduktion
  • Ausgehend von Basisstamm 2 (UDP-Glucose) wird ein Stamm konstruiert, welcher große Mengen an Sophorose herstellt und zwar als ein Polymer aus Sophoroseeinheiten. Dies wird durch zusätzliches Einbringen des Gens tts von Streptococcus pneumoniae (50) erreicht. Die Sophoroseeinheiten können aus dem Sophorosepolymer auf zwei Wegen erzeugt werden, d. h. mittels Säurehydrolyse oder über enzymatische Umwandlung. Solch ein Enzym kann auch in dem Produktionsstamm (über)exprimiert werden.
  • Um das Potential der metabolischen Veränderungs-Strategie auszuwerten, wurde das Sophorosepolymer für E. coli MG1655 P22-BaSP P22-tts und einen 6KO P22-BaSP P22-tts -Stamm (E. coli MG1655 ΔglgC Δpgm ΔlacZ Δagp ΔptsG Δglk) durch Wachsenlassen dieser Stämme auf einem Minimalmedium bestimmt, welches Lactose als einzige Kohlenstoffquelle enthielt. Die Ergebnisse sind in der 15 abgebildet. Diese Ergebnisse deuten an, dass die mutanten Stämme signifikant mehr Sophorosepolymer im Vergleich zum Wildtyp-Stamm produzieren.
  • Beispiel 10. Veränderung von Basisstamm 3 (Lactose-Lactose-Phosphorviase) und dessen Verwendungen
  • Durch Einbringen von Lactose-Phosphorylase (20) wird Lactose in Glucose und Galactose-1-P gespalten. Durch zusätzliches Knock-out von Genen, die für agp, galE, galT, und lacZ codieren, wird der Metabolismus in zwei getrennte Teile gespalten. Allerdings resultieren alle möglichen Kombinationen dieser Gene in einer erhöhten Akkumulation von Galactose-1-phosphat. Anstelle eines Knock-outs dieser Gene, kann dieses Ziel auch erreicht werden, indem die Gene fehlerhaft gemacht werden oder durch eine Reduktion ihrer Expression (Tabelle 8). Tabelle 8 Basisstamm 3 Galactose-1-phosphat (Lactose- Lactose-Phosphorylase)
    Knock -out Reaktion
    lacZ Glu +Gal ↔ Lactose
    galE UDP-Glc ↔ UDP-Gal
    agp G1P + H2O → Glu + Pi
    galT UDP-Glc + Gal1P ↔ UDP-Gal + G1P
    Knock -out Reaktion
    Lactose-Phosphorylase Lactose + Pi → Gal1P + Glucose
  • Beispiel 11. Galactose(β1-4)L-Rhamnoseproduktion:
  • Ausgehend von Basisstamm 3 wird ein Gal(β1-4)L-Rha-Produzent konstruiert und zwar durch zusätzliches Einbringen eines Gens, welches für eine (Ga)lacto-N-biose -D-Galactosyl-(β1-4)-L-Rhamnose-Phosphorylase codiert, welche Galactose-1-phosphat und Rhamnose in Gal(β1-4)L-Rha und Phosphat umwandelt.
  • Eine Fermentation wird unter Verwendung von Lactose als Hauptkohlenstoffquelle durchgeführt, wobei Mengen an Gal(β1-4)L-Rha erhalten werden. L-Rhamnose wird zu dem Medium hinzugefügt. Der unerwünschte Abbau von Rhamnose wird durch ein Knock-out von Genen verhindert, die bei dem Abbau von Rhamnose beteiligt sind (rhaA, rhaB, rhaC, rhaD).
  • Beispiel 12. Veränderung von Basisstamm 4 (Lactose-Lactosesvnthase) und dessen Verwendungen
  • Durch ein Einbringen von Lactosesynthase (71, 72) wird Lactose in Glucose und UDP-Galactose gespalten. Durch zusätzliches Knock-out von Genen, die für beta-Galactosidase (lacZ), UDP-Glucose, Galactose-1-P-Uridilyltransferase (galT), UDP-Glucose-4-Epimerase (galE), 5'-Nukleotidase / UDP-Zucker-Hydrolase (ushA), UDP-Glucose-6-Dehydrogenase (ugd), die zum Colansäure-Operon (ca) gehören, codieren, wird eine Mutante konstruiert, die UDP-Galactose (Tabelle 9) akkumuliert. Tabelle 9: Basisstamm 4 UDP-Galactose (Lactose-Synthase)
    Knock -out Reaktion
    lacZ Glu +Gal ↔ Lactose
    galE UDP-Glc ↔ UDP-Gal
    galT UDP-Glc + Gal1P ↔ UDP-Gal + G1P
    ca → Colansäure
    ushA UDP-Zucker + H2O ↔ Uridin-5'-phosphat + 2H++ ein Aldose-1-phosphat
    ugd 2 NAD +UDP-Zucker + H2O ↔ 2 NADH + UDP-Glucuronat + 3H+
    Knock -out Reaktion
    Lactose-Synthase Lactose → UDP-Gal + Glu
  • Beispiel 13. Galactinolproduktion:
  • Ausgehend von Basisstamm 4 wird ein Galactinol-Produzent konstruiert und zwar durch zusätzliches Einbringen eines Gens, welches für eine Inositol-3-alpha-Galactosyltransferase codiert, welche die folgende Umwandlung katalysiert: UDP-Galactose + myo-Inositol = UDP + O-α-D-Galactosyl-(1→3)-1 D-myo-inositol
  • Eine Fermentation wird unter Verwendung von Lactose als Hauptkohlenstoffquelle durchgeführt werden, was Mengen von Galactinol erbringt, in welcher myo-Inositol zu dem Medium hinzugefügt wird.
  • Beispiel 14. Globotrioseproduktion:
  • Ausgehend von Basisstamm 4 wird ein Globotriose-Produzent konstruiert und zwar durch zusätzliches Einbringen des Gens IgtC aus Neisseria meningitidis (3), das für eine α-1,4-Gal-Transferase codiert, welche die Umwandlung UDP-Gal + Lactose → UDP + Globotriose katalysiert. Eine Fermentation wird unter Verwendung von Lactose als Hauptkohlenstoffquelle durchgeführt, was Mengen an Globotriose erbrachte.
  • Beispiel 15. Veränderung von Basisstamm 5 und Produktion fucosylierter Zucker
  • Ausgehend von Basisstamm 5, der Fructose-6-phosphat akkumuliert (beschrieben in Beispiel 20 und Beispiel 28) können fucosylierte Zuckerderivate, wie Fucosyllactose und noch spezifischer 1,2-Fucosyllactose produziert werden. Zu diesem Zweck wird der Stamm modifiziert, so dass die Zelle gezwungen ist, Fructose-6-phosphat zu produzieren, was ein Vorläufer von GDP-Fucose ist. Glucose oder Glucose-1-phosphat (wenn das Ausgangsenzym entweder eine Sucrase oder eine Saccharose-Phosphorylase ist) wird dann in den zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsel über den Pentosephosphatweg eingespeist. Die 10 zeigt die Route hin zum Produkt und der Biomasse und den benötigten Knock-outs, um dies zu erreichen. Um einen Verlust an Fructose-6-phosphat über die Glycolyse zu vermeiden, werden pfkA, pfkB und pgi ausgeknockt. Um die Akkumulation von Pyruvat zu vermeiden, wird die Entner-Douderoff-Weg ausgeknockt (edd und eda).
  • Da GDP-Fucose ein Zwischenprodukt des Colansäure-Biosynthesewegs ist, muss dieser Weg bzw. Pathway modifiziert werden. Gene aus dem Colansäure-Operon, die potenziell die Produktausbeute verringern können, werden ausgeknockt. Diese Gene sind gmm, wcaA, wcaBi, wcaC, wcaD, wcaE, wcaF, wcaI, wcaJ, wcaK, wcaL und/oder wcaM. Die Gene manA, cpsG, cpsB, gmd und fcl (die für Mannose-6-phosphat-Isomerase, Phosphomannomutase, Mannose-1-phosphat-Guanylyltransferase, GDP-Mannose-4,6-Dehydratase beziehungsweise GDP-Fucose-Synthase codieren) werden in der Expression verbessert, um den Strom hin zur GDP-Fucose zu steigern. Entweder wird der Colansäure-Operon vollständig ausgeknockt und zwar mit dem erneuten Einbringen der benötigten Gene, die überexprimiert werden, mit einem künstlichen Promotor aus einer Promotorbibliothek, oder der Operon wird modifiziert, so dass die Gene, die obenstehend beschrieben sind, eines nach dem anderen ausgeknockt werden und die verbleibenden Gene in dem Operon in der Expression verbessert werden, in dem der Promotor des Operons mit einem künstlichen konstitutiven Promotor (23) ausgetauscht wird. Schließlich wird GDP-Fucose mit Lactose zu α-1,2-Fucosyllactose durch eine α-1,2-Fucosyltransferase verknüpft. Die getesteten Fucosyltransferasen stammen aus Helicobacter pylori, Bacteroides sp., Homo sapiens, Mus musculus, Bos taurus and, Dictyostelium discoideum.
  • Beispiel 16. Veränderung von E. coli Basisstamm 3 (Galactose-1-P) und dessen Verwendungen
  • Durch Knock-out von Genen, die für (eine) Phosphatase(n) (agp), UDP-Glucose, Galactose-1-P-Uridilyltransferase (galT), UDP-Glucose-4-Epimerase (galE) codieren, wird eine Mutante konstruiert, die Galactose-1-P akkumuliert. Durch eine zusätzliche Überexpression von Genen, die für Galactokinase (galK) und/oder Galactose-1-Epimerase (galM) codieren, wird die Bildung von Galactose-1-P verbessert (Tabelle 10). Tabelle 10 Basisstamm Galactose-1-phosphat
    Knock -out Reaktion
    galT Gal1P + UDP-Glucose ↔ UDP-Galactose + G1 P
    galE UDP-Glucose ↔ UDP-Galactose
    agp Glucose-1-phosphat + H2O → Pi + Glucose
    Knock -out Reaktion
    galK α-Galactose + ATP → Gal1P + ADP
    galM β-Galactose ↔ α-Galactose
  • Beispiel 17. Veränderung von Basisstamm 3 (Galactose-1-P) und dessen Verwendungen
  • Durch Knock-out von Genen, die für (eine) Phosphatase(n) (agp), UDP-Glucose, Galactose-1-P-Uridilyltransferase (galT), UDP-Glucose-4-Epimerase (galE) codieren und durch zusätzliche Überexpression von Genen, die für Galactokinase (galK) codieren, wird eine Mutante konstruiert, die Galactose-1-P akkumuliert (Tabelle 11). Tabelle 11 E. coli Basisstamm Galactose-1-phosphat
    Knock -out Reaktion
    galT Gal1P + UDP-Glucose ↔ UDP-Galactose + G1P
    galE UDP-Glucose ↔ UDP-Galactose
    galK α-Galactose + ATP → Gal1P + ADP
    galM β-Galactose ↔ α-Galactose
    agp Glucose-1-phosphat + H2O → Pi + Glucose
    Knock -out Reaktion
    galK α-Galactose + ATP → Gal1P + ADP
  • Um das Potential der metabolischen Veränderungs-Strategie auszuwerten, wurde die Galactose-1-phosphat-Konzentration für den Wildtyp, E. coli MG1655 ΔgalET P22 galK, E. coli MG1655 ΔgalETKM Δagp P22 galK, E. coli MG1655 ΔgalET P22 galK und E. coli MG1655 ΔgalETKM Δagp P22 galK + Orotat (2 g/L) durch Wachsenlassen dieser Stämme auf einem Minimalmedium, das Lactose (15 g/L) als Hauptkohlenstoffquelle enthält, bestimmt. Die Ergebnisse werden in der Tabelle 12 abgebildet. Tabelle 12 Galactose-1-P-Konzentration von verschiedenen E. coli -Mutanten
    Stamm Galactose-1-P (mg/L)
    E. coli MG1655 Nicht nachweisbar
    E. coli MG1655 ΔgalET P22 galK 15,73
    E. coli MG1655 ΔgalETKM Δagp P22 galK 69,08
    E. coli MG1655 ΔgalET P22 galK 12,48
    E. coli MG1655 ΔgalETKM Δagp P22 galK + Orotat (2 g/L) 64,90
  • Beispiel 18. Produktion von Glucose-6-phosphat unter Verwendung von Saccharose-Phosohorvlase in E. coli
  • Durch Einbringen von Saccharose-Phosphorylase wird Saccharose in Glucose-1-P und Fructose gespalten. Durch zusätzliches Knock-out von Genen, die für (eine) Phosphatase(n) (agp), Glucose-6-phosphat-1-Dehydrogenase (zwf, Phosphoglucose-Isomerase (pgi), Glucose-1-phosphat-Adenylyltransferase (glgC) codieren, wird eine Mutante konstruiert, die Glucose-6-P akkumuliert.
  • Die KO-Mutanten werden auf solch eine Art und Weise ausgewählt, dass der Metabolismus in zwei getrennte Teile gespalten wird. Allerdings resultieren alle möglichen Kombinationen in einer gesteigerten Bereitstellung. Anstelle eines Knock-outs dieser Gene wird dieses Ziel auch erreicht, indem die Gene fehlerhaft gemacht werden oder indem ihre Expression verringert wird.
  • Durch die metabolische Veränderung von E. coli wird ein Basisstamm konstruiert, der ein wirksamer Produzent von Spezial-Kohlenhydraten und deren Derivaten ist, deren Pathway bei Glucose-6-P beginnt (Tabelle 13). Tabelle 13 Basisstamm Glucose-6-phosphat unter Verwendung einer Saccharose-Phosphorylase
    Knock -out Reaktion
    zwf G6P + NADP → 6PG + NADPH
    agp G1P + H2O → Glc + Pi
    glgC G1P + ATP + H ↔ ADP-Glucose + PPi
    pgi G6P↔F6P
    Knock -out Reaktion
    Saccharose-Phosphorylase Suc + Pi → G1P + Fru
    pgm G6P ↔ G1P
  • Beispiel 19. Produktion von Glucose-6-phosphat unter Verwendung von Invertase in E. coli
  • Durch Einbringen von Saccharose-Hydrolase/-Invertase wird Saccharose in Glucose und Fructose gespalten. Durch zusätzliches Knock-out von Genen, die für (eine) Phosphatase(n) (agp), Glucose-6-phosphat-1-Dehydrogenase (zwf), Phosphoglucose-Isomerase (pgi), Glucose-1-phosphat-Adenylyltransferase (glgC), Phosphoglucomutase (pgm) codieren, wird eine Mutante konstruiert, die Glucose-6-P akkumuliert (Tabelle 14). Tabelle 14: Basisstamm Glucose-6-phosphat unter Verwendung von Invertase in E. coli
    Knock -out Reaktion
    zwf G6P + NADP → 6PG + NADPH
    agp G1P + H2O → Glu + Pi
    pgi G6P ↔ F6P
    pgm G6P ↔ G1P
    Knock -out Reaktion
    Invertase Suc + H2O → Glc + Fru
  • Beispiel 20. Produktion von Fructose-6-phosphat unter Verwendung von Invertase in E. coli
  • Durch Einbringen von Saccharose-Hydrolase/-Invertase wird Saccharose in Glucose und Fructose gespalten. Durch zusätzliches Knock-out von Genen, die für (eine) Phosphatase(n) (agp), Phosphofructokinase (pfkA und pfkB), Phosphoglucose-Isomerase (pgi), Glucose-1-phosphat-Adenylyltransferase (glgC), Phosphoglucomutase (pgm) codieren, wird eine Mutante konstruiert, die Fructose-6-phosphat akkumuliert (Tabelle 15). Tabelle 15 Basisstamm Fructose-6-phosphat
    Knock -out Reaktion
    pfkA F6P+ATP → FBP+ADP
    pfkB F6P+ATP → FBP+ADP
    agp G1P + H2O → Glc + Pi
    pgi G6P ↔ F6P
    pgm G6P ↔ G1P
    Knock -out Reaktion
    Invertase Suc + H2O → Glc + Fru
  • Beispiel 21. Produktion von β-Glucose-1-phosphat unter Verwendung von Maltose-Phosphorvlase in E. coli
  • Durch Einbringen von Maltose-Phosphorylase wird Maltose in β-D-Glucose-1-phosphat und Glucose gespalten. Durch zusätzliches Knock-out von Genen, die für (eine) Phosphatase(n) (agp, ytbT), Phosphoglucomutase (ycjU), Maltose-Hydrolase (malPQ) codieren, wird eine Mutante konstruiert, welche β-Glucose -1-P akkumuliert. Die KO-Mutanten werden auf solch eine Art und Weise gewählt, dass der Metabolismus in zwei getrennte Teile gespalten wird. Allerdings resultieren alle möglichen Kombinationen dieser Gene in einer gesteigerten Bereitstellung. Anstelle eines Knock-outs dieser Gene wird dieses Ziel auch erreicht, indem die Gene fehlerhaft gemacht werden oder indem ihre Expression verringert wird (Tabelle 16). Tabelle 16: Basisstamm β-D-Glucose-1-phosphat unter Verwendung von Maltose-Phosphorylase in E. coli
    Knock -out Reaktion
    malPQ Maltose → Glucose
    yfbT β-D-Glucose-1 -phosphat + H2O → Glucose + Pi
    agp Glucose-1-phosphat +H2O → Glucose+ Pi
    ycjU β-D-Glucose-1 -phosphat ↔ β-D-Glucose-6-phosphat
    Knock -out Reaktion
    Maltose-Phosphorylase (MP) Maltose + Pi → Glucose-1P + Glucose
  • Beispiel 22. Produktion von β-Glucose-1-phosphat unter Verwendung von Trehalose-Phosphorvlase in E. coli
  • Durch Einbringen von Trehalose-Phosphorylase wird Trehalose in β-D-Glucose-1-phosphat und Glucose aufgespalten. Durch zusätzliches Knock-out von Genen, die für (eine) Phosphatase(n) (agp, yfbT), Phosphoglucomutase (ycjU), unerwünschte natürliche Trehalose-abbauende Enzyme (treABC, treC, treE, treF) codieren, wird eine Mutante konstruiert, welche β-Glucose -1-phosphat akkumuliert (Tabelle 17).
  • Die KO-Mutanten werden auf solch eine Art und Weise gewählt, dass der Metabolismus in zwei getrennte Teile gespalten wird. Allerdings resultieren alle möglichen Kombinationen dieser Gene in einer gesteigerten Produktivität. Anstelle eines Knock-outs dieser Gene wird dieses Ziel erreicht, indem die Gene fehlerhaft gemacht werden oder indem ihre Expression verringert wird. Tabelle 17 Basisstamm β-D-Glucose-1-phosphat unter Verwendung von Trehalose-Phosphorylase in E. coli
    Knock -out Reaktion
    treA Trehalose + H2O → 2 β-D-Glucose
    treC Trehalose-6-phosphat + H2O → β-D-Glucose-6-phosphat + β-D-Glucose
    treE Trehalose-6-phosphat + H2O ↔ β-D-Glucose-6-phosphat + β-D-Glucose
    treF Trehalose + H2O ↔ 2 β-D-Glucose
    yfbT β-D-Glucose-1 -phosphat +H2O → Glucose + Pi
    agp Glucose-1-phosphat +H2O → Glucose + Pi
    ycjU β-D-Glucose-1 -phosphat ↔ β-D-Glucose-6-phosphat
    Knock -out Reaktion
    Trehalose-Phosphorylase (TP) Trehalose + Pi → β-D-Glucose-1 P + Glucose
    otsB Trehalose-6-phosphat + H2O → Trehalose + Pi
  • Beispiel 23. Produktion von Koiibiose
  • Durch zusätzliches Einbringen von Kojibiose-Phosphorylase in einen Stamm, der β-D-Glucose-1-phosphat akkumuliert, und zusätzliches Knock-out von Genen, die für Glucokinase (glk) und, Phosphotransferase-System (ptsG) codieren, wird eine Mutante konstruiert, die Kojibiose produziert.
  • Eine Fermentation wird mit einem mutanten E. coli-Stamm (ΔlacZΔglgCΔagpΔptsGΔmalPQΔycjU pCXp22MPp22KP) unter Verwendung von Maltose und Glucose als Hauptkohlenstoffquelle durchgeführt, wodurch Kojibiose erbracht wird (16).
  • Beispiel 24. Produktion von UDP-Glucose aus Saccharose mittels einer Saccharose-Phosphorvlase
  • Durch Einbringen von Saccharose-Phosphorylase (z. B. aus Bifidobacterium adolescentis stammend) wird Saccharose in Fructose und Glucose-1-P gespalten. Ausgehend von einem Glucose-1-phosphat akkumulierenden Stamm (siehe obenstehende Beispiele) und durch zusätzliches Knock-out von Genen, die für UDP-Glucose-4-Epimerase (galE), UDP-Glucose-Galactose-1-P-Uridilyltransferase (galT), 5'-Nukleotidase / UDP-Zucker-Hydrolase (ushA), UDP-Glucose-6-Dehydrogenase (ugd) codieren, wird eine Mutante konstruiert, die UDP-Glucose akkumuliert und zwar durch zusätzliche Überexpression von Genen, die für UDP-Glucose-Pyrophosphorylase codieren (z. B. von Bifidobacterium bifidum kommend) (Tabelle 18). Tabelle 18 Basisstamm UDP-Glucose von Saccharose über eine Saccharose-Phosphorylase in E. coli
    Knock-out Reaktion
    lacZ Glu +Gal ↔ Lactose
    galE UDP-Glucose↔UDP-Galactose
    galT Gal1P + UDP-Glucose ↔ UDP-Galactose + G1P
    ca → Colansäure
    ushA ein UDP-Zucker + H2O ↔ Uridin-5'-phosphat + ein α-D-Aldose-1-phosphat + 2 H+
    ugd 2 NAD+ + UDP-D-Glucose + H2O ↔ 2 NADH + UDP-D-Glucuronat + 3 H+
    pgm G1P ↔ G6P
    glgC G1P + ATP + H → ADP-Glucose + PPi
    agp G1P + H2O ↔ Glu + Pi
    ptsG Glc + PEP → G6P + Pyr
    glk Glc + ATP → G6P + ADP
    Knock-out Reaktion
    galU/F G1P +UTP → UDP-Glucose + PPi
    Saccharose-Phosphorylase Suc → G1P + Fru
  • Beispiel 25. Produktion von UDP-Glucose in E. coli mit einer Saccharose-6-phosphat-Synthase, kombiniert mit Saccharose PTS
  • Durch Einbringen von Saccharose PTS (94) und Saccharose-6-phosphat-Synthase (69) wird Saccharose in Fructose-6-phosphat und UDP-Glucose umgewandelt. Ausgehend von dem Stamm, der in Beispiel 4 beschrieben wurde, ohne Saccharose-Phosphorylase, und durch zusätzliches Knock-out von Genen, die für (eine) Phosphatase(n) (agp), UDP-Glucose-4-Epimerase (galE), UDP-Glucose-Galactose-1-P-Uridilyltransferase (galT), 5'-Nukleotidase / UDP-Zucker-Hydrolase (ushA), UDP-Glucose 6-Dehydrogenase (ugd) codieren, wird eine Mutante konstruiert, die UDP-Glucose akkumuliert und zwar durch zusätzliche Überexpression von Genen, die für UDP-Glucose-Pyrophosphorylase codieren (Bifidobacterium bifidum) (Tabelle 19). Tabelle 19 Basisstamm UDP-Glucose mit Saccharose-6-phosphat-Synthase kombiniert mit Saccharose PTS
    Knock -out Reaktion
    galE UDP-Glucose ↔ UDP-Galactose
    galU/galF UTP + G1P ↔ UDP-Glucose + PPi
    galT Gal1P + UDP-Glucose ↔ UDP-Galactose + G1P
    ca → Colansäure
    ushA ein UDP-Zucker + H2O ↔ Uridin-5'-phosphat + ein α-D-Aldose-1-phosphat + 2 H+
    ugd 2 NAD+ + UDP-D-Glucose + H2O ↔ 2 NADH + UDP-D-Glucuronat + 3 H+
    Knock -out Reaktion
    Saccharose-6P-Synthase UDP-Glucose + D-Fructose 6-phosphat → UDP + Saccharose-6-phosphat
    Saccharose PTS Saccharose + PEP → Saccharose-6-phosphat + Pyruvat
  • Beispiel 26. Produktion von UDP-Galactose via Galactokinase
  • Durch Überexpression von Genen, die für Galactokinase (galK) und Galactose-1-phosphat-Uridylyltransferase (zum Beispiel aus Bifidobacterium bifidum stammend) codieren, wird die Bildung von UDP-Galactose durch zusätzliches Knock-out von Genen verbessert, die für (eine) Phosphatase(n) (agp), UDP-Glucose, Galactose-1-P-Uridilyltransferase (galT), UDP-Glucose-4-Epimerase (galE) codieren, wird eine Mutante konstruiert, welche Galactose-1-P akkumuliert (Tabelle 20). Tabelle 20 Basisstamm UDP-Galactose mittels Galactokinase
    Knock -out Reaktion
    galT Gal1P + UDP-Glucose ↔ UDP-Galactose + G1P
    galE UDP-Glucose ↔ UDP-Galactose
    galK α-Galactose + ATP → Gal1P + ADP
    galM β-Galactose ↔ α-Galactose
    agp Glucose-1-phosphat + H2O →Pi + Glucose
    Knock -out Reaktion
    galK α-Galactose + ATP → Gal1P + ADP
    Galactose-1 -phosphat-Uridylyltransferase Gal1P + UTP → UDP-Galactose +PPi
  • Beispiel 27. Produktion von UDP-Galactose mittels Lactose-Phosphorylase
  • Durch Einbringen von Lactose-Phosphorylase (20) wird Lactose in Glucose und Galactose-1-P gespalten. Durch Knock-out von Genen, die für (eine) Phosphatase(n) (agp), UDP-Glucose, Galactose-1-P-Uridilyltransferase (galT), UDP-Glucose-4-Epimerase (galE) codieren, wird eine Mutante konstruiert, die Galactose-1-P akkumuliert. Durch zusätzliche Überexpression von Genen, die für Galactose-1-phosphat-Uridylyltransferase (zum Beispiel von Bifidobacterium bifidum kommend) codieren, wird die Bildung von UDP-Galactose verbessert (Tabelle 21).
  • Die KO-Mutanten werden auf solch eine Art und Weise ausgewählt, dass der Metabolismus in zwei getrennte Teile gespalten wird. Allerdings resultieren alle möglichen Kombinationen dieser Gene in einer gesteigerten Produktivität. Anstelle eines Knock-outs dieser Gene wird dieses Ziel erreicht, indem die Gene fehlerhaft gemacht werden oder indem ihre Expression verringert wird. Tabelle 21 Basisstamm UDP-Galactose mittels Lactose-Phosphorylase
    Knock -out Reaktion
    lacZ Glu +Gal ↔ Lactose
    galE UDP-Glc ↔ UDP-Gal
    agp G1P + H2O → Glu + Pi
    galT UDP-Glc + Gal1P ↔ UDP-Gal + G1P
    Knock -out Reaktion
    Lactose-Phosphorylase Lactose + Pi → Gal1P + Glucose
    Galactose-1 -phosphat-uridylylTransferase Gal1P + UTP → UDP-Galactose +PPi
  • Beispiel 28. Fructose-6-phosphat-Akkumulation in E. coli
  • Der Stoffwechsel wird aufgeteilt, um Fructose-6-phosphat anzusammeln. Dies wird erreicht, indem die Gene ausgeschaltet werden, die für die Aktivität von Phosphoglucose-Isomerase und Phosphofructokinase codieren. In E. coli werden diese Aktivitäten durch die Gene pgi, pfkA und pfkB codiert. Die Wachstumsrate von Stämmen ohne diese Aktivitäten ist in der Tabelle 22 für das Wachstum auf Glucose und Saccharose beschrieben. Die Wachstumsrate des Wildtyp-Stammes wird ein wenig beeinflusst, wenn er auf Saccharose nach Einführung einer Saccharose-Phosphorylase wachsen gelassen wird, im Vergleich zu dem Wachstum auf Glucose, jedoch führt die Einführung von pgi-Knockouts und pfkA- und pfkB-Doppelmutationen zu einer signifikanten Verringerung der Wachstumsrate, wobei letztere extrem niedrig (0,02 h-1) auf Glucose ist. Überraschenderweise weist der Mutantenstamm ΔpgiΔpfkAΔpfkB eine Wachstumsrate auf, die der von der Δpgi-Einzelmutante ähnlich ist. Tabelle 22: Spezifische Wachstumsraten der Glykolyse-Knockout-Stämme auf einem Minimalmedium mit Glucose und Saccharose. In die auf Saccharose wachsen gelassenen Stämme wurde ein für Saccharose-Phosphorylase codierendes Plasmid eingeführt.
    Stamm Wachstumsrate auf Glucose (h-1) Wachstumsrate auf Saccharose (h-1)
    Wildtyp 0,64 0,41
    Δpgi 0,18 0,23
    ΔpfkAΔpfkB 0,02 n.d.
    ΔpgiΔpfkAΔpfkB 0,23 0,24
  • Nur der Mutantenstamm pgiΔpfkAΔpfkB akkumulierte Fructose-6-phosphat im Medium, wenn er auf Saccharose wachsen gelassen wurde, die anderen Stämme zeigten keine F6P-Akkumulation an. Das Wachstumsprofil und die F6P-Akkumulation durch diesen Stamm sind in der 17 dargestellt.
  • Beispiel 29. αGlucose-1-phosphat-Akkumulation in Saccharomyces cerevisiae
  • Da Saccharomyces cerevisiae von Natur aus Saccharose spaltet, werden alle alternativen Saccharose abbauenden Reaktionen (Invertasen), die von den Genen SUC2, MAL32, MAL12, YJL216C, YGR287c codiert werden, ausgeschaltet. Um die Assimilation von α-Glucose-1-phosphat zu vermeiden, werden die Enzyme, die dieses aktivierte Kohlenhydrat umwandeln, weniger funktional oder nicht-funktional gemacht. Diese Enzyme sind Phosphoglucomutase, codiert durch PGM1 und PGM2, und Glucose-1-Phosphatase, codiert durch INM1 und INM2, durch Einführung einer Saccharose-Phosphorylase (z. B. aus Bifidobacterium Aduicentis stammend), ähnlich dem gespaltenen Metabolismus von E. coli (siehe Beispiel oben). Der Saccharomyces cereviseae-Metabolismus ist in zwei Teile geteilt, was zur Akkumulation von αGlucose-1 -phosphat führt.
  • Beispiel30. Cellobioseproduktion mit Saccharomyces cerevisiae
  • Da Saccharomyces cerevisiae von Natur aus Saccharose spaltet, werden alle alternativen Saccharose abbauenden Reaktionen (Invertasen), die von den Genen SUC2, MAL32, MAL12, YJL216C, YGR287c codiert werden, ausgeschaltet. Um die Assimilation von α-Glucose-1-phosphat zu vermeiden, werden die Enzyme, die dieses aktivierte Kohlenhydrat umwandeln, weniger funktional oder nicht-funktional gemacht. Diese Enzyme sind Phosphoglucomutase, codiert durch PGM1 und PGM2, und Glucose-1-Phosphatase, codiert durch INM1 und INM2, durch Einführung einer Saccharose-Phosphorylase (z. B. aus Bifidobacterium Aduicentis stammend), ähnlich dem gespaltenen Metabolismus von E. coli (siehe Beispiel oben). Der Saccharomyces cerevisiae-Metabolismus ist in zwei Teile geteilt, was zur Akkumulation von αGlucose-1-phosphat führt. Durch die Einführung eines aus Cellulomonas uda stammenden Cellobiose-Phosphorylase-Gens ist Saccharomyces cerevisiae in der Lage Cellobiose zu produzieren.
  • Um einen Abbau von Glucose zu vermeiden, wird die durch GLK1 codierte Glucokinaseaktivität ebenfalls ausgeschaltet. Da Hexokinasen in Saccharomyces cerevisiae nicht spezifisch sind, werden diese durch eine spezifische heterologe substratspezifische Hexokinase ersetzt. Fructokinasen, die aus E. coli oder Bifidobacterium adolescentis stammen, zeigen eine geringere Aktivität für Glucose und können die Gene ersetzen, die für die von HXK1 und HXK2 codierten nativen Hexokinasen codieren.
  • Beispiel 31. Fructose-6-phosphat-Akkumulation in Saccharomyces cerevisiae durch die Einführung einer Saccharose-Phosphorylase
  • Da Saccharomyces cerevisiae von Natur aus Saccharose spaltet, werden alle alternativen Saccharose abbauenden Reaktionen (Invertasen), die von den Genen SUC2, MAL32, MAL12, YJL216C, YGR287c codiert werden, ausgeschaltet. Durch Einführung von Saccharose-Phophorylase aus Bifidobacterium adolescentis wird Saccharose in Fructose und Glucose-1-phosphat gespalten. Um die Umwandlung von Fructose-6-phosphat in Biomasse zu vermeiden, wird die Aktivität der Enzyme Phosphoglucose-Isomerase und Phosphofructokinase reduziert oder eliminiert, indem die Gene PGM1, PFK1 und PFK2 weniger funktional bzw. nicht-funktional gemacht werden.
  • Beispiel 32. Galactose-1-phosphat-Akkumulation in Saccharomyces cerevisiae
  • Galactose-1-phosphat ist vom Disaccharid-Lactose abgeleitet. Da Saccharomyces cerevisiae von Natur aus keine Lactose spaltet, wird eine heterologe β-Galactosidase (z. B. aus E. coli) eingeführt. Dies führt zum Abbau von Lactose zu Galactose und Glucose. Das Ziel ist es, die Versorgung eines Biosynthesewegs eines speziellen Kohlenhydrats mit Galactose-1-phosphat zu erhöhen. Deshalb kann Galactose-l-phosphat nicht mehr in Biomasse umgewandelt werden, die durch UDP-Glucose-hexose-I-phosphat-Uridylyltransferase, die Aldose-Reduktase, katalysiert wird. Dies wird erreicht, indem die Gene, die für UDP-Glucose-hexose-1 -phosphat-Uridylyltransferase und Aldose-Reduktase, GAL7 bzw. GRE3, codieren, ausgeschaltet werden. Um einen Abbau des Galactose-1-phosphats zu vermeiden, werden die für Galactose-1-phosphatase codierenden Gene ausgeschaltet. Dies sind INMI und INM2. Eine Galactokinase wird überexprimiert, um die Bildung von Galactose-1-phosphat aus Galactose zu erhöhen.
  • Beispiel 33. Glucose-6-phosphat-Akkumulation in Saccharomvces cerevisiae mittels nativer Invertase
  • Zur Aufteilung des Saccharomyces cerevisiae-Metabolismus in zwei Teile (um die Versorgung mit Glucose-6-phosphat zu verbessern, damit es als Baustein für ein spezielles Kohlenhydrat verwendet werden kann) werden Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Phosphoglucomutase und Phosphoglucose-Isomerase, die codiert sind durch die Gene ZWF1, PGM1 und PGM2 bzw. PGI1, ausgeschaltet. In einem solchen Stamm wird Saccharose in Fructose und Glucose gespalten durch die nativen Invertasen und zu Fructose-6-phosphat und Glucose-6-phosphat durch die nativen Hexokinasen phosphoryliert. Glucose-6-phosphat wird dann dem speziellen Kohlenhydratbiosyntheseweg zugeführt, und Fructose-6-phosphat wird in Biomasse umgewandelt.
  • Beispiel 34. Glucose-6-phosphat-Akkumulation in Saccharomyces cerevisiae mittels Saccharose-Phosphorvlase
  • Saccharomyces cerevisiae wird modifiziert, um Glucose-6-phosphat aus Saccharose mit einer Saccharose-Phosphorylase herzustellen, die aus Bifidobacterium adolescentis stammt. Da Saccharose-Phosphorylase mit Invertase um Saccharose konkurriert, werden die Gene, die für die Invertaseaktivität codieren, ausgeschaltet. Diese Gene sind SUC2, MAL32, MAL12, YJL216C und YGR287c. Glucose-1-phosphat wird dann weiter zu Glucose-6-phosphat mit einer von PGM1 und PGM2 codierten Phosphoglucomutase umgewandelt. Um einen Abbau von Glucose-1-phosphat zu Glucose zu vermeiden, werden Glucose-1-Phosphatase-codierende Gene ausgeschaltet, die von INM1 und INM2 codiert werden. Die Assimilation dieses aktivierten Saccharids wird weiter reduziert, indem die UTP-Glucose-1-phosphat-Uridylyltransferase-Aktivität in der Zelle eliminiert wird, indem die Gene YHL012W und UGP1 weniger funktional oder nicht-funktional gemacht werden. Die Fructoseeinheit wird durch die von HXKI und HXK2 codierten nativen Hexokinasen phosphoryliert und in Biomasse umgewandelt.
  • Beispiel 35. Erhöhte UDP-Glucosebildung in Saccharomyces cerevisiae mittels Saccharose-Synthase
  • Da Saccharomyces cerevisiae von Natur aus Saccharose spaltet, werden alle alternativen Saccharose abbauenden Reaktionen (Invertasen), die von den Genen SUC2, MAL32, MAL12, YJL216C, YGR287c codiert werden, ausgeschaltet. Eine Saccharose-Synthase, z. B. aus Solanum tuberosum stammend, wird eingeführt, so dass Saccharose in UDP-Glucose und Fructose gespalten wird. Um eine UDP-Glucose-Umwandlung in Biomasse zu vermeiden, wird die Aktivität der Enzyme UDP-Glucose-Diphosphorylase, UDP-Glucose-4-Epimerase, UDP-Glucose-hexose-1-phosphat-Uridylyltransferase, UDP-Glucose-glycogen-Glucosyltransferase, UDP-Glucose-1,3-beta-D-Glucanglucosyltransferase, UDP-Glucose-Glucosephosphat-Glucosyltransferase weniger funktional oder nicht-funktional gemacht. Diese Enzyme werden durch die Gene UGP1 und YHL012W, GAL10, GAL7, GSY1 und GSY2, FEN1 und FKS1 bzw. GSC2 und TPS1 codiert. Die Fructoseeinheit wird durch die von HXKI und HXK2 codierten nativen Hexokinasen phosphoryliert und in Biomasse umgewandelt.
  • Beispiel 36. Erhöhte UDP-Glucose-Bildung in Saccharomyces cerevisiae mittels Saccharose Saccharose-Phosphorviase
  • Um die UDP-Glucose-Versorgung in Saccharomyces cereviseae zu erhöhen, wird ein Stamm wie in Beispiel 29 beschrieben weiter modifiziert, indem das Gen GAL7 überexprimiert wird, das für eine UTP-Glucose-1 -phosphat-Uridylyltransferase codiert, die die Umwandlung von α-Glucose-1 -phosphat zu UDP-Glucose katalysiert.
  • Beispiel 37. Erhöhte UDP-Galactose-Bildung in Saccharomyces cerevisiae mittels β-Galactosidase
  • Um die UDP-Galactose-Versorgung in Saccharomyces cereviseae zu erhöhen, wird ein Stamm wie in Beispiel 32 beschrieben weiter modifiziert, indem ein Gen überexprimiert wird, das für eine UTP-Galactose-1-phosphat-Uridylyltransferase (z. B. aus Bifidobacterium bifidum stammend) codiert, die die Umwandlung von α-Galactose-1-phosphat zu UDP-Galactose katalysiert.
  • Beispiel 38. Dictvostellium discoideum α1,2-Fucosvltransferase-Aktivität
  • Einführung
  • Die Dictyostelium discoideum α1,2-Fucosyltransferase (FT) ist Teil einer ziemlich neuen Glycosyltransferase-Klasse. Alle bekannten FT gehören zur Klasse GT11, während D. discoideum FT zur Klasse GT74 gehört. Eine solche FT wurde bisher nur in zwei anderen Organismen gefunden, nämlich Desulfococcus oleovorans und Desulfotomaculum reducens. Die dritte Klasse ist GT37, die nur Pflanzen-FT enthält (18). Eine ClustalW- und T-Coffee-Ausrichtung zeigte an, dass die Identität mit H. pylori nur 9,7% bzw. 15,5% beträgt. Die konservierten Motive von GT11 sind in 19 dargestellt, und diese kommen im Dictyostelium-Protein überhaupt nicht vor (67). Diese Domänen unterscheiden sich hinsichtlich der Fucosylierungsaktivität der Transferasen. Die ersten beiden Motive sind für α-1,2-Fucosyltransferase und α-6-Fucosyltransferase gleich, während das dritte die Enzyme voneinander unterscheidet. α-1,3-Fucosyltransferase enthält zwei völlig unterschiedliche konservierte Motive.
  • Es wurde jedoch beschrieben, dass das Dictyostelium discoideum FT nur auf Lacto-N-biose und nicht auf Galactose-phenyl-β-galactosid, Galβ1-6-GlcNac, Lactose, Galβ1-6Gal, Xyl, Glc, GlcNAc und GalNac (92) aktiv ist.
  • In der 20 ist eine LC-MSMS-Analyse des Dictyostellium discoideum-Fucosyltransferase-Assays gezeigt. Dieser Assay zeigte überraschenderweise, dass diese heterolog exprimierte Fucosyltransferase mit Lactose als Akzeptor und GDP-Fucose als Fucosedonor aktiv ist. Die Aktivität dieses Enzyms betrug 0,19 ± 0,01 U/mg Protein und wurde nach dem Verfahren von Persson und Palcic (68) bestimmt.
  • Weil nur die Hälfte des Enzyms von Dictyostelium discoideum für seine α1,2-Fucosyltransferase-Aktivität verantwortlich ist, wurde dieser Teil auf ähnliche Weise wie das vollständige Enzym kloniert, jedoch mit einem zusätzlichen Startcodon (codiert durch ATG) vor der Nukleotidsequenz. Dieses neue Enzym wurde in einem ΔlacZΔglgCΔmanAΔCA-Mutantenstamm hergestellt und auf α1,2-Fucosyltransferase-Aktivität mit einem LC-MSMS getestet. Die 21 zeigt deutlich, dass dieses Teilenzym immer noch in der Lage ist, 2-Fucosyllactose aus GDP-Fucose und Lactose zu bilden.
  • Beispiel 39. Myo-Inositolproduktion in E. coli
  • Ausgehend von einem Basisstamm, der Glucose-6-phosphat akkumuliert, wird ein Myo-Inositol-Produzent konstruiert, indem zusätzlich ein Gen eingeführt wird, das für Myo-Inositol-1-Phosphat-Synthase (INO1, das aus Saccharomyces cerevisiae stammt) und Myo-Inositol-1 (oder 4)-Monophosphatase (INM1 und INM2, die aus Saccharomyces cerevisiae stammen) codiert.
  • Beispiel 40. Lacto-N-biose-Produktion in E. coli
  • Ausgehend von einem Basisstamm, der Galactose-1-phosphat akkumuliert, wird ein Lacto-N-biose-Produzent konstruiert, indem zusätzlich ein Gen eingeführt wird, das für Lacto-N-biose-Phosphorylase (Inbp, Bifidobacterium longum) codiert. Eine Fermentation wird unter Verwendung von Lactose und N-Acetylglucoamin als Kohlenstoffquellen durchgeführt. Der Abbau von N-Acetylglucosamin wird im Produzentenstamm durch Eliminieren jeglicher N-Acetyl-D-Glucosamin-Kinase-Aktivität (nagK) und N-Acetylglucosamin-PTS-Aktivität (nagE, ptsH, ptsI, manXYZ) gehemmt.
  • Hierin sind die folgenden Aspekte offenbart:
    • Aspekt 1: Ein metabolisch veränderter Organismus für die Herstellung von wenigstens einem Spezialprodukt, das aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus einem Saccharid, einem aktivierten Saccharid, einem Nukleosid, einem Glycosid, einem Glycolipid und einem Glycoprotein, dadurch gekennzeichnet, dass:
      1. a) der Organismus genetisch modifiziert ist durch die Einführung von wenigstens: i) einem Gen, das eine Kohlenhydrat-Hydrolase codiert, in Kombination mit einem Gen, das eine Kohlenhydrat-Kinase codiert, ii) einem Gen, das eine Kohlenhydrat-Synthase codiert, oder iii) einem Gen, das eine Kohlenhydrat-Phosphorylase codiert, so dass der Organismus in der Lage ist, ein Disaccharid, Oligosaccharid, Polysaccharid oder eine Mischung davon in ein aktiviertes Saccharid und ein Saccharid aufzuspalten, und
      2. b) der Organismus genetisch weiter modifiziert ist, so dass wenigstens ein anderes Gen als beliebige der in Schritt a) eingeführten Gene des Organismus weniger funktional oder nicht-funktional gemacht worden ist, und wobei das andere Gen ein Enzym, welches das aktivierte Saccharid in Biomasse umwandelt, und/oder bio-katalytische Enzyme codiert.
    • Aspekt 2: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß Aspekt 1, wobei der Organismus genetisch weiter modifiziert ist durch die Einführung von wenigstens einem anderen Gen, welches das aktivierte Saccharid in ein Spezialprodukt umwandelt, oder wobei wenigstens ein anderes endogenes Gen des Organismus, welches das aktivierte Saccharid in ein Spezialprodukt umwandelt, überexprimiert wird. Aspekt 3: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß Aspekt 1 oder 2, wobei der Organismus in der Lage ist, auf einem Disaccharid, Oligosaccharid, Polysaccharid oder einer Mischung davon als die hauptsächliche Kohlenstoffquelle zu wachsen.
    • Aspekt 4: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß den Aspekten 1 bis 3, wobei die genetische Modifizierung von Schritt a) optional ist, oder ersetzt wird durch die Überexpression von wenigstens: i) einem endogenen Gen, das eine Kohlenhydrat-Hydrolase codiert, in Kombination mit einem Gen, das Kohlenhydrat-Kinase codiert, ii) einem endogenen Gen, das eine Kohlenhydrat-Synthase codiert, oder, iii) einem endogenen Gen, das eine Kohlenhydrat-Phosphorylase codiert, und wobei der Organismus in der Lage ist, ein Disaccharid, Oligosaccharid, Polysaccharid oder eine Mischung davon in ein aktiviertes Saccharid und ein Saccharid aufzuspalten.
    • Aspekt 5: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß den Aspekten 1 - 4, wobei das aktivierte Saccharid in Schritt b) durch das Saccharid ersetzt wird, und wobei das aktivierte Saccharid in der weiteren genetischen Modifizierung gemäß den Aspekten 2 - 4 durch das Saccharid ersetzt wird. Aspekt 6: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß den Aspekten 1 - 4, wobei das Gen in Schritt a) ein Disaccharid, Oligosaccharid, Polysaccharid in zwei aktivierte Saccharide oder in zwei Saccharide aufspaltet.
    • Aspekt 7: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß den Aspekten 1 - 6, wobei der Organismus ein Mikroorganismus, der aus der Liste gewählt ist, welche aus einem Bakterium, einer Hefe, einer Pilzzelle besteht, oder eine Pflanzenzelle oder eine Tierzelle ist.
    • Aspekt 8: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß Aspekt 7, wobei das Bakterium Escherichia coli ist, oder wobei die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist.
    • Aspekt 9: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß den Aspekten 1 - 8, wobei das aktivierte Saccharid aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus alpha-Glucose-1-phosphat, alpha-Galactose-1-phosphat, beta-Glucose-1-phosphat, beta-Galactose-1-phosphat, UDP-Glucose, Glucose-6-phosphat, Fructose-6-phosphat und UDP-Galactose, und wobei das Saccharid aus der Gruppe gewählt ist, die aus Fructose, Glucose und Galactose besteht.
    • Aspekt 10: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß den Aspekten 1 - 9, wobei die Kohlenhydrat-Hydrolase eine Lactase, Invertase, Sucrase, Maltase, Trehalase, Saccharose-6-phosphat-Hydrolase und/oder Amylase ist, und wobei die Kohlenhydrat-Kinase ist eine Galactokinase, eine Fructokinase, eine Glucokinase und/oder Mannokinase.
    • Aspekt 11: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß den Aspekten 1 - 3, 6 - 10, wobei:
      • - das Gen in Schritt a) eine Saccharose-Phosphorylase codiert, und/oder
      • - die folgenden Gene in Schritt b) nicht-funktional gemacht werden: ein Gen, das eine beta-Galactosidase codiert, und/oder ein Gen, das eine Phosphoglucomutase codiert, und/oder ein Gen, das eine Glucose-1-phosphat-Adenylyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine Phosphatase codiert, und/oder ein Gen, das eine Glucose-1-phosphat-Uridyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucose-4-Epimerase codiert, und/oder ein Gen, das UDP-Glucose : Galactose-1-phosphat-Uridyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das UDP-Galactopyranose-Mutase codiert und/oder ein Gen, das UDP-Galactose:(Glucosyl)lipopolySaccharid-1,6-Galactosyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Galactosyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucosyltransferase codiert und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucuronat-Transferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucose-Lipidträger-Transferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Zucker-Hydrolase codiert, und/oder ein Gen, das eine Invertase codiert, und/oder ein Gen, das eine Maltase codiert, und/oder ein Gen, das eine Trehalase codiert, und/oder ein Gen, das eine Zucker transportierende Phosphotransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine Hexokinase codiert. Aspekt 12: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß Aspekt 11 wobei:
      • - das Gen in Schritt a) eine Saccharose-Phosphorylase codiert;
      • - die Gene in Schritt b) Folgende sind: das Gen lacZ, das Gen pgm, das Gen ycjU, das Gen glgC, das Gen agp, das Gen ptsG, das Gen glk, das Gen glf, das Gen waaB, das Gen ushA, das Gen wcaA, das Gen wcaC, das Gen wcaE, das Gen wcaI, das Gen wcaL, das Gen wcaJ, das Gen galU, das Gen galF, das Gen galE, das Gen galT, das Gen malP und/oder das Gen malQ.
    • Aspekt 13: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß Aspekt 11, wobei:
      • - das Gen in Schritt a) eine Saccharose-Phosphorylase codiert;
      • - die Gene in Schritt b) Folgende sind: das Gen PGM1, das Gen PGM2, das Gen GLG1, das Gen GLG2, das Gen INM1, das Gen INM2, das Gen GLK1, das Gen HXK1, das Gen HXK2, das Gen GAL10, das Gen GAL7, das Gen YHL012W, das Gen UGP1, das Gen GSY1, das Gen GSY2, das Gen DIE2, das Gen ALG8, das Gen ATG26, das Gen SUC2, das Gen MAL32, das Gen MAL12, das Gen YJL216C und/oder das Gen YGR287C und/oder FEN1 und/oder FKS1 und/oder GSC2 und/oder TPS1.
    • Aspekt 14: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß Aspekt 12 - 13, wobei die Saccharose-Phosphorylase aus einem Milchsäurebakterium stammt und wobei das Milchsäurebakterium Bifidobacterium adolescentis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus acidophilus oder Streptococcus mutans ist.
    • Aspekt 15: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß den Aspekten 11 - 14, wobei die Saccharose-Phosphorylase von Schritt a) durch eine Saccharose-Synthase, eine Maltose-Phosphorylase oder eine Maltose-Synthase ersetzt wurde.
    • Aspekt 16: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß den Aspekten 11 - 14, wobei die Saccharose-Phosphorylase von Schritt a) durch eine Lactose-Phosphorylase oder eine Lactose-Synthase ersetzt wurde.
    • Aspekt 17: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß Aspekt 5, wobei:
      • - das Gen in Schritt a) eine Saccharose-Phosphorylase codiert, und/oder
      • - die folgenden Gene in Schritt b) nicht-funktional gemacht werden: ein Gen, das eine beta-Galactosidase codiert, und/oder ein Gen, das eine Glucose-6-phosphat-Isomerase codiert, und/oder ein Gen, das eine Glucose-1-phosphat-Adenylyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine Glucose-1-phosphatase codiert, und/oder ein Gen, das eine Phosphofructokinase A codiert, und/oder ein Gen, das eine Phosphofructokinase B codiert, und/oder ein Gen, das Phosphogluconat-Dehydratase codiert, und/oder ein Gen, das 2-Keto-3-deoxygluconat-6-phosphat-Aldolase codiert, und/oder ein Gen, das eine Glucose-1 -phosphat-Uridyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucose-4-Epimerase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucose:galactose-1-phosphat-Uridyltransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Galactopyranose-Mutase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Galactose:(Glucosyl)lipopolysaccharid-1,6-Galactosyl-Transferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Galactosyl-Transferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucosyl-Transferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucuronat-Transferase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Glucose-Lipidträger-Transferase codiert, und/oder ein Gen, das eine GDP-Mannose-Hydrolase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-Zucker-Hydrolase codiert, und/oder ein Gen, das eine Mannose-6-phosphat-Isomerase codiert, und/oder ein Gen, das eine UDP-N-Acetylglucosamin-Enoylpyruvoyl-Transferase codiert und/oder ein Gen, das eine UDP-N Acetylglucosamin-Acetyltransferase codiert und/oder ein Gen, das eine UDP-N-Acetylglucosamin-2-epimerase codiert, und/oder ein Gen, das eine Undecaprenyl-phosphat-alpha-N-acetylglucosaminyl-Transferase codiert, und/oder ein Gen, das eine Glucose-6-phosphat-1-Dehydrogenase codiert, und/oder ein Gen, das eine L-Glutamin : D-Fructose-6-phosphat-Aminotransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine Mannose-6-phosphat-Isomerase codiert, und/oder ein Gen, das eine Sorbitol-6-phosphat-Dehydrogenase codiert, und/oder ein Gen, das eine Mannitol-1-phosphat-5-Dehydrogenase codiert, und/oder ein Gen, das eine Allulose-6-phosphat-3-Epimerase codiert, und/oder ein Gen, das eine Invertase codiert, und/oder ein Gen, das eine Maltase codiert, und/oder ein Gen, das eine Trehalase codiert, und/oder ein Gen, das eine Zucker transportierende Phosphotransferase codiert, und/oder ein Gen, das eine Hexokinase codiert.
    • Aspekt 18: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß Aspekt 17, wobei:
      • - das Gen in Schritt a) ein Gen ist, das eine Saccharose-Phosphorylase codiert;
      • - die Gene in Schritt b) Folgende sind: das Gen lacZ, das Gen pgi, das Gen glgC, das Gen agp, das Gen pfkA, das Gen pfkB, das Gen waaB, das Gen ushA, das Gen eda, das Gen edd, das Gen wcaA, das Gen wcaC, das Gen wcaE, das Gen wcaI, das Gen wcaL, das Gen wcaJ, das Gen wcaB, das Gen wcaF, das Gen wcaK, das Gen wcaD, das Gen galU, das Gen galF, das Gen galE, das Gen gmm, das Gen galT, das Gen manA, das Gen murA, das Gen IpxA, das Gen rffE, das Gen rfe, das Gen glmS, das Gen srlD, das Gen mtlD, das Gen alsE und/oder zwf.
    • Aspekt 19: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß Aspekt 18, wobei:
      • - das Gen in Schritt a) ein Gen ist, das eine Saccharose-Phosphorylase codiert;
      • - die Gene in Schritt b) Folgende sind: das Gen pgi1, das Gen PFK1, das Gen PFK2, das Gen PFK26, das Gen PFK26, das Gen PFK27, das Gen GND1, das Gen GND2, das Gen PMI40, das Gen ZWF1, das Gen GFA1, das Gen GLG1, das Gen GLG2, das Gen INM1, das Gen INM2, das Gen GLK1, das Gen HXK1, das Gen HXK2, das Gen GAL10, das Gen GAL7, das Gen YHL012W, das Gen UGP1, das Gen GSY1, das Gen GSY2, das Gen DIE2, das Gen ALG8, das Gen ATG26, das Gen SUC2, das Gen MAL32, das Gen MAL12, das Gen YJL216C und/oder das Gen YGR287C und/oder FEN1 und/oder FKS1 und/oder GSC2 und/oder TPS1.
    • Aspekt 20: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß Aspekt 18 - 19, wobei die Saccharose-Phosphorylase aus einem Milchsäurebakterium stammt und wobei das Milchsäurebakterium Bifidobacterium adolescentis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus acidophilus oder Streptococcus mutants ist.
    • Aspekt 21: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß den Aspekten 2 - 20, wobei das Gen, welches das aktivierte Saccharid in ein Spezialprodukt umwandelt, eine Epimerase, eine Transferase, eine Reduktase, eine (Pyro)phosphorylase, eine (De)carboxylase, eine Dehydratase, eine Permease, eine Synthase, eine Dehydrogenase, eine Oxidase oder eine Isomerase codiert.
    • Aspekt 22: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß Aspekt 21, wobei die Epimerase UDP-Galactose-4-Epimerase oder UDP-N-Acetylglucosamine-Epimerase ist, und/oder wobei die Transferase eine Glycosyltransferase, eine Fucosyltransferase, eine Sialyltransferase oder eine Sulfotransferase ist.
    • Aspekt 23: Der metabolisch veränderte Organismus gemäß den Aspekten 1 - 22, wobei das Spezialprodukt eine MonoSaccharid, ein Disaccharid, ein Trisaccharid, ein Tetrasaccharid, ein Pentasaccharid, ein Polysaccharid, ein Nukleosid, ein O-Glycosid, ein S-Glycosid, ein N-Glycosid, ein C-Glycosid, ein Glycoprotein, ein Glycolipid oder ein aktiviertes Kohlenhydrat ist.
    • Aspekt 24: Ein Verfahren zur Herstellung eines Spezialprodukts gemäß einem beliebigen der Aspekte 1 - 23, umfassend:
      • i) metabolisches Verändern eines Mikroorganismus gemäß einem beliebigen der Aspekte 1 - 23, und
      • ii) Kultivieren des genetisch veränderten Mikroorganismus, und
      • iii) Extrahieren und Reinigen des Spezialproduktes.
    • Aspekt 25: Verwendung einer 2-Fucosyltransferase, die aus Dictyostellium discoideum stammt, mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID N° 1 angegeben ist, oder einem Fragment davon mit 2-Fucosyltransferase-Aktivität, oder einer Varianten davon mit einer Sequenzidentität von wenigstens 75 % und mit 2-Fucosyltransferase-Aktivität, um Fucosyllactose herzustellen.
    • Aspekt 26: Verwendung gemäß Aspekt 25 wobei das Fragment mit 2-Fucosyltransferase-Aktivität eine Aminosäuresequenz aufweist, wie sie durch die SEQ ID N° 4 angegeben ist.
    • Aspekt 27: Verwendung einer Nukleinsäure, die 2-Fucosyltransferase gemäß einem beliebigen von Aspekt 25 und 26 codiert, um Fucosyllactose herzustellen.
    • Aspekt 28: Verwendung gemäß Aspekt 27, wobei die Nukleinsäuren eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, wie sie durch die SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 5 oder SEQ ID N° 6 angegeben sind.
  • Bezugszeichenliste
    • 3KO
    ein Mutantenstamm, in dem die Gene pgm, IacZ und glgC ausgeschaltet wurden (knocked out)
    4KO
    ein Mutantenstamm, in dem die Gene pgm, IacZ, glgC und agp ausgeschaltet wurden
    6PG
    6-Phosphogluconat
    BA
    Bifidobacterium adolescentis
    BaSP
    eine Saccharose-Phosphorylase, die aus Bifidobacterium adolescentis stammt
    CA
    Colansäure-Operon, definiert von Stevenson et al. (86)
    CDW
    Zelltrockengewicht
    CuCP
    Cellulomonas uda-Cellobiose-Phosphorylase
    F6P
    Fructose-6-phosphat
    FBP
    Fructose-1,6-bisphosphat
    Fru
    Fructose
    FT
    α-1,2-Fucosyltransferase
    G1P
    Glucose-1-phosphat
    Gal1P
    Galactose-1-phosphat
    Glc
    Glucose
    Glu
    Glucose
    KI
    Knock in
    KO
    Knock out
    KP
    Kojibiose-Phosphorylase
    LA
    Lactobacillus acidophilus
    LB
    Luria Bertani -Nährlösung
    LM
    Leuconostoc mesenteroides
    MP
    Maltose-Phosphorylase
    P22
    Promotor 22 der Promotor-Bibliothek von De Mey et al. (2007)
    pCXp22
    ein Pasmid, welches den P22-Promotor enthält, gemäß Aerts et al. (1)
    PEP
    Phosphoenolpyruvat
    Pi
    Anorganisches Phosphat
    PPi
    Pyrophosphat
    Pyr
    Pyruvat
    rpm
    Rotationen pro Minute
    SM
    Streptococcus mutans
    SP
    Saccharose-Phosphorylase
    Suc
    Saccharose
    UDP-gal
    UDP-Galactose
    UDP-glc
    UDP-Glucose
    WT
    Wildtyp-Stamm
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  • Einige Gegenstände der Erfindung sind in den nachfolgenden Punkten 1 bis 32 beispielhaft dargestellt:
    1. 1. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe für die Herstellung von wenigstens einem Spezialprodukt, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus einem Saccharid, einem aktivierten Saccharid, einem Nukleosid, einem Glycosid, einem Glycolipid und einem Glycoprotein besteht, dadurch gekennzeichnet, dass:
      1. a) das Bakterium oder die Hefe in der Lage ist, auf einem Disaccharid, Oligosaccharid, Polysaccharid oder einer Mischung davon als die hauptsächliche Kohlenstoffquelle zu wachsen;
      2. b) das Bakterium oder die Hefe genetisch modifiziert ist, um den Metabolismus in einen Herstellungs-Stoffwechselweg, der zu dem Spezialprodukt führt, und einen Biomasse-Stoffwechselweg, der zu Wachstum/Biomasse führt, aufzuspalten;
      3. c) das Bakterium oder die Hefe in der Lage ist, das Disaccharid, Oligosaccharid, Polysaccharid oder eine Mischung davon innerhalb des Bakteriums oder der Hefe in ein aktiviertes Saccharid und ein Saccharid, in zwei aktivierte Saccharide oder in zwei Saccharide aufzuspalten und
      4. d) jedes von dem aktivierten Saccharid und dem Saccharid oder jedes von den zwei aktivierten Sacchariden oder jedes von den zwei Sacchariden in einem eigenständigen Stoffwechselweg verwendet wird, gewählt aus dem Herstellungs-Stoffwechselweg und dem Biomasse-Stoffwechselweg.
    2. 2. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 1, wobei die Aufspaltung des Disaccharids, Oligosaccharids, Polysaccharids oder einer Mischung davon in ein aktiviertes Saccharid und ein Saccharid erhalten wird durch die Einführung oder Überexpression von wenigstens: i) einem Gen, das eine Kohlenhydrat-Hydrolase codiert, in Kombination mit einem Gen, das eine Kohlenhydrat-Kinase codiert; ii) einem Gen, das eine Kohlenhydrat-Synthase codiert oder iii) einem Gen, das eine Kohlenhydrat-Phosphorylase codiert, oder wobei die Aufspaltung des Disaccharids, Oligosaccharids, Polysaccharids oder einer Mischung davon in zwei Saccharide durch die Einführung oder Überexpression von wenigstens einem Gen, das eine Kohlenhydrat-Hydrolase codiert, erhalten wird.
    3. 3. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die genetische Modifizierung zur Aufspaltung des Metabolismus in einen Herstellungs-Stoffwechselweg und einen Biomasse-Stoffwechselweg das Weniger-Funktional- oder Nicht-Funktional-Machen wenigstens eines Gens umfasst, das ein Enzym codiert, welches das aktivierte Saccharid oder das Saccharid, welches in dem Herstellungs-Stoffwechselweg verwendet wird, in Biomasse umwandelt.
    4. 4. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, wobei das aktivierte Saccharid, das in dem Herstellungs-Stoffwechselweg verwendet wird, zu dem Spezialprodukt umgewandelt wird, oder wobei das Saccharid, das in dem Herstellungs-Stoffwechselweg verwendet wird, aktiviert wird durch eine Kinase und zu dem Spezialprodukt umgewandelt wird, und wobei das Bakterium oder die Hefe genetisch modifiziert ist, so dass wenigstens ein Gen, das ein Enzym codiert, welches das aktivierte Saccharid oder das Saccharid, welches in dem Herstellungs-Stoffwechselweg verwendet wird, in Biomasse umwandelt, weniger funktional oder nicht-funktional gemacht wird.
    5. 5. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Bakterium oder die Hefe genetisch weiter modifiziert ist durch die Einführung von wenigstens einem anderen Gen, das ein Enzym codiert, welches das aktivierte Saccharid oder das Saccharid, welches in dem Herstellungs-Stoffwechselweg verwendet wird, in ein Spezialprodukt umwandelt, oder, wobei wenigstens ein anderes endogenes Gen des Bakteriums oder der Hefe, welches ein Enzym codiert, das das aktivierte Saccharid oder das Saccharid, das in dem Herstellungs-Stoffwechselweg verwendet wird, in ein Spezialprodukt umwandelt, überexprimiert wird.
    6. 6. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, wobei das aktivierte Saccharid des aktivierten Saccharids und des Saccharids, die durch das Aufspalten des Disaccharids, Oligosaccharids, Polysaccharids oder einer Mischung davon innerhalb des Bakteriums oder der Hefe erhalten wurden, in dem Herstellungs-Stoffwechselweg verwendet wird.
    7. 7. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Saccharid des aktivierten Saccharids und des Saccharids, die durch das Aufspalten des Disaccharids, Oligosaccharids, Polysaccharids oder einer Mischung davon innerhalb des Bakteriums oder der Hefe erhalten wurden, in dem Herstellungs-Stoffwechselweg verwendet wird.
    8. 8. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Bakterium Escherichia coli ist oder wobei die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist.
    9. 9. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, wobei das aktivierte Saccharid aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus alpha-Glucose-1-phosphat, alpha-Galactose-1-phosphat, beta-Glucose-1-phosphat, beta-Galactose-1-phosphat, UDP-Glucose, Glucose-6-phosphat, Fructose-6-phosphat und UDP-Galactose, und wobei das Saccharid aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Fructose, Glucose und Galactose.
    10. 10. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 9, wobei die Kohlenhydrat-Hydrolase eine Lactase, Invertase, Sucrase, Maltase, Trehalase, Saccharose-6-phosphat-Hydrolase und/oder Amylase ist, und wobei die Kohlenhydrat-Kinase eine Galactokinase, eine Fructokinase, eine Glucokinase und/oder Mannokinase ist.
    11. 11. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 6, 8 - 9,
      • - wobei die Aufspaltung des Disaccharids, Oligosaccharids, Polysaccharids oder einer Mischung davon innerhalb des Bakteriums oder der Hefe in ein aktiviertes Saccharid und ein Saccharid erhalten wird durch die Einführung oder Überexpression von einem Gen, das eine Saccharose-Phosphorylase codiert; und - wobei die genetische Modifizierung zur Aufspaltung des Metabolismus in einen Herstellungs-Stoffwechselweg und ein Biomasse-Stoffwechselweg Folgendes umfasst:
      • - wenigstens ein Gen weniger funktional oder nicht-funktional machen, das ein Enzym codiert, das das aktivierte Saccharid in Biomasse umwandelt, gewählt aus einem Gen, das eine Phosphoglucomutase codiert, einem Gen, das eine Glucose-1-phosphat-Adenylyltransferase codiert, einem Gen, das eine Phosphatase codiert, und einem Gen, das eine Glucose-1-phosphat-Uridyltransferase codiert, und
      • - ein oder mehrere Gene optional weniger funktional oder nicht-funktional machen, das bzw. die gewählt ist bzw. sind aus einem Gen, das eine beta-Galactosidase codiert, einem Gen, das eine UDP-Glucose-4-epimerase codiert, einem Gen, das UDP-Glucose:Galactose-1-phosphat-Uridyltransferase codiert, einem Gen, das UDP-Galactopyranose-Mutase codiert, einem Gen, das UDP-Galactose:(Glucosyl)lipopolysaccharid-1,6-galactosyl-Transferase codiert, einem Gen, das eine UDP-Galactosyl-Transferase codiert, einem Gen, das eine UDP-Glucosyl-Transferase codiert, einem Gen, das eine UDP-Glucuronat-Transferase codiert, einem Gen, das eine UDP-Glucose-Lipidträger-Transferase codiert, einem Gen, das eine UDP-Zucker-Hydrolase codiert, einem Gen, das eine Invertase codiert, einem Gen, das eine Maltase codiert, einem Gen, das eine Trehalase codiert, einem Gen, das eine Zucker transportierende Phosphotransferase codiert, und einem Gen, das eine Hexokinase codiert.
    12. 12. Metabolisch verändertes Bakterium gemäß Anspruch 11, wobei Gene, die von dem Gen pgm, dem Gen ycjU, dem Gen glgC, dem Gen agp und/oder dem Gen glk gewählt sind, weniger funktional oder nicht-funktional gemacht wurden, und wobei optional Gene, die gewählt sind von dem Gen lacZ, dem Gen ptsG, dem Gen glf, dem Gen waaB, dem Gen ushA, dem Gen wcaA, dem Gen wcaC, dem Gen wcaE, dem Gen wcal, dem Gen wcaL, dem Gen wcaJ, dem Gen galU, dem Gen galF, dem Gen galE, dem Gen galT, dem Gen malP und/oder dem Gen malQ, weniger funktional oder nicht-funktional gemacht werden.
    13. 13. Metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 11, wobei Gene, die von dem Gen PGM1, dem Gen PGM2, dem Gen INM1, dem Gen INM2 und/oder dem Gen YHL012W gewählt sind, weniger funktional oder nicht-funktional gemacht werden, und wobei optional Gene, die von dem Gen GLG1, dem Gen GLG2, dem Gen GLK1, dem Gen HXK1, dem Gen HXK2, dem Gen GAL10, dem Gen GAL7, dem Gen UGP1, dem Gen GSY1, dem Gen GSY2, dem Gen DIE2, dem Gen ALG8, dem Gen ATG26, dem Gen SUC2, dem Gen MAL32, dem Gen MAL12, dem Gen YJL216C, dem Gen YGR287C, FEN1, FKS1, GSC2 und/oder TPS1 gewählt sind, weniger funktional oder nicht-funktional gemacht werden.
    14. 14. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 12 oder 13, wobei die Saccharose-Phosphorylase aus einem Milchsäurebakterium stammt, und wobei das Milchsäurebakterium Bifidobacterium adolescentis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus acidophilus oder Streptococcus mutans ist.
    15. 15. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 11 - 14, wobei die Saccharose-Phosphorylase durch eine Saccharose-Synthase, eine Maltose-Phosphorylase oder eine Maltose-Synthase ersetzt wird.
    16. 16. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 11 - 14, wobei die Saccharose-Phosphorylase durch eine Lactose-Phosphorylase oder eine Lactose-Synthase ersetzt wird.
    17. 17. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 7 - 9,
      • - wobei die Aufspaltung des Disaccharids, Oligosaccharids, Polysaccharids oder einer Mischung davon innerhalb des Bakteriums oder der Hefe in ein aktiviertes Saccharid und ein Saccharid erhalten wird durch die Einführung oder Überexpression von einem Gen, das eine Saccharose-Phosphorylase codiert; und - wobei die genetische Modifizierung zur Aufspaltung des Metabolismus in einen Herstellungs-Stoffwechselweg und einen Biomasse-Stoffwechselweg Folgendes umfasst:
      • - wenigstens ein Gen weniger funktional oder nicht-funktional machen, das ein Enzym codiert, das das Saccharid in Biomasse umwandelt, gewählt aus einem Gen, das eine Glucose-6-phosphat-Isomerase codiert, einem Gen, das eine Phosphofructokinase A codiert, einem Gen, das eine Phosphofructokinase B codiert, einem Gen, das eine Sorbitol-6-phosphat-Dehydrogenase codiert, einem Gen, das eine Mannitol-1-phosphat-5-Dehydrogenase codiert und einem Gen, das eine Zucker transportierende Phosphotransferase codiert, und
      • - ein oder mehrere Gene optional weniger funktional oder nicht-funktional machen, das bzw. die gewählt ist bzw. sind aus einem Gen, das eine beta-Galactosidase codiert, einem Gen, das eine Glucose-1-phosphat-Adenylyltransferase codiert, einem Gen, das eine Glucose-1-phosphatase codiert, einem Gen, das Phosphogluconat-Dehydratase codiert, einem Gen, das 2-Keto-3-desoxygluconat-6-phosphat-Aldolase codiert, einem Gen, das eine Glucose-1-phosphat-Uridyltransferase codiert, einem Gen, das eine UDP-Glucose-4-epimerase codiert, einem Gen, das eine UDP-Glucose:Galactose-1-phosphat-Uridyltransferase codiert, einem Gen, das eine UDP-Galactopyranose-Mutase codiert, einem Gen, das eine UDP-Galactose:(Glucosyl)lipopolysaccharid-1,6-Galactosyltransferase codiert, einem Gen, das eine UDP-Galactosyltransferase codiert, einem Gen, das eine UDP-Glucosyltransferase codiert, einem Gen, das eine UDP-Glucuronat-Transferase codiert, einem Gen, das eine UDP-Glucose-Lipidträger-Transferase codiert, einem Gen, das eine GDP-Mannose-Hydrolase codiert, einem Gen, das eine UDP-Zucker-Hydrolase codiert, einem Gen, das eine Mannose-6-phosphat-Isomerase codiert, einem Gen, das eine UDP-N-Acetylglucosaminenoylpyruvoyl-Transferase codiert, einem Gen, das eine UDP-N-Acetylglucosamin-Acetyltransferase codiert, einem Gen, das eine UDP-N-Acetylglucosamin-2-Epimerase codiert, einem Gen, das eine Undecaprenyl-phosphat-alfa-N-acetylglucosaminyl-Transferase codiert, einem Gen, das eine Glucose-6-phosphat-1-Dehydrogenase codiert, einem Gen, das eine L-Glutamin:D-fructose-6-phosphat-Aminotransferase codiert, einem Gen, das eine Mannose-6-phosphat-Isomerase codiert, einem Gen, das eine Allulose-6-phosphat-3-Epimerase codiert, einem Gen, das eine Invertase codiert, einem Gen, das eine Maltase codiert, einem Gen, das eine Trehalase codiert und einem Gen, das eine Hexokinase codiert.
    18. 18. Metabolisch verändertes Bakterium gemäß Anspruch 17, wobei Gene, die von dem Gen pgi, dem Gen agp, dem Gen pfkA, dem Gen pfkB, dem Gen srlD und/oder dem Gen mtlD gewählt sind, weniger funktional oder nicht-funktional gemacht werden, und wobei optional Gene, die von dem Gen lacZ, dem Gen glgC, dem Gen waaB, dem Gen ushA, dem Gen eda, dem Gen edd, dem Gen wcaA, dem Gen wcaC, dem Gen wcaE, dem Gen wcal, dem Gen wcaL, dem Gen wcaJ, dem Gen wcaB, dem Gen wcaF, dem Gen wcaK, dem Gen wcaD, dem Gen galU, dem Gen galF, dem Gen galE, dem Gen gmm, dem Gen galT, dem Gen manA, dem Gen murA, dem Gen IpxA, dem Gen rffE, dem Gen rfe, dem Gen glmS, dem Gen alsE und/oder dem Gen zwf gewählt sind, weniger funktional oder nicht-funktional gemacht werden.
    19. 19. Metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 17, wobei Gene, die von dem Gen pgi1, dem Gen PFK1, dem Gen PFK2, dem Gen PFK26, dem Gen PFK26 und/oder dem Gen PFK27 gewählt sind, weniger funktional oder nicht-funktional gemacht werden, und wobei optional Gene, die von dem Gen GND1, dem Gen GND2, dem Gen PMI40, dem Gen ZWF1, dem Gen GFA1, dem Gen GLG1, dem Gen GLG2, dem Gen INM1, dem Gen INM2, dem Gen GLK1, dem Gen HXK1, dem Gen HXK2, dem Gen GAL10, dem Gen GAL7, dem Gen YHL012W, dem Gen UGP1, dem Gen GSY1, dem Gen GSY2, dem Gen DIE2, dem Gen ALG8, dem Gen ATG26, dem Gen SUC2, dem Gen MAL32, dem Gen MAL12, dem Gen YJL216C, dem Gen YGR287C, FEN1, FKS1, GSC2 und/oder TPS1 gewählt sind, weniger funktional oder nicht-funktional gemacht werden.
    20. 20. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 18 oder 19, wobei die Saccharose-Phosphorylase aus einem Milchsäurebakterium stammt, und wobei das Milchsäurebakterium Bifidobacterium adolescentis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus acidophilus oder Streptococcus mutans ist.
    21. 21. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 5 - 20, wobei das Gen, welches das aktivierte Saccharid in ein Spezialprodukt umwandelt, eine Epimerase, eine Transferase, eine Reduktase, eine (Pyro)phosphorylase, eine (De)carboxylase, eine Dehydratase, eine Permease, eine Synthase, eine Dehydrogenase, eine Oxidase oder eine Isomerase codiert.
    22. 22. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 21, wobei die Epimerase UDP-Galactose-4-epimerase oder UDP-N-Acetylglucosamin-Epimerase ist, und/oder wobei dieTransferase eine Glycosyltransferase, eine Fucosyltransferase, eine Sialyltransferase oder eine Sulfotransferase ist.
    23. 23. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 22, wobei das Spezialprodukt ein Monosaccharid, ein Disaccharid, ein Trisaccharid, ein Tetrasaccharid, ein Pentasaccharid, ein Polysaccharid, ein Nukleosid, ein O-Glycosid, ein S-Glycosid, ein N-Glycosid, ein C-Glycosid, ein Glycoprotein, ein Glycolipid oder ein aktiviertes Kohlenhydrat ist.
    24. 24. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 7 - 9, wobei das Spezialprodukt ein fucosylierter Zucker ist, wobei das Bakterium oder die Hefe genetisch modifiziert ist durch die Einführung oder Überexpression von wenigstens einem Gen, das eine Saccharose-Phosphorylase codiert, so dass der Organismus in der Lage ist, Saccharose in Glucose-1-phosphat und Fructose innerhalb des Bakteriums oder der Hefe aufzuspalten, wobei das Bakterium oder die Hefe ein Fructokinase umfasst, um Fructose zu Fructose-6-phosphat umzuwandeln; wobei das Bakterium oder die Hefe genetisch weiter modifiziert ist, so dass wenigstens ein Gen, das ein Enzym codiert, welches das Fructose-6-phosphat in Biomasse umwandelt, weniger funktional oder nicht-funktional gemacht wird, und wobei das Fructose-6-phosphat zu dem fucosylierten Zucker umgewandelt wird.
    25. 25. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 24, wobei der fucosylierte Zucker Fucosyllactose, bevorzugterweise α-1,2-Fucosyllactose, ist.
    26. 26. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 24 oder 25, wobei das Bakterium oder die Hefe genetisch weiter modifiziert ist durch die Einführung von wenigstens einem Gen, das ein Enzym codiert, welches das Fructose-6-phosphat in einen fucosylierten Zucker umwandelt, oder wobei wenigstens ein endogenes Gen des Bakteriums oder der Hefe, das ein Enzym codiert, welches das Fructose-6-phosphat in einen fucosylierten Zucker umwandelt, überexprimiert wird.
    27. 27. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 24 bis 26, wobei das wenigstens eine Gen, das ein Enzym codiert, welches die Fructose in Biomasse umwandelt, ein Gen, das eine Phosphofructokinase codiert, und/oder ein Gen, das eine Phosphoglucose-Isomerase codiert, umfasst.
    28. 28. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 27, wobei das wenigstens eine Gen, das ein Enzym codiert, welches die Fructose in Biomasse umwandelt, pfkA, pfkB und/oder pgi umfasst.
    29. 29. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 26 bis 28, wobei das wenigstens eine Gen, das ein Enzym codiert, welches das Fructose-6-phosphat in einen fucosylierten Zucker umwandelt, ein Gen, das eine Fructokinase (frk) codiert, ein Gen, das eine Mannose-6-phosphat-Isomerase (manA) codiert, ein Gen, das eine Phosphomannomutase (cpsG) codiert, ein Gen, das eine Mannose-1-phosphat-Guanylyltransferase (cpsB) codiert, ein Gen, das eine GDP-Mannose-Dehydrase (gmd) codiert, ein Gen, das eine GDP-Fucose-Synthase (fcl) codiert, und/oder ein Gen, das eine Fucosyltransferase codiert, umfasst.
    30. 30. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 24 bis 29, wobei die Saccharose-Phosphorylase aus einem Milchsäurebakterium stammt, das aus der Gruppe gewählt ist, umfassend Bifidobacterium adolescentis, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus acidophilus oder Streptococcus mutans, bevorzugterweise Bifidobacterium adolescentis.
    31. 31. Verfahren für die Herstellung von einem Spezialprodukt, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Saccharid, einem aktivierten Saccharid, einem Nukleosid, einem Glycosid, einem Glycolipid und einem Glycoprotein, umfassend die Schritte:
      1. a) des Kultivierens eines metabolisch veränderten Bakteriums oder einer metabolisch veränderten Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 30 und
      2. b) des Extrahierens und Reinigens des Spezialprodukts.
    32. 32. Verfahren für die Herstellung von fucosylierten Zuckern, umfassend die Schritte
      1. a) des Kultivierens eines metabolisch veränderten Bakteriums oder einer metabolisch veränderten Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 24 bis 30 und
      2. b) des Extrahierens und Reinigens der fucosylierten Zucker.
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Claims (30)

  1. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe für die Herstellung eines Kohlenhydrat-Spezialproduktes, dadurch gekennzeichnet, dass das Bakterium oder die Hefe: a) gentechnisch modifiziert worden ist durch die Einführung eines heterologen Gens, das eine Saccharose-Phosphorylase codiert, die in der Lage ist, Saccharose in Glucose-1-phosphat und Fructose aufzuspalten, oder eines heterologen Gens, das eine Kohlenhydrat-Hydrolase codiert, die in der Lage ist, Saccharose in Glucose und Fructose aufzuspalten; b) eine Fructokinase umfasst, um die Umwandlung von Fructose zu Fructose-6-phosphat zu katalysieren; und c) gentechnisch weiter modifiziert worden ist, um den Verlust von Fructose-6-phosphat über die Glykolyse zu verhindern, und zwar aufgrund der Zerstörung eines endogenen Gens, das eine Phosphofructokinase, eine Phosphoglucose-Isomerase oder eine Kombination davon codiert.
  2. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 1, wobei ein endogenes Gen, das eine Phosphofructokinase codiert, zerstört worden ist.
  3. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 1, wobei ein endogenes Gen, das eine Phosphoglucose-Isomerase codiert, zerstört worden ist.
  4. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, wobei ein endogenes Gen, das eine Phosphofructokinase codiert, und ein endogenes Gen, das eine Phosphoglucose-Isomerase codiert, zerstört worden sind.
  5. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Phosphofructokinase die Umwandlung von Fructose-6-phosphat zu Fructose-1,6-bisphosphat katalysiert, und die Phosphoglucose-Isomerase die Umwandlung von Fructose-6-phosphat zu Glucose-6-phosphat katalysiert.
  6. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Bakterium oder die Hefe gentechnisch weiter modifiziert worden ist, um den Verlust von Fructose-6-phosphat über die Umwandlung zu Fructose zu verhindern, und zwar durch die genetische Zerstörung eines endogenen Gens, das eine Phosphatase codiert.
  7. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, wobei ein heterologes Gen, das eine Saccharose-Phosphorylase codiert, die in der Lage ist, Saccharose in Glucose-1-phosphat und Fructose aufzuspalten, eingeführt worden ist.
  8. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 6, wobei das Bakterium oder die Hefe eine Phosphoglucomutase umfasst, um die Umwandlung von Glucose-1-phosphat zu Glucose-6-phosphat zu katalysieren.
  9. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei die Saccharose-Phosphorylase aus Bifidobacterium adolescentis ist.
  10. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, wobei ein heterologes Gen, das eine Kohlenhydrat-Hydrolase codiert, die in der Lage ist, Saccharose in Glucose und Fructose aufzuspalten, eingeführt worden ist.
  11. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 10, wobei das Bakterium oder die Hefe eine Hexokinase umfasst, um die Umwandlung von Glucose zu Glucose-6-phosphat zu katalysieren.
  12. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 11, wobei die Hexokinase eine Glucokinase ist.
  13. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei das Bakterium oder die Hefe gentechnisch weiter modifiziert worden ist, um die Umwandlung von Glucose-6-phosphat zu Biomasse zu fördern, und zwar durch die genetische Zerstörung eines endogenen Gens einer Phosphoglucomutase, eines endogenen Gens, das eine Glucose-1-phosphat-Adenylyltransferase codiert, oder einer Kombination davon.
  14. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Kohlenhydrat-Hydrolase eine Invertase ist.
  15. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Kohlenhydratspezialprodukt ein aktiviertes Saccharid oder ein Trisaccharid ist.
  16. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 15, wobei das aktivierte Saccharid aus Fructose-6-phosphat und GDP-Fucose gewählt ist.
  17. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 15, wobei das Trisaccharid eine Fucosyllactose ist.
  18. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Kohlenhydratspezialprodukt Fructose-6-phosphat ist.
  19. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Bakterium oder die Hefe Enzyme umfasst, welche das Fructose-6-phosphat zu dem Kohlenhydratspezialprodukt umwandelt.
  20. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 19, wobei das Bakterium oder die Hefe gentechnisch weiter modifiziert worden ist durch die Einführung von einem oder mehreren heterologen Genen, das bzw. die ein oder mehrere Enzyme codiert bzw. codieren, welches bzw. welche das Fructose-6-phosphat zu dem Kohlenhydratspezialprodukt umwandelt bzw. umwandeln.
  21. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 16, 19 oder 20, wobei das Kohlenhydratspezialprodukt GDP-Fucose ist und wobei das Bakterium oder die Hefe Folgendes umfasst: (i) eine Mannose-6-phosphat-Isomerase, um die Umwandlung von Fructose-6-phosphat zu Mannose-6-phosphat zu katalysieren, (ii) eine Phosphomannomutase, um die Umwandlung von Mannose-6-phosphat zu Mannose-1-phosphat zu katalysieren; (iii) eine Mannose-1-phosphat-Guanylyltransferase, um die Umwandlung von Mannose-1-phosphat zu GDP-Mannose zu katalysieren; (iv) eine GDP-Mannose-Dehydratase, um die Umwandlung von GDP-Mannose zu GDP-4-Dehydro-6-desoxy-mannose zu katalysieren; und (v) eine GDP-Fucose-Synthase, um die Umwandlung von GDP-4-Dehydro-6-desoxy-mannose zu GDP-Fucose zu katalysieren.
  22. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 21, wobei das Bakterium oder die Hefe gentechnisch weiter modifiziert worden ist durch die Einführung von einem oder mehreren heterologen Genen, das bzw. die aus der Gruppe gewählt ist bzw. sind, bestehend aus: einem heterologen Gen, das eine Mannose-6-phosphat-Isomerase codiert, einem heterologen Gen, das eine Phosphomannomutase codiert, einem heterologen Gen, das eine Mannose-1-phosphat-Guanylyltransferase codiert, einem heterologen Gen, das eine GDP-Mannose codiert, und einem heterologen Gen, das eine GDP-Fucose-Synthase codiert.
  23. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 15, 17, 19 oder 20, wobei das Kohlenhydratspezialprodukt eine Fucosyllactose ist, und wobei das Bakterium oder die Hefe Folgendes umfasst: (i) eine Mannose-6-phosphat-Isomerase, um die Umwandlung von Fructose-6-phosphat zu Mannose-6-phosphat zu katalysieren; (ii) eine Phosphomannomutase, um die Umwandlung von Mannose-6-phosphat zu Mannose-1-phosphat zu katalysieren; (iii) eine Mannose-1-phosphat-Guanylyltransferase, um die Umwandlung von Mannose-1-phosphat zu GDP-Mannose zu katalysieren; (iv) eine GDP-Mannose-Dehydratase, um die Umwandlung von GDP-Mannose zu GDP-4-Dehydro-6-desoxy-mannose zu katalysieren; und (v) eine GDP-Fucose-Synthase, um die Umwandlung von GDP-4-Dehydro-6-desoxy-mannose zu GDP-Fucose zu katalysieren; und (vi) eine Fucosyltransferase um die Umwandlung von GDP-Fucose zu einer Fucosyllactose zu katalysieren.
  24. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 23, wobei das Bakterium oder die Hefe gentechnisch weiter modifiziert worden ist durch die Einführung von einem oder mehreren heterologen Genen, das bzw. die aus der Gruppe gewählt ist bzw. sind, bestehend aus: einem heterologen Gen, das eine Mannose-6-phosphat-Isomerase codiert, einem heterologen Gen, das eine Phosphomannomutase codiert, einem heterologen Gen, das eine Mannose-1-phosphat-Guanylyltransferase codiert, einem heterologen Gen, das eine GDP-Mannose codiert, einem heterologen Gen, das eine GDP-Fucose-Synthase codiert, und einem heterologen Gen, das eine Fucosyltransferase codiert.
  25. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 17, 23 oder 24, wobei die Fucosyllactose aus der Gruppe gewählt ist, die aus 1,2-Fucosyllactose, 1,3-Fucosyllactose, 1,4-Fucosyllactose, 1,6-Fucosyllactose, und einer beliebigen Kombination davon besteht.
  26. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 17, 23, 24 oder 25, wobei die Fucosyllactose 1,2-Fucosyllactose ist.
  27. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 26, wobei das bzw. die metabolisch veränderte Bakterium oder Hefe ein metabolisch verändertes Bakterium ist.
  28. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 27, wobei das Bakterium Escherichia coli ist.
  29. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 26, wobei das bzw. die metabolisch veränderte Bakterium oder Hefe eine metabolisch veränderte Hefe ist.
  30. Metabolisch verändertes Bakterium oder metabolisch veränderte Hefe gemäß Anspruch 24, wobei die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist.
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