KR20020037052A

KR20020037052A - 신규 트랜스알도라아제 유전자

Info

Publication number: KR20020037052A
Application number: KR1020027003639A
Authority: KR
Inventors: 이께다마사또; 다까노유따까; 가마다노조무; 나까노데쯔오
Original assignee: 히라타 다다시; 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤
Priority date: 1999-09-21
Filing date: 2000-09-21
Publication date: 2002-05-17
Also published as: KR100768016B1; WO2001021774A1; EP1225218A4; US20050266517A1; EP1225218A1; AU7318700A; US7005284B1

Abstract

본 발명의 목적은 신규 트랜스알도라아제 유전자 및, 이 유전자에 코드되는 폴리펩티드, 이 유전자를 조합하여 얻어지는 재조합체 DNA, 이 재조합체 DNA 를 보유하는 미생물 및, 이 미생물을 이용한 방향족 아미노산, 방향족 비타민, L-히스티딘, 리보플라빈, 핵산, 핵산 관련 물질, 신규 당 등의 제조법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의검토하였다. 그 결과, 코리네박테리움속에 속하며, 쉬키미산 요구성 변이주로서 취득되는 트랜스 케토라아제 결손 변이주의 쉬키미산 요구성을 상보하는 DNA 단편으로서, 코리네박테리움속에 속하는 미생물의 염색체 DNA 로부터 신규 트랜스알도라아제 유전자를 단리하였다. 또한, 이 유전자를 포함하는 재조합체 DNA 를 구축하고, 이 재조합체 DNA 를 숙주 미생물에 도입함으로써 상기 목적을 달성할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

Description

신규 트랜스알도라아제 유전자 {NOVEL TRANSALDOLASE GENE}

트랜스알도라아제는 펜토오스 인산 경로의 효소이며, 방향족 아미노산이나 방향족 비타민 등의 방향족 화합물, 푸린누클레오티드나 피리미딘누클레오티드 등의 핵산 관련 물질, L-히스티딘, 리보플라빈 등의 생합성이나 대사에 중요한 역할을 하고 있다 [Arch. Microbiol.,164, 324 (1995)]. 따라서, 그들 대사산물의 효율적인 발효생산균을 육종하기 위한 표적으로서, 트랜스알도라아제 유전자 및 그 유전자 산물은 유용하다.

트랜스알도라아제를 코드하는 DNA 에 대해서는, 에쉐리키아ㆍ콜리 유래의 유전자 [GeneBank Accession Number D13159], 마이코박테리움ㆍ튜버큘로시스 유래의 유전자 [Nature,393, 537 (1998)], 시네코코커스 유래의 유전자 [Plant Mol. Biol.,30, 213 (1996)] 등이 단리되어 그 염기서열이 결정되어 있다.

또, 에쉐리키아ㆍ콜리에서는 트랜스알도라아제 활성을 증가시키면 방향족 화합물 등의 생산성이 향상되는 것이 보고되어 있다 (WO98/18936).

그러나, 아미노산 발효 등에서 널리 사용되고 있는 산업상 중요한 코리네박테리움속에 속하는 미생물에 대해서는, 이제까지 트랜스알도라아제 유전자나 이 유전자에 코드되는 효소에 관한 보고는 없고, 따라서 그 염기서열에 대해서도 전혀 알려져 있지 않았다.

트랜스알도라아제를 사용한 당의 합성에 대해서는, 전분을 처리한 것으로부터 D-프룩토오스를 생성하기 위해 사용된 예 [J. Am. Chem. Soc.,114, 6980 (1992)] 가 보고되어 있다.

발명의 개시

본 발명의 과제는 신규로 발견된 트랜스알도라아제 유전자 및, 이 유전자에 코드되는 폴리펩티드, 이 유전자를 조합하여 얻어지는 재조합체 DNA, 이 재조합체 DNA 를 보유하는 형질전환체 및, 이 형질전환체를 이용한, 상기 폴리펩티드, 방향족 아미노산, 방향족 비타민, L-히스티딘, 리보플라빈, 핵산 및 핵산 관련 물질, 신규 당 등의 제조법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해, 재조합 DNA 수법을 구사하여 코리네박테리움속에 속하는 미생물의 염색체 유래의 유전자에 관하여 예의검토하였다. 그 결과, 펜토오스 인산 경로상에서 트랜스알도라아제와는 다른 효소인 트랜스 케토라아제를 코드하는 유전자의 3' 측 하류에 트랜스알도라아제 유전자가 인접하여 존재하는 것을 처음으로 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.즉, 본 발명은 하기 (1) ∼ (16) 에 관한 것이다.

(1) 서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.

(2) 서열번호 1 에 기재된 폴리펩티드에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 트랜스알도라아제 활성을 갖는 폴리펩티드.

(3) 서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열과 60 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 트랜스알도라아제 활성을 갖는 단백질.

(4) 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나의 폴리펩티드를 코드하는 DNA.

(5) 서열번호 2 에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA.

(6) 상기 (4) 또는 (5) 의 DNA 와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 트랜스알도라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA.

(7) 상기 (4) ∼ (6) 중 어느 하나의 DNA 를 벡터에 조합하여 얻어지는 재조합체 DNA.

(8) 상기 (7) 의 재조합체 DNA 를 보유하는 형질전환체.

(9) 상기 (8) 의 형질전환체가 보유하는 상기 (4) ∼ (6) 중 어느 하나의 DNA, 또는 이 DNA 의 상류에 존재하는 전사ㆍ번역에 관계되는 DNA 의 염기서열 중에 1 이상의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되고, 또한 이 치환, 결실 또는 삽입 전과 비교하여 트랜스알도라아제의 활성이 증강된 형질전환체.

(10) 형질전환체가 방향족 아미노산 또는 방향족 비타민을 생산하는 능력을 갖는 형질전환체인 상기 (8) 또는 (9) 의 형질전환체.

(11) 상기 (10) 의 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 방향족 아미노산 또는 방향족 비타민을 생성축적시키고, 이 배양물로부터 이 물질을 채취하는 것을 특징으로 하는 이 물질의 제조법.

(12) 상기 (8) 의 형질전환체가 보유하는 상기 (4) ∼ (6) 중 어느 하나의 DNA, 또는 이 DNA 의 상류에 존재하는 전사ㆍ번역에 관계되는 DNA 의 염기서열 중에 1 이상의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되고, 또한 이 치환, 결실 또는 삽입전에 비교하여 트랜스알도라아제의 활성이 저하 또는 결손된 형질전환체.

(13) 형질전환체가 L-히스티딘, 리보플라빈, 핵산 및 핵산 관련 물질에서 선택되는 물질을 생산하는 능력을 갖는 형질전환체인 상기 (8) 또는 (12) 의 형질전환체.

(14) 상기 (13) 의 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 L-히스티딘, 리보플라빈, 핵산 및 핵산 관련 물질에서 선택되는 물질을 생성축적시키고, 이 배양물로부터 이 물질을 채취하는 것을 특징으로 하는 이 물질의 제조법.

(15) 상기 (8) 의 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나의 폴리펩티드를 생성축적시키고, 이 배양물로부터 이 폴리펩티드를 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 제조법.

(16) 상기 (8) 또는 (9) 의 형질전환체, 이 형질전환체의 배양물 또는 이 배양물의 처리물을 효소원으로서 사용하고, 케토스 및 알도스를 수성 매질 중에 존재시키고, 이 수성 매질 중에 상기 알도스에 상기 케토스의 디히드록시아세톤 부분이전이된 당을 생성축적시키고, 상기 수성 매질로부터 이 당을 채취하는 것을 특징으로 하는 이 당의 제조법.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

(1) 본 발명의 폴리펩티드

본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 또, 서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열에서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 트랜스알도라아제 활성을 갖는 폴리펩티드도 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다.

상기 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 트랜스알도라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (이하, 모레큘러ㆍ클로닝 제 2 판이라고 약기), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (이하, 커런트ㆍ프로토콜즈ㆍ인ㆍ모레큘러ㆍ바이올로지라고 약기), Nucleic Acids Research,10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,79, 6409 (1982), Gene,34, 315 (1985), Nucleic Acids Research,13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 488 (1985) 등에 기재된 부위 특이적 변이도입법을 사용하여, 예컨대 서열번호 1 로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 에 부위 특이적 변이를 도입함으로써 취득할 수 있다.

결실, 치환 또는 부가되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않지만, 1 개에서 수십개, 특히 1 개에서 몇 개의 아미노산인 것이 바람직하다. 또, 본 발명의 폴리펩티드가 트랜스알도라아제 활성을 갖기 위해서는 서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 60 % 이상, 통상은 80 % 이상, 특히 95 % 이상의 상동성을 갖고 있는 것이 바람직하다.

단, 본 발명의 폴리펩티드에는 공지된 트랜스알도라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 포함되지 않는다.

(2) 본 발명의 DNA

본 발명의 DNA 는 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA 이다. 본 발명의 DNA 로서는, 예컨대 서열번호 2 에 기재된 DNA 를 들 수 있다.

또, 서열번호 2 에 기재된 DNA 와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA 도 본 발명의 DNA 에 포함된다. 이 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA 란, 서열표의 서열번호 2 에 나타나는 염기서열을 포함하는 DNA 또는 이 DNA 의 내부 단편을 프로브로 하여 콜로니ㆍ하이브리다이제이션법, 플라크ㆍ하이브리다이제이션법 또는 서던 하이브리다이제이션법 등을 사용함으로써 얻어지는 DNA 를 의미하며, 구체적으로는 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA 또는 이 DNA 의 단편을 고정화한 필터를 사용하여 0.7 ∼ 1.0 mol/ℓ의 NaCl 존재하, 65 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 행한 후, 0.1 ∼ 2 배 정도의 SSC 용액 (1 배 농도의 SSC 용액의 조성은 150 mmol/ℓ염화나트륨, 15 mmol/ℓ시트르산나트륨으로 이루어짐) 을 사용하고, 65 ℃ 조건하에서 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA 를 들 수 있다.

하이브리다이제이션은 모레큘러ㆍ클로닝 제 2 판 등의 실험서에 기재되어 있는 방법에 준하여 행할 수 있다. 하이브리다이즈 가능한 DNA 로서 구체적으로는, 서열번호 2 에 나타나는 염기서열과 적어도 80 % 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 95 % 이상의 상동성을 갖는 DNA 를 들 수 있다.

단, 본 발명의 DNA 에는 공지된, 트랜스알도라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 는 포함되지 않는다.

본 발명의 DNA 는 코리네박테리움속에 속하는 미생물의 염색체 DNA 로부터, 후술하는 방법에 의해 단리할 수 있다. 유전자의 공여체가 되는 코리네박테리움속에 속하는 미생물로서는 코리네박테리움속 또는 브레비박테리움속에 속하는 균주이면 어느것이나 사용할 수 있다. 그와 같은 미생물의 구체예로서는, 예컨대 하기의 균주를 들 수 있다.

코리네박테리움ㆍ글루타미쿰ATCC31833

코리네박테리움ㆍ글루타미쿰ATCC13032

코리네박테리움ㆍ아세토아시도필룸ATCC13870

코리네박테리움ㆍ칼루나애ATCC15991

코리네박테리움ㆍ헤르큘리스ATCC13868

코리네박테리움ㆍ멜라세콜라ATCC17965

코리네박테리움ㆍ리륨ATCC15990

코리네박테리움ㆍ암모니아게네스ATCC6872

브레비박테리움ㆍ이마리오필룸ATCC14068

브레비박테리움ㆍ사카롤리티쿰ATCC14066

브레비박테리움ㆍ티오게니탈리스ATCC19240

브레비박테리움ㆍ디바리쿠튬ATCC14020

브레비박테리움ㆍ플라붐ATCC14067

브레비박테리움ㆍ락토페르멘툼ATCC13869

코리네박테리움속에 속하는 미생물로부터의 염색체 DNA 의 추출은 배양균체로부터, 통상의 방법 [예컨대, 일본 공개특허공보 소58-126789 호에 기재된 방법] 에 따라 용이하게 행할 수 있다. 염색체 DNA 로부터의 본 발명의 DNA 의 단리는 쉬키미산 요구성 변이주로서 취득되는 트랜스 케토라아제 결손 변이주 [Appl. Microbiol. Biotechnol.,50, 375 (1998)] 의 상보로 선택함으로써 실시할 수 있다.

즉, 염색체 DNA 를 적당한 제한효소로 절단하고, 벡터 플라스미드에 연결한 후, 이 플라스미드를 사용하여 트랜스 케토라아제 유전자 결손주 [예컨대, 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 TKT6 주 (FERM BP-6399)] 를 형질전환하고, 쉬키미산 요구성이 회복된 형질전환주를 선택한다. 이 형질전환주가 갖는 플라스미드를 단리함으로써 트랜스 케토라아제 유전자와 함께 본 발명의 DNA 를 취득할 수 있다.

이와 같이 하여 서열번호 2 로 나타나는 본 발명의 DNA 가 일단 취득되고, 그 염기서열이 결정된 후에는 이 염기서열의 5' 단 및 3' 단의 염기서열에 기초한 프라이머를 조제하고, 코리네박테리움속에 속하는 미생물로부터 조제한 염색체 DNA 를 주형으로 하여 PCR 법 [PCR Protocols, Academic Press (1990)] 을 사용하여 DNA 의 증폭을 행함으로써 다른 코리네박테리움속에 속하는 미생물로부터 본 발명의 DNA 를 용이하게 취득할 수 있다.

또, 서열번호 2 로 나타나는 DNA 의 전체길이 또는 일부를 프로브로 하여 코리네박테리움속에 속하는 미생물로부터 조제한 염색체 DNA 에 대하여 콜로니 하이브리다이제이션이나 플라크 하이브리다이제이션 (모레큘러ㆍ클로닝 제 2 판) 을 행함으로써, 다른 코리네박테리움속에 속하는 미생물로부터 본 발명의 DNA 를 취득할 수 있다.

또한, 서열번호 2 로 나타나는 염기서열에 기초하여, 포스포아미다이드법을 이용한 파킨ㆍ엘마사의 DNA 합성장치로 화학합성함으로써도 본 발명의 DNA 를 취득할 수 있다.

(3) 본 발명의 폴리펩티드의 제조

본 발명의 폴리펩티드는 모레큘러ㆍ클로닝 제 2 판이나 커런트ㆍ프로토콜즈ㆍ인ㆍ모레큘러ㆍ바이올로지 등에 기재된 방법 등을 사용하고, 예컨대 이하의 방법에 의해 본 발명의 DNA 를 숙주세포내에서 발현시켜 제조할 수 있다.

상기 폴리펩티드를 코드하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다. 또, 필요에 따라 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 부분의 염기서열을, 숙주세포의 발현에 최적의 코돈이 되도록 염기를 치환한 DNA 를 조제한다. 이 DNA 는 본 발명의 폴리펩티드의 효율적 제조에 유용하다.

상기 DNA 단편을 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 재조합 벡터를 제조한다.

이 재조합 벡터를 상기 발현 벡터에 적합한 숙주세포에 도입한다.

숙주세포로서는 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등, 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 어느것이나 사용할 수 있다.

발현 벡터로서는 상기 숙주세포에서 자립복제 가능 내지는 염색체중으로의 조합이 가능하며, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다.

세균 등의 원핵생물을 숙주세포로서 사용하는 경우에는, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 함유하여 이루어지는 재조합 벡터는 원핵생물내에서 자립복제 가능함과 동시에, 프로모터, 리포솜 결합서열, 본 발명의 DNA, 전사종결서열로 구성된 벡터인 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 포함되어 있어도 된다.

발현 벡터로서는, 예컨대 pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (모두 베링거 만하임사에서 시판), pKK233-2 (Pharmacia 사 제조), pSE280 (Invitrogen 사 제조), pGEMEX-1 (Promega 사 제조), pQE-8 (QIAGEN 사 제조), pKYP10 (일본 공개특허공보 소58-110600 호), pKYP200 [Agric. Biol. Chem.,48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem.,53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82, 4306 (1985)], pBluescript Ⅱ SK(-) (Stratagene 사 제조), pTrs30 [Escherichia coliJM109/pTrS30 (FERM BP-5407) 에서 조제], pTrs32 [Escherichia coliJM109/pTrS32 (FERM BP-5408) 에서 조제], pGHA2 [Escherichia coliIGHA2 (FERM B-400) 에서 조제, 일본 공개특허공보 소60-221091 호], pGKA2 [Escherichia coliIGKA2 (FERM BP-6798) 에서 조제, 일본 공개특허공보 소60-221091 호], pTerm2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400 [J. Bacteriol.,172, 2392 (1990)], pGEX (Pharmacia 사 제조), pET 시스템 (Novagen 사 제조) 등을 들 수 있다.

프로모터로서는 숙주세포내에서 기능하는 것이면 어떠한 것이어도 된다. 예컨대, trp 프로모터 (P_trp), lac 프로모터, P_L프로모터, P_R프로모터, T7 프로모터 등의, 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또, P_trp를 2 개 직렬시킨 프로모터 (P_trp×2), tac 프로모터, lacT7 프로모터, let I 프로모터와 같이 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.

리포솜 결합서열인 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 서열과 개시 코돈 사이를 적당한 거리 (예컨대 6 ∼ 18 염기) 로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 재조합 벡터에서는, 본 발명의 DNA 의 발현에는 전사종결서열은 반드시 필요하지는 않지만, 구조유전자의 바로 아래에 전사종결서열을 배치하는 것이 바람직하다.

숙주세포로서는 에쉐리키아속, 세라티아속, 바실러스속, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속, 마이크로박테리움속, 슈도모나스속 등에 속하는 미생물, 예컨대 에쉐리키아ㆍ콜리 XL1-Blue, 에쉐리키아ㆍ콜리 XL2-Blue, 에쉐리키아ㆍ콜리 DH1, 에쉐리키아ㆍ콜리 MC1000, 에쉐리키아ㆍ콜리 KY3276, 에쉐리키아ㆍ콜리 W1485, 에쉐리키아ㆍ콜리 JM109, 에쉐리키아ㆍ콜리 HB101, 에쉐리키아ㆍ콜리 No.49, 에쉐리키아ㆍ콜리 W3110, 에쉐리키아ㆍ콜리 NY49, 에쉐리키아ㆍ콜리 GI698, 에쉐리키아ㆍ콜리 TB1, 세라티아 피카리아 (Serratia ficaria), 세라티아 폰티콜라 (Serratia fonticola), 세라티아 리쿠에파시엔스 (Serratia liquefacines), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 브레비박테리움 암모니아제네스 (Brevibacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 임마리오필룸 (Brevibacterium immariophilum) ATCC14068, 브레비박테리움 사카롤리티쿰 (Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066, 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13869, 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 미크로박테리움 암모니아필룸 (Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354, 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 슈도모나스 종 D-0110 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입방법으로서는 상기 숙주세포로 DNA 를 도입하는 방법이면 어떤 방법도 사용할 수 있고, 예컨대 칼슘이온을 사용하는 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69, 2110 (1972)], 프로토플라스트법 (일본 공개특허공보 소63-2483942 호), 또는 Gene,17, 107 (1982) 이나 Molecular & General Genetics,168, 111 (1979) 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

효모를 숙주세포로서 사용하는 경우에는 재조합 벡터로서, 예컨대YEP13(ATCC37115), YEp24(ATCC37051), YCp50(ATCC37419), pHS19, pHS15 등을 들 수 있다.

프로모터로서는 효모균주내에서 발현할 수 있는 것이면 어느것이나 사용해도 되고, 예컨대 헥소-스키나아제 등의 해당계(解糖系) 유전자의 프로모터, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 히트쇼크 폴리펩티드 프로모터, MFα1 프로모터, CUP 1 프로모터 등을 들 수 있다.

숙주세포로서는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속, 시조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 속, 클리베로마이세스 (Kluyveromyces) 속, 트리코스포론 (Trichosporon) 속, 시와니오마이세스 (Schwanniomyces) 속, 피키아 (Pichia) 속, 칸디다 (Candida) 속 등에 속하는 미생물, 예컨대 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀루란스 (Trichosporon pullulans), 쉬반니오마이세스 알루비우스 (Schwanniomyces alluvius), 칸디다 우틸리스 (Candida utilis) 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입방법으로서는 효모에 DNA 를 도입하는 방법이면 어떤 방법도 사용할 수 있고, 예컨대 일렉트로포레이션법 [Methods Enzymol.,194, 182 (1990)], 스페로플라스트법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75, 1929 (1978)], 아세트산 리튬법 [J. Bacteriology,153, 163 (1983)], Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75, 1929 (1978) 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

동물세포를 숙주로서 사용하는 경우에는 발현 벡터로서, 예컨대 pcDNAI, pcDM8 (프나코시사 제조), pAGE107 [일본 공개특허공보 평3-22979 호, Cytotechnology,3, 133 (1990)], pAS3-3 (일본 공개특허공보 평2-227075 호), pCDM8 [Nature,329, 840 (1987)], pcDNAI/Amp (Invitrogen 사 제조), pREP4 (Invitrogen 사 제조), pAGE103 [J. Biochem.,101, 1307 (1987)], pAGE210 등을 들 수 있다.

프로모터로서는 동물세포내에서 기능하는 것이면 어느것이나 사용할 수 있고, 예컨대 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 의 IE (immediate early) 유전자의 프로모터, SV40 의 초기 프로모터, 레트로 바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트쇼크 프로모터, SRα프로모터 등을 들 수 있다. 또, 인체 CMV 의 IE 유전자의 엔핸서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.

숙주세포로서는 인체의 세포인 나마르바 (Namalwa) 세포, 원숭이의 세포인 COS 세포, 차이니즈ㆍ햄스터의 세포인 CHO 세포, HBT5637 (일본 공개특허공보 소63-299 호) 등을 들 수 있다.

동물세포로의 재조합 벡터의 도입방법으로서는 동물세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 어떤 방법도 사용할 수 있고, 예컨대 일렉트로포레이션법 [Cytotechnology,3, 133 (1990)], 인산 칼슘법 (일본 공개특허공보 평2-227075 호), 리포펙션법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 7413 (1987)], Virology, 52, 456 (1973) 등을 들 수 있다.

곤충세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 예컨대 커런트ㆍ프로토콜즈ㆍ인ㆍ모레큘러ㆍ바이올로지, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992), Bio/Technology,6, 47 (1988) 등에 기재된 방법에 의해 폴리펩티드를 발현할 수 있다.

즉, 재조합 유전자 도입 벡터 및 바큘로 바이러스를 곤충세포에 함께 도입하여 곤충세포 배양 상등액중에 재조합 바이러스를 얻은 후, 추가로 재조합 바이러스를 곤충세포에 감염시키고, 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.

상기 방법에서 사용되는 유전자 도입 벡터로서는, 예컨대 pVL1392, pVL1393, pBlueBacⅢ (모두 Invitorogen 사 제조) 등을 들 수 있다.

바큘로 바이러스로서는, 예컨대 밤나방과 곤충에 감염되는 바이러스인 오토그래퍼ㆍ칼리포르니카ㆍ뉴클리어ㆍ폴리헤드로시스ㆍ바이러스 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 들 수 있다.

곤충세포로서는Spodoptera frugiperda의 난소세포인 Sf9, Sf21 [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)],Trichoplusia ni의 난소세포인 High5 (Invitrogen 사 제조) 등을 사용할 수 있다.

재조합 바이러스를 조제하기 위한, 곤충세포로의 상기 재조합 유전자 도입 벡터와 상기 바큘로 바이러스를 함께 도입하는 방법으로서는, 예컨대 인산 칼슘법 (일본 공개특허공보 평2-227075 호), 리포펙션법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 7413 (1987)] 등을 들 수 있다.

식물세포를 숙주세포로서 사용하는 경우에는 발현 벡터로서, 예컨대 Ti 플라스미드, 담배 모자이크 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.

프로모터로서는 식물세포내에서 발현할 수 있는 것이면 어느것이나 사용해도 되고, 예컨대 칼리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 의 35S 프로모터, 이네악틴 1 프로모터 등을 들 수 있다.

숙주세포로서는 담배, 감자, 토마토, 당근, 대두, 평지, 알팔파, 벼, 밀, 보리 등의 식물세포 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입방법으로서는 식물세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 어떤 방법도 사용할 수 있고, 예컨대 아그로박테리움 (Agrobacterium) (일본 공개특허공보 소59-140885 호, 일본 공개특허공보 소60-70080 호, WO94/00977), 일렉트로포레이션법 (일본 공개특허공보 소60-251887 호), 파티클 건 (유전자총) 을 사용하는 방법 (특허 제 2606856 호, 특허 제 2517813 호) 등을 들 수 있다.

유전자의 발현방법으로서는 직접 발현 이외에, 모레큘러ㆍ클로닝 제 2 판에 기재되어 있는 방법 등에 준하여 분비 생산, 융합 단백질 발현 등을 행할 수 있다.

효모, 동물세포, 곤충세포 또는 식물세포에 의해 발현시킨 경우에는 당 또는 당쇄가 부가된 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

이상과 같이 하여 얻어지는 본 발명의 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물내에 본 발명의 폴리펩티드를 생성축적시키고, 이 배양물로부터 채취함으로써 본 발명의 폴리펩티드를 제조할 수 있다.

본 발명의 형질전환체를 배지에 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라 행할 수 있다.

본 발명의 형질전환체가 대장균 등의 원핵생물 또는 효모 등의 진핵생물을 숙주로 하여 얻어진 형질전환체인 경우, 이 형질전환체를 배양하는 배지로서, 이 형질전환체가 자화될 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하며, 이 형질전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면 천연배지, 합성배지의 어느것을 사용해도 된다.

탄소원으로서는 상기 형질전환체가 자화될 수 있는 것이면 되고, 글루코오스, 프락토오스, 슈크로오스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알콜류 등을 사용할 수 있다.

질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 그 외의 질소함유 화합물 및, 펩톤, 고기 엑기스, 효모 엑기스, 콘스치프 리커, 카세인 가수분해물, 콩깻묵 및 콩깻묵 가수분해물, 각종 발효균체 및 그의 소화물 등을 사용할 수 있다.

무기염으로서는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산 제1철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.

배양은 진탕배양 또는 심부(深部) 통기교반배양 등의 호기적 조건하에서 행한다. 배양온도는 15 ∼ 40 ℃ 가 좋고, 배양시간은 통상 16 시간 ∼ 7 일간이다. 배양중의 pH 는 3.0 ∼ 9.0 으로 유지하는 것이 바람직하다. pH 의 조정은 무기 또는 유기의 산, 알칼리 용액, 우레아, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 행한다.

또, 배양중 필요에 따라 앰피실린이나 테트라사이클린 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.

프로모터로서 유도성 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 필요에 따라 유도물질을 배지에 첨가해도 된다. 예컨대,lac프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을,trp프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.

동물세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지 [The Journal of the American Medical Association,199, 519 (1967)], Eagle 의 MEM 배지 [Science,122, 501 (1952)], 다르베코 개변 MEM 배지 [Virology,8, 396 (1959)], 199 배지 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73, 1 (1950)] 또는 이들 배지에 소 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.

배양은 통상 pH 6 ∼ 8, 30 ∼ 40 ℃, 5 % CO₂존재하 등의 조건하에서 1 ∼ 7 일간 행한다.

또, 배양중 필요에 따라 카나마이신, 페니실린 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.

곤충세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지 (PharMingen 사 제조), Sf-900 Ⅱ SFM 배지 (LifeTechnologies 사 제조), ExCell400, ExCell405 (모두 JRH Biosciences 사 제조), Grace's Insect Medium [Nature,195, 788 (1962)] 등을 사용할 수 있다.

배양은 통상 pH 6 ∼ 7, 25 ∼ 30 ℃ 등의 조건하에서 1 ∼ 5 일간 행한다.

또, 배양중 필요에 따라 겐타마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.

식물세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체는 세포로서, 또는 식물의 세포나 기관에 분화시켜 배양할 수 있다. 이 형질전환체를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 무라시게ㆍ앤드ㆍ스쿠그 (MS) 배지, 화이트 (White) 배지, 또는 이들 배지에 옥신, 사이토카이닌 등, 식물 호르몬을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.

배양은 통상 pH 5 ∼ 9, 20 ∼ 40 ℃ 의 조건하에서 3 ∼ 60 일간 행한다.

또, 배양중 필요에 따라 카나마이신, 하이그로마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.

상기와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 조합한 재조합체 벡터를 보유하는 미생물, 동물세포, 또는 식물세포 유래의 형질전환체를 통상의 배양방법에 따라 배양하고, 상기 폴리펩티드를 생성축적시키고, 이 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 채취함으로써 상기 폴리펩티드를 제조할 수 있다.

유전자의 발현방법으로서는 직접 발현 이외에, 모레큘러ㆍ클로닝 제 2 판에 기재되어 있는 방법 등에 준하여 분비 생산, 융합 폴리펩티드 발현 등을 행할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 생산방법으로서는 숙주세포내에 생산시키는 방법,숙주세포외에 분비시키는 방법, 또는 숙주세포 외막상에 생산시키는 방법이 있으며, 사용하는 숙주세포나, 생산시키는 폴리펩티드의 구조를 바꿈으로써 상기 방법을 선택할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드가 숙주세포내 또는 숙주세포 외막상에 생산되는 경우, 폴슨 등의 방법 [J. Biol. Chem.,264, 17619 (1989)], 로우 등의 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86, 8227 (1989), Genes Develop.,4, 1288 (1990)], 또는 일본 공개특허공보 평5-336963 호, WO94/23021 등에 기재된 방법을 준용함으로써 상기 폴리펩티드를 숙주세포외로 적극적으로 분비시킬 수 있다.

즉, 유전자 재조합의 수법을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드의 활성부위를 포함하는 폴리펩티드 바로 앞에 시그널펩티드를 부가한 형태로 발현시킴으로써, 본 발명의 폴리펩티드를 숙주세포외로 적극적으로 분비시킬 수 있다.

또, 일본 공개특허공보 평2-227075 호에 기재되어 있는 방법에 준하여 디히드로 엽산 환원효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수도 있다.

또한, 유전자 도입한 동물 또는 식물의 세포를 재분화시킴으로써 유전자가 도입된 동물개체 (트랜스제닉 비인간 동물) 또는 식물개체 (트랜스제닉 식물) 를 조성하고, 이들 개체를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 제조할 수도 있다.

형질전환체가 동물개체 또는 식물개체인 경우에는, 통상의 방법에 따라 사육 또는 재배하고, 상기 폴리펩티드를 생성축적시키고, 상기 동물개체 또는 식물개체로부터 상기 폴리펩티드를 채취함으로써 상기 폴리펩티드를 제조할 수 있다.

동물개체를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서는, 예컨대 공지된 방법 [American Journal of Clinical Nutrition,63, 639S (1996), American Journal of Clinical Nutrition,63, 627S (1996), Bio/Technology,9, 830 (1991)] 에 준하여 유전자를 도입하여 조성한 동물중에 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법을 들 수 있다.

동물개체의 경우에는, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 비인간 동물을 사육하고, 상기 폴리펩티드를 이 동물중에 생성ㆍ축적시키고, 이 동물중으로부터 상기 폴리펩티드를 채취함으로써 상기 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 상기 동물중의 생성ㆍ축적 장소로서는, 예컨대 상기 동물의 젖 (일본 공개특허공보 소63-309192 호), 알 등을 들 수 있다. 이 때 사용되는 프로모터로서는 동물에서 발현할 수 있는 것이면 어느것이나 사용할 수 있는데, 예컨대 유선(乳腺)세포 특이적인 프로모터인 α카세인 프로모터, β카세인 프로모터, β락토글로블린 프로모터, 호에산성 프로테인 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

식물개체를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서는, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 식물을 공지된 방법 [조직배양, 20 (1994), 조직배양, 21 (1995), Trends in Biotechnology,15, 45 (1997)] 에 준하여 재배하고, 상기 폴리펩티드를 이 식물중에 생성ㆍ축적시키고, 이 식물중으로부터 상기 폴리펩티드를 채취함으로써 상기 폴리펩티드를 생산하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 형질전환체에 의해 제조된 폴리펩티드를 단리정제하기 위해서는통상의 효소의 단리정제법을 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 폴리펩티드가 세포내에 용해상태로 발현된 경우에는, 배양 종료후 세포를 원심분리에 의해 회수하여 수계(水系) 완충액에 현탁한 후, 초음파 파쇄기, 프렌치프레스, 만톤가우린 호모지나이저, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하여 무세포 추출액을 얻는다. 이 무세포 추출액을 원심분리함으로써 얻어지는 상등액으로부터, 통상의 효소의 단리정제법, 즉 용매추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸 (DEAE)-세파로오스, DIAION HPA-75 (미쯔비시가세이사 제조) 등의 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF (Pharmacia 사 제조) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로오스, 페닐세파로오스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용한 겔 여과법, 어피니티-크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 수법을 단독 또는 조합하여 사용하여 정제표품을 얻을 수 있다.

또, 상기 폴리펩티드가 세포내에 불용체를 형성하여 발현된 경우에는 마찬가지로 세포를 회수한 후 파쇄하고, 원심분리를 행함으로써 침전분획으로서 폴리펩티드의 불용체를 회수한다. 회수한 폴리펩티드의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 이 가용화액을 희석 또는 투석하고, 이 가용화액중의 단백질 변성제의 농도를 낮춤으로써 상기 폴리펩티드를 정상의 입체구조로 되돌린다. 이 조작 후, 상기와 동일한 단리정제법에 의해 상기 폴리펩티드의 정제표품을 얻을 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드, 또는 이 폴리펩티드에 당쇄가 부가된 폴리펩티드 등의 유도체가 세포외로 분비된 경우에는 배양 상등액에 상기 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 상기 배양물을 상기와 동일한 원심분리 등의 수법에 의해 처리함으로써 배양 상등액을 취득하고, 이 배양 상등액으로부터, 상기와 동일한 단리정제법을 사용함으로써 정제표품을 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 취득되는 폴리펩티드로서, 예컨대 서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다.

또, 본 발명의 폴리펩티드는 Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, Advanced ChemTech 사, 파킨ㆍ엘마사, Pharmacia 사, Protein Technology Instrument 사, Synthecell-Vega 사, PerSeptive 사, 시마즈세이사꾸쇼 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학합성할 수도 있다.

(4) 본 발명의 DNA 를 이용한 물질의 제조법

(a) 방향족 아미노산이나 방향족 비타민 등의 방향족 화합물, 푸린누클레오티드나 피리미딘누클레오티드 등의 핵산 관련 물질, L-히스티딘 또는 리보플라빈 등의 제조

본 발명의 DNA 나 그 염기서열정보를 사용함으로써, 방향족 아미노산이나 방향족 비타민 등의 방향족 화합물, 푸린누클레오티드나 피리미딘누클레오티드 등의 핵산 관련 물질, L-히스티딘 또는 리보플라빈 등의 생산능을 갖는 형질전환체의 트랜스알도라아제 활성을 원하는대로 개변하는 것이 가능해지고, 그에 의해 그들 대사산물의 공업적으로 유리한 제조법을 제공할 수 있다.

본 발명에 의해 얻을 수 있는 방향족 아미노산이란 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 등의 아미노산을 말하며, 방향족 비타민이란 엽산 (비타민 M), 메나퀴논 (비타민 K2), p-히드록시 벤조산 또는 그것에 유래하는 유비퀴논, p-아미노벤조산 (비타민 H'), 안트라닐산 (비타민 L), 토코페롤 (비타민 E) 등을 말하며, 핵산 관련 물질이란 푸린누클레오티드, 피리미딘누클레오티드, 푸린누클레오시드, 피리미딘누클레오시드, 푸린염기, 피리미딘염기, 푸라빈누클레오티드 등의 물질을 말한다.

이들 물질의 제조법을 이하에 서술한다.

상기 (3) 에서 제조한 형질전환체에 있어서, 본 발명의 DNA 또는 본 발명의 DNA 의 상류에 존재하며 이 DNA 의 전사ㆍ번역에 관계되는 DNA 가 갖는 염기서열 중에 1 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 DNA 를 보유하는 형질전환체 (이하, 형질전환체의 변이체라고 약기) 중에서, 트랜스알도라아제의 활성이 증강된 형질전환체, 또는 트랜스알도라아제 활성이 저하 또는 결실된 형질전환체를 선택한다. 이 결실, 치환 또는 부가는 공지된 방법 (모레큘러 클로닝 제 2 판, 커런트ㆍ프로토콜즈ㆍ인ㆍ모레큘러ㆍ바이올로지 등에 기재된 방법) 에 준하여 행할 수 있다.

트랜스알도라아제 활성의 측정은 하기 실시예 (4) 에 따라 행할 수 있다.

즉, 형질전환체의 변이체를 상기 (3) 의 방법에 따라 배양하여 조(粗)효소액을 조제한다. 트리스 40 mmol/ℓ(pH 7.6), 디포스포피리딘 0.1 mmol/ℓ, 프룩토오스 6-인산 2.8 mmol/ℓ, 에리트로오스 4-인산 0.2 mmol/ℓ, 글리세롤-3-인산-데히드로게나아제 및 트리오스포스페이트-이소메라아제 혼합액 (베링거 만하임사제조) 10 ㎍ 을 함유하는 반응액에 상기 조효소액을 첨가하여 1 ㎖ 로 하고, 25 ℃ 에서 반응시킨다. 이 반응에 의해 생성된 글리세르알데히드-3-인산을 분광광도계를 사용하여 340 ㎚ 에서의 흡광도의 감소를 측정함으로써 활성을 측정할 수 있다.

이 활성측정방법으로 형질전환체의 변이체의 트랜스알도라아제 활성을 측정하고, 트랜스알도라아제 활성이 향상 또는 저하 또는 결실된 형질전환체의 변이체를 선택함으로써 목적으로 하는 형질전환체를 얻을 수 있다.

방향족 아미노산 또는 방향족 비타민의 생산균이 숙주인 경우에는 트랜스알도라아제 활성을 증강시킴으로써 그들 방향족 화합물의 생산효율을 향상시킬 수 있다.

또, 푸린누클레오티드나 피리미딘누클레오티드 등의 핵산 관련 물질, L-히스티딘 또는 리보플라빈 등의 생산균이 숙주인 경우에는 트랜스알도라아제 활성을 저하 또는 결실시킴으로써 그들의 생산효율을 향상시킬 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 방향족 아미노산, 방향족 비타민, L-히스티딘, 리보플라빈, 푸린누클레오티드나 피리미딘누클레오티드 등의 핵산 관련 물질 등을 생성축적시키고, 이 배양물로부터 농축정석법, 활성탄처리법 또는 이온교환수지법 등의 공지된 방법 [엔도 이사오 등, 화학공학회 (편) 「바이오세퍼레이션 프로세스 편람」, 쿄리쯔 출판 (1996)] 을 사용하여 상기 물질을 단리ㆍ정제함으로써 목적으로 하는 물질을 효율적으로 생산할 수 있다.

상기 형질전환체의 배양은 상기 (3) 에 기재된 본 발명의 폴리펩티드를 제조하기 위한 형질전환체의 배양방법과 동일한 방법으로 행할 수 있다.

(b) 신규 당의 제조

상기 방법에 의해 얻어진 형질전환체, 이 형질전환체의 배양물 또는 이 배양물의 처리물을 효소원으로서 사용하고, 케토스 및 알도스를 수성 매질 중에 존재시키고, 이 수성 매질 중에 트랜스알도라아제 활성에 의해 상기 알도스에 상기 케토스의 디히드록시아세톤 부분이 전이된 당을 생성축적시키고, 상기 수성 매질로부터 이 당을 채취할 수도 있다.

상기 케토스로서는, 예컨대 세도헵튜로오스 7-인산, 프룩토오스 6-인산 등을 들 수 있고, 상기 알도스로서는, 예컨대 에리트로오스 4-인산, 글리세르알데히드 3-인산 등을 들 수 있다.

형질전환체의 배양물의 처리물로서는 배양균체, 이 균체의 건조물, 이 균체의 동결건조물, 이 균체의 계면활성제 처리물, 이 균체의 효소처리물, 이 균체의 초음파 처리물, 이 균체의 기계적 마쇄물, 이 균체의 용매처리물 등의 균체처리물, 균체의 단백분획물, 균체 및 균체처리물의 고정화물 등, 이 균체로부터 추출하여 얻어지는 효소표품 등을 들 수 있다.

본 발명에 의해 얻어지는 당의 생성에서 사용되는 효소원은, 37 ℃ 에서 1 분 동안에 1 밀리몰의 본 발명에 의해 얻어지는 당을 생성할 수 있는 활성을 1 단위 (U) 로 하여 1 mU/ℓ∼ 1,000 U/ℓ이고, 바람직하게는 10 mU/ℓ∼ 100 U/ℓ의 농도로 사용한다.

본 발명에 의해 얻어지는 당의 생성에서 사용되는 수성 매질로서는 물, 인산염, 탄산염, 아세트산염, 붕산염, 시트르산염, 트리스 등의 완충액, 메탄올, 에탄올 등의 알콜류, 아세트산 에틸 등의 에스테르류, 아세톤 등의 케톤류, 아세트아미드 등의 아미드류 등을 들 수 있다. 또, 효소원으로서 사용한 형질전환체의 배양액을 수성 매질로서 사용할 수 있다.

본 발명에 의해 얻어지는 당의 생성에서, 필요에 따라 계면활성제 또는 유기용매를 첨가해도 된다. 계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌ㆍ옥타데실아민 (예컨대, 나이민 S-215, 닛뽄유시사 제조) 등의 비이온 계면활성제, 세틸트리메틸암모늄ㆍ브로마이드나 알킬디메틸ㆍ벤질암모늄클로라이드 (예컨대, 카티온 F2-40E, 닛뽄유시사 제조) 등의 카티온계 계면활성제, 라우로일ㆍ잘코시네이트 등의 음이온계 계면활성제, 알킬디메틸아민 (예컨대, 3급 아민 FB, 닛뽄유시사 제조) 등의 3급 아민류 등, 갈락토오스 함유 당질의 생성을 촉진하는 것이면 어느것이나 되고, 1 종 또는 몇 종을 혼합하여 사용할 수도 있다. 계면활성제는 통상 0.1 ∼ 50 g/ℓ의 농도로 사용된다. 유기용제로서는 자일렌, 톨루엔, 지방족 알콜, 아세톤, 아세트산 에틸 등을 들 수 있고, 통상 0.1 ∼ 50 ㎖/ℓ의 농도로 사용된다.

수성 매질 중에 생성된 본 발명에 의해 얻어지는 당의 정량은 Dionex 사 제조의 당 분석장치 등을 사용하여 행할 수 있다 [Anal. Biochem.,189, 151 (1990)].

반응액중에 생성된 본 발명에 의해 얻어지는 당의 채취는 활성탄이나 이온교환수지 등을 사용하는 통상의 방법에 의해 행할 수 있다.

상기 방법을 사용함으로써 종래에는 합성하는 것이 곤란했던 당의 합성을 용이하게 할 수 있게 되고, 또 신규 당을 합성하는 것도 가능해진다.

이하에 본 발명의 실시예를 나타내는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

(1) 코리네박테리움 글루타미쿰의 트랜스 케토라아제 결손 변이주의 취득

코리네박테리움 글루타미쿰 L22 [야생형 주 ATCC31833 에서 유도된 리조팀 감수성 변이주 ; R. Katsumata et al., Proc. 4th Eur. Congr. Biotechnol.,4, 767 (1987)] 를 NB 배지 [분말 부이용 20 g, 효모 엑기스 5 g 을 물 1 ℓ에 함유하고, pH 7.2 로 조정한 배지] 3 ㎖ 중에 식균(植菌)하고, 30 ℃ 에서 OD₆₆₀이 약 0.6 이 될때까지 배양하였다.

배양한 후, 원심분리에 의해 집균하고, 얻어진 균체를 50 mmol/ℓ트리스말레산 완충액 (pH 6.0) 으로 1 회 세정하고, NTG 400 ㎎/ℓ를 함유하는 동 완충액 3 ㎖ 중, 실온에서 20 분간 변이처리하였다. 이 처리균체를 동 완충액으로 2 회 원심세정한 후, NB 배지 3 ㎖ 중, 30 ℃ 에서 1 시간 배양하였다.

상기 배양액을 생리식염수로 10^-6∼ 10^-8로 희석하고, 얻어진 희석액 0.1 ㎖ 를 NB 한천배지 [NB 배지에 한천을 1.4 % 함유하는 배지, pH 7.2] 에 도포하고, 30 ℃ 에서 2 일간 배양하였다.

한천배지상에 생육된 콜로니를 최소한천배지 M1 [글루코오스 10 g,(NH₄)H₂PO₄1 g, KCl 0.2 g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.2 g, FeSO₄ㆍ7H₂O 10 ㎎, MnSO₄ㆍ4∼6H₂O 0.2 ㎎, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.9 ㎎, CuSO₄ㆍ5H₂O 0.4 ㎎, Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O 0.09 ㎎, (NH₄)₆Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O 0.04 ㎎, 비오틴 50 ㎎, p-아미노벤조산 2.5 ㎎, 티아민염산염 1 ㎎ 및 한천 16 g 을 물 1 ℓ에 함유하고, pH 7.2 로 조정한 배지] 및 쉬키미산 50 ㎎/ℓ를 함유하는 M1 한천배지에 각각 도포하고, 30 ℃ 에서 배양하였다.

최소한천배지 M1 에서는 생육되지 않고, 쉬키미산 50 ㎎/ℓ를 함유하는 M1 한천배지에서 생육될 수 있는 주를 쉬키미산 요구 변이주로서 분리하였다. 분리된 쉬키미산 요구 변이주를 쉬키미산 50 ㎎/ℓ를 함유하는 M1 한천배지 및 이 배지중의 글루코오스를 리보오스로 치환한 배지에 각각 도포하고, 30 ℃ 에서 배양하였다.

상기 쉬키미산 요구 변이주 중에서, 쉬키미산 50 ㎎/ℓ를 함유하는 M1 한천배지에서 생육되지만, 이 배지중의 글루코오스를 리보오스로 치환한 배지에서는 생육될 수 없는 주를, 쉬키미산 요구성이며 리보오스 비자화성의 변이주로서 분리하였다.

분리된 쉬키미산 요구성이며 리보오스 비자화성의 변이주를 쉬키미산 50 ㎎/ℓ를 함유하는 M1 배지 40 ㎖ 중 30 ℃ 에서 24 시간 배양한 후, 원심분리하여 얻은 균체를 초음파 파쇄하고, 원심분리함으로써 무세포 추출액을 조제하였다. 이 무세포 추출액을 조효소액으로 하고, 트랜스 케토라아제의 활성을 이하와 같이 하여 측정하였다.

트리스 50 mmol/ℓ(pH 7.5), NADH 0.2 mmol/ℓ, 티아민피롤린산 0.01 mmol/ℓ, MgCl₂1 mmol/ℓ, 자일로오스-5-인산 0.5 mmol/ℓ, 리브로오스-5-인산 0.5 mmol/ℓ, 글리세롤-3-인산 데히드로게나아제 및 트리오스포스페이트 이소메라아제 혼합액 (베링거 만하임사 제조) 10 ㎍ 을 함유하는 반응액에 조효소액을 첨가하여 1.5 ㎖ 로 하고, 30 ℃ 에서 반응시켰다.

분광광도계를 사용하여 340 ㎚ 에서의 NADH 의 흡광도 감소를 측정함으로써 생성되는 글리세르알데히드-3-인산량을 측정하였다.

이 측정에 의해, 분리된 쉬키미산 요구성이며 리보오스 비자화성의 변이주로부터 글리세르알데히드-3-인산을 전혀 생성하지 않는, 트랜스 케토라아제 활성이 결손된 변이주 TKT6 주를 선택하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰 TKT6 주는 부다페스트 조약에 기초하여 평성 10 년 6 월 30 일자로 공업기술원 생명공학 공업기술연구소, 일본국 이바라키껭 쯔꾸바시 히가시 1 초메 1 반 3 고 (우편번호 305-8566) 에 FERM BP-6399 호로서 기탁되어 있다.

(2) 트랜스 케토라아제 유전자 및 트랜스알도라아제 유전자를 함유하는 DNA 단편의 클로닝

양 유전자의 공급원으로서 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 ATCC31833 의 염색체 DNA 를, 이 유전자의 수용균으로서 실시예 1 에서 취득한 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰의 트랜스 케토라아제 유전자 결손주 TKT6 (FERM BP-6399) 을 사용하였다.벡터는 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰으로 복제 가능한 플라스미드 pCSEK20 을 사용하였다. pCSEK20 은 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 유래의 플라스미드 pCG2 (일본 공개특허공보 소58-35197 호) 의 복제개시점, 마찬가지로 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 유래의 플라스미드 pCG4 (일본 공개특허공보 소57-183799 호) 의 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신 내성 유전자 및, 에쉐리키아ㆍ콜리의 일반적 벡터인 pGA22 [J. Bacteriol.,140, 400 (1979)] 의 카나마이신 내성 유전자로 이루어지는 플라스미드이다 [Appl. Microbiol. Biotechnol.,51, 201 (1999)].

코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 ATCC31833 의 배양 및 배양균체로부터의 염색체 DNA 의 조제는 일본 공개특허공보 평6-169785 호에 기재된 방법에 따라 행하였다. pCSEK20 은 이것을 보유시킨 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 ATCC31833 의 배양균체로부터 일본 공개특허공보 평6-169785 호에 기재된 벡터의 조제방법에 따라 단리하였다.

코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 ATCC31833 의 염색체 DNA 로부터의 트랜스 케토라아제 유전자 및 트랜스알도라아제 유전자를 함유하는 DNA 단편의 클로닝은 이하와 같이 하여 행하였다.

상기와 같이 조제한 염색체 DNA 및 pCSEK20 플라스미드 DNA 각각 1 ㎍ 을EcoRI (5 단위) 로 절단하고, 양 절단물을 다까라슈조사 제조 라이게이션키트를 사용하여 연결처리하였다. 이와 같이 하여 구축된 플라스미드를 사용하여 쉬키미산 요구성을 나타내는 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰의 트랜스 케토라아제 유전자 결손주 TKT6 (FERM BP-6399) 을 이하의 방법으로 형질전환하였다.

코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 TKT6 을 NB 배지 5 ㎖ 중에 식균하고, 30 ℃ 에서 1 일 배양한 종(種)배양액 4 ㎖ 를 쉬키미산 100 ㎍/㎖ 를 함유하는 SSM 배지 [글루코오스 20 g, (NH₄)₂SO₄10 g, 우레아 3 g, 효모 엑기스 1 g, KH₂PO₄1 g, MgCl₂ㆍ6H₂O 0.4 g, FeSO₄ㆍ7H₂O 10 ㎎, MnSO₄ㆍ4∼6H₂O 0.2 ㎎, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.9 ㎎, CuSO₄ㆍ5H₂O 0.4 ㎎, Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O 0.09 ㎎, (NH₄)6Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O 0.04 ㎎, 비오틴 30 ㎍ 및 사이아민 염산염 1 ㎎ 을 물 1 ℓ에 함유하고, pH 7.2 로 조정한 배지] 40 ㎖ 에 식균하고, 30 ℃ 에서 OD₆₆₀이 0.6 이 될때까지 진탕배양하였다.

균체를 집균하고, 이 세포를 RCGP 배지 [글루코오스 5 g, 카자미노산 5 g, 효모 엑기스 2.5 g, KH₂PO₄1.5 g, MgCl₂ㆍ6H₂O 0.41 g, FeSO₄ㆍ7H₂O 10 ㎎, MnSO₄ㆍ4∼6H₂O 2 ㎎, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.9 ㎎, (NH₄)6Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O 0.04 ㎎, 비오틴 30 ㎍ 및 사이아민 염산염 2 ㎎, 숙신산 2나트륨 135 g, 폴리비닐피롤리돈 (분자량 10,000) 30 g 을 물 1 ℓ에 함유하는 배지] 의 리조팀을 함유하는 용액 10 ㎖ 에 약 10⁹세포/㎖ 가 되도록 현탁하고, L 형 시험관에 옮겨 30 ℃ 에서 6 시간 천천히 진탕하고 반응시켜 프로토플라스트화하였다.

이 프로토플라스트균액 0.5 ㎖ 를 소시험관에 넣어 2,500 ×g 으로 5 분간 원심분리하고, TSMC 완충액 (MgCl₂10 mmol/ℓ, CaCl₂30 mmol/ℓ, 트리스 50 mmol/ℓ, 자당 400 mmol/ℓ, pH 7.5) 1 ㎖ 에 재현탁하여 원심세정한 후, TSMC 완충액0.1 ㎖ 에 재현탁하였다. 이 균액에 2 배 농도의 TSMC 완충액과 상기 연결혼합액의 1 대 1 혼합액 100 ㎕ 를 첨가하여 혼화하고, 이어서 TSMC 완충액중에 20 % PEG 6,000 을 함유하는 액 0.8 ㎖ 를 첨가하여 혼합하였다. 3 분후, RCGP 배지 (pH 7.2) 2 ㎖ 를 첨가하고, 2,500 ×g 으로 5 분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 침전된 프로토플라스트를 1 ㎖ 의 RCGP 배지에 현탁하였다. 이 현탁액 0.2 ㎖ 를 카나마이신 200 ㎍/㎖ 를 함유하는 RCGP 한천배지 (RCGP 배지에 1.4 % 한천을 함유하는 배지, pH 7.2) 에 도포하고, 30 ℃ 에서 10 일간 배양하였다.

한천배지상에 생육된 콜로니를 모으고, 생리식염수로 2 회 원심세정한 후, 생리식염수 1 ㎖ 에 현탁하였다. 이 균액을 카나마이신 20 ㎍/㎖ 를 함유하는 최소한천배지 M1 [글루코오스 10 g, (NH₄)H₂PO₄1 g, KCl 0.2 g, KH₂PO₄1 g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.2 g, FeSO₄ㆍ7H₂O 10 ㎎, MnSO₄ㆍ4∼6H₂O 0.2 ㎎, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.9 ㎎, CuSO₄ㆍ5H₂O 0.4 ㎎, Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O 0.09 ㎎, (NH₄)₆Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O 0.04 ㎎, 비오틴 50 ㎍, P-아미노벤조산 2.5 ㎎, 사이아민 염산염 1 ㎎ 및 한천 16 g 을 물 1 ℓ에 함유하고, pH 7.2 로 조정한 배지] 상에 재도포하여 30 ℃ 에서 3 일간 배양하고, 카나마이신 내성이며, 쉬키미산 비요구성이 된 형질전환주를 선택하였다.

이들 형질전환주로부터 일본 공개특허공보 평6-169785 호에 기재된 벡터의 조제방법에 따라 플라스미드 DNA 를 단리하였다. 형질전환주의 1 주로부터 얻어지며, pCTK60 이라고 명명한 플라스미드는 각 제한효소에 의한 절단산물을 아가로오스 겔 전기영동법으로 해석한 결과, pCSEK20 의EcoRI 부위에 약 7.6 kb 의EcoRI DNA 단편이 삽입된 구조를 갖고 있는 것을 알았다. 서브클로닝과 상보시험의 결과, 동 DNA 단편내의 약 4.1 kb 의XhoI-EcoRI DNA 단편상에 적어도 트랜스 케토라아제 유전자가 존재하는 것을 알았다.

(3)XhoI-EcoRI DNA 단편의 염기서열 결정

상기 약 4.1 kb 의XhoI-EcoRI DNA 단편을 함유하는 플라스미드로부터 통상의 방법에 따라 이 DNA 단편을 회수하였다. 이 DNA 단편 및 벡터 pUC19 (다까라슈조사 제조) 를 여러 가지의 제한효소를 사용하여 분해한 후, T4DNA 리가아제를 사용하여 벡터 DNA 단편과 분해 DNA 단편을 결합시켰다. 얻어진 연결혼합액을 사용하여 통상법에 따라 대장균 DH5α(도요보사 제조) 를 형질전환하였다. 얻어진 형질전환균을, 앰피실린을 최종농도로 100 ㎍/㎖ 함유하는 LB 한천배지 [트립톤 10 g, 효모 엑기스 5 g, NaCl 10 g, 한천 20 g 을 물 1 ℓ에 용해시킨 배지] 에 도포하고, 37 ℃ 에서 16 시간 배양하였다.

선택배지상에 생육한 균주를, 앰피실린을 최종농도로 100 ㎍/㎖ 함유하는 LB 배양액에 식균하고, 30 ℃ 에서 12 시간 배양하였다. 배양균체로부터 알칼리 SDS 법 (모레큘러ㆍ클로닝 제 2 판) 에 의해 플라스미드를 추출하였다.

추출한 플라스미드 DNA 를 사용하여 디데옥시누클레오시드 효소법에 의해 벡터 pUC19 에 삽입된 각종 DNA 단편의 염기서열을 결정하였다. 구체적으로는 아마샴사 제조 서모ㆍ시쿼나아제ㆍ사이클ㆍ시퀀스ㆍ키트 (Thermo Sequenase cycle sequencing kit ; Amersham) 를 사용하여 프로토콜에 따라 반응시킨 후, 라이ㆍ코어사 제조 DNA 시퀀서 LONG READER 4200 을 사용하여 삽입 DNA 단편의 염기서열을결정하였다. 이 삽입 DNA 단편의 염기서열을 서열번호 3 에 나타냈다.

이들 서열의 해석은 소프트웨어ㆍ디벨로프먼트사 제조의 시퀀스 해석 소프트 제네틱ㆍ맥 (GENETYX MAC) ATSQ 3.0 을 사용하여 행하였다. 그 결과, 4.1 kb 의XhoI-EcoRI DNA 단편의 염기서열 중에는 2 개의 오픈 리딩 프레임이 존재하는 것을 알았다.

그들 염기서열로부터 추정되는 아미노산의 1 차 구조를 분류학적으로 코리네박테리움속과 가까운 마이코박테리움ㆍ튜버큘로시스의 트랜스 케토라아제 및 트랜스알도라아제의 아미노산 1 차 구조와 비교한 결과, 서열표의 서열번호 3 에 기재된 염기서열중 373 번째부터 2472 번째까지의 오픈 리딩 프레임이 트랜스 케토라아제 유전자이고, 2643 번째부터 3722 번째까지의 오픈 리딩 프레임이 트랜스알도라아제 유전자인 것이 판명되었다. 이 트랜스알도라아제 유전자의 오픈 리딩 프레임으로부터 추측되는 아미노산 서열을 서열번호 1 에, 염기서열을 서열번호 2 에 나타냈다.

(4) 트랜스 케토라아제 및 트랜스알도라아제의 활성 측정

상기 약 4.1 kb 의XhoI-EcoRI DNA 단편의 양 말단을 통상법에 따라 평활말단에 수복한 후, 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰으로 복제 가능한 벡터 pCG116 [Appl. Microbiol. Biotechnol.,51, 201 (1999)] 의Smal 부위에 삽입하여 재조합체 플라스미드 pHTK65 를 구축하였다. 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 ATCC31833 을 상기 재조합체 플라스미드로 형질전환하고, 이 형질전환주의 트랜스 케토라아제 및 트랜스알도라아제의 활성을 측정하였다. 트랜스 케토라아제 활성은 일본 공개특허공보 평6-169785 호에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 트랜스알도라아제 활성은 이하와 같이 하여 측정하였다.

트리스 40 mmol/ℓ(pH 7.6), 디포스포피리딘 0.1 mmol/ℓ, 프룩토오스 6-인산 2.8 mmol/ℓ, 에리트로오스 4-인산 0.2 mmol/ℓ, 글리세롤-3-인산-데히드로게나아제 및 트리오스포스페이트-이소메라아제 혼합액 (베링거 만하임사 제조) 10 ㎍ 을 함유하는 반응액에 조효소액을 첨가하여 1 ㎖ 로 하고, 25 ℃ 에서 반응을 개시하였다. 생성된 글리세르알데히드-3-인산을, 분광광도계를 사용하여 340 ㎚ 에서의 흡광도의 감소를 측정함으로써 정량하였다. 그 결과, ATCC31833 주의 트랜스 케토라아제 및 트랜스알도라아제의 단위 단백질 중량 및 단위 시간당의 활성을 각각 1 로 했을 때의 pHTK65 를 보유하는 형질전환주의 활성은 모두 5 배 이상으로 증가되어 있었다.

본 발명은 신규로 발견된 트랜스알도라아제 유전자 및, 이 유전자에 코드되는 폴리펩티드, 이 유전자를 조합하여 얻어지는 재조합체 DNA, 이 재조합체 DNA 를 보유하는 형질전환체 및, 이 형질전환체를 이용한, 상기 폴리펩티드, 방향족 아미노산, 방향족 비타민, L-히스티딘, 리보플라빈, 핵산, 핵산 관련 물질, 또는 신규 당 등의 제조법에 관한 것이다.

본 발명에서 신규로 발견된 트랜스알도라아제 유전자, 그 염기서열정보, 이 유전자에 코드되는 폴리펩티드, 또는 그 아미노산 서열정보를 사용함으로써, 아미노산 발효 등에서 널리 사용되고 있는 산업상 중요한 코리네박테리움속에 속하는 미생물의 트랜스알도라아제를 원하는대로 개변한 발효생산균을 육종할 수 있다. 또한, 당류나 그 유도체의 합성 등, 입체선택적인 탄소-탄소 결합형성반응에 유용한 트랜스알도라아제 고활성주를 육종할 수 있다.

Claims

서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열을 포함하고 폴리펩티드.
서열번호 1 에 기재된 폴리펩티드에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 트랜스알도라아제 활성을 갖는 폴리펩티드.
서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열과 60 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 트랜스알도라아제 활성을 갖는 단백질.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 DNA.
서열번호 2 에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA.
제 4 항 또는 제 5 항에 기재된 DNA 와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 트랜스알도라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA.
제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 를 벡터에 조합하여 얻어지는 재조합체 DNA.
제 7 항에 기재된 재조합체 DNA 를 보유하는 형질전환체.
제 8 항에 기재된 형질전환체가 보유하는 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA, 또는 이 DNA 의 상류에 존재하는 전사ㆍ번역에 관계되는 DNA 의 염기서열 중에 1 이상의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되고, 또한 이 치환, 결실 또는 삽입 전과 비교하여 트랜스알도라아제의 활성이 증강된 형질전환체.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 형질전환체가 방향족 아미노산 또는 방향족 비타민을 생산하는 능력을 갖는 형질전환체.
제 10 항에 기재된 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 방향족 아미노산 또는 방향족 비타민을 생성축적시키고, 배양물로부터 방향족 아미노산 또는 방향족 비타민을 채취하는 것을 특징으로 하는, 방향족 아미노산 또는 방향족 비타민의 제조법.
제 8 항에 기재된 형질전환체가 보유하는 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA, 또는 이 DNA 의 상류에 존재하는 전사ㆍ번역에 관계되는 DNA 의 염기서열 중에 1 이상의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되고, 또한 이 치환, 결실 또는 삽입전에 비교하여 트랜스알도라아제의 활성이 저하 또는 결손된 형질전환체.
제 8 항 또는 제 12 항에 있어서, 형질전환체가 L-히스티딘, 리보플라빈, 핵산 및 핵산 관련 물질에서 선택되는 물질을 생산하는 능력을 갖는 형질전환체인 형질전환체.
제 13 항에 기재된 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 L-히스티딘, 리보플라빈, 핵산 및 핵산 관련 물질에서 선택되는 물질을 생성축적시키고, 배양물로부터 상기 물질을 채취하는 것을 특징으로 하는, L-히스티딘, 리보플라빈, 핵산 및 핵산 관련 물질의 제조법.
제 8 항에 기재된 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 생성축적시키고, 배양물로부터 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 채취하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드의 제조법.
제 8 항 또는 제 9 항에 기재된 형질전환체, 이 형질전환체의 배양물 또는 이 배양물의 처리물을 효소원으로서 사용하고, 케토스 및 알도스를 수성 매질 중에 존재시키고, 이 수성 매질 중에 상기 알도스에 상기 케토스의 디히드록시아세톤 부분이 전이된 당을 생성축적시키고, 상기 수성 매질로부터 상기 당을 채취하는 것을 특징으로 하는, 알도스에 케토스의 디히드록시아세톤 부분이 전이된 당의 제조법.