JPH11155572A - ４（ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼおよび該酵素をコードするｄｎａ - Google Patents
４（ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼおよび該酵素をコードするｄｎａInfo
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- JPH11155572A JPH11155572A JP9325534A JP32553497A JPH11155572A JP H11155572 A JPH11155572 A JP H11155572A JP 9325534 A JP9325534 A JP 9325534A JP 32553497 A JP32553497 A JP 32553497A JP H11155572 A JPH11155572 A JP H11155572A
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 医薬品などの合成原料として有用である４
（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸、４（Ｒ）−
ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸または４（Ｒ）−ヒドロ
キシ−Ｌ−プロリンを工業的に有利に製造する方法を提
供する。 【解決手段】 グリオキシル酸とピルビン酸から、４
（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せず、
４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成
する反応を触媒する酵素４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸アルドラーゼ、該酵素をコードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体
ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られ
る形質転換体、該形質転換体を用いた４（Ｒ）−ヒドロ
キシ−２−ケトグルタル酸、４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ
−グルタミン酸または４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンの製造法を提供する。
（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸、４（Ｒ）−
ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸または４（Ｒ）−ヒドロ
キシ−Ｌ−プロリンを工業的に有利に製造する方法を提
供する。 【解決手段】 グリオキシル酸とピルビン酸から、４
（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せず、
４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成
する反応を触媒する酵素４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸アルドラーゼ、該酵素をコードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体
ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られ
る形質転換体、該形質転換体を用いた４（Ｒ）−ヒドロ
キシ−２−ケトグルタル酸、４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ
−グルタミン酸または４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロ
リンの製造法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はグリオキシル酸とピ
ルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸を生成する反応を触媒する酵素４（Ｒ）−ヒドロキ
シ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ、該酵素をコード
するＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる
組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入し
て得られる形質転換体、該形質転換体を用いた４（Ｒ）
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸〔以下、４（Ｒ）Ｋ
ＨＧと略す〕、４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン
酸〔以下、４（Ｒ）ＨＧと略す〕または４（Ｒ）−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリン〔以下、４（Ｒ）ＨＹＰと略す〕
の製造法に関する。
ルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸を生成する反応を触媒する酵素４（Ｒ）−ヒドロキ
シ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ、該酵素をコード
するＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる
組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入し
て得られる形質転換体、該形質転換体を用いた４（Ｒ）
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸〔以下、４（Ｒ）Ｋ
ＨＧと略す〕、４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン
酸〔以下、４（Ｒ）ＨＧと略す〕または４（Ｒ）−ヒド
ロキシ−Ｌ−プロリン〔以下、４（Ｒ）ＨＹＰと略す〕
の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ピルビン酸とグリオキシル酸とから４−
ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する４−ヒドロ
キシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ（以下、ＫＡＬ
と略称す）活性はいくつかの生物に存在することが報告
されているが、いずれも４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸のみならず４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸をも同時に生成し、４（Ｒ）−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸のみを特異的に生成する４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ〔以下、４
（Ｒ）ＫＡＬと略す〕は知られていない〔Methods in E
nzymology 41 partB, 115, E.E.Dekker & U. Maitra、
J. Biol. Chem., 257, 5079 (1972)〕。
ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する４−ヒドロ
キシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ（以下、ＫＡＬ
と略称す）活性はいくつかの生物に存在することが報告
されているが、いずれも４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸のみならず４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸をも同時に生成し、４（Ｒ）−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸のみを特異的に生成する４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ〔以下、４
（Ｒ）ＫＡＬと略す〕は知られていない〔Methods in E
nzymology 41 partB, 115, E.E.Dekker & U. Maitra、
J. Biol. Chem., 257, 5079 (1972)〕。
【０００３】４（Ｒ）ＫＨＧの製造法として、エリスロ
−４−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を化学的に脱アミ
ノする方法（Methods in Enzymology, 17 partB, 27
5）、オキサロ酢酸とグリオキシル酸から合成したラセ
ミ-4-ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸から４（Ｓ）−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸を分解除去する方法〔J. C
hem. Soc. Perkin Trans., 1, 1085(1992)〕、ピルビン
酸とグリオキシル酸から４（Ｒ）ＫＨＧを生成する活性
を有する生体触媒を、ピルビン酸もしくは該生体触媒に
よってピルビン酸に転換されうる化合物とグリオキシル
酸に作用させる方法（特開平７−２８９２８４）などが
知られている。
−４−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を化学的に脱アミ
ノする方法（Methods in Enzymology, 17 partB, 27
5）、オキサロ酢酸とグリオキシル酸から合成したラセ
ミ-4-ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸から４（Ｓ）−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸を分解除去する方法〔J. C
hem. Soc. Perkin Trans., 1, 1085(1992)〕、ピルビン
酸とグリオキシル酸から４（Ｒ）ＫＨＧを生成する活性
を有する生体触媒を、ピルビン酸もしくは該生体触媒に
よってピルビン酸に転換されうる化合物とグリオキシル
酸に作用させる方法（特開平７−２８９２８４）などが
知られている。
【０００４】前２者の製法は原料が高価であったり、収
量が低いため実用的ではない。後者の製法は実用可能で
はあるものの、更なる経済的製法が望まれている。４
（Ｒ）ＨＧの製造法としては、化学合成したＤＬ−４−
ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸にアンモニアとＮＡＤ
ＰＨ存在下でグルタミン酸デヒドロゲナーゼを作用さ
せ、生じた４（Ｒ）４（Ｓ）ラセミ体の４−ヒドロキシ
グルタミン酸をイオン交換クロマトで分割する方法（Me
thods in Enzymology,17 partB,277）やアミノ基供与体
存在下ピルビン酸とグリオキシル酸から４（Ｒ）ＨＧを
生成する活性を有する生体触媒をピルビン酸もしくは該
生体触媒によってピルビン酸に転換されうる化合物とグ
リオキシル酸に作用させる方法(特開平８−８０１９８)
などが知られている。
量が低いため実用的ではない。後者の製法は実用可能で
はあるものの、更なる経済的製法が望まれている。４
（Ｒ）ＨＧの製造法としては、化学合成したＤＬ−４−
ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸にアンモニアとＮＡＤ
ＰＨ存在下でグルタミン酸デヒドロゲナーゼを作用さ
せ、生じた４（Ｒ）４（Ｓ）ラセミ体の４−ヒドロキシ
グルタミン酸をイオン交換クロマトで分割する方法（Me
thods in Enzymology,17 partB,277）やアミノ基供与体
存在下ピルビン酸とグリオキシル酸から４（Ｒ）ＨＧを
生成する活性を有する生体触媒をピルビン酸もしくは該
生体触媒によってピルビン酸に転換されうる化合物とグ
リオキシル酸に作用させる方法(特開平８−８０１９８)
などが知られている。
【０００５】前者の製法は高価な原料と光学分割操作を
必要とするために実用に供しがたい。後者の製法は実用
可能ではあるものの、更なる経済的製法が望まれてい
る。４（Ｒ）ＨＹＰの製造法としては、コラーゲン加水
分解物より分離精製する方法の他、クロノスタキス属、
グリオクラディウム属またはネクトリア属に属する微生
物を培養しその培養物中より抽出する方法(特開平５−
２３６９８０)、4-ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸を4-ヒ
ドロキシ-L-プロリンに転換する活性を有する微生物を4
-ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸に作用させる方法(特開
平３−２６６９９５)などが知られている。しかしいず
れの方法も原料あるいは分離精製に費やすコストが高
く、優れた製法とは言い難い。
必要とするために実用に供しがたい。後者の製法は実用
可能ではあるものの、更なる経済的製法が望まれてい
る。４（Ｒ）ＨＹＰの製造法としては、コラーゲン加水
分解物より分離精製する方法の他、クロノスタキス属、
グリオクラディウム属またはネクトリア属に属する微生
物を培養しその培養物中より抽出する方法(特開平５−
２３６９８０)、4-ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸を4-ヒ
ドロキシ-L-プロリンに転換する活性を有する微生物を4
-ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸に作用させる方法(特開
平３−２６６９９５)などが知られている。しかしいず
れの方法も原料あるいは分離精製に費やすコストが高
く、優れた製法とは言い難い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、医薬
品などの合成原料として有用である４（Ｒ）ＫＨＧ、４
（Ｒ）ＨＧおよび４（Ｒ）ＨＹＰを、工業的に有利に製
造する方法を提供することにある。
品などの合成原料として有用である４（Ｒ）ＫＨＧ、４
（Ｒ）ＨＧおよび４（Ｒ）ＨＹＰを、工業的に有利に製
造する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、グリオキシル
酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−
ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する酵素４
（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ
〔４（Ｒ）ＫＡＬ〕、該酵素をコードするＤＮＡ、該Ｄ
ＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、
該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転
換体、該形質転換体を用いた４（Ｒ）ＫＨＧ、４（Ｒ）
ＨＧまたは４（Ｒ）ＨＹＰの製造法に関する。
酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−
ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する酵素４
（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ
〔４（Ｒ）ＫＡＬ〕、該酵素をコードするＤＮＡ、該Ｄ
ＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、
該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転
換体、該形質転換体を用いた４（Ｒ）ＫＨＧ、４（Ｒ）
ＨＧまたは４（Ｒ）ＨＹＰの製造法に関する。
【０００８】また、アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨ
Ｇから４（Ｒ）ＨＹＰを生成する活性を有する生体触媒
を用いた４（Ｒ）ＨＹＰの製造法に関する。
Ｇから４（Ｒ）ＨＹＰを生成する活性を有する生体触媒
を用いた４（Ｒ）ＨＹＰの製造法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の４（Ｒ）ＫＡＬとして、グリオキシル酸とピル
ビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグル
タル酸のみを生成する反応を触媒する酵素であればいず
れも用いることができ、例えば、配列番号１で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号１
で表されるアミノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が置
換、欠失または付加したアミノ酸配列を有し、かつグリ
オキシル酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキ
シ−２−ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する
活性を有するポリペプチドをあげることができる。
本発明の４（Ｒ）ＫＡＬとして、グリオキシル酸とピル
ビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグル
タル酸のみを生成する反応を触媒する酵素であればいず
れも用いることができ、例えば、配列番号１で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号１
で表されるアミノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が置
換、欠失または付加したアミノ酸配列を有し、かつグリ
オキシル酸とピルビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキ
シ−２−ケトグルタル酸のみを生成する反応を触媒する
活性を有するポリペプチドをあげることができる。
【００１０】配列番号１で表されるアミノ酸配列とは一
個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加したアミノ酸
配列を有し、かつグリオキシル酸とピルビン酸とから、
４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せ
ず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを
生成する反応を触媒する活性を有するポリペプチドは、
Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982) 、Proc. Na
tl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982) 、Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 81,5662 (1984) 、Science, 224, 14
31 (1984)、PCT WO85／00817(1985) 、Nature, 316, 60
1 (1985) 、Gene,34, 315 (1985)、Nucleic Acids Rese
arch, 13, 4431 (1985) 、カレント・プロトコールズ・
イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocol
s in Molecular Biology）, ８章 Mutagenesis of Clon
ed ＤＮＡ，John Wiley & Sons,Inc.(1989)等に記載の
方法に準じて調製することができる。
個以上のアミノ酸が置換、欠失または付加したアミノ酸
配列を有し、かつグリオキシル酸とピルビン酸とから、
４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せ
ず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを
生成する反応を触媒する活性を有するポリペプチドは、
Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982) 、Proc. Na
tl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982) 、Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 81,5662 (1984) 、Science, 224, 14
31 (1984)、PCT WO85／00817(1985) 、Nature, 316, 60
1 (1985) 、Gene,34, 315 (1985)、Nucleic Acids Rese
arch, 13, 4431 (1985) 、カレント・プロトコールズ・
イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocol
s in Molecular Biology）, ８章 Mutagenesis of Clon
ed ＤＮＡ，John Wiley & Sons,Inc.(1989)等に記載の
方法に準じて調製することができる。
【００１１】本発明のＤＮＡとして、上記本発明の４
（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡをあげることができ、
例えば、配列番号２または３で表される塩基配列を有す
るＤＮＡ、および、該ＤＮＡとストリンジェントな条件
下でハイブリダイズするＤＮＡをあげることができる。
（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡをあげることができ、
例えば、配列番号２または３で表される塩基配列を有す
るＤＮＡ、および、該ＤＮＡとストリンジェントな条件
下でハイブリダイズするＤＮＡをあげることができる。
【００１２】本発明のＤＮＡとストリンジェントな条件
下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、配列番号２また
は３で表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブとし
て、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・
ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイ
ブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤ
ＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク
由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７
〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼ
ーションを行った後、０．１倍〜２倍濃度のＳＳＣ溶液
（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナ
トリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる）を
用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより
同定できるＤＮＡをあげることができる。
下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、配列番号２また
は３で表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブとし
て、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・
ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイ
ブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤ
ＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク
由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７
〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼ
ーションを行った後、０．１倍〜２倍濃度のＳＳＣ溶液
（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナ
トリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる）を
用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより
同定できるＤＮＡをあげることができる。
【００１３】ハイブリダイゼーションは、モレキュラー
・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molec
ular Cloning, A laboratory manual)、第２版〔サンブ
ルック(Sambrook)、フリッチ(Fritsch) 、マニアチス(M
aniatis)編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー・プレス (Cold Spring Harbor LaboratoryPre
ss)、１９８９年刊、以下、モレキュラー・クローニン
グ 第２版と略す〕等に記載されている方法に準じて行
うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具
体的には、配列番号２および３で表される塩基配列から
選ばれる塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有
するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤ
ＮＡ、更に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮ
Ａをあげることができる。
・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molec
ular Cloning, A laboratory manual)、第２版〔サンブ
ルック(Sambrook)、フリッチ(Fritsch) 、マニアチス(M
aniatis)編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー・プレス (Cold Spring Harbor LaboratoryPre
ss)、１９８９年刊、以下、モレキュラー・クローニン
グ 第２版と略す〕等に記載されている方法に準じて行
うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具
体的には、配列番号２および３で表される塩基配列から
選ばれる塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有
するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤ
ＮＡ、更に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮ
Ａをあげることができる。
【００１４】本発明のＤＮＡは、グリオキシル酸とピル
ビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル
酸を生成する活性を有する微生物より取得することがで
きる。 該微生物として、例えばバチルス属に属する微
生物をあげることができ、具体的にはバチルス エスピ
ーＯＣ１８７株をあげることができる。バチルス エス
ピーＯＣ１８７株は本発明者らにより土壌より分離され
た菌株であって、ブダペスト条約に基づいて平成６年４
月１９日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４６４６として寄託されている。
ビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル
酸を生成する活性を有する微生物より取得することがで
きる。 該微生物として、例えばバチルス属に属する微
生物をあげることができ、具体的にはバチルス エスピ
ーＯＣ１８７株をあげることができる。バチルス エス
ピーＯＣ１８７株は本発明者らにより土壌より分離され
た菌株であって、ブダペスト条約に基づいて平成６年４
月１９日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４６４６として寄託されている。
【００１５】以下に、グリオキシル酸とピルビン酸とか
ら４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成す
る活性を有する微生物より４（Ｒ）ＫＡＬをコードする
ＤＮＡを取得する方法を記す。グリオキシル酸とピルビ
ン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
を生成する活性を有する微生物から、通常のＤＮＡ単離
法、例えばフェノール法〔Biochim. Biophys. Acta., 7
2, 619 (1963)〕により、該微生物の染色体ＤＮＡを調
製する。得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素により
切断し該制限酵素切断断片をベクターＤＮＡに組込むこ
とにより、該微生物染色体のＤＮＡライブラリーを構築
する。このＤＮＡライブラリーを用いて宿主微生物を形
質転換する。得られた形質転換体について、グリオキシ
ル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸を生成する活性を測定する。親株よりも該
活性の増強された形質転換体より目的とする遺伝子を含
むＤＮＡを得ることができる。
ら４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成す
る活性を有する微生物より４（Ｒ）ＫＡＬをコードする
ＤＮＡを取得する方法を記す。グリオキシル酸とピルビ
ン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
を生成する活性を有する微生物から、通常のＤＮＡ単離
法、例えばフェノール法〔Biochim. Biophys. Acta., 7
2, 619 (1963)〕により、該微生物の染色体ＤＮＡを調
製する。得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素により
切断し該制限酵素切断断片をベクターＤＮＡに組込むこ
とにより、該微生物染色体のＤＮＡライブラリーを構築
する。このＤＮＡライブラリーを用いて宿主微生物を形
質転換する。得られた形質転換体について、グリオキシ
ル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸を生成する活性を測定する。親株よりも該
活性の増強された形質転換体より目的とする遺伝子を含
むＤＮＡを得ることができる。
【００１６】この一連の操作は、公知のin vitro組換え
技法（モレキュラー・クローニング第２版）に準じて行
うことができる。グリオキシル酸とピルビン酸とから４
（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活
性を有する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーを構築す
るベクターＤＮＡとしては、大腸菌Ｋ１２株において自
律複製できるものであれば、ファージベクター、プラス
ミッドベクターなどいずれでも使用できる。具体的に
は、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies,
5, 58 (1992)〕、pBluescriptII SK(+)〔ヌクレイック
・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Research）, 1
7, 9494 (1989)〕、λｚａｐ II（ストラタジーン社
製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮＡ クローニン
グ、ア・プラクティカル・アプローチ（DNA Cloning,A
Practical Approach ）, 1, 49 (1985)〕、Lambda Blue
Mid（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ（ファル
マシア社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ （ファルマシア社
製）、ｐｃＤ２〔モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー（Mol.Cell. Biol.）, 3, 280 (1983)〕、ｐ
ＵＣ１８ 〔ジーン（Gene）, 33, 103 (1985)〕、ｐＳ
ＴＶ２９（宝酒造社製）等をあげることができる。
技法（モレキュラー・クローニング第２版）に準じて行
うことができる。グリオキシル酸とピルビン酸とから４
（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活
性を有する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーを構築す
るベクターＤＮＡとしては、大腸菌Ｋ１２株において自
律複製できるものであれば、ファージベクター、プラス
ミッドベクターなどいずれでも使用できる。具体的に
は、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies,
5, 58 (1992)〕、pBluescriptII SK(+)〔ヌクレイック
・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Research）, 1
7, 9494 (1989)〕、λｚａｐ II（ストラタジーン社
製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮＡ クローニン
グ、ア・プラクティカル・アプローチ（DNA Cloning,A
Practical Approach ）, 1, 49 (1985)〕、Lambda Blue
Mid（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ（ファル
マシア社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ （ファルマシア社
製）、ｐｃＤ２〔モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー（Mol.Cell. Biol.）, 3, 280 (1983)〕、ｐ
ＵＣ１８ 〔ジーン（Gene）, 33, 103 (1985)〕、ｐＳ
ＴＶ２９（宝酒造社製）等をあげることができる。
【００１７】宿主微生物としては、大腸菌に属する微生
物であればいずれでも用いることができる。具体的に
は、Escherichia coli XL1-Blue MRF'〔ストラタジーン
社製、Strategies, 5, 81 (1992)〕、Escherichia coli
C600〔ジェネティックス（Genetics）、39, 440 (195
4)〕、Escherichia coli Y1088〔Science, 222, 778 (1
983)〕 、Escherichia coli Y1090〔Science, 222, 778
(1983)〕、Escherichiacoli NM522 〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、1
66, 1 (1983)〕、Escherichia coli K802〔J. Mol. Bio
l., 16, 118 (1966)〕、Escherichia coli JM105、Esch
erichia coli ATCC33625等が用いられる。
物であればいずれでも用いることができる。具体的に
は、Escherichia coli XL1-Blue MRF'〔ストラタジーン
社製、Strategies, 5, 81 (1992)〕、Escherichia coli
C600〔ジェネティックス（Genetics）、39, 440 (195
4)〕、Escherichia coli Y1088〔Science, 222, 778 (1
983)〕 、Escherichia coli Y1090〔Science, 222, 778
(1983)〕、Escherichiacoli NM522 〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、1
66, 1 (1983)〕、Escherichia coli K802〔J. Mol. Bio
l., 16, 118 (1966)〕、Escherichia coli JM105、Esch
erichia coli ATCC33625等が用いられる。
【００１８】４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡ断片を
そのままあるいは適当な制限酵素などで切断後、常法に
よりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析
方法、例えばサンガー(Sanger)らのジデオキシ法〔Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕あるいは
３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー〔パーキン・エルマー
（Perkin Elmer）社製〕等の塩基配列分析装置を用いて
分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
そのままあるいは適当な制限酵素などで切断後、常法に
よりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析
方法、例えばサンガー(Sanger)らのジデオキシ法〔Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕あるいは
３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー〔パーキン・エルマー
（Perkin Elmer）社製〕等の塩基配列分析装置を用いて
分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００１９】このようにして決定された４（Ｒ）ＫＡＬ
をコードするＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号
２に示された塩基配列をあげることができる。決定され
たＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＤＮＡ合成機で化学合
成することにより、本発明のＤＮＡを調製することもで
きる。ＤＮＡ合成機としては、チオホスファイト法を利
用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミ
ダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合
成機ｍｏｄｅｌ３９２等をあげることができる。
をコードするＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号
２に示された塩基配列をあげることができる。決定され
たＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＤＮＡ合成機で化学合
成することにより、本発明のＤＮＡを調製することもで
きる。ＤＮＡ合成機としては、チオホスファイト法を利
用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミ
ダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合
成機ｍｏｄｅｌ３９２等をあげることができる。
【００２０】本発明の４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮ
Ａより４（Ｒ）ＫＡＬを宿主細胞中で発現させるため
に、モレキュラー・クローニング 第２版やカレント・
プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー
サプルメント１〜３４等に記載された方法等を用いるこ
とができる。即ち、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクタ
ーのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造
成し、それを宿主細胞に導入することにより、本発明の
４（Ｒ）ＫＡＬを発現する形質転換体を得ることができ
る。
Ａより４（Ｒ）ＫＡＬを宿主細胞中で発現させるため
に、モレキュラー・クローニング 第２版やカレント・
プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー
サプルメント１〜３４等に記載された方法等を用いるこ
とができる。即ち、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクタ
ーのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造
成し、それを宿主細胞に導入することにより、本発明の
４（Ｒ）ＫＡＬを発現する形質転換体を得ることができ
る。
【００２１】宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細
胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるもので
あればいずれも用いることができる。発現ベクターとし
ては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色
体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位
置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるもので
あればいずれも用いることができる。発現ベクターとし
ては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色
体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位
置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００２２】細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる
場合は、本発明のＤＮＡの発現ベクターは原核生物中で
自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソー
ム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成
されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺
伝子が含まれていてもよい。発現ベクターとしては、例
えば、pKK233-2（ファルマシア社）、pSE280（インビト
ロジェン社）、pGEMEX-1〔プロメガ(Promega)社〕、pQE
-8（キアゲン(QIAGEN)社）、ｐＫＹＰ１０( 特開昭５８
−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Agric.Biol. Che
m., 48, 669 (1984)〕、ｐＬＳＡ１〔Agric. Biol. Che
m., 53, 277(1989)〕、ｐＧＥＬ１〔Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript （STRAT
AGENE社）、ｐＴｒｓ３０〔Escherichia coli JM109/pT
rS30（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒ
ｓ３２〔Escherichia coli JM109/pTrS32（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Escherichi
a coli IGHA2（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）より調製〕、
ｐＧＫＡ２〔Escherichia coli IGKA2（ＦＥＲＭ ＢＰ
−６７９８）より調製〕、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２
２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、
ＵＳ５１６０７３５）、ｐＧＥＸ（Pharmacia社）、ｐ
ＥＴシステム（Novagen社）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＡＣＹ
Ｃ１８４、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＣＧ１、ｐ
ＣＳ１１６（特開平６−２７７０８２）等を例示するこ
とができる 。
場合は、本発明のＤＮＡの発現ベクターは原核生物中で
自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソー
ム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成
されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺
伝子が含まれていてもよい。発現ベクターとしては、例
えば、pKK233-2（ファルマシア社）、pSE280（インビト
ロジェン社）、pGEMEX-1〔プロメガ(Promega)社〕、pQE
-8（キアゲン(QIAGEN)社）、ｐＫＹＰ１０( 特開昭５８
−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Agric.Biol. Che
m., 48, 669 (1984)〕、ｐＬＳＡ１〔Agric. Biol. Che
m., 53, 277(1989)〕、ｐＧＥＬ１〔Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript （STRAT
AGENE社）、ｐＴｒｓ３０〔Escherichia coli JM109/pT
rS30（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒ
ｓ３２〔Escherichia coli JM109/pTrS32（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Escherichi
a coli IGHA2（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）より調製〕、
ｐＧＫＡ２〔Escherichia coli IGKA2（ＦＥＲＭ ＢＰ
−６７９８）より調製〕、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２
２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、
ＵＳ５１６０７３５）、ｐＧＥＸ（Pharmacia社）、ｐ
ＥＴシステム（Novagen社）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＡＣＹ
Ｃ１８４、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＣＧ１、ｐ
ＣＳ１１６（特開平６−２７７０８２）等を例示するこ
とができる 。
【００２３】プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細
胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター
（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーター等の、大
腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげること
ができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター
（Ｐtrp ｘ２）、tacプロモーター、T7プロモーター、P
letIプロモーターのように人為的に設計改変されたプロ
モーター等も用いることができる。
胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター
（Ｐlac）、PLプロモーター、PRプロモーター等の、大
腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげること
ができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター
（Ｐtrp ｘ２）、tacプロモーター、T7プロモーター、P
letIプロモーターのように人為的に設計改変されたプロ
モーター等も用いることができる。
【００２４】リボソーム結合配列としては、シャイン−
ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を
適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミ
ッドを用いることが好ましい。４（Ｒ）ＫＡＬをコード
するＤＮＡは４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡであれ
ばいずれも用いることができるが、該ＤＮＡの塩基配列
を宿主微生物での発現に最適なコドンとなるように、塩
基を置換して用いることにより高発現化が達成できる。
大腸菌を宿主として、発現に最適なコドンとなるように
塩基を置換した４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡの具
体例として、配列番号３で示される塩基配列等をあげる
ことができる。
ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を
適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミ
ッドを用いることが好ましい。４（Ｒ）ＫＡＬをコード
するＤＮＡは４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡであれ
ばいずれも用いることができるが、該ＤＮＡの塩基配列
を宿主微生物での発現に最適なコドンとなるように、塩
基を置換して用いることにより高発現化が達成できる。
大腸菌を宿主として、発現に最適なコドンとなるように
塩基を置換した４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤＮＡの具
体例として、配列番号３で示される塩基配列等をあげる
ことができる。
【００２５】本発明の組換えベクターにおいては、本発
明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要では
ないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置するこ
とが好ましい。本発明の４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤ
ＮＡを含むプラスミッドとしては、例えばｐＫＳＲ２２
２、ｐＫＳＲ３０３、ｐＫＳＲ３２１、ｐＫＳＲ８０３
等があげられる。ｐＫＳＲ３０３を含む大腸菌であるEs
cherichia coli NHK46/pKSR303は、平成９年８月１２日
付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城
県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）にＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６０５１として寄託されている。
明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要では
ないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置するこ
とが好ましい。本発明の４（Ｒ）ＫＡＬをコードするＤ
ＮＡを含むプラスミッドとしては、例えばｐＫＳＲ２２
２、ｐＫＳＲ３０３、ｐＫＳＲ３２１、ｐＫＳＲ８０３
等があげられる。ｐＫＳＲ３０３を含む大腸菌であるEs
cherichia coli NHK46/pKSR303は、平成９年８月１２日
付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城
県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）にＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６０５１として寄託されている。
【００２６】宿主細胞としては、エシェリヒア属、クレ
ブシエラ属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレ
ビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属等に
属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue 、
Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、E
scherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、E
scherichia coli W1485 、Escherichia coli JM109 、E
scherichia coli HB101、Escherichia coli No.49 、Es
cherichia coli W3110 、Escherichia coli NY49、Esch
erichia coli ATCC33625、Escherichia coli ATCC1130
3、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefacines、
Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacte
rium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium fla
vum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC1
3869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032 、Coryn
ebacterium acetoacidophilum ATCC13870 、Microbacte
rium ammoniaphilum ATCC15354、Klebsiela oxytoca AT
CC8724、Serratia marsecens ATCC13880等をあげること
ができる。
ブシエラ属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレ
ビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属等に
属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue 、
Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、E
scherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、E
scherichia coli W1485 、Escherichia coli JM109 、E
scherichia coli HB101、Escherichia coli No.49 、Es
cherichia coli W3110 、Escherichia coli NY49、Esch
erichia coli ATCC33625、Escherichia coli ATCC1130
3、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefacines、
Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacte
rium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium fla
vum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC1
3869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032 、Coryn
ebacterium acetoacidophilum ATCC13870 、Microbacte
rium ammoniaphilum ATCC15354、Klebsiela oxytoca AT
CC8724、Serratia marsecens ATCC13880等をあげること
ができる。
【００２７】組換えベクターの導入方法としては、上記
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、
プロトプラスト法（特開昭63-2483942）等をあげること
ができる。酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、
発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ATCC3711
5）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC3741
9）等を用いることができる。
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、
プロトプラスト法（特開昭63-2483942）等をあげること
ができる。酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、
発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ATCC3711
5）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、ＹＣｐ５０（ATCC3741
9）等を用いることができる。
【００２８】プロモーターとしては、酵母菌株中で発現
できるものであればいずれのものを用いてもよく、例え
ば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモー
ター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒー
トショックポリペプチドプロモーター 、MFα1 プロモ
ーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげる
ことができる。
できるものであればいずれのものを用いてもよく、例え
ば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモー
ター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒー
トショックポリペプチドプロモーター 、MFα1 プロモ
ーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターをあげる
ことができる。
【００２９】宿主細胞としては、サッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisae）、シゾサッカロミ
セス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュ
イベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ト
リコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulan
s）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces
alluvius）等をあげることができる。
ビシエ（Saccharomyces cerevisae）、シゾサッカロミ
セス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュ
イベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ト
リコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulan
s）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces
alluvius）等をあげることができる。
【００３０】組換えベクターの導入方法としては、酵母
にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが
でき、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. E
nzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 1929 (1978)〕、酢酸リ
チウム法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. B
acteriol.）、153, 163 (1983)〕等をあげることができ
る。
にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが
でき、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. E
nzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 1929 (1978)〕、酢酸リ
チウム法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. B
acteriol.）、153, 163 (1983)〕等をあげることができ
る。
【００３１】動物細胞を宿主として用いる場合には、発
現ベクターとして、例えば、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-
22979 ；サイトテクノロジー（Cytotechnology）、3, 1
33,(1990)〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐＣ
ＤＭ８〔ネイチャー（Nature）、329, 840, (1987)〕、
ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲ
ＥＰ４（インビトロジェ ン社製）ｐＡＧＥ１０３〔J.
Biochem., 101, 1307(1987)〕、ｐＡＧＥ２１０等が用
いられる。
現ベクターとして、例えば、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-
22979 ；サイトテクノロジー（Cytotechnology）、3, 1
33,(1990)〕、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）、ｐＣ
ＤＭ８〔ネイチャー（Nature）、329, 840, (1987)〕、
ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲ
ＥＰ４（インビトロジェ ン社製）ｐＡＧＥ１０３〔J.
Biochem., 101, 1307(1987)〕、ｐＡＧＥ２１０等が用
いられる。
【００３２】プロモーターとしては、動物細胞中で発現
できるものであればいずれも用いることができ、例え
ば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（imme
diateearly）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プ
ロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター等
をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子
のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
できるものであればいずれも用いることができ、例え
ば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（imme
diateearly）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プ
ロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター等
をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子
のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００３３】宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマ
ルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、
チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、Ｈ
ＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることが
できる。組換えベクターの導入方法としては、動物細胞
にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが
でき、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechno
logy, 3, 133 (1990)〕、リン 酸カルシウム法（特開平
2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができ
る。
ルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、
チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、Ｈ
ＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることが
できる。組換えベクターの導入方法としては、動物細胞
にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが
でき、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechno
logy, 3, 133 (1990)〕、リン 酸カルシウム法（特開平
2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができ
る。
【００３４】昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例
えばバキュロウイルス・イクスプレッション・ベクター
ズ ア・ラボラトリー・マニュアル（Baculovirus Expre
ssion Vectors, A Laboratory Manual）、カレント・プ
ロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サ
プルメント1-３４、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に
記載された方法によって、４（Ｒ）ＫＡＬを発現するこ
とができる。
えばバキュロウイルス・イクスプレッション・ベクター
ズ ア・ラボラトリー・マニュアル（Baculovirus Expre
ssion Vectors, A Laboratory Manual）、カレント・プ
ロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サ
プルメント1-３４、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に
記載された方法によって、４（Ｒ）ＫＡＬを発現するこ
とができる。
【００３５】即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバ
キュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上
清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルス
を昆虫細胞に感染させ、４（Ｒ）ＫＡＬを発現させるこ
とができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベク
ターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９
３ 、ｐＢｌｕｅＢａｃIII （ともにインビトロジェン
社製）等をあげることができる。
キュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上
清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルス
を昆虫細胞に感染させ、４（Ｒ）ＫＡＬを発現させるこ
とができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベク
ターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９
３ 、ｐＢｌｕｅＢａｃIII （ともにインビトロジェン
社製）等をあげることができる。
【００３６】バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗
蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カ
リフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス
(Autographa californica nuclear polyhedrosis viru
s) などを用いることができる。昆虫細胞としては、Spo
doptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２
１〔バキュロウイルス・ エクスプレッション・ベクター
ズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイ
チ・フリーマン・アンド・カンパニー（W.H.Freeman an
d Company）、ニューヨーク（New York）、(1992)〕、T
richoplusia niの卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５（インビ
トロジェン社製）等を用いることができる。
蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カ
リフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス
(Autographa californica nuclear polyhedrosis viru
s) などを用いることができる。昆虫細胞としては、Spo
doptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２
１〔バキュロウイルス・ エクスプレッション・ベクター
ズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイ
チ・フリーマン・アンド・カンパニー（W.H.Freeman an
d Company）、ニューヨーク（New York）、(1992)〕、T
richoplusia niの卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５（インビ
トロジェン社製）等を用いることができる。
【００３７】組換えウイルスを調製するための、昆虫細
胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウ
イルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウ
ム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 84,7413 (1987)〕等をあげるこ
とができる。遺伝子の発現方法としては、直接発現以外
に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されてい
る方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を
おこなうことができる。
胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウ
イルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウ
ム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 84,7413 (1987)〕等をあげるこ
とができる。遺伝子の発現方法としては、直接発現以外
に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されてい
る方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を
おこなうことができる。
【００３８】以上のようにして得られる形質転換体を培
地に培養し、培養物中に本発明の４（Ｒ）ＫＡＬを生成
蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明の
４（Ｒ）ＫＡＬを製造することができる。本発明の形質
転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられ
る通常の方法に従って行うことができる。大腸菌等の原
核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた
形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得
る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の
培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地
のいずれを用いてもよい。
地に培養し、培養物中に本発明の４（Ｒ）ＫＡＬを生成
蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明の
４（Ｒ）ＫＡＬを製造することができる。本発明の形質
転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられ
る通常の方法に従って行うことができる。大腸菌等の原
核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた
形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得
る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の
培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地
のいずれを用いてもよい。
【００３９】炭素源としては、該生物が資化し得るもの
であればよく、グルコース、フラクトース、スクロー
ス、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン
加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機
酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を
用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩
化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のア
ンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カ
ゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各
種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができ
る。
であればよく、グルコース、フラクトース、スクロー
ス、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン
加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機
酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を
用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩
化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のア
ンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カ
ゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各
種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができ
る。
【００４０】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養
は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的
条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時
間は、通常１０〜９６時間である。培養中ｐＨは３．０
〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の
酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア
などを用いて行う。
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養
は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的
条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時
間は、通常１０〜９６時間である。培養中ｐＨは３．０
〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の
酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア
などを用いて行う。
【００４１】また、培養中必要に応じて、アンピシリン
やテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた
発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときに
は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよ
い。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクター
で形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモ
ーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培
養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加し
てもよい。
やテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた
発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときに
は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよ
い。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクター
で形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモ
ーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培
養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加し
てもよい。
【００４２】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭ
Ｉ１６４０培地、EagleのＭＥＭ培地またはこれら培地
に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができ
る。培養は、通常５％ＣＯ2存在下等の条件下で行う。
培養温度は３５〜３７℃がよく、培養時間は、通常３〜
７日間である。
を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭ
Ｉ１６４０培地、EagleのＭＥＭ培地またはこれら培地
に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができ
る。培養は、通常５％ＣＯ2存在下等の条件下で行う。
培養温度は３５〜３７℃がよく、培養時間は、通常３〜
７日間である。
【００４３】また、培養中必要に応じて、カナマイシ
ン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培
地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地
〔ファーミンジェン（Pharmingen）社製〕、Sf-900 II
SFM培地（ギブコＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００ 、
ＥｘＣｅｌｌ４０５ 〔いずれもＪＲＨバイオサイエン
シーズ（JRH Biosciences）社製〕等を用いることがで
きる。
ン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培
地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地
〔ファーミンジェン（Pharmingen）社製〕、Sf-900 II
SFM培地（ギブコＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００ 、
ＥｘＣｅｌｌ４０５ 〔いずれもＪＲＨバイオサイエン
シーズ（JRH Biosciences）社製〕等を用いることがで
きる。
【００４４】培養温度は２５〜３０℃がよく、培養時間
は、通常１〜４日間である。また、培養中必要に応じ
て、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。上記形質転換体の培養液から、上記方法により発現
させた４（Ｒ）ＫＡＬを単離精製するためには、通常の
酵素の単離、精製法を用いればよい。
は、通常１〜４日間である。また、培養中必要に応じ
て、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。上記形質転換体の培養液から、上記方法により発現
させた４（Ｒ）ＫＡＬを単離精製するためには、通常の
酵素の単離、精製法を用いればよい。
【００４５】例えば、本発明の４（Ｒ）ＫＡＬが、細胞
内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を
遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破
砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザ
ー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を
得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られ
た上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出
法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿
法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロー
ス、DIAION HPA-75（三菱化成社製）等レジンを用いた
陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF
（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換
クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニル
セファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフ
ィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティーク
ロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電
点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み
合わせて用い、精製標品を得ることができる。
内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を
遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破
砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザ
ー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を
得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られ
た上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出
法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿
法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロー
ス、DIAION HPA-75（三菱化成社製）等レジンを用いた
陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF
（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換
クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニル
セファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフ
ィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティーク
ロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電
点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み
合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００４６】また、該４（Ｒ）ＫＡＬが細胞内に不溶体
を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕
し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、
通常の方法により該４（Ｒ）ＫＡＬを回収後、該４
（Ｒ）ＫＡＬの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化す
る。該可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないある
いはポリペプチド変性剤の濃度が４（Ｒ）ＫＡＬが変性
しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該４
（Ｒ）ＫＡＬを正常な立体構造に構成させた後、上記と
同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕
し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、
通常の方法により該４（Ｒ）ＫＡＬを回収後、該４
（Ｒ）ＫＡＬの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化す
る。該可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないある
いはポリペプチド変性剤の濃度が４（Ｒ）ＫＡＬが変性
しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該４
（Ｒ）ＫＡＬを正常な立体構造に構成させた後、上記と
同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
【００４７】本発明の４（Ｒ）ＫＡＬが細胞外に分泌さ
れた場合には、培養上清に該４（Ｒ）ＫＡＬを回収する
ことができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離
等の手法により処理することにより可溶性画分を取得
し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用い
ることにより、精製標品を得ることができる。
れた場合には、培養上清に該４（Ｒ）ＫＡＬを回収する
ことができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離
等の手法により処理することにより可溶性画分を取得
し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用い
ることにより、精製標品を得ることができる。
【００４８】また、上記方法により発現させた４（Ｒ）
ＫＡＬを、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカル
ボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル
法）等の化学合成法によっても製造することができる。
また、桑和貿易（米国Advanced ChemTech社製）、パー
キンエルマー ジャパン（米国Perkin-Elmer社製）、フ
ァルマシア バイオテク（スウェーデンPharmaciaBiotec
h社製）、アロカ（米国Protein TechnologyInstrument
社製）、クラボウ（米国Synthecell-Vega社製）、日本
パーセプティブ・リミテッド（米国PerSeptive社製），
島津製作所等のペプチド合成機を利用し合成することも
できる。
ＫＡＬを、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカル
ボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル
法）等の化学合成法によっても製造することができる。
また、桑和貿易（米国Advanced ChemTech社製）、パー
キンエルマー ジャパン（米国Perkin-Elmer社製）、フ
ァルマシア バイオテク（スウェーデンPharmaciaBiotec
h社製）、アロカ（米国Protein TechnologyInstrument
社製）、クラボウ（米国Synthecell-Vega社製）、日本
パーセプティブ・リミテッド（米国PerSeptive社製），
島津製作所等のペプチド合成機を利用し合成することも
できる。
【００４９】上記で取得した形質転換体由来であり、か
つグリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）ＫＨＧを
生成する活性を有する生体触媒Ｉ、ピルビン酸およびグ
リオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水
性媒体中に４（Ｒ）ＫＨＧを生成させ、生成した４
（Ｒ）ＫＨＧを該水性媒体中より採取することにより４
（Ｒ）ＫＨＧを製造することができる。
つグリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｒ）ＫＨＧを
生成する活性を有する生体触媒Ｉ、ピルビン酸およびグ
リオキシル酸を水性媒体中に存在させることにより、水
性媒体中に４（Ｒ）ＫＨＧを生成させ、生成した４
（Ｒ）ＫＨＧを該水性媒体中より採取することにより４
（Ｒ）ＫＨＧを製造することができる。
【００５０】生体触媒Ｉとしては、上記で取得した形質
転換体の培養物、細胞、細胞処理物のいずれも用いるこ
とができる。細胞処理物としては、細胞の乾燥物、凍結
乾燥物、界面活性剤または有機溶剤処理物、酵素処理
物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、細胞の蛋白質分
画〔４（Ｒ）ＫＡＬの粗酵素または精製酵素〕、細胞お
よび細胞処理物の固定化物等をあげることができる。
転換体の培養物、細胞、細胞処理物のいずれも用いるこ
とができる。細胞処理物としては、細胞の乾燥物、凍結
乾燥物、界面活性剤または有機溶剤処理物、酵素処理
物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、細胞の蛋白質分
画〔４（Ｒ）ＫＡＬの粗酵素または精製酵素〕、細胞お
よび細胞処理物の固定化物等をあげることができる。
【００５１】生体触媒Ｉ濃度は、湿菌体重量換算で０．
１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌであ
る。
１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌであ
る。
【００５２】水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸
塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝
液、ならびに、メタノール、エタノールなどのアルコー
ル類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケ
トン類、アセトアミド等のアミド類などの有機溶媒を含
有した水性溶液があげられる。また必要に応じてトリト
ンＸ−１００（ナカライテスク社製）やノニオンＨＳ２
０４（日本油脂社製）などの界面活性剤あるいはトルエ
ンやキシレンのような有機溶媒を０．１〜２０ｇ／ｌ程
度添加してもよい。
塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝
液、ならびに、メタノール、エタノールなどのアルコー
ル類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケ
トン類、アセトアミド等のアミド類などの有機溶媒を含
有した水性溶液があげられる。また必要に応じてトリト
ンＸ−１００（ナカライテスク社製）やノニオンＨＳ２
０４（日本油脂社製）などの界面活性剤あるいはトルエ
ンやキシレンのような有機溶媒を０．１〜２０ｇ／ｌ程
度添加してもよい。
【００５３】ピルビン酸およびグリオキシル酸の濃度
は、１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは２０〜２００ｇ／ｌ
である。生体触媒Ｉによりピルビン酸に転換され得る化
合物をピルビン酸の代替として用いることもできる。該
化合物として、グルコース、フラクトース、シュークロ
ース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの
糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸等をあげ
ることができる。
は、１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは２０〜２００ｇ／ｌ
である。生体触媒Ｉによりピルビン酸に転換され得る化
合物をピルビン酸の代替として用いることもできる。該
化合物として、グルコース、フラクトース、シュークロ
ース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの
糖類や、酢酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸等をあげ
ることができる。
【００５４】水性媒体に、生体触媒Ｉ、ピルビン酸およ
びグリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜８０
℃、好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましく
はｐＨ５〜９の条件下で、０．５〜９６時間反応させ、
４（Ｒ）ＫＨＧを製造することができる。生体触媒Ｉと
して用いられる細胞の培養初発または途中に、ピルビン
酸およびグリオキシル酸を上記濃度添加し、４（Ｒ）Ｋ
ＨＧを製造することもできる。その際、ピルビン酸また
は該組換え株によってピルビン酸に転換される化合物
は、予め培養基質として添加しておいてもよいし、グリ
オキシル酸とともに添加してもよい。
びグリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜８０
℃、好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましく
はｐＨ５〜９の条件下で、０．５〜９６時間反応させ、
４（Ｒ）ＫＨＧを製造することができる。生体触媒Ｉと
して用いられる細胞の培養初発または途中に、ピルビン
酸およびグリオキシル酸を上記濃度添加し、４（Ｒ）Ｋ
ＨＧを製造することもできる。その際、ピルビン酸また
は該組換え株によってピルビン酸に転換される化合物
は、予め培養基質として添加しておいてもよいし、グリ
オキシル酸とともに添加してもよい。
【００５５】また、生体触媒Ｉが、上記記載の形質転換
体であって、更に、１）グリオキシル酸とピルビン酸と
から４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成
する能力を有しない、２）リポ酸に対する栄養要求性を
有する、および３）リンゴ酸シンターゼ活性の低いある
いは有しないという性質の中から選ばれる１つ以上の性
質を有する形質転換体由来のものが、４（Ｒ）ＫＨＧの
製造には好ましい。このような形質転換体の微生物とし
ては、例えば、エシェリヒア コリＫ−１２系統の亜株
ＮＨＫ４０〔リポ酸要求性（ｌｉｐ）、４ＫＡＬ欠損
（ｅｄａ）〕、コリネバクテリウム グルタミクムＡＴ
ＣＣ１３０３２株等をあげることができる。エシェリヒ
ア コリＮＨＫ４０株は、ブダペスト条約に基づいて平
成９年４月１６日付で工業技術院生命工学工業技術研究
所にＦＥＲＭ ＢＰ−５９１９として寄託されている。
体であって、更に、１）グリオキシル酸とピルビン酸と
から４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成
する能力を有しない、２）リポ酸に対する栄養要求性を
有する、および３）リンゴ酸シンターゼ活性の低いある
いは有しないという性質の中から選ばれる１つ以上の性
質を有する形質転換体由来のものが、４（Ｒ）ＫＨＧの
製造には好ましい。このような形質転換体の微生物とし
ては、例えば、エシェリヒア コリＫ−１２系統の亜株
ＮＨＫ４０〔リポ酸要求性（ｌｉｐ）、４ＫＡＬ欠損
（ｅｄａ）〕、コリネバクテリウム グルタミクムＡＴ
ＣＣ１３０３２株等をあげることができる。エシェリヒ
ア コリＮＨＫ４０株は、ブダペスト条約に基づいて平
成９年４月１６日付で工業技術院生命工学工業技術研究
所にＦＥＲＭ ＢＰ−５９１９として寄託されている。
【００５６】上記製造法により製造された４（Ｒ）ＫＨ
Ｇは、通常用いられる有機酸の精製法を用いて単離する
ことができる。該精製法として、例えば、遠心分離によ
り固形物を除いた反応上清から、イオン交換樹脂や膜処
理法などの操作を組み合わせて、４（Ｒ）ＫＨＧを単離
することができる。上記記載の形質転換体、アミノ基供
与体、糖質およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在さ
せることにより、水性媒体中に４（Ｒ）ＨＧを生成さ
せ、生成した４（Ｒ）ＨＧを該水性媒体中より採取する
ことにより４（Ｒ）ＨＧを製造することができる。
Ｇは、通常用いられる有機酸の精製法を用いて単離する
ことができる。該精製法として、例えば、遠心分離によ
り固形物を除いた反応上清から、イオン交換樹脂や膜処
理法などの操作を組み合わせて、４（Ｒ）ＫＨＧを単離
することができる。上記記載の形質転換体、アミノ基供
与体、糖質およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在さ
せることにより、水性媒体中に４（Ｒ）ＨＧを生成さ
せ、生成した４（Ｒ）ＨＧを該水性媒体中より採取する
ことにより４（Ｒ）ＨＧを製造することができる。
【００５７】形質転換体の濃度は、湿菌体重量換算で
０．１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌで
ある。水性媒体としては、上記４（Ｒ）ＫＨＧの製造法
において記載の水性媒体を用いることができる。アミノ
基供与体としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、尿素などの無機アンモニウム塩または
グルタミン酸をはじめとする各種アミノ酸などをあげる
ことができる。アミノ基供与体の濃度は０．１〜１００
ｇ／ｌ、好ましくは１〜５０ｇ／ｌである。
０．１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌで
ある。水性媒体としては、上記４（Ｒ）ＫＨＧの製造法
において記載の水性媒体を用いることができる。アミノ
基供与体としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、尿素などの無機アンモニウム塩または
グルタミン酸をはじめとする各種アミノ酸などをあげる
ことができる。アミノ基供与体の濃度は０．１〜１００
ｇ／ｌ、好ましくは１〜５０ｇ／ｌである。
【００５８】糖質としては、上記形質転換体が資化しう
るものであればよく、グルコース、フラクトース、シュ
ークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜
などを用いることができる。糖質およびグリオキシル酸
の濃度は、１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは１０〜２００
ｇ／ｌである。
るものであればよく、グルコース、フラクトース、シュ
ークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜
などを用いることができる。糖質およびグリオキシル酸
の濃度は、１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは１０〜２００
ｇ／ｌである。
【００５９】水性媒体に、上記形質転換体、糖質および
グリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、
好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐ
Ｈ５〜９の条件下で、０．５〜９６時間反応させ、４
（Ｒ）ＨＧを製造することができる。
グリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、
好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐ
Ｈ５〜９の条件下で、０．５〜９６時間反応させ、４
（Ｒ）ＨＧを製造することができる。
【００６０】上記形質転換体の培養初発または途中に、
グリオキシル酸を上記濃度添加し、４（Ｒ）ＨＧを製造
することもできる。また、上記記載の形質転換体が、更
に、１）グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｓ）−
ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有し
ない、２）リポ酸に対する栄養要求性を有する、３）リ
ンゴ酸シンターゼ活性の低いあるいは有しない、および
４）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を
有しないという性質の中から選ばれる１つ以上の性質を
有する形質転換体由来のものが、４（Ｒ）ＨＧの製造に
は好ましい。このような形質転換体の微生物としては、
例えば、エシェリヒア コリＫ−１２系統の亜株ＮＨＫ
４０〔リポ酸要求性（ｌｉｐ）、４ＫＡＬ欠損（ｅｄ
ａ）〕、コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１
３０３２株、エシェリヒア コリＫ−１２系統の亜株Ｎ
ＨＫ４６株〔ｌｉｐ，ｅｄａ，リンゴ酸シンターゼ欠損
（ｇｌｃ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼ欠損（ｐｐｃ）〕等をあげることができる。エシェリ
ヒア コリＮＨＫ４６株は、ブダペスト条約に基づいて
平成９年４月１６日付で工業技術院生命工学工業技術研
究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５９２０として寄託されてい
る。
グリオキシル酸を上記濃度添加し、４（Ｒ）ＨＧを製造
することもできる。また、上記記載の形質転換体が、更
に、１）グリオキシル酸とピルビン酸とから４（Ｓ）−
ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有し
ない、２）リポ酸に対する栄養要求性を有する、３）リ
ンゴ酸シンターゼ活性の低いあるいは有しない、および
４）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を
有しないという性質の中から選ばれる１つ以上の性質を
有する形質転換体由来のものが、４（Ｒ）ＨＧの製造に
は好ましい。このような形質転換体の微生物としては、
例えば、エシェリヒア コリＫ−１２系統の亜株ＮＨＫ
４０〔リポ酸要求性（ｌｉｐ）、４ＫＡＬ欠損（ｅｄ
ａ）〕、コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１
３０３２株、エシェリヒア コリＫ−１２系統の亜株Ｎ
ＨＫ４６株〔ｌｉｐ，ｅｄａ，リンゴ酸シンターゼ欠損
（ｇｌｃ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼ欠損（ｐｐｃ）〕等をあげることができる。エシェリ
ヒア コリＮＨＫ４６株は、ブダペスト条約に基づいて
平成９年４月１６日付で工業技術院生命工学工業技術研
究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５９２０として寄託されてい
る。
【００６１】上記記載の形質転換体、アミノ基供与体、
糖質およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させるこ
とにより、水性媒体中に４（Ｒ）ＨＹＰを生成させ、生
成した４（Ｒ）ＨＹＰを該水性媒体中より採取すること
により４（Ｒ）ＨＹＰを製造することができる。形質転
換体の濃度は、湿菌体重量換算で０．１〜２００ｇ／
ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌである。
糖質およびグリオキシル酸を水性媒体中に存在させるこ
とにより、水性媒体中に４（Ｒ）ＨＹＰを生成させ、生
成した４（Ｒ）ＨＹＰを該水性媒体中より採取すること
により４（Ｒ）ＨＹＰを製造することができる。形質転
換体の濃度は、湿菌体重量換算で０．１〜２００ｇ／
ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌである。
【００６２】水性媒体としては、上記４（Ｒ）ＫＨＧの
製造法において記載の水性媒体を用いることができる。
アミノ基供与体としては、アンモニア、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、尿素などの無機アンモニウム塩
またはグルタミン酸をはじめとする各種アミノ酸などを
あげることができる。アミノ基供与体の濃度は０．１〜
１００ｇ／ｌ、好ましくは１〜５０ｇ／ｌである。
製造法において記載の水性媒体を用いることができる。
アミノ基供与体としては、アンモニア、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、尿素などの無機アンモニウム塩
またはグルタミン酸をはじめとする各種アミノ酸などを
あげることができる。アミノ基供与体の濃度は０．１〜
１００ｇ／ｌ、好ましくは１〜５０ｇ／ｌである。
【００６３】糖質としては、上記形質転換体が資化しう
るものであればよく、グルコース、フラクトース、シュ
ークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜
などを用いることができる。糖質およびグリオキシル酸
の濃度は、１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは１０〜２００
ｇ／ｌである。
るものであればよく、グルコース、フラクトース、シュ
ークロース、マルトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜
などを用いることができる。糖質およびグリオキシル酸
の濃度は、１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは１０〜２００
ｇ／ｌである。
【００６４】水性媒体に、上記形質転換体、糖質および
グリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、
好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐ
Ｈ５〜９の条件下で、０．５〜９６時間反応させ、４
（Ｒ）ＨＹＰを製造することができる。また、上記形質
転換体の培養初発または途中に、グリオキシル酸を上記
濃度添加し、４（Ｒ）ＨＹＰを製造することもできる。
グリオキシル酸を上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、
好ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐ
Ｈ５〜９の条件下で、０．５〜９６時間反応させ、４
（Ｒ）ＨＹＰを製造することができる。また、上記形質
転換体の培養初発または途中に、グリオキシル酸を上記
濃度添加し、４（Ｒ）ＨＹＰを製造することもできる。
【００６５】４（Ｒ）ＨＹＰの製造において、上記記載
の形質転換体が、更に、１）グリオキシル酸とピルビン
酸とから４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を
生成する能力を有しない、２）リポ酸に対する栄養要求
性を有する、３）リンゴ酸シンターゼ活性の低いあるい
は有しない、および４）ホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼ活性を有しない５）アゼチジン−２−カル
ボン酸や３，４−デヒドロプロリン、チオプロリン等の
プロリンアナログに耐性を有するという性質の中から選
ばれる１つ以上の性質を有する形質転換体であることが
好ましい。このような形質転換体の微生物として、例え
ば、エシェリヒア コリＫ−１２系統の亜株ＮＨＫ４０
〔リポ酸要求性（ｌｉｐ）、４ＫＡＬ欠損（ｅｄ
ａ）〕、コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１
３０３２株、エシェリヒア コリＫ−１２系統の亜株Ｎ
ＨＫ４６株〔ｌｉｐ，ｅｄａ，リンゴ酸シンターゼ欠損
（ｇｌｃ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼ欠損（ｐｐｃ）〕、ＮＨＫ４７株〔ｌｉｐ，ｅｄａ，
ｇｌｃ，ｐｐｃ，アゼチジン−２−カルボン酸耐性〕等
をあげることができる。エシェリヒア コリＮＨＫ４７
株は、ブダペスト条約に基づいて平成９年４月１６日付
で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−
５９２１として寄託されている。
の形質転換体が、更に、１）グリオキシル酸とピルビン
酸とから４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を
生成する能力を有しない、２）リポ酸に対する栄養要求
性を有する、３）リンゴ酸シンターゼ活性の低いあるい
は有しない、および４）ホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼ活性を有しない５）アゼチジン−２−カル
ボン酸や３，４−デヒドロプロリン、チオプロリン等の
プロリンアナログに耐性を有するという性質の中から選
ばれる１つ以上の性質を有する形質転換体であることが
好ましい。このような形質転換体の微生物として、例え
ば、エシェリヒア コリＫ−１２系統の亜株ＮＨＫ４０
〔リポ酸要求性（ｌｉｐ）、４ＫＡＬ欠損（ｅｄ
ａ）〕、コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１
３０３２株、エシェリヒア コリＫ−１２系統の亜株Ｎ
ＨＫ４６株〔ｌｉｐ，ｅｄａ，リンゴ酸シンターゼ欠損
（ｇｌｃ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼ欠損（ｐｐｃ）〕、ＮＨＫ４７株〔ｌｉｐ，ｅｄａ，
ｇｌｃ，ｐｐｃ，アゼチジン−２−カルボン酸耐性〕等
をあげることができる。エシェリヒア コリＮＨＫ４７
株は、ブダペスト条約に基づいて平成９年４月１６日付
で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−
５９２１として寄託されている。
【００６６】上記のような各種欠損株や耐性株は、親株
に通常の変異操作、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤処理、
ＵＶ照射、γ線照射等を施した後、適当な寒天平板培地
に塗布し、生育した変異株を取得し、目的とする酵素活
性が親株に比べて欠損あるいは低下した菌株や親株より
アナログに耐性な菌株を選択することによって得ること
ができる。またエシェリヒア コリＫ−１２系統の菌株
においては、目的とする欠損または耐性変異を有する別
の菌株から所望の菌株にＰ１ファージなどを用いて欠損
変異を移すこと（形質導入）によっても各種欠損変異株
や耐性変異株を得ることができる。
に通常の変異操作、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤処理、
ＵＶ照射、γ線照射等を施した後、適当な寒天平板培地
に塗布し、生育した変異株を取得し、目的とする酵素活
性が親株に比べて欠損あるいは低下した菌株や親株より
アナログに耐性な菌株を選択することによって得ること
ができる。またエシェリヒア コリＫ−１２系統の菌株
においては、目的とする欠損または耐性変異を有する別
の菌株から所望の菌株にＰ１ファージなどを用いて欠損
変異を移すこと（形質導入）によっても各種欠損変異株
や耐性変異株を得ることができる。
【００６７】４（Ｒ）ＨＹＰの製造法としては更に、ア
ミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）ＨＹＰ
に変換する活性を有する生体触媒II、アミノ基供与体お
よび４（Ｒ）ＫＨＧを水性媒体中に存在させることによ
り、水性媒体中に４（Ｒ）ＨＹＰを生成させ、生成した
４（Ｒ）ＨＹＰを該水性媒体中より採取することにより
４（Ｒ）ＨＹＰを製造する方法をあげることができる。
ミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）ＨＹＰ
に変換する活性を有する生体触媒II、アミノ基供与体お
よび４（Ｒ）ＫＨＧを水性媒体中に存在させることによ
り、水性媒体中に４（Ｒ）ＨＹＰを生成させ、生成した
４（Ｒ）ＨＹＰを該水性媒体中より採取することにより
４（Ｒ）ＨＹＰを製造する方法をあげることができる。
【００６８】生体触媒IIとしては、アミノ基供与体およ
び４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）ＨＹＰに変換する活性を
有する微生物の培養物、菌体、菌体処理物のいずれも用
いることができる。
び４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）ＨＹＰに変換する活性を
有する微生物の培養物、菌体、菌体処理物のいずれも用
いることができる。
【００６９】アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから
４（Ｒ）ＨＹＰに変換する活性を有する微生物として、
例えばエシェリヒア(Escherichia)属、コリネバクテリ
ウム(Corynebacterium)属等に属する微生物があげられ
る。具体的には、大腸菌由来でプロリンによるフィード
バック阻害が緩和された変異型ＰｒｏＢＡ遺伝子を含む
プラスミドｐＫＳＲ１９を導入したエシェリヒア コリ
(Escherichia coli)Ｋ−１２株系統のＡＴＣＣ３３６２
５株（ＡＴＣＣ３３６２５／ｐＫＳＲ１９）、コリネバ
クテリウム アセトアシドフィラム(Corynebacterium a
cetoacidophilum)ＦＥＲＭ Ｐ−４９６２株等をあげる
ことができる。より好ましくは、グルタミン酸の要求性
を有する変異株をあげることができる。そのような変異
株は、親株に通常の変異操作、例えばＮ−メチル−Ｎ’
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変
異剤処理、ＵＶ照射、γ線照射等を施した後、適当な寒
天平板培地に塗布し、生育した変異株を取得し、生育に
グルタミン酸を要求する菌株を選択することによって得
ることができる。またエシェリヒア コリＫ−１２系統
の菌株においては、形質導入によっても欠損変異株を得
ることができる。このような微生物としてエシェリヒア
コリ(Escherichia coli)Ｋ−１２株系統のＡＴＣＣ３
３６２５にイソクエン酸デヒドロゲナーゼの欠損変異
（ｉｃｄ）を付与したＮＨＫ３株にｐＫＳＲ１９を導入
したＮＨＫ３／ｐＫＳＲ１９株やｐＫＳＲ１９に大腸菌
由来のＰｒｏＣ遺伝子を連結したｐＫＳＲ２１を導入し
たＮＨＫ３／ｐＫＳＲ２１株、さらにグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼとグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼを含むプラスミドｐＫＳＲ５０をも導入したＮＨＫ３
／ｐＫＳＲ２１＋ｐＫＳＲ５０株があげられる。またグ
ルタミン酸の要求性に加え、アゼチジン−２−カルボン
酸、３，４−デヒドロプロリンやチオプロリンなどプロ
リンアナログに耐性となった宿主微生物を用いると一層
有利である。
４（Ｒ）ＨＹＰに変換する活性を有する微生物として、
例えばエシェリヒア(Escherichia)属、コリネバクテリ
ウム(Corynebacterium)属等に属する微生物があげられ
る。具体的には、大腸菌由来でプロリンによるフィード
バック阻害が緩和された変異型ＰｒｏＢＡ遺伝子を含む
プラスミドｐＫＳＲ１９を導入したエシェリヒア コリ
(Escherichia coli)Ｋ−１２株系統のＡＴＣＣ３３６２
５株（ＡＴＣＣ３３６２５／ｐＫＳＲ１９）、コリネバ
クテリウム アセトアシドフィラム(Corynebacterium a
cetoacidophilum)ＦＥＲＭ Ｐ−４９６２株等をあげる
ことができる。より好ましくは、グルタミン酸の要求性
を有する変異株をあげることができる。そのような変異
株は、親株に通常の変異操作、例えばＮ−メチル−Ｎ’
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変
異剤処理、ＵＶ照射、γ線照射等を施した後、適当な寒
天平板培地に塗布し、生育した変異株を取得し、生育に
グルタミン酸を要求する菌株を選択することによって得
ることができる。またエシェリヒア コリＫ−１２系統
の菌株においては、形質導入によっても欠損変異株を得
ることができる。このような微生物としてエシェリヒア
コリ(Escherichia coli)Ｋ−１２株系統のＡＴＣＣ３
３６２５にイソクエン酸デヒドロゲナーゼの欠損変異
（ｉｃｄ）を付与したＮＨＫ３株にｐＫＳＲ１９を導入
したＮＨＫ３／ｐＫＳＲ１９株やｐＫＳＲ１９に大腸菌
由来のＰｒｏＣ遺伝子を連結したｐＫＳＲ２１を導入し
たＮＨＫ３／ｐＫＳＲ２１株、さらにグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼとグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼを含むプラスミドｐＫＳＲ５０をも導入したＮＨＫ３
／ｐＫＳＲ２１＋ｐＫＳＲ５０株があげられる。またグ
ルタミン酸の要求性に加え、アゼチジン−２−カルボン
酸、３，４−デヒドロプロリンやチオプロリンなどプロ
リンアナログに耐性となった宿主微生物を用いると一層
有利である。
【００７０】そのような微生物は、上記のように親株に
変異操作や形質導入を施すことによって得られるほか、
プロリンアナログ耐性遺伝子を含むプラスミドを導入す
ることによっても得ることができる。具体的にはエシェ
リヒア コリＮＨＫ２３／ｐＫＳＲ２１＋ｐＫＳＲ５０
株があげられる。なおエシェリヒア コリＮＨＫ３／ｐ
ＫＳＲ２１＋ｐＫＳＲ５０株およびＮＨＫ２３／ｐＫＳ
Ｒ２１＋ｐＫＳＲ５０株は、平成９年８月１２日付で、
エシェリヒア コリＮＨＫ３／ｐＫＳＲ１９株は平成９
年８月２６日付で、各々ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５２、Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６０５３、ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７６と
して、ブダペスト条約に基づいき工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されている。
変異操作や形質導入を施すことによって得られるほか、
プロリンアナログ耐性遺伝子を含むプラスミドを導入す
ることによっても得ることができる。具体的にはエシェ
リヒア コリＮＨＫ２３／ｐＫＳＲ２１＋ｐＫＳＲ５０
株があげられる。なおエシェリヒア コリＮＨＫ３／ｐ
ＫＳＲ２１＋ｐＫＳＲ５０株およびＮＨＫ２３／ｐＫＳ
Ｒ２１＋ｐＫＳＲ５０株は、平成９年８月１２日付で、
エシェリヒア コリＮＨＫ３／ｐＫＳＲ１９株は平成９
年８月２６日付で、各々ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５２、Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６０５３、ＦＥＲＭ ＢＰ−６０７６と
して、ブダペスト条約に基づいき工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されている。
【００７１】菌体処理物としては、菌体の乾燥物、凍結
乾燥物、界面活性剤または有機溶剤処理物、酵素処理
物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、菌体の蛋白質分
画〔アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）
ＨＹＰに変換する活性を有する粗酵素または精製酵
素〕、菌体および菌体処理物の固定化物等をあげること
ができる。
乾燥物、界面活性剤または有機溶剤処理物、酵素処理
物、超音波処理物、機械的摩砕処理物、菌体の蛋白質分
画〔アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨＧから４（Ｒ）
ＨＹＰに変換する活性を有する粗酵素または精製酵
素〕、菌体および菌体処理物の固定化物等をあげること
ができる。
【００７２】生体触媒IIの濃度は、微生物菌体換算で
０．１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌで
ある。４（Ｒ）ＫＨＧは、単離精製された４（Ｒ）ＫＨ
Ｇのほか、４（Ｓ）ＫＨＧおよび４（Ｓ）ＨＧを含まな
い粗精製標品、あるいは上記に記載した微生物に由来す
る生体触媒反応を利用して生成された４（Ｒ）ＫＨＧを
含有する反応液等を利用することができる。４（Ｒ）Ｋ
ＨＧの濃度は１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは２０〜２０
０ｇ／ｌである。
０．１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは５〜１００ｇ／ｌで
ある。４（Ｒ）ＫＨＧは、単離精製された４（Ｒ）ＫＨ
Ｇのほか、４（Ｓ）ＫＨＧおよび４（Ｓ）ＨＧを含まな
い粗精製標品、あるいは上記に記載した微生物に由来す
る生体触媒反応を利用して生成された４（Ｒ）ＫＨＧを
含有する反応液等を利用することができる。４（Ｒ）Ｋ
ＨＧの濃度は１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは２０〜２０
０ｇ／ｌである。
【００７３】水性媒体としては、上記４（Ｒ）ＫＨＧの
製造法において記載の水性媒体を用いることができる。
水性媒体に、生体触媒II、アミノ基供与体および４
（Ｒ）ＫＨＧを上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、好
ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ
５〜９の条件下で、０．５〜９６時間反応させ、４
（Ｒ）ＨＹＰを製造することができる。
製造法において記載の水性媒体を用いることができる。
水性媒体に、生体触媒II、アミノ基供与体および４
（Ｒ）ＫＨＧを上記濃度添加し、温度１５〜８０℃、好
ましくは２５〜６０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ
５〜９の条件下で、０．５〜９６時間反応させ、４
（Ｒ）ＨＹＰを製造することができる。
【００７４】生体触媒IIとして用いられる微生物の培養
初発または途中に４（Ｒ）ＫＨＧを上記濃度添加し４
（Ｒ）ＨＹＰを製造することもできる。上記の如くして
生成した４（Ｒ）ＨＧあるいは４（Ｒ）ＨＹＰは、通常
用いられるアミノ酸の精製法を用いて単離することがで
きる。例えば遠心分離により固形物を除いた反応上清か
ら、イオン交換樹脂や膜処理法などの操作を組み合わせ
て、４（Ｒ）ＨＧあるいは４（Ｒ）ＨＹＰを単離するこ
とができる。以下に本発明の実施例を示す。
初発または途中に４（Ｒ）ＫＨＧを上記濃度添加し４
（Ｒ）ＨＹＰを製造することもできる。上記の如くして
生成した４（Ｒ）ＨＧあるいは４（Ｒ）ＨＹＰは、通常
用いられるアミノ酸の精製法を用いて単離することがで
きる。例えば遠心分離により固形物を除いた反応上清か
ら、イオン交換樹脂や膜処理法などの操作を組み合わせ
て、４（Ｒ）ＨＧあるいは４（Ｒ）ＨＹＰを単離するこ
とができる。以下に本発明の実施例を示す。
【００７５】
【実施例】実施例１ ４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子の取得 バチルス エスピー(Bacillus sp.)ＯＣ１８７株（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４６４６）を１白金耳、１０ｍｌのＬＢ液
体培地〔バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵
母エキス（ディフコ社製） ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを水１
リットルに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕に植菌
し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養菌体から
公知の方法〔Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (196
3)〕に従い染色体ＤＮＡを単離した。精製したバチルス
エスピーＯＣ１８７株の染色体ＤＮＡ ５μｇとｐＳ
ＴＶ２９プラスミドＤＮＡ（宝酒造社製）１μｇをＳａ
ｌＩ用緩衝液（宝酒造社製Ｋバッファー）１００μｌに
溶かし、２０単位の制限酵素Ｓａｌ Ｉ（宝酒造社製）
を加え、３７℃で３時間消化反応を行った後、６５℃で
１５分間加熱することによって反応を停止させた。該反
応停止液に３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）１０μ
ｌを添加後、−２０℃に冷却したエタノール３００μｌ
を加え、−８０℃で３０分間静置した。静置後、該エタ
ノール混合物中に形成された沈殿を遠心分離によって取
得した（以下、該操作をエタノール沈殿法と略す）。該
沈殿を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション バッ
ファーＡ液（宝酒造社製）４０μｌ、ライゲーション
バッファーＢ液（宝酒造社製）５μｌを加え、混合した
後、１６℃で１６時間ＤＮＡ連結反応を行い組換え体Ｄ
ＮＡを得た（以下、該操作をライゲーション反応と略
す)。該組換え体ＤＮＡを用い、エシェリヒア コリ(Es
cherichia coli)Ｋ−１２株系統のＡＴＣＣ３３６２５
株をマニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング
第２版〕に従って形質転換し、クロラムフェニコール
２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（ＬＢ培地に寒天２
％を加えて固めたもの）に塗布し、３７℃で２４時間イ
ンキュベートした。生じたクロラムフェニコールに耐性
の形質転換コロニー約２０００個についてピルビン酸と
グリオキシル酸から４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル
酸を合成する活性を測定した。
ＲＭ ＢＰ−４６４６）を１白金耳、１０ｍｌのＬＢ液
体培地〔バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵
母エキス（ディフコ社製） ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを水１
リットルに含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕に植菌
し、３０℃で２０時間培養した。得られた培養菌体から
公知の方法〔Biochim. Biophys. Acta., 72, 619 (196
3)〕に従い染色体ＤＮＡを単離した。精製したバチルス
エスピーＯＣ１８７株の染色体ＤＮＡ ５μｇとｐＳ
ＴＶ２９プラスミドＤＮＡ（宝酒造社製）１μｇをＳａ
ｌＩ用緩衝液（宝酒造社製Ｋバッファー）１００μｌに
溶かし、２０単位の制限酵素Ｓａｌ Ｉ（宝酒造社製）
を加え、３７℃で３時間消化反応を行った後、６５℃で
１５分間加熱することによって反応を停止させた。該反
応停止液に３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）１０μ
ｌを添加後、−２０℃に冷却したエタノール３００μｌ
を加え、−８０℃で３０分間静置した。静置後、該エタ
ノール混合物中に形成された沈殿を遠心分離によって取
得した（以下、該操作をエタノール沈殿法と略す）。該
沈殿を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション バッ
ファーＡ液（宝酒造社製）４０μｌ、ライゲーション
バッファーＢ液（宝酒造社製）５μｌを加え、混合した
後、１６℃で１６時間ＤＮＡ連結反応を行い組換え体Ｄ
ＮＡを得た（以下、該操作をライゲーション反応と略
す)。該組換え体ＤＮＡを用い、エシェリヒア コリ(Es
cherichia coli)Ｋ−１２株系統のＡＴＣＣ３３６２５
株をマニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニング
第２版〕に従って形質転換し、クロラムフェニコール
２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（ＬＢ培地に寒天２
％を加えて固めたもの）に塗布し、３７℃で２４時間イ
ンキュベートした。生じたクロラムフェニコールに耐性
の形質転換コロニー約２０００個についてピルビン酸と
グリオキシル酸から４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル
酸を合成する活性を測定した。
【００７６】即ち、各形質転換株をクロラムフェニコー
ル２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地３ｍｌ中で３０℃
にて２０時間培養し、該培養液に３０μｌのキシレンと
２Ｍピルビン酸ナトリウム溶液１５０μｌ、２Ｍグリオ
キシル酸溶液（ＮａＯＨにてｐＨ６．４に調製）１５０
μｌを添加し、３７℃で３０分間振盪した。該振盪液の
遠心上清を住友化学社製のSUMICHIRAL OA-5000（内径
４．６ｍｍ、長さ５ｃｍ)を用い、１ｍＭ 酢酸銅（I
I）、０．１ｍＭ 酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ４．
５）８５：イソプロパノール１５の混合液を移動層と
し、ＵＶ２１０ｎｍの吸光度を測定するＨＰＬＣ法で分
析し、４（Ｒ）および４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケト
グルタルの生成量を測定した。
ル２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地３ｍｌ中で３０℃
にて２０時間培養し、該培養液に３０μｌのキシレンと
２Ｍピルビン酸ナトリウム溶液１５０μｌ、２Ｍグリオ
キシル酸溶液（ＮａＯＨにてｐＨ６．４に調製）１５０
μｌを添加し、３７℃で３０分間振盪した。該振盪液の
遠心上清を住友化学社製のSUMICHIRAL OA-5000（内径
４．６ｍｍ、長さ５ｃｍ)を用い、１ｍＭ 酢酸銅（I
I）、０．１ｍＭ 酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ４．
５）８５：イソプロパノール１５の混合液を移動層と
し、ＵＶ２１０ｎｍの吸光度を測定するＨＰＬＣ法で分
析し、４（Ｒ）および４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケト
グルタルの生成量を測定した。
【００７７】該測定により、４（Ｒ）ＫＨＧ合成活性を
有する形質転換株を選択し、該形質転換株より、４
（Ｒ）ＫＨＧ合成活性を担う約３．５ｋｂのＳａｌ Ｉ
処理ＤＮＡ断片を有するプラスミドｐＫＳＲ２０１を取
得した。該Ｓａｌ Ｉ処理ＤＮＡ断片の制限酵素地図を
図１に示す。さらに各種制限酵素を用いて、このＤＮＡ
断片上の４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子領域を含むＰｓｔ Ｉ−
Ｓａｌ Ｉ約１．８ｋｂをｐＳＴＶ２９のＰｓｔ Ｉ−Ｓ
ａｌ Ｉサイト間に挿入したｐＫＳＲ２２２を作製し
た。
有する形質転換株を選択し、該形質転換株より、４
（Ｒ）ＫＨＧ合成活性を担う約３．５ｋｂのＳａｌ Ｉ
処理ＤＮＡ断片を有するプラスミドｐＫＳＲ２０１を取
得した。該Ｓａｌ Ｉ処理ＤＮＡ断片の制限酵素地図を
図１に示す。さらに各種制限酵素を用いて、このＤＮＡ
断片上の４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子領域を含むＰｓｔ Ｉ−
Ｓａｌ Ｉ約１．８ｋｂをｐＳＴＶ２９のＰｓｔ Ｉ−Ｓ
ａｌ Ｉサイト間に挿入したｐＫＳＲ２２２を作製し
た。
【００７８】ｐＫＳＲ２２２に含まれる４（Ｒ）ＫＡＬ
遺伝子のＤＮＡ配列をジデオキシ法〔Proc. Natl. Sci.
USA, 74, 5463(1977)〕により決定した。４（Ｒ）ＫＡ
Ｌ遺伝子の構造遺伝子領域を配列番号２に、ＤＮＡ配列
より推定される４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子のアミノ酸配列を
配列番号１に示した。
遺伝子のＤＮＡ配列をジデオキシ法〔Proc. Natl. Sci.
USA, 74, 5463(1977)〕により決定した。４（Ｒ）ＫＡ
Ｌ遺伝子の構造遺伝子領域を配列番号２に、ＤＮＡ配列
より推定される４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子のアミノ酸配列を
配列番号１に示した。
【００７９】実施例２ 発現プラスミドの作製 ４（Ｒ）ＫＡＬ活性を高発現させるために、エシェリヒ
ア コリのトリプトファン生合成酵素遺伝子由来のプロ
モーター（Ｔｒｐプロモーター）を４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝
子上流に連結したプラスミドの造成を行った。また同時
に、４（Ｒ）ＫＡＬのＮ末端５アミノ酸に対応するＤＮ
Ａ塩基配列はバチルス エスピーＯＣ１８７株由来の配
列から、エシェリヒア コリの至適コドンに相応する配
列へと改変した。
ア コリのトリプトファン生合成酵素遺伝子由来のプロ
モーター（Ｔｒｐプロモーター）を４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝
子上流に連結したプラスミドの造成を行った。また同時
に、４（Ｒ）ＫＡＬのＮ末端５アミノ酸に対応するＤＮ
Ａ塩基配列はバチルス エスピーＯＣ１８７株由来の配
列から、エシェリヒア コリの至適コドンに相応する配
列へと改変した。
【００８０】４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子のＮ末端に対応し、
２残基目のヒスチジン残基、４残基目のロイシン残基お
よび５残基目のセリン残基に相応するコドンをエシェリ
ヒアコリの至適コドンに相応する文字に改変した配列番
号４に示した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと４
（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子のＣ末端に対応する配列番号５に示
した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを常法に従っ
て合成した。これらのオリゴヌクレオチドをプライマー
として、ＰＣＲ法〔R.F.Saiki etal., Science, 230, 1
350 (1985)〕によって４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子を増幅させ
た。
２残基目のヒスチジン残基、４残基目のロイシン残基お
よび５残基目のセリン残基に相応するコドンをエシェリ
ヒアコリの至適コドンに相応する文字に改変した配列番
号４に示した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと４
（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子のＣ末端に対応する配列番号５に示
した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを常法に従っ
て合成した。これらのオリゴヌクレオチドをプライマー
として、ＰＣＲ法〔R.F.Saiki etal., Science, 230, 1
350 (1985)〕によって４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子を増幅させ
た。
【００８１】即ち、ｐＫＳＲ２２２を鋳型とし、Ｇｅｎ
ｅ ＡｍｐＴＭ Ｋｉｔ (パーキンエルマージャパン社
製)および、同社のＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅ
ｒを用い、９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、７２
℃で１分間からなる反応工程を１サイクルとして３０サ
イクル行った後、７２℃で５分間反応させた。該反応に
より増幅された約６３０ｂｐｓのＤＮＡ断片をクロロホ
ルム抽出した後、エタノール沈殿法により該ＤＮＡ断片
を精製した。
ｅ ＡｍｐＴＭ Ｋｉｔ (パーキンエルマージャパン社
製)および、同社のＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅ
ｒを用い、９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、７２
℃で１分間からなる反応工程を１サイクルとして３０サ
イクル行った後、７２℃で５分間反応させた。該反応に
より増幅された約６３０ｂｐｓのＤＮＡ断片をクロロホ
ルム抽出した後、エタノール沈殿法により該ＤＮＡ断片
を精製した。
【００８２】該ＤＮＡ断片２μｇとＴｒｐプロモーター
を有する参考例１記載のベクタープラスミドｐＴｒＳ３
３１μｇを各々Ｃｌａ ＩおよびＢａｍ ＨＩで２重消化
後、各々のＣｌａ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ消化ＤＮＡ断片をア
ガロース電気泳動によって精製した。これら精製された
両断片を混合した後、エタノール沈殿を行い、得られた
ＤＮＡ沈殿を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション
反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
を有する参考例１記載のベクタープラスミドｐＴｒＳ３
３１μｇを各々Ｃｌａ ＩおよびＢａｍ ＨＩで２重消化
後、各々のＣｌａ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ消化ＤＮＡ断片をア
ガロース電気泳動によって精製した。これら精製された
両断片を混合した後、エタノール沈殿を行い、得られた
ＤＮＡ沈殿を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション
反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
【００８３】該組換え体ＤＮＡを用い、エシェリヒア
コリＡＴＣＣ３３６２５株をマニアチスらの方法〔モレ
キュラー・クローニング 第２版〕に従って形質転換
後、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含
むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間培養した。
コリＡＴＣＣ３３６２５株をマニアチスらの方法〔モレ
キュラー・クローニング 第２版〕に従って形質転換
後、該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含
むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間培養した。
【００８４】生育してきたアンピシリン耐性の形質転換
体のコロニー数個について実施例１と同様の方法により
（ただし培養時にはクロラムフェニコールに替わりにア
ンピシリン１００μｇ／ｍｌを添加した）４（Ｒ）ＫＡ
Ｌ合成活性を測定した。いずれの形質転換体も高い４
（Ｒ）ＫＡＬ合成活性を有していた。これらの形質転換
体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地
３ｍｌ中で３７℃で１６時間振盪培養し、得られた培養
液を遠心分離することにより取得した菌体より公知の方
法〔モレキュラー・クローニング 第２版〕でプラスミ
ドを単離した。
体のコロニー数個について実施例１と同様の方法により
（ただし培養時にはクロラムフェニコールに替わりにア
ンピシリン１００μｇ／ｍｌを添加した）４（Ｒ）ＫＡ
Ｌ合成活性を測定した。いずれの形質転換体も高い４
（Ｒ）ＫＡＬ合成活性を有していた。これらの形質転換
体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地
３ｍｌ中で３７℃で１６時間振盪培養し、得られた培養
液を遠心分離することにより取得した菌体より公知の方
法〔モレキュラー・クローニング 第２版〕でプラスミ
ドを単離した。
【００８５】これら単離したプラスミドを各種制限酵素
で切断して構造を調べた結果、いずれも同じ構造のプラ
スミドを有していることが確認された。このようにして
作製されたプラスミドをｐＫＳＲ３０３と命名した。ｐ
ＫＳＲ３０３の制限酵素切断地図を図２に示した。次
に、コリネバクテリウム属細菌中に４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝
子を導入するために、コリネバクテリウム属細菌中で自
律増殖できるベクタープラスミドｐＣＳ１１６〔該プラ
スミドを含有するEscherichia coli KY9002/pCS116（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６０５５）より取得〕とｐＫＳＲ３０３
との連結を行った。
で切断して構造を調べた結果、いずれも同じ構造のプラ
スミドを有していることが確認された。このようにして
作製されたプラスミドをｐＫＳＲ３０３と命名した。ｐ
ＫＳＲ３０３の制限酵素切断地図を図２に示した。次
に、コリネバクテリウム属細菌中に４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝
子を導入するために、コリネバクテリウム属細菌中で自
律増殖できるベクタープラスミドｐＣＳ１１６〔該プラ
スミドを含有するEscherichia coli KY9002/pCS116（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６０５５）より取得〕とｐＫＳＲ３０３
との連結を行った。
【００８６】ｐＣＳ１１６およびｐＫＳＲ３０３各々１
μｇを４５μｌのＨバッファー（宝酒造社製）に溶解
し、１０単位のＢｇｌ IIを加え３７℃で３時間消化反
応を行った。該反応により得られたＤＮＡをフェノール
抽出した後、エタノール沈殿法により該ＤＮＡ断片を取
得した。
μｇを４５μｌのＨバッファー（宝酒造社製）に溶解
し、１０単位のＢｇｌ IIを加え３７℃で３時間消化反
応を行った。該反応により得られたＤＮＡをフェノール
抽出した後、エタノール沈殿法により該ＤＮＡ断片を取
得した。
【００８７】該ＤＮＡを５μｌの蒸留水に溶解し、ライ
ゲーション反応を行い、組換え体ＤＮＡを取得した。該
組換え体ＤＮＡを用い、エシェリヒア コリＡＴＣＣ３
３６２５株をマニアチスらの方法〔モレキュラー・クロ
ーニング 第２版〕に従って形質転換後、該形質転換体
をアンピシリン１００μｇ／ｍｌとスペクチノマイシン
１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃
で２４時間培養した。
ゲーション反応を行い、組換え体ＤＮＡを取得した。該
組換え体ＤＮＡを用い、エシェリヒア コリＡＴＣＣ３
３６２５株をマニアチスらの方法〔モレキュラー・クロ
ーニング 第２版〕に従って形質転換後、該形質転換体
をアンピシリン１００μｇ／ｍｌとスペクチノマイシン
１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃
で２４時間培養した。
【００８８】生育してきたアンピシリンおよびスペクチ
ノマイシンに耐性なコロニーから上記同様にプラスミド
を単離し、該プラスミドを用い公知の方法（特開平６−
２７７０８２）にしたがってコリネバクテリウム グル
タミクム(Corynebacterium glutamicum) ＡＴＣＣ１３
０３２株を形質転換した。
ノマイシンに耐性なコロニーから上記同様にプラスミド
を単離し、該プラスミドを用い公知の方法（特開平６−
２７７０８２）にしたがってコリネバクテリウム グル
タミクム(Corynebacterium glutamicum) ＡＴＣＣ１３
０３２株を形質転換した。
【００８９】該形質転換体をスペクチノマイシン１００
μｇ／ｍｌを含むＢＹ寒天培地〔ブイヨン（極東社製）
２０ｇ、酵母エキス（極東社製）５ｇを水１リットルに
含みｐＨ７．２に調整し、寒天２％を加えて固めた培
地〕に塗布し、３０℃で４８時間培養した。生育してき
たスペクチノマイシンに耐性なコロニー数個から公知の
方法（特開昭５７−１８３７９９）にしたがってプラス
ミドを単離した。
μｇ／ｍｌを含むＢＹ寒天培地〔ブイヨン（極東社製）
２０ｇ、酵母エキス（極東社製）５ｇを水１リットルに
含みｐＨ７．２に調整し、寒天２％を加えて固めた培
地〕に塗布し、３０℃で４８時間培養した。生育してき
たスペクチノマイシンに耐性なコロニー数個から公知の
方法（特開昭５７−１８３７９９）にしたがってプラス
ミドを単離した。
【００９０】これら単離したプラスミドを各種制限酵素
で切断して構造を調べた結果、いずれも同じ構造のプラ
スミドを有していることが確認された。このようにして
作製されたプラスミドをｐＫＳＲ８０３と命名した。ｐ
ＫＳＲ８０３の制限酵素切断地図を図３に示した。
で切断して構造を調べた結果、いずれも同じ構造のプラ
スミドを有していることが確認された。このようにして
作製されたプラスミドをｐＫＳＲ８０３と命名した。ｐ
ＫＳＲ８０３の制限酵素切断地図を図３に示した。
【００９１】実施例３ 各種菌株による４（Ｒ）ＫＨＧ
の生産 エシェリヒア コリＢ株系統のＡＴＣＣ１１３０３株、
クレブシエラ オキシトカ(Klebsiela oxytoca) ＡＴＣ
Ｃ８７２４株、セラチア マルセセンス(Serratia mars
ecens) ＡＴＣＣ１３８８０株を各々ＬＢ培地３ｍｌに
１白金耳づつ植菌し、２８℃で１２時間培養した。
の生産 エシェリヒア コリＢ株系統のＡＴＣＣ１１３０３株、
クレブシエラ オキシトカ(Klebsiela oxytoca) ＡＴＣ
Ｃ８７２４株、セラチア マルセセンス(Serratia mars
ecens) ＡＴＣＣ１３８８０株を各々ＬＢ培地３ｍｌに
１白金耳づつ植菌し、２８℃で１２時間培養した。
【００９２】培養後、得られた培養液を遠心分離するこ
とによりにより各々の菌体を取得した。これら菌体を各
々、氷冷した５０ｍＭ ＣａＣｌ2溶液１ｍｌに懸濁し、
これら懸濁液を遠心分離することによりにより各々の菌
体を再度取得した。これら菌体を各々、０．２ｍｌの氷
冷した５０ｍＭ ＣａＣｌ2、５０％グリセロール溶液に
懸濁後、氷中に１０分間放置した。
とによりにより各々の菌体を取得した。これら菌体を各
々、氷冷した５０ｍＭ ＣａＣｌ2溶液１ｍｌに懸濁し、
これら懸濁液を遠心分離することによりにより各々の菌
体を再度取得した。これら菌体を各々、０．２ｍｌの氷
冷した５０ｍＭ ＣａＣｌ2、５０％グリセロール溶液に
懸濁後、氷中に１０分間放置した。
【００９３】これら菌懸濁液に実施例２で作製したｐＫ
ＳＲ３０３を０．２μｇ添加し氷中に２０分間放置した
後、４２℃で３０秒間加熱し、各々に０．８ｍｌのＬＢ
培地を加え、３０℃で１時間振盪培養した。これら培養
液を４００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培
地に塗布し、３０℃で２４時間培養した。
ＳＲ３０３を０．２μｇ添加し氷中に２０分間放置した
後、４２℃で３０秒間加熱し、各々に０．８ｍｌのＬＢ
培地を加え、３０℃で１時間振盪培養した。これら培養
液を４００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培
地に塗布し、３０℃で２４時間培養した。
【００９４】生育したきたコロニーを選択することによ
り、ｐＫＳＲ３０３の導入されたエシェリヒア コリＢ
株系統のＡＴＣＣ１１３０３株、クレブシエラ オキシ
トカＡＴＣＣ８７２４株およびセラチア マルセセンス
ＡＴＣＣ１３８８０株を取得した。エシェリヒア コリ
ＡＴＣＣ３３６２５株、ＡＴＣＣ１１３０３株、クレブ
シエラ オキシトカＡＴＣＣ８７２４株、セラチア マ
ルセセンスＡＴＣＣ１３８８０株の各株、これらの株に
ｐＫＳＲ３０３を導入した株、コリネバクテリウムグル
タミクムＡＴＣＣ１３０３２株およびｐＫＳＲ８０３を
導入したＡＴＣＣ１３０３２株の各株を３ｍｌのＬＢ培
地で１６時間振盪培養した。
り、ｐＫＳＲ３０３の導入されたエシェリヒア コリＢ
株系統のＡＴＣＣ１１３０３株、クレブシエラ オキシ
トカＡＴＣＣ８７２４株およびセラチア マルセセンス
ＡＴＣＣ１３８８０株を取得した。エシェリヒア コリ
ＡＴＣＣ３３６２５株、ＡＴＣＣ１１３０３株、クレブ
シエラ オキシトカＡＴＣＣ８７２４株、セラチア マ
ルセセンスＡＴＣＣ１３８８０株の各株、これらの株に
ｐＫＳＲ３０３を導入した株、コリネバクテリウムグル
タミクムＡＴＣＣ１３０３２株およびｐＫＳＲ８０３を
導入したＡＴＣＣ１３０３２株の各株を３ｍｌのＬＢ培
地で１６時間振盪培養した。
【００９５】これら培養液にキシレン３０μｌ、２Ｍピ
ルビン酸ナトリウム溶液１５０μｌ、２Ｍグリオキシル
酸溶液（ＮａＯＨにてｐＨ６．４に調製）１５０μｌを
添加し、３７℃で３０分間振盪した。これら反応液の遠
心上清を、実施例１と同様の方法により４（Ｒ）および
４（Ｓ）−ヒドロキシ-2-ケトグルタル生成量を測定し
た。
ルビン酸ナトリウム溶液１５０μｌ、２Ｍグリオキシル
酸溶液（ＮａＯＨにてｐＨ６．４に調製）１５０μｌを
添加し、３７℃で３０分間振盪した。これら反応液の遠
心上清を、実施例１と同様の方法により４（Ｒ）および
４（Ｓ）−ヒドロキシ-2-ケトグルタル生成量を測定し
た。
【００９６】結果を第１表に示した。
【００９７】
【表１】
【００９８】実施例４ 大腸菌変異株による４（Ｒ）Ｋ
ＨＧの生産 エシェリヒア コリＫ−１２系統の菌株でｐｐｃ、ｌｉ
ｐ、ｅｄａの３重欠損変異を持つＮＨＫ４３株からリン
ゴ酸シンターゼ活性低下株を誘導した。即ち、グルタミ
ン酸２ｇ／ｌ、リポ酸１００μｇ／ｌを添加したＬＢ培
地中で対数増殖期まで培養したＮＨＫ４３株の菌体を遠
心分離によって集め、０．０５Ｍトリス−マレイン酸緩
衝液（ｐＨ６．０）で洗浄後、菌体濃度が１０9細胞／
ｍｌになるように同緩衝液に懸濁した。
ＨＧの生産 エシェリヒア コリＫ−１２系統の菌株でｐｐｃ、ｌｉ
ｐ、ｅｄａの３重欠損変異を持つＮＨＫ４３株からリン
ゴ酸シンターゼ活性低下株を誘導した。即ち、グルタミ
ン酸２ｇ／ｌ、リポ酸１００μｇ／ｌを添加したＬＢ培
地中で対数増殖期まで培養したＮＨＫ４３株の菌体を遠
心分離によって集め、０．０５Ｍトリス−マレイン酸緩
衝液（ｐＨ６．０）で洗浄後、菌体濃度が１０9細胞／
ｍｌになるように同緩衝液に懸濁した。
【００９９】該懸濁液にＮＴＧを終濃度が６００ｍｇ／
ｌになるように加え、室温で２０分間保持して変異処理
を行った。該変異処理菌体をグルコース０．５％、グル
タミン酸０．０５ｇ／ｌ、リポ酸１００μｇ／ｌ、グリ
オキシル酸３０ｍＭを添加したＭ９最少寒天培地〔モレ
キュラー・クローニング 第２版〕に塗布した後、３７
℃で２日間培養した。
ｌになるように加え、室温で２０分間保持して変異処理
を行った。該変異処理菌体をグルコース０．５％、グル
タミン酸０．０５ｇ／ｌ、リポ酸１００μｇ／ｌ、グリ
オキシル酸３０ｍＭを添加したＭ９最少寒天培地〔モレ
キュラー・クローニング 第２版〕に塗布した後、３７
℃で２日間培養した。
【０１００】生育してきた菌株のうち、小さいコロニー
を形成する菌株をグルタミン酸２ｇ／ｌ、リポ酸１００
μｇ／ｌを添加したＬＢ寒天培地上に接種し、培養し
た。
を形成する菌株をグルタミン酸２ｇ／ｌ、リポ酸１００
μｇ／ｌを添加したＬＢ寒天培地上に接種し、培養し
た。
【０１０１】該培養プレートに生育した菌株をグルコー
ス０．５％、グルタミン酸０．５ｇ／ｌ、リポ酸１００
μｇ／ｌを添加したＭ９最少寒天培地とグルコース０．
５％、リポ酸１００μｇ／ｌ、グリオキシル酸３０ｍＭ
を添加したＭ９最少寒天培地とにレプリカし、前者培地
上では生育するが後者培地上では生育できない株を選択
した。
ス０．５％、グルタミン酸０．５ｇ／ｌ、リポ酸１００
μｇ／ｌを添加したＭ９最少寒天培地とグルコース０．
５％、リポ酸１００μｇ／ｌ、グリオキシル酸３０ｍＭ
を添加したＭ９最少寒天培地とにレプリカし、前者培地
上では生育するが後者培地上では生育できない株を選択
した。
【０１０２】該選択された菌株をＭＳ培地〔グルコース
３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １０ｇ、Ｍ
ｇＳＯ4 １ｇ、チアミン塩酸塩 １００μｇ、酵母エキ
ス １ｇ、ペプトン １ｇ、リポ酸 ５０μｇ、ＣａＣＯ3
２０ｇ、グルタミン酸 ２ｇを水１リットル中に含み、
ｐＨ７．２に調整した培地〕中、３７℃で振盪培養し
た。
３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １０ｇ、Ｍ
ｇＳＯ4 １ｇ、チアミン塩酸塩 １００μｇ、酵母エキ
ス １ｇ、ペプトン １ｇ、リポ酸 ５０μｇ、ＣａＣＯ3
２０ｇ、グルタミン酸 ２ｇを水１リットル中に含み、
ｐＨ７．２に調整した培地〕中、３７℃で振盪培養し
た。
【０１０３】対数増殖期後期まで培養した段階で、遠心
分離により集菌し、５０ｍＭトリス−塩酸バッファー
（ｐＨ７．０）で該菌体を洗浄後、超音波破砕機で破砕
した。該菌体破砕液を遠心分離（１５、０００ｒｐｍ、
４５分間）し、得られた上清を細胞抽出液とした。該細
胞抽出液のリンゴ酸シンターゼ活性を、既報〔Methods
in Enzymology 5,633(1962)〕にしたがって測定し、活
性の検出されなかったＮＨＫ４６株を目的の変異株とし
て選択した。
分離により集菌し、５０ｍＭトリス−塩酸バッファー
（ｐＨ７．０）で該菌体を洗浄後、超音波破砕機で破砕
した。該菌体破砕液を遠心分離（１５、０００ｒｐｍ、
４５分間）し、得られた上清を細胞抽出液とした。該細
胞抽出液のリンゴ酸シンターゼ活性を、既報〔Methods
in Enzymology 5,633(1962)〕にしたがって測定し、活
性の検出されなかったＮＨＫ４６株を目的の変異株とし
て選択した。
【０１０４】該ＮＨＫ４６株に、Ｐ１ファージによる形
質導入法〔J.H.Miller, Experiments in Molecular Gen
etics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)〕を用いて、エ
シェリヒア コリＷ３１１０株由来のｌｉｐ+遺伝子を
導入し、リポ酸非要求性のＮＨＫ４８株を得た。ＮＨＫ
４３株、ＮＨＫ４６株およびＮＨＫ４８株にマニアチス
らの方法〔モレキュラー・クローニング 第２版〕に従
ってｐＫＳＲ２２２を導入し（ただし培養はリポ酸 １
００μｇ／ｌ、グルタミン酸 ２ｇ／ｌを添加して行っ
た）、クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を
得た。
質導入法〔J.H.Miller, Experiments in Molecular Gen
etics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)〕を用いて、エ
シェリヒア コリＷ３１１０株由来のｌｉｐ+遺伝子を
導入し、リポ酸非要求性のＮＨＫ４８株を得た。ＮＨＫ
４３株、ＮＨＫ４６株およびＮＨＫ４８株にマニアチス
らの方法〔モレキュラー・クローニング 第２版〕に従
ってｐＫＳＲ２２２を導入し（ただし培養はリポ酸 １
００μｇ／ｌ、グルタミン酸 ２ｇ／ｌを添加して行っ
た）、クロラムフェニコール耐性を指標に形質転換体を
得た。
【０１０５】 また同様にしてアンピシリン耐性を指標に
ＮＨＫ４６株にｐＫＳＲ３０３を導入し、エシェリヒア
コリＮＨＫ４６／ｐＫＳＲ３０３株を取得した。各形
質転換株をグルコース １％、炭酸カルシウム ２％、リ
ポ酸 １００μｇ／ｌ、グルタミン酸 ２ｇ／ｌを添加し
たＬＢ培地に植菌し、２８℃で１６時間振盪培養した。
ＮＨＫ４６株にｐＫＳＲ３０３を導入し、エシェリヒア
コリＮＨＫ４６／ｐＫＳＲ３０３株を取得した。各形
質転換株をグルコース １％、炭酸カルシウム ２％、リ
ポ酸 １００μｇ／ｌ、グルタミン酸 ２ｇ／ｌを添加し
たＬＢ培地に植菌し、２８℃で１６時間振盪培養した。
【０１０６】これら培養液各々０．５ｍｌずつを滅菌し
た５ｍｌのＴ培地〔グルコース ５０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ４
ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １０ｇ、ＭｇＳＯ4 １ｇ、チアミ
ン塩酸塩 １０μｇ、酵母エキス ０．２ｇ、ＫＣｌ ３
ｇ、リポ酸 ５０μｇ、トリプトファン ２５０ｍｇ、Ｃ
ａＣＯ3 ２０ｇ、グルタミン酸 ２ｇを水１リットル中
に含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕に添加し、３０℃
で２４時間振盪培養した後、２Ｍグリオキシル酸溶液
（ＮａＯＨでｐＨ６．４に調整）０．２５ｍｌを添加し
３７℃でさらに２４時間振盪培養した。
た５ｍｌのＴ培地〔グルコース ５０ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ４
ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １０ｇ、ＭｇＳＯ4 １ｇ、チアミ
ン塩酸塩 １０μｇ、酵母エキス ０．２ｇ、ＫＣｌ ３
ｇ、リポ酸 ５０μｇ、トリプトファン ２５０ｍｇ、Ｃ
ａＣＯ3 ２０ｇ、グルタミン酸 ２ｇを水１リットル中
に含み、ｐＨ７．２に調整した培地〕に添加し、３０℃
で２４時間振盪培養した後、２Ｍグリオキシル酸溶液
（ＮａＯＨでｐＨ６．４に調整）０．２５ｍｌを添加し
３７℃でさらに２４時間振盪培養した。
【０１０７】これら培養液を遠心分離して得た培養上清
を実施例１と同様の方法により４（Ｒ）ＫＨＧおよび４
（Ｓ）ＫＨＧの生成量を測定した。結果を第２表に示
す。４（Ｒ）ＫＨＧ生成量の比較から、リポ酸要求性変
異とリンゴ酸シンターゼ活性低下変異は４（Ｒ）ＫＨＧ
生産に寄与することが明白となった。
を実施例１と同様の方法により４（Ｒ）ＫＨＧおよび４
（Ｓ）ＫＨＧの生成量を測定した。結果を第２表に示
す。４（Ｒ）ＫＨＧ生成量の比較から、リポ酸要求性変
異とリンゴ酸シンターゼ活性低下変異は４（Ｒ）ＫＨＧ
生産に寄与することが明白となった。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】実施例５ ジャーファーメンターでの４
（Ｒ）ＫＨＧ生産 エシェリヒア コリＫ−１２系統の菌株でｌｉｐ、ｅｄ
ａの２重欠損変異を持つＮＨＫ４０株に実施例４と同様
にしてｐＫＳＲ２２２を導入し、形質転換体を取得し
た。
（Ｒ）ＫＨＧ生産 エシェリヒア コリＫ−１２系統の菌株でｌｉｐ、ｅｄ
ａの２重欠損変異を持つＮＨＫ４０株に実施例４と同様
にしてｐＫＳＲ２２２を導入し、形質転換体を取得し
た。
【０１１０】該形質転換体をグルコース １％、炭酸カ
ルシウム ２％、リポ酸 １００μｇ／ｌを添加したＬＢ
培地に植菌し、２８℃で１３時間振盪培養した。該培養
液１０ｍｌを、同じ組成の培地を２００ｍｌ入れ滅菌し
た１Ｌ容三角フラスコに添加し、２８℃で１３時間振盪
培養した。該培養液全量を、Ｊ１培地〔１リットルあた
り、ラクトース ３０ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １０ｇ、Ｋ
Ｃｌ ３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ２ｇ、Ｍｇ
ＳＯ 4 １ｇ、酵母エキス ０．５ｇ、トリプトファン ２
５０ｍｇ、ＣａＣｌ2 １５ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７ａｑ １
０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４-６ａｑ １０ｍｇ、ＮｉＣｌ
2 １．５ｍｇ、モリブデン酸アンモン １．５ｍｇ、Ｃｏ
Ｃｌ2 １．５ｍｇ、チアミン塩酸塩 １００μｇ、リポ
酸 ７５μｇ、を含有し、ｐＨ６．８に調整した培地〕
を１８００ ｍｌ入れ滅菌した５ｌ容ジャーファーメン
ターに添加し、アンモニア水でｐＨを６．８に保ちつ
つ、通気２Ｌ／ｍｉｎ、撹拌５００ｒｐｍ、３３℃の条
件で培養した。
ルシウム ２％、リポ酸 １００μｇ／ｌを添加したＬＢ
培地に植菌し、２８℃で１３時間振盪培養した。該培養
液１０ｍｌを、同じ組成の培地を２００ｍｌ入れ滅菌し
た１Ｌ容三角フラスコに添加し、２８℃で１３時間振盪
培養した。該培養液全量を、Ｊ１培地〔１リットルあた
り、ラクトース ３０ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １０ｇ、Ｋ
Ｃｌ ３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ２ｇ、Ｍｇ
ＳＯ 4 １ｇ、酵母エキス ０．５ｇ、トリプトファン ２
５０ｍｇ、ＣａＣｌ2 １５ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７ａｑ １
０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４-６ａｑ １０ｍｇ、ＮｉＣｌ
2 １．５ｍｇ、モリブデン酸アンモン １．５ｍｇ、Ｃｏ
Ｃｌ2 １．５ｍｇ、チアミン塩酸塩 １００μｇ、リポ
酸 ７５μｇ、を含有し、ｐＨ６．８に調整した培地〕
を１８００ ｍｌ入れ滅菌した５ｌ容ジャーファーメン
ターに添加し、アンモニア水でｐＨを６．８に保ちつ
つ、通気２Ｌ／ｍｉｎ、撹拌５００ｒｐｍ、３３℃の条
件で培養した。
【０１１１】培養２０時間後に、該培養液にキシレン
２０ｍｌおよび２Ｍ グリオキシル酸溶液（ＮａＯＨで
ｐＨ６．４に調製）３７０ｍｌを添加し、３７℃でさら
に１２時間培養した。該培養上清中の４（Ｒ）ＫＨＧ含
量を実施例１と同様の方法により測定した。該培養上清
には、２９９．５ｍＭの４（Ｒ）ＫＨＧが生成されてい
た。
２０ｍｌおよび２Ｍ グリオキシル酸溶液（ＮａＯＨで
ｐＨ６．４に調製）３７０ｍｌを添加し、３７℃でさら
に１２時間培養した。該培養上清中の４（Ｒ）ＫＨＧ含
量を実施例１と同様の方法により測定した。該培養上清
には、２９９．５ｍＭの４（Ｒ）ＫＨＧが生成されてい
た。
【０１１２】実施例６ ４（Ｒ）ＨＧ生産 Ｐ１ファージによる形質導入法〔J.H.Miller, Experime
nts in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.
(1972)〕を用いて、エシェリヒア コリＷ３１１０株由
来のｐｐｃ+遺伝子をＮＨＫ４３株に導入し、グルタミ
ン酸非要求性のＮＨＫ４５株を取得した。
nts in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.
(1972)〕を用いて、エシェリヒア コリＷ３１１０株由
来のｐｐｃ+遺伝子をＮＨＫ４３株に導入し、グルタミ
ン酸非要求性のＮＨＫ４５株を取得した。
【０１１３】該株に実施例４と同様の方法でｐＫＳＲ２
２２を導入した。ｐＫＳＲ２２２を保有するＮＨＫ４３
株、ＮＨＫ４６株、ＮＨＫ４８株、ＮＨＫ４５株および
ｐＫＳＲ３０３を保有するＮＨＫ４６株を実施例４と同
様に培養し、これら培養上清中の４（Ｒ）ＨＧ、４
（Ｓ）ＨＧの生成量をメルク社製Lichrospher(C18)カラ
ムを用い、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１０ｍＭ 無
水硫酸ナトリウム（ｐＨ２．２）、０．４％ ｎ−プロ
パノール、０．０３％ ＳＤＳを含む溶液を移動層と
し、溶出液をo-フタルアルデヒドでポストカラムラベル
した後、励起光３５０nm、蛍光448nmの蛍光を測定する
ＨＰＬＣによって分析し４（Ｒ）ＨＧ、４（Ｓ）ＨＧの
生成量を測定した。
２２を導入した。ｐＫＳＲ２２２を保有するＮＨＫ４３
株、ＮＨＫ４６株、ＮＨＫ４８株、ＮＨＫ４５株および
ｐＫＳＲ３０３を保有するＮＨＫ４６株を実施例４と同
様に培養し、これら培養上清中の４（Ｒ）ＨＧ、４
（Ｓ）ＨＧの生成量をメルク社製Lichrospher(C18)カラ
ムを用い、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１０ｍＭ 無
水硫酸ナトリウム（ｐＨ２．２）、０．４％ ｎ−プロ
パノール、０．０３％ ＳＤＳを含む溶液を移動層と
し、溶出液をo-フタルアルデヒドでポストカラムラベル
した後、励起光３５０nm、蛍光448nmの蛍光を測定する
ＨＰＬＣによって分析し４（Ｒ）ＨＧ、４（Ｓ）ＨＧの
生成量を測定した。
【０１１４】結果を第３表に示した。４（Ｒ）ＨＧ生成
量の比較から、リポ酸要求性変異、リンゴ酸シンターゼ
活性低下変異およびホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼ欠損変異は４（Ｒ）ＨＧ生産に寄与することが
明白となった。またｐＫＳＲ８０３を保有するコリネバ
クテリウムグル タミクムＡＴＣＣ１３０３２株をＬＢ
培地に植菌し、１６時間振盪培養した。
量の比較から、リポ酸要求性変異、リンゴ酸シンターゼ
活性低下変異およびホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼ欠損変異は４（Ｒ）ＨＧ生産に寄与することが
明白となった。またｐＫＳＲ８０３を保有するコリネバ
クテリウムグル タミクムＡＴＣＣ１３０３２株をＬＢ
培地に植菌し、１６時間振盪培養した。
【０１１５】該培養液０．５ｍｌを滅菌した５ｍｌのＴ
Ｃ培地〔グルコース １００ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、
Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２０ｇ、Ｍｇ
ＳＯ 4 ０．２５ｇ、尿素 ３ｇ、ビオチン １００μｇ、
コーンスチープリカー ５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７ａｑ １０
ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４-６ａｑ ５ｍｇ、ＣａＣＯ3 ２０
ｇを水１リットル中に含有し、ｐＨ７．２に調整した培
地〕に添加し、３０℃で２４時間振盪培養した後、該培
養液に２Ｍグリオキシル酸溶液（ＮａＯＨにてｐＨ６．
４に調製）０．２５ｍｌを添加し、３７℃でさらに２４
時間振盪培養した。
Ｃ培地〔グルコース １００ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、
Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２０ｇ、Ｍｇ
ＳＯ 4 ０．２５ｇ、尿素 ３ｇ、ビオチン １００μｇ、
コーンスチープリカー ５ｇ、ＦｅＳＯ4 ・７ａｑ １０
ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４-６ａｑ ５ｍｇ、ＣａＣＯ3 ２０
ｇを水１リットル中に含有し、ｐＨ７．２に調整した培
地〕に添加し、３０℃で２４時間振盪培養した後、該培
養液に２Ｍグリオキシル酸溶液（ＮａＯＨにてｐＨ６．
４に調製）０．２５ｍｌを添加し、３７℃でさらに２４
時間振盪培養した。
【０１１６】該培養上清中の４（Ｒ）ＨＧ、４（Ｓ）Ｈ
Ｇの生成量を同様にＯＤＳカラムを用い測定した。結果
を第３表に示した。
Ｇの生成量を同様にＯＤＳカラムを用い測定した。結果
を第３表に示した。
【０１１７】
【表３】
【０１１８】実施例７ ジャーファーメンターでの４
（Ｒ）ＨＧ生産 ｐＫＳＲ３０３を保有するエシェリヒア コリＮＨＫ４
６株をグルコース １％、炭酸カルシウム ２％、リポ酸
１００μｇ／ｌ、グルタミン酸 ２ｇ／ｌを添加したＬ
Ｂ培地に植菌し、２８℃で１３時間振盪培養した。該培
養液１０ｍｌを、同じ組成の培地２００ｍｌを入れ滅菌
した１Ｌ容三角フラスコに添加し、２８℃で１３時間振
盪培養した。
（Ｒ）ＨＧ生産 ｐＫＳＲ３０３を保有するエシェリヒア コリＮＨＫ４
６株をグルコース １％、炭酸カルシウム ２％、リポ酸
１００μｇ／ｌ、グルタミン酸 ２ｇ／ｌを添加したＬ
Ｂ培地に植菌し、２８℃で１３時間振盪培養した。該培
養液１０ｍｌを、同じ組成の培地２００ｍｌを入れ滅菌
した１Ｌ容三角フラスコに添加し、２８℃で１３時間振
盪培養した。
【０１１９】該培養液全量を、Ｊ２培地〔１リットルあ
たり、グルコース ３０ｇ、グルタミン酸 １２ｇ、（Ｎ
Ｈ4）2ＳＯ4 １０ｇ、ＫＣｌ ３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、
Ｋ2ＨＰＯ4 ２ｇ、ＭｇＳＯ4 １ｇ、酵母エキス ０．５
ｇ、トリプトファン ２５０ｍｇ、イソロイシン ２０ｍ
ｇ、メチオニン １０ｍｇ、ＣａＣｌ2 １５ｍｇ、Ｆｅ
ＳＯ4・７ａｑ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４-６ａｑ １０
ｍｇ、ＮｉＣｌ2 １．５ｍｇ、モリブデン酸アンモン
１．５ｍｇ、ＣｏＣｌ2 １．５ｍｇ、チアミン塩酸塩
１００μｇ、リポ酸 ７５μｇを含有し、ｐＨ６．８に
調整した培地〕１８００ｍｌを入れ滅菌した５Ｌ容ジャ
ーファーメンターに添加し、アンモニア水でｐＨを６．
８に保ちつつ、通気２Ｌ／ｍｉｎ、撹拌５００ｒｐｍ、
３３℃の条件で培養した。 培養１４時間後、該培養液
に２Ｍ グリオキシル酸溶液（ＮａＯＨでｐＨ６．４に
調製）１９０ｍｌを添加し、３７℃でさらに適宜グルコ
ースを添加しながら６０時間培養を継続した。
たり、グルコース ３０ｇ、グルタミン酸 １２ｇ、（Ｎ
Ｈ4）2ＳＯ4 １０ｇ、ＫＣｌ ３ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ、
Ｋ2ＨＰＯ4 ２ｇ、ＭｇＳＯ4 １ｇ、酵母エキス ０．５
ｇ、トリプトファン ２５０ｍｇ、イソロイシン ２０ｍ
ｇ、メチオニン １０ｍｇ、ＣａＣｌ2 １５ｍｇ、Ｆｅ
ＳＯ4・７ａｑ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４-６ａｑ １０
ｍｇ、ＮｉＣｌ2 １．５ｍｇ、モリブデン酸アンモン
１．５ｍｇ、ＣｏＣｌ2 １．５ｍｇ、チアミン塩酸塩
１００μｇ、リポ酸 ７５μｇを含有し、ｐＨ６．８に
調整した培地〕１８００ｍｌを入れ滅菌した５Ｌ容ジャ
ーファーメンターに添加し、アンモニア水でｐＨを６．
８に保ちつつ、通気２Ｌ／ｍｉｎ、撹拌５００ｒｐｍ、
３３℃の条件で培養した。 培養１４時間後、該培養液
に２Ｍ グリオキシル酸溶液（ＮａＯＨでｐＨ６．４に
調製）１９０ｍｌを添加し、３７℃でさらに適宜グルコ
ースを添加しながら６０時間培養を継続した。
【０１２０】該培養上清中の４（Ｒ）ＨＧ量を実施例６
と同様にＨＰＬＣで分析した。該培養上清中には、１１
７．８ｍＭの４（Ｒ）ＨＧが生成していた。
と同様にＨＰＬＣで分析した。該培養上清中には、１１
７．８ｍＭの４（Ｒ）ＨＧが生成していた。
【０１２１】実施例８ プロリン合成酵素遺伝子と４
（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子の連結 大腸菌由来の脱感作されたＰｒｏＢＡ遺伝子を有するプ
ラスミドｐＰＲＯ−１１〔該プラスミドを含有するEsch
erichia coli ATCC33625/pPRO11（ＦＥＲＭＢＰ−６０
７７）より取得〕をＰｓｔＩで消化し、該消化物をアガ
ロースゲル電気泳動後Prep-A-Gene DNA Purification S
ystem （ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてＰｒｏＢＡ遺伝
子を含む約３ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。
（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子の連結 大腸菌由来の脱感作されたＰｒｏＢＡ遺伝子を有するプ
ラスミドｐＰＲＯ−１１〔該プラスミドを含有するEsch
erichia coli ATCC33625/pPRO11（ＦＥＲＭＢＰ−６０
７７）より取得〕をＰｓｔＩで消化し、該消化物をアガ
ロースゲル電気泳動後Prep-A-Gene DNA Purification S
ystem （ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてＰｒｏＢＡ遺伝
子を含む約３ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。
【０１２２】該断片およびマルチプルクローニングサイ
トを持つプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア バ
イオテク社製）のＰｓｔＩ消化物を用い、ライゲーショ
ン反応を行い、得られた生成物を用いて大腸菌ＡＴＣＣ
３３６２５株を形質転換した。該形質転換体をアンピシ
リン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３
７℃で２４時間培養し、アンピシリン耐性の形質転換体
を取得した。
トを持つプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア バ
イオテク社製）のＰｓｔＩ消化物を用い、ライゲーショ
ン反応を行い、得られた生成物を用いて大腸菌ＡＴＣＣ
３３６２５株を形質転換した。該形質転換体をアンピシ
リン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３
７℃で２４時間培養し、アンピシリン耐性の形質転換体
を取得した。
【０１２３】これら形質転換体を、グルコース ０．５
％、チアミン塩酸塩 １００μｇ／ｌ、３，４−デヒド
ロプロリン １００ｍｇ／ｌを添加したＭ９最少寒天培
地にレプリカした。脱感作型ＰｒｏＢＡ遺伝子を有する
株は１００ｍｇ／ｌの３，４−デヒドロプロリンに耐性
を示すため（特開平３−２６６９９５）、上記培地で生
育した株を脱感作型ＰｒｏＢＡ遺伝子を有する株として
選択した。
％、チアミン塩酸塩 １００μｇ／ｌ、３，４−デヒド
ロプロリン １００ｍｇ／ｌを添加したＭ９最少寒天培
地にレプリカした。脱感作型ＰｒｏＢＡ遺伝子を有する
株は１００ｍｇ／ｌの３，４−デヒドロプロリンに耐性
を示すため（特開平３−２６６９９５）、上記培地で生
育した株を脱感作型ＰｒｏＢＡ遺伝子を有する株として
選択した。
【０１２４】選択された株から常法にしたがってプラス
ミドを抽出し、制限酵素解析を行い、ｐＴｒｃ９９Ａの
ＰｓｔＩサイトにＰｒｏＢＡ遺伝子を含む約３ｋｂのＤ
ＮＡ断片が、ｐＴｒｃ９９Ａのｔａｃプロモーターに対
してＰｒｏＢＡの転写方向が順方向となるように挿入さ
れた構造を持つｐＫＳＲ１７を取得した。ｔａｃプロモ
ーターとＰｒｏＢＡの転写開始点を近づけるため、ｐＫ
ＳＲ１７をＥｃｏＲＶで部分消化し、さらにＳｍａＩで
消化した後、該消化物をライゲーション反応に供し、自
己環化させた。
ミドを抽出し、制限酵素解析を行い、ｐＴｒｃ９９Ａの
ＰｓｔＩサイトにＰｒｏＢＡ遺伝子を含む約３ｋｂのＤ
ＮＡ断片が、ｐＴｒｃ９９Ａのｔａｃプロモーターに対
してＰｒｏＢＡの転写方向が順方向となるように挿入さ
れた構造を持つｐＫＳＲ１７を取得した。ｔａｃプロモ
ーターとＰｒｏＢＡの転写開始点を近づけるため、ｐＫ
ＳＲ１７をＥｃｏＲＶで部分消化し、さらにＳｍａＩで
消化した後、該消化物をライゲーション反応に供し、自
己環化させた。
【０１２５】該環化物を用いて大腸菌ＡＴＣＣ３３６２
５株を形質転換した。数個の形質転換体からプラスミド
を抽出し、制限酵素解析を行った結果、いずれのプラス
ミドも同じ構造を有することが確認された。該プラスミ
ドをｐＫＳＲ１８と命名した。
５株を形質転換した。数個の形質転換体からプラスミド
を抽出し、制限酵素解析を行った結果、いずれのプラス
ミドも同じ構造を有することが確認された。該プラスミ
ドをｐＫＳＲ１８と命名した。
【０１２６】該ｐＫＳＲ１８をＥｃｏＲＩとＢｇｌIIで
消化し、DNA blunting kit（宝酒造社製）を使って平滑
末端化後、アガロースゲル電気泳動とPrep-A-Gene DNA
Purification System（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて
ＰｒｏＢＡ遺伝子を含む約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を単
離精製した。該ＤＮＡ断片と、高温誘導型プロモーター
を有する発現ベクターｐＰＡＣ１〔該プラスミドを含有
するEscherichia coli KY8415/pPAC1（ＦＥＲＭ ＢＰ
−６０５４）より取得〕をＣｌａＩで消化し、DNA blun
ting kitを使って平滑末端化したＤＮＡ断片をライゲー
ション反応によって連結した。
消化し、DNA blunting kit（宝酒造社製）を使って平滑
末端化後、アガロースゲル電気泳動とPrep-A-Gene DNA
Purification System（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて
ＰｒｏＢＡ遺伝子を含む約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を単
離精製した。該ＤＮＡ断片と、高温誘導型プロモーター
を有する発現ベクターｐＰＡＣ１〔該プラスミドを含有
するEscherichia coli KY8415/pPAC1（ＦＥＲＭ ＢＰ
−６０５４）より取得〕をＣｌａＩで消化し、DNA blun
ting kitを使って平滑末端化したＤＮＡ断片をライゲー
ション反応によって連結した。
【０１２７】該連結反応物を用いて、大腸菌ＡＴＣＣ３
３６２５株を形質転換し、形質転換体からプラスミドを
抽出し、ｐＰＡＣ１の高温誘導型プロモーター下流にＰ
ｒｏＢＡの転写方向が順方向となるように挿入された構
造を持つｐＫＳＲ１９を取得した。一方、大腸菌のＰｒ
ｏＣ遺伝子を含むＨｉｎｃII−ＸｈｏＩ処理ＤＮＡ断片
をｐＴｒｓ３３のＳｍａＩ−ＳａｌＩ間に挿入したｐＥ
ｐｒｏＣをＥｃｏＲＩとＢｇｌIIで消化しDNA blunting
kitを使って平滑末端化後、アガロースゲル電気泳動と
Prep-A-Gene DNA Purification System（ＢＩＯ−ＲＡ
Ｄ社製）を用いてＴｒｐプロモーターからＰｒｏＣ遺伝
子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。
３６２５株を形質転換し、形質転換体からプラスミドを
抽出し、ｐＰＡＣ１の高温誘導型プロモーター下流にＰ
ｒｏＢＡの転写方向が順方向となるように挿入された構
造を持つｐＫＳＲ１９を取得した。一方、大腸菌のＰｒ
ｏＣ遺伝子を含むＨｉｎｃII−ＸｈｏＩ処理ＤＮＡ断片
をｐＴｒｓ３３のＳｍａＩ−ＳａｌＩ間に挿入したｐＥ
ｐｒｏＣをＥｃｏＲＩとＢｇｌIIで消化しDNA blunting
kitを使って平滑末端化後、アガロースゲル電気泳動と
Prep-A-Gene DNA Purification System（ＢＩＯ−ＲＡ
Ｄ社製）を用いてＴｒｐプロモーターからＰｒｏＣ遺伝
子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。
【０１２８】該ＤＮＡ断片とＳｐｈＩで消化後平滑末端
化したｐＫＳＲ１９をライゲーション反応によって連結
した。該連結反応物を用いて、大腸菌ＡＴＣＣ３３６２
５株を形質転換した。該形質転換体をアンピシリン１０
０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２
４時間培養し、アンピシリン耐性の形質転換体を取得し
た。
化したｐＫＳＲ１９をライゲーション反応によって連結
した。該連結反応物を用いて、大腸菌ＡＴＣＣ３３６２
５株を形質転換した。該形質転換体をアンピシリン１０
０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２
４時間培養し、アンピシリン耐性の形質転換体を取得し
た。
【０１２９】該アンピシリン耐性の形質転換体からプラ
スミドを抽出し、制限酵素解析を行い、脱感作型Ｐｒｏ
ＢＡ遺伝子とＰｒｏＣ遺伝子を有するプラスミドを見出
し、ｐＫＳＲ２１と命名した。該ｐＫＳＲ２１をＢａｍ
ＨＩ消化、平滑末端化後さらにＰｓｔＩ消化し、アガロ
ースゲル電気泳動とPrep-A-Gene DNA Purification Sys
tem（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて約７ｋｂのＤＮＡ
断片を単離精製した。
スミドを抽出し、制限酵素解析を行い、脱感作型Ｐｒｏ
ＢＡ遺伝子とＰｒｏＣ遺伝子を有するプラスミドを見出
し、ｐＫＳＲ２１と命名した。該ｐＫＳＲ２１をＢａｍ
ＨＩ消化、平滑末端化後さらにＰｓｔＩ消化し、アガロ
ースゲル電気泳動とPrep-A-Gene DNA Purification Sys
tem（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて約７ｋｂのＤＮＡ
断片を単離精製した。
【０１３０】該ＤＮＡ断片と、実施例２で作成したｐＫ
ＳＲ３０３をＥｃｏＲＩ消化、平滑末端化後さらにＰｓ
ｔＩ消化し、アガロースゲル電気泳動とPrep-A-Gene DN
APurification System（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて
単離精製した約２．９ｋｂのＤＮＡ断片とをライゲーシ
ョン反応によって連結した。該連結反応物を用いて、大
腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株を形質転換した。
ＳＲ３０３をＥｃｏＲＩ消化、平滑末端化後さらにＰｓ
ｔＩ消化し、アガロースゲル電気泳動とPrep-A-Gene DN
APurification System（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて
単離精製した約２．９ｋｂのＤＮＡ断片とをライゲーシ
ョン反応によって連結した。該連結反応物を用いて、大
腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株を形質転換した。
【０１３１】該形質転換体をアンピシリン１００μｇ／
ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間培
養し、アンピシリン耐性の形質転換体を取得した。該ア
ンピシリン耐性の形質転換体からプラスミドを抽出し、
制限酵素解析を行い、脱感作型ＰｒｏＢＡ、ＰｒｏＣ遺
伝子および４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子を有するプラスミドｐ
ＫＳＲ３２１を得た。
ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間培
養し、アンピシリン耐性の形質転換体を取得した。該ア
ンピシリン耐性の形質転換体からプラスミドを抽出し、
制限酵素解析を行い、脱感作型ＰｒｏＢＡ、ＰｒｏＣ遺
伝子および４（Ｒ）ＫＡＬ遺伝子を有するプラスミドｐ
ＫＳＲ３２１を得た。
【０１３２】本実施例のプラスミドの構築手順を図４に
示した。
示した。
【０１３３】実施例９ グリオキシル酸添加培養による
４（Ｒ）ＨＹＰ生産 実施例４で作成したＮＨＫ４６株からプロリンアナログ
のアゼチジン−２−カルボン酸に耐性となった変異株を
誘導した。即ち、実施例４と同様に培養したＮＨＫ４６
株に実施例４と同様に変異処理を施し、グルコース
０．５％、グルタミン酸 ０．５ｇ／ｌ、リポ酸 １００
μｇ／ｌ、アゼチジン−２−カルボン酸 １００ｍｇ／
ｌを添加したＭ９最少寒天培地に塗布し、３７℃で２日
間培養した。
４（Ｒ）ＨＹＰ生産 実施例４で作成したＮＨＫ４６株からプロリンアナログ
のアゼチジン−２−カルボン酸に耐性となった変異株を
誘導した。即ち、実施例４と同様に培養したＮＨＫ４６
株に実施例４と同様に変異処理を施し、グルコース
０．５％、グルタミン酸 ０．５ｇ／ｌ、リポ酸 １００
μｇ／ｌ、アゼチジン−２−カルボン酸 １００ｍｇ／
ｌを添加したＭ９最少寒天培地に塗布し、３７℃で２日
間培養した。
【０１３４】該培養において、大きなコロニーを形成し
て生育した、アゼチジン−２−カルボン酸耐性変異株Ｎ
ＨＫ４７株を取得した。ＮＨＫ４６株およびＮＨＫ４７
株に実施例８で作成したｐＫＳＲ３２１を導入し、アン
ピシリン耐性を指標に形質転換体を得た。各形質転換株
およびｐＫＳＲ３０３を保有するＮＨＫ４６株（実施例
４で作成）を実施例４と同様に培養し、これら培養上清
中の４（Ｒ）ＨＹＰ量をＨＰＬＣを用いて定量した。
て生育した、アゼチジン−２−カルボン酸耐性変異株Ｎ
ＨＫ４７株を取得した。ＮＨＫ４６株およびＮＨＫ４７
株に実施例８で作成したｐＫＳＲ３２１を導入し、アン
ピシリン耐性を指標に形質転換体を得た。各形質転換株
およびｐＫＳＲ３０３を保有するＮＨＫ４６株（実施例
４で作成）を実施例４と同様に培養し、これら培養上清
中の４（Ｒ）ＨＹＰ量をＨＰＬＣを用いて定量した。
【０１３５】ＨＰＬＣによる定量は以下のように行なっ
た。培養上清液８０μｌに１Ｍ 硼酸緩衝液（ｐＨ９．
６）２０μｌ、６ｍｇ／ｍｌ ＮＢＤ−Ｃｌ（7-chloro-
4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole chloride)を含むメタ
ノール溶液１００μｌを加え、遮光下６０℃、２０分間
反応させる。この反応液に１Ｎ ＨＣｌを５０μｌ添加
して反応を停止させた後、ミリポアフィルターで濾過
し、その濾液を以下の条件で分析した。
た。培養上清液８０μｌに１Ｍ 硼酸緩衝液（ｐＨ９．
６）２０μｌ、６ｍｇ／ｍｌ ＮＢＤ−Ｃｌ（7-chloro-
4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole chloride)を含むメタ
ノール溶液１００μｌを加え、遮光下６０℃、２０分間
反応させる。この反応液に１Ｎ ＨＣｌを５０μｌ添加
して反応を停止させた後、ミリポアフィルターで濾過
し、その濾液を以下の条件で分析した。
【０１３６】 移動相のグラジエントタイムプログラム 時間（min） B(Vol%) ０−１０ ０−８ １０−２０ ８−８０ ２０−２１ ８０−１００ ２１−２３ １００ ２３−２４ ０ 検出：Ｅｘ＝４７０ｎｍ， Ｅｍ＝５３０ｎｍの蛍光
検出 結果を第４表に示した。
検出 結果を第４表に示した。
【０１３７】
【表４】
【０１３８】実施例１０ ２段反応による４（Ｒ）ＨＹ
Ｐ生産 イソクエン酸デヒドロゲナーゼを欠損した大腸菌の変異
株ＥＢ１０６株〔E.coli Genetic Stock Center(Yal
e University, New Haven, CT, USA)より分与〕からＰ
１ファージによる形質導入法を用いて、大腸菌ＡＴＣＣ
３３６２５株にイソクエン酸デヒドロゲナーゼ欠損変異
（ｉｃｄ）を導入し、ＮＨＫ３株を作成した。本変異株
はｉｃｄ変異のためグルタミン酸要求性を示す。
Ｐ生産 イソクエン酸デヒドロゲナーゼを欠損した大腸菌の変異
株ＥＢ１０６株〔E.coli Genetic Stock Center(Yal
e University, New Haven, CT, USA)より分与〕からＰ
１ファージによる形質導入法を用いて、大腸菌ＡＴＣＣ
３３６２５株にイソクエン酸デヒドロゲナーゼ欠損変異
（ｉｃｄ）を導入し、ＮＨＫ３株を作成した。本変異株
はｉｃｄ変異のためグルタミン酸要求性を示す。
【０１３９】実施例８で作成したｐＫＳＲ１９を用いて
大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株を、実施例８で作成したｐ
ＫＳＲ１９およびｐＫＳＲ２１を用いて大腸菌ＮＨＫ３
株を、それぞれ形質転換し、アンピシリン耐性を指標に
各形質転換体を取得した。さらに大腸菌のグルタミン酸
デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｄｈ）を含むＰｓｔＩとＣ
ｌａＩサイトで挟まれた４．２ｋｂのＤＮＡ断片と大腸
菌のグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺
伝子（ｚｗｆ）を含むＢａｍＨＩとＳｐｈＩサイトで挟
まれた約３ｋｂのＤＮＡ断片を持ち、クロラムフェニコ
ール耐性遺伝子を有するｐＡＣＹＣ１７７由来のプラス
ミドｐＫＳＲ５０（図５に制限酵素地図を示した）を用
いてｐＫＳＲ２１を保有する大腸菌ＮＨＫ３株（ＮＨＫ
３／ｐＫＳＲ２１株）を形質転換し、アンピシリンとク
ロラムフェニコール両薬剤に耐性であることを指標に、
ｐＫＳＲ５０とｐＫＳＲ２１を保有するＮＨＫ３株（Ｎ
ＨＫ３／ｐＫＳＲ５０＋ｐＫＳＲ２１）を取得した。
大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株を、実施例８で作成したｐ
ＫＳＲ１９およびｐＫＳＲ２１を用いて大腸菌ＮＨＫ３
株を、それぞれ形質転換し、アンピシリン耐性を指標に
各形質転換体を取得した。さらに大腸菌のグルタミン酸
デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｄｈ）を含むＰｓｔＩとＣ
ｌａＩサイトで挟まれた４．２ｋｂのＤＮＡ断片と大腸
菌のグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺
伝子（ｚｗｆ）を含むＢａｍＨＩとＳｐｈＩサイトで挟
まれた約３ｋｂのＤＮＡ断片を持ち、クロラムフェニコ
ール耐性遺伝子を有するｐＡＣＹＣ１７７由来のプラス
ミドｐＫＳＲ５０（図５に制限酵素地図を示した）を用
いてｐＫＳＲ２１を保有する大腸菌ＮＨＫ３株（ＮＨＫ
３／ｐＫＳＲ２１株）を形質転換し、アンピシリンとク
ロラムフェニコール両薬剤に耐性であることを指標に、
ｐＫＳＲ５０とｐＫＳＲ２１を保有するＮＨＫ３株（Ｎ
ＨＫ３／ｐＫＳＲ５０＋ｐＫＳＲ２１）を取得した。
【０１４０】また大腸菌Ｋ−１２株系統で、変異型（ｉ
ｃｄ，ｓｕｃＡ，ｐｕｔＡ，ｅｄａ）を有する変異株Ｎ
ＨＫ２３株にも同様にしてｐＫＳＲ５０とｐＫＳＲ２１
を導入し、ＮＨＫ２３／ｐＫＳＲ５０＋ｐＫＳＲ２１株
を取得した。大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株、上記の様に
して造成したＮＨＫ３、ＡＴＣＣ３３６２５／ｐＫＳＲ
１９株、ＮＨＫ３／ｐＫＳＲ１９株、ＮＨＫ３／ｐＫＳ
Ｒ５０＋ｐＫＳＲ２１株およびＮＨＫ２３／ｐＫＳＲ５
０＋ｐＫＳＲ２１株を実施例４と同様にＴ培地中で３０
℃にて２４時間培養した後、実施例５で作成した４
（Ｒ）ＫＨＧを含有する培養上清をミリポア濾過滅菌し
たものを４（Ｒ）ＫＨＧの終濃度が４０ｍＭになるよう
に添加し、３７℃でさらに２４時間振盪培養した。
ｃｄ，ｓｕｃＡ，ｐｕｔＡ，ｅｄａ）を有する変異株Ｎ
ＨＫ２３株にも同様にしてｐＫＳＲ５０とｐＫＳＲ２１
を導入し、ＮＨＫ２３／ｐＫＳＲ５０＋ｐＫＳＲ２１株
を取得した。大腸菌ＡＴＣＣ３３６２５株、上記の様に
して造成したＮＨＫ３、ＡＴＣＣ３３６２５／ｐＫＳＲ
１９株、ＮＨＫ３／ｐＫＳＲ１９株、ＮＨＫ３／ｐＫＳ
Ｒ５０＋ｐＫＳＲ２１株およびＮＨＫ２３／ｐＫＳＲ５
０＋ｐＫＳＲ２１株を実施例４と同様にＴ培地中で３０
℃にて２４時間培養した後、実施例５で作成した４
（Ｒ）ＫＨＧを含有する培養上清をミリポア濾過滅菌し
たものを４（Ｒ）ＫＨＧの終濃度が４０ｍＭになるよう
に添加し、３７℃でさらに２４時間振盪培養した。
【０１４１】該培養上清中の４（Ｒ）ＨＹＰ量をＨＰＬ
Ｃで定量した。結果を第５表に示した。コリネバクテリ
ウム グルタミクムＫＹ１０９１２株をＬＢ培地中で１
６時間振盪培養した。該培養液０．５ｍｌを滅菌した５
ｍｌのＴＣ培地に添加し、３０℃で２４時間振盪培養し
た後、ミリポア濾過滅菌した実施例５で作成したＲ−Ｋ
ＨＧを含有する培養上清を４（Ｒ）ＫＨＧの終濃度が４
０ｍＭになるように添加し、３７℃でさらに２４時間振
盪培養した。
Ｃで定量した。結果を第５表に示した。コリネバクテリ
ウム グルタミクムＫＹ１０９１２株をＬＢ培地中で１
６時間振盪培養した。該培養液０．５ｍｌを滅菌した５
ｍｌのＴＣ培地に添加し、３０℃で２４時間振盪培養し
た後、ミリポア濾過滅菌した実施例５で作成したＲ−Ｋ
ＨＧを含有する培養上清を４（Ｒ）ＫＨＧの終濃度が４
０ｍＭになるように添加し、３７℃でさらに２４時間振
盪培養した。
【０１４２】該培養培養上清中の４（Ｒ）ＨＹＰ量をＨ
ＰＬＣで定量した。結果を第５表に示した。
ＰＬＣで定量した。結果を第５表に示した。
【０１４３】
【表５】
【０１４４】実施例１１ マイクロジャーファーメンタ
ーでの４（Ｒ）ＨＹＰ生産 実施例１０で造成したエシェリヒア コリＮＨＫ２３／
ｐＫＳＲ５０＋ｐＫＳＲ２１株をグルコース １％、炭
酸カルシウム ２％、グルタミン酸 ２ｇ／ｌを添加した
ＬＢ培地に植菌し、２８℃で１３時間振盪培養した。該
培養液０．５ｍｌを、同じ組成の培地１０ｍｌを入れ滅
菌した３００ｍｌ容三角フラスコに添加し、２８℃で１
３時間振盪培養した。
ーでの４（Ｒ）ＨＹＰ生産 実施例１０で造成したエシェリヒア コリＮＨＫ２３／
ｐＫＳＲ５０＋ｐＫＳＲ２１株をグルコース １％、炭
酸カルシウム ２％、グルタミン酸 ２ｇ／ｌを添加した
ＬＢ培地に植菌し、２８℃で１３時間振盪培養した。該
培養液０．５ｍｌを、同じ組成の培地１０ｍｌを入れ滅
菌した３００ｍｌ容三角フラスコに添加し、２８℃で１
３時間振盪培養した。
【０１４５】該培養液全量を、リポ酸を除いたＪ２培地
９０ｍｌを入れ滅菌した２００ｍｌ容ジャーファーメン
ターに添加し、アンモニア水でｐＨを６．８に保ちつ
つ、通気２００ｍｌ／ｍｉｎ、撹拌８００ｒｐｍ、３３
℃の条件で培養した。
９０ｍｌを入れ滅菌した２００ｍｌ容ジャーファーメン
ターに添加し、アンモニア水でｐＨを６．８に保ちつ
つ、通気２００ｍｌ／ｍｉｎ、撹拌８００ｒｐｍ、３３
℃の条件で培養した。
【０１４６】培養１４時間後に、培養温度を４０℃にあ
げ、さらに８時間培養後、培養温度を３７℃に下げた。
培養２２時間目に、ジャーファーメンターから培養液を
２７ｍｌ抜き取り、該ジャーファーメンターに実施例５
で作成した４（Ｒ）ＫＨＧを含有する培養上清２７ｍｌ
をミリポア濾過滅菌後添加した〔４（Ｒ）ＫＨＧ終濃度
８０ｍＭ〕。
げ、さらに８時間培養後、培養温度を３７℃に下げた。
培養２２時間目に、ジャーファーメンターから培養液を
２７ｍｌ抜き取り、該ジャーファーメンターに実施例５
で作成した４（Ｒ）ＫＨＧを含有する培養上清２７ｍｌ
をミリポア濾過滅菌後添加した〔４（Ｒ）ＫＨＧ終濃度
８０ｍＭ〕。
【０１４７】３７℃の条件で、該ジャーファーメンター
に適宜グルコースを添加しながら４０時間培養を継続し
た。該培養上清中の４（Ｒ）ＨＹＰをＨＰＬＣで分析し
た。該培養により４９．９ｍＭ（６．５ｇ／ｌ）の４
（Ｒ）ＨＹＰが生成した。
に適宜グルコースを添加しながら４０時間培養を継続し
た。該培養上清中の４（Ｒ）ＨＹＰをＨＰＬＣで分析し
た。該培養により４９．９ｍＭ（６．５ｇ／ｌ）の４
（Ｒ）ＨＹＰが生成した。
【０１４８】参考例１ ｐＴｒＳ３３の構築 ＰＴｒＳ３３は特開昭５８−１１０６００および特開平
２−２２７０７５に記載された手順に従って容易に構築
することができる。以下に該プラスミドの構築方法を示
す。
２−２２７０７５に記載された手順に従って容易に構築
することができる。以下に該プラスミドの構築方法を示
す。
【０１４９】大腸菌ＩＫＹＰ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−６９
６２）より単離したプラスミドｐＫＹＰ−１をＴａｑ１
で部分消化後、ＥｃｏＲＩで消化し、得られた、トリプ
トファンプロモーターとＳＤ配列を含む約２．６ｋｂの
ＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動法により精製、
取得した。ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）をＴａｑ１で部
分消化した後、ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電
気泳動法により約４．３３ｋｂのＤＮＡ断片を精製、取
得した。
６２）より単離したプラスミドｐＫＹＰ−１をＴａｑ１
で部分消化後、ＥｃｏＲＩで消化し、得られた、トリプ
トファンプロモーターとＳＤ配列を含む約２．６ｋｂの
ＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動法により精製、
取得した。ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）をＴａｑ１で部
分消化した後、ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電
気泳動法により約４．３３ｋｂのＤＮＡ断片を精製、取
得した。
【０１５０】得られた約２．６ｋｂのＤＮＡ断片および
約４．３３ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結した。該連結ＤＮＡを用い、マニアチスらの方
法〔モレキュラー・クローニング 第２版〕に従って大
腸菌Ｃ６００ＳＦＳ株を形質転換し、アンピシリンおよ
びテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７
℃で２４時間インキュベートした。
約４．３３ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結した。該連結ＤＮＡを用い、マニアチスらの方
法〔モレキュラー・クローニング 第２版〕に従って大
腸菌Ｃ６００ＳＦＳ株を形質転換し、アンピシリンおよ
びテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７
℃で２４時間インキュベートした。
【０１５１】生育してきたアンピシリンおよびテトラサ
イクリンに耐性を示す形質転換体よりプラスミドｐＫＹ
Ｐ−５を抽出、取得した。該ｐＫＹＰ−５をＨａｐIIと
ＨｉｎｄIIIで消化し約３４０ｂｐのＤＮＡ断片を取得
した。該約３４０ｂｐのＤＮＡ断片を、ＣｌａＩとＨｉ
ｎｄIIIで消化したｐＢＲ３２２に挿入してｐＫＹＰ−
１０を取得した。
イクリンに耐性を示す形質転換体よりプラスミドｐＫＹ
Ｐ−５を抽出、取得した。該ｐＫＹＰ−５をＨａｐIIと
ＨｉｎｄIIIで消化し約３４０ｂｐのＤＮＡ断片を取得
した。該約３４０ｂｐのＤＮＡ断片を、ＣｌａＩとＨｉ
ｎｄIIIで消化したｐＢＲ３２２に挿入してｐＫＹＰ−
１０を取得した。
【０１５２】該ｐＫＹＰ−１０をＢａｎIIIとＮｒｕＩ
で消化した後、アガロースゲル電気泳動法により、トリ
プトファンプロモーターを含む約３．８ｋｂのＤＮＡ断
片を精製、取得した（ＢａｎIII−ＮｒｕＩ断片）。ト
リプトファンプロモーターの下流にＡＴＧ開始コドンを
付与するために、配列番号６および７に示されるＤＮＡ
配列を有する２種類のＤＮＡリンカーをトリエステル法
によって合成した。
で消化した後、アガロースゲル電気泳動法により、トリ
プトファンプロモーターを含む約３．８ｋｂのＤＮＡ断
片を精製、取得した（ＢａｎIII−ＮｒｕＩ断片）。ト
リプトファンプロモーターの下流にＡＴＧ開始コドンを
付与するために、配列番号６および７に示されるＤＮＡ
配列を有する２種類のＤＮＡリンカーをトリエステル法
によって合成した。
【０１５３】これら合成ＤＮＡリンカーをＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼを用いてリン酸化した後、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて、上記で取得したｐＫＹＰ−１０由来
のＢａｎIII−ＮｒｕＩ断片と連結した。該連結ＤＮＡ
を用い、マニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニ
ング 第２版〕に従って大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換
し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃
で２４時間インキュベートした。
レオチドキナーゼを用いてリン酸化した後、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて、上記で取得したｐＫＹＰ−１０由来
のＢａｎIII−ＮｒｕＩ断片と連結した。該連結ＤＮＡ
を用い、マニアチスらの方法〔モレキュラー・クローニ
ング 第２版〕に従って大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換
し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃
で２４時間インキュベートした。
【０１５４】生育してきたアンピシリンに耐性を示す形
質転換体よりプラスミドｐＴｒＳ２０を抽出、取得し
た。該ｐＴｒＳ２０をＳａｃＩとＰｓｔＩで消化後、ア
ガロースゲル電気泳動法により約１．１５ｋｂのＤＮＡ
断片を精製、取得した（ＳａｃＩ−ＰｓｔＩ断片）。
質転換体よりプラスミドｐＴｒＳ２０を抽出、取得し
た。該ｐＴｒＳ２０をＳａｃＩとＰｓｔＩで消化後、ア
ガロースゲル電気泳動法により約１．１５ｋｂのＤＮＡ
断片を精製、取得した（ＳａｃＩ−ＰｓｔＩ断片）。
【０１５５】大腸菌ＩＫＹＰ−２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−
８６３）より単離したｐＫＹＰ２６をＢａｍＨＩで消化
後、アガロースゲル電気泳動法により約１．７ｋｂのＤ
ＮＡ断片を精製、取得した（ＢａｍＨＩ断片）。またM1
3mp18RF ＤＮＡ（宝酒造社製）をＳａｃＩとＣｌａＩで
消化後、アガロースゲル電気泳動法により約０．６５ｋ
ｂのＤＮＡ断片を精製した（ＳａｃＩ−ＣｌａＩ断
片）。
８６３）より単離したｐＫＹＰ２６をＢａｍＨＩで消化
後、アガロースゲル電気泳動法により約１．７ｋｂのＤ
ＮＡ断片を精製、取得した（ＢａｍＨＩ断片）。またM1
3mp18RF ＤＮＡ（宝酒造社製）をＳａｃＩとＣｌａＩで
消化後、アガロースゲル電気泳動法により約０．６５ｋ
ｂのＤＮＡ断片を精製した（ＳａｃＩ−ＣｌａＩ断
片）。
【０１５６】更に、配列番号８および９に示されるＤＮ
Ａ配列を有する２種類のＤＮＡリンカーをアプライド・
バイオシステムズ社３８０Ａ ＤＮＡ合成機を用いて合
成し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いリン酸化し
た。上記で得られたｐＴｒＳ２０由来のＳａｃＩ−Ｐｓ
ｔＩ断片、ｐＫＹＰ２６由来のＢａｍＨＩ断片、M13mp1
8RF ＤＮＡ由来のＳａｃＩ−ＣｌａＩ断片および５’り
ん酸化された上記２つの合成ＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結した。
Ａ配列を有する２種類のＤＮＡリンカーをアプライド・
バイオシステムズ社３８０Ａ ＤＮＡ合成機を用いて合
成し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いリン酸化し
た。上記で得られたｐＴｒＳ２０由来のＳａｃＩ−Ｐｓ
ｔＩ断片、ｐＫＹＰ２６由来のＢａｍＨＩ断片、M13mp1
8RF ＤＮＡ由来のＳａｃＩ−ＣｌａＩ断片および５’り
ん酸化された上記２つの合成ＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結した。
【０１５７】該連結ＤＮＡを用い、マニアチスらの方法
〔モレキュラー・クローニング 第２版〕に従って大腸
菌ATCC33625株を形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ
寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間インキュベートし
た。生育してきたアンピシリンに耐性を示す形質転換体
よりプラスミドｐＴｒＳ３３を抽出、取得した。
〔モレキュラー・クローニング 第２版〕に従って大腸
菌ATCC33625株を形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ
寒天培地に塗布し、３７℃で２４時間インキュベートし
た。生育してきたアンピシリンに耐性を示す形質転換体
よりプラスミドｐＴｒＳ３３を抽出、取得した。
【０１５８】
【発明の効果】本発明により、グリオキシル酸とピルビ
ン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル
酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸のみを生成する反応を触媒する酵素４（Ｒ）−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ、該酵素をコ
ードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得ら
れる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導
入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いた４
（Ｒ）ＫＨＧ、４（Ｒ）ＨＧまたは４（Ｒ）ＨＹＰの製
造法を提供することができる。
ン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル
酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸のみを生成する反応を触媒する酵素４（Ｒ）−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼ、該酵素をコ
ードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得ら
れる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導
入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いた４
（Ｒ）ＫＨＧ、４（Ｒ）ＨＧまたは４（Ｒ）ＨＹＰの製
造法を提供することができる。
【０１５９】また、アミノ基供与体および４（Ｒ）ＫＨ
Ｇから４（Ｒ）ＨＹＰを生成する活性を有する生体触媒
を用いた４（Ｒ）ＨＹＰの製造法を提供することができ
る。
Ｇから４（Ｒ）ＨＹＰを生成する活性を有する生体触媒
を用いた４（Ｒ）ＨＹＰの製造法を提供することができ
る。
【０１６０】
配列番号： 1 配列の長さ： 208 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met His Val Leu Ser Gln Ile Lys Glu Gln Lys Val Ile Ala Ile Ile 1 5 10 15 Arg Gly Tyr Asn Pro Glu Glu Ala Val Ser Ile Ala Gly Ala Leu Lys 20 25 30 Ala Gly Gly Ile Arg Leu Val Glu Ile Thr Leu Asn Ser Pro Gln Ala 35 40 45 Ile Lys Ala Ile Glu Ala Val Ser Glu Asp Phe Gly Asp Glu Met Leu 50 55 60 Ile Gly Ala Gly Thr Val Leu Asp Pro Glu Ser Ala Arg Ala Ala Leu 65 70 75 80 Leu Ala Gly Ala Arg Phe Ile Leu Ser Pro Ile Val His Glu Glu Thr 85 90 95 Ile Lys Leu Thr Lys Arg Tyr Gly Ala Val Ser Ile Pro Gly Ala Phe 100 105 110 Thr Pro Thr Glu Ile Leu Lys Ala Tyr Glu Ser Gly Gly Asp Ile Ile 115 120 125 Lys Val Phe Pro Gly Thr Met Gly Pro Gly Tyr Ile Lys Asp Ile His 130 135 140 Gly Pro Phe Pro His Ile Pro Leu Leu Pro Thr Gly Gly Val Gly Leu 145 150 155 160 Glu Asn Leu His Glu Phe Leu Gln Ala Gly Ala Val Gly Ala Gly Ile 165 170 175 Gly Gly Ser Leu Val Arg Ala His Gln Asp Val Asn Asp Ala Phe Leu 180 185 190 Glu Val Leu Ser Lys Lys Ala Lys Gln Phe Val Glu Ala Ala Lys Gln 195 200 205
【０１６１】配列番号： 2 配列の長さ： 624 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：バチルス エスピー（Bacillus sp.） 株名：OC187 配列 ATGCATGTAT TGTCACAAAT CAAAGAACAA AAAGTGATTG CGATCATCCG CGGATACAAT 60 CCGGAGGAGG CAGTGAGCAT TGCCGGCGCC TTAAAAGCGG GCGGCATCAG GCTTGTGGAA 120 ATTACGCTCA ATTCCCCTCA AGCGATCAAA GCGATTGAAG CGGTTTCAGA AGATTTTGGA 180 GACGAAATGC TTATCGGAGC GGGAACCGTT CTTGATCCCG AATCTGCGAG AGCGGCGCTT 240 TTAGCCGGCG CGCGGTTTAT CCTGTCGCCA ATTGTTCATG AAGAGACGAT CAAGCTGACA 300 AAGCGATATG GAGCGGTCAG CATTCCGGGC GCCTTTACCC CGACGGAAAT ATTGAAGGCG 360 TATGAAAGCG GGGGAGACAT CATCAAAGTA TTTCCCGGAA CGATGGGGCC TGGCTATATC 420 AAAGATATCC ACGGACCGTT TCCGCATATT CCGCTGCTTC CGACGGGAGG GGTCGGGTTG 480 GAAAACCTTC ACGAGTTTTT ACAGGCCGGT GCGGTCGGTG CTGGAATCGG CGGTTCACTT 540 GTCAGGGCTC ATCAAGATGT AAATGACGCG TTTTTAGAAG TGCTGTCCAA AAAAGCAAAG 600 CAATTTGTTG AAGCAGCAAA ACAG 624
【０１６２】配列番号： 3 配列の長さ： 624 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：バチルス エスピー（Bacillus sp.） 株名：OC187 配列 ATGCACGTAC TGTCTCAAAT CAAAGAACAA AAAGTGATTG CGATCATCCG CGGATACAAT 60 CCGGAGGAGG CAGTGAGCAT TGCCGGCGCC TTAAAAGCGG GCGGCATCAG GCTTGTGGAA 120 ATTACGCTCA ATTCCCCTCA AGCGATCAAA GCGATTGAAG CGGTTTCAGA AGATTTTGGA 180 GACGAAATGC TTATCGGAGC GGGAACCGTT CTTGATCCCG AATCTGCGAG AGCGGCGCTT 240 TTAGCCGGCG CGCGGTTTAT CCTGTCGCCA ATTGTTCATG AAGAGACGAT CAAGCTGACA 300 AAGCGATATG GAGCGGTCAG CATTCCGGGC GCCTTTACCC CGACGGAAAT ATTGAAGGCG 360 TATGAAAGCG GGGGAGACAT CATCAAAGTA TTTCCCGGAA CGATGGGGCC TGGCTATATC 420 AAAGATATCC ACGGACCGTT TCCGCATATT CCGCTGCTTC CGACGGGAGG GGTCGGGTTG 480 GAAAACCTTC ACGAGTTTTT ACAGGCCGGT GCGGTCGGTG CTGGAATCGG CGGTTCACTT 540 GTCAGGGCTC ATCAAGATGT AAATGACGCG TTTTTAGAAG TGCTGTCCAA AAAAGCAAAG 600 CAATTTGTTG AAGCAGCAAA ACAG 624
【０１６３】配列番号：４ 配列の長さ： 30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 GTCATCGATA TGCACGTACT GTCTCAAATC 30
【０１６４】配列番号５ 配列の長さ： 27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 TGCGGATCCT TACTGTTTTG CTGCTTC 27
【０１６５】配列番号６ 配列の長さ： 19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 CGATAAGCTT ATGAGCTCG 19
【０１６６】配列番号７ 配列の長さ： 17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 CGAGCTCATA AGCTTAT 17
【０１６７】配列番号８ 配列の長さ： 49 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 CGATAAGCTT ATGATATCCA ACGTCGACGA CGGCGTCGAA CCATGGCCG 49
【０１６８】配列番号９ 配列の長さ： 51 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 GATCCGGCCA TGGTTCGACG CCGTCGTCGA CGTTGGATAT CATAAGCTTA T 51
【図１】図１はｐＫＳＲ２０１上にクローニングされた
Bacillus sp.OC187株由来のＤ片の制限酵素地図を示し
た図である。
Bacillus sp.OC187株由来のＤ片の制限酵素地図を示し
た図である。
【図２】図２はｐＫＳＲ３０３の制限酵素地図を示した
図である。
図である。
【図３】図３はｐＫＳＲ８０３の制限酵素地図を示した
図である。
図である。
【図４】図４はｐＫＳＲ１９、ｐＫＳＲ２１、ｐＫＳＲ
３２１の作成手順と構造を示した図である。
３２１の作成手順と構造を示した図である。
【図５】図５はｐＫＳＲ５０の制限酵素地図を示した図
である。
である。
Ａｍｐ：ｐＢＲ３２２由来アンピシリン耐性遺伝子 Ｐｔｒｐ：トリプトファンプロモーター ４（Ｒ）ＫＡＬ：４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
アルドラーゼをコードする遺伝子 Ｓｐｃ：スペクチノマイシン耐性遺伝子 ｌａｃｌｑ：過剰生産型lacリプレッサー遺伝子 Ｐｔａｃ：tacプロモーター ＰｒｏＢＡＲ：フィードバック阻害緩和型変異プロリン
生合成遺伝子ProBA ＰｐＬ：ラムダファージ由来pLプロモーター ＰｒｏＣ：プロリン生合成遺伝子ProC ＺＷＦ：グルコース-6リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 ＧＤＨ：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 Ｃｍ：クロラムフェニコール耐性遺伝子 ｏｒｉ１７７：pACYC177複製起点
アルドラーゼをコードする遺伝子 Ｓｐｃ：スペクチノマイシン耐性遺伝子 ｌａｃｌｑ：過剰生産型lacリプレッサー遺伝子 Ｐｔａｃ：tacプロモーター ＰｒｏＢＡＲ：フィードバック阻害緩和型変異プロリン
生合成遺伝子ProBA ＰｐＬ：ラムダファージ由来pLプロモーター ＰｒｏＣ：プロリン生合成遺伝子ProC ＺＷＦ：グルコース-6リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 ＧＤＨ：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 Ｃｍ：クロラムフェニコール耐性遺伝子 ｏｒｉ１７７：pACYC177複製起点
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 13/24 Ｃ１２Ｐ 13/24 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｐ 7/50 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 7/50 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/50 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 7/50 Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｐ 7/50 Ｃ１２Ｒ 1:45） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ｃ１２Ｒ 1:425）
Claims (26)
- 【請求項１】グリオキシル酸とピルビン酸とから、４
（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生成せず、
４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のみを生成
する反応を触媒する４（Ｒ）−ヒドロキシ-2-ケトグル
タル酸アルドラーゼ。 - 【請求項２】４（Ｒ）−ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸
アルドラーゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を
有するポリペプチド、または配列番号１で表されるアミ
ノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が置換、欠失または付
加したアミノ酸配列を有し、かつグリオキシル酸とピル
ビン酸とから、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸は生成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグル
タル酸のみを生成する反応を触媒する活性を有するポリ
ペプチドである、請求項１記載の４（Ｒ）−ヒドロキシ
-2-ケトグルタル酸アルドラーゼ。 - 【請求項３】請求項１または２記載の４（Ｒ）−ヒドロ
キシ-2-ケトグルタル酸アルドラーゼをコードするＤＮ
Ａ。 - 【請求項４】ＤＮＡが、バチルス属に属する微生物由来
のＤＮＡである、請求項３記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】バチルス属に属する微生物が、バチルス
エスピーＯＣ１８７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４６４６）で
ある、請求項４記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】ＤＮＡが、配列番号２または３で表される
塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである、請求
項３記載のＤＮＡ。 - 【請求項７】請求項３〜６のいずれかに記載のＤＮＡを
ベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項８】組換え体ＤＮＡが、ｐＫＳＲ２２２、ｐＫ
ＳＲ３０３、ｐＫＳＲ３２１およびｐＫＳＲ８０３から
選ばれる組換え体ＤＮＡである、請求項７記載の組換え
体ＤＮＡ。 - 【請求項９】請求項７または８記載の組換え体ＤＮＡを
宿主細胞に導入して得られる形質転換体。 - 【請求項１０】宿主細胞が、エシェリヒア属、コリネバ
クテリウム属、クレブシエラ属およびセラチア属に属す
る微生物から選ばれる微生物である請求項９記載の形質
転換体。 - 【請求項１１】エシェリヒア属に属する微生物がエシェ
リヒア・コリＮＨＫ４６／ｐＫＳＲ３０３である、請求
項１０記載の形質転換体。 - 【請求項１２】請求項９、１０または１１記載の形質転
換体を培地中で培養し、グリオキシル酸とピルビン酸と
から、４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は生
成せず、４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の
みを生成する反応を触媒する４（Ｒ）−ヒドロキシ-2-
ケトグルタル酸アルドラーゼを生成蓄積させ、該培養物
より該４（Ｒ）−ヒドロキシ-2-ケトグルタル酸アルド
ラーゼを採取することを特徴とする４（Ｒ）−ヒドロキ
シ-2-ケトグルタル酸アルドラーゼの製造法。 - 【請求項１３】請求項９、１０または１１記載の形質転
換体由来であり、かつグリオキシル酸とピルビン酸とか
ら４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成す
る活性を有する生体触媒Ｉ、ピルビン酸およびグリオキ
シル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体
中に４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成
させ、生成した４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸を該水性媒体中より採取することを特徴とする４
（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法。 - 【請求項１４】形質転換体が、１）グリオキシル酸とピ
ルビン酸とから４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸を生成する能力を有しない、２）リポ酸に対する栄
養要求性を有する、および３）リンゴ酸シンターゼ活性
の低いあるいは有しないという性質の中から選ばれる１
つ以上の性質を有する形質転換体である、請求項１３記
載の製造法。 - 【請求項１５】生体触媒Ｉが、微生物の培養物、菌体ま
たはそれらの処理物である、請求項１３記載の製造法。 - 【請求項１６】ピルビン酸が、請求項１３または１４記
載の形質転換体によりピルビン酸に転換することのでき
る化合物から、該形質転換体により転換されたピルビン
酸である、請求項１３記載の製造法。 - 【請求項１７】ピルビン酸に転換することのできる化合
物がグルコース、フラクトース、マルトース、グリセロ
ール、乳酸または乳酸アンモニウムである請求項１６記
載の製造法。 - 【請求項１８】請求項９、１０または１１記載の形質転
換体、アミノ基供与体、糖質およびグリオキシル酸を水
性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に４
（Ｒ）−ヒドロキシ−２−Ｌ−グルタミン酸を生成さ
せ、生成した４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−Ｌ−グルタミ
ン酸を該水性媒体中より採取することを特徴とする４
（Ｒ）−ヒドロキシ−２−Ｌ−グルタミン酸の製造法。 - 【請求項１９】形質転換体が、１）グリオキシル酸とピ
ルビン酸とから４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸を生成する能力を有しない、２）リポ酸に対する栄
養要求性を有する、３）リンゴ酸シンターゼ活性の低い
あるいは有しない、および４）ホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ活性を有しないという性質の中から
選ばれる１つ以上の性質を有する形質転換体である、請
求項１８記載の製造法。 - 【請求項２０】請求項９、１０または１１記載の形質転
換体、アミノ基供与体、糖質およびグリオキシル酸を水
性媒体中に存在させることにより、水性媒体中に４
（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成させ、生成し
た４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを該水性媒体中
より採取することを特徴とする４（Ｒ）−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンの製造法。 - 【請求項２１】形質転換体が、１）グリオキシル酸とピ
ルビン酸とから４（Ｓ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸を生成する能力を有しない、２）リポ酸に対する栄
養要求性を有する、３）リンゴ酸シンターゼ活性の低い
あるいは有しない、４）ホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼ活性を有しない、および５）プロリンアナ
ログに対して耐性を有するという性質の中から選ばれる
１つ以上の性質を有する形質転換体である、請求項２０
記載の製造法。 - 【請求項２２】アミノ基供与体および４（Ｒ）−ヒドロ
キシ−２−ケトグルタル酸から４（Ｒ）−ヒドロキシ−
Ｌ−プロリンを生成する活性を有する生体触媒II、アミ
ノ基供与体および４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグル
タル酸を水性媒体中に存在させることにより、水性媒体
中に４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成させ、
生成した４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを該水性
媒体中より採取することを特徴とする４（Ｒ）−ヒドロ
キシ−Ｌ−プロリンの製造法。 - 【請求項２３】生体触媒IIが微生物の培養物、菌体また
はそれらの処理物である請求項２２記載の製造法。 - 【請求項２４】微生物が、エシェリヒア属またはコリネ
バクテリウム属に属する微生物である請求項２３記載の
製造法。 - 【請求項２５】微生物が、１）グルタミン酸に対する栄
養要求性を有する、および２）プロリンアナログに対し
て耐性を有するという性質の中から選ばれる１つ以上の
性質を有する微生物である、請求項２３または２４記載
の製造法。 - 【請求項２６】４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸が請求項１３〜１７のいずれかに記載の製造法によ
り製造された４（Ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル
酸である、請求項２３記載の製造法。
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|---|---|---|---|
| JP32553497A JP4047958B2 (ja) | 1997-11-27 | 1997-11-27 | ４（ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼおよび該酵素をコードするｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP32553497A JP4047958B2 (ja) | 1997-11-27 | 1997-11-27 | ４（ｒ）−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸アルドラーゼおよび該酵素をコードするｄｎａ |
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| JPH11155572A true JPH11155572A (ja) | 1999-06-15 |
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