KR100768016B1 - 신규 트랜스알도라아제 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명의 목적은 신규 트랜스알도라아제 유전자 및, 이 유전자에 코드되는 폴리펩티드, 이 유전자를 조합하여 얻어지는 재조합체 DNA, 이 재조합체 DNA 를 보유하는 미생물 및, 이 미생물을 이용한 방향족 아미노산, 방향족 비타민, L-히스티딘, 리보플라빈, 핵산, 핵산 관련 물질, 신규 당 등의 제조법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의검토하였다. 그 결과, 코리네박테리움속에 속하며, 쉬키미산 요구성 변이주로서 취득되는 트랜스 케토라아제 결손 변이주의 쉬키미산 요구성을 상보하는 DNA 단편으로서, 코리네박테리움속에 속하는 미생물의 염색체 DNA 로부터 신규 트랜스알도라아제 유전자를 단리하였다. 또한, 이 유전자를 포함하는 재조합체 DNA 를 구축하고, 이 재조합체 DNA 를 숙주 미생물에 도입함으로써 상기 목적을 달성할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

Description

신규 트랜스알도라아제 유전자 {NOVEL TRANSALDOLASE GENE}

본 발명은 신규로 발견된 트랜스알도라아제 유전자 및, 이 유전자에 코드되는 폴리펩티드, 이 유전자를 조합하여 얻어지는 재조합체 DNA, 이 재조합체 DNA 를 보유하는 형질전환체 및, 이 형질전환체를 이용한, 상기 폴리펩티드, 방향족 아미노산, 방향족 비타민, L-히스티딘, 리보플라빈, 핵산, 핵산 관련 물질, 또는 신규 당 등의 제조법에 관한 것이다.

트랜스알도라아제는 펜토오스 인산 경로의 효소이며, 방향족 아미노산이나 방향족 비타민 등의 방향족 화합물, 퓨린뉴클레오티드나 피리미딘뉴클레오티드 등의 핵산 관련 물질, L-히스티딘, 리보플라빈 등의 생합성이나 대사에 중요한 역할을 하고 있다 [Arch. Microbiol., 164, 324 (1995)]. 따라서, 그들 대사산물의 효율적인 발효생산균을 육종하기 위한 표적으로서, 트랜스알도라아제 유전자 및 그 유전자 산물은 유용하다.

트랜스알도라아제를 코드하는 DNA 에 대해서는, 에쉐리키아ㆍ콜리 유래의 유전자 [GeneBank Accession Number D13159], 마이코박테리움ㆍ튜버큘로시스 유래의 유전자 [Nature, 393, 537 (1998)], 시네코코커스 유래의 유전자 [Plant Mol. Biol., 30, 213 (1996)] 등이 단리되어 그 염기서열이 결정되어 있다.

또, 에쉐리키아ㆍ콜리에서는 트랜스알도라아제 활성을 증가시키면 방향족 화합물 등의 생산성이 향상되는 것이 보고되어 있다 (WO98/18936).

그러나, 아미노산 발효 등에서 널리 사용되고 있는 산업상 중요한 코리네박테리움속에 속하는 미생물에 대해서는, 이제까지 트랜스알도라아제 유전자나 이 유전자에 코드되는 효소에 관한 보고는 없고, 따라서 그 염기서열에 대해서도 전혀 알려져 있지 않았다.

트랜스알도라아제를 사용한 당의 합성에 대해서는, 전분을 처리한 것으로부터 D-프룩토오스를 생성하기 위해 사용된 예 [J. Am. Chem. Soc., 114, 6980 (1992)] 가 보고되어 있다.

발명의 개시

본 발명의 과제는 신규로 발견된 트랜스알도라아제 유전자 및, 이 유전자에 코드되는 폴리펩티드, 이 유전자를 조합하여 얻어지는 재조합체 DNA, 이 재조합체 DNA 를 보유하는 형질전환체 및, 이 형질전환체를 이용한, 상기 폴리펩티드, 방향족 아미노산, 방향족 비타민, L-히스티딘, 리보플라빈, 핵산 및 핵산 관련 물질, 신규 당 등의 제조법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해, 재조합 DNA 수법을 구사하여 코리네박테리움속에 속하는 미생물의 염색체 유래의 유전자에 관하여 예의검토하였다. 그 결과, 펜토오스 인산 경로상에서 트랜스알도라아제와는 다른 효소인 트랜스 케토라아제를 코드하는 유전자의 3' 측 하류에 트랜스알도라아제 유전자가 인접하여 존재하는 것을 처음으로 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 본 발명은 하기 (1) ∼ (16) 에 관한 것이다.

(1) 서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.

(2) 서열번호 1 에 기재된 폴리펩티드에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 트랜스알도라아제 활성을 갖는 폴리펩티드.

(3) 서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열과 60 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 트랜스알도라아제 활성을 갖는 폴리펩티드.

(4) 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나의 폴리펩티드를 코드하는 DNA.

(5) 서열번호 2 에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA.

(6) 상기 (4) 또는 (5) 의 DNA 와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 트랜스알도라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA.

(7) 상기 (4) ∼ (6) 중 어느 하나의 DNA 를 벡터에 조합하여 얻어지는 재조합체 DNA.

(8) 상기 (7) 의 재조합체 DNA 를 보유하는 형질전환체.

(9) 상기 (8) 의 형질전환체가 보유하는 상기 (4) ∼ (6) 중 어느 하나의 DNA, 또는 이 DNA 의 상류에 존재하는 전사ㆍ번역에 관계되는 DNA 의 염기서열 중에 1 이상의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되고, 또한 이 치환, 결실 또는 삽입 전과 비교하여 트랜스알도라아제의 활성이 증강된 형질전환체.

(10) 형질전환체가 방향족 아미노산 또는 방향족 비타민을 생산하는 능력을 갖는 형질전환체인 상기 (8) 또는 (9) 의 형질전환체.

(11) 상기 (10) 의 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 방향족 아미노산 또는 방향족 비타민을 생성축적시키고, 이 배양물로부터 이 물질을 채취하는 것을 특징으로 하는 이 물질의 제조법.

(12) 상기 (8) 의 형질전환체가 보유하는 상기 (4) ∼ (6) 중 어느 하나의 DNA, 또는 이 DNA 의 상류에 존재하는 전사ㆍ번역에 관계되는 DNA 의 염기서열 중에 1 이상의 염기가 치환, 결실 또는 삽입되고, 또한 이 치환, 결실 또는 삽입전에 비교하여 트랜스알도라아제의 활성이 저하 또는 결손된 형질전환체.

(13) 형질전환체가 L-히스티딘, 리보플라빈, 핵산 및 핵산 관련 물질에서 선택되는 물질을 생산하는 능력을 갖는 형질전환체인 상기 (8) 또는 (12) 의 형질전환체.

(14) 상기 (13) 의 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 L-히스티딘, 리보플라빈, 핵산 및 핵산 관련 물질에서 선택되는 물질을 생성축적시키고, 이 배양물로부터 이 물질을 채취하는 것을 특징으로 하는 이 물질의 제조법.

(15) 상기 (8) 의 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나의 폴리펩티드를 생성축적시키고, 이 배양물로부터 이 폴리펩티드를 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나의 폴리펩티드의 제조법.

(16) 상기 (8) 또는 (9) 의 형질전환체, 이 형질전환체의 배양물 또는 이 배양물의 처리물을 효소원으로서 사용하고, 케토스 및 알도스를 수성 매질 중에 존재시키고, 이 수성 매질 중에 상기 알도스에 상기 케토스의 디히드록시아세톤 부분이 전이된 당을 생성축적시키고, 상기 수성 매질로부터 이 당을 채취하는 것을 특징으로 하는 이 당의 제조법.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

(1) 본 발명의 폴리펩티드

본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 또, 서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열에서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 트랜스알도라아제 활성을 갖는 폴리펩티드도 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다.

상기 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 트랜스알도라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (이하, 모레큘러ㆍ클로닝 제 2 판이라고 약기), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (이하, 커런트ㆍ프로토콜즈ㆍ인ㆍ모레큘러ㆍ바이올로지라고 약기), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) 등에 기재된 부위 특이적 변이도입법을 사용하여, 예컨대 서열번호 1 로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 에 부위 특이적 변이를 도입함으로써 취득할 수 있다.

결실, 치환 또는 부가되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않지만, 1 개에서 수십개, 특히 1 개에서 몇 개의 아미노산인 것이 바람직하다. 또, 본 발명 의 폴리펩티드가 트랜스알도라아제 활성을 갖기 위해서는 서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 60 % 이상, 통상은 80 % 이상, 특히 95 % 이상의 상동성을 갖고 있는 것이 바람직하다.

단, 본 발명의 폴리펩티드에는 공지된 트랜스알도라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 포함되지 않는다.

(2) 본 발명의 DNA

본 발명의 DNA 는 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA 이다. 본 발명의 DNA 로서는, 예컨대 서열번호 2 에 기재된 DNA 를 들 수 있다.

또, 서열번호 2 에 기재된 DNA 와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA 도 본 발명의 DNA 에 포함된다. 이 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA 란, 서열표의 서열번호 2 에 나타나는 염기서열을 포함하는 DNA 또는 이 DNA 의 내부 단편을 프로브로 하여 콜로니ㆍ하이브리다이제이션법, 플라크ㆍ하이브리다이제이션법 또는 서던 하이브리다이제이션법 등을 사용함으로써 얻어지는 DNA 를 의미하며, 구체적으로는 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA 또는 이 DNA 의 단편을 고정화한 필터를 사용하여 0.7 ∼ 1.0 mol/ℓ의 NaCl 존재하, 65 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 행한 후, 0.1 ∼ 2 배 정도의 SSC 용액 (1 배 농도의 SSC 용액의 조성은 150 mmol/ℓ염화나트륨, 15 mmol/ℓ시트르산나트륨으로 이루어짐) 을 사용하고, 65 ℃ 조건하에서 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA 를 들 수 있다.

하이브리다이제이션은 모레큘러ㆍ클로닝 제 2 판 등의 실험서에 기재되어 있는 방법에 준하여 행할 수 있다. 하이브리다이즈 가능한 DNA 로서 구체적으로 는, 서열번호 2 에 나타나는 염기서열과 적어도 80 % 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 95 % 이상의 상동성을 갖는 DNA 를 들 수 있다.

단, 본 발명의 DNA 에는 공지된, 트랜스알도라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 는 포함되지 않는다.

본 발명의 DNA 는 코리네박테리움속에 속하는 미생물의 염색체 DNA 로부터, 후술하는 방법에 의해 단리할 수 있다. 유전자의 공여체가 되는 코리네박테리움속에 속하는 미생물로서는 코리네박테리움속 또는 브레비박테리움속에 속하는 균주이면 어느것이나 사용할 수 있다. 그와 같은 미생물의 구체예로서는, 예컨대 하기의 균주를 들 수 있다.

코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 ATCC31833

코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 ATCC13032

코리네박테리움ㆍ아세토아시도필룸 ATCC13870

코리네박테리움ㆍ칼루나애 ATCC15991

코리네박테리움ㆍ헤르큘리스 ATCC13868

코리네박테리움ㆍ멜라세콜라 ATCC17965

코리네박테리움ㆍ리륨 ATCC15990

코리네박테리움ㆍ암모니아게네스 ATCC6872

브레비박테리움ㆍ이마리오필룸 ATCC14068

브레비박테리움ㆍ사카롤리티쿰 ATCC14066

브레비박테리움ㆍ티오게니탈리스 ATCC19240

브레비박테리움ㆍ디바리쿠튬 ATCC14020

브레비박테리움ㆍ플라붐 ATCC14067

브레비박테리움ㆍ락토페르멘툼 ATCC13869

코리네박테리움속에 속하는 미생물로부터의 염색체 DNA 의 추출은 배양균체로부터, 통상의 방법 [예컨대, 일본 공개특허공보 소58-126789 호에 기재된 방법] 에 따라 용이하게 행할 수 있다. 염색체 DNA 로부터의 본 발명의 DNA 의 단리는 쉬키미산 요구성 변이주로서 취득되는 트랜스 케토라아제 결손 변이주 [Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 375 (1998)] 의 상보로 선택함으로써 실시할 수 있다.

즉, 염색체 DNA 를 적당한 제한효소로 절단하고, 벡터 플라스미드에 연결한 후, 이 플라스미드를 사용하여 트랜스 케토라아제 유전자 결손주 [예컨대, 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 TKT6 주 (FERM BP-6399)] 를 형질전환하고, 쉬키미산 요구성이 회복된 형질전환주를 선택한다. 이 형질전환주가 갖는 플라스미드를 단리함으로써 트랜스 케토라아제 유전자와 함께 본 발명의 DNA 를 취득할 수 있다.

이와 같이 하여 서열번호 2 로 나타나는 본 발명의 DNA 가 일단 취득되고, 그 염기서열이 결정된 후에는 이 염기서열의 5' 단 및 3' 단의 염기서열에 기초한 프라이머를 조제하고, 코리네박테리움속에 속하는 미생물로부터 조제한 염색체 DNA 를 주형으로 하여 PCR 법 [PCR Protocols, Academic Press (1990)] 을 사용하여 DNA 의 증폭을 행함으로써 다른 코리네박테리움속에 속하는 미생물로부터 본 발명의 DNA 를 용이하게 취득할 수 있다.

또, 서열번호 2 로 나타나는 DNA 의 전체길이 또는 일부를 프로브로 하여 코리네박테리움속에 속하는 미생물로부터 조제한 염색체 DNA 에 대하여 콜로니 하이브리다이제이션이나 플라크 하이브리다이제이션 (모레큘러ㆍ클로닝 제 2 판) 을 행함으로써, 다른 코리네박테리움속에 속하는 미생물로부터 본 발명의 DNA 를 취득할 수 있다.

또한, 서열번호 2 로 나타나는 염기서열에 기초하여, 포스포아미다이드법을 이용한 파킨ㆍ엘마사의 DNA 합성장치로 화학합성함으로써도 본 발명의 DNA 를 취득할 수 있다.

(3) 본 발명의 폴리펩티드의 제조

본 발명의 폴리펩티드는 모레큘러ㆍ클로닝 제 2 판이나 커런트ㆍ프로토콜즈ㆍ인ㆍ모레큘러ㆍ바이올로지 등에 기재된 방법 등을 사용하고, 예컨대 이하의 방법에 의해 본 발명의 DNA 를 숙주세포내에서 발현시켜 제조할 수 있다.

상기 폴리펩티드를 코드하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다. 또, 필요에 따라 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 부분의 염기서열을, 숙주세포의 발현에 최적의 코돈이 되도록 염기를 치환한 DNA 를 조제한다. 이 DNA 는 본 발명의 폴리펩티드의 효율적 제조에 유용하다.

상기 DNA 단편을 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 재조합 벡터를 제조한다.

이 재조합 벡터를 상기 발현 벡터에 적합한 숙주세포에 도입한다.

숙주세포로서는 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포, 식물세포 등, 목적으로 하 는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 어느것이나 사용할 수 있다.

발현 벡터로서는 상기 숙주세포에서 자립복제 가능 내지는 염색체중으로의 조합이 가능하며, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다.

세균 등의 원핵생물을 숙주세포로서 사용하는 경우에는, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 함유하여 이루어지는 재조합 벡터는 원핵생물내에서 자립복제 가능함과 동시에, 프로모터, 리포솜 결합서열, 본 발명의 DNA, 전사종결서열로 구성된 벡터인 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 포함되어 있어도 된다.

발현 벡터로서는, 예컨대 pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (모두 베링거 만하임사에서 시판), pKK233-2 (Pharmacia 사 제조), pSE280 (Invitrogen 사 제조), pGEMEX-1 (Promega 사 제조), pQE-8 (QIAGEN 사 제조), pKYP10 (일본 공개특허공보 소58-110600 호), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript Ⅱ SK(-) (Stratagene 사 제조), pTrs30 [Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407) 에서 조제], pTrs32 [Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408) 에서 조제], pGHA2 [Escherichia coli IGHA2 (FERM B-400) 에서 조제, 일본 공개특허공보 소60-221091 호], pGKA2 [Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-6798) 에서 조제, 일본 공개특허공보 소60-221091 호], pTerm2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)], pGEX (Pharmacia 사 제조), pET 시스템 (Novagen 사 제조) 등을 들 수 있다.

프로모터로서는 숙주세포내에서 기능하는 것이면 어떠한 것이어도 된다. 예컨대, trp 프로모터 (P_trp), lac 프로모터, P_L 프로모터, P_R 프로모터, T7 프로모터 등의, 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또, P_trp 를 2 개 직렬시킨 프로모터 (P_trp ×2), tac 프로모터, lacT7 프로모터, let I 프로모터와 같이 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 사용할 수 있다.

리포솜 결합서열인 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 서열과 개시 코돈 사이를 적당한 거리 (예컨대 6 ∼ 18 염기) 로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 재조합 벡터에서는, 본 발명의 DNA 의 발현에는 전사종결서열은 반드시 필요하지는 않지만, 구조유전자의 바로 아래에 전사종결서열을 배치하는 것이 바람직하다.

숙주세포로서는 에쉐리키아속, 세라티아속, 바실러스속, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속, 마이크로박테리움속, 슈도모나스속 등에 속하는 미생물, 예컨대 에쉐리키아ㆍ콜리 XL1-Blue, 에쉐리키아ㆍ콜리 XL2-Blue, 에쉐리키아ㆍ콜리 DH1, 에쉐리키아ㆍ콜리 MC1000, 에쉐리키아ㆍ콜리 KY3276, 에쉐리키아ㆍ콜리 W1485, 에쉐리키아ㆍ콜리 JM109, 에쉐리키아ㆍ콜리 HB101, 에쉐리키아ㆍ콜리 No.49, 에쉐리키아ㆍ콜리 W3110, 에쉐리키아ㆍ콜리 NY49, 에쉐리키아ㆍ콜리 GI698, 에쉐리키아ㆍ 콜리 TB1, 세라티아 피카리아 (Serratia ficaria), 세라티아 폰티콜라 (Serratia fonticola), 세라티아 리쿠에파시엔스 (Serratia liquefacines), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 브레비박테리움 암모니아제네스 (Brevibacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 임마리오필룸 (Brevibacterium immariophilum) ATCC14068, 브레비박테리움 사카롤리티쿰 (Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066, 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13869, 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 미크로박테리움 암모니아필룸 (Microbacterium ammoniaphilum) ATCC15354, 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 슈도모나스 종 D-0110 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입방법으로서는 상기 숙주세포로 DNA 를 도입하는 방법이면 어떤 방법도 사용할 수 있고, 예컨대 칼슘이온을 사용하는 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], 프로토플라스트법 (일본 공개특허공보 소63-2483942 호), 또는 Gene, 17, 107 (1982) 이나 Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

효모를 숙주세포로서 사용하는 경우에는 재조합 벡터로서, 예컨대 YEP13(ATCC37115), YEp24(ATCC37051), YCp50(ATCC37419), pHS19, pHS15 등을 들 수 있다.

프로모터로서는 효모균주내에서 발현할 수 있는 것이면 어느것이나 사용해도 되고, 예컨대 헥소-스키나아제 등의 해당계(解糖系) 유전자의 프로모터, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 히트쇼크 폴리펩티드 프로모터, MFα1 프로모터, CUP 1 프로모터 등을 들 수 있다.

숙주세포로서는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속, 시조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 속, 클리베로마이세스 (Kluyveromyces) 속, 트리코스포론 (Trichosporon) 속, 시와니오마이세스 (Schwanniomyces) 속, 피키아 (Pichia) 속, 칸디다 (Candida) 속 등에 속하는 미생물, 예컨대 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀루란스 (Trichosporon pullulans), 쉬반니오마이세스 알루비우스 (Schwanniomyces alluvius), 칸디다 우틸리스 (Candida utilis) 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입방법으로서는 효모에 DNA 를 도입하는 방법이면 어떤 방법도 사용할 수 있고, 예컨대 일렉트로포레이션법 [Methods Enzymol., 194, 182 (1990)], 스페로플라스트법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)], 아세트산 리튬법 [J. Bacteriology, 153, 163 (1983)], Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

동물세포를 숙주로서 사용하는 경우에는 발현 벡터로서, 예컨대 pcDNAI, pcDM8 (프나코시사 제조), pAGE107 [일본 공개특허공보 평3-22979 호, Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3 (일본 공개특허공보 평2-227075 호), pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI/Amp (Invitrogen 사 제조), pREP4 (Invitrogen 사 제조), pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], pAGE210 등을 들 수 있다.

프로모터로서는 동물세포내에서 기능하는 것이면 어느것이나 사용할 수 있고, 예컨대 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 의 IE (immediate early) 유전자의 프로모터, SV40 의 초기 프로모터, 레트로 바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트쇼크 프로모터, SRα프로모터 등을 들 수 있다. 또, 인체 CMV 의 IE 유전자의 엔핸서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.

숙주세포로서는 인체의 세포인 나마르바 (Namalwa) 세포, 원숭이의 세포인 COS 세포, 차이니즈ㆍ햄스터의 세포인 CHO 세포, HBT5637 (일본 공개특허공보 소63-299 호) 등을 들 수 있다.

동물세포로의 재조합 벡터의 도입방법으로서는 동물세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 어떤 방법도 사용할 수 있고, 예컨대 일렉트로포레이션법 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], 인산 칼슘법 (일본 공개특허공보 평2-227075 호), 리포펙션법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], Virology, 52, 456 (1973) 등을 들 수 있다.

곤충세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 예컨대 커런트ㆍ프로토콜즈ㆍ인ㆍ 모레큘러ㆍ바이올로지, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992), Bio/Technology, 6, 47 (1988) 등에 기재된 방법에 의해 폴리펩티드를 발현할 수 있다.

즉, 재조합 유전자 도입 벡터 및 바큘로 바이러스를 곤충세포에 함께 도입하여 곤충세포 배양 상등액중에 재조합 바이러스를 얻은 후, 추가로 재조합 바이러스를 곤충세포에 감염시키고, 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.

상기 방법에서 사용되는 유전자 도입 벡터로서는, 예컨대 pVL1392, pVL1393, pBlueBacⅢ (모두 Invitorogen 사 제조) 등을 들 수 있다.

바큘로 바이러스로서는, 예컨대 밤나방과 곤충에 감염되는 바이러스인 오토그래퍼ㆍ칼리포르니카ㆍ뉴클리어ㆍ폴리헤드로시스ㆍ바이러스 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 들 수 있다.

곤충세포로서는 Spodoptera frugiperda 의 난소세포인 Sf9, Sf21 [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)], Trichoplusia ni 의 난소세포인 High5 (Invitrogen 사 제조) 등을 사용할 수 있다.

재조합 바이러스를 조제하기 위한, 곤충세포로의 상기 재조합 유전자 도입 벡터와 상기 바큘로 바이러스를 함께 도입하는 방법으로서는, 예컨대 인산 칼슘법 (일본 공개특허공보 평2-227075 호), 리포펙션법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] 등을 들 수 있다.

식물세포를 숙주세포로서 사용하는 경우에는 발현 벡터로서, 예컨대 Ti 플라 스미드, 담배 모자이크 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.

프로모터로서는 식물세포내에서 발현할 수 있는 것이면 어느것이나 사용해도 되고, 예컨대 칼리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 의 35S 프로모터, 이네악틴 1 프로모터 등을 들 수 있다.

숙주세포로서는 담배, 감자, 토마토, 당근, 대두, 평지, 알팔파, 벼, 밀, 보리 등의 식물세포 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입방법으로서는 식물세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 어떤 방법도 사용할 수 있고, 예컨대 아그로박테리움 (Agrobacterium) (일본 공개특허공보 소59-140885 호, 일본 공개특허공보 소60-70080 호, WO94/00977), 일렉트로포레이션법 (일본 공개특허공보 소60-251887 호), 파티클 건 (유전자총) 을 사용하는 방법 (특허 제 2606856 호, 특허 제 2517813 호) 등을 들 수 있다.

유전자의 발현방법으로서는 직접 발현 이외에, 모레큘러ㆍ클로닝 제 2 판에 기재되어 있는 방법 등에 준하여 분비 생산, 융합 단백질 발현 등을 행할 수 있다.

효모, 동물세포, 곤충세포 또는 식물세포에 의해 발현시킨 경우에는 당 또는 당쇄가 부가된 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

이상과 같이 하여 얻어지는 본 발명의 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물내에 본 발명의 폴리펩티드를 생성축적시키고, 이 배양물로부터 채취함으로써 본 발명의 폴리펩티드를 제조할 수 있다.

본 발명의 형질전환체를 배지에 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라 행할 수 있다.

본 발명의 형질전환체가 대장균 등의 원핵생물 또는 효모 등의 진핵생물을 숙주로 하여 얻어진 형질전환체인 경우, 이 형질전환체를 배양하는 배지로서, 이 형질전환체가 자화될 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하며, 이 형질전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면 천연배지, 합성배지의 어느것을 사용해도 된다.

탄소원으로서는 상기 형질전환체가 자화될 수 있는 것이면 되고, 글루코오스, 프락토오스, 슈크로오스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알콜류 등을 사용할 수 있다.

질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 그 외의 질소함유 화합물 및, 펩톤, 고기 엑기스, 효모 엑기스, 콘스치프 리커, 카세인 가수분해물, 콩깻묵 및 콩깻묵 가수분해물, 각종 발효균체 및 그의 소화물 등을 사용할 수 있다.

무기염으로서는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산 제1철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.

배양은 진탕배양 또는 심부(深部) 통기교반배양 등의 호기적 조건하에서 행한다. 배양온도는 15 ∼ 40 ℃ 가 좋고, 배양시간은 통상 16 시간 ∼ 7 일간이다. 배양중의 pH 는 3.0 ∼ 9.0 으로 유지하는 것이 바람직하다. pH 의 조정은 무기 또는 유기의 산, 알칼리 용액, 우레아, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 행한다.

또, 배양중 필요에 따라 앰피실린이나 테트라사이클린 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.

프로모터로서 유도성 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 필요에 따라 유도물질을 배지에 첨가해도 된다. 예컨대, lac 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.

동물세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle 의 MEM 배지 [Science, 122, 501 (1952)], 다르베코 개변 MEM 배지 [Virology, 8, 396 (1959)], 199 배지 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] 또는 이들 배지에 소 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.

배양은 통상 pH 6 ∼ 8, 30 ∼ 40 ℃, 5 % CO₂ 존재하 등의 조건하에서 1 ∼ 7 일간 행한다.

또, 배양중 필요에 따라 카나마이신, 페니실린 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.

곤충세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지 (PharMingen 사 제조), Sf-900 Ⅱ SFM 배지 (Life Technologies 사 제조), ExCell400, ExCell405 (모두 JRH Biosciences 사 제조), Grace's Insect Medium [Nature, 195, 788 (1962)] 등을 사용할 수 있다.

배양은 통상 pH 6 ∼ 7, 25 ∼ 30 ℃ 등의 조건하에서 1 ∼ 5 일간 행한다.

또, 배양중 필요에 따라 겐타마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.

식물세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체는 세포로서, 또는 식물의 세포나 기관에 분화시켜 배양할 수 있다. 이 형질전환체를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 무라시게ㆍ앤드ㆍ스쿠그 (MS) 배지, 화이트 (White) 배지, 또는 이들 배지에 옥신, 사이토카이닌 등, 식물 호르몬을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.

배양은 통상 pH 5 ∼ 9, 20 ∼ 40 ℃ 의 조건하에서 3 ∼ 60 일간 행한다.

또, 배양중 필요에 따라 카나마이신, 하이그로마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 된다.

상기와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 조합한 재조합체 벡터를 보유하는 미생물, 동물세포, 또는 식물세포 유래의 형질전환체를 통상의 배양방법에 따라 배양하고, 상기 폴리펩티드를 생성축적시키고, 이 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 채취함으로써 상기 폴리펩티드를 제조할 수 있다.

유전자의 발현방법으로서는 직접 발현 이외에, 모레큘러ㆍ클로닝 제 2 판에 기재되어 있는 방법 등에 준하여 분비 생산, 융합 폴리펩티드 발현 등을 행할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 생산방법으로서는 숙주세포내에 생산시키는 방법, 숙주세포외에 분비시키는 방법, 또는 숙주세포 외막상에 생산시키는 방법이 있으며, 사용하는 숙주세포나, 생산시키는 폴리펩티드의 구조를 바꿈으로써 상기 방법을 선택할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드가 숙주세포내 또는 숙주세포 외막상에 생산되는 경우, 폴슨 등의 방법 [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], 로우 등의 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], 또는 일본 공개특허공보 평5-336963 호, WO94/23021 등에 기재된 방법을 준용함으로써 상기 폴리펩티드를 숙주세포외로 적극적으로 분비시킬 수 있다.

즉, 유전자 재조합의 수법을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드의 활성부위를 포함하는 폴리펩티드 바로 앞에 시그널펩티드를 부가한 형태로 발현시킴으로써, 본 발명의 폴리펩티드를 숙주세포외로 적극적으로 분비시킬 수 있다.

또, 일본 공개특허공보 평2-227075 호에 기재되어 있는 방법에 준하여 디히드로 엽산 환원효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수도 있다.

또한, 유전자 도입한 동물 또는 식물의 세포를 재분화시킴으로써 유전자가 도입된 동물개체 (트랜스제닉 비인간 동물) 또는 식물개체 (트랜스제닉 식물) 를 조성하고, 이들 개체를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 제조할 수도 있다.

형질전환체가 동물개체 또는 식물개체인 경우에는, 통상의 방법에 따라 사육 또는 재배하고, 상기 폴리펩티드를 생성축적시키고, 상기 동물개체 또는 식물개체로부터 상기 폴리펩티드를 채취함으로써 상기 폴리펩티드를 제조할 수 있다.

동물개체를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서는, 예컨대 공지된 방법 [American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (1996), American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996), Bio/Technology, 9, 830 (1991)] 에 준하여 유전자를 도입하여 조성한 동물중에 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법을 들 수 있다.

동물개체의 경우에는, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 비인간 동물을 사육하고, 상기 폴리펩티드를 이 동물중에 생성ㆍ축적시키고, 이 동물중으로부터 상기 폴리펩티드를 채취함으로써 상기 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 상기 동물중의 생성ㆍ축적 장소로서는, 예컨대 상기 동물의 젖 (일본 공개특허공보 소63-309192 호), 알 등을 들 수 있다. 이 때 사용되는 프로모터로서는 동물에서 발현할 수 있는 것이면 어느것이나 사용할 수 있는데, 예컨대 유선(乳腺)세포 특이적인 프로모터인 α카세인 프로모터, β카세인 프로모터, β락토글로블린 프로모터, 호에산성 프로테인 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

식물개체를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서는, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 식물을 공지된 방법 [조직배양, 20 (1994), 조직배양, 21 (1995), Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)] 에 준하여 재배하고, 상기 폴리펩티드를 이 식물중에 생성ㆍ축적시키고, 이 식물중으로부터 상기 폴리펩티드를 채취함으로써 상기 폴리펩티드를 생산하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 형질전환체에 의해 제조된 폴리펩티드를 단리정제하기 위해서는 통상의 효소의 단리정제법을 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 폴리펩티드가 세포내에 용해상태로 발현된 경우에는, 배양 종료후 세포를 원심분리에 의해 회수하여 수계(水系) 완충액에 현탁한 후, 초음파 파쇄기, 프렌치프레스, 만톤가우린 호모지나이저, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하여 무세포 추출액을 얻는다. 이 무세포 추출액을 원심분리함으로써 얻어지는 상등액으로부터, 통상의 효소의 단리정제법, 즉 용매추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸 (DEAE)-세파로오스, DIAION HPA-75 (미쯔비시가세이사 제조) 등의 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF (Pharmacia 사 제조) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로오스, 페닐세파로오스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용한 겔 여과법, 어피니티-크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 수법을 단독 또는 조합하여 사용하여 정제표품을 얻을 수 있다.

또, 상기 폴리펩티드가 세포내에 불용체를 형성하여 발현된 경우에는 마찬가지로 세포를 회수한 후 파쇄하고, 원심분리를 행함으로써 침전분획으로서 폴리펩티드의 불용체를 회수한다. 회수한 폴리펩티드의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 이 가용화액을 희석 또는 투석하고, 이 가용화액중의 단백질 변성제의 농도를 낮춤으로써 상기 폴리펩티드를 정상의 입체구조로 되돌린다. 이 조작 후, 상기와 동일한 단리정제법에 의해 상기 폴리펩티드의 정제표품을 얻을 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드, 또는 이 폴리펩티드에 당쇄가 부가된 폴리펩티드 등의 유도체가 세포외로 분비된 경우에는 배양 상등액에 상기 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 상기 배양물을 상기와 동일한 원심분리 등의 수법에 의해 처리함으로써 배양 상등액을 취득하고, 이 배양 상등액으로부터, 상기와 동일한 단리정제법을 사용함으로써 정제표품을 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 취득되는 폴리펩티드로서, 예컨대 서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다.

또, 본 발명의 폴리펩티드는 Fmoc 법 (플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc 법 (t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, Advanced ChemTech 사, 파킨ㆍ엘마사, Pharmacia 사, Protein Technology Instrument 사, Synthecell-Vega 사, PerSeptive 사, 시마즈세이사꾸쇼 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학합성할 수도 있다.

(4) 본 발명의 DNA 를 이용한 물질의 제조법

(a) 방향족 아미노산이나 방향족 비타민 등의 방향족 화합물, 퓨린뉴클레오티드나 피리미딘뉴클레오티드 등의 핵산 관련 물질, L-히스티딘 또는 리보플라빈 등의 제조

본 발명의 DNA 나 그 염기서열정보를 사용함으로써, 방향족 아미노산이나 방향족 비타민 등의 방향족 화합물, 퓨린뉴클레오티드나 피리미딘뉴클레오티드 등의 핵산 관련 물질, L-히스티딘 또는 리보플라빈 등의 생산능을 갖는 형질전환체의 트랜스알도라아제 활성을 원하는대로 개변하는 것이 가능해지고, 그에 의해 그들 대사산물의 공업적으로 유리한 제조법을 제공할 수 있다.

본 발명에 의해 얻을 수 있는 방향족 아미노산이란 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 등의 아미노산을 말하며, 방향족 비타민이란 엽산 (비타민 M), 메나퀴논 (비타민 K2), p-히드록시 벤조산 또는 그것에 유래하는 유비퀴논, p-아미노벤조산 (비타민 H'), 안트라닐산 (비타민 L), 토코페롤 (비타민 E) 등을 말하며, 핵산 관련 물질이란 퓨린뉴클레오티드, 피리미딘뉴클레오티드, 퓨린뉴클레오시드, 피리미딘뉴클레오시드, 퓨린염기, 피리미딘염기, 플라빈뉴클레오티드 등의 물질을 말한다.

이들 물질의 제조법을 이하에 서술한다.

상기 (3) 에서 제조한 형질전환체에 있어서, 본 발명의 DNA 또는 본 발명의 DNA 의 상류에 존재하며 이 DNA 의 전사ㆍ번역에 관계되는 DNA 가 갖는 염기서열 중에 1 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 DNA 를 보유하는 형질전환체 (이하, 형질전환체의 변이체라고 약기) 중에서, 트랜스알도라아제의 활성이 증강된 형질전환체, 또는 트랜스알도라아제 활성이 저하 또는 결실된 형질전환체를 선택한다. 이 결실, 치환 또는 부가는 공지된 방법 (모레큘러 클로닝 제 2 판, 커런트ㆍ프로토콜즈ㆍ인ㆍ모레큘러ㆍ바이올로지 등에 기재된 방법) 에 준하여 행할 수 있다.

트랜스알도라아제 활성의 측정은 하기 실시예 (4) 에 따라 행할 수 있다.

즉, 형질전환체의 변이체를 상기 (3) 의 방법에 따라 배양하여 조(粗)효소액을 조제한다. 트리스 40 mmol/ℓ(pH 7.6), 디포스포피리딘 0.1 mmol/ℓ, 프룩토오스 6-인산 2.8 mmol/ℓ, 에리트로오스 4-인산 0.2 mmol/ℓ, 글리세롤-3-인산-데히드로게나아제 및 트리오스포스페이트-이소메라아제 혼합액 (베링거 만하임사 제조) 10 ㎍ 을 함유하는 반응액에 상기 조효소액을 첨가하여 1 ㎖ 로 하고, 25 ℃ 에서 반응시킨다. 이 반응에 의해 생성된 글리세르알데히드-3-인산을 분광광도계를 사용하여 340 ㎚ 에서의 흡광도의 감소를 측정함으로써 활성을 측정할 수 있다.

이 활성측정방법으로 형질전환체의 변이체의 트랜스알도라아제 활성을 측정하고, 트랜스알도라아제 활성이 향상 또는 저하 또는 결실된 형질전환체의 변이체를 선택함으로써 목적으로 하는 형질전환체를 얻을 수 있다.

방향족 아미노산 또는 방향족 비타민의 생산균이 숙주인 경우에는 트랜스알도라아제 활성을 증강시킴으로써 그들 방향족 화합물의 생산효율을 향상시킬 수 있다.

또, 퓨린뉴클레오티드나 피리미딘뉴클레오티드 등의 핵산 관련 물질, L-히스티딘 또는 리보플라빈 등의 생산균이 숙주인 경우에는 트랜스알도라아제 활성을 저하 또는 결실시킴으로써 그들의 생산효율을 향상시킬 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 방향족 아미노산, 방향족 비타민, L-히스티딘, 리보플라빈, 퓨린뉴클레오티드나 피리미딘뉴클레오티드 등의 핵산 관련 물질 등을 생성축적시키고, 이 배양물로부터 농축정석법, 활성탄처리법 또는 이온교환수지법 등의 공지된 방법 [엔도 이사오 등, 화학공학회 (편) 「바이오세퍼레이션 프로세스 편람」, 쿄리쯔 출판 (1996)] 을 사용하여 상기 물질을 단리ㆍ정제함으로써 목적으로 하는 물질을 효율적으로 생산할 수 있다.

상기 형질전환체의 배양은 상기 (3) 에 기재된 본 발명의 폴리펩티드를 제조하기 위한 형질전환체의 배양방법과 동일한 방법으로 행할 수 있다.

(b) 신규 당의 제조

상기 방법에 의해 얻어진 형질전환체, 이 형질전환체의 배양물 또는 이 배양물의 처리물을 효소원으로서 사용하고, 케토스 및 알도스를 수성 매질 중에 존재시키고, 이 수성 매질 중에 트랜스알도라아제 활성에 의해 상기 알도스에 상기 케토스의 디히드록시아세톤 부분이 전이된 당을 생성축적시키고, 상기 수성 매질로부터 이 당을 채취할 수도 있다.

상기 케토스로서는, 예컨대 세도헵튜로오스 7-인산, 프룩토오스 6-인산 등을 들 수 있고, 상기 알도스로서는, 예컨대 에리트로오스 4-인산, 글리세르알데히드 3-인산 등을 들 수 있다.

형질전환체의 배양물의 처리물로서는 배양균체, 이 균체의 건조물, 이 균체의 동결건조물, 이 균체의 계면활성제 처리물, 이 균체의 효소처리물, 이 균체의 초음파 처리물, 이 균체의 기계적 마쇄물, 이 균체의 용매처리물 등의 균체처리물, 균체의 단백질 분획물, 균체 및 균체처리물의 고정화물 등, 이 균체로부터 추출하여 얻어지는 효소표품 등을 들 수 있다.

본 발명에 의해 얻어지는 당의 생성에서 사용되는 효소원은, 37 ℃ 에서 1 분 동안에 1 밀리몰의 본 발명에 의해 얻어지는 당을 생성할 수 있는 활성을 1 단위 (U) 로 하여 1 mU/ℓ∼ 1,000 U/ℓ이고, 바람직하게는 10 mU/ℓ∼ 100 U/ℓ의 농도로 사용한다.

본 발명에 의해 얻어지는 당의 생성에서 사용되는 수성 매질로서는 물, 인산염, 탄산염, 아세트산염, 붕산염, 시트르산염, 트리스 등의 완충액, 메탄올, 에탄올 등의 알콜류, 아세트산 에틸 등의 에스테르류, 아세톤 등의 케톤류, 아세트아미드 등의 아미드류 등을 들 수 있다. 또, 효소원으로서 사용한 형질전환체의 배양액을 수성 매질로서 사용할 수 있다.

본 발명에 의해 얻어지는 당의 생성에서, 필요에 따라 계면활성제 또는 유기용매를 첨가해도 된다. 계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌ㆍ옥타데실아민 (예컨대, 나이민 S-215, 닛뽄유시사 제조) 등의 비이온 계면활성제, 세틸트리메틸암모늄ㆍ브로마이드나 알킬디메틸ㆍ벤질암모늄클로라이드 (예컨대, 카티온 F2-40E, 닛뽄유시사 제조) 등의 카티온계 계면활성제, 라우로일ㆍ잘코시네이트 등의 음이온계 계면활성제, 알킬디메틸아민 (예컨대, 3급 아민 FB, 닛뽄유시사 제조) 등의 3급 아민류 등, 갈락토오스 함유 당질의 생성을 촉진하는 것이면 어느것이나 되고, 1 종 또는 몇 종을 혼합하여 사용할 수도 있다. 계면활성제는 통상 0.1 ∼ 50 g/ℓ의 농도로 사용된다. 유기용제로서는 자일렌, 톨루엔, 지방족 알콜, 아세톤, 아세트산 에틸 등을 들 수 있고, 통상 0.1 ∼ 50 ㎖/ℓ의 농도로 사용된다.

수성 매질 중에 생성된 본 발명에 의해 얻어지는 당의 정량은 Dionex 사 제조의 당 분석장치 등을 사용하여 행할 수 있다 [Anal. Biochem., 189, 151 (1990)].

반응액중에 생성된 본 발명에 의해 얻어지는 당의 채취는 활성탄이나 이온교환수지 등을 사용하는 통상의 방법에 의해 행할 수 있다.

상기 방법을 사용함으로써 종래에는 합성하는 것이 곤란했던 당의 합성을 용이하게 할 수 있게 되고, 또 신규 당을 합성하는 것도 가능해진다.

이하에 본 발명의 실시예를 나타내는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

(1) 코리네박테리움 글루타미쿰의 트랜스 케토라아제 결손 변이주의 취득

코리네박테리움 글루타미쿰 L22 [야생형 주 ATCC31833 에서 유도된 리조팀 감수성 변이주 ; R. Katsumata et al., Proc. 4th Eur. Congr. Biotechnol., 4, 767 (1987)] 를 NB 배지 [분말 부이용 20 g, 효모 엑기스 5 g 을 물 1 ℓ에 함유하고, pH 7.2 로 조정한 배지] 3 ㎖ 중에 식균(植菌)하고, 30 ℃ 에서 OD₆₆₀ 이 약 0.6 이 될때까지 배양하였다.

배양한 후, 원심분리에 의해 집균하고, 얻어진 균체를 50 mmol/ℓ트리스말레산 완충액 (pH 6.0) 으로 1 회 세정하고, NTG 400 ㎎/ℓ를 함유하는 동 완충액 3 ㎖ 중, 실온에서 20 분간 변이처리하였다. 이 처리균체를 동 완충액으로 2 회 원심세정한 후, NB 배지 3 ㎖ 중, 30 ℃ 에서 1 시간 배양하였다.

상기 배양액을 생리식염수로 10^-6 ∼ 10^-8 로 희석하고, 얻어진 희석액 0.1 ㎖ 를 NB 한천배지 [NB 배지에 한천을 1.4 % 함유하는 배지, pH 7.2] 에 도포하고, 30 ℃ 에서 2 일간 배양하였다.

한천배지상에 생육된 콜로니를 최소한천배지 M1 [글루코오스 10 g, (NH₄)H₂PO₄ 1 g, KCl 0.2 g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.2 g, FeSO₄ㆍ7H₂O 10 ㎎, MnSO₄ㆍ4∼6H₂O 0.2 ㎎, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.9 ㎎, CuSO₄ㆍ5H₂O 0.4 ㎎, Na₂ B₄O₇ㆍ10H₂O 0.09 ㎎, (NH₄)₆Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O 0.04 ㎎, 비오틴 50 ㎎, p-아미노벤조산 2.5 ㎎, 티아민염산염 1 ㎎ 및 한천 16 g 을 물 1 ℓ에 함유하고, pH 7.2 로 조정한 배지] 및 쉬키미산 50 ㎎/ℓ를 함유하는 M1 한천배지에 각각 도포하고, 30 ℃ 에서 배양하였다.

최소한천배지 M1 에서는 생육되지 않고, 쉬키미산 50 ㎎/ℓ를 함유하는 M1 한천배지에서 생육될 수 있는 주를 쉬키미산 요구 변이주로서 분리하였다. 분리된 쉬키미산 요구 변이주를 쉬키미산 50 ㎎/ℓ를 함유하는 M1 한천배지 및 이 배지중의 글루코오스를 리보오스로 치환한 배지에 각각 도포하고, 30 ℃ 에서 배양하였다.

상기 쉬키미산 요구 변이주 중에서, 쉬키미산 50 ㎎/ℓ를 함유하는 M1 한천배지에서 생육되지만, 이 배지중의 글루코오스를 리보오스로 치환한 배지에서는 생육될 수 없는 주를, 쉬키미산 요구성이며 리보오스 비자화성의 변이주로서 분리하였다.

분리된 쉬키미산 요구성이며 리보오스 비자화성의 변이주를 쉬키미산 50 ㎎/ℓ를 함유하는 M1 배지 40 ㎖ 중 30 ℃ 에서 24 시간 배양한 후, 원심분리하여 얻은 균체를 초음파 파쇄하고, 원심분리함으로써 무세포 추출액을 조제하였다. 이 무세포 추출액을 조효소액으로 하고, 트랜스 케토라아제의 활성을 이하와 같이 하여 측정하였다.

트리스 50 mmol/ℓ(pH 7.5), NADH 0.2 mmol/ℓ, 티아민피롤린산 0.01 mmol/ℓ, MgCl₂ 1 mmol/ℓ, 자일로오스-5-인산 0.5 mmol/ℓ, 리브로오스-5-인산 0.5 mmol/ℓ, 글리세롤-3-인산 데히드로게나아제 및 트리오스포스페이트 이소메라아제 혼합액 (베링거 만하임사 제조) 10 ㎍ 을 함유하는 반응액에 조효소액을 첨가하여 1.5 ㎖ 로 하고, 30 ℃ 에서 반응시켰다.

분광광도계를 사용하여 340 ㎚ 에서의 NADH 의 흡광도 감소를 측정함으로써 생성되는 글리세르알데히드-3-인산량을 측정하였다.

이 측정에 의해, 분리된 쉬키미산 요구성이며 리보오스 비자화성의 변이주로부터 글리세르알데히드-3-인산을 전혀 생성하지 않는, 트랜스 케토라아제 활성이 결손된 변이주 TKT6 주를 선택하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰 TKT6 주는 부다페스트 조약에 기초하여 평성 10 년 6 월 30 일자로 공업기술원 생명공학 공업기술연구소, 일본국 이바라키껭 쯔꾸바시 히가시 1 초메 1 반 3 고 (우편번호 305-8566) 에 FERM BP-6399 호로서 기탁되어 있다.

(2) 트랜스 케토라아제 유전자 및 트랜스알도라아제 유전자를 함유하는 DNA 단편의 클로닝

양 유전자의 공급원으로서 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 ATCC31833 의 염색체 DNA 를, 이 유전자의 수용균으로서 실시예 1 에서 취득한 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰의 트랜스 케토라아제 유전자 결손주 TKT6 (FERM BP-6399) 을 사용하였다. 벡터는 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰으로 복제 가능한 플라스미드 pCSEK20 을 사용하였다. pCSEK20 은 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 유래의 플라스미드 pCG2 (일본 공개특허공보 소58-35197 호) 의 복제개시점, 마찬가지로 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 유래의 플라스미드 pCG4 (일본 공개특허공보 소57-183799 호) 의 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신 내성 유전자 및, 에쉐리키아ㆍ콜리의 일반적 벡터인 pGA22 [J. Bacteriol., 140, 400 (1979)] 의 카나마이신 내성 유전자로 이루어지는 플라스미드이다 [Appl. Microbiol. Biotechnol., 51, 201 (1999)].

코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 ATCC31833 의 배양 및 배양균체로부터의 염색체 DNA 의 조제는 일본 공개특허공보 평6-169785 호에 기재된 방법에 따라 행하였다. pCSEK20 은 이것을 보유시킨 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 ATCC31833 의 배양균체로부터 일본 공개특허공보 평6-169785 호에 기재된 벡터의 조제방법에 따라 단리하였다.

코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 ATCC31833 의 염색체 DNA 로부터의 트랜스 케토라아제 유전자 및 트랜스알도라아제 유전자를 함유하는 DNA 단편의 클로닝은 이하와 같이 하여 행하였다.

상기와 같이 조제한 염색체 DNA 및 pCSEK20 플라스미드 DNA 각각 1 ㎍ 을 EcoRI (5 단위) 로 절단하고, 양 절단물을 다까라슈조사 제조 라이게이션키트를 사용하여 연결처리하였다. 이와 같이 하여 구축된 플라스미드를 사용하여 쉬키미산 요구성을 나타내는 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰의 트랜스 케토라아제 유전자 결손주 TKT6 (FERM BP-6399) 을 이하의 방법으로 형질전환하였다.

코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 TKT6 을 NB 배지 5 ㎖ 중에 식균하고, 30 ℃ 에서 1 일 배양한 종(種)배양액 4 ㎖ 를 쉬키미산 100 ㎍/㎖ 를 함유하는 SSM 배지 [글루코오스 20 g, (NH₄)₂SO₄ 10 g, 우레아 3 g, 효모 엑기스 1 g, KH₂ PO₄ 1 g, MgCl₂ㆍ6H₂O 0.4 g, FeSO₄ㆍ7H₂O 10 ㎎, MnSO₄ㆍ4∼6H₂ O 0.2 ㎎, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.9 ㎎, CuSO₄ㆍ5H₂O 0.4 ㎎, Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O 0.09 ㎎, (NH₄)6Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O 0.04 ㎎, 비오틴 30 ㎍ 및 사이아민 염산염 1 ㎎ 을 물 1 ℓ에 함유하고, pH 7.2 로 조정한 배지] 40 ㎖ 에 식균하고, 30 ℃ 에서 OD₆₆₀ 이 0.6 이 될때까지 진탕배양하였다.

균체를 집균하고, 이 세포를 RCGP 배지 [글루코오스 5 g, 카자미노산 5 g, 효모 엑기스 2.5 g, KH₂PO₄ 1.5 g, MgCl₂ㆍ6H₂O 0.41 g, FeSO ₄ㆍ7H₂O 10 ㎎, MnSO₄ㆍ4∼6H₂O 2 ㎎, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.9 ㎎, (NH₄)6Mo₇O₂₄ ㆍ4H₂O 0.04 ㎎, 비오틴 30 ㎍ 및 사이아민 염산염 2 ㎎, 숙신산 2나트륨 135 g, 폴리비닐피롤리돈 (분자량 10,000) 30 g 을 물 1 ℓ에 함유하는 배지] 의 리조팀을 함유하는 용액 10 ㎖ 에 약 10⁹ 세포/㎖ 가 되도록 현탁하고, L 형 시험관에 옮겨 30 ℃ 에서 6 시간 천천히 진탕하고 반응시켜 프로토플라스트화하였다.

이 프로토플라스트균액 0.5 ㎖ 를 소시험관에 넣어 2,500 ×g 으로 5 분간 원심분리하고, TSMC 완충액 (MgCl₂ 10 mmol/ℓ, CaCl₂ 30 mmol/ℓ, 트리스 50 mmol/ℓ, 자당 400 mmol/ℓ, pH 7.5) 1 ㎖ 에 재현탁하여 원심세정한 후, TSMC 완충액 0.1 ㎖ 에 재현탁하였다. 이 균액에 2 배 농도의 TSMC 완충액과 상기 연결혼합액의 1 대 1 혼합액 100 ㎕ 를 첨가하여 혼화하고, 이어서 TSMC 완충액중에 20 % PEG 6,000 을 함유하는 액 0.8 ㎖ 를 첨가하여 혼합하였다. 3 분후, RCGP 배지 (pH 7.2) 2 ㎖ 를 첨가하고, 2,500 ×g 으로 5 분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 침전된 프로토플라스트를 1 ㎖ 의 RCGP 배지에 현탁하였다. 이 현탁액 0.2 ㎖ 를 카나마이신 200 ㎍/㎖ 를 함유하는 RCGP 한천배지 (RCGP 배지에 1.4 % 한천을 함유하는 배지, pH 7.2) 에 도포하고, 30 ℃ 에서 10 일간 배양하였다.

한천배지상에 생육된 콜로니를 모으고, 생리식염수로 2 회 원심세정한 후, 생리식염수 1 ㎖ 에 현탁하였다. 이 균액을 카나마이신 20 ㎍/㎖ 를 함유하는 최소한천배지 M1 [글루코오스 10 g, (NH₄)H₂PO₄ 1 g, KCl 0.2 g, KH₂ PO₄ 1 g, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.2 g, FeSO₄ㆍ7H₂O 10 ㎎, MnSO₄ㆍ4∼6H ₂O 0.2 ㎎, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.9 ㎎, CuSO₄ㆍ5H₂O 0.4 ㎎, Na₂B₄O₇ㆍ10H₂O 0.09 ㎎, (NH₄)₆Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O 0.04 ㎎, 비오틴 50 ㎍, P-아미노벤조산 2.5 ㎎, 사이아민 염산염 1 ㎎ 및 한천 16 g 을 물 1 ℓ에 함유하고, pH 7.2 로 조정한 배지] 상에 재도포하여 30 ℃ 에서 3 일간 배양하고, 카나마이신 내성이며, 쉬키미산 비요구성이 된 형질전환주를 선택하였다.

이들 형질전환주로부터 일본 공개특허공보 평6-169785 호에 기재된 벡터의 조제방법에 따라 플라스미드 DNA 를 단리하였다. 형질전환주의 1 주로부터 얻어지며, pCTK60 이라고 명명한 플라스미드는 각 제한효소에 의한 절단산물을 아가로오스 겔 전기영동법으로 해석한 결과, pCSEK20 의 EcoRI 부위에 약 7.6 kb 의 EcoRI DNA 단편이 삽입된 구조를 갖고 있는 것을 알았다. 서브클로닝과 상보시험의 결과, 동 DNA 단편내의 약 4.1 kb 의 XhoI-EcoRI DNA 단편상에 적어도 트랜스 케토라아제 유전자가 존재하는 것을 알았다.

(3) XhoI-EcoRI DNA 단편의 염기서열 결정

상기 약 4.1 kb 의 XhoI-EcoRI DNA 단편을 함유하는 플라스미드로부터 통상의 방법에 따라 이 DNA 단편을 회수하였다. 이 DNA 단편 및 벡터 pUC19 (다까라슈조사 제조) 를 여러 가지의 제한효소를 사용하여 분해한 후, T4DNA 리가아제를 사용하여 벡터 DNA 단편과 분해 DNA 단편을 결합시켰다. 얻어진 연결혼합액을 사용하여 통상법에 따라 대장균 DH5α(도요보사 제조) 를 형질전환하였다. 얻어진 형질전환균을, 앰피실린을 최종농도로 100 ㎍/㎖ 함유하는 LB 한천배지 [트립톤 10 g, 효모 엑기스 5 g, NaCl 10 g, 한천 20 g 을 물 1 ℓ에 용해시킨 배지] 에 도포하고, 37 ℃ 에서 16 시간 배양하였다.

선택배지상에 생육한 균주를, 앰피실린을 최종농도로 100 ㎍/㎖ 함유하는 LB 배양액에 식균하고, 30 ℃ 에서 12 시간 배양하였다. 배양균체로부터 알칼리 SDS 법 (모레큘러ㆍ클로닝 제 2 판) 에 의해 플라스미드를 추출하였다.

추출한 플라스미드 DNA 를 사용하여 디데옥시뉴클레오시드 효소법에 의해 벡터 pUC19 에 삽입된 각종 DNA 단편의 염기서열을 결정하였다. 구체적으로는 아마샴사 제조 서모ㆍ시쿼나아제ㆍ사이클ㆍ시퀀스ㆍ키트 (Thermo Sequenase cycle sequencing kit ; Amersham) 를 사용하여 프로토콜에 따라 반응시킨 후, 라이ㆍ코어사 제조 DNA 시퀀서 LONG READER 4200 을 사용하여 삽입 DNA 단편의 염기서열을 결정하였다. 이 삽입 DNA 단편의 염기서열을 서열번호 3 에 나타냈다.

이들 서열의 해석은 소프트웨어ㆍ디벨로프먼트사 제조의 시퀀스 해석 소프트 제네틱ㆍ맥 (GENETYX MAC) ATSQ 3.0 을 사용하여 행하였다. 그 결과, 4.1 kb 의 XhoI-EcoRI DNA 단편의 염기서열 중에는 2 개의 오픈 리딩 프레임이 존재하는 것을 알았다.

그들 염기서열로부터 추정되는 아미노산의 1 차 구조를 분류학적으로 코리네박테리움속과 가까운 마이코박테리움ㆍ튜버큘로시스의 트랜스 케토라아제 및 트랜스알도라아제의 아미노산 1 차 구조와 비교한 결과, 서열표의 서열번호 3 에 기재된 염기서열중 373 번째부터 2472 번째까지의 오픈 리딩 프레임이 트랜스 케토라아제 유전자이고, 2643 번째부터 3722 번째까지의 오픈 리딩 프레임이 트랜스알도라아제 유전자인 것이 판명되었다. 이 트랜스알도라아제 유전자의 오픈 리딩 프레임으로부터 추측되는 아미노산 서열을 서열번호 1 에, 염기서열을 서열번호 2 에 나타냈다.

(4) 트랜스 케토라아제 및 트랜스알도라아제의 활성 측정

상기 약 4.1 kb 의 XhoI-EcoRI DNA 단편의 양 말단을 통상법에 따라 평활말단에 수복한 후, 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰으로 복제 가능한 벡터 pCG116 [Appl. Microbiol. Biotechnol., 51, 201 (1999)] 의 Smal 부위에 삽입하여 재조합체 플라스미드 pHTK65 를 구축하였다. 코리네박테리움ㆍ글루타미쿰 ATCC31833 을 상기 재조합체 플라스미드로 형질전환하고, 이 형질전환주의 트랜스 케토라아제 및 트랜스알도라아제의 활성을 측정하였다. 트랜스 케토라아제 활성은 일본 공개특허 공보 평6-169785 호에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 트랜스알도라아제 활성은 이하와 같이 하여 측정하였다.

트리스 40 mmol/ℓ(pH 7.6), 디포스포피리딘 0.1 mmol/ℓ, 프룩토오스 6-인산 2.8 mmol/ℓ, 에리트로오스 4-인산 0.2 mmol/ℓ, 글리세롤-3-인산-데히드로게나아제 및 트리오스포스페이트-이소메라아제 혼합액 (베링거 만하임사 제조) 10 ㎍ 을 함유하는 반응액에 조효소액을 첨가하여 1 ㎖ 로 하고, 25 ℃ 에서 반응을 개시하였다. 생성된 글리세르알데히드-3-인산을, 분광광도계를 사용하여 340 ㎚ 에서의 흡광도의 감소를 측정함으로써 정량하였다. 그 결과, ATCC31833 주의 트랜스 케토라아제 및 트랜스알도라아제의 단위 단백질 중량 및 단위 시간당의 활성을 각각 1 로 했을 때의 pHTK65 를 보유하는 형질전환주의 활성은 모두 5 배 이상으로 증가되어 있었다.

본 발명에서 신규로 발견된 트랜스알도라아제 유전자, 그 염기서열정보, 이 유전자에 코드되는 폴리펩티드, 또는 그 아미노산 서열정보를 사용함으로써, 아미노산 발효 등에서 널리 사용되고 있는 산업상 중요한 코리네박테리움속에 속하는 미생물의 트랜스알도라아제를 원하는대로 개변한 발효생산균을 육종할 수 있다. 또한, 당류나 그 유도체의 합성 등, 입체선택적인 탄소-탄소 결합형성반응에 유용한 트랜스알도라아제 고활성주를 육종할 수 있다.

<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD <120> NOVEL TRANSALDOLASE GENE <150> JP1999-266548 <151> 1999-09-21 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 360 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC31388 <400> 1 Met Ser His Ile Asp Asp Leu Ala Gln Leu Gly Thr Ser Thr Trp Leu 1 5 10 15 Asp Asp Leu Ser Arg Glu Arg Ile Thr Ser Gly Asn Leu Ser Gln Val 20 25 30 Ile Glu Glu Lys Ser Val Val Gly Val Thr Thr Asn Pro Ala Ile Phe 35 40 45 Ala Ala Ala Met Ser Lys Gly Asp Ser Tyr Asp Ala Gln Ile Ala Glu 50 55 60 Leu Lys Ala Ala Gly Ala Ser Val Asp Gln Ala Val Tyr Ala Met Ser 65 70 75 80 Ile Asp Asp Val Arg Asn Ala Cys Asp Leu Phe Thr Gly Ile Phe Glu 85 90 95 Ser Ser Asn Gly Tyr Asp Gly Arg Val Ser Ile Glu Val Asp Pro Arg 100 105 110 Ile Ser Ala Asp Arg Asp Ala Thr Leu Ala Gln Ala Lys Glu Leu Trp 115 120 125 Ala Lys Val Asp Arg Pro Asn Val Met Ile Lys Ile Pro Ala Thr Pro 130 135 140 Gly Ser Leu Pro Ala Ile Thr Asp Ala Leu Ala Glu Gly Ile Ser Val 145 150 155 160 Asn Val Thr Leu Ile Phe Ser Val Ala Arg Tyr Arg Glu Val Ile Ala 165 170 175 Ala Tyr Ile Glu Gly Ile Lys Gln Ala Ala Ala Asn Gly His Asp Val 180 185 190 Ser Lys Ile His Ser Val Ala Ser Phe Phe Val Ser Arg Val Asp Val 195 200 205 Glu Ile Asp Lys Arg Leu Glu Ala Ile Gly Ser Asp Glu Ala Leu Ala 210 215 220 Leu Arg Gly Lys Ala Gly Val Ala Asn Ala Gln Arg Ala Tyr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Lys Glu Leu Phe Asp Ala Ala Glu Leu Pro Glu Gly Ala Asn Thr 245 250 255 Gln Arg Pro Leu Trp Ala Ser Thr Gly Val Lys Asn Pro Ala Tyr Ala 260 265 270 Ala Thr Leu Tyr Val Ser Glu Leu Ala Gly Pro Asn Thr Val Asn Thr 275 280 285 Met Pro Glu Gly Thr Ile Asp Ala Val Leu Glu Leu Gly Asn Leu His 290 295 300 Gly Asp Thr Leu Ser Asn Ser Ala Ala Glu Ala Asp Ala Val Phe Ser 305 310 315 320 Gln Leu Glu Ala Leu Gly Val Asp Leu Ala Asp Val Phe Gln Val Leu 325 330 335 Glu Thr Glu Gly Val Asp Lys Phe Val Ala Ser Trp Ser Glu Leu Leu 340 345 350 Glu Ser Met Glu Ala Arg Leu Lys 355 360 <210> 2 <211> 1080 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC31388 <400> 2 atgtctcaca ttgatgatct tgcacagctc ggcacttcca cttggctcga cgacctctcc 60 cgcgagcgca ttacttccgg caatctcagc caggttattg aggaaaagtc tgtagtcggt 120 gtcaccacca acccagctat tttcgcagca gcaatgtcca agggcgattc ctacgacgct 180 cagatcgcag agctcaaggc cgctggcgca tctgttgacc aggctgttta cgccatgagc 240 atcgacgatg ttcgcaatgc ttgtgatctg ttcaccggca tcttcgagtc ctccaacggc 300 tacgacggcc gcgtgtccat cgaggttgac ccacgtatct ctgctgaccg cgacgcaacc 360 ctggctcagg ccaaggagct gtgggcaaag gttgatcgtc caaacgtcat gatcaagatc 420 cctgcaaccc caggttcttt gccagcaatc accgacgctt tggctgaggg catcagcgtt 480 aacgtcacct tgatcttctc cgttgctcgc taccgcgagg tcatcgctgc gtacatcgag 540 ggaatcaagc aggcagctgc aaacggccac gacgtatcca agatccactc tgtggcttcc 600 ttcttcgtct cccgcgtcga cgttgagatc gacaagcgcc tcgaggcaat cggatccgat 660 gaggctttgg ctctgcgcgg caaggcaggc gttgccaacg ctcagcgcgc ttacgctgtg 720 tacaaggagc ttttcgacgc cgccgagctg cctgaaggtg ccaacactca gcgcccactg 780 tgggcatcca ccggcgtgaa gaaccctgcg tacgctgcaa ctctttacgt ttccgagctg 840 gctggtccaa acaccgtcaa 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cct ctt ggc 789 Glu Tyr Arg His Thr Lys Gly Val Glu Ile Thr Thr Gly Pro Leu Gly 125 130 135 cag ggt ctt gca tct gca gtt ggt atg gcc atg gct gct cgt cgt gag 837 Gln Gly Leu Ala Ser Ala Val Gly Met Ala Met Ala Ala Arg Arg Glu 140 145 150 155 cgt ggc cta ttc gac cca acc gct gct gag ggc gaa tcc cca ttc gac 885 Arg Gly Leu Phe Asp Pro Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ser Pro Phe Asp 160 165 170 cac cac atc tac gtc att gct tct gat ggt gac ctg cag gaa ggt gtc 933 His His Ile Tyr Val Ile Ala Ser Asp Gly Asp Leu Gln Glu Gly Val 175 180 185 acc tct gag gca tcc tcc atc gct ggc acc cag cag ctg ggc aac ctc 981 Thr Ser Glu Ala Ser Ser Ile Ala Gly Thr Gln Gln Leu Gly Asn Leu 190 195 200 atc gtg ttc tgg gat gac aac cgc atc tcc atc gaa gac aac act gag 1029 Ile Val Phe Trp Asp Asp Asn Arg Ile Ser Ile Glu Asp Asn Thr Glu 205 210 215 atc gct ttc aac gag gac gtt gtt gct cgt tac aag gct tac ggc tgg 1077 Ile Ala Phe Asn Glu Asp Val Val Ala Arg Tyr Lys Ala Tyr Gly Trp 220 225 230 235 cag acc att gag gtt gag gct ggc gag gac gtt gca gca atc gaa gct 1125 Gln Thr Ile Glu Val Glu Ala Gly Glu Asp Val Ala Ala Ile Glu Ala 240 245 250 gca gtg gct gag gct aag aag gac acc aag cga cct acc ttc atc cgc 1173 Ala Val Ala Glu Ala Lys Lys Asp Thr Lys Arg Pro Thr Phe Ile Arg 255 260 265 gtt cgc acc atc atc ggc ttc cca gct cca acc atg atg aac acc ggt 1221 Val Arg Thr Ile Ile Gly Phe Pro Ala Pro Thr Met Met Asn Thr Gly 270 275 280 gct gtg cac ggt gct gct ctt ggc gca gct gag gtt gca gca acc aag 1269 Ala Val His Gly Ala Ala Leu Gly Ala Ala Glu Val Ala Ala Thr Lys 285 290 295 act gag ctt gga ttc gat cct gag gct cac ttc gcg atc gac gat gag 1317 Thr Glu Leu Gly Phe Asp Pro Glu Ala His Phe Ala Ile Asp Asp Glu 300 305 310 315 gtt atc gct cac acc cgc tcc ctc gca gag cgc gct gca cag aag aag 1365 Val Ile Ala His Thr Arg Ser Leu Ala Glu Arg Ala Ala Gln Lys Lys 320 325 330 gct gca tgg cag gtc aag ttc gat gag tgg gca gct gcc aac cct gag 1413 Ala Ala Trp Gln Val Lys Phe Asp Glu Trp Ala Ala Ala Asn Pro Glu 335 340 345 aac aag gct ctg ttc gat cgc ctg aac tcc cgt gag ctt cca gcg ggc 1461 Asn Lys Ala Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser Arg Glu Leu Pro Ala Gly 350 355 360 tac gct gac gag ctc cca aca tgg gat gca gat gag aag ggc gtc gca 1509 Tyr Ala Asp Glu Leu Pro Thr Trp Asp Ala Asp Glu Lys Gly Val Ala 365 370 375 act cgt aag gct tcc gag gct gca ctt cag gca ctg ggc aag acc ctt 1557 Thr Arg Lys Ala Ser Glu Ala Ala Leu Gln Ala Leu Gly Lys Thr Leu 380 385 390 395 cct gag ctg tgg ggc ggt tcc gct gac ctc gca ggt tcc aac aac acc 1605 Pro Glu Leu Trp Gly Gly Ser Ala Asp Leu Ala Gly Ser Asn Asn Thr 400 405 410 gtg atc aag ggc tcc cct tcc ttc ggc cct gag tcc atc tcc acc gag 1653 Val Ile Lys Gly Ser Pro Ser Phe Gly Pro Glu Ser Ile Ser Thr Glu 415 420 425 acc tgg tct gct gag cct tac ggc cgt aac ctg cac ttc ggt atc cgt 1701 Thr Trp Ser Ala Glu Pro Tyr Gly Arg Asn Leu His Phe Gly Ile Arg 430 435 440 gag cac gct atg gga tcc atc ctc aac ggc att tcc ctc cac ggt ggc 1749 Glu His Ala Met Gly Ser Ile Leu Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly 445 450 455 acc cgc cca tac ggt gga acc ttc ctc atc ttc tcc gac tac atg cgt 1797 Thr Arg Pro Tyr Gly Gly Thr Phe Leu Ile Phe Ser Asp Tyr Met Arg 460 465 470 475 cct gca gtt cgt ctt gca gct ctc atg gag acc gac gct tac tac gtc 1845 Pro Ala Val Arg Leu Ala Ala Leu Met Glu Thr Asp Ala Tyr Tyr Val 480 485 490 tgg acc cac gac tcc atc ggt ctg ggc gaa gat ggc cca acc cac cag 1893 Trp Thr His Asp Ser Ile Gly Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln 495 500 505 cct gtt gaa acc ttg gct gcg ctg cgc gcc atc cca ggt ctg tcc gtc 1941 Pro Val Glu Thr Leu Ala Ala Leu Arg Ala Ile Pro Gly Leu Ser Val 510 515 520 ctg cgt cct gca gat gcg aat gag acc gcc cag gct tgg gct gca gca 1989 Leu Arg Pro Ala Asp Ala Asn Glu Thr Ala Gln Ala Trp Ala Ala Ala 525 530 535 ctt gag tac aag gaa ggc cct aag ggt ctt gca ctg acc cgc cag aac 2037 Leu Glu Tyr Lys Glu Gly Pro Lys Gly Leu Ala Leu Thr Arg Gln Asn 540 545 550 555 gtt cct gtt ctg gaa ggc acc aag gag aag gct gct gaa ggc gtt cgc 2085 Val Pro Val Leu Glu Gly Thr Lys Glu Lys Ala Ala Glu Gly Val Arg 560 565 570 cgc ggt ggc tac gtc ctg gtt gag ggt tcc aag gaa acc cca gat gtg 2133 Arg Gly Gly Tyr Val Leu Val Glu Gly Ser Lys Glu Thr Pro Asp Val 575 580 585 atc ctc atg ggc tcc ggc tcc gag gtt cag ctt gca gtt aac gct gcg 2181 Ile Leu Met Gly Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Ala Val Asn Ala Ala 590 595 600 aaa gct ctg gaa gct gag ggc gtt gca gct cgc gtt gtt tca gtt cct 2229 Lys Ala Leu Glu Ala Glu Gly Val Ala Ala Arg Val Val Ser Val Pro 605 610 615 tgc atg gat tgg ttc cag gag cag gac gca gag tac atc gag tcc gtt 2277 Cys Met Asp Trp Phe Gln Glu Gln Asp Ala Glu Tyr Ile Glu Ser Val 620 625 630 635 ctg cct gca gct gtg acc gct cgt gtg tct gtt gaa gct ggc atc gca 2325 Leu Pro Ala Ala Val Thr Ala Arg Val Ser Val Glu Ala Gly Ile Ala 640 645 650 atg cct tgg tac cgc ttc ttg ggc acc cag ggc cgt gct gtc tcc ctt 2373 Met Pro Trp Tyr Arg Phe Leu Gly Thr Gln Gly Arg Ala Val Ser Leu 655 660 665 gag cac ttc ggt gct tct gcg gat tac cag acc ctg ttt gag aag ttc 2421 Glu His Phe Gly Ala Ser Ala Asp Tyr Gln Thr Leu Phe Glu Lys Phe 670 675 680 ggc atc acc acc gat gca gtc gtg gca gcg gcc aag gac tcc att aac 2469 Gly Ile Thr Thr Asp Ala Val Val Ala Ala Ala Lys Asp Ser Ile Asn 685 690 695 agt taattgcc ctgctgtttt tagcttcaac ccggggcagt atgattctcc 2520 Ser 700 ggaattttat tgccccgggt tgttgttgtt aatcggtaca aagggtctta agcacatccc 2580 ttacttgcct gctctccttg agcacagttc aagaacaatt cttttaagga aaatttagtt 2640 tc atg tct cac att gat gat ctt gca cag ctc ggc act tcc act 2684 Met Ser His Ile Asp Asp Leu Ala Gln Leu Gly Thr Ser Thr 1 5 10 tgg ctc gac gac ctc tcc cgc gag cgc att act tcc ggc aat ctc agc 2732 Trp Leu Asp Asp Leu Ser Arg Glu Arg Ile Thr Ser Gly Asn Leu Ser 15 20 25 30 cag gtt att gag gaa aag tct gta gtc ggt gtc acc acc aac cca gct 2780 Gln Val Ile Glu Glu Lys Ser Val Val Gly Val Thr Thr Asn Pro Ala 35 40 45 att ttc gca gca gca atg tcc aag ggc gat tcc tac gac gct cag atc 2828 Ile Phe Ala Ala Ala Met Ser Lys Gly Asp Ser Tyr Asp Ala Gln Ile 50 55 60 gca gag ctc aag gcc gct ggc gca tct gtt gac cag gct gtt tac gcc 2876 Ala Glu Leu Lys Ala Ala Gly Ala Ser Val Asp Gln Ala Val Tyr Ala 65 70 75 atg agc atc gac gat gtt cgc aat gct tgt gat ctg ttc acc ggc atc 2924 Met Ser Ile Asp Asp Val Arg Asn Ala Cys Asp Leu Phe Thr Gly Ile 80 85 90 ttc gag tcc tcc aac ggc tac gac ggc cgc gtg tcc atc gag gtt gac 2972 Phe Glu Ser Ser Asn Gly Tyr Asp Gly Arg Val Ser Ile Glu Val Asp 95 100 105 110 cca cgt atc tct gct gac cgc gac gca acc ctg gct cag gcc aag gag 3020 Pro Arg Ile Ser Ala Asp Arg Asp Ala Thr Leu Ala Gln Ala Lys Glu 115 120 125 ctg tgg gca aag gtt gat cgt cca aac gtc atg atc aag atc cct gca 3068 Leu Trp Ala Lys Val Asp Arg Pro Asn Val Met Ile Lys Ile Pro Ala 130 135 140 acc cca ggt tct ttg cca gca atc acc gac gct ttg gct gag ggc atc 3116 Thr Pro Gly Ser Leu Pro Ala Ile Thr Asp Ala Leu Ala Glu Gly Ile 145 150 155 agc gtt aac gtc acc ttg atc ttc tcc gtt gct cgc tac cgc gag gtc 3164 Ser Val Asn Val Thr Leu Ile Phe Ser Val Ala Arg Tyr Arg Glu Val 160 165 170 atc gct gcg tac atc gag gga atc aag cag gca gct gca aac ggc cac 3212 Ile Ala Ala Tyr Ile Glu Gly Ile Lys Gln Ala Ala Ala Asn Gly His 175 180 185 190 gac gta tcc aag atc cac tct gtg gct tcc ttc ttc gtc tcc cgc gtc 3260 Asp Val Ser Lys Ile His Ser Val Ala Ser Phe Phe Val Ser Arg Val 195 200 205 gac gtt gag atc gac aag cgc ctc gag gca atc gga tcc gat gag gct 3308 Asp Val Glu Ile Asp Lys Arg Leu Glu Ala Ile Gly Ser Asp Glu Ala 210 215 220 ttg gct ctg cgc ggc aag gca ggc gtt gcc aac gct cag cgc gct tac 3356 Leu Ala Leu Arg Gly Lys Ala Gly Val Ala Asn Ala Gln Arg Ala Tyr 225 230 235 gct gtg tac aag gag ctt ttc gac gcc gcc gag ctg cct gaa ggt gcc 3404 Ala Val Tyr Lys Glu Leu Phe Asp Ala Ala Glu Leu Pro Glu Gly Ala 240 245 250 aac act cag cgc cca ctg tgg gca tcc acc ggc gtg aag aac cct gcg 3452 Asn Thr Gln Arg Pro Leu Trp Ala Ser Thr Gly Val Lys Asn Pro Ala 255 260 265 270 tac gct gca act ctt tac gtt tcc gag ctg gct ggt cca aac acc gtc 3500 Tyr Ala Ala Thr Leu Tyr Val Ser Glu Leu Ala Gly Pro Asn Thr Val 275 280 285 aac acc atg cca gaa ggc acc atc gac gct gtt ctg gaa ctg ggc aac 3548 Asn Thr Met Pro Glu Gly Thr Ile Asp Ala Val Leu Glu Leu Gly Asn 290 295 300 ctg cac ggt gac acc ctg tcc aac tcc gcg gca gaa gct gac gct gtg 3596 Leu His Gly Asp Thr Leu Ser Asn Ser Ala Ala Glu Ala Asp Ala Val 305 310 315 ttc tcc cag ctt gag gct ctg ggc gtt gac ttg gca gat gtc ttc cag 3644 Phe Ser Gln Leu Glu Ala Leu Gly Val Asp Leu Ala Asp Val Phe Gln 320 325 330 gtc ctg gag acc gag ggt gtg gac aag ttt gtt gct tct tgg agc gaa 3692 Val Leu Glu Thr Glu Gly Val Asp Lys Phe Val Ala Ser Trp Ser Glu 335 340 345 350 ctg ctt gag tcc atg gaa gct cgc ctg aag tagaatca gcacgctgca 3740 Leu Leu Glu Ser Met Glu Ala Arg Leu Lys 355 360 tcagtaacgg cgacatgaaa tcgaattagt tcgatcttat gtggccgtta cacatctttc 3800 attaaagaaa ggatcgtgac gctaccatcg tgagcacaaa cacgaccccc tccagctgga 3860 caaacccact gcgcgacccg caggataaac gactcccccg catcgctggc ccttccggca 3920 tggtgatctt cggtgtcact ggcgacttgg ctcgaaggaa gctgctcccc gccatttatg 3980 atctagcaaa ccgcggattg ctgcccccag gattctcgtt ggtaggttac ggccgccgcg 4040 aatggtccaa agaagacttt gaaaaatacg tacgcgatgc cgcaagtgct ggtgctcgta 4100 cggaattc 4108 <210> 4 <211> 700 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC31388 <400> 4 Met Thr Thr Leu Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gln Ala Leu Thr Val Arg 1 5 10 15 Asn Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Asp Val Asp Thr Lys Ala Val Asp Thr 20 25 30 Val Arg Val Leu Ala Ala Asp Ala Val Glu Asn Cys Gly Ser Gly His 35 40 45 Pro Gly Thr Ala Met Ser Leu Ala Pro Leu Ala Tyr Thr Leu Tyr Gln 50 55 60 Arg Val Met Asn Val Asp Pro Gln Asp Thr Asn Trp Ala Gly Arg Asp 65 70 75 80 Arg Phe Val Leu Ser Cys Gly His Ser Ser Leu Thr Gln Tyr Ile Gln 85 90 95 Leu Tyr Leu Gly Gly Phe Gly Leu Glu Met Asp Asp Leu Lys Ala Leu 100 105 110 Arg Thr Trp Asp Ser Leu Thr Pro Gly His Pro Glu Tyr Arg His Thr 115 120 125 Lys Gly Val Glu Ile Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Leu Ala Ser 130 135 140 Ala Val Gly Met Ala Met Ala Ala Arg Arg Glu Arg Gly Leu Phe Asp 145 150 155 160 Pro Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ser Pro Phe Asp His His Ile Tyr Val 165 170 175 Ile Ala Ser Asp Gly Asp Leu Gln Glu Gly Val Thr Ser Glu Ala Ser 180 185 190 Ser Ile Ala Gly Thr Gln Gln Leu Gly Asn Leu Ile Val Phe Trp Asp 195 200 205 Asp Asn Arg Ile Ser Ile Glu Asp Asn Thr Glu Ile Ala Phe Asn Glu 210 215 220 Asp Val Val Ala Arg Tyr Lys Ala Tyr Gly Trp Gln Thr Ile Glu Val 225 230 235 240 Glu Ala Gly Glu Asp Val Ala Ala Ile Glu Ala Ala Val Ala Glu Ala 245 250 255 Lys Lys Asp Thr Lys Arg Pro Thr Phe Ile Arg Val Arg Thr Ile Ile 260 265 270 Gly Phe Pro Ala Pro Thr Met Met Asn Thr Gly Ala Val His Gly Ala 275 280 285 Ala Leu Gly Ala Ala Glu Val Ala Ala Thr Lys Thr Glu Leu Gly Phe 290 295 300 Asp Pro Glu Ala His Phe Ala Ile Asp Asp Glu Val Ile Ala His Thr 305 310 315 320 Arg Ser Leu Ala Glu Arg Ala Ala Gln Lys Lys Ala Ala Trp Gln Val 325 330 335 Lys Phe Asp Glu Trp Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Lys Ala Leu Phe 340 345 350 Asp Arg Leu Asn Ser Arg Glu Leu Pro Ala Gly Tyr Ala Asp Glu Leu 355 360 365 Pro Thr Trp Asp Ala Asp Glu Lys Gly Val Ala Thr Arg Lys Ala Ser 370 375 380 Glu Ala Ala Leu Gln Ala Leu Gly Lys Thr Leu Pro Glu Leu Trp Gly 385 390 395 400 Gly Ser Ala Asp Leu Ala Gly Ser Asn Asn Thr Val Ile Lys Gly Ser 405 410 415 Pro Ser Phe Gly Pro Glu Ser Ile Ser Thr Glu Thr Trp Ser Ala Glu 420 425 430 Pro Tyr Gly Arg Asn Leu His Phe Gly Ile Arg Glu His Ala Met Gly 435 440 445 Ser Ile Leu Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly Thr Arg Pro Tyr Gly 450 455 460 Gly Thr Phe Leu Ile Phe Ser Asp Tyr Met Arg Pro Ala Val Arg Leu 465 470 475 480 Ala Ala Leu Met Glu Thr Asp Ala Tyr Tyr Val Trp Thr His Asp Ser 485 490 495 Ile Gly Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln Pro Val Glu Thr Leu 500 505 510 Ala Ala Leu Arg Ala Ile Pro Gly Leu Ser Val Leu Arg Pro Ala Asp 515 520 525 Ala Asn Glu Thr Ala Gln Ala Trp Ala Ala Ala Leu Glu Tyr Lys Glu 530 535 540 Gly Pro Lys Gly Leu Ala Leu Thr Arg Gln Asn Val Pro Val Leu Glu 545 550 555 560 Gly Thr Lys Glu Lys Ala Ala Glu Gly Val Arg Arg Gly Gly Tyr Val 565 570 575 Leu Val Glu Gly Ser Lys Glu Thr Pro Asp Val Ile Leu Met Gly Ser 580 585 590 Gly Ser Glu Val Gln Leu Ala Val Asn Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala 595 600 605 Glu Gly Val Ala Ala Arg Val Val Ser Val Pro Cys Met Asp Trp Phe 610 615 620 Gln Glu Gln Asp Ala Glu Tyr Ile Glu Ser Val Leu Pro Ala Ala Val 625 630 635 640 Thr Ala Arg Val Ser Val Glu Ala Gly Ile Ala Met Pro Trp Tyr Arg 645 650 655 Phe Leu Gly Thr Gln Gly Arg Ala Val Ser Leu Glu His Phe Gly Ala 660 665 670 Ser Ala Asp Tyr Gln Thr Leu Phe Glu Lys Phe Gly Ile Thr Thr Asp 675 680 685 Ala Val Val Ala Ala Ala Lys Asp Ser Ile Asn Ser 690 695 700 <210> 5 <211> 360 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC31388 <400> 5 Met Ser His Ile Asp Asp Leu Ala Gln Leu Gly Thr Ser Thr Trp Leu 1 5 10 15 Asp Asp Leu Ser Arg Glu Arg Ile Thr Ser Gly Asn Leu Ser Gln Val 20 25 30 Ile Glu Glu Lys Ser Val Val Gly Val Thr Thr Asn Pro Ala Ile Phe 35 40 45 Ala Ala Ala Met Ser Lys Gly Asp Ser Tyr Asp Ala Gln Ile Ala Glu 50 55 60 Leu Lys Ala Ala Gly Ala Ser Val Asp Gln Ala Val Tyr Ala Met Ser 65 70 75 80 Ile Asp Asp Val Arg Asn Ala Cys Asp Leu Phe Thr Gly Ile Phe Glu 85 90 95 Ser Ser Asn Gly Tyr Asp Gly Arg Val Ser Ile Glu Val Asp Pro Arg 100 105 110 Ile Ser Ala Asp Arg Asp Ala Thr Leu Ala Gln Ala Lys Glu Leu Trp 115 120 125 Ala Lys Val Asp Arg Pro Asn Val Met Ile Lys Ile Pro Ala Thr Pro 130 135 140 Gly Ser Leu Pro Ala Ile Thr Asp Ala Leu Ala Glu Gly Ile Ser Val 145 150 155 160 Asn Val Thr Leu Ile Phe Ser Val Ala Arg Tyr Arg Glu Val Ile Ala 165 170 175 Ala Tyr Ile Glu Gly Ile Lys Gln Ala Ala Ala Asn Gly His Asp Val 180 185 190 Ser Lys Ile His Ser Val Ala Ser Phe Phe Val Ser Arg Val Asp Val 195 200 205 Glu Ile Asp Lys Arg Leu Glu Ala Ile Gly Ser Asp Glu Ala Leu Ala 210 215 220 Leu Arg Gly Lys Ala Gly Val Ala Asn Ala Gln Arg Ala Tyr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Lys Glu Leu Phe Asp Ala Ala Glu Leu Pro Glu Gly Ala Asn Thr 245 250 255 Gln Arg Pro Leu Trp Ala Ser Thr Gly Val Lys Asn Pro Ala Tyr Ala 260 265 270 Ala Thr Leu Tyr Val Ser Glu Leu Ala Gly Pro Asn Thr Val Asn Thr 275 280 285 Met Pro Glu Gly Thr Ile Asp Ala Val Leu Glu Leu Gly Asn Leu His 290 295 300 Gly Asp Thr Leu Ser Asn Ser Ala Ala Glu Ala Asp Ala Val Phe Ser 305 310 315 320 Gln Leu Glu Ala Leu Gly Val Asp Leu Ala Asp Val Phe Gln Val Leu 325 330 335 Glu Thr Glu Gly Val Asp Lys Phe Val Ala Ser Trp Ser Glu Leu Leu 340 345 350 Glu Ser Met Glu Ala Arg Leu Lys 355 360

Claims (21)

1. 서열번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드.
2. 삭제
3. 삭제
4. 하기 (a) 또는 (b) 로 표현되는 DNA:

   (a) 제 1 항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 DNA,

   (b) 서열번호 2 의 염기서열로 이루어진 DNA.
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 4 항에 기재된 DNA 를 벡터에 조합하여 얻어지는 재조합체 DNA.
8. 제 7 항에 기재된 재조합체 DNA 를 보유하는 형질전환체.
9. 삭제
10. 제 8 항에 있어서, 형질전환체가 방향족 아미노산 또는 방향족 비타민을 생산하는 능력을 갖는 형질전환체.
11. 제 10 항에 기재된 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 방향족 아미노산 또는 방향족 비타민을 생성축적시키고, 배양물로부터 방향족 아미노산 또는 방향족 비타민을 채취하는 것을 특징으로 하는, 방향족 아미노산 또는 방향족 비타민의 제조법.
12. 삭제
13. 제 8 항에 있어서, 형질전환체가 L-히스티딘; 리보플라빈; 핵산; 및 퓨린-뉴클레오티드, 피리미딘-뉴클레오티드, 퓨린-뉴클레오시드, 피리미딘-뉴클레오시드, 퓨린-염기, 피리미딘-염기 및 플라빈-뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 관련 물질에서 선택되는 물질을 생산하는 능력을 갖는 형질전환체인 형질전환체.
14. 제 13 항에 기재된 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 L-히스티딘; 리보플라빈; 핵산; 및 퓨린-뉴클레오티드, 피리미딘-뉴클레오티드, 퓨린-뉴클레오시드, 피리미딘-뉴클레오시드, 퓨린-염기, 피리미딘-염기 및 플라빈-뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 관련 물질에서 선택되는 물질을 생성축적시키고, 배양물로부터 상기 물질을 채취하는 것을 특징으로 하는, L-히스티딘, 리보플라빈, 핵산 및 핵산 관련 물질의 제조법.
15. 제 8 항에 기재된 형질전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 제 1 항에 기재된 폴리펩티드를 생성축적시키고, 배양물로부터 제 1 항에 기재된 폴리펩티드를 채취하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항에 기재된 폴리펩티드의 제조법.
16. 제 8 항에 기재된 형질전환체, 이 형질전환체의 배양물 또는 이 배양물의 처리물을 효소원으로서 사용하고, 케토스 및 알도스를 수성 매질 중에 존재시키고, 이 수성 매질 중에 상기 알도스에 상기 케토스의 디히드록시아세톤 부분이 전이된 당을 생성축적시키고, 상기 수성 매질로부터 상기 당을 채취하는 것을 특징으로 하는, 알도스에 케토스의 디히드록시아세톤 부분이 전이된 당의 제조법으로서,

    상기 배양물의 처리물이 배양 균체의 건조물; 균체의 동결건조물; 균체의 계면활성제 처리물; 균체의 효소처리물; 균체의 초음파 처리물; 균체의 마쇄물; 균체의 용매처리물; 균체의 단백질 분획물; 및 배양 균체 및 처리 균체의 고정화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 제조법.
17. 삭제
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21. 삭제