KR20010112944A - 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 억제하기 위한 방법 및조성물 - Google Patents

폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 억제하기 위한 방법 및조성물 Download PDF

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KR20010112944A
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퍼척캐써린
세티슈챈드란씨
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이곤 이 버그
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Abstract

포유류 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 억제시키기 위한 치료학적 조성물에는 길이가 약 200개 이상의 뉴클레오티드이고 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적으로 상동성인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 부분적으로 이본쇄인 RNA 분자를 포유류 세포에 제공하는 제제가 포함된다. 이러한 RNA 분자는 바람직하게는 기능성 단백질을 생성시키지 않는다. 당해 조성물에 유용한 제제는 시험관내에서 효소적 합성법 또는 화학적 합성법으로 제조되거나 미생물의 재조합 배양물에서 제조되어 이로부터 분리되는 RNA 분자이거나, 또는 포유류 세포로의 전달 후에 생체내에서 목적하는 RNA 분자를 생성시킬 수 있다. 바이러스성 감염, 기타 병원성 감염 또는 특정 암의 치료 또는 예방 방법에서는, 이들 조성물을, 병원체 기원이거나 또는 종양이나 기타 암에 반응하여 생성될 수 있는 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 투여한다.

Description

폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 억제하기 위한 방법 및 조성물{Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences}
폴리뉴클레오티드 조성물은 주로 포유류에게서 질병을 치료하거나 예방하기 위하여 약제학적으로 사용될 뿐만 아니라 이러한 분야에서의 연구에 사용되는 것으로 보고되었다. 구체적으로 언급하면, 상당한 활성이 현재, 바이러스성, 세균성, 진균성 감염 등의 병원성 세포외 및 세포내 감염을 치료하는데 있어서의 폴리뉴클레오티드 조성물의 용도를 포괄하고 있다. 한 예로서, DNA 백신은, 포유류 면역 시스템을 이용함으로써 병원체를 퇴치시키는 제제를 생체내에서 포유류 세포에게 전달하는 것으로 기재되어 있다. 따라서, 이러한 백신은, 예를 들면, 바이러스성 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하고, 감염제에 의한 챌린지시 체액성 또는 세포성면역 반응을 유도하도록 고안된다. 한편, 유전자 요법 벡터는 일반적으로, 포유류에서는 발현되지 않거나, 부적절하게 발현되거나 또는 불충분하게 발현되는 단백질을 포유류 세포에 전달하도록 고안된 폴리뉴클레오티드 조성물이다. 이러한 벡터는 종종, 항원성으로서 인식되거나 또는 원치 않는 세포성 면역 반응을 야기시키는 폴리뉴클레오티드 서열에 종 특이적 면역 반응을 전해야만 한다.
또한, 폴리뉴클레오티드 조성물의 기타 치료학적 용도는, 결여되거나 불충분하게 발현된 단백질을 질병에 걸린 포유류 환자에게 전달하기 위한 것이다. 더우기, 폴리뉴클레오티드는 그 자체가 진단/영상화 프로토콜에서 생체내 시약으로서 유용하거나; 유전자 요법, 안티센스 프로토콜 및 백신 투여에 있어서 시약으로서 유용하거나; 또는 각종 질환, 예를 들면, 유전적 결함, 감염성 질병, 암 및 자가면역 질병을 치료하거나 예방하는데 사용될 약제로서 유용하다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 생물학적 연구 검정, 의학, 진단 및 스크리닝 검정, 및 오염물 탐지 검정과 같은 검정에서 시험관내 시약으로서 유용하다.
당해 분야에 널리 공지된 많은 문제점으로 인해, 수 많은 폴리뉴클레오티드 조성물이 유용한 약제로서 광범위하게 허용되지 못하고 있다. 따라서, 지금까지 포유류에게서 질병을 치료하도록 의학 협회에 의해 허용된 DNA 백신이나 치료제는 거의 없었다.
폴리뉴클레오티드 조성물에 의해 매개되는 현상이 식물과 선충에서 관찰되었는데, 이는 해독 후 유전자 사일런싱(silencing) 및 전사 사일런싱으로서 지칭된다. 이러한 현상은 프로모터와 같은 조절 요소, 또는 해당 세포에서 이미 발현된본래의 유전자 또는 이의 부분과 일부 상동성을 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현하는 RNA, 바이러스, 비로이드 또는 플라스미드로 식물, 선충 또는 드로소필라(Drosophila)를 형질감염 또는 감염시키면, 내인성 조절 요소 또는 유전자와 외인성 서열 모두의 발현이 영구적으로 억제될 수 있다는 것을 입증해준다. 이러한 사일런싱 효과는 유전자 특이적인 것으로 밝혀졌다[참조: L. Timmons and A. Fire,Nature, 395: 354(Oct. 29, 1998); A. Fire et al.,Nature, 391: 806-810(Feb. 19, 1998); and R. Jorgensen et al.,Science, 279: 1486-1487(March 6, 1998)]. 완전한 길이의 프로-알파 I 콜라겐 유전자를 암호화하는 DNA 플라스미드를 설치류 섬유아세포 조직 세포주에 일시적으로 형질감염시키고, 본래의 콜라겐 유전자와 상기와 같이 일시적으로 발현된 유전자에 대한 "사일런싱" 효과를 관찰하였다[참조: Bahramian and Zarbl,Mol. Cell. Biol., 19(1): 274-283(Jan. 1999)].
또한, 2차 구조를 갖는 안티센스 RNA를 사용하고/하거나 이를 이본쇄 RNAse와 함께 사용함으로써 유전자를 억제시키는 것에 관한 국제 공개특허공보 WO98/05770(1998. 2. 12.자로 공개됨)를 참조할 수 있다. 국제 공개특허공보 WO99/53050(1999. 10. 21.자로 공개됨)은 또한, 센스 및 안티-센스 RNA 분자를 암호화하는 키메릭 유전자를 도입함으로써, 특히 식물 세포에서의 핵산의 표현형 발현을 저하시키는 것에 관한 것이다.
포유류 내의 필수 유전자 서열에는 어떠한 불리한 영향도 미치지 않으면서, 포유류에게서 질병을 유발시키는 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 포유류 세포에서 바이러스 및 기타 세포내 병원체의 복제에 필수적인 폴리뉴클레오티드 서열;세포외 포유류 병원체의 서열; 또는 포유류에서 암 확산을 매개하는 종양 항원의 서열 등의 기능을 억제시키는 폴리뉴클레오티드 조성물 및 이를 사용하는 방법이 당업계에 요망된다.
발명의 요약
한 국면에 있어서, 본 발명은 포유류 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 억제시키기 위한 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 길이가 약 200개 이상의 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 부분적으로 이본쇄인 RNA 분자를 포유류 세포에 제공해주는 제제를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면, 바이러스 또는 기타 세포내 병원체의 폴리뉴클레오티드 서열; 암 항원 또는 필수 종양형성성 조절 서열의 폴리뉴클레오티드 서열; 포유류에 존재하는 세포외 병원체의 폴리뉴클레오티드 서열; 또는 세포에서 "작동 중지"될 것이 요망되는 기타 모든 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있는 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적으로 상동성이다. 상기 RNA 분자는 바람직하게는 기능성 단백질을 생성시키지 않는다. 이러한 RNA 분자는 바람직하게는, 천연의 필수 포유류 폴리뉴클레오티드 서열과는 거의 비-상동성이다. 한 양태에서는, 이러한 조성물의 제제는 시험관내에서 효소적 합성법 또는 화학적 합성법으로 제조된 RNA 분자이다. 또 다른 양태에서는, RNA 분자를 재조합체 배양물, 예를 들면, 세균 세포에서 생성시키고, 이로부터 분리한 다음, 이를 다음에 논의된 방법에 사용할 수 있다. 또 다른 양태에서는, 상기 조성물의 제제가 포유류 세포로의 전달 후에 생체내에서RNA 분자를 생성시킨다.
또 다른 국면에 있어서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체 중에, 바로 위에서 언급된 조성물과 다음에 구체적으로 기재되는 조성물중 하나 이상; 및 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 바이러스와 같은 세포내 병원성 감염을 치료하는데 유용하다. 기타 이러한 조성물은 특정 암을 치료하는데 유용하다. 기타 상기 조성물은 특정한 세포외 병원체를 치료하는데 유용하다. 또한, 기타 조성물은 치료 또는 백신용으로 사용하기 위해 포유류에게서 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 억제시킬 필요가 있는 모든 질병이나 장애를 치료하는데 유용하다.
또 다른 국면에 있어서, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드가 감염된 포유류 세포에서 바이러스의 복제 및/또는 발병에 필요한 바이러스 폴리뉴클레오티드 서열인, 상기 언급된 조성물중 하나 이상을 약제학적으로 허용되는 담체 중에서, 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 함께 포유류에게 투여함으로써, 상기 포유류에게서 바이러스성 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 조성물은 포유류의 세포에서 바이러스성 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 투여된다.
추가의 국면에 있어서, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드가 감염된 포유류 세포에서 바이러스의 복제 및/또는 발병에 필요한 바이러스 폴리뉴클레오티드 서열인, 상기 언급된 조성물중 하나 이상을 약제학적으로 허용되는 담체 중에서, 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 함께 포유류에게투여함으로써, 상기 포유류에게서 바이러스성 감염을 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 조성물은 바이러스가 포유류 세포 내로 후속적으로 도입되는 경우 바이러스성 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 투여된다.
또 다른 국면에 있어서, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드가 종양 항원 또는 이의 기능성 단편, 또는 조절 서열을 암호화하는 서열이고 이러한 서열 기능이 포유류에게서 종양을 유지하도록 요구되는 것인, 상기 언급된 조성물 하나 이상을 포유류에게 투여함으로써, 상기 포유류에게서 바이러스에 의해 유도된 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 조성물은 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 약제학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 상기 조성물은 포유류에서 종양-유지 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 투여된다.
또 다른 국면에 있어서, 본 발명은 세포내 병원체에 의한 포유류의 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 표적 폴리뉴클레오티드가 감염된 포유류 세포에서 상기 병원체의 복제 및/또는 발병에 필요한 세포내 병원체의 폴리뉴클레오티드 서열인, 상기 언급된 조성물중 하나 이상을 포유류에게 투여한다. 이 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 중에서 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 함께, 포유류에서 상기 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 투여된다.
또 다른 국면에 있어서, 본 발명은 세포외 포유류 병원체에 의한 포유류의 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 표적 폴리뉴클레오티드가 감염된 포유류에서 상기 병원체의 복제 및/또는 발병에 필요한 세포외 병원체의 폴리뉴클레오티드 서열인, 상기 언급된 조성물중 하나 이상을 포유류에게 투여한다. 이 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 중에서, 상기 포유류에서 상기 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 투여된다. 이는 병원성 세포에 의한 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 함께 투여될 수 있다.
또 다른 국면에 있어서, 본 발명은 포유류에게서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 표적 폴리뉴클레오티드가 하기 유전자 또는 조절 서열의 정상적인 복사물체도 보유하고 있는 포유류에서 비정상적인 암을 유발하는 유전자 또는 발현되지 않은 조절 서열의 폴리뉴클레오티드 서열인, 상기 언급된 조성물중 하나 이상을 포유류에게 투여한다. 이러한 국면에 따르면, 비정상적인 서열과 정상적인 서열 간의 차이는 폴리뉴클레오티드 차이이다. 이 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 중에서, 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 함께, 상기 포유류에서 비정상적인 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 투여된다.
추가의 국면에 있어서, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드 서열이, 건강한 포유류에게서는 발견되지 않는 폴리뉴클레오티드 생성물 또는 이러한 생성물의 발현에 필수적인 발현되지 않은 조절 서열을 발현하는 폴리뉴클레오티드 서열인, 상기 언급된 조성물중 하나 이상을, 상기 건강한 포유류에게서는 발견되지 않는 폴리뉴클레오티드 생성물의 발현을 특징적으로 나타내는 질병 또는 장애가 있는 포유류에게 투여하는 것을 포함하여, 포유류에게서 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 이 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 중에서 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제의 존재하 또는 부재하에, 상기 포유류의 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 생성물 또는 조절 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 투여된다.
본 발명의 또 다른 국면은 진단 또는 기타 연구 검정에 사용하기 위하여 시험관내에서, 또는 치료 또는 기타 의학적 사용을 위해 포유류에게 반송하기 위하여 생체외에서, 포유류 세포 또는 조직에서의 목적하지 않는 유전자의 발현을 저하시키거나 억제시키기 위한 시약과 같이, 연구 방법에 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 기타 국면은 다음의 바람직한 양태의 상세한 설명에서 추가로 기재된다.
본 발명은 포유류 세포에 존재하는 특정의 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능에 대한 억제 효과 또는 기타 조절 효과를 지니고 있는 폴리뉴클레오티드 조성물, 및 이러한 조성물을 치료, 예방, 진단 및 연구 방법에 사용하는 방법에 관한 것이다.
도 1A는 박테리오파아지 T7 RNA 폴리머라제 프로모터-정방향 gag 프라이머(T7F) 및 역방향 gag(R) 프라이머를 사용하여 생성된 PCR 생성물을 예시하는 것이다. T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 상기 PCR 주형으로부터 전사시키면, RNA 서열 gag 센스 쇄가 생성된다.
도 1B는 정방향 gag 프라이머(F) 및 T7 프로머터 역방향 gag(T7R) 프라이머를 사용하여 생성된 PCR 생성물을 예시하는 것이다. T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 상기 주형으로부터 전사시키면, RNA 서열 gag 안티센스 쇄가 생성된다. 도 1A의 주형과 도 1B의 주형 모두를 사용하면, 이본쇄 gag RNA 서열이 생성된다.
본 발명은 선택된 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키기 위하여, 포유류 종을 괴롭히는 질병과 장애를 치료, 예방, 연구 및 진단하기 위한 신규한 폴리뉴클레오티드 조성물 및 방법을 제공한다. 이들 조성물 및 방법은 시험관내와 생체내 모두에서 유용하다. 이들 조성물 및 방법은 추가로, 관련 포유류의 면역 시스템을 전혀 자극할 필요없이 치료학적 목적을 달성하도록 세포의 분자 기전을 이용할 수 있게 해준다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적" 또는 "표적 폴리뉴클레오티드 서열"은 천연이든 아니든 간에 포유류 유기체 또는 포유류 세포 내에 존재하는 모든 서열, 및 세포내 또는 세포외 병원성 감염 또는 질병으로 인해 존재하는 이종 서열 또는 가능하게는 결함있는 포유류 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 이러한 폴리뉴클레오티드 서열은 저하시키거나 억제시켜야 하는 것이 요망되는 기능을 지닌다. 상기 표적 서열은 암호화 서열일 수 있는데, 즉 이는 단백질 또는 이의 기능성 단편을 발현하도록 해독된다. 또 다른 한편, 표적 서열은 비-암호화 서열일 수 있으나, 조절 기능을 지닐 수 있다. 하나의 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 감염된 포유류 세포에서 바이러스의 복제 및/또는 발병에 필요한 바이러스 폴리뉴클레오티드 서열이다. 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 또 다른 양태는 바이러스-유도된 암의 종양 항원 또는 이의 기능성 단편, 또는 발현되지 않은 조절 서열이고, 이러한 서열은 포유류에서 종양을 유지하는데 요구된다. 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 또 다른 양태는 감염된 포유류에서 병원체의 복제 및/또는 발병에 필요한 세포내 또는 세포외 병원체의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 또 다른 양태는 하기 유전자 또는 서열의 정상적인 복사체도 보유하고 있는 포유류에서 비정상적인 암-유발 유전자(또는 발현되지 않은 조절 서열)의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 비정상적인 서열과 정상적인 서열 간의 차이는 폴리뉴클레오티드 서열 수준차이다. 이러한 비정상적인 서열은, 예를 들면, 2개의 정상적인 유전자의 융합물일 수 있고, 표적 서열은 이러한 융합물 전체에 걸쳐 있는 서열, 예를 들면, 특정 백혈병을 특징적으로 나타내는 BCR-abl 유전자 서열일 수 있다. 용어 "유전자"는 전사되고/되거나 해독되든지 간에, 프로모터와 같은 조절 서열을 포함한, "사일런스(silence)"되도록 한 모든 표적 서열을 포함한다.
용어 "포유류" 또는 "포유류의"는 이들의 통상적인 의미를 포괄한다. 본 발명이 사람에게서의 효능을 가장 바람직하게 추구하고자 하였지만, 개, 고양이 및 말과 같은 가축 포유류 뿐만 아니라 특히 관심있는 포유류, 예를 들면, 동물원 동물, 농장 가축 등에 이용될 수 있다.
A. 본 발명의 조성물
본 발명에 따라서, 포유류 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 억제하기 위한 조성물은 적어도 부분적으로 이본쇄인 RNA 분자를 포유류 세포에게 제공해주는 제제를 포함한다. 일반적으로, 용어 "RNA"는 특정한 경우, 예를 들면,리보스의 2'-OH 그룹이 특정한 연결에 요구되는 경우를 제외하고는, RNA-DNA 하이브리드를 포함할 수 있다. 상기 RNA 분자는 길이가 약 200개 이상의 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 중요하게는, 이러한 RNA 분자의 폴리뉴클레오티드 서열이 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적으로 상동성이다. 이러한 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 바람직하게는, 엑손 서열 또는 이의 부분을 함유한다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 인트론 서열을 함유하지 않는다. 바람직하게는, RNA 분자는 기능성 단백질을 생성시키지 않으며, 더욱 바람직하게는, 해독되지 않는다. 상기 RNA 분자의 폴리뉴클레오티드 서열은 바람직하게는, 정상적으로 기능하는 천연의 필수 포유류 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적으로 비-상동성이다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들면, 단일 표적 병원체 또는 하나 이상의 표적 병원체의 하나 이상의 유전자 서열, 또는 사일런스시키고자 하는 기타 범주의 표적을 암호화하는 다중 표적 또는 폴리펩티드 접근 방식을 이용할 수 있다.
"적어도 부분적으로 이본쇄인 RNA 분자"에는 길이가 약 100 내지 10,000 폴리뉴클레오티드인 RNA 폴리뉴클레오티드 서열이 포함된다. 현재, 이 서열은 가장 바람직하게는 길이가 200개 이상의 폴리뉴클레오티드이지만, 한 양태에서는, 길이가 200 내지 8000개 폴리뉴클레오티드 범위일 수 있다. 또 다른 양태에서는, RNA 분자의 길이가 7500개 미만의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또 다른 양태에서는, RNA 분자의 서열 길이가 약 5000개 미만의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 또 다른 양태에서는, RNA 분자의 서열 길이가 약 2000개 미만의 폴리뉴클레오티드일수 있다. 또 다른 양태에서는, RNA 분자의 서열 길이가 약 1000개 미만의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또 다른 양태에서는, RNA 분자의 서열 길이가 약 750개 미만의 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
RNA 분자가 최소한의 안정성을 유지하기 위해서는, 폴리뉴클레오티드 서열의 조성과 약 -9.2kcal/mol의 ㅿG에 따라서, 이본쇄 서열 내에 최소 11 내지 30개의 뉴클레오티드가 포함된다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, ㅿG는 분자상 입체 배치가 안정성을 유지하기 위해 요구되는 최소 외부 에너지 상태를 규정한다[참조: Jaeger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 20: 7706-7710(1989); and Soler and Jankowski,Math. Biosci., 2: 167-190(1991)]. 이러한 최소치를 기준으로 하면, 상기 부분적으로 이본쇄인 RNA 분자의 10% 이상이 바람직하게는 이본쇄이다. 또 다른 한편, 이들 RNA 분자의 이본쇄 부분은 해당 서열의 30% 이상일 수 있다. 또 다른 양태에서는, 이들 분자의 이본쇄 부분이 해당 서열의 50% 이상일 수 있다. 또 다른 양태에서는, 이들 분자의 이본쇄 부분이 해당 서열의 70% 이상일 수 있다. 또 다른 양태에서는, 이들 분자의 이본쇄 부분이 해당 서열의 90% 이상일 수 있다. 또 다른 양태에서는, 전체 서열이 이본쇄일 수 있다. 또 다른 한편, 이들 분자의 이본쇄 부분은 해당 서열의 어느 한 말단이나 양 말단 모두에서 발생될 수 있거나, 또는 이 분자가 선형인 경우에는 몇몇 중간 부분에서 발생될 수 있다. 유사하게, 이본쇄 부분은 상기 분자가 환상인 경우에는 어떠한 위치에서도 발생될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서는, RNA 분자의 이본쇄 부분이, 이러한 분자가 포유류 세포 내에 있을 때만 이본쇄로 된다. 본 발명의 기타 양태에서는, 부분적으로 이본쇄인 분자가 RNA/DNA 하이브리드, 예를 들면, 시험관내에서 제조된 RNA와 DNA를 함유하는 일본쇄, 또는 이러한 일본쇄 또는 이의 부분의 2개의 이중체이다. 또 다른 양태에서는, 생체내 또는 시험관내에서 제조된 RNA 분자가 RNA 일본쇄와 DNA 일본쇄로 구성된 이중체이다.
부분적으로 이본쇄인 RNA 분자 폴리뉴클레오티드 서열은, 상기 표적 서열의 기능을 효과적으로 저하시키거나 억제시키기 위해서는 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적으로 상동성이어야만 한다. 필수 상동성은 컴퓨터 알고리듬을 사용하여 적절하게 규정할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, "상동성" 또는 "동일성"은 이러한 두 서열 간의 정합 동일성에 의해 결정된 바와 같이, 2개의 폴리펩티드 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 서열 관련 정도를 의미한다. 동일성과 상동성 모두는 선행 기술 분야에 현존하는 방법에 의해 용이하게 계산할 수 있다[참조: COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, (1988); BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, (1993); COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, (1994); SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, (1987); and SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M. and Devereux, J. eds., M Stockton Press, New York, (1991)]. 두 폴리뉴클레오티드 서열 간의 동일성과 상동성을 측정하기 위한 수 많은 방법이 존재하긴 하지만, 용어 "동일성", "유사성" 및 상동성은 당해 분야의 숙련인에게 널리 공지되어 있다[참조: H. Carillo and D. Lipton,SIAM J. Applied Math., 48: 1073(1988)]. 두 서열 간의 동일성 또는 상동성을 결정하기 위해 통상 이용되는 방법에는 문헌[참조: Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and H. Carillo and D. Lipton,SIAM J. Applied Math., 48: 1073(1988)]에 기재된 방법이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 동일성 또는 상동성을 결정하는데 바람직한 방법은 시험된 두 서열 간의 가장 많은 정합을 제공하도록 고안된다. 동일성과 유사성을 결정하는 방법이 컴퓨터 프로그램으로 개발되었다. 두 서열 간의 동일성과 상동성을 결정하는데 바람직한 컴퓨터 프로그램에는 GCG 프로그램 패키지로부터의 알고리듬 BESTFIT[참조: J. Devereux et al.,Nucl. Acids Res., 12(1): 387(1984)], 관련 MACVECTOR 프로그램(Oxford) 및 FASTA(Pearson) 프로그램이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들면, 중요한 천연의 포유류 폴리뉴클레오티드 서열과 표적 폴리뉴클레오티드 서열 간의 데이타베이스내 서열 유사성에 대한 조사 결과, 본 발명에서 사용하기에 적합한 RNA 분자를 고안할 수 있다. 특정한 모든 RNA 분자에 필요한 상동성 및/또는 알고리듬은 표적의 동일성, 및/또는 본 발명의 방법을 사용한 후에 정상적으로 기능하도록 요망되는 천연의 포유류 서열에 대한 표적 서열의 근사 상동성에 따라서 당해 분야의 숙련인에 의해 선택될 수 있다.
한 가지 바람직한 양태에서는, RNA 폴리뉴클레오티드 서열이 바람직하게는, 표적 서열과 10% 이상의 전체 상동성을 나타내고, 37℃의 디폴트 어닐링 온도를 이용한 MACVECTOR 프로그램을 사용하여, 표적 서열의 유사한 30개의 뉴클레오티드 영역과 50% 이상의 해당 창에서의 상동성을 나타내는 30개의 연속된 뉴클레오티드의 하나 이상의 세그먼트(창)을 함유한다. 또 다른 양태에서는, 이러한 RNA 폴리뉴클레오티드 서열이 바람직하게는, 표적 서열과 30% 이상의 전체 상동성을 나타내고, 표적 서열의 유사한 30개의 뉴클레오티드 영역과 50% 이상의 해당 창에서의 상동성을 나타내는 30개의 연속된 뉴클레오티드의 하나 이상의 창을 함유한다. 또 다른 양태에서는, 이러한 RNA 폴리뉴클레오티드 서열이 바람직하게는, 표적 서열과 50% 이상의 전체 상동성을 나타내고, 표적 서열의 유사한 30개의 뉴클레오티드 영역과 50% 이상의 해당 창에서의 상동성을 나타내는 30개의 연속된 뉴클레오티드의 하나 이상의 창을 함유한다. 또 다른 양태에서는, 이러한 RNA 폴리뉴클레오티드 서열이 바람직하게는, 표적 서열과 70% 이상의 전체 상동성을 나타내고, 표적 서열의 유사한 30개의 뉴클레오티드 영역과 50% 이상의 해당 창에서의 상동성을 나타내는 30개의 연속된 뉴클레오티드의 하나 이상의 창을 함유한다. 또 다른 양태에서는, 이러한 RNA 폴리뉴클레오티드 서열이 바람직하게는, 표적 서열과 90% 이상의 전체 상동성을 나타내고, 표적 서열의 유사한 30개의 뉴클레오티드 영역과 50% 이상의 해당 창에서의 상동성을 나타내는 30개의 연속된 뉴클레오티드의 하나 이상의 창을 함유한다.
또한, 또 다른 양태에서는, 상기 RNA 폴리뉴클레오티드 서열이 바람직하게는, 표적 서열과 10% 이상의 전체 상동성을 나타내고, 표적 서열의 유사한 30개의 뉴클레오티드 영역과 70% 이상의 해당 창에서의 상동성을 나타내는 30개의 연속된 뉴클레오티드의 하나 이상의 창을 함유한다. 또 다른 양태에서는, 상기 RNA 폴리뉴클레오티드 서열이 바람직하게는, 표적 서열과 10% 이상의 전체 상동성을 나타내고, 표적 서열의 유사한 30개의 뉴클레오티드 영역과 90% 이상의 해당 창에서의 상동성을 나타내는 30개의 연속된 뉴클레오티드의 하나 이상의 세그먼트(창)를 함유한다.
또 다른 양태에서는, 상기 RNA 폴리뉴클레오티드 서열이 바람직하게는, 표적 서열과 10% 이상의 전체 상동성을 나타내고, 표적 서열의 유사한 30개의 뉴클레오티드 영역과 50% 이상의 해당 창에서의 상동성을 나타내는 30개의 연속된 뉴클레오티드의 둘 이상의 창을 함유한다. 이러한 유형의 다른 양태가 당해 분야의 숙련인에 의해 개발될 수 있다.
제2의 바람직한 양태에서는, 상기 RNA 폴리뉴클레오티드 서열이 바람직하게는, 표적 서열과 10% 이상의 전체 상동성을 나타내고, 37℃의 디폴트 어닐링 온도를 이용한 MACVECTOR 프로그램을 사용하여, 표적 서열의 5개의 뉴클레오티드 영역과 해당 창에서의 절대적 상동성을 나타내는 5개의 연속된 뉴클레오티드의 하나 이상의 세그먼트(창)을 함유한다. 이러한 양태의 또 다른 변형에서는, 이러한 RNA 폴리뉴클레오티드 서열이 바람직하게는, 표적 서열과 30% 이상의 전체 상동성을 나타내고, 표적 서열의 5개의 뉴클레오티드 영역과 절대적 상동성을 나타내는 5개의 연속된 뉴클레오티드의 하나 이상의 창을 함유한다. 또 다른 양태에서는, 이러한 RNA 폴리뉴클레오티드 서열이 바람직하게는, 표적 서열과 50% 이상의 전체 상동성을 나타내고, 상기 언급된 5개의 뉴클레오티드의 절대적으로 상동성인 창을 함유한다. 이러한 양태의 기타 변형이 당해 분야의 숙련인에 의해 개발될 수 있다.
상기 유형에서 지칭된 창의 존재로 인해, 나머지 서열의 전체 상동성이 낮을 수 있지만, 낮은 전체 상동성은 아마도 다음에 기재된 치료학적 조성물의 투여량에 불리한 영향을 미치는 것으로 예상된다. RNA 폴리뉴클레오티드 서열 내의 상기 창의 수 증가는 나머지 서열의 전체 상동성을 저하시키지만, 투여량에는 영향을 미치지 않을 것으로 보인다.
필요한 상동성의 선택, 프로그램에 대한 디폴트 선택 및 상동성 계산에 이용된 프로그램의 선택은, 본 명세서의 교시와 과학 문헌에 발표된 지식이 주어지는 한은 당해 분야의 기술 내라는 것을 인지해야 한다.
상기 RNA 분자 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 바람직하게는, 정상적으로 기능하는 천연의 모든 필수 포유류 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적으로 비-상동성이기 때문에, 이러한 RNA 분자 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 방법에 사용될 때, 천연의 모든 필수 포유류 폴리뉴클레오티드 서열의 기능에 불리한 영향을 미치지 않는다. 이러한 천연의 기능성 포유류 폴리뉴클레오티드 서열에는 목적하는 단백질을 암호화하는 포유류 서열 뿐만 아니라 비-암호화 서열이지만, 건강한 포유류에서 필수 조절 서열을 제공해주는 포유류 서열이 포함된다. 필수적으로, 본 발명에 유용한 RNA 분자는 본 발명의 방법을 수행한 후에 기능이 방해받지 않도록 한 포유류 폴리뉴클레오티드 서열로부터의 서열과 충분히 별개여야만 한다. 상기 표적 서열과의 상동성을 결정하기 위해 기재된 바와 같이, 당해 분야의 숙련인은 상기 언급된 컴퓨터 알고리듬에 의거하여 당해 RNA 분자 폴리뉴클레오티드 서열과 정상적인 포유류 서열 간의 필수 상동성 결핍 부분을 규정할 수 있다. 따라서, 하나의 예시 양태에서는, RNA 폴리뉴클레오티드 서열과 분비된 정상 서열 간의 상동성은 상기 언급된 유형의 상동성 보다 낮다. 보다 바람직하게는, RNA 폴리뉴클레오티드와 정상 포유류 서열 간에는 거의 상동성을 나타내지 않는다. 필요한 상동성의 선택은 본 명세서의 교시와 과학 문헌에 발표된 지식이 주어지는 한은 당해 분야의 기술 내라는 것을 인지해야 한다.
최종적으로, 본 발명의 조성물의 RNA 분자의 또 다른 바람직한 특성은 기능성 단백질을 생성시키지 못하거나, 또는 해독되지 못한다는 것이다. 이러한 RNA 분자 또는 전달제는, 기능성 단백질을 임의로 발현하지 못하도록 하거나 해독과 관련된 세포성 인자와 임의로 상호작용하지 못하도록 공지된 각종 방법으로 공학적 조작될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 상기 제제에는, 이것이 합성된 RNA 분자든 생체내에서 RNA 분자가 되는 제제이든지 간에, 폴리-아데닐화 서열이 결핍되어 있다. 유사하게, 상기 제제에는 단백질 해독에 필요한 코작(Kozak) 영역이 결핍될 수 있다. 또 다른 양태에서는, RNA 분자에는 또한, 본래의 개시 메티오닌 코돈이 결핍될 수 있다. 또 다른 양태에서는, 당해 RNA 분자 폴리뉴클레오티드 서열에 캡 구조가 결핍되어 있다. 추가의 양태에서는, RNA 분자가 단백질 합성용 시그날을 전혀 지니고 있지 않다. 또 다른 양태에서는, RNA 분자가 암호화 서열을 함유하지 않거나 기능적으로 작동하지 않는 암호화 서열을 함유한다. 또 다른 양태에서는, RNA 서열이 인트론 서열로 단속될 수 있다. 추가의 양태에서는, 헤어핀 서열이 존재할 경우, 본래의 개시 코돈 앞에 위치시킬 수 있다. 또 다른 양태에서는, RNA 분자가 상기 언급된 바와 같이 RNA/DNA 하이브리드일 수 있다. 이러한 모든 양태는 공지된 교시, 예를 들면, 다음에 인용되는 바와 같은 문헌에 의거함으로써 고안될 수 있다.
다음은 본원에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 억제를 달성하기 위해 사용될 수 있는 각종 특정 양태이다. 다음에 기재된 각종 RNA(및 RNA/DNA 하이브리드) 구조물을 단독으로 사용하거나 또는, 예를 들면, 라리어트(lariat)(센스 또는 안티센스) 및/또는 상보적 환상 및/또는 선형 분자를 둘 이상 조합하여 사용할 수 있다는 것을 인식해야 한다. 안티센스 라리어트 또는 환상 구조물을 단독으로 사용할 수도 있다. 더우기, 이들 구조물은 자가 상보성 영역(예를 들면, 탠덤(tandem) 센스 및 안티센스 서열) 뿐만 아니라 목적하는 표적에 비해 부가의 안티센스 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서 전반에 걸쳐, 용어 "안티센스"는 어떠한 mRNA와도 상보적이고 이와 하이브리드화할 수 있는 것을 의미하는데 사용된다.
한 양태에서는, "라리어트" 형태의 폴리뉴클레오티드가 활용될 수 있다. 라리어트는 통상의 3'-5' 연결과는 반대로 2'-5' 포스포디에스테르 연결을 함유한다. 이러한 구조물은 스플라이세오솜 및 자가-절단성 리보자임에 의해 촉매된 스플라이싱 반응 중에 형성된다. 이들 구조물은 스플라이싱 반응의 중간체이거나 부산물이다. 이 구조물은 특정 세포에서의 발현(전사)을 통하여 생체내에서 제조되거나 또는 시험관내에서 제조될 수 있다. 리보즈 또는 데옥시리보즈의 자유 5' 포스포릴 그룹이 루프 백(loop back) 방식으로 리보즈의 2'-OH에 연결될 때 라리어트가 형성된다. 이러한 라리어트는 상기 루트 내에 10개 이상의 뉴클레오티드를 함유할 수있거나 또는 완전한 환일 수 있는데, 각 경우에 있어서 루프 백 연결은 2'-5'이다. 라리어트 연결성 말단 뉴클레오티드는 환-유사 구조를 생성시킨다. 루프 및/또는 줄기는 단일 분자 내에 종렬로 배치된 센스 및 안티센스 서열을 함유하거나, 또는 각각의 단일 라리어트는 센스 또는 안티센스 서열을 함유한다. 별개의 분자 내에 센스 및 안티센스를 함유하는 라리어트는 이본쇄 형태로서 함께 투여할 수 있거나, 또는 안티센스 라리어트는 단독으로 사용하여 세포 중의 mRNA와 함께 이본쇄를 형성할 수 있다. 라리어트는 RNA 또는 DNA 하이브리드일 수 있는데, 2'-5' 연결은 이러한 하이브리드의 RNA 부분의 2'-OH를 통해 이루어진다[참조: Rees C and Song Q.Nucl. Acid Res., 27,2672-2681(1999); Dame E et al.,Biochemistry, 38, 3157-3167, 1999; Clement J. Q. et al.,RNA, 5, 206-220, 1999; Block T and Hill J.J. Neurovirol., 3, 313-321, 1997; Schindewolf CA and Domdey H.,Nucl. Acid Res., 23,1133-1139 (1995)].
또 다른 양태에서는, 환상 RNA(또는 환상 RNA-DNA 하이브리드)가 말단의 2'-5' 또는 3'-5' 연결을 통하여 생성될 수 있다. 이들은, 양 말단을 시험관내에서 근접하게 만들어 주는 스플린터(splinter)를 사용하는 RNA 리가제 반응을 통하여 효소적으로 생성시키거나, 또는 자가 스플라이싱 리보자임을 사용함으로써(생체내 및 시험관내) 효소적으로 생성시킬 수 있다. 목적하는 억제는 자가 상보성을 지니거나 지니지 않는 단일 환을 포함한, 시험관내에서 제조되었거나 생체내에서 발현된 하나 이상의 RNA 환 뿐만 아니라 이본쇄 환상 RNA(표적 폴리뉴클레오티드에 비해 센스 쇄와 안티센스 쇄 모두), 또는 서로에 대한 상보성 영역을 갖는 일본쇄RNA 뿐만 아니라 표적에 대해 상보성을 지니는 일본쇄 RNA의 2개 환을 제공함으로서 달성할 수 있다.
또 다른 양태는 단일 RNA(또는 RNA-DNA 하이브리드) 안티센스 환(표적 mRNA에 대해 상보적인 자가 상보성을 지니고 있지 않는 환상 RNA)을 활용한다. 또 다른 양태는 RNA-DNA 환, 또는 표적 mRNA 분자에 대해 상보적인 환상 DNA 분자를 활용한다. 표적 메세지에 대한 상보성을 지닌 종렬의 센스 및 안티센스 서열(어떠한 순서로든 가능하다)을 갖는 단일 환을, 표적 서열의 기능을 억제시키는 조성물로서 사용할 수 있다. 로드형 절편을 형성할 수 있는 자가 상보적 서열 뿐만 아니라 표적에 대한 부가의 안티센스 서열을 갖는 환상 분자를 사용하는 것이 바람직할 수 있다[참조: Schindewolf CA and Domdey H.,Nucl. Acid Res., 23,1133-1139 (1995); Rees C and Song Q.Nucl. Acid Res., 27,2672-2681(1999); Block T and Hill J.J. Neurovirol., 3, 313-321, 1997].
추가의 양태에서는, 표적 서열을 억제시키는 조성물이 캡핑된(capped) 선형 RNA이다. dsRNA가 시험관내서 형성되든 생체내에서 형성되든지 간에, 양 쇄 중의 어느 하나 또는 둘 다를 캡핑할 수 있다. 세포질성 발현이 통상적으로 RNA 분자의 캡핑을 가져다 주지 않는 상황에서는, 백시니아 캡핑 효소 또는 알파바이러스 캡핑 효소와 같은 캡핑 효소의 사용을 포함한 각종 수단에 의해 캡핑을 수행할 수 있다. 캡핑된 안티센스 분자를 사용하여 표적 유전자의 목적하는 전사 후 사일런싱을 달성할 수 있다. 캡핑된 RNA는 시험관내 또는 생체내에서 제조할 수 있다. RNA polII에 의해 핵에서 제조된 RNA가 통상적으로 캡핑된다. 세포질에서 발현된 RNA는 캡핑될 수 있거나 될 수 없다. 캡핑은 세포질성 바이러스의 캡핑 효소를 발현함으로써 성취될 수 있다. 둘 다가 캡핑되거나, 하나가 캡핑되고 하나가 캡핑되지 않거나, 둘 다가 캡핑되지 않은 RNA 또는 RNA-DNA 하이브리드 서열이 이들 조성물에 사용될 수 있다. 캡핑되거나 캡핑되지 않은 안티센스 분자는 단독으로 사용되거나 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드 구조물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명에 따르는 RNA 분자는, 문헌[참조: Promega Protocols and Applications Guide, (3rd ed. 1996), eds. Doyle, ISBN No. 1-882274-57-1]에 의해 기재된 통상적인 방법에 따라서, 예를 들면, 박테리오파아지 T7, T3 또는 SP6 RNA 폴리머라제를 사용하는 통상적인 효소적 합성법에 의해 시험관내에서 제조된 RNA 분자 또는 부분적으로 이본쇄인 RNA 서열, 또는 RNA/DNA 하이브리드로서, 당해 조성물 중에서 포유류 세포 또는 이러한 포유류 세포에 존재하는 세포외 병원체에 전달될 수 있다.
또 다른 방법으로는, 이들 분자는 시험관내에서 화학적 합성법에 의해 제조될 수 있다[참조: Q. Xu et al.,Nucl. Acids Res., 24(18):3643-4(Sept. 1996); N. Naryshkin et al.,Bioorg. Khim., 22(9):691-8(Sept. 1996); J. A. Grasby et al.,Nucl. Acids Res., 21(19):4444-50(Sept. 1993); C. Chaix et al.,Nucl. Acids Res., 17(18):7381-93(1989); S.H. Chou et al.,Biochem., 28(6):2422-35(Mar. 1989); O. Odai et al.,Nucl. Acids Symp. Ser., 21:105-6(1989); N.A. Naryshkin et al.,Bioorg. Khim. 22(9):691-8(Sept. 1996); S. Sun et al.,RNA, 3(11):1352-1363(Nov. 1997); X. Zhang et al.,Nucl. Acids Res., 25(20):3980-3(Oct. 1997); S.M. Gravaznov et al.,Nucl. Acids Res., 26(18):4160-7(Sept. 1998); M. Kadokura et al.,Nucl. Acids Symp. Ser., 37:77-8(1997); A. Davison et al.,Biomed. Pept. Proteins Nucl. Acids, 2(1):1-6(1996); and A. V. Mudrakovskaia et al.,Bioorg. Khim., 17(6):819-22(Jun. 1991)].
또 다른 한편, 본 발명의 RNA 분자는 재조합 미생물, 예를 들면, 세균 및 효모, 또는 재조합 숙주 세포, 예를 들면, 포유류 세포에서 제조하고, 이의 배양물로부터, 통상적인 기술, 예를 들면, 해당 기술이 상세히 기재되어 있는 실험 매뉴얼을 예시하고 있는 문헌[참조: Sambrook et al, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 기술 및 미국 특허 제5,824,538호; 제5,877,159호 및 제65,643,771호(본원에 참조문헌으로 삽입됨)에 기재된 기술을 사용하여 분리시킬 수 있다.
시험관내에서 제조되거나 합성된 RNA 분자는 이를 시험관내에서 제조한 상태로 포유류 세포 또는 포유류에게 직접적으로 전달할 수 있다. 상기 참조문헌들은 본원에 제공된 교시가 주어지는 한, 다음의 특정 양태를 만들어 내는데 필요한 기술을 당해 분야의 숙련인에게 제공해준다. 따라서, 한 양태에서는, 당해 조성물의 "제제"가 완전히 이본쇄이거나 부분적으로 이본쇄인 RNA인 이중체(즉, 2개의 쇄로 구성)이다. 또 다른 양태에서는, 상기 제제가 일본쇄 RNA 센스 쇄이다. 또 다른 양태에서는, 상기 조성물의 제제가 일본쇄 RNA 안티 센스 쇄이다. 바람직하게는, 이러한 일본쇄 RNA 센스 또는 안티센스 쇄는 한쪽 말단 또는 양 말단에 헤어핀을형성한다. 바람직하게는, 상기 일본쇄 RNA 센스 또는 안티센스 쇄가 말단 간의 몇몇 중간 위치에서 헤어핀을 형성한다. 이러한 일본쇄 RNA 센스 또는 안티센스 쇄는 그 자체가 폴딩(fold back)되어 시험관내 또는 생체내에서 부분적으로 이본쇄가 되도록 고안할 수 있다. 당해 조성물에 사용된 유효제로서 현존 RNA 분자의 또 다른 양태는, 염기 쌍을 형성하지 않은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 임의로 격리된, 센스 폴리뉴클레오티드 서열과 안티센스 폴리뉴클레오티드 서열 모두를 포함하는 일본쇄 RNA 서열이다. 바람직하게는, 이러한 일본쇄 RNA 서열은, 이러한 서열이 세포 내에 존재할 때 또는 이의 합성 동안에 시험관내에서 이본쇄가 될 능력을 지니고 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 상기 언급된 바와 같은 RNA/DNA 하이브리드이다. 합성 RNA 분자의 또 다른 양태는 로드(rod) 구조를 임의로 형성하는 환상 RNA 분자이거나[참조: K-S. Wang et al.,Nature, 323:508-514(1986)], 또는 부분적으로 이본쇄이며, 문헌[참조: Wang et al.,Nucl. Acids Res., 22(12):2326-33(June 1994); Y. Matsumoto et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87(19):7628-32(Oct. 1990);Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(8):3117-21(Apr. 1994); M Tsagris et al.,Nucl. Acids Res., 19(7):1605-12(Apr. 1991); S. Braun et al.,Nucl. Acids Res., 24(21):4152-7(Nov. 1996); Z. Pasman et al., RNA, 2(6):603-10(Jun. 1996); P. G. Zaphiropoulos,Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93(13):6536-41(Jun. 1996); D. Beaudry et al.,Nucl. Acids Res., 23(15):3064-6(Aug. 1995): 모두 본원에 참조문헌으로 삽입됨]에 기재된 기술에 따라서 제조할 수 있다. 또 다른 제제는 별개의 쇄 상에 존재하거나 동일한 쇄 위에 산재된 RNA와 DNA로 구성된 이본쇄 분자이다.
또 다른 한편, 상기 RNA 분자는 생체내에서 형성될 수 있으므로, 이러한 제제를 포유류 세포 또는 포유류에게 전달한 후에 생체내에서 부분적으로 이본쇄인 RNA 분자를 생성시키는 "전달제"에 의해 전달될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물을 형성하는 제제는 한 양태에서는, 상기 언급된 RNA 분자 중의 하나를 "암호화"하는 이본쇄 DNA 분자이다. 이러한 DNA 제제는 세포 내에서 전사되어 이본쇄 RNA가 되는 뉴클레오티드 서열을 제공해준다. 또 다른 양태에서는, 상기 DNA 서열이, 세포 내에서 상기 언급된 일본쇄 RNA 센스 또는 안티센스 쇄로 전사되어 한쪽 말단 또는 양 말단에서 임의로 헤어핀을 형성하거나 그 자체가 폴딩되어 부분적으로 이본쇄가 되도록 하는 데옥시리보뉴클레오티드 서열을 제공해준다. 본 조성물의 전달제인 DNA 분자는 염기 쌍을 형성하지 않은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 임의로 격리된, 센스 폴리뉴클레오티드 서열과 안티센스 폴리뉴클레오티드 서열 모두를 포함하는 일본쇄 RNA 서열을 제공할 수 있으며, 이러한 일본쇄 RNA 서열은 이본쇄가 될 능력을 지니고 있다. 또 다른 한편, 전달제인 DNA 분자는 생체내에서 로드 구조 또는 부분적 이본쇄를 임의로 형성하는 상기 언급된 환상 RNA 분자의 전사를 제공해준다. 이러한 DNA 분자는 또한, 상기 언급된 바와 같은 RNA/DNA 하이브리드, 또는 하나의 RNA 쇄와 하나의 DNA 쇄를 함유하는 이중체의 생체내 생성을 제공할 수 있다. 이들 각종 DNA 분자는 상기 인용된 삼브룩(Sambrook) 문헌 또는 프로메가(Promega) 문헌에 기재된 것과 같은 통상적인 기술에 의거하여 고안할 수 있다.
포유류 세포에서 상기 언급된 RNA 분자를 형성시킬 수 있는 본 발명의 후자전달제는 DNA 일본쇄 또는 이본쇄 플라스미드 또는 벡터일 수 있다. 시험관내 또는 생체내에서 본원에 기재된 바와 같은 RNA를 생성하도록 고안된 발현 벡터는 미토콘드리아성 RNA 폴리머라제, RNA polI, RNA polII 및 RNA polIII을 포함한 RNA 폴리머라제의 제어 하의 서열을 함유할 수 있다. 이들 벡터를 사용하여, 목적하는 RNA 분자를 본 발명에 따르는 세포에서 전사시킬 수 있다. 벡터는 바람직하게는, 내인성 미토콘드리아성 RNA 폴리머라제(예를 들면, 해당 벡터가 상응하는 사람 미토콘드리아성 프로모터를 활용할 수 있는 경우에는, 사람 미토콘드리아성 RNA 폴리머라제)를 활용하도록 고안될 수 있다. 미토콘드리아성 폴리머라제를 사용하여 생체내에서 캡핑되거나(캡핑 효소의 발현을 통함) 캡핑되지 않은 메세지를 생성시킬 수 있다. RNA polI, RNA polII 및 RNA polIII 전사체를 생체내에서 생성시킬 수도 있다. 이러한 RNA를 캡핑시키거나 캡핑시키지 않을 수 있으며, 경우에 따라, 백시니아 캡핑 효소 또는 알파바이러스 캡핑 효소와 같은 캡핑 효소의 사용을 포함한 각종 수단에 의해 세포질성 캡핑을 수행할 수 있다. DNA 벡터는 동종 폴리머라제와 함께 미토콘드리아성, RNA polI, II 또는 polIII, 또는 바이러스성, 세균성 또는 박테리오파아지 프로모터들 중의 하나 또는 이들을 조합한 다중 프로모터를 함유하도록 고안된다. 바람직하게는, 상기 프로모터가 RNA polII인 경우, RNA 분자를 암호화하는 서열은 핵 내에서의 분해를 피하기 위해 약 300개의 뉴클레오티드 초과의 개방 판독 프레임을 가진다. 이러한 플라스미드 또는 벡터는 세균, 바이러스 또는 파아지로부터의 플라스미드 서열을 포함할 수 있다. 상기 벡터에는 염색체성, 에피솜성 및 바이러스-유래된 벡터, 예를 들면, 세균성 플라스미드, 박테리오파아지, 효모 에피솜, 효모 염색체성 요소 및 바이러스로부터 유래된 벡터; 이들의 조합물로부터 유래된 벡터, 예를 들면, 플라스미드와 박테리오파아지 유전적 요소로부터 유래된 벡터; 코스미드 및 파아지미드가 포함된다. 따라서, 한 가지 벡터 예는 일본쇄 또는 이본쇄 파아지 벡터이다. 또 다른 벡터 예는 일본쇄 또는 이본쇄 RNA 또는 DNA 바이러스성 벡터이다. 이러한 벡터는 DNA와 RNA를 세포 내로 도입시키는 것으로 널리 공지된 기술에 의해, 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 DNA로서 세포에 도입할 수 있다. 상기 벡터는 또한 파아지 및 바이러스성 벡터일 수 있고, 바람직하게는 감염 및 형질도입에 널리 공지된 기술에 의해 패키지되거나 캡시드화된 바이러스로서 세포 내로 도입된다. 바이러스성 벡터는 복제 적격성이거나 복제 결함성 일 수 있다. 후자의 경우에는, 바이러스성 증식이 일반적으로, 숙주 세포를 보충하는 경우에만 일어난다.
또 다른 양태에서는, 당해 전달제가 하나 이상의 단일 DNA 또는 RNA 플라스미드 또는 벡터를 포함한다. 한 예로서, 제1 DNA 플라스미드는 상기 언급된 바와 같은 일본쇄 RNA 센스 폴리뉴클레오티드 서열을 제공할 수 있고, 제2 DNA 플라스미드는 상기 언급된 바와 같은 일본쇄 RNA 안티센스 폴리뉴클레오티드 서열을 제공할 수 있는데, 이러한 센스 및 안티센스 RNA 서열은 염기쌍을 형성하고 이본쇄가 될 능력을 지니고 있다. 상기 플라스미드(들)는 기타 통상적인 플라스미드 서열, 예를 들면, 단백질의 재조합 발현을 위한 플라스미드와 벡터를 작제하는데 사용되는 것으로 널리 공지된 서열과 같은 세균성 서열을 포함할 수 있다. 그러나, 단백질 발현을 가능하게 해주는 서열, 예를 들면, 코작(Kozak) 영역 등이 이들 플라스미드작제물 내에 포함되지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 dsRNA를 생성하도록 고안된 벡터는 바람직하게는, 표적 서열에 상보적이고 동종인 상이한 수 많은 dsRNA를 포함한 둘 이상의 서열을 생성시키도록 고안될 수 있다. 이러한 접근법은 단일 벡터가, 다수의 상이한 dsRNA를 생성시킴으로써, 단일 전사 단위로부터의 단일 dsRNA 분자 보다는 오히려 독립적으로 작동되는 많은 dsRNA를 생성시킬 수 있다는 점에서 바람직하며, 이로써 최적 효능에 대해 자가 선별할 수 있다. 자가촉매작용 서열 뿐만 아니라 무작위 및/또는 예정된 스플라이스 부위를 생성하도록 절단시키기 위한 서열을 포함한 각종 수단을 이용하여 이를 달성할 수 있다.
포유류 세포에서 상기 언급된 목적하는 RNA 분자를 형성하는데 필요한 정보를 제공해주는 기타 전달제에는 본 발명에 요구되는 RNA 분자에 필요한 서열을 함유하도록 고안되는, 살아있거나, 약독화되거나 사멸되거나, 불활성화된 재조합 세균이 포함된다. 이러한 재조합 세균 세포, 진균 세포 등은 본원에 참조문헌으로 삽입된 미국 특허 제5,824,538호; 제5,877,159호; 및 제65,643,771호에 기재된 것과 같은 통상적인 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 이들 전달제를 제조하는데 유용한 미생물에는 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피뮤륨(Salmonella typhimurium), 및 각종의 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 스타필로코커스(Staphylococcus) 종을 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 상기 인용 문헌에 열거된 것들이 포함된다.
포유류 세포에서 상기 언급된 목적하는 RNA 분자를 형성하는데 필요한 정보를 제공해주는 기타 전달제에는 상기 논의된 본 발명에 요구되는 RNA 폴리뉴클레오티드 서열을 수반하는, 살아있거나, 약독화되거나 사멸되거나, 불활성화된 바이러스, 특히 재조합 바이러스가 포함된다. 이러한 바이러스는, 유전자를 유전자 요법 등을 위해 세포에 전달하기 위해 현재 사용되고 있는 재조합 바이러스와 유사하게 고안될 수 있지만, 바람직하게는 단백질 또는 단백질의 기능성 단편을 발현하는 능력을 지니고 있지 않다. 이들 중에서, 요구되는 RNA 분자를 생체내에서 포유류 세포에 제공하도록 조작될 수 있는 유용한 바이러스 또는 바이러스성 서열은 알파바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 바쿨로바이러스, 델타 바이러스, 천연두 바이러스, 간염 바이러스, 포진 바이러스, 파포바 바이러스(예: SV40), 폴리오바이러스, 슈도라비 바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 양성 및 음성 쇄 RNA 바이러스, 비로이드 및 비루소이드, 또는 이들의 부분이지만, 이에 제한되지는 않는다. 이들 각종의 바이러스성 전달제는 본 발명의 교시를 나타내는, 문헌[참조: M. Di Nocola et al.,Cancer Gene Ther., 5(6):350-6(1998)]에 기재된 것과 같은 통상적인 기술을 적용함으로써 고안할 수 있다.
포유류 세포에서 상기 언급된 목적하는 RNA 분자를 형성하는데 필요한 정보를 제공해주는 기타 전달제에는 상기 언급된 바와 같은 합성 RNA 분자 또는 DNA 전달 분자 또는 전달 재조합 바이러스로 시험관내에서 형질감염시키거나 감염시킨, 살아있거나, 약독화되거나 사멸되거나, 불활성화된 공여체 세포가 포함된다. 이어서, 이들 공여체 세포를 다음에 상세히 기재되는 바와 같이 포유류에게 투여하여,상기 억제 효과를 매개하는 포유류에서의 기전을 자극할 수 있다. 이들 공여체 세포는 바람직하게는, C127, 3T3, CHO, HeLa, 사람 신장 293, BHK 세포주 및 COS-7 세포 등의 포유류 세포이고, 이는 바람직하게는 포유류 수용자와 동일한 포유류 종 기원이다. 상기 공여체 세포는 문헌[참조: Emerich et al.,J. Neurosci., 16:5168-81(1996)]에 기재된 것과 유사한 기술을 사용하여 만들 수 있다. 훨씬 더 바람직한 공여체 세포는 치료받고자 하는 특정 포유류로부터 수거하여, 문헌[참조; D.B. Kohn et al.,Nature Med., 4(7):775-80(1998)]에 기재된 것과 같은, 입양(adoptive) 면역전달 기술과 유사한 생체외 조작에 의해 공여체 세포로 만들 수 있다. 공여체 세포는 또한, 경우에 따라 비-포유류 종 기원일 수 있다.
최종적으로, 본 발명의 조성물은 상기 언급된 하나 이상의 선택된 제제를 포함할 수도 있다. 당해 조성물은 상기 언급된 합성 RNA 분자, 상기 언급된 합성 DNA 전달 분자, 및 상기 언급된 기타 전달제, 예를 들면, 재조합 세균, 세포 및 바이러스 중의 어느 하나의 혼합물을 함유할 수 있다. 조성물 혼합물의 실체는 당해 분야의 숙련인에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
B. 본 발명의 약제학적(치료학적 또는 예방적) 조성물
약제학적 사용을 위한 본 발명의 조성물은 바람직하게는, 상기 언급된 합성 RNA 분자 또는 이러한 RNA 분자를 생체내 포유류 세포에게 제공해주는 제제를 약제학적으로 허용되는 담체 중에서, 약제학적 전달을 위한 임의의 부가 성분과 함께 함유한다. 당해 약제학적 조성물의 특정 제형은 RNA 분자를 전달하는 상기 제제의형태에 좌우된다.
적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물의 투여를 촉진시키지만, 생리학적으로는 불활성이고/이거나 무해하다. 담체는 당해 분야의 숙련인에 의해 선택될 수 있다. 이러한 담체에는 멸균 식염수, 인산염, 완충 식염수, 덱스트로즈, 멸균수, 글리세롤, 에탄올, 락토즈, 슈크로즈, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 물, 및 이들의 조합물이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 부가적으로, 담체 또는 희석제는 글리세롤 모노스테아레이트 또는 글리세롤 디스테아레이트와 같은 지연형 물질을 단독으로 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다. 또한, 서방출형 중합체 제형이 사용될 수 있다. 제형은 전달제의 형태 뿐만 아니라 투여 방식에도 적합해야 한다. 투여 방식에 따른 적당한 담체의 선택은 당해 분야의 숙련인에 의해 통상적으로 수행된다.
당해 조성물이 합성 RNA 분자를 함유하는 경우 또는 상기 제제가 또 다른 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, DNA 분자, 플라스미드, 바이러스성 벡터, 재조합 바이러스, 또는 상기 언급된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 상이한 폴리뉴클레오티드의 다중 복사체 등인 경우에는, 당해 조성물이 바람직하게는, 단지 담체와 함께 "나상(naked)" 폴리뉴클레오티드로서 제형화될 수 있다. 또 다른 한편, 당해 조성물은 바람직하게는, 임의의 폴리뉴클레오티드 촉진성 제제 또는 "보조-제제", 예를 들면, 국소 마취제, 펩티드, 지질(양이온성 지질, 리포솜 또는 지질성 입자 포함), 다가양이온(예: 폴리리신), 분지된 3차원 다가양이온(예: 덴드리머), 탄수화물, 양이온성 양친매체, 세제, 벤질암모늄 계면활성제, 또는 세포로의 폴리뉴클레오티드의 전달을 촉진시켜 주는 또 다른 화합물을 함유한다. 본 발명에 유용한 상기 촉진제 또는 보조-제제의 총괄적인 예가 미국 특허 제5,593,972호; 제5,703,055호; 제5,739,118호; 제5,837,533호; 및 국제 공개특허공보 WO 96/10038(1996. 4. 4.자 공개됨) 및 WO 94/16737(1994. 8. 8.자 공개됨)(이들 각각은 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다)에 기재되어 있다.
사용된 촉진제가 국소 마취제, 바람직하게는 부피바카인인 경우에는, 당해 폴리뉴클레오티드 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.1 내지 약 1.0중량%의 양이 바람직하다. 이는 또한, 보조-제제로서 벤질암모늄 계면활성제를 약 0.001 내지 0.03중량%의 양으로 투여하여 혼입하는 것을 교시하고 있는 국제 특허출원 PCT/US98/22841을 참조할 수 있다(이의 교시가 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다).
당해 조성물의 전달제가 폴리뉴클레오티드 조성물 이외의 것인 경우, 예를 들면, 상기 언급된 바와 같은 형질감염된 공여체 세포 또는 세균인 경우에는, 당해 조성물이 미국 특허 제5,824,538호; 제5,643,771호; 제5,877,159호(본원에 참조문헌으로 삽입됨)에 기재된 것과 같은 기타 부가의 제제를 함유할 수도 있다.
당해 조성물의 어떠한 것에도 존재할 수 있는 부가의 성분은 아주벤트(adjuvant), 방부제, 화학적 안정화제 또는 기타 항원성 단백질이다. 전형적으로, 안정화제, 아주벤트 및 방부제는 표적 사람 또는 동물에서의 효능에 가장 우수한 제형을 결정하도록 최적화시킨다. 방부제의 적합한 예에는 클로로부탄올, 칼륨 솔베이트, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린,글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀이 포함된다. 사용될 수 있는 적합한 안정화 성분에는, 예를 들면, 카사미노산, 슈크로즈, 젤라틴, 페놀 레드, N-Z 아민, 이인산일칼륨, 락토즈, 락트알부민 가수분해물 및 분유가 포함된다. 통상적인 아주벤트를 사용하여 백혈구를 유인하거나 면역 반응을 증진시킨다. 적합한 아주벤트에는 리비(Ribi) 광유 및 물, 수산화알루미늄, 암피겐(Amphigen), 아비리딘(Aviridine), L121/스쿠알렌, D-락티드-폴리락티드/글리코시드, 플루로닉 플리오이스(pluronic plyois), 뮤라밀 디펩티드, 사멸된 보르데텔라(Bordetella), 및 사포닌, 예를 들면, 쿠일(Quil A)가 포함된다.
또한, 형질감염제 및/또는 복제제 및/또는 염증제로서 기능할 수 있고 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 기타 제제에는 성장 인자, 사이토킨 및 림포킨, 예를 들면, 알파-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), 콜로니 자극 인자, 예를 들면, G-CSF, GM-CSF, 종양 괴사 인자(TNF), 상피 성장 인자(EGF), 및 인터루킨, 예를 들면, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 및 IL-12가 포함된다. 추가로, 섬유아세포 성장 인자, 표면 활성제, 예를 들면, 면역 자극성 복합체(ISCOMS), 프로인트 불완전 아주벤트, LPS 동족체(모노포스포릴 지질 A(MPL) 포함), 뮤라밀 펩티드, 퀴논 동족체 및 소포성 복합체, 예를 들면, 스쿠알렌과 스쿠알렌, 및 하이알루론산이 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수도 있다.
당해 약제학적 조성물은 또한, 이러한 조성물의 선택된 투여 방식에 적합한 기타 첨가제를 함유할 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 비경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장 투여, 질내 투여 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 통상적인 어떠한 투여 경로를 통해서도 투여하기에 적합한 첨가제를 함유할 수 있다. 이러한 경로 모두는 당해 조성물의 투여에 적합하고, 사용된 제제, 치료받는 환자 및 질환, 및 담당의에 의한 유사한 요인들에 따라서 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한, 비내 투여 또는 폐 투여용을 포함한, 산제, 액제 또는 현탁제 투여형 개발을 위해 기타 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 사용될 수 있는 동결건조된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다[참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol. 2, 19thedition (1995), e.g., Chapter 95 Aerosols; 및 국제 특허출원 PCT/US99/05547; 이의 교시가 본원에 참조문헌으로 삽입된다]. 이들 조성물의 투여 경로는 경우에 따라 조합하거나 조정할 수 있다.
몇몇 바람직한 양태에서는, 본 발명의 약제학적 조성물이, 예를 들면, 액제, 산제, 에어로졸, 정제, 캅셀제, 장피 정제 또는 캅셀제, 또는 좌제의 형태로 포유류 피검자에게 투여하도록 제조된다.
약제학적 조성물로서 사용될 경우의 본 발명의 조성물은 당해 조성물의 전달제(예를 들면, 합성 RNA 분자, 또는 DNA 분자, 플라스미드, 바이러스성 벡터, 재조합 바이러스 및 이들의 혼합물일 수 있는 전달제)로서 폴리뉴클레오티드 분자를 약 1ng 내지 약 20mg 포함할 수 있다. 몇몇 바람직한 양태에서는, 상기 조성물이 폴리뉴클레오티드 서열을 약 10ng 내지 약 10mg 함유한다. 기타 양태에서는, 상기 약제학적 조성물이 폴리뉴클레오티드 서열을 약 0.1 내지 약 500㎍ 함유한다. 몇몇 바람직한 양태에서는, 상기 조성물이 폴리뉴클레오티드 서열을 약 1 내지 약 350㎍ 함유한다. 기타 바람직한 양태에서는, 상기 약제학적 조성물이 폴리뉴클레오티드 서열을 약 25 내지 약 250㎍ 함유한다. 몇몇 바람직한 양태에서는, 백신 및 치료제가 폴리뉴클레오티드 서열을 약 100㎍ 함유한다.
전달제가 공여체 세포 또는 세균인 본 발명의 조성물은 약 1 내지 약 107세포/용량의 투여량으로 전달될 수 있다. 유사하게, 전달제가 살아있는 재조합 바이러스인 경우, 적합한 벡터-이용 조성물은 용량당 1 x 102pfu 내지 1 x 1012pfu를 함유한다.
본 발명의 교시가 주어지고, 본 발명의 조성물로 형질감염되거나 감염된 세포 보다 더 많은 세포로 증식시키는 본 발명의 방법 및 조성물의 억제 효과 능력이 관찰되는 한은, 적합한 투여량 조정이 상기 언급된 투여량 보다 하향에서 이루어질 수 있을 것이다. 따라서, 상기 투여량 범위는 단지 지침일 뿐이다. 일반적으로, 약제학적 조성물은, 표적 기능이 질병이나 이러한 질병의 원인이 되는 제제의 추가의 증식에 필요한 질병, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위하여, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 억제 또는 저하시키는데 유효한 양으로 투여된다. 이용된 투여 단위 중의 약제학적 조성물의 양은 본 발명의 조성물에 대한 시험관내 세포의 반응과 실험 동물의 반응을 기준으로 하여 실험적으로 결정한다. 최적의 투여량은 각각의 치료 양상과 조치에 대한 표준 방법으로 결정한다. 따라서, 이들 조성물의 투여 용량, 시간, 경로, 및 재투여 필요성은 치료받는 질환, 이의 중증도, 합병증, 및 포유류 피검자의 연령 및 신체적 상태, 기타 활성 화합물의 이용 여부 등과 같은 요인들을 고려하여 당해 분야의 숙련인에 의해 결정될 수 있다.
C. 본 발명의 치료학적 및 예방적 방법
본 발명의 방법은 상기에 상세히 기재된 조성물; 및 가능하게는 포유류 세포에 부분적으로 이본쇄인 RNA 분자를 제공할 수 있는, 당해 분야에서 현재 사용되고 있는 기타 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들면, 기능성이거나 기능성이지 않은 단백질을 암호화하지 않는 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 공지된 RNA 촉매적 서열, 예를 들면, 리보자임)을 이용할 수 있다. 그러나, 이들 방법의 효능은 단백질을 생성하지 않는 RNA 분자를 사용함으로써 증진되는 것으로 예상된다. 상기 방법은 포유류 또는 포유류 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열(들)의 기능을 저하 또는 억제시킨다. 상기 언급된 조성물, 약제학적 조성물, 투여량 및 투여 방식은 세포외 또는 세포내 병원체인 이종 병원성 유기체에 의한 감염을 포함하여, 포유류를 괴롭히는 각종 질병을 치료하는데 특히 바람직하다. 부가적으로, 본 발명의 조성물은 병원체에 의한 포유류의 감염을 예방하거나, 또는 잠복중인 병원체의 재활성화로 인해 야기되는 발병을 예방하는데 유용하다. 이들 조성물은 또한, 병원체에 의해 유도된 암을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 방법의 한 양태는 포유류에서 바이러스성 감염을 치료하는 방법이다. 이러한 치료에 특히 적합한 것은 DNA 바이러스 또는 중간 DNA 단계를 갖는 바이러스이다. 이러한 바이러스에는 레트로바이러스(Retrovirus),헤르페스바이러스(Herpesvirus), 헤파데노바이러스(Hepadenovirus), 폭스바이러스(Foxvirus), 파르보바이러스(Parvovirus), 파필로마바이러스(Papillomavirus) 및 파포바바이러스(Papovavirus) 종의 바이러스가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법으로 치료하는데 더욱 바람직한 바이러스의 몇몇 예에는 HIV, HBV, HSV, CMV, HPV, HTLV 및 EBV가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 방법에 사용된 제제는 감염된 포유류 세포에서 바이러스의 복제 및/또는 발병에 필요한 바이러스 폴리뉴클레오티드 서열인 표적 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 상동성인, 상기 언급된 바와 같은 적어도 부분적으로 이본쇄인 RNA 분자를 포유류의 세포에 제공해준다. 이러한 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 바이러스의 증식에 필요한 단백질에 대한 단백질-암호화 서열, 예를 들면, HIV gag, env 및 pol 유전자, HPV6 L1 및 E2 유전자, HPV11 L1 및 E2 유전자, HPV16 E6 및 E7 유전자, HPV18 E6 및 E7 유전자, HBV 표면 항원, HBV 코어 항원, HBV 역전사효소, HSV gD 유전자, HSV vp16 유전자, HSV gC, gH, gL 및 gB 유전자, HSV ICP0, ICP4 및 ICP6 유전자, 바리셀라 조스터(Varicella zoster) gB, gC 및 GH 유전자 및 BCR-abl 염색체성 서열, 및 세포에서 세포로의 감염 전이에 필요한 조절 기능을 제공해주는 비-암호화 바이러스성 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들면, HIV LTR, 및 기타 바이러스성 프로모터 서열, 예를 들면, HSV vp16 프로모터, HSV-ICP0 프로모터, HSV-ICP4, ICP6 및 gD 프로모터, HBV 표면 항원 프로모터, HBV 프레-게놈 프로모터이다. 상기 언급된 바와 같이, 당해 조성물은 폴리뉴클레오티드 흡수 인핸서 또는 촉진인자, 및 임의의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여한다.포유류에게 투여되는 양은 포유류의 세포에서 바이러스성 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효하다.
특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 일단 RNA 분자가 상기 바이러스에 의해 감염된 세포에 전달되거나 이에서 생성되면, 외인성 RNA 분자가 동종 바이러스성 서열을 저하 또는 억제(즉, 작동 중지)시키고, 그 자체가 억제되므로, 바이러스성 서열의 기능이 저하되거나 억제된다. 다음 실시예에서 입증된 바와 같이, 기능 억제 효과는 외인성 RNA 분자가 투여된 포유류 세포에서부터 외인성 RNA 분자가 직접적으로 제공되지 않았던 피검자 중의 기타 포유류 세포로 옮겨간다. 이러한 결과는 RNA 분해 수준에서 일어나는 것으로 현재 이론화되었다.
따라서, 상기 방법은, HIV gag와 같은, 바이러스 복제 및/또는 발병에 필수적인 바이러스 유전자 기능을 중지시키거나 억제하기 위하여, HIV와 같은 바이러스로 이미 감염된 포유류 피검자를 치료하는데 사용할 수 있다. 또 다른 한편, 상기 방법은 잠복 바이러스, 예를 들면, 바리셀라 조스터(Varicella Zoster) 바이러스로서 포유류에 존재하고 대상 포진으로서 공지된 질병의 원인이 되는 제제인 바이러스의 기능을 억제하는데 이용될 수 있다. 유사하게, 적어도 일부는 바이러스, 세균 또는 또 다른 병원체에 의해 야기되는 것으로 밝혀진 바 있는, 아테롬성 동맥경화증, 궤양, 만성 피로증후군 및 자가면역 질환, HSV-1 및 HSV-2의 재발, HPV 영속형 감염, 예를 들면, 생식기 우췌, 및 만성 HBV 감염 등의 질병은, 포유류 피검자에서 바이러스 복제 및/또는 발병에 필수적인 특정의 바이러스성 폴리뉴클레오티드 서열을 표적화함으로써 본 발명에 따라서 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 상기 언급된 조성물은 포유류에서 바이러스성 감염을 예방하기 위한 방법에 이용될 수 있다. 상기 언급된 방법, 즉 상기 언급된 조성물을 필수 표적 바이러스성 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 저하 또는 억제시키는데 유효한 양으로 포유류에게 투여하는 방법을, 포유류가 바이러스에 노출되기 이전에 적용할 경우, 외인성 RNA 분자가 포유류 내에 남아 있어, 그 자체가 나중에 포유류에 표시되는 동종의 바이러스성 서열을 억제하는 작용을 하는 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 백신용으로 바이러스성 폴리뉴클레오티드 서열을 억제 또는 저하시키는데 사용할 수 있다.
상기 본 발명의 "항-바이러스" 방법의 유사한 양태에는 포유류에서 바이러스에 의해 유도된 암을 치료 또는 예방하는 방법이 포함된다. 이러한 암에는 HPV E6/E7 바이러스-유도된 경부암, HTLV 유도된 암, 및 EBV 유도된 암, 예를 들면, 버키트 임파종(Burkitts lymphoma)이 포함된다. 이 방법은 표적 폴리뉴클레오티드가 종양 항원 또는 이의 기능성 단편, 또는 발현되지 않은 조절 서열을 암호화하는 서열이고 이러한 항원 또는 서열 기능이 포유류에게서 종양의 유지에 요구되는, 상기 언급된 바와 같은 조성물을 포유류에게 투여함으로써 달성된다. 이러한 서열에는 HPV 16 E6 및 E7 서열 및 HPV 18 E6 및 E7 서열이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 기타 서열이 당해 분야의 숙련인에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 상기 조성물은 포유류에서 항원의 기능을 저하하거나 억제시키는데 유효한 양으로 투여되고, 바람직하게는 상기 언급된 바와 같은 조성물 성분, 투여량 및 투여 경로를 이용한다. 상기 방법의 근원이 되는 분자 기전은 상기 언급된 바와 동일하다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 본 발명의 조성물이, 세포내 또는 세포외의 비-바이러스성 병원체에 의한 포유류의 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 이용할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포내 병원체"는, 이의 생식 또는 생활 주기의 적어도 일부분 동안은 숙주 세포 내에 존재하고 이 안에서 병원성 단백질을 생산하거나 생산하도록 야기된, 바이러스, 세균, 원생동물 또는 기타 병원성 유기체를 지칭한다. 이들이 세포내 병원체인 경우의 생활 주기 내의 특정 단계에 포함되는, 세포를 감염시키는 세포내 병원체에는 리스테리아(Listeria), 클라미디아(Chlamydia), 레이슈마니아(Leishmania), 브루셀라(Brucella), 미코박테리아(Mycobacteria), 시겔라(Shigella), 및 플라스모디아(Plasmodia), 예를 들면, 말라리아의 원인균인 피. 팔시파륨(P. falciparum)이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 세포외 병원체는 포유류 세포 외부에서 복제 및/또는 증식하는 병원체, 예를 들면, 고노로애(Gonorrhoeae) 및 보렐리아(Borrellia) 등이다. 이러한 양태에 따르면, 약제학적으로 허용되는 담체에서 상기 언급된 바와 같은 조성물을 특정 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 함께, 이미 감염되었거나 병원체에 노출되는 것으로 예상되는 포유류 피검자에게 투여함으로써, 병원체에 의한 상기 감염을 치료하거나 가능하게는 예방할 수 있다. 이러한 경우, 상기 조성물의 RNA 분자는, 감염된 포유류 또는 포유류 세포에서 병원체의 복제 및/또는 발명에 필요한 병원체의 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적으로 상동성인 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다. 앞서와 같이, 투여된 조성물의 양은 포유류에서 상기 병원성 서열의 기능을 저하 또는 억제시키는데 유효한 양이다. 투여량,시간, 경로 등은 상기 언급된 바와 같다.
당해 분야의 숙련인은 본 명세서가 주어지는 한, 바이러스 과 및 속, 또는 원핵성 및 진핵성 원생동물 병원체를 포함한 병원체 뿐만 아니라 다세포 기생충를 용이하게 선택할 수 있으며, 이에 대한 본 발명에 따르는 치료학적 또는 예방적 조성물을 제조할 수 있다[참조: 면역학 개론서와 미국 특허 제5,593,972호(본원에 참조문헌으로 삽입됨)에서의 상기 병원체의 목록표].
본 발명의 조성물 및 가능하게는 선행 기술의 단백질 암호화 분자를 본 발명의 또 다른 신규한 방법에 이용할 수도 있다. 이러한 조성물은 또한, 포유류의 특정한 비-병원성 질병 또는 장애, 예를 들면, 특정 암 또는 유전적 장애를 치료하는데 유용하다. 본 발명에 따르는 치료 또는 예방에 특히 민감한 질환은 이상한 포유류 폴리뉴클레오티드 서열(이의 기능은 해당 장애의 개시 또는 진행에 필요하지만, 포유류의 건강에 해롭거나 심각하게 불리한 영향을 미치지 않으면서 억제될 수 있다)이 존재하는 것을 특징으로 하는 질환이다. 달리 말하면, 상기 치료에 적합한 질병의 특징은, 포유류가 상기 유전자의 기능없이도 생존할 수 있거나 이러한 유전자의 기능이 실질적으로 저하된 경우에도 생존할 수 있다는 것이다. 이러한 경우, 이상하거나 비정상적인 폴리뉴클레오티드 서열의 기능은 치료에 의해 외적으로 대체될 수 있다. 또 다른 경우, 상기 질병은 포유류에서 비정상적인 폴리뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 존재 또는 기능에 의해 야기될 수 있는데, 이 경우 상기 포유류는 또한 상기 폴리뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 정상적인 복사체도 보유하고 있으며, 비정상적인 유전자와 정상적인 유전자의 차이는 뉴클레오티드 서열 차이이다. 이러한 경우, 본 발명의 방법에 의한 상기 비정상적인 폴리뉴클레오티드 서열의 기능 억제는 아마도, 외인성 처리없이 정상적인 폴리뉴클레오티드 서열이 기능하도록 해주는 것이다.
따라서, 한 양태에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 포유류에서 비정상적인 암 유발 폴리뉴클레오티드 서열 또는 유전자인, 포유류에서의 암 치료 또는 예방 방법은 본 발명의 조성물을 상기 포유류에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 조성물은 포유류에서 상기 비정상적인 서열의 기능을 저하 또는 억제하는데 유효한 양으로 투여한다. 상기 언급된 바와 같이, 상기 조성물은 특정 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있고, 상기 언급된 투여량, 투여방법 및 투여경로로 투여할 수 있다.
비정상적인 폴리뉴클레오티드 서열과 정상적인 폴리뉴클레오티드 서열이 존재하는 것을 특징으로 하는 포유류 암에는 만성 골수성 백혈병(CML) 및 급성 임파아구성 백혈병(ALL)이 포함되는데, 여기서는 비정상적인 서열이 2개의 정상적인 유전자의 융합물, 즉bcr-abl이다. 국제 공개특허공보 WO94/13793(1994. 6. 23.자 공개됨)에서의 이들 암의 기재내용과 이들 질병이 기재되어 있는 본원의 참조문헌을 참조할 수 있다. 이러한 암 또는 질병, 예를 들면, CML에서는, 발병된 포유류가 상기 폴리뉴클레오티드 서열 또는 유전자의 정상적인 복사체도 보유하고 있으며, 비정상적인 서열 또는 유전자와 정상적인 서열 또는 유전자의 차이는 뉴클레오티드 서열 차이이다. 예를 들면, CML의 경우, 비정상적인 서열은 bcr-abl 융합물인 반면, 정상적인 서열은 bcr 및 abl이다. 따라서, 상기 방법을 이용할 수 있는데, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 융합물에 걸쳐 있는 서열이다. 포유류에서의 상기 암의 치료 또는 예방 방법은 본 발명의 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는데, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드 서열은 해당 유전자의 정상적인 복사체도 보유하고 있는 포유류에서 비정상적인 암 유발 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열이고 비정상적인 유전자와 정상적인 유전자 간의 차이는 폴리뉴클레오티드 서열 차이이다. 상기 조성물은 상기 언급된 바와 같이, 약제학적으로 허용되는 담체 중에서 특정 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 함께, 포유류에서 비정상적인 서열의 기능을 저하 또는 억제시키기에 유효한 양으로 투여된다.
따라서, 본 발명은 바람직하지 못한 생성물 또는 기능을 발현하거나 매개하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적으로 상동성인 부분적 이본쇄 RNA 분자를 포유류의 세포에 전달시킬 수 있는 조성물을, 상기 포유류의 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 기능을 저하 또는 억제시키는데 유효한 양으로 사용함으로써, 건강한 포유류에서는 발견되지 않는 바람직하지 못한 폴리뉴클레오티드 생성물의 발현 또는 폴리뉴클레오티드 매개된 기능을 특징적으로 나타내는 상기 포유류에서의 질병 또는 장애를 치료하기 위한 상기 언급된 분자 기전을 유발시키는 방법을 포괄한다. 상기 RNA 분자가 필수 포유류 폴리뉴클레오티드 서열과 충분히 비-상동성이어서, 이것이 상기 필수 서열의 기능을 억제시키지 못한다면, 상기 방법은 많은 치료학적 및 예방적 용도를 지니는 것으로 명백히 알 수 있다. 당해 분야의 숙련인은 상기언급된 장애를 용이하게 선택할 수 있고, 본 발명의 조성물이 지시하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 용이하게 선택할 수도 있다.
D. 본 발명의 기타 방법
상기 언급된 조성물, 및 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 억제 또는 저하시키기 위해 상기 조성물을 사용하는 일반적인 방법을 각종 연구 및 시험관내 적용 분야에 응용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법은, RNA 분자 폴리뉴클레오티드 서열이 선택된 서열과 실질적으로 상동성이고 바람직하게는 해당 동물 내의 다른 폴리뉴클레오티드 서열과는 실질적으로 비-상동성인 본 발명의 조성물을 조직 배양물 중의 세포 또는 생체내 포유류 실험용 동물에게 투여함으로써, 이러한 세포주 또는 포유류 실험용 동물에서 상기 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 결정하기 위한 연구에 적용할 수 있다. 상기 표적 서열의 기능 억제로, 해당 동물의 생물학과 생리학에 대한 상기 서열의 영향을 연구할 수 있다.
유사하게, 본 발명의 방법은, 선택된 기능성 서열, 예를 들면, 효소 서열, 단백질 발현 서열, 또는 이의 발현에 필요한 조절 서열을 "사일런싱"함으로써, 선택된 경로에 결함이 있는, 포유류, 세균, 효모, 진균, 곤충 및 기타 기원의 세포주를 만드는데 적용하여 사용할 수 있다. 이와 같이 조작된 세포를 통상적인 검정 또는 약물 스크리닝 검정 등에 이용할 수 있다.
유사한 방법에서는, 선택된 유전자의 기능을 영구적으로 차단시키기에 충분한 투여량을 변화시킴으로써, "녹-아웃(knock-out)" 실험용 동물을 제조할 수 있다. 따라서, 상기 언급된 바와 같이 실험용 동물을 "녹 아웃"시키도록 선택된 서열과 충분히 상동성인 폴리뉴클레오티드 서열과 함께 RNA 분자를 전달하는데 있어서의 본 발명의 방법은 약제학적 및 유전적 연구에 유용한 "녹-아웃" 마우스와 기타 실험용 동물을 개발하는 보다 단순한 기술을 제공해준다.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 기타 연구 방법에는 연구용 제제로서 또는 목적하는 단백질의 미생물에 의한 생산을 위한 산업적 생산용 균주로서 사용하기 위하여, 미생물, 진핵 및 원핵 생물의 변이체를 제조하는 것이 포함된다. 기타 용도는 본원의 교시가 주어지는 한 당해 분야의 숙련인에게 명백할 것으로 예상된다.
다음 실시예는 본 조성물의 제조 방법, 및 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 저하 또는 억제하기 위해 본 발명의 조성물을 사용하는 방법을 예시하고 있다. 당해 조성물의 제제로서 시험관내 합성에 의해 제조된 이본쇄 RNA 분자 및 HIV gag 또는 HIV gD2의 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하는 이들 실시예는 단지 본 발명의 양태를 예시할 뿐이다. 당해 분야의 숙련인은 조성물의 각종 제제 및 표적 폴리뉴클레오티드 서열 실체에 대한 기타의 선택이 본 명세서에 교시된 바와 같이 용이하게 이루어질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이들 실시예는 단지 예시하고자 함이며, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.
실시예 1: 바이러스에 의해 감염된 세포에서의 HIV p24 기능 저하 또는 억제
HIV 감염 과정 동안, 바이러스성 게놈이 DNA 주형 내로 역전사되고, 이는 감염된 분할 세포의 숙주 염색체 내로 통합된다. 이와 같이 통합된 복사체가 현재, 보다 많은 HIV 입자가 제조되는 블루프린트이다. 본 발명에 따르면, HIV의 복제 및/또는 발병에 필수적인 폴리뉴클레오티드 서열의 기능이 저하 또는 억제되는 경우에는, 이러한 바이러스성 감염이 치료될 수 있다. 본 실시예는 본 발명에 따르는 방법의 한 양태의 이행을 예시하고 있다.
플라스미드 HIV gpt(AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog)를 사용하여, 결함있는 HIV 게놈인 HIVgpt의 통합된 복사체를 함유하는 안정하게 통합된 랩도근육종(RD) 또는 COS7 세포주를 생성시킨다. 이러한 HIVgpt 게놈은 엔벨로프(envelope) 유전자 대신 미코페놀산(MPA) 내성 유전자를 암호화함으로써 MPA에 대한 내성을 부여해준다. 이 세포주는 세포를 상기 플라스미드로 형질감염시킨 다음 MPA에서 세포를 선별하여 만든다. MPA에 대해 내성이 있는 세포를 클론적으로 증폭시킨다. 이어서, 배양되어 클론에 의해 증대된 세포로부터의 배지를 대상으로 하여, p24 ELISA 검정용 키트(Coulter Corporation)를 사용하여 p24(세포외적으로 분비되는 HIV gag 폴리펩티드)의 존재에 대해 검정한다. 모든 세포가 p24에 대해 양성이었다.
2개의 RD 세포주와 2개의 COS7 세포주를 사용하여, 본 발명에 따르는 방법의 한 양태, 즉 이들 세포에서 p24 합성을 제어하는 HIV p24 표적 폴리뉴클레오티드의 기능을 저하 또는 억제시키는 양태를 입증한다.
본 발명의 시약을 생성시키기 위해, HIV 균주 HXB2의 gag 유전자를 동일한배위로 지도화하고 캡, 폴리아데닐화 서열 및 본래의 개시 코돈이 결핍되어 있는 600bp 이본쇄 RNA(dsRNA), 600 폴리뉴클레오티드(nt) 센스 RNA 및 600nt 안티센스 RNA을 사용하여 세포를 형질감염시킨다. 이 RNA 분자는 한쪽 말단에 박테리오파아지 T7 폴리머라제 프로모터를 갖는 PCR 생성물의 전사를 통하여 생성된다(도 1A 및 1B 참조). 이러한 프라이머의 배위는 HIV(HXB2)의 완전한 게놈(Genbank 수탁 번호 K03455)의 지도로부터 유도되었다[참조: L. Ratner et al.,AIDS Res. Hum. Retroviruses, 3(1):57-69(1987)]. 정방향 gag 프라이머를 배위 901-924에 위치시키는데, 이 서열은 T7 정방향 gag 프라이머 내의 T7 프로모터 다음에 둔다. 역방향 gag 프라이머를 배위 1476-1500에 위치시키고, T7 역방향 gag 프라이머 내의 T7 프로모터 다음에 둔다.
제제가 일본쇄 센스 RNA인 본 발명의 조성물을 생성시키기 위해, T7 프로모터를 정방향 PCR 프라이머의 5' 말단에 위치시킨다. 5'에서 3'로 쓰여진(T7 프로모터의 상단 쇄가 밑줄쳐져 있다), ss 센스 RNA을 암호화하는 DNA 주형을 생성시키는데 사용된 PCR 프라이머는 다음의 T7 정방향 gag 프라이머(서열 1)와 역방향 gag 프라이머(서열 2)이다:
5'GTAATACGACTCACTATAGGGCGGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAG 3'(서열 1);
5'CTGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTC 3'(서열 2).
제제가 일본쇄 안티센스 RNA 분자인 조성물을 생성시키기 위해, T7 프로모터를 역방향 PCR 프라이머의 5' 말단에 위치시킨다. 이들 프라이머는 다음의 T7 역방향 gag 프라이머(서열 3)와 정방향 gag 프라이머(서열 4)이다:
5'GTAATACGACTCACTATAGGGCGCTGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTC 3'(서열 3);
5'GCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAG 3'(서열 4).
상기 언급된 양 유형의 PCR 생성물이, 제제가 이본쇄 RNA 분자인 조성물을 생성시키기 위한 T7 전사 반응에 포함된다. 또 다른 한편, 본 발명에 따르는 조성물의 제제는 전사후 센스 RNA와 안티센스 RNA를 함께 혼합함으로써 제조한다.
대조군으로서, 유사한 크기의 센스 RNA, 안티센스 RNA 및 dsRNA 분자를 단순포진 바이러스의 gD 유전자로부터 유도하고, 유형 2 게놈을 동일한 PCR 및 T7 전사 기술에 의해 생성시킨다. HSV gD에 대한 PCR 프라이머의 배위는 Genbank 수탁 번호 K01408인 HSV gD2 유전자의 지도로부터 유도시킨다. 정방향 gD 프라이머를 배위 313-336에 위치시키는데, 이 서열은 T7 정방향 gD 프라이머 내의 T7 프로모터 다음에 둔다. 역방향 gD 프라이머를 배위 849-872에 위치시키고, T7 역방향 gD 프라이머 내의 T7 프로모터 다음에 둔다. 이들 대조군 서열을 생성시키기 위해 사용된 프라이머 세트는 다음과 같다:
T7 정방향 gD 프라이머(서열 5):
5'GTAATACGACTCACTATAGGGCGGTCGCGGTGGGACTCCGCGTCGTC 3';
정방향 gD 프라이머(서열 6): 5'GTCGCGGTGGGACTCCGCGTCGTC 3';
T7 역방향 gD 프라이머(서열 7):
5'GTAATACGACTCACTATAGGGCGGTGATCTCCGTCCAGTCGTTTATC 3'; 및
역방향 gD 프라이머(서열 8): 5'GTGATCTCCGTCCAGTCGTTTATC 3'.
상기 본 발명의 RNA 분자 및 상기 언급된 대조군 서열을 다음과 같이 RD 및COS7 세포주로 검정한다: 6웰 플레이트 중의 5 내지 6 x 105세포/웰을 약 80 내지 90% 컨플루언스(confluence) 배양하고, 형질감염제로서 10㎕ 리포펙타민(Gibco-BRL)을 사용하여, 선택된 RNA 분자 또는 대조군 분자 2 내지 3㎍으로 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 1 내지 17시간 동안 항온배양한다. 또 다른 세포 배양물을, 공지된 형질감염제 없이 전달된 RNA 1 내지 500㎍의 용량으로 형질감염시킨 다음, 이 세포를 0.5분 내지 약 2일 동안 항온배양한다. 예를 들면, 세포의 한 그룹은 센스 gag RNA로 형질감염시키고, 또 다른 그룹은 안티센스 gag RNA로 형질감염시키며, 또 다른 그룹은 ds gag RNA로 형질감염시키고, 또 다른 그룹은 센스 gD RNA 대조군으로 형질감염시키며, 또 다른 그룹은 안티센스 gD RNA 대조군으로 형질감염시키고, 또 다른 그룹은 ds gD RNA 대조군으로 형질감염시킨다. 또한, 부가의 음성 대조군은 RNA 분자가 전혀 공급되지 않은 세포이다.
상기 세포를 37℃에서 배양하고 수 주간에 걸쳐 p24 합성에 대해 기록한다. p24 ELISA 검정용 키트(Coulter Corp.)를 사용하여 세포 배지 중에서 p24를 측정하고 또한 래빗트 폴리클로날 항-p24 혈청(Intracell Corp.)과 FITC-접합된 항-래빗트 IgG(Sigma)를 사용하여 p24에 대해 고정 세포를 면역염색함으로써, RNA를 투여한지 2일 후에 매주 3회씩 상기 세포를 검정한다.
본 발명에 따르면, 어떠한 gD RNA 분자도 p24 합성을 지연시키거나 억제시키는 능력을 나타내지 못하였다. 그러나, 본 발명에 따르면, ds gag RNA는 p24 합성을 억제시키거나 하향 조절한다. 상기 센스 및 안티센스 RNA 분자는, 이들 RNA가어느 정도로 이본쇄를 형성할 수 없는 한, p24 합성에 대해 (만일 있으면) 약간의 억제 효과만을 야기시키는 것으로 예상된다.
실시예 2: 하나의 세포 배양물로부터 또 다른 세포 배양물까지의 p24 합성 저하율 결정
하향 조절된 바 없는 세포에 하향 조절된 시그날을 전달할 수 있다는 것을 증명하기 위하여, 본 실시예는 당해 제제에 의해 형질감염되지 않은 배양물 중의 세포에 저하/억제 효과(즉, p24 합성의 억제 또는 저하)를 전달하는 것을 입증해준다.
A. COS7 세포와 RD 세포의 공동 배양
p24 합성의 저하를 입증해주는 실시예 1 배양물로부터의 세포를, 어떠한 RNA 분자와도 미리 항온배양한 적이 없는 세포의 대조군 세포와 함께 배양하는데, 이는 사실상 야생형 수준으로 합성되는 p24이다. 본 발명에 따라서, 미리 형질감염된 세포는 표적 폴리뉴클레오티드 기능 억제를 감염되지 않은 세포에 전이할 수 있으며, 상기 공동 배양물 중의 대조군 세포는 p24 합성 저하를 특징적으로 나타낸다.
대조군 세포를 배양물 중의 미리 형질감염된 세포와 구별하기 위하여, 첫 번째 프로토콜을 다음과 같이 수행한다: p24 합성 억제를 입증해주는 실시예 1의 COS 7 세포를 각종 세포 유형 비, 예를 들면, 6웰 플레이트 중의 총 6 내지 7 x 105세포에 대해 1/1000 내지 1/10(COS 7/RD) 범위의 비에서 야생형 수준으로 p24를 발현하는 감염되지 않은 RD 세포와 함께 배양한다. 실시예 1에 구체화된 조건 하에서 배양한지 2일 후에, 배양물 중의 RD 세포를 대상으로 하여 p24 합성에 대해 검사한다. 이 세포를 3주 동안 매주 3회씩 검사한다.
p24 합성을 두 가지 방법으로 검사한다. 첫 번째 방법에서는, 상기와 같이 공동 배양된 세포로부터의 배지를 대상으로 하여, p24 ELISA 검정(Coulter)을 이용하여 p24에 대해 검정한다. 두 번째 방법에서는, FITC에 접합된 항-래빗트 IgG와 p24에 대한 래빗트 폴리클로날 혈청(Intracell Corp.)을 사용하여, 세포를 p24에 대해 면역염색시킨다. COS 7 세포와 RD 세포는 형태에 의해 구별되기 때문에, RD 세포에서의 염색 상실은 COS 7 세포와 용이하게 구별될 수 있다. COS 7 세포는 T 항원을 발현하는 반면, RD 세포를 그렇치 않기 때문에, r-피코에리트린(PE)과 접합된 항-마우스 IgG와 SV40 T 항원에 대한 마우스 모노클로날 혈청(Pharmagen Corp.)을 사용하여, 상기 공동 배양된 세포를 T Ag에 대해 염색시킨다. COS 7 세포만이 이들 조건 하에서 염색된다. 세포 염색은 형광성 현미경 검사법 또는 유동 혈구계산에 의해 결정한다.
배양물 중의 RD 세포의 p24 기능 억제는, 공동 배양된 RD 세포 내에서의 FITC 염색 상실에 의해, RD 세포만을 함유하는 대조군 배양물과 비교함으로써 입증된다. FITC 또는 PE로 염색되지 않은 공동 배양물 중의 RD 세포는, p24 표적 폴리뉴클레오티드의 p24 합성 기능이 실시예 1의 RNA 분자(특히 ds RNA 분자)에 의해 저하되거나 억제되었다는 증거이다.
B. 형질감염된 RD 세포와 형질감염되지 않은 RD 세포와의 배양
두 번째 프로토콜에서는, p24 생산 저하를 나타내는 실시예 1의 형질감염된 RD 세포를, 통합된 하이그로마이신 내성 유전자를 함유하고 상이한 세포 비, 예를 들면, 6웰 플레이트 중의 총 세포수 6 내지 7 x 105에 대해 1/1000 내지 1/10(RD/대조군 RD) 범위의 비를 이용하여 정상 수준의 p24를 발현하도록 공학적 처리시킨 형질감염되지 않은 RD 세포와 함께 배양한다. 하이그로마이신 내성 RD 세포는 다음과 같이 제조한다: RD 세포(5 내지 6 x 105세포)를 6웰 플레이트에서 80 내지 90% 컨플루언스로 배양한 다음, 티미딘 키나제(TK) 프로모터의 제어 하에 하이그로마이신 내성 유전자를 함유하는 pCEP4(Invitrogen Corp.)의 Nru 1-Sal 1 단편 2.5㎍으로 형질감염시킨다. 형질감염은 형질감염제 리포펙타민(Gibco BRL)을 사용하여 수행한다. 형질감염시킨지 2일 후, 상기 세포를 400㎍/ml 하이그로마이신의 존재 하에서 항온배양한다. 내성 세포는 클론에 의해 증대된다. 클론에 의해 증대된 세포주 중의 하나 이상을 본 실험에서 대조군으로 사용한다.
실시예 1에 제시된 조건 하에서 공동 배양한지 1일 내지 수 주후에 복제된 공동 배양물을 400㎍/ml 하이그로마이신과 함께 항온배양한다. 이 농도의 하이그로마이신은 하이그로마이신 내성이 아닌 RD 세포를 사멸시켜, 단지 대조군 하이그로마이신 내성 RD 세포만이 남게된다. 나머지 내성 세포는 대조군 세포로부터 유도된 것이다. 예를 들면, 실시예 1의 ELISA 뿐만 아니라 상기 언급된 면역염색법을 사용하여, p24 수준을 대조군 세포로부터 직접적으로 측정한다.
본 발명에 따라서, p24 생성 억제는 적어도 대조군 세포의 서브세트에서 나타난다.
실시예 3: 본 발명의 방법에 의한 내인성 인터루킨-12 생성의 생체내 억제
A. 본 발명의 조성물로서의 RNA 분자의 고안
본 실험에서의 모든 RNA 분자는 길이가 600nt에 근접하고, 모든 RNA 분자는 IL-12의 p40 쇄를 생성할 수 없도록 고안된다. 이 분자는 캡도 없고 폴리-A 서열도 갖지 않으며; 본래의 개시 코돈이 존재하지 않고, 상기 RNA는 완전한 길이의 생성물을 암호화하지 않는다. 다음의 RNA 분자가 고안된다:
(1) IL-12 p40 쥐 메신저 RNA(mRNA)와 상동성인 일본쇄(ss) 센스 RNA 폴리뉴클레오티드 서열;
(2) IL-12 p40 쥐 mRNA에 상보적인 ss 안티센스 RNA 폴리뉴클레오티드 서열;
(3) 센스 및 안티센스 p40 IL-12 쥐 mRNA 폴리뉴클레오티드 서열 모두로 구성된 이본쇄(ds) RNA 분자;
(4) IL-12 p40 쥐 이종 RNA(hnRNA)과 상동성인 ss 센스 RNA 폴리뉴클레오티드 서열;
(5) IL-12 p40 쥐 hnRNA에 상보적인 ss 안티센스 RNA 폴리뉴클레오티드 서열;
(6) 센스 및 안티센스 IL-12 p40 쥐 hnRNA 폴리뉴클레오티드 서열 모두로 구성된 ds RNA 분자;
(7) IL-12 p40 프로모터의 상단 쇄와 상동성인 ss 쥐 RNA 폴리뉴클레오티드 서열;
(8) IL-12 p40 프로모터의 하단 쇄와 상동성인 ss 쥐 RNA 폴리뉴클레오티드 서열; 및
(9) IL-12 p40 프로모터의 상단 쇄 및 하단 쇄와 상동성인 쥐 RNA 폴리뉴클레오티드 서열로 구성된 ds RNA 분자.
음성 대조군으로서, 실시예 1에 기재된 HSV2 gD 유전자로부터 유도된 센스, 안티센스 및 ds RNA를 또한 사용한다. 또 다른 대조군 그룹은 RNA가 공급되지 않은 마우스로 구성된다.
실시예 1에 기재된 바와 같이, 상기 (1) 내지 (9)의 각종 RNA 분자는 한쪽 말단에 T7 프로모터를 갖는 PCR 생성물의 T7 RNA 폴리머라제 전사를 통하여 생성된다. 센스 RNA가 요망되는 경우에는, T7 프로모터를 정방향 PCR 프라이머의 5' 말단에 위치시킨다. 안티센스 RNA가 요망되는 경우에는, T7 프로모터를 역방향 PCR 프라이머의 5' 말단에 위치시킨다. dsRNA가 요망되는 경우에는, 양 유형의 PCR 생성물이 T7 전사 반응에 포함된다. 또 다른 한편, 전사 후에 센스 RNA와 안티센스 RNA를 함께 혼합한다.
본 실시예의 RNA 분자를 작제하는데 사용된 PCR 프라이머는 5'에서 3'이며, T7 프라이머의 상단 쇄가 밑줄 쳐져 있다.
정방향 IL-12 게놈(hnRNA)(서열 9): 5'TCAGCAAGCACTTGCCAAACTCCTG3' 및
역방향 IL-12 게놈(hnRNA)(서열 10): 5'GAGACAAGGTCTCTGGATGTTATTG 3';
T7 정방향 IL-12 게놈(hnRNA)(서열 11):
5'GTAATACGACTCACTATAGGGTCAGCAAGCACTTGCCAAACTCCTG 3' 및
T7 역방향 IL-12 게놈(hnRNA)(서열 12):
5'GTAATACGACTCACTATAGGGGAGACAAGGTCTCTGGATGTTATTG 3';
T7 정방향 IL-12 프로모터(서열 13):
5'GTAATACGACTCACTATAGGGCCTATAAGCATAAGAGACGCCCTC 3' 및
정방향 IL-12 프로모터(서열 14):
5'CCTATAAGCATAAGAGACGCCCTC 3';
역방향 IL-12 프로모터(서열 15):
5'GGCTGCTCCTGGTGCTTATATAC 3' 및
T7 역방향 IL-12 프로모터(서열 16):
5'GTAATACGACTCACTATAGGGGGCTGCTCCTGGTGCTTATATAC 3';
T7 정방향 IL-12 cDNA(mRNA)(서열 17):
5'GTAATACGACTCACTATAGGGTGTGTCCTCAGAAGCTAACCATC 3' 및
정방향 IL-12 cDNA(mRNA)(서열 18):
5'TGTGTCCTCAGAAGCTAACCATC 3';
역방향 IL-12 cDNA(mRNA)(서열 19):
5'GCAGGTGACATCCTCCTGGCAGGA 3' 및
T7 역방향 IL-12 cDNA(mRNA)(서열 20):
5'GTAATACGACTCACTATAGGGGCAGGTGACATCCTCCTGGCAGGA 3'.
게놈 및 PCR 프라이머 배위는 문헌[참조: Tone et al.,Eur. J. Immunol., 26:1222-1227(1996)]에 제공된 지도를 기준으로 한 것이다. 정방향 IL-12 게놈 프라이머는 배위 8301-8325에 위치시킨다. 역방향 IL-12 게놈 프라이머는 배위 8889-8913에 위치시킨다. 정방향 IL-12 프로모터 프라이머는 배위 83-106에 위치시킨다. 역방향 IL-12 프로모터 프라이머는 배위 659-682에 위치시킨다. cDNA PCR 프라이머에 대한 배위는 Genbank 수탁 번호 M86671을 기준으로 한 것이다. 정방향 IL-12 cDNA 프라이머는 배위 36-58에 위치시킨다. 역방향 IL-12 cDNA 프라이머는 배위 659-682에 위치시킨다.
B. 검정
Balb/c 마우스(그룹당 5마리 마우스)에게, 상기 언급된 쥐 IL-12 p40 쇄 특이적 RNA 또는 상기 동정된 대조군을 10 내지 500㎍의 용량으로 근육내 또는 복강내 주사한다. 3주 동안 4일마다 상기 마우스로부터 혈청을 수집하고, 이를 대상으로 하여, 퀀티키닌(Quantikine) M-IL-12 p40 ELISA 검정(Genzyme)을 사용하여 IL-12 p40 쇄 수준에 대해 검정한다.
본 발명에 따르면, IL-12 프로모터로부터 유도된 IL-12 mRNA, IL-12 hnRNA 및 ds RNA 모두로부터 유도된 ds RNA 분자가 공급된 마우스는 IL-12 생성 저하 또는 억제를 나타낸다. 상기 RNA 분자가 어느 정도의 이본쇄를 형성할 능력이 없는 한은, 일본쇄 IL-12 유도된 RNA 분자가 공급된 마우스의 혈청에서 (만일 있다면)약간의 억제 효과가 관찰된다. HSV gD 유도된 RNA 중의 어떠한 것도 특정 방식으로 생체내에서 IL-12를 저하 또는 억제시키지 못하는 것으로 예상된다.
실시예 4: 질병을 예방하는데 있어서의 본 발명의 방법
A. 시험관내 검정
20 내지 30% 컨플루언스로 시딩된 베로(Vero) 및/또는 BHK 세포를, 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 37℃ 하에 6웰 플레이트에서 배양한다. 세포가 80 내지 90% 컨플루언스를 나타내면, 이를 형질감염제로서 리포펙타민(Gibco-BRL)을 사용하여 실시예 1에 기재된 HIV gag- 및 HSV gD-특이적 RNA 분자 2 내지 3㎍으로 형질감염시킨다. 상기 RNA 분자를 또한, 공지된 어떠한 형질감염제의 부재 하에 5 내지 100㎍의 양으로 전달한다. 또 다른 세포 그룹에게는 RNA가 공급되지 않는다.
기타 베로 및/또는 BHK 세포 그룹을 유사하게, HCMV 프로모터와 SV40 폴리A 서열의 제어 하에 HSV2 gD 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 이본쇄 DNA 플라스미드인 플라스미드 24(이는 본원에 참조문헌으로 삽입된 미국 특허 제5,851,804호에 기재되어 있다) 2 내지 3㎍으로 형질감염시킨다.
이와 같이 형질감염된 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 37℃ 하에 배양한다. 형질감염시킨지 1, 2, 4 및 7일 후에, 세포를 250㎕ DMEM의 접종물에서 0.1의 감염 다중도(MOI)로 HSV2로 감염시킨다. 상기 접종물을 1시간 동안 흡착시킨 후, 웰당 DMEM(10% FBS) 2ml를 가한다. 형질감염된지 4일 및 7일 후에 감염된 세포의 경우에는, 상기 세포를 새로운 6웰 플레이트 내로 계대접종하여, 이들이 감염시에 컨플루언스 되도록 한다. 상기 세포를 계대접종하지 않을 경우, 이들은 과밀해진다.
감염시킨지 36 내지 48시간 후에, 세포 용해물을 대상으로 하여, 베로 세포에 대한 통상적인 플라그 검정에 의해 바이러스 역가를 검정한다[참조: Clinical Virology Manual, 2d edit., eds. S. Specter and G. Lancz, pp. 473-94(1992)]. 본 발명에 따르면, ds DNA 플라스미드 APL-400-024로 형질감염된 세포, 및 gD2 항원의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 ds RNA 분자로 형질감염된 세포는 HSV2에 의해 대량으로 감염될 수 없다. 기타 모든 세포는 HSV2에 의해 대량으로 감염되는 것으로 예상된다.
B. 생체내 검정
대조군으로서 HIV gag 특이적 RNA 분자와 HSV gD 단백질을 생성하는 능력을 지니고 있지 않은, 실시예 1에 기재된 HSV-gD 특이적 RNA 분자를 사용하여, 본 발명의 HSV gD 특이적 RNA 분자의 주입을 통하여 HSV 챌린지(challenge)로부터의 보호에 대해 마우스를 평가한다.
Balb/c 마우스(그룹당 5마리 마우스)를 10 내지 500㎍ RNA 범위 용량의 상기 기재된 RNA 분자로 근육내 또는 복강내 면역시킨다. RNA 주사한지 1, 2, 4 및 7일 후에, 질내 접종함으로써 마우스를 HSV-2(30㎕ 중의 105pfu)로 챌린지한다. HSV-2 접종한 후 매일 마우스를 대상으로 하여 감염 징후를 관찰하고, 이를 0 내지 4등급으로 나누었다. 0은 감염 징후가 전혀 없는 것이고, 1은 홍조를 나타내고, 2는 소포 및 홍조를 나타내며, 3은 소포, 홍조 및 요실금을 나타내고, 4는 마비를 나타낸다.
본 발명에 따르면, HSV gD 서열을 함유하는 본 발명의 dsRNA 분자가 공급된 마우스는 챌린지로부터 보호되는 것으로 밝혀졌다. HIV gag 대조군 RNA 분자가 공급된 마우스는 보호되지 않는다. HSV gD 서열을 함유하는 ss RNA 분자가 공급된 마우스는, 이들 분자가 생체내에서 적어도 부분적으로 이본쇄가 되는 능력을 지니고 있지 않는 한은, 거의 최소한도로 보호되는 것으로 예상된다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 dsRNA 분자는 HSV gD 단백질을 제조할 능력이 없기 때문에, 해당 동물에 대한 상기 RNA 분자의 전달에 의해 제공된 보호는 유전자 특이적인 비-면역 매개된 기전에서 비롯된 것이다.
상기 언급된 모든 공개 참조문헌이 본원에 참조문헌으로 삽입된다. 본 발명의 수 많은 변형 및 변이가 본 명세서에 포함되고, 이는 당해 분야의 숙련인에게 명백한 것으로 예상된다. 본 발명의 조성물 및 방법에 대한 이러한 변형 및 변화는 첨부된 청구의 범위 내에 포괄되는 것으로 여겨진다.

Claims (67)

  1. 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적으로 상동성이고 선택된 천연의 필수 포유류 폴리뉴클레오티드 서열과는 실질적으로 비-상동성인, 길이가 약 200개 이상의 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고 기능성 단백질을 생성하지 않는 적어도 부분적으로 이본쇄인 RNA 분자를 포유류 세포에 제공해 주는 제제를 포함하는, 포유류 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 억제하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, RNA 분자의 폴리뉴클레오티드 서열의 11개 이상의 연속된 뉴클레오티드가, 폴리뉴클레오티드 서열의 조성과 약 -9.2kcal/mol의 ㅿG에 따라서 이본쇄 서열로 존재하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, RNA 분자의 거의 전체 폴리뉴클레오티드 서열이 이본쇄인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, RNA 분자 폴리뉴클레오티드 서열이 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 정확한 상동성을 나타내는 적어도 약 12개 내지 약 16개의 연속된 뉴클레오티드의 서열을 갖고, 표적 서열에 대한 이러한 RNA 분자 폴리뉴클레오티드 서열의 총 상동성이 약 10%를 초과하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상동성이 약 50%를 초과하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 제제가 시험관내에서의 효소적 합성법 또는 화학적 합성법에 의해 제조된 RNA 분자인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 제제가 재조합 미생물 또는 이러한 미생물이 성장하는 배양 배지로부터 분리시킴으로써 시험관내에서 제조된 RNA 분자인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 제제가 포유류 세포로의 전달 후에 생체내에서 RNA 분자를 생성시키는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 제제가 이본쇄 RNA인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 제제가 일본쇄 RNA 센스 쇄인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 일본쇄 RNA 센스 쇄가 한쪽 또는 양쪽 말단, 또는 이들 말단 사이의 중간 지점에서 헤어핀을 형성하는 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 일본쇄 RNA 센스 쇄가, 그 자체가 폴딩(fold back)되어 부분적 이본쇄가 되는 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 제제가 일본쇄 RNA 안티센스 쇄인 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 일본쇄 RNA 안티센스 쇄가 한쪽 또는 양쪽 말단, 또는 이들 말단 사이의 중간 지점에서 헤어핀을 형성하는 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 일본쇄 RNA 안티센스 쇄가, 그 자체가 폴딩되어 부분적 이본쇄가 되는 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 제제가, 염기 쌍을 형성하지 않은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 임의로 격리된, 센스 폴리뉴클레오티드 서열과 안티센스 폴리뉴클레오티드 서열 모두를 포함하는 일본쇄 RNA 서열이며, 이러한 일본쇄 RNA 서열이 이본쇄가 될 능력을 지니고 있는 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 제제가 로드(rod) 구조를 형성하는 환상 RNA 분자인 조성물.
  18. 제8항에 있어서, 제제가 RNA 분자를 암호화하는 이본쇄 DNA 분자인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, DNA가 이본쇄 RNA를 암호화하는 조성물.
  20. 제18항에 있어서, DNA가 일본쇄 RNA 센스 쇄를 암호화하는 조성물.
  21. 제20항에 있어서, DNA가, 한쪽 또는 양쪽 말단, 또는 이들 말단 사이의 중간 지점에서 헤어핀을 형성하는 일본쇄 RNA 센스 쇄를 암호화하는 조성물.
  22. 제20항에 있어서, DNA가, 그 자체가 폴딩되어 부분적 이본쇄가 되는 일본쇄 RNA 센스 쇄를 암호화하는 조성물.
  23. 제18항에 있어서, DNA가 일본쇄 RNA 안티센스 쇄를 암호화하는 조성물.
  24. 제23항에 있어서, DNA가, 한쪽 또는 양쪽 말단, 또는 이들 말단 사이의 중간 지점에서 헤어핀을 형성하는 일본쇄 RNA 안티센스 쇄를 암호화하는 조성물.
  25. 제23항에 있어서, DNA가, 그 자체가 폴딩되어 부분적 이본쇄가 되는 일본쇄 RNA 안티센스 쇄를 암호화하는 조성물.
  26. 제18항에 있어서, DNA가, 염기 쌍을 형성하지 않은 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 임의로 격리된, 센스 폴리뉴클레오티드 서열과 안티센스 폴리뉴클레오티드 서열 모두를 포함하고 이본쇄가 될 능력을 지니고 있는 일본쇄 RNA 서열을 암호화하는 조성물.
  27. 제18항에 있어서, DNA가, 로드 구조를 형성하는 환상 RNA 분자를 암호화하는 조성물.
  28. 제1항에 있어서, 제제가 플라스미드인 조성물.
  29. 제1항에 있어서, 제제가, 일본쇄 RNA 센스 폴리뉴클레오티드 서열을 암호화하는 제1 DNA 플라스미드와 일본쇄 RNA 안티센스 폴리뉴클레오티드 서열을 암호화하는 제2 DNA 플라스미드를 포함하고, 이러한 센스 및 안티센스 RNA 서열이 염기 쌍을 형성하여 이본쇄가 되는 능력을 지니는 조성물.
  30. 제28항에 있어서, 플라스미드가 세균성 서열을 포함하는 조성물.
  31. 제1항에 있어서, 제제가 재조합 세균인 조성물.
  32. 제1항에 있어서, 제제가 재조합 바이러스인 조성물.
  33. 제1항에 있어서, 제제가 제2항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 기재된 분자로 시험관내에서 형질감염된 공여체 세포인 조성물.
  34. 제30항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, 제제가 살아있는 재조합 바이러스 또는 세균 또는 세포, 사멸된 바이러스 또는 세균 또는 세포, 또는 불활성화된 바이러스 또는 세균 또는 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  35. 제1항에 있어서, 제제에 폴리아데닐화 서열이 결핍되어 있는 조성물.
  36. 제1항에 있어서, RNA 분자가 해독되지 않는 조성물.
  37. 제1항에 있어서, 제제에 코작(Kozak) 영역이 결핍되어 있는 조성물.
  38. 제1항에 있어서, 제제에 개시 메티오닌 코돈이 결핍되어 있는 조성물.
  39. 제1항에 있어서, RNA 분자에 캡(cap) 구조가 결핍되어 있는 조성물.
  40. 제1항에 있어서, 제제에 단백질 합성용 시그날이 결핍되어 있는 조성물.
  41. 제1항에 있어서, 상이한 제제들의 혼합물을 포함하는 조성물.
  42. 제1항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열이, 감염된 포유류 세포에서 바이러스의 복제 및/또는 발병에 필요한 바이러스 폴리뉴클레오티드 서열인 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 바이러스가 DNA 바이러스, 및 중간 DNA 단계를 나타내는 바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 바이러스가 레트로바이러스(Retrovirus), 헤르페스바이러스(Herpesvirus), 헤파데노바이러스(Hepadenovirus), 폭스바이러스(Poxvirus), 파르보바이러스(Parvovirus), 파필로마바이러스(Papillomavirus) 및 파포바바이러스(Papovavirus)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 바이러스가 HIV, HBV, HSV, CMV, HPV, HTLV 및 EBV로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  46. 제1항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 종양 항원 또는 이의 기능성 단편, 또는 바이러스-유도된 암의 조절 서열이고, 이러한 항원 또는 서열이 포유류에서 종양의 유지에 요구되는 것인 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 암이 HPV E6/E7 바이러스-유도된 경부암, HTLV-유도된 암 및 EBV-유도된 암으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  48. 제1항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열이, 감염된 포유류 세포에서 병원체의 복제 및/또는 발병에 필요한 세포내 또는 세포외 병원체의 폴리뉴클레오티드 서열인 조성물.
  49. 제1항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열이, 당해 서열의 정상적인 복사체도 보유하고 있는 포유류에서 비정상적인 암-유발 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열이고, 비정상적인 서열과 정상적인 서열 간의 차이가 폴리뉴클레오티드 차이인 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 비정상적인 서열이 2개의 정상적인 유전자의 융합물인 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 상기 융합물 전체에 걸쳐 있는 폴리뉴클레오티드 서열인 조성물.
  52. 약제학적으로 허용되는 담체 중에, 제1항 내지 제51항 중의 어느 한 항의 조성물, 및 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제를 포함하는 약제학적 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 제2 제제가 국소 마취제, 펩티드, 지질(양이온성 지질, 리포솜 또는 지질성 입자 포함), 다가양이온, 분지된 3차원 다가양이온, 탄수화물, 양이온성 양친매체, 세제, 벤질암모늄 계면활성제, 또는 세포로의 폴리뉴클레오티드의 전달을 촉진시켜 주는 또 다른 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 제2 제제가 부피바카인인 조성물.
  55. 약제학적으로 허용되는 담체 중에서 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 함께 제1항에 따르는 조성물을, 포유류의 세포에서 바이러스성 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 포유류에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드가 감염된 포유류 세포에서 바이러스의 복제 및/또는 발병에 필요한 바이러스 폴리뉴클레오티드 서열인, 포유류에게서 바이러스성 감염을 치료하는 방법.
  56. 약제학적으로 허용되는 담체 중에서 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 함께 제1항에 따르는 조성물을, 바이러스가 포유류 세포 내로 후속적으로 도입되는 경우 바이러스성 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 포유류에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드가 감염된 포유류 세포에서 바이러스의 복제 및/또는 발병에 필요한 바이러스 폴리뉴클레오티드 서열인, 포유류에게서 바이러스성 감염을 예방하는 방법.
  57. 약제학적으로 허용되는 담체 중에서 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 함께 제1항에 따르는 조성물을, 포유류에서 항원의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 포유류에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드가 종양 항원, 조절 서열 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 서열이고 이러한 항원 또는 서열 기능이 포유류에게서 종양을 유지하는데 요구되는 것인, 포유류에게서 바이러스에 의해 유도된 암을 치료 또는 예방하는 방법.
  58. 약제학적으로 허용되는 담체 중에서 병원성 또는 포유류 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 함께 제1항에 따르는 조성물을, 포유류에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 포유류에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드가 감염된 포유류 또는 포유류 세포에서 병원체의 복제 및/또는 발병에 필요한 병원체의 폴리뉴클레오티드 서열인, 세포내 또는 세포외 병원체에 의한 포유류의 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
  59. 약제학적으로 허용되는 담체 중에서 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 함께 제1항에 따르는 조성물을, 포유류에서 비정상적인 암 유발 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 포유류에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드가 당해 서열의 정상적인 복사체도 보유하고 있는 포유류에서 비정상적인 암을 유발하는 서열의 폴리뉴클레오티드 서열이고 비정상적인 서열과 정상적인 서열 간의 차이가 폴리뉴클레오티드 차이인, 포유류에게서 암을 치료 또는 예방하는 방법.
  60. 포유류의 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 생성물의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양의 제1항에 따르는 조성물을, 건강한 포유류에게서는 발견되지 않는 폴리뉴클레오티드 생성물의 발현을 특징적으로 나타내는 질병 또는 장애가 있는 포유류에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드 서열이, 상기 폴리뉴클레오티드 생성물 또는 이러한 생성물의 발현에 필요한 조절 서열을 발현하는 폴리뉴클레오티드 서열인, 포유류에게서 질병 또는 장애를 치료하는 방법.
  61. 포유류에서 바이러스성 감염을 치료하기 위한 약제를 제조하는데 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 감염된 포유류 세포에서 바이러스의 복제 및/또는 발병에 필요한 바이러스 폴리뉴클레오티드 서열인, 약제학적으로 허용되는 담체 중에서, 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 함께 존재하는 제1항에 따르는 조성물의 용도.
  62. 제61항에 있어서, 조성물이, 포유류의 세포에서 바이러스성 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 존재하는 용도.
  63. 제61항에 있어서, 조성물이, 바이러스가 포유류 세포 내로 후속적으로 도입될 때 바이러스성 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 존재하는 용도.
  64. 포유류에서 바이러스에 의해 유도된 암을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하는데 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 종양 항원, 조절 서열 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 서열이고 이러한 항원 또는 서열 기능이 포유류에게서 종양을 유지하는데 요구되는 것인, 약제학적으로 허용되는 담체 중에서 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 함께, 포유류에서 상기 항원의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 존재하는 제1항에 따르는 조성물의 용도.
  65. 세포내 또는 세포외 병원체에 의한 포유류의 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하는데 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 감염된 포유류 또는 포유류 세포에서 병원체의 복제 및/또는 발병에 필요한 병원체의 폴리뉴클레오티드 서열인, 약제학적으로 허용되는 담체 중에서 병원성 또는 포유류 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 함께, 포유류에서 상기 서열의기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 존재하는 제1항에 따르는 조성물의 용도.
  66. 포유류에게서 암을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하는데 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드가 당해 서열의 정상적인 복사체도 보유하고 있는 포유류에서 비정상적인 암을 유발하는 서열의 폴리뉴클레오티드 서열이고 비정상적인 서열과 정상적인 서열 간의 차이가 폴리뉴클레오티드 차이인, 약제학적으로 허용되는 담체 중에서 세포에서의 폴리뉴클레오티드 흡수를 촉진시키는 임의의 제2 제제와 함께, 포유류에서 상기 비정상적인 서열의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 존재하는 제1항에 따르는 조성물의 용도.
  67. 건강한 포유류에게서는 발견되지 않는 폴리뉴클레오티드 생성물의 발현을 특징적으로 나타내는 포유류에서의 질병 또는 장애를 치료하기 위한 약제를 제조하는데 있어서, 표적 폴리뉴클레오티드 서열이 상기 폴리뉴클레오티드 생성물 또는 이러한 생성물의 발현에 필요한 조절 서열을 발현하는 폴리뉴클레오티드 서열인, 포유류의 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드 생성물의 기능을 저하시키거나 억제시키는데 유효한 양으로 존재하는 제1항에 따르는 조성물의 용도.
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