CH695778A5 - Hemmung der Transkription eines Zielgens in einer Zelle oder in Geweben. - Google Patents
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Description
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens in eukaryontischen Zellen oder Gewebe. Sie umfasst ausserdem eine Zelle, in der die Hemmung der Expression eines Zielgens spezifisch ist, und schliesslich betrifft sie ein Kit, das Reagenzien zur Hemmung der Transkription eines Zielgens in einer Zelle enthält.
[0002] Die spezifische Hemmung der Genexpression ist für die therapeutische Forschung von enormer Bedeutung.
Genauer gesagt könnte sie eingesetzt werden, um eine Technik zu entwickeln, mit der spezifisch die Funktion einzelner Gene gehemmt werden kann.
[0003] Insbesondere könnte sie verwendet werden, um die Progression spezifischer Krankheiten zu verhindern, etwa bei Krebserkrankungen, Infektionskrankheiten oder neurologischen Störungen, indem z.B. die Funktion spezifischer Gene gehemmt wird.
[0004] Ausserdem könnte sie eingesetzt werden, um die Unterschiede zwischen einem normalen und einem erkrankten Gewebe analysieren zu können.
[0005] Ferner wäre sie von Vorteil für die Untersuchung der Zellproliferation, für die Analyse der Genfunktion oder der funktionellen Veränderung der Genexpression.
Bestimmte Gene sind möglicherweise nur in bestimmten Entwicklungsstadien für die Lebensfähigkeit einer Zelle oder eines Organismus erforderlich.
[0006] Klassische genetische Techniken wurden eingesetzt, um Mutationen in Organismen mit einer verminderten Expression ausgewählter Gene zu charakterisieren.
Für solche Techniken sind aufwendige Absuchverfahren erforderlich, ausserdem sind sie auf Organismen beschränkt, bei denen sich die genetische Manipulation bereits etabliert hat.
[0007] Diese Schwierigkeiten lassen sich mit einem Verfahren umgehen, bei dem die Genexpression in Säugerzellen gehemmt wird, indem sie durch doppelsträngige (ds)-RNA gestört wird.
[0008] Die Technik beruht auf dem Einführen von ds-RNAs in Zellen, wo es zu einer Störung spezifischer messenger-RNA(mRNA)-MoleküIe kommt, wodurch die Genexpression gehemmt wird.
[0009] In der internationalen Patentanmeldung WO 99/32 619 wird ein Verfahren beschrieben, mit dem die Genexpression in einem wirbellosen Modellorganismus spezifisch gehemmt wird.
Dieses Verfahren beruht auf der Verwendung von ds-RNAs und deren Einführen in eine lebende Zelle, wodurch die Genexpression eines Zielgens in dieser Zelle gehemmt wird. Die ds-RNAs werden in die Zelle, d.h. intrazellulär, oder extrazellulär, d.h. in eine Körperhöhle, eingeführt.
[0010] In der internationalen Patentanmeldung WO 99/32 619 kann ein in ein Viruspartikel verpacktes virales Konstrukt verwendet werden, um ein Expressionskonstrukt in die Zelle einzuführen und die durch das Expressionskonstrukt codierte RNA wirksam zu transkribieren.
[0011] Konstrukte mit sowohl Sense- als auch Antisense-Sequenzen im gleichen viralen Vektor bewirkten keine erfolgreiche Hemmung der Genexpression, was höchstwahrscheinlich auf einer unzulänglichen Wechselwirkung mit der Ziel-mRNA zurückzuführen ist.
Es wurde postuliert, dass, wenn die Sense- und die Antisense-RNA durch ein einziges Konstrukt codiert werden, die Bildung des RNA-Doppelstrangs unmittelbar erfolgt und deshalb keine Wechselwirkung mit den mRNAs möglich ist.
[0012] Kürzlich wurde in einer wissenschaftlichen Veröffentlichung (F. Wianny und M. Zernicka-Goetz, "Specific interference with gene function by double stranded RNA in early mouse development", Nature Cell Biology, Bd. 2, Februar 2000, S. 70-75) beschrieben, dass synthetische ds-RNAs sowohl in Maus-Oocyten als auch Prä-implantations-Embryos mittels Mikroinjektion eingeführt wurden und eine spezifische Hemmung der Genexpression bewirkten.
[0013] Eine Hauptschwierigkeit besteht zurzeit darin, die ds-RNA effizient in die Zellen einzuführen.
Auf diesem Gebiet wurde noch keine genetische Technik entwickelt, mit der ds-RNAs direkt in Zellen eingeführt werden können.
[0014] Natürlich wäre es vorteilhaft, wenn ds-RNAs biologisch und nicht mechanisch in Zellen eingeführt werden könnten. Ein solches Einführen würde die Manipulationen reduzieren und verhindern, dass mechanische Zellschäden entstehen.
[0015] Ausserdem wäre die Fähigkeit, ein spezifisches Zielgen hemmen zu können, ohne andere Gene der Zelle zu beeinträchtigen, von grosser Wichtigkeit.
[0016] Schliesslich wäre es von wesentlichem Interesse, ein spezifisches Zielgen zu einem spezifischen Zeitpunkt und an einer definierten Stelle in einem Gewebe oder Organismus hemmen zu können,
ohne dass permanente Mutationen in das Zielgenom eingeführt werden müssen.
[0017] Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens in Zellen oder Gewebe bereit, umfassend die Infektion der Zellen oder des Gewebes mit (a) Viruspartikeln, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Sense-RNA-Strang darstellt, und (b) Viruspartikeln, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang darstellt, wobei der Sense- und der Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen enthalten, die zu einem Teil des Zielgens homolog sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ausserdem eine Zelle, in der zwei komplementäre RNA-Stränge die Expression eines Zielgens stören, sie betrifft ein Kit, das Reagenzien zur Hemmung der Transkription eines Zielgens in Zellen oder Gewebe umfasst, und schliesslich die Verwendung des beanspruchten Verfahrens für die Behandlung und Verhinderung einer Krankheit sowie ein Arzneimittel.
[0018] Der hier verwendete Begriff "ds-RNA" bedeutet doppelsträngige RNA.
[0019] Der hier verwendete Begriff "ss-RNA" bedeutet einzelsträngige RNA.
[0020] Der hier verwendete Begriff "Sense" bedeutet eine RNA-Sequenz, die dem Strang der mRNA entspricht.
[0021] Der hier verwendete Begriff "Antisense" bedeutet eine RNA-Sequenz, die zu dem Sense-Strang der mRNA komplementär ist.
[0022] Der hier verwendete Ausdruck "eine Sequenz, die spezifisch ist für" bedeutet,
dass die Sequenz des Sense- und des Antisense-RNA-Strangs mit dem Zielgen in mindestens 90%, vorzugsweise 95%, stärker bevorzugt 99% und am stärksten bevorzugt 100% der Basen identisch ist.
[0023] Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Hemmung der Expression eines Zielgens in Zellen oder Gewebe umfasst die Infektion der Zellen oder des Gewebes mit (a) Viruspartikeln, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Sense-RNA-Strang darstellt, und (b) Viruspartikeln, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang darstellt, wobei der Sense- und der Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen enthalten, die zu einem Teil des Zielgens homolog sind.
[0024] Die vorliegende Erfindung kann für eine selektive Hemmung spezifischer Genfunktionen eingesetzt werden, indem ds-RNAs in den Zellen biologisch erzeugt werden,
im Gegensatz dazu, dass ds-RNAs in die Zellen oder in das Gewebe mechanisch eingeführt werden. Insbesondere kann sie zur Behandlung oder Verhinderung spezifischer Krankheiten oder pathologischer Befunde eingesetzt werden, wobei eine spezifische Überexpression von Genen gehemmt wird, die für das Ausbrechen oder die Fortdauer der Krankheiten oder der pathologischen Befunde erforderlich ist.
[0025] Eine Behandlung würde eine Besserung beliebiger Symptome, die bei der Krankheit auftreten, oder klinischer Indikationen umfassen, die mit den pathologischen Befunden assoziiert sind.
[0026] Z.B. kann die vorliegende Erfindung zur Behandlung oder zur Vorbeugung bei Patienten eingesetzt werden, die an Tumoren leiden, indem eine spezifische Genfunktion gehemmt wird.
Tumoren umfassen Krebserkrankungen des Ovars, der Prostata, der Brust, des Colons, der Leber, des Magens, des Gehirns, von Kopf und Hals sowie der Lungen.
[0027] Eine weitere Verwendung der vorliegenden Erfindung könnte ein Verfahren darstellen, mit dem eine Genfunktion in einem Organismus durch eine spezifische Hemmung der Expression identifiziert wird.
[0028] Ausserdem kann die vorliegende Erfindung für die Analyse und Verhinderung des Mechanismus für Wachstum, Entwicklung, Stoffwechsel, Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Krankheit oder andere biologische Prozesse eingesetzt werden.
[0029] Der vorliegende Erfindung weist die folgenden Vorteile auf:
die Einfachheit einer biologischen Erzeugung von ds-RNAs in Zellen oder Gewebe, die hocheffiziente Amplifikation der eingeführten ss-RNAs, die Stabilität von ds-RNAs in Zellen und Gewebe und die Wirksamkeit der Hemmung sowie die biologische Sicherheit.
[0030] Der Begriff "Alphavirus" hat seine herkömmliche Bedeutung nach dem Stand der Technik und umfasst die verschiedenen Arten von Alphaviren, wie Eastern Equine Encephalitis-Virus (EEE), Venezuelan Equine Encephalitis-Virus (VEE), Everglades-Virus, Mucambo-Virus, Pixuna-Virus, Western Equine Encephalitis-Virus (WEE), Sindbis-Virus, South African Arbovirus Nr.
86, Semliki Forest-Virus, Middelburg-Virus, Chikungunya-Virus, O'nyong-nyong-Virus, Ross River-Virus, Barmah Forest-Virus, Getah-Virus, Sagiyama-Virus, Bebaru-Virus, Mayaro-Virus, Una-Virus, Aura-Virus, Whataroa-Virus, Babanki-Virus, Kyzylagach-Virus, Highlands J-Virus, Fort Morgan-Virus, Ndumu-Virus und Buggy Creek-Virus. Der Begriff "Alphavirus" umfasst auch Vektoren, die davon hergeleitet sind.
Bevorzugte Alphaviren umfassen z.B. das Semliki Forest-Virus (SFV) (Liljeström und Garoff, 1991, "A new generation of animal cell expression vectors based on the Semliki Forest virus replicon", Bio/Technology 9, 1356-1361), Sindbis-Virus (SIN) (Xiong et al., "Sindbis virus: An efficient broad host range vector for gene expression in animal cells", Science 243 (1989), 1188-1191) und Venezuelan Equine Encephalitis-Virus (VEE) (Davis et al., "In vitro synthesis of infectious venezuelan equine encephalitis virus RNA from a cDNA clone: Analysis of a viable deletion mutant", Virology 171 (1989), 189-204).
Das Alphavirus und davon hergeleitete Vektoren sind dem Fachmann bekannt und im Handel erhältlich.
[0031] In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die Zellen oder das Gewebe mit einer Menge von Viruspartikeln, die ss-RNA enthalten, infiziert, so dass mindestens eine Kopie pro Zelle übertragen werden kann. Wie hier beschrieben wird die Infektion mit einer Anzahl durchgeführt, die grösser oder gleich zehn Viruspartikeln pro Zelle entspricht.
[0032] Das Infektionsverfahren ist dem Fachmann bekannt. Die in vitro-lnfektion von Zell-Linien und primären Zellkulturen, wie z.B. Fibroblasten, Hepatocyten, Neuronen, erfolgt, indem SFV-Partikel direkt zu den Zellkulturen zugegeben werden.
Die Viruspartikel erkennen Rezeptoren auf der Zelloberfläche, durchdringen die Zellmembran entweder durch Fusion oder durch Endocytose (abhängig vom Zelltyp), wonach die RNA-Moleküle ins Cytoplasma freigesetzt werden ("The Alphaviruses: Gene Expression, Replication and Evolution", Strauss, J. H., und Strauss, E. G., Microbiological Reviews 58 (1994), 491-562).
[0033] Zellen oder Gewebe werden im vorstehenden Verfahren mit separaten Viruspartikeln infiziert, die komplementäre Stränge, Sense- und Antisense-RNA-Stränge exprimieren.
[0034] Wir hier beschrieben können Zellen oder Gewebe im vorliegenden Verfahren mit gleichen Mengen von Viruspartikeln, die den Sense-RNA-Strang enthalten, und von Viruspartikeln, die den Antisense-RNA-Strang enthalten, gemeinsam infiziert werden, wodurch die Bildung von ds-RNAs ermöglicht wird, die in der Lage sind, die Genexpression zu stören.
Durch höhere Dosen von ds-RNA kann möglicherweise eine stärkere Hemmung bewirkt werden.
[0035] In der vorliegenden Erfindung erhalten die Viruspartikel den ss-RNA-Strang, der Nucleotidesequenzen umfasst, die zu einem Teil des Zielgens homolog sind, und dieser ss-RNA-Strang wird in den Vektor des Alphavirus cloniert. Der ss-mRNA-Strang kann entweder in Sense- oder in Antisense-Orientierung in den Vektor cloniert werden. Die anderen Gene, die im Vektor vorliegen, sind die Nicht-Strukturgene des Alphavirus, insbesondere die Gene nsP-1-4 ("The Alphavirus: Gene Expression, Replication, and Evolution", Strauss, J. H., und Strauss, E. G., Microbiological Reviews 58 (1994), 491-562), die für die RNA-Replikation in Wirtszellen verantwortlich sind.
Die Expression von nsP-1-4 führt zur Bildung des Replicase-Komplexes, der eine intensive RNA-Replikation in Gang setzt, d.h. die Erzeugung grosser Mengen von Sense- und Antisense-RNA, die zu einer effizienten Bildung von ds-RNA in der Lage sind.
[0036] Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht allgemein die Hemmung vieler verschiedener Arten von Zielgenen in eukaryontischen Zellen oder Gewebe. Das Zielgen kann ein eukaryontisches Gen, ein Virusgen, ein Gen eines Krankheitserregers oder ein synthetisches Gen sein.
Natürlich kann das Zielgen ein aus der Zeile stammendes Gen, d.h. ein zelluläres Gen, ein Transgen, d.h. ein Genkonstrukt, das an einer ektopischen Stelle im Genom der Zelle eingefügt ist, oder ein Gen aus einem Krankheitserreger sein, der einen Organismus infizieren kann, aus dem die Zelle stammt.
[0037] Die Zielgene können ein beliebiges Gen von Interesse sein, wobei bereits eine grosse Zahl von Proteinen von Interesse identifiziert und isoliert wurde. Das Zielgen kann z.B. ein die Entwicklung betreffendes Gen, wie Cyclinkinase-Inhibitoren, Wachstums-/Differenzierungs-Faktoren und ihre Rezeptoren, Telomerase-Reverse-Transkriptase (TERT), ein Onkogen, ein Tumorsuppressor-Gen oder ein Enzym sein.
Ein von einem beliebigen Krankheitserreger stammendes Gen kann das Ziel der Hemmung sein.
[0038] Da die Hemmung der vorliegenden Erfindung sequenzspezifisch ist, umfassen die in die Zellen oder ins Gewebe eingeführten Sense- und Antisense-RNA-Stränge eine komplementäre Nucleotidsequenz eines Teils des Zielgens.
[0039] Zum Durchführen der vorliegenden Erfindung ist es nicht erforderlich, dass eine vollständige Homologie zwischen der RNA und dem Zielgen vorliegt. Wie hier beschrieben werden Sequenzvariationen toleriert, die z.B. auf genetischen Mutationen, Polymorphismen oder evolutionären Abweichungen beruhen.
Es wurde gefunden, dass RNA-Stränge für Hemmungen wirksam sind, die im Vergleich zum Zielgen Insertionen, Deletionen und einzelne Punktmutationen aufweisen.
[0040] Die Länge der homologen Nucleotidsequenz sollte mindestens 50 Basen, vorzugsweise 75, 100 oder 125 Basen ausmachen.
[0041] In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung äussert sich die Hemmung der Expression des Zielgens durch einen phänotypischen Verlust. Abhängig vom Zielgen und der intrazellulären Dosis der ds-RNA kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu einem teilweisen oder vollständigen Verlust der Funktion des Zielgens in den Zellen oder im Gewebe des Organismus führen.
[0042] Die Hemmung der Genexpression bezieht sich auf das Fehlen oder die Abnahme des Spiegels des Proteins und/oder der mRNA aus dem Zielgen.
Die Folgen der Hemmung auf Eigenschaften der Zelle oder des Organismus können durch Verfahren der Molekularbiologie getestet werden, wie z.B. RNA-Lösung-Hybridisierung, Northern-Hybridisierung (Sambrook et al., Molecular Cloning, Bd. 1, 7. 37 und 7.39) und biochemische Tests, wie z.B. Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay (ELISA), Western Blotting (Towbin et al., 1979;
Bunette, 1981, oder Sambrook et al., Molecular Cloning, Bd. 3, 18.60) oder Radioimmuntest (RIA) (Sambrook et al., Molecular Cloning, Bd. 3, 18.19-18-20).
[0043] Das Ausmass der Hemmung kann bestimmt werden, indem die Werte aus unbehandelten Zellen mit denen verglichen werden, die aus Zellen erhalten wurden, die gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt wurden.
[0044] Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine beliebige Zelle, die zwei komplementäre RNA-Stränge, einen Sense- und einen Antisense-RNA-Strang, enthält, die innerhalb der Zelle eine doppelsträngige RNA bilden, und die aufgrund der Homologie der Nucleotidsequenz mit einem Teil eines spezifischen Zielgens in der Lage sind,
die Expression des Zielgens zu stören.
[0045] Wie hier beschrieben können die eukaryontischen Zellen oder das Gewebe mit dem Zielgen einen beliebigen Zell- oder Gewebetyp darstellen, der mit einem Alphavirus infiziert werden kann. Sie können z.B. aus dem vaskulären oder extravaskulären Kreislauf, aus dem Blut- oder Lymphsystem, aus Muskeln, Leber, Gehirn oder aus der Zerebrospinalflüssigkeit stammen.
[0046] Die eukaryotischen Zellen oder das Gewebe können in einem beliebigen Organismus enthalten sein, einschliesslich z.B.
Fisch, Amphibien, Reptilien, Insekten oder Säuger, wie Rind, Schwein, Hamster, Maus, Ratte, Primat und Mensch.
[0047] Ausserdem beansprucht die vorliegende Erfindung ein Kit, das Reagenzien zur Hemmung der Expression eines Zielgens umfasst, wobei das Kit mindestens eine ausreichende Menge von einzelsträngigen viralen RNA-Partikeln enthält, die entweder den Sense- oder den Antisense-RNA-Strang darstellen, die zueinander komplementär sind und eine ds-RNA bilden, umfassend eine Nucleotidsequenz, die zu einem Teil des Zielgens homolog ist, und die in der Lage sind, die Expression des Zielgens zu stören.
[0048] Ein solches Kit kann Reagenzien umfassen, die erforderlich sind, um die RNA in vivo oder in vitro in die Testproben oder Individuen einzuführen.
[0049] Ein solches Kit kann auch Anweisungen enthalten,
anhand dessen ein Anwender des Kits die Erfindung durchführen kann.
[0050] Die Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird auch für die Behandlung oder Verhinderung einer Krankheit beansprucht.
[0051] Zur Behandlung einer Krankheit oder eines pathologischen Befunds kann ein Zielgen ausgewählt werden, das während der Entwicklung der Krankheit exprimiert wird oder das die Ursache des pathologischen Befunds ist.
[0052] Zur Verhinderung einer Krankheit oder eines pathologischen Befunds kann ein Zielgen ausgewählt werden, das für das Ausbrechen und/oder die Fortdauer der Krankheit oder des pathologischen Befunds erforderlich ist.
[0053] Die vorliegende Erfindung kann für die Behandlung oder Verhinderung von Krebs eingesetzt werden, einschliesslich solider Tumoren oder Leukämien, indem Tumoren mit den viralen Vektoren, die Sense- und Antisense-RNA enthalten,
gemeinsam infiziert werden, mit dem Ziel, ds-RNA für die Hemmung der mRNA-Translation eines Gens zu erzeugen, das für die Fortdauer des karzinogenen/tumorigenen Phänotyps erforderlich ist.
[0054] Die vorliegende Erfindung kann z.B. für die Behandlung oder Verhinderung von Infektionskrankheiten eingesetzt werden, die auf einen Krankheitserreger zurückzuführen sind.
Zellen oder Gewebe, die/das mit dem menschlichen Immundefizienzvirus (HIV) infiziert sind/ist oder die/das damit infiziert werden können/kann, können/kann gemäss der vorliegenden Erfindung als Ziel dienen, um die Expression eines spezifischen Gens zu hemmen, das für das Ausbrechen und/oder die Fortdauer der Infektion verantwortlich oder dafür erforderlich ist.
[0055] Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von (a) Viruspartikeln, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Sense-RNA-Strang darstellt, und (b) Viruspartikeln, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang darstellt, wobei der Sense- und der Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen umfassen, die zu einem Teil eines Zielgens homolog sind,
zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten.
[0056] Ausserdem betrifft die vorliegende Erfindung Viruspartikel, die (a) einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Sense-RNA-Strang darstellt, und Viruspartikel, die (b) einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang darstellt, wobei der Sense- und der Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen umfassen, die zu einem Teil eines Zielgens homolog sind, zur Verwendung als eine therapeutisch wirksame Substanz zur Behandlung oder Verhinderung einer Krankheit, insbesondere als Anti-Krebs-Substanz.
[0057] Schliesslich betrifft die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel, umfassend (a) Viruspartikel, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Sense-RNA-Strang darstellt, und (b) Viruspartikel,
die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang darstellt, wobei der Sense- und der Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen umfassen, die zu einem Teil eines Zielgens homolog sind, und gegebenenfalls pharmazeutisch verträgliche Excipienten, für die Hemmung der Expression des Zielgens in Zellen oder Gewebe.
[0058] Die vorliegende Erfindung lässt sich anhand der folgenden Beispiele besser verstehen, wobei diese lediglich der Erläuterung dienen und die Erfindung in keiner Weise einschränken sollen.
[0059] Die nachstehenden Beispiele werden zusammen mit den folgenden Figuren präsentiert.
Figuren
[0060] Fig. 1: Hemmung der Expression von Aldolase A mit Block-Stammpräparaten.
Abbildung A: Schematische Darstellung des menschlichen Aldolase-A-Gens und von Sonden, die für die Expressionsanalyse verwendet wurden.
A und B sind Fragmente, die als Sonde zum Testen von Northern-Blots eingesetzt wurden (Fig. 2). V und G sind Primerpaare, die entweder die durch die Virus-Stammpräparate dargestellte RNA oder andere selektiv chromosomale Transkripte amplifizieren.
Abbildung B: Nachweis von entweder viral codierter AldoIase-mRNA mit VA/VB (die ersten zwei Darstellungen von oben) oder von endogen codierter mRNA unter Verwendung von GA/GB (die unteren Darstellungen). Co sind nicht-infizierte Kontrollzellen, s ist mit dem Sense-Strang-Virus und as mit dem Antisense-Virus infiziert, und ds stellt ein 1:1-Gemisch aus beiden Virus-Stammpräparaten dar (Block-Stammpräparat).
[0061] Fig. 2: Analyse von Aldolase-RNA durch Northern-Blots
Obere Abbildung: Die Gesamt-RNA von infizierten Zellen (vgl.
Fig. 1) wurde durch Gelanalyse aufgetrennt, auf eine Membran überführt und entweder mit der markierten Sonde A, die die durch das Virus dargestellte Region abdeckt, oder mit der Sonde B getestet, die für chromosomale Kopien von Aldolase-A-RNA spezifisch ist. Für die Sonde A war eine Exposition von 1,5 Stunden und für die Sonde B eine Übernacht-Exposition auf Röntgenfilm erforderlich. Unten ist ein gescanntes Diagramm der Autoradiographie des Sonde-B-Blots dargestellt.
[0062] Fig. 3: Korrelation zwischen der Hemmung der Gen-Transkription und der Virustitration
Die Zellen wurden mit einer MOI (Infektions-Multiplizität) von 0,5 bis 50 mit s/as-Virus-Block-Stammpräparaten infiziert und 24 Stunden inkubiert. Die Gesamt-RNA wurde isoliert und in cDNA überführt.
Eine PCR wurde 25 Zyklen lang mit Primern durchgeführt, die entweder für Aldolase oder für GAPDH (Kontrolle) spezifisch waren. Die Amplicons wurden durch herkömmliche Agarose-Gelelektrophorese sichtbar gemacht. Die Ergebnisse mit zwei unabhängigen Virus-Block-Stammpräparaten sind dargestellt (1/3 und 4/5).
[0063] Fig. 4: Kinetiken der Hemmung durch as/s-Virus-Stammpräparate HEK-Zellen (menschliche embryonale Nierenzellen) wurden mit 1/3 Block-Stammpräparaten oder mit den einzelnen s- und as-Stammpräparaten infiziert.
Die Zellen wurden die angegebenen Zeiten inkubiert, worauf eine PCR-Analyse der Transkriptebenen folgte.
[0064] Fig. 5: Messung der Enzymaktivität von Aldolase A
Co bedeutet den Enzymwert in nicht-infizierten Zellen, und B stellt einen Puffer als negative Kontrolle dar, as-, s- und Block-Stammpräparate (ds) wurden zur 24-stündigen Infektion von Zellen bei einer MOI von 25 eingesetzt. Die Zellen wurden geerntet, lysiert und die Enzymaktivität unter Verwendung eines kommerziellen Tests anhand von 3 oder 5 Microl Lysat gemessen.
[0065] Fig. 6: Anhalten des Zellzyklus durch Abwärts-Regulation von Cyclin
Von links nach rechts: 1. Kontrolle Medium; 2. nicht-infizierte Zellen (maximale Proliferation); 3. Zellen, die mit einem Virus infiziert waren, das das grüne fluoreszierende Protein (GFP) exprimierte (Kontrolle der Infektion); 4. und 5.
Kontrolle des Tests mit den Antibiotika G418 und Zeocin; 6. ds-RNA der menschlichen Aldolase A (Kontrolle der Hemmung); 7. Cyclin A-Sense-SFV; 8. Cyclin A-Antisense SFV; 9. Cyclin A-Sense- und Antisense-SFV (ds); 10. Cyclin B-Sense-SFV; 11. Cyclin B-Antisense-SFV; 12. Cyclin B-Sense- und Antisense-SFV (ds); 13.
Cyclin A-Sense- und Cyclin B-Sense- und Antisense-SFV (ds).
[0066] Fig. 7: Mikroskopische Abbildung einer Kultur von Zellen, infiziert mit einem GFP-exprimierenden Virus, und einer Kultur von Cyclin A- und Cyclin B-Sense- und Antisense-SFV.
[0067] Die in den nachstehenden Beispielen erforderlichen Verfahren und Techniken sind aus der Literatur bekannt und werden z.B. in Sambrook et al., 1989, beschrieben.
[0068] In den nachstehenden Beispielen ist der verwendete SFV-Vektor eine nicht-cytopathogene Version mit zwei Punktmutationen im SFV-Nicht-Strukturgen nsP2 (Ser259Pro und Arg650Asp), beschrieben von Lundstrom, K., Schweitzer, C, Richards, J. G., Ehrengruber, M. U., Jenck, F., und Muelhardt, C, 1999, "Semliki Forest virus vectors for in vitro und in vivo applications", Gene Therapy and Molecular Biology 4 (1999), 23-31.
Dieser modifizierte SFV-Vektor bewirkt in den infizierten Wirtszellen keine Hemmung der endogenen Genexpression, so dass eine gezielte und spezifische Genhemmung durch die ds-RNA-Technologie möglich ist.
Beispiele
Beispiel 1
[0069] Hemmung der Expression von Aldolase A in BHK-Zellen (Baby Hamster Nierenzellen) (registrierte ATCC-Nummer: CCL-10) (Fig. 1)
Auf Grundlage des menschlichen Aldolase-A-Gens (M. Sakakibara, T. Mukai und K. Hori, "Nucleotide sequence of a cDNA clone for human aldolase: A messenger RNA in the liver", Biochem. Biophys. Res. Commun. 30 (1985), 413-420) wurden drei Paare von Oligonucleotid-Primern ausgewählt, um die erforderlichen Genregionen zu amplifizieren. VA (Nt. 210 bis 240, wie von M. Sakakibara, T. Mukai und K. Hori, "Nucleotide sequence of a cDNA clone for human aldolase: A messenger RNA in the liver", Biochem. Biophys. Res.
Commun. 30 (1985), 413-420, beschrieben) und VB (Nt. 740 bis 710, wie von M. Sakakibara, T. Mukai und K. Hori, "Nucleotide sequence of a cDNA clone for human aldolase: A messenger RNA in the liver", Biochem. Biophys. Res. Commun. 30 (1985), 413-420, beschrieben) amplifizieren eine Region von etwa 600 Nucleotiden, die für die Konstruktion der Sense- und Antisense-Virus-Stammpräparate verwendet wurde. GA (Nt. 170 bis 200, wie von M. Sakakibara, T. Mukai und K. Hori, "Nucleotide sequence of a cDNA clone for human aldolase: A messenger RNA in the liver", Biochem. Biophys. Res. Commun. 30 (1985), 413-420, beschrieben) und GB (Nt. 780 bis 750, wie von M. Sakakibara, T. Mukai und K. Hori, "Nucleotide sequence of a cDNA clone for human aldolase: A messenger RNA in the liver", Biochem. Biophys. Res.
Commun. 30 (1985), 413-420, beschrieben) amplifizieren eine chromosomale Region des Aldolase-Gens. Die Northern-Sonde A wird unter Verwendung der Primer VA und VB hergestellt, und die Sonde B wird mit einem Primerpaar der Stromaufwärts-Region amplifiziert (Nt. 951 bis 980 und Nt. 1330 bis 1301, wie von M. Sakakibara, T. Mukai und K. Hori, "Nucleotide sequence of a cDNA clone for human aldolase: A messenger RNA in the liver", Biochem. Biophys. Res. Commun. 30 (1985), 413-420, beschrieben). Die Zellen wurden infiziert und 24 Stunden gezüchtet. Die RNA wurde isoliert und gemäss herkömmlichen Verfahren in cDNA überführt. Alle PCR-Produkte wurden für die Sequenzierung in herkömmliche Clonierungsvektoren subcloniert. VA/VB wurde weiter in den SFV-Vektor cloniert, um infektiöse SFV-Partikel zu erzeugen.
Die viral codierte Aldolase-mRNA ist reichlich vorhanden und lässt sich nach 15 PCR-Zyklen in virusinfizierten Zellen nachweisen. In Zellen ohne Virus wird kein Signal erhalten. Unter Verwendung der genomischen Primer für Aldolase-mRNA wird eine Bande der erwarteten Grösse in den nicht-infizierten Zellen und in Zellen, die mit Sense- oder Antisense-produzierenden Viren infiziert waren, nachgewiesen.
Das Gemisch aus sowohl Sense- als auch Antisense-Viren ist ein wirksamer Inhibitor der Expression des chromosomalen Aldolase-Gens, während die Expression der viralen Gene unbeeinflusst bleibt.
Beispiel 2
[0070] Analyse von Aldolase-RNA durch Northern-Blots (Fig. 2)
Die Gesamt-RNA aus nicht-infizierten Zellen oder aus Zellen, die mit den angegebenen Virus-Stammpräparaten infiziert waren, wurde auf einem herkömmlichen Formamid-Gel aufgetrennt, nach der Elektrophorese auf eine Nitrocellulose-Membran überführt und anschliessend entweder mit dem radiomarkierten Fragment A oder B als Sonde getestet (vgl. Beispiel 1). Die Sonde A weist aufgrund der kurzen Expositionszeit von 45 Minuten fast ausschliesslich die aus dem Virus stammende Aldolase-RNA nach.
Die Sonde B weist nach 16 Stunden Exposition des hybridisierten Blots mit dem Film lediglich chromosomal codierte Aldolase-mRNA nach. Ein gefärbtes Gel mit ribosomaler RNA wurde verwendet, um das Auftragen zu kontrollieren (unter der Sonde B). Insbesondere aus dem gescannten Diagramm des Gels ist deutlich ersichtlich, dass die Spiegel der Aldolase-mRNA in den Zellen am niedrigsten sind, die mit beiden Viren infiziert sind.
Beispiel 3
[0071] Die Hemmung der Gen-Transkription ist von den Virustitern abhängig
Wie aus Fig. 3 ersichtlich ist, beginnen die Spiegel der Aldolase-mRNA im Vergleich zur Kontrolle bei einer MOI von 12,5 abzunehmen, und bei 50 kann unter Verwendung dieses empfindlichen Tests im Wesentlichen keine mRNA nachgewiesen werden.
Dagegen werden die Spiegel eines anderen chromosomalen Kontrollgens (GAPDH) mit steigender MOI nicht verändert.
Beispiel 4
Kinetiken einer Hemmung durch as/s-Virus-Stammpräparate
[0072] BHK-Zellen (registrierte ATCC-Nummer: CCL-10) wurden mit as- oder s- oder einem as/s-Gemisch von Aldolase-RNA-Virus-Stammpräparaten infiziert. Zu den in der Figur angegebenen Zeitpunkten wurde die RNA isoliert und in cDNA überführt. Nach der PCR wurden die Produkte durch Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert. Nach acht Stunden zeigt sich eine geringfügige Zerstörung der genomischen Aldolase-RNA, und die höchste Aktivität lässt sich nach 48 Stunden nachweisen. In diesem bestimmten Experiment beeinflusste auch das Sense-darstellende Virus die Stabilität der RNA.
Die GAPDH-RNA bleibt unverändert, ausser in den 48- und 72-Stunden-Proben, in denen eine Verringerung der RNA-Spiegel in den Zellen deutlich wird, die mit dem s/as-Virus-Gemisch infiziert waren. Dies hängt möglicherweise mit dem Absterben der Zellen zusammen, da es sich bei der Aldolase um ein essentielles Enzym handelt.
Beispiel 5
Verringerung der Aldolase-Enzymkaktivität durch s/as-Aldolase-Virusstammpräparate
[0073] BHK-Zellen (registrierte ATCC-Nummer: CCL-10) wurden mit den angegebenen Stammpräparaten infiziert und 24 Stunden unter herkömmlichen Bedingungen für die Zellkultur gezüchtet. Die Zellen wurden geerntet und in 1 x PBS, enthaltend 0,2% Triton X-100, lysiert. Nach zehnminütiger Zentrifugation bei 16 000 X g und bei 4 deg.
C wurde der Überstand gewonnen und entweder 3 Microl (graue Balken) oder 5 Microl (schwarze Balken) anhand eines kommerziellen Kits (SIGMA, Katalog-Nr. 752-A) und des gelieferten Protokolls getestet. Die deutlichste Verringerung der Enzymaktivität tritt wie erwartet in der Probe auf, die mit den beiden s- und as-Virus-Stammpräparaten infiziert war.
Beispiel 6
Das "Niederschlagen" ("knock down") von Cyclin führt zu einem Anhalten des Zellzyklus
[0074] Anhalten des Zellzyklus durch eine Abwärts-Regulation von Cyclin
Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293-Zellen) (registrierte ATCC-Nummer:
CRL-1573) wurden zum Zeitpunkt Null mit den angegebenen SFV-Viruspartikeln infiziert und die Proliferation nach 20 (hellgraue Balken) und 40 Stunden (dunkelgraue Balken) in Kultur unter Verwendung eines kommerziellen Farbtests getestet (Promega G5421 gemäss dem technischen Merkblatt TB245). Das Gemisch der Cyclin A- und B-blockierenden Viruspräparate war am effektivsten und sogar noch wirksamer als die Hemmung des Zellwachstums durch Antibiotika (Neomycin und Zeocin).
[0075] Die Sequenz von Cyclin A ist wie beschrieben ("Hepatitis B virus integration in a cyclin A gene in a hepatocellular carcinoma", Wang, Chevenisse X., Henglein, B., Brechot, C, Nature 343 (1990), 555-557), und die Sequenz von Cyclin B ist wie beschrieben (Kim, D. G., Choi, S. S., Kang, Y. S., Lee, K. H., Kim, U.-J., Shin, H.-S., eingereicht (6.
Mai 1997) bei den EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken, Hinterlegungsnummer AF002822, Life Science, Pohang University of Science and Technology, San 31, Pohang, Kyungbuk 790-784, Korea).
Beispiel 7
Züchten von Zellen, die mit Sense und Antisense in einem Vektor infiziert waren
[0076] Sense- und Antisense-Fragmente der Cyclin A- und B-Gene wurden in einen einzelnen SFV-Vektor cloniert, indem ein zweiter subgenomischer 26S-Promotor eingeführt wurde.
Die Konstrukte waren wie folgt:
SFV 26S - Sense-Cyclin A - SFV 26S - Antisense-Cyclin A und
SFV 26S - Sense-Cyclin B - SFV 26S - Antisense-Cyclin B.
[0077] Infektionen von HEK293-Zellen mit SFV-Cyclin A oder SFV-Cyclin B alleine oder mit beiden zusammen bewirkten keinerlei Anhalten der Zellproliferation.
[0078] Dies zeigte, dass Konstrukte mit sowohl Sense- als auch Antisense-Fragmenten im gleichen Vektor nicht in der Lage sind, die Expression chromosomaler Cyclin-Gene zu hemmen.
Claims (12)
1. Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens in eukaryontischen Zellen oder Gewebe, welche durch Alphaviren infiziert werden können, in vitro, umfassend die Infektion der Zellen oder des Gewebes mit (a) Viruspartikeln, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Sense-RNA-Strang darstellt, und (b) Viruspartikeln, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang darstellt, wobei der Sense- und der Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen enthalten, die zu einem Teil des Zielgens homolog sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Viruspartikel Alphaviren sind.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, wobei für die Infektion der Viruspartikel, die ss-RNA enthalten, die einen Sense-RNA-Strang darstellt, in gleichen Mengen vorliegen wie diejenigen, die ss-RNA enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang darstellt.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei einzelsträngige RNA entweder in Sense- oder Antisense-Orientierung in den Vektor des Viruspartikels cloniert werden.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei das Zielgen ein eukaryontisches Gen, ein virales Gen oder ein synthetisches Gen ist.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, wobei das Zielgen ein die Entwicklung betreffendes Gen, ein Onkogen, ein Tumorsuppressor-Gen oder ein ein Enzym codierendes Gen ist.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei die homologe Nucleotidsequenz für das Zielgen spezifisch ist und eine Länge von mindestens 50 Basen aufweist.
8. Kit, das Reagenzien zur Hemmung der Expression eines Zielgens in eukaryontischen Zellen oder Gewebe umfasst, welche durch Alphaviren infiziert werden können, wobei das Kit mindestens eine ausreichende Menge von Viruspartikeln mit einzelsträngiger RNA (ss-RNA) enthält, die entweder einen Sense- oder einen Antisense-RNA-Strang darstellt, die komplementär sind und innerhalb der Zellen oder des Gewebes eine ds-RNA bilden, umfassend eine Nucleotidsequenz, die zu einem Teil des Zielgens homolog ist, und die in der Lage ist, die Expression des Zielgens zu stören.
9. Arzneimittel, umfassend (a) Viruspartikel, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Sense-RNA-Strang darstellt, und (b) Viruspartikel, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang darstellt, wobei der Sense- und der Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen enthalten, die zu einem Teil eines Zielgens homolog sind, und gegebenenfalls pharmazeutisch verträglich Excipienten.
10. Arzneimittel nach Anspruch 9 zur Behandlung oder Verhinderung von Krebs, vorzugsweise von soliden Tumoren oder Leukämien.
11. Viruspartikel, die (a) einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Sense-RNA-Strang darstellt, und Viruspartikel, die (b) einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang darstellt, wobei der Sense- und der Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen umfassen, die zu einem Teil eines Zielgens homolog sind, zur Verwendung als therapeutisch wirksame Substanz zur Behandlung oder Verhinderung einer Krankheit.
12. Viruspartikel nach Anspruch 11 zur Verwendung als therapeutisch wirksame Substanz, insbesondere als Anti-Krebs-Substanz.
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