KR102614189B1 - Cd3xcd20 이특이적 항체를 이용한 종양의 치료 방법 - Google Patents

Cd3xcd20 이특이적 항체를 이용한 종양의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 환자에게 CD3 x CD20 이중특이적 항체를 투여하는 방법(투여 용법)에 관계하며, 이는 (a) 제 1 용량의 전술한 항체를 특이적 용량으로 투여하고; 그리고 연속하여 (b) 일정 기간 후 제 2 용량의 전술한 항체를 투여하고, 이때 전술한 제 2 용량은 전술한 제 1 용량을 초과한다. 본 발명의 상기 방법 (및 유사하게 본 발명의 투여 용법)은 인간 환자에서 B 세포 (CD20-양성) 암을 치료하는데 또한 적합하며, 또는 인간 환자에게서 CD3 x CD20 이중특이적 항체의 주기적 또는 지속적인 투여에 의해 중재되는 의학적 상태를 개선 및/또는 예방하는데 적합하다. 본 발명은 또한 전술한 청구항중 임의의 한 항에서 정의된 바와 같은 방법 또는 치료 용법에 이용되는 약학 조제물의 제조를 위한 CD3 x CD20 이중특이적 항체의 용도에 관계한다. 상기 제 1 용량, 상기 제 2 용량, 및 임의의 후속 용량을 포함하는 약학적 포장 또는 키트 또한 본 발명의 일부다.

Description

CD3XCD20 이중특이적 항체를 이용한 종양을 치료하는 방법{METHODS FOR TUMOR TREATMENT USING CD3XCD20 BISPECIFIC ANTIBODY}
관련 출원들에 대한 교차-참조
본 출원은 2014년 11월 17일자로 제출된 미국 가특허 출원 번호 62/080,716, 2015년 5월 13일자로 제출된 미국 가특허 출원 62/160,788에 대해 우선권을 주장하며, 이들 두 출원의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
서열 목록
본 출원은 2014년 6월 3일자 생성된 화일명 10162WO01_ST25.txt (83,392 바이트)의 컴퓨터 판독형태로 제출된 서열 목록을 참고자료로 편입한다.
발명의 분야
본 발명은 CD20 및 CD3 항원들을 표적으로 하는 이중특이적 항체들, 그리고 종양 사멸 방법들에 관계한다. 본 발명은 종양 치료를 위한 항체 요법들과 연합된 Fc 결합으로 기인될 수 있는 이펙터(effector) 기능들을 감소시키거나 및/또는 제어하는 방법들에 또한 관계한다.
배경기술
CD20-결합 아암(arm)과 CD3-결합 아암을 갖는 이중특이적 항체는 항종양 활성을 증가시키는데 필요한 크로스토크(crosstalk)를 제공할 수 있다. 이러한 이중특이적 항체에서 제3의 양상(modality)은 Fc 도메인이다. Fc 결합 성질들의 변형은 치료요법 항체의 항종양 효능을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
면역글로불린 Fc 도메인이 이의 수용체에 결합하면 이펙터 세포들을 결합된 항원의 부위들로 가져가고, 이로써 궁극적으로 다양한 신호생성과 면역 반응들이 초래된다. 이들 다양한 ＂이펙터 기능들＂, 가령, CDC 및 ADCC는 IgG의 Fab 도메인과 표적 항원 사이에 복합체를 형성하는 G 부류 면역글로불린들(IgGs)의 결과이며, 반면 IgG의 Fc 도메인은 이펙터 세포들 상에서 Fc 수용체들에 결합한다. IgG의 일부 이펙터 기능들은 항원 결합과 독립적이며, 그리고 순환하는 혈청 수준들 및 경계를 통한 Ig를 전달하는 능력과 같은 기능을 실현한다. 다른 이펙터 기능들은 기본적으로 면역글로불린 요법들, 이를테면 암 치료에 유용한 것으로 간주된다. 특히 ADCC 기전은 시판되는 치료요법 항체들, 이를 테면, 라스투주마브 (전이성 유방암)와 리툭시맙 (비-호지킨의 림프종)의 주요 항-종양 기전들중에 하나인 것으로 간주된다.
현재 치료요법 전략은 항체들의 변형된 Fc 도메인들에 의한 감소된 이펙터 기능들 (또는 감소된 Fc 감마 수용체 결합)은 항원(가령, 항체 차단제들 또는 길항제들)의 생물학적 활성을 중화 또는 억제하거나, 또는 하류 세포의 신호생성 (가령, 항체 작동제들)을 활성화시키거나 또는 개시하는 항체들에 대하여 유용할 수 있다는 것을 전형적으로 암시한다.
그러나, 감소된 이펙터 기능을 가진 종양 표적 항체들의 기획은 종양 요법에 있어서 반직관적인데, 그 이유는 표적 세포의 감소된 세포독성 (가령, ADCC 및 CDC)은 이 질환을 치료, 가령, 종양 세포들을 파괴하거나 또는 종양 성장에 효과가 없을 것이기 때문인 것으로 예상된다.
본 명세서에서 설명된 한 가지 전략은 표지자들을 특이적으로 표적화하고, 뿐만 아니라 종양-특이적 T 세포 사멸을 촉발시키기 위하여 이중특이적 항원 결합과 복합된 차등적 Fc 수용체 결합을 이용한다. 이 항체의 Fc 도메인은 Fc 수용체들을 품고있는 T 세포들, 자연 살해 세포들 및 대식세포들과 같은 세포들의 바람직하지 못한 사멸을 제거 또는 감소시키기 위하여 Fc 수용체 결합을 신중하게 제어하도록 기획된다. FcγRII 수용체 결합 상호작용들이 포함되나, FcγRI 또는 FcγRIII 상호작용들이 결여된 Fc 수용체 상호작용에 대하여 독특한 결합 패턴은 CD3과 CD20에 모두 결합하는 이중특이적 항체들에 있어 종양-표적 Ig 요법에 놀랍도록 유익하다. 여전히, 환자로부터 과도한 사이토카인 방출과 독성을 야기시키지 않고, 면역계를 자극시키고, 그리고 종양 절제에 효과적인 더 나은 요법들이 필요하다.
현재 이중특이적 요법들, 이를 테면 BiTE® (이중-특이적 T-세포 인게이져) 항체들은 미미한 용량으로, 그러나 빈번한 간격으로 투여된다. CD20+ B-세포 악성종양을 가진 환자들, 구체적으로 초기 요법이후 재발 또는 진행되는 환자들에 대한 허용가능한 투여 용법(regimen)을 가진 추가 치료 선택에 대한 미충족 의학적 요구가 있다.
발명의 간단한 요약
제 1 측면에서, 본 발명은 인간 CD3과 CD20에 결합하는 변경된 Fc 결합 도메인들을 가지며, 그리고 면역계의 자연적 레퍼토리에서 찾아볼 수 없는 특이적 이펙터 기능들을 더 보유하도록 작제되는 이중특이적 항체들을 제공한다. 본 발명의 이 측면에 따른 항체들은 그중에서도 CD3을 발현시키는 T 세포들을 표적으로 하고, 가령, CD3-중재된 T 세포 활성화를 특이적 세포 유형들, 이를 테면 항-CD20 종양 세포들로 지향시키는 이중특이적 항체들의 일부로써 T 세포-중재된 사멸이 유익하거나 또는 바람직한 환경하에서 T 세포 활성화를 자극하는데 유용하다. 본 발명의 항체들은 독성 효과들, 가령, 사이토카인 스톰(storm)을 최소화시키면서, 면역계를 자극, 가령, T 세포 활성화에 이들의 효과를 강화시키는 용량-증량(dose-escalation) 프로토콜로 투여된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 B 세포 암을 치료 또는 개선하는 이중특이적 항체의 용도, 또는 대상체에서 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 제 1 용량의 상기 항체를 제 1 기간 동안 투여하고, 연속하여 제 2 용량의 전술한 항체를 제 2 투여 기간 동안 투여하는 것을 포함하며, 이때 전술한 제 2 용량은 전술한 제 1 용량을 초과하며, 이때 상기 이중특이적 항체는 인간 CD3에 결합하는 제 1 항원-결합 도메인, 인간 CD20에 결합하는 제 2 항원-결합 도메인, 그리고 상기 제 1 및 제 2 항원-결합 도메인들의 각각에 묶여있는(tethered) 키메라 Fc 도메인을 포함하고, 그리고 암을 치료 또는 개선시키는 것은 (a) 이 대상체에서 종양 성장을 억제시키고, (b) 이 대상체에서 B-세포 용해를 중재하고, (c) 이 대상체에서 B-세포 암을 치료하고, (d) 이 대상체에서 CD20 발현에 양성인 암을 치료하거나, 또는 (e) 이 대상체에서 CD20-발현시키는 흑색종 암을 치료하는 것을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 종양 부하 또는 암을 치료 또는 개선하는 이중특이적 항체의 용도, 또는 대상체에서 치료 방법을 제공하는데, 이 방법은 제 1 용량의 상기 항체를 제 1 기간 동안 투여하고, 연속하여 제 2 용량의 전술한 항체를 제 2 투여 기간 동안 투여하는 것을 포함하며, 이때 전술한 제 2 용량은 전술한 제 1 용량을 초과하며, 이때 상기 이중특이적 항체는 인간 CD3에 결합하는 제 1 항원-결합 도메인, 인간 종양 표적 항원 또는 종양-특이적 항원에 결합하는 제 2 항원-결합 도메인, 그리고 상기 제 1 및 제 2 항원-결합 도메인들의 각각에 묶여있는 키메라 Fc 도메인을 포함하고, 그리고 종양 부하 또는 암을 치료 또는 개선시키는 것은 (a) 이 대상체에서 종양 성장을 억제시키고, (b) 이 대상체에서 종양-세포 용해를 중재하고, (c) 이 대상체에서 종양 표적 항원 또는 종양-특이적 항원 발현에 양성인 암을 치료하거나, 또는 (d) 이 대상체에서 종양 표적 항원-발현시키는 암, 또는 상기 종양-특이적 항원을 발현시키는 종양을 치료하는 것을 포함한다.
본 발명의 예시적인 항-CD3/CD20 항체들은 본 명세서의 표 1 내지 8에 열거된다. 표 1은 예시적인 이중특이적 항체들의 중쇄 가변 영역들 (HCVRs)과 경쇄 가변 영역들 (LCVRs), 뿐만 아니라 중쇄 상보성 결정 영역들 (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 그리고 경쇄 상보성 결정 영역들 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 아미노산 서열 식별자들(identifiers)을 제시한다. 표 2는 예시적인 이중특이적 항체들의 HCVRs, LCVRs, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 인코드하는 핵산 분자들의 서열 식별자들을 제시한다. 표 3은 HCVR, 중쇄 불변 영역 (CH) 및 LCVR 조합들이 포함된 아미노산 서열 식별자 조합들을 제시한다. 표 4는 예시적인 이중특이적 항체들의 HCVR, 중쇄 불변 영역 (CH) 및 LCVR 조합들을 인코드하는 핵산 분자들의 조합의 핵산 서열 식별자들을 제시한다.
표 5는 본 발명의 중쇄 예시들에 대한 아미노산 서열 식별자들을 설명하며, 이때 상기 이중특이적 항체는 본 발명의 CH와 쌍을 이루는 표 5의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 HCVR을 포함한다. 표 6은 본 발명의 경쇄 예시들에 대한 아미노산 서열 식별자들을 별도로 설명하며, 이때 상기 이중특이적 항체는 표 6의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 LCVR을 포함한다.
본 발명은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열, 또는 이에 대하여 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열들로부터 선택된 아미노산 서열이 포함된 HCVR을 포함하는 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들을 제공한다.
본 발명은 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열, 또는 이에 대하여 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열들로부터 선택된 아미노산 서열이 포함된 LCVR을 포함하는 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들을 또한 제공한다.
본 발명은 표 2에 열거된 예시적인 항-CD3/CD20 항체들에 포함된 아미노산 쌍을 포함하는 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 쌍 (HCVR/LCVR)을 포함하는 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들을 또한 제공한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 서열 번호: 2/10 (가령, 항체 1 및 항체 2)로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명은 표 1에 열거된 중쇄 CDR1 (HCDR1) 아미노산 서열, 또는 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열들로부터 선택된 아미노산 서열이 포함된 HCDR1을 포함하는 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들을 또한 제공한다.
본 발명은 표 1에 열거된 중쇄 CDR2 (HCDR2) 아미노산 서열, 또는 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열들로부터 선택된 아미노산 서열이 포함된 HCDR2를 포함하는 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들을 또한 제공한다.
본 발명은 표 1에 열거된 중쇄 CDR3 (HCDR3) 아미노산 서열, 또는 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열들로부터 선택된 아미노산 서열이 포함된 HCDR3을 포함하는 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들을 또한 제공한다.
본 발명은 표 1에 열거된 경쇄 CDR1 (LCDR1) 아미노산 서열, 또는 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열들로부터 선택된 아미노산 서열이 포함된 LCDR1을 포함하는 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들을 또한 제공한다.
본 발명은 표 1에 열거된 경쇄 CDR2 (LCDR2) 아미노산 서열, 또는 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열들로부터 선택된 아미노산 서열이 포함된 LCDR2를 포함하는 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들을 또한 제공한다.
본 발명은 표 1에 열거된 경쇄 CDR3 (LCDR3) 아미노산 서열, 또는 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열들로부터 선택된 아미노산 서열이 포함된 LCDR3을 포함하는 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들을 또한 제공한다.
본 발명은 표 1에 열거된 임의의 LCDR3 아미노산 서열들과 쌍을 이루는 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열들을 포함하는 HCDR3과 LCDR3 아미노산 서열 쌍 (HCDR3/LCDR3)을 포함하는 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들을 또한 제공하는데, 이를 테면 상기 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍은 서열 번호: 8/16 (가령, 항체 1 또는 항체 2)으로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명은 표 1에 포함된 6개 CDRs (가령, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) 세트를 포함하는 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들을 또한 제공한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열들 세트는 서열 번호: 4-6-8-20-22-24; 또는 12-14-16-20-22-24 (가령, 항체 1 또는 항체 2)이다.
관련된 구체예에 있어서, 본 발명은 표 1에서 열거된 예시적인 항체들이 정의된 바와 같이, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 안에 포함된 6개 CDRs (가령, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) 세트를 포함하는 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 서열 번호: 2/18 (가령, 항체 1 또는 항체 2)로 구성된 군에서 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 안에 포함된 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열들 세트를 포함하는 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. HCVR 및 LCVR 아미노산 서열들 안에서 CDRs를 식별해내기 위한 방법들과 기술들은 당분야에 공지되어 있으며, 본 명세서에서 공개된 특정 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열들 안에 CDRs를 식별해내는데 이용될 수 있다. CDRs의 경계를 식별하는데 이용될 수 있는 예시적인 관례는 가령, Kabat 정의, Chothia 정의, 및 AbM 정의를 포함한다. 일반적인 정의에서, Kabat 정의는 서열 가변성에 근거하며, Chothia 정의는 구조적 루프 영역들의 위치에 근거하며, 그리고 AbM 정의는 Kabat와 Chothia 접근법 사이에 절충이다. 가령, Kabat, ＂Sequences of Proteins of Immunological Interest,＂ National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol . Biol . 273:927-948 (1997); 및 Martin et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:9268-9272 (1989) 참고. 공적인 데이터베이스는 항체 안에 CDR 서열들의 식별에 또한 이용가능하다.
본 발명은 항체들 또는 이의 부분들을 인코드하는 핵산 분자들을 또한 제공하는데, 예를 들면, 본 발명은 표 1에 열거된 HCVR 또는 LCVR 아미노산 서열들을 인코드하는 핵산 분자들을 제공하며; 특정 구체예들에 있어서 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCVR/LCVR 핵산 서열들, 또는 이에 대하여 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열들로부터 선택된 아미노산 서열이 포함된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 표 1에 열거된 HCDR1 또는 HCDR2 또는 HCDR3 아미노산 서열들을 인코드하는 핵산 분자들을 또한 제공하며; 특정 구체예들에 있어서 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCDR1 또는 HCDR2 또는 HCDR3 핵산 서열들, 또는 이에 대하여 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열들로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 표 1에 열거된 LCDR1 또는 LCDR2 또는 LCDR3 아미노산 서열들을 인코드하는 핵산 분자들을 또한 제공하며; 특정 구체예들에 있어서 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 LCDR1 또는 LCDR2 또는 LCDR3 핵산 서열들, 또는 이에 대하여 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열들로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 HCVR을 인코드하는 핵산 분자들을 또한 제공하며, 이때 상기 HCVR은 3개의 CDRs (가령, HCDR1-HCDR2-HCDR3) 세트를 포함하며, 이때 상기 HCDR1-HCDR2-HCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에서 열거된 예시적인 항-CD3 항체들에서 정의된 바와 같다.
본 발명은 LCVR을 인코드하는 핵산 분자들을 또한 제공하며, 이때 상기 LCVR은 3개의 CDRs (가령, LCDR1-LCDR2-LCDR3) 세트를 포함하며, 이때 상기 LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에서 열거된 예시적인 항-CD3 항체들에서 정의된 바와 같다.
본 발명은 HCVR과 LCVR 모두를 인코드하는 핵산 분자들을 또한 제공하며, 이때 상기 HCVR은 표 1에서 열거된 상기 HCVR 아미노산 서열들의 아미노산 서열을 포함하며, 그리고 이때 상기 LCVR은 표 1에서 열거된 상기 LCVR 아미노산 서열들의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 핵산 분자는 표 2에 열거된 임의의 HCVR 핵산 서열들, 또는 이에 대하여 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열들로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 그리고 표 2에 열거된 LCVR핵산 서열들, 또는 이에 대하여 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열들로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 이 측면에 따른 특정 구체예들에 있어서, 상기 핵산 분자는 HCVR 및 LCVR을 인코드하며, 이때 상기 HCVR 및 LCVR은 표 1에 열거된 동일한 항-CD3 항체로부터 모두 유도된다.
본 발명은 표 2에 열거된 CH 아미노산 서열, 또는 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열들로부터 선택된 아미노산 서열이 포함된 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하는 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들을 또한 제공한다.
본 발명은 표 2에 열거된 CH 핵산 서열, 또는 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열들로부터 선택된 핵산 서열이 포함된 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하는 항체들, 또는 이의 항원-결합 단편들을 또한 제공한다.
본 발명은 항-CD3 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역과 항-CD20 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 재조합 발현 벡터들을 또한 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 상기에서 언급된 임의의 핵산 분자들을 포함하는 재조합 발현 벡터들을 포함하고, 가령, 핵산 분자들은 표 1 및 표 2에서 제시된 바와 같은 상기 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 서열들, 및/또는 CH 서열들을 인코드한다. 이러한 벡터들이 도입되는 숙주 세포, 뿐만 아니라 항체들 또는 항체 단편들의 생산을 허용하는 조건하에서 숙주 세포들을 배양하고, 그리고 이렇게 생산된 이 항체들과 항체 단편들을 회수함으로써 상기 항체들 또는 이의 부분들을 만드는 방법들 또한 본 발명의 범위 안에 포함될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 CD3과 CD20에 특이적으로 결합하는 치료요법적으로 유효량의 재조합 인간 항체 또는 이의 단편을 제공하며, 이때 상기 항체는 키메라 Fc 도메인, 그리고 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함한다. 관련된 측면에 있어서, 본 발명은 항-CD3/CD20 항체와 제 2 치료요법 물질의 조합인 조성물을 특징으로 한다. 한 구체예에 있어서, 상기 제 2 치료요법 물질은 항-CD3/CD20 항체와 유익하게 조합된 임의의 물질이다. 항-CD3/CD20 항체와 유익하게 복합될 수 있는 예시적인 물질들은 CD3에 결합하고 및/또는 이의 신호생성을 활성화시키는 다른 물질들 (다른 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들, 등을 포함하는) 및/또는 CD3에 직접적으로 결합하지 않지만, 그러나 그럼에도 불구하고 면역 세포 활성화를 활성화시키거나 또는 자극하거나, 또는 종양 사멸을 강화시키는 물질들을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 항-CD3 항체들과 관련된 추가적인 복합 요법들과 공동-제형들은 본 명세서의 도처에서 공개된다.
본 발명의 또다른 측면에 있어서, 본 발명은 CD3과 표적 항원에 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자들을 제공하며, 이때 상기 분자는 감소된 이펙터 기능을 갖는 키메라 Fc 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 분자는 본 명세서에서 설명된 키메라 Fc 도메인을 포함한다. 특정 예시적인 구체예들에 있어서, 상기 이중특이적 항원-결합 분자들은 CD3과 CD20에 결합하고; 이러한 이중특이적 항원-결합 분자들은 본 명세서에서 ＂항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들＂로 지칭된다. 상기 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자의 항-CD20 부분은 CD20을 발현시키는 종양 세포들 (가령, B-세포 종양)을 표적으로 하는데 유용하며, 상기 이중특이적 분자의 항-CD3 부분은 T-세포들을 활성화시키는데 유용하다. 종양 세포에 CD20의 결합과 T-세포에 CD3의 동시 결합은 상기 활성화된 T-세포에 의해 표적이된 종양 세포의 직접적인 사멸 (세포 용해)을 중재하고, 그리고 상기 키메라 Fc 도메인에 결합하는 이펙터 세포들에 의해 실행된다. 따라서, 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들은 그 중에서도 CD20-발현시키는 종양과 관련된 또는 이로 인한 질환 및 장애들(가령, 림프종 및 흑색종 종양)을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들은 CD20-양성 종양의 퇴행을 위한 방법을 더 제공한다. 따라서, 본 발명은 대상체에서 B 세포 암을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 치료요법적 양의 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들을 투여하는 것을 포함하며, 이때 이 양은 상기 대상체에서 종양 부하를 감소시키고, 종양 퇴행을 일으키고, 또는 종양 발달을 감소시키는데 충분한 양이다.
본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들은 CD20-양성 흑색종의 억제 또는 퇴행 방법을 더 제공한다. 따라서, 본 발명은 대상체에서 흑색종을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 치료요법적 양의 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들을 투여하는 것을 포함하며, 이때 이 양은 대상체에서 종양 성장을 억제하고, 종양 부하를 감소시키고, 또는 종양 발달을 감소시키는데 충분한 양이다.
본 발명의 이 측면에 따른 이중특이적 항원-결합 분자들은 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원-결합 도메인, CD20에 특이적으로 결합하는 제 2 항원-결합 도메인, 그리고 키메라 Fc 도메인을 포함한다. 본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들 (가령, 이중특이적 항체들)을 포함하는데, 이때 각 항원-결합 도메인은 경쇄 가변 영역 (LCVR)과 쌍을 이룬 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함한다. 본 발명의 특정 예시적인 구체예에 있어서, 상기 항-CD3 항원-결합 도메인과 상기 항-CD20 항원 결합 도메인은 각각 공통의 LCVR과 쌍을 이룬 상이한, 구별되는 HCVRs를 포함한다. 예를 들면, 본 명세서의 실시예 2에서 설명된 바와 같이, 이중특이적 항체들은 CD3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원-결합 도메인과 그리고 CD20에 특이적으로 결합하는 제 2 항원-결합 도메인을 포함하며, 이때 상기 제 1 항원-결합 도메인은 항-CD3 항체로부터 유도된 HCVR/LCVR 쌍을 포함하고; 이때 상기 제 2 항원-결합 도메인은 항-CD3 항체로부터 유도된 LCVR과 쌍을 이루는 항-CD20 항체로부터 유도된 HCVR을 포함하도록 (가령, 상기 항-CD3 항원-결합 도메인에는 동일한 LCVR이 포함됨) 만들어졌다. 환언하면, 본 명세서에서 공개된 예시적인 분자들에서, 항-CD3 항체의 LCVR와 항-CD20 항체의 HCVR간에 쌍의 형성으로 CD20에 특이적으로 결합하는 (그러나 CD3에 결합하지 않는) 항원-결합 도메인이 만들어진다. 이러한 구체예들에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 항원-결합 도메인들은 구별되는 항-CD3 및 항-CD20 HCVRs을 포함하지만 공통의 항-CD3 LCVR은 공유한다.
본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들을 제공하며, 이때 상기 CD3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원-결합 도메인은 표 1 또는 표 2에서 제시된 임의의 상기 HCVR 아미노산 서열들을 포함한다. 상기 CD3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원-결합 도메인은 표 1 또는 표 2에서 제시된 임의의 상기 LCVR 아미노산 서열들을 또한 포함할 수 있다. 특정 구체예들에 따르면, 상기 CD3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원-결합 도메인은 표 1 또는 표 2에서 제시된 임의의 상기 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍들을 포함한다. 본 발명은 또한 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들을 제공하는데, 이때 상기 CD3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원-결합 도메인은 표 1 또는 표 2에서 제시된 임의의 중쇄 CDR1-CDR2-CDR3 아미노산 서열들을 포함하고, 및/또는 표 1 또는 표 2에서 제시된 임의의 경쇄 CDR1-CDR2-CDR3 아미노산 서열들을 포함한다.
특정 구체예들에 따르면, 본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들을 제공하는데, 이때 상기 CD3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원-결합 도메인은 서열 번호: 10을 포함하는 아미노산 서열, 또는 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함한다.
본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들을 제공하는데, 이때 상기 CD3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원-결합 도메인은 서열 번호: 18을 포함하는 아미노산 서열, 또는 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함한다.
본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들을 또한 제공하며, 이때 상기 CD3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원-결합 도메인은 서열 번호: 10/18로 구성된 군에서 선택된 HCVR 및 LCVR (HCVR/LCVR) 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들을 또한 제공하며, 이때 상기 CD3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원-결합 도메인은 서열 번호: 16을 포함하는 아미노산 서열, 또는 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3) 도메인; 그리고 서열 번호: 24를 포함하는 아미노산 서열, 또는 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR3 (LCDR3) 도메인을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 CD3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원-결합 도메인은 서열 번호: 16/24를 포함하는 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자들을 포함하는데, 이때 상기 CD3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원-결합 도메인은 서열 번호: 12, 또는 이에 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1) 도메인; 서열 번호: 14, 또는 이에 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2) 도메인; 서열 번호: 20, 또는 이에 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR1 (LCDR1) 도메인; 그리고 서열 번호: 22, 또는 이에 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2 (LCDR2) 도메인을 포함한다.
본 발명의 특정한 비-제한적, 예시적인 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자들은 차례로 서열 번호: 12-14-16-20-22-24로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열들을 갖는 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인들을 포함하는 CD3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원-결합 도메인을 포함한다.
본 발명은 또한 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들을 제공하는데, 이때 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 제 2 항원-결합 도메인은 서열 번호: 2, 또는 이에 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함한다.
본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들을 제공하는데, 이때 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 제 2 항원-결합 도메인은 서열 번호: 18을 포함하는 아미노산 서열, 또는 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함한다. 본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들을 제공하는데, 이때 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 제 2 항원-결합 도메인은 서열 번호: 75를 포함하는 아미노산 서열, 또는 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함한다.
본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들을 또한 제공하며, 이때 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 제 2 항원-결합 도메인은 서열 번호: 2/18, 또는 서열 번호: 2/75을 포함하는 HCVR 및 LCVR (HCVR/LCVR) 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 분자들을 또한 제공하며, 이때 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 제 2 항원-결합 도메인은 서열 번호: 8의 아미노산 서열, 또는 이에 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3) 도메인; 그리고 서열 번호: 24, 또는 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 이에 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3 (LCDR3) 도메인을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 제 2 항원-결합 도메인은 서열 번호: 8/24를 포함하는 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자들을 또한 제공하며, 이때 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 제 2 항원-결합 도메인은 서열 번호: 4, 또는 이에 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1) 도메인; 서열 번호: 6, 또는 이에 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2) 도메인; 서열 번호: 20, 또는 이에 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR1 (LCDR1) 도메인; 그리고 서열 번호: 22, 또는 이에 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98% 또는 최소한 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2 (LCDR2) 도메인을 포함한다.
본 발명의 특정한 비-제한적, 예시적인 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자들은 차례로 서열 번호: 4-6-8-20-22-24 (가령, 항체 1 또는 항체 2)로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인들을 포함하는 CD20에 특이적으로 결합하는 제 2 항원-결합 도메인을 포함한다 (가령, 항체 1 또는 항체 2).
관련된 구체예에 있어서, 본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자들을 포함하며, 이때 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 제 2 항원-결합 도메인은 서열 번호: 2/18의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (HCVR/LCVR) 안에 포함된 중쇄 및 경쇄 CDR 도메인들을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에서 공개된 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자들의 임의의 HCVR, LCVR 또는 CDR 서열들을 인코드하는 핵산 분자들을 제공하는데, 본 명세서의 표 2, 7 및 8에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열들이 포함된 핵산 분자들, 뿐만 아니라 표 2, 7 및 8에서 제시된 임의의 기능적 복합 또는 재배열된 2가지 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자들을 포함한다. 상기 항체들의 생산을 허용하는 조건하에서 숙주 세포들을 배양하고, 그리고 생산된 상기 항체들을 회수함으로써 상기 항체를 생산하는 방법과 같이, 본 발명의 핵산들을 나르는 재조합 발현 벡터들, 및 이러한 벡터들이 도입되는 숙주 세포들 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자들을 포함하며 이때 CD3에 특이적으로 결합하는 임의의 전술한 항원-결합 도메인들은 CD20에 특이적으로 결합하는 임의의 전술한 항원-결합 도메인들과 복합, 연결 또는 그렇지 않으면 연합되어 CD3과 CD20에 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자가 형성된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 인간 CD3에 결합하는 제 1 항원-결합 도메인, 인간 CD20에 결합하는 제 2 항원-결합 도메인, 그리고 상기 제 1 및 제 2 항원-결합 도메인들 각각에 연결된 키메라 Fc 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다. 관련된 측면에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 인간 FcγRIIA 및 인간 FcγRIIB에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명은 인간 FcγRIIA 및 인간 FcγRIIB에 선호적으로 결합하고, 그리고 인간 FcγRI 또는 인간 FcγRIII에 대하여 결합 친화력이 없거나 또는 거의 없는 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자들을 제공한다. 본 발명의 상기 이중특이적 항체들은 시험관 분석에서 측정될 때, 상기 항체들이 인간 FcγRI 또는 인간 FcγRIII에 결합하는 친화력보다 더 높은 친화력으로 인간 FcγRIIA 및 인간 FcγRIIB에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 이때 상기 항체는 인간 FcγRIIA 및 인간 FcγRIIB 모두에 특이적으로 결합하고, 시험관 분석에서 측정될 때 인간 FcγRI 및 인간 FcγRIII 각각에 대하여 1 μM 미만의 KD 결합 친화력을 나타낸다.
다른 측면들에 있어서, 본 발명은 키메라 Fc 도메인을 각각 포함하는 제 1 및 제 2 중쇄 폴리펩티드가 포함된 이중특이적 항체를 제공하는데, 이때 상기 제 1 중쇄 폴리펩티드는 인간 CD3에 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하고, 그리고 이때 상기 제 2 중쇄 폴리펩티드는 인간 CD20에 결합하는 제 2 항원-결합 도메인을 포함한다.
다른 구체예들에 있어서, 시험관 분석에서 측정될 때 상기 항체는 인간 FcγRIIB에 결합과 비교하여, 인간 FcγRIIA에 대하여 더 높은 결합 친화력을 나타낸다. 여전히 다른 구체예들에 있어서, 상기 항체는 인간 FcγRIIA에 결합하고, 시험관 분석에서 측정될 때 인간 FcγRIIB에 결합과 비교하여 더 낮은 KD 값을 나타낸다. 일부 구체예들에 있어서, 시험관 분석에서 측정될 때 상기 항체는 25℃에서 10 내지 30 μM 사이의 KD 값으로 인간 FcγRIIA에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 시험관 분석에서 측정될 때 상기 항체는 25℃에서 100 내지 250 μM 사이의 KD 값으로 인간 FcγRIIB에 결합한다.
또다른 구체예에 있어서, 시험관 분석에서 측정될 때 상기 항체는 인간 FcγRI에 대하여 탐지가능한 결합 친화력이 없거나 또는 거의 없다. 일부 구체예들에 있어서, 시험관 분석에서 측정될 때 상기 항체는 인간 FcγRIII에 대하여 탐지가능한 결합 친화력이 없거나 또는 거의 없다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 시험관 분석은 표면 플라스몬 공명 분석이다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 시험관 세포독성 분석에서 측정하였을 때, 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하여 감소된 항체-의존적-세포의 세포독성 (ADCC)을 나타낸다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 탐지가능한 항체-의존적-세포의 세포독성 (ADCC)이 없거나 또는 무시할 수준을 나타낸다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 시험관 세포독성 분석에서 측정하였을 때, 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하여 감소된 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 나타낸다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 상기 전체 세포 집단의 50% 미만의 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 나타낸다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 탐지가능한 보체 의존적 세포독성 (CDC)이 없거나 또는 무시할 수준을 나타낸다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항체와 비교하였을 때, Fc 수용체들을 품고 있는 세포들, 이를 테면 NK 세포들 또는 대식세포들의 감소된 사멸을 나타낸다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항체과 비교하였을 때, NK 세포들 또는 대식세포들에 의한 T-세포들의 감소된 사멸을 나타낸다.
일부 구체예들에 있어서, 시험관 분석에서 측정될 때, 상기 항체는 인간 FcγRIIB에 대한 이의 KD 결합 친화력보다 인간 FcγRIIA에 대한 KD 결합 친화력이 더 크고, 이는 인간 FcγRIII에 대한 이의 KD 결합 친화력보다 크거나 또는 대등한 인간 FcγRI에 대한 이의 KD 결합 친화력보다 더 크다. 다른 구체예들에 있어서, 시험관 분석에서 측정될 때 상기 항체의 KD 결합 친화력은 인간 FcγRIIA > 인간 FcγRIIB > 인간 FcγRI > 인간 FcγRIII으로 나타낸다.
일부 구체예들에 있어서, 시험관 분석에서 측정될 때, 상기 항체는 인간 FcγRIIB에 대한 이의 KD 결합 친화력보다 인간 FcγRIIA에 대한 KD 결합 친화력이 더 크고, 이는 인간 FcγRI에 대한 이의 KD 결합 친화력보다 크거나 또는 대등한 인간 FcγRIII에 대한 이의 KD 결합 친화력보다 더 크다. 다른 구체예들에 있어서, 시험관 분석에서 측정될 때 상기 항체의 KD 결합 친화력은 인간 FcγRIIA > 인간 FcγRIIB > 인간 FcγRIII > 인간 FcγRI으로 나타낸다.
일부 구체예들에 있어서 상기 인간 FcγRIII는 인간 FcγRIIIA 또는 인간 FcγRIIIB이다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 키메라 Fc 도메인는 키메라 힌지를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 제 1 항원-결합 도메인, 제 2 항원-결합 도메인, 및 키메라 중쇄 불변 (CH) 영역을 포함하는 이중특이적 항체를 제공하는데, 이때 (a) 상기 제 1 항원-결합 도메인은 CD3에 결합하고, (b) 상기 제 2 항원-결합 도메인은 CD20에 결합한다. 본 발명의 특정 측면들에 있어서,시험관 분석에서 측정될 때 야생형 CH 영역을 포함하는 항체와 비교하여, 상기 키메라 CH 영역은 인간 FcγRIIA 및 인간 FcγRIIB에 더 큰 친화력으로 결합한다. 여전히 또다른 측면에 있어서, 시험관 분석에서 측정될 때 야생형 CH 영역을 포함하는 항체와 비교하여 상기 키메라 CH는 더 낮은 친화력 내지 친화력 없이 인간 FcγRI 및 인간 FcγRIII에 결합한다.
본 발명은 키메라 힌지 영역을 포함하는 이중특이적 항체들을 제공한다. 일부 측면들에 있어서, 상기 키메라 힌지 영역은 위치 216 내지 236의 아미노산 서열 (EU 넘버링)을 포함한다. 본 발명의 상기 이중특이적 항체들은 상기 키메라 힌지가 위치 228 내지 236 (EU 넘버링)의 인간 IgG2 하부 힌지 아미노산 서열 PCPAPPVA (서열 번호: 52)을 포함하도록 작제된다. 특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 이중특이적 항체들은 키메라 힌지를 포함하며, 상기 키메라 힌지의 상부 힌지 부분은 IgG1 상부 힌지의 위치 216 내지 227 (EU 넘버링)의 아미노산 잔기들을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 이중특이적 항체들은 키메라 힌지를 포함하며, 상기 키메라 힌지의 상부 힌지 부분은 IgG4 상부 힌지의 위치 216 내지 227 (EU 넘버링)의 아미노산 잔기들을 포함한다.
한 구체예에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 키메라 힌지 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA (서열 번호: 53)을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 키메라 힌지 아미노산 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVA (서열 번호: 54)을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 위치 237 내지 340 (EU 넘버링)의 인간 IgG4 CH2 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 CH3 도메인 또는 인간 IgG4 CH3 도메인으로부터 유도된 CH3 도메인을 포함한다. 여전히 다른 구체예들에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG1 CH1 도메인 및 인간 IgG1 CH3 도메인을 포함한다. 더 많은 구체예들에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 인간 IgG4 CH1 도메인 및 인간 IgG4 CH3 도메인을 포함한다.
본 발명의 한 측면은 키메라 불변 중쇄 영역을 포함하는 이중특이적 항체를 만드는 방법을 제공하며, 전술한 방법은 다음을 포함한다: (a) 숙주 세포에 CD3 항원에 결합할 수 있는 제 1 경쇄를 인코드하는 핵산 분자를 형질감염시키고, 전술한 핵산 분자는 상기 제 1의 VL 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열과 Ig의 불변 CL 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때 선택된 항원-특이적 항체의 VL 영역을 인코드하는 전술한 뉴클레오티드 서열과 Ig의 CL 영역을 인코드하는 전술한 뉴클레오티드 서열은 서로 작동가능하도록 연계되며; (b) 단계 (a)의 숙주 세포에 CD3 항원에 결합할 수 있는 항체의 제 1 중쇄를 인코드하는 핵산 분자를 형질감염시키고, 전술한 핵산 분자는 VH 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열과 인간 Ig의 키메라 불변 CH 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때 전술한 Ig의 VH 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열과 CH 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 서로 작동가능하도록 연계되며; 이때 상기 CH 영역은 상기 제 2 CH3 도메인이 단백질 A에 결합하는 것을 감소 또는 없애도록 상기 CH3 도메인 안에 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 인코드하고; (c) 단계 (a)의 숙주 세포에 CD20 항원에 결합할 수 있는 상기 항체의 제 2 중쇄를 인코드하는 핵산 분자를 형질감염시키고, 전술한 핵산 분자는 VH 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열과 인간 Ig의 키메라 CH 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때 전술한 Ig의 VH 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열과 전술한 CH 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 서로 작동가능하도록 연계되며; 그리고 (c) 전술한 숙주 세포 안에서 (a)와 (b)의 핵산 분자들을 공동-발현시킴으로써 전술한 항체를 만든다.
일부 측면들에 있어서, 상기 이중특이적 항체를 만드는 방법은 임의선택적으로 단계 (a)의 숙주 세포에 CD20 항원에 결합할 수 있는 제 2 경쇄를 인코드하는 핵산 분자를 형질감염시키는 것을 포함하고, 전술한 핵산 분자는 상기 제 2 경쇄의 VL 영역을 인코드하는 뉴클레오티드와 Ig의 불변 CL 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때 전술한 상기 제 2 경쇄의 VL 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열과 전술한 Ig의 CL 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 서로 작동가능하도록 연계된다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 제 1 중쇄는 H95R 변형 (IMGT 엑손 넘버링에 의해; EU 넘버링에 따르면 H435R)을 포함하는 CH3 영역을 포함한다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 제 1 중쇄는 Y96F 변형 (IMGT; EU 넘버링에 따르면 Y436F)을 더 포함하는 CH3 영역을 포함한다. 더 많은 구체예들에 있어서, 상기 방법은 단백질 A를 이용하여 상기 항체를 단리해내는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 측면은 다음을 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다: (a) 제 1 표적 항원을 인지하고, 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 제 1 중쇄, (b) 제 2 표적 항원을 인지하고, 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 제 2 중쇄, 그리고 (c) 상기 제 1 또는 제 2 표적 항원을 인지하고, 결합할 수 있는 공통의 경쇄 항원-결합 도메인, 이때 상기 (a) 또는 (b)의 중쇄 또는 (a)와 (b) 모두의 중쇄는 서열 번호: 53 또는 서열 번호: 54의 아미노산 서열이 포함된 키메라 힌지 영역을 포함하는 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역 (CH)는 서열 번호: 26, 서열 번호: 28, 서열 번호: 30, 또는 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 키메라 CH-인코딩 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 25, 서열 번호: 27, 서열 번호: 29, 서열 번호: 31, 또는 서열 번호: 33을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 키메라 CH 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 26, 서열 번호: 28, 서열 번호: 30, 또는 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 인코드한다. 여전히 다른 구체예들에 있어서, 상기 CH 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 25, 서열 번호: 27, 서열 번호: 29, 서열 번호: 31 또는 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 측면들에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 인코드하는 핵산 분자를 포함한다. 다른 측면들에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 서열 번호: 34의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경쇄-인코딩 핵산 분자를 포함한다.
특정 측면들에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 인코드하는 핵산 분자를 포함한다. 다른 측면들에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 서열 번호: 36의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 중쇄-인코딩 핵산 분자를 포함한다.
특정 측면들에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 인코드하는 핵산 분자를 포함한다. 다른 측면들에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 서열 번호: 38 또는 서열 번호: 39의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 중쇄-인코딩 핵산 분자를 포함한다.
특정 측면들에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 인코드하는 핵산 분자를 포함한다. 다른 측면들에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 서열 번호: 41의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 중쇄-인코딩 핵산 분자를 포함한다.
특정 측면들에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 인코드하는 핵산 분자를 포함한다. 다른 측면들에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 서열 번호: 43의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 중쇄-인코딩 핵산 분자를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 치료요법적으로 유효량의 상기 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자를 제공한다. 관련된 측면에 있어서, 본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자와 제 2 치료요법 물질이 복합된 조성물을 특징으로 한다. 한 구체예에 있어서, 상기 제 2 치료요법 물질은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자와 유익하게 조합된 임의의 물질이다. 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자와 유익하게 조합될 수 있는 예시적인 물질들은 본 명세서의 도처에서 상세하게 논의된다.
여전히 또다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자를 이용하여 CD20을 발현시키는 종양 세포들을 표적으로 하거나/사멸시키는 치료요법적 방법을 제공하는데, 이때 상기 치료요법 방법들은 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자를 포함하는 치료요법적으로 유효량의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자 또는 항체를 이용하여 CD20을 발현시키는 종양 세포들을 표적으로 하거나/사멸시키는 치료요법적 방법은 제 1 기간 동안 제 1 용량의 상기 항원-결합 분자 또는 항체를 투여하고, 연속하여 제 2 투여 기간 동안 제 2 용량의 전술한 항체를 투여하는 것을 포함하며, 이때 전술한 제 2 용량은 전술한 제 1 용량을 초과한다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 이중특이적 항원-결합 분자의 사용은 제 1 기간 동안 제 1 용량의 상기 항체를 투여하고, 연속하여 제 2 투여 기간 동안 제 2 용량의 전술한 항체를 투여하는 것을 포함하고, 이때 전술한 제 2 용량은 전술한 제 1 용량을 초과한다. 특정 측면들에 있어서, 상기 제 1 용량의 상기 항체와 상기 제 2 용량의 상기 항체는 적합한 제형 안에 있다.
본 발명은 CD20 발현과 관련된 또는 이로 인한 질환 또는 장애의 치료를 위한 약물의 제조에 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자의 사용을 포함한다.
본 발명은 제 1 항원-결합 도메인, 제 2 항원-결합 도메인, 및 키메라 중쇄 불변 (CH) 영역이 포함된 이중특이적 항체를 또한 포함하며, 이때: 상기 제 1 항원-결합 도메인은 CD3에 결합하고, 상기 제 2 항원-결합 도메인은 CD20에 결합하고, 상기 키메라 CH 영역은 야생형 CH 영역을 포함하는 항체와 비교하였을 때, 더 높은 친화력으로 인간 FcγRIIA 및 인간 FcγRIIB에 결합하고, 이러한 이중특이적 항체는 약물의 제조에 사용된다. 본 발명은 CD3에 결합하는 제 1 항원-결합 도메인, CD20에 결합하는 제 2 항원-결합 도메인, 및 인간 FcγRIIB보다는 인간 FcγRIIA에 더 높은 친화력으로 결합하는 키메라 CH 영역이 포함된, 약물의 제조에 사용되는 이중특이적 항체를 제공한다.
다른 구체예들은 후속하는 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 키메라 힌지 영역들의 작제에 이용되는 힌지 아미노산들과 대응하는 아미노산 넘버링 관례를 설명한다..
도 2는 UniProtKB/Swiss-Prot 기탁 번호 P01857 에서 IGHG1로 설명된, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인들이 포함된 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다(서열 번호: 45).
도 3은 UniProtKB/Swiss-Prot 기탁 번호 P01859에서 IGHG2로 설명된, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인들이 포함된 인간 IgG2 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다 (서열 번호: 46).
도 4는 UniProtKB/Swiss-Prot 기탁 번호 P01861에서 IGHG4로 설명된, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인들이 포함된 인간 IgG4 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다 (서열 번호: 47).
도 5a 및 5b: 야생형 또는 키메라 힌지 CH 영역들을 갖는 항체들 존재 하에서 Daudi (도 5a) 및 Raji (도 5b) 세포들에 있어서 CDC 활성의 결핍을 나타내는 용량-반응 곡선. (＂대조＂ 항체 4 = wt IgG1 CH를 가진 이중특이적 Ab; 항체 1; 항체 2; IgG1 아이소타입 대조 = wt IgG1 CH를 가진 비특이적 Ab)
도 6a 및 6b: 야생형 또는 키메라 힌지 CH 영역들을 갖는 항체들 존재 하에서 Daudi (도 6a) 및 Raji (도 6b) 세포들에 있어서 ADCC 활성의 결핍을 나타내는 용량-반응 곡선. (＂대조＂ 항체 4 = wt IgG1 CH를 가진 이중특이적 Ab; 항체 1; 항체 2; IgG1 아이소타입 대조 = wt IgG1 CH.를 가진 비특이적 Ab)
도 7a-7f는 Raji 종양 세포들 및 PBMCs (또는 PBMC 없는 대조-도 7d)의 혼합물을 피하에 이식한 NSG 마우스에서 시간의 경과에 따른 종양 용적(mm3)을 나타내고, 반면 본 발명의 CD3xCD20 이중특이적 항체(Ab 1) 또는 비이클 또는 대조 항체는 종양 이식 후 그리고 종양 이식된 동일한 날짜 (0일차)에 시작된 치료시 투여되며, 그리고 25 일 동안 측정되었다. 도 7a: 비이클 치료에 의한 종양 성장를 보이는 마우스는 없다; 도 7b: 0.4 mg/kg 대조 Ab5 (항-FelD1 Ab) 치료에 의해 종양 성장 억제를 나타내는 마우스는 5마리중 1마리(1/5); 도 7c: 0.4 mg/kg 항체 1 (Ab 1) 치료에 의해 종양 성장 억제를 나타내는 마우스는 5마리중 5마리; 도 7d: PBMCs가 이식되지 않았고, 0.4 mg/kg Ab1 치료에 의해 종양 성장 억제를 나타내는 마우스는 5마리중 0마리; 도 7e: 0.04 mg/kg Ab 1 치료에 의해 종양 성장 억제를 나타내는 마우스는 5마리중 5마리; 그리고 도 7f: 0.004 mg/kg Ab 1 치료에 의해 종양 성장 억제를 나타내는 마우스는 5마리중 5마리.
도 8a와 8b는 Raji 종양 세포들과 PBMCs의 혼합물을 피하로 이식받고, NSG 마우스에게 IgG 보충과 함께 또는 보충없이 Ab1 (CD3xCD20-키메라Fc)로 치료되거나(도 8a), 또는 IgG 보충과 함께 또는 보충없이 Ab4 (CD3xCD20-wtFc)로 치료된 마우스 (도 8b)에서 비이클과 비교하여, 시간 경과에 따른 종양 용적(mm3)을 나타낸다. 두가지 CD3xCD20 이중특이적 항체들은 모두 이 모델에서 IgG 보충과 함께 상당한 종양 성장 억제를 실증하였다. 도 8a에서 볼 수 있는 바와 같이, CD3xCD20-키메라Fc 이중특이적 항체 (Ab 1)는 이 실험에서 IgG 보충과 함께 또는 보충없이 테스트한 기간에 걸쳐 완전한 종양 성장 억제를 실증하였다.
도 9는 CD3xCD20 이중특이적 항체로 처리된 NSG 마우스에서 14일째 존재하는 종양 (~200-400 mm3)의 퇴행을 설명한다. NSG 마우스의 피하로 Raji 종양 세포들과 PBMCs (HLA-일치된 세포들)의 혼합물을 치료 15일전에 이식하였으며, 그 다음 종양이 만들어졌고, 측정되었다. 마우스는 일주일에 한 번(7일차, 14일차, 21일차) 0.4 mg/kg 항체 1 (CD3xCD20-키메라 Fc 항체), 또는 0.4 mg/kg 대조 Ab5 (항-FelD1 Ab), 또는 비이클 대조로 치료받았다.
도 10은 CD3xCD20 이중특이적 항체로 치료받은 NSG 마우스에서 21일차에 존재하는 종양 (~500-900 mm3)의 퇴행을 설명하는데, NSG 마우스의 피하로 Raji 종양 세포들과 PBMCs (HLA-일치된 세포들)의 혼합물을 치료 15일전에 이식하였으며, 그 다음 종양이 만들어졌고, 측정되었다. 마우스는 일주일에 한 번(7일차, 14일차, 21일차) 0.4 mg/kg 항체 1 (CD3xCD20-키메라 Fc 항체), 또는 0.4 mg/kg 대조 Ab5 (항-FelD1 Ab), 또는 비이클 대조로 치료받았다.
도 11a 및 11b는 단일특이적 항체 투여 (리툭시맙)와 비교하여, 항체 1 및 항체 4, CD3xCD20 이중특이적 항체 투여의 생체내 효능을 설명하는데, 이는 7일간의 연구에서 시노몰구스 원숭이들의 말초 혈액에서 CD20+ B-세포 수준들 또는 CD3+ T-세포 수준들의 변화를 측정한다. 항체들 또는 플라시보는 0일차 시점에 투여되었다. 도 11a: 말초 혈액내 B-세포 수준들은 플라시보를 제외한 모든 시료에서 2일차에 상당히 고갈되었다; 도 11b: 이중특이적 항체들로 처리를 받은 동물들의 말초 혈액에서 2일차에 일시적인 T-세포들의 상실이 관찰되었고, 4일차에 기준 수준으로 회복되었다. 플라시보 또는 리툭시맙 (Rituxan) 집단에서 T-세포들의 상실(기준선 이하)은 관찰되지 않았다.
도 12a 및 12b는 장기간(3개월) 연구에서 시노몰구스 원숭이들의 말초 혈액에서 CD20+ B-세포 수준들 또는 CD3+ T-세포 수준들의 변화를 측정함으로써, 항체 1 및 항체 4, CD3xCD20 이중특이적 항체 투여의 생체내 효능을 나타낸다. 플라시보 (비이클) 또는 이중특이적 항체들은 1.0 mg/kg의 농도로 0일차 시점에 투여되었다. 도 12a: 말초 혈액에서 B-세포 수준들은 2일차에 상당히 고갈되었고, 플라시보를 제외한 모든 시료에서 연구 기간에 걸쳐 고갈된 수준이 유지되었다; 도 12b: 이중특이적 항체들로 처리를 받은 동물들의 경우 연구 기간 동안 계속(>80일) 관찰하였을 때, 2일차에 일시적인 T-세포들의 상실이 관찰되었고, 4일차에 기준 수준으로 회복되었고, 그리고 기준 수준 주변에서 유지되었다. 플라시보로 처리된 동물들에서 일시적인 T-세포들의 상실은 관찰되지 않았다.
도 13a 및 13b는 장기간(2개월) 연구에서 시노몰구스 원숭이들의 말초 혈액에서 CD20+ B-세포 수준들 또는 CD3+ T-세포 수준들의 변화를 측정함으로써, 항체 1 및 항체 4, CD3xCD20 이중특이적 항체의 낮은 용량 투여의 생체내 효능을 나타낸다. 이중특이적 항체들은 0일차에 0.01 mg/kg 또는 0.001 mg/kg (1 μg/kg)로 투여되었다. 도 13a: 더 높은 용량의 CD3xCD20 이중특이적 항체들로 처리된 동물들에서 관찰된 것과 유사하게(도 11a 또는 12a 또한 참고), 말초 혈액에서 B-세포 수준들은 2일차에 상당히 고갈되었고, 플라시보를 제외한 모든 시료에서 연구 기간에 걸쳐 고갈된 수준이 유지되었다; 도 13b: 매우 낮은 용량 (1 μg/kg)의 이중특이적 항체들로 처리를 받은 동물들은 더 높은 용량의 CD3xCD20 이중특이적 항체들로 처리를 받은 동물에서 볼 수 있는 것과 같이 (도 11b 또는 12b), 동일한 일시적 T-세포들의 상실과 회복을 경험한다.
도 14는 CD3xCD20-키메라Fc 항체 1로 처리를 받은 동물들의 말초 혈액에서 항체 상실과 B-세포 상실의 상관 관계를 나타낸다. 동물의 순환계에서 항체 노출 (개방 기호)은 시간의 경과함에 따라 고갈되어, B-세포 집단 (굵은 기호)은 회복하기 시작한다 (가령, 동물 번호 I06881의 경우 81일차에 관찰된 것과 같이 (채워진 원)).
도 15는 CD3xCD20-키메라Fc 항체 2로 처리를 받은 동물들의 말초 혈액에서 항체 상실과 B-세포 상실의 상관 관계를 나타낸다. 동물의 순환계에서 항체 노출 (개방 기호)은 시간의 경과함에 따라 고갈되어, B-세포 집단 (굵은 기호)은 회복하기 시작한다 (가령, 동물 번호 I06876의 경우 66일차에 관찰된 것과 같이 (채워진 삼각), 그리고 동물 번호 I06877의 경우 68일차에서 관찰된 것과 같이(채워진 사각)).
도 16은 CD3xCD20-wtFc (Ab 4) 이중특이적 항체로 처리를 받은 동물들의 말초 혈액에서 항체 상실과 B-세포 상실의 상관 관계를 나타낸다. 동물의 순환계에서 항체 노출 (개방 기호)은 시간의 경과함에 따라 고갈되어, B-세포 집단 (굵은 기호)은 회복하기 시작한다 (가령, 동물 번호 I06870의 경우 91일차에 관찰된 것과 같이 (채워진 삼각), 그리고 동물 번호 I06872의 경우 64일차에서 관찰된 것과 같이(채워진 원)).
도 17a 및 17b는 상기 항-CD20 단일특이적 항체와 비교하여 CD3xCD20 이중특이적 항체들을 투여한 시노몰구스 원숭이들의 비장(도 17a) 또는 장간막림프절 (도 17b)에서 조직 B-세포들의 고갈을 나타내는데, 상기 이중특이적 코호트에는 훨씬 더 낮은 투여 분량(0.01 내지 1.0 mg/kg 용량)이 투여된다. 이 고갈은 플라시보 대조 동물 코호트의 어느 조직에서도 나타나지 않았다. CD3xCD20 이중특이적 항체들은 모두 (Ab1 및 Ab 4) 0.1 mg/kg에 대등한 또는 그 이상의 용량에서 림프구 장기들 안에서 용량-의존적 B-세포 고갈을 일으켰고, 상기 이중특이적 항체들은 리툭시맙보다 더 효과적으로 B-세포들을 고갈시킨다.
도 18a 및 18b는 시험관내 생물분석에서 CD3xCD20 이중특이적 항체들은 인간 PBMCs (도 18a) 또는 시노몰구스 PBMCs (도 18b)의 증식을 유도한다는 것을 설명하고, 반면 대조 항체 5 (-▲-; CD3xCD20에 비특이적)는 활성을 나타내지 않는다.
도 19a 및 19b는 세포독성 분석에서 CD3xCD20-중재된 Raji 표적 사멸을 설명한다. 항체 1은 인간 (도 19a) T 세포들과 시노몰구스 (도 19b) T 세포들에 대한 차례로 대표적인 EC50 값 25.0ρM 및 9.10ρM으로 표적 세포 사멸을 중재하였다. 항체 4는 인간 (도 19a) T 세포들과 시노몰구스 (도 19b) T 세포들에 대한 차례로 대표적인 EC50 값 15.7ρM 및 1.73ρM으로 표적 세포 사멸을 중재하였다. 대조 (-▲-)의 활성은 관찰되지 않았다.
도 20a 및 20b는 순수(
Figure 112023012738684-pct00001
) T-세포들에 의한 세포 사멸을 중재한다는 것을 설명한다. 도 20a는 항체 4의 테스트된 최대 농도에서 대표적인 FACS 분산을 나타낸다. B16F10.9 야생형 세포들은 CFDA-SE로 라벨되었고, B16F10.9/CD20 세포들은 바이올렛 세포 추적자로 라벨되었다. 이펙터 세포들은 라벨되지 않는다. 도 20a의 제 2 패널은 항-CD3xCD20에 의한 치료에 의해 CD20-발현시키는 세포들이 제거되었음을 보여준다(우측 아래 사분원). 도 20b는 CD20xCD3 항체들, 가령, 항체 4 (wtFc), 항체 1(키메라Fc) 또는 대조 Ab 5, 및 PBMCs 존재하에서 48시간 후 생존 B16F10.9/CD20 세포들의 비율을 나타낸다. 생존 백분율은 살아있는 세포 집단 안에서 CD20 음성 B16F10.9 세포들에 대한 B16F10.9/CD20 세포들의 백분율을 비교함으로써 결정되었다. Ab 4 및 Ab 1은 혼합 세포 집단 안에서 인간 T 세포들에게 특이적으로 지향되어 CD20을 발현시키는 표적 세포만을 죽인다 (도 20b). 상기 이중특이적 항체들 존재하에서 항체 4 (EC50 12.8ρM) 및 항체 1 (EC50 19.5ρM)에 의해 용량-의존적 방식으로 고갈된 B16F10.9/CD20 세포들에서만 표적 세포 사멸이 관찰되었다 (도 20b). 테스트된 최대 용량(10 μg/mL)에서 CD20-발현시키는 세포들의 5% 미만이 생존하였다.
도 21은 B16F10.9/CD20 세포들을 표적으로 하는 48시간 세포독성 분석에서 전체 CD2+ 이펙터 세포들중 활성화된 (CD69+) 세포들의 백분율을 나타내는데, 이러한 활성화는 CD20xCD3 항체, 가령, 항체 4 (wtFc) 또는 항체 1 (키메라 Fc)에 의해 유도되었다.
도 22a 및 22b는 CD3xCD20 이중특이적 항체가 이 항체의 이중특이적 결합 아암을 통하여 T-세포들과 표적 세포들 (CD20+ 세포들)의 클러스터링을 유도하였다는 것을 설명한다. 이펙터 세포들은 CFSE로 착색되며, CD20+ 세포들은 바이올렛 세포 추적자로 착색되며, 그리고 사분역으로 분리하기 위하여 게이팅되었다. 무관한 대조 항체 (대조 항체 5)와 함께 항온 처리후, 이 세포 혼합물에서 클러스터링(이중-착색)은 나타나지 않는다 (도 22a). CD3xCD20 이중특이적 항체 (Ab 4)와 항온처리 후, 이들은 CFSE와 바이올렛 모두로 착색되었기 때문에 세포 클러스터들이 나타난다(도 22b의 산점도 상에 좌측 상부 사분위 참고, 굵은 사각형으로 강조되어 있음).
도 23 은 Raji 종양 세포들과 PBMCs의 혼합물을 피하로 이식받은 NSG 마우스의 종양 용적(mm3)연구를 나타내는데, 반면 본 발명의 CD3xCD20 이중특이적 항체 (Ab 1) 0.4 mg/kg, 2X/주 (i.p), 무관한 항체 대조 Ab 6, 0.4 mg/kg, 2X/주 (i.p), 또는 비이클은 리툭시맙, 항-CD20 항체, 8 mg/kg, 5X/주 (i.p), 및 CD19xCD3 BiTE, 0.5 mg/kg, 5X/주 (i.v)와 비교되었다. (CD19xCD3 BiTE의 경우 Nagorsen D, et al. Pharmacol Ther. 2012 Dec;136(3):334-42, 2012. 참고) 종양 이식 후 각각 투여되었다. 데이터는 평균 (SEM)으로 표현되며, ANOVA 분석된다. 이 생체내 모델에서 주당 2x, i.p. 투여된 Ab1은 주당 5x i.v.투여된 CD19xCD3 BiTE의 효능에 필적하였다.
도 24는 Raji/PBMC 혼합물을 피하로 이식을 받은 NSG 마우스에서 종양 용적(mm3) 연구를 나타내는데, 도 23과 유사하지만, 그러나 AB1, 대조 Ab 6, 리툭시맙 및 비이클 대조의 경우 ANOVA 분석이 제공된다. 주당 2x 투여된 Ab 1은 존재하는 Raji 종양을 억제하는데 있어서 리툭시맙 요법 (8 mg/kg; 주당 5x, i.p.투여됨)보다 우수하였다.
도 25a 및 25b는 CD3xCD20 이중특이적 항체로 처리를 받은 인화된 마우스의 hCD20/B16F10.9 종양 이식과 동시에 또는 나중에 치료가 개시되었을 때 지연된 종양 성장을 설명한다. 도 25a: hCD3 마우스는 hCD20-형질변형된 B16F10.9 흑색종 세포들을 피하로 이식받고, 동시에 0.004 mg/kg 또는 0.4 mg/kg 항체 1 (CD3xCD20-키메라 Fc 항체), 또는 4 mg/kg 대조 Ab5 (항-FelD1 Ab), 또는 비이클 대조 (i.p. 주당 2회)로 처리를 받았다. 도 25b: hCD3 마우스는 hCD20/B16F10.9 흑색종 세포들을 피하로 이식받았고, 존재하는 종양은 10일차 그리고 그 이후 항체 1 (CD3xCD20-키메라 Fc 항체) 또는 대조로 처리되었다. 마우스는 0.4 mg/kg 또는 4 mg/kg Ab1, 또는 0.4 mg/kg 대조 Ab5 (항-FelD1 Ab), 또는 비이클 대조로 주당 2회 i.p.로 처리되었다.
상세한 설명
본 발명이 기술되기 전에, 본 발명은 설명된 특정 방법 및 실험 조건에 제한되지 않으며, 그러한 방법 및 조건은 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한 본 명세서에서 이용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 목적이며, 본 발명의 범위는 오로지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되기 때문에 제한적인 용도가 아님을 인지해야 한다.
명시적으로 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계 숙련자들에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 ＂약＂은 특정 열거된 수치에 관련하여 사용될 때, 그 값이 열거된 값과 1 % 이하로 다를 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 본원에서 사용된 바와 같이, ＂약 100＂이라는 표현은 99와 101 그리고 그 사이에 있는 모든 값들 (가령, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 등,)을 포함한다.
본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법들 및 재료들이 하기에서 설명된다.
정의
본원에서 사용된 바와 같이, 표현 ＂CD3＂은 다중 분자 T 세포 수용체 (TCR)의 일부로서 T 세포 상에 발현되고, 4 개의 수용체 쇄 중 2 개의 연합으로부터 형성된 동종이량체 또는 이종이량체로 구성된 항원을 의미한다: CD3-엡실론, CD3-델타, CD3-제타, 및 CD3-감마. 본원의 단백질, 폴리펩티드 및 단백질 단편에 대한 모든 언급은 비-인간 종으로부터 유래한 것으로 명시되지 않는 한, 각각의 단백질, 폴리펩티드 또는 단백질 단편의 인간 버전을 의미한다. 따라서, 표현 ＂CD3＂은 비-인간 종, 가령, ＂마우스 CD3＂, ＂원숭이 CD3＂등으로부터 유래한 것으로 명시되지 않는 한, 인간 CD3을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, ＂CD3에 결합하는 항체＂또는 ＂항-CD3 항체＂는 단일 CD3 서브 유닛 (예를 들어, 엡실론, 델타, 감마 또는 제타)을 특이적으로 인식하는 항체 및 그의 항원 결합 단편, 뿐만 아니라 2 개의 CD3 서브 유닛 (예를 들어, 감마/엡실론, 델타/엡실론, 및 제타/제타 CD3 이량체)의 이량체 복합체를 특이적으로 인식하는 항체들과 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. 본 발명의 항체들 및 항원-결합 단편들은 가용성 CD3 및/또는 세포 표면 발현된 CD3에 결합할 수 있다. 가용성 CD3는 자연 CD3 단백질 뿐만 아니라, 예를 들어 막 구조 도메인이 없거나 또는 그렇지 않으면 세포막과 결합되지 않은 단량체 및 이량체 CD3 구조물과 같은 재조합 CD3 단백질 변이체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 표현 ＂세포 표면-발현된 CD3＂은 시험관내 또는 생체 내에서 세포의 표면 상에 발현되는 하나 이상의 CD3 단백질을 의미하며, 따라서 CD3 단백질의 적어도 일부는 세포막의 세포외 측면에 노출되고, 항체의 항원-결합 부분에 접근 가능하다. ＂세포 표면-발현된 CD3＂에는 세포 막의 기능성 T 세포 수용체의 맥락에서 포함된 CD3 단백질이 포함된다. ＂세포 표면-발현된 CD3＂은 세포 표면상의 동종이량체 또는 이종이량체의 일부로서 발현되는 CD3 단백질 (예를 들어, 감마/엡실론, 델타/엡실론 및 제타/제타 CD3 이량체)을 포함한다. ＂세포 표면-발현된 CD3＂이라는 표현은 또한 세포 표면 상에 다른 CD3 사슬 유형없이, 그 자체로 발현되는 CD3 쇄 (예를 들어, CD3-엡실론, CD3-델타 또는 CD3-감마)를 포함한다. ＂세포 표면-발현된 CD3＂은 정상적으로 CD3 단백질을 발현하는 세포의 표면에서 발현되는 CD3 단백질을 포함하거나 또는 이것으로 구성될 수 있다. 대안으로, ＂세포 표면-발현된 CD3＂은 일반적으로 표면 상에서 인간 CD3을 발현시키지 않지만, 표면 상에 CD3를 발현하도록 인위적으로 조작된 세포의 표면 상에 발현되는 CD3 단백질을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, ＂항-CD3 항체＂라는 표현은 단일 특이성을 갖는 1가 항체 뿐만 아니라 CD3에 결합하는 제 1 아암 및 제 2 (표적) 항원에 결합하는 제 2 아암을 포함하는 이중 특이성 항체를 포함하며, 이때 상기 항-CD3 아암은 본원의 표 1 또는 표 2에 기재된 바와 같은, 임의의 HCVR/LCVR 또는 CDR 서열을 포함한다. 항-CD3 이중 특이성 항체의 예들은 본 명세서의 도처에서 기재되어 있다. 용어 ＂항원-결합 분자＂는 항체, 예를 들어 이중특이적 항체를 포함하는 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 예시적인 항-CD3 항체는 또한 US 2007/0280945A1; 및 2013년 9월 19일자로 출원된 PCT 국제 출원 PCT/US13/60511 호에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참고자료에 편입되어 있다.
본원에 사용된 용어 ＂CD20＂은 비-인간 종 (예를 들어, ＂마우스 CD20＂, ＂원숭이 CD20＂등)이라고 특정되지 않는 한, 인간 CD20 단백질을 나타낸다. 상기 인간 CD20 단백질은 NCBI 참고 서열 NP_690605.1에서의 아미노산 서열을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, ＂항-CD20 항체＂라는 표현은 미국 특허 제7,879,984호에 기재된 바와 같이, 단일 특이성을 갖는 1가 항체, 이를 테면 Rituxan (리툭시맙)를 포함한다. 예시적인 항-CD20 항체는 또한 각각 본원에 참고로 인용된 US 7,879,984 및 2013년 9월 19일 출원된 PCT 국제 출원 PCT/US13/60511에 기재되어 있다.
＂종양 표적 항원＂은 종양 세포에 의해 발현되는 표적 항원을 지칭하지만, 종양으로 변형되기 전에 동족(cognate) 세포 (또는 건강한 세포)에 의해 발현될 수 있다. ＂종양-특이적 항원＂은 종양 세포 내에서 발현되거나 존재하지만, 일반적으로 건강한 세포 또는 상이한 기원의 세포에는 존재하지 않는 항원을 의미한다.
본원에 사용된 용어 ＂항체＂는 특정 항원 (예, CD3)에 특이적으로 결합하거나 상호작용하는 최소한 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 임의의 항원 결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 ＂항체＂는 이황화 결합에의해 상호 연결된 2 개의 중쇄 (H) 쇄 및 2 개의 경쇄 (L)가 포함된, 4 개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 면역글로불린 분자 및 그의 다량체 (예, IgM)를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원 명세서에서 HCVR 또는 VH로 축약됨)과 중쇄 불변 영역을 포함한다. 상기 중쇄 불변 영역은 3개 도메인들, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원 명세서에서 LCVR 또는 VL로 축약됨)과 경쇄 불변 영역을 포함한다. 상기 경쇄 불변 영역은 한 개 도메인 (CL1)을 포함한다. 상기 VH 및 VL 영역들은 틀구조 영역 (FR)으로 불리는, 보다 보존된 영역들 안에 삽입된 상보성 결정 영역 (CDR)으로 지칭되는 초가변성의 영역으로 더 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카복시-말단 방향으로 다음 순서로 배열된 3 개의 CDR 및 4 개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 발명의 상이한 구체예들에서, 항-CD3 항체 (또는 이의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식 세포계 서열과 동일할 수 있거나, 또는 자연적으로 또는 인위적으로 변형될 수 있다. 아미노산 컨센서스(consensus) 서열은 2 개 또는 그 이상의 CDRs의 병렬 분석에 기초하여 정의될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 ＂항체＂는 완전한 항체 분자의 항원-결합 단편을 또한 포함한다. 본원에서 사용되는 항체의 ＂항원-결합 부분＂, 항체의 ＂항원-결합 단편＂등은 자연적으로 발생되거나, 효소적으로 수득가능한 합성 또는 유전공학에 의해 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 특이적으로 결합하는 임의의 당단백질을 포함하며, 이들은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성한다. 항체의 항원 결합 단편은 단백질 분해성 절단, 또는 항체 가변 및 임의의 불변 도메인을 인코딩하는 DNA의 조작 및 발현이 관련된 재조합 유전공학 기술과 같은 임의의 적합한 표준 기술을 사용하여, 예를 들어 완전 항체 분자로부터 유도될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고 및/또는 상업적 공급원, DNA 라이브러리 (예를 들어, 파지-항체 라이브러리를 포함)로부터 용이하게 입수할 수 있거나 또는 합성될 수 있다. DNA는 서열화되고, 예를 들어, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적절한 배치로 배열하거나, 또는 코돈을 도입하고, 시스테인 잔기를 만들고, 아미노산을 변형, 추가 또는 삭제하기 위하여, 화학적으로 또는 분자 생물학 기술을 사용하여 조작될 수 있다.
항원 결합 단편의 비 제한적인 예는 (i) Fab 단편; (ii) F (ab＇) 2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일 사슬 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 그리고 (vii) 항체의 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인식 단위 (예를 들어, CDR3 펩티드와 같은 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)) 또는 구속된 FR3-CDR3-FR4 펩티드를 포함한다. 　도메인 특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-삭제된 항체, 키메라 항체, CDR-접합된 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디 (가령, 1가 나노바디, 2가 나노바디 등) 작은 모듈형 면역약제 (SMIP) 및 상어 가변 IgNAR 도메인과 같은 다른 조작된 분자들 또한 본원에서 사용된 ＂항원-결합 단편＂이라는 표현 내에 포함된다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 하나 이상의 가변 도메인을 포함할 것이다. 상기 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성을 가질 수 있으며, 일반적으로 하나 또는 그 이상의 골격 서열에 인접하거나 또는 하나 이상의 골격서열과 같은 프레임에 있는 최소한 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 연합된 VH 도메인을 갖는 항원-결합 단편들에 있어서, 상기 VH 및 VL 도메인들은 임의의 적합한 배열로 서로에 대해 위치할 수 있다. 예를 들면, 상기 가변 영역은 이량체일 수 있고, VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체들을 포함한다. 대안으로, 항체의 상기 항원-결합 단편은 단량체 VH 또는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 항체의 항원-결합 단편은 최소한 하나의불변 단편 (Fc) 도메인에 공유적으로 연계된, 또는 그렇지 않으면 Fc 도메인에 묶여있는 최소한 하나의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 안에서 볼 수 있는 가변 도메인과 불변 도메인들의 비-제한적 예시적인 배열은 다음을 포함한다: (i) VH-CH1-힌지-CH2-CH3; (ii) VH-힌지-CH2-CH3; (iii) VH-CL; (iv) VL-CH1-CH2-CH3; (v) VL-CH2-CH3; 그리고 (vi) VL-CL. 상기 나열된 임의의 예시적인 배열을 포함하는 가변 및 불변 도메인의 임의의 배열에서, 가변 및 불변 도메인은 서로 직접 결합되거나, 또는 본 발명의 전체 또는 부분 키메라 힌지에 의해, 또는 전체 또는 부분 CH1와 키메라 힌지에 의한 연결 (묶임)될 수 있다. 힌지 영역은 적어도 하나의 폴리펩티드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에 유연성 또는 반-유연성 결합을 초래하는 최소한 상부 및 하부 힌지 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 서로 비-공유적으로 연합된 또는 하나의또는 이상의 단량체 VH 또는 VL 도메인과 연합된 (예를 들어, 디설파이드 결합 (들)) 상기 언급된 임의의 가변 및 불변 도메인 배열의 동종-이량체 또는 이종-이량체 (또는 다른 다량체)를 포함한다.
본원에 개시된 예시적인 이중특이적 항체 포맷을 포함하는 본 발명의 다중 특이적 항체 포맷은 전형적으로 적어도 2 개의 상이한 가변 도메인을 포함하며, 이때 각 가변 도메인은 별도의 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 다특이적 포맷은 당 업계에서 이용가능한 일상적인 기술을 사용하여, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편과 관련하여 용도를 위하여 개작될 수 있다.
본 발명의 상기 항체들은 시험관에서 측정하였을 때, 보체-의존적 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존적 세포-중재된 세포독성 (ADCC)이 감소되거나 또는 없도록 변형된다. ＂보체-의존적 세포독성＂ (CDC)은 보체의 존재 하에 본 발명의 항체에 의한 항원-발현 세포의 용해를 지칭한다. ＂항체-의존적 세포-중재된 세포독성＂ (ADCC)은 Fc 수용체 (FcRs) (가령, 자연 살해 세포 (NK), 호중구 및 대식세포)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인지하고, 이로 인하여 표적 세포의 용해를 유도하는 세포-매개된 반응을 말한다. CDC 및 ADCC는 당업계에 널리 공지되어있는 분석법을 사용하여 측정할 수 있다. (가령 , U.S. 특허 5,500,362 및 5,821,337, 그리고 Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 참고). 항체의 중쇄 불변 영역 (CH)은 항체가 보체를 고착시키고, 세포-의존적 세포독성을 중재하는 능력에 있어서 중요하다. 따라서, 항체의 CH는 항체가 세포독성을 매개하는 것이 바람직한지의 여부에 근거하여 선택될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 이중특이적 항체들은 인간 항체들이다. 본원에 사용된 용어 ＂인간 항체＂는 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들어 CDR 및 특히 CDR3에서, 인간 생식계 면역글로불린 서열 (예를 들어, 시험관내에서의 랜덤 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 도입된 돌연변이, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 ＂인간 항체＂는 마우스와 같은 다른 포유 동물 종의 생식 세포계에서 유래된 CDR 서열이 인간 골격 서열상에 접합되어 있는 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 항체들은 일부 구체예들에 있어서, 재조합 인간 항체들일 수 있다. 본원에 사용된 용어 ＂재조합 인간 항체＂는 숙주 세포에 형질 도입된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 재조합 복합적 인간 항체 라이브러리 (하기에 추가로 기재 됨)로부터 분리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자변형된 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체(가령, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 참고) 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열들을 다른 DNA 서열들에 스플라이싱하는 것이 관련된 임의의 다른 수단에 의해 준비, 발현, 창조 또는 단리된 항체들을 포함하도록 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체들은 인간 생식세포 면역글로불린 서열들들로부터 유도된 가변 영역들과 불변 영역들을 갖는다. 그러나, 특정 구체 예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이 유발 (또는 인간 Ig 서열에 대한 유전자삽입 동물이 생체내 체세포 돌연변이 유발에 사용되는 경우)을 겪고, 따라서 인간 생식세포계 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 관련되지만, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 생체내 인간 항체 생식선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
인간 항체는 힌지 이질성과 관련된 두 가지 형태로 존재할 수 있습니다. 한 형태에서, 면역글로불린 분자는 약 150-160 kDa의 안정적인 4개 사슬 구조를 포함하며, 여기서 상기 이량체는 사슬 간의 중쇄 이황화 결합에의해 함께 서로 유지된다. 두 번째 형태에서, 이량체는 사슬 간 이황화 결합을 통해 연결되지 않고, 공유 결합된 경쇄 및 중쇄로 구성된 약 75-80 kDa의 분자(반-항체)가 형성된다. 이러한 형태들은 친화성 정제 후에도, 분리하기가 매우 어렵다.
다양한 손상되지 않은 IgG 이소타입에서의 제 2 형태의 출현 빈도는 항체의 힌지 부위 이소타입과 관련된 구조적 차이로 인한 것이지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 인간 IgG4 힌지의 힌지 영역에서의 단일 아미노산 치환은 인간 IgG1 힌지를 사용하여 통상적으로 관찰되는 수준으로 제 2 형태 출현을 상당히 감소시킬 수 있다.(Angal et al (1993) Molecular Immunology 30:105) 본 발명은 예를 들어 생산시 원하는 항체 형태의 수율 개선을 위하여 힌지 영역에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는 항체를 포함한다.
본 발명의 항체들은 단리된 항체들일 수 있다. 본원에 사용된 ＂단리된 항체＂는 자연 환경의 적어도 하나의 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 항체를 의미한다. 예를 들어, 항체가 자연적으로 존재하거나 자연적으로 생산되는 유기체의 적어도 하나의 성분, 또는 항체가 자연적으로 존재하거나 자연적으로 생산되는 조직 또는 세포로부터 분리되거나 제거된 항체가 본 발명의 목적을 위한 ＂분리된 항체＂이다. 또한, 분리된 항체는 재조합 세포 내 그 자리에 있는 (in situ) 항체를 포함한다. 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 거친 항체이다. 특정 구체예들에 따르면, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다.
본원에 기술된 항-CD3 또는 항-CD20 가변 영역은 이 항체들이 유도된 대응하는 생섹세포 서열들과 비교하였을 때, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 골격 및/또는 CDR 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 본원에 개시된 아미노산 서열을 예를 들어, 항체 서열 공공 데이터베이스로부터 이용가능한 배아 줄기 서열과 비교함으로써, 용이하게 확인할 수 있다. 본 발명은 항체 및 이의 항원-결합 단편들을 포함하는데, 이들은 본원에서 공개된 임의의 아미노산 서열들로부터 유도되며, 이때 하나 이상의 골격 및/또는 CDR 영역 내의 하나 또는 그 이상의 아미노산이 이 항체가 유도된 생식계 서열의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이되거나, 또다른 인간 생식계 서열의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이되거나, 또는 상응하는 생식계 잔기들의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이된다 (이러한 서열 변화는 본원에서 집합적으로 ＂생식세포 돌연변이＂라고 칭한다). 당업자는 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로 시작하여, 하나 또는 그 이상의 개별적인 생식 세포 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 항체 및 항원-결합 단편을 용이하게 생산할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 V H 및/또는 V L 도메인들 안에 모든 골격 및/또는 CDR 잔기는 이 항체가 유래된 원래의 생식 세포계 서열에서 발견되는 잔기로 다시 돌연변이된다. 다른 구체예들에 있어서, 특정 잔기들만이 원래의 생식 세포계 서열로 돌연변이되는데, 예를 들어 FR1의 처음 8 개 아미노산 또는 FR4의 마지막 8 개 아미노산 내에서 발견된 돌연변이 잔기들, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 발견된 돌연변이된 잔기들이다. 다른 구체예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 틀구조 및/또는 CDR 잔기 (들)은 상이한 생식세포 서열 (즉, 항체가 최초 유도된 생식세포 서열과는 상이한 생식세포 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 또한, 본 발명의 항체는 틀구조 및/또는 CDR 영역 내에 2 개 또는 그 이상의 생식선 돌연변이의 임의의 조합을 포함할 수 있는데, 예를 들어 특정 개별 잔기는 특정 생식세포 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 반면, 원래의 생식세포 서열과는 상이한 특정 다른 잔기들은 유지되거나 또는 상이한 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이된다. 일단 수득되면, 하나 또는 그 이상의 생식세포 돌연변이를 포함하는 항체 및 항원-결합 단편은 결합 특이성의 개선, 결합 친화력의 증가, 길항 또는 항진적(경우에 따라) 생물학적 특성의 개선 또는 강화, 면역원성의 감소 등에 대하여 용이하게 테스트될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 수득된 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명에 포함된다.
본 발명은 하나 또는 그 이상의 보존적 치환을 갖는 본원에 개시된 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 항-CD3 또는 항-CD20 가변 영역을 또한 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 본원에서 표 1에 기재된 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열과 비교하여 가령, 10 개 이하, 8 개 이하, 6 개 이하 또는 4 개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-CD3 항체를 포함한다.
＂에피토프＂라는 용어는 파라토프 (paratope)로 알려진 항체 분자의 가변 영역에서 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원 결정기를 의미한다. 단일 항원은 하나 또는 그 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원상의 상이한 영역에 결합할 수 있고, 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 입체형태(conformational) 또는 선형일 수 있다. 입체형태 에피토프는 선형 폴리펩티드 사슬의 상이한 세그먼트로부터 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생성된다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 사슬의 인접한 아미노산 잔기들에 의해 생성된다. 특정 환경에서, 에피토프는 이 항원 상에 사카라이드, 포스포릴기 또는 설포닐기의 모이어티를 포함할 수 있다.
핵산 또는 이의 단편을 언급할 때, ＂실질적인 동일성＂또는 ＂실질적으로 동일한＂이란 용어는 또다른 핵산 (또는 그의 상보적 가닥)과 적절한 뉴클레오티이드 삽입 또는 결실과 최적으로 정렬될 때, 하기에서 논의되는 바와 같이, 임의의 잘 알려진 서열 동일성 알고리즘, 가령 FASTA, BLAST 또는 Gap에 의해 측정되었을 때, 뉴클레오티이드 염기의 적어도 약 95 % 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 %에서 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 특정 경우, 기준 핵산 분자와 실질적으로 동일성을 갖는 핵산 분자는 기준 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
폴리펩티드에 적용될 때, ＂실질적인 유사성＂ 또는 ＂실질적으로 유사한＂이라는 용어는 2 개의 펩티드 서열이, 디폴트 갭 웨이트를 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때, 적어도 95 %, 더욱 바람직하게는 최소한 98 % 또는 99 % 이상의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. ＂보존적 아미노산 치환＂은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질 (가령, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 (R 기)를 갖는 또다른 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2 개 또는 그 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 다른 경우, 서열 동일성 또는 유사성의 백분율은 치환의 보존적 특성을 보정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 행하기 위한 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 가령, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331 참고. 유사한 화학적 성질을 갖는 측쇄를 갖는 아미노 그룹의 예는 (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소 루신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드 함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르 테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 황 함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는 다음과 같다: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산 염-아스파테이트 및 아스파라긴-글루타민. 대안으로, 보존적 치환은 Gonnet et al.,(1992) Science 256: 1443-1445에 개시된 PAM250 로그-유사 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. ＂적당히 보수적인＂ 대체는 PAM250 로그-유사 매트릭스에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
폴리펩티드에 대한 서열 유사성 (또한 서열 동일성이라고도 함)은 일반적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 비롯한 다양한 치환, 결실 및 기타 변형에 할당된 유사성 측정을 사용하여 유사한 서열을 연결시킨다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는 상이한 생물 종의 동종 폴리펩티드 또는 야생형 단백질과 그의 뮤테인 사이에 동동 폴리펩티드와 밀접하게 관련된 폴리펩티드 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위해, 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있는 Gap 및 Bestfit과 같은 프로그램을 포함한다. 가령 , GCG 버전 6.1 참고. 폴리펩티드 서열은 GCG 버전 6.1의 프로그램에서 디폴트 또는 권장 매개변수들과 함께 FASTA를 사용하여 또한 비교할 수 있다. FASTA (가령, FASTA2 및 FASTA3)는 문의 서열과 검색 서열 사이의 최상의 중첩 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다 (Pearson (2000) supra). 상이한 유기체로부터의 다수의 서열을 함유하는 데이터베이스에 본 발명의 서열을 비교할 때, 또다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 매개변수들을 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 가령, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 및 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402 참고.
이중특이적 항원-결합 분자들
본 발명의 상기 항체들은 이중특이적 또는 다중 특이적 항체일 수 있다. 다중 특이적 항체는 하나의 표적 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 특이적이거나, 또는 하나 또는 그 이상의 표적 폴리펩티드에 특이적인 항원-결합 도메인을 함유할 수 있다. 가령, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244 참고. 본 발명의 항-CD3xCD20 항체는 또다른 펩티드 또는 단백질과 같은 또다른 기능성 분자와 연결되거나 또는 공동 발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 다른 항체 또는 항체 단편과 같은 하나 이상의 다른 분자 실체에 기능적으로 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전 융합, 비공유 결합 또는 다른 방식으로) 연결되어, 부가적인 결합 특이성을 갖는 이중특이적 또는 다중 특이적 항체를 만들 수 있다.
따라서, 본 발명은 면역글로불린의 한 아암은 인간 CD3에 결합하고, 면역글로불린의 다른 아암은 표적 항원에 특이적인 이중특이적 항체를 포함한다. CD3 이중 특이성 항체의 다른 아암이 결합하는 표적 항원은 표적화된 면역 반응이 요구되는 세포, 조직, 기관, 미생물 또는 바이러스 상에 또는 그 부근에서 발현되는 임의의 항원일 수 있다. CD3-결합 아암은 본원의 표 1에 기재된 바와 같은 임의의 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항체의 한 아암은 CD3에 결합하고, 다른 아암은 표적 항원에 결합하는 본 발명의 이중특이적 항체와 관련하여, 표적 항원은 종양-관련 항원일 수 있다. 특이적 종양-연합된 항원들의 비-제한적 예들은 다음을 포함한다: 가령, AFP, ALK, BAGE 단백질, BIRC5 (설비빈), BIRC7, β-카테닌, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, 탄산 탈수효소 IX, 카스파제-8, CALR, CCR5, CD19, CD20(MS4A1), CD22, CD30, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, 시클린-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvIII, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra-1, FOLR1, GAGE 단백질 (가령, GAGE-1,-2), GD2, GD3, GloboH, 글리피칸-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, MAGE 단백질 (가령, MAGE-1,-2,-3,-4,-6, 및-12), MART-1, 메소텔린, ML-IAP, Muc1, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA (FOLH1), RAGE 단백질, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, Thompson-nouvelle 항원 (Tn), TRP-1, TRP-2, 티로시나제, 및 우로플라킨-3.
항체의 한 아암은 CD3에 결합하고, 다른 아암은 표적 항원에 결합하는 본 발명의 이중특이적 항체와 관련하여, 표적 항원은 감염 질환-관련 항원일 수 있다. 감염 질환-연합된 항원들의 비-제한적 실시예는 다음을 포함한다: 가령, 바이러스 입자의 표면 상에 발현되거나 또는 바이러스에 감염된 세포 상에 우선적으로 발현되는 항원으로서, 이때 상기 바이러스는 HIV, 간염 (A, B 또는 C형 간염), 헤르페스 바이러스 (가령, HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, 입스타인 바르 바이러스), 아데노 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 라이노바이러스, 코크삭키 바이러스, 코로나 바이러스, 호흡기 융합 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스 , 풍진 바이러스, 파보바이러스, 우두바이러스, HTLV, 뎅기 바이러스, 유두종 바이러스, 연체동물 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스 성 뇌염 바이러스로 구성된 군에서 선택된다. 대안으로, 상기 표적 항원은 박테리아의 표면 상에 발현되거나 또는 박테리아에 감염된 세포 상에 우선적으로 발현되는 항원일 수 있으며, 이때 상기 박테리아는 클라미디아, 리케차, 마이코박테리아, 포도상구균, 스트렙토코커스, 폐렴구균, 수막염구균, 임균, 클렙시엘라, 프로테우스, 세라시아, 슈도모나스, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라, 바실리, 콜레라, 파상풍, 보틀리누스, 탄저병, 역병, 렙토스피라 및 라임 병 세균으로 구성된 군에서 선택된다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 표적 항원은 곰팡이 표면에서 발현되는 항원, 또는 곰팡이로 감염된 세포에서 우선적으로 발현되는 항원이며, 이때 곰팡이는 칸디다(알비칸, 쿠르세이, 글라브라타, 트로피칼리스, 등), 크립토코코스 네오포르만스, 아스퍼길러스 (푸미가투스, 나이거, 등), 무코랄레스 (무코르, 아비시디아, 리조푸스, 등), 스포로트릭스 쉰키, 블라스토미세스 데르마티티디스, 파라코시디오이데스 브라실리렌시스, 코코디오이데스 이미티스, 및 히스토플라스마 캅술라툼으로 구성된 군에서 선택된다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 표적 항원은 기생충의 표면에서 발현되거나 또는 기생충에 감염된 세포에서 우선적으로 발현되는 항원이며, 이때 상기 기생충은 엔타모에바 히스틸리카, 발란티디움 콜리, 나에글레리아포우레리, 아칸타모에바 종, 기아르디아 람비아, 크립토스포리디움 종, 뉴모시스티스 카리니, 플라스모디움 비박스, 바베시아 미크로티, 트립파노소마 부루세이, 트립파노소마 쿠루지, 레이쉬마니아 도노바니, 톡소플라스마 곤디, 니포스트롱리우스 부라실렌시스, 테아니아 크라시셉스, 및 부르기아 말라이로 구성된 군에서 선택된다. 특이적 병원체-연합된 항원들의 비-제한적 실시예는 가령, HIV gp120, HIV CD4, B형 간염 당단백질 L, B형 간염 당단백질 M, B형 간염 당단백질 S, C형 간염 E1, C형 간염 E2, 간세포-특이적 단백질, 헤르페스 단순 바이러스 gB, 사이토메갈로바이러스 gB, 및 HTLV 외피 단백질을 포함한다.
특정 예시적인 구체예들에 있어서, 본 발명은 CD3과 CD20에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자들을 포함한다. 이러한 분자들은 본원에서 가령, ＂항-CD3/항-CD20＂, 또는 ＂항-CD3/CD20＂, 또는 ＂항-CD3xCD20＂ 또는 ＂CD3xCD20＂ 이중특이적 분자들, 또는 다른 유사한 용어로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, ＂항원-결합 분자＂란 표현은 최소한 하나의 상보성 결정 영역 (CDR) 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 추가적인 CDRs 및/또는 틀구조영역들 (FRs)과 복합된 것을 포함하거나 또는 이로 구성된 단백질, 폴리펩티드 또는 분자 복합체가 특정 항원에 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다. 특정 구체예들에 있어서, 항원-결합 분자는 본원의 도처에서 정의된 바와 같이 항체 또는 항체의 단편이다.
본원에서 사용된 바와 같이, ＂이중특이적 항원-결합 분자＂란 표현은 최소한 제 1 항원-결합 도메인과 제 2 항원-결합 도메인을 포함하는 단백질, 폴리펩티드 또는 분자 복합체를 의미한다. 이중특이적 항원-결합 분자 내의 각각의 항원-결합 도메인은 단독으로 또는 하나 또는 그 이상의 추가 CDR 및/또는 FRs와 조합된 최소한 하나의 CDR을 포함하고, 특정 항원에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 내용에 있어서, 상기 제 1 항원-결합 도메인은 제 1 항원 (가령, CD3)에 특이적으로 결합하고, 상기 제 2 항원-결합 도메인은 제 2의, 구별되는 항원 (가령, CD20)에 결합한다.
본 발명의 특정 예시적인 구체예에 있어서, 상기 이중특이적 항원-결합 분자는 이중특이적 항체다. 이중특이적 항체의 각 항원-결합 도메인은 중쇄 가변 도메인 (HCVR) 및 경쇄 가변 도메인 (LCVR)을 포함한다. 제 1 및 제 2 항원-결합 도메인 (가령, 이중특이적 항체)을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자에 있어서, 상기 제 1 항원-결합 도메인의 CDRs는 접두어 ＂A1＂로 지정되고, 상기 제 2 항원-결합 도메인의 CDRs는 접두어 ＂A2＂로 지정될 수 있다. 따라서, 본원에서 상기 제 1 항원-결합 도메인의 CDRs는 A1-HCDR1, A1-HCDR2, 및 A1-HCDR3로 지칭될 수 있으며; 그리고 상기 제 2 항원-결합 도메인의 CDRs는 A2-HCDR1, A2-HCDR2, 및 A2-HCDR3로 지칭될 수 있다.
상기 제 1 항원-결합 도메인과 상기 제 2 항원-결합 도메인은 서로 직접 또는 간접적으로 연결되어, Fc 도메인에 추가 결합된 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자 (가령, 이중특이적 ScFv)를 만들 수 있다. 대안으로, 상기 제 1 항원-결합 도메인과 상기 제 2 항원-결합 도메인은 각각 별도의 Fc 도메인에 연결될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자들은 별도의 항체 중쇄의 각 개별적 부위인 2개의 Fc 도메인을 포함할 것이다. 상기 제 1 및 제 2 Fc 도메인들은 이종이량체(가령, 이중특이적) 분자들의 정제 실시 또는 용이성을 위하여 의도된 상기 CH3 도메인 안의 돌연변이를 제외하고, 동일한 서열일 수 있다.
본 발명은 제 1 CH3 도메인과 제 2 Ig CH3 도메인이 포함된 이중특이적 항원-결합 분자들을 포함하는데, 이때 상기 제 1 및 제 2 Ig CH3 도메인들은 서로 최소한 하나의 아미노산에 의해 상이하며, 이때 최소한 하나의 아미노산 차이는 이러한 아미노산 차이가 없는 이중-특이적 항체와 비교하였을 때, 단백질 A에 대한 상이 이중특이적 항체의 결합을 감소시킨다. 한 구체예에 있어서, 상기 제 1 Ig CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고, 상기 제 2 Ig CH3 도메인은 단백질 A 결합을 감소 또는 없애는 돌연변이, 이를 테면 H435R 변형 (EU 넘버링; IMGT 엑손 넘버링에 따르면 H95R)을 포함한다. 상기 제 2 CH3은 Y436F 변형 (EU 넘버링; IMGT에 따르면 Y96F )을 더 포함할 수 있다. 상기 제 2 CH3 안에서 볼 수 있는 추가 변형은 다음을 포함한다: IgG1 CH3 도메인들의 경우, D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, 및 V422I(EU에 따름)(IMGT에 따르면 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, 및 V82I); 그리고 IgG4 CH3 도메인들의 경우 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, 및 V422I(EU에 따름) (IMGT에 따르면, Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, 및 V82I).
다른 이중특이적 항체 포맷 또는 기술이 본 발명의 이중특이적항원-결합 분자를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 제 1 항원 결합 특이성을 갖는 다른 항체 또는 그의 단편은 하나 이상의 다른 분자 실체, 예를 들어 제 2 항원-결합 항체를 갖는 다른 항체 또는 항체 단편에 기능적으로 (예를 들어, 화학적 결합, 유전자 융합, 비공유 결합 또는 다른 방식으로)연결되어, 이중특이적 항원-결합 분자를 만들 수 있다. 본 발명의 내용에서 이용될 수 있는 특이적 예시적인 이중특이적 형태는 가령, scFv-기반된 또는 다이바디 이중특이적 형태, IgG-scFv 융합, 이중 가변 도메인 (DVD)-Ig, Quadroma, 노브-인투-홀(knobs-into-holes), 공통의 경쇄 (가령, 노브-인투-홀을 가진 공통의 경쇄, 등), CrossMab, CrossFab, (SEED)바디, 류신 지퍼, Duobod, IgG1/IgG2, 이중 작용 Fab (DAF)-IgG, 및 Mab2 이중특이적 형태 (가령, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, 및 전술한 형태에 대한 검토용으로 본원에서 언급된 참고자료 참고)를 포함하나, 이에 국한되지는 않는다.
본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자들에서, 상기 Fc 도메인들은 원하는 기능의 변화 없이, Fc 도메인의 명시된 키메라 버젼과 비교하였을 때, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변화(가령, 삽입, 결손 또는 치환)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 Fc 도메인 안에 하나 또는 그 이상의 변형을 포함하여, Fc와 FcRn 사이에 변형된 결합 상호작용 (가령, 강화된 또는 감소된)을 갖는 변형된 Fc 도메인을 갖게 되는 이중특이적 항원-결합 분자들을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 상기 이중특이적 항원-결합 분자는 CH2 또는 CH3 영역 안에 변형을 포함하는데, 이때 상기 변형은 산성 환경(가령, pH 범위가 약 5.5 내지 약 6.0인 엔도좀 안에서)에서 상기 Fc 도메인이 FcRn에 대한 친화력을 증가시킨다. 이러한 Fc 변형의 비-제한적 예로는 가령, 위치 250 (가령, E 또는 Q); 위치 250 및 428 (가령, L 또는 F); 위치 252 (가령, L/Y/F/W 또는 T), 254 (가령, S 또는 T), 및 256 (가령, S/R/Q/E/D 또는 T)에서 변형; 또는 위치 428 및/또는 위치 433 (가령, L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 위치 434 (가령, H/F 또는 Y); 또는 위치 250 및/또는 428에서 변형; 또는 위치 307 또는 308 (가령, 308F, V308F), 및 위치 434에서 변형을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 상기 변형은 428L (가령, M428L) 및 434S (가령, N434S) 변형; 428L, 259I (가령, V259I), 및 308F (가령, V308F) 변형; 433K (가령, H433K) 및 434 (가령, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256 (가령, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형 (가령, T250Q 및 M428L); 그리고 307 및/또는 308 변형 (가령, 308F 또는 308P)을 포함한다.
서열 변이체들
본 발명의 상기 항체들 및 이중특이적 항원-결합 분자들은 개별 항원-결합 도메인들이 유도된 대응하는 생식 세포들과 비교하였을 때, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 골격 및/또는 CDR 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는 본원에 개시된 아미노산 서열을 예를 들어, 항체 서열 공공 데이터베이스로부터 이용가능한 배아 줄기 서열과 비교함으로써, 용이하게 확인할 수 있다. 본 발명의 상기 항원-결합 분자들은 본 명세서에서 개시된 임의의 예시적인 아미노산 서열들로부터 유도된 항원-결합 도메인들을 포함할 수 있는데, 이때 하나 이상의 골격 및/또는 CDR 영역 내의 하나 또는 그 이상의 아미노산이 이 항체가 유도된 생식계 서열의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이되거나, 또다른 인간 생식계 서열의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이되거나, 또는 상응하는 생식계 잔기들의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이된다 (이러한 서열 변화는 본원에서 집합적으로 ＂생식세포 돌연변이＂라고 칭한다). 당업자는 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로 시작하여, 하나 또는 그 이상의 개별적인 생식 세포 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 항체 및 항원-결합 단편을 용이하게 생산할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, V H 및/또는 V L 도메인들 안에 모든 골격 및/또는 CDR 잔기는 이 항원-결합 도메인이 유래된 원래의 생식 세포계 서열에서 발견되는 잔기로 다시 돌연변이된다. 다른 구체예들에 있어서, 특정 잔기들만이 원래의 생식 세포계 서열로 돌연변이되는데, 예를 들어 FR1의 처음 8 개 아미노산 또는 FR4의 마지막 8 개 아미노산 내에서 발견된 돌연변이 잔기들, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 발견된 돌연변이된 잔기들이다. 다른 구체예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 틀구조 및/또는 CDR 잔기 (들)은 상이한 생식세포 서열 (즉, 상기 항원-결합 도메인이 최초 유도된 생식세포 서열과는 상이한 생식세포 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 더욱이, 상기 항원-결합 도메인들은 틀구조 및/또는 CDR 영역 내에 2 개 또는 그 이상의 생식선 돌연변이의 임의의 조합을 포함할 수 있는데, 예를 들어 특정 개별 잔기는 특정 생식세포 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 반면, 원래의 생식세포 서열과는 상이한 특정 다른 잔기들은 유지되거나 또는 상이한 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이된다. 일단 수득되면, 하나 또는 그 이상의 생식세포 돌연변이를 포함하는 항원-결합 도메인들은 결합 특이성의 개선, 결합 친화력의 증가, 길항 또는 항진적(경우에 따라) 생물학적 특성의 개선 또는 강화, 면역원성의 감소 등에 대하여 용이하게 테스트될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 수득된 하나 또는 그 이상의 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자들은 본 발명에 포함된다.
본 발명은 항원-결합 분자들을 또한 포함하는데. 이때 하나의또는 이둘 모두의 항원-결합 도메인들은 하나 또는 그 이상의 보존적 치환을 갖는 본원에 개시된 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열의 변이체를 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열과 비교하여 가령, 10 개 이하, 8 개 이하, 6 개 이하 또는 4 개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항원-결합 도메인이 포함된 항원-결합 분자들을 포함한다. ＂보존적 아미노산 치환＂은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질 (가령, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 (R 기)를 갖는 또다른 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 성질을 갖는 측쇄를 갖는 아미노 그룹의 예는 (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소 루신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드 함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르 테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 황 함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는 다음과 같다: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산 염-아스파테이트 및 아스파라긴-글루타민. 대안으로, 보존적 치환은 Gonnet et al.,(1992) Science 256: 1443-1445에 개시된 PAM250 로그-유사 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. ＂적당히 보수적 인＂ 대체는 PAM250 로그-유사 매트릭스에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
폴리펩티드에 대한 서열 유사성 (또한 서열 동일성이라고도 함)은 일반적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정될 수 있다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 비롯한 다양한 치환, 결실 및 기타 변형에 할당된 유사성 측정을 사용하여 유사한 서열을 연결시킨다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는 상이한 생물 종의 동종 폴리펩티드 또는 야생형 단백질과 그의 뮤테인 사이에 동동 폴리펩티드와 밀접하게 관련된 폴리펩티드 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위해, 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있는 Gap 및 Bestfit과 같은 프로그램을 포함한다. 가령, GCG Version 6.1 참고. 폴리펩티드 서열은 GCG 버전 6.1의 프로그램에서 디폴트 또는 권장 매개변수들과 함께 FASTA를 사용하여 또한 비교할 수 있다. FASTA (가령, FASTA2 및 FASTA3)는 문의 서열과 검색 서열 사이의 최상의 중첩 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다 (Pearson (2000) supra). 상이한 유기체로부터의 다수의 서열을 함유하는 데이터베이스에 본 발명의 서열을 비교할 때, 또다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 매개변수들을 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 가령, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 및 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402 참고.
pH-의존적 결합
본 발명은 pH-의존적 결합 특징들을 가진 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항체들을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 항-CD3 항체는 중성 pH와 비교하였을 때, 산성 pH에 대하여 감소된 결합을 나타낼 수 있다. 대안으로, 본 발명의 항-CD3 항체들은 중성 pH와 비교하였을 때, 산성 pH에 대하여 강화된 결합을 나타낼 수 있다. ＂산성 pH＂란 약 6.2 미만의 pH 값, 가령, 약 6.0, 5.95, 5,9, 5.85, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5, 5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0, 또는 그 미만을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, ＂중성 pH＂란 표현은 약 7.0 내지 약 7.4의 pH를 의미한다. ＂중성 pH＂는 약 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35, 및 7.4의 pH 값을 포함한다.
특정 경우들에 있어서, ＂중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 ...감소된 결합＂이란 중성 pH에서 상기 항체가 이의 항원에 결합하는 KD 값에 대하여 산성 pH에서 상기 항체가 이의 항원에 결합하는 KD 값의 비율 (또는 이의 역)으로 표현된다. 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 산성/중성 KD 비율이 약 3.0 또는 그 이상인 경우, 본 발명의 목적을 위하여, 중성 pH와 비교하였을 때 산성 pH에서 CD3에 대하여 감소된 결합을 나타낼 수 있다. 특정 예시적인 구체예들에 있어서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 산성/중성 KD 비율은 약 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 20.0. 25.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 100.0 또는 그 이상일 수 있다.
pH-의존적 결합 특징들을 갖는 항체들은 중성 pH와 비교하였을 때, 산성 pH에서 특정 항원에 감소된(또는 강화된) 결합을 나타내는 항체들의 집단을 스크리닝함으로써, 획득될 수 있다. 추가적으로, 상기 항원-결합 도메인의 변형은 pH-의존적 특징들을 가진 항체들을 만들 수 있다. 예를 들면, 항원-결합 도메인 (가령, CDR 안에)의 하나 또는 그 이상의 아미노산을 히스티딘 잔기로 치환함으로써, 중성 pH와 비교하였을 때 산성 pH에서 항원-결합이 감소된 항체가 획득될 수 있다.
Fc 수용체 결합
키메라 Fc 도메인, 이를 테면 상이한 IgG 아이소타입들으로부터 유도된, Ig 중쇄의 힌지-CH2-CH3 불변 도메인을 포함하고, 그리고 Fc 수용체 결합 및 활성화에 있어서 독특한 특징들을 가진 본 발명의 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자들 및 항체들이 제공된다. 본 발명의 특정 Fc 도메인들은 키메라 힌지가 포함되도록 작제된다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 ＂키메라＂는 상이한 기원의 부분들로 구성된다는 것을 의미한다. 구절 ＂키메라 단백질＂은 현실적으로 보통 연결되지 않는, 제 2 아미노산 단백질에 연결된 제 1 아미노산 단백질을 포함한다. 상기 아미노산 서열들은 별도의 단백질로 존재하거나, 또는 동일한 단백질 상에 상이한 배열로 존재하고, 그리고 이들이 함께 새로운 배열의 융합 폴리펩티드가된다. 키메라 단백질은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들면, 화학적 합성에 의해, 또는 목적하는 배열로 키메라 단백질의 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 생성함으로써 제조될 수 있다. 예시적인 키메라 단백질은 IgG의 중쇄 도메인들을 연결하는 키메라 힌지 서열들과 본 발명의 상기 인간 항체들 및 항원-결합 단백질을 만들기 위하여 작제된 융합 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 공개된 상기 키메라 단백질은 가령, 야생형 IgG Fc 영역 또는 도메인과 비교하였을 때, 정션(junctions)에서 면역원성 에피토프가 창출되는 것이 최소화되도록 기획되었다. 따라서, 본 발명의 작제된 단백질은 감소된 면역원성, 및 Fc 수용체들에대한 감소된 결합을 나타내고, 뿐만 아니라 이펙터 기능들이 감소되거나 없다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 ＂힌지＂는 면역글로불린의 CH2 도메인의 N-말단에 CH1의 C-말단을 연결시키는 보존적 아미노산 잔기들의 영역을 포함한다. 상기 CH2 엑손에 의해 코드된 CH2 도메인의 N-말단의 몇가지 아미노산들은 ＂하부 힌지＂의 일부분으로 또한 간주된다. 임의의 하나의 이론에 결부되지 않고, IgG1, IgG2 및 IgG4의 힌지 영역의 아미노산들은 구별되는 힌지 엑손에 의해 인코드된 12-15개 연속 아미노산, 그리고 CH2 도메인의 N-말단 몇개의 아미노산들(상기 CH2 엑손에 의해 인코드됨)을 포함하는 것으로 특징화되었다 (Brekke, O.H., et al. Immunology Today 16(2):85-90 (1995)). 한편, IgG3은 4개의 세그먼트(segment)로 구성된 힌지 영역을 포함하는데: 하나의 상부 세그먼트은 IgG1의 힌지 영역과 닮고, 3개의 세그먼트는 IgG3에 고유한 동일한 아미노산 반복들이다.
본원에 사용된 용어 ＂키메라 힌지＂는 하나의 Ig 분자의 힌지 영역으로부터 유래된 제 1 아미노산 서열과 상이한 Ig 분자 클래스 또는 서브클래스의 힌지 영역으로부터 유래된 제 2 아미노산 서열을 포함하는 키메라 단백질을 포함하도록 의도된다. 본 발명의 예시적인 키메라 힌지는 인간 IgG1 힌지 영역 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유도된 제 1 아미노산 서열, 또는 ＂상부 힌지＂ 서열, 그리고 인간 IgG2 힌지 영역로부터 유도된 제 2 아미노산 서열, 또는 ＂하부 힌지＂ 서열을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 제 1 또는 ＂상부 힌지＂ 서열은 EU 넘버링에 따라 위치 216에서 227까지의 아미노산 잔기들을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 제 2 또는 ＂하부 힌지＂ 서열은 EU 넘버링에 따라 위치 228에서 236까지의 아미노산 잔기들을 포함한다.
본 내용의 목적을 위하여, ＂상부 힌지＂ 영역은 EU 넘버링에 따라 위치 216에서 227까지의 아미노산 잔기를 포함한다(Kabat 넘버링에 따르면 위치 226에서 240까지의 아미노산 잔기) (도 1 참고). ＂하부 힌지＂ 영역은 EU 넘버링에 따라 위치 228에서 236까지의 아미노산 잔기를 포함한다(Kabat 넘버링에 따르면 위치 241에서 249까지의 아미노산 잔기) (도 1 참고).
본 발명의 실시자의 편의를 위하여 본원에서, 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4의 힌지 영역의 아미노산은 Kabat의 EU 넘버링 시스템에 의해 식별되었다(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological interest. 5th ed. US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242 (1991)), IMGT® Scientific Chart, IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®, http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html, created: 17 May 2001, last updated:10 Jan 2013에 따라 최근에 업데이트된 ＂EU 넘버링＂ 또는 ＂EU 색인＂으로도 또한 공지됨.
인간 IgG1, IgG2 및 IgG4 힌지 아미노산의 EU 넘버링과 IMGT 독특한 도메인 넘버링, IMGT 엑손 넘버링, 및 Kabat 넘버링 관례 (Kabat, E.A. et al., 1991, supra 또한 참고)의 관련성이 다음의 표 A에서 F에서 설명된다:
표 A: IgG1 힌지 넘버링
Figure 112017063914847-pct00002
표 B: IgG1 C-도메인 힌지 넘버링
Figure 112017063914847-pct00003
표 C: IgG2 힌지 넘버링
Figure 112017063914847-pct00004
표 D: IgG2 C-도메인 힌지 넘버링
Figure 112017063914847-pct00005
표 E: IgG4 힌지 넘버링
Figure 112017063914847-pct00006
표 F: IgG4 C-도메인 힌지 넘버링
Figure 112017063914847-pct00007
항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유하는 단백질이, 가령, 예정된 항원 또는 FcγR에 결합 문맥에 있어서 용어 ＂결합＂은 전형적으로 최소 2개의 실체, 또는 분자 구조 간의 상호작용 또는 연합, 이를 테면 항체-항원 상호작용, 또는 Fc-함유하는 단백질이 FcγR에 대한 상호작용 또는 연합을 말한다.
상기 항원 또는 FcR을 리간드로 사용하고, 상기 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유하는 단백질을 피분석물 (또는 항리간드)로 이용하여 BIAcore 3000 기구에서 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술에 의해 측정되었을 때, 예를 들면, 결합 친화력은 전형적으로 약 10-7 M 또는 그 미만, 이를 테면 약 10-8 M 또는 그 미만, 이를 테면 약 10-9 M 또는 그 미만의 KD에 상응한다. 따라서, 상기 항체 또는 다른 결합 단백질은 비-특이적 항원 (가령, BSA, 카제인)에 결합을 위한 이의 친화력보다 최소한 10-배 낮은, 이를 테면 최소한 100 배 낮은, 예를 들면 최소한 1,000 배 낮은, 이를 테면 최소한 10,000 배 낮은, 예를 들면 최소한 100,000 배 낮은 KD 값에 대응하는 친화력으로 예정된 항원 또는 수용체에 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 ＂KD＂ (M)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 지수, 또는 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유하는 단백질이 FcγR에 대한 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유하는 단백질의 해리 평형 지수를 지칭한다. 따라서, KD와 결합 친화력은 역관계에 있으며, KD 값이 작을수록 친화력은 더 높다 (가령, 더 강하다). 따라서, 용어 ＂더 높은 친화력＂ 또는 ＂더 강한 친화력＂이란 상호작용을 형성하는 더 높은 능력과 관계하며, 따라서 KD 값은 더 작고, 그리고 역으로 용어 ＂더 낮은 친화력＂ 또는 ＂더 약한 친화력＂이란 상호작용을 형성하는 능력이 더 낮고, 따라서 KD 값은 더 크다. 일부 경우들에 있어서, 상기 분자 (가령, 항체)가 다른 상호작용 파트너 분자 (가령, 수용체 Y)에 대한 결합 친화력과 비교하였을 때, 특정 분자 (가령, 항체)가 이의 상호작용 파트너 분자 (가령, 수용체 X)에 대하여 더 높은 결합 친화력 (또는 KD)은 더 큰 KD 값 (더 낮은, 또는 더 약한, 친화력)을 더 작은 KD (더 높은, 또는 더 강한, 친화력)으로 나누어서 결정된 결합 비율로 표현될 수 있는데, 예를 들면 이 경우에서 5-배 또는 10-배 더 큰 결합 친화력으로 표현될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 ＂kd＂ (sec-1 또는 1/s)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 지수, 또는 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유하는 단백질이 FcγR에 대한 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유하는 단백질의 해리 속도 지수를 지칭한다. 전술한 값은 또한 koff 값으로도 불린다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 ＂ka＂ (M-1 x sec-1 또는 1/M)는 특정 항체-항원 상호작용의 연합 속도 지수, 또는 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유하는 단백질이 FcγR에 대한 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유하는 단백질의 연합 속도 지수를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, ＂KA＂ (M-1 또는 1/M)는 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 ＂KD＂ (M)는 특정 항체-항원 상호작용의 연합 평형 지수, 또는 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유하는 단백질이 FcγR에 대한 항체, Ig, 항체-결합 단편, 또는 Fc-함유하는 단백질의 연합 평형 지수를 지칭한다. 상기 연합 평형 상수는 ka를 kd로 나누면 얻게된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 ＂EC50＂ 또는 ＂EC50＂는 특정 노출 시간 후 기준치와 최대치의 중간에서 반응을 유도하는 항체의 농도가 포함된, 최대 효과 농도의 절반을 말한다. 상기 EC50는 본질적으로 최대 효과의 50 %가 관찰되는 항체의 농도를 말한다. 따라서, 감소된 결합은 증가된 EC50 또는 최대 유효 농도 값의 절반으로 관찰된다.
한 구체예에 있어서, 감소된 결합은 표적 세포의 최대 양의 절반에 결합할 수 있는 증가된 EC50 항체 농도로서 정의될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 감소된 세포독성 활성, 이를 테면 ADCC 또는 CDC는 표적 세포의 최대 양의 절반에 용해시킬 수 있는 증가된 EC50 항체 농도로서 정의될 수 있다. 세포 독성은 또한 세포 독성 (%) 또는 칼세틴 방출 분석 또는 동등한 분석에서 용해된 세포의 총 집단의 분율인 용해 퍼센트로서 측정된다. 세포 독성 백분율은 실시예 6에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.
다른 구체예들에 있어서, 감소된 증식은 표적 세포의 최대 양의 절반을 증식시킬 수 있는 증가된 EC50 항체 농도로서 정의될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 구절 ＂이펙터 기능들＂은 FcγR에 결합시 Fc 함유 단백질에 의해 부여된 기능적 능력을 포함하는 것으로 의도된다. 한 가지 임의의 이론에 결부되지 않고, Fc/FcγR 복합체의 형성은 결합된 항원 부위에 다양한 이펙터 세포를 모집하여 전형적으로 세포 내에서 다양한 신호 전달 사건과 중요한 후속 면역 반응을 유도한다.
본 발명의 키메라 Fc-함유하는 항원-결합 단백질 및 항체들은 대응하는 야생형 Fc-함유하는 항원-결합 단백질 또는 항체들과 비교하였을 때, 변경된 또는 감소된 이펙터 기능들을 나타낸다. 가령, 2014년 8월 7일자 공개된 PCT 공고 번호 WO 2014/121087 참고하며, 이는 본원에 전문이 참고자료에 편입된다.
일부 구체예들에 있어서, 감소된 또는 변경된 상기 이펙터 기능은 세포독성 이펙터 기능, 가령, 세포독성, 보체-의존적 세포독성 (CDC), 또는 항체-의존적 세포독성 (ADCC)이다. 한 구체예에 있어서, 감소된 또는 변경된 상기 이펙터 기능은 보체-의존적 세포독성이다. 또다른 구체예에 있어서, 감소된 또는 변경된 상기 이펙터 기능은 항체-의존적 세포독성이다. 다른 구체예들에 있어서, 감소된 또는 변경된 상기 이펙터 기능은 상기 표적 세포들의 세포 증식이다.
몇 가지 항체 이펙터 기능들은 Fc 수용체들 (FcRs)에 의해 최소한 부분적으로 중재되며, 이는 전형적인 면역글로불린의 불변 도메인(특히 CH2 및 CH3 도메인)에서 항체의 Fc 영역에 결합한다. 상이한 부류의 면역글로불린, 가령, IgG, IgE, IgA, IgM, 및 IgD에 특이적인 다수의 Fc 수용체들이 있다. 상기 인간 IgG Fc 수용체 패밀리는 3개 군으로 나뉜다: 높은 친화력으로 IgG에 결합할 수 있는 FcγRI (CD64), 그리고 낮은 친화력 수용체들인 FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16). 각 FcγR 하위부류는 2개 또는 3개 유전자들에 의해 인코드되며, 그리고 교대적 RNA 스플라이싱에 의해 다중 전사체가 되고, 이로 인하여 FcγR 아이소폼에서 광범위한 다양성이 존재한다 (가령, FcγRIA (CD64; FCGR1A), FcγRIB (CD64; FCRG1B), FcγRIIA (CD32A; FCGR2A), FcγRIIB (CD32B; FCGR2B), FcγRIIC (CD32C; FCGR2C), FcγRIIIA (CD16a; FCGR3A), 및 FcγRIIIB (CD16b; FCGR3B)). 추가적으로, FcRn, 또는 신생 Fc 수용체 (Fc 수용체 운반자, 알파, 또는 FCGRT로도 알려짐)는 태반을 통하여 엄마로부터 태아에게 IgG 항체들을 전달할 수 있다. 더욱이, Fc 수용체들은 가령, B 세포들, 단핵구, 수지상 세포들, 호중구, 및 특정 림프구들이 포함된 다양한 세포들에서 발현된다. 예를 들면, U937 세포들, 인간 단핵구 세포 계통은 FcγRI 및 FcγRIIA를 모두 발현시킨다 (가령, Jones, et al. J Immunol 135(5):3348-53 (1985); 그리고 Brooks, et al. J Exp Med 170:1369-85 (October 1989) 참고). 본원에 언급된 각각의 수용체는 전사체 변이체, 아이소폼 및 다형성을 포함하는 임의의 공지된 기능적 형태의 수용체를 포함한다.
Ig Fc가 이의 수용체의 결합으로 이들 이펙터 세포들을 결합된 항원의 부위로 이들 이펙터 세포들을 가져가게 되고, B 세포 활성화, 염증 반응들, 세포독성 반응들, 및 식작용 반응들이 포함된 다양한 신호생성 및 면역 반응들이 궁극적으로 초래된다. 이와 같이, Ig Fc가 이의 수용체에 감소된 또는 변경된 결합으로 이펙터 기능들의 감소가 초래될 수 있다.
구절 ＂항체-의존적 세포의 식작용＂, 또는 ＂ADCP＂는 세포용해를 유도하기 보다는 표적 세포를 집어삼킴으로써, 표적 세포를 제거(또는 사멸)시키는 이펙터 기능과 관련된다. ADCP는 사멸 종양 세포들을 사멸시키기 위한 중요한 생체내 기전일 수 있다. ADCP는 2색 형광 유동 세포분석 방법, 예를 들면 가령, PKH2 (녹색 형광 염료) 및 상기 테스트 세포들을 구별하기 위한 상이한 세포 표면 단백질에 대항하는 피코에리틴-접합된(적색) 단일클론 항체들을 이용하고, 따라서 식작용 활성 및 식작용 비율을 결정함으로써 측정될 수 있다. ADCP 측정은 당분야에 공지되어 있다. FcγRIIb에 비해 FcγRIIa를 선택적으로 활성화시키는 치료 전략은 대식세포의 식작용 활동을 강화시킬 수 있다(Richards, JO, et al. 2008 Mol Cancer Ther 7(8):2517-27). 본 발명의 상기 키메라 Fc-함유하는 항원-결합 단백질 및 항체들은 인간 FcγRIIA에 결합하고, 이를 활성화시킨다. 특정 환경에 있어서, 본 발명의 상기 항원-결합 단백질 및 항체들은 상기 항체들이 FcγRIIB에 결합하는 결합 친화력보다 더 큰 친화력으로 인간 FcγRIIA에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 항체는 인간 FcγRIIB에 대한 이의 KD 결합 친화력보다 약 5-배 이상 더 큰 KD 결합 친화력으로 인간 FcγRIIA에 결합한다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 항체는 인간 FcγRIIB에 대한 이의 KD 결합 친화력보다 약 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 또는 20-배 이상 더 큰 KD 결합 친화력으로 인간 FcγRIIA에 결합한다.
상기 항체들 및 이중특이적 항원-결합 분자들의 생물학적 특징들
본 발명은 인간 CD3과 CD20에 결합하는 항체들 및 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 시험관 결합 분석, 가령, 본원 실시예 3에서 정의된 분석 포멧 (가령, CD3xCD20 항체들에 대한 Jurkat 세포들 또는 Raji 세포들의 결합을 평가함으로써), 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용하여 측정하였을 때, 약 60 nM 미만의 EC50 값으로 Jurkat 세포들 (CD3+) 및 Raji 세포들 (CD20+)에 결합하는 항-CD3xCD20 항체들을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 항체들 또는 항원-결합 단편들은 가령, 본원 실시예 4에서 정의된 분석 포멧 (가령, CD3xCD20 항체들에 대한 Jurkat 세포들 또는 Raji 세포들의 결합을 평가함으로써), 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용하여 측정하였을 때, 약 75 nM 미만, 약 70 nM 미만, 약 65 nM 미만, 약 60 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 40 nM 미만, 약 30 nM 미만, 또는 약 25 nM 미만의 EC50 값으로 세포(가령, Jurkat 세포 및/또는 Raji 세포) 의 표면에서 CD3 또는 CD20에 결합한다.
본 발명은 인간 CD3 및 인간 CD20에 동시에 결합할 수 있는 이중특이적 항원-결합 분자들 (가령, 이중특이적 항체들)을 포함한다. 특정 구체예들에 따르면, 본 발명의 상기 이중특이적 항원-결합 분자들은 CD3 및/또는 CD20을 발현시키는 세포와 특이적으로 상호작용한다. 이중특이적 항원-결합 분자가 CD3 및/또는 CD20을 발현시키는 세포에 결합하는 정도는 본원 실시예 4에서 설명된 바와 같이, 형광 활성화된 세포 소팅 (FACS)에 의해 평가될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 CD3을 발현시키는 인간 T-세포 계통 (가령, Jurkat), CD20을 발현시키는 인간 B-세포 계통 (가령, Raji), 및 영장류 T-세포들 (가령, 시노몰구스 말초혈액 단핵 세포들 [PBMCs])에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자들을 포함한다. 본 발명은실시예 4에서 정의된 FACS 분석 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용하여 측정하였을 때, 약 8.74 x10-6 내지 약 5.99 x10-8, 또는 그 미만의 EC50 값으로 임의의 전술한 세포들 및 세포 계통에 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자들을 포함한다.
본 발명은 인간 CD3에 높은 친화력으로 결합하는 이중특이적 항체들 및 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. 본 발명은 치료요법 내용과 원하는 특정 표적 성질들에 따라, 인간 CD3에 중간 또는 낮은 친화력으로 결합하는 이중특이적 항체들 및 이의 항원-결합 단편들을 또한 포함한다. 예를 들면, 하나의 아암은 CD3에 결합하고, 또다른 아암은 표적 항원 (가령, CD20)에 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자의 내용에 있어서, 표적 항원에 높은 친화력으로 결합하는 항원-결합 아암을 표적으로 하고, 한편 상기 항-CD3 아암은 CD3에 단지 중간 또는 낮은 친화력으로 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방식으로, 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 항원-결합 분자의 특이적 표적화는 일반적인/비표적화된 CD3 결합 및 이로 인한 부작용을 회피함으로써 달성될 수 있다.
본 발명은 인간 CD3에 결합하고, 종양 세포들의 T 세포-중재된 사멸을 유도하는 항체 및 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 본원 실시예 5에서 정의된 분석 포멧 (항-CD3 항체들의 존재하에, 인간 PBMCs에 의한 Raji 세포들의 종양 사멸 정도를 평가함으로써), 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용하여 T 세포-중재된 종양 세포 사멸 시험관 분석에서 측정되었을 때, 약 60 pM 미만의 EC50 값으로 종양 세포들의 T 세포-중재된 사멸을 유도하는 항-CD3xCD20 항체들을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 항체들 또는 항원-결합 단편들은 실시예 5에서 정의된 분석 포멧 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용하여 시험관 T 세포-중재된 종양 세포 사멸 분석에서 측정되었을 때, 약 56 pM 미만, 약 50 pM 미만, 약 45 pM 미만, 약 40 pM 미만, 약 35 pM 미만, 약 30 pM 미만, 약 25 pM 미만, 약 20 pM 미만, 약 15 pM 미만, 약 10 pM 미만, 약 5 pM 미만, 또는 약 1 pM미만의 EC50 값으로 T 세포-중재된 종양 세포 사멸 (가령, Raji 세포들의 PBMC-중재된 사멸)을 유도한다.
본 발명은 야생형 IgG Fc 도메인을 갖는 항체보다 적지만, 인간 CD3/CD20에 결합하고, 보체-의존성 세포 독성 (CDC)을 유도하는 항체 및 그의 항원 결합 단편을 또한 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 본원 실시예 6에서 정의된 분석 포멧 (보체 및 항-CD3xCD20 항체들의 존재하에, 표적 세포 사멸 (Raji 또는 Daudi)들의정도를 평가함으로써), 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용하여 시험관 T 세포-중재된 종양 세포 사멸 분석에서 측정되었을 때, 약 50% 미만의 세포독성 백분율 (세포독성 %)로 Raji 또는 Daudi (CD20-발현시키는) 세포들의 CDC 사멸을 유도하는 항-CD3xCD20 항체들을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 항체들 또는 항원-결합 단편들은 실시예 6에서 정의된 분석 포멧 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용하여 시험관 보체-중재된 세포 사멸 분석에서 측정되었을 때, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 배경 세포독성 미만, 또는 탐지가능한 세포독성이 없이 CDC 세포 사멸 (가령, Raji 또는 Daudi 세포들의 보체-중재된 사멸)을 유도한다.
본 발명은 야생형 IgG Fc 도메인을 갖는 항체와 비교하여 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 (ADCC)을 크게 유도하지 않고 인간 CD3/CD20에 결합하는 항체 및 그의 항원 결합 단편을 또한 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 본원 실시예 7에서 정의된 분석 포멧 (NK 세포들 및 항-CD3xCD20 항체들의 존재하에, 표적 세포 사멸 (Raji 또는 Daudi)의 정도를 평가함으로써), 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용하여 시험관 NK 세포-중재된 세포 사멸 분석에서 측정되었을 때, 약 20% 미만의 (또는 배경 세포독성 미만)의 세포독성 백분율(세포독성 %)로 Raji 또는 Daudi (CD20-발현시키는) 세포들의 인지가능한 사멸이 없는 항-CD3xCD20 항체들을 포함한다. 실질적으로 유사한 분석은 NK 세포들, 대식세포들, 호중구, 호산구 또는 변이체 FcγRIII을 발현시키는 세포가 포함된 FcγRIII-발현시키는 다른 세포들의 존재를 포함할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 항체들 또는 항원-결합 단편들은 실시예 7에서 정의된 분석 포멧 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용하여 시험관 FcγRIII-중재된 세포 사멸 분석에서 측정되었을 때, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 1% 미만, 배경 세포독성 미만의 세포독성 백분율, 또는 탐지가능한 세포독성 활성이 없이, 탐지가능한 ADCC 활성 (가령, Raji 또는 Daudi 세포들의 NK 세포 또는 FcγRIII-중재된 사멸)을 나타내지 않는다.
특정 구체예들에 따르면, 본 발명은 실시예 8에서 정의된 분석 포멧을 이용하여 약 23.5 μM 미만의 KD로 인간 FcγRIIA (가령, 25℃에서)에 결합하는 항체들 및 항체들의 항원-결합 단편들을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 항체들 또는 항원-결합 단편들은 실시예 8에서 정의된 분석 포멧(가령, mAb-포획 또는 항원-포획 포멧), 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용하여 표면 플라스몬 공명에서 측정되었을 때, 약 20.5 μM 미만, 약 20 μM 미만, 약 19.3 μM 미만, 약 18 μM 미만, 약 17 μM 미만, 약 16 μM 미만, 약 15 μM 미만, 약 10 μM 미만, 약 9 μM 미만, 약 8 μM 미만, 약 7 μM 미만, 약 6 μM 미만, 약 5 μM 미만, 약 4 μM 미만, 약 3 μM 미만, 약 2 μM 미만, 약 1 μM 미만, 약 900 nM 미만, 약 800 nM 미만, 또는 약 700 nM 미만의 KD로 FcγRIIA에 결합한다.
특정 구체예들에 따르면, 본 발명은 실시예 8에서 정의된 분석 포멧을 이용하여 약 233 μM 미만의 KD로 인간 FcγRIIB (가령, 25℃에서)에 결합하는 항체들 및 항체들의 항원-결합 단편들을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 항체들 또는 항원-결합 단편들은 실시예 8에서 정의된 분석 포멧(가령, mAb-포획 또는 항원-포획 포멧), 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용하여 표면 플라스몬 공명에서 측정되었을 때, 약 200 μM 미만, 약 190 μM 미만, 약 180 μM 미만, 약 170 μM 미만, 약 160 μM 미만, 약 150 μM 미만, 약 140 μM 미만, 약 130 μM 미만, 약 125 μM 미만, 약 123 μM 미만, 약 120 μM 미만, 약 110 μM 미만, 약 100 μM 미만, 약 90 μM 미만, 약 80 μM 미만, 약 70 μM 미만, 약 60 μM 미만, 약 50 μM 미만, 또는 약 40 μM 미만의 KD로 FcγRIIB에 결합한다.
본 발명은 가령, 실시예 9에서 정의된 분석 포멧, 실질적으로 유사한 분석을 이용하여 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명에서 측정되었을 때, 약 8 일 이상의 해리 반감기(t½)로 CD3xCD20에 결합하는 항체들 및 이의 항원-결합 단편들을 또한 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 항체들은 가령, 본원 명세서 실시예 9에서 정의된 분석 포멧 (가령, mAb-포획 또는 항원-포획 포멧), 또는 실질적으로 유사한 분석을 이용하여, 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정하였을 때, 약 5 일 이상, 6 일 이상, 약 7 일 이상, 약 8 일 이상, 약 9 일 이상, 약 10 일 이상, 약 11 일 이상, 약 12 일 이상, 약 13 일 이상, 약 14 일 이상, 약 15 일 이상, 또는 약 20 일 이상의 t½을 나타낸다.
본 발명은 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 분석에서 실질적으로 활성을 나타내지 않는 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자들을 또한 포함한다 : (a) 시험관내 PBMC 증식 유도; (b) CDC 세포독성 (가령, 본원의 실시예 6 참고); (d) ADCC (가령, 본원의 실시예 7 참고).
본 발명은 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 분석에서 실질적으로 활성을 나타내지 않는 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자들을 또한 포함한다: (a) 시노몰구스 원숭이들에서 B-세포들 (가령, CD45+/CD20+ B-세포들)고갈 (가령, 본원에서 실시예 10 및 11 참고); (b) 면역결핍 마우스 모델에서 B-세포 종양 용적 (가령, Raji 종양 용적) 감소 (가령, 실시예 12A 참고); 그리고 (c) 종양이 확립된 마우스 모델에서 종양의 퇴행 (가령, 실시예 12B).
본 발명은 대상체에서 B 세포를 고갈시킬 수 있는 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자를 포함한다(가령, 실시예 10 참고). 예를 들면, 특정 구체예들에 따르면, 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자들이 제공되는데, 이때 대상체에게 상기 이중특이적 항원-결합 분자의 단일 투여(가령, 약 1 mg/kg, 약 0.9 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 0.7 mg/kg, 약 0.6 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.08 mg/kg, 약 0.06 mg/kg 약 0.04 mg/kg, 약 0.03 mg/kg, 약 0.02 mg/kg, 약 0.01 mg/kg, 또는 그 미만의 용량에서)로 인하여 이 대상체(가령, 이 대상체로부터 취한 혈액 샘플안에)에서 B 세포의 수를 탐지가능한 수준 이하로 감소시키게된다. 특정 구체예들에 있어서, 약 0.1 mg/kg의 용량으로 상기 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자를 단일 투여하면 이 대상체에게 상기 이중특이적 항원-결합 분자를 투여한 후 약 7 일차, 약 6 일차, 약 5 일차, 약 4 일차, 약 3 일차, 약 2 일차, 또는 약 1 일차 후에 탐지가능한 수준 이하로 감소시키게된다. 특정 구체예들에 따르면, 약 0.01 mg/kg의 용량으로 상기 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자를 단일 투여하면, 투여 후 최소한 약 7 일차, 8 일차, 9 일차, 10 일차, 11 일차, 12 일차, 13 일차, 14 일차, 15 일차, 16 일차, 17 일차 또는 그 이상의 시점까지 B-세포의 수를 탐지가능한 수준 이하로 유지하게된다. 본원에서 사용된 바와 같이, ＂탐지가능한 수준 이하＂라는 표현은 본원의 실시예 10에서 제시된 바와 같이, 가령, B-세포 표지자들에 대한 FACS 분석과 같은 표준 B 세포 검출 분석을 사용하여 대상체로부터 추출한 혈액 시료에서 B 세포가 직접 또는 간접적으로 검출되지 않을 수 있음을 의미한다.
대안으로, 단일, 제 1 용량은 낮은 용량, 이를 테면 10 μg, 또는 30 μg, 또는 100 μg에서 투여되며, 그 다음 일정 기간 후, 환자에서 사이토카인 스톰을 방지, 감소 또는 개선시키기 위하여 상기 제 1 용량보다 더 높은, 가령, 2배 또는 3배 더 높은 용량의 제 2 용량이 투여된다. 환자에서 ＂사이토카인 스톰(cytokine storm)＂을 감소시킨다는 것은 사이토카인 캐스캐이드 또는 과다사이토카인증의 영향을 감소시키는 것을 말하며, 이때 이러한 음성 면역 반응은 사이토카인과 백색 혈액 세포들 간에 양성 피드백 루프에 의해, 및/또는 매우 상승된 수준의 다양한 사이토카인에 의해 야기될 수 있다.
본원에서 실시예 20에 따르면, 본 발명의 상기 이중특이적 항원-결합 분자 (가령, Ab 1)의 제 1 (초기) 용량이 투여되고, 후속적으로 일정 기간 후 제 2 용량이 투여되는데, 이때 상기 제 2 용량은 상기 제 1 용량을 초과(더 많은)한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 제 2 용량은 상기 제 1 용량보다 약 2배 이상 또는 약 3배 이상 더 많다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 이중특이적 항원-결합 분자는 연속하여 몇 주동안, 이를 테면 4 주 연속 매주 제 1 용량으로 투여된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 제 1 용량은 추가적인 일정 시간 동안 매월 용량(또는 명시된 수의 매달 투여 분량)이 투여된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 제 1 용량에 대한 명시된 투여 용법 후, 상기 제 2 용량은 추가적인 일정 시간 동안 매월 용량이 투여된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 제 1 (초기) 용량은 10 μg이며, 상기 제 2 용량은 30 μg이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 제 1 (초기) 용량은 30 μg이며, 상기 제 2 용량은 100 μg이다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 제 1 (초기) 용량은 100 μg이며, 상기 제 2 용량은 300 μg이다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 제 1 (초기) 용량은 300 μg이며, 상기 제 2 용량은 100 μg이다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 제 1 (초기) 용량은 1000 μg이며, 상기 제 2 용량은 2000 μg이다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 제 1 (초기) 용량은 2000 μg이며, 상기 제 2 용량은 3000 μg이다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 제 1 (초기) 용량은 3000 μg이며, 상기 제 2 용량은 4000 μg이다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 제 1 (초기) 용량은 4000 μg이며, 상기 제 2 용량은 5000 μg이다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 제 1 (초기) 용량은 5000 μg이며, 상기 제 2 용량은 6000 μg이다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 제 1 (초기) 용량은 6000 μg이며, 상기 제 2 용량은 7000 μg이다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 제 1 (초기) 용량은 7000 μg이며, 상기 제 2 용량은 8000 μg이다.
본 발명은 대상체에게 투여되었을 때 단지 T 세포의 일시적인 감소만 야기하는 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자들을 또한 제공한다. 예를 들면, 약 0.01 mg/kg, 또는 약 0.1 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg의 용량으로 대상체에게 투여되었을 때, 투여 후 1일차에 T 세포 수를 감소시키는 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자들이 제공되며, 그러나 이때 혈액 마이크로리터당 T 세포의 수는 그 이후 (가령, 투여 후 약 2 일차, 4 일차, 7 일차, 14 일차, 28 일차 또는 그 이후) 시점에서 다시 상승된다. 예를 들면 본 발명은 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자를 제공하는데, 이때 약 0.01 mg/kg 또는 약 0.1 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg의 용량으로 대상체에게 상기 항원 결합 분자를 투여 한 후 약 4일차 내지 약 7일차에 상기 대상체로부터 뽑은 혈액의 마이크로리터당 T 세포의 수는 본원 실시예 10에서 제시된 표준 T-세포 탐지 분석, 가령, T-세포 표지자들에 대한 FACS 분석에 의해 탐지될 때, 상기 이중특이적 항원-결합 분자의 투여 전 상기 대상체에서 뽑아낸 혈액의 마이크로리터당 T-세포 수와 동일하거나 그 보다 많다.
에피토프 메핑 및 관련 기술
본 발명의 상기 항원-결합 분자들이 결합하는 CD3 또는 CD20의 에피토프는 CD3 단백질의 3개 또는 그 이상 (가령, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상) 아미노산의 단일 연속 서열로 구성될 수 있다. 대안으로, 상기 에피토프는 CD3 또는 CD20의 다수의 비-연속 아미노산 (또는 아미노산 서열들)로 구성될 수 있다. 본 발명의 항체들은 단일 CD3 쇄 안에 포함된 아미노산 (가령, CD3-엡실론, CD3-델타 또는 CD3-감마)과 반응할 수 있거나, 또는 2개 또는 그 이상의 상이한 CD3 쇄와 반응할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, ＂에피토프＂라는 용어는 파라토프 (paratope)로 알려진 항체 분자의 가변 영역에서 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원 결정기를 의미한다. 단일 항원은 하나 또는 그 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원상의 상이한 영역에 결합할 수 있고, 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 입체형태(conformational) 또는 선형일 수 있다. 입체형태 에피토프는 선형 폴리펩티드 사슬의 상이한 세그먼트로부터 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생성된다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 사슬의 인접한 아미노산 잔기들에 의해 생성된다. 특정 환경에서, 에피토프는 이 항원 상에 사카라이드, 포스포릴기 또는 설포닐기의 모이어티를 포함할 수 있다.
당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 항체의 항원-결합 도메인이 폴리펩티드 또는 단백질 내의 ＂하나 이상의 아미노산과 상호 작용하는지＂ 여부를 결정할 수 있다. 예시적인 기술은 가령, 통상적인 교차-차단 분석, 이를 테면 Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)에서 설명된 통상적인 교차-차단 분석, 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩티드 블랏 분석 (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), 및 펩티드 절단 분석을 포함한다. 추가로, 이를 테면 에피토프 절개, 에피토프 추출 및 항원들의 화학적 변형과 같은 방법들이 이용될 수 있다 (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). 항체의 항원-결합 도메인이 상호 작용하는 폴리펩티드 내의 아미노산을 확인하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분광법에 의해 검출된 수소/중수소 교환이다. 일반적으로, 수소/중수소 교환 방법은 관심 단백질을 중수소-라벨링하고, 이어서 항체를 중수소-라벨된 단백질에 결합시키는 것을 포함한다. 다음으로, 단백질/항체 복합체는 물로 옮겨짐으로써 수소-중수소 교환이 항체에 의해 보호되는 잔기 (중수소-라벨된 상태를 유지)를 제외한 모든 잔기에서 일어난다. 항체가 해리된 후, 표적 단백질은 프로테아제 분해 및 질량 분광 분석을 거쳐서, 항체와 상호 작용하는 특정 아미노산에 해당하는 중수소-라벨된 잔기가 드러난다. 가령, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem . 73:256A-265A 참고. 항원/항체 복합체의 X-선 결정학은 또한 에피토프 매핑 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 본 명세서에서 설명된 임의의 특이적 예시적인 항체들과 동일한 에피토프에 결합하는 항-CD3 항체들을 더 포함한다(가령, 본원의 표 1에서 제시한 임의의 아미노산을 포함하는 항체들). 유사하게, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 임의의 특이적 예시적인 항체들과 함께 CD3에 결합하는 것을 경쟁하는 항-CD3 항체들을 더 포함한다(가령, 본원의 표 1에서 제시한 임의의 아미노산을 포함하는 항체들).
본 발명은 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원-결합 도메인, 그리고 인간 CD20에 특이적으로 결합하는 제 2 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자들을 또한 포함하는데, 이때 상기 제 1 항원-결합 도메인은 CD3 상에서 본 명세서에서 설명된 특이적 예시적인 CD3-특이적 항원-결합 도메인들과 동일한 에피토프에 결합하고, 및/또는 이때 상기 제 2 항원-결합 도메인은 CD20 상에서 본 명세서에서 설명된 특이적 예시적인 CD20-특이적 항원-결합 도메인들과 동일한 에피토프에 결합한다.
유사하게, 본 발명은 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 제 1 항원-결합 도메인, 그리고 인간 CD20에 특이적으로 결합하는 제 2 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자들을 또한 포함하는데, 이때 상기 제 1 항원-결합 도메인은 본 명세서에서 설명된 특이적 예시적인 CD3-특이적 항원-결합 도메인들과 CD3에 결합하는 것을 경쟁하고, 및/또는 이때 상기 제 2 항원-결합 도메인은 본 명세서에서 설명된 특이적 예시적인 CD20-특이적 항원-결합 도메인들과 CD20에 결합하는 것을 경정한다.
공지된 일상적인 방법을 사용하여, 특정 항원-결합 분자 (가령, 항체) 또는 그의 항원-결합 도메인이 본 발명의 기준 항원-결합 분자와 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 결합을 위해 경쟁하는지 여부를 용이하게 결정할 수 있다 예를 들면, 시험 항체가 본 발명의 기준 이중특이적 항원 결합 분자로서 CD3 (또는 CD20)상의 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 기준 이중특이적 분자를 먼저 CD3 단백질 (또는 CD20 단백질)에 결합되도록 한다. 다음으로, 시험 항체가 CD3 (또는 CD20) 분자에 결합하는 능력을 평가한다. 기준 이중특이적 항원 결합 분자와의 포화 결합 후에, 시험 항체가 CD3 (또는 CD20)에 결합할 수 있다면, 시험 항체는 기준 이중 특이 항원과는 상이한 CD3 (또는 CD20)에 결합한다는 결론을 내릴 수 있다. 반면, 기준 이중특이적 항원 결합 분자와의 포화 결합 후에, 시험 항체가 CD3 (또는 CD20) 분자에 결합할 수 없다면, 시험 항체는 본 발명의 기준 특이적 항원-결합 분자가 결합된 에피포트와 동일한 CD3 (또는 CD20)의 에피토프에 결합할 수 있다. 그 다음, 시험 항체의 관찰된 결핍이 실제로 기준 이중특이적 항원 결합 분자와 동일한 에피토프에 대한 결합에 기인한 것인지, 또는 공간적 차단 (예를 들어, 또는 또다른 현상)이 이러한 관찰된 결합의 부족의 원인이 되는 지를 확인하기 위해 추가의 통상적인 실험(가령, 펩티드 돌연변이 및 결합 분석)이 실시될 수 있다. 이러한 종류의 실험은 ELISA, RIA, Biacore, 유동 세포 계측법 또는 당업계에서 이용 가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 분석을 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에 따르면, 예를 들어, 경쟁 결합 분석법에서 예를 들어 1-, 5-, 10-, 20- 또는 100-배 초과하는 하나의 항원-결합 단백질이 다른 단백질의 결합을 적어도 50 %, 그러나 바람직하게는 75 %, 90 % 또는 심지어 99 %까지 결합을 억제한다면, 2 개의 항원-결합 단백질은 동일한(또는 중첩되는) 에피토프에 결합한다 (가령, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502 참고). 대안으로, 항원에서 하나의 항원 결합 단백질의 결합을 감소 또는 제거하는 필수적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 하나의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 2 개의 항원 결합 단백질은 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 하나의 항원-결합 단백질의 결합을 감소시키거나 제거하는 아미노산 돌연변이의 서브세트만이 다른 하나의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 2 개의 항원-결합 단백질은 ＂중첩된 에피토프＂를 갖는 것으로 간주된다.
항체 또는 이의 항원-결합 도메인이 기준 항원-결합 분자와의 결합에 대해 경쟁하는지를 결정하기 위해, 상기 결합 방법은 두 가지 방향으로 수행된다: 제 1 배향에서, 기준 항원-결합 분자는 포화 조건하에 CD3 단백질 (또는 CD20 단백질)에 결합시킨 다음, CD3 (또는 CD20) 분자에 대한 시험 항체의 결합을 평가한다. 제 2 배향에서, 시험 항체는 포화 조건하에 CD3 (또는 CD20) 분자에 결합시킨 다음, CD3 (또는 CD20) 분자에 대한 기준 항원-결합 분자의 결합을 평가한다. 두 방향 모두에서 첫 번째 (포화) 항원 결합 분자 만이 CD3 (또는 CD20) 분자에 결합할 수 있다면, 시험 항체와 기준 항원 결합 분자는 CD3(또는 CD20)에 결합에 있어서 경쟁하는 것으로 결론내린다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 기준 항원-결합 분자와의 결합에 대해 경쟁하는 항체는 반드시 기준 항체와 동일한 항원 에피토프에 결합할 필요는 없지만, 중첩 또는 인접 항원 에피토프에 결합함으로써, 기준 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
항원-결합 도메인들의 준비 및 이중특이적 분자들의 작제
특정 항원에 특이적인 항원-결합 도메인은 당업계에 공지된 임의의 항체 생성 기술에 의해 제조될 수 있다. 일단 수득되면, 2 개의 상이한 항원 (예를 들어, CD3 및 CD20)에 특이적인 2 개의 상이한 항원-결합 도메인은 일상적 방법을 사용하여 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자를 생성하도록 서로에 대해 적절히 배치될 수 있다. (본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자를 제조하는데 사용될 수 있는 예시적인 이중특이적 항체 포맷의 논의는 본 명세서의 도처에서 제공된다). 특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 다중특이적 항원-결합 분자들의 하나 또는 그 이상의 개별 구성분(가령, 중쇄 및 경쇄)은 키메라, 인화된 또는 전체 인간 항체들로부터 유도된다. 이러한 항체들을 만드는 방법들은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자의 중쇄 및/또는 경쇄 중 하나의이상은 VELOCIMMUNE ™ 기술을 사용하여 제조될 수 있다. VELOCIMMUNE™ 기술 (또는 임의의 다른 인간 항체 생성 기술)을 사용하여, 특정 항원 (예를 들어, CD3 또는 CD20)에 대한 고친화이며, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 키메라 항체가 처음으로 단리된다. 친화력, 선택성, 에피토프, 등이 포함된 바람직한 특징들에 대하여 상기 항체들이 특징화되고, 선택된다. 상기 마우스 불변 영역은 원하는 인간 불변 영역으로 대체되어 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자에 혼입될 수 있는 완전 인간 중쇄 및/또는 경쇄를 생성한다.
유전자 조작 동물은 인간의 이중특이적 항원-결합 분자를 만드는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 내인성 마우스 면역글로불린 경쇄 가변 서열을 재배치할 수 없고, 발현시킬 수 없는 유전적으로 변형된 마우스가 사용될 수 있으며, 이때 상기 마우스는 내인성 마우스 카파에서 내인성 마우스 카파 불변 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 면역글로불린 서열에 의해 코딩된 하나의또는 두 개의 인간 경쇄 가변 도메인만을 발현한다. 이러한 유전자 변형 마우스는 2 개의 상이한 인간 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트 중 하나로부터 유래된 가변 도메인을 포함하는 동일한 경쇄와 연합된 2 개의 상이한 중쇄를 포함하는 완전 인간 이중특이적 항원-결합 분자를 생성하는데 사용될 수 있다. (가령, 그러한 조작된 마우스 및 이의 이중특이적 항원-결합 분자를 생성시키는 그의 용도에 대한 상세한 설명은 US 2011/0195454 참고).
생물등가물 ( Bioequivalents )
본 발명은 본원에 개시된 예시적인 분자의 아미노산 서열과는 다르나 CD3 및/또는 CD20에 결합하는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 항원-결합 분자를 포함한다. 이러한 변이체 분자는 부모 서열과 비교하여, 아미노산의 하나 이상의 첨가, 결실 또는 치환을 포함할 수 있지만, 기재된 이중특이적 항원-결합 분자의 생물학적 활성과 본질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다.
본 발명은 본원에 기재된 임의의 예시적인 항원-결합 분자와 생물학적으로 동등한 항원-결합 분자를 포함한다. 두 가지 항원-결합 단백질 또는 항체는 예를 들어, 이들이 약학적 균등물 또는 약학적 대안인 경우, 동등한 것으로 간주되며, 유사한 실험 조건 하에 단일 분량 또는 다중 분량으로 동일한 몰 용량이 투여될 때, 이들의 흡수율 및 흡수 정도가 유의한 차이를 나타내지 않는다. 그들의 흡수의 정도에 대등하지만, 흡수 속도는 대등하지 않는 경우, 일부 항원-결합 단백질은 대등한 또는 약학적으로 대안으로 간주되며, 흡수 속도에서 이러한 차이는 의도적이고, 라벨링에 반영되기 때문에 생물학적 동등성 간주될 수 있으며, 이들은 만성적 사용시 효과적인 신체 약물 농도 성취에 필수적이며 않으며, 그리고 연구된 특정 의약품의 경우 의학적으로 무의미한 것으로 간주된다.
한 구체예에 있어서, 2 개의 항원-결합 단백질은 안전성, 순도 및 효능에 임상적으로 의미있는 차이가 없다면, 생물학적으로 동등하다.
한 구체예에 있어서, 제품의 전환없이 지속 요법과 비교하였을 때, 환자에서 면역원성의 임상적으로 심각한 변화, 또는 감소된 유효성을 포함하여 부작용 위험이 증가없이, 환자가 참고 제품과 생물 의약품 사이에서 1 회 또는 그 이상 전환할 수 있다면, 2 개의 항원 결합 단백질은 생물학적으로 동일하다
한 구체예에 있어서, 2 개의 항원-결합 단백질은 이들 모두 공통의 메카니즘 또는 사용 조건 또는 조건에 대한 작용 메카니즘에 의해 그러한 메카니즘의 공지된 수준으로 작용하는 경우, 생물학적으로 동등하다.
생물학적 동등성은 생체내 및 시험관내 방법에 의해 실증될 수 있다. 생물학적 동등성 측정은 다음을 포함한다: 가령, (a) 인간 또는 다른 포유류에서 생체내 테스트, 이때 상기 항체 또는 이의 대사물질의 농도가 시간에 대한 함수로써 혈액, 혈장, 혈청, 또는 다른 생물학적 유체 안에서 측정되며; (b) 생체내 생물이용성 데이터에서 인간과 관련되며, 인간에 합당한 것으로 예측되는 시험관 테스트; (c) 인간 또는 다른 포유류에서 생체내 테스트, 이때 상기 항체 (또는 이의 표적)의 적절한 급성 약학 효과는 시간에 대한 함수로 측정되며; 그리고 (d) 항원-결합 단백질의 안정성, 효과, 또는 생물이용성 또는 생물동등성을 확립하는 잘-조절된 임상 시도.
본원에 기재된 예시적인 이중특이적 항원-결합 분자의 생물학적 동등 변이체는 예를 들어, 생물학적 활성에 필요하지 않은 잔기 또는 서열의 다양한 치환을 제조하거나, 또는 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실시킴으로써 작제될 수 있다. 　예를 들면, 생물학적 활성에 필수적이지 않은 시스테인 잔기는 재생시 불필요하거나 부정확한 분자내 디설파이드 브릿지의 형성을 방지하기 위해 삭제되거나 다른 아미노산으로 대체될 수 있다. 다른 내용에서, 생물학적 동등 항원-결합 단백질은 예를 들어 글리코실화를 제거 또는 제거하는 돌연변이를 포함하는, 분자의 글리코실화 특성을 변형시키는 아미노산 변화를 포함하는 본원에 기재된 예시적인 이중특이적 항원-결합 분자의 변이체를 포함할 수 있다.
종 선택성 및 종 교차 반응성
본 발명의 특정 구체예들에 따르면, 인간 CD3에 결합하지만, 다른종의 CD3에 결합하는 항원-결합 분자들이 제공된다. 인간 CD20에 결합하나, 다른 종의 CD20에 결합하는 항원-결합 분자들을 또한 제공한다. 본 발명은 인간 CD3와 하나 또는 그 이상의 비-인간 종의 CD3에 결합하는 항원-결합 분자들; 및/또는 인간 CD20와 하나 또는 그 이상의 비-인간 종의 CD20에 결합하는 항원-결합 분자들을 또한 포함한다.
본 발명의 특정 예시적인 구체예들에 있어서, 인간 CD3 및/또는 인간 CD20에 결합하지만. 마우스, 렛, 기니아피그, 햄스터, 게르빌루쥐, 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 시노몰구스, 마모셋, 붉은털원숭이 또는 침팬지 CD3 및/또는 CD20중 하나의또는 그 이상에 결합할 수도 있고, 또는 결합하지 않을 수 있는 항원-결합 분자들이 제공된다. 예를 들면, 본 발명의 특정 예시적인 구체예에서, 인간 CD3 및 시노몰구스 CD3에 결합하는 제 1 항원-결합 도메인, 및 인간 CD20에 특이적으로 결합하는 제 2 항원-결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자들이 제공된다.
면역접합체들( Immunoconjugates )
본 발명은 치료요법 모이어티 (＂면역접합체＂), 이를 테면 세포독소, 화학치료요법 약물, 면역억제제 또는 방사능동위원소에 접합된 항원-결합 분자들을 포괄한다. 세포독성 물질들은 세포들에 유해한 임의 물질을 포함한다. 면역접합체들의 형성을 위한 적합한 세포독성 물질 및 화학치료요법 물질의 예는 당분야에 공지되어 있다 (예를 들면, WO 05/103081 참고).
치료요법 제형 및 투여
본원에서 사용된 바와 같이, ＂유효량＂및 ＂치료학적 유효량＂이란 용어는 독성, 자극 또는 알레르기 반응과 같은 부작용이 없이, 원하는 치료 반응을 생성하기에 충분한 활성 치료제의 양을 지칭한다. 특정한 ＂유효량＂은 특정 인자들, 가령, 치료되는 특정 상태, 환자의 신체 상태, 치료되는 동물의 유형, 치료 기간, 동시 치료요법의 성격 (있는 경우) 및 사용된 특정 제제 및 화합물 또는 그의 유도체의 구조의 요인에 따라 달라질 것이다. 이 경우에서, 양은 다음 중 하나의이상을 초래할 경우 치료 효과가 있는 것으로 간주될 수 있다: (a) 종양 성장 (가령, B-세포 암)의 억제; 그리고 (b) B-세포 암의 역전 또는 안정화.
환자에게 투여되는 항원-결합 분자의 투여량은 환자의 연령 및 체격, 표적 질환, 조건, 투여 경로 및 이와 유사한 것에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 투여량은 일반적으로 체중 또는 신체 표면적에 따라 산출된다. 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 성인 환자에서 치료 목적으로 사용되는 경우, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자를 약 0.01 내지 약 20 mg/체중 kg, 좀더 바람직하게 약 0.02 내지 약 7, 약 0.03 내지 약 5, 또는 약 0.05 내지 약 3 mg/체중 kg의 용량에서 정상적으로 정맥내 투여하는 것이 유리할 수 있다. 상태의 중증도에 따라 치료의 빈도와 기간을 조정할 수 있다. 이중특이적 항원-결합 분자를 투여하기 위한 효과적인 용량 및 스케줄은 경험적으로 결정될 수 있다; 예를 들어, 환자에서 진행은 정기적 평가에 의해 모니터링될 수 있고 그에 따라 투여분이 조정될 수 있습니다. 또한, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 용량의 종간 비례축소가 수행될 수 있다 (가령, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).
다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, 이를 이용하여 본 발명의 약학 조성물을 투여할 수 있는데, 예를 들어, 리포솜, 미립자, 마이크로 캡슐, 돌연변이 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개된 엔도시토시스가 이용될 수 있다(가령, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참고). 도입 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 구강 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들면, 주입 또는 볼 루스 주사에 의해, 상피 또는 점막 피부 라이닝 (예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소적 투여일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 표준 바늘 및 주사기에 의해 피하 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 　또한, 피하 전달과 관련하여, 펜 전달 장치는 본 발명의 약학 조성물을 전달하는 용도로 용이하다. 　이러한 펜 전달 장치는 재사용 또는 일회용일 수 있다. 　재사용 가능한 펜 전달 장치는 일반적으로 약학 조성물을 함유하는 교체 가능한 카트리지를 사용한다. 　카트리지 내의 모든 약학 조성물이 투여되고 카트리지가 비워지면, 비어있는 카트리지는 쉽게 폐기되어 약학 조성물을 함유하는 새로운 카트리지로 대체될 수 있다. 　그 다음 상기 펜 전달 장치는 재사용될 수 있다. 　일회용 펜 전달 장치에 있어서, 교체용 카트리지는 없다. 　오히려, 일회용 펜 전달 장치는 장치 내의 저장조에 보유된 약학 조성물로 미리 채워진다. 　저장기 안에 약학 조성물이 없어지면, 전체 장치를 버린다.
다수의 재사용 가능한 펜 및 자동 주사기 전달 장치는 본 발명의 약학 조성물의 피하 전달에 사용될 수 있다. 　예로는 다음의 것들이 포함되나, 이에 국한되지 않는다: AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ 펜 (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ 펜, HUMALOG™ 펜, HUMALIN 70/30™ 펜 (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II 및 III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ 펜 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, 및 OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Germany), 그외 몇몇. 　본 발명의 약학 조성물의 피하 전달에 사용되는 일회용 펜 전달 장치의 예로는 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: SOLOSTAR™ 펜 (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), 및 KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICKTM Autoinjector (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLETTM (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), 및 HUMIRATM 펜 (Abbott Labs, Abbott Park IL), 그외 몇몇.
특정 상황에서, 약학 조성물은 조절된 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 구체예에 있어서, 펌프가 이용될 수 있다 (Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 참고). 또다른 구체예에 있어서, 폴리머 재질이 이용될 수 있다; Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida 참고. 여전히 또다른 구체예에서, 조절된 방출 시스템은 조성물의 표적 근처에 배치될 수 있고, 따라서 전신 용량의 일부만을 필요로 한다 (가령, Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 참고). 다른 조절된 방출 시스템은 Langer, 1990, Science 249:1527-1533의 리뷰에서 논의된다.
주사 가능한 제제는 정맥내, 피하, 피내 및 근육내 주사, 드립 주입 등을 위한 투약 형태를 포함할 수 있다. 이들 주사용 제제는 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 주사가능한 제제는 전술한 항체 또는 그의 염을 무균 수성 매질 또는 주사제로써 통상적으로 사용되는 유성 매질에 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 제조될 수 있다. 주사를 위한 수성 매질로서는, 예를 들면, 생리 식염수, 글루코스 및 기타 보조제 등을 함유하는 등장액이 있으며, 이들은 알코올(가령, 에탄올), 폴리알코올 (가령, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제 [가령, 폴리소르베이트 80, HCO-50 (수소화된 카스트오일의 폴리옥시에틸렌 (50 mol) 부가생성물)], 등의 적당한 용해제와 조합하여 사용할 수 있다. 유성 배지로서는, 예를 들면, 참기름, 콩기름 등을 사용할 수 있고, 벤질 벤조산 염, 벤질 알콜 등의 가용화제와 병용할 수 있다. 따라서, 이와 같이 제조된 주사제는 바람직하게는 적절한 앰풀에 충전된다.
유리하게는, 전술한 경구 또는 비경구 사용을 위한 약학 조성물은 활성 성분의 용량에 적합한 단위 투여량으로 제형으로 제조된다. 이러한 단위 용량의 투여 형태는 예를 들어, 정제, 환제, 캡슐, 주사제 (예컨대, 앰플, 바이알), 좌제 등을 포함한다.
상기 항원-결합 분자들의 치료요법적 용도
본 발명은 항-CD3 항체 또는 CD3 및 표적 항원 (가령, CD20)에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자를 포함하는 치료요법 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법들을 포함한다. 상기 치료요법 조성물은 본 명세서에서 공개된 임의의 상기 항체들 또는 이중특이적 항원-결합 분자들과 약학적으로 수용가능한 운반체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 표현 ＂이를 필요로 하는 대상체＂란 암의 하나 이상의 징후 또는 징후를 나타내는 인간 또는 비인간 동물 (예를 들어, 종양을 나타내는 대상, 또는 하기에 언급된 임의의 암으로 고통받는 대상)을 의미하며, 그렇지 않으면 CD20 활성의 저해 또는 감소, 또는 CD20+ B 세포의 고갈 또는 CD20+ B 세포 종양의 퇴보로부터 이익을 얻게 되는 인간 또는 비인간 동물을 말한다.
본 발명의 상기 항체들 및 이중특이적 항원-결합 분자들( 그리고 이를 포함하는 치료요법 조성물)은 특히 면역 반응의 자극, 활성화 및/또는 표적화가 유익한 임의의 질병 또는 장애를 치료하는데 유용하다. 특히, 본 발명의 상기 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자들은 CD20 발현 또는 CD20+ B 세포들의 활성 또는 증식에 관련된 또는 중재된 임의의 질환 또는 장애의 치료, 예방 또는 개선에 유용할 수 있다. 본 발명의 치료 방법이 달성되는 작용 메카니즘은 예를 들어, 세포자멸, 식균 작용에 의해 또는 이 메커니즘 중 2 개 이상의 조합 또는 유사한 세포 독성에 의해, 작동 세포의 존재 하에 CD20을 발현하는 세포를 죽이는 것을 포함한다. 본 발명의 상기 이중특이적 항원-결합 분자들을 이용하여 억제 또는 사멸되는 CD20을 발현시키는 세포는 예를 들면, 종양원성 B 세포들을 포함한다.
종양 부하 또는 종양 퇴행 감소는 대상체에서 종양 또는 종양들의 부분적 또는 완전한 사라짐을 포함한다. 종양 퇴행은 낮은 종양 부담 또는 덜 심각한 질병 상태로의 경향을 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이 회귀는 종양 크기의 감소 및/또는 종양 수의 감소를 포함하여 신체의 측정 가능한 악성 종양이 점진적으로 감소하는 것이다. 종양 발생의 감소에는 추가 또는 새로운 종양 성장의 부분적 또는 완전한 억제 또는 억제가 포함된다.
본 발명의 상기 항원-결합 분자들은 뇌 및 뇌수막, 구인두, 폐 및 기관지 나무, 위장관, 남성 및 여성 생식 기관, 근육, 뼈 및 피부 및 부속기관, 연결조직, 비장, 면역계, 혈액 형성 세포 및 골수, 간 및 요로, 그리고 눈과 같은 특별한 감각 기관에서 발생하는 일차 및/또는 전이성 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 이중특이적 항원-결합 분자들은 다음 중 하나 또는 그 이상의 암을 치료하는데 이용된다: 신장 세포 암종, 췌장 암종, 유방암, 두경부암, 전립선 암, 악성 신경교종, 골육종, 결장직장암, 위암 (예: MET 증식을 동반한 위암), 악성 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 활액 육종, 갑상선암 또는 흑색 종. 특정 예시적인 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 이중특이적 항원-결합 분자들은 B 세포 암 (예: 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 [NHL], 전구체 B 세포 림프 구성 백혈병/림프종, 성숙한 B 세포 신생물, B 세포 만성 림프구성 백혈병/소 림프구성 림프종, B 세포 림프모구백혈병, 림프성 세포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 여포성 림프종, 피부 여포 중심 림프종, 주변 구역 B 세포 림프종, 털이 많은 세포 백혈병, 확산성 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질 세포종, 형질 세포성 골수종, 이식-후 림프 증식성 장애, 월덴스트롬 거대글로불린 혈증 및 역형성 거대 세포 림프종 )의 치료에 이용된다.
본 발명의 상기 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자들은 대상체에서 종양 부하를 감소시키고, 종양의 퇴행을 만들고, 종양 성장을 억제하고 또는 종양 발달을 감소시키는데 충분한 양으로 투여된다. 본 발명의 일부 예시적인 구체예들에 있어서, 상기 투여된 양은 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 mg/kg이다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 투여된 양은 약 0.4 mg/kg이다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 투여된 양은 약 0.04 mg/kg이다. 여전히 다른 구체예들에 있어서, 상기 투여된 양은 약 0.004 mg/kg이다.
본 발명의 특정 구체예들에 따르면, 상기 항원-결합 분자들은 단독 항-CD20 요법에 저항적이거나 (가령, 리툭시맙 요법에 저항적인), 또는 불완전한 반응을 보이는 B-세포 림프종 (가령, NHL)에 걸린 환자의 치료에 유용하다. 본 발명의 다른 관련된 구체예들에 따르면, 본 명세서에서 공개된 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자를 항-CD20 요법에 대하여 난치성 B-세포 림프종 (가령, NHL)을 앓고 있는 환자(가령, 리툭시맙-난치성 종양 또는 재발된 또는 난치성 B-세포 림프종을 가진 환자)에게 투여하는 것을 포함하는 방법들이 제공된다. 종양 스캐닝 등과 같은 당업계에 공지된 분석/진단 방법을 사용하여 환자가 단독 항 CD20 요법에 내성이 있거나 불완전하게 반응하거나 불응성인 종양이 있는지 여부를 확인할 수 있다.
본 발명은 대상체에서 잔류 암을 치료하는 방법들을 또한 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 ＂잔류 암＂이란 항암 요법으로 치료한 후 피험자에서 하나 이상의 암 세포의 존재하거나 또는 지속한다는 것을 의미한다.
특정 측면들에 따르면, 본 발명은 항-CD20 단일-요법을 받은 후 (가령, 항-CD20 항체, 이를 테면 리툭시맙를 포함하는 약학 조성물을 투여받은 후) 대상체에게 본원의 도처에서 공개된 하나 또는 그 이상의 상기 이중특이적 항원-결합 분자들을 투여하는 것을 포함하는 CD20 발현 (가령, B 세포 림프종)과 연합된 질환 또는 장애를 치료하는 방법들을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 항-CD20 단일-요법을 받은 후 (가령, 리툭시맙 치료 또는 이에 대등한 치료), 1 일차, 2 일차, 3 일차, 4 일차, 5 일차, 6 일차, 1 주, 2 주, 3 주 또는 4 주, 2 개월, 4 개월, 6 개월, 8 개월, 1 년, 또는 그 이상 시점에 환자에게 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자를 투여하는 것을 포함하는 B 세포 림프종을 치료하는 방법들을 포함한다.
복합 요법들 및 제형
본 발명은 하나 또는 그 이상의 추가적인 치료요법 물질과 복합하여 본 명세서에서 설명된 예시적인 항체들 및 이중특이적 항원-결합 분자들을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법들을 제공한다. 본 발명의 항원-결합 분자와 복합되거나, 또는 복합되어 투여될 수 있는 예시적인 추가적인 치료요법 물질은 가령, EGFR 길항제 (가령, 항-EGFR 항체 [가령, 세투시마브 또는 파니투무마브] 또는 EGFR의 작은 분자 저해제 [가령, 게피티니브 또는 에르로티니브]), 또다른 EGFR 패밀리 구성원의 길항제, 이를 테면 Her2/ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4 (가령, 항-ErbB2, 항-ErbB3 또는 항-ErbB4 항체 또는 ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4 활성의 작은 분자 억제제), EGFRvIII의 길항제 (가령, EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항체), cMET 길항제 (가령, 항-cMET 항체), IGF1R 길항제 (가령, 항-IGF1R 항체), B-raf 억제제 (가령, 베무라페니브, 소라페니브, GDC-0879, PLX-4720), PDGFR-α 억제제 (가령, 항-PDGFR-α 항체), PDGFR-β 억제제 (가령, 항-PDGFR-β 항체), VEGF 길항제 (가령, VEGF-Trap, 가령, US 7,087,411 (＂VEGF-억제 융합 단백질＂로도 본 명세서에서 언급됨), 항-VEGF 항체 (가령, 베바시주마브), VEGF 수용체의 작은 분자 키나제 억제제 (가령, 수니티니브, 소라페니브 또는 파조파니브)), DLL4 길항제 (가령, US 2009/0142354에서 공개된 항-DLL4 항체), Ang2 길항제 (가령, US 2011/0027286에서 공개된 항-Ang2 항체, 이를 테면 H1H685P), FOLH1 길항제 (가령, 항-FOLH1 항체), PRLR 길항제 (가령, 항-PRLR 항체), STEAP1 또는 STEAP2 길항제 (가령, 항-STEAP1 항체 또는 항-STEAP2 항체), TMPRSS2 길항제 (가령, 항-TMPRSS2 항체), MSLN 길항제 (가령, 항-MSLN 항체), CA9 길항제 (가령, 항-CA9 항체), 유로플라킨 길항제 (가령, 항-유로플라킨 항체), 단가 CD20 길항제 (가령, 단가 항-CD20 항체, 이를 테면 리툭시맙), 등을 포함한다. 본 발명의 상기 항원-결합 분자들과 복합되어 유익하게 투여될 수 있는 다른 물질은 작은-분자 사이토카인 억제제들이 포함된 사이토카인 억제제들 그리고 사이토카인, 이를 테면 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, 또는 이들의 각 수용체들에 결합하는 항체들을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물 (가령, 본원에서 공개된 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항원-결합 분자를 포함하는 약학 조성물)은 ＂ICE＂: 이포스파미드 (가령, Ifex®), 카르보플라틴 (가령, Paraplatin®), 에토포시드 (가령, Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16); ＂DHAP＂: 덱사메타손 (가령, Decadron®), 시타라빈 (가령, Cytosar-U®, 시토신 아라비노시드, ara-C), 시스플라틴 (가령, Platinol®-AQ); 그리고 ＂ESHAP＂: 에토포시드 (가령, Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16), 메틸프레드니솔론 (가령, Medrol®), 높은-용량 시타라빈, 시스플라틴 (가령, Platinol®-AQ)으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 치료요법 조합들을 포함하는 치료요법 용법의 일부로 또한 투여될 수 있다.
본 발명은 본 명세서에서 언급된 임의의 상기 항원-결합 분자들과 VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvIII, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-α, PDGFR-β, FOLH1, PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, 유로플라킨의 하나 또는 그 이상의 억제제, 또는 임의의 전술한 사이토카인의 억제제가 포함된 치료요법 조합들을 또한 포함하며, 이때 상기 억제제는 압타머, 안티센스 분자, 리보자임, siRNA, 펩티도바디, 나노바디 또는 항체 단편 (가령, Fab 단편; F(ab＇)2 단편; Fd 단편; Fv 단편; scFv; dAb 단편; 또는 다른 작제된 분자들, 이를 테면 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 및 최소 인지 단위들)이다. 본 발명의 상기 항원-결합 분자들은 항바이러스제, 항생제, 진통제, 코르티코스테로이드 및/또는 NSAID와 조합하여 투여 및/또는 공배합될 수 있다. 본 발명의 상기 항원-결합 분자들은 또한 방사선 치료 및/또는 통상적인 화학 요법을 또한 포함하는 치료 요법의 일부로서 투여될 수 있다.
추가의 치료적 활성 성분 (들)은 본 발명의 항원-결합 분자의 투여 직전, 동시 또는 투여 직후에 투여될 수 있다 (본 개시의 목적을 위해, 그러한 투여 요법은 추가 치료 활성 성분과 ＂조합하여＂ 항원-결합 분자를 투여하는 것으로 간주된다).
본 발명은 본 발명의 항원-결합 분자가 본 명세서에서 설명된 추가적인 치료요법적으로 활성 성분(들)과 공동 제형화되는 약학 조성물을 포함한다.
투여 용법
본 발명의 특정 구체예들에 따르면, 항원-결합 분자 (가령, 항-CD3 항체 또는 CD20 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자)의 다중 용량은 명시된 일정에 걸쳐 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 한 측면에 따른 상기 방법들은 대상체에게 본 발명의 다중 용량의 항원-결합 분자를 연속적으로 투여하는 것을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, ＂연속적으로 투여하는＂이란 각 용량의 항원-결합 분자가 상이한 시점, 가령, 예정된 간격 (가령, 시간, 일차, 주 또는 개월)을 두고 상이한 일자에 투여되는 것을 말한다. 본 발명은 상기 환자에게 단일 초기 용량의 항원-결합 분자를 투여하고, 이어서 하나 또는 그 이상의 2차 용량의 상기 항원-결합 분자를 투여하고, 그리고 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 3차 용량의 상기 항원-결합 분자를 연속적으로 투여하는 것을 포함하는 방법들을 포함한다.
용어 ＂초기 용량＂, ＂2차 용량＂, 및 ＂3차 용량＂은 본 발명의 상기 항원-결합 분자를 투여하는 임시 순서를 말한다. 따라서, ＂초기 용량＂또는 ＂제 1 용량＂은 치료 요법 초기에 투여되는 용량 ( ＂기본 용량＂이라고도 함)이며; ＂2 차 용량＂은 초기 투여 후에 투여되는 용량이며; ＂3 차 용량＂은 2 차 투여 분량 후에 투여되는 투여 용량이다. 초기, 2 차 및 3 차 용량은 모두 항원 결합 분자와 동일한 양을 함유할 수 있지만, 그러나 일반적으로 투여 빈도 측면에서 서로 다를 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 그러나, 초기, 2 차 및/또는 3 차 용량 내에 함유된 항원-결합 분자의 양은 치료 과정 동안 서로 변화한다 (예를 들어, 적절하게 상향 또는 하향 조정된다). 특정 구체예들에 있어서, 2 회 또는 그 이상 (예, 2, 3, 4, 또는 5 회) 투여 용량은 치료법의 시작 단계에서 ＂적하 용량(loading doses)＂으로 투여하고, 이후의 용량은 덜 빈번하게 투여한다 (예, ＂유지 용량(maintenance doses)＂) .
최소 농도에서 투여되는 제 1 투여 및 이어서 연속 투여 또는 제 2 투여는 제 1 투여 량의 2 배 또는 3 배 투여되는 것이 환자에게 유익할 것이라는 것이 밝혀졌다
일부 구체예들에 있어서, 제 1 용량의 항원-결합 분자는 환자에게 연속하여 제 1 기간 동안 투여되며, 후속 제 2 용량의 전술한 항원-결합 분자는 환자에게 연속하여 제 2 투여 기간 동안 투여되며, 이때 전술한 제 2 용량은 전술한 제 1 용량을 초과한다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 제 1 용량은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 주 동안 주당 1회 또는 2회 투여된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 제 2 용량은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 주 또는 개월 동안 주당 1회, 주당 2회, 한달에 한번 또는 한달에 두번 투여된다.
본 발명의 하나의 예시적인 구체예에서, 각 2차 및/또는 3차 용량은 바로 직전 투여 이후 1 내지 26 (가령, 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20½, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½, 또는 그 이상) 주에 투여된다. 구절 ＂바로 직전 용량＂은 본원에서 사용된 바와 같이, 다수 투여의 순서에 있어서, 중간 개입 투여 없이 순서에서 바로 그 다음 투여에 앞서 환자에게 투여된 항원-결합 분자의 용량을 말한다.
본 발명의 이 측면에 따른 상기 방법들은 환자에게 항원-결합 분자 (가령, CD20 및 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자)를 임의의 수의 2차 및/또는 3차 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 특정 구체예들에 있어서, 오직 한 번의 2차 용량이 이 환자에게 투여된다. 다른 구체예들에 있어서, 2회 또는 그 이상 (가령, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 그 이상) 2차 용량이 이 환자에게 투여된다. 유사하게, 특정 구체예들에 있어서, 오직 한번의 3차 용량이 이 환자에게 투여된다. 다른 구체예들에 있어서, 2회 또는 그 이상 (가령, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 그 이상) 3차 용량이 이 환자에게 투여된다.
다수의 2차 용량이 관련된 구체예들에 있어서, 각 2차 용량은 다른 2차 용량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들면, 각 2차 용량은 바로 직전 투여후 1-2주에 이 환자에게 투여될 수 있다. 유사하게, 다수의 3차 용량이 관련된 구체예들에 있어서, 각 3차 용량은 다른 3차 용량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들면, 각 3차 용량은 바로 직전 투여후 2-4주에 이 환자에게 투여될 수 있다. 대안으로, 2차 및/또는 3차 용량이 환자에게 투여되는 빈도는 치료 용법의 과정에 걸쳐 변화될 수 있다. 투여 빈도는 임상 시험 후 개별 환자의 필요에 따라 의사가 치료하는 과정에서 조정할 수도 있습니다.
상기 항체들의 진단학적 용도
본 발명의 상기 항-CD3xCD20 항체들은 진단 목적으로 시료에서 CD3, 또는 CD3-발현시키는 세포들을 탐지 및/또는 측정하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 항-CD3xCD20 항체, 이의 단편은 CD3의 비정상 발현 (가령, 과다-발현, 과소-발현, 발현의 부족, 등,)을 특징으로 하는 상태 또는 질환을 진단하는데 이용될 수 있다. CD3의 예시적인 진단 분석은 가령, 본 발명의 항-CD3xCD20 항체를 환자로부터 획득한 시료에 접촉시키는 것을 포함하며, 이때 상기 항체는 탐지가능한 라벨 또는 리포터 분자로 라벨될 수 있다. 대안으로, 라벨안된 항-CD3xCD20 항체는 자체적으로 탐지가능하게 라벨된 제 2 항체와 함께 진단 용도에 이용될 수 있다. 상기 탐지가능한 라벨 또는 리포터 분자는 방사능동위원소, 이를 테면 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 125I; 형광 또는 화학적 발광 모이어티, 이를 테면 플루오레세인 이소티오시아네이트, 또는 로다민; 또는 효소, 이를 테면 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 겨자무과산화효소, 또는 루시페라제가될 수 있다. 시료 안에 CD3을 탐지 또는 측정하는데 이용될 수 있는 특이적 예시적인 분석은 효소-연계된 면역흡착분석 (ELISA), 방사능면역분석 (RIA), 및 형광-활성화된 세포 소팅 (FACS)을 포함한다.
본 발명의 상기 항-CD3xCD20 항체들은 시료 안에 CD20, 또는 CD20-발현시키는 세포들을 탐지 및/또는 측정하거나, 또는 유사하게 CD20의 비정상적 발현 (가령, 과다-발현, 과소-발현, 발현의 부족, 등)을 특징으로 하는 상태 또는 질환을 진단하는데 또한 이용될 수 있다.
본 발명에 따라 CD3 또는 CD20 진단 분석에 이용될 수 있는 시료는 정상 또는 병리학적 상태에서 탐지가능한 양의 CD3 및/또는 CD20 단백질, 또는 이의 단편들을 포함하는 환자로부터 획득가능한 임의의 조직 또는 유체 시료를 포함한다. 일반적으로, 건강한 환자 (가령, 비정상적 CD3 또는 CD20 수준들 또는 활성과 연합된 질환 또는 상태를 앓고 있지 않는 환자)로부터 획득된 특정 시료 안에 CD3 또는 CD20의 수준은 CD3 또는 CD20의 기준 또는 표준 또는 수준을 우선 확립하기 위하여 측정될 것이다. 그 다음 CD3 또는 CD20의 기준 수준은 CD3-또는 CD20-관련된 질환 또는 상태를 가진 것으로 의심되는 대상체로부터 획득된 시료에서 측정된 CD3의 수준과 비교될 것이다.
실시예
다음의 실시예들은 본 발명의 조성물 및 방법이 어떻게 만들어지고, 이용되는지에 대한 완벽한 공개 및 설명을 당업계 숙련자들에게 제시하기 위하여 제공되는 것이며, 발명자들이 이들의 발명으로 간주하는 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다. 이용된 수치(가령, 양, 온도, 등)에 있어서 정확성을 보장하기 위한 노력이 있었지만, 일부 실험적 오류 및 편차들은 고려되어야 한다. 다른 언급이 없는 한, 부분은 중량부이며, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 도씨 또는 실온이며, 압력은 대기압 또는 그 주변값이다.
실시예 1. 항- CD3 및 항- CD20 항체들의 생성
항-CD3 또는 항-CD20 항체들을 단리하는 몇 가지 방법들이 공지되어 있다. 하기 실시 예에서 사용된 완전한 인간 항-CD3 항체는 미국 특허 출원 공개 제 2007/0280945A1 호에 기재된 바와 같이 골수종 세포에 융합하지 않고 항원 양성 B 세포로부터 직접 분리하였다.
항-CD3 항체들의 추가적인 실시예들은 상기 방법들에서 이용될 수 있으며, 이러한 항체들의 설명과 이러한 항-CD3 항체들의 생물학적 성질은 2013년 9월 19일자로 제출된 PCT 국제 출원 번호 PCT/US13/60511에서 설명되며, 이는 본원에 참고자료에 편입되어 있다. 이러한 항-CD20 항체들의 예시적인 항-CD20 항체들 및 생물학적 성질들은 각각 본원에 참고로 인용된 US 7,879,984 및 2013년 9월 19일 출원된 PCT 국제 출원 PCT/US13/60511에 기재되어 있다.
본 실시예의 이중 특이성 항체를 제조하는데 사용되는 항-CD20 항체 및 항체를 제조하는 방법은 US 7,879,984에 기술된 바와 같다.
상기 이중특이적 항체들의 항-CD3 항원-결합 아암 및 항-CD20 결합 아암을 구축하는데 이용되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역들 및 CDRs의 아미노산 서열 식별자들은 표 1에 제시된다. 대응하는 핵산 서열 식별자들은 표 2에 제시된다.
Figure 112017063914847-pct00008
Figure 112017063914847-pct00009
실시예 2. CD3 과 CD20 에 결합하는 이중특이적 항체들의 생산
항-CD3-특이적 결합 도메인 및 항-CD20-특이적 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체들은 표준 방법을 이용하여 상기 서열을 가지도록 작제되는데, 이때 항-CD3 항체의 중쇄 및 경쇄는 항-CD20 항체의 중쇄와 복합된다.
이와 같이, 본 실시예에 따라 만들어진 이중특이적 항체들은 2개의 별도 항원-결합 도메인들 (가령, 결합 아암)을 포함한다. 상기 제 1 항원-결합 도메인은 항-CD3 항체로부터 유도된 경쇄 가변 영역 (＂CD3-VL＂)과 쌍을 이룬 항-CD20 항체 (＂CD20-VH＂)로부터 유도된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 CD20-VH/CD3-VL 쌍형성은 CD20을 특이적으로 인지하는 항원-결합 도메인을 만든다. 상기 제 2 항원-결합 도메인은 항-CD3 항체로부터 유도된 경쇄 가변 영역 (＂CD3-VL＂)과 쌍을 이룬 항-CD3 항체 (＂CD3-VH＂)로부터 유도된 중쇄 가변 영역을 포함한다. CD3-VH/CD3-VL 쌍형성은 CD3을 특이적으로 인지하는 항원-결합 도메인을 만든다. 동일한 CD20-VH가 본 실시예에서 만들어진 모든 이중특이적 항체에 이용되며, ＂CD20-VH-A＂로 지정된다.
각 중쇄의 야생형 중쇄 불변 도메인 (CH)은 재조합 기술에 의해 키메라 CH로 대체된다. 하나의 결합 아암 (가령, 항-CD3 결합 아암)의 CH는 이중특이적 단리를 용이하게 하는 CH의 CH3 영역에 돌연변이를 포함한다.
실시예에 따라 만들어진 다양한 이중특이적 항체들의 성분 부분들의 요약은표 3과 표 4에서 제시된다.
Figure 112017063914847-pct00010
Figure 112017063914847-pct00011
표 5과 6에서 본 실시예의 이중특이적 항체의 대응하는 CDRs와 함께, 다양한 중쇄 가변 영역들 (표 5) 및 경쇄 가변 영역들 (표 6)에 대한 아미노산 서열 식별자를 제시한다.
Figure 112017063914847-pct00012
Figure 112017063914847-pct00013
또한, 표 7과 8은 본 실시예의 이중특이적 항체의 대응하는 CDRs와 함께, 다양한 중쇄 가변 영역들 (표 7), 중쇄 불변 영역들, 및 경쇄 가변 영역들 (표 8)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 서열 식별자들을 제시한다.
Figure 112017063914847-pct00014
Figure 112017063914847-pct00015
상기에서 설명된 상기 이중특이적 항체들에 추가하여, 다음의 대조 항체들은 다음의 실시예에서 실시된 특정 실험에 또한 이용된다:
대조 항체 1: US 4,361,549에서 제시되고, 하이브리도마 CRL-8001 (American Type Culture Collection, Manassas, VA)에서 이용가능한 인간 T-세포 표면 항원에 대한 단일클론 항체 ＂OKT-3＂
대조 항체 2: BD Pharmagen, Cat # 55052에서 이용가능한 인간 T 임파 세포상에 T3 복합체의 입실론 쇄에 대항하는 반응성 항체 ＂SP34＂
대조 항체 3: US 5,736,137에서 공개된 바와 같이, 리투산의 중쇄 및 경쇄 서열과 함께 항-CD20 치료요법 항체.
(대조) 항체 4: CD3xCD20 항체-야생형 Fc (wtFc)으로 또한 공지된 바와 같이, 이 항체는 서열 번호: 2/18의 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 (서열 번호: 4-6-8-20-22-24의 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열들)과 야생형 IgG1 CH 영역 (서열 번호: 45)을 갖는 항-CD20 아암; 그리고 서열 번호: 10/18의 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 (서열 번호: 12-14-16-20-22-24의 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열들)과 용이한 단리를 위하여 CH3 도메인에 2개의 아미노산 변형(서열번호:48)을 갖는 야생형 IgG1 CH 영역을 가진 항체가 만들어졌다. CD3xCD20 항체-wtFc (항체 4)는 상이한 Fc 도메인 서열들 또는 구조를 가진 항체들에 항체 이펙터 기능들, 또는 다른 성질들과 비교를 위한 목적으로, 야생형 IgG1 Fc 도메인(가령, 본 발명의 CD3xCD20-키메라 Fc 항체들의 항원-결합 도메인에 일치된)을 갖는 일치된 대조 항체로 지칭될 수 있다
대조 항체 5: 항-FelD1 단일클론 항체는 인간 CD20 또는 CD3과 교차-반응성이 없는 고양이 항원에 결합한다. 이 IgG1 비-특이적 항체 대조는 2013년 11월 7일자에 공개된 PCT 공개 번호 WO2013/166236에서 설명된 방법들에 의해 획득가능하였다
대조 항체 6: PCT 공개 번호. WO2013/166236에서 설명된 항-FelD1 항원-결합 도메인은 Ab 1에 유사하게 키메라 IgG4 Fc 도메인을 포함하도록 본 명세서에서 설명된 바와 같이 작제되었다. 대조 Ab 6는 인간 CD20 또는 CD3에 교차-반응성을 가지지만, Ab 1에 유사한 이펙터 기능을 갖는다.
실시예 3. 키메라 중쇄 구축
표준 클로닝 기술을 이용하여 상기 키메라 중쇄, 예를 들면 키메라 CH IgG4 (서열 번호: 26) 및 키메라 CH IgG1 (서열 번호: 30)을 만들었다. 우선, 상기 키메라 IgG4 CH는 2-단계 PCR 증폭 과정을 통하여 만들었다. 2개의 PCR 단편들, 단편 1 및 2은 CH 영역, P1-P2 및 P3-P4의 각각 측면에 있는 프라이머 쌍들을 이용하여 야생형 hIgG4 CH DNA를 함유하는 출발 벡터 구조 pR001을 이용하여 증폭되었다. 하기 표 9 참고.) 상기 프라이머는 원하는 IgG2 하부 힌지 서열 (서열 번호: 52를 인코드하는)과 측면 제한 부위를 모두 상기 단편들 안으로 도입시켰다. 이들 두 단편은 그 다음 PCR 프라이머 P2 및 P4를 이용하여 연결되었다. 생성된 서열은 IgG2 하부 힌지 서열을 갖는 키메라 IgG4 CH가 포함된 Xho1-Not1 제한 부위 생성 벡터 구조체 pR002를 통하여 pR001 안으로 삽입되었다. 상기 서열은 프라이머 P10 및 P11을 이용하여 확인되었다.
또한, 다중 단계 PCR 증폭을 통해 키메라 IgG1 CH가 생성되었다. 단편 1a는 주형 pR85503 (야생형 인간 IgG1 CH DNA를 포함)으로부터 프라이머 P2 및 P5 (하기 표 9 참조)를 사용하여 생성하였다. 단편 2a는 주형으로 pR002 (상기 키메라 IgG4 CH DNA를 함유하는)를 이용하여 프라이머 P6 및 P8로 증폭되었다. 단편 3은 주형 pR003 (야생형 hIgG1 CH DNA; 서열 번호: 45)으로부터 프라이머 P7 및 P9를 이용하여 만들었다. 단편들 1a 및 2a는 프라이머 P2 및 P8을 이용하여 연결되어, 단편 4가 만들어졌다. 프라이머 P6 및 P9를 이용하여 단편 2a과 3을 연결시켜 단편 5가 만들어졌다. 그 다음 단편 4와 5는 프라이머 P2 및 P9를 이용하여 융합되었다. 생성된 서열은 IgG2 하부 힌지 및 IgG4 CH2 도메인과 IgG1 불변 영역을 갖는 Xho1-Not1 제한 부위 생성 벡터 구조체 pR004를 통하여 pR001 안으로 삽입되었다. 상기 서열은 프라이머 P10 및 P11을 이용하여 확인되었다.
Figure 112017063914847-pct00016
실시예 4. 단일특이적 항체들과 비교하여 Jurkat , Raji 및 원숭이 T-세포들에 선택적으로 결합하는 CD20 x CD3 이중특이적 항체들
CD3xCD20 항체-wtFc (대조 항체 4)는 Jurkat (CD3+, CD20-인간 T-세포 계통), Raji (CD3-, CD20+ 인간 B-세포 계통), 또는 시노몰구스 PBMCs (＂mkT 세포들＂)에 결합하는 이의 능력에 대하여 FACS 결합 방법을 통하여 실시예 2에서 제시된 단일특이적 대조 항체들과 비교되었다.
다음 프로토콜을 이용하여 FACS 데이터를 획득하였다: 웰당 2x105로 세포는 얼음 위에서 30분 동안 연속적으로 희속된 항체와 함께 항온처리되었다. 항온처리 후, 세포들을 세척하였고, 적절한 2차 (Jurkat, RAJI 세포들) 또는 2차 항체들의 칵테일 (cyno PBMC용)이 추가되었으며, 추가적인 30 분 동안 항온처리되었다. 항온처리 후, 세포들은 세척되었고, 1% BSA를 함유하는 차가운 PBS에 재현탁되었고, BD FACS Canto II 상에 유동세포분석에 의해 분석되었다. Jurkat 및 Raji 세포들은 측면 및 전방 산란에 의해 모였고, 한편 시노몰구스 T 세포들 또한 CD2+CD4+ 집단에 모였다(gated). 세포 결합 역가의 EC50들은 4-매개변수 비-선형 퇴행 분석을 이용하여 산출된 값과 Prism 소프트웨어를 이용하여 결정되었다. 표 10에 결과를 나타낸다.
Figure 112017063914847-pct00017
표 10에 나타낸 바와 같이, 테스트된 항체 패널은 특이성에 따라 다양한 세포주에서 일정 범위의 결합 친화력을 보였다. 이중특이적 대조 항체 4는 인간 및 시노몰구스 표적 계통 모두에 결합하는 능력을 보였다. 대조 항체 4는 본 발명의 항체 1과 항체 2와 동일한 항-CD3xCD20 가변 영역을 가지나, 야생형 IgG1 CH 영역을 포함한다. 항-CD3 대조 1 (OKT3), 항-CD3 대조 2 (SP34), 및 항-CD20 대조 3은 차례로 Jurkat, 시노몰구스 T 세포들, 및 RAJI에 결합하였다.
실시예 5. 야생형 CH를 가진 CD20 x CD3 이중특이적 항체들은 활성화된 T-세포들 존재하에 Raji 세포들에 대해 세포독성을 유도한다
CD20-발현시키는 Raji 세포들에게 T-세포 중재된 사멸을 재전송하는 CD20 x CD3 이중특이적 항체들의 능력이 시험관 세포독성 분석에서 테스트되었다. 또한, Fc/FcR 상호작용들을 통하여 U937 세포들을 죽이는 이중특이적 및 부계 항-CD3 항체들의 능력 또한 연구되었다.
다음의 프로토콜을 이용하여 칼세인 사멸 분석이 실행되었다: 인간 및 시노몰구스 PBMC는 각각 피콜-플락 또는 임파세포 포유류 세포 분리 배지를 통하여 단리되었다. 상기 단리된 PBMCs는 재조합 인간 IL-2 (30U/ml) 및 T-세포 활성화 비드가 포함된 배지로 몇일 동안에 걸쳐 활성화되었다 (인간 PBMC의 경우 항-CD3/CD28, 시노몰구스 PBMC의 경우 항-CD2/CD3/CD28).
표적 세포들 (CD20 중재된 사멸은 Raji, 그리고 FcR 중재된 사멸은 U937)은 칼세인으로 라벨되었고, 37℃에서 3시간 과정에 걸쳐 3-배 연속 희석 항체를 이용하여 10:1의 이펙터:표적 비율로 활성화된 T-세포들과 함께 항온처리되었다. 항온처리 후, 플레이트는 원심분리되었고, 상청액은 형광분석을 위하여 반투성 검성 투명 바닥 플레이트로 옮겼다. 50% 세포독성을 유도하는 이중특이적 항체의 몰 농도로 정의된 EC50은 Prism을 이용하여 결정되었다. 4-매개변수 비-선형 퇴행 분석을 이용하여 값이 산출되었다. 결과는 표 10에 요약된다.
Figure 112017063914847-pct00018
표 11에서 나타낸 것과 같이, 인간-특이적 및 시노몰구스 교차 반응성 항-CD3 아암, 및 야생형 IgG1 CH 영역을 포함하는 이중특이적 CD20 x CD3 항체는 인간 활성화된 T 세포들 존재하에서 Raji 세포들에게 특이적으로 세포독성을 제공할 수 있다. 시노몰구스 활성화된 T 세포들 존재 하에서, 원숭이 T-세포들을 활성화시키는 항-CD3 아암을 갖는 대조 Ab 4 이중특이적 항체와 함께 항온처리될 때 Raji는 사멸되었다. 상기 이중특이적 항체 뿐만 아니라 대조 Ab 1 (항-CD3 mAb)은 U937 Fc/FcR 의존적 사멸 분석에서 활성을 나타내었다. 이 활성은 이 반응에 비-특이적 인간 IgG 차단을 추가함으로써 차단될 수 있다 (데이터는 나타내지 않음).
실시예 6-키메라 CH 영역들을 포함하는 CD20 x CD3 이중특이적 항체들은 CDC 분석에서 감소된 이펙터 기능을 나타낸다.
실시예 2에서 설명된 바와 같이, 키메라 CH 영역들을 가진 CD20xCD3 이중특이적 항체들은 이펙터 기능을 변경 또는 감소시키도록 작제되었다. IgG1 아이소타입의 야생형 (wt) 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체들(대조 Ab 4)과 비교하였을 때, 상기 CH 영역에서 아미노산 치환은 Ig Fc가 이의 수용체(들)에 결합하는 능력을 방해할 수 있다. 이로써 신호생성 및 면역 반응들, 이를 테면 B 세포 활성화 또는 식작용이 변경될 수 있다. 보체 의존적 세포독성 (CDC) (본 실시예) 및 항체-의존적 세포-중재된 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능 (실시예 7 참고)에 있어서 상기 CH 영역에서의 아미노산 변형 효과가 검사되었다.
CDC 이펙터 기능에 있어서 항체 1과 항체 2의 효과를 검사하기 위하여, CD20-발현시키는 Raji (표적) 세포들(5000/웰) 또는 Daudi 세포들은 5% 인간 혈청 보체 존재하에서 도말되었다. 100nM에서 시작하여 항체 1, 항체 2 및 대조 항체들의 연속 희석물은 4 시간 동안 37℃에서 세포에 추가되었다. CytoTox Glo™ 키트 (Promega)를 이용하여 표적 세포 용해가 측정되었고, 세포독성 백분율이 산출되었다.
다음 식을 이용하여 세포독성 백분율이 산출되었다:
세포독성 % = ((LS -LSR)/(LMR-LSR))*100%, 이때 LSR은 표적 세포 기준 발광이며, LMR은 디기토닌에 의해 용해된 세포로부터 최대 칼세인 방출을 나타낸다. 세포독성에 대한 EC50은 Prism 소프트웨어 (GraphPad)를 이용하여 결정되었다. 4-매개변수 비-선형 퇴행 분석을 이용하여 값들이 산출되었으며, 표 12, 및 도 5a 및 5b에 나타낸다.
Daudi 및 Raji 세포들에 대한 항체 1 및 항체 2의 CDC 활성은 wt 중쇄 불변 영역을 보유한 대응 항체와 비교하였을 때, 상당히 감소된다. 표 12, 및 도 5a/b 참고. Raji 세포들에 대한 항체 1에서 일부 CDC 활성이 관찰되었지만, 그러나, 전반적인 결과에서 상기 키메라 항체들은 wt IgG1 Fc 대조 항체들보다 더 약한 이펙터 반응을 만들었다는 것을 보여준다.
Figure 112017063914847-pct00019
실시예 7-키메라 CH 영역들을 포함하는 CD3 x CD20 이중특이적 항체들은 ADCC 분석에서 감소된 이펙터 기능을 나타낸다.
ADCC 이펙터 기능에서 야생형 CH 영역들 (및 동일한 가변 영역들)을 가진 이중특이적 항체에 대항하여 항체 1과 항체 2의 효과를 검사하기 위하여, FcγRIIIa의 더 높은 친화력 V 대립형질을 발현하도록 조작된 새로 단리된 무자극 CD56-양성 NK 세포들 또는 NK92 세포들은 키메라 CH-항체들 (항체 1 및 항체 2) 및 wt-CH 대조 항체 (대조 항체 4) 존재하에서 칼세인-라벨된 CD20-양성 Raji 또는 Daudi 세포들과 함께 도말되었다. 표적 세포들로부터 칼세인 방출이 모니터되었으며, 세포독성 백분율이 결정되었다. 상기 CDC 분석에서 설명된 바와 같이, 세포독성 백분율 및 EC50가 산출되었다. 표 13 및 도 6a 및 6b에 결과를 나타낸다.
상기 키메라 CH 항체들, 항체 1 및 항체 2는 Raji 또는 Daudi 세포들에 대하여 ADCC 활성을 중재하지 않는다 (표 13).
Figure 112017063914847-pct00020
실시예 8-표면 플라스몬 공명 유도된 결합 친화력 및 키메라 항체들의 운동 상수
키메라 불변 중쇄 영역들을 갖는 상기 항-CD3 x 항-CD20 이중특이적 항체들 항체 1 및 항체 4는 인간 및 시노몰구스 Fcγ 수용체들에 대한 이들의 운동 결합 매개변수를 결정하기 위하여 표면 플라스몬 공명 (SPR) (Biacore) 기술을 이용하여 분석되었다. 아이소타입 대조, 즉 wt-IgG1 아이소타입 대조 및 wt-IgG4 CPPC 아이소타입 대조는 유사한 방식으로 테스트되었다.
간략하게 설명하자면, 카르복시메틸 덱스트란-피복된 (CM-5) 칩을 이용하는 Biacore T200 기구 상에서 25℃에서 SPR 실험이 실행되었다. 마우스 단일클론 항-펜타-히스티딘 항체 (GE Healthcare)는 표준 아민-커플링 화학을 이용하여 CM-5 센서 칩의 표면에 고정되었다. His-테그된 인간 또는 원숭이 FcγR 단백질의 140RU-376RU은 상기 항-펜타-히스티딘 아민-결합된 CM-5 칩 상에 포획되었고, 항체들의 원액은 상기 포획된 단백질 위에 분당 20 μl씩 2.5분간 주사되었다. mAb 결합 반응이 모니터되었고, 낮은 친화력 수용체들에 대한 정상-상태(steady-state) 결합 평형이 산출되었다. 운동 연합 (ka) 및 해리 (kd) 속도 상수는 Scrubber 2.0 곡선 피팅 소프트웨어를 이용하여 데이터를 프로세싱하고, 이를 1:1 결합 모델에 피팅함으로써 결정되었다. 결합 해리 평형 상수 (KD) 및 해리 반감기 (t1/2)는 운동 속도 상수로부터 다음과 같이 산출되었다: KD (M) = kd/ka; 그리고 t1/2 (분) = (ln2/(60*kd).
Figure 112017063914847-pct00021
표 14의 결과에서 설명하듯, SPR 분석에서 항체 1 및 항체 2 이중특이적 항체들은 야생형 (wt) hIgG1 또는 hIgG4-CPPC CH 영역을 갖는 항체들과 비교하여, 인간 FcγRI에 결합을 나타내지 않는다. wt hIgG1 또는 hIgG4-CPPC Fc 서열을 가진 황체들과 비교하여, 본 발명의 키메라 중쇄 이중특이적 항체들은 또한 몇 가지 낮은-친화력 인간 FcRγ 수용체들에 대해 약한 결합을 나타내거나 또는 결합을 나타내지 않는다 (가령, 인간 FcRγIIA, FcRγIIB에서는 약한 결합, 그리고 인간 FcRγI, FcRγIIIA, 또는 FcRγIIIB에서는 탐지된 결합이 없음)(하기 표 15).
Figure 112017063914847-pct00022
실시예 9- 키메라 항체들의 약동학 프로파일
항체 1 및 항체 2의 독성역학 프로파일은 30-분 IV 주입을 한번 받고, 이어서 12-주 관찰된 시노몰구스 수컷 원숭이들 (3마리 동물/치료집단)의 혈액 시료를 획득하여 평가되었다. 혈청에서 전체 약물 농도의 독성 역학 분석을 위한 혈액 시료는 투여-전 그리고 투여-후 5 분, 및 5시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 168 시간, 그리고 14일차, 21일차, 35일차, 49일차, 66일차 및 84일차에 수집되었다. 결과적으로 얻은 혈청 시료는 Ab 1 또는 Ab 2의 전체 약물 농도를 결정하기 위하여 직접적인 효소 연계된 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 분석되었다. 테스트 물품의 독성 역학은 약동학적 매개변수들을 결정하기 위하여, 비-구획성 분석 (Phoenix WinNonLin)을 이용하여 평가되었다. 결과는 표 16에 나타낸다 (AUC = 시간 곡선에 대한 농도 아래 면적; Cmax = 혈청에서 관찰된 최대 농도).
Figure 112017063914847-pct00023
시노몰구스 원숭이들에게 1.0 mg/kg의 Ab 1 및 Ab 2의 단일 정맥 투여후, 평균 절정 농도 (Cmax)는 33.4 및 26.0 μg/mL이며, 그리고 평균 AUC0 -168h 값은 100 및 61.1 일일*ug/mL으로 관찰되었다. 겉보기 말단 반감기는 이 두 분자의 8.14-14.0 일 사이인 것으로 추정되었다. Ab 1 및 Ab 2에 지속적인 노출은 12-주 관찰 기간 대부분 동안 모든 동물에서 유지되었고, 치료 집단 간에 노출은 비교가능하였다는 것을 데이터에서 나타낸다. 테스트 물품의 겉보기 면역원성은 관찰되지 않았다. Ab 1 및 Ab 2의 전반적인 약동학적 프로파일은 시노몰구스 원숭이에서 투여된 단일클론 항체들의 전형이다.
실시예 10. CD3 x CD20 이중특이적 항체들은 단일특이적 항체보다 더 낮은 용량으로 시노몰구스 원숭이들에게서 CD20+ B-세포들을 고갈시킬 수 있다.
항체 1 및 대조 항체 4, CD3xCD20 이중특이적 항체 투여의 생체내 잠재력을 결정하기 위하여, 시노몰구스 원숭이들의 말초혈액에서 CD20+ B-세포 수준들의 변화는 단일특이적 항-CD20 항체 (대조 Ab 3)과 비교하여 항-CD3xCD20 이중특이적 항체의 투여 후 FACS를 통하여 검사되었다. 본 연구는 다음과 같이 투약 군당 3마리 동물의 8개 용량 군으로 구성된 수컷 시노몰구스 원숭이들 (마카카 파스키술라리스(Macaca fascicularis))에서 실행되었다: 그룹 1은 플라시보 집단 (비이클 대조 투여)이며; 그룹 2는 단일특이적 항체 (대조 Ab 3; 리투산)을 30 mg/kg (원숭이에서 30 mg/kg는 상기 인간 용량의 375 mg/m2에 상응하며, 이는 최대 임상 용량으로 간주됨)을 제공받았으며; 그룹 3은 이중특이적 CD3xCD20 대조 항체 4를 0.01 mg/kg으로 제공받았으며; 그룹 4-항체 4를 0.1 mg/kg로 제공받았으며; 그룹 5-항체 4를 1 mg/kg로 제공받았으며; 그룹 6-항체 1을 0.01 mg/kg로 제공받았으며; 그룹 7-항체 1을 0.1 mg/kg로 제공받았으며; 그리고 그룹 8-항체 1을 1 mg/kg로 제공받았다. 동물에 투여하기 전 -7일 및 -4일차에 혈액을 빼내었다. 항체 약물 또는 비이클 (플라시보)의 용량은 i.v. 주입에 의해 투여되었고, 혈액은 투여 후 2일차, 4일차, 및 7 일차에 빼내었다. 혈액 시료는 B 세포 (CD20; 표 17) 및 T 세포 (CD3, 하기 참고) 표지자들에 대하여 FACS에 의해 분석되었고, 이들 세포 유형들의 절대적 수가 측정되었다.
간략하게 설명하자면, 100 μl의 혈액은 3분 동안 Eppendorf 튜브 안에 1.5 ml RBC 용해 완충액과 함께 항온처리되었다. 세포들은 0.4xg에서 5분 동안 원심분리되었고, FACS 세척액 (PBS+3%FBS)으로 2x 세척되었고, Fc 차단 시약으로 실온에서 10분 동안 차단되었다. 그 다음 세포들은 hCD45 및 CD20 형광 시약에 대하여 직접적으로 공액된 항체들과 함께, 4℃에서 30분 동안 항온처리되었다. B 세포 하위세트 (CD20) 또는 T 세포 하위세트 (CD3)의 정량적 결정은 백색 혈액 세포 (WBC) 집단을 기술하기 위하여, CD45 형광 착색 및 측면 분산 특징적 (SSC) 분계 (CD45brightSSCdim)로 구성된 이질적 게이팅 전략을 이용하여 우선 실행되었다. 그 다음 B 세포 집단은 관련 형광 라벨된 항체들(CD20 APC-Cy7)을 사용하여 식별되었다. 착색 후, 세포들은 FACSCanto 세포측정기에 의해 FACS 획득 및 FlowJo 소프트웨어로 분석 전, 2회 세척되었다. 결과는 표 17 및 도 11a와 11b에 나타낸다.
Figure 112017063914847-pct00024
표 17 및 도 11a에 나타낸 것과 같이, CD3xCD20 이중특이적 항체들 및 상기 항-CD20 단일특이적 항체의 투여로 측정된 제 1 시점(2일차)에서의 기준 수준으로 순환하는 B-세포들의 수가 감소되었다. 플라시보 대조 동물 코호트에서 이러한 고갈은 나타나지 않았다. 상기 이중특이적 코호트에서 B-세포 고갈은 1 mg/kg 용량의 이중특이적 항체들의 투여 후 1 주 동안 유지되었으며, 마찬가지로 B-세포 고갈은 0.01 및 0.10 mg/kg 용량의 이중특이적 코호트에서도 유지되었다.
본 실험에서 T-세포 (CD3+) 수준들은 또한 형광 라벨된 항-CD3 항체들에의해서도 모니터되었다. 순환하는 T-세포들의 일시적 상실이 상기 이중특이적 항체 (Ab 4 및 Ab 1; 모든 용량) 코호트에서 투여 후 2일 차에 관찰되었다. 측정된 시점에서 비이클 (플라시보) 대조 또는 대조 Ab 3 (리투산) 집단에서는 T-세포의 상실(기준 이하)이 관찰되지 않았다. 4일차에 상기 이중특이적 항체 코호트에서 T-세포 수준들이 기준 수준으로 회복되었으며, 실험 종료시까지 기준 수준에서 유지되었다 (도 11b).
상기에서 설명된 연구와 유사하게, CD20+ B-세포 수준들 또는 CD3+ T-세포 수준들에서의 변화를 측정하는 장기(3개월) 연구에서 시노몰구스 원숭이들의 말초 혈액에서 항체 1 및 항체 4, CD3xCD20 이중특이적 항체들의 생체내 능력이 측정되었다. 플라시보 (비이클) 또는 이중특이적 항체들은 1.0 mg/kg의 농도로 0일차 시점에 투여되었다. 말초 혈액에서 B-세포 수준들은 이중특이적 항체 코호트 모두에서 2일 차에 상당히 고갈되었고, 플라시보를 제외한 모든 시료에서 연구 기간에 걸쳐 고갈된 수준이 유지되었다(도 12a 참고). 이중특이적 항체들로 처리를 받은 동물들의 경우 연구 기간 동안 계속(>80일) 관찰하였을 때, 이중특이적 코호트에서 2일차에 일시적인 T-세포들의 상실이 관찰되었고, 4일차에 기준 수준으로 회복되었고, 그리고 기준 수준 주변에서 유지되었다. (도 12b). 플라시보로 처리된 동물들에서 일시적인 T-세포들의 상실은 관찰되지 않았다.
낮은 투여 용량에서 항체 1 및 항체 4, CD3xCD20 이중특이적 항체의 생체내 효능을 더 측정하기 위하여, CD20+ B-세포 수준들 또는 CD3+ T-세포 수준들에서 변화는 상기 실험과 유사하게 장기(2개월) 연구에서 시노몰구스 원숭이들의 말초 혈액에서 측정되었다. 이중특이적 항체들은 0일차에 0.01 mg/kg 또는 0.001 mg/kg (1 μg/kg)로 투여되었다. 더 높은 용량의 CD3xCD20 이중특이적 항체들로 처리된 동물들에서 관찰된 것과 유사하게(표 17 및 도 11a 또는 12a 참고), CD3xCD20 코호트의 경우 (도 13a), 말초 혈액에서 B-세포 수준들은 2일차에 상당히 고갈되었고, 플라시보를 제외한 모든 시료에서 연구 기간에 걸쳐 고갈된 수준이 유지되었다. 매우 낮은 용량 (1 μg/kg)의 이중특이적 항체들로 처리를 받은 동물들은 더 높은 용량의 CD3xCD20 이중특이적 항체들로 처리를 받은 동물에서 볼 수 있는 것과 같이, 동일한 일시적 T-세포들의 상실과 회복을 경험한다. (도 11b 또는 12b와 비교하여 도 13b 참고).
설명된 연구들에서 관찰된 B-세포 상실은 CD3xCD20-키메라Fc 항체 1로 처리된 동물의 말초혈액에서 순환 항체의 상실과 관련있었다 ( 도 14 참고). 동물의 순환계에서 항체 노출은 시간의 경과함에 따라 고갈되어, B-세포 집단은 회복하기 시작한다 (가령, 동물 번호 I06881의 경우 81일차에 관찰된 것과 같이).
말초혈액에서 순환 항체의 상실과 B-세포 상실의 관련성은 CD3xCD20-키메라Fc 항체 2로 처리된 동물들에서 또한 볼 수 있었고 (도 15 참고), 반면 동물들의 순환계에서 항체 노출은 시간이 경과함에 따라 고갈되었고, 그다음 B-세포 집단이 회복되기 시작하는데, 가령, 동물 번호. I06876의 경우 66일차에 관찰되었으며, 동물 번호. I06877의 경우 68일차에 관찰되었다. CD3xCD20-wtFc (Ab 4) 이중특이적 항체로 처리된 동물에서도 유사한 관련성이 또한 관찰되었다 (도 16 참고). 동물의 순환계에서 항체 노출은 시간의 경과함에 따라 고갈되기 때문에, B-세포 집단은 회복하기 시작한다(도 16 참고, 가령, 동물 번호 I06870의 경우 91일차에 관찰되며, 동물 번호 I06872의 경우 64일차에 관찰된다).
실시예 11. CD3 x CD20 이중특이적 항체들은 단일특이적 항체보다 더 낮은 투여분향으로 시노몰구스 원숭이들의 림프구 조직에서 CD20 + B-세포들을 고갈시킬 수 있다.
시노몰구스 원숭이들의 림프구 조직에서 CD20+ B-세포 수준의 변화는 단일특이적 항-CD20 항체 (대조 Ab 3-리투산)와 비교하여 항-CD3xCD20 이중특이적 항체 (항체 1 또는 항체 4) 투여 후 FASC를 통하여 검사되었다. 이 연구는 상기 실시예 10에서 제시된 그룹 1-8과 유사하게, 투약 군당 3마리 동물의 8개 용량 군으로 구성된 수컷 시노몰구스 원숭이들 (마카카 파스키술라리스(Macaca fascicularis))에서 실행되었다. 항체 약물 또는 비이클의 용량은 i.v. 주입에 의해 투여되었으며, 동물은 투약후 7일차에 희생되었고, 조직이 수거되었다. 조직 시료는 백색 혈액 세포 (CD45+), 특히 B 세포 (CD20+), 표지자들에 대하여 FACS에 의해 분석되었고, 그 다음 B 세포들의 용적 %이 결정되었다.
B 세포 집단은 상기 실시예 10에서 설명된 방법과 유사하게, 관련 형광 라벨된 항체들(CD20 APC-Cy7)을 사용 및 FACS 획득을 통하여 식별되었다. 결과는 표 18과 도 17a 및 17b에서 나타낸다.
Figure 112017063914847-pct00025
표 18 및 도 17a에 나타낸 것과 같이, 상기 항-CD20 단일특이적 항체와 비교하여 CD3xCD20 이중특이적 항체들의 투여로 상기 이중특이적 코호트의 경우 훨씬 더 낮은 용량(0.01 내지 1.0 mg/kg 용량)에서 비장내 조직 B-세포가 고갈되었다. 이 고갈은 플라시보 대조 동물 코호트에서는 나타나지 않았다.
표 18 및 도 17b에 나타낸 것과 같이, 상기 항-CD20 단일특이적 항체와 비교하여 CD3xCD20 이중특이적 항체들의 투여로 상기 이중특이적 코호트의 경우 훨씬 더 낮은 용량(0.01 내지 1.0 mg/kg 용량)에서 장간막림프절내 조직 B-세포가 고갈되었고, 0.1 mg/kg 용량 및 1 mg/kg 용량의 이중특이적 항체는 단일특이적 코호트보다 더 효과적으로 B-세포를 고갈시켰다. 플라시보 대조 동물 코호트에서 이러한 고갈은 나타나지 않았다.
실시예 12. CD3 x CD20 이중특이적 항체를 이용한 종양 치료
A. CD20 x CD3 이중특이적 항체를 이용한 치료는 NSG 마우스에서 Raji 종양 성을 억제한다.
Raji 종양 성장 감소에 있어서 선택된 항-CD3xCD20 이중특이적 항체들의 효과를 평가하기 위하여, Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, USA)에서 구입한 NSG 마우스 (NOD/LtSz-scid/IL2Rγnull 마우스)의 피하로 2x106 Raji 종양 세포들과 5x105 인간 PBMCs를 공동 이식하였다(0일차). 같은 날, 마우스 한 마리당(한 치료 집단에 N-=5마리) 용량 0.4, 0.04 또는 0.004 mg/kg의 항체 1, 또는 대조 항체 5 (무관한 표적에 대한 IgG1 항체), 또는 비이클 대조로 마우스를 처리하였다. 0일차에 시작하여, 상기 마우스는 남은 연구 기간 동안 주당 2회씩 복강내 용량의 약물 또는 비이클로 처리되었다. 칼리퍼를 이용하여 주당 2회 종양 크기를 측정하였고, 종양 용적은 다음과 같이 산출되었다: 용적 = (길이 x 폭2)/2. GraphPad 소프트웨어 Prism 5.0 (MacIntosh Version)을 이용하여 통계학적 분석을 실행하였다.
Tukey의 다중 비교 포스트-테스트와 함께 2-원 ANOVA에 의해 통계학적 유의성이 결정되었다. 각 판독의 데이터는 치료 그룹에 걸쳐 비교되었다. p<0.05 역치는 통계학적으로 유의적인 것으로 간주되었다. 결과는 도 7a-7f에 나타낸다. 이러한 결과에서 공동-이식된 인간 면역 세포들을 가진 마우스에서 항체 1 (CD3xCD20-키메라Fc)은 Raji 종양을 표적으로 하여, 테스트된 투여 용량에서 완전한 종양 성장 억제를 초래하였음을 보여준다 (도 7c: 0.4 mg/kg Ab1; 도 7e: 0.04 mg/kg Ab1; 도 7f: 0.004 mg/kg Ab1). 본 실시예는 CD3xCD20 이중특이적 항체 1을 이용한 치료는 종양 이식 시점에서 시작하여 종양 성장을 억제하는데 효과적임을 실증한다. 대조와 비교하여 0.4, 0.04 또는 0.004 mg/kg 용량의 항체 1을 제공받은 마우스에서 이식 후 최대 23일까지 Raji 종양 성장이 완전하게 억제 유지되었다. 항체 1 또는 대조 항체는 연구 동안 마우스 체중에 유의적인 효과를 가지지 못하였음이 또한 관찰되었다 (데이터 나타내지 않음).
CD3xCD20 이중특이적 항체들의 항종양 효과는 유사한 NSG 마우스 모델 (상기에서 설명됨)에서 추가 테스트되었지만, 그러나 각 NSG 마우스에게 -1일차에 1 mg의 마우스 IgG (mIgG2a Fc)가 투여되었고, 그 이후 주당 일회 투여되었다. 결과는 도 8a-8b에 나타낸다.
본 실험은 CD3xCD20 이중특이적 항체 1 (CD3xCD20-키메라Fc) 또는 CD3xCD20 이중특이적 항체 4 (CD3xCD20-wtFc)를 이용한 치료는 순환하는 IgG 존재 하에 테스트된 이중특이적 Ab의 용량에서 종양 이식 시점에서 시작되는 종양 성장 억제에 효과적이었음을 설명한다 (도 8a-8b). 도 8a에서 볼 수 있는 바와 같이, 항체 1 (CD3xCD20-키메라Fc 이중특이적 항체)은 이 실험에서 IgG 보충과 함께 또는 보충없이 테스트한 기간에 걸쳐 완전한 종양 성장 억제를 실증하였다.
B. CD3 x CD20 이중특이적 항체를 이용한 치료는 NSG 마우스에서 확립된 종양을 축소시킨다
NSG 마우스에서 확립된 종양의 감소에 있어서 선택된 항-CD3xCD20 이중특이적 항체들의 효과가 평가되었다. NSG 마우스 (NOD/LtSz-scid/IL2Rγnull 마우스)는 Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, USA)로부터 구입하였으며, HLA-일치된 Raji 종양 세포들 (2x106) 및 인간 PBMCs (5x105)이 피하로 공동-이식되었다(-15일차). 치료에 앞서 15일 동안 이 숙주 안에서 종양이 확립되도록 하였다. 약물 투여 하루 전 (-1일차), 상기 마우스에게 5 mg의 mIgG2a Fc 보충물이 각각 투여되었다. 상기 마우스에게 연속하여 실험 기간 동안(7일차, 14일차 등) 주당 일회 마우스당 5mg으로 mIgG2a Fc가 투여되었다. 마우스는 종양 크기에 따라 약물 투여에 앞서 2개 실험군으로 분리되었다: 그룹 1: ~200-400 mm3 또는 그룹 2: ~500-900 mm3.
약물 치료 후, 0일차, 3일차, 6일차, 10일차, 14일차, 17일차, 21일차 및 28일차에 각 마우스에서 종양 크기가 모니터되었고, 기록되었다. 칼리퍼를 이용하여 주당 2회 종양 크기를 측정하였고, 종양 용적은 다음과 같이 산출되었다: 용적 = (길이 x 폭2)/2. 촉지를 통하여 종양의 존재가 또한 결정되었다. GraphPad 소프트웨어 Prism 5.0 (MacIntosh Version)을 이용하여 통계학적 분석을 실행하였다. 각 판독의 데이터는 치료 그룹에 걸쳐 비교되었다. 도 9와 도 10에 결과를 나타낸다.
a. 그룹 1: ~200-400 mm3 종양. 0일차에 시작하여, 각 4 또는 5마리의 몇개 코호트는 주당 일회 (가령, 7일차, 14일차, 등등) 표시된 용량의 약물 또는 비이클로 다음과 같이 처리되었다:
i. 대조: 비이클 단독
ii. 대조 항체 5, 0.4 mg/kg
iii. 항체 1 (CD20xCD3-키메라Fc), 0.4 mg/kg
b. 그룹 2: ~500-900 mm3 종양. 0일차에 시작하여, 각 4마리의 몇개 코호트는 주당 일회 (가령, 7일차, 14일차, 등등) 표시된 용량의 약물로 다음과 같이 처리되었다:
i. 대조 항체 5, 0.4 mg/kg
ii. 항체 1 (CD20xCD3-키메라Fc), 0.4 mg/kg
0.4 mg/kg의 항체 1 (CD20xCD3-키메라Fc)이 투여된 코호트에서 14 일차에 종양이 완전히 퇴행되었다. 도 9 참고.
더 큰 종양이 있는 모델(가령, 그룹 2, ~500-900 mm3)에서, 항체 1 (CD20xCD3-키메라Fc) 치료 (0.4 mg/kg)하면, 마우스에서 관찰된 종양이 21일차에 완전하게 제거되었다. 도 10 참고.
실시예 13. CD3xCD20 이중특이적 항체들은 시험관내 PBMC 증식을 유도한다.
ATP 촉매된 정량화 (CellTiter Glo®)를 이용하여 말초혈액 단핵 세포들 (PBMCs)를 자극하고 증식을 유도하는 선택된 CD3xCD20 이중특이적 항체들 및 대조 구조체의 능력을 평가하였다. PBMCs의 활성화로 사이토카인이 방출되며, 이는 세포의 증식을 구동시킨다.
다음 프로토콜을 이용하여 증식 데이터를 획득하였다: 인간 또는 시노몰구스 원숭이 유도된 PBMCs (5x105 /웰)는 CD3xCD20 이중특이적 항체들 또는 대조 항체와 시판되는 항-CD28 항체 (인간: 200　ng/mL, 시노몰구스: 500 ng/mL)의 일련의 희석물과 함께 72 시간 동안 37℃에서 항온처리되었다. Cell Titer Glo®를 이용하여 세포를 정량화시키고, VICTOR X5 다중-라벨 플레이트 판독기 (PerkinElmer)를 이용하여 세포 생존력에 대한 판독으로 발광을 측정하여 살아있는 세포들을 탐지한다. 세포 생존력 (미자극된 세포와 비교하여 자극된 세포의 유도 배수)은 자극된 세포의 발광을 자극안된 세포의 기준 발광으로 나누어 결정하고, Prism 소프트웨어를 이용하여 그래프화되었다. 결과는 표 19와 도 18a 및 18b에 요약되어 있다.
Figure 112017063914847-pct00026
표 19와 도 18a-18b에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 CD20 x CD3 이중특이적 항체들은 모두 인간 또는 시노몰구스 PBMCs의 증식을 유도하였다. 항체 1은 대략 대등한 효능으로 인간과 시노몰구스 PBMC의 증식을 유도하였다. 대조 Ab 5는 활성을 나타내지 않았다.
실시예 14. CD20 x CD3 이중특이성은 시험관에서 활성화된 T-세포들에 의한 세로 사멸을 중재한다.
인간 또는 시노몰구스 PBMCs는 각각 피콜-플락 또는 임파세포 포유류 세포 분리 배지를 이용하여 단리되었다. 단리된 PBMCs (1x106 세포들/mL의 인간 PBMCs 또는 5x106 세포들/mL의 시노몰구스 PBMCs)는 재조합 인간 IL-2 (인간 PBMCs의 경우 30 U/mL, 시노몰구스 PBMCs의 경우 100 U/mL) 및 T 세포 활성화 비드 (인간 PBMCs의 경우 항-CD3/CD28, 시노몰구스 PBMCs의 경우 항-CD2/CD3/CD28)를 함유하고 있는 완전 배지(10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 292 μg/mL L-글루타민이 보충된 RPMI)에서 각각 7일 및 21 일 동안 활성화되었다. CD20 발현시키는 Raji 세포들 (2x106 세포들/mL)은 8 μM 칼세인-AM으로 30 분 동안 37℃에서 라벨되었고, 배지로 3회 세척되었다. 칼세인-라벨될 표적 세포들 (10,000-20,000개의 세포/웰)은 활성화된 T 세포들 (이펙터/표적 세포 비율 10:1)과 함께 200 μL 안에 도말하고, 완전 배지 안에 항체 1, Ab 4 또는 대조 Ab 5 (인간 농도 범위: 2nM 내지 0.00003nM; 시노몰구스 농도 범위: 6.6nM 내지 0.002pM)의 연속 희석물로 2 시간 동안 37℃에서 항온처리되었다. 항온처리 후, 플레이트는 원심분리되었고, 상청액은 형광분석을 위하여 반투성 검성 투명 바닥 플레이트로 옮겼다. 다음 식을 이용하여 세포독성 백분율이 산출되었다:
세포독성 % = ((FS-FSR)/(FMR-FSR))*100%,
이때 FS는 테스트 웰로부터 칼세인 방출이며, FSR은 자발적 칼세인 방출이며, FMR는 트리톤-X에 의해 용해된 세포들로부터 최대 칼세인 방출이다.
세포 생존력 (ATP 촉매된 정량화)의 EC50은 Prism 소프트웨어를 이용하여 결정되었다. 세포 용해 (세포독성)는 최대 방출의 분획으로써 칼세인 방출에 의해 측정되었다. 세포의 세포독성 백분율은 결정된 최대 방출 및 EC50 값과 비교하여 관찰된 방출로 산출되었다. 결과는 표 20과 도 19a (인간 T-세포들) 및 19b (원숭이 T-세포들)에 나타낸다.
Figure 112017063914847-pct00027
표 20에 나타낸 것과 같이, 항체 1은 인간 (도 19a) T 세포들과 시노몰구스 (도 19b) T 세포들에 대한 차례로 대표적인 EC50 값 25.0ρM 및 9.10ρM으로 표적 세포 사멸을 중재하였다. 항체 4는 인간 (도 19a) T 세포들과 시노몰구스 (도 19b) T 세포들에 대한 차례로 대표적인 EC50 값 15.7ρM 및 1.73ρM으로 표적 세포 사멸을 중재하였다. 대조의 활성은 관찰되지 않았다.
유동세포측정에 의해 CD20-보유하는 표적 세포들의 특이적 사멸을 모니터하기 위하여, B16F10.9 부모 뮤린 골수종 세포들 (CD20을 발현시키지 않음) 및 인간 CD20 (B16F10.9/CD20)를 안정적으로 발현시키도록 작제된 B16F10.9 세포들은 차례로 1μM의 형광 추적 염료 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙시니미딜 에스테르 (CFDA-SE) 및 바이올렛 세포 추적자로 라벨되었다. 라벨링 후, 세포들은 1:1 비율로 혼합되었고, 37℃에서 하룻밤 동안 도말되었다. 별도로, 인간 PBMCs는 1x106 세포/mL에서 보충된 RPMI 배지에 도말되었고, 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리되어, 흡착된 대식세포들, 수지상 세포들, 그리고 일부 단핵구를 고갈시킴으로써 림프구에 대하여 농축되었다. 그 다음날, 표적 세포들은 흡착 세포-고갈된 순수(
Figure 112023012738684-pct00028
) PBMC (이펙터/표적 세포 4:1 비율)와 테스트 CD3xCD20 이중특이적 항체들 또는 IgG1 대조 항체 5 (농도 범위: 66.7nM 내지 0.25ρM)의 일련의 희석물과 함께 48 시간 동안 37℃에서 공동-항온처리되었다. 세포들은 효소-없는 세포 해리 완충액을 이용하여 세포 배양 플레이트로부터 제거되었고, FACS에 의해 분석되었다. FACS 분석을 위하여, 세포들은 죽은/살아있는 근적외선 세포 추적자 (Invitrogen)로 착색되었다. 사멸의 특이성을 평가하기 위하여, 세포들은 살아있는 바이올렛 및 CFDA-SE 라벨된 집단에서 게이트되었다. 각 집단의 백분율은 다음과 같이 조정된 생존의 산출에 대하여 보고된다: 조정된 생존=(R1/R2)*100, 여기에서 항체 없을 때R1=[(B16F10.9/CD20)/주변(bystander) 세포들 (B16F10.9)]*100, 그리고 R2=동일 비율, 단 테스트 항체 존재하는 경우.
Figure 112017063914847-pct00029
CD3xCD20-키메라Fc (항체 1) 및 CD3xCD20-wtFc (항체 4)는 모두 혼합 세포 집단 안에서 인간 T 세포들에게 특이적으로 지향되어 CD20을 발현시키는 표적 세포만을 죽인다 (도 20a-b). 상기 이중특이적 항체들 존재하에서 항체 1 (EC50 19.5ρM) 및 항체 4 (EC50 12.8ρM)에 의해 용량-의존적 방식으로 고갈된 B16F10.9/CD20 세포들에서만 표적 세포 사멸이 관찰되었다 (도 20b). 테스트된 최대 용량(10 μg/mL)에서 CD20-발현시키는 세포들의 5% 미만이 생존하였다. (도 20b). B16F10.9 부모 세포 집단 또는 대조 Ab 5, IgG1 대조 항체와 함께 B16F10.9/CD20 집단에서는 세포 사멸 증거가 관찰되지 않았다.
실시예 15. CD3xCD20 이중특이적 항체는 20 시간 FACS 시험관 분석에서 T 세포에 있어서 조기 활성화 표지자 CD69를 상향조절한다.
CD69+는 가장 조기에 유도가능한 세포 표면 표지자들중 하나이며, 이는 T 세포들이 활성화되었다는 것을 나타낸다. T-세포 활성화는 특이적 세포 표면 표지자들, 이를 테면 CD69의 상향-조절을 검사함으로써 결정될 수 있다.
전혈에서 인간 또는 시노몰구스 T 세포에 있어서 조기 활성화 표지자 CD69를 상향조절하는 CD3xCD20 이중특이적 항체의 능력은 20 시간 시험관 FACS 분석에 의해 결정되었다. 간략하게 설명하자면, T 세포 활성화는 편평한 바닥 96웰 플레이트 안에서 RPMI+L-글루타메이트 존재 하에 항체 1, 항체 4 또는 대조 Ab 5 (농도 범위 50nM 내지 0.0006nM)의 5-배 (인간) 또는 10-배 (시노몰구스) 연속 희석물과 함께 새로 단리된 단리된 인간 또는 시노몰구스 전혈 (100 μL)을 최종 용적 200 μL로 20 시간 동안 37℃에서 항온처리함으로써 평가되었다. 항온처리 후, 상기 플레이트는 5 분 동안 1000 rpm에서 회전시켜, 혈장이 제거되었다. T 세포에서 CD69 상향 조절을 측정하기 위하여, CD2 및 CD69, 뿐만 아니라 CD45, CD4, CD8, 그리고 CD19 (인간) 또는 CD16 (시노몰구스)에 직접적으로 공액된 항체들을 포함하는 표현형결정 칵테일을 상기 혈액에 30 분 동안 4℃에서 추가하였다. 제조업자의 지시에 따라 붉은 혈액 세포들은 15 분 동안 1.5 mL PharmLyse 완충액과 함께 용해되었다. 세포들은 2회 세척되었고, 200 μL 냉각 PBS + 1%　FBS에 재현탁되었고, BD FACSCanto 세포측정기를 이용하여 유동세포 분석에 의해 분석되었다. CD4+ T 세포들은 생존가능한 작은 CD45+ 림프구 상에서 우선 게이팅하고, 그 다음 CD19-/CD2+/CD4+ T 세포들 (인간) 또는 CD16-/CD2+/CD4+ T 세포들 (시노몰구스)에서 게이팅함으로써 식별되었다.
전체 CD2+ 이펙터 세포들중에서 활성화된 (CD69+) T 세포의 백분율이 보고된다. 표 22 및 도 21 참고 상기 결과에서 CD3xCD20 이중특이적 항체들은 조기 활성화 표지자 CD69에 의해 탐지되는 T 세포를 상당히 활성화시켰다는 것을 보여준다.
Figure 112017063914847-pct00030
실시예 16. CD3xCD20 이중특이적 항체들은 표적 세포들과 T 세포의 클러스터링을 유도한다.
세포 클러스터링 포멧을 이용하여 CD3xCD20 이중특이적 항체는 이의 이중특이적 결합 아암을 통하여 T-세포들을 표적 세포들 (CD20+ 세포들)에 연결시키는지를 결정하였다. 이펙터 세포들은 CFSE로 사전착색되었으며, CD20+ 세포들은 24시간 동안 바이올렛 세포 추적자로 사전착색되었고, 무관한 대조 항체 (대조 항체 5, 무관한 IgG1 아이소타입 항체)와 함께 항온처리 후 사분역으로 분리하기 위하여 게이팅되었다. 무관한 항체를 이용한 치료에서 세포 혼합물에 클러스트링(이중-착색)이 없음을 나타내는 도 22a 참고. CD3xCD20 이중특이적 항체로 항온처리후, CFSE와 바이올렛 모두로 착색되었기 때문에 세포 클러스터들이 나타난다 (도 22b 참고, 산점도 상에 좌측 상부 사분위 참고, 굵은 사각형으로 강조되어 있음).
실시예 17. CD3 + 세포들 상에서 저해성 Tim-3 및 PD-1 표지자들의 발현
종양을 가진 숙주들에서 T 세포 기능이상, 또는 소진(exhaustion)이 발생한다. Tim-3 및 PD-1 수용체들은 만성 질환 상태에서 소진된 T 세포의 표지자들로 확인되었다. 연구자들 Sakuishi, K. et al. (J. Exp . Med. 207(10):2187-2194, 2010)에 따르면, Tim-3 및 PD-1 (Tim-3+PD-1+TILs)에 양성인 종양-침윤 림프구(TILs)는 IL-2, TNF, 및 IFN-γ를 증식시키고, 생산하는 것의 실패로 정의된 가장 심각한 소진된 표현형을 나타낸다.
CD3-양성 세포들은 HLA-일치된 Raji 종양 세포들 및 인간 PBMCs가 피하에 공동-이식된 NSG 마우스의 혈액과 종양으로부터 추출되었다-상기 실시예 12B를 참고. 간략하게 설명하자면, 종양은 치료 15일 전 숙주에서 확립되도록 하였고, 그 다음 상기 마우스는 종양 크기에 따라 2개 치료군으로 분리되었다 (실시예 12B 참고). 각 연구 그룹으로부터 9일차에 처리된 마우스 (이중특이적 Ab) 와 미처리된 마우스로부터 혈액을 채집하였다, 가령, 그룹 1, ~200-400 mm3 또는 그룹 2, ~500-900 mm3. 1500 mm3에 이르는 종양을 가진 미처리된(비이클 또는 대조 Ab 마우스는 연구 종료시 희생되었고, 이들 종양은 PD1 및 Tim-3의 발현에 대하여 테스트되었다.
순환하는 T 세포 실험을 위하여, 생존가능한 CD45+CD3+ T 세포들 분획은 Tim-3 또는 PD-1 (Biolegend로부터 시판)에 대한 직접-라벨된 항체를 이용하여 표지자 식별을 위하여 선택되었다. Tim-3+PD-1+ 세포들은 미처리된 동물의 혈액에서 순환하는 T 세포들의 우세한 분획이었다. 그러나, CD20xCD3 이중특이적 항체 (Ab 1) 처리된 동물들의 혈액내 T 세포는 Tim-3+PD-1+ 세포들의 하위 분획을 나타내었다.
미처리된 숙주의 종양 세포들은 분리되었고, 생존능에 대하여 착색되었다. CD45+CD3+ 세포 분획에 대하여 분류하기 위하여 생존가능한 단일 세포에 대한 FACS 분석이 실행되었으며, 그 다음 Tim-3 또는 PD-1 발현에 대하여 테스트되었다.
저해성 수용체 Tim-3 및 PD-1은 실시예 12B에서 설명된 실험 동안 미처리된 마우스의 NSG B 세포 림프종에서 CD3+ TILs 상에서 발현되었으며, Tim-3+PD-1+ 세포들은 T 세포 침윤 종양의 우세한 분획이었음을 알아내었다.
실시예 18. CD3 x CD20 이중특이적 항체를 이용한 치료는 확립된 Raji 종양을 가진 NSG 마우스에서 항- CD20 + 항체보다 더욱 효과적이다.
NSG 마우스에서 확립된 종양의 감소에 있어서 선택된 항-CD3xCD20 이중특이적 항체들의 효과가 평가되었다. NSG 마우스 (NOD/LtSz-scid/IL2Rγnull 마우스; Jackson Laboratories)에게 Raji 종양 세포들 (2x106) 및 인간 PBMCs (5x105)를 피하로 공동-이식되었다(-14일차) (실시예 12B와 유사하게).
확립된 Raji 종양의 억제에 있어서, 상기 CD20xCD3 이중특이적 Ab1 (0.4mg/kg에서 투여됨; 2x/주 i.p.)는 CD19xCD3 BiTE (0.5mg/kg에서 투여됨; 5x/주 i.v.)와 필적하였으며 (도 23), 리툭시맙 요법 (8 mg/kg에서 투여됨; 5x/주 i.p.) (도 24)보다 우수하였다.
실시예 19. CD3 x CD20 이중특이적 항체를 이용한 흑색종 치료
연구자들은 환자의 흑색종 암의 특정 하위집단, 이를 테면 CD20+ 흑색종 종양 세포들은 종양-개시 특징들을 나타내고, 질병 재발의 더 높은 위험을 나타낼 수 있다고 결정하였다 (Pinc et al. Mol Ther. 20(5):1056-1062, 2012, epub 2012 Feb 21). 상기 CD20xCD3 이중특이적 항체 Ab1은 면역-기능있는(competent) 마우스에서 hCD20-형질변형된 B16F10.9 (B16F10.9/CD20) 종양 성장을 상당히 지연시켰기 때문에, CD20을 발현시키는 다른 종양 세포에 대항한 강력한 활성을 입증하였다.
실시예 20. CD20 -직접적인 항체 요법으로 기존에 치료를 받은 CD20 + B-세포 악성종양을 가진 환자들에서 항- CD20xCD3 이중특이적 단일클론 항체의 안전성 및 내약성을 연구하기 위한 상 1 임상 시험
연구 목적 및 개요
본 연구의 주요 목적은 정맥내 투여된 항 CD20xCD3 이중 특이성 단일 클론 항체의 안전성, 내약성 및 용량-제한 독성 (DLTs)을 평가하는 것이다. 본 발명에 이용된 항-CD20xCD3 이중특이적 단일클론 항체는 본원에서 ＂Ab1＂로 언급된 항체다.
연구의 2차 목적은 다음과 같다: (a) Ab1의 약동학 (PK) 프로파일을 특성화하기 위해; (b) Ab1의 면역원성을 평가하기 위하여; (c) 이전에 항-CD20 항체 요법으로 치료받은 CD20 + B 세포 악성 종양 (비호지킨 림프종 [NHL] 및 만성 림프구성 백혈병 [CLL]) 환자에게 투여된 Ab1의 예비 항종양 활성을 연구하기 위하여.
연구의 특정 탐색 목표는 행동 기전, 관찰된 독성 및 사이토 카인 프로파일링, 말초 혈액 B-세포 및 T-세포 하위세트 및 면역 표현형결정을 포함하는 잠재적인 항-종양 활성 그리고 말초 혈액에서의 유전자 발현의 변화와 상호 관련이 있는 생물표지자들을 평가하는 것이다.
연구 기획
오픈-라벨, 멀티-센터, 용량 증량 연구는 IV 주입으로 투여된 항-CD20xCD3 단일 클론 항체 ＂Ab1＂로 개시되었다. 환자들은 초기 시작 복용량과 2 회 및 연속 복용량 투여를 위한 더 높은 복용량으로 구성된 복용량 수준 (DL) 코호트에 배정되었다. 환자들은 징조(NHL 또는 CLL)에 따라 등록되었다. 각 DL에서 코호트당 3 내지 6명의 환자를 가진, 2개 코호트 (각 징조에 하나씩)가 있다.
임상적으로 처음 임상적 효과가 나타난 환자들과, 재발 또는 진행되는 환자들은 재발 또는 진행할 때 견딜 수 있는 것으로 보이는 가장 높은 DL에서 Ab1로 재처리될 수 있다.
이미 등록한 환자는 Ab1의 최초 투여 28 일 이내에 검사 절차를 거쳐 적격성을 결정했다. 프로토콜 기준에 따라 각 코호트가 채워질 때 까지 환자는 후원자의 자격 확인순으로 징조 (NHL 또는 CLL)에 따라 순차적으로 등록되었다.
각 DL에서 NHL과 CLL을 위한 별도의 독립적인 용량 증량 코호트가 있다. 각각의 DL은 초기 용량과 2 차 및 이후 투여 용량으로 구성되며, 이때 초기 용량이 용인된다면, 이후 이차 및 이후 용량은 초기 용량보다 높을 것이다.
용량 증량는 통상적인 3+3 용량 증량 기획을 따른다. 관찰된 독성에 근거하여 코호트당 3 내지 6명의 환자가 기획된다.
용량 증량 단계가 종료되고, 그리고 추후 연구를 위해 권장 분량을 결정할 때, 3 가지 확장 코호트가 각성 코호트에서 무통성 NHL, 공격적 NHL 및 CLL에서 계획되며, 각 확장 코호트는 10 명의 환자가 있다.
상기 제 1 DL에서, 동일한 징조 안에 첫 3 명의 환자에 대한 초기 연구 약 투여 사이에는 48 시간의 대기 기간이 필요할 것이다. 첫 번째 DL에 속한 후속 환자는 징조에 관계없이 같은 날에 치료를 받지 않는다. 후속 코호트에서 이전 코호트에서 또는 해당 코호트 내에서 예상치 못한 독성이 관찰되지 않는다면, 처음 3 명의 환자에 대한 초기 주입은 적어도 24 시간 간격으로 투여되어야 한다.
각 환자의 코호트가 등록되고, 치료되고, 그리고 DLT 관찰 기간이 완료된 후, 후원자와 조사자(들) 모두가 안전성 데이터를 검토한 후에 등록 (또는 현재 공개 DL 코호트의 확장)을 위한 후속 DL 코호트의 공개가 결정된다. DLT 관찰 기간은 이 연구에서 유도 기간과 일치하는 치료의 첫 28 일로 정의된다. 유도하는 동안 환자는 Ab1를 4 주간 투여하는 치료를 받게된다.
DLT가 평가가능하도록 하기 위하여, 개별 환자는 적어도 Ab1의 첫 2 번 투여를 받았어야 한다(1주차 1일과 2주차 1일). 추가적으로, 첫 번째 투여 후 적어도 28 일, 두 번째 투여 후 적어도 21 일 동안 환자를 모니터링해야 한다.
연구 기간
치료 기간은 6 개월이다. 환자는 4 주간의 유도 기간 동안 Ab1-4 주간 용량을 최대 9 회 투여하는 것으로 치료를 시작할 수 있고, 5 개월간 유지 관리 기간 동안 추가적으로 매월 5 회 투여받을 수 있다. 추적 관찰 기간은 6 개월이될 것이다.
환자 집단
총 150명의 환자에 있어서 용량 증량 코호트 (DL1에서 DL7까지가 각각 6 명의 환자를 등록한다고 가정)에서 두 징조 (NHL 및 CLL)에 대한 용량 증량 코호트에서 최대 84 명의 환자가 필요할 수 있고, DL8에서 DL10이 추가된다면, 추가로 36 명을 추가로 등록할 수 있고, 확장 코호트에서 최대 30 명의 환자 (NHL 20 명 (무통 NHL 10 명, CLL 10 명))가 필요할 수 있다.
환자는 이전 치료법에 반응하지 않는 활성 질환을 가진 환자, 이전에 CD20-지향된 항체 요법으로 치료 받았던 환자, 치료 선택에 대한 표준이 없는 환자, 그리고 항 CD20 항체로 치료한 환자들은 CD20 + B 세포 악성 종양에 대한 기록을 가지고 있어야만 한다.
연구를 위한 포함 기준 은 다음과 같다: (1) CD20+ B-세포 악성 기록을 가지며, 활성 질환은 기존 요법에 반응하지 않고, 치료 선택 표준이 존재하지 않고, 항-CD20 항체를 이용한 치료가 적절할 수 있다; (2) 항-CD20 항체 요법으로 기존 치료를 받아야만 했던 경우; (3) CT 스캔에 의해 기록되었을 때 최소한 한 개의 이차원적으로 측정가능한 병소(B 세포 NHL 및 CLL) ≥1.5 cm를 가진 모든 환자; (4) CLL 환자는 백색 혈액 세포 (WBC) ≤200 x 109를 보유해야만 한다; (5) 연령 ≥18세; (6) 동부 종양학 협력 그룹(Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG)) 수행능 상태 ≤1; (7) 기대 수명이 최소한 6 개월; (8) 다음의 적절한 골수 기능이 기록된 경우: (a) 혈소판 카운트 ≥75 x 109/L, (b) Hb 수준 ≥9 g/dL, 및 (c) ANC ≥1 x 109/L; (9) 적절한 장기 기능; (10) 의무적 종양 생검 사전 치료를 받으려는 의지, 조사자의 견해에서 환자에게 심각한 위험없이 생검될 수 있는 접근가능한 병소를 가지는 경우; (11) 병원 방문 및 연구-관련 절차에 순응할려는 의지가 있고, 가능한 경우; 그리고 (12) 서면 동의서를 제공한 경우.
연구를 위한 배제 기준 은 다음과 같다: (1) 원발성 중추신경계(CNS) 림프종 또는 비-원발성 CNS NHL에 의한 공지의 또는 의심이 되는 CNS 관련성; (2) CNS 병리의 병력 또는 현재 이와 관련 병력, 이를 테면 (a) 간질, 발작, 불완전마비, 실어증, 졸증, 심각한 뇌 손상, 소뇌 질환, 기질성뇌증후군, 정신병, 또는 (b) 염증 병소 존재에 대한 증거 및/또는 뇌 MRI 상에 혈관염; (3) 연구 약물의 제1 투여전 28일 이내 표준 항-림프종 화학요법(비-생물성) 또는 방사능요범; (4) 블리나투모나브를 이용한 사전 요법; (5) 동종이계 줄기세포 이식; (6) 연구 약물의 제1 투여전 12주 이내 리툭시맙, 아렘투주마브 또는 다른 연구 또는 시판되는 생물학적 물질로 치료 [주석: 즉각 치료를 요하는 공격적 림프종 환자의 경우, 워시-아웃 기간은 28 일로 줄일 수 있음]; (7) 연구 약물의 제1 투여전 28일 이내 면역억제 요법(생물학적이외의); (8) 연구 약물의 제1 투여전 28일 이내 조사중인 비-생물학적 물질로 치료; (9) 연구 약물의 유사한 화학적 또는 생물학적 조성물의 화합물로 인한 알레르기 반응 병력; (10) 테트라사이클린 항생제 군에서 임의의 화합물에 대한 과민성 병력; (11) 연구 참여 전 5년 이내 B-세포 악성 이외의 다른 악성 병력, 피부의 절제된/제거된 기저 또는 편평 세포 암종 또는 자궁경관 자리에 암종 제외; (12) 제 1 투여 4주 이내에 입원 또는 IV 항-감염제 치료를 요하는 공지의 활성 세균, 바이러스, 곰팡이, 미코박테리아 또는 다른 감염 또는 임의의 주요 감염 에피소드; (13) 연구 실행에 방해가될 수 있거나, 또는 환자를 위험에 처하게할 수 있는 심각한 동시발생 질환 또는 의학적 상태; (14) 진행중인 전신 코르티코스테로이드 치료, 단 다른 증상(비-종양 및 비-면역억제성)을 위하여 코르티코스테로이드를 최대 일일 5 mg의 프레드니손 또는 이의 등가물 이용은 제외; (15) 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)에 감염 또는 B형 간염 바이러스 (HBV) 또는 C형 간염 바이러스 (HCV)로 인한 만성 감염; (16) 알로퓨리놀 및 라스부리카제에 대한 공지의 과민성; (17) 임신 또는 수유중인 여성; (18) 연구 기간 동안 적절한 피임을 하기를 꺼려하는 임신 가능성이 있는 성적으로 활발한 여성 또는 남성.
치료
Ab1은 살균된 일회용 바이알에 액체로서 공급되었다. 각 바이알은 2mg/mL의 농도에서 Ab1을 1mL로 빼낼 수 있도록 포함한다. 자세한 준비 및 관리 지침은 약국 매뉴얼의 사이트에 제공될 것이다.
용량 (DL) 1에서의 초기 Ab1 용량은 30 mcg이었고; DL10에 도달하면 용량은 8000 mcg까지 올라갈 수 있다. Ab1의 용량은 적어도 60 분에 걸쳐 IV 주입으로 외래에 등록된 환자에게 투여되었다. 용량 수준들은 표 23에 설명된다.
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환자들은 4 주간의 유도 기간 동안 매주 Ab1을 투여 받았고, 그 이후 월별 할당된 코호트 당 용량으로 추가 5회 투여 받았다.
종점
일차 종점은 Ab1의 권장 2 단계 용량 (RP2D)으로 최대 내약 용량 (MTD) 및/또는 최적의 생물학적 용량 (OBD)을 결정하기 위한 안전성 (특히 부작용 [AEs] 및 DLTs)이다.
2차 종점은 (a) 약물동력학: Ab1의 농도; (b) 면역원성: 항-Ab1 항체들; (c) 전반적인 반응율 (ORR), 진행없는 생존 (PFS) 및 전반적인 생존 (OS)이 포함된 항종양 활성, 그리고 CLL 환자의 최소 잔류 질환(MRD). ORR 관련하여, 종양 반응 평가는 NCI-International Working Group (NCI-WG)의 악성 림프종에 관란 개정된 반응 기준과 CLL의 진단 및 치료를 위한 만성 림프구 백혈병 국제 지침 워크숍에 따라 실행될 것이다.
본 연구의 탐색적 종점은 다음을 포함하는 약력학(PD) 측정을 포함한다: (a) B-세포 및 T-세포 하위세트 및 표현형, (b) 순환하는 사이토카인 수준들, 및 (c) C-반응성 단백질 (CRP).
과정 및 평가
기본 절차는 다음을 포함한다: 뇌 MRI, 심전도 (ECG), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), C형 간염 바이러스 (HCV) 및 B형 간염 바이러스 (HBV) 테스트, 및 응고.
안전성 절차는 다음을 포함한다: 병력, 신체검사, B 증후군의 평가, 수행도 평가, 임상 실험실 테스트, 바이탈 신호, AEs, 및 수반 약물처치.
효과 절차는 다음을 포함한다: CT 스캔, 18F-플루오르데옥시글루코스-양전자방출단층촬영 (FDG-PET) 스캔, 골수 흡출물 및 생검, 림프절 및/또는 종양 생검, 및 말초혈액 시료 (오직 CLL 환자들만)를 포함하는 종양 평가.
PK 및 항-약물 항체 (ADA) 평가를 위한 혈액 시료는 등록된 환자들로부터 수집되었다.
사이토카인 생산, 전-염증성 사이토카인의 혈청 수준의 변화, 및 림프구 하위 집합 및 활성화 상태의 변화를 모니터링하기 위해 등록된 환자로부터 생물표지자들을 수집하였다. 또한 이 샘플들은 기저 질환의 임상 경과에 영향을 주거나 치료 부작용을 조절하는 변수에 대해 종양 또는 체세포 유전 분석을 허용한다.
본 발명은 여기에 설명된 특정 실시예에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 전술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 본원에 기재된 것에 추가하여 본 발명의 다양한 변형이 있을 수 있음이 당업자에게는 자명할 것이다 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> METHODS FOR TUMOR TREATMENT USING CD3XCD20 BISPECIFIC ANTIBODY <130> 10162WO01 <150> US 62/080,716 <151> 2014-11-17 <150> US 62/160,788 <151> 2015-05-13 <160> 75 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 gaagtacagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggatt cacctttaat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggaatg ggtctcagtt attagttgga atagtgatag cataggctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatgc acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagataat 300 cactatggtt cggggagtta ttactactac caatacggta tggacgtctg gggccaaggg 360 accacggtca ccgtctcctc ag 382 <210> 2 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp 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tggtcaaagg cttctacccc 1140 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaggctcac cgtggacaag 1260 agcaggtggc aggaggggaa tgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320 cactacacac agaagtccct ctccctgtct ctgggtaaat ga 1362 <210> 37 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Trp Asn Ser Asp Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met His Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Asn His Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gln Tyr 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 46 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 47 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 48 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 49 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 49 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 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<400> 55 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 1 5 10 15 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 20 25 30 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 35 40 45 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 50 55 60 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 65 70 75 80 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 85 90 95 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 <210> 56 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 56 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 57 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 57 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 58 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 58 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 59 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 59 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 60 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 60 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 61 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 61 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 62 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 62 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 63 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 63 ttcgcgcagc ttaggtttat gccagggggg acgggtggca cgggtcgtgg tggacaccgt 60 <210> 64 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 64 aagcttatac tcgagctcta gattgggaac ccgggtctct 40 <210> 65 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 65 cccaccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaa 58 <210> 66 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 66 tgtgtcttca gggagaggga cagagaccca tttactcgcc ggcg 44 <210> 67 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 67 ctcgggttta gaacactgtt ttgagtgtgt acgggtggca cgggtcgtgg tggacaccgt 60 <210> 68 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 68 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag caccacctgt g 51 <210> 69 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 69 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta cacc 54 <210> 70 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 70 ctcttttggt agaggtttcg gtttcccgtc ggggctcttg gtgtccacat gtgg 54 <210> 71 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 71 cttcagggag agggacagag gcccatttac tcgccggcg 39 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 72 gctgacagac taacagactg 20 <210> 73 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 73 atacattata cgaagttata ccggta 26 <210> 74 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 74 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 1 5 10 15 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 20 25 30 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 35 40 45 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 50 55 60 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 65 70 75 80 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 85 90 95 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 75 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 75 Ala Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro 1 5 10 15 Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser 20 25 30 Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Ile Asn Trp Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (21)

  1. 대상체에서 CD20-양성 B-세포 암을 치료 또는 개선하는 방법에 사용하기 위한 이중특이적 항체를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 방법이 사이토카인 캐스케이드의 효과를 감소시키는 용량-증량 (dose-escalation) 프로토콜로 상기 이중특이적 항체를 투여함을 포함하고, 상기 용량-증량 프로토콜이 상기 이중특이적 항체의 제1 용량을 투여하고 상기 이중특이적 항체의 제2 용량을 후속적으로 투여함을 포함하고, 이때 상기 제2 용량은 상기 제1 용량을 초과하며,
    상기 이중특이적 항체는 인간 CD3에 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 인간 CD20에 결합하는 제2 항원-결합 도메인, 및 상기 제1 및 제2 항원-결합 도메인 각각에 연결된 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기서,
    인간 CD3에 특이적으로 결합하는 상기 제1 항원-결합 도메인 (A1)은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역들 (A1-HCDR1, A1-HCDR2, A1-HCDR3)과 3개의 경쇄 상보성 결정 영역들 (A1-LCDR1, A1-LCDR2, A1-LCDR3)을 포함하고, 인간 CD20에 특이적으로 결합하는 상기 제2 항원-결합 도메인 (A2)은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역들 (A2-HCDR1, A2-HCDR2 및 A2-HCDR3)과 3개의 경쇄 상보성 결정 영역들 (A2-LCDR1, A2-LCDR2 및 A2-LCDR3)을 포함하고; 이때
    (i) A1-HCDR1은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하고;
    (ii) A1-HCDR2는 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하고;
    (iii) A1-HCDR3은 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하고;
    (iv) A1-LCDR1은 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하고;
    (v) A1-LCDR2는 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하고;
    (vi) A1-LCDR3은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하고;
    (vii) A2-HCDR1은 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고;
    (viii) A2-HCDR2는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하고;
    (ix) A2-HCDR3은 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고;
    (x) A2-LCDR1은 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하고;
    (xi) A2-LCDR2는 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    (xii) A2-LCDR3은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 중쇄 불변 영역은
    (a) 위치 228에서 236 (EU 넘버링)의 PCPAPPVA (서열 번호: 52)을 포함하는 인간 IgG2 하부 힌지 아미노산 서열;
    (b) 위치 216에서 227 (EU 넘버링)의 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 상부 힌지 아미노산 서열;
    (c) 위치 237에서 340 (EU 넘버링)의 인간 IgG4 CH2 도메인 아미노산 서열; 및
    (d) 인간 IgG1 CH1 도메인 및 인간 IgG1 CH3 도메인, 또는 인간 IgG4 CH1 도메인 및 인간 IgG4 CH3 도메인을 포함하고; 그리고
    표면 플라스몬 공명 분석으로 측정했을 때, 상기 이중특이적 항체는 인간 FcγRIIB에 비해 인간 FcγRIIA에 더 높은 결합 친화성을 나타내며, 인간 FcγRI 및 인간 FcγRIII에 대한 검출가능한 결합 친화성이 없거나 거의 없는,
    이중특이적 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 B-세포는 프리(pre)-B 림프구, 성숙한 B-림프구, 또는 B-세포 비-호지킨 림프종 세포인, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 잔류 암을 가지는 것에 근거하여 선택되는, 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암은 림프종 또는 백혈병인, 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 암은 소포성 림프종, B-세포 만성 림프구성 백혈병, B-세포 림프모구성 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 변연대 림프종, 맨틀(Mantle) 세포 림프종, 모발상 세포 백혈병 및 버킷(Burkitt) 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1 용량은 1000 μg이하인, 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 (a) 항-CD20 단일특이적 요법 단독, 또는 (b) 리툭시맙 단일요법에 내성이 있거나(resistant), 또는 불완전한 반응을 보이는 종양을 앓고 있는, 약제학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 상기 이중특이적 항체를 투여하기 최소 1일 내지 1년 전 항-CD20 단일특이적 항체 요법을 받았던, 약제학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은
    (a) 키메라 힌지 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA (서열 번호: 53); 또는
    (b) 키메라 힌지 아미노산 서열 ESKYGPPCPPCPAPPVA (서열 번호: 54)를 포함하는, 약제학적 조성물.
  10. 삭제
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  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 상기 제1 항원-결합 도메인은 (i) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR), 및 (ii) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하고; 그리고 인간 CD20에 특이적으로 결합하는 상기 제2 항원-결합 도메인은 (iii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR), 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함하는, 약제학적 조성물.
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