KR102481317B1 - Tmprss6 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Tmprss6 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 TMPRSS6 유전자를 표적으로 하는 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 조성물, 및 TMPRSS6의 발현을 억제하기 위해 상기 dsRNA 조성물을 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

TMPRSS6 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF TMPRSS6 GENE}
관련 출원의 전후-참조
본 출원은 2011년 3월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 61/468,830호, 및 2011년 12월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 61/568,942호이다. 이들 선원들은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 TMPRSS6 유전자 발현의 특이적 억제에 관한 것이다.
발명의 배경
TMPRSS6(막횡단 프로테아제, 세린 6)은 타입 II 세린 프로테아제를 인코딩하고, 간에서 주로 발현된다. TMPRSS6은 헵시딘 수준의 하향-조절을 야기시키는 헵시딘 활성제 및 BMP 공동-수용체 HJV(헤모주벨린(hemojuvelin))에 결합하여 단백질분해적으로 분해시킴으로써 간 내의 철 수준에 영향을 미친다.
TMPRSS6은 짧은 N-말단 세포질내 꼬리, 타입 II 막횡단 도메인, 2개의 세포외 CUB(보체 인자 C1s/C1r, 성게(urchin) 배아 성장인자 및 BMP(골형성 단백질)) 도메인으로 구성된 줄기 영역, 3개의 LDLR(저밀도 지질단백질 수용체 부류 A) 도메인, 및 C-말단 트립신-유사 세린 프로테아제 도메인으로 구성된다. 또한, 세포외 도메인 내에 N-당화에 대한 컨센서스 부위, 및 세포질내 꼬리 영역 내에 잠재적 인산화 부위가 존재한다.
발명의 개요
예를 들어, 세포 또는 포유동물 내에서 TMPRSS6 유전자의 RNA 전사체의 RNA-유도 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)-매개 분해를 수행하는 조성물 및 방법이 본원에 기재된다. TMPRSS6 유전자의 발현에 의해 야기되는 병리학적 질환 및 질병, 예를 들어, 철 과잉을 특징으로 하는 장애(예를 들어, 탈라세미아, 예를 들어, 중간성 β-탈라세미아 또는 α-탈라세미아)를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 또한 기재된다. 철 흡수 또는 동원을 감소시키거나 방지시킴으로써, 특정 병리학적 질환에서 철 과부하를 개선시키기 위한 조성물 및 방법이 또한 기재된다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 일반적으로 혈색소증(체내의 철 형성)의 치료에 유용하다.
본원에서 사용되는 용어 "iRNA"는 RNA(이 용어는 본원에서 정의되는 바와 같음)를 함유하고, RNA-유도 침묵 복합체(RISC) 경로를 통한 RNA 전사체의 표적화된 분해를 매개하는 작용제를 나타낸다. 한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 iRNA는 세포 또는 포유동물에서 TMPRSS6의 발현을 억제한다. 대안적으로, 또 다른 구현예에서, iRNA는 세포 또는 포유동물에서 TMPRSS6의 발현을 상향조절한다.
본원에서 특정된 조성물에 포함된 iRNA는 30개 이하의 뉴클레오티드, 일반적으로 19 내지 24개의 뉴클레오티드 길이이고, TMPRSS6 유전자의 mRNA 전사체의 적어도 일부에 실질적으로 상보적인 영역을 갖는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 갖는 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 포함한다. 한 구현예에서, dsRNA는 적어도 15개의 연속적 뉴클레오티드의 영역을 포함한다.
한 구현예에서, TMPRSS6 유전자의 발현을 억제시키기 위한 iRNA는 서로 상보적인 적어도 2개의 서열을 포함한다. iRNA는 첫번째 서열을 갖는 센스 가닥 및 두번째 서열을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 안티센스 가닥은 TMPRSS6을 인코딩하는 mRNA의 적어도 일부에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상보성 영역은 30개 이하의 뉴클레오티드, 및 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이이다. 일반적으로, iRNA는 19 내지 24개, 예를 들어, 19 내지 21개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, iRNA는 약 15 내지 약 25개의 뉴클레오티드 길이이고, 다른 구현예에서, iRNA는 약 25 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이이다. TMPRSS6을 발현하는 세포와 접촉시 iRNA는 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 검사시 TMPRSS6 유전자의 발현을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35% 또는 적어도 40% 또는 그 이상까지 억제한다. 한 구현예에서, TMPRSS6 iRNA는 안정적 핵산 지질 입자(SNALP) 내에서 제형화된다.
한 구현예에서, 본원에 특정된 iRNA는 표 2, 3 또는 4의 센스 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 dsRNA의 첫번째 서열 및 표 2, 3 또는 4의 상응하는 안티센스 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 두번째 서열을 포함한다. 본원에 특정된 iRNA 분자는 자연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 갖는 뉴클레오티드, 및 콜레스테릴 유도체에 결합된 말단 뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 변형된 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오티드, 잠김(locked) 뉴클레오티드, 무염기(abasic) 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 및 비-자연 염기를 포함하는 뉴클레오티드의 군으로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, 상기 변형된 서열은 표 2, 3 또는 4의 센스 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 상기 iRNA의 첫번째 서열 및 표 2, 3 또는 4의 안티센스 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 두번째 서열을 기초로 할 것이다.
한 구현예에서, 본원에 특정된 iRNA는 SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:455, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:524, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:494, SEQ ID NO:445, SEQ ID NO:592, SEQ ID NO:47, 및 SEQ ID NO:540으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 갖는 TMPRSS6 dsRNA의 센스 가닥 및 SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:456, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:525, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:495, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:593, SEQ ID NO:48 및 SEQ ID NO:541로 구성되는 군으로부터 선택된 서열로 구성되는 안티센스 가닥을 포함한다.
또 다른 구현예에서, TMPRSS6을 표적으로 하는 dsRNA를 함유하는 조성물은 상승된 철 수준, 예를 들어, 간 내의 상승된 철 수준을 갖는 피검체에 투여된다. 상승된 철 수준을 갖는 피검체는 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 60% 초과 또는 그 이상의 상승된 혈청 철 수준(예를 들어, 350 ㎍/dL 초과, 500 ㎍/dL 초과 또는 1000 ㎍/dL 초과 또는 그 이상), 상승된 혈청 페리틴 수준, 또는 트랜스페린 포화 수준을 갖는 피검체로 확인될 수 있다.
경증 내지 중등증의 철 과부하는 300 내지 2500 ㎍/L의 혈청 페리틴 수준으로 표시되는 한편, 2500 ㎍/L을 초과하는 수준은 심장 질병의 증가된 위험과 관련된다. 1000 ㎍/L을 초과하는 혈청 페리틴은 일차적 및 이차적 철 과부하 둘 모두에서 불리한 결과와 관련된 것으로 밝혀졌다. 폐경전 여성에서 200 ㎍/L, 및 남성 및 폐경후 여성에서 300 ㎍/L를 초과하는 혈청 페리틴 수준이 혈색소증으로 인한 일차 철 과부하를 나타내며, 1000 ㎍/L를 초과하는 페리틴 수준은 통상적으로 철 과부하로 인한 간 손상을 암시한다. 300 ㎍/L, 500 ㎍/L, 1000 ㎍/L, 1500 ㎍/L, 2000 ㎍/L, 또는 2500 ㎍/L 또는 그 이상을 초과하는 혈청 페리틴 수준을 갖는 피검체는 TMPRSS6을 표적으로 하는 dsRNA를 이용한 치료에 대한 후보자이다.
또 다른 구현예에서, TMPRSS6을 표적으로 하는 dsRNA를 함유하는 조성물이 상승된 트랜스페린 수준, 예를 들어, 400 ㎎/dL 초과, 500 ㎎/dL 초과, 1000 ㎎/dL 초과 또는 그 이상의 트랜스페린 수준을 갖는 피검체에 투여된다.
철 수준은 또한 TIBC(총철결합능) 시험에 의해 측정될 수 있다. TIBC 시험은 트랜스페린이 완전히 포화된 경우 혈액이 갖는 철의 양을 측정한다. 트랜스페린은 간에 의해 생성되므로, TIBC는 간 기능 및 영양을 모니터하는데 사용될 수 있다. 400 ㎍/dL 초과, 500 ㎍/dL 초과, 또는 1000 ㎍/dL 초과 또는 그 이상의 TIBC 값을 갖는 피검체가 TMPRSS6을 표적으로 하는 dsRNA를 이용한 치료에 대한 후보자이다.
한 구현예에서, dsRNA의 투여는, 예를 들어, 간 또는 혈청 내의 철 수준을 적어도 5%, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 그 이상까지 낮춘다. 일부 구현예에서, 혈청 페리틴 수준, 혈청 트랜스페린 수준, 트랜스페린 포화 수준 또는 TIBC 값 중 하나 이상은 처리전 수준에 비해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 그 이상까지 감소된다. 또 다른 구현예에서, 철 수준에서의 감소, 혈청 페리틴 수준에서의 감소, 트랜스페린 또는 트랜스페린 포화 수준에서의 감소, 또는 TIBC 값에서의 감소는 적어도 5, 10, 20, 30, 또는 40일 또는 그 이상 동안 유지된다.
한 구현예에서, 피검체는 적어도 부분적으로는 철 수준을 낮출 필요(단지 철 수준을 낮추는 것을 필요로 하는 상황이 발생한 것으로 인해 환자를 선택하는 것에 반함)를 기초로 하여 선택된다.
한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 iRNA는 야생형 TMPRSS6 RNA 전사체를 표적으로 하고, 또 다른 구현예에서, iRNA는 돌연변이 전사체(예를 들어, 대립유전자 변이체를 갖는 TMPRSS6 RNA)를 표적으로 한다. 예를 들어, 본 발명에서 특정된 iRNA는 TMPRSS6의 다형 변이체, 예를 들어, 단일 뉴클레오티드 다형태(SNP)를 표적으로 할 수 있다. 또 다른 구현예에서, iRNA는 야생형 및 돌연변이 TMPRSS6 전사체 둘 모두를 표적으로 한다. 또 다른 구현예에서, iRNA는 TMPRSS6의 전사체 변이체를 표적으로 한다.
한 구현예에서, 본 발명에서 특정된 iRNA는 TMPRSS6 RNA 전사체의 비-코딩 영역, 예를 들어, 5' 또는 3' 비번역 영역을 표적으로 한다.
한 구현예에서, 본 발명에서 특정된 iRNA는 간, 예를 들어, 간의 간세포 또는 쿠퍼 세포, 예를 들어, 비대 쿠퍼 세포에 전달된다.
한 양태에서, 본 발명에서 특정된 구현예는 본 발명에서 특정된 iRNA 중 적어도 하나를 함유하는 세포를 제공한다. 세포는 일반적으로 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포이다.
또 다른 양태에서, 본 발명에서 특정된 구현예는 유기체, 일반적으로 인간 피검체에서 TMPRSS6 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 조성물은 통상적으로 본원에 기재된 iRNA 중 하나 이상 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 전달 비히클을 포함한다. 한 구현예에서, 조성물은 증가된 철 수준을 야기시키는 장애, 예를 들어, 혈색소증을 치료하기 위해 사용된다. 예를 들어, 조성물은 탈라세미아, 예를 들어, 중간성 β-탈라세미아를 치료하는데 유용하다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은, 예를 들어, 2개월 마다 1회 이하, 1개월 마다 1회 이하, 1개월 마다 2회 이하, 4주 마다 1회 이하, 3주 마다 1회 이하, 2주 마다 1회 이하, 또는 1주 마다 1회 이하의 본원에 기재된 투여 요법의 투여용으로 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 약학적 조성물의 투여는 1개월 또는 그 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 또는 6개월, 또는 1년, 또는 5년, 또는 10년, 또는 그 이상, 예를 들어, 피검체의 나머지 생애 동안 유지될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 iRNA, 예를 들어, TMPRSS6을 표적으로 하는 dsRNA를 함유하는 조성물은 비-iRNA 치료제, 예를 들어, 혈색소증, 또는 혈색소증을 야기시키는 장애, 예를 들어, 탈라세미아를 치료하는 것으로 공지된 작용제와 함께 투여된다. 예를 들어, 본 발명에서 특정된 iRNA는 β 탈라세미아, 예를 들어, 중간성 β-탈라세미아, 또는 증가된 철 수준과 관련된 또 다른 장애의 치료를 위한 작용제와 함께 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, TMPRSS6 iRNA가 환자에게 투여된 후, 비-iRNA 작용제가 환자에게 투여된다(또는 그 반대로 투여된다). 또 다른 구현예에서, TMPRSS6 iRNA 및 비-iRNA 치료제는 동시에 투여된다. 한 구현예에서, 작용제는, 예를 들어, 철 수준에 영향을 미치는 작용제, 예를 들어, 철 킬레이트제(예를 들어, 데스페리옥사민(desferrioxamine)), 또는 폴산이다.
또 다른 양태에서, 하기 단계를 수행함으로써 세포에서 TMPRSS6 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법이 본원에 제공된다:
(a) 세포에 서로 상보적인 적어도 2개의 서열을 포함하는 이중-가닥 리보핵산(dsRNA)을 도입시키는 단계로서, 상기 dsRNA가 첫번째 서열을 갖는 센스 가닥 및 두번째 서열을 갖는 안티센스 가닥을 갖고, 상기 안티센스 가닥이 TMPRSS6을 인코딩하는 mRNA의 적어도 일부에 실질적으로 상보적인 상보성 영역을 가지며, 상기 상보성 영역이 30개 이하의 뉴클레오티드, 즉, 15 내지 30개의 뉴클레오티드 길이, 및 일반적으로 19 내지 24개의 뉴클레오티드 길이이고, TMPRSS6을 발현하는 세포와 접촉시 상기 dsRNA가 TMPRSS6 유전자의 발현을 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 그 이상까지 억제하는, 단계; 및
(b) TMPRSS6 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 달성함으로써, 세포에서 TMPRSS6 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 시간 동안 단계 (a)에서 생성된 세포를 유지시키는 단계.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 또는 포유동물에서 TMPRSS6 유전자의 발현을 활성화시키는데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 수행함으로써 세포에서 TMPRSS6 유전자의 발현을 조절하기 위한 방법을 제공한다:
(a) 세포에 서로 상보적인 적어도 2개의 서열을 포함하는 이중-가닥 리보핵산(dsRNA)을 도입시키는 단계로서, 상기 dsRNA가 첫번째 서열을 갖는 센스 가닥 및 두번째 서열을 갖는 안티센스 가닥을 갖고, 상기 안티센스 가닥이 TMPRSS6을 인코딩하는 mRNA의 적어도 일부에 실질적으로 상보적인 상보성 영역을 가지며, 상기 상보성 영역이 30개 이하의 뉴클레오티드, 즉, 15 내지 30개의 뉴클레오티드 길이, 및 일반적으로 19 내지 24개의 뉴클레오티드 길이이고, TMPRSS6을 발현하는 세포와 접촉시 상기 dsRNA가 TMPRSS6 유전자의 발현을 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 그 이상까지 조절하는, 단계; 및
(b) TMPRSS6 유전자의 mRNA 전사체의 분해 또는 보호를 달성함으로써, 세포에서 TMPRSS6 유전자의 발현을 조절하기에 충분한 시간 동안 단계 (a)에서 생성된 세포를 유지시키는 단계.
한 구현예에서, 상기 방법은 간 세포, 예를 들어, 간세포, 또는 쿠퍼 세포에서의 유전자 발현을 억제하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 간 세포에서 유전자 발현을 활성화시키기 위한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정, 예를 들어, 혈색소증과 관련된 장애를 치료하거나, 예방하거나, 역전시키거나, 관리하기 위한 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명에서 특정된 iRNA 중 하나 이상을 상기 치료, 예방, 역전, 또는 관리를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 환자는 탈라세미아, 예를 들어, 중간성 β-탈라세미아를 갖는다. 또 다른 구현예에서, TMPRSS6을 표적으로 하는 iRNA의 투여는 환자에서 TMPRSS6-매개 장애의 적어도 하나의 증상, 예를 들어, 철 과부하와 관련된 증상, 예를 들어, 관절 동통, 복부 동통, 또는 쇠약의 중증도를 완화시키거나 경감시킨다.
한 양태에서, 본 발명은 세포에서 TMPRSS6 유전자의 발현을 억제하기 위한 벡터를 제공한다. 한 구현예에서, 상기 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 iRNA의 적어도 하나의 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 조절 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포에서 TMPRSS6 유전자의 발현을 억제하기 위한 벡터를 함유하는 세포를 제공한다. 상기 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 iRNA 중 하나의 적어도 하나의 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 병리학적 질병과 관련된 두번째 유전자를 표적으로 하는 두번째 iRNA와 조합된 TMPRSS6 iRNA를 함유하고, 질병, 예를 들어, β-탈라세미아를 치료하는데 유용한 조성물을 제공한다. 예를 들어, 두번째 iRNA는 헵시딘의 음성 조절제, 예를 들어, 저산소증 유도성 인자, 예를 들어, HIF-1a 또는 HIF-2a; GDF15; 또는 TWSG1을 표적으로 할 수 있다. 한 구현예에서, 두번째 iRNA는 β-탈라세미아로부터 발생하는 두번째 장애와 관련된 유전자를 표적으로 한다. 예를 들어, 두번째 iRNA는 당뇨병, 혈전증 또는 골감소증과 관련된 유전자를 표적으로 할 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예의 세부사항은 하기 설명에 기재된다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 장점은 하기 설명 및 도면, 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.
발명의 상세한 설명
세포 또는 포유동물에서 TMPRSS6 유전자의 발현을 억제하기 위한 iRNA 및 이를 이용하는 방법이 본원에 기재되며, 상기 iRNA는 TMPRSS6 유전자를 표적으로 한다. 또한, TMPRSS6 유전자 발현에 의해 야기되는 병리학적 질환 및 질병, 예를 들어, 철의 상승된 수준과 관련된 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. iRNA는 RNA 간섭(RNAi)으로 공지된 과정을 통해 mRNA의 서열-특이적 분해를 유도한다. 한 대안적 구현예에서, iRNA는 세포 또는 포유동물에서 TMPRSS6 유전자의 발현을 활성화시키며, 상기 iRNA는 TMPRSS6 유전자를 표적으로 한다.
TMPRSS6은 HAMP 유전자 발현의 억제제로서 철 항상성에서 중요한 역할을 한다. HAMP 유전자는 철 항상성의 중추 조절인자인 간 호르몬 헵시딘을 인코딩한다. 헵시딘은 흡수성 장세포, 간세포 및 대식세포에 주로 국소화되는 철 익스포터(exporter) 단백질 페로포르틴(ferroportin, FPN1)에 결합한다. 페로포르틴의 세포외 도메인에 결합하는 헵시딘은 페로포르틴의 내재화 및 분해를 발생시키고, 이에 따라 장으로부터의 식이성 철의 흡수, 및 대식세포 및 간세포로부터의 철의 방출을 감소시킨다. HAMP 유전자 발현은 BMP-공동-수용체 헤모주벨린(HJV)에 의해 매개되는 골 형태형성 단백질(BMP)/Decapentaplegic에 대한 엄마의 자식들(Sons of Mothers Against Decapentaplegic, SMAD)-의존성 신호전달 캐스케이드를 통해 철에 반응하여 자극될 수 있다. HAMP 조절에서의 TMPRSS6의 중요한 역할은 BMP-매개 HAMP 상향조절의 억제에서의 역할이다. TMPRSS6은 BMP 매개 HAMP 상향조절에 필수적인 BMP 공동-수용체 HJV를 분해하여, 이에 따라 BMP 신호전달, 핵으로의 SMAD 전위, 및 HAMP 전사 활성화를 방지함으로써 BMP-매개 HAMP 상향조절을 억제한다.
여러 인간 및 마우스 연구에서 HAMP 조절 및 철 항상성에서의 TMPRSS6의 역할을 확인하였다(Du et al. Science 2008, Vol. 320, pp1088-1092; Folgueras et al. Blood 2008, Vol. 112, pp2539-45). TMPRSS6에서의 기능성 돌연변이의 상실이 헵시딘 발현의 상향조절을 발생시켜, 상승된 헵시딘 수준, 저색소성 소구성 빈혈, 낮은 평균적혈구용적(MCV), 낮은 트랜스페린 포화, 경구 철의 불량한 흡수, 및 비경구 철에 대한 불완전한 반응을 특징으로 하는, 철분 불응성 철분결핍 빈혈(iron refractory iron deficiency anemia, IRIDA)로 언급되는 유전성 철 결핍 빈혈을 야기(Finberg. Seminars in Hematology 2009, Vol. 46, pp378-86)시킬 수 있는 것이 연구에서 밝혀졌다. 그러나, HAMP의 양성 조절인자(예를 들어, BMP1, BMP4, 및 HFE)에서의 기능성 돌연변이의 손실은 헵시딘 발현을 하향조절하고, 철 과부하 장애를 야기시키는 것으로 밝혀졌다(Milet et al. Am J Hum Gen 2007, Vol. 81, pp799-807; Finberg et al. Blood 2011, Vol. 117, pp4590-9). 유전성 혈색소증(HH)으로 집합적으로 언급되는 일차 철 과부하 장애, 대량 무효 조혈(massive ineffective hematopoiesis)을 특징으로 하는 빈혈증, 및 철 과부하(이차 혈색소증), 예를 들어, 중간성 β-탈라세미아(TI)에서, 상승된 혈청 철 농도 및 철 저장에도 불구하고 헵시딘 수준은 낮다. 중간성 β-탈라세미아의 마우스 모델에서 TMPRSS6 발현의 손실이 헵시딘의 상승된 수준을 발생시키는 것으로 입증되었다(Finberg 2010 Oral Presentation: "TMPRSS6, an inhibitor of Hepatic BMP/Smad Signaling, is required for Hepcidin Suppression and Iron Loading in a Mouse Model of β-Thalassemia. American Society of Hematology Annual Meeting 2010, Abstract No.: 164).
본 발명은 TMPRSS6 유전자의 발현을 조절하기 위한 방법 및 iRNA 조성물을 기재한다. 특정 구현예에서, TMPRSS6의 발현은 TMPRSS6-특이적 iRNA를 이용하여 감소되거나 억제됨으로써, HAMP 발현은 증가되고, 혈청 철 수준은 감소된다. 따라서, 본 발명에서 특정된 iRNA 조성물을 이용한 TMPRSS6 유전자 발현 또는 활성의 억제는 피검체에서 철 수준을 감소시키는 것을 목표로 하는 요법에 대한 유용한 방법일 수 있다. 이러한 억제는 상승된 철 수준과 관련된 장애, 예를 들어, 혈색소증 또는 탈라세미아, 예를 들어, β-탈라세미아를 치료하는데 유용할 수 있다.
본원에 기재된 조성물의 iRNA는 30개 이하의 뉴클레오티드 길이, 즉, 15 내지 30개의 뉴클레오티드 길이, 일반적으로 19 내지 24개의 뉴클레오티드 길이인 영역을 갖는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함하며, 상기 영역은 TMPRSS6 유전자의 mRNA 전사체의 적어도 일부와 실질적으로 상보적이다. 이들 iRNA의 사용은 포유동물에서 TMPRSS6 발현과 관련된 병리와 연관되는 유전자의 mRNA의 표적화된 분해를 가능케 한다. TMPRSS6 iRNA의 매우 낮은 투여량은 특히 RNAi를 특이적 및 효과적으로 매개하여, TMPRSS6 유전자의 발현의 유의한 억제를 발생시킬 수 있다. 세포-기반 검정을 이용하여, 본 발명자는 TMPRSS6을 표적으로 하는 iRNA가 RNAi를 특이적 및 효과적으로 매개하여, TMPRSS6 유전자의 발현의 유의한 억제를 발생시킬 수 있는 것을 입증하였다. 따라서, 상기 iRNA를 포함하는 방법 및 조성물은 상승된 철 수준을 야기시키는 장애, 예를 들어, 혈색소증, 또는 β-탈라세미아, 예를 들어, 중간성 β-탈라세미아의 치료에서와 같이 TMPRSS6을 하향조절함으로써 매개될 수 있는 병리학적 과정을 치료하는데 유용하다. 하기 상세한 설명은 TMPRSS6 유전자의 발현을 억제하기 위한 iRNA를 함유하는 조성물을 제조하고 사용하는 방법, 뿐만 아니라 상기 유전자의 발현에 의해 야기되는 질병 및 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다.
본원에 특정된 약학적 조성물의 구현예는 또한 약학적으로 허용되는 담체와 함께 30개 이하의 뉴클레오티드 길이, 일반적으로 19 내지 24개의 뉴클레오티드 길이인 영역을 포함하는 안티센스 가닥을 갖는 iRNA를 포함하며, 상기 영역은 TMPRSS6 유전자의 RNA 전사체의 적어도 일부와 실질적으로 상보적이다. 본 발명에서 특정된 조성물의 구현예는 또한 30개 이하의 뉴클레오티드 길이, 일반적으로 19 내지 24개의 뉴클레오티드 길이이고, TMPRSS6 유전자의 RNA 전사체의 적어도 일부와 실질적으로 상보적인 상보성 영역을 갖는 안티센스 가닥을 갖는 iRNA를 포함한다.
따라서, 일부 양태에서, TMPRSS6 iRNA 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약학적 조성물, TMPRSS6 유전자의 발현을 억제하기 위해 상기 조성물을 이용하는 방법, 및 TMPRSS6 유전자의 발현에 의해 야기되는 질병을 치료하기 위해 약학적 조성물을 이용하는 방법이 본 발명에서 특정된다.
I. 정의
편의를 위해, 명세서, 실시예, 및 첨부된 청구항에서 사용되는 특정 용어 및 구의 의미가 하기에 제공된다. 본 명세서의 다른 부분에서의 용어의 사용과 본 섹션에서 제공되는 이의 정의 사이의 명백한 불일치가 존재하는 경우, 본 섹션에서의 정의가 우세하다.
"G," "C," "A," "T" 및 "U"는 각각 일반적으로 염기로서 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘 및 우라실을 각각 함유하는 뉴클레오티드를 나타낸다. 그러나, 용어 "리보뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"는 또한 하기에 추가로 상술되는 바와 같은 변형된 뉴클레오티드, 또는 대용의 대체 모이어티를 나타낼 수 있는 것이 이해될 것이다. 당업자는 구아닌, 시토신, 아데닌, 및 우라실이 상기 대체 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 염기쌍 형성 특성을 실질적으로 변경시킴이 없이 다른 모이어티로 대체될 수 있음을 잘 인지한다. 예를 들어, 비제한적으로, 염기로서 이노신을 포함하는 뉴클레오티드는 아데닌, 시토신, 또는 우라실을 함유하는 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성할 수 있다. 그러므로, 우라실, 구아닌, 또는 아데닌을 함유하는 뉴클레오티드는, 예를 들어, 이노신을 함유하는 뉴클레오티드에 의해 본원에 특정된 dsRNA의 뉴클레오티드 서열에서 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, 올리고뉴클레오티드 내의 어느 곳에서든지의 아데닌 및 시토신은 구아닌 및 우라실로 각각 대체되어, 표적 mRNA와 G-U 워블 염기쌍을 형성할 수 있다. 상기 대체 모이어티를 함유하는 서열은 본원에 기재된 조성물 및 방법에 적합하다.
본원에서 사용되는 "막횡단 프로테아제, 세린 6"("TMPSSR6")은 세포에서 발현된 특정 폴리펩티드를 나타낸다. TMPRSS6은 또한 마트립타제-2(matriptase-2), IRIDA(철분 불응성 철-결핍 빈혈), 막횡단 프로테아제 세린 6, 타입 II 막횡단 세린 프로테아제 6, 및 막-결합된 모자이크 세린 프로테이나제 마트립타제-2로도 공지되어 있다. TMPRSS6은 약 899개의 아미노산 길이의 세린 프로테아제 타입 II 막횡단 단백질이다. TMPRSS6은 다수의 도메인, 예를 들어, 짧은 endo 도메인, 막횡단 도메인, 바다 성게 정자 단백질/엔테로펩티다제 도메인/아그린(SEA) 도메인, 2개의 보체 인자/성게 배아 성장인자/BMP 도메인(CUB), 3개의 LDL-R 부류 도메인(LDLa), 및 보존된 His-Asp-Ser 트라이어드(triad)(HDS)를 갖는 트립신-유사 세린 프로테아제 도메인을 함유한다. 인간 TMPRSS6 mRNA 전사체의 서열은 NM_153609.2(SEQ ID NO:1)(도 1)에서 발견될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "iRNA"는 RNA(이 용어는 본원에서 정의되는 바와 같음)을 함유하고, RNA-유도성 침묵 복합체(RISC) 경로를 통한 RNA 전사체의 표적화된 분해를 매개하는 작용제를 나타낸다. 한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 iRNA는 TMPRSS6 발현의 억제를 수행한다. 대안적으로, 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 iRNA는 TMPRSS6 발현을 활성화시킨다.
본원에서 사용되는 "표적 서열"은 일차 전사 생성물의 RNA 가공의 생성물인 메신저 RNA(mRNA)를 포함하는 TMPRSS6 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 연속적 부분을 나타낸다. 서열의 표적 부분은 적어도 상기 부분 또는 상기 부분 근처에서의 iRNA-유도성 분해에 대한 기질로 작용하기에 충분히 길 것이다. 예를 들어, 표적 서열은 일반적으로 9 내지 36개의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 15 내지 30개의 뉴클레오티드 길이, 및 이들 사이의 모든 하위 범위의 길이일 것이다. 비제한적인 예로서, 표적 서열은 15 내지 30개의 뉴클레오티드, 15 내지 26개의 뉴클레오티드, 15 내지 23개의 뉴클레오티드, 15 내지 22개의 뉴클레오티드, 15 내지 21개의 뉴클레오티드, 15 내지 20개의 뉴클레오티드, 15 내지 19개의 뉴클레오티드, 15 내지 18개의 뉴클레오티드, 15 내지 17개의 뉴클레오티드, 18 내지 30개의 뉴클레오티드, 18 내지 26개의 뉴클레오티드, 18 내지 23개의 뉴클레오티드, 18 내지 22개의 뉴클레오티드, 18 내지 21개의 뉴클레오티드, 18 내지 20개의 뉴클레오티드, 19 내지 30개의 뉴클레오티드, 19 내지 26개의 뉴클레오티드, 19 내지 23개의 뉴클레오티드, 19 내지 22개의 뉴클레오티드, 19 내지 21개의 뉴클레오티드, 19 내지 20개의 뉴클레오티드, 20 내지 30개의 뉴클레오티드, 20 내지 26개의 뉴클레오티드, 20 내지 25개의 뉴클레오티드, 20 내지 24개의 뉴클레오티드, 20 내지 23개의 뉴클레오티드, 20 내지 22개의 뉴클레오티드, 20 내지 21개의 뉴클레오티드, 21 내지 30개의 뉴클레오티드, 21 내지 26개의 뉴클레오티드, 21 내지 25개의 뉴클레오티드, 21 내지 24개의 뉴클레오티드, 21 내지 23개의 뉴클레오티드, 또는 21 내지 22개의 뉴클레오티드일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "서열을 포함하는 가닥"은 표준 뉴클레오티드 명명법을 이용하여 언급되는 서열에 의해 기재되는 뉴클레오티드의 사슬을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
달리 표시하지 않는 한, 두번째 뉴클레오티드 서열과 관련하여 첫번째 뉴클레오티드 서열을 기재하기 위해 사용되는 경우 본원에서 사용되는 용어 "상보적"은 특정 조건하에서 두번째 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화되어 이와 듀플렉스(duplex) 구조를 형성하는 첫번째 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 능력을 나타내며, 이는 당업자에 의해 이해될 것이다. 상기 조건은, 예를 들어, 엄격한 조건일 수 있으며, 여기서 엄격한 조건은 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 12 내지 16시간 동안 50℃ 또는 70℃ 후, 세척을 포함할 수 있다. 유기체 내부에서 조우될 수 있는 바와 같은 다른 조건, 예를 들어, 생리학적으로 관련된 조건이 적용될 수 있다. 당업자는 하이브리드화된 뉴클레오티드의 궁극적 적용에 따라 2개의 서열의 상보성의 시험을 위한 가장 적절한 조건의 세트를 결정할 수 있을 것이다.
iRNA 내, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 dsRNA 내의 상보성 서열은 하나 또는 둘 모두의 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 두번째 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 첫번째 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 염기쌍 형성을 포함한다. 상기 서열은 본원에서 서로와 관련하여 "완전히 상보적"으로 언급될 수 있다. 그러나, 본원에서 두번째 서열과 관련하여 첫번째 서열이 "실질적으로 상보적"으로 언급되는 경우, 2개의 서열은 완전히 상보적이거나, 이들은 이들의 궁극적 적용, 예를 들어, RISC 경로를 통한 유전자 발현의 억제에 가장 적절한 조건하에서 하이브리드화되는 능력을 보유하면서 30개 이하의 염기쌍(bp)의 듀플렉스에 대해 하이브리드화시 하나 이상, 그러나 일반적으로는 5, 4, 3 또는 2개 이하의 미스매치된 염기쌍을 형성할 수 있다. 그러나, 2개의 올리고뉴클레오티드가 하이브리드화시 하나 이상의 단일 가닥의 오버행을 형성하도록 설계되는 경우, 이러한 오버행은 상보성의 결정과 관련하여 미스매치로 간주되지 않을 것이다. 예를 들어, 21개의 뉴클레오티드 길이의 한 올리고뉴클레오티드 및 23개의 뉴클레오티드 길이의 또 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA(여기서, 보다 긴 올리고뉴클레오티드는 보다 짧은 올리고뉴클레오티드에 대해 완전히 상보적인 21개의 뉴클레오티드의 서열을 포함함)는 또한 본원에 기재된 목적상 "완전히 상보적"으로 언급될 수 있다.
본원에서 사용되는 "상보적" 서열은 또한 하이브리드화되는 능력과 관련된 상기 필요조건이 충족되는 한 비-왓슨-크릭 염기쌍 및/또는 비-자연 및 변형된 뉴클레오티드로부터 형성된 염기쌍을 포함할 수 있거나, 이들로부터 온전히 형성될 수 있다. 이러한 비-왓슨-크릭 염기쌍은 G:U 워블 또는 훅스타인(Hoogstein) 염기쌍 형성을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원의 용어 "상보적", "완전히 상보적" 및 "실질적으로 상보적"은 dsRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이, 또는 iRNA 작용제의 안티센스 가닥과 표적 서열 사이의 염기 매칭과 관련하여 사용될 수 있으며, 이는 이들의 사용의 상황으로부터 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 메신저 RNA(mRNA)의 "적어도 일부에 실질적으로 상보적"인 폴리뉴클레오티드는 관심 mRNA(예를 들어, TMPRSS6을 인코딩하는 mRNA)의 연속적 부분에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 예를 들어, 서열이 TMPRSS6을 인코딩하는 mRNA의 중단되지 않은 부분에 실질적으로 상보적인 경우 폴리뉴클레오티드는 TMPRSS6 mRNA의 적어도 일부에 상보적이다.
본원에서 사용되는 용어 "이중-가닥 RNA" 또는 "dsRNA"는 표적 RNA와 관련하여 "센스" 및 "안티센스" 배향을 갖는 것으로 언급되는 2개의 역평행 및 실질적으로 상보적인 핵산 가닥을 포함하는 하이브리드화된 듀플렉스 영역을 갖는 RNA 분자 또는 분자의 복합체를 포함하는 iRNA를 나타낸다. 듀플렉스 영역은 RISC 경로를 통한 요망되는 표적 RNA의 특이적 분해를 허용하는 임의의 길이일 수 있으나, 이는 통상적으로 9 내지 36개의 염기쌍 길이, 예를 들어, 15 내지 30개의 염기쌍 길이의 범위일 것이다. 9 내지 36개의 염기쌍의 듀플렉스를 고려하는 경우, 듀플렉스는, 예를 들어, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 또는 36개와 같은 상기 범위 내의 임의의 길이, 및 15 내지 30개의 염기쌍, 15 내지 26개의 염기쌍, 15 내지 23개의 염기쌍, 15 내지 22개의 염기쌍, 15 내지 21개의 염기쌍, 15 내지 20개의 염기쌍, 15 내지 19개의 염기쌍, 15 내지 18개의 염기쌍, 15 내지 17개의 염기쌍, 18 내지 30개의 염기쌍, 18 내지 26개의 염기쌍, 18 내지 23개의 염기쌍, 18 내지 22개의 염기쌍, 18 내지 21개의 염기쌍, 18 내지 20개의 염기쌍, 19 내지 30개의 염기쌍, 19 내지 26개의 염기쌍, 19 내지 23개의 염기쌍, 19 내지 22개의 염기쌍, 19 내지 21개의 염기쌍, 19 내지 20개의 염기쌍, 20 내지 30개의 염기쌍, 20 내지 26개의 염기쌍, 20 내지 25개의 염기쌍, 20 내지 24개의 염기쌍, 20 내지 23개의 염기쌍, 20 내지 22개의 염기쌍, 20 내지 21개의 염기쌍, 21 내지 30개의 염기쌍, 21 내지 26개의 염기쌍, 21 내지 25개의 염기쌍, 21 내지 24개의 염기쌍, 21 내지 23개의 염기쌍, 또는 21 내지 22개의 염기쌍을 포함하나 이에 제한되지는 않는 상기 범위 사이의 임의의 하위 범위일 수 있다. Dicer 및 유사한 효소로 가공함으로써 세포 내에서 생성되는 dsRNA는 일반적으로 19 내지 22개의 염기쌍 길이의 범위 내이다. dsDNA의 듀플렉스 영역의 한 가닥은 표적 RNA의 영역에 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥은 적어도 하나의 자가-상보적 영역을 갖는 단일한 RNA 분자로부터 유래될 수 있거나, 2개 이상의 별개의 RNA 분자로부터 형성될 수 있다. 듀플렉스 영역이 단일 분자의 2개의 가닥으로부터 형성되는 경우, 분자는 듀플렉스 구조를 형성하는 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에서 뉴클레오티드의 단일 가닥 사슬에 의해 분리된 듀플렉스 영역(본원에서 "헤어핀 루프"로 언급됨)을 가질 수 있다. 헤어핀 루프는 적어도 하나의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 23개 또는 그 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. dsRNA의 2개의 실질적으로 상보적인 가닥이 별개의 RNA 분자에 의해 포함되는 경우, 이들 분자는 공유적으로 연결될 필요는 없으나, 공유적으로 연결될 수 있다. 2개의 가닥이 헤어핀 루프가 아닌 수단에 의해 공유적으로 연결되는 경우, 연결 구조는 "링커"로 언급된다. 용어 "siRNA"는 또한 상기 기재된 바와 같은 dsRNA를 나타내는 것으로 본원에서 사용된다.
당업자는 용어 "RNA 분자" 또는 "리보핵산 분자"가 자연적으로 발현되거나 발견되는 바와 같은 RNA 분자 뿐만 아니라 본원에 기재되어 있거나 당 분야에 공지된 바와 같은 하나 이상의 리보뉴클레오티드/리보뉴클레오시드 유사체 또는 유도체를 포함하는 RNA의 유사체 및 유도체를 포함하는 것을 인지할 것이다. 엄격히 말하면, "리보뉴클레오시드"는 뉴클레오시드 염기 및 리보스 당을 포함하고, "리보뉴클레오티드"는 1개, 2개 또는 3개의 포스페이트 모이어티를 갖는 리보뉴클레오시드이다. 그러나, 용어 "리보뉴클레오시드" 및 "리보뉴클레오티드"는 본원에서 사용됨에 따라 동등한 것으로 간주될 수 있다. RNA는, 예를 들어, 하기 본원에 기재되는 바와 같이 핵염기 구조 또는 리보스-포스페이트 백본 구조 내에서 변형될 수 있다. 그러나, 리보뉴클레오시드 유사체 또는 유도체를 포함하는 분자는 듀플렉스를 형성하는 능력을 보유해야 한다. 비제한적인 예로서, RNA 분자는 또한 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오시드, 5' 포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오시드, 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드기에 연결된 말단 뉴클레오시드, 잠김 뉴클레오시드, 무염기 뉴클레오시드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오시드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오시드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오시드, 모르폴리노 뉴클레오시드, 포스포라미데이트 또는 비-자연 염기 포함 뉴클레오시드, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 적어도 하나의 변형된 리보뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 대안적으로, RNA 분자는 적어도 2개의 변형된 리보뉴클레오시드, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개 또는 그 이상, 및 dsRNA 분자의 전체 길이까지 변형된 리보뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 변형은 RNA 분자에서 상기 복수의 변형된 리보뉴클레오시드 각각에 대해 동일할 필요는 없다. 한 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에서의 사용에 고려되는 변형된 RNA는 필요한 듀플렉스 구조를 형성하는 능력을 갖고, RISC 경로를 통한 표적 RNA의 특이적 분해를 허용하거나 매개하는 펩티드 핵산(PNA)이다.
한 양태에서, 변형된 리보뉴클레오시드는 데옥시리보뉴클레오시드를 포함한다. 상기 예에서, iRNA 작용제는, 예를 들어, 데옥시뉴클레오시드 오버행(들), 또는 dsRNA의 이중 가닥 부분 내의 하나 이상의 데옥시뉴클레오시드를 포함하는 하나 이상의 데옥시뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 그러나, 이는 어떠한 상황이라도 용어 "iRNA"에 의해 포함되는 이중 가닥 DNA 분자인 것이 자명하다.
한 양태에서, RNA 간섭 작용제는 표적 RNA 서열과 상호작용하여 표적 RNA의 분해를 유도하는 단일 가닥 RNA를 포함한다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 식물 및 무척추동물 세포로 도입된 긴 이중 가닥 RNA는 Dicer로 공지된 타입 III 엔도뉴클레아제에 의해 siRNA로 분해된다(Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485). 리보뉴클레아제-III-유사 효소인 Dicer는 dsRNA를 특징적인 2개의 염기 3' 오버행을 갖는 19 내지 23개의 염기쌍의 짧은 간섭 RNA로 가공한다(Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). 이후, siRNA는 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)로 통합되며, 여기서 하나 이상의 헬리카제는 siRNA 듀플렉스를 풀어, 상보적 안티센스 가닥이 표적 인지를 유도하는 것을 가능케 한다(Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). 적절한 표적 mRNA로의 결합시, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 표적을 분해하여 침묵을 유도한다(Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15: 188). 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 표적 유전자의 침묵을 수행하기 위해 RISC 복합체의 형성을 촉진하는 단일 가닥 RNA에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드 오버행"은 iRNA의 듀플렉스 구조, 예를 들어, dsRNA로부터 돌출되는 적어도 하나의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 나타낸다. 예를 들어, dsRNA의 한 가닥의 3'-말단이 다른 가닥의 5'-말단을 넘어 연장되거나, 그 반대인 경우, 뉴클레오티드 오버행이 존재한다. dsRNA는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 오버행을 포함할 수 있고, 대안적으로, 오버행은 적어도 2개의 뉴클레오티드, 적어도 3개의 뉴클레오티드, 적어도 4개의 뉴클레오티드, 적어도 5개의 뉴클레오티드 또는 그 이상의 오버행을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 오버행은 데옥시뉴클레오티드/뉴클레오시드를 포함하는 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 이들의 임의의 조합 상에 존재할 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오티드(들)은 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5' 말단, 3' 말단 또는 둘 모두의 말단 상에 존재할 수 있다.
한 구현예에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 3' 말단 및/또는 5' 말단에 1 내지 10개의 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. 한 구현예에서, dsRNA의 센스 가닥은 3' 말단 및/또는 5' 말단에 1 내지 10개의 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 오버행 내의 뉴클레오티드 중 하나 이상은 뉴클레오시드 티오포스페이트로 대체된다.
dsRNA에 관하여 본원에서 사용되는 용어 "블런트(blunt)" 또는 "블런트 말단"은 dsRNA의 제공된 말단에 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 존재하지 않고, 즉, 뉴클레오티드 오버행이 존재하지 않는 것을 의미한다. dsRNA의 하나 또는 둘 모두의 말단은 블런트일 수 있다. dsRNA의 둘 모두의 말단이 블런트인 경우, dsRNA는 블런트 말단인 것으로 언급된다. 명백함을 위해, "블런트 말단" dsRNA는 둘 모두의 말단이 블런트, 즉, 분자의 어느 말단에도 뉴클레오티드 오버행이 없는 dsRNA이다. 가장 흔히, 상기 분자는 이의 전체 길이에 걸쳐 이중-가닥일 것이다.
용어 "안티센스 가닥" 또는 "가이드 가닥(guide strand)"은 표적 서열에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 iRNA, 예를 들어, dsRNA의 가닥을 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "상보성 영역"은 서열, 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 표적 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 나타낸다. 상보성 영역이 표적 서열에 완전히 상보적이 아닌 경우, 미스매치는 분자의 내부 또는 말단 영역 내에 존재할 수 있다. 일반적으로, 가장 용인되는 미스매치는 말단 영역 내, 예를 들어, 5' 및/또는 3' 말단의 5, 4, 3, 또는 2개의 뉴클레오티드 내로 존재한다.
본원에서 사용되는 용어 "센스 가닥" 또는 "패신저 가닥(passenger strand)"은 안티센스 가닥(이 용어는 본원에서 정의되는 바와 같음)의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 iRNA의 가닥을 나타낸다.
한 구현예에서, 본원에서 사용되는 용어 "SNALP"는 안정적 핵산-지질 입자를 나타낸다. SNALP는 iRNA와 같은 핵산 또는 iRNA가 전사되는 플라스미드를 포함하는 감소된 수성 내부를 코팅하는 지질의 소포를 나타낸다. SNALP는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20060240093호, 20070135372호, 및 국제 출원 번호 WO 2009082817호에 기재되어 있다. "SNALP" 제형의 예는 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.
iRNA에 대해 언급하는 경우 "세포로 도입시키는"은 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 세포로의 섭취 또는 흡수를 촉진하거나 수행하는 것을 의미한다. iRNA의 흡수 또는 섭취는 독립적인 확산성 또는 능동 세포 과정을 통하거나, 보조 작용제 또는 장치에 의해 발생할 수 있다. 상기 항목의 의미는 시험관 내의 세포로 제한되지 않고, iRNA는 또한 "세포로 도입"될 수 있고, 여기서 세포는 살아있는 유기체의 일부이다. 상기 예에서, 세포로의 도입은 유기체로의 전달을 포함할 것이다. 예를 들어, 생체내 전달을 위해, iRNA는 조직 부위로 주사되거나 전신적으로 투여될 수 있다. 생체내 전달은 또한 β-글루칸 전달 시스템, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 5,032,401호 및 5,607,677호, 및 미국 공개 번호 2005/0281781호에 기재된 것에 의해 이루어질 수 있다. 세포로의 시험관내 도입은 전기천공 및 리포펙션(lipofection)과 같은 당 분야에 공지된 방법을 포함한다. 추가 방법이 본원의 하기에 기재되어 있거나 당 분야에 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "~의 발현을 조절하다"는 처리되지 않은 세포에서의 TMPRSS6의 발현에 비해 본원에 기재된 바와 같은 iRNA 조성물로 처리된 세포에서의 TMPRSS6 유전자 발현의 적어도 부분적 "억제" 또는 부분적 "활성화"를 나타낸다.
용어 "활성화시키다", "향상시키다", "~의 발현을 상향 조절하다", "~의 발현을 증가시키다" 등은 이들이 TMPRSS6 유전자를 나타내는 한, 본원에서 TMPRSS6 유전자가 전사되고, 첫번째 세포 또는 세포의 군과 실질적으로 동일하지만 TMPRSS6 유전자의 발현이 증가되도록 처리되지 않은 두번째 세포 또는 세포의 군(대조군 세포)과 비교시 TMPRSS6 유전자의 발현이 증가되도록 처리된 첫번째 세포 또는 세포의 군에서 분리되거나 이로부터 검출될 수 있는 TMPRSS6 mRNA의 양에서의 증가로 나타나는 TMPRSS6 유전자의 발현의 적어도 부분적 활성화를 나타낸다.
한 구현예에서, TMPRSS6 유전자의 발현은 본원에 기재된 바와 같은 iRNA의 투여에 의해 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%까지 활성화된다. 일부 구현예에서, TMPRSS6 유전자는 본 발명에서 특정된 iRNA의 투여에 의해 적어도 약 60%, 70%, 또는 80%까지 활성화된다. 일부 구현예에서, TMPRSS6 유전자의 발현은 본원에 기재된 바와 같은 iRNA의 투여에 의해 적어도 약 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상까지 활성화된다. 일부 구현예에서, TMPRSS6 유전자 발현은 처리되지 않은 세포에서의 발현에 비해 본원에 기재된 바와 같은 iRNA로 처리된 세포에서 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1000배 또는 그 이상까지 증가된다. 작은 dsRNA에 의한 발현의 활성화는, 예를 들어, 각각이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Li et al., 2006 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:17337-42], 및 US20070111963호 및 US2005226848호에 기재되어 있다.
용어 "침묵", "~의 발현을 억제하다", "~의 발현을 하향-조절하다", "~의 발현을 억제하다" 등은 이들이 TMPRSS6 유전자를 나타내는 한, 본원에서 TMPRSS6 유전자가 전사되고, 첫번째 세포 또는 세포의 군과 실질적으로 동일하지만 TMPRSS6 유전자의 발현이 억제되도록 처리되지 않은 두번째 세포 또는 세포의 군(대조군 세포)과 비교시 TMPRSS6 유전자의 발현이 억제되도록 처리된 첫번째 세포 또는 세포의 군에서 분리되거나 이로부터 검출될 수 있는 TMPRSS6 mRNA의 양에서의 감소로 나타나는 TMPRSS6 유전자의 발현의 적어도 부분적 억제를 나타낸다. 억제의 정도는 보통 하기로 표현된다:
Figure 112022017774699-pat00001
대안적으로, 억제의 정도는 TMPRSS6 유전자 발현과 기능적으로 연관된 파라미터, 예를 들어, TMPRSS6 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 양, 또는 특정 표현형을 나타내는 세포의 수의 감소, 예를 들어, 철 수준 또는 철 흡수에서의 감소로 제공될 수 있다. 원칙적으로, TMPRSS6 유전자 침묵은 항시적으로 또는 유전공학적으로 TMPRSS6을 발현하는 임의의 세포에서, 및 임의의 적절한 검정에 의해 결정될 수 있다.
예를 들어, 특정 예에서, TMPRSS6 유전자의 발현은 본 발명에서 특정된 iRNA의 투여에 의해 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%까지 억제된다. 일부 구현예에서, TMPRSS6 유전자는 본원에 기재된 iRNA의 투여에 의해 적어도 약 60%, 70%, 또는 80%까지 억제된다. 일부 구현예에서, TMPRSS6 유전자는 본원에 기재된 바와 같은 iRNA의 투여에 의해 적어도 약 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 그 이상까지 억제된다.
TMPRSS6 발현의 상황에서 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료하다", "치료" 등은 TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 경감 또는 완화를 나타낸다. 본 발명의 상황에서, 하기 본원에 언급된 다른 질환 중 임의의 질환(TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정이 아닌 질환)에 관한 것인 한, 용어 "치료하다", "치료" 등은 상기 질환과 관련된 적어도 하나의 증상의 경감 또는 완화, 또는 상기 질환의 진행 또는 예견되는 진행의 둔화 또는 역전, 예를 들어, 혈색소증, 예를 들어, β-탈라세미아의 진행의 둔화를 의미한다.
질병 마커 또는 증상의 상황에서 "낮추다"는 상기 수준에서의 통계적으로 유의한 감소를 의미한다. 상기 감소는, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 그 이상일 수 있고, 이는 바람직하게는 상기 장애가 없는 개체에 대한 정상의 범위 내로 허용되는 수준으로 하향시키는 것이다.
본원에서 사용되는 구 "치료적 유효량" 및 "예방적 유효량"은 TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정, 또는 TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 명백한 증상의 치료, 예방 또는 관리에서 치료적 이점을 제공하는 양을 나타낸다. 치료적으로 효과적인 특정량은 일반적인 의사에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 당 분야에 공지된 요인, 예를 들어, TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 유형, 환자의 병력 및 연령, TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 단계, 및 TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정을 억제하는 다른 작용제의 투여에 따라 다양할 수 있다.
본원에서 사용되는 "약학적 조성물"은 약리학적 유효량의 iRNA 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 "약리학적 유효량", "치료적 유효량" 또는 간단히 "유효량"은 의도된 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성시키는데 효과적인 iRNA의 양을 나타낸다. 예를 들어, 제공된 임상적 치료가 질병 또는 장애와 관련된 측정가능한 파라미터에서의 적어도 10% 감소가 존재하는 경우에 효과적인 것으로 간주되는 경우, 상기 질병 또는 장애의 치료를 위한 약물의 치료적 유효량은 상기 파라미터에서 적어도 10%의 감소를 발생시키는데 필요한 양이다. 예를 들어, TMPRSS6을 표적으로 하는 iRNA의 치료적 유효량은 TMPRSS6 단백질 수준을 적어도 10%까지 감소시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "탈라세미아"는 유전적 열성 혈액 장애를 나타낸다. 기능소실 돌연변이는 헤모글로빈을 구성하는 글로빈 사슬 합성의 감소된 속도를 발생시키거나 상기 글로빈 사슬 중 하나의 합성을 발생시키지 않으며, 정상 글로빈 단백질에서 결핍을 야기시킨다. 탈라세미아 환자는 α 글로빈(α-탈라세미아로 언급됨), β 글로빈(β-탈라세미아로 언급됨) 또는, 드문 경우로, δ 글로빈의 결핍을 발생시킨다. α-탈라세미아에서, 과량의 β 사슬은 비정상적인 산소 결합 곡선을 갖는 불안정한 테트라머를 형성하고, β-탈라세미아는 경증성, 중증성, 또는 중간성 β-탈라세미아일 수 있다.
β 글로빈 사슬은 HBB(헤모글로빈, β) 유전자로 언급되는 단일 유전자에 의해 인코딩된다. 경증성 β-탈라세미아는 하나의 돌연변이 β-탈라세미아 대립유전자, 및 하나의 야생형 대립유전자를 갖는 환자에서 발생한다. 이러한 질환은 혈액 철 수준에 영향을 미치지 않고, 환자는 치료를 필요로 하지 않는다. 중증성 β-탈라세미아는 환자가 2개의 넉다운 돌연변이 β-탈라세미아 대립유전자를 갖는 경우에 발생한다. 과량의 철이 상기 환자에서 축적되고, 과량의 철이 비대 쿠퍼 세포에 주로 저장된다. 중증성 β-탈라세미아를 갖는 환자는 통상적으로 만성 혈액 수혈 요법, 철 킬레이트화, 비장절제술 및 동종이형 조혈 이식으로 처리된다. 환자가 β-탈라세미아 유전자의 하나의 넉다운 대립유전자 및 하나의 부분적 기능소실 대립유전자를 갖는 경우에 중간성 β-탈라세미아가 발생한다. 과량의 철이 상기 환자에서 축적되고, 과량의 철이 간세포에 주로 저장된다. 중증성 탈라세미아 및 중간성 탈라세미아를 갖는 환자는 빈혈(저산소증)을 가지며, 이는 EPO(에리트로포이에틴)에서의 증가, 및 결과로서, 극적인 보상 및 무효 조혈(골수 내의 줄기 세포에 의한 적혈구 세포의 생성)을 발생시킨다. 중간성 탈라세미아를 갖는 환자는 때때로 간비장비대(hepatosplenomegaly), 황달, 골감소증, 혈전 사건, 다리 궤양, 폐 저혈압, 울혈심부전, 당뇨병, 성장호르몬 결핍, 갑상샘저하증, 부갑상샘저하증, 생식샘저하증, 및 얼굴 변형이 발생한다.
본원에서 사용되는 용어 "혈색소증"은 너무 많은 철이 위장관으로부터 흡수되는 것을 발생시키는 장애를 나타낸다. 혈색소증은 원발성 및 속발성의 2개의 형태로 발생한다. 미국에서 가장 흔한 유전 장애인 원발성 혈색소증(200 내지 300명의 미국인 중 추정상 1명이 걸림)은 보통 너무 많은 철이 흡수되도록 하는 특이적 유전적 문제에 의해 야기된다. 속발성, 또는 후천적 혈색소증은 탈라세미아 또는 철적혈모구빈혈과 같은 질병에 의해 야기될 수 있다. 속발성 혈색소증은 때때로 용혈 빈혈 및 만성 알콜 중독을 갖는 환자에서 발생한다. 혈색소증의 증상은 복부 동통, 관절 동통, 피로, 에너지 결핍, 쇠약, 피부의 흑화(종종 "변색(bronzing)"으로 언급됨), 및 신체 모발의 손실을 포함한다.
용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 치료제의 투여를 위한 담체를 나타낸다. 이러한 담체는 염수, 완충된 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 용어는 특이적으로 세포 배양 배지를 배제한다. 경구 투여되는 약물에 대해, 약학적으로 허용되는 담체는 약학적으로 허용되는 부형제, 예를 들어, 비활성 희석제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 감미제, 착향제, 착색제 및 보존제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 비활성 희석제는 소듐 및 칼슘 카르보네이트, 소듐 및 칼슘 포스페이트, 및 락토스를 포함하는 한편, 옥수수 전분 및 알긴산이 적합한 붕해제이다. 결합제는 전분 및 젤라틴을 포함할 수 있는 한편, 존재시 윤활제는 일반적으로 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탤크(talc)일 것이다. 요망시, 정제는 위장관 내에서의 흡수를 지연시키기 위해 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 물질로 코팅될 수 있다. 약물 제형에 포함된 작용제는 본원의 하기에 추가로 기재된다.
본원에서 사용되는 "피검체"는 포유동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 및 다른 비-인간 영장류이다. 한 바람직한 구현예에서, 피검체는 인간이다.
본원에서 사용되는 용어 "LNPXX"(여기서, "XX"는 숫자임)는 또한 본원에서 "AFXX"로 언급된다. 예를 들어, LNP09는 또한 AF09로 언급되고, LNP12는 또한 AF12로 공지되거나 언급된다.
본원에서 사용되는 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 본 발명에서 필수적인 조성물, 방법, 및 이들의 각각의 구성요소(들)에 대한 언급에서 사용되나, 필수적이거나 그렇지 않은 간에 특정되지 않은 구성요소의 포함도 허용된다.
본원에서 사용되는 용어 "~로 필수적으로 구성되는"은 제공된 구현예에 필요한 구성요소를 나타낸다. 상기 용어는 본 발명에서 특정된 구현예의 기본적 및 신규한 또는 기능적 특징(들)에 크게 영향을 미치지 않는 구성요소의 존재를 허용한다.
용어 "~로 구성되는"은 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법, 및 이들의 각각의 구성요소에 관한 것으로, 이는 구현예의 기재에서 언급되지 않은 임의의 구성요소를 배제한다.
II. 이중-가닥 리보핵산(dsRNA)
TMPRSS6 유전자의 발현을 조절하는 iRNA 작용제가 본원에 기재된다. 한 구현예에서, iRNA 작용제는 세포 또는 포유동물, 예를 들어, 상승된 철 수준을 갖는 인간, 예를 들어, β-탈라세미아, 또는 혈색소증을 갖는 환자에서 TMPRSS6 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 분자를 포함한다. dsRNA는 TMPRSS6 유전자의 발현에서 형성된 mRNA의 적어도 일부에 상보적인 상보성 영역을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 상보성 영역은 30개 이하의 뉴클레오티드 길이, 일반적으로 19 내지 24개의 뉴클레오티드 길이이고, 여기서 TMPRSS6 유전자를 발현하는 세포와 접촉시 dsRNA는, 예를 들어, PCR 또는 분지된 DNA(bDNA)-기반 방법, 또는 단백질-기반 방법, 예를 들어, 웨스턴 블롯에 의해 검정시 TMPRSS6 유전자의 발현을 적어도 10%까지 억제한다. 한 구현예에서, iRNA 작용제는 세포 또는 포유동물에서 TMPRSS6 유전자의 발현을 활성화시킨다. 세포 배양물, 예를 들어, COS 세포, HeLa 세포, 일차 간세포, HepG2 세포, 일차 배양된 세포 또는 피검체로부터의 생물학적 샘플 내에서의 TMPRSS6 유전자의 발현은 bDNA 또는 TaqMan® 검정에 의해서와 같이 TMPRSS6 mRNA 수준을 측정하거나, 예를 들어, 웨스턴 블로팅 또는 흐름세포측정법 기술을 이용한 면역형광 분석에 의해서와 같이 단백질 수준을 측정함으로써 검정될 수 있다.
dsRNA는 dsRNA가 사용되는 조건하에서 하이브리드화되어 듀플렉스 구조를 형성하는 상보적인 2개의 RNA 가닥을 포함한다. dsRNA의 한 가닥(안티센스 가닥)은 표적 서열에 실질적으로 상보적이고, 일반적으로 완전히 상보적인 상보성 영역을 포함한다. 표적 서열은 TMPRSS6 유전자의 발현 동안 형성되는 mRNA의 서열로부터 유래될 수 있다. 다른 가닥(센스 가닥)은 적합한 조건하에서 결합되는 경우 2개의 가닥이 하이브리드화되어 듀플렉스 구조를 형성하도록 하는 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함한다. 일반적으로, 듀플렉스 구조는 15개 내지 30개, 더욱 일반적으로 18개 내지 25개, 더욱 더 일반적으로 19개 내지 24개, 가장 일반적으로 19개 내지 21개의 염기쌍 길이이다. 유사하게, 표적 서열에 대한 상보성 영역은 15개 내지 30개, 더욱 일반적으로 18개 내지 25개, 더욱 더 일반적으로 19개 내지 24개, 가장 일반적으로 19개 내지 21개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, dsRNA는 15개 내지 20개의 뉴클레오티드 길이이고, 다른 구현예에서, dsRNA는 25개 내지 30개의 뉴클레오티드 길이이다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 분해에 대해 표적화된 RNA의 표적화된 영역은 가장 흔하게는 보다 큰 RNA 분자, 종종, mRNA 분자의 일부일 것이다. 관련된 경우, mRNA 표적의 "일부"는 RNAi-유도 분해(즉, RISC 경로를 통한 분해)에 대한 기질이 되기에 충분한 길이의 mRNA 표적의 연속적 서열이다. 9개의 염기쌍만큼 짧은 듀플렉스를 갖는 dsRNA는 일부 환경하에서 RNAi-유도 RNA 분해를 매개할 수 있다. 가장 흔하게는, 표적은 적어도 15개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 15 내지 30개의 뉴클레오티드 길이일 것이다.
당업자는 또한 듀플렉스 영역이 dsRNA의 일차 기능적 부분, 예를 들어, 9 내지 36개, 예를 들어, 15 내지 30개의 염기쌍의 듀플렉스 영역인 것을 인지할 것이다. 따라서, 한 구현예에서, 예를 들어, 분해에 대한 요망되는 RNA를 표적으로 하는 15 내지 30개의 염기쌍의 기능적 듀플렉스로 가공되는 한, 30개 염기쌍을 초과하는 듀플렉스 영역을 갖는 RNA 분자 또는 RNA 분자의 복합체는 dsRNA이다. 따라서, 당업자는, 한 구현예에서, miRNA가 dsRNA인 것을 인지할 것이다. 또 다른 구현예에서, dsRNA는 자연 발생 miRNA가 아니다. 또 다른 구현예에서, TMPRSS6 발현을 표적으로 하는데 유용한 iRNA 작용제는 보다 큰 dsRNA의 분해에 의해 표적 세포에서 생성되지 않는다.
본원에 기재된 바와 같은 dsRNA는 하나 이상의 단일-가닥 뉴클레오티드 오버행을 추가로 포함할 수 있다. dsRNA는, 예를 들어, Biosearch, Applied Biosystems, Inc.로부터 시판되는 바와 같은 자동화된 DNA 합성기의 사용에 의해 하기 추가로 논의되는 바와 같은 당 분야에 공지된 표준 방법에 의해 합성될 수 있다. 한 구현예에서, TMPRSS6 유전자는 인간 TMPRSS6 유전자이다. 또 다른 구현예에서, TMPRSS6 유전자는 마우스 또는 래트 TMPRSS6 유전자이다. 마우스 TMPRSS6 mRNA의 서열은 GenBank 등록 번호 NM_027902호(GI:125656151, 2010년 12월 28일에 기록됨)에서 발견될 수 있다. 래트 TMPRSS6 mRNA의 서열은 GenBank 등록 번호 NM_001130556.1호(GI:194474097, 2011년 1월 17일에 기록됨)에서 발견될 수 있다. 특정 구현예에서, 첫번째 서열은 표 2, 3 또는 4 중 하나의 센스 서열을 포함하는 dsRNA의 센스 가닥이고, 두번째 서열은 표 2, 3 또는 4 중 하나의 안티센스 서열을 포함하는 dsRNA의 안티센스 가닥이다. 표 2, 3 또는 4에 제공된 표적 서열 내의 다른 곳을 표적으로 하는 대안적 dsRNA 작용제는 표적 서열 및 플랭킹 TMPRSS6 서열을 이용하여 용이하게 결정될 수 있다.
한 양태에서, dsRNA는 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열인 센스 및 안티센스 서열을 포함할 것이며, 여기서 센스 가닥은 표 2, 3 또는 4에 제공된 서열의 군으로부터 선택된다. 이러한 양태에서, 2개의 서열 중 하나는 2개의 서열의 나머지에 상보적이고, 상기 서열 중 하나는 TMPRSS6 유전자의 발현에서 생성된 mRNA의 서열에 실질적으로 상보적이다. 이와 같이, 이러한 양태에서, dsRNA는 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이며, 여기서 하나의 올리고뉴클레오티드는 표 2, 3 또는 4에 센스 가닥으로 기재되고, 두번째 올리고뉴클레오티드는 표 2, 3 또는 4로부터의 센스 가닥의 상응하는 안티센스 가닥으로 기재된다. 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같고 당 분야에 공지된 바와 같이, dsRNA의 상보적 서열은 또한 별개의 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 것과 반대로 단일한 핵산 분자의 자가-상보적 영역으로 함유될 수 있다.
당업자는 20 내지 23개, 특이적으로는 21개의 염기쌍을 갖는 듀플렉스 구조를 갖는 dsRNA가 RNA 간섭을 유도하는데 있어서 특히 효과적인 것으로 언급되는 것을 잘 인지한다(Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). 그러나, 다른 당업자는 보다 짧거나 보다 긴 RNA 듀플렉스 구조가 또한 효과적일 수 있는 것을 발견하였다. 상기 기재된 구현예에서, 표 2, 3 또는 4에 제공된 올리고뉴클레오티드 서열의 특성에 의해, 본원에 기재된 dsRNA는 최소 21 nt의 길이의 적어도 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 하나 또는 둘 모두의 말단 상에 단지 소수의 뉴클레오티드가 없는 표 2, 3 또는 4의 서열 중 하나를 갖는 보다 짧은 듀플렉스가 상기 기재된 dsRNA에 비해 유사하게 효과적일 수 있음이 합리적으로 예상될 수 있다. 그러므로, 표 2, 3 또는 4의 서열 중 하나로부터의 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 이 이상의 연속적 뉴클레오티드의 부분적 서열을 갖고, TMPRSS6 유전자의 발현을 완전한 서열을 포함하는 dsRNA로부터의 5, 10, 15, 20, 25, 또는 30% 이하의 억제까지 억제하는 능력에 있어서 다양한 dsRNA가 본 발명에 따라 고려된다.
또한, 표 2, 3 또는 4에 제공된 RNA는 RISC-매개 분해에 민감한 TMPRSS6 전사체 내의 부위를 확인한다. 이와 같이, 본 발명은 추가로 상기 서열 중 하나의 서열 내를 표적으로 하는 iRNA를 특징으로 한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 iRNA는 iRNA가 상기 특정 부위 내의 어느 곳에서든지의 전사체의 분해를 촉진하는 경우 RNA 전사체의 특정 부위 내를 표적으로 하는 것으로 언급된다. 이러한 iRNA는 일반적으로 TMPRSS6 유전자 내의 선택된 서열에 연속적인 영역으로부터 획득된 추가의 뉴클레오티드 서열에 커플링된 표 2, 3 또는 4에 제공된 서열 중 하나로부터의 적어도 15개의 연속적 뉴클레오티드를 포함할 것이다.
표적 서열은 일반적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드 길이이나, 임의의 제공된 표적 RNA의 분해를 유도하기 위한 상기 범위 내의 특정 서열의 적합성에서의 광범위한 변화가 존재한다. 본원에 나열된 다양한 소프트웨어 패키지 및 지침이 임의의 제공된 유전자 표적에 대한 최적의 표적 서열의 확인을 위한 안내를 제공하나, 제공된 크기(비제한적인 예로, 21개의 뉴클레오티드)의 "윈도우(window)" 또는 "마스크(mask)"가 표적 서열로 작용할 수 있는 크기 범위 내의 서열을 확인하기 위해 표적 RNA 서열 상에 글자 그대로 또는 상징적으로(예를 들어, 인 실리코(in silico)를 포함함) 위치되는 경험적 방법이 또한 수행될 수 있다. 서열 "윈도우"를 최초 표적 서열 위치에서 하나의 뉴클레오티드만큼 업스트림 또는 다운스트림으로 점진적으로 이동시킴으로써, 선택된 임의의 제공된 표적 크기에 대해 가능한 서열의 완전한 세트가 확인될 때까지 차위(next) 잠재적 표적 서열이 확인될 수 있다. 최적으로 작용하는 상기 서열을 확인하기 위한 확인된 서열(본원에 기재되어 있거나 당 분야에 공지된 바와 같은 검정을 이용함)의 체계적 합성 및 시험과 커플링된 상기 과정은 iRNA 작용제로 표적화되는 경우 표적 유전자 발현의 최적 억제를 매개하는 RNA 서열을 확인할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 표 2, 3 또는 4에서 확인된 서열이 효과적인 표적 서열이나, 동등하거나 보다 나은 억제 특징을 갖는 서열을 확인하기 위해 하나의 뉴클레오티드만큼 제공된 서열의 업스트림 또는 다운스트림으로 점진적으로 "윈도우를 보행(walking the window)"시킴으로써 억제 효능의 추가 최적화가 달성될 수 있음이 고려된다.
추가로, 예를 들어, 표 2, 3 또는 4에서 확인된 임의의 서열에 대해 보다 길거나 보다 짧은 서열을 생성시키기 위해 뉴클레오티드를 체계적으로 추가하거나 제거하고, 상기 지점으로부터 표적 RNA 위 또는 아래로 상기 보다 길거나 짧은 크기의 윈도우를 보행시킴으로써 생성된 서열을 시험함으로써 추가 최적화가 달성될 수 있음이 고려된다. 또한, 새로운 후보 표적을 생성시키기 위한 상기 방법과 당 분야에 공지되어 있거나 본원에 기재된 바와 같은 억제 검정에서의 표적 서열을 기초로 한 iRNA의 효과에 대한 시험을 커플링시키는 것은 억제의 효율에서의 추가의 개선을 발생시킬 수 있다. 추가로 또한, 상기 최적화된 서열은, 예를 들어, 본원에 기재되거나 당 분야에 공지된 바와 같은 변형된 뉴클레오티드의 도입, 오버행 내의 추가 또는 변화, 또는 발현 억제제로서 분자를 추가로 최적화(예를 들어, 혈청 안정성 또는 순환 반감기 증가, 열 안정성 증가, 막횡단 전달 향상, 특정 위치 또는 세포 유형으로의 표적화, 침묵 경로 효소와의 상호작용 증가, 엔도솜으로부터의 방출 증가 등)시키기 위한 당 분야에 공지되고/되거나 본원에 논의된 바와 같은 다른 변형에 의해 조정될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 iRNA는 표적 서열에 대한 하나 이상의 미스매치를 함유할 수 있다. 한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 iRNA는 3개 이하의 미스매치를 함유한다. iRNA의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 미스매치를 함유하는 경우, 미스매치의 영역이 상보성의 영역의 중심에 위치되지 않는 것이 바람직하다. iRNA의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 미스매치를 함유하는 경우, 미스매치가 상보성 영역의 5' 또는 3' 말단으로부터 마지막 5개의 뉴클레오티드 내에 존재하도록 제한되는 것이 바람직하다. 예를 들어, TMPRSS6 유전자의 영역에 상보적인 23개의 뉴클레오티드 iRNA 작용제 RNA 가닥에 대해, RNA 가닥은 일반적으로 중심 13개의 뉴클레오티드 내에 어떠한 미스매치를 함유하지 않는다. 본원에 기재된 방법 또는 당 분야에 공지된 방법은 표적 서열에 대한 미스매치를 함유하는 iRNA가 TMPRSS6 유전자의 발현을 억제시키는데 효과적인지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 특히, TMPRSS6 유전자 내의 특정 상보성 영역이 집단 내의 다형 서열 변화를 갖는 것으로 공지된 경우에 TMPRSS6 유전자의 발현을 억제하는데 있어서 미스매치를 갖는 iRNA의 효능의 고려가 중요하다.
한 구현예에서, dsRNA의 적어도 하나의 말단은 1 내지 4개, 일반적으로 1 또는 2개의 뉴클레오티드의 단일-가닥 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. 적어도 하나의 뉴클레오티드 오버행을 갖는 상기 dsRNA는 이들의 블런트-말단 대응부에 비해 예기치 않은 우수한 억제 특성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, iRNA의 RNA, 예를 들어, dsRNA는 안정성 또는 다른 이로운 특징을 향상시키기 위해 화학적으로 변형된다. 본 발명에서 특정된 핵산은 참조로서 본원에 포함되는 문헌["Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley ＆ Sons, Inc., New York, NY, USA]에 기재된 것과 같은 당 분야에서 널리 확립된 방법에 의해 합성되고/되거나 변형될 수 있다. 변형은, 예를 들어, (a) 말단 변형, 예를 들어, 5' 말단 변형(인산화, 컨쥬게이션, 역전된 결합 등), 3' 말단 변형(컨쥬게이션, DNA 뉴클레오티드, 역전된 결합 등), (b) 염기 변형, 예를 들어, 안정화 염기, 불안정화 염기, 또는 파트너의 연장된 레퍼토리, 염기의 제거(무염기 뉴클레오티드), 또는 컨쥬게이션된 염기와 염기쌍을 형성하는 염기를 이용한 대체, (c) 당 변형(예를 들어, 2' 위치 또는 4' 위치에서의 변형) 또는 당의 대체, 뿐만 아니라 (d) 포스포디에스테르 결합의 변형 또는 대체를 포함하는 백본 변형을 포함한다. 본원에 기재된 구현예에서 유용한 RNA 화합물의 특이적 예는 변형된 백본 또는 비-자연 뉴클레오시드간 결합을 함유하는 RNA를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 변형된 백본을 갖는 RNA는 특히 백본 내에 인 원자를 갖지 않는 것을 포함한다. 본 명세서의 목적상, 당 분야에 때때로 언급되는 바와 같은, 뉴클레오시드간 백본에서 인 원자를 갖지 않는 변형된 RNA가 또한 올리고뉴클레오시드인 것으로 간주될 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 RNA는 이의 뉴클레오시드간 백본에서 인 원자를 가질 것이다.
변형된 RNA 백본은, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 예를 들어, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포라미데이트, 예를 들어, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상 3'-5' 결합을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 결합된 유사체, 및 역전된 극성을 갖는 것을 포함하며, 여기서 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍은 3'-5' 대 5'-3' 또는 2'-5' 대 5'-2'로 연결된다. 다양한 염, 혼합된 염 및 자유산 형태가 또한 포함된다.
상기 인-함유 결합의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허는 각각이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 3,687,808호; 4,469,863호; 4,476,301호; 5,023,243호; 5,177,195호; 5,188,897호; 5,264,423호; 5,276,019호; 5,278,302호; 5,286,717호; 5,321,131호; 5,399,676호; 5,405,939호; 5,453,496호; 5,455,233호; 5,466,677호; 5,476,925호; 5,519,126호; 5,536,821호; 5,541,316호; 5,550,111호; 5,563,253호; 5,571,799호; 5,587,361호; 5,625,050호; 6,028,188호; 6,124,445호; 6,160,109호; 6,169,170호; 6,172,209호; 6,239,265호; 6,277,603호; 6,326,199호; 6,346,614호; 6,444,423호; 6,531,590호; 6,534,639호; 6,608,035호; 6,683,167호; 6,858,715호; 6,867,294호; 6,878,805호; 7,015,315호; 7,041,816호; 7,273,933호; 7,321,029호; 및 미국 특허 RE39464호를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
인 원자를 포함하지 않는 변형된 RNA 백본은 짧은 사슬 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 또는 하나 이상의 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오시드간 결합에 의해 형성되는 백본을 갖는다. 이들은 모르폴리노 결합(뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨)을 갖는 백본; 실록산 백본; 설파이드, 설폭시드 및 설폰 백본; 포르마세틸 및 티오포르마세틸 백본; 메틸렌 포르마세틸 및 티오포르마세틸 백본; 알켄 함유 백본; 설파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 설포네이트 및 설폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 구성요소 부분을 갖는 다른 백본을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허는 각각이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 5,034,506호; 5,166,315호; 5,185,444호; 5,214,134호; 5,216,141호; 5,235,033호; 5,64,562호; 5,264,564호; 5,405,938호; 5,434,257호; 5,466,677호; 5,470,967호; 5,489,677호; 5,541,307호; 5,561,225호; 5,596,086호; 5,602,240호; 5,608,046호; 5,610,289호; 5,618,704호; 5,623,070호; 5,663,312호; 5,633,360호; 5,677,437호; 및 5,677,439호를 포함하나, 이로 제한되지는 않는다.
iRNA에서 사용하기에 적합하거나 고려되는 다른 RNA 모방체(mimetic)에서, 당 및 뉴클레오시드간 결합 둘 모두, 즉, 뉴클레오티드 단위의 백본은 신규한 기로 대체된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 하이브리드화를 위해 유지된다. 한 상기 올리고머 화합물인 우수한 하이브리드화 특성을 갖는 것으로 밝혀진 RNA 모방체는 펩티드 핵산(PNA)으로 언급된다. PNA 화합물에서, RNA의 당 백본은 아미드 함유 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본으로 대체된다. 핵염기는 유지되고, 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허는 각각이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 5,539,082호; 5,714,331호; 및 5,719,262호를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. PNA 화합물의 추가 교시는, 예를 들어, 문헌[Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]에서 발견될 수 있다.
본 발명에서 특정된 일부 구현예는 포스포로티오에이트 백본을 갖는 RNA 및 헤테로원자 백본, 특히 상기 언급된 미국 특허 번호 5,489,677호의 --CH2--NH--CH2--, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 백본으로 공지됨], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2--CH2--[여기서, 자연 포스포디에스테르 백본은 --O--P--O--CH2--로 표시됨], 및 상기 언급된 미국 특허 번호 5,602,240호의 아미드 백본을 갖는 올리고뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 특정된 RNA는 상기 언급된 미국 특허 번호 5,034,506호의 모르폴리노 백본 구조를 갖는다.
변형된 RNA는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 본원에 특정된 iRNA, 예를 들어, dsRNA는 2' 위치에 OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 중 하나를 포함할 수 있고, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 예시적인 적합한 변형은 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2를 포함하고, 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 구현예에서, dsRNA는 2' 위치에 C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노,폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 분해 기, 리포터 기, 인터켈레이터(intercalator), iRNA의 약동학적 특성을 개선시키기 위한 기, 또는 iRNA의 약역학적 특성을 개선시키기 위한 기, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환기 중 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O--CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 공지됨)(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), 즉, 알콕시-알콕시기를 포함한다. 또 다른 예시적 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 하기 본원의 실시예에 기재된 바와 같은 2'-DMAOE로도 공지된 O(CH2)2ON(CH3)2 기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로도 당 분야에 공지됨), 즉, 본원의 하기의 실시예에도 기재된 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2이다.
다른 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 유사한 변형이 또한 iRNA의 RNA 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상 또는 2'-5' 연결된 dsRNA 내의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. iRNA는 또한 펜토푸라노실 당의 위치 내의 사이클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 가질 수 있다. 상기 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허는 미국 특허 번호 4,981,957호; 5,118,800호; 5,319,080호; 5,359,044호; 5,393,878호; 5,446,137호; 5,466,786호; 5,514,785호; 5,519,134호; 5,567,811호; 5,576,427호; 5,591,722호; 5,597,909호; 5,610,300호; 5,627,053호; 5,639,873호; 5,646,265호; 5,658,873호; 5,670,633호; 및 5,700,920호를 포함하나, 이에 제한되지는 않고, 상기 특허 중 특정 특허는 본 출원과 함께 공통으로 소유되며, 상기 출원 각각은 참조로서 본원에 포함된다.
iRNA는 또한 핵염기(종종, 당 분야에서 "염기"로 간단히 언급됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "변형되지 않은" 또는 "자연" 핵염기는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형된 핵염기는 다른 합성 및 자연 핵염기, 예를 들어, 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-다아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가 핵염기는 미국 특허 번호 3,687,808호에 개시된 것, 문헌[Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008]에 개시된 것, 문헌[The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley ＆ Sons, 1990]에 개시된 것, 문헌[Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 개시된 것, 및 문헌[Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993]에 개시된 것을 포함한다. 상기 핵염기 중 특정 핵염기가 본 발명에서 특정된 올리고머 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 이들은 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예를 들어, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6 내지 1.2℃까지 증가시키는 것으로 밝혀졌고(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 이는 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합되는 경우에 더욱 더 특히 예시적인 염기 치환이다.
상기 언급된 변형된 핵염기 뿐만 아니라 다른 변형된 핵염기 중 특정 핵염기의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허는 각각이 참조로서 본원에 포함되는 상기 언급된 미국 특허 번호 3,687,808호, 뿐만 아니라 미국 특허 번호 4,845,205호; 5,130,30호; 5,134,066호; 5,175,273호; 5,367,066호; 5,432,272호; 5,457,187호; 5,459,255호; 5,484,908호; 5,502,177호; 5,525,711호; 5,552,540호; 5,587,469호; 5,594,121호, 5,596,091호; 5,614,617호; 5,681,941호; 6,015,886호; 6,147,200호; 6,166,197호; 6,222,025호; 6,235,887호; 6,380,368호; 6,528,640호; 6,639,062호; 6,617,438호; 7,045,610호; 7,427,672호; 및 7,495,088호, 및 참조로서 또한 본원에 포함되는 미국 특허 번호 5,750,692호를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
iRNA의 RNA는 또한 하나 이상의 잠김 핵산(LNA)을 포함하도록 변형될 수 있다. 잠김 핵산은 리보스 모이어티가 2' 및 4' 탄소를 연결시키는 여분의 브릿지를 포함하는 변형된 리보스 모이어티를 갖는 뉴클레오티드이다. 이러한 구조는 3'-엔도 구조적 형태 내의 리보스를 효과적으로 "잠근다". siRNA에 대한 잠금 핵산의 추가는 혈청 내에서의 siRNA 안정성을 증가시키고, 표적외(off-target) 효과를 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).
잠금 핵산 뉴클레오티드의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허는 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,268,490호; 6,670,461호; 6,794,499호; 6,998,484호; 7,053,207호; 7,084,125호; 및 7,399,845호를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 특정된 iRNA의 RNA의 또 다른 변형은 RNA에 iRNA의 활성, 세포 분포, 약동학 특성, 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 리간드, 모이어티 또는 컨쥬게이트를 화학적으로 연결시키는 것을 포함한다. 이러한 모이어티는 지질 모이어티, 예를 들어, 콜레스테롤 모이어티(Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), 콜산(Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), 티오에테르, 예를 들어, 베릴-S-트리틸티올(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett, 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-0-헥사데실-rac-글리세로-3-포스포네이트(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan et al., Nucleosides ＆ Nucleotides, 1995, 14:969-973), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), 팔미틸 모이어티(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
한 구현예에서, 리간드는 통합되는 iRNA 작용제의 분포, 표적화 또는 수명을 변경시킨다. 바람직한 구현예에서, 리간드는, 예를 들어, 이러한 리간드가 부재하는 종에 비해 선택된 표적, 예를 들어, 분자, 세포 또는 세포 유형(예를 들어, 간 세포, 예를 들어, 간세포), 구획, 예를 들어, 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 신체의 영역에 대한 향상된 친화성을 제공한다. 바람직한 리간드는 듀플렉스화된 핵산 내의 듀플렉스 쌍 형성 내의 부분을 취하지 않을 것이다.
리간드는 자연 발생 물질, 예를 들어, 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지질단백질(LDL), 또는 글로불린); 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 풀루란(pullulan), 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산); 또는 지질을 포함할 수 있다. 리간드는 또한 재조합 또는 합성 분자, 예를 들어, 합성 중합체, 예를 들어, 합성 폴리아미노산일 수 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리리신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락티드-코-글리콜리드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체, 또는 폴리포스파진이다. 폴리아민의 예는 폴리에틸렌이민, 폴리리신(PLL), 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아민, 슈도펩티드-폴리아민, 펩티드모방체(peptidomimetic) 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 4차염, 또는 α 헬리칼 펩티드를 포함한다.
리간드는 또한 표적화 기, 예를 들어, 세포 또는 조직 표적화 작용제, 예를 들어, 신장 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어, 항체를 포함할 수 있다. 표적화 기는 갑상샘자극호르몬, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스, 다가 푸코스, 당화된 폴리아미노산, 다가 갈락토스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 폴레이트, 비타민 B12, 비타민 A, 비오틴, 또는 RGD 펩티드 또는 RGD 펩티드 모방체일 수 있다.
리간드의 다른 예는 염료, 중격제(예를 들어, 아크리딘), 가교제(예를 들어, 소랄렌(psoralene), 미토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린(texaphyrin), 사피린(Sapphyrin)), 폴리사이클릭 방향족 탄화수소(예를 들어, 페나진(phenazine), 디하이드로페나진(dihydrophenazine)), 인공 엔도뉴클레아제(예를 들어, EDTA), 친유성 분자, 예를 들어, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, 03-(올레오일)리토콜산, 03-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진) 및 펩티드 컨쥬게이트(예를 들어, 안테나페디아(antennapedia) 펩티드, Tat 펩티드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 머캅토, PEG(예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성 표지된 마커, 효소, 합텐(예를 들어, 비오틴), 운반/흡수 촉진제(예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 폴산), 합성 리보뉴클레아제(예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 컨쥬게이트, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP, 또는 AP를 포함한다.
리간드는 단백질, 예를 들어, 당단백질, 또는 펩티드, 예를 들어, 공동-리간드에 대한 특이적 친화성을 갖는 분자, 또는 항체, 예를 들어, 암세포, 내피 세포, 또는 골세포와 같은 특이적 세포 유형에 결합하는 항체일 수 있다. 리간드는 또한 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수 있다. 이들은 또한 비-펩티드 종, 예를 들어, 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 보조인자, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스, 또는 다가 푸코스를 포함할 수 있다. 리간드는, 예를 들어, 지질다당질, p38 MAP 키나제의 활성제, 또는 NF-κB의 활성제일 수 있다.
리간드는 물질, 예를 들어, 세포의 세포골격을 붕괴시키거나, 예를 들어, 세포의 미세관, 미세섬유, 및/또는 중간세사를 붕괴시킴으로써 세포로의 iRNA 작용제의 흡수를 증가시킬 수 있는 약물일 수 있다. 약물은, 예를 들어, 탁손(taxon), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 사이토카라신(cytochalasin), 노코다졸(nocodazole), 자플라키놀리드(japlakinolide), 라트루쿨린 A(latrunculin A), 팔로이딘(phalloidin), 스윈홀리드 A(swinholide A), 인다노신(indanocine), 또는 미오서빈(myoservin)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 iRNA에 부착된 리간드는 PK 조정자로 작용한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "PK 조정자"는 약동학 조정자를 나타낸다. PK 조정자는 리포파일(lipophile), 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩티드, 단백질 결합 작용제, PEG, 비타민 등을 포함한다. 예시적 PK 조정자는 콜레스테롤, 지방산, 콜산, 리토콜산, 디알킬글리세라이드, 디아실글리세라이드, 인지질, 스핑고지질, 나프록센, 이부프로펜, 비타민 E, 비오틴 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 또한 혈청 단백질에 결합하는 것으로 공지되어 있고, 이에 따라 짧은 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 백본 내에 다수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 약 5개의 염기, 10개의 염기, 15개의 염기 또는 20개의 염기의 올리고뉴클레오티드가 또한 리간드(예를 들어, PK 조절 리간드)로서 본 발명에 적용가능하다. 또한, 혈청 성분(예를 들어, 혈청 단백질)에 결합하는 앱타머가 또한 본원에 기재된 구현예에서 PK 조절 리간드로 사용하기에 적합하다.
이중막을 용이하게 가로지를 수 없는 거대분자 약물 및 친수성 약물 분자에 대해, 세포의 엔도솜/리소솜 구획에서의 포착은 이들의 작용 부위로의 효과적인 전달에 대한 가장 큰 장애인 것으로 생각된다. 최근 수년간, 상기 문제를 다루기 위해 다수의 접근법 및 전략이 고안되었다. 리포솜 제형에 대해, 제형 내에서의 융합유도 지질의 사용이 가장 흔한 접근법이다(Singh, R. S., Goncalves, C. et al. (2004). On the Gene Delivery Efficacies of pH-Sensitive Cationic Lipids via Endosomal Protonation. A Chemical Biology Investigation. Chem. Biol. 11, 713-723.). 양성자 첨가 및/또는 pH-유도 형태 변화를 통해 pH-민감성 엔도솜 분해성 활성을 나타내는 다른 성분은 하전된 중합체 및 펩티드를 포함한다. 예는 문헌[Hoffman, A. S., Stayton, P. S. et al. (2002). Design of "smart" polymers that can direct intracellular drug delivery. Polymers Adv. Technol. 13, 992-999; Kakudo, Chaki, T., S. et al. (2004). Transferrin-Modified Liposomes Equipped with a pH-Sensitive Fusogenic Peptide: An Artificial Viral-like Delivery System. Biochemistry 436, 5618-5628; Yessine, M. A. and Leroux, J. C. (2004). Membrane-destabilizing polyanions: interaction with lipid bilayers and endosomal escape of biomacromolecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 56, 999-1021; Oliveira, S., van Rooy, I. et al. (2007)]에서 발견될 수 있다. 융합유도 펩티드가 종양유전자의 iRNA-유도 침묵을 개선시키는 엔도솜 이탈(endosomal escape)을 향상시킨다(Int. J. Pharm. 331, 211-4). 이들은 일반적으로 리포솜 또는 리포플렉스(lipoplex)와 같은 약물 전달 시스템의 상황에서 사용되어 왔다. 예를 들어, 리포솜 제형을 이용한 폴레이트 수용체-매개 전달을 위해, pH-민감성 융합유도 펩티드가 리포솜 내로 통합되었고, 흡수 과정 동안 약물 언로딩(unloading)의 개선을 통해 활성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다(Turk, M. J., Reddy, J. A. et al. (2002)). 엔도솜 pH에서 폴레이트-표적화 리포솜으로부터의 약물 방출을 향상시키는 신규한 pH-민감성 펩티드의 특성이 문헌[Biochim. Biophys. Acta 1559, 56-68]에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 엔도솜 분해성 성분은 pH-의존성 막 활성 및/또는 융합유도성(fusogenicity)을 나타내는 다중음이온 펩티드 또는 펩티드모방체일 수 있다. 펩티드모방체는 펩티드를 모방하도록 설계된 작은 단백질-유사 사슬일 수 있다. 펩티드모방체는 분자의 특성을 변경시키기 위한 존재하는 펩티드의 변형, 또는 비자연 아미노산 또는 이들의 유사체를 이용한 펩티드-유사 분자의 합성으로부터 발생할 수 있다. 특정 구현예에서, 이들은 펩티드와 비교시 개선된 안정성 및/또는 생물학적 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, 엔도솜 분해성 성분은 엔도솜 pH(예를 들어, pH 5 내지 6)에서 이의 활성 형태를 취한다. "활성" 형태는 엔도솜 분해성 성분이 엔도솜의 용해 및/또는 본 발명에서 특정된 모듈 조성물(modular composition), 또는 이의 성분 중 임의의 성분(예를 들어, 핵산)의 엔도솜으로부터 세포의 세포질로의 운반을 촉진한다.
화합물의 라이브러리는 용혈 검정을 이용하여 중성 pH에 대한 엔도솜 pH에서의 이들의 차별적 막 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 상기 방법에 의해 분리된 유망한 후보자는 본 발명에서 특정된 모듈 조성물의 성분으로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 엔도솜 분해성 성분을 확인하기 위한 방법은 화합물의 라이브러리를 제공하는 단계; 혈액 세포와 라이브러리의 막을 접촉시키는 단계로서, 접촉이 발생하는 매질의 pH가 조절되는 단계; 화합물이 중성 pH(예를 들어, 약 pH 7 내지 8)에 비해 낮은 pH(예를 들어, 약 pH 5 내지 6)에서 혈액 세포의 차별적 용해를 유도하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
예시적 엔도솜 분해성 성분은 GALA 펩티드(Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972), EALA 펩티드(Vogel et al., J. Am. Chem. Soc, 1996, 118: 1581-1586), 및 이들의 유도체(Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68)를 포함한다. 특정 구현예에서, 엔도솜 분해성 성분은 pH에서의 변화에 반응하여 전하에서의 변화 또는 양성자 첨가를 겪게 되는 화학적 기(예를 들어, 아미노산)를 함유할 수 있다. 엔도솜 분해성 성분은 선형 또는 분지형일 수 있다. 엔도솜 분해성 성분의 예시적 일차 서열은 H2N-(AALEALAEALEALAEALEALAEAAAAGGC)-CO2H(SEQ ID NO:2); H2N-(AALAEALAEALAEALAEALAEALAAAAGGC-C02H(SEQ ID NO:3); 및 H2N-(ALEALAEALEALAEA)-CONH2(SEQ ID NO:4)를 포함한다.
특정 구현예에서, 하나보다 많은 엔도솜 분해성 성분은 본 발명에서 특정된 iRNA 작용제로 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 이는 iRNA 작용제로 동일한 엔도솜 분해성 성분 중 하나보다 많은 성분을 통합시키는 것을 수반할 것이다. 다른 구현예에서, 이는 iRNA 작용제로 2개 이상의 상이한 엔도솜 분해성 성분을 통합시키는 것을 수반할 것이다.
이들 엔도솜 분해성 성분은, 예를 들어, 엔도솜 pH에서 형태를 변화시킴으로써 엔도솜 이탈을 매개할 수 있다. 특정 구현예에서, 엔도솜 분해성 성분은 중성 pH에서 무작위 코일 형태로 존재할 수 있고, 엔도솜 pH에서 양친매성 헬릭스로 재배열될 수 있다. 상기 형태 변이의 결과로서, 이들 펩티드는 엔도솜의 지질막으로 삽입되어, 세포질로의 엔도솜 내용물의 누출을 야기시킬 수 있다. 형태 변이는 pH-의존성이므로, 엔도솜 분해성 성분은 혈액(약 pH 7.4)에서 순환하면서 융합유도 활성을 거의 나타내지 않거나 융합유도 활성을 나타내지 않을 수 있다. 본원에서 사용되는 "융합유도 활성"은 엔도솜 분해성 성분에 의해 지질막의 붕괴를 발생시키는 활성으로 정의된다. 융합유도 활성의 한 예는 엔도솜 분해성 성분에 의한 엔도솜 막의 붕괴이며, 이는 엔도솜 용해 또는 누출 및 엔도솜으로부터 세포질로의 본 발명에서 특정된 모듈 조성물의 하나 이상의 성분(예를 들어, 핵산)의 운반을 발생시킨다.
본원에 기재된 바와 같은 용혈 검정에 더하여, 적합한 엔도솜 분해성 성분이 다른 방법을 이용하여 당업자에 의해 시험되고 확인될 수 있다. 예를 들어, pH 환경에 따른 전하 변화에 반응하는 화합물의 능력은 통상적인 방법에 의해, 예를 들어, 세포 검정으로 시험될 수 있다. 특정 구현예에서, 시험 화합물은 세포와 조합되거나 세포와 접촉되고, 세포는, 예를 들어, 세포내이입에 의해 시험 화합물을 내재화시킨다. 이후, 엔도솜 제조물은 대조군 세포로부터의 엔도솜 제조물에 비해 접촉된 세포 및 엔도솜 제조물로부터 제조될 수 있다. 대조군 세포에 비한 접촉된 세포로부터의 엔도솜 분획에서의 변화, 예를 들어, 감소는 시험 화합물이 융합유도 작용제로 작용할 수 있는 것을 나타낸다. 대안적으로, 접촉된 세포 및 대조군 세포는 세포 내의 엔도솜 집단 내에서의 차이를 결정하기 위해, 예를 들어, 현미경검사, 예를 들어, 광학 또는 전자 현미경검사에 의해 평가될 수 있다. 시험 화합물 및/또는 엔도솜은, 예를 들어, 엔도솜 누출을 정량하기 위해 표지될 수 있다.
또 다른 유형의 검정에서, 본원에 기재된 iRNA 작용제는 하나 이상의 시험 또는 추정 융합유도 작용제를 이용하여 작제된다. iRNA 작용제는 용이한 시각화를 위해 표지될 수 있다. iRNA 작용제가 세포에 의해 흡수된 후 엔도솜 이탈을 촉진시키는 엔도솜 분해성 성분의 능력은, 예를 들어, 엔도솜 제조물의 제조, 또는 세포의 세포질 내의 표지된 iRNA 작용제의 시각화를 가능케 하는 현미경검사 기술에 의해 평가될 수 있다. 특정한 다른 구현예에서, 유전자 발현의 억제, 또는 임의의 다른 생리학적 파라미터가 엔도솜 이탈에 대한 대용 마커로 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, pH-의존성 구조 변이를 나타내는 화합물을 확인하기 위해 원형 이색성 분광학(circular dichroism spectroscopy)이 이용될 수 있다.
2-단계 검정이 또한 수행될 수 있으며, 여기서 첫번째 검정은 pH에서의 변화에 반응하는 시험 화합물 단독의 능력을 평가하고, 두번째 검정은 pH에서의 변화에 반응하는 시험 화합물을 포함하는 모듈 조성물의 능력을 평가한다.
지질 컨쥬게이트
한 리간드에서, 리간드 또는 컨쥬게이트는 지질 또는 지질-기반 분자이다. 이러한 지질 또는 지질-기반 분자는 바람직하게는 혈청 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합한다. HSA 결합 리간드는 표적 조직, 예를 들어, 신체의 비-신장 표적 조직으로의 컨쥬게이트의 분포를 가능케 한다. 예를 들어, 표적 조직은 간의 실질 세포를 포함하는 간일 수 있다. HSA에 결합할 수 있는 다른 분자가 또한 리간드로 사용될 수 있다. 예를 들어, 네프록신(neproxin) 또는 아스피린이 사용될 수 있다. 지질 또는 지질-기반 리간드는 (a) 컨쥬게이트의 분해에 대한 내성을 증가시킬 수 있고/있거나, (b) 표적 세포 또는 세포막으로의 표적화 또는 운반을 증가시킬 수 있고/있거나, (c) 혈청 단백질, 예를 들어, HSA에 대한 결합을 조절하기 위해 사용될 수 있다.
지질 기반 리간드는 조절, 예를 들어, 표적 조직으로의 컨쥬게이트의 결합을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, HSA에 더욱 강하게 결합하는 지질 또는 지질-기반 리간드는 신장으로 표적화될 가능성이 적고, 따라서 신체로부터 청소될 가능성이 적을 것이다. HSA에 덜 강하게 결합하는 지질 또는 지질-기반 리간드는 신장으로 컨쥬게이트를 표적화시키기 위해 사용될 수 있다.
한 바람직한 구현예에서, 지질 기반 리간드는 HSA에 결합한다. 바람직하게는, 이는 컨쥬게이트가 바람직하게는 비-신장 조직으로 분포되도록 하기에 충분한 친화성으로 HSA에 결합한다. 그러나, 친화성은 HSA-리간드 결합이 역전될 수 없을 만큼 너무 강하지 않은 것이 바람직하다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 지질 기반 리간드는 HSA에 약하게 결합하거나 전혀 결합하지 않아, 컨쥬게이트는 바람직하게는 신장에 분포될 것이다. 신장 세포로 표적화되는 다른 모이어티가 또한 지질 기반 리간드 대신 또는 지질 기반 리간드에 더하여 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 리간드는 표적 세포, 예를 들어, 증식하는 세포에 의해 흡수되는 모이어티, 예를 들어, 비타민이다. 이들은, 예를 들어, 악성 또는 비-악성 유형, 예를 들어, 암세포의 원치 않는 세포 증식을 특징으로 하는 장애를 치료하는데 특히 유용하다. 예시적 비타민은 비타민 A, E, 및 K를 포함한다. 다른 예시적 비타민은 B 비타민, 예를 들어, 폴산, B12, 리보플라빈, 비오틴, 피리독살 또는 암 세포에 의해 흡수되는 다른 비타민 또는 영양소를 포함한다. 또한, HSA 및 저밀도 지질단백질(LDL)이 포함된다.
또 다른 양태에서, 리간드는 세포-투과제, 바람직하게는 헬리칼 세포-투과제이다. 바람직하게는, 상기 작용제는 양친매성이다. 예시적 작용제는 펩티드, 예를 들어, tat 또는 안테노페디아(antennopedia)이다. 상기 작용제가 펩티드인 경우, 이는 펩티딜모방체(peptidylmimetic), 인버토머(invertomer), 비-펩티드 또는 슈도-펩티드 결합, 및 D-아미노산의 사용을 포함하는 바와 같이 변형될 수 있다. 바람직하게는, 헬리칼 작용제는 바람직하게는 친유성 및 소유성(lipophobic) 상을 갖는 α-헬리칼 작용제이다.
세포 투과 펩티드
본 발명과 함께 사용하기에 적합한 펩티드는 자연 펩티드, 예를 들어, tat 또는 안테나페디아 펩티드, 합성 펩티드, 또는 펩티드모방체일 수 있다. 또한, 펩티드는 변형된 펩티드일 수 있고, 예를 들어, 펩티드는 비-펩티드 또는 슈도-펩티드 결합, 및 D-아미노산을 포함할 수 있다. 펩티드모방체(본원에서 올리고펩티드모방체로도 언급됨)는 자연 펩티드와 유사한 규정된 3-차원 구조로 폴딩될 수 있는 분자이다. iRNA 작용제로의 펩티드 및 펩티드모방체의 부착은, 예를 들어, 세포 인지 및 흡수를 향상시킴으로써 iRNA의 약동학 분포에 영향을 미칠 수 있다. 펩티드 또는 펩티드모방체 모이어티는 약 5 내지 50개의 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개의 아미노산 길이일 수 있다.
펩티드 또는 펩티드모방체는, 예를 들어, 세포 투과 펩티드, 양이온성 펩티드, 양친매성 펩티드, 또는 소수성 펩티드(예를 들어, 주로 Tyr, Trp 또는 Phe로 구성됨)일 수 있다. 펩티드 모이어티는 덴드리머 펩티드, 결속성 펩티드(constrained peptide) 또는 가교된 펩티드일 수 있다. 또 다른 대안에서, 펩티드 모이어티는 소수성 막 전위 서열(MTS)을 포함할 수 있다. 예시적 소수성 MTS-함유 펩티드는 아미노산 서열 AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:5)를 갖는 RFGF이다. 소수성 MTS를 함유하는 RFGF 유사체(예를 들어, 아미노산 서열 AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:6))가 또한 표적화 모이어티일 수 있다. 펩티드 모이어티는 세포막을 가로지르는 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 및 단백질을 포함하는 큰 극성 분자를 가질 수 있는 "전달" 펩티드일 수 있다. 예를 들어, HIV Tat 단백질(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:7)) 및 드로소필라(Drosophila) 안테나페디아 단백질(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO: 8))로부터의 서열은 전달 펩티드로서 작용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 파지-디스플레이 라이브러리, 또는 1-비드-1-화합물(OBOC) 조합 라이브러리로부터 확인된 펩티드와 같은 펩티드 또는 펩티드모방체는 DNA의 무작위 서열에 의해 인코딩될 수 있다(Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). 바람직하게는, 지질에 결속된 펩티드 또는 펩티드모방체는 세포-표적화 펩티드, 예를 들어, 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD)-펩티드, 또는 RGD 모방체이다. 펩티드 모이어티는 약 5개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산 길이의 범위일 수 있다. 펩티드 모이어티는, 예를 들어, 안정성을 증가시키거나 형태적 특성을 유도하기 위해 구조적 변형을 가질 수 있다. 하기 기재되는 구조적 변형 중 임의의 변형이 이용될 수 있다.
RGD 펩티드 모이어티는 종양 세포, 예를 들어, 내피 종양 세포 또는 유방암 종양 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다(Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002). RGD 펩티드는 폐, 신장, 비장, 또는 간을 포함하는 다양한 다른 조직의 종양에 대해 dsRNA 작용제를 표적화시키는 것을 촉진할 수 있다(Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001). 바람직하게는, RGD 펩티드는 신장으로의 iRNA 작용제의 표적화를 촉진할 것이다. RGD 펩티드는 선형 또는 고리형일 수 있고, 특정 조직으로의 표적화를 촉진하기 위해 변형, 예를 들어, 당화되거나 메틸화될 수 있다. 예를 들어, 당화된 RGD 펩티드는 ανβ3를 발현하는 종양 세포에 iRNA 작용제를 전달할 수 있다(Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001).
증식하는 세포에서 풍부화되는 마커를 표적으로 하는 펩티드가 사용될 수 있다. 예를 들어, RGD를 함유하는 펩티드 및 펩티드모방체는 암세포, 특히 ανβ3 인테그린을 나타내는 세포를 표적화할 수 있다. 따라서, RGD 펩티드, RGD를 함유하는 고리형 펩티드, D-아미노산을 포함하는 RGD 펩티드, 뿐만 아니라 합성 RGD 모방체를 사용할 수 있다. RGD에 더하여, ανβ3 인테그린 리간드를 표적화하는 다른 모이어티를 사용할 수 있다. 일반적으로, 증식하는 세포 및 혈관형성을 조절하기 위해 상기 리간드가 사용될 수 있다.
"세포 투과 펩티드"는 세포, 예를 들어, 미생물 세포, 예를 들어, 박테리아 또는 진균 세포, 또는 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포를 투과할 수 있다. 미생물 세포-투과 펩티드는, 예를 들어, α-헬리칼 선형 펩티드(예를 들어, LL-37 또는 세로핀 P1(Ceropin P1)), 이황화결합-함유 펩티드(예를 들어, α-디펜신(α-defensin), β-디펜신 또는 박테네신(bactenecin)), 또는 단지 1개 또는 2개의 우세 아미노산을 함유하는 펩티드(예를 들어, PR-39 또는 인돌리시딘(indolicidin))일 수 있다. 세포 투과 펩티드는 또한 핵 위치 신호(NLS)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 투과 펩티드는 HIV-1 gp41 및 SV40 큰 T 항원의 NLS의 융합 펩티드 도메인으로부터 유래되는 MPG와 같은 양분된 양친매성 펩티드일 수 있다(Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
탄수화물 컨쥬게이트
일부 구현예에서, 본원에 기재된 iRNA 올리고뉴클레오티드는 탄수화물 컨쥬게이트를 추가로 포함한다. 탄수화물 컨쥬게이트는 핵산, 뿐만 아니라 본원에 기재된 바와 같은 생체내 치료 용도에 적합한 조성물의 생체내 전달에 유리하다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "탄수화물"은 그 자체로 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 적어도 6개의 탄소 원자(선형이거나, 분지형이거나, 고리형일 수 있음)를 갖는 하나 이상의 단당류 단위로 구성되는 탄수화물인 화합물, 또는 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 적어도 6개의 탄소 원자(선형이거나, 분지형이거나, 고리형일 수 있음)를 각각 갖는 하나 이상의 단당류 단위로 구성되는 탄수화물 모이어티를 일부로서 갖는 화합물을 나타낸다. 대표적 탄수화물은 당(단당류, 이당류, 삼당류 및 약 4 내지 9개의 단당류 단위를 함유하는 올리고당류), 및 다당류, 예를 들어, 전분, 글리코겐, 셀룰로스 및 다당류 검을 포함한다. 특이적 단당류는 C5 및 이 이상(바람직하게는, C5-C8)의 당을 포함하고, 이당류 및 삼당류는 2개 또는 3개의 단당류 단위(바람직하게는, C5-C8)를 갖는 당을 포함한다.
한 구현예에서, 탄수화물 컨쥬게이트는 하기 화학식, 즉, 화학식 II 내지 화학식 XXII로 구성되는 군으로부터 선택된다:
Figure 112022017774699-pat00002
Figure 112022017774699-pat00003
Figure 112022017774699-pat00004
Figure 112022017774699-pat00005
Figure 112022017774699-pat00006
본원에 기재된 구현예에서 사용하기 위한 또 다른 대표적 탄수화물 컨쥬게이트는 하기 화학식을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
Figure 112022017774699-pat00007
상기 식에서, X 또는 Y 중 하나는 올리고뉴클레오티드이고, 나머지는 수소이다.
일부 구현예에서, 탄수화물 컨쥬게이트는, 비제한적인 예로, PK 조정자, 엔도솜 분해성 리간드, 및 세포 투과 펩티드와 같은 다른 리간드를 추가로 포함한다.
링커
일부 구현예에서, 본원에 기재된 컨쥬게이트는 분해될 수 있거나 분해되지 않을 수 있는 다양한 링커를 이용하여 iRNA 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다.
용어 "링커" 또는 "연결기"는 화합물의 2개의 부분을 연결시키는 유기 모이어티를 의미한다. 링커는 통상적으로 직접 결합 또는 원자, 예를 들어, 산소 또는 황, 단위, 예를 들어, NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH 또는 원자의 사슬, 비제한적인 예로, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 알케닐, 치환되거나 비치환된 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알케닐, 헤테로사이클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐아릴알케닐, 알케닐아릴알키닐, 알키닐아릴알킬, 알키닐아릴알케닐, 알키닐아릴알키닐, 알킬헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴알케닐, 알킬헤테로아릴알키닐, 알케닐헤테로아릴알킬, 알케닐헤테로아릴알케닐, 알케닐헤테로아릴알키닐, 알키닐헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로사이클릴알킬, 알킬헤테로사이클릴알케닐, 알킬헤테로사이클릴알키닐, 알케닐헤테로사이클릴알킬, 알케닐헤테로사이클릴알케닐, 알케닐헤테로사이클릴알키닐, 알키닐헤테로사이클릴알킬, 알키닐헤테로사이클릴알케닐, 알키닐헤테로사이클릴알키닐, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알키닐헤테로아릴을 포함하며, 상기 화합물에서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릭에 의해 중단되거나 종결될 수 있고, R8은 수소, 아실, 지방족 또는 치환된 지방족이다. 한 구현예에서, 링커는 1 내지 24개의 원자, 바람직하게는 4 내지 24개의 원자, 바람직하게는 6 내지 18개의 원자, 더욱 바람직하게는 8 내지 18개의 원자, 가장 바람직하게는 8 내지 16개의 원자이다.
분해가능한 연결기는 세포 외부에서 충분히 안정적이나, 표적 세포로의 진입시 분해되어 링커가 함께 고정시킨 2개의 부분을 방출시키는 것이다. 한 바람직한 구현예에서, 분해가능한 연결기는 피검체의 혈액 내, 또는 두번째 참조 조건(예를 들어, 혈액 또는 혈청에서 발견되는 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있음)하에서 보다 표적 세포 내 또는 첫번째 참조 조건(예를 들어, 세포내 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있음)하에서 적어도 10배 또는 그 이상, 바람직하게는 적어도 100배 더 신속히 분해된다.
분해가능한 연결기는 분해 작용제, 예를 들어, pH, 산화환원 전위 또는 분해성 분자의 존재에 민감하다. 일반적으로, 분해 작용제는 혈청 또는 혈액 내에서보다 세포 내부에서 더욱 우세하거나, 더 높은 수준 또는 활성으로 발견된다. 이러한 분해성 작용제의 예는 환원에 의해 산화환원 분해성 연결기를 분해시킬 수 있는, 세포 내에 존재하는, 예를 들어, 머캅탄과 같은 산화 또는 환원 효소 또는 환원제를 포함하는, 특정 기질에 대해 선택되거나 기질 특이성을 갖지 않는 산화환원 작용제; 에스테르분해효소; 산성 환경을 발생시킬 수 있는 엔도솜 또는 작용제, 예를 들어, 5의 pH 또는 그 보다 낮은 pH를 발생시키는 엔도솜 또는 작용제; 일반적인 산으로 작용함으로써 산 분해성 연결기를 가수분해시키거나 분해시킬 수 있는 효소인 펩티다제(기질 특이적일 수 있음), 및 포스파타제를 포함한다.
분해성 연결기, 예를 들어, 이황화결합은 pH에 민감할 수 있다. 인간 혈청의 pH는 7.4인 한편, 평균 세포내 pH는 약 7.1 내지 7.3의 범위로 약간 낮다. 엔도솜은 5.5 내지 6.0의 범위의 더욱 산성인 pH를 갖고, 리소솜은 약 5.0으로 더욱 더 산성인 pH를 갖는다. 일부 링커는 바람직한 pH에서 분해됨으로써, 세포 내부의 리간드로부터, 또는 세포의 요망되는 구획으로 양이온성 지질을 방출시키는 분해성 연결기를 가질 것이다.
링커는 특정 효소에 의해 분해가능한 분해성 연결기를 포함할 수 있다. 링커로 통합된 분해성 연결기의 유형은 표적화되는 세포에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 간 표적화 리간드는 에스테르기를 포함하는 링커를 통해 양이온성 지질에 연결될 수 있다. 간 세포에는 에스테라제가 풍부하고, 이에 따라, 링커는 에스테라제가 풍부하지 않은 세포 유형보다 간 세포에서 더욱 효과적으로 분해될 것이다. 다른 에스테라제가 풍부한 세포-유형은 폐, 신장 피질, 및 고환의 세포를 포함한다.
펩티드 결합을 함유하는 링커는 펩티다제가 풍부한 표적화 세포 유형, 예를 들어, 간 세포 및 윤활막세포를 표적화하는 경우에 사용될 수 있다.
일반적으로, 분해가능한 후보 연결기의 적합도는 후보 연결기를 분해시키는 분해 작용제(또는 조건)의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 또한, 혈액 내에서 또는 다른 비-표적 조직과 접촉시 분해에 저항하는 능력에 대해 분해가능한 후보 연결기를 시험하는 것이 또한 요망될 것이다. 따라서, 첫번째 조건과 두번째 조건 사이의 분해에 대한 상대 감수성을 결정할 수 있으며, 상기 첫번째 조건은 표적 세포 내에서의 분해를 나타내도록 선택되고, 두번째 조건은 다른 조직 또는 생물학적 유체, 예를 들어, 혈액 또는 혈청에서의 분해를 나타내도록 선택된다. 평가는 세포 비함유 시스템, 세포, 세포 배양물, 기관 또는 조직 배양물, 또는 전체 동물에서 수행될 수 있다. 세포 비함유 또는 배양물 조건에서 최초 평가를 수행하고, 전체 동물에서 추가 평가에 의해 확인하는 것이 유용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 유용한 후보 화합물은 혈액 또는 혈청(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건하)에 비해 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건하)에서 적어도 2, 4, 10 또는 100배 더 신속히 분해된다.
분해가능한 산화환원 연결기
분해성 연결기의 한 부류는 환원 또는 산화 시에 분해되는 산화환원 분해성 연결기이다. 환원적 분해성 연결기의 예는 디설파이드 연결기(-S-S-)이다. 분해성 후보 연결기가 적합한 "환원적 분해성 연결기"이거나, 예를 들어, 특정 iRNA 모이어티 또는 특정 표적화 작용제와 함께 사용하기에 적합한지 결정하기 위해, 본원에 기재된 방법을 참고할 수 있다. 예를 들어, 후보자는 세포, 예를 들어, 표적 세포에서 관찰되는 분해 속도를 모방하는 당 분야에 공지된 시약을 이용하여 디티오트레이톨(DTT), 또는 다른 환원제와의 인큐베이션에 의해 평가될 수 있다. 후보자는 또한 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택되는 조건하에서 평가될 수 있다. 한 바람직한 구현예에서, 후보 화합물은 혈액 내에서 많아야 10%까지 분해된다. 바람직한 구현예에서, 유용한 후보 화합물은 혈액(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건하)에 비해 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건하)에서 적어도 2, 4, 10 또는 100배 더 신속히 분해된다. 후보 화합물의 분해 속도는 세포내 매질을 모방하도록 선택된 조건하에서 표준 효소 동역학 검정을 이용하여 결정될 수 있고, 세포외 매질을 모방하도록 선택된 조건과 비교될 수 있다.
포스페이트-기반 분해성 연결기
포스페이트-기반 분해성 연결기는 포스페이트기를 분해하거나 가수분해시키는 작용제에 의해 분해된다. 세포 내에서 포스페이트기를 분해시키는 작용제의 예는 세포 내의 포스파타제와 같은 효소이다. 포스페이트-기반 연결기의 예는 -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)( Rk)-S-이다. 바람직한 구현예는 -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-Ρ(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-이다. 한 바람직한 구현예는 -O-P(O)(OH)-O-이다. 이들 후보자는 상기 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
산 분해성 연결기
산 분해성 연결기는 산성 조건하에서 분해되는 연결기이다. 바람직한 구현예에서, 산 분해성 연결기는 약 6.5의 pH 또는 이보다 낮은 pH(예를 들어, 약 6.0, 5.5, 5.0, 또는 이보다 낮은 pH)를 갖는 산성 환경 내에서, 또는 일반적인 산으로 작용할 수 있는 효소와 같은 작용제에 의해 분해된다. 세포 내에서, 특이적인 낮은 pH 소기관, 예를 들어, 엔도솜 및 리소솜이 산 분해성 연결기에 대한 분해 환경을 제공할 수 있다. 산 분해성 연결기의 예는 하이드라존, 에스테르, 및 아미노산의 에스테르를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 산 분해성 기는 일반 화학식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O)를 가질 수 있다. 에스테르(알콕시기)의 산소에 부착된 탄소가 아릴기, 치환된 알킬기, 또는 3차 알킬기, 예를 들어, 디메틸 펜틸 또는 t-부틸인 경우가 바람직한 구현예이다. 이들 후보자는 상기 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
에스테르-기반 연결기
에스테르-기반 분해성 연결기는 세포 내의 에스테라제 및 아미다제와 같은 효소에 의해 분해된다. 에스테르-기반 분해성 연결기의 예는 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌기의 에스테르를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 에스테르 분해성 연결기는 일반 화학식 -C(O)O-, 또는 -OC(O)-를 갖는다. 이들 후보자는 상기 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
펩티드-기반 분해성 기
펩티드-기반 분해성 연결기는 세포 내의 펩티다제 및 프로테아제와 같은 효소에 의해 분해된다. 펩티드-기반 분해성 연결기는 올리고펩티드(예를 들어, 디펩티드, 트리펩티드 등) 및 폴리펩티드를 생성시키기 위해 아미노산 사이에 형성되는 펩티드 결합이다. 펩티드-기반 분해성 기는 아미드기(-C(O)NH-)를 포함하지 않는다. 아미드기는 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키넬렌 사이에 형성될 수 있다. 펩티드 결합은 펩티드 및 단백질을 생성시키기 위해 아미노산 사이에 형성되는 아미드 결합의 특별한 유형이다. 펩티드 기반 분해기는 일반적으로 펩티드 및 단백질을 발생시키는 아미노산 사이에 형성된 펩티드 결합(즉, 아미드 결합)으로 제한되고, 전체 아미드 작용기를 포함하지 않는다. 펩티드-기반 분해성 연결기는 화학식 -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-를 가지며, 여기서 RA 및 RB는 2개의 인접한 아미노산의 R 기이다. 이들 후보자는 상기 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
링커를 갖는 대표적 탄수화물 컨쥬게이트는 하기 화학식을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
Figure 112022017774699-pat00008
Figure 112022017774699-pat00009
Figure 112022017774699-pat00010
상기 식에서, X 또는 Y 중 하나는 올리고뉴클레오티드이고, 나머지는 수소이다.
RNA 컨쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허는 미국 특허 번호 4,828,979호; 4,948,882호; 5,218,105호; 5,525,465호; 5,541,313호; 5,545,730호; 5,552,538호; 5,578,717호; 5,580,731호; 5,591,584호; 5,109,124호; 5,118,802호; 5,138,045호; 5,414,077호; 5,486,603호; 5,512,439호; 5,578,718호; 5,608,046호; 4,587,044호; 4,605,735호; 4,667,025호; 4,762,779호; 4,789,737호; 4,824,941호; 4,835,263호; 4,876,335호; 4,904,582호; 4,958,013호; 5,082,830호; 5,112,963호; 5,214,136호; 5,082,830호; 5,112,963호; 5,214,136호; 5,245,022호; 5,254,469호; 5,258,506호; 5,262,536호; 5,272,250호; 5,292,873호; 5,317,098호; 5,371,241호; 5,391,723호; 5,416,203호; 5,451,463호; 5,510,475호; 5,512,667호; 5,514,785호; 5,565,552호; 5,567,810호; 5,574,142호; 5,585,481호; 5,587,371호; 5,595,726호; 5,597,696호; 5,599,923호; 5,599,928호 및 5,688,941호; 6,294,664호; 6,320,017호; 6,576,752호; 6,783,931호; 6,900,297호; 7,037,646호를 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 상기 특허 각각은 참조로서 본원에 포함된다.
제공된 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없고, 사실, 상기 언급된 변형 중 하나보다 많은 단일 화합물 내 또는 심지어 iRNA 내의 단일한 뉴클레오시드에 통합될 수 있다. 본 발명은 또한 키메라 화합물인 iRNA 화합물을 포함한다. 본 발명의 상황에서 "키메라" iRNA 화합물 또는 "키메라"는 dsRNA 화합물의 경우에 뉴클레오티드와 같은 적어도 하나의 단량체 단위로 각각 구성된 2개 이상의 화학적으로 별개의 영역을 함유하는 iRNA 화합물, 바람직하게는 dsRNA이다. 이들 iRNA는 통상적으로, 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 흡수, 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성을 iRNA에 부여하도록 RNA가 변형된 적어도 하나의 영역을 함유한다. iRNA의 추가 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 분해시킬 수 있는 효소에 대한 기질로 작용할 수 있다. 예를 들어, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 분해시키는 세포 엔도뉴클레아제이다. 따라서, RNase H의 활성화는 RNA 표적의 분해를 발생시키고, 이에 의해 유전자 발현의 iRNA 억제의 효능을 크게 향상시킨다. 결과로서, 동일 표적 영역에 하이브리드화되는 포스포로티오에이트 데옥시 dsRNA에 비해 키메라 dsRNA가 사용되는 경우 보다 짧은 iRNA를 이용하여 동등한 결과가 종종 수득될 수 있다. RNA 표적의 분해는 통상적으로 겔 전기영동 및, 필요시, 당 분야에 공지된 관련된 핵산 하이브리드화 기술에 의해 검출될 수 있다.
특정 예에서, iRNA의 RNA는 비-리간드 기에 의해 변형될 수 있다. iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키기 위해 다수의 비-리간드 분자가 iRNA에 컨쥬게이션되었고, 상기 컨쥬게이션을 수행하기 위한 절차는 과학 문헌에서 이용 가능하다. 상기 비-리간드 모이어티는 지질 모이어티, 예를 들어, 콜레스테롤(Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), 콜산(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티오(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett, 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-0-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan et al., Nucleosides ＆ Nucleotides, 1995, 14:969), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), 팔미틸 모이어티(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)를 포함하였다. 상기 RNA 컨쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허가 상기에 나열되어 있다. 통상적 컨쥬게이션 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에 아미노 링커를 갖는 RNA의 합성을 포함한다. 이후, 아미노기는 적절한 커플링 또는 활성화 시약을 이용하여 컨쥬게이션되는 분자와 반응된다. 컨쥬게이션 반응은 용액 상에서 고체 지지체에 여전히 고정된 RNA와 함께 수행될 수 있거나, RNA의 분해 후에 수행될 수 있다. HPLC에 의한 RNA 컨쥬게이트의 정제는 통상적으로 순수한 컨쥬게이트를 발생시킨다.
iRNA의 전달
iRNA의 전달을 필요로 하는 피검체로의 iRNA의 전달은 다수의 다양한 방식으로 달성될 수 있다. iRNA, 예를 들어, dsRNA를 포함하는 조성물을 피검체에 투여함으로써 생체내 전달이 직접 수행될 수 있다. 대안적으로, iRNA를 인코딩하고 이의 발현을 유도하는 하나 이상의 벡터를 투여함으로써 전달은 간접적으로 수행될 수 있다.
iRNA 조성물의 직접 전달
일반적으로, 핵산 분자를 전달하는 임의의 방법이 iRNA와의 사용에 대해 적합화될 수 있다(예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는, Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 및 WO94/02595 참조). 그러나, 생체내에서 iRNA 분자를 성공적으로 전달하기 위해 고려해야 할 중요한 3개의 요인이 존재한다: (a) 전달된 분자의 생물학적 안정성, (2) 비특이적 효과의 방지, 및 (3) 표적 조직 내의 전달된 분자의 축적. iRNA의 비특이적 효과는, 예를 들어, 조직(비제한적인 예로, 종양)으로의 직접적인 주사 또는 이식에 의한 국소 투여에 의하거나, 제조물을 국소적으로 투여함으로써 최소화될 수 있다. 치료 부위로의 국소 투여는 작용제의 국소 농도를 최대화시키고, 작용제에 의해 달리 손상될 수 있거나, 작용제를 분해시킬 수 있는 전신 조직으로의 작용제의 노출을 제한하고, 투여되는 iRNA 분자의 보다 적은 전체 용량을 가능케 한다. 여러 연구에서 iRNA가 국소 투여되는 경우 유전자 생성물의 성공적인 넉다운이 밝혀졌다. 예를 들어, 시노몰구스 원숭이에서의 유리체내 주사(Tolentino, MJ., et al (2004) Retina 24:132-138) 및 마우스에서의 망막하 주사(Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis. 9:210-216)에 의한 VEGF dsRNA의 안구내 전달은 둘 모두가 연령-관련 황반변성의 실험 모델에서 신생혈관증식을 방지하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 마우스에서의 dsRNA의 직접적 종양내 주사는 종양 부피를 감소시키고(Pille, J., et al (2005) Mol. Ther.11 :267-274), 종양을 갖는 마우스의 생존을 연장시킬 수 있다(Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S., et al (2007) Mol. Ther. 15:515-523). RNA 간섭은 또한 직접 주사에 의한 CNS로의 국소 전달(Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) 및 비내 투여에 의한 폐로의 국소 전달(Howard, KA., et al (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al (2005) Nat. Med. 11:50-55)을 이용하여 성공적인 것으로 밝혀졌다. 질병의 치료를 위해 iRNA를 전신 투여하기 위해, RNA는 변형되거나 약물 전달 시스템을 이용하여 대안적으로 전달될 수 있고, 이러한 둘 모두의 방법은 생체내에서 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제에 의한 dsRNA의 신속한 분해를 방지하는 작용을 한다. RNA 또는 약학적 담체의 변형은 또한 표적 조직으로의 iRNA 조성물의 표적화 및 요망되지 않는 표적외 효과의 회피를 가능케 할 수 있다. iRNA 분자는 세포 흡수를 향상시키고 분해를 방지하기 위해 콜레스테롤과 같은 친유성 기로의 화학적 컨쥬게이션에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 친유성 콜레스테롤 모이어티에 컨쥬게이션된 ApoB에 특이적인 iRNA가 마우스에 전신 주사되었고, 간 및 공장 둘 모두에서 apoB mRNA의 넉다운을 발생시켰다(Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178). 앱타머로의 iRNA의 컨쥬게이션은 전립선암의 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하고, 종양 회귀를 매개하는 것으로 밝혀졌다(McNamara, JO., et al (2006) Nat. Biotechnol. 24: 1005-1015). 한 대안적 구현예에서, iRNA는 약물 전달 시스템, 예를 들어, 나노입자, 덴드리머, 중합체, 리포솜, 또는 양이온성 전달 시스템을 이용하여 전달될 수 있다. 양성으로 하전된 양이온성 전달 시스템은 iRNA 분자(음성으로 하전됨)의 결합을 촉진시키고, 또한 음성으로 하전된 세포막에서의 상호작용을 향상시켜, 세포에 의한 iRNA의 효과적인 흡수를 가능케 한다. 양이온성 지질, 덴드리머, 또는 중합체는 iRNA에 결합될 수 있거나, 유도되어 iRNA를 둘러싸는 소포 또는 마이셀(micelle)을 형성할 수 있다(예를 들어, Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116 참조). 소포 또는 마이셀의 형성은 전신 투여되는 경우 iRNA의 분해를 추가로 방지한다. 양이온성-iRNA 복합체를 제조하고 투여하는 방법은 충분히 당업자의 능력 내이다(예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205 참조). iRNA의 전신 전달에 유용한 약물 전달 시스템의 일부 비제한적인 예는 DOTAP(Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN., et al (2003), supra), 올리고펙타민(Oligofectamine), "고체 핵산 지질 입자"(Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114), 카디오리핀(Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), 폴리에틸렌이민(Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp(RGD) 펩티드(Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487), 및 폴리아미도아민(Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16: 1799-1804)을 포함한다. 일부 구현예에서, iRNA는 전신 투여를 위해 사이클로덱스트린과 복합체를 형성한다. iRNA 및 사이클로덱스트린의 투여 방법 및 약학적 조성물은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 7,427,605호에서 발견될 수 있다.
벡터가 인코딩된 iRNA
또 다른 양태에서, TMPRSS6 유전자를 표적으로 하는 iRNA는 DNA 또는 RNA 벡터로 삽입된 전사 단위로부터 발현될 수 있다(예를 들어, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., International PCT Publication No. WO 00/22113, Conrad, PCT Publication No. WO 00/22114, and Conrad, U.S. Pat. No. 6,054,299 참조). 발현은 사용되는 특정 작제물 및 표적 조직 또는 세포 유형에 따라 일시적(약 몇시간 내지 몇주)이거나 지속적(몇주 내지 몇개월 또는 그 이상의 기간)일 수 있다. 이들 트랜스진(transgene)은 선형 작제물, 원형 플라스미드, 또는 바이러스 벡터로 도입될 수 있고, 이는 통합 벡터 또는 통합되지 않는 벡터일 수 있다. 트랜스진은 또한 염색체외 플라스미드로서 유전되는 것을 가능케 하도록 작제될 수 있다(Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 1292).
iRNA의 개별적 가닥 또는 가닥들은 발현 벡터 상의 프로모터로부터 전사될 수 있다. 2개의 별개의 가닥이, 예를 들어, dsRNA를 발생시키도록 발현되어야 하는 경우, 2개의 별개의 발현 벡터가 표적 세포로 공동 도입(예를 들어, 트랜스펙션 또는 감염에 의함)될 수 있다. 대안적으로, dsRNA의 각각의 개별적 가닥은 동일 발현 플라스미드에 위치되는 두 프로모터 모두에 의해 전사될 수 있다. 한 구현예에서, dsRNA의 가닥은 링커 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 연결된 역위된 반복 폴리뉴클레오티드로 발현되어, dsRNA는 스템 및 루프 구조를 갖는다.
iRNA 발현 벡터는 일반적으로 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 진핵생물 세포와 상용성인 발현 벡터, 바람직하게는 척추동물 세포와 상용성인 발현 벡터가 본원에 기재된 바와 같은 iRNA의 발현을 위한 재조합 작제물을 생성시키는데 사용될 수 있다. 진핵생물 세포 발현 벡터는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 다수의 상업적 공급원으로부터 이용 가능하다. 통상적으로, 요망되는 핵산 세그먼트의 삽입을 위한 편리한 제한 부위를 함유하는 상기 벡터가 제공된다. iRNA 발현 벡터의 전달은 정맥내 또는 근내 투여, 환자로부터 체외이식된 표적 세포로의 투여 후 환자로의 재도입, 또는 요망되는 표적 세포로의 도입을 가능케 하는 임의의 다른 수단에 의한 전달과 같이 전신 전달일 수 있다.
iRNA 발현 플라스미드는 양이온성 지질 담체(예를 들어, 올리고펙타민(Oligofectamine)) 또는 비-양이온성 지질-기반 담체(예를 들어, Transit-TKO™)와의 복합체로서 표적 세포로 트랜스펙션될 수 있다. 1주 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 표적 RNA의 다양한 영역을 표적으로 하는 iRNA-매개 넉다운을 위한 다수의 지질 트랜스펙션이 또한 본 발명에 의해 고려된다. 숙주 세포로의 벡터의 성공적인 도입이 다양한 공지된 방법을 이용하여 모니터될 수 있다. 예를 들어, 일시적 트랜스펙션은 리포터, 예를 들어, 형광 마커, 예를 들어, 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)을 이용하여 신호화될 수 있다. 생체외에서의 세포의 안정적 트랜스펙션은 특정 환경적 요인(예를 들어, 항생제 및 약물)에 대한 내성, 예를 들어, 하이그로마이신 B 내성을 갖는 트랜스펙션된 세포를 제공하는 마커를 이용하여 보장될 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물과 함께 이용될 수 있는 바이러스 벡터 시스템은 (a) 아데노바이러스 벡터; (b) 렌티바이러스 벡터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 레트로바이러스 벡터; (c) 아데노-관련 바이러스 벡터; (d) 단순헤르페스 바이러스 벡터; (e) SV40 벡터; (f) 폴리오마 바이러스 벡터; (g) 유두종 바이러스 벡터; (h) 피코나바이러스 벡터; (i) 폭스바이러스 벡터, 예를 들어, 오르토폭스, 예를 들어, 우두 바이러스 벡터 또는 조류폭스, 예를 들어, 카나리아 발진병 또는 수두; 및 (j) 보조-의존성 또는 무기력 아데노바이러스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 복제-불능 바이러스가 또한 유리할 수 있다. 다양한 벡터가 세포의 유전체에 통합되거나 통합되지 않을 것이다. 작제물은 요망시 트랜스펙션을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 작제물은 에피솜 복제가 가능한 벡터, 예를 들어, EPV 및 EBV 벡터로 통합될 수 있다. iRNA의 재조합 발현을 위한 작제물은 표적 세포에서의 iRNA의 발현을 보장하기 위해 일반적으로 조절 성분, 예를 들어, 프로모터, 인핸서 등을 필요로 할 것이다. 벡터 및 작제물을 고려하는 다른 양태가 하기에 추가로 기재된다.
iRNA의 전달에 유용한 벡터는 요망되는 표적 세포 또는 조직에서 iRNA의 발현에 충분한 조절 성분(프로모터, 인핸서 등)을 포함할 것이다. 조절 성분은 항시성 또는 조절/유도성 발현을 제공하도록 선택될 수 있다.
iRNA의 발현은, 예를 들어, 특정 생리학적 조질인자, 예를 들어, 순환 글루코스 수준, 또는 호르몬에 민감한 유도성 조절 서열을 이용함으로써 정밀하게 조절될 수 있다(Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). 세포 또는 포유동물에서 dsRNA 발현의 조절에 적합한 상기 유도성 발현 시스템은, 예를 들어, 엑디손(ecdysone), 에스트로겐, 프로게스테론, 테트라사이클린, 이합체화의 화학적 유도인자, 및 이소프로필-β-D1-티오갈락토피라노시드(IPTG)에 의한 조절을 포함한다. 당업자는 iRNA 트랜스진의 의도된 사용을 기초로 하여 적절한 조절/프로모터 서열을 선택할 수 있을 것이다.
한 특정 구현예에서, iRNA를 인코딩하는 핵산 서열을 함유하는 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있다(Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993) 참조). 이들 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전체의 정확한 패키징 및 숙주 세포 DNA로의 통합에 필요한 성분을 함유한다. iRNA를 인코딩하는 핵산 서열이 환자로의 핵산의 전달을 촉진하는 하나 이상의 벡터로 클로닝된다. 레트로바이러스 벡터에 관한 더욱 세부사항은, 예를 들어, 화학요법에 더욱 내성인 줄기세포를 제조하기 위해 조혈 줄기세포로 mdr1 유전자를 전달하기 위한 레트로바이러스 벡터의 사용을 기재하는 문헌[Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994)]에서 발견될 수 있다. 유전자 요법에서의 레트로바이러스 벡터의 사용을 예시하는 다른 참고문헌은 문헌[Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); and Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)]이다. 사용에 고려되는 렌티바이러스 벡터는, 예를 들어, 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,143,520호; 5,665,557호; 및 5,981,276호에 기재된 HIV 기반 벡터를 포함한다.
iRNA의 전달에서 사용하기 위해 아데노바이러스가 또한 고려된다. 아데노바이러스는, 예를 들어, 호흡기 상피로 유전자를 전달하기 위한 특히 매력적인 비히클이다. 아데노바이러스는 호흡기 상피를 자연적으로 감염시키고, 여기서 이들은 가벼운 질병을 야기시킨다. 아데노바이러스 기반 전달 시스템에 대한 다른 표적은 간, 중추신경계, 내피 세포, 및 근육이다. 아데노바이러스는 분열하지 않는 세포를 감염시킬 수 있는 장점을 갖는다. 문헌[Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993)]에서는 아데노바이러스-기반 유전자 요법의 개관이 제시되어 있다. 문헌[Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)]에서는 레서스 원숭이의 호흡기 상피로 유전자를 전달하기 위한 아데노바이러스 벡터의 사용이 설명되어 있다. 유전자 요법에서의 아데노바이러스의 사용의 다른 예는 문헌[Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); PCT Publication W094/12649; and Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995)]에서 발견될 수 있다. 본 발명에서 특정된 iRNA를 발현시키기에 적합한 AV 벡터, 재조합 AV 벡터를 작제하기 위한 방법, 및 표적 세포로 벡터를 전달하기 위한 방법은 문헌[Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010]에 기재되어 있다.
아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터의 사용이 또한 고려된다(Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); U.S. Pat. No. 5,436,146). 한 구현예에서, iRNA는, 예를 들어, U6 또는 H1 RNA 프로모터, 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 갖는 재조합 AAV 벡터로부터의 2개의 별개의 상보적인 단일-가닥 RNA 분자로 발현될 수 있다. 본 발명에서 특정된 dsRNA를 발현시키기에 적합한 AAV 벡터, 재조합 AV 벡터를 작제하기 위한 방법, 및 표적 세포로 벡터를 전달하기 위한 방법이, 전체 개시내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61:3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63:3822-3826; U.S. Pat. No. 5,252,479; U.S. Pat. No. 5,139,941; International Patent Application No. WO 94/13788; and International Patent Application No. WO 93/24641]에 기재되어 있다.
또 다른 바람직한 바이러스 벡터는 폭스 바이러스, 예를 들어, 백시니아 바이러스, 예를 들어, 약독화된 백시니아, 예를 들어, 변형된 바이러스 앙카라(Modified Virus Ankara, MVA) 또는 NYVAC, 조류폭스, 예를 들어, 수두 또는 카나리아 발진병이다.
바이러스 벡터의 향성(tropism)은 다른 바이러스로부터의 외피 단백질 또는 다른 표면 항원으로 벡터를 슈도타이핑(pseudotyping)시키거나, 적절한 경우 다양한 바이러스 캡시드 단백질을 치환시킴으로써 변형될 수 있다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 수포성 구내염 바이러스(VSV), 광견병, 에볼라, 모콜라(Mokola) 바이러스 등으로부터의 표면 단백질로 슈도타이핑될 수 있다. AAV 벡터는 다양한 캡시드 단백질 혈청형을 발현하도록 벡터를 조작함으로써 다양한 세포를 표적화하도록 제조될 수 있으며, 예를 들어, 전체 개시내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801]을 참조하라.
벡터의 약학적 제조물은 허용되는 희석제 중의 벡터를 포함할 수 있거나, 유전자 전달 비히클이 임베딩(imbedding)되는 서방형 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 레트로바이러스 벡터와 같은 완전한 유전자 전달 벡터가 재조합 세포로부터 온전하게 생성될 수 있는 경우, 약학적 제조물은 유전자 전달 시스템을 생성하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
III. iRNA를 함유하는 약학적 조성물
한 구현예에서, iRNA 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다. iRNA를 함유하는 약학적 조성물은 TMPRSS6 유전자의 발현 또는 활성과 관련된 질병 또는 장애, 예를 들어, TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정을 치료하는데 유용하다. 이러한 약학적 조성물은 전달 방식을 기초로 하여 제형화된다. 한 예는 비경구 전달, 예를 들어, 정맥내(IV) 전달을 통한 전신 투여용으로 제형화되는 조성물이다.
본원에 특정된 약학적 조성물은 TMPRSS6 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 투여량으로 투여된다. 일반적으로, iRNA의 적합한 용량은 하루 당 수용자의 체중 킬로그램 당 0.01 내지 200.0 밀리그램의 범위, 일반적으로 하루 당 체중 킬로그램 당 1 내지 50 ㎎의 범위 내일 것이다. 예를 들어, dsRNA는 단일 용량 당 0.05 ㎎/㎏, 0.5 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏, 1.5 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏, 30 ㎎/㎏, 40 ㎎/㎏, 또는 50 ㎎/㎏으로 투여될 수 있다. 약학적 조성물은 매일 1회, 또는 매주 1회, 또는 매월 1회 또는 2개월에 1회 투여될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 주 당 2회 또는 매월 2회, 또는 2주, 3주 또는 4주 마다 1회 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, iRNA는 하루 전체에 걸쳐 적절한 간격으로 2, 3, 또는 이 이상의 하위-용량으로 투여되거나, 조절 방출 제형을 통해 연속적 주입 또는 전달로도 투여된다. 상기 경우, 각각의 하위-용량에 함유된 iRNA는 전체 일일 투여량을 달성하기 위해 상응하게 더 적어야 한다. 투여량 단위는 또한, 예를 들어, 수일의 기간에 걸친 iRNA의 지속 방출을 제공하는 통상적인 지속 방출 제형을 이용하여 수일에 걸친 전달용으로 조성될 수 있다. 지속 방출 제형은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 특정 부위의 작용제의 전달에 특히 유용하고, 예를 들어, 본 발명의 작용제와 함께 사용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 투여 단위는 상응하는 다수의 일일 용량을 함유한다.
TMPRSS6 수준에 대한 단일 용량의 효과는 길게 지속될 수 있어, 이후의 용량은 3, 4, 또는 5일 이하의 간격, 또는 1, 2, 3, 또는 4주 이하의 간격으로 투여된다.
당업자는 질병 또는 장애의 중증도, 이전의 치료, 피검체의 전반적 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 특정 요인이 피검체를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 치료적 유효량의 조성물을 이용한 피검체의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 본 발명에 의해 포함되는 개별적 iRNA에 대한 유효 투여량 및 생체내 반감기의 측정은 통상적인 방법을 이용하거나, 본원 다른 곳에 기재된 바와 같은 적절한 동물 모델을 이용한 생체내 시험을 기초로 하여 이루어질 수 있다.
마우스 유전학에서의 진전은 다양한 인간 질병, 예를 들어, TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 연구를 위한 다수의 마우스 모델을 생성시켰다. 이러한 모델은 iRNA의 생체내 시험, 뿐만 아니라 치료학적 유효 용량을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 적합한 마우스 모델은, 예를 들어, 인간 TMPRSS6을 발현하는 트랜스진을 함유하는 마우스이다.
본 발명은 또한 본 발명에서 특정된 iRNA 화합물을 포함하는 약학적 조성물 및 제형을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 요망되는지의 여부 및 치료되는 영역에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(예를 들어, 경피 패치에 의함), 예를 들어, 분무기에 의한 흡입 또는 통기를 포함하는 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의한 폐내; 기관내, 비내, 표피 및 경피, 경구 또는 비경구 투여일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복막내 또는 근내 주사 또는 주입; 예를 들어, 이식된 장치를 통한 피하; 또는, 예를 들어, 실질내, 수막강내 또는 뇌실내 투여에 의한 두개내 투여를 포함한다.
iRNA는 간(예를 들어, 간의 간세포)과 같은 특정 조직을 표적화하는 방식으로 전달될 수 있다.
국소 투여를 위한 약학적 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 점적, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약학적 담체, 수성, 분말, 또는 유성 베이스(base), 증점제 등이 필요하거나 요망될 수 있다. 코팅된 콘돔, 장갑 등이 또한 유용할 수 있다. 적합한 국소 제형은 본 발명에서 특정된 iRNA가 국소 전달제, 예를 들어, 지질, 리포솜, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트제 및 계면활성제와 혼합되어 있는 제형을 포함한다. 적합한 지질 및 리포솜은 중성(예를 들어, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린), 음성(예를 들어, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성(예를 들어, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다. 본 발명에서 특정된 iRNA는 리포솜 내에서 피막화될 수 있거나, 리포솜, 특히 양이온성 리포솜에 대해 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, iRNA는 지질, 특히, 양이온성 지질에 대해 복합체화될 수 있다. 적합한 지방산 및 에스테르는 아라키돈산, 올레산, 에이코산산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 C1-20 알킬 에스테르(예를 들어, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세라이드, 디글리세라이드 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 국소 제형은 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,747,014호에 상세히 기재되어 있다.
리포솜 제형
약물의 제형화에 대해 연구되고, 사용되는 마이크로에멀젼 외에 많은 조직화된 계면활성제 구조가 존재한다. 이들은 단층, 마이셀, 이중층 및 소포를 포함한다. 소포, 예를 들어, 리포솜은 약물 전달의 관점으로부터 이들의 특이성 및 이들이 제공하는 작용의 지속기간으로 인해 큰 관심을 끌었었다. 본 발명에서 사용되는 용어 "리포솜"은 구체 이중층 또는 이중층들 내에 배열되는 양쪽성 지질로 구성되는 소포를 의미한다.
리포솜은 친유성 물질 및 수성 내부로부터 형성되는 막을 갖는 단층 또는 다층 소포이다. 수성 부분은 전달되는 조성물을 함유한다. 양이온성 리포솜은 세포벽에 융합될 수 있는 장점을 갖는다. 세포벽과 효과적으로 융합할 수 없으나 비-양이온성 리포솜은 생체내에서 대식세포에 의해 흡수된다.
온전한 포유동물 피부를 통과하기 위해, 지질 소포는 적합한 경피 구배의 영향 하에서 50 nm 미만의 직경을 각각 갖는 일련의 미세 포어를 통해 통과해야 한다. 따라서, 고도로 변형될 수 있고, 상기 미세 포어를 통해 통과할 수 있는 리포솜을 이용하는 것이 요망된다.
리포솜의 추가 장점은 자연 인지질로부터 수득된 리포솜이 생체적합성 및 생물분해성이고; 리포솜이 광범위한 물 및 지질 가용성 약물을 포함할 수 있고; 리포솜이 이들의 내부의 구획 내의 피막화된 약물을 대사 및 분해로부터 보호할 수 있는 것을 포함한다(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). 리포솜 제형의 제조에서 중요한 고려사항은 지질 표면 전하, 소포 크기 및 리포솜의 수성 부피이다.
리포솜은 작용 부위로의 활성 성분의 운반 및 전달에 유용하다. 리포솜 막은 생물학적 막과 구조적으로 유사하므로, 리포솜이 조직에 적용되는 경우, 리포솜은 세포막과 융합되기 시작하고, 리포솜 및 세포의 융합이 진행됨에 따라, 리포솜 내용물이 활성제가 작용할 수 있는 세포로 옮겨진다.
리포솜 제형은 많은 약물에 대한 전달 방식으로서 광범위한 연구가 집중되어 왔다. 국소 투여를 위해, 리포솜이 다른 제형에 비해 여러 장점을 제공한다는 증거가 증가하고 있다. 상기 장점은 투여되는 약물의 높은 전신 흡수와 관련된 감소된 부작용, 요망되는 표적에서의 투여된 약물의 증가된 축적, 및 친수성 및 소수성인 매우 다양한 약물을 피부에 투여하는 능력을 포함한다.
여러 보고서에서 피부로 고분자량 DNA를 포함하는 작용제를 전달하는 리포솜의 능력이 상술되었다. 진통제, 항체, 호르몬 및 고분자량 DNA를 포함하는 화합물이 피부에 투여되었다. 적용 대부분은 상표피의 표적화를 발생시켰다.
리포솜은 2개의 광범위한 부류로 나뉜다. 양이온성 리포솜은 음성으로 하전된 DNA 분자와 상호작용하여 안정적인 복합체를 형성하는 양성으로 하전된 리포솜이다. 양성으로 하전된 DNA/리포솜 복합체는 음성으로 하전된 세포 표면에 결합하고, 엔도솜 내에 내재화된다. 엔도솜 내의 산성 pH로 인해, 리포솜은 파열되고, 이들의 내용물을 세포 세포질로 방출시킨다(Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
pH-민감성이거나 음성으로 하전된 리포솜은 핵산과 복합체화되지 않고 핵산을 엔트랩핑(entrapping)시킨다. DNA 및 지질 둘 모두는 유사하게 하전되므로, 복합체 형성이 아니라 반발작용이 발생한다. 그럼에도 불구하고, 일부 DNA는 상기 리포솜의 수성 내부에 엔트랩핑된다. 배양 중인 세포 단층으로 티미딘 키나제 유전자를 인코딩하는 핵산을 전달하기 위해 pH-민감성 리포솜이 사용되었다. 외인성 유전자의 발현이 표적 세포에서 검출되었다(Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
리포솜 조성물의 한 주요 유형은 자연-유래 포스파티딜콜린이 아닌 인지질을 포함한다. 예를 들어, 중성 리포솜 조성물이 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포솜 조성물은 일반적으로 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되는 한편, 음이온성 융합유도 리포솜은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로부터 형성된다. 또 다른 유형의 리포솜 조성물이 포스파티딜콜린(PC), 예를 들어, 대두 PC, 및 란(egg) PC로부터 형성된다. 또 다른 유형은 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.
여러 연구에서 피부로의 리포솜 약물 제형의 국소적 전달을 평가하였다. 기니아 피그 피부에 대한 인터페론 함유 리포솜의 적용은 피부 헤르페스 상처의 감소를 발생시킨 반면, 다른 수단(예를 들어, 용액 또는 에멀젼으로)을 통한 인터페론의 전달은 효과가 없었다(Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). 추가로, 추가 연구에서 수성 시스템을 이용한 인터페론의 투여를 위한 리포솜 제형의 일부로서 투여된 인터페론의 효능을 시험하였고, 리포솜 제형이 수성 투여에 비해 우수한 것으로 결론내려졌다(du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).
피부에 대한 약물의 전달에서의 유용성을 결정하기 위해, 비-이온성 리포솜 시스템, 특히 비-이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템을 또한 시험하였다. 마우스 피부의 진피로 사이클로스포린-A를 전달하기 위해 Novasome™ I(글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 Novasome™ II(글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포솜 제형이 이용되었다. 결과는 상기 비이온성 리포솜 시스템이 피부의 다양한 층으로의 사이클로스포린 A의 침착을 촉진하는데 효과적인 것을 나타내었다(Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
리포솜은 또한 "입체적으로 안정화된" 리포솜을 포함하고, 본원에서 사용되는 상기 용어는 리포솜으로 통합되는 경우 특화된 지질이 결핍된 리포솜에 비해 향상된 순환 수명을 발생시키는 하나 이상의 특화된 지질을 포함하는 리포솜을 나타낸다. 입체적으로 안정화된 리포솜의 예는 리포솜의 소포-형성 지질 부분의 일부가 (A) 하나 이상의 당지질, 예를 들어, 모노시알로강글리오시드 GM1을 포함하거나, (B) 하나 이상의 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티로 유도체화된 것이다. 임의의 특정 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 적어도 강글리오시드, 스핑고미엘린, 또는 PEG-유도체화된 지질을 함유하는 입체적으로 안정화된 리포솜에 대해, 상기 입체적으로 안정화된 리포솜의 향상된 순환 반감기는 망상내피계(RES)의 세포로의 감소된 흡수로부터 유래되는 것으로 당 분야에서 생각된다(Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
하나 이상의 당지질을 포함하는 다양한 리포솜이 당 분야에 공지되어 있다. 문헌[Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64)]에는 리포솜의 혈액 반감기를 개선시키는 모노시알로강글리오시드 GM1, 갈락토세레브로시드 설페이트 및 포스파티딜이노시톨의 능력이 보고되어 있다. 이러한 발견은 문헌[Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949)]에 해설되어 있다. 미국 특허 4,837,028호 및 WO 88/04924호(둘 모두 Allen et al.)에는 (1) 스핑고미엘린 및 (2) 강글리오시드 GM1 또는 갈락토세레브로시드 설페이트 에스테르를 포함하는 리포솜이 개시되어 있다. 미국 특허 번호 5,543,152호(Webb et al.)에는 스핑고미엘린을 포함하는 리포솜이 개시되어 있다. 1,2-sn-디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하는 리포솜이 WO 97/13499호(Lim et al)에 개시되어 있다.
하나 이상의 친수성 중합체와 함께 유도체화된 지질을 포함하는 많은 리포솜, 및 이의 제조 방법이 당 분야에 공지되어 있다. 문헌[Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778)]에는 PEG 모이어티를 함유하는 비이온성 세제 2C1215G를 포함하는 리포솜이 기재되어 있다. 문헌[Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79)]에는 중합체 글리콜을 이용한 폴리스티렌 입자의 친수성 코팅이 유의하게 향상된 혈액 반감기를 발생시키는 것이 기재되어 있다. 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, PEG)의 카르복실기의 부착에 의해 변형된 합성 인지질이 문헌[Sears (U.S. Pat. Nos. 4,426,330 and 4,534,899)]에 기재되어 있다. 문헌[Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235)]에는 PEG 또는 PEG 스테아레이트와 함께 유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PE)을 포함하는 리포솜이 혈액 순환 반감기에서 유의한 증가를 갖는 것을 나타내는 실험이 기재되어 있다. 문헌[Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91)]에는 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE) 및 PEG의 조합물로부터 형성된 DSPE-PEG와 같은 다른 PEG-유도체화된 인지질에 대한 상기 관찰이 연장되어 있다. 외부 표면 상에 공유적으로 결합된 PEG 모이어티를 갖는 리포솜이 유럽 특허 번호 EP 0 445 131 B1호 및 WO 90/04384호(Fisher)에 기재되어 있다. 1 내지 20 몰 퍼센트의 PEG와 함께 유도체화된 PE를 함유하는 리포솜 조성물, 및 이의 사용 방법이 문헌[Woodle et al. (U.S. Pat. Nos. 5,013,556 and 5,356,633) and Martin et al. (U.S. Pat. No. 5,213,804 and European Patent No. EP 0 496 813 B1)]에 기재되어 있다. 다수의 다른 지질-중합체 컨쥬게이트를 포함하는 리포솜이 WO 91/05545호 및 미국 특허 번호 5,225,212호(둘 모두 Martin et al.) 및 WO 94/20073호(Zalipsky et al.)에 개시되어 있다. PEG-변형된 세라미드 지질을 포함하는 리포솜이 WO 96/10391호(Choi et al.)에 기재되어 있다. 미국 특허 번호 5,540,935호(Miyazaki et al.) 및 미국 특허 번호 5,556,948호(Tagawa et al.)에는 표면 상에서 기능성 모이어티로 추가로 유도체화될 수 있는 PEG-함유 리포솜이 기재되어 있다.
핵산을 포함하는 다수의 리포솜이 당 분야에 공지되어 있다. WO 96/40062호(Thierry et al.)에는 리포솜 내에 고분자량 핵산을 피막화시키는 방법이 개시되어 있다. 미국 특허 번호 5,264,221호(Tagawa et al.)에는 단백질-결합된 리포솜이 개시되어 있고, 상기 리포솜의 내용물이 dsRNA를 포함할 수 있는 것이 주장되어 있다. 미국 특허 번호 5,665,710호(Rahman et al.)에는 리포솜 내에 올리고데옥시뉴클레오티드를 피막화시키는 특정 방법이 기재되어 있다. WO 97/04787호(Love et al.)에는 raf 유전자에 표적화된 dsRNA를 포함하는 리포솜이 개시되어 있다.
트랜스퍼솜(transfersome)은 리포솜의 또 다른 유형이며, 약물 전달 비히클에 대한 매력적인 후보자인 고도로 변형가능한 지질 응집물이다. 트랜스퍼솜은 이들이 비말보다 작은 포어를 통해 용이하게 통과할 수 있는 매우 고도로 변형가능한 지질 비말로 기재될 수 있다. 트랜스퍼솜은 이들이 사용되는 환경에 적합화될 수 있고, 예를 들어, 이들은 자가-최적화(피부 내의 포어의 형태에 적합화)되고, 자가-복구되고, 종종 단편화 없이 이들의 표적에 도달하고, 종종 자가-로딩된다. 트랜스퍼솜을 제조하기 위해, 표면 가장자리-활성제(edge-activator), 보통 계면활성제를 표준 리포솜 조성물에 첨가하는 것이 가능하다. 피부에 혈청 알부민을 전달하기 위해 트랜스퍼솜이 사용되어 왔다. 혈청 알부민의 트랜스퍼솜-매개 전달은 혈청 알부민을 함유하는 용액의 피하 주사만큼 효과적인 것으로 밝혀졌다.
계면활성제는 제형, 예를 들어, 에멀젼(마이크로에멀젼을 포함함) 및 리포솜에서 널리 적용된다. 자연 및 합성 둘 모두인 많은 상이한 유형의 계면활성제의 특성을 분류하고 등급화시키는 가장 흔한 방식은 친수성/친유성 균형(hydrophile/lipophile balance, HLB)의 사용에 의한 것이다. 친수성기("헤드"로도 공지됨)의 특성은 제형에서 사용되는 다양한 계면활성제를 분류하기에 가장 유용한 수단을 제공한다(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
계면활성제 분자가 이온화되지 않는 경우, 이는 비이온성 계면활성제로 분류된다. 비이온성 계면활성제는 약학적 및 미용 제품에 광범위하게 적용되고, 광범위한 pH 값에 걸쳐 사용가능하다. 일반적으로, 이들의 HLB 값은 이들의 구조에 따라 2 내지 약 18의 범위이다. 비이온성 계면활성제는 비이온성 에스테르, 예를 들어, 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 소르비탄 에스테르, 수크로스 에스테르, 및 에톡실화된 에스테르를 포함한다. 비이온성 알칸올아미드 및 에테르, 예를 들어, 지방 알콜 에톡실레이트, 프로폭실화된 알콜, 및 에톡실화/프로폭실화 블록 공중합체가 또한 상기 부류에 포함된다. 폴리옥시에틸렌 계면활성제가 비이온성 계면활성제 부류의 가장 대중적인 일원이다.
계면활성제 분자가 음성 전하를 갖고, 물에 용해되거나 분산되는 경우, 계면활성제는 음이온성으로 분류된다. 음이온성 계면활성제는 카르복실레이트, 예를 들어, 비누, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 황산의 에스테르, 예를 들어, 알킬 설페이트 및 에톡실화된 알킬 설페이트, 설포네이트, 예를 들어, 알킬 벤젠 설포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 설포석시네이트, 및 포스페이트를 포함한다. 음이온성 계면활성제 부류의 가장 중요한 일원은 알킬 설페이트 및 비누이다.
계면활성제 분자가 양성 전하를 갖고, 물에 용해되거나 분산되는 경우, 계면활성제는 양이온성으로 분류된다. 양이온성 계면활성제는 4차 암모늄 염 및 에톡실화된 아민을 포함한다. 4차 암모늄 염이 상기 부류의 가장 많이 사용되는 일원이다.
계면활성제 분자가 양성 또는 음성 전하를 갖는 능력을 갖는 경우, 계면활성제는 양쪽성으로 분류된다. 양쪽성 계면활성제는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인 및 포스파티드를 포함한다.
약물 제품, 제형 및 에멀젼에서의 계면활성제의 사용이 개관되어 있다(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
핵산 지질 입자
한 구현예에서, 본 발명에서 특정된 TMPRSS6 dsRNA는 지질 제형 내에 완전히 피막화되어, 예를 들어, SPLP, pSPLP, SNALP, 또는 다른 핵산-지질 입자가 형성된다. 본원에서 사용되는 용어 "SNALP"는 SPLP를 포함하는 안정적인 핵산-지질 입자를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "SPLP"는 지질 소포 내에 피막화된 플라스미드 DNA를 포함하는 핵산-지질 입자를 나타낸다. SNALP 및 SPLP는 통상적으로 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 입자의 응집을 방지하는 지질(예를 들어, PEG-지질 컨쥬게이트)을 함유한다. SNALP 및 SPLP는 전신 적용에 매우 유용한데, 이는 이들이 정맥내(i.v.) 주사 후에 연장된 순환 반감기를 나타내고, 원위 부위(예를 들어, 투여 부위와 신체적으로 떨어진 부위)에 축적되기 때문이다. SPLP는 PCT 공개 번호 WO 00/03683호에 기재된 바와 같은 피막화된 축합 작용제-핵산 복합체를 포함하는 "pSPLP"를 포함한다. 본 발명의 입자는 통상적으로 약 50 nm 내지 약 150 nm, 더욱 통상적으로 약 60 nm 내지 약 130 nm, 더욱 통상적으로 약 70 nm 내지 약 110 nm, 가장 통상적으로 약 70 nm 내지 약 90 nm의 평균 직경을 갖고, 실질적으로 비독성이다. 또한, 본 발명의 핵산-지질 입자에 존재시 핵산은 뉴클레아제를 이용한 분해에 대해 수용액에서 내성이 있다. 핵산-지질 입자 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,976,567호; 5,981,501호; 6,534,484호; 6,586,410호; 6,815,432호; 및 PCT 공개 번호 WO 96/40964호에 개시되어 있다.
한 구현예에서, 지질 대 약물 비(질량/질량 비)(예를 들어, 지질 대 dsRNA 비)는 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위 내일 것이다.
양이온성 지질은, 예를 들어, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(I-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), N-(I-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민(DODMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디리놀레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레이옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-디리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 또는 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올(DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오(DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA) 또는 이들의 유사체, (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민(ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)(2-하이드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸아잔디일)디도데칸-2-올(Tech G1), 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 양이온성 지질은 입자 내에 존재하는 전체 지질의 약 20 mol % 내지 약 50 mol % 또는 약 40 mol %로 포함될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 화합물 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란이 지질-siRNA 나노입자를 제조하는데 사용될 수 있다. 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란의 합성은 참조로서 본원에 포함되는 2008년 10월 23일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/107,998호에 기재되어 있다.
한 구현예에서, 지질-siRNA 입자는 63.0 ± 20 nm의 입자 크기 및 0.027 siRNA/지질 비와 함께, 40%의 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란: 10%의 DSPC: 40%의 콜레스테롤: 10%의 PEG-C-DOMG(몰 퍼센트)를 포함한다.
비-양이온성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE), 콜레스테롤, 또는 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 음이온성 지질 또는 중성 지질일 수 있다. 비-양이온성 지질은 콜레스테롤이 포함되는 경우 입자에 존재하는 전체 지질의 약 5 mol % 내지 약 90 mol %, 약 10 mol %, 또는 약 58 mol %로 존재할 수 있다.
입자의 응집을 억제하는 컨쥬게이션된 지질은, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질, 비제한적인 예로, PEG-디아실글리세롤(DAG), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라마이드(Cer), 또는 이들의 혼합물일 수 있다. PEG-DAA 컨쥬게이트는, 예를 들어, PEG-디라우릴옥시프로필(Ci2), PEG-디미리스틸옥시프로필(Ci4), PEG-디팔미틸옥시프로필(Ci6), 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필(C]8)일 수 있다. 입자의 응집을 방지하는 컨쥬게이션된 지질은 입자에 존재하는 전체 지질의 0 mol % 내지 약 20 mol % 또는 약 2 mol %로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산-지질 입자는, 예를 들어, 입자에 존재하는 전체 지질의 약 10 mol % 내지 약 60 mol % 또는 약 48 mol %의 콜레스테롤을 추가로 포함한다.
LNP01
한 구현예에서, 리피도이드(lipidoid) ND98·4HCl(MW 1487)(전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 2008년 3월 26일에 출원된 미국 특허 출원 번호 12/056,230호 참조), 콜레스테롤(Sigma-Aldrich), 및 PEG-세라마이드 C16(Avanti Polar Lipids)이 지질-dsRNA 나노입자(즉, LNP01 입자)를 제조하는데 사용될 수 있다. 에탄올 중의 각각의 스톡 용액이 다음과 같이 제조될 수 있다: ND98, 133 ㎎/㎖; 콜레스테롤, 25 ㎎/㎖, PEG-세라마이드 C16, 100 ㎎/㎖. ND98, 콜레스테롤, 및 PEG-세라마이드 C16 스톡 용액은 이후에, 예를 들어, 42:48:10의 몰 비로 조합될 수 있다. 조합된 지질 용액은, 최종 에탄올 농도가 약 35 내지 45%이고, 최종 소듐 아세테이트 농도가 약 100 내지 300 mM이 되도록 수성 dsRNA(예를 들어, 소듐 아세테이트 pH 5 중)와 혼합될 수 있다. 지질-dsRNA 나노입자는 통상적으로 혼합시에 자연적으로 형성된다. 요망되는 입자 크기 분포에 따라, 결과로서 생성된 나노입자 혼합물은, 예를 들어, 압출성형기, 예를 들어, Lipex Extruder(Northern Lipids, Inc)를 이용하여 폴리카르보네이트 막(예를 들어, 100 nm 컷-오프)을 통해 압출될 수 있다. 일부 경우에, 압출 단계는 생략될 수 있다. 에탄올 제거 및 자연적 완충액 교환은, 예를 들어, 투석 또는 접면 유동 여과에 의해 달성될 수 있다. 완충액은 약 pH 7, 예를 들어, 약 pH 6.9, 약 pH 7.0, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3, 또는 약 pH 7.4에서, 예를 들어, 인산염 완충 염수(PBS)와 교환될 수 있다.
Figure 112022017774699-pat00011
LNP01 제형은, 예를 들어, 참조로서 본원에 포함되는 국제 출원 공개 번호 WO 2008/042973호에 기재되어 있다.
추가의 예시적인 지질-dsRNA 제형은 하기와 같다:
Figure 112022017774699-pat00012
Figure 112022017774699-pat00013
DSPC: 디스테아로일포스파티딜콜린
DPPC: 디팔미토일포스파티딜콜린
PEG-DMG: PEG-디디미리스토일 글리세롤(C14-PEG, 또는 PEG-C14)(2000의 평균 분자량을 갖는 PEG)
PEG-DSG: PEG-디스티릴 글리세롤(C18-PEG, 또는 PEG-C18)(2000의 평균 분자량을 갖는 PEG)
PEG-cDMA: PEG-카르바모일-1,2-디미리스틸옥시프로필아민(2000의 평균 분자량을 갖는 PEG)
SNALP(1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA))를 포함하는 제형이 참조로서 본원에 포함되는 2009년 4월 15일에 출원된 국제 공개 번호 WO2009/127060호에 기재되어 있다.
XTC를 포함하는 제형은, 예를 들어, 2009년 1월 29일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/148,366호; 2009년 3월 2일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/156,851호; 2009년 6월 10일에 출원된 미국 가출원 일련 번호; 2009년 7월 24일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/228,373호; 2009년 9월 3일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/239,686호, 및 2010년 1월 29일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2010/022614호에 기재되어 있으며, 이들은 참조로서 본원에 포함된다.
MC3을 포함하는 제형은, 예를 들어, 2009년 9월 22일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/244,834호, 2009년 6월 10일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/185,800호, 및 2010년 6월 10일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US10/28224호에 기재되어 있으며, 이들은 참조로서 본원에 포함된다.
ALNY-100을 포함하는 제형은, 예를 들어, 2009년 11월 10일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US09/63933호에 기재되어 있으며, 이는 참조로서 본원에 포함된다.
*C12-200을 포함하는 제형은 2009년 5월 5일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/175,770호 및 2010년 5월 5일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US10/33777호에 기재되어 있으며, 이들은 참조로서 본원에 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "LNPXX"(여기서, "XX"는 수(numerla)임)는 본원에서 "AFXX"로도 언급된다. 예를 들어, LNP09는 AF09로도 언급되며, LNP12는 또한 AF12로 공지되어 있거나 언급된다.
양이온성 지질의 합성
본 발명에서 특정된 핵산-지질 입자에서 사용되는 화합물 중 임의의 화합물, 예를 들어, 양이온성 지질 등은 실시예에 더욱 상세히 기재되는 방법을 포함하는 공지된 유기 합성 기술에 의해 제조될 수 있다. 모든 치환기는 달리 나타내지 않는 한 하기 정의되는 바와 같다.
"알킬"은 1 내지 24개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지형, 비고리형 또는 고리형의 포화 지방족 탄화수소를 의미한다. 대표적 포화 직쇄 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실 등을 포함하는 한편, 포화 분지형 알킬은 이소프로필, 2차-부틸, 이소부틸, 3차-부틸, 이소펜틸 등을 포함한다. 대표적 포화 고리형 알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 등을 포함하는 한편, 불포화 고리형 알킬은 사이클로펜테닐 및 사이클로헥세닐 등을 포함한다.
"알케닐"은 인접한 탄소 원자 사이에 적어도 하나의 이중결합을 함유하는 상기 정의된 바와 같은 알킬을 의미한다. 알케닐은 시스 및 트랜스 이성질체 둘 모두를 포함한다. 대표적 직쇄 및 분지형 알케닐은 에틸에닐, 프로필에닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸에닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐 등을 포함한다.
"알키닐"은 인접한 탄소 사이에 적어도 하나의 삼중결합을 추가로 함유하는 상기 정의된 바와 같은 임의의 알킬 또는 알케닐을 의미한다. 대표적 직쇄 및 분지형 알키닐은 아세틸에닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-메틸-1 부티닐 등을 포함한다.
"아실"은 부착 지점의 탄소가 하기 정의되는 바와 같은 옥소기로 치환된 임의의 알킬, 알케닐, 또는 알키닐을 의미한다. 예를 들어, -C(=O)알킬, -C(=O)알케닐, 및 -C(=O)알키닐은 아실기이다.
"헤테로사이클"은 포화되거나, 불포화되거나, 방향족이고, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 7원 모노사이클릭, 또는 7 내지 10원 바이사이클릭, 헤테로사이클릭 고리를 의미하며, 상기 질소 및 황 헤테로원자는 임의로 산화될 수 있고, 상기 질소 헤테로원자는 임의로 4차화될 수 있으며, 이러한 헤테로사이클은 상기 헤테로사이클 중 임의의 헤테로사이클이 벤젠 고리에 융합된 바이사이클릭 고리를 포함한다. 헤테로사이클은 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자를 통해 부착될 수 있다. 헤테로사이클은 하기 정의되는 바와 같은 헤테로아릴을 포함한다. 헤테로사이클은 모르폴리닐, 피롤리디노닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페리지닐, 하이단토이닐, 발레로락타밀, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로피리디닐, 테트라하이드로프리미디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐, 테트라하이드로피리미디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐 등을 포함한다.
용어 "임의로 치환된 알킬", "임의로 치환된 알케닐", "임의로 치환된 알키닐", "임의로 치환된 아실" 및 "임의로 치환된 헤테로사이클"은 치환되는 경우 적어도 하나의 수소 원자가 치환기로 대체되는 것을 의미한다. 옥소 치환기(=O)의 경우, 2개의 수소 원자가 대체된다. 이와 관련하여, 치환기는 옥소, 할로겐, 헤테로사이클, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx 및 -SOnNRxRy를 포함하며, 여기서 n은 0, 1 또는 2이고, Rx 및 Ry는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로사이클이고, 상기 알킬 및 헤테로사이클 치환기 각각은 옥소, 할로겐, -OH, -CN, 알킬, -ORx, 헤테로사이클, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx 및 -SOnNRxRy 중 하나 이상으로 추가로 치환될 수 있다.
"할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 의미한다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 특정된 방법은 보호기의 사용을 필요로 할 수 있다. 보호기 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, New York City, 1999 참조). 간단히, 본 발명의 상황 내의 보호기는 작용기의 원치 않는 반응성을 감소시키거나 제거하는 임의의 기이다. 보호기는 특정 반응 동안 작용기의 반응성을 감추기 위해 작용기에 첨가될 수 있고, 이후 본래의 작용기를 나타내기 위해 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, "알콜 보호기"가 사용된다. "알콜 보호기"는 알콜 작용기의 원치 않는 반응성을 감소시키거나 제거하는 임의의 기이다. 보호기는 당 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 첨가되고 제거될 수 있다.
화학식 A의 합성
일부 구현예에서, 본 발명에서 특정된 핵산-지질 입자는 하기 화학식 A의 양이온성 지질을 이용하여 제형화된다:
Figure 112022017774699-pat00014
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 이들 각각은 치환되거나 비치환될 수 있으며, R3 및 R4는 독립적으로 저급 알킬이거나 R3 및 R4는 함께 합쳐져 임의로 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 XTC (2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란)이다. 일반적으로, 상기 화학식 A의 지질은 하기 반응식 1 또는 2에 의해 제조될 수 있고, 여기서 모든 치환기는 달리 표시하지 않는 한 상기 정의된 바와 같다.
반응식 1
Figure 112022017774699-pat00015
R1 및 R2가 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 이들 각각이 임의로 치환될 수 있고, R3 및 R4가 독립적으로 저급 알킬이거나, R3 및 R4가 함께 합쳐져 임의로 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성할 수 있는 지질 A는 반응식 1에 따라 제조될 수 있다.
케톤(1) 및 브로마이드(2)는 구입하거나, 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 화합물(1) 및 (2)의 반응은 케탈(3)을 발생시킨다. 아민(4)을 이용한 케탈(3)의 처리는 화학식 A의 지질을 발생시킨다. 화학식 A의 지질은 화학식(5)의 유기염을 이용하여 상응하는 암모늄 염으로 전환될 수 있고, 여기서 X는 할로겐, 하이드록시드, 포스페이트, 설페이트 등으로부터 선택된 음이온 반대이온이다.
반응식 2
Figure 112022017774699-pat00016
.
대안적으로, 케톤(1) 시작물질은 반응식 2에 따라 제조될 수 있다. 그리냐르 시약(6) 및 시아니드(7)는 구입하거나, 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 화합물(6) 및 (7)의 반응은 케톤(1)을 발생시킨다. 케톤(1)의 화학식 A의 상응하는 지질로의 전환은 반응식 1에 기재된 바와 같다.
MC3의 합성
DLin-M-C3-DMA(즉, (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트)의 제조는 하기와 같다. 디클로로메탄(5 ㎖) 중 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올(0.53 g), 4-N,N-디메틸아미노부티르산 하이드로클로라이드(0.51 g), 4-N,N-디메틸아미노피리딘(0.61g) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드(0.53 g)의 용액을 밤새 실온에서 교반하였다. 용액을 희석된 염산으로 세척한 후, 희석된 수성 중탄산나트륨으로 세척하였다. 유기 분획을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과시키고, 용매를 로토바프(rotovap) 상에서 제거하였다. 잔여물을 1-5% 메탄올/디클로로메탄 용리 구배를 이용하여 실리카 겔 컬럼(20 g) 아래로 통과시켰다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 조합시키고, 용매를 제거하여, 무색 오일(0.54 g)을 생성시켰다.
ALNY-100의 합성
케탈 519[ALNY-100]의 합성을 하기 반응식 3을 이용하여 수행하였다:
Figure 112022017774699-pat00017
화합물(515)의 합성
2목(two neck) RBF(1L) 내의 200 ㎖의 무수 THF 중 LiAlH4(3.74 g, 0.09852 mol)의 교반된 현탁액에 70 ㎖의 THF 중 화합물(514)(10g, 0.04926mol)의 용액을 질소 대기 하에서 0℃에서 천천히 첨가하였다. 첨가 완료 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온시킨 후, 4시간 동안 가열 환류시켰다. 반응의 진행을 TLC에 의해 모니터하였다. 반응 완료(TLC에 의함) 후, 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 포화 Na2SO4 용액의 조심스러운 첨가로 켄칭시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하고, 여과시켰다. 잔여물을 THF로 잘 세척하였다. 여과액 및 세척액을 혼합시키고, 400 ㎖의 디옥산 및 26 ㎖의 농축된 HCl로 희석시키고, 실온에서 20분 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 진공하에서 제거하여, 백색 고체로서 화합물(515)의 하이드로클로라이드 염을 생성시켰다. 수율: 7.12 g 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 9.34 (브로드(broad), 2H), 5.68 (s, 2H), 3.74 (m, 1H), 2.66-2.60 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 5H).
화합물(516)의 합성
250 ㎖의 2목 RBF 내의 100 ㎖의 건성 DCM 중 화합물(515)의 교반된 용액에 NEt3(37.2 ㎖, 0.2669 mol)를 첨가하고, 질소 대기 하에서 0℃로 냉각시켰다. 50 ㎖의 건성 DCM 중 N-(벤질옥시-카르보닐옥시)-석신이미드(20 g, 0.08007 mol)를 천천히 첨가한 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온시켰다. 반응 완료(TLC에 의해 2 내지 3시간) 후, 혼합물을 1N HCl 용액(1 x 100 ㎖) 및 포화 NaHCO3 용액(1 x 50 ㎖)으로 연속적으로 세척하였다. 이후, 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 증발시켜, 미정제 물질을 생성시키고, 이를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 점착성 덩어리로 화합물(516)을 수득하였다. 수율: 11g(89%). 1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ = 7.36-7.27(m, 5H), 5.69 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (br., 1H) 2.74 (s, 3H), 2.60(m, 2H), 2.30-2.25(m, 2H). LC-MS [M+H] -232.3 (96.94%).
화합물(517A) 및 화합물(517B)의 합성
사이클로펜텐(516)(5 g, 0.02164 mol)을 1목의 500 ㎖ RBF 내의 220 ㎖의 아세톤 및 물(10:1)의 용액에 용해시키고, 여기에 실온에서 N-메틸 모르폴린-N-옥사이드(7.6 g, 0.06492 mol) 및 이후 4.2 ㎖의 3차-부탄올 중 OsO4(0.275 g, 0.00108 mol)의 7.6% 용액을 첨가하였다. 반응 완료(약 3시간) 후, 혼합물을 고체 Na2SO3의 첨가로 켄칭시키고, 생성된 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM(300 ㎖)으로 희석시키고, 물(2 x 100 ㎖), 및 이후 포화 NaHCO3(1 x 50 ㎖) 용액, 물(1 x 30 ㎖), 및 최종적으로 염수(1 x 50 ㎖)로 세척하였다. 유기상을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 미정제 물질의 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 정제로 부분입체 이성질체의 혼합물을 생성시키고, 이를 prep HPLC에 의해 분리시켰다. 수득량: - 6 g 미정제
517A - 피크-1 (백색 고체), 5.13 g (96%). 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 7.39-7.31(m, 5H), 5.04(s, 2H), 4.78-4.73(m, 1H), 4.48-4.47(d, 2H), 3.94-3.93(m, 2H), 2.71(s, 3H), 1.72-1.67(m, 4H). LC-MS-[M+H]-266.3, [M+NH4+]-283.5 존재, HPLC-97.86%. 입체화학이 X-선에 의해 확인되었다.
화합물(518)의 합성
화합물(505)의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여, 화합물(518)(1.2 g, 41%)을 무색 오일로 수득하였다. 1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 7.35-7.33(m, 4H), 7.30-7.27(m, 1H), 5.37-5.27(m, 8H), 5.12(s, 2H), 4.75(m,1H), 4.58-4.57(m,2H), 2.78-2.74(m,7H), 2.06-2.00(m,8H), 1.96-1.91(m, 2H), 1.62(m, 4H), 1.48(m, 2H), 1.37-1.25(br m, 36H), 0.87(m, 6H). HPLC-98.65%.
화합물(519)의 합성을 위한 일반 절차
헥산(15 ㎖) 중 화합물(518)(1 eq)의 용액을 THF(1 M, 2 eq) 중 LAH의 얼음 냉각된 용액에 적하 방식으로 첨가하였다. 첨가 완료 후, 혼합물을 0.5시간에 걸쳐 40℃에서 가열한 후, 얼음 배쓰 상에서 다시 냉각시켰다. 혼합물을 포화 수성 Na2SO4로 조심스럽게 가수분해시킨 후, 셀라이트를 통해 여과시키고, 오일로 감소시켰다. 컬럼 크로마토그래피로 무색 오일로 수득되는 순수한 화합물(519)(1.3 g, 68%)를 생성시켰다. 13C NMR = 130.2, 130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3, 79.3, 64.4, 44.7, 38.3, 35.4, 31.5, 29.9 (x2), 29.7, 29.6 (x2), 29.5 (x3), 29.3 (x2), 27.2 (x3), 25.6, 24.5, 23.3, 226, 14.1; 전기분무(Electrospray) MS (+ve): C44H8ONO2에 대한 분자량 (M + H)+ 계산치 654.6, 실측치 654.6.
표준 또는 압출을 포함하지 않는 방법에 의해 제조된 제형은 유사한 방식으로 특성규명될 수 있다. 예를 들어, 제형은 통상적으로 육안 검사로 특성규명된다. 이들은 응집물 또는 침전물이 없는 희끄무레한 반투명 용액일 것이다. 지질-나노입자의 입자 크기 및 입자 크기 분포는, 예를 들어, Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern, USA)를 이용한 광 분산에 의해 측정될 수 있다. 입자는 약 20 내지 300 nm, 예를 들어, 40 내지 100 nm의 크기일 것이다. 입자 크기 분포는 단봉(unimodal)일 것이다. 제형 내의 전체 dsRNA 농도, 뿐만 아니라 엔트래핑된 분획은 염료 배제 검정을 이용하여 평가된다. 제형화된 dsRNA의 샘플은 제형 분쇄 계면활성제, 예를 들어, 0.5% Triton-X100의 존재 또는 부재하에서 RNA-결합 염료, 예를 들어, Ribogreen(Molecular Probes)과 함께 인큐베이션될 수 있다. 제형에서의 전체 dsRNA는 표준 곡선과 비교한, 계면활성제를 함유하는 샘플로부터의 신호에 의해 결정될 수 있다. 엔트랩핑된 분획은 전체 dsRNA 함량으로부터 "부재" dsRNA 함량(계면활성제의 부재하에서의 신호에 의해 측정됨)을 공제함으로써 결정된다. 엔트랩핑된 dsRNA의 퍼센트는 통상적으로 85% 초과이다. SNALP 제형에 대해, 입자 크기는 적어도 30 nm, 적어도 40 nm, 적어도 50 nm, 적어도 60 nm, 적어도 70 nm, 적어도 80 nm, 적어도 90 nm, 적어도 100 nm, 적어도 110 nm, 및 적어도 120 nm이다. 적합한 범위는 통상적으로 대략 적어도 50 nm 내지 대략 적어도 110 nm, 대략 적어도 60 nm 내지 대략 적어도 100 nm, 또는 대략 적어도 80 nm 내지 대략 적어도 90 nm이다.
경구 투여를 위한 조성물 및 제형은 분말 또는 과립, 미립자, 나노입자, 물 또는 비수성 매질 중 현탁액 또는 용액, 캡슐, 젤 캡슐, 샤세(sachet), 정제 또는 소형 정제(minitablet)를 포함한다. 증점제, 착향제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합체가 요망될 수 있다. 일부 구현예에서, 경구 제형은 본 발명에서 특정된 dsRNA가 하나 이상의 침투 향상제 계면활성제 및 킬레이트제와 함께 투여되는 것이다. 적합한 계면활성제는 지방산 및/또는 이의 에스테르 또는 염, 담즙산 및/또는 이의 염을 포함한다. 적합한 담즙산/염은 케노데옥시콜산(CDCA) 및 우르소데옥시케노데옥시콜산(UDCA), 콜산, 데하이드로콜산, 데옥시콜산, 글루콜산(glucholic acid), 글리콜산(glycholic acid), 글리코데옥시콜산, 타우로콜산, 타우로데옥시콜산, 소듐 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트 및 소듐 글리코디하이드로푸시데이트를 포함한다. 적합한 지방산은 아라키돈산, 운데칸산, 올레산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 모노글리세라이드, 디글리세라이드 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염(예를 들어, 소듐)을 포함한다. 일부 구현예에서, 침투 향상제의 조합물, 예를 들어, 담즙산/염과 조합된 지방산/염이 사용된다. 한 예시적 조합물은 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 소듐 염이다. 추가 침투 향상제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다. 본 발명에서 특정된 DsRNA는 분무되는 건조 입자를 포함하는 과립 형태로 경구 전달될 수 있거나, 복합체화되어 미세입자 또는 나노입자를 형성할 수 있다. DsRNA 복합체화 작용제는 폴리-아미노산; 폴리이민; 폴리아크릴레이트; 폴리알킬아크릴레이트, 폴리옥세탄, 폴리알킬시아노아크릴레이트; 양이온화된 젤라틴, 알부민, 전분, 아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 전분; 폴리알킬시아노아크릴레이트; DEAE-유도체화된 폴리이민, 폴룰란(pollulan), 셀룰로스 및 전분을 포함한다. 적합한 복합체화 작용제는 키토산, N-트리메틸키토산, 폴리-L-리신, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴, 폴리스퍼민, 프로타민, 폴리비닐피리딘, 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌 P(TDAE), 폴리아미노스티렌(예를 들어, p-아미노), 폴리(메틸시아노아크릴레이트), 폴리(에틸시아노아크릴레이트), 폴리(부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소헥실시아노아크릴레이트), DEAE-메타크릴레이트, DEAE-헥실아크릴레이트, DEAE-아크릴아미드, DEAE-알부민 및 DEAE-덱스트란, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리헥실아크릴레이트, 폴리(D,L-락트산), 폴리(DL-락틱-코-글리콜산(PLGA)), 알기네이트, 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함한다. dsRNA에 대한 경구 제형 및 이의 제조는 각각이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 6,887,906호, 미국 공개 번호 20030027780호, 및 미국 특허 번호 6,747,014호에 상세히 기재되어 있다.
비경구, 실질내(뇌로의 투여), 수막강내, 뇌실내 또는 간내 투여를 위한 조성물 및 제형은 완충제, 희석제 및 다른 적합한 첨가제, 비제한적인 예로, 침투 향상제, 담체 화합물 및 다른 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 비제한적인 예로, 용액, 에멀젼, 및 리포솜-함유 제형을 포함한다. 이들 조성물은 미리형성된 액체, 자가-유화 고체 및 자가-유화 반고체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 성분으로부터 생성될 수 있다. 간 장애, 예를 들어, 간 암종을 치료하는 경우 간을 표적으로 하는 제형이 특히 바람직하다.
단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있는 본 발명의 약학적 제형은 약학 산업에서 널리 공지된 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기술은 활성 성분과 약학적 담체(들) 또는 부형제(들)을 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 성분과 액체 담체 또는 미세하게 나누어진 고체 담체 또는 둘 모두를 균일하고 충분하게 회합시킨 후, 필요시 제품을 성형시킴으로써 제조된다.
본 발명의 조성물은 많은 가능한 투여 형태, 비제한적인 예로, 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 액체 시럽, 연성 겔, 좌약, 및 관장제 중 임의의 투여 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 수성, 비수성 또는 혼합된 매질의 현탁액으로 제형화될 수 있다. 수성 현탁액은, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.
추가 제형
에멀젼
본 발명의 조성물은 에멀젼으로 제조되고 제형화될 수 있다. 에멀젼은 통상적으로 0.1 ㎛ 직경을 보통 초과하는 비말 형태의 또 다른 액체에 분산된 한 액체의 이종성 시스템이다(예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams ＆ Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301 참조). 에멀젼은 종종 서로 충분히 혼합되고 분산된 2개의 비혼화성 액체 상을 포함하는 2상 시스템이다. 일반적으로, 에멀젼은 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 종류일 수 있다. 수성상이 벌크 유성상으로의 미세한 비말로 미세하게 나누어지고 분산되는 경우, 생성된 조성물은 유중수(w/o) 에멀젼으로 언급된다. 대안적으로, 유성상이 벌크 수성상으로의 미세한 비말로 미세하게 나누어지고 분산되는 경우, 생성된 조성물은 수중유(o/w) 에멀젼으로 언급된다. 에멀젼은 분산된 상에 더하여 추가 성분, 및 수성상 또는 유성상 중 용액으로 제공되거나, 별개의 상으로 자체로 제공될 수 있는 활성 약물을 함유할 수 있다. 약학적 부형제, 예를 들어, 유화제, 안정화제, 염료, 및 항산화제가 또한 필요시 에멀젼에 제공될 수 있다. 약학적 에멀젼은 또한, 예를 들어, 유중수중유(o/w/o) 및 수중유중수(w/o/w) 에멀젼의 경우에서와 같이 2개보다 많은 상으로 구성되는 다중 에멀젼일 수 있다. 상기 복합체 제형은 종종 간단한 2원 에멀젼이 제공하지 않는 특정한 장점을 제공한다. o/w 에멀젼의 개별적 오일 비말이 작은 물 비말을 둘러싸는 다중 에멀젼이 w/o/w 에멀젼을 구성한다. 마찬가지로, 유성 연속 상 내에서 안정화된 물의 소구체 내에서 둘러싸인 오일 비말의 시스템이 o/w/o 에멀젼을 제공한다.
에멀젼은 열역학적 안정성이 거의 없거나 없는 것을 특징으로 한다. 종종, 에멀젼의 분산되거나 불연속적인 상이 외부 또는 연속 상으로 잘 분산되고, 유화제의 사용 또는 제형의 점도를 통해 상기 형태로 유지된다. 에멀젼의 상 중 어느 상이든 에멀젼-유형 연고 베이스 및 크림의 경우에서와 같이 반고체 또는 고체일 수 있다. 에멀젼을 안정화시키는 다른 수단은 에멀젼의 어느 상으로 통합될 수 있는 유화제의 사용을 수반한다. 유화제는 합성 계면활성제, 자연 발생 유화제, 흡수 베이스, 및 미세하게 분산된 고체의 4개의 부류로 넓게 분류될 수 있다(예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams ＆ Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199 참조).
표면활성제로도 공지된 합성 계면활성제는 에멀젼의 제형에서 광범위하게 적용되며, 이는 문헌에 개관되어 있다(예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams ＆ Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199 참조). 계면활성제는 통상적으로 양쪽성이고, 친수성 및 소수성 부분을 포함한다. 계면활성제의 친수성 대 소수성 특성의 비는 친수성/친유성 균형(HLB)으로 명명되었으며, 이는 제형의 제조에서 계면활성제를 분류하고 선택하는데 있어서 가치있는 도구이다. 계면활성제는 친수성 기의 특성을 기초로 하여 비이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성으로 상이한 부류로 분류될 수 있다(예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams ＆ Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285 참조).
에멀젼 제형에서 사용되는 자연 발생 유화제는 라놀린, 밀랍, 포스파티드, 레시틴 및 아카시아를 포함한다. 흡수 베이스는 무수 라놀린 및 친수성 광유와 같이 이들이 이들의 반고체 경도를 유지하면서 w/o 에멀젼을 형성시키기 위해 물을 흡수할 수 있도록 하는 친수성 특성을 갖는다. 미세하게 나누어진 고체가 또한, 특히 계면활성제와 조합되고, 점성 제조물 내에서 우수한 유화제로 사용되어 왔다. 이들은 극성 무기 고체, 예를 들어, 중금속 하이드록사이드, 비팽윤 점토, 예를 들어, 벤토나이트, 애타풀자이트(attapulgite), 헥토라이트, 카올린, 몬모릴로나이트, 콜로이드 알루미늄 실리케이트 및 콜로이드 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 안료 및 비극성 고체, 예를 들어, 탄소 또는 글리세릴 트리스테아레이트를 포함한다.
매우 다양한 비-유화 물질이 또한 에멀젼 제형에 포함되며, 이들은 에멀젼의 특성에 기여한다. 이들은 지방, 오일, 왁스, 지방산, 지방 알콜, 지방 에스테르, 보습제, 친수성 콜로이드, 보존제 및 항산화제를 포함한다(Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
친수성 콜로이드 또는 하이드로콜로이드는 자연 발생 검(gum) 및 합성 중합체, 예를 들어, 다당류(예를 들어, 아카시아, 아가, 알긴산, 카라기난(carrageenan), 구아 검, 카라야 검(karaya gum), 및 트래거캔쓰(tragacanth)), 셀룰로스 유도체(예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스 및 카르복시프로필셀룰로스), 및 합성 중합체(예를 들어, 카르보머, 셀룰로스 에테르, 및 카르복시비닐 중합체)를 포함한다. 이들은 물 내에서 분산되거나 팽창하여, 분산된-상 비말 주위에 강한 계면 필름을 형성시키거나, 외부 상의 점도를 증가시킴으로써 에멀젼을 안정화시키는 콜로이드 용액을 형성시킨다.
에멀젼은 종종 미생물의 성장을 용이하게 도울 수 있는 다수의 성분, 예를 들어, 탄수화물, 단백질, 스테롤 및 포스파티드를 함유하므로, 이들 제형은 종종 보존제를 포함한다. 에멀젼 제형에 포함되는 일반적으로 사용되는 보존제는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 4차 암모늄 염, 벤즈알코늄 클로라이드, p-하이드록시벤조산의 에스테르, 및 붕산을 포함한다. 제형의 황폐를 방지하기 위해 항산화제가 또한 에멀젼 제형에 일반적으로 첨가된다. 사용되는 항산화제는 자유 라디칼 제거제, 예를 들어, 토코페롤, 알킬 갈레이트, 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 또는 환원제, 예를 들어, 아스코르브산 및 소듐 메타바이설파이트, 및 항산화제 상승작용제, 예를 들어, 시트르산, 타르타르산, 및 레시틴일 수 있다.
피부, 경구 및 비경구 경로를 통한 에멀젼 제형의 적용 및 이들의 제조 방법은 문헌에 개관되어 있다(예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams ＆ Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199 참조). 제형화의 용이성, 뿐만 아니라 흡수로부터의 효능 및 생체이용률의 입장으로 인해, 경구 전달을 위한 에멀젼 제형이 매우 다양하게 사용되어 왔다(예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams ＆ Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199 참조). 광유 베이스 설사제, 지용성 비타민 및 고지방 영양 제조물이 특히 o/w 에멀젼으로서 일반적으로 투여되는 물질이다.
본 발명의 한 구현예에서, iRNA 및 핵산의 조성물은 마이크로에멀젼으로 제형화된다. 마이크로에멀젼은 단일 광학적으로 등방성이고, 열역학적으로 안정적인 액체 용액인 물, 오일 및 양친매성의 시스템으로 정의될 수 있다(예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams ＆ Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245 참조). 통상적으로, 마이크로에멀젼은 먼저 계면활성제 수용액에 오일을 분산시킨 후, 충분한 양의 네번째 성분, 일반적으로 중간 사슬-길이 알콜을 첨가하여 투명한 시스템을 형성시킴으로써 제조되는 시스템이다. 따라서, 마이크로에멀젼은 또한 표면-활성 분자의 계면 필름에 의해 안정화되는 2개의 비혼화성 액체의 열역학적으로 안정적이고, 등방성의 투명한 분산액으로 기재되어 왔다(Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). 마이크로에멀젼은 일반적으로 오일, 물, 계면활성제, 보조계면활성제 및 전해질을 포함하는 3 내지 5개의 성분의 조합을 통해 제조된다. 마이크로에멀젼이 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 유형인지의 여부는 사용되는 오일 및 계면활성제의 특성, 및 계면활성제 분자의 극성 머리 및 탄화수소 꼬리의 구조 및 기하학적 패킹에 좌우된다(Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
상태도(phase diagram)를 이용한 현상학적 방법이 광범위하게 연구되었고, 마이크로에멀젼을 제형화시키는 방법의 당업자에 대한 광범위한 지식을 발생시켰다(예를 들어, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams ＆ Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335 참조). 통상적인 에멀젼에 비해, 마이크로에멀젼은 자연적으로 형성되는 열역학적으로 안정적인 비말의 형성에서 수-불용성 약물을 용해화시키는 장점을 제공한다.
마이크로에멀젼의 제조에서 사용되는 계면활성제는 단독이거나 보조계면활성제와 조합된 이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, Brij 96, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 테트라글리세롤 모노라우레이트(ML310), 테트라글리세롤 모노올레에이트(MO310), 헥사글리세롤 모노올레에이트(PO310), 헥사글리세롤 펜타올레에이트(PO500), 데카글리세롤 모노카프레이트(MCA750), 데카글리세롤 모노올레에이트(MO750), 데카글리세롤 세퀴올레에이트(SO750), 데카글리세롤 데카올레에이트(DAO750)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 보조계면활성제, 보통 단쇄 알콜, 예를 들어, 에탄올, 1-프로판올, 및 1-부탄올은 계면활성제 필름으로 침투하고, 그 결과로서 계면활성제 분자 사이에서 생성된 빈 공간으로 인해 무질서한 필름을 생성시킴으로써 계면 유동성을 증가시키는 작용을 한다. 그러나, 마이크로에멀젼은 계면활성제의 사용 없이 제조될 수 있고, 알콜을 함유하지 않는 자가-에멀젼화 마이크로에멀젼 시스템이 당 분야에 공지되어 있다. 수성상은 통상적으로 물, 약물의 수용액, 글리세롤, PEG300, PEG400, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜의 유도체일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 오일상은 물질, 예를 들어, Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, 지방산 에스테르, 중간 사슬(C8-C12) 모노, 디, 및 트리-글리세라이드, 폴리옥시에틸화된 글리세릴 지방산 에스테르, 지방 알콜, 폴리글리콜화된 글리세라이드, 포화 폴리글리콜화된 C8-C10 글리세라이드, 식물성 오일 및 실리콘 오일을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
마이크로에멀젼은 약물 용해화 및 약물의 향상된 흡수의 관점으로부터 특히 흥미롭다. 펩티드를 포함하는 약물의 경구 생체이용률을 향상시키기 위해 지질 기반 마이크로에멀젼(o/w 및 w/o 둘 모두)이 제안되었다(예를 들어, U.S. Patent Nos. 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205 참조). 마이크로에멀젼은 개선된 약물 용해화, 효소 가수분해로부터 약물의 보호, 막 유동성 및 투과성에서의 계면활성제-유도 변화로 인한 약물 흡수의 가능한 향상, 제조의 용이성, 고체 투여 형태에 비한 경구 투여의 용이성, 개선된 임상 효능, 및 감소된 독성의 장점을 제공한다(예를 들어, U.S. Patent Nos. 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143 참조). 종종, 마이크로에멀젼은, 이들의 성분이 주위 온도에서 함께 모이는 경우에 자연적으로 형성될 수 있다. 이는 열불안정성 약물, 펩티드 또는 iRNA를 제형화하는 경우에 특히 유리할 수 있다. 마이크로에멀젼은 미용 및 약학적 적용 둘 모두에서 활성 성분의 경피 전달에서 효과적이다. 본 발명의 마이크로에멀젼 조성물 및 제형이 위장관으로부터의 iRNA 및 핵산의 증가된 전신 흡수를 촉진할 뿐만 아니라, iRNA 및 핵산의 국소 세포 흡수를 개선시킬 것이 예상된다.
본 발명의 마이크로에멀젼은 또한 제형의 특성을 개선시키고, 본 발명의 iRNA 및 핵산의 흡수를 향상시키기 위해, 추가 성분 및 첨가제, 예를 들어, 소르비탄 모노스테아레이트(Grill 3), 라브라솔(Labrasol), 및 침투 향상제를 함유할 수 있다. 본 발명의 마이크로에멀젼에서 사용되는 침투 향상제는 5개의 광범위한 부류인 계면활성제, 지방산, 담즙산, 킬레이트제, 및 비-킬레이트화 비-계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). 상기 부류 각각은 하기에 논의된다.
침투 향상제
한 구현예에서, 본 발명은 동물의 피부로의 핵산, 특히 iRNA의 효과적인 전달을 수행하기 위해 다양한 침투 향상제를 이용한다. 대부분의 약물은 이온화된 형태 및 비이온화된 형태 둘 모두로 용액 중에 존재한다. 그러나, 보통 지질 용해성 또는 친지질성 약물만이 세포막을 용이하게 가로지른다. 가로질러지는 막이 침투 향상제로 처리되는 경우 비-친지질성 약물도 세포막을 가로지를 수 있는 것으로 밝혀졌다. 세포막을 가로지르는 비-친지질성 약물의 확산을 돕는 것에 더하여, 침투 향상제는 또한 친지질성 약물의 침투성을 향상시킨다.
침투 향상제는 5개의 광범위한 부류, 즉, 계면활성제, 지방산, 담즙산, 킬레이트제, 및 비-킬레이트화 비-계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92 참조). 침투 향상제의 상기 언급된 부류 각각은 하기에 매우 상세히 기재된다.
계면활성제: 본 발명과 관련하여, 계면활성제(또는 "표면-활성제")는 수용액에 용해되는 경우, 점막을 통한 iRNA의 흡수가 향상되는 결과와 함께 용액의 표면 장력 또는 수용액과 또 다른 액체 사이의 계면 장력을 감소시키는 화학적 존재물이다. 담즙산 염 및 지방산에 더하여, 상기 침투 향상제는, 예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르(예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92 참조); 및 퍼플루오계 에멀젼(perfluorochemical emulsions), 예를 들어, FC-43(Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252 참조)을 포함한다.
지방산: 침투 향상제로 작용하는 다양한 지방산 및 이들의 유도체는, 예를 들어, 올레산, 라우르산, 카프르산(n-데칸산), 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인 (1-모노올레오일-rac-글리세롤), 디라우린, 카프릴산, 아라키돈산, 글리세롤 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 이들의 C1-20 알킬 에스테르(예를 들어, 메틸, 이소프로필 및 t-부틸), 및 이들의 모노- 및 디-글리세라이드(즉, 올레에이트, 라우레이트, 카프레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 리놀레에이트 등)을 포함한다(예를 들어, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654 참조).
담즙산 염: 담즙의 생리학적 역할은 지질 및 지용성 비타민의 분산 및 흡수의 촉진을 포함한다(예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman ＆ Oilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935 참조). 다양한 자연 담즙산 염, 및 이들의 합성 유도체가 침투 향상제로 작용한다. 따라서, 용어 "담즙산 염"은 담즙의 자연 발생 성분 중 임의의 성분 뿐만 아니라 이들의 합성 유도체 중 임의의 유도체를 포함한다. 적합한 담즙산 염은, 예를 들어, 콜산(또는 이의 약학적으로 허용되는 소듐 염, 소듐 콜레이트), 데하이드로콜산(소듐 데하이드로콜레이트), 데옥시콜산(소듐 데옥시콜레이트), 글루콜산(소듐 글루콜레이트), 글리콜산(소듐 글리코콜레이트), 글리코데옥시콜산(소듐 글리코데옥시콜레이트), 타우로콜산(소듐 타우로콜레이트), 타우로데옥시콜산(소듐 타우로데옥시콜레이트), 케노데옥시콜산(소듐 케노데옥시콜레이트), 우르소데옥시콜산(UDCA), 소듐 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트(STDHF), 소듐 글리코디하이드로푸시데이트 및 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(POE)를 포함한다(예를 들어, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583 참조).
킬레이트제: 본 발명과 관련하여 사용되는 킬레이트제는 점막을 통한 iRNA의 흡수가 향상되는 결과와 함께, 용액으로부터의 금속 이온과 함께 복합체를 형성함으로써 용액으로부터의 금속 이온을 제거하는 화합물로 정의될 수 있다. 본 발명에서 침투 향상제로서의 용도와 관련하여, 킬레이트제는 대부분의 특성규명된 DNA 뉴클레아제가 촉매작용을 위해 2가 금속 이온을 필요로 하고, 이에 따라 킬레이트제에 의해 억제됨에 따라 DNase 억제제로서 또한 작용하는 추가 장점을 갖는다(Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). 적합한 킬레이트제는 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA), 시트르산, 살리실레이트(예를 들어, 소듐 살리실레이트, 5-메톡시살리실레이트 및 호모바닐레이트), 콜라겐의 N-아실 유도체, 라우레트-9 및 β-디케톤의 N-아미노 아실 유도체(에나민)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다(예를 들어, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51 참조).
비-킬레이트화 비-계면활성제: 본원에서 사용되는 바와 같은, 비-킬레이트화 비-계면활성제 침투 향상제 화합물은 킬레이트제 또는 계면활성제로서 무의미한 활성을 나타내지만, 그럼에도 불구하고 앨리멘터리 뮤코사(alimentary mucosa)를 통해 iRNA의 흡수를 향상시키는 화합물로 정의될 수 있다(예를 들어, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33 참조). 이러한 부류의 침투 향상제는, 예를 들어, 불포화 사이클릭 우레아, 1-알킬- 및 1-알케닐아자사이클로-알카논 유도체(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92); 및 비-스테로이드 항-염증제, 예를 들어, 디클로페낙 소듐, 인도메타신 및 페닐부타존(Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626)을 포함한다.
세포 수준에서 iRNA의 흡수를 향상시키는 작용제가 또한 본 발명의 약학적 조성물 및 다른 조성물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 양이온성 지질, 예를 들어, 리포펙틴(Junichi et al., U.S. Pat. No. 5,705,188), 양이온성 글리세롤 유도체, 및 다가양이온성 분자, 예를 들어, 폴리리신(Lollo et al., PCT Application WO 97/30731)이 또한 dsRNA의 세포 흡수를 향상시키는 것으로 공지되어 있다. 시판되는 트랜스펙션 시약의 예는, 예를 들어, 특히 Lipofectamine™(Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000™(Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™(Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™(Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™(Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX(Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 CD(Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™(Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX(Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine™(Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™(Invitrogen; Carlsbad, CA), X-tremeGENE Q2 트랜스펙션 시약(Roche; Grenzacherstrasse, Switzerland), DOTAP 리포솜 트랜스펙션 시약(Grenzacherstrasse, Switzerland), DOSPER 리포솜 트랜스펙션 시약(Grenzacherstrasse, Switzerland), 또는 Fugene(Grenzacherstrasse, Switzerland), Transfectam® 시약(Promega; Madison, WI), TransFast™ 트랜스펙션 시약(Promega; Madison, WI), Tfx™-20 시약(Promega; Madison, WI), Tfx™-50 시약(Promega; Madison, WI), DreamFect™(OZ Biosciences; Marseille, France), EcoTransfect(OZ Biosciences; Marseille, France), TransPassa D1 트랜스펙션 시약(New England Biolabs; Ipswich, MA, USA), LyoVec™/LipoGen™(Invivogen; San Diego, CA, USA), PerFectin 트랜스펙션 시약(Genlantis; San Diego, CA, USA), NeuroPORTER 트랜스펙션 시약(Genlantis; San Diego, CA, USA), GenePORTER 트랜스펙션 시약(Genlantis; San Diego, CA, USA), GenePORTER 2 트랜스펙션 시약(Genlantis; San Diego, CA, USA), Cytofectin 트랜스펙션 시약(Genlantis; San Diego, CA, USA), BaculoPORTER 트랜스펙션 시약(Genlantis; San Diego, CA, USA), TroganPORTER™ 트랜스펙션 시약(Genlantis; San Diego, CA, USA), RiboFect(Bioline; Taunton, MA, USA), PlasFect(Bioline; Taunton, MA, USA), UniFECTOR(B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), SureFECTOR(B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), 또는 HiFect™(B-Bridge International, Mountain View, CA, USA)을 포함한다.
투여된 핵산의 침투를 향상시키기 위해 글리콜, 예를 들어, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜, 피롤, 예를 들어, 2-피롤, 아존, 및 테르펜, 예를 들어, 리모넨 및 멘톤을 포함하는 다른 작용제가 사용될 수 있다.
담체
본 발명의 특정 조성물은 또한 제형 내에 담체 화합물을 포함한다. 본원에서 사용되는 "담체 화합물" 또는 "담체"는 비활성(즉, 그 자체로 생물학적 활성을 갖지 않음)이지만, 예를 들어, 생물학적 활성 핵산을 붕괴시키거나, 순환으로부터 이의 제거를 촉진시킴으로써 생물학적 활성을 갖는 핵산의 생체이용률를 감소시키는 생체내 방법에 의해 핵산으로 인지되는 핵산 또는 이의 유사체를 나타낼 수 있다. 핵산 및 담체 화합물(통상적으로, 담체 화합물은 과량)의 공동투여는 추정상 공통의 수용체에 대한 담체 화합물과 핵산 사이의 경쟁으로 인해 간, 신장 또는 다른 순환외 저장소에서 회수되는 핵산의 양의 실질적 감소를 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 간 조직에서의 부분적인 포스포로티오에이트 dsRNA의 회수는, 폴리이노신산, 덱스트란 설페이트, 폴리시티드산(polycytidic acid) 또는 4-아세트아미도-4'이소티오시아노-스틸벤-2,2'-디설폰산과 함께 공동투여되는 경우에 감소될 수 있다(Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA ＆ Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
부형제
담체 화합물과 대조적으로, "약학적 담체" 또는 "부형제"는 동물에게 하나 이상의 핵산을 전달하기 위한 약학적으로 허용되는 용매, 현탁제 또는 임의의 다른 약학적으로 비활성인 비히클이다. 부형제는 액체이거나 고체일 수 있고, 핵산 및 제공된 약학적 조성물의 다른 성분과 조합되는 경우에 요망되는 벌크, 경도 등을 제공하기 위해 의도하는 계획된 투여 방식에 따라 선택된다. 통상적인 약학적 담체는 결합제(예를 들어, 전호화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 등); 충전제(예를 들어, 락토스 및 다른 당, 미정질 셀룰로스, 펙틴, 젤라틴, 칼슘 설페이트, 에틸 셀룰로스, 폴리아크릴레이트 또는 칼슘 하이드로겐 포스페이트 등); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탤크, 실리카, 콜로이드 실리콘 디옥사이드, 스테아르산, 금속 스테아레이트, 수소처리된 식물성 오일, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트 등); 붕해제(예를 들어, 전분, 소듐 전분 글리콜레이트 등); 및 습윤제(예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트 등)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
핵산과 유해하게 반응하지 않는 비-비경구 투여에 적합한 약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 부형제가 또한 본 발명의 조성물을 제형화하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 물, 염 용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 탤크, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
핵산의 국소 투여를 위한 제형은 멸균 및 비-멸균 수용액, 통상적인 용매, 예를 들어, 알콜 중 비-수성 용액, 또는 액체 또는 고체 오일 베이스 중 핵산의 용액을 포함할 수 있다. 용액은 또한 완충제, 희석제 및 다른 적합한 첨가제를 함유할 수 있다. 핵산과 유해하게 반응하지 않는 비-비경구 투여에 적합한 약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 부형제가 사용될 수 있다.
적합한 약학적으로 허용되는 부형제는 물, 염 용액, 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 탤크, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
기타 성분
본 발명의 조성물은 당 분야에서 확립된 사용 수준으로 약학적 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 보조 성분을 추가로 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 추가의 상용성인 약학적으로 활성인 물질, 예를 들어, 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제를 함유할 수 있거나, 본 발명의 조성물의 다양한 투여 형태를 물리적으로 제형화시키는데 유용한 추가 물질, 예를 들어, 염료, 착향제, 보존제, 항산화제, 유백제, 증점제 및 안정화제를 함유할 수 있다. 그러나, 상기 물질은 첨가되는 경우 본 발명의 조성물의 성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해하지 않아야 한다. 상기 제형은 멸균될 수 있고, 요망시, 제형의 핵산(들)과 유해하게 상호작용하지 않는 보조제, 예를 들어, 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 착향제 및/또는 방향성 물질 등과 혼합될 수 있다.
수성 현탁액은, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.
*일부 구현예에서, 본 발명에서 특정된 약학적 조성물은 (a) 하나 이상의 iRNA 화합물 및 (b) 비-RNAi 메커니즘에 의해 작용하는 하나 이상의 항-사이토카인 생물학적 작용제를 포함한다. 상기 생물학적 작용제의 예는 IL1β(예를 들어, 아나킨라(anakinra)), IL6(예를 들어, 토실리주맙(tocilizumab)), 또는 TNF(예를 들어, 에타너셉트(etanercept), 인플릭시맙(infliximab), 아들리무맙(adlimumab), 또는 세르톨리주맙(certolizumab))을 표적으로 하는 생물학적 작용제를 포함한다.
상기 화합물의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치사성인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고, 이는 비 LD50/ED50로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터가 인간에서 사용하기 위한 일정한 범위의 투여량을 제형화시키는데 사용될 수 있다. 본원에 특정된 조성물의 투여량은 일반적으로 독성이 거의 없거나 없이 ED50을 포함하는 일정 범위의 순환 농도 내에 속한다. 투여량은 이용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 다양할 수 있다. 본 발명에서 특정된 방법에서 사용되는 임의의 화합물에 대해, 치료적 유효 용량은 세포 배양 검정으로부터 먼저 평가될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 결정되는 바와 같은 IC50(즉, 증상의 최대의 절반의 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 화합물 또는, 적절한 경우, 표적 서열의 폴리펩티드 생성물의 순환 혈장 농도 범위를 달성(예를 들어, 폴리펩티드의 감소된 농도를 달성)시키도록 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 상기 정보는 인간에서 유용한 용량을 더욱 정확히 결정하기 위해 이용될 수 있다. 혈장에서의 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
투여에 더하여, 상기 논의된 바와 같이, 본원에 기재된 iRNA는 TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 치료에 효과적인 다른 공지된 작용제와 함께 투여될 수 있다. 임의의 사건에서, 투여 의사는 당 분야에 공지되거나 본원에 기재된 표준 효능 측정을 이용하여 관찰된 결과를 기초로 하여 iRNA 투여의 양 및 시기를 조정할 수 있다.
TMPRSS6 유전자의 발현에 의해 야기되는 질병을 치료하기 위한 방법
본 발명은 특히 TMPRSS6-매개 장애 또는 질병의 치료를 위한 TMPRSS6을 표적으로 하는 iRNA 및 적어도 하나의 상기 iRNA를 함유하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, TMPRSS6 유전자를 표적으로 하는 iRNA를 함유하는 조성물은 상승된 철 수준과 관련된 장애, 예를 들어, 탈라세미아(예를 들어, 중간성 β-탈라세미아 또는 α-탈라세미아), 원발성 혈색소증, 속발성 혈색소증, 중증 소아 혈색소증, 철적혈모구빈혈, 용혈 빈혈, 적혈구형성이상빈혈, 또는 낫적혈구빈혈의 치료에 사용된다. 한 구현예에서, TMPRSS6 iRNA는 혈색소병증을 치료하는데 사용된다. 본 발명에서 특정된 TMPRSS6 iRNA는 또한 다른 질환, 예를 들어, 만성 알콜중독으로 인한 철의 상승된 수준을 치료하는데 사용될 수 있다.
탈라세미아에서, 골수는 불충분한 양의 헤모글로빈 사슬을 합성하며, 이는 차례로 적혈구 세포의 생성을 감소시키고 빈혈을 야기시킨다. α 또는 β 사슬이 영향을 받을 수 있으나, β 탈라세미아가 더욱 흔하고, 신생아 신체는 β 사슬을 갖지 않는 HbF를 여전시 생성하므로 신생아는 건강하고, 생체 처음 수개월 동안, 골수는 HbA를 생성하는 것으로 전환되고, 증상이 나타나기 시작한다.
β-탈라세미아는 HBB 유전자의 비-발현(β0) 또는 낮은 발현(β+) 대립유전자를 갖는 돌연변이로부터 발생한다. β-탈라세미아는 유전형에 따라 중증도에 있어서 다양하며, 경증성/소질(trait) β-탈라세미아(β/β0 또는 β/β+), 중간성 β-탈라세미아(β0/β+), 및 중증성 β-탈라세미아(β0/β0 또는 β+/β+)를 포함한다.
중간성 탈라세미아(TI)는 통상적으로 약간의 용혈로 나타나는 한편, 중증성 β-탈라세미아(TM)는 통상적으로, 예를 들어, 빈혈 및 비장비대를 야기시키는 많은 용혈; 및 골수 구동(bone marrow drive)(골격 변화, 골감소증)을 야기시키는 매우 효과가 없는 적혈구생성, 증가된 에리트로포이에틴 합성, 간비장비대, 조혈제의 소모(거대적혈모구빈혈), 및 혈액에서의 높은 요산을 야기시키는 많은 용혈을 수반한다. 본 발명에서 특정된 iRNA, 예를 들어, TMPRSS6 iRNA는 보다 TI와 유사한 탈라세미아를 통상적으로 수반하는 철 과부하를 치료(예를 들어, β0/β+, β/ β0 또는 β/β+ 유전형을 갖는 개체를 치료)하는데 더 적합하다.
β-탈라세미아의 증상은 또한, 예를 들어, 요법으로 인한 합병증, 예를 들어, 내분비병증, 간 섬유증 및 심장 섬유증을 야기시키는 철 과부하를 포함한다. TMPRSS6을 표적으로 하는 iRNA 작용제의 투여는 하나 이상의 상기 증상을 치료하는데 효과적일 수 있다.
α-탈라세미아는 HBA1 또는 HBA2 유전자의 발현되지 않거나(α0), 낮은 발현(α+)의 대립유전자를 갖는 돌연변이로부터 발생한다. α-탈라세미아는 유전형에 따라 중증도에 있어서 다양하며, 이는 소질 탈라세미아(-α/αα), Hb Bart 및 태아수종(α0/α0), 경증성 α-탈라세미아(--/αα), (-α/-α), 및 HbH 질병(--/-α)을 포함한다. 보다 적은 α-글로빈 사슬이 생성되어, 성인에서 과량의 β 사슬 및 신생아에서 과량의 γ 사슬을 발생시킨다. 과량의 β 사슬은 비정상적 산소 해리 곡선을 갖는 불안정한 테트라머(헤모글로빈 H 또는 4개의 베타 사슬의 HbH로 언급됨)를 형성한다. TMPRSS6을 표적으로 하는 iRNA 작용제의 투여는 α-탈라세미아를 갖는 피검체에서 철 과부하를 치료하는데 효과적일 수 있다.
혈색소증의 증상은, 예를 들어, 복부 동통, 관절 동통, 피로, 에너지 결핍, 쇠약, 피부의 흑화(종종 "갈색화"로 언급됨), 및 신체 모발의 손실을 포함한다. TMPRSS6을 표적으로 하는 iRNA 작용제의 투여는 상기 증상 중 하나 이상을 치료하는데 효과적일 수 있다.
철 과부하와 관련된 다른 증상은 간 질병(경화증, 암), 심근경색 또는 심부전, 당뇨병, 골관절염, 골다공증, 대사 증후군, 갑상선저하증, 생식선저하증, 및 일부 경우에 조기 사망에 대한 증가된 위험을 포함한다. 과부하를 발생시키는 철 관리 부적절은 또한 상기 신경변성 질병, 예를 들어, 알츠하이머병, 조기-발병 파킨슨병, 헌팅턴병, 간질 및 다발경화증을 가속화시킬 수 있다. TMPRSS6을 표적으로 하는 iRNA, 예를 들어, 표 2, 3 또는 4에 기재된 iRNA의 투여는 상기 증상 중 하나 이상을 치료할 수 있거나, 증가된 철 수준에 의해 악화되는 질병 또는 장애의 발달 또는 진행을 방지할 수 있다.
본 발명은 추가로 다른 약학적 및/또는 다른 치료 방법, 예를 들어, 공지된 약학적 및/또는 공지된 치료 방법, 예를 들어, 상승된 철 수준과 관련된 장애를 치료하기 위해 현재 사용되는 방법과 조합된, 예를 들어, 상승된 철 수준과 관련된 장애를 치료하기 위한 iRNA 또는 이의 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, TMPRSS6을 표적으로 하는 iRNA는, 예를 들어, 철 킬레이트제(예를 들어, 데스페록사민), 폴산, 수혈, 정맥절개술, 궤양을 관리하기 위한 작용제, 태아 헤모글로빈 수준을 증가시키기 위한 작용제(예를 들어, 하이드록시우레아), 감염을 조절하기 위한 작용제(예를 들어, 항생제 및 항바이러스제), 혈전 상태를 치료하기 위한 작용제, 또는 줄기 세포 또는 골수 이식과 함께 투여된다. 줄기 세포 이식은 제대(umbilical cord)로부터의 줄기 세포, 예를 들어, 친척, 예를 들어, 형제로부터의 줄기 세포를 이용할 수 있다. 예시적 철 킬레이트제는 데스페록사민(desferroxamine), 데페라시록스(Deferasirox)(Exjade), 데페로프론(deferoprone), 비타민 E, 맥아 오일, 토코페르솔란(tocophersolan), 및 인디카크산틴(indicaxanthin)을 포함한다.
iRNA 및 추가 치료제는 동일 조성물로, 예를 들어, 비경구적으로 투여될 수 있거나, 추가 치료제가 별개의 조성물의 일부로서 또는 본원에 기재된 또 다른 방법에 의해 투여될 수 있다. TMPRSS6 iRNA 및 추가 치료제의 투여는 동시에 이루어질 수 있거나, 임의의 순서로 상이한 시간에 이루어질 수 있다.
본 발명은 TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 질병 또는 장애, 예를 들어, 상승된 철 수준과 관련된 장애를 갖는 환자에게 TMPRSS6을 표적으로 하는 iRNA 작용제를 투여하는 방법을 특징으로 한다. dsRNA의 투여는 철 수준을 낮추고/낮추거나, 페리틴 수준을 낮추고/낮추거나, 트랜스페린 포화 수준을 낮출 수 있다. 예를 들어, dsRNA의 투여는 혈청 철 수준을 낮추고/낮추거나 혈청 페리틴 수준을 낮출 수 있다. 트랜스페린 포화 수준은 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 그 이상까지 낮추어질 수 있다. 트랜스페린 포화 수준은 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 35% 미만 또는 그 이하까지 낮추어질 수 있다. 트랜스페린 포화는 혈청 트랜스페린에 결합한 철의 양의 척도이고, 이는 혈청 철 대 전체 철-결합 능력의 비에 해당한다.
상기 상황에서 "낮추다"는 상기 수준에서의 통계적으로 유의한 감소를 의미한다. 감소는, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 그 이상일 수 있고, 이는 바람직하게는 상기 장애를 갖지 않는 개체에 대해 정상의 범위 내인 것으로 허용되는 수준까지 낮아진다.
질병의 치료 또는 예방의 효능은, 예를 들어, 질병 진행, 질병 완화, 증상 중증도, 동통의 감소, 삶의 질, 치료 효과를 유지시키는데 필요한 약물의 용량, 질병 마커 또는 치료되거나 예방을 위해 표적화되는 제공된 질병에 적절한 임의의 다른 측정가능한 파라미터의 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 충분히 상기 파라미터 중 어느 하나, 또는 파라미터의 임의의 조합을 측정함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터하는 것은 당업자의 능력 내에 있다. 예를 들어, 트랜스페린 포화 또는 혈청 페리틴의 수준은 제공된 치료 요법의 효능에 대해 모니터될 수 있다.
철 수준 시험은 통상적으로 환자의 혈액 샘플에 대해 수행된다. 철 수준 시험은 단백질 트랜스페린에 의해 수행되는 혈액 혈청 내의 철의 양을 측정한다. TIBC(전체 철-결합능) 시험은 트랜스페린이 완전히 포화되는 경우에 혈액이 갖는 철의 양을 측정한다. 트랜스페린은 간에 의해 생성되므로, TIBC는 간 기능 및 영양을 모니터하기 위해 사용될 수 있다. 트랜스페린 시험은 혈액 내의 트랜스페린(시데로필린으로도 언급됨) 수준의 직접 측정이다. 트랜스페린의 포화 수준은 혈청 철 수준을 TIBC로 나눔으로써 계산될 수 있다. 트랜스페린 시험은 신체에 의한 이후의 사용을 위한 철을 저장하는 혈액 내의 단백질의 수준을 측정한다.
본원에 기재된 iRNA 처리는 혈청 내의 철 수준, 예를 들어, 350 ㎍/dL 초과, 500 ㎍/dL 초과, 1000 ㎍/dL 초과, 또는 그 이상으로 측정되는 철 수준으로 나타날 수 있는 상승된 철 수준을 갖는 개체를 처리하기 위해 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 혈청 내의 철의 상승된 수준은, 예를 들어, 15, 20, 25, 또는 30 ㎎/g(건조 중량)을 초과하는 수준이다.
본원에 기재된 iRNA 처리는 혈청 내의 상승된 페리틴 수준, 예를 들어, 300 ㎍/L 초과, 500 ㎍/L 초과, 1000 ㎍/L 초과, 1500 ㎍/L 초과, 2000 ㎍/L 초과, 2500 ㎍/L 초과, 또는 3000 ㎍/L 초과, 또는 그 이상으로 측정되는 페리틴 수준으로 나타날 수 있는 상승된 철 수준을 갖는 개체를 처리하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 iRNA 처리는 혈청 내의 상승된 트랜스페린 수준, 예를 들어, 400 ㎎/dL 초과, 500 ㎎/L 초과, 1000 ㎎/dL 초과, 또는 그 이상으로 측정되는 트랜스페린 수준으로 나타날 수 있는 상승된 철 수준을 갖는 개체를 처리하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 iRNA 처리는 중간으로 상승된 트랜스페린 포화 수준, 예를 들어, 40%, 45%, 또는 50% 또는 그 이상의 포화 수준으로 나타날 수 있는 중간으로 상승된 철 수준을 갖는 개체를 처리하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 처리는 트랜스페린 포화에서 단지 약간의 상승을 갖는 개체에서 상승된 철 수준을 방지하기 위해 또한 사용될 수 있다. 당업자는 본원에 기재된 바와 같은 iRNA를 이용한 처리를 받은 피검체 및 적어도 5% 또는 10%의 트랜스페린 포화 수준에서의 감소에 대한 검정에서 트랜스페린 포화 수준을 용이하게 모니터할 수 있다.
본원에 기재된 iRNA 처리는 400 ㎍/dL 초과, 500 ㎍/dL 초과, 또는 1000 ㎍/dL 초과, 또는 그 이상의 TIBC 값으로 나타날 수 있는 상승된 철 수준을 갖는 개체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, TMPRSS6 siRNA를 이용한 처리를 필요로 하는 개체는 감소된 적혈구용적률 수준, 감소된 헤모글로빈 수준, 증가된 적혈구 세포 분포 폭, 증가된 망상적혈구 수, 감소된 성숙 적혈구 세포의 수, 증가된 불포화 철 결합능, 감소된 무효 적혈구생성, 감소된 골수외 조혈, 및/또는 감소된 HAMP1 발현 수준을 갖는다.
환자는 혈당(글루코스) 수준 또는 α 태아단백질 수준의 검정, 심초음파상(예를 들어, 심장의 기능을 시험), 심전도(ECG)(예를 들어, 심장의 전기 활성을 관찰), 영상화 시험(예를 들어, CT 스캔, MRI 및 초음파), 및 간 기능 시험에 의해 추가로 모니터될 수 있다. 과량의 철 염색 또는 철 농도는 간 생검 샘플에서 측정될 수 있거나, 간 손상의 정도, 예를 들어, 간 질병의 단계를 확인하기 위해 측정될 수 있다.
치료 또는 예방 효과는 질병 상태의 하나 이상의 파라미터에서의 통계적으로 유의한 개선이 존재하거나, 증상이 달리 예견되는 경우 증상이 악화되거나 발달하는 것이 실패하는 경우에 명백하다. 예로서, 질병의 측정가능한 파라미터에서의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상의 바람직한 변화가 효과적인 치료를 나타낼 수 있다. 제공된 iRNA 약물 또는 이러한 약물의 제형에 대한 효능은 또한 당 분야에 공지된 바와 같은 제공된 질병에 대한 실험 동물 모델을 이용하여 판단될 수 있다. 실험 동물 모델을 이용하는 경우, 마커 또는 증상에서의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되는 경우 치료 효능이 입증된다.
대안적으로, 효능은 임상적으로 허용되는 질병 중증도 등급화 척도를 기초로 하여 진단 당업자에 의해 결정되는 바와 같은 질병의 중증도에서의 감소에 의해 측정될 수 있다.
환자는 iRNA의 치료량, 예를 들어, 0.01 ㎎/㎏, 0.05 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏, 0.5 ㎎/㎏, 1.0 ㎎/㎏, 1.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 또는 2.5 ㎎/㎏의 dsRNA가 투여될 수 있다. iRNA는 일정 기간, 예를 들어, 5분, 10분, 15분, 20분, 또는 25분의 기간에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 투여는, 예를 들어, 주기적으로, 예를 들어, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월 또는 그 이상 동안 격주(즉, 2주 마다)로 반복된다. 최초 처리 요법 후, 치료제는 덜 빈번히 투여될 수 있다. 예를 들어, 3개월 동안 격주의 투여 후, 투여는 6개월 또는 1년 또는 그 이상 동안 1개월에 1회 반복될 수 있다. iRNA의 투여는, 예를 들어, 세포, 조직, 혈액, 소변 또는 환자의 다른 구획 내에서 TMPRSS6 수준을 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 그 이상으로 감소시킬 수 있다.
iRNA의 완전한 용량의 투여 전, 환자는 보다 적은 용량, 예를 들어, 5% 주입 반응물이 투여될 수 있고, 유해효과, 예를 들어, 알레르기 반응 또는 증상의 악화가 모니터될 수 있다. 또 다른 예에서, 환자는 원치않는 면역자극 효과, 예를 들어, 증가된 사이토카인(예를 들어, TNF-α 또는 INF-α) 수준에 대해 모니터될 수 있다.
상승된 철 수준과 관련된 많은 장애는 유전성이다. 따라서, TMPRSS6 iRNA를 필요로 하는 환자는 가족력을 얻음으로써 확인될 수 있다. 건강관리 제공자, 예를 들어, 의사, 간호사, 또는 가족 구성원은 TMPRSS6 dsRNA를 처방하거나 투여하기 전에 가족력을 얻을 수 있다. TMPRSS6 dsRNA가 환자에게 투여되기 전에 TMPRSS6 유전자에서의 돌연변이를 확인하기 위해 DNA 시험이 또한 환자에 대해 수행될 수 있다. 예를 들어, 유전성 혈색소증의 진단은 GenBank Accession No. CAB07442.1 (GI:1890180, 2008년 10월 23일에 기록됨)에 따라 2개의 HFE(혈색소증) 유전자 돌연변이 C282Y 및 H63D를 확임함으로써 확인될 수 있다.
TMPRSS6 발현에 대한 억제 효과로 인해, 본 발명에 따른 조성물 또는 이로부터 제조된 약학적 조성물은 삶의 질을 향상시킬 수 있다.
TMPRSS6 유전자의 발현을 조절하기 위한 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 TMPRSS6 유전자의 발현을 조절(에를 들어, 억제 또는 활성화)하기 위한 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 상기 방법은, 예를 들어, 연장된 기간, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4일 또는 그 이상, 예를 들어, 1주, 2주, 3주, 4주 또는 그 이상 동안 표적 TMPRSS6 유전자의 발현이 감소되도록 하기 위해 본 발명에서 특정된 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함한다. 감소된 표적 TMPRSS6 유전자의 효과는 바람직하게는 신체 내에서의 철 흡수 및/또는 동원에서의 감소를 발생시킨다. 감소된 철 흡수 또는 동원은 혈청 페리틴 수준, 혈청 또는 간 철 수준, 및/또는 혈청 트랜스페린 포화 수준에서의 관찰된 감소로 나타날 수 있다. 일부 구현예에서, 혈청 페리틴 수준, 혈청 또는 간 철 수준, 또는 혈청 트랜스페린 포화 수준 중 하나 이상은 처리전 수준에 비해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 그 이상까지 감소된다. 일부 구현예에서, 혈청 페리틴 수준은 처리전 수준에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 그 이상까지 감소된다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 표적 TMPRSS6 유전자의 발현이 미처리된 동물에 비해, 예를 들어, 적어도 10%까지 증가되도록, 본원에 기재된 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, TMPRSS6의 활성화는 연장된 기간, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4일 또는 그 이상, 예를 들어, 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 그 이상에 걸쳐 발생한다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, iRNA는 TMPRSS6 mRNA 전사체를 안정화시키고/시키거나, 유전체 내의 프로모터와 상호작용하고/하거나, TMPRSS6 발현의 억제제를 억제함으로써 TMPRSS6 발현을 활성화시킬 수 있다.
본 발명에서 특정된 방법 및 조성물에 유용한 iRNA는 표적 TMPRSS6 유전자의 RNA(일차 RNA 또는 가공된 RNA)를 특별히 표적화한다. iRNA를 이용한 상기 TMPRSS6 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법은 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 제조되고 수행될 수 있다.
한 구현예에서, 상기 방법은 iRNA를 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 상기 iRNA는 치료되는 포유동물의 TMPRSS6 유전자의 RNA 전사체의 적어도 일부와 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 치료되는 유기체가 포유동물, 예를 들어, 인간인 경우, 조성물은 경구, 복막내, 또는 비경구 경로, 예를 들어, 두개내(예를 들어, 뇌실내, 실질내 및 수막강내), 정맥내, 근내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 비내, 직장내, 및 국소(협측 및 설하를 포함함) 투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 당 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명에서 특정된 iRNA 및 방법의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질이 하기 기재된다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 전체내용이 참조로서 포함된다. 불일치의 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법, 및 예는 단지 예시이며, 이로 제한하고자 하는 것이 아니다.
도면의 설명
도 1은 인간 TMPRSS6 mRNA의 서열(Ref. Seq. NM_153609.2, GI:56682967, 2011년 1월 23일에 기록됨, SEQ ID NO:1)이다.
도 2a 및 2b는 일차 마우스 간세포에서의 TMPRSS6 유전자 발현의 감소에서의 2개의 화학적으로 변형된 TMPRSS6을 표적으로 하는 siRNA의 효능을 도시한다.
도 3a 및 3b는 WT C57BL/6 마우스에서의 TMPRSS6 및 HAMP1 유전자 발현에 대한 LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273) 및 LNP-TMPRSS6 siRNA-2(AD-46286) 각각의 효과를 도시한다.
도 4는 WT C57BL/6 마우스에서의 TMPRSS6 유전자 발현, HAMP1 유전자 발현, 및 혈청 철 수준에 대한 TMPRSS6 siRNA 매개 효과의 지속기간을 도시한다.
도 5는 WT C57BL/6 마우스에서의 HAMP1 유전자 발현 및 혈청 철 수준에 대한 TMPRSS6 siRNA 매개 효과를 유지시키는데 필요한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 수준을 도시한다.
도 6a 및 6b는 WT C57BL/6 마우스에서의 혈액학적 파라미터에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과를 도시한다. 도 6a는 투여 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 7일, 및 14일 후 WT C57BL/6 마우스에서의 헤모글로빈(HBG)에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과를 도시한다. 도 6b는 투여 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 7일, 및 14일 후 WT C57BL/6 마우스에서의 적혈구용적률에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과를 도시한다.
도 7은 혈청 철 수준, 불포화철결합능(UIBC) 수준, 및 트랜스페린 포화 수준을 포함하는 탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 혈청 철 파라미터에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과를 도시한다.
도 8a 내지 8c는 탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 망상적혈구 및 적혈구 파라미터에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과를 도시한다. 도 8a는 망상적혈구 수(%)에 대한 효과를 도시하고, 도 8b는 망상적혈구의 헤모글로빈 함량(CHr)에 대한 효과를 도시하고, 도 8c는 성숙 적혈구 세포의 수에 대한 효과를 도시한다.
도 9a 내지 9d는 탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 혈액학적 파라미터에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과를 도시한다. 도 9a는 적혈구용적률(HCT) 수준에 대한 효과를 도시하고, 도 9b는 헤모글로빈(HGB)에 대한 효과를 도시하고, 도 9c는 적혈구 세포(RBC) 분포폭(RDW)에 대한 효과를 도시하고, 도 9d는 평균 적혈구 값(mean corpuscle value, MCV)에 대한 효과를 도시한다.
도 10a 내지 10c는 탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 비장 및 간 철 함량에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과를 도시한다. 도 10a는 총 비장 철 함량에 대한 효과를 도시하고, 도 10b는 비장 중량에 대한 효과를 도시하고, 도 10c는 간에서의 철의 농도에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과를 도시한다.
실시예
실시예 1. 간섭 RNA(iRNA) 합성
시약의 공급원
시약의 공급원이 본원에서 특정되지 않는 경우, 상기 시약은 분자 생물학에 적용하기 위한 품질/순도 표준의 분자 생물학용 시약의 임의의 공급자로부터 구입될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 합성
본 출원인은 본원에 기재된 iRNA 분자를 생성하기 위해 몇 가지 상이한 방법들을 사용하였다. 본 실시예는 사용된 하나의 접근법에 대해 기재한다. 통상적인 당업자는 본원에 기재된 바와 같은 iRNA를 제조하기 위해 당 분야에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다.
올리고뉴클레오티드를 AKTAoligopilot 합성기에서 합성하였다. 상업적으로 이용 가능한 제어되는 다공 글래스(pore glass) 고형 지지체(dT-CPG, 500Å, Prime Synthesis) 및 표준 보호기를 갖는 RNA 포스포라미다이트, 예를 들어, 5'-O-디메톡시트리틸 N6-벤조일-2'-t-부틸디메틸실릴-아데노신-3'-O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸포스포라미다이트, 5'-O-디메톡시트리틸-N4-아세틸-2'-t-부틸디메틸실릴-시티딘-3'-O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸포스포라미다이트, 5'-O-디메톡시트리틸-N2--이소부트릴-2'-t-부틸디메틸실릴-구아노신-3'-O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸포스포라미다이트, 및 5'-O-디메톡시트리틸-2'-t-부틸디메틸실릴-우리딘-3'-O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸포스포라미다이트(Pierce Nucleic Acids Technologies)를 상기 올리고뉴클레오티드 합성을 위해 사용하였다. 2'-F 포스포라미다이트, 예를 들어, 5'-O-디메톡시트리틸-N4-아세틸-2'-플루로-시티딘-3'-O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸-포스포라미다이트 및 5'-O-디메톡시트리틸-2'-플루로-우리딘-3'-O-N,N'-디이소프로필-2-시아노에틸-포스포라미다이트는 프로메가(Promega)사로부터 구입하였다. 10% THF/ANC(v/v)중에 0.2M 농도로 사용한 구아노신을 제외한 모든 포스포라미다이트를 아세토니트릴(CH3CN)중에 0.2M 농도로 사용하였다. 16분의 커플링/리사이클링 시간을 사용하였다. 활성제는 5-에틸 티오테트라졸(0.75M, American International Chemicals)이며; PO-산화를 위해 요오드/물/피리딘을 사용하고 PS-산화를 위해서는 2,6-루티딘/ACN(1:1 v/v)중의 PADS(2%)를 사용하였다.
3'-리간드 컨쥬게이션된 가닥들을 상응하는 리간드를 함유하는 고형 지지체를 사용하여 합성하였다. 예를 들어, 상기 서열 내로의 콜레스테롤 단위의 도입을 하이드록시프롤리놀-콜레스테롤 포스포라미다이트로부터 수행하였다. 하이드록시프롤리놀-콜레스테롤 모이어티를 수득하기 위해 콜레스테롤을 6-아미노헥사노에이트 연결을 통해 트랜스-4-하이드록시프롤리놀에 결속시켰다. Biosearch Tehnologies사로부터 구입한 상응하는 Quasar-570(Cy-3) 포스포라미다이트로부터 5'-말단 Cy-3 및 Cy-5.5(형광단) 표지된 iRNA를 합성하였다. 5'-말단 및/또는 내부 위치에 대한 리간드의 컨쥬게이션은 적절히 보호된 리간드-포스포라미다이트 빌딩 블록을 사용함으로써 달성되었다. 고형-지지체-결합된 올리고뉴클레오티드에 대한 5-(에틸티오)-1H-테트라졸 활성제의 존재하에 무수 CH3CN 중의 포스포라미다이트의 0.1M 용액의 커플링을 15분 연장시켰다. 포스페이트에 대한 뉴클레오티드간 포스파이트의 산화는 (문헌 1에) 보고된 바와 같이 표준 요오드-물을 사용하거나 10분의 산화 대기 시간을 가지고 컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드와 함께 3차-부틸 하이드로퍼옥사이드/아세토니트릴/물(10:87:3)로 처리함으로써 수행되었다. DDTT(AM Chemicals사로부터 구입), PADS 및/또는 Beaucage 시약과 같은 황 전달 시약을 사용함으로써 포스포로티오에이트에 대한 포스파이트의 산화에 의해 포스포로티오에이트를 도입시켰다. 콜레스테롤 포스포라미다이트를 사내에서 합성하고 디클로로메탄중에 0.1M의 농도로 사용하였다. 상기 콜레스테롤 포스포라미다이트에 대한 커플링 시간은 16분이다.
탈보호 I(핵염기 탈보호)
합성 완료 후, 지지체를 100㎖ 유리병(VWR)으로 이동시켰다. 55℃에서 6.5시간 동안 80㎖의 에탄올 암모니아 혼합물[암모니아:에탄올(3:1)]을 사용하여 염기와 포스페이트기의 동시 탈보호에 의해 지지체로부터 올리고뉴클레오티드를 분해하였다. 상기 병을 얼음 상에서 간단히 냉각시킨 후, 에탄올 암모니아 혼합물을 새로운 250-㎖ 병내로 여과시켰다. 에탄올/물(1:1 v/v)의 2 x 40㎖ 부분을 사용하여 CPG를 세척하였다. 이후, 혼합물의 부피를 회전증발(roto-vap)에 의해 약 30㎖까지 감소시켰다. 이후, 혼합물을 드라이아이스상에서 동결시키고, 고속 진공기(speed vac)상의 진공 하에서 건조시켰다.
탈보호 II(2'-TBDMS 기의 제거)
상기 건조된 잔여물을 26㎖의 트리에틸아민, 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드(TEA·3HF) 또는 피리딘-HF 및 DMSO(3:4:6)에 재현탁시키고, 90분 동안 60℃에서 가열하여 2' 위치에서 3차-부틸디메틸실릴(TBDMS) 기를 제거하였다. 이후, 50㎖의 20mM 소듐 아세테이트를 사용하여 반응을 켄칭시키고, pH를 6.5로 조정하였다. 올리고뉴클레오티드를 정제시까지 냉동고에 보관하였다.
분석
올리고뉴클레오티드를 정제하기 전에 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석하였고, 완충액 및 컬럼의 선택을 서열 및/또는 컨쥬게이션된 리간드의 특성에 의존하였다.
HPLC 정제
리간드-컨쥬게이션된 올리고뉴클레오티드를 역상 조제용 HPLC에 의해 정제하였다. 컨쥬게이션되지 않은 올리고뉴클레오티드를 사내에서 패킹된 TSK 겔 컬럼상에서 음이온-교환 HPLC에 의해 정제하였다. 완충액은 10% CH3CN 중의 20mM 소듐 포스페이트(pH 8.5)(완충액 A) 및 10% CH3CN, 1M NaBr 중의 20mM 소듐 포스페이트(pH 8.5)(완충액 B)이다. 전장 올리고뉴클레오티드를 함유하는 분획을 풀링(pooling)시키고, 탈염시키고, 동결건조시켰다. 약 0.15 OD의 탈염된 올리고뉴클레오티드를 150μL까지 물에 희석시킨 후, CGE 및 LC/MS 분석용의 특정 바이알내로 피펫팅(pipetting)하였다. 이후, 화합물을 LC-ESMS 및 CGE에 의해 분석하였다.
iRNA 제조
iRNA의 일반적인 제조를 위해, 등몰량(equimolar amount)의 센스 및 안티센스 가닥을 1xPBS 중에서 5분 동안 95℃에서 가열하고, 실온까지 천천히 냉각시켰다. 상기 듀플렉스의 완전성을 HPLC 분석에 의해 확인하였다.
핵산 서열을 표준 명명법, 및 상세하게는 표 1의 약어를 사용하여 하기에 표시하였다.
표 1: 핵산 서열 표시에 사용된 뉴클레오티드 단량체의 약어. 올리고뉴클레오티드에 존재하는 경우 이들 단량체는 5'-3'-포스포디에스테르 결합에 의해 서로 연결되는 것으로 이해될 것이다.
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실시예 2. TMPRSS6 siRNA 설계
전사체
TMPRSS6를 표적화하는 siRNA를 설계 및 합성하였다. 설계에 NCBI Refseq 콜렉션으로부터의 인간 전사체 NM_153609.2(SEQ ID NO:1, 도 1)를 사용하였다.
siRNA 듀플렉스를 TMPRSS6 유전자와 100% 동일성을 갖도록 설계하였다.
655 센스 및 655 안티센스 인간 TMPRSS6 유래 siRNA 올리고 전체를 설계하였다. 상기 올리고들을 표 2에 나타내었다. 추가적인 센스 및 안티센스 인간 TMPRSS6 유래 siRNA 올리고는 표 3에 나타내었다. 변형을 갖는 센스 및 안티센스 인간 TMPRSS6 유래 siRNA 올리고는 표 4에 나타내었다.
표 2. 인간 TMPRSS6 dsRNA의 센스 및 안티센스 가닥 서열
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표 3. 인간 TMPRSS6 dsRNA의 변형되지 않은 센스 및 안티센스 가닥 서열
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표 4. 인간 TMPRSS6 dsRNA의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 서열
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TMPRSS6 서열의 합성
TMPRSS6 iRNA 서열은 MerMade 192 합성기에서 1μmol 규모로 합성될 수 있다.
엔도라이트(Endolight) 화학이 하기 상술한 바와 같이 적용될 수 있다.
센스 가닥 내에 모든 피리미딘(시토신 및 우리딘)은 2'-O-메틸 염기(2'-O-메틸 C 및 2'-O-메틸 U)를 포함하였다.
안티센스 가닥에서, 리보 A 뉴클레오시드에 (5' 위치로) 인접한 피리미딘은 이의 상응하는 2-O-메틸 뉴클레오시드로 대체될 수 있다.
센스 및 안티센스 서열 둘 모두의 3' 말단에 두 개의 염기 dTsdT 연장부가 도입될 수 있다.
MerMade 192 합성 소프트웨어에 로딩하기에 적합하도록 만들기 위해 서열 파일(file)은 텍스트 파일로 변환될 수 있다.
합성, 분해 및 탈보호
TMPRSS6 서열의 합성은 포스포라미다이트 화학을 사용하는 고형으로 지지된 올리고뉴클레오티드 합성을 사용한다.
상기 서열의 합성은 96 웰 플레이트에서 1㎛ 규모로 수행될 수 있다. 아미다이트 용액은 0.1M 농도로 제조될 수 있고, 에틸 티오 테트라졸(아세토니트릴 중의 0.6M)은 활성제로서 사용될 수 있다.
합성된 서열은 분해될 수 있고, 제1 단계에서 메틸아민을 사용하고 제2 단계에서 플루오라이드 시약을 사용하여 96 웰 플레이트에서 탈보호될 수 있다. 미정제 서열은 아세톤:에탄올(80:20) 믹스를 사용하여 침전될 수 있고, 펠렛은 0.02M 소듐 아세테이트 완충액 중에 재현탁될 수 있다. 각 서열로부터의 샘플은 동일성 확인을 위해 LC-MS에 의해, 그리고 정량화를 위해 UV에 의해 분석될 수 있다. 샘플 중 선택된 세트는 또한 순도를 결정하기 위해 IEX 크로마토그래피에 의해 분석될 수 있다.
정제 및 탈염
모든 서열은 Source 15Q 컬럼을 사용하는 AKTA 익스플로러(AKTA explorer) 정제 시스템에서 정제될 수 있다. 샘플 주입 및 수집은 96 웰(1.8㎖ -딥(deep) 웰) 플레이트에서 수행될 수 있다. 전장 서열에 상응하는 단일 피크가 용리물에서 수집될 수 있다. 정제된 서열은 AKTA 정제기를 사용하는 Sephadex G25 컬럼상에서 탈염될 수 있다. 탈염된 TMPRSS6 서열은 (A260에서 UV 측정에 의해) 농도 및 (이온교환 HPLC에 의해) 순도에 대해 분석될 수 있다. 이후, 단일 가닥은 어닐링을 위해 제공될 수 있다.
실시예 3. TMPRSS6 넉다운 활성에 대한 TMPRSS siRNA 듀플렉스의 시험관내 스크리닝.
TMPRSS6 siRNA 듀플렉스를 시험관내에서 TMPRSS6 발현을 넉다운시키는 능력에 대해 스크리닝하였다. 단일 용량 스크리닝, 용량 반응 스크리닝, 및 숙주 세포의 생존능력을 평가하였다.
시험관내 스크리닝:
단일 용량 및 용량 반응 연구를 위한 세포 배양 및 트랜스펙션:
HeLa 또는 Hep3B 세포(ATCC, Manassas, VA)를 10% FBS, 스트렙토마이신, 및 글루타민(ATCC)이 보충된 X(ATCC)에서 5% CO2의 대기하에 37℃에서 거의 컨플루언스(confluence)까지 성장시킨 후, 트립신처리에 의해 플레이트로부터 방출시켰다. 96-웰 플레이트 내로 웰 당 5㎕의 siRNA 듀플렉스에 웰 당 14.8㎕의 Opti-MEM와 함께 0.2㎕의 리포펙타민(Lipofectamine) RNAiMax(Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150)를 첨가하고, 15분 동안 실온에서 인큐베이션시킴으로써 트랜스펙션을 수행하였다. 이후, 약 2 x104 HeLa 또는 Hep3B 세포를 함유하는 80㎕의 완전 성장 배지(항생제 비함유)를 siRNA 혼합물에 첨가하였다. RNA 정제 전에 세포를 24시간 또는 120시간 동안 인큐베이션시켰다. 단일 용량 실험은 10nM 및 0.1nM 최종 듀플렉스 농도에서 수행하였고, 용량 반응 실험은 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 0.00001nM 최종 듀플렉스 농도에서 수행하였다.
DYNABEADS® mRNA 분리 키트(Invitrogen, part #: 610-12)를 사용한 전체 RNA 분리:
세포를 수확하고 150㎕의 용해/결합 완충액에서 용해시킨 후, Eppendorf® Thermomixer를 사용하여 850rpm에서 5분 동안 혼합하였다(혼합 속도는 상기 과정 전체에서 동일하였다). 10마이크로리터의 자성 비드 및 80㎕의 용해/결합 완충액 혼합물을 둥근 바닥 플레이트에 첨가하고, 1분 동안 혼합하였다. 자성 스탠드를 사용하여 자성 비드를 포획하고, 비드를 흩뜨리지 않으면서 상층액을 제거하였다. 상층액을 제거한 후, 용해된 세포를 남아있는 비드에 첨가하고 5분 동안 혼합하였다. 상층액을 제거한 후에, 자성 비드를, 150㎕의 세척 완충액 A를 사용하여 2회 세척하고, 1분 동안 혼합하였다. 비드를 다시 포획하고, 상층액을 제거하였다. 이후, 150㎕의 세척 완충액 B를 사용하여 비드를 세척하고, 포획하고, 상층액을 제거하였다. 다음에, 150㎕ 용리 완충액을 사용하여 비드를 세척하고, 포획하고, 상층액을 제거하였다. 이후, 비드가 2분 동안 건조되도록 하였다. 건조 후, 50㎕의 용리 완충액을 첨가하고, 70℃에서 5분 동안 혼합하였다. 비드를 5분 동안 자석상에서 포획하였다. 40㎕의 상층액을 회수하여, 또 다른 96 웰 플레이트에 첨가하였다.
ABI 고성능 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813)을 사용한 cDNA 합성:
반응당 2㎕의 10X 완충액, 0.8㎕의 25X dNTP, 2㎕의 무작위 프라이머, 1㎕의 역전사효소, 1㎕의 RNase 억제제 및 3.2㎕의 H2O의 마스터 믹스를 10㎕ 전체 RNA에 첨가하였다. 다음의 단계를 거쳐 Bio-Rad C-1000 또는 S-1000 써멀 싸이클러(Hercules, CA)를 사용하여 cDNA를 생성하였다: 25℃ 10분, 37℃ 120분, 85℃ 5초, 4℃ 유지(hold).
실시간 PCR:
2㎕의 cDNA를, 384 웰 50 플레이트(Roche cat # 04887301001)에 웰 당 0.5㎕ GAPDH TaqMan 프로브(Applied Biosystems Cat #4326317E), 0.5㎕ TMPRSS6 TaqMan 프로브(Applied Biosystems cat # Hs00542184_m1) 및 5㎕ Lightcycler 480 프로브 마스터 믹스(Roche Cat #04887301001)를 함유하는 마스터 믹스에 첨가하였다. ΔΔCt(RQ) 검정을 사용하여 실시간 PCR을 ABI 7900HT 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 수행하였다. 각 듀플렉스를 2회의 독립적인 트랜스펙션에서 시험하였고, 각 트랜스펙션을 요약표에 달리 기재하지 않는 한 이중으로 검정하였다.
상대적인 배수 변화를 계산하기 위해, ΔΔCt 방법을 사용하여 실시간 데이터를 분석하였고, 10nM AD-1955를 사용하여 트랜스펙션된 세포, 또는 모의 트랜스펙션된 세포를 사용하여 수행된 검정으로 정상화하였다. XLFit를 사용하는 4 파라미터 적합 모델을 사용하여 IC50을 계산하였고, 동일한 용량 범위에 걸쳐 AD-1955를 사용하여 트랜스펙션된 세포, 또는 가장 낮은 용량으로 트랜스펙션된 세포로 정상화하였다.
생존능력 스크리닝. HeLa 또는 Hep3B 세포(ATCC, Manassas, VA)를 10% FBS, 스트렙토마이신, 및 글루타민(ATCC)이 보충된 X(ATCC)에서 5% CO2의 대기하에 37℃에서 거의 컨플루언스까지 성장시킨 후, 트립신처리에 의해 플레이트로부터 방출시켰다. 100, 10, 1, 0.1, 0.01 및 0.0001nM siRNA를 사용한 트랜스펙션 후에 HeLa 및 Hep3B 세포에서 세포 생존능력을 3일 및 5일째에 측정하였다. 96 웰 플레이트에 세포를 웰 당 2.5X103 내지 5X103 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 각 siRNA를 삼중으로 검정하였고, 데이터를 평균내었다. PLK1 및 AD-19200을 표적화하는 siRNA를 생존능력의 상실에 대한 양성 대조군으로 포함시키고, 음성 대조군으로는 AD-1955를 포함시켰다. PLK1 및 AD-19200은 용량 의존적으로 생존능력의 상실을 야기한다. 생존능력을 측정하기 위해, 20㎕의 CellTiter Blue(Promega)를 3일 및 5일 후에 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이후, 플레이트를 560Ex/590Em 에서 분광광도계(Molecular Devices)로 판독하였다. 생존능력을 3회 반복 트랜스펙션 +/- 표준 편차로부터의 광 단위의 평균값으로서 표현하였다.
TMPRSS6 siRNA 듀플렉스에 의한 TMPRSS6 발현의 시험관내 넉다운.
표 5는 TMPRSS6를 표적화하는 siRNA를 사용하여 트랜스펙션된 Hep3B 세포에서의 TMPRSS6의 넉다운을 나타내는 데이터를 제시한다. 음성 대조군 siRNA인 AD-1955를 사용하여 트랜스펙션된 세포와 비교한, TMPRSS6를 표적화하는 siRNA를 사용하여 트랜스펙션된 세포에 잔존하는 TMPRSS6 메시지의 분획으로써 데이터를 표현하였다. 미처리된 세포("나이브(naive)" 세포)를 두번째 음성 대조군으로 제공하였다. 모든 siRNA를 적어도 2회 이상 시험하였고, 또한 qPCR 반응을 이중으로 수행하였다. 단일 용량 실험을 10nM 및 0.1nM의 최종 siRNA 듀플렉스 농도에서 수행하였다.
표 5. 시험관내에서 단일 용량 스크리닝에서의 TMPRSS6 발현.
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시험관내 용량 반응 스크리닝에서의 선택 TMPRSS6 siRNA 듀플렉스의 IC 50 .
표 6은 시험관내 용량 반응 스크리닝으로부터 결정된 선택 TMPRSS6 siRNA 듀플렉스의 IC50 값을 제시한 것이다. 10nM 및 0.1nM 단일 용량 스크리닝(표 5)에서 효능있었던 TMPRSS6 siRNA 듀플렉스를 Hep3B 세포에 트랜스펙션 이후 1일 및 5일에 용량 반응에서의 TMPRSS6 넉다운 활성에 대해 시험하였다. 용량 반응 실험을 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 0.00001nM의 최종 siRNA 듀플렉스 농도에서 수행하였다. 정상화를 위해, TMPRSS6의 넉다운을 표적화되지 않은 대조군인 AD-1955, 또는 시험된 각 듀플렉스에 대한 최저 siRNA 농도에서 수득된 값과 비교하여 측정하였다.
표 6. 시험관내 용량 반응 스크리닝에서의 선택 TMPRSS6 siRNA 듀플렉스의 IC 50 .
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TMPRSS6 siRNA 듀플렉스를 사용하여 트랜스펙션된 HeLa 및 HEP3B 세포주의 시험관내 생존능력 스크리닝.
표 7은 TMPRSS6 siRNA 듀플렉스를 사용하여 트랜스펙션된 HeLa 및 HEP3B 세포주의 생존능력 데이터를 제시한다. 생존능력 데이터를 평균 미가공 형광 단위로서 표현하였으며, 여기서 더 작은 값은 더 낮은 생존능력을 나타낸다. 오류는 3회 반복 트랜스펙션으로부터의 표준 편차로서 표현하였다.
표 7. TMPRSS6 siRNA 듀플렉스를 사용하여 트랜스펙션된 HeLa 및 HEP3B 세포주의 생존능력
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실시예 4. TMPRSS6 siRNA 듀플렉스 리드(lead) 선택.
추가의 생체내 실험에 사용하기 위한 특정 TMPRSS6 siRNA를 선택하기 위해, 화학적으로 변형된 siRNA를 TMPRSS6 유전자 침묵 활성에 대해 HEP3B 인간 간암 세포에서의 트랜스펙션에 의해 스크리닝하였다. 최소 예측 표적외 잠재성(minimal predicted off-target potential), 및 인간 시노몰구스 원숭이, 래트 및 마우스를 포함하는 다종(multi-species) 반응성을 갖는 2개의 매우 효능 있는 siRNA를 생체내 평가를 위해 선택하였다. 또한 2개의 선택된 TMPRSS6 siRNA의 효능을 일차 마우스 간세포에서 확인하였고, 여기서 TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273) 및 TMPRSS6 siRNA-2(AD-46286) 둘 모두는 강한 TMPRSS6 유전자 침묵 활성을 보였는데, TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)의 경우 70pM의 IC50을 보였고(도 2a) TMPRSS6 siRNA-2(AD-46286)은 140pM의 IC50을 보였다(도 2b).
실시예 5. WT C57BL/6 마우스에서의 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과.
WT C57BL/6 마우스에서의 TMPRSS6 및 HAMP1 mRNA 발현에 대한 TMPRSS6 siRNA의 효과.
생체내에서 LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273) 및 LNP-TMPRSS6 siRNA-2(AD-46286)의 효과를 평가하기 위해, 8주령 암컷 WT C57BL/6 마우스에 1㎎/㎏의 LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273) 또는 LNP-TMPRSS6 siRNA-2(AD-46286) 또는 LNP-AD-19551(비-포유류 유전자 루시퍼라제(LUCIFERASE))를 꼬리 정맥 IV 주사를 통해 투여하였다. TMPRSS6 siRNA를 LNP11(MC3)와 함께 제형화하였다. 마우스를 투여한 지 24시간 후에 희생시키고, 간을 회수하여 급속 냉동시키고, 분말이 되도록 갈았다. 소량(약 20㎎)의 간 분말을 용해 완충액 중에서 분쇄하고, TaqMan®에 의한 mRNA 분석을 위해 사용하였다. 군(group)당 총 5마리의 마우스를 사용하였다. 데이터를 B-액틴 mRNA에 비한 표적 TMPRSS6 mRNA의 LNP-Luc 대조군 비의 백분율로서 표현하였다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 각각 0.035㎎/㎏의 ED50 및 0.18㎎/㎏의 ED50을 갖는, LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273) 및 LNP-TMPRSS6 siRNA-2(AD-46286)에 의한 간 TMPRSS6 mRNA 발현의 특이적이고 효능 있는 용량 의존적 억제가 있었다(데이터는 평균 +/-표준 편차를 나타낸다). 도 3b에 도시된 바와 같이, 또한 LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273) 및 LNP-TMPRSS6 siRNA-2(AD-46286)에 의한 간 HAMP1 mRNA 발현의 용량 의존적 억제가 또한 있었다.
WT C57BL/6 마우스에서의 TMPRSS6 및 HAMP1 유전자 발현의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 기간.
TMPRSS6 및 HAMP1 유전자 발현의 TMPRSS6 siRNA 매개 넉다운의 기간을 평가하기 위해, 8주령의 WT C57BL/6 마우스에 LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273), 또는 LNP-Luc 대조군(LNP-AD-1955), 또는 PBS를 꼬리 정맥 IV 주사를 통해 단일 1㎎/㎏ 용량을 투여하였으며; 모든 siRNA 작용제는 LNP11 제형으로서 전달하였다. 마우스를 6시간, 24시간, 48시간, 3일, 7일 및 14일에 희생시켰다. 간에서의 TMPRSS6 및 HAMP1의 mRNA 발현 수준을 TaqMan® 검정을 사용하여 분석하였고, B-액틴으로 정상화시켰다. 군당 5마리의 마우스를 사용하였고, 데이터를 평균 +/-표준 편차로서 도 4에 나타내었다. 도 4에 도시된 바와 같이, LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)의 1㎎/㎏ 단일 용량은 투여한 지 6시간 후에 이미 TMPRSS6 mRNA 발현을 넉다운시켰고, 2주의 기간 동안 LNP-Luc 대조군 또는 PBS 대조군의 약 90%까지 TMPRSS6 mRNA 발현을 감소시켰다. HAMP1 유전자 발현은 투여한 지 24시간 후부터 증가하기 시작하여, 투여한 지 14일 후에 대조군의 200%의 최대 증가를 가지면서 2주의 기간 동안 유지되었다(도 4). 추가로, Olympus AU 400을 사용하여 혈청 철 수준을 트랜스페린(Tf) 포화의 백분율로서 검정하였다. 트랜스페린 포화의 수준을 총철결합능(TIBC)에 대한 혈청 철의 비로서 계산하였고 트랜스페린 포화의 백분율로서 표현하였다. 트랜스페린 포화의 백분율은 투여한 지 24시간 후부터 시작하여 약 50%까지 감소하였고 2주 기간 동안 유지되었으며, 이는 혈청 내의 순환 철 수준이 감소된 것을 나타낸다(도 4). WT C57BL/6 마우스에서 HAMP1 유전자 발현 및 혈청 철 수준에 대한 TMPRSS6 siRNA 매개 효과를 유지하기 위해 필요한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 수준.
WT C57BL/6 마우스에서 HAMP1 유전자 발현 및 혈청 철 수준에 대한 TMPRSS6 siRNA 매개 효과를 유지하기 위해 필요한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 수준을 평가하기 위해; C57BL/6 마우스에 0.3㎎/㎏의 LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273), 또는 LNP-Luc 대조군, 또는 PBS를 투여하였고; 모든 siRNA 작용제는 LNP11 제형으로서 전달하였다. 마우스를 투여한 지 5시간, 24시간, 48시간, 3일, 7일, 14일, 21일 후에 희생시켰다. TMPRSS6 및 HAMP1의 mRNA 발현 수준을 TaqMan® 검정을 사용하여 분석하였고, B-액틴으로 정상화시켰다. 군당 5마리의 마우스를 사용하였고, 데이터는 평균 +/-표준 편차로서 도 5에 제시하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 90%의 TMPRSS6 유전자 발현의 최대 감소가 투여한 지 24시간 후에 달성되었고, 투여한 지 3일 후까지 유지되었다. 투여한 지 7일 후에, TMPRSS6 유전자 발현은 약 85%까지 감소되었고; HAMP1 유전자 발현은 대조군의 약 250%까지 유도되었으며; 트랜스페린 포화(%)는 약 50%까지 감소하였다(도 5). 투여한 지 21일 후에, TMPRSS6 유전자 발현은 약 40%까지 감소하였고; HAMP1 유전자 발현은 정상화되었으며; 트랜스페린 포화(%)에 의해 측정된 바와 같은 혈청 철 수준은 정상 수준으로 회복되기 시작하였다(도 5). 요약하면, TMPRSS6 mRNA 발현의 최대 넉다운은 투여한 지 24시간 후에 달성되었고, 투여한 지 3주 후까지 정상 발현 수준의 약 50%까지 회복되었으며; 헵시딘(hepcidin) mRNA 수준은 24시간에 이미 증가하였고, 투여한 지 7일 후까지 유지되었으며; 헵시딘 수준은 투여한 지 14일 후에 대조군 수준으로 회복되었고; 순환 철 수준의 지표로서의 트랜스페린 포화는 투여한 지 24시간에 이미 대조군 수준의 50%까지 감소하였고, 4주 무렵에 정상화되었다. 따라서 도 5에 제시된 데이터는 HAMP1 유전자 발현 및 혈청 철 수준에 대한 LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273) 매개 효과를 유지하기 위해서는 50% 초과의 TMPRSS6 침묵이 필요함을 보여준다.
WT C57BL/6 마우스에서 혈액학적 파라미터에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과.
헤모글로빈(HGB) 및 적혈구용적률을 포함하는 혈액학적 파라미터에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과를 평가하기 위해; WT C57BL/6 마우스에 TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273) 또는 LNP-Luc 대조군, 또는 PBS의 1㎎/㎏ 단일 용량을 투여하였고; 이후, 투여한 지 2주 후까지 상이한 시점에 희생시켰다. 헤모글로빈(HGB), 적혈구용적률, 평균 적혈구 용적(MCV), 평균 적혈구 혈색소량(MCH), 평균 적혈구 혈색소 농도(MCHC), 및 망상적혈구 헤모글로빈 함량(Chr)을 포함하는 혈액학적 파라미터를 Advia 120 분석기를 사용하여 검정하였다. 도 6a 및 도 6b에 도시된 바와 같이, Th3/+ 마우스에서 TMPRSS6의 침묵은 HGB 감소를 초래하였고(도 6a), WT C57BL/6 마우스에서 적혈구용적률 감소를 초래하였다(도 6b). 평균 적혈구 용적(MCV), 평균 적혈구혈 색소량(MCH), 평균 적혈구 혈색소 농도(MCHC), 및 망상적혈구 헤모글로빈 함량(Chr)에 대해 유사한 효과가 있었다.
실시예 6. 탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과.
탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 혈청 철 파라미터에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과.
탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 철 수준, 불포화 철-결합능(UIBC), 및 Tf 포화를 포함하는, 혈청 철 파라미터에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과를 평가하기 위해, 6주령의 Th3/+ 마우스에 1㎎/㎏의 LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273), 또는 LNP-Luc 대조군, 또는 PBS를 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였고, 투여한 지 2주 후에 마우스를 희생시켰다. 군당 5마리의 마우스를 사용하였고, 데이터는 평균 +/-표준 편차로서 도 7에 제시하였는데, **은 P-값<0.01을 의미하고 ***은 P-값<0.001을 의미한다. 도 7에 도시된 바와 같이, Th3/+ 마우스에서의 TMPRSS6의 침묵은 PBS 대조군과 비교하여 혈청 철, UIBC, 및 Tf 포화의 현저한 감소를 초래하였다.
탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 망상적혈구 및 적혈구 파라미터에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과.
탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 망상적혈구 수, 망상적혈구 헤모글로빈 함량(CHr), 및 적혈구 수(RBC)를 포함하는 망상적혈구 및 적혈구 파라미터에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과를 평가하기 위해; 6주령의 Th3/+ 마우스에 1㎎/㎏의 LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273), 또는 LNP-Luc 대조군, 또는 PBS를 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였고, 투여한 지 2주 후에 마우스를 희생시켰다. 망상적혈구 수, 망상적혈구 헤모글로빈 함량(CHr), 및 적혈구 수(RBC)를 포함하는 망상적혈구 및 적혈구 파라미터를 Advia 120 분석기를 사용하여 검정하였다. 군당 5마리의 마우스를 사용하였고, 데이터를 평균 +/- 표준 편차로서 도 8a 내지 도 8c에 제시하였는데, **은 P-값<0.01을 의미하고 ***은 P-값<0.001을 의미한다. 각각 도 8a 및 도 8b에 도시된 바와 같이, Th3/+ 마우스에서 TMPRSS6의 침묵은 망상적혈구의 헤모글로빈 함량(Chr)뿐만 아니라 망상적혈구의 수에서 현저한 감소를 초래하였다. 또한, Th3/+ 마우스에서 TMPRSS6의 침묵은 성숙한 적혈구의 수(RBC)에서 현저한 증가를 초래하였으며(도 8c), 이는 비효과적인 적혈구생성, 골수외조혈, 및 적혈구세포 생산에 있어서 현저한 개선을 나타낸다.
탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 혈액학적 파라미터에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과.
탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 적혈구용적률(HCT), 헤모글로빈(HGB), 적혈구 세포 분포 폭(RDW), 및 평균 적혈구 값(MCV)을 포함하는 혈액학적 파라미터에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과를 평가하기 위해; 6주령의 Th3/+ 마우스에 1㎎/㎏의 LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273), 또는 LNP-Luc 대조군, 또는 PBS를 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였고, 투여한 지 2주 후에 마우스를 희생시켰다. 적혈구용적률(HCT), 헤모글로빈(HGB), 적혈구 세포 분포 폭(RDW), 및 평균 적혈구 값(MCV)을 포함하는 혈액학적 파라미터를 Advia 120 분석기를 사용하여 검정하였다. 군당 5마리의 마우스를 사용하였고, 데이터를 평균 +/- 표준 편차로서 도 9에 제시하였는데, **은 P-값<0.01을 의미하고 ***은 P-값<0.001을 의미한다. Th3/+ 마우스에서의 TMPRSS6의 침묵은 HCT에서의 현저한 증가(도 9a), HGB에서의 현저한 증가(도 9b), RDW에서의 현저한 감소(도 9c), 및 MCV에서의 현저한 감소(도 9d)를 초래하였다. 도 9에 제시된 데이터는 LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273)의 투여 후 이들 혈액학적 파라미터에서의 β-탈라세미아 표현형의 정상화를 보여준다.
탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 말초 혈액 형태에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과.
탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 말초 혈액 형태에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과를 평가하기 위해; 6주령의 Th3/+ 마우스에 1㎎/㎏의 LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273) 또는 LNP-Luc 대조군을 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였고, 투여한 지 2주 후에 마우스를 희생시켰다. 10배 배율에서의 메이-그룬왈드/김자(May-Grunwald/Gimsa) 염색은 성숙한 적혈구 형태의 정상화를 향한 전체적 경향뿐만 아니라 감소된 망상적혈구 수를 나타내는 대조군에 비한 TMPRSS6 siRNA를 사용하여 처리된 Th3/+ 마우스에서의 다염성(polychromasia)에 있어서 뚜렷한 감소를 보였다. 10배 배율에서의 메이-그룬왈드/김자 염색은 또한 WT 대조군 동물과 비교하는 경우 WT TMPRSS6 siRNA 동물에 의해 약간의 적혈구대소부동증(anisocytosis)이 유도되었음을 보여주었다.
탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 비장 구조(splenic architecture)에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과.
탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 비장 구조에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과를 평가하기 위해; 6주령의 Th3/+ 마우스에 1㎎/㎏의 LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273), 또는 LNP-Luc 대조군, 또는 PBS를 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였고, 투여한 지 2주 후에 마우스를 희생시켰다. 10배 배율에서의 헤마톡실린 및 에오신(H＆E) 염색은 대조군과 비교하여 TMPRSS6 siRNA로 처리된 Th3/+ 마우스가 굴모양(sinusoidal) 골수외 적혈구생성에서의 감소 및 백색 속질 결절의 재현을 포함하는 비장 구조의 정상화를 갖는 것을 보여주었다.
탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 비장 및 간 철 함량에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과.
탈라세미아 마우스(Th3/+)에서의 비장 및 간 철 함량에 대한 TMPRSS6의 TMPRSS6 siRNA 매개 침묵의 효과를 평가하기 위해; 6주령의 Th3/+ 마우스에 1㎎/㎏의 LNP-TMPRSS6 siRNA-1(AD-46273), 또는 LNP-Luc 대조군, 또는 PBS를 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였고, 투여한 지 2주 후에 마우스를 희생시켰다. 군당 5마리의 마우스를 사용하였고, 데이터를 평균 +/- 표준 편차로서 도 10a 내지 도 10c에 제시하였는데, **은 P-값<0.01을 의미하고 ***은 P-값<0.001을 의미한다. Th3/+ 마우스에서의 TMPRSS6의 침묵은 비장 철 함량 및 비장 중량의 현저한 감소를 초래하였는데(각각 도 10a 및 도 10b), 이는 골수외 조혈의 정상화를 나타낸다. 간 철함량이 감소하는 성향이 또한 관찰되었으나, 이는 통계학적으로 유의하지는 않았다(도 10c).
상기 결과들은 제형화된 siRNA의 전신 투여에 의한 TMPRSS6의 침묵이 중간성 β-탈라세미아의 마우스 모델에서 표현형을 개선하기에 충분한 수준으로 HAMP 발현을 증가시킴을 입증한다. 따라서, LNP-TMPRSS6-siRNA가 비정상적으로 낮은 헵시딘 수준을 특징으로 하는 선천적인 철 과부하 장애(예를 들어, 중간성 β-탈라세미아 및 유전성 혈색소증)에 대해 개발되고 있다.
동등물
당업자는 본원에 기재된 발명의 특정 구현예들에 대한 많은 동등물들을 통상적인 것을 초과하지 않는 실험을 사용하여 인지하거나, 이해할 수 있을 것이다. 이러한 동등물들 하기 청구항에 포함시키고자 한다.
SEQUENCE LISTING <110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF TMPRSS6 GENE <130> IF13P180/US <150> US 61/568,942 <151> 2011-12-09 <150> US 61/468,830 <151> 2011-03-29 <160> 611 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3212 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cttgagccag acccagtcca gctctggtgc ctgccctctg gtgcgagctg acctgagatg 60 cacttccctc ctctgtgagc tgtctcggca cccacttgca gtcactgccg cctgatgttg 120 ttactcttcc actccaaaag gatgcccgtg gccgaggccc cccaggtggc tggcgggcag 180 ggggacggag gtgatggcga ggaagcggag ccggagggga tgttcaaggc ctgtgaggac 240 tccaagagaa aagcccgggg ctacctccgc ctggtgcccc tgtttgtgct gctggccctg 300 ctcgtgctgg cttcggcggg ggtgctactc tggtatttcc tagggtacaa ggcggaggtg 360 atggtcagcc aggtgtactc aggcagtctg cgtgtactca atcgccactt ctcccaggat 420 cttacccgcc gggaatctag tgccttccgc agtgaaaccg ccaaagccca gaagatgctc 480 aaggagctca tcaccagcac ccgcctggga acttactaca actccagctc cgtctattcc 540 tttggggagg gacccctcac ctgcttcttc tggttcattc tccaaatccc 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65 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 65 cagucugcgu guacucaau 19 <210> 66 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 66 auugaguaca cgcagacug 19 <210> 67 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 67 ugcguguacu caaucgcca 19 <210> 68 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 68 uggcgauuga guacacgca 19 <210> 69 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 69 cguguacuca aucgccacu 19 <210> 70 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 70 aguggcgauu gaguacacg 19 <210> 71 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 71 guguacucaa ucgccacuu 19 <210> 72 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 72 aaguggcgau ugaguacac 19 <210> 73 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 73 guacucaauc gccacuucu 19 <210> 74 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 74 agaaguggcg auugaguac 19 <210> 75 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 75 cacuucuccc aggaucuua 19 <210> 76 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 76 uaagauccug ggagaagug 19 <210> 77 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens 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90 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 90 uuggcgguuu cacugcgga 19 <210> 91 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 91 ccgcagugaa accgccaaa 19 <210> 92 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 92 uuuggcgguu ucacugcgg 19 <210> 93 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 93 cgccugggaa cuuacuaca 19 <210> 94 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 94 uguaguaagu ucccaggcg 19 <210> 95 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 95 gccugggaac uuacuacaa 19 <210> 96 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 96 uuguaguaag uucccaggc 19 <210> 97 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 97 cugggaacuu acuacaacu 19 <210> 98 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 98 aguuguagua aguucccag 19 <210> 99 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 99 uacaacucca gcuccgucu 19 <210> 100 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 100 agacggagcu ggaguugua 19 <210> 101 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 101 acaacuccag cuccgucua 19 <210> 102 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 102 uagacggagc uggaguugu 19 <210> 103 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 103 aacuccagcu ccgucuauu 19 <210> 104 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 104 aauagacgga gcuggaguu 19 <210> 105 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 105 uuuggggagg gaccccuca 19 <210> 106 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 106 ugaggggucc cuccccaaa 19 <210> 107 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 107 ggaccccuca ccugcuucu 19 <210> 108 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 108 agaagcaggu gaggggucc 19 <210> 109 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 109 gcuucuucug guucauucu 19 <210> 110 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 110 agaaugaacc agaagaagc 19 <210> 111 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 111 ucuucugguu cauucucca 19 <210> 112 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 112 uggagaauga accagaaga 19 <210> 113 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 113 agcaccgccg gcugaugcu 19 <210> 114 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 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19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 151 ucauggcggu cgucuggaa 19 <210> 152 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 152 uuccagacga ccgccauga 19 <210> 153 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 153 gcuacuacga ccccuucgu 19 <210> 154 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 154 acgaaggggu cguaguagc 19 <210> 155 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 155 ccgugcagcc gguggucuu 19 <210> 156 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 156 aagaccaccg gcugcacgg 19 <210> 157 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 157 ucuuccaggc cugugaagu 19 <210> 158 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 158 acuucacagg ccuggaaga 19 <210> 159 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 159 gccugugaag ugaaccuga 19 <210> 160 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 160 ucagguucac uucacaggc 19 <210> 161 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 161 gugaagugaa ccugacgcu 19 <210> 162 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 162 agcgucaggu ucacuucac 19 <210> 163 <211> 19 <212> RNA 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<400> 457 acgcuggguu guuaccgcut t 21 <210> 458 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 458 agcgguaaca acccagcgut t 21 <210> 459 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 459 cagaaguaug auuugccgut t 21 <210> 460 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 460 acggcaaauc auacuucugt t 21 <210> 461 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 461 cgcugaccgc ugggugauat t 21 <210> 462 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 462 uaucacccag cggucagcgt t 21 <210> 463 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 463 ucugguauuu ccuaggguat t 21 <210> 464 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 464 uacccuagga aauaccagat t 21 <210> 465 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 465 ccuacagggc 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 478 cuggguuguu accgcuacat t 21 <210> 479 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 479 uguagcggua acaacccagt t 21 <210> 480 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 480 ugcacuaugg cuuguacaat t 21 <210> 481 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 481 uuguacaagc cauagugcat t 21 <210> 482 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 490 ugugaugggg ucaaggacut t 21 <210> 491 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 491 aguccuugac cccaucacat t 21 <210> 492 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 492 cuggagaggu guccuucaat t 21 <210> 493 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 493 uugaaggaca ccucuccagt t 21 <210> 494 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 494 uccgcaguga aaccgccaat t 21 <210> 495 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 495 uuggcgguuu cacugcggat t 21 <210> 496 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 496 gggccgagua cgaaguggat t 21 <210> 497 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 497 uccacuucgu acucggccct t 21 <210> 498 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 498 ggaccgacug gccauguaut t 21 <210> 499 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 499 auacauggcc agucggucct t 21 <210> 500 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 500 caacggccug gaugagagat t 21 <210> 501 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 501 ucucucaucc aggccguugt t 21 <210> 502 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 502 aguugauccc acaggaccut t 21 <210> 503 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 503 agguccugug ggaucaacut t 21 <210> 504 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 504 ccgcagugaa accgccaaat t 21 <210> 505 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 505 uuuggcgguu ucacugcggt t 21 <210> 506 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 514 aaaccgccaa agcccagaat t 21 <210> 515 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 515 uucugggcuu uggcgguuut t 21 <210> 516 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 516 cagugugaaa gacauagcut t 21 <210> 517 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 517 agcuaugucu uucacacugt t 21 <210> 518 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 518 cccucucugg acuacggcut t 21 <210> 519 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 519 agccguaguc cagagagggt t 21 <210> 520 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 520 guucgggguc gacacaucut t 21 <210> 521 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 521 agaugugucg accccgaact t 21 <210> 522 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 522 ugugugccgg cuaccgcaat t 21 <210> 523 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 523 uugcgguagc cggcacacat t 21 <210> 524 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 524 gcuucuucug guucauucut t 21 <210> 525 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 525 agaaugaacc agaagaagct t 21 <210> 526 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: 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oligonucleotide <400> 530 ucgcugaccg cugggugaut t 21 <210> 531 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 531 aucacccagc ggucagcgat t 21 <210> 532 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 532 aguggugacc ugaggaacut t 21 <210> 533 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 533 aguuccucag gucaccacut t 21 <210> 534 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 534 caagcagggg gacaaguaut t 21 <210> 535 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 535 auacuugucc cccugcuugt t 21 <210> 536 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 536 ugaugucugc uccagugaut t 21 <210> 537 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 537 aucacuggag cagacaucat t 21 <210> 538 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 538 cuaacuuggg aucugggaat t 21 <210> 539 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 539 uucccagauc ccaaguuagt t 21 <210> 540 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 540 ugguauuucc uaggguacat t 21 <210> 541 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 541 uguacccuag gaaauaccat t 21 <210> 542 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 542 gagguguccu ucaaggugat t 21 <210> 543 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 543 ucaccuugaa ggacaccuct t 21 <210> 544 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 544 aagcaggggg acaaguauut t 21 <210> 545 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 545 aauacuuguc ccccugcuut t 21 <210> 546 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 546 cagcuggggg ucaagacgut t 21 <210> 547 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 547 acgucuugac ccccagcugt t 21 <210> 548 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 548 cuugggaucu gggaauggat t 21 <210> 549 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 549 uccauuccca gaucccaagt t 21 <210> 550 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 550 gguauuuccu aggguacaat t 21 <210> 551 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 551 uuguacccua ggaaauacct t 21 <210> 552 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 552 ggcuaccgca agggcaagat t 21 <210> 553 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 553 ucuugcccuu gcgguagcct t 21 <210> 554 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 554 gcagggggac aaguauucut t 21 <210> 555 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 555 agaauacuug ucccccugct t 21 <210> 556 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 556 gcucagcagc aagaaugcut t 21 <210> 557 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 557 agcauucuug cugcugagct t 21 <210> 558 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 558 uugggaucug ggaauggaat t 21 <210> 559 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 559 uuccauuccc agaucccaat t 21 <210> 560 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 560 ccaaagccca gaagaugcut t 21 <210> 561 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 561 agcaucuucu gggcuuuggt t 21 <210> 562 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 562 gcuaccgcaa gggcaagaat t 21 <210> 563 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 563 uucuugcccu ugcgguagct t 21 <210> 564 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 564 ugguggcagg agguggcaut t 21 <210> 565 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 565 augccaccuc cugccaccat t 21 <210> 566 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 566 cccacucugu acagaggcut t 21 <210> 567 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 567 agccucugua cagagugggt t 21 <210> 568 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 568 cucacagccc agacccucat t 21 <210> 569 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 569 ugagggucug ggcugugagt t 21 <210> 570 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 570 ccucucugga cuacggcuut t 21 <210> 571 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 571 aagccguagu ccagagaggt t 21 <210> 572 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 572 guggcaggag guggcaucut t 21 <210> 573 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 573 agaugccacc uccugccact t 21 <210> 574 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 574 uucggaagcc ccuggucuat t 21 <210> 575 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 575 uagaccaggg gcuuccgaat t 21 <210> 576 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 576 agcucagcug cccuuuggat t 21 <210> 577 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 577 uccaaagggc agcugagcut t 21 <210> 578 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 578 ggccuggaug agagaaacut t 21 <210> 579 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 579 aguuucucuc auccaggcct t 21 <210> 580 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 580 uggcaggagg uggcaucuut t 21 <210> 581 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 581 aagaugccac cuccugccat t 21 <210> 582 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 582 ucggaagccc cuggucuaat t 21 <210> 583 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 583 uuagaccagg ggcuuccgat t 21 <210> 584 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 584 gcucagcugc ccuuuggaat t 21 <210> 585 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 585 uuccaaaggg cagcugagct t 21 <210> 586 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 586 acugugacug uggccuccat t 21 <210> 587 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 587 uggaggccac agucacagut t 21 <210> 588 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 588 aggagguggc aucuugucut t 21 <210> 589 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 589 agacaagaug ccaccuccut t 21 <210> 590 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 590 ccccuggucu aacuugggat t 21 <210> 591 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 591 ucccaaguua gaccaggggt t 21 <210> 592 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 592 ucagcugccc uuuggaauat t 21 <210> 593 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 593 uauuccaaag ggcagcugat t 21 <210> 594 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 594 ucggggucga cacaucugut t 21 <210> 595 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 595 acagaugugu cgaccccgat t 21 <210> 596 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 596 gucccugaug ucugcuccat t 21 <210> 597 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 597 uggagcagac aucagggact t 21 <210> 598 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 598 cccuggucua acuugggaut t 21 <210> 599 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 599 aucccaaguu agaccagggt t 21 <210> 600 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 600 cagcugcccu uuggaauaat t 21 <210> 601 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 601 uuauuccaaa gggcagcugt t 21 <210> 602 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 602 ucaucgcuga ccgcugggut t 21 <210> 603 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 603 acccagcggu cagcgaugat t 21 <210> 604 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 604 ccuggagagg uguccuuca 19 <210> 605 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 605 ugaaggacac cucuccagg 19 <210> 606 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 606 caacggccug gaugagaga 19 <210> 607 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 607 ucucucaucc aggccguug 19 <210> 608 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 608 aguggugacc ugaggaacu 19 <210> 609 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 609 aguuccucag gucaccacu 19 <210> 610 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 610 cagcugcccu uuggaauaa 19 <210> 611 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 611 uuauuccaaa gggcagcug 19

Claims (31)

  1. 세포 내에서 TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 리보핵산(dsRNA)으로서,
    상기 dsRNA가 이중-가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고,
    상기 안티센스 가닥이 뉴클레오티드 서열 AGAAUGAACCAGAAGAAGC (SEQ ID NO: 110)과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하며,
    상기 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 상기 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고,
    적어도 하나의 가닥이 리간드에 컨쥬게이션 되는, 이중-가닥 리보핵산(dsRNA).
  2. 세포 내에서 TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 리보핵산(dsRNA)으로서,
    상기 dsRNA가 이중-가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고,
    상기 안티센스 가닥이 뉴클레오티드 서열 AGAAUGAACCAGAAGAAGC (SEQ ID NO: 110)과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 16개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하며,
    상기 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 상기 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고,
    적어도 하나의 가닥이 리간드에 컨쥬게이션 되는, 이중-가닥 리보핵산(dsRNA).
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 가닥이 독립적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드 길이인, dsRNA.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 가닥이 독립적으로 15 내지 25개의 뉴클레오티드 길이인, dsRNA.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 가닥이 독립적으로 19 내지 24개의 뉴클레오티드 길이인, dsRNA.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 가닥이 독립적으로 19 내지 21개의 뉴클레오티드 길이인, dsRNA.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 가닥이 30개 이하의 뉴클레오티드 길이인, dsRNA.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드 및 상기 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드인, dsRNA.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드기에 연결된 말단 뉴클레오티드, 잠김 뉴클레오티드(locked nucleotide), 무염기(abasic) 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포라미데이트, 및 비-자연 염기를 포함하는 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는, dsRNA.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 무염기(abasic) 뉴클레오티드, 및 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되는, dsRNA.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 가닥이 적어도 1개의 뉴클레오티드의 오버행을 포함하는, dsRNA.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 dsRNA는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 더 포함하는, dsRNA.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리간드는 N-아세틸갈락토사민 (N-acetylgalactosamine, GalNAc)을 포함하는, dsRNA.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리간드는 하기 화학식 II의 구조를 포함하는 탄수화물 컨쥬게이트를 포함하는, dsRNA:
    Figure 112022030126415-pat00057
    .
  15. 제1항의 dsRNA를 포함하며, TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 장애를 갖는 인간 피검체의 치료에 사용하기 위한 것이고, 상기 TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 장애는 혈색소증, β-탈라세미아(β-thalassemia) 또는 중간성 β-탈라세미아(β-thalassemia intermedia)인, TMPRSS6 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물.
  16. 제2항의 dsRNA를 포함하며, TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 장애를 갖는 인간 피검체의 치료에 사용하기 위한 것이고, 상기 TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 장애는 혈색소증, β-탈라세미아(β-thalassemia) 또는 중간성 β-탈라세미아(β-thalassemia intermedia)인, TMPRSS6 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 장애는 혈색소증인, 약학적 조성물.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 장애는 β-탈라세미아(β-thalassemia)인, 약학적 조성물.
  19. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 TMPRSS6 발현에 의해 매개되는 장애는 중간성 β-탈라세미아(β-thalassemia intermedia)인, 약학적 조성물.
  20. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 dsRNA는 피하 투여 또는 정맥내 투여로 투여되는, 약학적 조성물.
  21. (a) 시험관 내(in vitro)에서 제1항 또는 제2항의 dsRNA를 세포로 도입시키는 단계; 및
    (b) TMPRSS6 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 달성함으로써 상기 세포에서 TMPRSS6 유전자의 발현을 억제하는 시간 동안 단계 (a)에서 생성된 세포를 유지시키는 단계를 포함하는, 세포에서 TMPRSS6 발현을 억제하는 시험관 내(in vitro) 방법.
  22. 제21항에 있어서, TMPRSS6 발현이 적어도 30%까지 억제되는, 방법.
  23. 제1항 또는 제2항의 dsRNA의 약학적 유효량을 유효성분으로 포함하는 철 항상성 장애 질환의 치료용 약학적 조성물로서, 상기 철 항상성 장애 질환은 혈색소증과 관련된 질환, β-탈라세미아(β-thalassemia), 및 중간성 β-탈라세미아(β-thalassemia intermedia)로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 조성물은 피검체의 혈청 내의 철을 10% 이상 감소시키는, 약학적 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 상기 조성물은 0.01 ㎎/㎏(피검체의 체중) 내지 5 ㎎/㎏(피검체의 체중)의 dsRNA의 양으로 투여되는, 약학적 조성물.
  26. 제1항 또는 제2항의 dsRNA를 포함하는 세포.
  27. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 센스 가닥의 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 뉴클레오티드 및 상기 안티센스 가닥의 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인, dsRNA.
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