DE60119562T2

DE60119562T2 - Verbesserte synthese von purin-blockierten nukleinsäure-analoga

Info

Publication number: DE60119562T2
Application number: DE60119562T
Authority: DE
Inventors: Troels Koch; Reissig Flemming JENSEN
Original assignee: Santaris Pharma AS
Current assignee: Roche Innovation Center Copenhagen AS
Priority date: 2000-10-04
Filing date: 2001-10-04
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2021-10-05
Also published as: US6998484B2; EP1334109A2; US20020086998A1; ATE325806T1; WO2002028875A2; DE60119562D1; JP4413493B2; AU2001293687A1; JP2004510779A; DK1334109T3; EP1334109B1; WO2002028875A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Strategie zur Synthese von Purin-LNA-(Locked Nucleic Acid)-Analogen, die höhere Gesamtausbeuten ergibt und somit kostengünstiger ist als vorher bekannte Verfahren zur Synthese von Purin-LNA-Analogen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Über Synthesen von Purin-LNA-(Locked Nucleic Acid)-Monomeren wurde zuerst von Wengel et al. (Singh, S. K.; Nielsen, P., Koshkin, A. A. und Wengel, J., Chem. Commun., 1998, 455; Koshkin, A. A.; Singh, S. K.; Nielsen, P.; Rajwanshi, V. K.; Kumar, R.; Melgaard, M.; Olsen, C. E. und Wengel, J., Tetrahedron, 1998. 54, 3607) berichtet. Die beiden Purin-LNA-Monomere (1S, 3R, 4R, 7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-(2-N-isobutyrylguanin-9-yl und 6-N-benzoyladenin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan wurden unter Verwendung einer konvergenten Strategie in 5 Schritten aus dem entscheidenden Zwischenprodukt 4-C-Acetoxymethyl-l,2-di-O-acetyl-3,5-di-O-benzyl-O-ribofuranose synthetisiert. Die Glykosylierung des entscheidenden Zwischenprodukts mit silyliertem 2-N-Isobutyrylguanin und 6-N-Benzoyladenin ergab die 4'-C-Acetoxymethylguanin- bzw. Adeninnucleoside, die nach Entacetylierung und Monotosylierung mit anschließendem baseninduzierten Ringschluss die entsprechenden 2'-O,4'-C-Methylenbicyclonucleoside ergaben. Die abschließende Entbenzylierung lieferte (1S, 3R, 4R, 7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-(2-N-isobutyrylguanin-9-yl und 6-N-benzoyladenin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan mit einer Gesamtausbeute von 16 % bzw. 14 % (aus dem entscheidenden Zwischenprodukt berechnet). Die niedrige Gesamtausbeute ist in erster Linie die Folge der Glykosylierungsreaktionen, die bei einer Ausbeute von 50 % isomere Gemische aus Nucleosidanalogen ergeben, und des anschließenden innermolekularen Ringschlusses des C-verzweigten Kohlenhydrats, dessen Verarbeitung eine Ausbeute von weniger als 44 % ergibt. Für die Synthese von Thymin-, Uracil- und 4-N-Benzoylcytosin-LNA-Nucleosidanalogen wurden analoge Syntheseverfahren eingesetzt ( EP 1 013 661 ).
Über eine analoge konvergente Synthese von (1S, 3R, 4R, 7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(2-N-isobutyrylguanin-9-yl und Adenin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan wurde von Pfundheller, H. M. et al (Lomholt, C., Koshkin, A. A., Fensholdt, J., Meldgaard, M., und Pfundheller, H. M., Poster vorgestellt beim XIV International Roundtable Nucleoside and Nucleotides and Their Biological Applications, 10.–14. September 2000; San Francisco, USA), berichtet. Ausgehend von dem entscheidenden Zwischenprodukt 1,2-Di-O-acetyl-3-O-benzyl-4-C-methansulfonylmethyl-5-O-methansuffonyl-D-ribofuranose wurden bei einer Gesamtausbeute von 50 % Purin-LNA-Monomere erhalten. Diese Strategie weist jedoch noch den Nachteil auf, dass es in der Glykosylierungsreaktion zur Bildung von isomeren Gemischen kommt, die mit Hilfe von chromatographischen Verfahren getrennt werden müssen.
Charakteristische Eigenschaften der oben erörterten, bekannten Strategien sind relativ niedrige Gesamtausbeuten, viele Syntheseschritte und die Notwendigkeit des Einsatzes von chromatographischen Verfahren zur Trennung von isomeren Gemischen. Somit ist es dringend erforderlich, eine effektivere Synthesestrategie für Purin-LNA-Analoge zu entwickeln, die zu einer Verbesserung der Gesamtausbeute und einer Verringerung der Produktionskosten führt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liefert eine neue Strategie für die Synthese von Purin-LNA-Analogen, die eine regioselektive 9-N-Puringlykosylierungsreaktion mit anschließender nucleophiler aromatischer Eintopfsubstitutionsreaktion des 6-Substituenten im Purinring und gleichzeitigem nucleophilinduzierten innermolekularen Ringschluss des C-verzweigten Kohlenhydrats zur Bildung neuartiger Purin-LNA-Analoge umfasst. Die neue Strategie wird anhand der Synthese der neuartigen Verbindung (1S,3R,4R,7S)-7-Benzyloxy-1-methansulfonylmethyl-3-(guanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan, die nach Isobutyrylschutz der 2-Aminopuringruppe und anschließender Substitution von 1-Methansulfonyl mit Benzoat, Entbenzoylierung und Entbenzylierung leicht in (1S,3R,4R,7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-((2-N-isobutyrylguanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan umgewandelt werden kann, gezeigt. Die neue Strategie kann ohne weiteres auf die Synthese von Purin-LNAs ausgedehnt werden, die andere 6-substitutierte Analoge enthalten, und lässt sich außerdem noch auf andere Heteroatome in der bicyclischen Verbindung, wie beispielsweise Stickstoff und Schwefel, und nicht nur auf Sauerstoff ausdehnen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Synthese von neuartigen Purin-LNA-Analogen mit der allgemeinen Formel I,
wobei die beiden geminalen Substituenten J¹ und J² zusammen Oxo oder Thion darstellen, und bei getrennter Betrachtung einer von ihnen OR⁹, NR¹⁰R¹¹, oder SR¹², und der andere zusammen mit J³ eine Doppelbindung darstellt; wenn J¹ und J² Oxo oder Thion darstellen, stellt J³ Wasserstoff dar;
W aus NR¹R², OR³ und SR⁴ ausgewählt wird;
A¹, A², A³, und A⁴ unabhängig voneinander aus -O-, -S- und -NR¹³- ausgewählt werden, wobei R¹³ aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C_1-8-Alkyl und gegebenenfalls substituiertem (C_1-8-Alkyl)carbonyl ausgewählt wird;
jeder der Substituenten R¹, R², R³, R⁴, R⁹, R¹⁰, R¹¹ und R¹² unabhängig voneinander aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem C_1-12-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkynyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl, gegebenenfalls substituiertem Aryl(C_1-6-Alkyl), gegebenenfalls substituiertem Arylcarbonyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl(C_1-6Alkyl)-Carbonyl, gegebenenfalls substituiertem C_1-12-Alkylcarbonyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkenylcarbonyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkynylcarbonyl, gegebenenfalls substituiertem Arylsulfonyl, gegebenenfalls substituiertem C_1-12-Alkylsulfonyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkenylsulfonyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12Alkynylsulfonyl, C_1-12-Alkoxycarbonyl, Formyl, Tetrahydropyan-2-yl, gegebenenfalls substituiertem Heteroaryl, gegebenenfalls substituiertem Heteroarylcarbonyl, Carbamoyl und "aktiven/funktionellen" Gruppen der allgemeinen Form M-K ausgewählt wird, wobei M der "aktive/funktionelle" Teil der betreffenden Gruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelatgruppen, Reportergruppen und Liganden, und wobei K ein Spacer ist, durch den der "aktive/funktionelle" Teil am Purinring angebracht ist, und wobei K ein optionaler Spacer ist, der 1–50 Atome umfasst;
R⁵ aus gegebenenfalls substituiertem Alkylsulfonyl, gegebenenfalls substituiertem Arylsulfonyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl(C_1-6Alkyl), gegebenenfalls substituiertem Arylcarbonyl und Tri(alkyl/aryl)silyl ausgewählt wird;
R⁶ aus gegebenenfalls substituiertem Aryl(C_1-6-Alkyl), gegebenenfalls substituiertem Tetahydropyran-2-yl, gegebenenfalls substituiertem Arylcarbonyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl und Tri(alkyl/aryl)silyl ausgewählt wird;
R⁵ und R⁶ zusammen auch Dialkyldisiloxanyliden darstellen können; und
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 ist;
wobei das Verfahren den folgenden Schritt umfasst:
Behandlung einer Verbindung (nachfolgend als "entscheidendes Zwischenprodukt" bezeichnet) mit der allgemeinen Formel II:
in der A¹, A², A³, A⁴, R⁵, R⁸, R¹³, W und n wie oben definiert sind;
A⁵ aus -O-, -S- und -NR¹³- ausgewählt wird;
R⁷ aus gegebenenfalls substituiertem Alkylsulfonyl und gegebenenfalls substituiertem Arylsulfonyl ausgewählt wird,
R⁸ aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem (C_1-6-Alkyl)carbonyl, gegebenenfalls substituiertem Arylcarbonyl, Tri(alkyl/aryl)silyl und Fluorenyl(C_1-6-Alkyl)oxycarbonyl ausgewählt wird; und
X aus Halogen, CN, gegebenenfalls substituiertem Sulfonyl und gegebenenfalls substituiertem Arylsulfonyl ausgewählt wird;
mit einem nucleophilen Reagens.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf neuartige Verbindungen mit der oben definierten allgemeinen Formel II sowie auf in den Ansprüchen 30–32 definierte Verbindungen.
Die vorliegende Erfindung hat die folgenden wesentlichen Vorteile:

– Nucleophile Eintopfsubstitutionsreaktion von Purin-6-hatid (oder einer ähnlichen Verbindung) und gleichzeitiger nucleophilinduzierter innermolekularer Ringschluss des C-verzweigten Kohlenwasserstoffes mit Bildung neuartiger Purin-LNA-Analoge.
– Bequemer Zugang zu Purine-LNA-Analogen, die eine Vielzahl von Substituenten in der aromatischen 6-Position umfassen.
– Bequemer Zugang zu Purin-LNA-Monomeren, die eine Oligomerisation zulassen.
– Regioselektive 9-N-Puringlykosylierung des Ausgangsmaterials mit der allgemeinen Formel III, die die chromatographische Trennung der Nucleinsäureisomere überflüssig macht.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In dem Bestreben, die Synthese von Purin-LNA-Analogen zu verbessern, wurde eine neue Strategie für die regioselektive 9-N-Puringlykosylierung und den innermolekularen Ringschluss entwickelt. Mit Hilfe dieser neuen Synthesestrategie wurde (1S,3R,4R,7S)-7-Benzyloxy-1-methansulfonylmethyl-3-(guanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1)heptan bei einer hohen Ausbeute in nur zwei Schritten aus 1,2-Di-O-acetyl-3-O-benzyl-4-C-methansulfonylmethyl-5-O-methansulfonyl-D-ribofuranose synthetisiert. Die regioselektive Glykosylierung von 1,2-Di-O-acetyl-3-O-benzyl-4-C-methansulfonylmethyl-5-O-methansulfonyl-D-ribofuranose wurde unter Einsatz von 2-Amino-6-chlorpurin als heterocyclische Base in einer "Eintopf"-Vorbruggen-Glykosylierungsreaktion durchgeführt, wobei sich als einziges Produkt 9-N-Purinnucleinsäureisomer ergab. Die Tatsache, dass die Glykosylierungsreaktion zugunsten des 9-N-Purinnucleinsäureisomers regioselektiv vonstatten geht und dass die anschließende nucleophile Substitution des 6-Chlorpurins in einer Eintopfreaktion zusammen mit dem nucleophilinduzierten Ringschluss des C-verzweigten Kohlenwasserstoffes durchgeführt werden kann, macht diese neue Synthese bequemer und kostengünstiger als bisher bekannte Strategien. Diese neue Synthesestrategie bietet außerdem bequemen Zugang zu Purin-LNA-Analogen, die eine Vielzahl von Substituenten in der 6-Position sowie Purin-LNA-Monomere, die für die Oligomerisation geeignet sind, umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Purin-LNA-Analogen mit der oben definierten allgemeinen Formel I:
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Behandlung des entscheidenden Zwischenprodukts mit der oben definierten allgemeinen Formel II:
mit einem nucleophilen Reagens.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird das nucleophile Reagens aus gegebenenfalls substituiertem Hydroxy(C_1-6-Alkan), gegebenenfalls substituiertem Phenol, gegebenenfalls substituiertem Hydroxy(C_1-6-Alkyl)benzol, NH₃, gegebenenfalls substituiertem Amino(C_1-6-Alkan), gegebenenfalls substituiertem Anilin, gegebenenfalls substituiertem Amino(C_1-6-Alkyl)benzol, gegebenenfalls substituiertem Thio(C_1-6-Alkan), gegebenenfalls substituiertem Benzolthiol, gegebenenfalls substituiertem Thio(C_1-6-alkyl)benzol, M-K-OH, M-K-NH₂ und M-K-SH (wobei M beispielsweise ein Flurophor ist (wie beispielsweise Flourescein, Pyren, Anthracen, usw.), Biotin, Anthraginonyl usw. ausgewählt, und K ist -(CH₂)_n- wie es beispielsweise nachstehend beschrieben ist). Es wird derzeit angenommen, dass 3-Hydroxypropionitril, NH₃, 3-Mercaptopropionitril, Benzylalkohol, 2-Hydroxy-ethylbenzol, 2-Nydroxy-1-nitroethan und Benzylamin, insbesondere 3-Hydroxypropionitril, die am besten geeigneten Nucleophilen sind.
Das molare Verhältnis zwischen der Verbindung II und dem nucleophilen Reagens liegt typischerweise im Bereich von 1:2 bis 1:10, vorzugsweise von 1:2–1:8, am besten von 1:2–1:6.
Auf der Grundlage der vorliegenden Erfindung sollte einem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein, dass, wenn einige der nucleophilen Reagenzien in einer überschüssigen Menge eingesetzt werden, dies eine zusätzliche Eliminierungsreaktion des sich zu Beginn gebildeten Substitutionsprodukts bewirken kann, so dass man 6-oxo- und 6-thio-Purin-LNA-Analoge erhält. Ein Merkmal dieser nucleophilen Reagenzien ist, dass sie einen azidischen α-Wasserstoff enthalten, der sich an einer β-Eliminierungsreaktion beteiligen kann, wie beispielsweise 3-Hydroxypropionitril, 3-Mercaptopropionitril, 2-Hydroxy-ethylbenzol, 2-Hydroxy-1-nitroethan.
Die Behandlung der Verbindung II mit dem nucleophilen Reagens wird typischerweise bei –30°C bis 100°C, zum Beispiel bei –20°C bis 60°C, durchgeführt.
Es versteht sich, dass die Behandlung der Verbindung II mit dem nucleophilen Reagens in Anwesenheit einer nichtnucleophilen starken Base, wie beispielsweise NaH, LiH, Lithiumdiisopropylamid und Lithium-tert-butoxid, durchgeführt werden kann. Durch die Anwesenheit einer nichtnucleophilen starken Base kommt es zur Bildung des gewünschten Nucleophils. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird die Behandlung in Anwesenheit von NaH oder LiH, vorzugsweise NaH, durchgeführt.
Für einen Fachmann auf diesem Gebiet dürfte es auch offensichtlich sein, dass die Behandlung der Verbindung II mit dem nucleophilen Reagens typischerweise in Anwesenheit eines Lösungsmittels, wie beispielsweise Pyridintetrahydrofuran, Toluol, Xylol, Benzol, Diethylether, Acetonitril, Triethylamin, N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dichlormethan und 1,2-Dichlorethan, vorzugsweise Tetrahydrofuran, durchgeführt wird.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung verkörpert jeder der Substituenten A¹, A², A³, A⁴ und A⁵ -O-. In dem Ausführungsbeispiel, in dem einer oder mehrere der Substituenten A¹, A², A³, A⁴ und A⁵ -NR¹³- verkörpern, verkörpert R¹³ vorzugsweise Wasserstoff oder Methyl, und am besten Wasserstoff.
In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung verkörpert W OH, SH oder NH₂, vorzugsweise NH₂.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung verkörpern J¹ und J² zusammen Oxo oder Thion, vorzugsweise Oxo, und J³ verkörpert Wasserstoff.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel verkörpert J¹ OR⁹, NR¹⁰R¹¹, oder SR¹², und J² verkörpert gemeinsam mit J³ eine Doppelbindung.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird X aus Chlor, Fluor, Brom, Iod, CN, Methansulfonyl, α-Toluolsulfonyl, vorzugsweise Chlor, ausgewählt.
n ist eine ganze Zahl von 1 bis 3, wie beispielsweise 1, 2 oder 3, und vorzugsweise ist n 1.
Jeder der Substituenten R¹, R², R³, R⁴, R⁹, R¹⁰, R¹¹ und R¹² wird vorzugsweise getrennt aus Wasserstoff, Methyl, Trifluormethyl, Ethyl, Propyl, Isopropryl, Butyl, t-Butyl, Pentyl, Cyclopentyl, Hexyl, Cyclohexyl, Phenyl, Benzyl, Phertylethyl, ortho-, meta-, und para-Methylbenzyl, 2-Chlorbenzyl, 4-Phenylbenzyl, 2-Cyanethyl und "aktiven/funktionellen" Gruppen ausgewählt, wobei M Psoralane, Ethidiumbromid, Acridin, Anthraquinon, Biotin, Rhodamin oder Fluorescein und K Polyethylenglycol, Polymethylen usw. bezeichnet.
In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung bezeichnet K eine Einfachbindung, so dass der "aktive/funktionelle" Teil der betreffenden Gruppe direkt am Purinring angelagert wird.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung verkörpert jeder der Substituenten R⁶ und R⁷ getrennt Methansulfonyl, Trifluormethansulfonyl, Ethansulfonyl, 2,2,2-Trifluorethansulfonyl, Propansulfonyl, Isopropansulfonyl, Butansulfonyl, Nonafluorbutansulfonyl, Pentansulfonyl, Cyclopentansulfonyl, Hexansulfonyl, Cyclohexansulfonyl, α-Toluolsulfonyl, 2-Chlor-α-Toluolsulfonyl, ortho-, meta-, para-Toluolsulfonyl, Benzolsulfonyl, ortho-, meta-, para-Brombenzolsulfonyl oder ortho-, meta-, para-Nitrobenzolsulfonyl.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung verkörpern R⁶ und R⁷ Methansulfonyl, Trifluormethansulfonyl, Ethansulfonyl, 2,2,2-Trifluorethansulfonyl, Butansulfonyl, Nonafluorbutansulfonyl, α-Toluolsulfonyl, para-Toluolsulfonyl, Benzolsulfonyl, para-Brombenzolsulfonyl, para-Nitrobenzolsulfonyl, Trimethylsilyl, tert-Butyldimethylsilyl, tert-Butyldiphenylsilyl, tert-Butylmethoxyphenylsilyl und tert-Butoxydiphenylsilyl, vorzugsweise Methansulfonyl, Trifluormethansulfonyl, para-Toluolsulfonyl und para-Brombenzolsulfonyl, besser Methansulfonyl und para-Toluolsulfonyl und am besten Methansulfonyl.
In einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung sind R⁵ und R⁷ identisch und werden aus Methansulfonyl, Trifluormethansulfonyl, Ethansuffonyl. 2,2,2-Trifluorethansulfonyl, Butansulfonyl, Nonafluorbutansulfonyl, α-Toluolsulfonyl, para-Toluolsulfonyl, Benzolsulfonyl, para-Brombenzolsulfonyl und para-Nitrobenzolsulfonyl, vorzugsweise Methansulfonyl, Trifluormethansulfonyl, para-Toluolsulfonyl und para-Brombenzolsulfonyl, besser Methansulfonyl und para-Toluolsulfonyl, und am besten Methansulfonyl, ausgewählt.
Einige bevorzugte Ausführungsbeispiele von R⁶ umfassen Benzyl, ortho-, meta-, para-Methylbenzyl, 2-Chlorbenzyl, 4-Phenylbenzyl, Tetrahydropyran-2-yl, Benzoyl und Phenyl, wobei von allen diesen Benzyl bevorzugt wird.
In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung verkörpern R⁵ und R⁶ gemeinsam Di-tert-Butylsilylen, 1.3-(1,1,3,3-Tetraisopropyl)disiloxanyliden oder 1,3-(1,1,3,3-Tetra-tert-butoxy)disiloxanyliden.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird R⁵ aus Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertem Alkylcarbonyl (z. B. Acetyl und Trifluoracetyl), gegebenenfalls substitutiertem Arylcarbonyl (z. B. Benzoyl und m-Trifluormethylbenzoyl), tert-Butyldimethylsilyl, tert-Butyldiphenylsilyl und 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, ausgewählt, wobei gilt, dass, wenn A⁴ -NR¹³- verkörpert, R⁸ aus Triftuoracetyl und 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl ausgewählt wird.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird R⁸ aus Acetyl, Benzoyl und m-Trifluormethylbenzoyl, vorzugsweise Acetyl, ausgewählt.
In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung verkörpert R⁶ Benzyl, R⁵ und R⁷ verkörpern beide Methansulfonyl, und R⁸ verkörpert Acetyl.
In einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung verkörpern A¹, A², A³, A⁴ und A⁵ alle Sauerstoff, ist X Chlor, W ist NH₂, beide Substituenten R⁵ und R⁷ sind Methansulfonyl, R⁶ verkörpert Benzyl, R⁸ verkörpert Acetyl und n ist 1.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verbindung mit der allgemeinen Formel I entsprechend der obigen Definition, wobei gilt, dass R¹ nicht Wasserstoff und R² nicht Isobutyryl ist oder umgekehrt, wenn A¹, A², A³ und A⁴ alle Sauerstoff verkörpern, ist R⁵ Methansulfonyl, R⁵ ist Benzyl und n ist 1.
Das entscheidende Zwischenprodukt mit der allgemeinen Formel II kann mit einem Verfahren synthetisiert werden, das den folgenden Schritt umfasst:
Kupplung des Ausgangsmaterials mit der allgemeinen Formel III:
wobei A¹, A², A³, A⁴, A⁵, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸ und n so sind, wie dies vorstehend definiert worden ist; und R¹⁴ aus gegebenenfalls substituiertem (C_1-6-Alkyl)carbonyloxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, Halogen, gegebenenfalls substituiertem Arylthio, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkylthio, und gegebenenfalls substituiertem Aryloxy, wie beispielsweise Acetyloxy, Methoxy, Ethoxy, Chlorid, Fluorid, Bromid oder Iodid, oder SC₆H₅ ausgewählt wird.
mit einem Purin mit der allgemeinen Formel IV:
wobei X und W so sind, wie dies oben definiert worden ist;
in einer Glykosylierungsreaktion.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird die Glykosylierungsreaktion gemäß dem Vorbruggen-Glykosylierungsverfahren durchgeführt, das die Reaktion des Ausgangsmaterials III mit silyliertem Purin in Anwesenheit einer Lewis-Säure einschließt.
In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung wird die Glykosylierungsreaktion als eine "Eintopf"-Vorbruggen-Glykosylierungsreaktion durchgeführt, die die Kupplung des Ausgangsmaterials III mit dem Purin einschließt. Die Reaktion kann durch Anwesenheit eines Silylierungsmittels erleichtert werden, wie beispielsweise N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (BSA) und 1,1,1,3,3,3-Hexamethyldisilazan (HMDS), und/oder einer Lewis-Säure wie zum Beispiel Zinn(IV)chlorid und Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (TMS-Triflat).
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung ist das Silylierungsmittel N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid und die Lewis-Säure Trimethylsilyltrifluormethansulfonat.
In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird R⁸ aus Acetyl, Benzoyl und m-Trifluormethylbenzoyl, vorzugsweise Acetyl, und R¹⁴ aus Acetyloxy, Methoxy, Ethoxy, Chlorid, Fluorid, Bromid, Iodid und SC₆H₅, vorzugsweise Acetyloxy und Methoxy, und am besten Acetyloxy, ausgewählt.
In dem am meisten bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung verkörpern A¹, A², A³, A⁴ und A⁵ alle Sauerstoff, R⁶ verkörpert Benzyl, R⁵ und R⁷ verkörpern beide Methansulfonyl, R⁸ verkörpert Acetyl, und R¹⁴ verkörpert Acetyloxy.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf Verbindungen mit der allgemeinen Formel II entsprechend der vorstehenden Definition.
Synthese von Purin-LNA-Analogen
Als anschauliches Beispiel für die Synthese von Purin-LNAs mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde (1S,3R,4R,7S)-7-Benzyloxy-1-methansulfonylmethyl-3-(2-N-isobutyrylguanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2.2.1]heptan (6) unter Verwendung von 1,2-Di-O-acetyl-3-O-benzyl-4-C-methansulfonylmethyl-5-O-methansulfonyl-D-ribofuranose (3) als Ausgangsmaterial synthetisiert. Die "Eintopf"-Glykosylierung von 3 mit 2-Amino-6-chlorpurin unter Verwendung von N, O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (BSA) als Silylierungsmittel und Trimethylsilyltriflat in 1,2-Dichlorethan ergab 4. Die Verbindung 4 wurde im folgenden Schritt ohne weitere Reinigung eingesetzt. Die nucleophile "Eintopf"-Substitution von 6-Chlorpurin unter Verwendung von 3-Hydroxypropionitril (4.5 Äquivalente) mit anschließendem nucleophilinduzierten Ringschluss ergab 5. Es wurde ein Isobutyrylschutz der 2-Aminopuringruppe durchgeführt, indem 5 über Nacht mit Isobuttersäureanhydrid in Anwesenheit von N,N-Dimethylaminopyridin erwärmt wurde, wodurch sich nach wässriger Behandlung eine größere Ausbeute an 6 ergab. Die Substitution mit Benzoat, Entbenzoylierung und Entbenzylierung ergaben in 3 Schritten 9. Das Nucleosidphosphoramidit 11 wurde nach Koshkin et al (Tetrahedron, 1998, 54, 3607–3630) erhalten.
Figuren
In den Abbildungen zeigen
1 eine mit Hilfe der Erfindung durchgeführte Gesamtsynthese von G-LNA.
2 die neue erfindungsgemäße Strategie, die folgendes umfasst: regioselektive 9-N-Puringlykosylierungsreaktion gefolgt von einer nucleophilen aromatischen Eintopfsubstitutionsreaktion des 6-Chlors im Purinring und einem nucleophilinduzierten innermolekularen Ringschluss des C-verzweigten Kohlenwasserstoffs mit Bildung von Guanin-9-yl-LNA.
Definitionen
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "C_1-12-Alkyl" eine lineare, cyclische oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Cyclopropyl, Butyl, tert-Butyl, Isobutyl, Cyclobutyl, Pentyl, Cyclopentyl, Hexyl, Cyclohexyl und Dodecyl. In analoger Weise bedeutet der Begriff "C_1-6-Alkyl" eine lineare, cyclische oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, tert-Butyl, Isobutyl, Pentyl, Cyclopentyl, Hexyl, Cyclohexyl, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, tert-Butyl, Isobutyl und Cyclohexyl.
In ähnlicher Weiser umfasst der Begriff "C_2-12-Alkenyl" lineare, cyclische oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppen mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen und einer ungesättigten Bindung. Beispiele für Alkenylgruppen sind Vinyl, Allyl, Butenyl, Pentenyl, Hexenyl, Heptenyl, Octenyl, Dodecaenyl.
In ähnlicher Weise bedeutet der Begriff "C_2-12-Alkynyl" eine lineare oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen und einer Dreifachbindung. Beispiele dafür sind Ethynyl, Propynyl, Butynyl, Octynyl, und Dodecanyl.
Im vorliegenden Zusammenhang, d. h. in Verbindung mit den Begriffen "Alkyl", "Alkenyl", und "Alkynyl", bedeutet der Begriff "gegebenenfalls substituiert", dass die betreffende Gruppe einmal oder mehrmals substitutiert sein kann, vorzugsweise 1-3-mal, wobei die Gruppe(n) aus Hydroxyl, C_1-6-Alkoxy, Carboxyl, C_1-6-Alkoxycarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonyl, Formyl, Aryl, Aryloxycarbonyl, Arylcarbonyl, Heteroaryl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-Alkyl)amino, Carbamoyl, Mono- und Di(C_1-6-Alkyl)aminocarbonyl, Amino-C_1-6-Alkylaminocarbonyl, Mono- und Di(C_1-6-Alkyl)amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonylamino, Cyano, Carbamido, Halogen ausgewählt wird (werden), wobei Aryl und Heteroaryl 1-5-mal, vorzugsweise 1-3-mal, substituiert sein können mit C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Nitro, Cyano, Amino oder Halogen. Besonders bevorzugte Beispiele sind Hydroxyl, C_1-6-Alkoxy, Carboxyl, Aryl, Heteroaryl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-Alkyl)amino und Halogen, wobei Aryl und Heteroaryl 1-3 Mal mit C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Nitro, Cyano, Amino oder Halogen substituiert sein können. Aryl und Heteroaryl können so substituiert werden, wie nachstehend speziell für "gegebenenfalls substituiertes Aryl und Heteroaryl" beschrieben wird.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "Aryl" einen vollständig oder teilweise aromatischen carbocyclischen Ring oder ein entsprechendes Ringsystem, wie beispielsweise Phenyl, Naphthyl, 1,2,3,4-Tetrahydronaphthyl, Anthracyl, Phenanthracyl, Pyrenyl, Benzopyrenyl, Fluorenyl und Xanthenyl, von denen Phenyl ein bevorzugtes Beispiel darstellt.
Der Begriff "Heteroaryl" bedeutet einen vollständig oder teilweise aromatischen carbocyclischen Ring oder ein entsprechendes Ringsystem, wobei ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch Heteroatome, z. B. Stickstoff-(=N- oder -NH), Schwefel- und/oder Sauerstoffatome ersetzt worden sind. Beispiele für solche Heteroarylgruppen sind Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Pyridinyl, Pyrazinyl, Pyridazinyl, Piperidinyl, Cumaryl, Furyl, Quinolyl, Benzothiazolyl, Benzotriazolyl, Benzodiazolyl, Benzooxozolyl, Phthalazinyl, Phthalanyl, Triazolyl, Tetrazolyl, Isoquinolyl, Acridinyl, Carbazolyl, Dibenzazepinyl, Indolyl, Benzopyrazolyl, Phenoxazonyl.
Im vorliegenden Zusammenhang, d. h. in Verbindung mit den Begriffen "Aryl" und "Heteroaryl", bedeutet der Begriff "gegebenenfalls substituiert", dass die betreffende Gruppe einmal oder mehrmals substituiert sein kann, vorzugsweise 1-5-mal, insbesondere 1-3-mal mit einer Gruppe/Gruppen, die aus Hydroxyl (das, wenn es in einem Enolsystem vorliegt, in der tautomeren Ketoform dargestellt werden kann), C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy, Oxo (das in der tautomeren Enolform dargestellt sein kann), Carboxyl, C_1-6-Alkoxycarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonyl, Formyl, Aryl, Aryloxy, Aryloxycarbonyl, Arylcarbonyl, Heteroaryl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-Alkyl)amino; Carbamoyl, Mono- und Di(C_1-6-Alkyl)aminocarbonyl, Amino-C_1-6-Alkylaminocarbonyl, Mono- und Di(C_1-6-Alkyl)amino-C_1-6-Alkylaminocarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonylamino, Cyano, Guanidino, Carbamido, C_1-6-Alkanoyloxy, Sulfono, C_1-6-Alkylsulfonyloxy, Nitro, Sulfanyl, Dihalogen-C_1-4-Alkyl, Trihalogen-C_1-4-Alkyl, Halogen ausgewählt wird, wobei Aryl und Heteroaryl Substituenten verkörpern, die 1-3-mal mit C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Nitro, Cyano, Amino oder Halogen substituiert werden können. Bevorzugte Beispiele sind Hydroxyl, C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy, Carboxyl, C_1-6-Alkoxycarbonyl, C_1-6-Alkylcarbonyl, Aryl, Amino, Mono- und Di(C_1-6-Alkyl)amino, und Halogen, wobei Aryl 1-3-mal mit C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, Nitro, Cyano, Amino oder Halogen substituiert werden kann.
Im verliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "Tri(alkyl/aryl)silyl" eine Silylgruppe, die mit 0-3 Alkylgruppen und/oder 0-3 Arylgruppen substituiert ist, wobei gilt, dass die Gesamtzahl an Alkyl- und Arylgruppen 3 beträgt, ausgewählt aus Trimethylsilyl, Allyldimethylsilyl, Dimethylphenylsilyl, Diphenylmethylsilyl, Isopropyldimethylsilyl, tert-Butyldimethylsilyl, tert-Butyldiphenylsilyl, Triethylsilyl, Triisopropylsilyl, Diethylisopropylsilyl, Dimethylthexylisopropylsilyl, Tribenzylsilyl, Tri-para-xylylsilyl, Triphenylsilyl, Diphenylmethylsilyl, Di-tert-Butylmethylsilyl, Tris(trimethylsilyl)silyl, tert-Butylmethoxyphenylsilyl, tert-Butoxydiphenylsilyl.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "Dialkyldisiloxanyliden" Siloxan, das mit 4 Alkylgruppen substituiert ist, die aus 1,3-(1,1,3,3-Tetraisopropyl)disiloxanyliden und 1,3-(1,1,3,3-Tetra-tert-butoxy)disiloxanyliden ausgewählt worden sind.
"Halogen" umfasst Fluor, Chlor, Brom, und Iod.
Wenn hier der Begriff "DNA-Interkalator" verwendet wird, bedeutet er eine Gruppe, die in eine(n) DNA- oder RNA-Helix, -Doppelstrang oder -Dreifachstrang interkalieren kann. Beispiele für funktionelle Teile von DNA-Interkalatoren sind Acridine, Anthracen, Quinone, wie zum Beispiel Anthraquinon, Indol, Quinolin, Isoquinolin, Dihydroquinone, Anthracycline, Tetracycline, Methylenblau, Anthracyclinon, Psoralene, Cumarine, Ethidiumhalogenide, Dynemicin, Metallkomplexe, wie beispielsweise 1,10-Phenanthrolin-Kupfer, Tris(4,7-diphenyl-1,10-phenanthrolin)Ruthenium-Cobalt-enediyne, wie zum Beispiel Calcheamicin, Porphyrine, Distamycin, Netropcin, Viologen, Daunomycin. Besonders interessante Beispiele sind Acridine, Quinone wie beispielsweise Anthraquinon, Methylenblau, Psoralene, Cumarine, und Ethidiumhalogenide.
Im vorliegenden Zusammenhang erstreckt sich der Begriff "photochemisch aktive Gruppen" auf Verbindungen, bei denen bei Bestrahlung mit Licht chemische Reaktionen stattfinden. Anschauliche Beispiele für entsprechende funktionelle Gruppen sind Quinone, besonders 6-Methyl-1,4-naphtoquinon, Anthraquinon, Naphtoquinon, und 1,4-Dimethylanthraquinon, Diazirine, aromatische Azide, Benzophenone, Psoralene, Diazoverbindungen und Diazirinoverbindungen.
Im vorliegenden Zusammenhang ist der Begriff "thermochemisch reaktionsfähige Gruppe " als eine funktionelle Gruppe definiert, die in der Lage ist, eine thermochemisch ausgelöste kovalente Bindung mit anderen Gruppen einzugehen. Anschauliche Beispiele für funktionelle Teile thermochemisch reaktionsfähiger Gruppen sind Carbonsäure, Carbonsäureester, wie beispielsweise aktivierte Ester, Carbonsäurehalogenide, wie beispielsweise Säurefluoride, Säurechloride, Säurebromid und Säureiodide, Carbonsäureazide, Carbonsäurehydrazide, Sulfonsäuren, Sulfonsäureester, Sulfonsäurehalogenide, Semicarbazide, Thiosemicarbazide, Aldehyde, Ketone, primäre Alkohole, sekundäre Alkohole, tertiäre Alkohole, Phenole, Alkylhalogenide, Thiole, Disulfide, primäre Amine, sekundäre Amine, tertiäre Amine, Hydrazine, Eoxide, Maleimide und Borsäurederivative.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "Chelatgruppe" ein Molekül, das mehr als eine Bindungsstelle enthält und sich häufig gleichzeitig durch mehr als eine Bindungsstelle an ein anderes Molekül, Atom oder Ion bindet. Beispiele für funktionelle Teile von Chelatgruppen sind Iminodiessigsäure, Nitrilotriessigsäure (NTA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Aminophosphonsäure usw.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "Reportergruppe" eine Gruppe, die entweder durch sich selbst oder als Teil einer Nachweisserie nachweisbar ist. Beispiele für funktionelle Teile von Reportergruppen sind Biotin, Digoxigenin, Fluoreszenzgruppen (Gruppen, die in der Lage sind, elektromagnetische Strahlung, z. B. Licht oder Röntgenstrahlen einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren und die anschließend die absorbierte Energie als Strahlung mit einer längeren Wellenlänge wieder emittieren; anschauliche Beispiele sind Dansyl (5-dimethytamino)-1-naphthalensulfonyl), DOXYL (N-oxyl-4,4-dimethyloxazolidin), PROXYL (N-oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin), TEMPO (N-oxyl-2,2,6,6-tetramethylpiperidin), Dinitrophenyl, Acridine, Cumarine, Cy3 und Cy5 (Handelsmarken von Biological Detection Systems, Inc.), Erytrosin, Cumarsäure, Umbelliferon, Texas Red, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Rox, 7-Nitrobenzo-2-oxa-1-diazol (NBD), Pyren, Fluorescein, Europium, Ruthenium, Samarium und andere Seltenerdenmetalle), Radioisotopmarker, Chemilumineszenzmarker (Marker, die durch die Emission von Licht während einer chemischen Reaktion nachweisbar sind), Spinmarker (ein freies Radikal (z. B. substituierte organische Nitroxide) oder andere paramagnetische Sonden (z. B. Cu²⁺, Mg²⁺), die an ein biologisches Molekül gebunden sind, das durch Anwendung der Elektronenspinresonanzspektrometrie nachweisbar ist), Enzyme (wie beispielsweise Peroxidasen, alkalische Phosphatasen, β-Galactosidasen und Glucoseoxidasen), Antigene, Antikörper, Haptene (Gruppen, die in der Lage sind, mit einem Antikörper eine Verbindung einzugehen, die aber selbst keine Immunreaktion einleiten können, wie beispielsweise Peptide und Steroidhormone), Trägersysteme für die Durchdringung von Zellmembranen, wie beispielsweise: Fettsäurerückstände, Steroidkomponenten (Cholesteryl), Vitamin A, Vitamin D, Vitamin E, Folsäurepeptide für spezielle Rezeptoren, Gruppen für vermittelnde Endocytose, epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Bradykinin und aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor (PDGF). Besonders interessante Beispiele sind Biotin, Fluorescein, Texas Red, Rhodamin, Dinitrophenyl, Digoxigenin, Ruthenium, Europium, Cy5, Cy3 usw.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet "Ligand" etwas, was bindet. Liganden können funktionelle Gruppen enthalten, wie beispielsweise: aromatische Gruppen (wie beispielsweise Benzol, Pyridin, Naphtalen, Anthracen und Phenanthren), heteroaromatische Gruppen (wie beispielsweise Thiophen, Furan, Tetrahydrofuran, Pyridin, Dioxan, und Pyrimidin), Carbonsäuren, Carbonsäureester, Carbonsäurehalogenide, Carbonsäureazide, Carbonsäurehydrazide, Sulfonsäuren, Sulfonsäureester, Sulfonsäurehalogenide, Semicarbazide, Thiosemicarbazide, Aldehyde, Ketone, primäre Alkohole, sekundäre Alkohole, tertiäre Alkohole, Phenole, Alkylhalogenide, Thiole, Disulfide, primäre Amine, sekundäre Amine, tertiäre Amine, Hydrazine, Epoxide, Maleimide, C₁-C₂₀-Alkylgruppen, gegebenenfalls unterbrochen oder abgeschlossen durch eines oder mehrere Heteroatome wie beispielsweise Sauerstoffatome, Stickstoffatome und/oder Schwefelatome, gegebenenfalls mit aromatischen oder einfach/mehrfach ungesättigten Kohlenwasserstoffen, Polyoxyethylen, wie zum Beispiel Polyethylenglycol, Oligo-/Polyamide, wie zum Beispiel Poly-β-Alanin, Polyglycin, Polylysin, Peptide, Oligo/Polysaccharide, Oligo-/Polyphosphate, Toxine, Antibiotika, Zellgifte und Steroide, und auch "Affinitätsliganden", d. h. funktionelle Gruppen oder Biomoleküle, die eine spezifische Affinität für Orte an speziellen Proteinen, Antikörpern, Poly- und Oligosacchariden und anderen Biomolekülen haben.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "Spacer" eine thermochemisch und photochemisch nichtaktive, Abstand erzeugende Gruppe und wird benutzt, um zwei oder mehr unterschiedliche Teile der oben definierten Arten zu verbinden. Spacer werden anhand einer Vielzahl von Merkmalen ausgewählt, zu denen ihre Hydrophobie, Hydrophilie, Molekülflexibilität und Länge gehören (siehe z. B. Hermanson et. al., "Immobilised Affinity Ligand Techniques", Academic Press, San Diego, California (1992), S. 137–ff). Im Allgemeinen beträgt die Länge der Spacer weniger als oder ungefähr 400 A, in einigen Anwendungen vorzugsweise weniger als 100 A. Der Spacer umfasst somit eine Kette von Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren Heteroatomen, wie beispielsweise Sauerstoffatomen, Stickstoffatomen, und/oder Schwefelatomen unterbrochen oder abgeschlossen wird. So kann der Spacer K eine oder mehrere Amid-, Ester-, Amino-, Ether-, und/oder Thioetherfunktionalitäten und gegebenenfalls aromatische oder einfach/mehrfach ungesättigte Kohlenwasserstoffe, Polyoxyethylen, wie zum Beispiel Polyethylenglycol, Oligo-/Polyamide, wie zum Beispiel Poly-β-Alanin, Polyglycin, Polylysin und Peptide im Allgemeinen, Oligosaccharide, Oligo-/Polyphosphate enthalten. Darüber hinaus kann der Spacer aus daraus kombinierten Einheiten bestehen. In besonders interessanten Ausführungsbeispielen umfasst der Spacer eine chemisch spaltbare Gruppe. Beispiele für solche chemisch spaltbaren Gruppen beinhalten unter reduktiven Bedingungen spaltbare Disulfidgruppen, durch Peptidasen spaltbare Peptidfragmente oder unter oxidativen Bedingungen spaltbare Selenide usw.
Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "Nucleosid" ein Glycosid einer heterocyclischen Base. Der Begriff "Nucleosid" wird in weiterem Sinne so verwendet, dass er nicht in der Natur vorkommende Nucleoside, in der Natur vorkommende Nucleoside sowie andere Nucleosidanaloge umfasst. Anschauliche Beispiele für Nucleoside sind Ribonucleoside, die einen Riboseanteil enthalten, sowie Deoxyribonucleside, die einen Deoxyriboseanteil enthalten. Was die Basen von derartigen Nucleosiden betrifft, so ist gemeint, dass dies jede beliebige in der Natur auftretende Base sein kann, z. B. Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin und Uracil sowie alle modifizierten Variationen davon oder alle möglichen nichtnatürlichen Basen.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung.
EXPERIMENTELLES
Beispiel 1
3-O-Benzyl-4-C-methansulfonoxymethyl-5-methansulfonyl-l,2-O-isopropyliden-β-D-ribofuranose (2)
Eine Lösung aus 3-O-Benzyl-4-C-hydroxymethyl-l,2-O-isopropyliden- -D-ribofuranose (1, 11.1 g, 40 mmol) (Youssefyeh, R. D.; Verheyden, J. P. H.; Moffatt, J. G., J. Org.Chem. 1979, 44, 1301) in trockenem Pyridin (30 ml) wurde in einem Eisbad gekühlt. Dann wurde Methansulfonylchlorid (8,3 ml, 108 mmol) unter Rühren zugegeben. Man ließ das Gemisch sich auf Raumtemperatur erwärmen und dann wurde es 1 h lang gerührt. Es wurde Ether (200 ml) zugegeben, und die Lösung wurde mit Wasser (3 × 200 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet und unter verringertem Druck auf 16,4 g (98 %) der Verbindung (2) als schwach gelber Feststoff eingedickt.
Beispiel 2
1,2-O-Acetyl-3-O-benzyl-4-C(methansulfonyloxymethyl)-5-O-methansulfonyloxymethyl-)-β-D-ribofuranose (3)
1,2-O-Isopropyliden-3-O-benzyl-4-C-methansulfonyloxymethyl-5-O-methansulfonyloxymethyl-β-D-ribofuranose (2,20 g, 43 mmol) wird in Essigsäure (175 ml) gelöst, es werden Essigsäureanhydrid (28 ml) und schließlich 320 μl konzentrierte Schwefelsäure zugegeben. Die Lösung wird über Nacht gerührt. Die Lösung wird dann bei einer Wasserbadtemperatur von 35 °C auf die Hälfte ihres Volumens eingedampft. Dann wird Wasser (300 ml) zugegeben. Die entstandene Emulsion wird dreimal mit Ether (150 ml) und zweimal mit DCM extrahiert (zu diesem Zeitpunkt bildet sich eine Emulsion). Die kombinierten organischen Phasen werden zweimal mit Wasser und gesättigter HCO₃ ^– gewaschen (intensive CO₂- Entwicklung). Die organische Phase wird zu einem Sirup eingedampft, in DCM (200 ml) wieder gelöst, und das restliche Essigsäureanhydrid wird durch starkes Rühren in einem Zweiphasensystem aus DCM und gesättigtem HCO₃ ^–(150 ml) rasch abgekühlt. Es kann zusätzliches HCO₃ ^– (fest) zugegeben werden, wenn die wässrige Phase azidisch wird. Wenn die wässrige Phase, nachdem sich 3 h lang kein Gas mehr entwickelt hat, noch basisch ist (pH = 8), werden die Phasen getrennt, und die wässrige Phase wird zweimal mit DCM extrahiert (2 × 100 ml). Die organischen Phasen werden gesammelt, getrocknet (MgSO₄) und das DCM wird verdampft, so dass sich ein dicker Sirup ergibt. Das α/β-Verhältnis lässt sich auch aus dem HPLC ersehen, aber beim Rf (MeOH/DCM: 5:95) besteht im Vergleich zum Ausgangsmaterial kein echter Unterschied. Das TLC wird in 20 %iger Schwefelsäure in Anwesenheit von Wärme entwickelt.
Dieses Produkt wird ohne weitere Reinigung verwendet.
Beispiel 3
1-(2-O-Acetyl-3-O-benzyl-4-C-methansulfonyloxymethyl-5-O-methansulfonyl-β-D-ribofuranosyl)-2-amino-6-chlorpurin (4)
N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (29,6 g, 35 ml) wurde einem gerührten Brei aus (3) (30 g, 58,8 mmol) und 2-Amino-6-chlorpurin (12 g, 70 mmol) in 1,2-Dichlorethan (über Sieben getrocknet, 450 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde 40 min lang unter Rückfluss erhitzt, um eine homogene Lösung zu erhalten. Dann wurde das Gemisch von der Wärmezufuhr entfernt, und es wurde tropfenweise Trimethylsilyltriflat (22 ml, 118 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für weitere 2 h unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und es wurde eine gesättigte wässrige Bicarbonatlösung (400 ml) zugegeben. Der Brei wurde 15 min gerührt, der pH-Wert wurde mit Hilfe von Eisessig auf 7–8 eingestellt, und das Gemisch wurde mit Chlorform extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit AcOEt und Chlorform extrahiert, und die organischen Phasen wurden kombiniert. Die organische Phase wurde mit Sole (2 × 250 ml) und Bicarbonat (2 × 250 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zu Verbindung (4) in Form eines gelblichen Schaums eingedickt, der sich unter Vakuumtrocknung ausdehnt. Ausbeute: 35,4 g, 97 %.
Beispiel 4
(1S, 3R, 4R, 7S)-7-Benzyloxy-1-methansulfonyloxymethyl-3-(guanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2:2:1] heptan (5)
Eine Lösung aus 3-Hydroxypropionitril (22,6 g, 21,7 ml) in trockenem THF (75 ml) wurde über einen Zeitraum von 15 min einer gerührten Suspension aus Natriumhydrid (14 g, 60 % in Mineralöl aufgeschlämmt) in trockenem THF (250 ml) zugegeben, und das Gemisch wurde 30 min lang bei Umgebungstemperatur gerührt. In trockenem THF (300 ml) aufgelöstes 1-(2-O-Acetyl-3-O-benzyl-4-C-methansulfonyloxymethyl-5-O-methansulfonyl-β-D-ribofuranosyl)-2-amino-6-chlorpurin (4) (35,4 g, 57 mmol) wurde innerhalb eines Zeitraums von 10 min tropfenweise zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde zusätzlich 30 min lang gerührt, bis das HPLC eine Gesamtumwandlung von 4 auf 5 zeigte. Dem Reaktionsgemisch wurde Wasser (600 ml) zugegeben, und der pH-Wert wurde mit Eisessig auf 7–8 eingestellt. Der sich ergebende Brei wurde anschließend mit EtOAc (4 × 300 ml) extrahiert, und die organischen Phasen wurden kombiniert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedickt. Das sich ergebende Öl wurde anschließend mit McOH behandelt und unter starkem Rühren bis zum Kochen unter Rückfluss erwärmt, um einen Brei zu erhalten, der nach Warmfilterung schwachgelbe Kristalle (16 g) der Verbindung (5) ergab. Eine abschließende Eindampfung der Mutterlauge ergab weitere 8 g in Form eines rohen bräunlichen Feststoffs.
Kombinierte Ausbeute: 90 %
Beispiel 5
(1S, 3R, 4R, 7S)-7-Benzyloxy-1-methansulfonyloxymethyl-3-(2-N-isobutyryl-guanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2:2:1]heptan (6)
(1S, 3R, 4R, 7S)-7-Benzyloxy-1-methansulfonyloxymethyl-3-(guanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2:2:1]heptan (5) (16 9, 34,6 mmol) wird in DMF (Siebe, 200 ml) aufgelöst, und Isobuttersäureanhydrid (3,5 äq., 20 ml) wird zusammen mit N,N-Dimethylaminopyridin (0,2 äq., 0,84 g) zugegeben, und die Reaktion wird bei 60 °C über Nacht gerührt. Das Volumen des Reaktionsgemischs wird auf 20 % reduziert, in gesättigtes wässriges Bicarbonat (200 ml) gegossen, und das Gemisch wird 30 min lang gerührt. Das Zielmolekül wird in EtOAc extrahiert, die organische Phase wird mit Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wird durch Verdampfen entfernt, um Verbindung (6) in Form eines schwach gelben Schaums zu erhalten (19,9 g), der ohne weitere Reinigung im folgenden Schritt eingesetzt wird.
Beispiel 6
(1S, 3R, 4R, 7S)-7-Benzyloxy-1-benzoyloxymethyl-3-(2-N-isobutyrylguanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2:2:1]heptan (7)
(1S, 3R, 4R, 7S)-7-Benzyloxy-1-methansulfonyloxymethyl-3-(2-N-isobutyrylguanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2:2:1]heptan (6) (19,9 g von oben, ungefähr 34 mmol) wird in DMF (über Sieben getrocknet, 300 ml) aufgelöst, und es wird Natriumbenzoat (15 g, 104 mmol, 3 äq.) zusammen mit katalytischen Mengen an Cäsiumcarbonat zugegeben. Das Gemisch wird auf 90 °C erwärmt, und man lässt es über Nacht reagieren. Die Lösung wird gefiltert, und dem Filtrat wird EtOAc zugesetzt, um Natriumbenzoat auszufällen. Das Gemisch wird wieder gefiltert und gewaschen (Wasser, 2 × 250 ml), getrocknet (Na₂SO₄) und unter vermindertem Druck zu Verbindung (7) in Form von Öl eingedickt, das ohne weitere Reinigung im folgenden Schritt eingesetzt wird.
Beispiel 7
(1S, 3R, 4R, 7S)-7-Benzyloxy-1-hydroxymethyl-3-(2-N-isobutyrylguanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2:2:1]heptan (8)
(1S, 3R, 4R, 7S)-7-Benzyloxy-1-benzoyloxymethyl-3-(2-N-isobutyrylguanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2:2:1]heptan (7, 8,2 g, 14,7 mmol) wird in Pyridin/Ethanol (1:8, 450 ml) aufgelöst, und es wird Natriumhydroxid (2 M, 15,5 ml) zugegeben. Das Gemisch wird 30 min lang bei Umgebungstemperatur gerührt, und anschließend wird es mit Hilfe von Essigsäure (25 ml) rasch abgekühlt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck eingedickt, und das Produkt wurde aus 20 %igem wässrigem Ethanol auskristalliert, gefiltert und getrocknet, um Verbindung (8) (5,8 g, 87 %) zu ergeben.
Beispiel 8
(1S, 3R, 4R, 7S)-7-Hydroxy-1-hydroxymethyl-3-(2-N-isobutyrylguanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2:2:1]heptan (9)
(1S, 3R, 4R, 7S)-7-Benzyloxy-1-hydroxymethyl-3-(2-N-isobutyrylguanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2:2:1]heptan (8) (5,8 g, 12,7 mmol) wird in Methanol (50 ml) aufgelöst, und es wird Pd/C (10 %, 2 g) zusammen mit Ameisensäure (3 ml) zu gegeben. Das Gemisch wurde 5 h lang unter Rückfluss erhitzt, auf Umgebungstemperatur abgekühlt und durch eine Kieselgelsäule gefiltert. Die Säule wurde mit Methanol (50 ml) gewaschen, das gesamte Filtrat wurde unter vermindertem Druck zu Verbindung (9) (4,55 g, 98 %) in Form eines glasähnlichen Feststoffs eingedickt.
(1S, 3R, 4R, 7S)-1-(4,4'-Dimethoxytrityloxymethyl)-7-hydroxy-3-(2-N-isobutyryl-guanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo [2:2:1]heptan (10) und (1S, 3R, 4R, 7S)-7-(2-Cyano-ethoxy(diisopropylamino)phosphinoxy)-1-(4,4'-dimethoxytrityloxymethyl)-3-(2-N-isobutyrylguanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2:2:1]heptan (11) werden nach Koshkin et al. (Tetrahedron 54 (1998) 3607–3630) synthetisiert.
Die Beispiele 9–12 veranschaulichen alternative experimentelle Verfahren.
Beispiel 9
1,2-O-Acetyl-3-O-benzyl-4-C(methansulfonyloxymethyl)-5-O-methansulfonyloxymethyl-)-β-D-ribofuranose (3)
1,2-O-Isopropyliden-3-O-benzyl-4-C-methansulfonyloxymethyl-5-O-methansulfonyl-oxymethyl-β-D-ribofuranose (23,0 g, 49,3 mmol) wird bei 18 °C unter einer N₂-Atmosphere in 82 ml Essigsäure (99 %) aufgeschlämmt, wobei sich eine schwach gelbe Suspension ergibt. Nach 10-minütigem Rühren ist die Substanz noch ungelöst. Danach wird dem Reaktionsgemisch in Essigsäure (99 %, 2 ml) aufgelöste Schwefelsäure (98 %, 247 mg) zugesetzt. Eine klare, hellgelbe Lösung mit weißem Sediment aus 1,2-O-Isopropyliden-3-O-benzyl-4-C-methansulfonyloxymethyl-5-O-methan-sulfonyloxymethyl-β-D-ribofuranose entsteht. Anschließend wird Essigsäureanhydrid (18 °C, 11,2 ml) über einen Zeitraum von 10 Minuten zugegeben, ohne dass eine sichtbare exotherme Reaktion erfolgt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur und unter einer Schutzgasatmosphäre stehen gelassen. Eine klare hellgelbe Lösung mit voller Umwandlung des Substrats entsteht. 80 ml Leitungswasser werden tropfenweise dem Reaktionsgemisch zugesetzt, das dann 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt wird. 80 ml Acetonitril werden der gelben Lösung zugesetzt, die dann weitere 60 Minuten lang gerührt wird, wonach das gelbe Reaktionsgemisch in einen Trenntrichter mit guter Phasentrennung gegossen wird. Die untere nicht klare organische Phase (132 ml) wird separiert und die obere trübe wässrige Phase (150 ml), die das Produkt enthält, wird mit weiteren 25 ml Methylenchlorid extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen (110 ml) werden mit 50 ml Leitungswasser gewaschen; der pH-Wert der wässrigen Phase beträgt 2–3. Die organische Phase wird ein weiteres Mal mit 47 ml Leitungswasser extrahiert; der pH-Wert der wässrigen Phase beträgt 2–3. Die organische Phase wird zweimal mit 50 ml 1 M K₂SO₄ gewaschen. Die sich ergebende trübe organische Phase wird in einen Rundkolben gegeben und 30 Minuten lang mit 25 ml frischer 1 M K₂SO₄ gerührt. Danach wird die klare organische Phase in einem Trenntrichter separiert und über MgSO₄ (6 g) getrocknet. Die getrocknete Lösung wird auf einem G3-Filter filtriert, das anschließend mit 50 ml Methylenchlorid gewaschen wird. Die sich ergebende hellgelbe Lösung wird eingedampft (Rotavapor, 53 °C, 100 bis 20 mbar). Das sich ergebende blassgelbe Öl wird intensiv getrocknet (1 mbar, 50 °C). Die Ausbeute beträgt 27,6 g (102 % einschließlich des restlichen Lösungsmittels). Sie ist rein, wie mittels TLC bestimmt wird (CH₂Cl₂/TBME/Et₃N 9,5:0,5:0,1);
Entwickler: McOH/Schwefelsäure 1:1.
Beispiel 10
1-(2-O-Acetyl-3-O-benzyl-4-C-methansulfonyloxymethyl-5-O-methansulfonyl-β-D-ribofuranosyl)-2-amino-6-chlorpurin (4)
1,2-O-Acetyl-3-O-benzyl-4-C(methansulfonyloxymethyl)-5-O-methansulfonyloxymethyl)-β-D-ribofuranose (3) (25,7 g, 50,4 mmol) wird durch sanftes Erwärmen in 242 ml McCN (HPLC-Qualität) aufgelöst und in einen mit N₂ gespülten 1-I-Dreihalskolben mit Perlrohr und Rührwerk gegeben. Dann wird Chlorguanin (9,33 g) zugegeben. BSA (24,5 ml) wird über einen Zeitraum von 5 Minuten tropfenweise der gelben Suspension zugegeben. Exothermer Temperaturanstieg 1 °C. Das Reaktionsgemisch wird unter Rückfluss erhitzt (80 °C). Danach wird die Suspension klar gelb. TMS-OTf (18,2 ml) wird über einen Zeitraum von 10 Minuten mit Hilfe einer Spritze unter N₂ tropfenweise zugegeben. Die sich ergebende klare orangerote Lösung wird 90 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird in einem Wasserbad auf Raumtemperatur abgekühlt, danach wird die Lösung mit 2,5 ml H₂O in 8 ml McCN rasch abgekühlt. Exothermer Temperaturanstieg: T = 20 bis 24 °C. Jetzt werden der roten Lösung 96 ml Leitungswasser zugegeben. Kein exothermer Temperaturanstieg, pH-Wert = 0,63. 3M NaOH wird tropfenweise zugegeben, bis der pH-Wert = 8. Das Reaktionsgemisch wird mit 100 ml Wasser und 120 ml CH₂Cl₂ geschüttelt. Die Phasen neigen zum Emulgieren. Phasentrennung: Eine obere klare gelbe wässrige Phase und eine untere gelbe organische Phase. Die wässrige Phase wird mit 100 ml Methylenchlorid extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen werden mit 100 ml 1M K₂HPO₄ gewaschen. Die gelbe Emulsion wird auf einem G3-Filter gefiltert, und der Filterkuchen (überschüssiges Chlorguanin) wird mit 20 ml Methylenchlorid gewaschen. Volumen der oberen organischen Phase: 400 ml; Volumen der unteren wässrigen Phase 40 ml, pH-Wert = 6–7. Die wässrige Phase wird mit 100 ml Methylenchlorid gewaschen. Die organische Phase wird mit 100 ml 1M K₂HPO₄ gewaschen; Phasentrennung. Die organischen Phasen werden kombiniert und mit 100 ml 1 M K₂HPO₄ weiter gewaschen. Die Phasen werden separiert und ergeben 620 ml trübe gelbe Lösung, die über 26 g MgSO₄ getrocknet wird. Nach dem Filtern wird die klare gelbe Lösung zu 28,7 g (91 %) gelben Schaum eingedampft (Rotavapor, 53 °C, 100 bis 1 mbar). TLC: Nur das Produkt ist sichtbar. HPLC: 97 % rein.
ANMERKUNG: Phasenumkehr: Trotz eines großen Methylenchloridvolumens, liegt die organische Phase im oberen Teil als gelbe Phase vor.
Beispiel 11
(1S, 3R, 4R, 7S)-7-Benzyloxy-1-methansulfonyloxymethyl-3-(guanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2:2:1]heptan (5)
3-Hydroxypropionitril (14,84 g, frisch destilliert) wird in einem 1-I-Dreihalskolben mit Rührwerk und N₂-Fluss in THF (257 ml HPLC-Qualität) aufgelöst. Die Lösung wird in einem Eisbad auf weniger als 5 °C abgekühlt, danach werden 12,2 g (51 %) NaH über 10 Minuten hinweg in kleinen Mengen in die Lösung gestreut; schwach exotherme Reaktion, Gasentwicklung. Die graufarbene Suspension wird bei 5–10 °C 30 Minuten lang gerührt. 1-(2-O-Acetyl-3-O-benzyl-4-C-methansulfonyloxymethyl-5-O-methansulfonyl-(3-D-ribofuranosyl)-2-amino-6-chlorpurin (4) (28,5 g, 46,0 mmol), das in 81 ml trockenem THF aufgelöst wurde, wird dem Reaktionsgemisch über 30 Minuten hinweg tropfenweise zugegeben, wodurch sich eine rotbraune klare Lösung ergibt, die dann bei 5 °C 3 Stunden lang gerührt wird. Deionisiertes Wasser (100 ml) wird tropfenweise (mit Kühlung) über 25 Minuten hinweg zugegeben; schwach exotherme Reaktion, Gasentwicklung. Der pH-Wert des Reaktionsgemischs beträgt 13. Der pH-Wert wird mit 3M HCl (58 ml) auf 7 eingestellt. Das Gemisch wird in einen Trenntrichter gegeben. Phasentrennung (wässrige Phase ganz unten). Die wässrige Phase wird mit THF (50 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen werden mit NaCl (100 ml, 25 %) + K₂HPO₄ (25 ml, 1M) zweimal extrahiert. pH-Wert (sich ergebende wässrige Phase) 7. Die sich ergebende organische Phase (440 ml) wird fast bis zur Trockne eingedampft. Dann erfolgt eine erneute Auflösung in THF (250 ml) und Eindampfung. THF (50 ml) wird zweimal zugegeben und zur Trockne eingedampft. Der Rest wird in 146 ml Methylenchlorid aufgeschlämmt, und die Suspension wird auf G3 gefiltert. Dann wird mit 53 ml Methylenchlorid gewaschen. Die sich ergebende Lösung wird zur Trockne eingedampft, und der Rest wird erneut in 145 ml Methylenchlorid aufgelöst und in einen Dreihalskolben mit 5 ml CH₂Cl₂ gegeben. 163 ml TBME werden tropfenweise sehr langsam unter heftigem Rühren (300 U/min) der roten Lösung zugegeben. Nach Zugabe von 20 ml MTBE scheiden sich auf der Seitenwand des Kolbens gelbe Kristalle ab. Die Kristalle werden abgekratzt und der Lösung mit Impfkristallen aus der früheren Charge zugegeben. Über einen Zeitraum von 90 Minuten hinweg werden 60 ml MTBE zugegeben, und die Ausfällung wird eingeleitet, so dass sich eine trübe Lösung bildet. Es werden 80 ml zugegeben, wobei es zu einer klaren Ausfällung von leichten Kristallen kommt. Die Lösung wird wieder angeimpft. Nach 2½ Stunden wird das gesamte MTBE zugegeben, und die Lösung wird weitere 30 Minuten lang gerührt. Die Lösung wird auf 5 °C abgekühlt und auf G3 gefiltert. Der gelbe Filterkuchen wird mit 100 ml CH₂Cl₂/MTBE 1:4 gewaschen und sauggetrocknet. Die Ausbeute beträgt 90,7 % (89 % rein bei Verwendung von HPLC).
Erneute Ausfällung des Rohproduktes: 17,8 g des Filterkuchens werden in 50 ml DMSO in einem mit Rührwerk ausgestatteten Kolben aufgeschlämmt. Die Suspension wird auf 90 °C erwärmt (Kontaktthermometer), und 150 ml deionisiertes Wasser werden über einen Zeitraum von 30 Minuten bei 85–90 °C langsam tropfenweise unter Rühren zugegeben. Nach Zugabe von 30 ml wird das Abscheiden einer Substanz auf der Seitenwand des Kolbens beobachtet, und nach 60 ml tritt das Abscheiden nach jedem zugegebenen Tropfen auf. Nach der letzten Zugabe wird die Heizung ausgeschaltet, und es werden noch weitere 40 ml Wasser zugegeben. Der Kolben wird gerührt, und man lässt ihn auf 20 °C abkühlen. Animpfen erfolgt bei 50 °C. Der Kolben wird in einem Eisbad auf 5 °C abgekühlt, und das Produkt wird auf einem G3-Filter getrocknet. Das Waschen erfolgt mit 2 Anteilen Wasser (20 ml) und MTBE (30 ml) und danach das Trocknen in einem Heißluftschrank. Die Ausbeute beträgt 15,0 g (66,7 %) (94 % rein durch Verwendung von HPLC).
Beispiel 12
(1S, 3R, 4R, 7S)-7-Benzyloxy-1-methansulfonyloxymethyl-3-(2-N-isobutyryl-guanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2:2:1]heptan (6)
(1S, 3R, 4R, 7S)-7-Benzyloxy-1-methansulfonyloxymethyl-3-(guanin-9-yl)-2,5-dioxabicyclo[2:2:1]heptan (5) (14,0 g, 30,2 mmol) wird unter Einsatz von N₂ in 70 ml Pyridin aufgelöst. DMAP (0,50 9) wird zugegeben. Anschließend wird Isobuttersäureanhydrid (16,70 g) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird 4 Stunden lang auf 60 °C erwärmt (96 % Produkt im Reaktionsgemisch bei Verwendung von HPLC). 50 ml deionisiertes Wasser und 50 ml CH₂Cl₂ werden dem warmen Reaktionsgemisch zugegeben, und die Lösung wird 60 Minuten lang gerührt (um überschüssiges Anhydrid rasch abzukühlen). 20 ml CH₂Cl₂ werden zugegeben, und die Phasen werden mit Hilfe eines Trenntrichters getrennt. Die wässrige Phase (50 ml) wird mit 40 ml CH₂Cl₂ extrahiert. Die organischen Phasen werden kombiniert und mit 60 ml deionisertes Wasser gewaschen. Die Phasentrennung wird durch Einsatz von gesättigtem NaCl (5 ml) erleichtert. Die klare rote organische Phase wird eingedampft (Rotavapor, 50 °C, 200 bis 10 mbar). Als Ausbeute erhält man 35,2 g rotes Öl. Dieses Öl kann in den nachfolgenden Schritten direkt verwendet werden.
ANMERKUNG: Der Pyridinrückstand kann erforderlichenfalls durch azeotrope Destillation mit Toluol entfernt werden.

Claims

Verfahren zur Synthese eines Purin "Locked Nucleic Acid" (LNA)-Analogs der allgemeinen Formel I,
worin die beiden geminalen Substituenten J¹ und J² zusammen Oxo oder Thion, und einzeln einer von ihnen OR⁹, NR¹⁰R¹¹ oder SR¹², und der andere zusammen mit J³ eine Doppelbindung bedeuten; wenn J¹ und J² Oxo oder Thion bedeuten, bedeutet J³ Hydrogen; W aus NR¹R², OR³ und SR⁴ ausgewählt ist; A¹, A², A³ und A⁴ unabhängig voneinander aus -O-, -S- und -NR¹³- ausgewählt sind, wobei R¹³ aus Hydrogen, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl und gegebenenfalls substituiertem (C_1-6-Alkyl)carbonyl ausgewählt ist; jeder der Substituenten R¹, R², R³, R⁴, R⁹, R¹⁰, R¹¹ und R¹² unabhängig voneinander aus Hydrogen, gegebenenfalls substituiertem C_1-12-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkynyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl, gegebenenfalls substituiertem Aryl(C_1-6-Alkyl), gegebenenfalls substituiertem Arylcarbonyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl(C_1-6Alkyl)-Carbonyl, gegebenenfalls substituiertem C_1-12-))Alkylcarbonyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkenylcarbonyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkynylcarbonyl, gegebenenfalls substituiertem Arylsulfonyl, gegebenenfalls substituiertem C_1-12-Alkylsulfonyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkenylsulfonyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkynylsulfonyl, C_1-12-Alkoxycarbonyl, Formel, Tetrahydropyran-2-yl, gegebenenfalls substituiertem Heteroaryl, gegebenenfalls substituiertem Heteroarylcarbonyl, Carbamoyl und "aktiven/funktionellen" Gruppen der allgemeinen Form M-K ausgewählt sind, wobei M den "aktiven/funktionellen" Teil der betreffenden Gruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelatgruppen, Reportergruppen und Liganden, und K ein Spacer ist, durch den der "aktive/funktionelle" Teil am Purinring angebracht ist, und wobei K gegebenenfalls ein Spacer ist, der 1–50 Atome umfasst; R⁵ aus gegebenenfalls substituiertem Alkylsulfonyl, gegebenenfalls substituiertem Arylsulfonyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl(C_1-6Alkyl), gegebenenfalls substituiertem Arylcarbonyl und Tri(alkyl/aryl)silyl ausgewählt ist; R⁶ aus gegebenenfalls substituiertem Aryl(C_1-6-Alkyl), gegebenenfalls substituiertem Tetrahydropyran-2-yl, gegebenenfalls substituiertem Arylcarbonyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl und Tri(alkyl/aryl)silyl ausgewählt ist; R⁵ und R⁶ zusammen auch Dialkyldisiloxanylide bedeuten können; und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 ist; das Verfahren folgende Stufe umfasst: Behandlung einer Verbindung der allgemeinen Formel II:
worin A¹, A², A³, A⁴, R⁵, R⁶, R¹³, W und n wie oben definiert sind; A⁵ aus -O-, -S- und -NR¹³- ausgewählt ist; R⁷ aus gegebenenfalls substituiertem Alkylsulfonyl und gegebenenfalls substituiertem Arylsulfonyl ausgewählt ist. R⁸ aus Hydrogen, gegebenenfalls substituiertem (C_1-6-Alkyl)carbonyl, gegebenenfalls substituiertem Arylcarbonyl, Tri(alkyl/aryl)silyl und Fluorenyl(C_1-6-alkyl)oxycarbonyl ausgewählt ist; und X aus Halogen, CN, gegebenenfalls substituiertem Alkylsulfonyl und gegebenenfalls substituiertem Arylsulfonyl ausgewählt ist. mit einem nucleophilen Reagens.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das nucleophile Reagens aus gegebenenfalls substituiertem Hydroxy(C_1-6-Alkan), gegebenenfalls substituiertem Phenol, gegebenenfalls substituiertem Hydroxy(C_1-6-alkyl)benzol, NH₃, gegebenenfalls substituiertem Amino(C_1-6-alkan), gegebenenfalls substituiertem Anilin, gegebenenfalls substituiertem Amino(C_1-6-alkyl)benzol, gegebenenfalls substituiertem Thio(C_1-6-alkan), gegebenenfalls substituiertem Benzolthiol, gegebenenfalls substituiertem Thio(C_1-6-alkyl)benzol, M-K-OH, M-K-NH₂ und M-K-SH ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das nucleophile Reagens 3-Hydroxypropionitril, NH₃, 3-Mercaptopropionitril, Benzylalkohol, 2-Hydroxy-Ethylbenzol, 2-Hydroxy-1-Nitroethan und Benzylamin ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–3, worin das Molarverhaltnis zwischen der Verbindung II und dem nucleophilen Reagens innerhalb des Bereichs von 1:2 bis 1:10 liegt.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das Molarverhaltnis zwischen der Verbindung II und dem nucleophilen Reagens innerhalb des Bereichs von 1:2 bis 1:8 liegt.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das Molarverhaltnis zwischen der Verbindung II und dem nucleophilen Reagens innerhalb des Bereichs von 1:2 bis 1:6 liegt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–6, worin die Behandlung der Verbindung II mit dem nucleophilen Reagens in Anwesenheit einer nichtnucleophilen starken Base vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 7, worin die Behandlung der Verbindung II mit dem nucleophilen Reagens in Anwesenheit von NaH oder LiH vorgenommen wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–8, worin die Behandlung der Verbindung II mit dem nucleophilen Reagens in Anwesenheit eines Lösungsmittels vorgenommen wird, das ausgewählt ist aus Pyridin, Tetrahydrofuran, Toluol, Xylol, Benzol, Diethylether, Acetonitril, Triethylamin, N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dichlormethan und 1,2-Dichlorethan.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–9, worin die Behandlung der Verbindung II mit dem nucleophilen Reagens bei –30 °C bis 100 °C vorgenommen wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–10, worin A¹, A², A³, A⁴ und A⁵ alle Oxygen bedeuten.
Verfahren nach den Ansprüchen 1–11, worin R⁶ ausgewählt ist aus Benzyl, Ortho-, Meta-, Para-Methylbenzyl, 2-Chlorbenzyl, 4-Phenylbenzyl, Tetrahydropyran-2-yl, Benzoyl und Phenyl.
Verfahren nach Anspruch 12, worin R⁶ Benzyl ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–13, worin jeder der Substituenten R⁵ und R⁷ ausgewählt ist aus Methansulfonyl, Trifluormethansulfonyl, Ethansulfonyl, 2,2,2-Trifluorethansulfonyl, Propansulfonyl, Iso-Propansulfonyl, Butansulfonyl, Nonafluorbutansulfonyl, Pentansulfonyl, Cyclopentansulfonyl, Hexansulfonyl, Cyclohexansulfonyl, α-Toluolsulfonyl, 2-chlor-α-Toluolsulfonyl, ortho-, meta-, para-Toluolsulfonyl, Benzolsulfonyl, ortho-, meta-, para-Brombenzolsulfonyl und ortho-, meta-, para-Nitrobenzolsulfonyl.
Verfahren nach Anspruch 14, worin jeder der Substituenten R⁵ und R⁷ ausgewählt ist aus Methansulfonyl, Trifluormethansulfonyl, para-Toluolsulfonyl und para-Brombenzolsulfonyl.
Verfahren nach Anspruch 15, worin beide Substituenten R⁵ und R⁷ Methansulfonyl sind.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–16, worin R⁸ ausgewählt ist aus Acetyl, Benzoyl und m-Trifluormethylbenzoyl.
Verfahren nach Anspruch 17, worin R⁸ Acetyl bedeutet.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–18, worin W OH, SH oder NH₂ bedeutet.
Verfahren nach Anspruch 19, worin W NH₂ bedeutet.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–20, worin X Chlor bedeutet.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1–21, worin A¹, A², A³, A⁴ und A⁵ alle Oxygen bedeuten, X Chlor ist, W NH₂ ist, beide Substituenten R⁵ und R⁷ Methansulfonyl sind, R⁶ Benzyl bedeutet, R⁸ Acetyl bedeutet, und n 1 ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Verbindung der allgemeinen Formel II durch Kopplung einer Verbindung der allgemeinen Formel III hergestellt ist:
worin A¹, A², A³, A⁴, A⁵, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸ und n wie oben definiert sind; und R¹⁴ aus gegebenenfalls substituiertem (C_1-6-Alkyl)carbonyloxy, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkoxy, Halogen, gegebenenfalls substituiertem Arylthio, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkylthio und gegebenenfalls substituiertem Aryloxy ausgewählt ist; mit einem Purin der allgemeinen Formel IV:
worin X und W wie oben definiert sind; in einer Glykosylierungsreaktion.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die Glykosylierungsreaktion in Anwesenheit einer Lewis-Säure vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die Lewis-Säure Trimethylsilyl-Trifluormethansulfonat ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 23–25, worin die Glykosylierungsreaktion in Anwesenheit eines Silylierungsmittel vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 26, worin das Silylierungsmittel N,O-bis(trimethylsilyl)acetamid ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 23–27, worin R¹⁴ aus Acetyloxy, Methoxy, Ethoxy, Chlorid, Fluorid, Bromid, Jodid und SC₆H₅ ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 28, worin R¹⁴ aus Acetyloxy und Methoxy ausgewählt ist.
(1S, 3R, 4R, 7S)-7-Benzyloxy-1-Methansulfonyloxymethyl-3-(guanin-9-yl)-2,5-dioxabi cyclo[2:2:1] Heptan.
9-(2-O-Acetyl-3-O-benzyl-5-O-methansulfonyl-4-C-methansulfonyloxymethyl-β-D-erythro-furanosyl)-2-amino-6-chlorpurin.
9-(3-O-benzyl-5-O-methansulfonyl-4-C-methansulfonyloxymethyl-β-D-e rythro-furanosyl)-2-amino-6-(2-cyanoethoxy)-purin.
Verbindung der allgemeinen Formel II:
worin W aus NR¹R², OR³ und SR⁴ ausgewählt ist; A¹, A², A³, A⁴ und A⁵ unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus O, S und -NR¹³ ausgewählt sind, wo R¹³ aus Hydrogen, gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkyl und gegebenenfalls substituiertem C_1-6-Alkylcarbonyl ausgewählt ist; jeder der Substituenten R¹, R², R³, R⁴, R⁹, R¹⁰, R¹¹ und R¹² unabhängig voneinander aus Hydrogen, gegebenenfalls substituiertem C_1-12-Alkyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkenyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkynyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl, gegebenenfalls substituiertem Aryl(C_1-6-alkyl), gegebenenfalls substituiertem Arylcarbonyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl(C_1-6alkyl)-Carbonyl, gegebenenfalls substituiertem C_1-12-Alkylcarbonyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkenylcarbonyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkynylcarbonyl, gegebenenfalls substituiertem Arylsulfonyl, gegebenenfalls substituiertem C_1-12-Alkylsulfonyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkenylsulfonyl, gegebenenfalls substituiertem C_2-12-Alkynylsulfonyl, C_1-12-Alkoxycarbonyl, Formyl, Tetrahydropyran-2-yl, gegebenenfalls substituiertem Heteroaryl, gegebenenfalls substituiertem Heteroarylcarbonyl, Carbamoyl und "aktiven/funktionellen" Gruppen der allgemeinen Form M-K ausgewählt sind, wobei M den "aktiven/funktionellen" Teil der betreffenden Gruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DNA-Interkalatoren, photochemisch aktiven Gruppen, thermochemisch aktiven Gruppen, Chelatgruppen, Reportergruppen und Liganden, und K ein Spacer ist, durch den ein "aktiver/funktioneller" Teil am Purinring angebracht ist, und wobei K gegebenenfalls ein Spacer ist, der 1–50 Atome umfasst; R⁵ aus gegebenenfalls substituiertem Alkylsulfonyl, gegebenenfalls substituiertem Arylsulfonyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl(C_1-6alkyl), gegebenenfalls substituiertem Arylcarbonyl und Tri(alkyl/aryl)silyl ausgewählt ist; R⁶ aus gegebenenfalls substituiertem Aryl(C_1-6-alkyl), gegebenenfalls substituiertem Tetrahydropyran-2-yl, gegebenenfalls substituiertem Arylcarbonyl, gegebenenfalls substituiertem Aryl und Tri(alkyl/aryl)silyl ausgewählt ist; R⁵ und R⁶ zusammen auch Dialkyldisiloxanyliden bedeuten können; und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 ist; R⁷ aus gegebenenfalls substituiertem Alkylsulfonyl und gegebenenfalls substituiertem Arylsulfonyl ausgewählt ist, R⁸ aus Hydrogen, gegebenenfalls substituiertem (C_1-6-alkyl)carbonyl, gegebenenfalls substituiertem arylcarbonyl, tri(alkyl/aryl)silyl und Fluorenyl(C_1-6-alkyl)oxycarbonyl ausgewählt ist; und X aus Halogen, CN, gegebenenfalls substituiertem Alkylsulfonyl und gegebenenfalls substituiertem Arylsulfonyl ausgewählt ist.
Verbindung nach Anspruch 33, worin A¹, A², A³ und A⁴ alle Oxygen bedeuten.
Verbindung nach den Ansprüchen 33–34, worin R⁶ ausgewählt ist aus Benzyl, ortho-, meta-, para-Methylbenzyl, 2-Chlorbenzyl, 4-Phenylbenzyl, Tetrahydropyran-2-yl, Benzoyl und Phenyl.
Verfahren nach Anspruch 35, worin R⁶ Benzyl ist.
Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 33–36, worin jeder der Substituenten R⁵ und R⁷ unabhängig voneinander aus Methansulfonyl, Trifluormethansulfonyl, Ethansulfonyl, 2,2,2-Trifluorethansulfonyl, Propansulfonyl, Iso-Propansulfonyl, Butansulfonyl, Nonafluorbutansulfonyl, Pentansulfonyl, Cyclopentansulfonyl, Hexansulfonyl, Cyclohexansulfonyl, α-Toluolsulfonyl, 2-chlor-α-Toluolsulfonyl, ortho-, meta-, para-Toluolsulfonyl, Benzolsulfonyl, ortho-, meta-, para-Brombenzolsulfonyl und ortho-, meta-, para-Nitrobenzolsulfonyl ausgewählt ist.
Verbindung nach Anspruch 37, worin jeder der Substituenten R⁵ und R⁷ Methansulfonyl, Trifluormethansulfonyl und ortho-, meta-, para-Toluolsulfonyl, vorzugsweise Methansulfonyl und ortho-, meta-, para-Toluolsulfonyl ist.
Verbindung nach Anspruch 38, worin beide Substituenten R⁵ und R⁷ Methansulfonyl sind.
Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 33–39, worin R⁸ Acetyl, Benzoyl und m-Trifluormethylbenzoyl bedeutet.
Verbindung nach Anspruch 40, worin R⁸ Acetyl bedeutet.
Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 33–41, worin W OH, SH oder NH₂ bedeutet.
Verbindung nach Anspruch 42, worin W NH₂ bedeutet.
Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 33–43, worin X Chlor bedeutet.
Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 33–44, worin A¹, A², A³, A⁴ und A⁵ alle Oxygen bedeutet, X Chlor ist, W NH₂ ist, beide Substituenten R⁵ und R⁷ Methansulfonyl sind, R⁸ Benzyl bedeutet, und n 1 ist.