KR102120629B1 - 3차원 조직 배양 및 조직 공학을 위한 글루코만난 스캐폴딩 - Google Patents

3차원 조직 배양 및 조직 공학을 위한 글루코만난 스캐폴딩 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 성장을 촉진할 수 있고 3차원 조직 배양 및 조직 공학에 적합한 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제공한다. 본 발명은 또한 중화된 글루코만난 스캐폴드를 만들고 분해시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 중화된 글루코만난 스캐폴드 상에서 세포를 성장시키는 방법을 추가로 제공한다.

Description

3차원 조직 배양 및 조직 공학을 위한 글루코만난 스캐폴딩{GLUCOMANNAN SCAFFOLDING FOR THREE-DIMENSIONAL TISSUE CULTURE AND ENGINEERING}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 제61/564,553호(출원일: 2011년 11월 29일)에 대한 우선권을 주장하며, 이는 모든 목적을 위하여 본 명세서에 전체가 포함된다.
손상되거나 병든 조직, 예를 들어 심장, 뼈, 간, 각막, 피부를 복구하는 생체 재료를 조작하는 것은 재생 의학에 있어서 활성적인 연구 지점이다. 조사되고 있는 한가지 접근법은, 세포 성장 및 분화를 용이하게 하여 시험관내에서 이식될 수 있는 기능 조직을 형성하는 생체 재료 구조체, 또는 스캐폴드와 결합된 세포를 사용하는 것이다. 세포외 미세환경의 주요 물리적 및 분자 특징을 모방하는 3차원(3D) 조직 배양 시스템은 조직 공학에 엄청난 이점을 제공한다.
생체 재료는 자연적으로 유래된 것, 예를 들어 단백질계 및 다당류계 생체 재료, 또는 합성, 예를 들어 중합체계, 펩티드계 및 세라믹계 생체 재료일 수 있다. 임상 조직 공학에 대한 이들 생체 재료의 설계와 개발을 위해 면역원성, 생분해성, 생체적합성, 개질 용이성 및 투과성과 같은 특성의 엄격한 탐색이 필요하다. 특히 높은 다공성 및 충분한 기공 크기는 세포 파종과 세포 및 영양소의 확산에 중요하다.
천연 생체 재료의 준비 가용성 및 생체적합성은 콜라겐을 가지고, 알킨산과 키토산은 이러한 천연 생체 재료를 3D 조직 배양에 매력적인 기질로 만들었다. 그러나, 파종된 세포의 일관성 없는 기계적 특성과 거동이 있는 문제는 이들의 임상 적용을 제한한다.
뼈 공학에 있어서, 스캐폴드의 다공성 및 기공 크기는 중요한 인자인 것으로 나타났다. 이전의 연구는 더 큰 기공(약 200 내지 300㎛)은 이온/기체 교환, 단백질 흡착, 및 뼈 인회석 무기물화를 촉진시킬 수 있는 표면 영역을 더 크게 만든다는 것을 나타내었다(Karageorgiou et al . Biomaterials 2005 26:5474-91; Yuan et al . Biomaterials 1999 20: 1799-806). 또한 더 큰 기공 크기가 천연 뼈의 피질 표면 및 해면 모양의 내부를 모방하고 이식물의 혈관을 발달시키는데 필요할 수 있다고 여겨진다(Karageorgiou et al . Biomaterials 2005 26:5474-91). 이와 같이, 뼈 세포와 함께 파종도로 뼈 재생에 사용될 수 있는 기공이 큰 스캐폴드에 대한 필요성이 있다.
글루코만난은 대략 11개 잔기마다 분지가 있는 D-만노스에 대하여 β-1,4 결합 D-글루코스의 비가 1:1.6으로 구성된 자연적으로 유래된 다당류이다(Alonso-Sande et al . Eur J Pharm Biopharm. 2009 72:453-62). 글루코만난은 가용성을 부여하는 소수성 상호작용 및 수소 결합에 관여하는 대략 5 내지 10% 치환된 아세틸기의 주쇄를 가진다. 알칼리의 존재 하에서 아세틸기의 가수분해는 글루코만난의 가용성을 감소시키고 응집하게 되어 겔을 형성하게 된다. 글루코만난은 유화제 및 증점제로서 식품에 일반적으로 사용되며 겔화 및 생분해 특성뿐만 아니라 필름, 미드 및 하이드로겔로 성형되는 전성으로 인하여 생물 약제학적 적용에 대하여 조사되고 있다. 글루코만난계 비드, 마이크로입자 및 나노입자는 DNA 및 약물 전달을 위해 개발되었으며(Liu et al . Drug Deliv . 2007 14:397-402; Wang et al . Int J Pharm. 2002 244: 117-26; Wen et al . Int J Biol Macromol . 2008 42:256-63), 경구 독성, 피부 감작, 장 독성, 배아 독성(embryotoxicity), 또는 세포 노화가 관찰되는 상당한 징후가 없다(Konishi et al Jpn J Exp Med. 1984 54: 139-42).
글루코만난은 최근에 연골세포 배양을 위한 복합 스캐폴드 및 연골 재생을 위한 주사가능한 스캐폴드로서 조사되어 왔다(Kondo et al . J Tissue Eng Regen Med. 2009 3:361-7). 이 조사는 곤약 글루코만난/히알루론산 하이드로겔을 생성하게 하였고, 여기서 세포는 배양되어 겔 중 현탁액으로서 덩어리를 형성하게 된다. 그러나, 조직 공학 적용을 위한 다공성 스캐폴드로서 글루코만난을 개발하는 탐구는 이제 수행되어야 한다.
놀랍게도, 본 발명은 세포 성장을 촉진시킬 수 있고, 3D 세포 배양 및 조직 공학뿐 아니라 생체 내 조직 재생, 예를 들어 뼈 재생을 위한 신규한 생체 재료 스캐폴드로서 유용한 글루코만난 미소공성 매트릭스를 제공한다.
염기성 글루코만난 스캐폴드가 중화될 때, 생성된 중화된 글루코만난 스캐폴드는 3차원(3D) 세포 배양 및 조직 공학을 위한 매트릭스로서 유용하다는 것이 밝혀졌다. 중화된 글루코만난 스캐폴드는 효율적인 세포 배양에 적합한 pH를 가지고, 산소, 영양소, 발현된 생성물 및 세포 폐기물의 확산을 가능하게 할 수 있는 다공성 구조를 가진다. 게다가, 본 발명의 중화된 글루코만난 스캐폴드는 표면 개질하기 쉬워서 세포 부착 및 증식을 촉진시킨다. 이러한 자연적으로 유래된 생체 재료 스캐폴드는 열적으로 안정적이고 비독성이며 생분해성이고, 광범위한 세포 유형, 예를 들어 조골세포, 간세포, 림프구 및 줄기 세포의 천연 3차원 미세환경을 모방할 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 pH가 약 8 초과인 염기성 글루코만난 스캐폴드를 대기압보다 높거나 거의 대기압인 압력에서 수용액과 접촉시켜서 pH가 약 7인 중화된 글루코만난 스캐폴드를 형성하며, 이에 의하여 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제조하는 단계를 포함하는, 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제조하는 방법을 제공한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 pH가 약 8 초과인 염기성 글루코만난 스캐폴드를 진공 압력 하에서 수용액과 접촉시켜서 pH가 약 7인 중화된 글루코만난 스캐폴드를 형성하며, 이에 의하여 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제조하는 단계를 포함하는, 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 중화된 글루코만난 스캐폴드와 세포의 반응 혼합물을 가열하여 세포를 증식시키고, 이에 의하여 중화된 글루코만난 스캐폴드 상에서 세포를 성장시키는 단계를 포함하는, 중화된 글루코만난 스캐폴드 상에서 세포를 성장시키는 방법을 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 pH가 약 8 초과인 염기성 글루코만난 스캐폴드를 수용액과 접촉시켜서 pH가 약 7인 중화된 글루코만난 스캐폴드를 형성함으로써 제조되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 pH가 약 8 초과인 염기성 글루코만난 스캐폴드를 대기압보다 높거나 거의 대기압인 압력에서 수용액과 접촉시켜서 pH가 약 7인 중화된 글루코만난 스캐폴드를 형성함으로써 제조되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제공하며, 여기서 염기성 글루코만난 스캐폴드는 세포 부착 프로모터를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 중화된 글루코만난 스캐폴드를 분해제와 접촉시킴으로써 본 발명의 중화된 글루코만난 스캐폴드를 분해시키는 방법을 제공한다.
도 1은 물로 승화시킨 후 글루코만난 겔의 표면(A)과 내부 구조(B), 글루코만난 스캐폴드 상에 파종된 인간 중간엽 줄기 세포(human mesenchymal stem cells; hMSC)(C, D)를 나타내는 글루코만난 스캐폴드 및 hMSC의 주사 전자 현미경 사진(표면 토폴로지).
도 2는 hMSC의 부착에 대한 폴리-L-리신(PLL)의 영향을 나타낸 그래프. PLL은 겔화 전 글루코만난 혼합물에 첨가되었다. hMSC는 대조군에 비하여 생성된 스캐폴드에 대하여 상당히 더 우수한 부착을 보였다(p<0.05)
도 3a 및 도 3b는 글루코만난 스캐폴드에서 배양된 hMSC의 생물 발광을 나타낸 도식. 반딧불이 루시페라제를 발현하는 hMSC를 대조군 또는 PLL-처리 글루코만난 스캐폴드 상에 파종하고 매주 영상화하였다. 대조군 스캐폴드에서 배양된 세포는 시간의 경과에 따라 생물 발광 수준의 증가를 보였다. 그러나, 글루코만난 스캐폴드에서 배양된 hMSC는 파종 부위로 제한되었으며 생물 발광의 증가를 보이지 않았다.
도 4는 글루코만난 스캐폴드에서 hMSC의 조직학을 나타낸 사진. 글루코만난 스캐폴드에서 배양된 hMSC는 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 세포 파종 전 글루코만난 스캐폴드는 (A) 도처에서 다공성 구조[200 내지 300㎛]를 나타내었다. 파종 후, 세포는 상이한 평태를 나타내었으며 구조(B 내지 D)를 형성하였다(10배 배율).
도 5는 비멘틴 및 사이토케라틴의 발현을 나타낸 사진. 배양 플레이트 상에서 배양된 모든 hMSC는 강한 비멘틴(B) 발현을 나타내었지만 사이토케라틴(A) 발현은 나타내지 않았다. 글루코만난 스캐폴드 상에 파종된 세포는 비멘틴 발현을 나타내었다(D, C = 아이소타입 대조군). 불규칙한 형상의 루멘을 둘러싸는 세포는 강한 사이토케라틴 발현을 나타내었으며, 이들 루멘을 라이닝하는 편평한 세포는 비멘틴과 사이토케라틴을 모두 발현하였다(E, F).
도 6은 글루코만난 스캐폴드의 효소 분해를 나타낸 도식. rhMSC와 함께 파종된 글루코만난 스캐폴드는 0.5, 5.0 및 50유닛/㎖의 셀룰라제 또는 β-만나나제로 분해시켰고, 스캐폴드로부터 방출된 세포는 트립신처리하고 계수하였다. 셀룰라제와 함께 항온처리된 스캐폴드는 모든 농도에서 세포의 효과적인 방출을 나타내었다. 그러나, 0.5유닛/㎖의 β-만나나제는 셀룰라제와 유사한 결과를 나타낸 반면(C), β-만나나제의 더 높은 농도는 차선의 세포 수를 생성하였다. 방출된 세포 응집물을 세척하고 밤새 배양하였다(A). 세포의 성장 결과물을 관찰하였다(B). 배율 = 10배, 삽입물 = 20배.
도 7은 글루코만난 스캐폴드 상으로 파종된 hMSC의 골형성 분화를 나타낸 사진. 글루코만난 스캐폴드 상으로 파종되고 골형성 유도 배지와 함께 그리고 골형성 유도 배지 없이 배양된 rhMSC를 인간 오스테오폰틴 및 뼈 시알로단백질 II(bone sialoprotein II; BSP II)에 대한 항체로 염색하였다. 유도된 hMSC는 오스테오폰틴 및 BSP II 발현 모두를 나타내었다. 비유도된 세포는 BSP II 발현을 개시하였다. 폰 코사(Von Kossa) 염색은 비유도 및 유도된 스캐폴드 모두에서 미네랄 침착을 나타내었아. 배율 = 10배.
도 8은 글루코만난 스캐폴드에서 CD34+ 조혈 세포와 공동 배양된 hMSC의 주사 전자 현미경 사진. hMSC를 글루코만난 스캐폴드 상으로 파종하고 CD34+ 조혈 세포와 공동 배양하였다. SEM 이미지는 hMSC에 대한 CD34+ 세포의 부착을 나타낸다(A 내지 D). hMSC는 기공을 "가교"하는 능력을 나타내었다(B).
도 9는 제작 전 및 후 글루코만난 스캐폴드를 나타낸 사진. 이러한 이미지는 실시예 1의 일부분일 수 있다. 글루코만난 스캐폴드는 척추의 형상(상부 오른쪽) 및 다양한 형상으로 제작하여 칼 또는 생검 펀치를 사용함으로써 세포 및 배양 용기에 맞추었다. 이 도면은 본 발명의 스캐폴드가 상이한 기관 시스템을 닮은 다양한 형상으로 제작될 수 있음을 나타내는 개념 증명 예를 제공한다.
도 10은 중화된 글루코만난 스캐폴드 및 인간 줄기 세포를 사용하여 생성된 3차원 뼈 구조체의 전체 이미지.
I. 정의
본원에서 사용된, 용어 "글루코만난"은 대략 11개 잔기마다 분지가 있는 D-만노스에 대하여 β-1,4-결합 D-글루코스의 비가 대략 1:1.6으로 구성된 자연적으로 유래된 다당류(Alonso-Sande et al . Eur J Pharm Biopharm. 2009 72:453-462) 및 이의 유도체이다. 글루코만난은 가용성을 부여하는 소수성 상호작용 및 수소 결합에 관여하는 대략 5 내지 10% 치환된 아세틸기의 주쇄를 가진다. 예시적인 글루코만난 유도체는 수용성 유도체, 예를 들어 O-알킬 유도체 및 O-카복시알킬 유도체, 다양한 치환도를 가지는 유도체(예컨대, 5 내지 10% 초과 또는 미만으로 치환된 아세틸기), 다양한 산화도를 가지는 유도체, 그래프트 공중합체(예컨대, 아크릴레이트 및 아크릴아마이드 공중합체) 및 이들의 염(예컨대, 이들의 4차 암모늄 염)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용된, 용어 "글루코만난 겔"은 열적으로 안정적이며 가교결합된 글루코만난의 균질한 현탁액이다. 글루코만난 겔은 다양한 방식으로 형성될 수 있으며, 상기 방식은 알칼리의 존재 하 글루코만난의 아세틸기의 가수분해를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 글루코만난 겔은 개질되어 세포 부착 및 증식을 촉진시킬 수 있다. 예시적인 개질은 세포 부착 프로모터의 혼입, 화학적 가교결합, 표면 코팅 및 작용기의 도입을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용된, 용어 "염기성 글루코만난 스캐폴드"는 글루코만난 겔을 탈수시킴으로써 형성되고 pH가 약 8 초과인 3차원 다공성 매트릭스를 말한다. 본 발명의 염기성 글루코만난 스캐폴드는 개질되어 세포 부착 및 증식을 촉진시킬 수 있다. 예시적인 개질은 세포 부착 프로모터의 혼입, 표면 코팅 및 작용기의 도입을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용된, 용어 "중화된 글루코만난 스캐폴드"는 세포 배양 및 조직 재생을 비롯한 조직 공학에 적합한 3차원 환경을 제공하며 pH가 약 7인 다공성 매트릭스를 말한다. 본 발명의 중화된 글루코만난 스캐폴드는 염기성 글루코만난 스캐폴드를 수용액으로 중화시킴으로써 형성된다. 본 발명의 중화된 글루코만난 스캐폴드는 개질되어 세포 부착 및 증식을 촉진시킬 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "접촉"은 적어도 2개의 별개의 종이 반응할 수 있도록 접촉되게 하는 과정을 말한다. 그러나, 생성된 반응 생성물은 첨가된 시약 사이에서의 반응으로부터, 또는 첨가된 시약의 하나 이상으로부터 반응 혼합물에서 생성될 수 있는 중간체로부터 직접적으로 생성될 수 있음이 이해되어야 한다.
본원에서 사용된, 용어 "세포 부착 프로모터"는, 예를 들어 기질의 표면을 개질함으로써 및/또는 표면 전하를 변경시킴으로써, 배양 기질에 세포의 부착 또는 부가를 향상시키는 천연 또는 합성 제제를 말한다. 세포 부착 프로모터는 또한 배양 기질에 혈청 또는 세포외 기질 단백질의 흡착을 향상시킬 수 있다. 예시적인 세포 부착 프로모터는 폴리-L-리신(PLL), 폴리-D-리신(PDL), RGD 펩타이드(RGD), KQAGDV, VAPG, FGL, 아민기, 및 세포외 기질 단백질, 예를 들어 피브로넥틴, 엘라스틴, 콜라겐 및 라미닌을 포함한다. 세포 부착 프로모터는 또한 세포 성장 및 세포 분화를 촉진시킬 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "완충 용액"은 완충액, 또는 약산과 이의 짝염기, 또는 약염기와 이의 짝산의 혼합물인 이온성 화합물의 균질한 혼합물을 말하며 수 중에서 H의 변화가 일어나지 않게 한다. 예시적인 완충액은 인산완충액, 예를 들어 인산완충식염수(PBS), 3-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}프로판설폰산(TAPS) 1,3-비스(트리스(하이드록시메틸)메틸아미노)프로판(BIS-TRIS), 트리스(하이드록시메틸)메틸아민(TRIS), 4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산(TES), 3-(N-모폴리노)프로판설폰산(MOPS), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)(PIPES) 및 2-(N-모폴리노)에탄설폰산(MES)을 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "산성 용액"은 산, 또는 수 중에서 양성자 공여체로서 작용하는 물질의 균질한 혼합물을 말한다. 산성 용액은 pH가 7 미만이다. 예시적인 산성 용액은 염산, 아세트산, 타르타르산, 말산 및 시트르산을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용된, 용어 "알칼리성 용액"은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 염을 포함하며 pH가 7 초과인 염기성 용액을 말한다. 대표적인 알칼리 금속 및 알칼리 토금속의 염은 수산화나트륨, 탄산나트륨, 수산화칼륨, 탄산칼륨, 수산화마그네슘, 탄산마그네슘, 수산화칼슘 및 탄산칼슘을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용된, 용어 "세포 배양 배지"는 세포의 성장을 지지하는 물질을 말한다. 세포 배양 배지는 통상적으로 완충 용액 중에 용해된 영양소의 혼합물을 포함하며, 상이한 유형의 세포 배양 배지는 상이한 유형의 세포를 성장시키는데 유용하다. 예시적인 세포 배양 배지는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 배지(Roswell Park Memorial Institute medium; RPMI), 둘베코의 개질된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM), 최소 영양 배지(Minimum Essential Medium; MEM), 둘베코의 개질된 이글 배지: 영양소 혼합물 F-12 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 medium; DMEM/F12), 이스코브의 개질된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium; IMDM), 배양 배지 유형의 국립 컬렉션(National Collection of Type Cultures medium; NCTC) 및 골형성 유도 배지(Osteogenic Induction Medium; OIM)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 사용된, 용어 "분해"는 스캐폴드를 함께 유지하는 가교 결합을 파괴하는 것을 말한다. 분해는 글리코시드 결합을 가수분해시키는 분해제를 사용하여 이루어진다. 스캐폴드 분해제는 임의의 화학물질 또는 효소, 예를 들어 엔도-1,4 β-만나나제, 만난 엔도-1,4-β-만노시다제, 글리코실 하이드롤라제 또는 셀룰라제일 수 있으며, 스캐폴드 분해제는 중화된 글루코만난 스캐폴드에 부가되거나 중화된 글루코만난 스캐폴드 내에 포함된 세포를 분해시키지 않는다. 다른 효소들도 본 발명에서 유용하다.
II . 중화된 글루코만난 스캐폴드
본 발명은 3차원 세포 배양 및 조직 공학에 대한 신규 스캐폴드로서 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제공한다. 중화된 글루코만난 스캐폴드는 세포를 배양하는데 적합한 중성 환경, 고도의 다공성 구조 및 기공 크기를 제공한다. 중화된 글루코만난 스캐폴드는 세포 부착 프로모터를 포함할 수 있다. 게다가, 상기 스캐폴드는 상동성이고 열적으로 안정적이며 탄력이 있고 생체적합성이 있으며 생분해성이고, 예를 들어 조형 또는 절삭에 의하여 3D 조직 배양 및 공학에 적합한 임의의 형상 및 크기로 만들어질 수 있다. 중화된 글루코만난 스캐폴드는 또한 오토클레이브에 의해 멸균되어, 이식 및 기타 생체 내 적용에 유용하게 만들어질 수 있다.
알지네이트계 스캐폴드(예컨대, AlgiMatrix)와 달리, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 크기는 한정되지 않는다. 추가적으로, 알지네이트계 스캐폴드를 개질하는데 다중의 복합한 화학 반응이 요구되는 것에 비하여 중화된 글루코만난 스캐폴드는 세포 부착을 위해 단일 단계로 개질될 수 있다.
중화된 글루코만난 스캐폴드는 염기성 글루코만난 스캐폴드를 중화하는데 적합한 임의의 조건에 의해 제조될 수 있다. 적합한 조건은, 예를 들어 적합한 시간 내에 글루코만난 스캐폴드의 pH를 약 8 이상에서 약 7로 낮출 수 있는 것이다. 예를 들어, 염기성 글루코만난 스캐폴드는 가열된 환경에서, 예를 들어 오토클레이브 내에서 수용액과 접촉될 수 있다. 대안적으로, 적합한 조건은 적합한 시간 동안 수용액을 사용하여 염기성 글루코만난 스캐폴드를 연속적으로 헹구는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 pH가 약 8 초과인 염기성 글루코만난 스캐폴드를 대기압보다 높거나 거의 대기압인 압력에서 수용액과 접촉시켜서 pH가 약 7인 중화된 글루코만난 스캐폴드를 형성하며, 이에 의하여 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제조하는 단계를 포함하는, 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제조하는 방법을 제공한다.
염기성 글루코만난 스캐폴드는 약 8.0 이상의 임의의 적합한 pH를 가질 수 있다. 적합한 pH의 예는 약 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0 및 그 이상을 포함한다.
중화된 글루코만난 스캐폴드는 약 7인 임의의 적합한 pH를 가질 수 있다. 적합한 pH의 예는 약 6.0 내지 약 8.0, 예를 들어 약 6.1 내지 약 7.9, 약 6.2 내지 약 7.8, 약 6.3 내지 약 7.7, 약 6.4 내지 약 7.6, 약 6.5 내지 약 7.5를 포함한다.
접촉은 임의의 적합한 온도에서 실행될 수 있다. 예를 들어, 온도는 실온, 실온 초과 또는 실온 미만일 수 있다. 일부 실시형태에서, 온도는 증기를 형성하는데 적합하다. 일부 실시형태에서, 온도는 약 0℃ 내지 약 200℃, 또는 약 20℃ 내지 약 200℃, 또는 약 20℃ 내지 약 150℃, 또는 약 0℃ 내지 약 130℃, 또는 약 20℃ 내지 약 130℃, 또는 약 20℃ 내지 약 100℃, 또는 약 20℃ 내지 약 50℃, 또는 약 30℃ 내지 약 50℃, 또는 약 50℃ 내지 약 200℃, 또는 약 75℃ 내지 약 150℃, 또는 약 100℃ 내지 약 150℃일 수 있다. 온도는 또한 약 0℃, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 약 200℃일 수 있다. 온도는 또한 약 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 45℃일 수 있다. 일부 실시형태에서, 접촉은 약 0℃ 내지 약 130℃의 온도에서 실행될 수 있다. 다른 실시형태에서, 접촉은 약 20℃ 내지 약 50℃의 온도에서 실행될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 접촉은 약 37℃의 온도에서 실행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 온도는 약 실온이다.
접촉은 임의의 적합한 압력에서 실행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 접촉은 감압 또는 증압 하에서 실행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 접촉은 대기압 초과에서 실행된다. 일부 실시형태에서, 접촉은 대기압보다 약 0.1psi 내지 약 50psi 높은 압력에서 실행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 접촉은 대기압보다 1psi 내지 약 50psi 높은 압력에서 실행될 수 있다. 기타 유용한 압력은 대기압보다 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 약 45psi 높은 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 접촉은 대기압보다 약 1psi 내지 약 30psi 높은 압력에서 실행된다. 또 다른 실시형태에서, 접촉은 대기압보다 약 10psi 내지 약 20psi 높은 압력에서 실행된다. 일부 실시형태에서, 접촉은 대기압보다 약 15psi 높은 압력에서 실행된다.
온도와 압력의 임의의 조합이 염기성 글루코만난 스캐폴드를 중화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 온도는 증기를 생성하는데 충분한 것, 예를 들어 100℃ 초과하는 것일 수 있고, 압력은 대기압보다 높은 것, 예를 들어 대기압보다 약 0.1psi 내지 약 50psi 높은 것일 수 있다. 온도와 압력의 기타 조합, 예를 들어 대기 온도 및 압력이 본 발명에서 유용하다.
접촉은 임의의 적합한 시간 동안 실행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시간은 약 1분 내지 약 1개월일 수 있다. 다른 실시형태에서, 접촉은 약 1시간 내지 약 1주일 동안 실행될 수 있다. 다른 실시형태에서, 접촉은 약 1시간 내지 약 1일 동안 실행될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 접촉은 약 8시간내지 약 20시간 동안 실행될 수 있다.
염기성 글루코만난 스캐폴드는 다양한 기타 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 부착 프로모터, 화학주성 분자 및 세포 신호전달 분자가 염기성 글루코만난 스캐폴드 내에 함입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 염기성 글루코만난 스캐폴드는 적합한 세포 부착 프로모터를 포함한다. 본 발명에서 유용한 세포 부착 프로모터는 글루코만난 스캐폴드에 세포를 부착할 수 있다. 세포 부착 프로모터는 또한 세포 성장을 촉진시키고/촉진시키거나 세포 분화를 촉진시킬 수 있다. 예시적인 세포 부착 프로모터는 폴리-L-리신(PLL), 폴리-D-리신(PDL), RGD 펩티드(RGD), KQAGDV, VAPG, FGL, 아민기, 및 세포외 기질 단백질, 예를 들어 피브로넥틴, 엘라스틴, 콜라겐 및 라미닌을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 부착 프로모터는 폴리-L-리신(PLL), 폴리-D-리신(PDL), RGD 펩티드(RGD), KQAGDV, VAPG, FGL, 아민기, 피브로넥틴, 엘라스틴, 콜라겐 또는 라미닌일 수 있다. 세포외 기질 단백질은 포유류 세포를 비롯한 임의의 적합한 공급원 유래의 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 세포 부착 프로모터는 PLL 또는 RGD이다. 임의의 실시형태에서, 세포 부착 프로모터는 PLL이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 pH가 약 8 초과인 염기성 글루코만난 스캐폴드를 수용액과 접촉시켜서 pH가 약 7인 중화된 글루코만난 스캐폴드를 형성하며, 이에 의하여 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제조하는 단계를 포함하는, 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 염기성 글루코만난 스캐폴드는 세포 부착 프로모터를 포함한다.
다른 실시형태에서, 염기성 글루코만난 스캐폴드는 적합한 화학주성 분자를 포함한다. 예시적인 화학주성 분자는 혈청, 케모카인, 형태 형성 단백질, 성장 인자, 히알루로난을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 실시형태에서, 염기성 글루코만난 스캐폴드는 적합한 세포 신호전달 분자를 포함한다. 예시적인 세포 신호전달 분자는 세포외 기질 단백질, 펩타이드 모티프 및 성장 인자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
수용액은 임의의 적합한 조성을 가질 수 있다. 수용액은 물 또는 물과 중화된 글루코만난 스캐폴드를 분해시키거나 소화시키지 않는 하나 이상의 비알칼리성 제제의 혼합물일 수 있다. 적합한 수용액의 예는 물, 완충 용액, 산성 용액 및 세포 배양 배지를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 수용액은 물, 완충 용액, 산성 용액 또는 세포 배양 배지일 수 있다.
하나의 실시형태에서, 수용액은 완충 용액이다. 적합한 완충 용액의 예는 PBS, TAPS, BIS-TRIS 프로판, TRIS, HEPES, TES, MOPS, PIPES 및 MES를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 완충 용액은 PBS, HEPES, MES, MOPS, TRIS 또는 BIS-TRIS 프로판이다. 임의의 실시형태에서, 완충 용액은 PBS이다.
다른 실시형태에서, 수용액은 산성 용액이다. 적합한 산성 용액의 예는 예를 들어 염산, 아세트산, 타르타르산, 말산 및 아세트산(이에 한정되는 것은 아님)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 실시형태에서, 수용액은 세포 배양 배지이다. 적합한 세포 배양 배지는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 배지(RPMI), 둘베코의 개질된 이글 배지(DMEM), 최소 영양 배지(MEM), 둘베코의 개질된 이글 배지: 영양소 혼합물 F-12 배지(DMEM/F12), 이스코브의 개질된 둘베코 배지(IMDM), 배양 배지 유형의 국립 컬렉션(NCTC) 및 골형성 유도 배지(OIM)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 배지(RPMI), 둘베코의 개질된 이글 배지(DMEM), 최소 영양 배지(MEM), 둘베코의 개질된 이글 배지: 영양소 혼합물 F-12 배지(DMEM/F12), 이스코브의 개질된 둘베코 배지(IMDM) 또는 배양 배지 유형의 국립 컬렉션(NCTC)이다.
본 발명의 방법은 다양한 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 글루코만난 분말, 알칼리성 용액 및 물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 반응 혼합물을 약 50℃ 내지 약 130℃의 온도에서 가열하여 글루코만난 겔을 형성하는 단계; 글루코만난 겔의 압력을 대기압보다 약 0.1psi 내지 약 50psi 높은 압력으로 증가시키는 단계; 글루코만난 겔을 약 50℃ 미만의 온도로 냉각시키는 단계; 및 글루코만난 겔로부터 물을 제거하여 염기성 글루코만난 스캐폴드를 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 염기성 글루코만난 스캐폴드는 상기 기재된 세포 부착 프로모터로 추가로 개질될 수 있다.
본 발명의 방법은 다양한 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 글루코만난 분말, 세포 부착 프로모터, 알칼리성 용액 및 물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 반응 혼합물을 약 50℃ 내지 약 130℃의 온도에서 가열하여 글루코만난 겔을 형성하는 단계; 글루코만난 겔의 압력을 대기압보다 약 0.1psi 내지 약 50psi 높은 압력으로 증가시키는 단계; 글루코만난 겔을 약 50℃ 미만의 온도로 냉각시키는 단계; 및 글루코만난 겔로부터 물을 제거하여 염기성 글루코만난 스캐폴드를 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
알칼리성 용액은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 염을 포함하는 임의의 용액일 수 있다. 알칼리성 용액은 pH가 7 초과인 염기성이다. 대표적인 알칼리 금속 및 알칼리 토금속의 염은 수산화나트륨, 탄산나트륨, 수산화칼륨, 탄산칼륨, 수산화마그네슘, 탄산마그네슘, 수산화칼슘 및 탄산칼슘을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 알칼리성 용액은 수산화칼슘을 포함한다.
글루코만난 분말, 세포 부착 프로모터 및 수산화칼슘은 각각 반응 혼합물에 임의의 적합한 양으로 존재할 수 있다. 임의의 실시형태에서, 글루코만난 분말은 물에 용해되어 수 중에 글루코만난을 약 1% 내지 약 5% w/v 함유하는 글루코만난 용액을 제공한다.
다른 실시형태에서, 세포 부착 프로모터는 세포 부착 프로모터를 약 0.0001% 내지 약 20% w/v 함유하는 수용액으로서 글루코만난 용액에 첨가된다. 일 실시형태에서, 세포 부착 프로모터는 세포 부착 프로모터를 약 0.0001% 내지 약 10% w/v 함유하는 수용액으로서 글루코만난 용액에 첨가된다. 다른 실시형태에서, 세포 부착 프로모터는 세포 부착 프로모터를 약 0.0001% 내지 약 1% w/v 함유하는 수용액으로서 글루코만난 용액에 첨가된다.
또 다른 실시형태에서, 수산화칼슘은 글루코만난 용액에 대하여 수산화칼슘의 임의의 적합한 비를 제공하는 양으로 글ㄹ코만난 용액에 첨가된다. 예를 들어, 글루코만난 용액에 대한 수산화칼슘의 비는 약 1:1000 내지 약 1:1(w/v)일 수 있다. 일 실시형태에서, 비는 1:10(w/v)이다. 다른 실시형태에서, 수산화칼슘은 수산화칼슘을 약 1% 내지 약 2% w/v 함유하는 수용액으로서 글루코만난 용액에 첨가된다.
반응 혼합물은 접촉 단계에 대하여 상기 기재한 것과 같은 임의의 적합한 온도에서 형성될 수 있다.
반응 혼합물은 임의의 적합한 온도로 가열될 수 있다. 일부 실시형태에서, 온도는 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130℃ 또는 그 이상보다 높을 수 있다. 일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 약 130℃ 초과의 온도에서 가열될 수 있다 일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 약 80℃ 초과의 온도로 가열될 수 있다.
글루코만난 겔의 압력은 임의의 적합한 압력으로 증가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 압력은 대기압보다 약 0.1psi 내지 약 200psi 높은 압력으로 증가될 수 있다. 다른 실시형태에서, 압력은 대기압보다 약 0.1psi 내지 약 50psi 높은 압력으로 증가된다. 임의의 실시형태에서, 압력은 약 30psi로 증가된다.
글루코만난 겔의 온도는 임의의 적합한 온도로 냉각될 수 있다. 일부 실시형태에서, 온도는 약 80℃ 미만으로 냉각된다. 임의의 실시형태에서, 온도는 약 50℃ 미만으로 냉각된다.
물은 임의의 적당한 방법에 의해 글루코만난 겔로부터 제거될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제거 단계는 동결-건조, 승화 또는 열적 유도 상 분리 작업에 의해 실행된다. 임의의 실시형태에서, 제거 단계는 승화에 의해 실행된다.
중화된 글루코만난 스캐폴드는 임의의 적합한 기공 크기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 중화된 글루코만난 스캐폴드는 기공 크기가 약 100㎛ 내지 약 400㎛이다. 다른 실시형태에서, 중화된 글루코만난 스캐폴드는 기공 크기가 약 150㎛ 내지 약 350㎛일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 중화된 글루코만난 스캐폴드는 기공 크기가 약 200㎛ 내지 약 300㎛일 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 pH가 약 8 초과인 염기성 글루코만난 스캐폴드를 대기압보다 높거나 거의 대기압인 압력에서 수용액과 접촉시켜서 pH가 약 7인 중화된 글루코만난 스캐폴드를 형성하며, 이에 의하여 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제조하는 단계를 포함하는, 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제조하는 방법을 제공한다.
접촉은 또한 임의의 적합한 진공 압력 하에서 실행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 접촉은 약 0.1mmHg 내지 760mmHg의 진공 압력 하에서 실행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 접촉은 약 10mmHg 내지 500mmHg의 진공 압력 하에서 실행될 수 있다. 기타 유용한 진공 압력은 약 20, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500mmHg를 포함한다. 다른 실시형태에서, 접촉은 약 10psi 내지 약 300mmHg의 진공 압력 하에서 실행된다. 또 다른 실시형태에서, 접촉은 약 400mmHg의 진공 압력에서 실행된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 pH가 약 8 초과인 염기성 글루코만난 스캐폴드를 수용액과 접촉시켜서 pH가 약 7인 중화된 글루코만난 스캐폴드를 형성함으로써 제조되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 pH가 약 8 초과인 염기성 글루코만난 스캐폴드를 수용액과 접촉시켜서 pH가 약 7인 중화된 글루코만난 스캐폴드를 형성함으로써 제조되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제공하며, 여기서 염기성 글루코만난 스캐폴드는 세포 부착 프로모터를 포함한다.
본 발명은 또한 중화된 글루코만난 스캐폴드를 분해제와 접촉시킴으로써 본 발명의 중화된 글루코만난 스캐폴드를 분해시키는 방법을 제공한다. 분해제는 글리코시드 결합을 가수분해할 수 있는 임의의 적합한 제제일 수 있다. 분해제는 임의의 화학물질 또는 효소일 수 있다. 분해제로서 유용한 효소는 엔도-1,4 β-만나나제, 만난 엔도-1,4-β-만노시다제, 글리코실 하이드롤라제 및 셀룰라제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 기타 분해제는 만나나제, 펙티나제, 자일라나제, 글루카나제, 갈락타나제, 또는 기타 다른 것들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 본 발명의 중화된 글루코만난 스캐폴드 및 적합한 생체 재료를 포함하는 복합 스캐폴드를 제공한다. 적합한 생체 재료는 단백질계 및 다당류계 생체 재료 및 중합체계, 펩타이드계 및 세라믹계 생체 재료를 포함한다. 예시적인 생체 재료는 세포외 기질 단백질(예컨대, 피브로넥틴, 엘라스틴, 콜라겐 및 라미닌), 알지네이트, 키토산, 히알루론산, 마트리겔(Tatrigel), 젤라틴, 하이드록시아파타이트, 인산칼슘 및 생활성 유리를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 다양한 글루코만난 스캐폴드를 제조하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 중성 글루코만난 스캐폴드를 제공한다. 중성 글루코만난 스캐폴드는 pH가 약 7일 수 있다.
일부 실시형태에서, 글루코만난 스캐폴드는 pH가 약 8 이상인 염기성 글루코만난 스캐폴드일 수 있다.
일부 실시형태에서, 글루코만난 스캐폴드는 세포 부착 프로모터를 포함한다. 상기 기재된 것과 같은 임의의 적합한 세포 부착 프로모터가 본 발명에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 부착 프로모터는 폴리-L-리신(PLL), 폴리-D-리신(PDL), RGD 펩타이드(RGD), KQAGDV, VAPG, FGL, 아민기, 피브로넥틴, 엘라스틴, 콜라겐 또는 라미닌을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세푸 부착 프로모터는 폴리-L-리신(PLL)일 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 글루코만난 스캐폴드는 상기 기재된 것과 같은 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 글루코만난 스캐폴드는 본 발명의 방법에 의해 제조된다.
III . 세포의 성장
본 발명의 중화된 글루코만난 스캐폴드는 세포를 성장시키는데 유용하다. 중화된 글루코만난 스캐폴드 상에서 배양된 세포는 기타 세포들 및 세포 유형과 상호작용하여 응집물을 형성할 수 있다. 중화된 글루코만난 스캐폴드에의 세포 부착 및 상기 스캐폴드 상에서의 세포 증식은 세포 부착 프로모터의 함입에 의해 촉진될 수 있다. 장기간의 배양은 중화된 글루코만난 스캐폴드에 의해 지지된다. 중화된 글루코만난 스캐폴드 상에서 배양될 때, 세포는 증식 및 분화를 겪을 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포는 골세포, 연골, 피부 세포 및 혈액 세포와 같은 기능적 계통으로 분화될 수 있다. 따라서, 골형성, 연골형성 및 조혈 작용과 같은 세포 과정은 중화된 글루코만난 스캐폴드 상에서 지지될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 중화된 글루코만난 스캐폴드와 세포의 반응 혼합물을 가열하여 세포를 증식시키고, 이에 의하여 중화된 글루코만난 스캐폴드 상에서 세포를 성장시키는 단계를 포함하는, 중화된 글루코만난 스캐폴드 상에서 세포를 성장시키는 방법을 제공한다. 세포는 생체 내 또는 시험관 내에서 성장될 수 있다.
적합한 세포 유형은 체세포, 예를 들어 섬유아세포, 피부 세포, 내피 세포, 골세포, 간세포, 뉴런 및 연골세포, 줄기 세포 및 전구 세포, 예를 들어 내피 전구 세포, 배아 줄기 세포, 유도만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈모세포, 신경 줄기 세포 및 근육 줄기 세포, 및 이들의 유도체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포이다. 임의의 실시형태에서, 세포는 줄기 세포이다. 임의의 다른 실시형태에서, 세포는 줄기 세포의 유도체이다.
중화된 글루코만난 스캐폴드 상에서 성장한 세포는 임의의 적합한 제제를 사용하여 글루코만난 스캐폴드를 용해시킴으로써 회수할 수 있다. 예를 들어, 글루코만난 스캐폴드는 하나 이상의 효소, 예를 들어 만나나제, 셀룰라제, 펙티나제, 자일라나제, 글루카나제, 갈락타나제 또는 기타 다른 것들을 사용하여 용해될 수 있다. 글루코만난 스캐폴드를 용해시키기 위한 기타 제제는 당업자에게 공지되어 있다.
IV . 실시예
실시예 1: 글루코만난 스캐폴드의 제조
글루코만난 분말(1 내지 5g)을 증류수 100㎖ 중에 용해시키고 5분 동안 서서히 교반시킨 다음, 용액을 실온에서 60분 동안 항온처리하였다. 수산화칼슘 용액(1.5%, 10㎖; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트루이스 소재)을 글루코만난 용액에 첨가하고 1분 동안 격렬하게 혼합하였다. 폴리-L-리신(시그마-알드리치)(0.001% 내지 1% w/v 수용액)을 혼합물에 첨가하고 30분 동안 디클로킹 챔버(decloaking chamber)에서 125℃까지 가열하였다. 실온으로 냉각한 후, 글루코만난 겔을 밤새 증류수에 담가두었다. 글루코만난 겔을 배양 접시에 둔 다음, 30분 동안 -50℃ 이하에서 송풍 냉동기에서 냉동시켰다. 비트리스 모델 50-SRC-5 승화기(Vitris model 50-SRC-5 Sublimator)를 사용하여 물을 승화시켰다. -58℃ 이하인 응축기 온도를 이용하여 저장 온도는 12℃였고, 진공은 80 내지 100밀리토르에서 유지하였다. 그 다음 생성된 글루코만난 생성물을 폴리에틸렌 주머니에 포장하고, 진공 밀봉하였으며, 사용할 때까지 -20℃ 이하에서 보관하였다.
글루코만난 스캐폴드의 중화
승화 전 물로 헹굼. 물의 승화 전에 글루코만난 겔을 다량의 물(대략 5리터)로 밤새(16 내지 24시간) 여러 번 세척하였다. 물의 승화 후, 글루코만난 스캐폴드를 물에 담구고, pH 지시약에 대하여 스캐폴드를 눌렀다. 스캐폴드는 pH가 10 초과인 것으로 나타났다. 이는 물의 승화 전 글루코만난 겔의 세척 및 물의 승화 후 글루코만난 스캐폴드를 물에 잠깐 담구어둔 것이 스캐폴드를 중화시키는 데 불충분하였다는 것을 나타내었다.
통상적인 PBS 세척. 글루코만나 스캐폴드를 PBS 중에서 1회 또는 3회 세척하였다. 이는 스캐폴드의 피상적인(오직 표면만) 중화를 가져와서 내부의 pH는 9 또는 10을 초과하였다. 또한 글루코만난 스캐폴드를 PBS 중에서 10, 30 및 60분 동안 세척하였다. 모든 경우에서, 이러한 접근법은 상기 기재된 바와 같이 스캐폴드의 피상적인 중화를 가져왔다. 이러한 결과는 완충 용액 중에서의 스캐폴드의 통상적인 세척은 포유류 세포를 배양하는 데 필수적인 스캐폴드의 중화에 불충분하다는 것을 나타내었다.
가열된 PBS 세척. 그 다음 글루코만난 스캐폴드를 PBS 중에서 30분 동안 95 내지 100℃에서 항온처리하였다. 스캐폴드의 가시적인 수축을 주목하였다. 끓는 PBS에서 30분 후, 스캐폴드를 절단하고 pH 지시약에 대하여 눌렀다. 스캐폴드의 외부 영역은 중성 pH를 나타내었다. 그러나, 스캐폴드의 중심은 스캐폴드 물질의 응축을 나타나었고, 이 중심 영역은 중성 범위를 벗어나 있었다. 상기 기재된 모든 경우에, 스캐폴드는 물에 뜬 상태를 유지하였으며, 이는 내부 공기 주머니의 존재를 나타낸다. 심지어 끓는 PBS로 30분 동안 처리한 후 조차에도, 스캐폴드는 형상이 현저하게 원하지 않는 변화를 보이면서 물에 뜬 상태를 유지하였다. 이러한 결과는 PBS가 스캐폴드 내부에 포집된 공기를 완전히 대체하지 않으며, 이는 불충분한 중화를 가져온다는 것을 나타내었다.
가압화된 PBS 세척. 글루코만난 스캐폴드를 PBS가 담긴 비커로 옮기고, 대기압보다 15psi 높은 가압 챔버에서 30분 동안 120℃에서 항온처리하였다. 스캐폴드의 수축이 관찰되지 않았다. 스캐폴드는 PBS 중에서 가라앉았으며, 이는 공기 주머니가 PBS로 완전히 대체되었음을 나타낸다. 글루코만난 생성물을 냉각시키고 평균 PBS 중에서 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. pH 지시약을 사용하여 스캐폴드의 pH가 중성이었음을 확인하였다. 전체 스캐폴드는 형상의 어떠한 변화없이 중성 pH를 나타내었다.
진공 하에서의 PBS 세척. 글루코만난 스캐폴드를 필터 상에 두고 진공 압력을 스캐폴드의 맨 아래 부분에 400mmHg에서 적용하였다. 1㎖의 PBS를 스캐폴드의 최상부에 10회 적용하였다. 절차 후, pH 지시약을 사용하여 스캐폴드의 pH가 중성이었음을 확인하였다. 전체 스캐폴드는 형상의 어떠한 변화없이 중성 pH를 나타내었다.
실시예 2: 중화된 글루코만난 스캐폴드 상에서의 세포 성장
세포의 제조. 인간 중배엽 줄기 세포(hMSC), 골수 단핵 세포(N-3, 여성 1명과 남성 2명, 20 내지 40세; 캄브렉스(Cambrex), 미국 뉴저지주 이스트루터포드 소재)를, 20% 소태아혈청(FBS), 1% L-글루타민, 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(인비트로겐(Invitrogen) 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)을 함유하는 α-MEM 중 100㎜ 플레이트에 놓고, 5% C02, 37℃에서 배양하였다. 플레이트를 세포가 대략 80%의 컨플루언스에 도달할 때까지 2일에 한번씩 인산완충식염수(PBS)로 3회 세척하였다. 세포를 37℃에서 5분 동안 0.25% 트립신-EDTA(인비트로겐)과 함께 배양하였다. 배양 배지를 불활성화시키기 위하여 트립신-EDTA을 1:1 비율로 세포에 첨가하였다. 세포를 배양 배지에 5x103 세포수/㎠로 재도말하였다. 세포를 최대 3계대까지 배양하고, 매 계대마다 제어된 속도 프로토콜을 사용하여 저온 보존하였으며, 사용할 때까지 액체 질소 중에서 보관하였다. CD34+ 세포에 대하여, 상기 언급된 골수 단핵 세포의 하위세트를 선택 완충액(selection buffer)(PBS 중 0.5% 소혈청 알부민-BSA 및 2mM EDTA를 함유하는 PBS) 중에서 PE(클론 581, BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 산호세 소재)와 접합된 CD34 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 선택 완충액 중에서 세척하고 항-PE 마이크로비드(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 독일 베르기슈 글라드바흐 소재)와 함께 4℃에서 20분 동안 배양하였다. 세포를 세척하고 선택 완충액의 500㎕ 중에 재현탁한 다음, 분리 컬럼(밀테니 바이오텍)에 적용하였다. 분리 컬럼은 3번 세척하고, 유지된 세포를 1㎖의 선택 완충액으로 용출시켰다. 분리 과정의 제2라운드는 용출된 세포에 대하여 실행하였다.
형질도입. 제2 계대 유래의 저온 보존된 hMSC를 해동하고 4㎎/㎖ 폴리브렌(시그마-알드리치)을 함유하는 배지 중 MND 프로모터의 제어 하에서 반딧불이 루시퍼라제를 발현하는 HIV-1-유래 렌티바이러스 벡터(1x106 감염성 입자/㎖)로 형질도입하였다. 세포가 대략 80%의 컨플루언스에 도달할 때까지 세포를 배양하였다. D-루시페린을 100㎎/㎖로 세포의 하위세트에 첨가하고, 광도계(시리우스(Sirius), 베르톨드, 독일 프로츠하임 소재)를 사용하여 생물 발광을 측정하여 성공적인 형질도입 여부를 확인하였다.
세포 파종 및 생물 발광 영상화. 글루코만난 스캐폴드를 대략 1㎝ x 1㎝ x 0.5㎝(폭 x 깊이 x 높이)로 절단하고, 재수화시켰으며, PBS로 5회 세척하고, 배양 배지에서 밤새 항온처리하였다. hMSC(1x106/스캐폴드)를 12웰 플레이트 중 글루코만난 스캐폴드 상으로 파종하고 5주 동안 배양하였다. 이비스 200(IVIS 200) 영상화 시스템(캘리퍼 라이프 사이언스(Caliper Life Sciences), 미국 매사추세츠주 홉킨턴 소재)을 사용하여 매 3 내지 4일마다 각 웰에 100㎎/㎖의 D-루시페린을 첨가한 후 생물 발광에 대하여 세포를 영상화하고, 이미지를 리빙 이미지 소프트웨어(Living Image software; version 3.1, 캘리퍼 라이프 사이언스)를 사용하여 분석하였다.
주사 전자 현미경. 파종된 hMSC가 있는 그리고 파종된 hMSC가 없는 글루코만난 스캐폴드를 등급화된 에탄올 계열 중에서 탈수시켰다. 또한 hMSC가 있는 스캐폴드는 CD34+ 세포(1 x 106)와 함께 공동 배양하였고, 3일 동안 항온처리하였으며, 이후 에탄올로 탈수시켰다. 샘플을 탄소 이중 스티키 탭(carbon double sticky tab)을 사용하여 12㎜ 알루미늄 핀 스터브 상에 장착하고, 펠코 오토 스퍼터 코터 SC-7(PELCO Auto Sputter Coater SC-7)을 사용하여 금으로 스퍼터 코팅하였으며, 필립스(Philips) XL30 TMP 주사㎖ 전자 현미경 상에서 관찰하였다.
실시예 3: 효소 분해
동결건조된 엔도-1,4 β-만나나제(메가자임(Megazyme)) 또는 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)(시그마-알드리치)로부터 얻은 셀룰라제를 배양 배지에 용해시켰다. hMSC이 파종된 스캐폴드를 0.5유닛/㎖, 5.0유닛/㎖, 또는 50유닛/㎖의 엔도-1,4 β-만나나제 또는 셀룰라제 중에서 밤새 항온처리하였다. 스캐폴드의 분해는 시각적으로 확인하였다. 일단 스캐폴드가 완전히 용해되면, 세포를 계수하였다.
실시예 4: 골형성 분화
hMSC이 파종된 스캐폴드를 골형성 유도 배지(캄브렉스(Cambrex)) 또는 배양 배지(대조군) 중에서 항온처리하였으며, 제조자의 권고사항에 따라서 배지는 매 3 내지 4일마다 바꾸었다. 3주 후, 스캐폴드를 10% 포르말린 중에 고정시키고, 그 다음 에탄올로 탈수시켰으며, 파라핀으로 포매시켰다. 스캐폴드를 면역조직화학을 위하여 6㎜로 자르고, 폰 코사 염색을 하였다.
면역세포화학. 부분(5 내지 6㎛)을 자일렌으로 처리한 다음, 등급화된 농도의 에탄올로 처리하였다. 슬라이드를 PBS로 세척한 후, 시트르산완충액(pH 6, 인비트로겐) 중 열-매개 항원 회수를 실행하였다. 냉각 후, PBS 중 따뜻한 시트르산완충액의 농도를 낮춘 다음, 백그라운드 스니퍼(Background Sniper; 바이오케어 메디컬(BioCare Medical) 미국 캘리포니아주 콩코드 소재)와 함께 항온처리를 적용하였으며, 상기 백그라운드 스니퍼는 15분 동안 각각의 슬라이드에 첨가하였다. 슬라이드를 PBS로 2번 세척한 다음, 2% 염소 혈청(시그마-알드리치)을 포함하는 차단완충액(1% BSA, 0.1% 어피 젤라틴, 0.1% 트리톤(Triton) X, 0.05% 트윈(tween)-20) 과 함께 1시간 동안 항온처리하였다. PBS로 2회 세척한 후, 일차 항체 완충액(1% BSA, 0.1% 어피 겔) 중에서 희석된 일차 항체를 4℃의 가습 챔버에서 밤새 슬라이드와 함께 항온처리하였다. 사용된 일차 항체는 1:50으로 희석된 광범위한 토끼 다중클론성 항-인간 사이토케라틴 항체(아브캄(Abcam), 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재) 및 1:100으로 희석된 마우스 단일클론성 항-인간 비멘틴 항체(시그마-알드리치)이었다. 뼈 마커에 있어서, 래트 단일클론성 항-인간 오스테오폰틴 항체 및 마우스 단일클론성 항-인간 뼈 시알로프로틴 II 항체(밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 빌러리카 소재)를 1:200 희석물로 사용하였다. 마우스, 래트 및 토끼 IgG 아이소타입 대조군(인비트로겐)을 포함하였다. 슬라이드를 PBS로 5분 동안 세척하고 실온의 암실에서 1시간 동안 이차 항체와 함께 항온처리하였다. 사용된 이차 항체는, 형광 항체 희석물(바이오케어 메디컬) 중에 1:200으로 희석된 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 염소 항-마우스, 알렉사 플루오르 954 염소 항-래트, 및 알렉사 플루오르 594 염소 항-토끼 항체(인비트로겐)이었다. PBS로 2번 세척한 후, 슬라이드를 프로롱 골드(ProLong Gold(등록상표)) 페이딩 방지 시약을 DAPI(인비트로겐) 및 놓여진 커버슬립과 함께 이용하여 장착하였다. 글라이드는 올림푸스(Olympus) BX61 현미경 하에서 관찰하였다.
폰 코사 염색. 부분(5 내지 6㎛)을 자일렌으로 처리한 다음, 등급화된 농도의 에탄올로 처리하였다. 부분을 증류수로 세척하고 자외선 하에서 1시간 동안 1% 질산은 수용액과 함께 항온처리한 다음, 증류수로 세척하고 5분 동안 5% 티오황산나트륨을 이용하여 항온처리하였다. 부분을 증류수로 세척하고 5분 동안 0.1% 뉴클리어패스트레드 용액과 함께 항온처리한 다음 등급화된 알코올 및 자일렌을 통하여 탈수시켰다. 그 다음 커버슬립을 영구적인 장착 매질 중의 슬라이드 위에 놓고 올림푸스 BX61 현미경 하에서 관찰하였다.
결과는 평균(SEM)의 평균 ± 표준 오차로서 기록되어 있으며, 마이크로소프트 엑셀(마이크로소프트(Microsoft), 미국 워싱턴주 레드먼드 소재)을 사용하여 계산하였다. 통계적 유의성(p<0.05)은 양면 스튜던트 t-테스트 분석법(two-sided Student's t-test analysis)에 의해 결정하였다.
상기한 발명이 이해의 명확함을 목적으로 예시 및 실시예에 의해 일부 상세한 내용으로 기술되었지만, 당업자는 첨부된 특허청구범위의 범주 내에서 임의의 변화 및 변형이 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 추가적으로, 본원에 제공된 각각의 참고문헌은, 각각의 참조문헌이 개별적으로 참조로 포함되어 있는 것과 같은 정도로 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.

Claims (29)

  1. 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 pH가 8 초과인 염기성 글루코만난 스캐폴드를 대기압보다 0.1psi 내지 50psi 높은 압력에서 수용액과 접촉시켜서 pH가 6 내지 8인 중화된 글루코만난 스캐폴드를 형성함으로써, 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제조하는 단계를 포함하는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 접촉은 0℃ 내지 130℃의 온도에서 실행되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 접촉은 20℃ 내지 50℃의 온도에서 실행되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 접촉은 37℃의 온도에서 실행되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 접촉은 1분 내지 1개월의 기간 동안 실행되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 접촉은 1시간 내지 1주의 기간 동안 실행되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 접촉은 1시간 내지 1일의 기간 동안 실행되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 접촉은 8시간 내지 20시간의 기간 동안 실행되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 염기성 글루코만난 스캐폴드는 세포 부착 프로모터를 추가로 포함하는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포 부착 프로모터는 폴리-L-리신(PLL), 폴리-D-리신(PDL), RGD 펩타이드(RGD), KQAGDV, VAPG, FGL, 아민기, 피브로넥틴, 엘라스틴, 콜라겐 및 라미닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포 부착 프로모터는 폴리-L-리신(PLL)인, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 방법은,
    글루코만난 분말, 세포 부착 프로모터, 알칼리성 용액 및 물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계;
    반응 혼합물을 50℃ 내지 130℃의 온도에서 가열하여 글루코만난 겔을 형성하는 단계;
    글루코만난 겔의 압력을 대기압보다 0.1psi 내지 200psi 높게 증가시키는 단계;
    글루코만난 겔을 50℃ 미만의 온도로 냉각시키는 단계; 및
    글루코만난 겔로부터 물을 제거하여 염기성 글루코만난 스캐폴드를 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 압력은 14.7psi 내지 50psi 증가되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  14. 제12항에 있어서, 물을 제거하는 단계는 승화에 의해 실행되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 수용액은 물, 완충 용액, 산성 용액 및 세포 배양 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 수용액은 완충 용액인, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 완충 용액은 PBS, HEPES, MES, MOPS, TRIS 및 BIS-TRIS 프로판으로 이루어진 군에서 선택되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 완충 용액은 PBS인, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 수용액은 세포 배양 배지인, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 배지(Roswell Park Memorial Institute medium; RPMI), 둘베코의 개질된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM), 최소 영양 배지(Minimum Essential Medium; MEM), 둘베코의 개질된 이글 배지: 영양소 혼합물 F-12 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 medium; DMEM/F12), 이스코브의 개질된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium; IMDM), 배양 배지 유형의 국립 컬렉션(National Collection of Type Cultures medium; NCTC) 및 골형성 유도 배지(Osteogenic Induction Medium; OIM)로 이루어진 군에서 선택되는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  21. 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 pH가 8 초과인 염기성 글루코만난 스캐폴드를 진공 압력 하에서 수용액과 접촉시켜서 pH가 6 내지 8인 중화된 글루코만난 스캐폴드를 형성함으로써, 중화된 글루코만난 스캐폴드를 제조하는 단계를 포함하는, 중화된 글루코만난 스캐폴드의 제조방법.
  22. 중화된 글루코만난 스캐폴드 상에서 세포를 성장시키는 방법으로서, 상기 방법은 제1항의 중화된 글루코만난 스캐폴드와 세포의 반응 혼합물을 가열하여 세포를 증식시킴으로써, 중화된 글루코만난 스캐폴드 상에서 세포를 성장시키는 단계를 포함하는, 세포의 성장방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 세포는 체세포, 줄기 또는 전구 세포 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포의 성장방법.
  24. 제1항의 방법에 의해 제조되는, pH가 6 내지 8인 글루코만난 스캐폴드.
  25. 제24항에 있어서, 세포 부착 프로모터를 포함하는 글루코만난 스캐폴드.
  26. 제25항에 있어서, 세포 부착 프로모터는 폴리-L-리신(PLL), 폴리-D-리신(PDL), RGD 펩타이드(RGD), KQAGDV, VAPG, FGL, 아민기, 피브로넥틴, 엘라스틴, 콜라겐 및 라미닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 글루코만난 스캐폴드.
  27. 제26항에 있어서, 상기 세포 부착 프로모터는 폴리-L-리신(PLL)인, 글루코만난 스캐폴드.
  28. 삭제
  29. 삭제
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