JP2017205113A - 三次元の組織培養およびティッシュエンジニアリングのためのグルコマンナンスキャフォールド - Google Patents

Abstract

【課題】細胞増殖を促進させる性質を備え、三次元的な組織培養及びティッシュエンジニアリングに適する中和グルコマンナンスキャフォールドの提供。【解決手段】中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する方法であって、ｐＨが約８を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドをほぼ大気圧又は大気圧を超える気圧で水溶液と接触させてｐＨが約７である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより前記中和グルコマンナンスキャフォールドを作製することを含む、方法。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は２０１１年１１月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／５６４，５５３号に基づく優先権を主張し、同仮特許出願の全文が、あらゆる目的のため本明細書に組み込まれる。

心臓、骨、肝臓、角膜、および皮膚といった組織が損傷を受けるかあるいは疾患を来した場合にそれを生体材料の構築によって補修することは、再生医療における盛んな研究分野である。現在研究が進められているアプローチのひとつとして、細胞の増殖や分化を促進する生体材料構造体、すなわちスキャフォールドと細胞を組み合わせることにより、移植可能な機能性組織をｉｎ ｖｉｔｒｏで作製する試みがある。細胞外微小環境の主な物理的および分子的特徴を再現した三次元的（３Ｄ）組織培養系はティッシュエンジニアリングに多大なる恩恵をもたらすといえる。

生体材料には天然由来の材料、たとえばタンパク質や多糖を主原料とする生体材料もあれば、合成により得られる材料、たとえば高分子やペプチド、セラミックを主原料とする生体材料もある。こうした生体材料を臨床でのティッシュエンジニアリングを目的として設計および開発するにあたっては免疫原性や生分解性、生体適合性、改良の容易さ、および透過性といった物性を厳密に検討する必要がある。また、細胞の播種および細胞や栄養素の拡散には多孔性や適切な孔径が特に重要となる。

コラーゲン、アルジネート、キトサンといった天然由来の生体材料は入手が容易であり生体適合性も備えるため、３Ｄ組織培養用の基質として魅力的な存在となっている。しかしながら機械的性質や播種後の細胞の挙動が一貫しないことに伴う課題のため、その臨床応用は限定される。

骨の構築に際しては、スキャフォールドの多孔度および孔径が重要な要素であることが明らかになっている。過去の研究から、孔径が大きいほど（約２００〜３００μｍ）表面積が大きくなり、イオン／ガスの交換、タンパク質の吸着および骨アパタイトの石灰化が促される可能性があることが示されている（Ｋａｒａｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００５ ２６：５４７４〜９１、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．
Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １９９９ ２０：１７９９〜８０６）。インプラントに血管を形成し、自然骨の皮質表面およびその内側の海綿状部分を再現するにはさらに大きな孔径が必要となる可能性も考えられる（Ｋａｒａｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００５ ２６：５４７４〜９１）。したがって、骨細胞を播種可能で骨の再生に利用しうる大きな細孔を有するスキャフォールドが必要とされているといえる。

グルコマンナンは、Ｄ−グルコースとＤ−マンノースとが１：１．６の割合でβ−１，４結合した構造に約１１残基間隔で側鎖を有する天然由来の多糖である（Ａｌｏｎｓｏ−Ｓａｎｄｅ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ． ２００９ ７２：４５３〜６２）。グルコマンナンは、約５〜１０％が置換されたアセチル基からなる主鎖を有し、これらのアセチル基が水素結合および疎水性相互作用に関与する結果、可溶性が獲得される。アセチル基をアルカリの存在下で加水分解するとグルコマンナンの可溶性が低下し、凝集に至り、ゲルが形成される。グルコマンナンは、乳化剤や増粘剤として食品に広く使われているほか、そのゲル化性や生分解性、そしてフイルムやビーズ、ヒドロゲルへの成形が可能な展性を理由にバイオ医薬品への応用に向けても調査が進められている。グルコマンナンを主原料とするビーズやマイクロ粒子、ナノ粒子がＤＮＡや薬物の送達媒体として開発されており（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． ２００７ １４：３９７〜４０２、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ． ２００２ ２４４：１１７〜２６、Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌ． ２００８ ４２：２５６〜６３）、経口毒性や皮膚感作性、腸毒性、胎児毒性、細胞老化の兆候は特に認められていない（Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｊｐｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １９８４ ５４：１３９〜４２）。

最近では、グルコマンナンは軟骨細胞培養用の複合スキャフォールドとして、および軟骨再生用の注射可能なスキャフォールドとして研究されている（Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ． ２００９ ３：３６１〜７）。この調査の結果、細胞が培養され、ゲル内に懸濁物として凝集しうるコンニャクグルコマンナン／ヒアルロン酸ヒドロゲルの製造がなされた。しかしながら、ティッシュエンジニアリングでの用途を意図した多孔質スキャフォールドとしてグルコマンナンを開発することはまだ検討されていない。

本発明は、斬新にも、細胞増殖を促進する性質を有し、三次元的な細胞培養およびティッシュエンジニアリングならびにｉｎ ｖｉｖｏでの組織再生、たとえば骨の再生に用いる新規の生体材料スキャフォールドとして有用なグルコマンナン微孔性マトリックスを提供する。

塩基性グルコマンナンスキャフォールドを中和するとき、その中和されたグルコマンナンスキャフォールドが三次元的（３Ｄ）な細胞培養およびティッシュエンジニアリングのマトリックスとして有用であることが明らかになっている。中和されたグルコマンナンスキャフォールドは細胞の効率的な増殖に適するｐＨ、そして酸素や栄養素、発現産物、細胞老廃物の拡散を可能にする多孔構造を有する。本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドはまた、細胞の接着および増殖の促進を目的としてその表面を改質することも可能である。この天然由来の生体材料スキャフォールドは耐熱性で無毒であり、生分解性を有するほか、骨芽細胞や肝細胞、リンパ球、幹細胞といった幅広い種類の細胞の自然界における三次元的微小環境を模したものであってもよい。

別の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する方法を提供する。当該方法は、ｐＨが約８を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドをほぼ大気圧または大気圧を超える気圧で水溶液と接触させてｐＨが約７である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより、中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する工程を含む。

一実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する方法を提供する。当該方法は、ｐＨが約８を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドを減圧下で水溶液と接触させてｐＨが約７である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより、中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する工程を含む。

別の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールド上で細胞を増殖させる方法を提供する。当該方法は、本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドと細胞との反応混合物をその細胞が増殖するよう加熱することにより、中和グルコマンナンスキャフォールド上で細胞を増殖させる工程を含む。

別の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを提供する。当該中和グルコマンナンスキャフォールドは、ｐＨが約８を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドを水溶液と接触させてｐＨが約７である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより作製される。

別の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを提供する。当該中和グルコマンナンスキャフォールドは、ｐＨが約８を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドをほぼ大気圧または大気圧を超える気圧で水溶液と接触させてｐＨが約７である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより作製される。塩基性グルコマンナンスキャフォールドは細胞接着促進剤を含有する。

さらなる実施形態において、本発明は、本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドを分解剤と接触させることによりその中和グルコマンナンスキャフォールドを分解する方法を提供する。

グルコマンナンスキャフォールドおよびヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の走査型電子顕微鏡像（表面トポロジー）を示す図である。水の昇華後のグルコマンナンゲルの表面（Ａ）および内部構造（Ｂ）ならびにグルコマンナンスキャフォールドに播種されたｈＭＳＣ（Ｃ、Ｄ）を示している。 ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）がｈＭＳＣの接着性に及ぼす影響を示す図である。ＰＬＬはゲル化前のグルコマンナン混合物に添加した。得られたスキャフォールドに対し、ｈＭＳＣは対照と比較して有意に高い接着性を示した（ｐ＜０．０５）。 図３ａおよび図３ｂは、グルコマンナンスキャフォールド内で培養したｈＭＳＣの生物発光を示す図である。ホタルルシフェラーゼを発現しているｈＭＳＣを対照またはＰＬＬで処理したグルコマンナンスキャフォールドに播種し、１週間ごとに撮影した。対照のスキャフォールド内で培養した細胞では生物発光の強度が時間とともに増大した。一方、グルコマンナンスキャフォールド内で培養したｈＭＳＣは播種した位置に拘束され、生物発光の増大を示さなかった。 グルコマンナンスキャフォールド内でのｈＭＳＣの組織構造を示す図である。グルコマンナンスキャフォールド内で培養したｈＭＳＣをヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。細胞播種前のグルコマンナンスキャフォールドは全体的に多孔構造［２００〜３００μｍ］を呈した（Ａ）。播種後、細胞は様々な形態を呈し、構造を形成した（Ｂ〜Ｄ）（倍率１０倍）。 ビメンチンおよびサイトケラチンの発現を示す図である。培養プレート上で培養したすべてのｈＭＳＣでビメンチンが強く発現していた（Ｂ）が、サイトケラチンは発現していなかった（Ａ）。グルコマンナンスキャフォールドに播種した細胞ではビメンチンが発現していた（Ｄ、Ｃはアイソタイプコントロール）。不定形の内腔の周囲に存在する細胞でサイトケラチンが強く発現しており、これらの内腔を覆う平坦な細胞ではビメンチンとサイトケラチンとの両方が発現していた（Ｅ、Ｆ）。 グルコマンナンスキャフォールドの酵素消化を示す図である。ｒｈＭＳＣを播種したグルコマンナンスキャフォールドを０．５、５．０および５０単位／ｍｌのセルラーゼまたはβ−マンナナーゼで消化し、スキャフォールドから遊離した細胞をトリプシン処理したうえでその数を計測した。セルラーゼとともにインキュベートしたスキャフォールドではすべての濃度で細胞の効率的な遊離が認められた。一方β−マンナナーゼは、高濃度で用いた場合は不十分な数の細胞しか得られなかったのに対し、０．５単位／ｍｌではセルロースと同程度の結果を示した（Ｃ）。遊離した細胞凝集塊を洗浄し、終夜培養した（Ａ）。細胞の増殖が認められた（Ｂ）。倍率は１０倍、インサートは２０倍。 グルコマンナンスキャフォールドに播種したｈＭＳＣの骨芽細胞への分化を示す図である。ｒｈＭＳＣをグルコマンナンスキャフォールドに播種し、骨芽細胞分化誘導培地の存在下または非存在下で培養したものを、抗ヒトオステオポンチン抗体および抗ヒト骨シアロタンパク質ＩＩ（ＢＳＰ ＩＩ）抗体で染色した。誘導培地を添加したｈＭＳＣではオステオポンチンとＢＳＰ ＩＩとの両方が発現していた。誘導培地を添加しなかった細胞ではＢＳＰ ＩＩが発現を開始していた。Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色では誘導培地を添加しなかったスキャフォールドと添加したスキャフォールドの両方に無機質の沈着が認められた。倍率は１０倍。 グルコマンナンスキャフォールド内でＣＤ３４＋造血細胞と共培養したｈＭＳＣの走査型電子顕微鏡像を示す図である。ｈＭＳＣをグルコマンナンスキャフォールドに播種し、ＣＤ３４＋造血細胞と共培養した。ＣＤ３４＋細胞によるｈＭＳＣへの接着がＳＥＭ像に認められた（Ａ〜Ｄ）。ｈＭＳＣは細孔を「架橋する」性質を示した（Ｂ）。 加工前および加工後のグルコマンナンスキャフォールドを示す図である。この画像は実施例１の一部であってもよい。ナイフ、生検パンチのうちいずれか一方を用い、ある種の椎骨の一形状（右上）や細胞および培養容器に適合する様々な形状へとグルコマンナンスキャフォールドを加工した。本発明のスキャフォールドが各種の器官系を模した様々な形状に加工しうるという構想を実証したひとつの例をこの図は与えている。 中和グルコマンナンスキャフォールドとヒト幹細胞とを用いて製造した三次元的な骨状構造体の肉眼写真を示す図である。

発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書中、用語「グルコマンナン」はＤ−グルコースとＤ−マンノースとが約１：１．６の割合でβ−１，４結合した構造に約１１残基間隔で側鎖を有する天然由来の多糖（Ａｌｏｎｓｏ−Ｓａｎｄｅ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ． ２００９ ７２：４５３〜４６２）およびその誘導体を意味する。グルコマンナンは約５〜１０％が置換されたアセチル基からなる主鎖を有しており、これらのアセチル基は水素結合および可溶性を与える疎水性相互作用に関与している。グルコマンナン誘導体の例としてはＯ−アルキル誘導体やＯ−カルボキシアルキル誘導体といった水溶性誘導体、置換度が様々に異なる誘導体（５〜１０％超または未満のアセチル基が置換されているなど）、酸化度が様々に異なる誘導体、グラフト共重合体（アクリレート・アクリルアミド共重合体など）とその塩（第四級アンモニウム塩など）が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中、用語「グルコマンナンゲル」は、架橋グルコマンナンが均一に分散した耐熱性の懸濁液を意味する。グルコマンナンゲルは様々な方法で形成することが可能である。方法の例としてはアルカリ存在下におけるグルコマンナンのアセチル基の加水分解が挙げられるが、これに限定されない。本発明のグルコマンナンゲルは細胞の接着および増殖の促進を目的として改質することも可能である。改質の例としては細胞接着促進剤の添加や化学的架橋、表面の被覆、官能基の導入が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中、用語「塩基性グルコマンナンスキャフォールド」は、グルコマンナンゲルの脱水により形成される、ｐＨが約８を超える三次元的な多孔質マトリックスを意味する。本発明の塩基性グルコマンナンスキャフォールドは細胞の接着および増殖の促進を目的として改質することも可能である。改質の例としては細胞接着促進剤の添加や表面の被覆、官能基の導入が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中、用語「中和グルコマンナンスキャフォールド」は、細胞培養およびティッシュエンジニアリング、たとえば組織の再生に適する三次元的な環境を与える、ｐＨが約７である多孔質マトリックスを意味する。本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドは塩基性グルコマンナンスキャフォールドを水溶液で中和することにより生成される。本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドは細胞の接着および増殖の促進を目的として改質することも可能である。

本明細書中、用語「接触」は、少なくとも２種類の異なる化学種をそれらが反応しうるように互いに触れさせる過程を意味する。なお、得られる反応生成物は添加試薬間の反応から直接生成する場合もあれば、添加試薬のうちの１種類以上から反応混合物中に生成しうる中間体から生成する場合もある。

本明細書中、用語「細胞接着促進剤」は、培養基材に対する細胞の接着性または付着性を、たとえばその基材の表面を改質および／または表面電荷の変化により増強させる天然物または合成物を意味する。細胞接着促進剤は培養基材に対する血清タンパク質または細胞外マトリックスタンパク質の吸着性をも増強するものであってもよい。細胞接着促進剤の例としてはポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）やポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）、ＲＧＤペプチド（ＲＧＤ）、ＫＱＡＧＤＶ、ＶＡＰＧ、ＦＧＬ、アミン基のほかフィブロネクチンやエラスチン、コラーゲン、ラミニンといった細胞外マトリックスタンパク質が挙げられる。細胞接着促進剤は細胞増殖および細胞分化をも促進するものであってもよい。

本明細書中、用語「緩衝液」は、緩衝剤、すなわち弱酸とそれに結合する塩基との混合物または弱塩基とそれに結合する酸との混合物でありｐＨの変化を是正するイオン性化合物を、水に均一に混合させて得られる混合物を意味する。緩衝剤の例としては、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）といったリン酸塩緩衝液、３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（ＢＩＳ−ＴＲＩＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン（ＴＲＩＳ）、４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、および２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中、用語「酸性溶液」は、酸、すなわちプロトン供与体として作用する物質を、水に均一に混合させて得られる混合物を意味する。酸性溶液はｐＨが７未満である。酸性溶液の例としては塩酸や酢酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中、用語「アルカリ性溶液」は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩を含有し、ｐＨが７を超える塩基性溶液を意味する。アルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩で代表的なものとしては水酸化ナトリウムや炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中、用語「細胞培養培地」は、細胞増殖の土台となる物質を意味する。細胞培養培地は典型的には緩衝液に溶解する栄養素の混合物を含み、細胞の種類が異なれば有用な細胞培養培地の種類も異なる。細胞培養培地の例としてはロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）やダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地：混合栄養Ｆ−１２培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、イスコフ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ培地（ＮＣＴＣ）、および骨芽細胞分化誘導培地（ＯＩＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中、用語「分解」は、スキャフォールドを一定の形状に保っている架橋結合を切断することを意味する。分解はグリコシド結合を加水分解させる分解剤を用いて行われる。スキャフォールド分解剤は中和グルコマンナンスキャフォールドに接着したまたは包埋された細胞を分解しない薬剤または酵素であればいかなる種類のものであってもよく、その例としてはエンド−１，４ β−マンナナーゼやマンナン エンド−１，４−β−マンノシダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼが挙げられる。他の酵素も本発明では有用である。
ＩＩ．中和グルコマンナンスキャフォールド

本発明は三次元的な細胞培養およびティッシュエンジニアリング用の新規なスキャフォールドである中和グルコマンナンスキャフォールドを提供する。この中和グルコマンナンスキャフォールドは中性の環境、ならびに細胞培養に適する多孔質構造および孔径を提供する。細胞接着促進剤を配合することも可能である。均質かつ耐熱性で弾性を有するとともに生体適合性および生分解性も備え、３Ｄ的な組織培養およびティッシュエンジニアリングに適する形状および大きさに、たとえば成形や切削によって加工することができる。オートクレーブで消毒することにより、移植などｉｎ ｖｉｖｏでの用途に適合させることもできる。

アルジネートを主原料とするスキャフォールド（ＡｌｇｉＭａｔｒｉｘなど）とは異なり、この中和グルコマンナンスキャフォールドは大きさに制約がない。また、アルジネートを主原料とするスキャフォールドがその改質に複数の複雑な化学反応を要するのに対し、この中和グルコマンナンスキャフォールドは単一の工程で細胞接着用に改質することが可能である。

この中和グルコマンナンスキャフォールドの作製は塩基性グルコマンナンスキャフォールドの中和に適するいかなる条件でも行うことができる。適する条件の例としては、グルコマンナンスキャフォールドのｐＨを約８超から約７まで、適切な所要時間で下げることが可能な条件が挙げられる。たとえば、塩基性グルコマンナンスキャフォールドを加熱環境内、たとえばオートクレーブ内で水溶液と接触させることができる。他の適する条件としては、塩基性グルコマンナンスキャフォールドを水溶液で適切な時間にわたって継続的にリンスすることが挙げられる。

一部の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する方法を提供する。この方法は、ｐＨが約８を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドをほぼ大気圧または大気圧を超える気圧で水溶液と接触させてｐＨが約７である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより、中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する工程を含む。

塩基性グルコマンナンスキャフォールドのｐＨは、約８．０以上の任意の適切なｐＨであってよい。適切なｐＨの例としては８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、およびそれを超えるｐＨが挙げられる。

中和グルコマンナンスキャフォールドのｐＨは、約７の任意の適切なｐＨであってよい。適切なｐＨの例としては約６．０〜約８．０、たとえば約６．１〜約７．９、約６．２〜約７．８、約６．３〜約７．７、約６．４〜約７．６、および約６．５〜約７．５が挙げられる。

接触は、任意の適切な温度で行うことができる。たとえば室温とすることができ、あるいは室温を超える温度や室温を下回る温度とすることも可能である。一部の実施形態では、蒸気の発生に適する温度が用いられる。一部の実施形態では、温度を約０℃〜約２００℃、約２０℃〜約２００℃、約２０℃〜約１５０℃、約０℃〜約１３０℃、約２０℃〜約１３０℃、約２０℃〜約１００℃、約２０℃〜約５０℃、約３０℃〜約５０℃、約５０℃〜約２００℃、約７５℃〜約１５０℃または約１００℃〜約１５０℃とすることができる。温度を約０℃、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または約２００℃とすることも可能である。あるいは約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４または４５℃とすることもできる。一部の実施形態では、約０℃〜約１３０℃の温度で接触が行われうる。他の実施形態では、約２０℃〜約５０℃の温度で接触が行われうる。さらに他の実施形態では、約３７℃の温度で接触が行われうる。一部の実施形態では、ほぼ室温が用いられる。

接触は、任意の適切な圧力下で行うことができる。一部の実施形態では、減圧下または加圧下で接触が行われうる。一部の実施形態では、大気圧を超える圧力で接触が行われる。一部の実施形態では、約０．１ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉだけ大気圧を超える圧力で接触が行われうる。一部の実施形態では、約１ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉだけ大気圧を超える圧力で接触が行われうる。他の有用な圧力としては、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または約４５ｐｓｉだけ大気圧を超える圧力が挙げられる。別の実施形態では、約１ｐｓｉ〜約３０ｐｓｉだけ大気圧を超える圧力で接触が行われる。さらに他の実施形態では、約１０ｐｓｉ〜約２０ｐｓｉだけ大気圧を超える圧力で接触が行われる。他の実施形態では、約１５ｐｓｉだけ大気圧を超える圧力で接触が行われる。

塩基性グルコマンナンスキャフォールドを中和する際の温度と圧力との組み合わせは任意である。たとえば温度を蒸気の発生に十分な、たとえば１００℃を超える温度とし、圧力を大気圧よりも高い、たとえば約０．１ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉだけ大気圧を超える圧力とすることが可能である。温度と圧力との他の組み合わせも本発明では有用であり、たとえば大気温度および大気圧が挙げられる。

接触は、任意の適切な期間行うことができる。一部の実施形態では、約１分〜約１ヵ月の期間接触が行われうる。他の実施形態では、約１時間〜約１週間にわたって接触が行われうる。他の実施形態では、約１時間〜約１日にわたって接触が行われうる。さらに他の実施形態では、約８時間〜約２０時間にわたって接触が行われうる。

塩基性グルコマンナンスキャフォールドは、他の様々な成分を含有してもよい。たとえば細胞接着促進剤や走化性分子、細胞シグナル伝達分子を塩基性グルコマンナンスキャフォールドに配合することができる。

一部の実施形態では、塩基性グルコマンナンスキャフォールドは適切な細胞接着促進剤を含有する。本発明で有用な細胞接着促進剤はグルコマンナンスキャフォールドに細胞を接着させる性質を有するものである。細胞接着促進剤は細胞増殖および／または細胞分化をも促進することができる。細胞接着促進剤の例としてはポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）やポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）、ＲＧＤペプチド（ＲＧＤ）、ＫＱＡＧＤＶ、ＶＡＰＧ、ＦＧＬ、アミン基のほかフィブロネクチンやエラスチン、コラーゲン、ラミニンといった細胞外マトリックスタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、細胞接着促進剤がポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）、ＲＧＤペプチド（ＲＧＤ）、ＫＱＡＧＤＶ、ＶＡＰＧ、ＦＧＬ、アミン基、フィブロネクチン、エラスチン、コラーゲンまたはラミニンであってもよい。細胞外マトリックスタンパク質の由来としては任意の適切な由来を使用することができ、例としては哺乳動物細胞が挙げられるがこれに限定されない。一部の実施形態では、細胞接着促進剤がＰＬＬまたはＲＧＤである。特定の実施形態では、細胞接着促進剤がＰＬＬである。

一部の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する方法を提供する。この方法は、ｐＨが約８を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドを水溶液と接触させてｐＨが約７である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより、中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する工程を含む。塩基性グルコマンナンスキャフォールドは細胞接着促進剤を含有する。

別の実施形態では、塩基性グルコマンナンスキャフォールドは適切な走化性分子を含有する。走化性分子の例としては血清やケモカイン、形態形成タンパク質、増殖因子、ヒアルロナンが挙げられるが、これらに限定されない。

別の実施形態では、塩基性グルコマンナンスキャフォールドは適切な細胞シグナル伝達分子を含有する。細胞シグナル伝達分子の例としては細胞外マトリックスタンパク質やペプチドモチーフ、増殖因子が挙げられるが、これらに限定されない。

水溶液の組成としては任意の適切な組成を使用することができる。水溶液は水であっても、中和グルコマンナンスキャフォールドを分解も消化もしない非アルカリ性物質１種類以上と水との混合物であってもよい。適する水溶液の例としては水や緩衝液、酸性溶液、細胞培養培地が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、水溶液が水、緩衝液、酸性溶液または細胞培養培地である。

一実施形態では、上記水溶液は緩衝液である。適する緩衝液の例としてはＰＢＳやＴＡＰＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパン、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、緩衝液がＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＲＩＳまたはＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパンである。特定の実施形態では、緩衝液がＰＢＳである。

別の実施形態では、上記水溶液は酸性溶液である。適する酸性溶液の例として、これらに限定はされないもののたとえば塩酸や酢酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸が挙げられるが、これらに限定されない。

別の実施形態では、上記水溶液は細胞培養培地である。適する細胞培養培地の例としてはロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）やダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地：混合栄養Ｆ−１２培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、イスコフ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ培地（ＮＣＴＣ）、および骨芽細胞分化誘導培地（ＯＩＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、細胞培養培地がロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地：混合栄養Ｆ−１２培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、イスコフ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ培地（ＮＣＴＣ）である。

本発明の方法は様々な追加工程を含んでもよい。一部の実施形態では、上記方法は、グルコマンナン粉末、アルカリ性溶液および水を含有する反応混合物を生成する工程と、前記反応混合物を約５０℃〜約１３０℃の温度で加熱してグルコマンナンゲルを形成する工程と、前記グルコマンナンゲルの圧力を、約０．１ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉだけ大気圧を超える圧力に上昇させる工程と、前記グルコマンナンゲルを約５０℃未満の温度まで冷却する工程と、前記グルコマンナンゲルから前記水を除去して塩基性グルコマンナンゲルを形成する工程とをさらに含む。得られる塩基性グルコマンナンゲルを前述の細胞接着促進剤でさらに改質することも可能である。

本発明の方法は様々な追加工程を含んでもよい。一部の実施形態では、上記方法は、グルコマンナン粉末、細胞接着促進剤、アルカリ性溶液および水を含有する反応混合物を生成する工程と、前記反応混合物を約５０℃〜約１３０℃の温度で加熱してグルコマンナンゲルを形成する工程と、前記グルコマンナンゲルの圧力を、約０．１ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉだけ大気圧を超える圧力に上昇させる工程と、前記グルコマンナンゲルを約５０℃未満の温度まで冷却する工程と、前記グルコマンナンゲルから前記水を除去して塩基性グルコマンナンゲルを形成する工程とをさらに含む。

アルカリ性溶液としてはアルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩を含有する任意の溶液を使用することができる。アルカリ性溶液は塩基性であり、ｐＨが７を超える。アルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩で代表的なものとしては水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、水酸化カルシウム、および炭酸カルシウムが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、アルカリ性溶液が水酸化カルシウムを含有する。

グルコマンナン粉末、細胞接着促進剤および水酸化カルシウムは反応混合物中にそれぞれ任意の適切な量で配合することができる。一部の実施形態では、グルコマンナン粉末を水に溶解させ、水中にグルコマンナン約１％〜約５％（ｗ／ｖ）を含有するグルコマンナン溶液を提供する。

他の実施形態では、このグルコマンナン溶液に、細胞接着促進剤含有率約０．０００１％〜約２０％（ｗ／ｖ）の水溶液を与えるよう細胞接着促進剤が添加される。一実施形態では、このグルコマンナン溶液に、細胞接着促進剤含有率約０．０００１％〜約１０％（ｗ／ｖ）の水溶液を与えるよう細胞接着促進剤が添加される。別の実施形態では、このグルコマンナン溶液に、細胞接着促進剤含有率約０．０００１％〜約１％（ｗ／ｖ）の水溶液を与えるよう細胞接着促進剤が添加される。

さらに他の実施形態では、このグルコマンナン溶液に、適切な水酸化カルシウム対グルコマンナン溶液比を与える量の水酸化カルシウムが添加される。水酸化カルシウム対グルコマンナン溶液比は、たとえば約１：１０００〜約１：１（ｗ／ｗ）とすることが可能である。一実施形態では、この比が１：１０（ｗ／ｗ）である。別の実施形態では、このグルコマンナン溶液に、水酸化カルシウム含有率約１％〜約２％（ｗ／ｖ）の水溶液を与えるよう水酸化カルシウムが添加される。

反応混合物は、任意の適切な温度で生成することができ、その例としては接触工程に関して上に示した温度が挙げられる。

反応混合物は、任意の適切な温度まで加熱することができる。一部の実施形態では、この温度は約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０℃以上かまたはそれを上回る温度であってもよい。一部の実施形態では、約１３０℃を超える温度で反応混合物が加熱されうる。一部の実施形態では、約８０℃を超える温度まで反応混合物が加熱されうる。

グルコマンナンゲルの圧力は、任意の適切な圧力に上昇させることができる。一部の実施形態では、約０．１ｐｓｉ〜約２００ｐｓｉだけ大気圧を超えるまで圧力が高められうる。他の実施形態では、約０．１ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉだけ大気圧を超えるまで圧力が高められる。特定の実施形態では、約３０ｐｓｉまで圧力が高められる。

グルコマンナンゲルは、任意の適切な温度まで冷却することができる。一部の実施形態では、８０℃未満前後まで温度が下げられる。特定の実施形態では、約５０℃未満まで温度が下げられる。

グルコマンナンゲルからの水の除去は任意の適切な方法により行うことができる。一部の実施形態では、この除去工程が凍結乾燥、昇華または熱誘発相分離の作業によって行われる。特定の実施形態では、この除去工程が昇華によって行われる。

中和グルコマンナンスキャフォールドの孔径としては任意の適切な孔径を使用することができる。一部の実施形態では、中和グルコマンナンスキャフォールドの孔径が約１００μｍ〜約４００μｍである。他の実施形態では、中和グルコマンナンスキャフォールドの孔径が約１５０μｍ〜約３５０μｍであってもよい。さらに他の実施形態では、中和グルコマンナンスキャフォールドの孔径が約２００μｍ〜約３００μｍであってもよい。

別の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する方法を提供する。この方法では、ｐＨが約８を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドをほぼ大気圧または大気圧を超える気圧で水溶液と接触させてｐＨが約７である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成する工程により、中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する。

接触は、任意の適切な減圧下で行うことができる。一部の実施形態では、約０．１ｍｍＨｇ〜７６０ｍｍＨｇの減圧下で接触が行われうる。一部の実施形態では、約１０ｍｍＨｇ〜約５００ｍｍＨｇの減圧下で接触が行われうる。他の有用な減圧圧力としては、約２０、５０、１００、２００、３００、４００または５００ｍｍＨｇが挙げられる。別の実施形態では、約１０ｐｓｉ〜約３００ｍｍＨｇの減圧下で接触が行われる。さらに他の実施形態では、約４００ｍｍＨｇの減圧下で接触が行われる。

別の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを提供する。この中和グルコマンナンスキャフォールドは、ｐＨが約８を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドを水溶液と接触させてｐＨが約７である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより作製される。

別の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを提供する。この中和グルコマンナンスキャフォールドは、ｐＨが約８を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドを水溶液と接触させてｐＨが約７である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより作製される。塩基性グルコマンナンスキャフォールドは細胞接着促進剤を含有する。

また、本発明は、本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドを分解剤と接触させることによりその中和グルコマンナンスキャフォールドを分解する方法を提供する。分解剤としてはグリコシド結合を加水分解させる性質を有する任意な適切な物質を使用することができる。分解剤は任意の薬剤であっても酵素であってもよい。分解剤として有用な酵素の例としては、エンド−１，４ β−マンナナーゼやマンナン エンド−１，４−β−マンノシダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。他の分解剤としてはマンナナーゼやペクチナーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、ガラクトナーゼなどの酵素が挙げられるが、これらに限定されない。

また、本発明は、本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドと適切な生体材料とを有する複合スキャフォールドを提供する。適切な生体材料としてはタンパク質および多糖を主原料とする生体材料や高分子、ペプチドおよびセラミックを主原料とする生体材料が挙げられる。生体材料の例としては細胞外マトリックスタンパク質（例えば、フィブロネクチンやエラスチン、コラーゲンおよびラミニン）やアルジネート、キトサン、ヒアルロン酸、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、生体活性ガラスが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の方法を用いて様々なグルコマンナンスキャフォールドを作製することができる。一部の実施形態において、本発明は中性のグルコマンナンスキャフォールドを提供する。この中性のグルコマンナンスキャフォールドは約７のｐＨを有しうる。

一部の実施形態では、このグルコマンナンスキャフォールドが、ｐＨが約８に同等または約８を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドであってもよい。

一部の実施形態では、このグルコマンナンスキャフォールドは細胞接着促進剤を含有する。任意の適切な細胞接着促進剤を本発明に用いることができ、その例としては上に示した細胞接着促進剤が挙げられる。一部の実施形態では、細胞接触促進剤がポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）、ＲＧＤペプチド（ＲＧＤ）、ＫＱＡＧＤＶ、ＶＡＰＧ、ＦＧＬ、アミン基、フィブロネクチン、エラスチン、コラーゲンまたはラミニンであってもよい。一部の実施形態では、細胞接触促進剤がポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）であってもよい。

上述のとおり、本発明のグルコマンナンスキャフォールドは様々な方法で作製することができ、その例としては上記の方法が挙げられる。一部の実施形態では、本発明のグルコマンナンスキャフォールドが本発明の方法により作製される。
ＩＩＩ．細胞の増殖

本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドは細胞の増殖に有用である。この中和グルコマンナンスキャフォールド上で培養された細胞は他の細胞や他の種類の細胞と相互作用し、凝集塊を形成する。この中和グルコマンナンスキャフォールドへの細胞の接着および同スキャフォールド上での細胞の増殖は細胞接着促進剤の配合により促進することが可能である。この中和グルコマンナンスキャフォールドは長期培養にも対応している。この中和グルコマンナンスキャフォールド上での培養により細胞を増殖および分化させることが可能である。たとえば、幹細胞は骨細胞や軟骨、皮膚細胞、血液細胞といった機能性系統へと分化しうる。したがって、骨形成や軟骨形成、造血といった細胞過程をこの中和グルコマンナンスキャフォールド上で生じさせることが可能である。

別の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールド上で細胞を増殖させる方法を提供する。この方法は、本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドと細胞との反応混合物をその細胞が増殖するよう加熱することにより、中和グルコマンナンスキャフォールド上で細胞を増殖させる工程を有する。細胞の増殖はｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも行うことができる。

適する細胞の種類としては線維芽細胞や皮膚細胞、内皮細胞、上皮細胞、骨細胞、肝細胞、神経細胞および軟骨細胞といった体細胞、ならびに上皮前駆細胞や胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、筋幹細胞といった幹細胞および前駆細胞、ならびにこれらの細胞から誘導される細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、前記細胞が体細胞である。他の実施形態では、前記細胞が幹細胞または前駆細胞である。特定の実施形態では、前記細胞が幹細胞である。他の特定の実施形態では、前記細胞が幹細胞から誘導される細胞である。

中和グルコマンナンスキャフォールド上で増殖させた細胞は、任意の適切な物質でグルコマンナンスキャフォールドを溶解させることにより回収することができる。たとえば、マンナナーゼやセルラーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、ガラクタナーゼなどの酵素１種類以上を用いてグルコマンナンスキャフォールドを溶解させることが可能である。グルコマンナンスキャフォールドの溶解に用いられる他の物質は当業者にとって既知のものである。
ＩＶ．実施例
実施例１：グルコマンナンスキャフォールドの作製

グルコマンナン粉末（１〜５ｇ）を蒸留水１００ｍｌに溶解させ、低速で５分間撹拌した後、得られた溶液を室温で６０分間インキュベートした。得られたグルコマンナン溶液に水酸化カルシウム水溶液（１．５％、１０ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州セントルイス）を加え、１分間激しく撹拌した。得られた混合物にポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）（０．００１％〜１％ｗ／ｖ水溶液）を加えたものを加熱・加圧容器（ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ ｃｈａｍｂｅｒ）に入れ、１２５℃まで３０分間加熱した。室温への冷却後、グルコマンナンゲルを蒸留水に終夜浸漬した。グルコマンナンゲルを培養皿に移したものを急速冷凍装置に入れ、−５０℃以下で３０分間凍結させた。Ｖｉｔｒｉｓ社５０−ＳＲＣ−５昇華装置を用いて昇華乾燥を行った。棚温度は１２℃、冷却器の温度は−５８℃以下であり、真空度は８０〜１００ミリトルを維持した。得られたグルコマンナン作製物をポリ袋に入れて真空パック処理し、−２０℃以下で使用時まで保管した。
グルコマンナンスキャフォールドの中和

昇華前に水でリンス。昇華乾燥前に大量の水（約５リットル）を使用して、グルコマンナンゲルの洗浄を一昼夜（１６〜２４時間）繰り返し行った。昇華乾燥後、得られたグルコマンナンスキャフォールドを水に浸漬し、そのスキャフォールドをｐＨ指示薬に押し当てた。スキャフォールドは１０を超えるｐＨを示した。このことから、昇華乾燥前のグルコマンナンゲルを洗浄し、昇華乾燥後のグルコマンナンスキャフォールドを水に短時間浸漬しただけではスキャフォールドの中和には不十分であったことが示された。

従来法でＰＢＳ洗浄。グルコマンナンスキャフォールドをＰＢＳで１回または３回洗浄した。その結果、スキャフォールドの皮相的（表面のみの）中和が起こり、内部のｐＨは９または１０を上回った。また、グルコマンナンスキャフォールドを１０、３０および６０分間にわたりＰＢＳで洗浄した。これらの手法ではいずれの場合も上記と同様のスキャフォールドの皮相的中和が起こるに留まった。これらの知見から、スキャフォールドを緩衝液で従来の方法により洗浄しただけでは哺乳動物細胞の培養に必要なスキャフォールドの中和には不十分であったことが示された。

加熱下でＰＢＳ洗浄。次に、グルコマンナンスキャフォールドを９５〜１００℃のＰＢＳ中で３０分間インキュベートした。肉眼で視認しうる収縮がスキャフォールドに生じた。沸騰するＰＢＳ中での３０分間のインキュベート後、スキャフォールドを切断してｐＨ指示薬に押し当てた。スキャフォールドの外部は中性のｐＨを示した。しかしながらスキャフォールドの中央部にはスキャフォールド材料の濃縮が認められ、この中央部は依然として中性の範囲から外れていた。上記すべての場合を通じてスキャフォールドは水に浮き、したがって内部に気泡が存在していたといえる。沸騰するＰＢＳで３０分間処理した後でさえ、スキャフォールドは著しい所望しない変形を来たしていながらも水に浮かんだ。これらの知見から、ＰＢＳはスキャフォールドの内部に取り込まれた空気を完全には置換しておらず、そのため中和が不十分であったことが示された。

加圧下でＰＢＳ洗浄。ＰＢＳを含むビーカーにグルコマンナンスキャフォールドを移したものを圧力容器に入れ、１５ｐｓｉだけ大気圧を超える圧力において１２０℃で３０分間インキュベートした。スキャフォールドの収縮は認められなかった。スキャフォールドはＰＢＳに沈み、このことから気泡がＰＢＳによって完全に置換されたことが示された。得られたグルコマンナン作製物を冷却し、滅菌ＰＢＳ中にて使用時まで４℃で保管した。ｐＨ指示薬を用いてスキャフォールドのｐＨを確認したところ、中性であった。スキャフォールド全体が中性のｐＨを示し、変形はなかった。

減圧下でＰＢＳ洗浄。グルコマンナンスキャフォールドをフィルターに載せ、スキャフォールドの底面に４００ｍｍＨｇの減圧をアプライした。ＰＢＳ １ｍｌをスキャフォールドの上面に１０回塗布した。その手順の後、ｐＨ指示薬を用いてスキャフォールドのｐＨを確認したところ、中性であった。スキャフォールド全体が中性のｐＨを示し、変形はなかった。
実施例２：中和グルコマンナンスキャフォールド上での細胞増殖

細胞の調製。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）としては、骨髄単核球（Ｎ＝３、女性１名男性２名、年齢２０〜４０歳、Ｃａｍｂｒｅｘ社、米国ニュージャージー州イーストラザフォード）を２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールズバッド）を添加したα−ＭＥＭ中の１００ｍｍプレートに播種し、５％ＣＯ_２中にて３７℃でインキュベートした。リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）による３回のプレート洗浄を、細胞が約８０％コンフルエンスに達するまで１日おきに繰り返し行った。細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とともに３７℃で５分間インキュベートした。培養培地をトリプシン−ＥＤＴＡに対して１：１の割合で細胞に添加することにより失活させた。細胞を培養培地に、細胞数を５×１０^３／ｃｍ^２としてあらためて播種した。３代目まで継代培養した細胞のすべての代を速度制御冷凍法により凍結保存し、液体窒素中にて使用時まで保管した。ＣＤ３４＋細胞としては、前述の骨髄単核球の一部を選択緩衝液（ＰＢＳ中に０．５％ウシ血清アルブミン−ＢＳＡおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）中にて、ＰＥに結合させたＣＤ３４抗体（クローン５８１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国カリフォルニア州サンノゼ）とともに４℃で３０分間インキュベートした。細胞を選択緩衝液で洗浄し、抗ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ドイツ、ベルギッシュ・グラートバッハ）とともに４℃で２０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、選択緩衝液５００μＬに再懸濁させたものを分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）にアプライした。分離カラムを３回洗浄し、残った細胞を選択緩衝液１ｍｌで溶出させた。溶出した細胞を２回目の分離処理に供した。

形質導入。凍結保存しておいたｈＭＳＣのうち２代目を解凍し、ＭＮＤプロモータの制御下でホタルルシフェラーゼを発現させたＨＩＶ−１由来レンチウイルスベクター（感染性粒子数１×１０^６／ｍｌ）による形質導入をポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）４ｍｇ／ｍｌ添加培地中にて行った。終夜インキュベートした細胞をＰＢＳで洗浄した後、新しい培地を補充した。約８０％コンフルエンスに達するまで細胞を培養した。細胞の一部にＤ−ルシフェリン１００ｍｇ／ｍｌを添加し、ルミノメーター（Ｓｉｒｉｕｓ、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社、ドイツ、プフォルツハイム）を用いて生物発光を計測することにより形質導入が無事行われたことを確認した。

細胞播種および生物発光イメージング。グルコマンナンスキャフォールドを約１ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ（幅×奥行×高さ）に切断したものを水で戻し、ＰＢＳで５回洗浄した後、培養培地で終夜インキュベートした。１２ウェルプレート内に設置したグルコマンナンスキャフォールドにｈＭＳＣ（スキャフォールド１個につき１×１０^６個）を播種し、５週間培養した。各ウェルにＤ−ルシフェリン１００ｍｇ／ｍｌを添加した後、３〜４日ごとにＩＶＩＳ ２００イメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国マサチューセッツ州ホプキントン）で細胞からの生物発光を撮影した。得られた画像をＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウエア（バージョン３．１、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で解析した。

走査型電子顕微鏡観察。ｈＭＳＣを播種したグルコマンナンスキャフォールドと播種していないグルコマンナンスキャフォールドとを、段階的エタノール系列液中で脱水した。また、ｈＭＳＣを播種したスキャフォールドをＣＤ３４＋細胞（１×１０^６個）と共培養し、３日間インキュベートした後、エタノールで脱水した。試料をカーボン両面テープで１２ｍｍのアルミニウム製試料台に載せ、ＰＥＬＣＯ Ａｕｔｏ Ｓｐｕｔｔｅｒ Ｃｏａｔｅｒ ＳＣ−７を用いてスパッタリングにより金で被覆した後、Ｐｈｉｌｉｐｓ社ＸＬ３０ ＴＭＰ走査型電子顕微鏡で観察した。
実施例３：酵素消化

エンド−１，４ β−マンナナーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社）またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来セルラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）の凍結乾燥物を培養培地に溶解させた。ｈＭＳＣを播種したスキャフォールドを０．５単位／ｍｌ、５．０単位／ｍｌもしくは５０単位／ｍｌのエンド−１，４ β−マンナナーゼまたはセルラーゼとともに終夜インキュベートした。スキャフォールドの分解を目視にて確認した。スキャフォールドが完全に溶解した時点で細胞数を計測した。
実施例４：骨芽細胞分化

ｈＭＳＣを播種したスキャフォールドを骨芽細胞分化誘導培地（Ｃａｍｂｒｅｘ社）または培養培地（対照）中にて、製造元の推奨事項に従い３〜４日ごとに培地を交換しながらインキュベートした。３週間後、スキャフォールドを１０％ホルマリンで固定した後にエタノールで脱水し、パラフィンに包埋した。スキャフォールドを６ｍｍの薄片に切り分け、免疫組織化学染色およびｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色の試料とした。

免疫細胞化学。試料片（５〜６μｍ）をキシレンで処理し、次いで段階的濃度のエタノールで処理した。クエン酸緩衝液（ｐＨ６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中にて熱による抗原の賦活化を行う前に、スライドをＰＢＳで洗浄した。冷却後、加温したクエン酸緩衝液をＰＢＳに添加した液体を、クエン酸緩衝液の濃度を段階的に下げながら塗布し、次いで各スライドにＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｓｎｉｐｅｒ（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ社、米国カリフォルニア州コンコード）を添加して１５分間インキュベートした。スライドをＰＢＳで２回洗浄した後、２％ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）添加ブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、０．１％魚皮ゼラチン、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０）を加えて１時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、一次抗体を一次抗体緩衝液（１％ＢＳＡ、０．１％魚皮ジェル）で希釈した液体をスライドとともに、加湿容器内にて４℃で終夜インキュベートした。一次抗体としては幅広い種類のウサギポリクローナル抗ヒトサイトケラチン抗体（Ａｂｃａｍ社、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）およびマウスモノクローナル抗ヒトビメンチン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用い、希釈倍率は前者で５０倍、後者で１００倍とした。骨マーカーとしてはラットモノクローナル抗ヒトオステオポンチン抗体およびマウスモノクローナル抗ヒト骨シアロタンパク質ＩＩ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国マサチューセッツ州ビルリカ）を２００倍に希釈したものを用いた。マウス、ラットおよびウサギのＩｇＧアイソタイプコントロール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）も使用した。スライドをＰＢＳで５分間洗浄し、二次抗体とともに室温にて暗所で１時間インキュベートした。二次抗体としてはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウス抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ９５４ヤギ抗ラット抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ヤギ抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を蛍光抗体法用希釈剤（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ社）で２００倍に希釈したものを用いた。ＰＢＳで２回洗浄したスライドにＤＡＰＩ添加Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ（登録商標）退色防止液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を封入剤として滴下し、カバーガラスを載せた。Ｏｌｙｍｐｕｓ社ＢＸ６１顕微鏡でスライドを観察した。

ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色。試料片（５〜６μｍ）をキシレンで処理し、次いで段階的濃度のエタノールで処理した。試料片を蒸留水で洗浄し、紫外光照射下にて１％硝酸銀水溶液とともに１時間インキュベートした後、再び蒸留水で洗浄し、５％チオ硫酸ナトリウムとともに５分間インキュベートした。試料片を蒸留水で洗浄し、０．１％ニュークリアファストレッド溶液とともに５分間インキュベートした後、段階的アルコールおよびキシレンでの脱水処理に供した。封入剤を滴下したスライドにカバーガラスを載せ、Ｏｌｙｍｐｕｓ社ＢＸ６１顕微鏡で観察した。

結果を、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）の形式で報告し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社、ワシントン州レドモンド）を使用して計算する。統計学的有意差（ｐ＜０．０５）の判定はＳｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定での解析により行った。

以上、本発明の明確な理解に資するよう図示および例示により本発明をある程度詳細に説明したが、添付した特許請求の範囲内である種の変更や修正を加えうることは当業者が理解するところであろう。加えて、各引用文献がそれぞれ参照により組み込まれた場合と同程度に、本明細書中に示した各引用文献の全文が参照により本明細書に組み込まれるものとする。

Claims (29)

1. 中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する方法であって、ｐＨが約８を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドをほぼ大気圧または大気圧を超える気圧で水溶液と接触させてｐＨが約７である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより前記中和グルコマンナンスキャフォールドを作製することを含む、方法。
2. 前記接触が約０℃〜約１３０℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
3. 前記接触が約２０℃〜約５０℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
4. 前記接触が約３７℃の温度で行われる、請求項１の方法。
5. 前記接触が約０．１ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉだけ大気圧を超える圧力で行われる、請求項１に記載の方法。
6. 前記接触が約１分〜約１ヵ月の期間行われる、請求項１に記載の方法。
7. 前記接触が約１時間〜約１週間の期間行われる、請求項１に記載の方法。
8. 前記接触が約１時間〜約１日の期間行われる、請求項１に記載の方法。
9. 前記接触が約８時間〜約２０時間の期間行われる、請求項１に記載の方法。
10. 前記塩基性グルコマンナンスキャフォールドは細胞接着促進剤をさらに含有する、請求項１に記載の方法。
11. 前記細胞接着促進剤がポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）、ＲＧＤペプチド（ＲＧＤ）、ＫＱＡＧＤＶ、ＶＡＰＧ、ＦＧＬ、アミン基、フィブロネクチン、エラスチン、コラーゲンおよびラミニンからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記細胞接着促進剤がポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記方法が、
    グルコマンナン粉末、前記細胞接着促進剤、アルカリ性溶液および水を含有する反応混合物を生成することと、
    前記反応混合物を約５０℃〜約１３０℃の温度で加熱してグルコマンナンゲルを形成する工程と、
    前記グルコマンナンゲルの圧力を、約０．１ｐｓｉ〜約２００ｐｓｉだけ大気圧を超える圧力に上昇させることと、
    前記グルコマンナンゲルを約５０℃未満の温度まで冷却することと、
    前記グルコマンナンゲルから前記水を除去して前記塩基性グルコマンナンゲルを形成することと
    をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
14. 前記圧力が約１４．７ｐｓｉから約５０ｐｓｉに上昇される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記除去工程が昇華によって行われる、請求項１３に記載の方法。
16. 前記水溶液が水、緩衝液、酸性溶液および細胞培養培地からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
17. 前記水溶液が緩衝液である、請求項１に記載の方法。
18. 前記緩衝液がＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＲＩＳおよびＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパンからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記緩衝液がＰＢＳである、請求項１７に記載の方法。
20. 前記水溶液が細胞培養培地である、請求項１に記載の方法。
21. 前記細胞培養培地がロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地：混合栄養Ｆ−１２培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、イスコフ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ培地（ＮＣＴＣ）および骨芽細胞分化誘導培地（ＯＩＭ）からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
22. 中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する方法であって、ｐＨが約８を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドを減圧圧力下で水溶液と接触させてｐＨが約７である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより前記中和グルコマンナンスキャフォールドを作製することを含む、方法。
23. 中和グルコマンナンスキャフォールド上で細胞を増殖させる方法であって、請求項１に記載の中和グルコマンナンスキャフォールドと細胞との反応混合物を前記細胞が増殖するよう加熱することにより前記中和グルコマンナンスキャフォールド上で細胞を増殖させることを含む、方法。
24. 前記細胞が体細胞、幹細胞または前駆細胞およびこれらの細胞から誘導される細胞からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
25. ｐＨが約７であるグルコマンナンスキャフォールド。
26. 細胞接着促進剤を含有する、請求項２５に記載のグルコマンナンスキャフォールド。
27. 前記細胞接着促進剤がポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）、ＲＧＤペプチド（ＲＧＤ）、ＫＱＡＧＤＶ、ＶＡＰＧ、ＦＧＬ、アミン基、フィブロネクチン、エラスチン、コラーゲンおよびラミニンからなる群から選択される、請求項２６に記載のグルコマンナンスキャフォールド。
28. 前記細胞接着促進剤がポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）である、請求項２５に記載のグルコマンナンスキャフォールド。
29. 請求項１に記載の方法によって作製される、請求項２５に記載のグルコマンナンスキャフォールド。