JP2017205113A - 三次元の組織培養およびティッシュエンジニアリングのためのグルコマンナンスキャフォールド - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞増殖を促進させる性質を備え、三次元的な組織培養及びティッシュエンジニアリングに適する中和グルコマンナンスキャフォールドの提供。【解決手段】中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する方法であって、pHが約8を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドをほぼ大気圧又は大気圧を超える気圧で水溶液と接触させてpHが約7である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより前記中和グルコマンナンスキャフォールドを作製することを含む、方法。【選択図】図1
Description
関連出願の相互参照
本出願は2011年11月29日に出願された米国仮特許出願第61/564,553号に基づく優先権を主張し、同仮特許出願の全文が、あらゆる目的のため本明細書に組み込まれる。
本出願は2011年11月29日に出願された米国仮特許出願第61/564,553号に基づく優先権を主張し、同仮特許出願の全文が、あらゆる目的のため本明細書に組み込まれる。
心臓、骨、肝臓、角膜、および皮膚といった組織が損傷を受けるかあるいは疾患を来した場合にそれを生体材料の構築によって補修することは、再生医療における盛んな研究分野である。現在研究が進められているアプローチのひとつとして、細胞の増殖や分化を促進する生体材料構造体、すなわちスキャフォールドと細胞を組み合わせることにより、移植可能な機能性組織をin vitroで作製する試みがある。細胞外微小環境の主な物理的および分子的特徴を再現した三次元的(3D)組織培養系はティッシュエンジニアリングに多大なる恩恵をもたらすといえる。
生体材料には天然由来の材料、たとえばタンパク質や多糖を主原料とする生体材料もあれば、合成により得られる材料、たとえば高分子やペプチド、セラミックを主原料とする生体材料もある。こうした生体材料を臨床でのティッシュエンジニアリングを目的として設計および開発するにあたっては免疫原性や生分解性、生体適合性、改良の容易さ、および透過性といった物性を厳密に検討する必要がある。また、細胞の播種および細胞や栄養素の拡散には多孔性や適切な孔径が特に重要となる。
コラーゲン、アルジネート、キトサンといった天然由来の生体材料は入手が容易であり生体適合性も備えるため、3D組織培養用の基質として魅力的な存在となっている。しかしながら機械的性質や播種後の細胞の挙動が一貫しないことに伴う課題のため、その臨床応用は限定される。
骨の構築に際しては、スキャフォールドの多孔度および孔径が重要な要素であることが明らかになっている。過去の研究から、孔径が大きいほど(約200〜300μm)表面積が大きくなり、イオン/ガスの交換、タンパク質の吸着および骨アパタイトの石灰化が促される可能性があることが示されている(Karageorgiou et al. Biomaterials 2005 26:5474〜91、Yuan et al.
Biomaterials 1999 20:1799〜806)。インプラントに血管を形成し、自然骨の皮質表面およびその内側の海綿状部分を再現するにはさらに大きな孔径が必要となる可能性も考えられる(Karageorgiou et al. Biomaterials 2005 26:5474〜91)。したがって、骨細胞を播種可能で骨の再生に利用しうる大きな細孔を有するスキャフォールドが必要とされているといえる。
Biomaterials 1999 20:1799〜806)。インプラントに血管を形成し、自然骨の皮質表面およびその内側の海綿状部分を再現するにはさらに大きな孔径が必要となる可能性も考えられる(Karageorgiou et al. Biomaterials 2005 26:5474〜91)。したがって、骨細胞を播種可能で骨の再生に利用しうる大きな細孔を有するスキャフォールドが必要とされているといえる。
グルコマンナンは、D−グルコースとD−マンノースとが1:1.6の割合でβ−1,4結合した構造に約11残基間隔で側鎖を有する天然由来の多糖である(Alonso−Sande et al. Eur J Pharm Biopharm. 2009 72:453〜62)。グルコマンナンは、約5〜10%が置換されたアセチル基からなる主鎖を有し、これらのアセチル基が水素結合および疎水性相互作用に関与する結果、可溶性が獲得される。アセチル基をアルカリの存在下で加水分解するとグルコマンナンの可溶性が低下し、凝集に至り、ゲルが形成される。グルコマンナンは、乳化剤や増粘剤として食品に広く使われているほか、そのゲル化性や生分解性、そしてフイルムやビーズ、ヒドロゲルへの成形が可能な展性を理由にバイオ医薬品への応用に向けても調査が進められている。グルコマンナンを主原料とするビーズやマイクロ粒子、ナノ粒子がDNAや薬物の送達媒体として開発されており(Liu et al. Drug Deliv. 2007 14:397〜402、Wang et al. Int J Pharm. 2002 244:117〜26、Wen et al. Int J Biol Macromol. 2008 42:256〜63)、経口毒性や皮膚感作性、腸毒性、胎児毒性、細胞老化の兆候は特に認められていない(Konishi et al. Jpn J Exp Med. 1984 54:139〜42)。
最近では、グルコマンナンは軟骨細胞培養用の複合スキャフォールドとして、および軟骨再生用の注射可能なスキャフォールドとして研究されている(Kondo et al. J Tissue Eng Regen Med. 2009 3:361〜7)。この調査の結果、細胞が培養され、ゲル内に懸濁物として凝集しうるコンニャクグルコマンナン/ヒアルロン酸ヒドロゲルの製造がなされた。しかしながら、ティッシュエンジニアリングでの用途を意図した多孔質スキャフォールドとしてグルコマンナンを開発することはまだ検討されていない。
本発明は、斬新にも、細胞増殖を促進する性質を有し、三次元的な細胞培養およびティッシュエンジニアリングならびにin vivoでの組織再生、たとえば骨の再生に用いる新規の生体材料スキャフォールドとして有用なグルコマンナン微孔性マトリックスを提供する。
塩基性グルコマンナンスキャフォールドを中和するとき、その中和されたグルコマンナンスキャフォールドが三次元的(3D)な細胞培養およびティッシュエンジニアリングのマトリックスとして有用であることが明らかになっている。中和されたグルコマンナンスキャフォールドは細胞の効率的な増殖に適するpH、そして酸素や栄養素、発現産物、細胞老廃物の拡散を可能にする多孔構造を有する。本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドはまた、細胞の接着および増殖の促進を目的としてその表面を改質することも可能である。この天然由来の生体材料スキャフォールドは耐熱性で無毒であり、生分解性を有するほか、骨芽細胞や肝細胞、リンパ球、幹細胞といった幅広い種類の細胞の自然界における三次元的微小環境を模したものであってもよい。
別の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する方法を提供する。当該方法は、pHが約8を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドをほぼ大気圧または大気圧を超える気圧で水溶液と接触させてpHが約7である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより、中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する工程を含む。
一実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する方法を提供する。当該方法は、pHが約8を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドを減圧下で水溶液と接触させてpHが約7である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより、中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する工程を含む。
別の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールド上で細胞を増殖させる方法を提供する。当該方法は、本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドと細胞との反応混合物をその細胞が増殖するよう加熱することにより、中和グルコマンナンスキャフォールド上で細胞を増殖させる工程を含む。
別の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを提供する。当該中和グルコマンナンスキャフォールドは、pHが約8を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドを水溶液と接触させてpHが約7である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより作製される。
別の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを提供する。当該中和グルコマンナンスキャフォールドは、pHが約8を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドをほぼ大気圧または大気圧を超える気圧で水溶液と接触させてpHが約7である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより作製される。塩基性グルコマンナンスキャフォールドは細胞接着促進剤を含有する。
さらなる実施形態において、本発明は、本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドを分解剤と接触させることによりその中和グルコマンナンスキャフォールドを分解する方法を提供する。
発明の詳細な説明
I.定義
本明細書中、用語「グルコマンナン」はD−グルコースとD−マンノースとが約1:1.6の割合でβ−1,4結合した構造に約11残基間隔で側鎖を有する天然由来の多糖(Alonso−Sande et al. Eur J Pharm Biopharm. 2009 72:453〜462)およびその誘導体を意味する。グルコマンナンは約5〜10%が置換されたアセチル基からなる主鎖を有しており、これらのアセチル基は水素結合および可溶性を与える疎水性相互作用に関与している。グルコマンナン誘導体の例としてはO−アルキル誘導体やO−カルボキシアルキル誘導体といった水溶性誘導体、置換度が様々に異なる誘導体(5〜10%超または未満のアセチル基が置換されているなど)、酸化度が様々に異なる誘導体、グラフト共重合体(アクリレート・アクリルアミド共重合体など)とその塩(第四級アンモニウム塩など)が挙げられるが、これらに限定されない。
I.定義
本明細書中、用語「グルコマンナン」はD−グルコースとD−マンノースとが約1:1.6の割合でβ−1,4結合した構造に約11残基間隔で側鎖を有する天然由来の多糖(Alonso−Sande et al. Eur J Pharm Biopharm. 2009 72:453〜462)およびその誘導体を意味する。グルコマンナンは約5〜10%が置換されたアセチル基からなる主鎖を有しており、これらのアセチル基は水素結合および可溶性を与える疎水性相互作用に関与している。グルコマンナン誘導体の例としてはO−アルキル誘導体やO−カルボキシアルキル誘導体といった水溶性誘導体、置換度が様々に異なる誘導体(5〜10%超または未満のアセチル基が置換されているなど)、酸化度が様々に異なる誘導体、グラフト共重合体(アクリレート・アクリルアミド共重合体など)とその塩(第四級アンモニウム塩など)が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中、用語「グルコマンナンゲル」は、架橋グルコマンナンが均一に分散した耐熱性の懸濁液を意味する。グルコマンナンゲルは様々な方法で形成することが可能である。方法の例としてはアルカリ存在下におけるグルコマンナンのアセチル基の加水分解が挙げられるが、これに限定されない。本発明のグルコマンナンゲルは細胞の接着および増殖の促進を目的として改質することも可能である。改質の例としては細胞接着促進剤の添加や化学的架橋、表面の被覆、官能基の導入が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中、用語「塩基性グルコマンナンスキャフォールド」は、グルコマンナンゲルの脱水により形成される、pHが約8を超える三次元的な多孔質マトリックスを意味する。本発明の塩基性グルコマンナンスキャフォールドは細胞の接着および増殖の促進を目的として改質することも可能である。改質の例としては細胞接着促進剤の添加や表面の被覆、官能基の導入が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中、用語「中和グルコマンナンスキャフォールド」は、細胞培養およびティッシュエンジニアリング、たとえば組織の再生に適する三次元的な環境を与える、pHが約7である多孔質マトリックスを意味する。本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドは塩基性グルコマンナンスキャフォールドを水溶液で中和することにより生成される。本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドは細胞の接着および増殖の促進を目的として改質することも可能である。
本明細書中、用語「接触」は、少なくとも2種類の異なる化学種をそれらが反応しうるように互いに触れさせる過程を意味する。なお、得られる反応生成物は添加試薬間の反応から直接生成する場合もあれば、添加試薬のうちの1種類以上から反応混合物中に生成しうる中間体から生成する場合もある。
本明細書中、用語「細胞接着促進剤」は、培養基材に対する細胞の接着性または付着性を、たとえばその基材の表面を改質および/または表面電荷の変化により増強させる天然物または合成物を意味する。細胞接着促進剤は培養基材に対する血清タンパク質または細胞外マトリックスタンパク質の吸着性をも増強するものであってもよい。細胞接着促進剤の例としてはポリ−L−リシン(PLL)やポリ−D−リシン(PDL)、RGDペプチド(RGD)、KQAGDV、VAPG、FGL、アミン基のほかフィブロネクチンやエラスチン、コラーゲン、ラミニンといった細胞外マトリックスタンパク質が挙げられる。細胞接着促進剤は細胞増殖および細胞分化をも促進するものであってもよい。
本明細書中、用語「緩衝液」は、緩衝剤、すなわち弱酸とそれに結合する塩基との混合物または弱塩基とそれに結合する酸との混合物でありpHの変化を是正するイオン性化合物を、水に均一に混合させて得られる混合物を意味する。緩衝剤の例としては、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)といったリン酸塩緩衝液、3−{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}プロパンスルホン酸(TAPS)、1,3−ビス(トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ)プロパン(BIS−TRIS)、トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン(TRIS)、4−2−ヒドロキシエチル−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、2−{[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}エタンスルホン酸(TES)、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、および2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中、用語「酸性溶液」は、酸、すなわちプロトン供与体として作用する物質を、水に均一に混合させて得られる混合物を意味する。酸性溶液はpHが7未満である。酸性溶液の例としては塩酸や酢酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中、用語「アルカリ性溶液」は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩を含有し、pHが7を超える塩基性溶液を意味する。アルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩で代表的なものとしては水酸化ナトリウムや炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中、用語「細胞培養培地」は、細胞増殖の土台となる物質を意味する。細胞培養培地は典型的には緩衝液に溶解する栄養素の混合物を含み、細胞の種類が異なれば有用な細胞培養培地の種類も異なる。細胞培養培地の例としてはロズウェルパーク記念研究所培地(RPMI)やダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、最小必須培地(MEM)、ダルベッコ変法イーグル培地:混合栄養F−12培地(DMEM/F12)、イスコフ変法ダルベッコ培地(IMDM)、National Collection of Type Cultures培地(NCTC)、および骨芽細胞分化誘導培地(OIM)が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中、用語「分解」は、スキャフォールドを一定の形状に保っている架橋結合を切断することを意味する。分解はグリコシド結合を加水分解させる分解剤を用いて行われる。スキャフォールド分解剤は中和グルコマンナンスキャフォールドに接着したまたは包埋された細胞を分解しない薬剤または酵素であればいかなる種類のものであってもよく、その例としてはエンド−1,4 β−マンナナーゼやマンナン エンド−1,4−β−マンノシダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼが挙げられる。他の酵素も本発明では有用である。
II.中和グルコマンナンスキャフォールド
II.中和グルコマンナンスキャフォールド
本発明は三次元的な細胞培養およびティッシュエンジニアリング用の新規なスキャフォールドである中和グルコマンナンスキャフォールドを提供する。この中和グルコマンナンスキャフォールドは中性の環境、ならびに細胞培養に適する多孔質構造および孔径を提供する。細胞接着促進剤を配合することも可能である。均質かつ耐熱性で弾性を有するとともに生体適合性および生分解性も備え、3D的な組織培養およびティッシュエンジニアリングに適する形状および大きさに、たとえば成形や切削によって加工することができる。オートクレーブで消毒することにより、移植などin vivoでの用途に適合させることもできる。
アルジネートを主原料とするスキャフォールド(AlgiMatrixなど)とは異なり、この中和グルコマンナンスキャフォールドは大きさに制約がない。また、アルジネートを主原料とするスキャフォールドがその改質に複数の複雑な化学反応を要するのに対し、この中和グルコマンナンスキャフォールドは単一の工程で細胞接着用に改質することが可能である。
この中和グルコマンナンスキャフォールドの作製は塩基性グルコマンナンスキャフォールドの中和に適するいかなる条件でも行うことができる。適する条件の例としては、グルコマンナンスキャフォールドのpHを約8超から約7まで、適切な所要時間で下げることが可能な条件が挙げられる。たとえば、塩基性グルコマンナンスキャフォールドを加熱環境内、たとえばオートクレーブ内で水溶液と接触させることができる。他の適する条件としては、塩基性グルコマンナンスキャフォールドを水溶液で適切な時間にわたって継続的にリンスすることが挙げられる。
一部の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する方法を提供する。この方法は、pHが約8を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドをほぼ大気圧または大気圧を超える気圧で水溶液と接触させてpHが約7である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより、中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する工程を含む。
塩基性グルコマンナンスキャフォールドのpHは、約8.0以上の任意の適切なpHであってよい。適切なpHの例としては8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、およびそれを超えるpHが挙げられる。
中和グルコマンナンスキャフォールドのpHは、約7の任意の適切なpHであってよい。適切なpHの例としては約6.0〜約8.0、たとえば約6.1〜約7.9、約6.2〜約7.8、約6.3〜約7.7、約6.4〜約7.6、および約6.5〜約7.5が挙げられる。
接触は、任意の適切な温度で行うことができる。たとえば室温とすることができ、あるいは室温を超える温度や室温を下回る温度とすることも可能である。一部の実施形態では、蒸気の発生に適する温度が用いられる。一部の実施形態では、温度を約0℃〜約200℃、約20℃〜約200℃、約20℃〜約150℃、約0℃〜約130℃、約20℃〜約130℃、約20℃〜約100℃、約20℃〜約50℃、約30℃〜約50℃、約50℃〜約200℃、約75℃〜約150℃または約100℃〜約150℃とすることができる。温度を約0℃、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190または約200℃とすることも可能である。あるいは約30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44または45℃とすることもできる。一部の実施形態では、約0℃〜約130℃の温度で接触が行われうる。他の実施形態では、約20℃〜約50℃の温度で接触が行われうる。さらに他の実施形態では、約37℃の温度で接触が行われうる。一部の実施形態では、ほぼ室温が用いられる。
接触は、任意の適切な圧力下で行うことができる。一部の実施形態では、減圧下または加圧下で接触が行われうる。一部の実施形態では、大気圧を超える圧力で接触が行われる。一部の実施形態では、約0.1psi〜約50psiだけ大気圧を超える圧力で接触が行われうる。一部の実施形態では、約1psi〜約50psiだけ大気圧を超える圧力で接触が行われうる。他の有用な圧力としては、約5、10、15、20、25、30、35、40または約45psiだけ大気圧を超える圧力が挙げられる。別の実施形態では、約1psi〜約30psiだけ大気圧を超える圧力で接触が行われる。さらに他の実施形態では、約10psi〜約20psiだけ大気圧を超える圧力で接触が行われる。他の実施形態では、約15psiだけ大気圧を超える圧力で接触が行われる。
塩基性グルコマンナンスキャフォールドを中和する際の温度と圧力との組み合わせは任意である。たとえば温度を蒸気の発生に十分な、たとえば100℃を超える温度とし、圧力を大気圧よりも高い、たとえば約0.1psi〜約50psiだけ大気圧を超える圧力とすることが可能である。温度と圧力との他の組み合わせも本発明では有用であり、たとえば大気温度および大気圧が挙げられる。
接触は、任意の適切な期間行うことができる。一部の実施形態では、約1分〜約1ヵ月の期間接触が行われうる。他の実施形態では、約1時間〜約1週間にわたって接触が行われうる。他の実施形態では、約1時間〜約1日にわたって接触が行われうる。さらに他の実施形態では、約8時間〜約20時間にわたって接触が行われうる。
塩基性グルコマンナンスキャフォールドは、他の様々な成分を含有してもよい。たとえば細胞接着促進剤や走化性分子、細胞シグナル伝達分子を塩基性グルコマンナンスキャフォールドに配合することができる。
一部の実施形態では、塩基性グルコマンナンスキャフォールドは適切な細胞接着促進剤を含有する。本発明で有用な細胞接着促進剤はグルコマンナンスキャフォールドに細胞を接着させる性質を有するものである。細胞接着促進剤は細胞増殖および/または細胞分化をも促進することができる。細胞接着促進剤の例としてはポリ−L−リシン(PLL)やポリ−D−リシン(PDL)、RGDペプチド(RGD)、KQAGDV、VAPG、FGL、アミン基のほかフィブロネクチンやエラスチン、コラーゲン、ラミニンといった細胞外マトリックスタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、細胞接着促進剤がポリ−L−リシン(PLL)、ポリ−D−リシン(PDL)、RGDペプチド(RGD)、KQAGDV、VAPG、FGL、アミン基、フィブロネクチン、エラスチン、コラーゲンまたはラミニンであってもよい。細胞外マトリックスタンパク質の由来としては任意の適切な由来を使用することができ、例としては哺乳動物細胞が挙げられるがこれに限定されない。一部の実施形態では、細胞接着促進剤がPLLまたはRGDである。特定の実施形態では、細胞接着促進剤がPLLである。
一部の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する方法を提供する。この方法は、pHが約8を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドを水溶液と接触させてpHが約7である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより、中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する工程を含む。塩基性グルコマンナンスキャフォールドは細胞接着促進剤を含有する。
別の実施形態では、塩基性グルコマンナンスキャフォールドは適切な走化性分子を含有する。走化性分子の例としては血清やケモカイン、形態形成タンパク質、増殖因子、ヒアルロナンが挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、塩基性グルコマンナンスキャフォールドは適切な細胞シグナル伝達分子を含有する。細胞シグナル伝達分子の例としては細胞外マトリックスタンパク質やペプチドモチーフ、増殖因子が挙げられるが、これらに限定されない。
水溶液の組成としては任意の適切な組成を使用することができる。水溶液は水であっても、中和グルコマンナンスキャフォールドを分解も消化もしない非アルカリ性物質1種類以上と水との混合物であってもよい。適する水溶液の例としては水や緩衝液、酸性溶液、細胞培養培地が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、水溶液が水、緩衝液、酸性溶液または細胞培養培地である。
一実施形態では、上記水溶液は緩衝液である。適する緩衝液の例としてはPBSやTAPS、BIS−TRISプロパン、TRIS、HEPES、TES、MOPS、PIPES、MESが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、緩衝液がPBS、HEPES、MES、MOPS、TRISまたはBIS−TRISプロパンである。特定の実施形態では、緩衝液がPBSである。
別の実施形態では、上記水溶液は酸性溶液である。適する酸性溶液の例として、これらに限定はされないもののたとえば塩酸や酢酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、上記水溶液は細胞培養培地である。適する細胞培養培地の例としてはロズウェルパーク記念研究所培地(RPMI)やダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、最小必須培地(MEM)、ダルベッコ変法イーグル培地:混合栄養F−12培地(DMEM/F12)、イスコフ変法ダルベッコ培地(IMDM)、National Collection of Type Cultures培地(NCTC)、および骨芽細胞分化誘導培地(OIM)が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、細胞培養培地がロズウェルパーク記念研究所培地(RPMI)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、最小必須培地(MEM)、ダルベッコ変法イーグル培地:混合栄養F−12培地(DMEM/F12)、イスコフ変法ダルベッコ培地(IMDM)またはNational Collection of Type Cultures培地(NCTC)である。
本発明の方法は様々な追加工程を含んでもよい。一部の実施形態では、上記方法は、グルコマンナン粉末、アルカリ性溶液および水を含有する反応混合物を生成する工程と、前記反応混合物を約50℃〜約130℃の温度で加熱してグルコマンナンゲルを形成する工程と、前記グルコマンナンゲルの圧力を、約0.1psi〜約50psiだけ大気圧を超える圧力に上昇させる工程と、前記グルコマンナンゲルを約50℃未満の温度まで冷却する工程と、前記グルコマンナンゲルから前記水を除去して塩基性グルコマンナンゲルを形成する工程とをさらに含む。得られる塩基性グルコマンナンゲルを前述の細胞接着促進剤でさらに改質することも可能である。
本発明の方法は様々な追加工程を含んでもよい。一部の実施形態では、上記方法は、グルコマンナン粉末、細胞接着促進剤、アルカリ性溶液および水を含有する反応混合物を生成する工程と、前記反応混合物を約50℃〜約130℃の温度で加熱してグルコマンナンゲルを形成する工程と、前記グルコマンナンゲルの圧力を、約0.1psi〜約50psiだけ大気圧を超える圧力に上昇させる工程と、前記グルコマンナンゲルを約50℃未満の温度まで冷却する工程と、前記グルコマンナンゲルから前記水を除去して塩基性グルコマンナンゲルを形成する工程とをさらに含む。
アルカリ性溶液としてはアルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩を含有する任意の溶液を使用することができる。アルカリ性溶液は塩基性であり、pHが7を超える。アルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩で代表的なものとしては水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、水酸化カルシウム、および炭酸カルシウムが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、アルカリ性溶液が水酸化カルシウムを含有する。
グルコマンナン粉末、細胞接着促進剤および水酸化カルシウムは反応混合物中にそれぞれ任意の適切な量で配合することができる。一部の実施形態では、グルコマンナン粉末を水に溶解させ、水中にグルコマンナン約1%〜約5%(w/v)を含有するグルコマンナン溶液を提供する。
他の実施形態では、このグルコマンナン溶液に、細胞接着促進剤含有率約0.0001%〜約20%(w/v)の水溶液を与えるよう細胞接着促進剤が添加される。一実施形態では、このグルコマンナン溶液に、細胞接着促進剤含有率約0.0001%〜約10%(w/v)の水溶液を与えるよう細胞接着促進剤が添加される。別の実施形態では、このグルコマンナン溶液に、細胞接着促進剤含有率約0.0001%〜約1%(w/v)の水溶液を与えるよう細胞接着促進剤が添加される。
さらに他の実施形態では、このグルコマンナン溶液に、適切な水酸化カルシウム対グルコマンナン溶液比を与える量の水酸化カルシウムが添加される。水酸化カルシウム対グルコマンナン溶液比は、たとえば約1:1000〜約1:1(w/w)とすることが可能である。一実施形態では、この比が1:10(w/w)である。別の実施形態では、このグルコマンナン溶液に、水酸化カルシウム含有率約1%〜約2%(w/v)の水溶液を与えるよう水酸化カルシウムが添加される。
反応混合物は、任意の適切な温度で生成することができ、その例としては接触工程に関して上に示した温度が挙げられる。
反応混合物は、任意の適切な温度まで加熱することができる。一部の実施形態では、この温度は約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130℃以上かまたはそれを上回る温度であってもよい。一部の実施形態では、約130℃を超える温度で反応混合物が加熱されうる。一部の実施形態では、約80℃を超える温度まで反応混合物が加熱されうる。
グルコマンナンゲルの圧力は、任意の適切な圧力に上昇させることができる。一部の実施形態では、約0.1psi〜約200psiだけ大気圧を超えるまで圧力が高められうる。他の実施形態では、約0.1psi〜約50psiだけ大気圧を超えるまで圧力が高められる。特定の実施形態では、約30psiまで圧力が高められる。
グルコマンナンゲルは、任意の適切な温度まで冷却することができる。一部の実施形態では、80℃未満前後まで温度が下げられる。特定の実施形態では、約50℃未満まで温度が下げられる。
グルコマンナンゲルからの水の除去は任意の適切な方法により行うことができる。一部の実施形態では、この除去工程が凍結乾燥、昇華または熱誘発相分離の作業によって行われる。特定の実施形態では、この除去工程が昇華によって行われる。
中和グルコマンナンスキャフォールドの孔径としては任意の適切な孔径を使用することができる。一部の実施形態では、中和グルコマンナンスキャフォールドの孔径が約100μm〜約400μmである。他の実施形態では、中和グルコマンナンスキャフォールドの孔径が約150μm〜約350μmであってもよい。さらに他の実施形態では、中和グルコマンナンスキャフォールドの孔径が約200μm〜約300μmであってもよい。
別の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する方法を提供する。この方法では、pHが約8を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドをほぼ大気圧または大気圧を超える気圧で水溶液と接触させてpHが約7である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成する工程により、中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する。
接触は、任意の適切な減圧下で行うことができる。一部の実施形態では、約0.1mmHg〜760mmHgの減圧下で接触が行われうる。一部の実施形態では、約10mmHg〜約500mmHgの減圧下で接触が行われうる。他の有用な減圧圧力としては、約20、50、100、200、300、400または500mmHgが挙げられる。別の実施形態では、約10psi〜約300mmHgの減圧下で接触が行われる。さらに他の実施形態では、約400mmHgの減圧下で接触が行われる。
別の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを提供する。この中和グルコマンナンスキャフォールドは、pHが約8を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドを水溶液と接触させてpHが約7である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより作製される。
別の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールドを提供する。この中和グルコマンナンスキャフォールドは、pHが約8を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドを水溶液と接触させてpHが約7である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより作製される。塩基性グルコマンナンスキャフォールドは細胞接着促進剤を含有する。
また、本発明は、本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドを分解剤と接触させることによりその中和グルコマンナンスキャフォールドを分解する方法を提供する。分解剤としてはグリコシド結合を加水分解させる性質を有する任意な適切な物質を使用することができる。分解剤は任意の薬剤であっても酵素であってもよい。分解剤として有用な酵素の例としては、エンド−1,4 β−マンナナーゼやマンナン エンド−1,4−β−マンノシダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、セルラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。他の分解剤としてはマンナナーゼやペクチナーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、ガラクトナーゼなどの酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
また、本発明は、本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドと適切な生体材料とを有する複合スキャフォールドを提供する。適切な生体材料としてはタンパク質および多糖を主原料とする生体材料や高分子、ペプチドおよびセラミックを主原料とする生体材料が挙げられる。生体材料の例としては細胞外マトリックスタンパク質(例えば、フィブロネクチンやエラスチン、コラーゲンおよびラミニン)やアルジネート、キトサン、ヒアルロン酸、Matrigel、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、生体活性ガラスが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の方法を用いて様々なグルコマンナンスキャフォールドを作製することができる。一部の実施形態において、本発明は中性のグルコマンナンスキャフォールドを提供する。この中性のグルコマンナンスキャフォールドは約7のpHを有しうる。
一部の実施形態では、このグルコマンナンスキャフォールドが、pHが約8に同等または約8を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドであってもよい。
一部の実施形態では、このグルコマンナンスキャフォールドは細胞接着促進剤を含有する。任意の適切な細胞接着促進剤を本発明に用いることができ、その例としては上に示した細胞接着促進剤が挙げられる。一部の実施形態では、細胞接触促進剤がポリ−L−リシン(PLL)、ポリ−D−リシン(PDL)、RGDペプチド(RGD)、KQAGDV、VAPG、FGL、アミン基、フィブロネクチン、エラスチン、コラーゲンまたはラミニンであってもよい。一部の実施形態では、細胞接触促進剤がポリ−L−リシン(PLL)であってもよい。
上述のとおり、本発明のグルコマンナンスキャフォールドは様々な方法で作製することができ、その例としては上記の方法が挙げられる。一部の実施形態では、本発明のグルコマンナンスキャフォールドが本発明の方法により作製される。
III.細胞の増殖
III.細胞の増殖
本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドは細胞の増殖に有用である。この中和グルコマンナンスキャフォールド上で培養された細胞は他の細胞や他の種類の細胞と相互作用し、凝集塊を形成する。この中和グルコマンナンスキャフォールドへの細胞の接着および同スキャフォールド上での細胞の増殖は細胞接着促進剤の配合により促進することが可能である。この中和グルコマンナンスキャフォールドは長期培養にも対応している。この中和グルコマンナンスキャフォールド上での培養により細胞を増殖および分化させることが可能である。たとえば、幹細胞は骨細胞や軟骨、皮膚細胞、血液細胞といった機能性系統へと分化しうる。したがって、骨形成や軟骨形成、造血といった細胞過程をこの中和グルコマンナンスキャフォールド上で生じさせることが可能である。
別の実施形態において、本発明は中和グルコマンナンスキャフォールド上で細胞を増殖させる方法を提供する。この方法は、本発明の中和グルコマンナンスキャフォールドと細胞との反応混合物をその細胞が増殖するよう加熱することにより、中和グルコマンナンスキャフォールド上で細胞を増殖させる工程を有する。細胞の増殖はin vivoでもin vitroでも行うことができる。
適する細胞の種類としては線維芽細胞や皮膚細胞、内皮細胞、上皮細胞、骨細胞、肝細胞、神経細胞および軟骨細胞といった体細胞、ならびに上皮前駆細胞や胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、筋幹細胞といった幹細胞および前駆細胞、ならびにこれらの細胞から誘導される細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、前記細胞が体細胞である。他の実施形態では、前記細胞が幹細胞または前駆細胞である。特定の実施形態では、前記細胞が幹細胞である。他の特定の実施形態では、前記細胞が幹細胞から誘導される細胞である。
中和グルコマンナンスキャフォールド上で増殖させた細胞は、任意の適切な物質でグルコマンナンスキャフォールドを溶解させることにより回収することができる。たとえば、マンナナーゼやセルラーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、ガラクタナーゼなどの酵素1種類以上を用いてグルコマンナンスキャフォールドを溶解させることが可能である。グルコマンナンスキャフォールドの溶解に用いられる他の物質は当業者にとって既知のものである。
IV.実施例
実施例1:グルコマンナンスキャフォールドの作製
IV.実施例
実施例1:グルコマンナンスキャフォールドの作製
グルコマンナン粉末(1〜5g)を蒸留水100mlに溶解させ、低速で5分間撹拌した後、得られた溶液を室温で60分間インキュベートした。得られたグルコマンナン溶液に水酸化カルシウム水溶液(1.5%、10ml、Sigma−Aldrich社、米国ミズーリ州セントルイス)を加え、1分間激しく撹拌した。得られた混合物にポリ−L−リシン(Sigma−Aldrich社)(0.001%〜1%w/v水溶液)を加えたものを加熱・加圧容器(decloaking chamber)に入れ、125℃まで30分間加熱した。室温への冷却後、グルコマンナンゲルを蒸留水に終夜浸漬した。グルコマンナンゲルを培養皿に移したものを急速冷凍装置に入れ、−50℃以下で30分間凍結させた。Vitris社50−SRC−5昇華装置を用いて昇華乾燥を行った。棚温度は12℃、冷却器の温度は−58℃以下であり、真空度は80〜100ミリトルを維持した。得られたグルコマンナン作製物をポリ袋に入れて真空パック処理し、−20℃以下で使用時まで保管した。
グルコマンナンスキャフォールドの中和
グルコマンナンスキャフォールドの中和
昇華前に水でリンス。昇華乾燥前に大量の水(約5リットル)を使用して、グルコマンナンゲルの洗浄を一昼夜(16〜24時間)繰り返し行った。昇華乾燥後、得られたグルコマンナンスキャフォールドを水に浸漬し、そのスキャフォールドをpH指示薬に押し当てた。スキャフォールドは10を超えるpHを示した。このことから、昇華乾燥前のグルコマンナンゲルを洗浄し、昇華乾燥後のグルコマンナンスキャフォールドを水に短時間浸漬しただけではスキャフォールドの中和には不十分であったことが示された。
従来法でPBS洗浄。グルコマンナンスキャフォールドをPBSで1回または3回洗浄した。その結果、スキャフォールドの皮相的(表面のみの)中和が起こり、内部のpHは9または10を上回った。また、グルコマンナンスキャフォールドを10、30および60分間にわたりPBSで洗浄した。これらの手法ではいずれの場合も上記と同様のスキャフォールドの皮相的中和が起こるに留まった。これらの知見から、スキャフォールドを緩衝液で従来の方法により洗浄しただけでは哺乳動物細胞の培養に必要なスキャフォールドの中和には不十分であったことが示された。
加熱下でPBS洗浄。次に、グルコマンナンスキャフォールドを95〜100℃のPBS中で30分間インキュベートした。肉眼で視認しうる収縮がスキャフォールドに生じた。沸騰するPBS中での30分間のインキュベート後、スキャフォールドを切断してpH指示薬に押し当てた。スキャフォールドの外部は中性のpHを示した。しかしながらスキャフォールドの中央部にはスキャフォールド材料の濃縮が認められ、この中央部は依然として中性の範囲から外れていた。上記すべての場合を通じてスキャフォールドは水に浮き、したがって内部に気泡が存在していたといえる。沸騰するPBSで30分間処理した後でさえ、スキャフォールドは著しい所望しない変形を来たしていながらも水に浮かんだ。これらの知見から、PBSはスキャフォールドの内部に取り込まれた空気を完全には置換しておらず、そのため中和が不十分であったことが示された。
加圧下でPBS洗浄。PBSを含むビーカーにグルコマンナンスキャフォールドを移したものを圧力容器に入れ、15psiだけ大気圧を超える圧力において120℃で30分間インキュベートした。スキャフォールドの収縮は認められなかった。スキャフォールドはPBSに沈み、このことから気泡がPBSによって完全に置換されたことが示された。得られたグルコマンナン作製物を冷却し、滅菌PBS中にて使用時まで4℃で保管した。pH指示薬を用いてスキャフォールドのpHを確認したところ、中性であった。スキャフォールド全体が中性のpHを示し、変形はなかった。
減圧下でPBS洗浄。グルコマンナンスキャフォールドをフィルターに載せ、スキャフォールドの底面に400mmHgの減圧をアプライした。PBS 1mlをスキャフォールドの上面に10回塗布した。その手順の後、pH指示薬を用いてスキャフォールドのpHを確認したところ、中性であった。スキャフォールド全体が中性のpHを示し、変形はなかった。
実施例2:中和グルコマンナンスキャフォールド上での細胞増殖
実施例2:中和グルコマンナンスキャフォールド上での細胞増殖
細胞の調製。ヒト間葉系幹細胞(hMSC)としては、骨髄単核球(N=3、女性1名男性2名、年齢20〜40歳、Cambrex社、米国ニュージャージー州イーストラザフォード)を20%ウシ胎仔血清(FBS)、1%L−グルタミンおよび1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Invitrogen社、米国カリフォルニア州カールズバッド)を添加したα−MEM中の100mmプレートに播種し、5%CO2中にて37℃でインキュベートした。リン酸緩衝生理食塩液(PBS)による3回のプレート洗浄を、細胞が約80%コンフルエンスに達するまで1日おきに繰り返し行った。細胞を0.25%トリプシン−EDTA(Invitrogen社)とともに37℃で5分間インキュベートした。培養培地をトリプシン−EDTAに対して1:1の割合で細胞に添加することにより失活させた。細胞を培養培地に、細胞数を5×103/cm2としてあらためて播種した。3代目まで継代培養した細胞のすべての代を速度制御冷凍法により凍結保存し、液体窒素中にて使用時まで保管した。CD34+細胞としては、前述の骨髄単核球の一部を選択緩衝液(PBS中に0.5%ウシ血清アルブミン−BSAおよび2mM EDTAを含有するPBS)中にて、PEに結合させたCD34抗体(クローン581、BD Biosciences社、米国カリフォルニア州サンノゼ)とともに4℃で30分間インキュベートした。細胞を選択緩衝液で洗浄し、抗PEマイクロビーズ(Miltenyi Biotech社、ドイツ、ベルギッシュ・グラートバッハ)とともに4℃で20分間インキュベートした。細胞を洗浄し、選択緩衝液500μLに再懸濁させたものを分離カラム(Miltenyi Biotech社)にアプライした。分離カラムを3回洗浄し、残った細胞を選択緩衝液1mlで溶出させた。溶出した細胞を2回目の分離処理に供した。
形質導入。凍結保存しておいたhMSCのうち2代目を解凍し、MNDプロモータの制御下でホタルルシフェラーゼを発現させたHIV−1由来レンチウイルスベクター(感染性粒子数1×106/ml)による形質導入をポリブレン(Sigma−Aldrich社)4mg/ml添加培地中にて行った。終夜インキュベートした細胞をPBSで洗浄した後、新しい培地を補充した。約80%コンフルエンスに達するまで細胞を培養した。細胞の一部にD−ルシフェリン100mg/mlを添加し、ルミノメーター(Sirius、Berthold社、ドイツ、プフォルツハイム)を用いて生物発光を計測することにより形質導入が無事行われたことを確認した。
細胞播種および生物発光イメージング。グルコマンナンスキャフォールドを約1cm×1cm×0.5cm(幅×奥行×高さ)に切断したものを水で戻し、PBSで5回洗浄した後、培養培地で終夜インキュベートした。12ウェルプレート内に設置したグルコマンナンスキャフォールドにhMSC(スキャフォールド1個につき1×106個)を播種し、5週間培養した。各ウェルにD−ルシフェリン100mg/mlを添加した後、3〜4日ごとにIVIS 200イメージングシステム(Caliper Life Sciences社、米国マサチューセッツ州ホプキントン)で細胞からの生物発光を撮影した。得られた画像をLiving Imageソフトウエア(バージョン3.1、Caliper Life Sciences社)で解析した。
走査型電子顕微鏡観察。hMSCを播種したグルコマンナンスキャフォールドと播種していないグルコマンナンスキャフォールドとを、段階的エタノール系列液中で脱水した。また、hMSCを播種したスキャフォールドをCD34+細胞(1×106個)と共培養し、3日間インキュベートした後、エタノールで脱水した。試料をカーボン両面テープで12mmのアルミニウム製試料台に載せ、PELCO Auto Sputter Coater SC−7を用いてスパッタリングにより金で被覆した後、Philips社XL30 TMP走査型電子顕微鏡で観察した。
実施例3:酵素消化
実施例3:酵素消化
エンド−1,4 β−マンナナーゼ(Megazyme社)またはAspergillus niger由来セルラーゼ(Sigma−Aldrich社)の凍結乾燥物を培養培地に溶解させた。hMSCを播種したスキャフォールドを0.5単位/ml、5.0単位/mlもしくは50単位/mlのエンド−1,4 β−マンナナーゼまたはセルラーゼとともに終夜インキュベートした。スキャフォールドの分解を目視にて確認した。スキャフォールドが完全に溶解した時点で細胞数を計測した。
実施例4:骨芽細胞分化
実施例4:骨芽細胞分化
hMSCを播種したスキャフォールドを骨芽細胞分化誘導培地(Cambrex社)または培養培地(対照)中にて、製造元の推奨事項に従い3〜4日ごとに培地を交換しながらインキュベートした。3週間後、スキャフォールドを10%ホルマリンで固定した後にエタノールで脱水し、パラフィンに包埋した。スキャフォールドを6mmの薄片に切り分け、免疫組織化学染色およびvon Kossa染色の試料とした。
免疫細胞化学。試料片(5〜6μm)をキシレンで処理し、次いで段階的濃度のエタノールで処理した。クエン酸緩衝液(pH6、Invitrogen社)中にて熱による抗原の賦活化を行う前に、スライドをPBSで洗浄した。冷却後、加温したクエン酸緩衝液をPBSに添加した液体を、クエン酸緩衝液の濃度を段階的に下げながら塗布し、次いで各スライドにBackground Sniper(BioCare Medical社、米国カリフォルニア州コンコード)を添加して15分間インキュベートした。スライドをPBSで2回洗浄した後、2%ヤギ血清(Sigma−Aldrich社)添加ブロッキング緩衝液(1%BSA、0.1%魚皮ゼラチン、0.1%Triton X、0.05%tween−20)を加えて1時間インキュベートした。PBSで2回洗浄した後、一次抗体を一次抗体緩衝液(1%BSA、0.1%魚皮ジェル)で希釈した液体をスライドとともに、加湿容器内にて4℃で終夜インキュベートした。一次抗体としては幅広い種類のウサギポリクローナル抗ヒトサイトケラチン抗体(Abcam社、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ)およびマウスモノクローナル抗ヒトビメンチン抗体(Sigma−Aldrich社)を用い、希釈倍率は前者で50倍、後者で100倍とした。骨マーカーとしてはラットモノクローナル抗ヒトオステオポンチン抗体およびマウスモノクローナル抗ヒト骨シアロタンパク質II抗体(Millipore社、米国マサチューセッツ州ビルリカ)を200倍に希釈したものを用いた。マウス、ラットおよびウサギのIgGアイソタイプコントロール(Invitrogen社)も使用した。スライドをPBSで5分間洗浄し、二次抗体とともに室温にて暗所で1時間インキュベートした。二次抗体としてはAlexa Fluor 488ヤギ抗マウス抗体、Alexa Fluor 954ヤギ抗ラット抗体およびAlexa Fluor 594ヤギ抗ウサギ抗体(Invitrogen社)を蛍光抗体法用希釈剤(BioCare Medical社)で200倍に希釈したものを用いた。PBSで2回洗浄したスライドにDAPI添加Prolong Gold(登録商標)退色防止液(Invitrogen社)を封入剤として滴下し、カバーガラスを載せた。Olympus社BX61顕微鏡でスライドを観察した。
von Kossa染色。試料片(5〜6μm)をキシレンで処理し、次いで段階的濃度のエタノールで処理した。試料片を蒸留水で洗浄し、紫外光照射下にて1%硝酸銀水溶液とともに1時間インキュベートした後、再び蒸留水で洗浄し、5%チオ硫酸ナトリウムとともに5分間インキュベートした。試料片を蒸留水で洗浄し、0.1%ニュークリアファストレッド溶液とともに5分間インキュベートした後、段階的アルコールおよびキシレンでの脱水処理に供した。封入剤を滴下したスライドにカバーガラスを載せ、Olympus社BX61顕微鏡で観察した。
結果を、平均±平均の標準誤差(SEM)の形式で報告し、Microsoft Excel(Microsoft社、ワシントン州レドモンド)を使用して計算する。統計学的有意差(p<0.05)の判定はStudentの両側t検定での解析により行った。
以上、本発明の明確な理解に資するよう図示および例示により本発明をある程度詳細に説明したが、添付した特許請求の範囲内である種の変更や修正を加えうることは当業者が理解するところであろう。加えて、各引用文献がそれぞれ参照により組み込まれた場合と同程度に、本明細書中に示した各引用文献の全文が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
Claims (29)
- 中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する方法であって、pHが約8を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドをほぼ大気圧または大気圧を超える気圧で水溶液と接触させてpHが約7である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより前記中和グルコマンナンスキャフォールドを作製することを含む、方法。
- 前記接触が約0℃〜約130℃の温度で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記接触が約20℃〜約50℃の温度で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記接触が約37℃の温度で行われる、請求項1の方法。
- 前記接触が約0.1psi〜約50psiだけ大気圧を超える圧力で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記接触が約1分〜約1ヵ月の期間行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記接触が約1時間〜約1週間の期間行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記接触が約1時間〜約1日の期間行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記接触が約8時間〜約20時間の期間行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記塩基性グルコマンナンスキャフォールドは細胞接着促進剤をさらに含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞接着促進剤がポリ−L−リシン(PLL)、ポリ−D−リシン(PDL)、RGDペプチド(RGD)、KQAGDV、VAPG、FGL、アミン基、フィブロネクチン、エラスチン、コラーゲンおよびラミニンからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記細胞接着促進剤がポリ−L−リシン(PLL)である、請求項11に記載の方法。
- 前記方法が、
グルコマンナン粉末、前記細胞接着促進剤、アルカリ性溶液および水を含有する反応混合物を生成することと、
前記反応混合物を約50℃〜約130℃の温度で加熱してグルコマンナンゲルを形成する工程と、
前記グルコマンナンゲルの圧力を、約0.1psi〜約200psiだけ大気圧を超える圧力に上昇させることと、
前記グルコマンナンゲルを約50℃未満の温度まで冷却することと、
前記グルコマンナンゲルから前記水を除去して前記塩基性グルコマンナンゲルを形成することと
をさらに含む、請求項10に記載の方法。 - 前記圧力が約14.7psiから約50psiに上昇される、請求項13に記載の方法。
- 前記除去工程が昇華によって行われる、請求項13に記載の方法。
- 前記水溶液が水、緩衝液、酸性溶液および細胞培養培地からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記水溶液が緩衝液である、請求項1に記載の方法。
- 前記緩衝液がPBS、HEPES、MES、MOPS、TRISおよびBIS−TRISプロパンからなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記緩衝液がPBSである、請求項17に記載の方法。
- 前記水溶液が細胞培養培地である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞培養培地がロズウェルパーク記念研究所培地(RPMI)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、最小必須培地(MEM)、ダルベッコ変法イーグル培地:混合栄養F−12培地(DMEM/F12)、イスコフ変法ダルベッコ培地(IMDM)、National Collection of Type Cultures培地(NCTC)および骨芽細胞分化誘導培地(OIM)からなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
- 中和グルコマンナンスキャフォールドを作製する方法であって、pHが約8を超える塩基性グルコマンナンスキャフォールドを減圧圧力下で水溶液と接触させてpHが約7である中和グルコマンナンスキャフォールドを形成することにより前記中和グルコマンナンスキャフォールドを作製することを含む、方法。
- 中和グルコマンナンスキャフォールド上で細胞を増殖させる方法であって、請求項1に記載の中和グルコマンナンスキャフォールドと細胞との反応混合物を前記細胞が増殖するよう加熱することにより前記中和グルコマンナンスキャフォールド上で細胞を増殖させることを含む、方法。
- 前記細胞が体細胞、幹細胞または前駆細胞およびこれらの細胞から誘導される細胞からなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
- pHが約7であるグルコマンナンスキャフォールド。
- 細胞接着促進剤を含有する、請求項25に記載のグルコマンナンスキャフォールド。
- 前記細胞接着促進剤がポリ−L−リシン(PLL)、ポリ−D−リシン(PDL)、RGDペプチド(RGD)、KQAGDV、VAPG、FGL、アミン基、フィブロネクチン、エラスチン、コラーゲンおよびラミニンからなる群から選択される、請求項26に記載のグルコマンナンスキャフォールド。
- 前記細胞接着促進剤がポリ−L−リシン(PLL)である、請求項25に記載のグルコマンナンスキャフォールド。
- 請求項1に記載の方法によって作製される、請求項25に記載のグルコマンナンスキャフォールド。
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