KR102072317B1 - 항-pd1 항체 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-PD1 항체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

항-PD1 항체 및 사용 방법
본 발명은 항-PD1 항체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
PD-1
T-세포에 2개의 별개의 신호로 공-자극하거나 제공하는 것은 항원-제시 세포(APC)에 의한 휴지 T 림프구의 림프구 활성화에 대한 널리 용인된 모델이다[Lafferty et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 53: 27-42 (1975)].
상기 모델은 또한 비-자가 관용 및 면역 관용으로부터 자가 관용을 구별하는 것을 가능하게 한다[Bretscher et al., Science 169: 1042-1049 (1970); Bretscher, P.A., P.N.A.S. USA 96: 185-190 (1999); Jenkins et al., J. Exp. Med. 165: 302-319 (1987)]. 1차 신호 또는 항원 특이적 신호는 T-세포 수용체(TCR)를 통해 변환된 후 주조직적합성-복합체(major histocompatibility-complex, MHC)의 배경에서 제공된 외래 항원 펩티드를 인식한다. 2차 또는 공-자극 신호는 항원-제시 세포(APC) 상에서 발현된 공-자극 분자에 의해 T-세포로 전달되고, T-세포가 클론성 증식, 사이토카인 분비 및 작동인자 기능을 촉진하도록 유도한다[Lenschow et al., Ann. Rev. Immunol. 14:233 (1996)]. 공-자극의 부재하에서, T-세포는 항원 자극에 불응성이 될 수 있고, 효과적인 면역 반응을 일으키지 않고, 또한 외래 항원에 대해 기능소실 또는 내성을 야기할 수 있다.
TCR 신호의 강도가 실제로 T-세포 활성화 및 분화에 대해 양적인 영향을 미치기 때문에, 단순한 2-신호 모델은 지나치게 단순화시킨 것일 수 있다[Viola et al., Science 273: 104-106 (1996); Sloan-Lancaster, Nature 363: 156-159 (1993)]. 더욱이, T-세포 활성화는, TCR 신호 강도가 높은 경우 공-자극 신호의 부재하에서도 일어날 수 있다. 보다 중요하게, T-세포는 양성 및 음성 2차 공-자극 신호를 둘 다 수용한다. 상기 양성 및 음성 신호의 조절은, 면역 관용을 유지하고 자가면역을 방지하면서 숙주의 보호 면역 반응을 최대화하는데 중요하다.
음성 2차 신호는 T-세포 내성의 유도에 필수적인 것으로 보이는 한편, 양성 신호는 T-세포 활성화를 촉진한다. 단순한 2-신호 모델은 나이브(naive) 림프구에 대한 타당한 설명을 제공하지만, 숙주의 면역 반응은 동적 과정이며, 공-자극 신호는 항원-노출된 T-세포에 의해서도 또한 제공될 수 있다.
공-자극 신호의 조작은 세포-기반 면역 반응을 증대시키거나 종료시키기 위한 수단을 제공하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 공-자극의 메카니즘은 치료적 관심분야이다. 최근에, T 세포 기능장애 또는 무반응은 억제 수용체, 예정 세포사멸 1 폴리펩티드(programmed death 1 polypeptide, PD-1)의 유도 및 지속된 발현과 동시에 일어나는 것으로 밝혀졌다, 결과적으로, PD-1의 치료적 표적화는 큰 관심 분야이다.
예정 세포사멸 1(PD-1) 단백질은, CD28, CTLA-4, ICOS 및 BTLA를 또한 포함하는, 수용체들의 CD28 계열의 억제성 구성원이다. PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포 상에서 발현된다[Agata et al, supra; Okazaki et al (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8]. 상기 계열의 초기 구성원인 CD28 및 ICOS는 단일클론 항체들의 첨가후에 증가하는 T 세포 증식에 대한 기능적 효과에 의해 발견되었다[Hutloff etal (1999) Nature 397:263-266; Hansen et al (1980) Immunogenics 10:247-260]. PD-1은 자멸성 세포에서의 차등 발현에 대한 스크리닝을 통해 발견되었다[Ishida et al (1992) EMBO J 11:3887-95]. 상기 계열의 다른 구성원들인 CTLA-4 및 BTLA는 각각 세포독성 T 림프구 및 TH1 세포에서의 차등 발현에 대한 스크리닝을 통해 발견되었다. CD28, ICOS 및 CTLA-4는 모두 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 가져 동종이량체화를 가능하게 한다. 대조적으로, PD-1은 단량체로서 존재하는 것으로 시사되어, 다른 CD28 계열 구성원들에서의 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기 특성이 결여된다.
PD-1 유전자는 Ig 유전자 상과의 일부인 55 kDa 제 1형 막관통 단백질이다[Agata et al. (1996) bit Immunol 8:765-72]. PD-1은 막 근위 면역수용체 티로신 억제 모티프(ITIM) 및 막 원위 티로신-기반 스위치 모티프(ITSM)를 함유한다[Thomas, MX. (＼995) J Exp A4edW, 1953-6; Vivier, E and Daeron, M (1997) Immunol Today 18:286-91]. PD-1은 CTLA-4와 구조적으로 유사하지만, B7-1 및 B7-2 결합에 중요한 MYPPPY 모티프가 결여되어 있다. PD-1에 결합시 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 밝혀진, PD-1에 대한 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2가 확인되었다[Freeman et al (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter etal (2002) Eur J Immunol 32:634-43]. PD-Ll 및 PD-L2는 둘 다 PD-1에는 결합하지만 다른 CD28 계열 구성원들에는 결합하지 않는 B7 동족체이다. PD-1에 대한 한 리간드인 PD-Ll은 다양한 인간 암들에서 많다[Dong et al (2002) Nat. Med 8:787-9]. PD-1과 PD-Ll 사이의 상호작용은 종양 침윤 림프구의 감소, T-세포 수용체 매개 증식의 감소, 및 암성 세포에 의한 면역 회피를 야기한다[Dong et al. (2003) J. MoI. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100]. 면역 억제는 PD-1과 PD-Ll과의 국소 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있으며, 상기 효과는 PD-1과 PD-L2와의 상호작용이 차단될 때 또한 부가적이다[Iwai et al. (2002) Proc. Nat 7. Acad. ScL USA 99: 12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66].
PD1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포 상에서 발현되는 CD28 계열의 억제성 구성원이다[Agata etal, supra; Okazaki et al. (2002) Curr Opin Immunol 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol YWJl 1-8]. PD-I 결핍 동물은, 자가면역 심근증 및 관절염과 신염을 동반하는 루푸스-유사 증후군을 포함한 다양한 자가면역 표현형을 나타낸다[Nishimura et al. (1999) Immunity H: 141-51; Nishimura et al. (2001) Science 291:319-22]. 또한, PD1은 자가면역 뇌척수염, 전신 홍반성 루프스, 이식편-대-숙주 질환(GVHD), 제 1형 당뇨병 및 류마티스성 관절염에서 한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다[Salama et al. (2003) J Exp Med 198:71-78: Prokunina and Alarcon-Riquelme (2004) Hum MoI Genet 13_:R143; Nielsen et al. (2004) Lupus 11:510]. 뮤린 종양 B 세포주에서, PD1의 ITSM은 BCR-매개 Ca<2+>-플럭스 및 하위 작동인자 분자의 티로신 포스포릴화를 차단하는데 필수적인 것으로 밝혀졌다[Okazaki etal. (2001) PNAS 98: 13866-71].
다음을 포함한 다양한 특허 출원들이 항-PD-1 항체의 생성 및/또는 PD-L1 결합 및/또는 PD-1 신호전달을 방해하는 약제(항-PD-1 항체 포함)를 사용하여 면역 반응을 증대시키는 방법을 개시하고 있다: US2003/0039653, US2004/0213795, US2006/0110383, US2007/0065427, US2007/0122378, US2012/237522, WO2004/072286, WO2006/121168, WO2006/133396, WO2007/005874, WO2008/083174, WO2008/156712, WO2009/024531, WO2009/014708, WO2009/114335, WO2010/027828, WO2010/027423, WO2010/036959, WO2010/029435, WO2010/029434, WO2010/063011, WO2010/089411, WO2011/066342, WO2011/110604, WO2011/110621, 및 WO2012/145493.
본 발명은 항-PD1 항체 및 그의 사용 방법을 제공한다.
본 발명의 한 양태는,
i) PD1-0103의 VH 및 VL을 포함하는 항-PD1 항체와 PD-1에 대한 결합을 위해 경쟁하고/하거나;
ii) 인간 및 사이노몰구스(cynomolguoes) PD-1에 결합하고/하거나;
iii) 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 인터페론-감마(IFN-감마) 분비를 85% 이상 증대시키고/시키거나;
iv) 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 분비를 200% 이상 증대시키는,
상기 항-PD1 항체이다.
본 발명의 또 다른 양태는, 혼합 림프구 반응(Mixed Lymphocyte Reaction, MLR) 분석에서 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 인터페론-감마(IFN-감마) 분비를 85% 이상 증대시키는, 인간 PD1에 결합하는 항체이다.
본 발명의 또 다른 양태는, 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 분비를 200% 이상 증대시키는, 인간 PD1에 결합하는 항체이다.
본 발명은 다음을 포함하는, 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체를 제공한다:
A) (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
B) (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
C) (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
D) (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
E) (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
F) (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
G) (a) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
본 발명은 다음을 포함하는, 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체를 제공한다:
A) (a) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
B) (a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
C) (a) (i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
D) (a) (i) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
E) (a) (i) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
F) (a) (i) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
G) (a) (i) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인.
본 발명은 또한,
A) i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
B) i) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 58의 VL 서열을 포함하거나,
ii) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 59의 VL 서열을 포함하거나,
iii) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 60의 VL 서열을 포함하거나,
iv) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 61의 VL 서열을 포함하거나; 또는
C) i) 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
D) i) 서열번호 23의 VH 서열 및 서열번호 24의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
E) i) 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
F) i) 서열번호 39의 VH 서열 및 서열번호 40의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
G) i) 서열번호 47의 VH 서열 및 서열번호 48의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
H) i) 서열번호 55의 VH 서열 및 서열번호 56의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하는,
인간 PD1에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-PD1 항체는 단일클론 항체이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-PD1 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-PD1 항체는 PD1에 결합하는 항체 단편이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-PD1 항체는 Fab 단편이다.
본 발명은 상기 항들중 어느 하나에 따른 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 발명은 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 항체가 생성되도록 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 숙주 세포로부터 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는, 항체를 생성하는 상기 방법을 제공한다.
본 발명은 본원에 기술된 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형을 제공한다.
본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 본원에 기술된 항체를 제공한다.
본 발명은 암을 치료하는데 사용하기 위한, 본원에 기술된 항체를 제공한다.
본 발명은 약제의 제조에 있어서 본원에 기술된 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 약제는 암의 치료를 위한 것이다.
본 발명은 개체에게 본원에 기술된 항체 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
도 1: 키메라 PD1-0103으로 PD1을 차단하면 동종이계 자극된 1차 인간 T 세포에 의한 IFN-감마 분비가 크게 증대된다.
도 2: 키메라 PD1-0103으로 PD1을 차단하면 동종이계 자극된 1차 인간 T 세포에 의한 인터페론-감마(IFN-g) 분비가 크게 증가한다.
도 3: 키메라 PD1-0103으로 PD1을 차단하면 동종이계 자극된 1차 인간 T 세포에 의한 종양 괴사 인자 알파(TNF) 분비가 크게 증가한다.
도 4: 4A) 그랜자임(Granzyme) B를 생성하는 CD4 T 세포의 빈도, 및 4B) 증가하는 농도의 상이한 항-PD-1 항체들의 존재하에 MLR의 상등액중에서 흡광도(광학 밀도, O.D.)로 검출된 IFN-γ의 양.
도 5: 5A) 상이한 항-PD-1 항체들의 존재하에 억제된 T 세포 수용체 신호전달의 재활성화에 대한 PD1/PD-L1 차단의 영향, 5B) 상이한 항-PD-1 항체들의 존재하에 억제된 T 세포 수용체 신호전달의 재활성화에 대한 PD1/PD-L1 차단의 영향.
도 6: PD1-0103의 Fab와의 복합체로서 PD1-ECD의 구조.
도 7: Fab PD1-0103과의 PD1-ECD 복합체의 구조: PD1 상의 ASN58에서의 글리코실화가 상호작용에 수반된다.
도 8: Fab PD1-0103과의 PD1-ECD 복합체의 구조: 에피토프 / 파라토프 상에서의 시점.
도 9: Asn58의 PD1 코어 당 측쇄 - Fab PD1-0103 중쇄 접촉부: 5 Å의 거리 컷오프에 의해 확인된 접촉부.
도 10: 항체와 상호작용하는 PD1-ECD의 잔기들 - 상술한 접촉 성질을 갖는 서열 그림 - PD-1.
도 11: PD1-ECD와 상호작용하는 항체의 잔기들 - 상술한 접촉 성질을 갖는 서열 그림 - 중쇄.
도 12: PD1-ECD와 상호작용하는 항체의 잔기들 - 상술한 접촉 성질을 갖는 서열 그림 - 경쇄.
도 13A: Asn58에서 비글리코실화된 PD1(왼쪽) 및 Asn58에서 글리코실화된 PD1(오른쪽)에 대한 상이한 항체들의 결합(비아코어(Biacore) 센서그램).
도 13B: Asn58에서 비글리코실화된 PD1 및 Asn58에서 글리코실화된 PD1에 대한 상이한 항체들의 결합 - 비아코어에 의해 측정된 온-오프-속도 mab.
도 14A: 이중특이성 CEA-CD3 항체와 함께 니볼루맙과 비교한 PD1-0103-0312(aPD-1)의 생체내 종양 성장 억제 - 고용량에서.
도 14B: 이중특이성 CEA-CD3 항체와 함께 니볼루맙과 비교한 PD1-0103-0312(aPD-1)의 생체내 종양 성장 억제 - 고용량에서.
본 발명의 취지에서 "수용체(acceptor) 인간 프레임워크"는, 하기에 정의된 바와 같은 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유도된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유도된" 수용체 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
용어 "PD1", "인간 PD1", "PD-1" 또는 "인간 PD-1"은, 본원에서 사용될 때, 인간 단백질 PD1(서열번호 68)(신호 서열이 없는 단백질)/(서열번호 70)(신호 서열을 갖는 단백질)을 말한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "인간 PD1에 결합하는", "인간 PD1에 특이적으로 결합하는", "인간 PD1에 결합하는" 항체 또는 "항-PD1 항체"는 1.0 x 10-8 몰/l 이하의 KD-값, 한 실시양태에서는 1.0　x　10-9　몰/l 이하의 KD-값, 한 실시양태에서는 1.0　x　10-9 몰/l 내지 1.0　x　10-13 몰/l의 KD-값의 결합 친화도하에 인간 PD1 항원 또는 그의 세포외 도메인(Extracellular Domain, ECD)에 특이적으로 결합하는 항체를 말한다. 결합 친화도는, 예를 들면, PD1 세포외 도메인을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 기술(비아코어(BIAcore)®, GE-헬쓰케어(GE-Healthcare), 스웨덴 웁살라 소재)과 같은 표준 결합 분석법으로 측정된다.
인간 PD1은 서열번호 70의 PD-1 잔기 49, 58, 74에 N-결합된 글리코실화 부위를 갖는다(예를 들면, 문헌 [D.Y. Lin et al , PNAS 105 (2008) 3011-3016] 참조). PD-1의 위치 Asn58에서의 코어 당쇄(N-결합된 글리코실화) 트리(tree)는 모노사카라이드와 관련하여 하기의 구조를 갖는다. 한 실시양태에서, PD1의 Asn58의 코어 당쇄는 Asn58에서 PD1에 결합되는 맨처음 5개의 당(모노사카라이드)을 말한다.
Asn58-N-GlcNAc(FUC) - GlcNAc- - BMA - MAN (도 9 참조) (이때, 하기의 약자들을 사용한다).
[GlcNAc]= NGA = N-아세틸-베타-D-갈락토스아민 = 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-베타-D-갈락토피라노스
[FUC] = 알파-L-푸코스　
[BMA] = 베타-D-만노피라노스
[MAN] = 알파-D-만노피라노스
당쇄 중 맨처음 GlcNAC는 푸코실화되어 GlcNAc(FUC)로 약칭된다.
한 실시양태에서, PD1의 Asn58의 코어 당쇄는 Asn58에서 PD1에 결합되는 맨처음 5개의 당(모노사카라이드) GlcNAc, FUC, GlcNAc, BMA, MAN을 말한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 일반적인 의미로 사용되며, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 경우의 항체 단편을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 항체 구조물을 포함한다.
"항체 단편"은 온전한(intact) 항체가 결합하는 항원과 결합하는 온전한 항체의 일부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 다른 분자를 말한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예, scFv); 및 항체 단편들로부터 생성된 다중특이성 항체가 포함되나 이로 한정되지는 않는다.
기준 항체와 "동일 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 분석법에서 그 항원에 대한 기준 항체의 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 말하며, 반대로, 기준 항체는 경쟁 분석법에서 그 항원에 대한 항체의 결합을 50% 이상 차단한다. 예시적인 경쟁 분석법이 본원에서 제공된다.
용어 "키메라" 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분은 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 말한다.
항체의 "클래스"는 그 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체의 5개 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 여러개가 서브클래스(이소타입(isotype)), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "세포독성 약제"는 세포 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 말한다. 세포독성 약제로는 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: 방사성 동위원소(예를 들면, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 약물(예를 들면, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 삽입제(intercalating agent)); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예를 들면, 핵산분해 효소; 항생물질; 독소, 예를 들면, 그의 단편 및/또는 변이체를 포함하여, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소; 및 하기에 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제.
약제, 예를 들면, 약학 제형의 "효과량"은 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량으로 및 필요한 시간동안 효과적인 양을 말한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단까지 이어진다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역중 아미노산 잔기의 번호지정은, 문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]에 기술된 바와 같이, EU 인덱스로도 불리는 EU 번호 체계에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 다음의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체(full length antibody)", "온전한 항체(intact antibody)" 및 "전항체(whole antibody)"는 본원에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 가지거나 또는 본원에서 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며, 상기 세포들의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 말한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"를 포함하며, 이들은 1차 형질전환된 세포, 및 계대 수에 관계없이 그로부터 유도된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoire) 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유도된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체의 상기 정의는 명확하게 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외한다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 흔히 존재하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 아군(subgroup)으로부터 이루어진다. 일반적으로, 서열의 상기 아군은 문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3]에서와 같은 아군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우, 상기 아군은 상기 카바트 등(Kabat et al.)의 문헌에서와 같은 아군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우, 상기 아군은 상기 카바트 등의 문헌에서와 같은 아군 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 말한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 1개 이상, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 여기서 HVR(예를 들면, CDR)의 전부 또는 거의 전부가 비-인간 항체의 HVR에 상응하고, FR의 전부 또는 거의 전부가 인간 항체의 FR에 상응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화가 일어난 항체를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에 있어서 초가변성이고("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")/이거나 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하고/하거나 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")을 함유하는 항체 가변 도메인의 영역들 각각을 말한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR: VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 본원에서 예시적인 HVR은 다음을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)에 존재하는 초가변 루프[Chothia and Lesk, J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987)];
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)에 존재하는 CDR[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)];
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2) 및 93-101(H3)에 존재하는 항원 접촉부[MacCallum et al. J. Mol . Biol. 262:732-745 (1996)]; 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3) 및 94-102(H3)를 포함한, (a), (b) 및/또는 (c)의 조합.
달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인내 다른 잔기들(예를 들면, FR 잔기)은 본원에서 카바트 등의 상기 문헌에 따라 번호가 지정된다.
"면역접합체"는 세포독성 약제를 포함하지만 이로 한정되지는 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물로는 가축(예, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼 및 설치류(예, 마우스 및 래트)가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상은 인간이다.
"단리된" 항체는 그 천연 환경의 성분으로부터 분리된 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는, 예를 들면, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전 초점(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정시, 95% 또는 99%보다 더 큰 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌 [Flatman, S. et al, J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87]을 참조하시오.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 말한다. 단리된 핵산은, 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-PD1 항체를 암호화하는 단리된 핵산"은 단일 벡터 또는 별개의 벡터들 중의 상기 핵산 분자(들) 및 숙주 세포내 하나 이상의 위치에 존재하는 상기 핵산 분자(들)을 포함하여, 항체 중쇄 및 경쇄(또는 그의 단편들)을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 말한다, 즉, 상기 집단을 이루는 개개 항체들은, 예를 들면, 천연 돌연변이를 함유하거나 또는 단일클론 항체 제제의 제조시 발생하는 가능한 변이체 항체(상기 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고/하거나, 동일 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정기(determinant) (에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체들을 포함하는 다중클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원상의 단일 결정기에 대해 유도된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 이해해서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용될 단일클론 항체는, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌 전체 또는 일부를 함유하는 유전자이식 동물을 이용하는 방법을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 단일클론 항체를 제조하기 위한 상기 방법 및 다른 예시적인 방법들이 본원에 기술되어 있다.
"네이키드(naked) 항체"는 이종 잔기(예를 들면, 세포독성 잔기) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 말한다. 네이키드 항체는 약학 제형중에 존재할 수 있다(선행 기술이 면역접합체를 갖는 경우에 포함).
"천연(native) 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH)에 이어, 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VL)에 이어, 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는, 그 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료 제품의 적응증, 사용법, 투여량, 투여법, 병용 치료, 금기사항 및/또는 사용에 관한 경고에 대한 정보를 포함하는, 치료 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 말하기 위해 사용된다.
기준 폴리펩티드 서열과 관련하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않고, 기준 폴리펩티드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 대중적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 당해 분야의 기술에 속하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당해 분야에 숙련된 자라면 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터들을 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 경우, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 산출한다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 제작되었으며, 소스 코드는 워싱턴 D.C., 20559의 미국 저작권청(U.S. Copyright Office)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 여기에 미국 저작권 등록 번호(U.S. Copyright Registration No.) TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스샌프란시스코 소재의 제넨테크 인코포레이티드로부터 대중적으로 이용가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여, UNIX 작업 시스템상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터들은 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 상기 서열 B와 비교해 또는 상기 서열 B에 대비해, 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(양자택일적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 상기 서열 B와 비교해 또는 상기 서열 B에 대비해 특정 % 아미노산 서열 동일성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서도 표현될 수 있다)은 다음과 같이 산출된다:
100 x 분수 X/Y
상기에서, X는 A와 B의 상기 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 기록된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B 중의 아미노산 잔기들의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 같지 않을 것임을 인지할 것이다. 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에서 기술된 바와 같이 수득된다.
용어 "약학 제형"은 그에 함유된 활성 성분의 생물 활성이 효과적이 되게 하기 위한 형태이면서 제형이 투여될 대상에게 허용될 수 없을 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 대상에게 무독성인, 활성 성분 이외의 다른, 약학 제형중의 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"(및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)은 치료되는 개체의 자연적 과정을 변화시키기 위한 시도의 임상적 개입을 말하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리학적 결과의 경감, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 진전을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는데 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들면, 문헌 [Kindt, T.J. et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인이면 항원-결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 상보성 VL 또는 VH 도메인 각각의 라이브리러를 스크리닝하기 위해, 상기 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628] 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조물로서의 벡터뿐 아니라 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈내에 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
조성물 및 방법
한 양태에서, 본 발명은, 부분적으로, 본 발명의 선별된 항-PD1 항체가 PD1의 특정 에피토프에 결합하며 상이한 면역 세포들(예, T-세포, B-세포, NK 세포, 수지상 세포(DC), 단핵구 및 대식세포)의 활성화를 증대시키는 능력을 갖는다는 발견을 기반으로 한다. 예를 들면, 이들은 면역조절 사이토카인(예, 인터페론 감마 및 그랜자임 B) 방출(분비)를 증가시킨다. 증가되거나 증가될 수 있는 다른 면역조절 사이토카인은, 예를 들면, 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 분비 및 IL-12이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 인터페론 감마(IFN-감마), 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 분비, IL-12 등은 인간 사이토카인을 말한다.
특정 실시양태에서, PD1에 결합하는 항체들이 제공된다. 본 발명의 항체들은, 예를 들면, 암의 진단 또는 치료에 유용하다.
예시적인 항-PD1 항체
한 양태에서, 본 발명은 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
특정 실시양태에서,
i) PD1-0103의 VH 및 VL을 포함하는 항-PD1 항체와 PD-1에 대한 결합을 위해 경쟁하고;
ii) 인간 및 사이노몰구스 PD-1에 결합하고;
iii) 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 인터페론-감마(IFN-감마) 분비를 85% 이상(한 바람직한 실시양태에서는 90% 이상, 한 바람직한 실시양태에서는 95% 이상) 증대시키고/시키거나[이때, 항체 부재하에서의 상기 분비는 0%로 설정되고(IFN 감마의 기저 수준), 20 EU/ml 재조합 인간 IL-2 하에서의 분비는 100%로 설정된다(실시예 3에 따른 (동종이계) 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서)];
iv) 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 분비를 200% 이상(한 바람직한 실시양태에서는 250% 이상) 증대시키는[이때, 항체 부재하에서의 상기 분비는 0%로 설정되고(IFN 감마의 기저 수준), 20 EU/ml 재조합 인간 IL-2 하에서의 분비는 100%로 설정된다(실시예 3에 따른 (동종이계) 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서)],
항-PD1 항체가 제공된다.
한 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-PD1 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 항-PD1 항체는
i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열; 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체
를 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 항-PD1 항체는
i) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 58의 VL 서열; 또는
ii) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 59의 VL 서열; 또는
iii) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 60의 VL 서열; 또는
iv) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 61의 VL 서열
을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 항-PD1 항체는 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 58의 VL 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 항-PD1 항체는 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 59의 VL 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 항-PD1 항체는 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 60의 VL 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 항-PD1 항체는 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 61의 VL 서열을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-PD1 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-PD1 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 항-PD1 항체는
i) 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열; 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체
를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-PD1 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-PD1 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는, (a) (i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 항-PD1 항체는
i) 서열번호 23의 VH 서열 및 서열번호 24의 VL 서열; 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체
를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-PD1 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-PD1 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는, (a) (i) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 항-PD1 항체는
i) 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열; 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체
를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-PD1 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-PD1 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는, (a) (i) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 항-PD1 항체는
i) 서열번호 39의 VH 서열 및 서열번호 40의 VL 서열; 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체
를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-PD1 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-PD1 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는, (a) (i) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 항-PD1 항체는
i) 서열번호 47의 VH 서열 및 서열번호 48의 VL 서열; 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체
를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-PD1 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은, (a) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-PD1 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는, (a) (i) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VH HVR 서열 모두를 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 VL HVR 서열 모두를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 항-PD1 항체는
i) 서열번호 47의 VH 서열 및 서열번호 48의 VL 서열; 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체
를 포함한다.
한 바람직한 실시양태에서, 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열을 포함하는 항-PD1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
한 바람직한 실시양태에서, 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열을 포함하는 항-PD1 항체와 인간 PD1에 대한 결합을 위해 경쟁하는(실시예 2에서 기술된 경쟁 분석법(에피토프 지도화 ELISA/결합 경쟁 분석법)으로 측정시) 항체가 제공된다.
한 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-PD1 항체(예를 들면, 인간 PD1에 결합하는 항체)를 제공한다:
A) (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-PD1 항체(예를 들면, 인간 PD1에 결합하는 항체)를 제공한다:
(a) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인.
한 양태에서, 본 발명은
A) i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
B) i) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 58의 VL 서열을 포함하거나,
ii) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 59의 VL 서열을 포함하거나,
iii) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 60의 VL 서열을 포함하거나,
iv) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 61의 VL 서열을 포함하거나; 또는
C) i) 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
D) i) 서열번호 23의 VH 서열 및 서열번호 24의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
E) i) 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
F) i) 서열번호 39의 VH 서열 및 서열번호 40의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
G) i) 서열번호 47의 VH 서열 및 서열번호 48의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
H) i) 서열번호 55의 VH 서열 및 서열번호 56의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하는,
인간 PD1에 결합하는 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은
i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하는,
인간 PD1에 결합하는 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 58의 VL 서열을 포함하는, 인간 PD1에 결합하는 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 59의 VL 서열을 포함하는, 인간 PD1에 결합하는 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 60의 VL 서열을 포함하는, 인간 PD1에 결합하는 항체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 61의 VL 서열을 포함하는, 인간 PD1에 결합하는 항체를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-PD1 항체(예를 들면, 인간 PD1에 결합하는 항체)를 제공한다:
A) (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
B) (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
C) (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
D) (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
E) (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
F) (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
G) (a) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
이때, 상기 항체는 독립적으로 하기 성질들 중 하나 이상을 특징으로 한다:
항-PD-1 항체는
i) PD1-0103의 VH 및 VL을 포함하는 항-PD1 항체와 PD-1에 대한 결합을 위해 경쟁하고/하거나,
ii) 인간 및 사이노몰구스 PD-1에 결합하고/하거나,
iii) 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 인터페론-감마(IFN-감마) 분비를 85% 이상(한 바람직한 실시양태에서는 90% 이상, 한 바람직한 실시양태에서는 95% 이상) 증대시키고/시키거나[이때, 항체 부재하에서의 상기 분비는 0%로 설정되고(IFN 감마의 기저 수준), 20 EU/ml 재조합 인간 IL-2 하에서의 분비는 100%로 설정된다(실시예 3에 따른 (동종이계) 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서)],
iv) 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 분비를 200% 이상(한 바람직한 실시양태에서는 250% 이상) 증대시킨다[이때, 항체 부재하에서의 상기 분비는 0%로 설정되고(IFN 감마의 기저 수준), 20 EU/ml 재조합 인간 IL-2 하에서의 분비는 100%로 설정된다(실시예 3에 따른 (동종이계) 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서)].
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-PD1 항체(예를 들면, 인간 PD1에 결합하는 항체)를 제공한다:
A) (a) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
B) (a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
C) (a) (i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
D) (a) (i) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
E) (a) (i) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
F) (a) (i) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
G) (a) (i) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인;
이때, 상기 항체는 독립적으로 하기 성질들 중 하나 이상을 특징으로 한다:
항-PD-1 항체는
i) PD1-0103의 VH 및 VL을 포함하는 항-PD1 항체와 PD-1에 대한 결합을 위해 경쟁하고/하거나,
ii) 인간 및 사이노몰구스 PD-1에 결합하고/하거나,
iii) 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 인터페론-감마(IFN-감마) 분비를 85% 이상(한 바람직한 실시양태에서는 90% 이상, 한 바람직한 실시양태에서는 95% 이상) 증대시키고/시키거나[이때, 항체 부재하에서의 상기 분비는 0%로 설정되고(IFN 감마의 기저 수준), 20 EU/ml 재조합 인간 IL-2 하에서의 분비는 100%로 설정된다(실시예 3에 따른 (동종이계) 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서)],
iv) 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 분비를 200% 이상(한 바람직한 실시양태에서는 250% 이상) 증대시킨다[이때, 항체 부재하에서의 상기 분비는 0%로 설정되고(IFN 감마의 기저 수준), 20 EU/ml 재조합 인간 IL-2 하에서의 분비는 100%로 설정된다(실시예 3에 따른 (동종이계) 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서)].
본 발명의 또 다른 양태에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-PD1 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하여 단일클론 항체이다. 한 실시양태에서, 항-PD1 항체는 항체 단편, 예를 들면, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 전장 항체, 예를 들면, 온전한 IgG1 또는 IgG4 항체, 또는 본원에서 정의된 바와 같은 다른 항체 클래스 또는 이소타입의 항체이다.
또 다른 양태에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-PD1 항체는 하기의 단락 1 내지 7에 기술된 바와 같은 임의의 특징들을 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다:
1. 항체 친화도
특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM 또는 ≤0.001 nM (예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 KD를 갖는다.
한 바람직한 실시양태에서, KD는 25 ℃에서 약 10 공명 단위(RU)에서 고정화 항원 CM5 칩을 사용하여 비아코어(BIACORE)®를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 분석법을 이용하여 측정한다. 간략하게, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 비아코어 인코포레이티드)을 공급자의 지시에 따라서 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 4.8)로 5 ㎍/ml(약 0.2 μM)로 희석한 후 5 ㎕/분의 유량으로 주입하여 약 10 공명 단위(RU)의 커플링된 단백질을 달성한다. 항원 주입 후에, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 동적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)을 25 ℃에서 0.05% 폴리솔베이트 20(트윈(TWEEN)-20™) 계면활성제를 갖는 PBS(PBST) 중에 약 25 ㎕/분의 유량으로 주입하였다. 결합 속도(kon 또는 ka) 및 해리 속도(koff 또는 kd)는 결합 및 해리 샌서그램을 동시에 적합화시켜 단순 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어® 평가 소프트웨어(Evaluation Software) 버전 3.2)을 이용하여 산출한다. 평형 해리 상수 KD는 비 kd/ka(koff/kon)로서 산출한다(예를 들면, 문헌 [Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881] 참조). 상기의 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 온-속도(on-rate)가 106 M-1s- 1를 초과하는 경우, 온-속도는, 분광계, 예를 들면, 정류기(stop-flow) 장착 분광광도계(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-AMINCO™ 분광광도계(써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정시, 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS(pH 7.2) 중 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의, 25 ℃에서의 형광 발광 강도(여기 = 295 nm; 발광 = 340 nm, 16 nm 통과대역(band-pass))에서의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기술을 이용하여 측정할 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편으로는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기에서 기술되는 다른 단편들이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 특정 항체 단편에 대한 검토를 위해서는, 문헌 [Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]을 참조하시오. scFv 단편에 대한 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌 [Plueckthun, A., In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994) pp. 269-315]; 또한 WO 93/16185 호; 및 미국 특허 제 5,571,894 및 5,587,458 호를 참조하시오. 재생 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 검토를 위해서는, 미국 특허 제 5,869,046 호를 참조하시오.
디아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다(예를 들면, EP 0 404 097 호; WO 1993/01161 호; 문헌 [Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; and Hollinger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448] 참조). 트리아바디 및 테트라바디도 또한 문헌 [Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]에 기술되어 있다.
단일-도메인 항체는 중쇄 가변 도메인 전체 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 월탐 소재); 예를 들면, 미국 특허 제 6,248,516 B1 호 참조).
항체 단편은, 온전한 항체의 단백질분해성 절단뿐 아니라 본원에 기술된 바와 같은 재조합 숙주 세포(예를 들면, 이. 콜라이 (E. coli) 또는 파지)에 의한 생성을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정한 키메라 항체가, 예를 들면, 미국 특허 제 4,816,567 호; 및 문헌 [Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]에 기술되어 있다. 한 예로, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 원숭이와 같은 비-인간 영장류로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 다른 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모 항체로부터 변화된 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는, 비-인간 모 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들면, CDR(또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체중 일부 FR 잔기는, 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화도를 회복시키거나 개선하기 위해 비-인간 항체(예를 들면, 그로부터 HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은, 예를 들면, 문헌 [Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633]에 개관되어 있고, 예를 들면, 문헌 [Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]; 미국 특허 제 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409 호; 문헌 [Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34](SDR(a-CDR) 그라프팅을 기술하고 있음); 문헌 [Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498]("재표면화"를 기술하고 있음); 문헌 [Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60]("FR 셔플링"을 기술하고 있음); 및 문헌 [Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 and Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260](FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근방법을 기술하고 있음)에 더 기술되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역으로는 다음이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다: "최적합(best-fit)" 방법을 이용하여 선택된 프레임워크 영역(예를 들면, 문헌 [Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역들의 특정 아군의 인간 항체들의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들면, 문헌 [Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; and Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632] 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역(예를 들면, 문헌 [Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633] 참조); 및 FR 라이브러리 검색으로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들면, 문헌 [Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 and Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618] 참조).
4. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 and Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459]에 기술되어 있다.
인간 항체는, 항원 자극에 대해 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 유전자이식 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 상기 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체내에 무작위로 통합되는 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 상기와 같은 유전자이식 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 유전자이식 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법에 대한 검토를 위해서는, 문헌 [Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125]을 참조하시오. 또한, 예를 들면, 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술을 설명하고 있는 미국 특허 제 6,075,181 및 6,150,584 호; 휴맙(HuMab)® 기술을 설명하고 있는 미국 특허 제 5,770,429 호; K-M 마우스® 기술을 설명하고 있는 미국 특허 제 7,041,870 호; 및 벨로시마우스(VelociMouse)® 기술을 설명하고 있는 미국 특허출원 공개 US 2007/0061900 호를 참조하시오. 상기 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들면, 상이한 인간 불변 영역과 조합시킴으로써 더 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기술되었다(예를 들면, 문헌 [Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63; and Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95] 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술에 의해 생성된 인간 항체는 또한 문헌 [Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562]에 기술되어 있다. 또 다른 방법으로는, 예를 들면, 미국 특허 제 7,189,826 호(하이브리도마 세포주로부터 단일클론 인간 IgM 항체의 생성을 기술하고 있음) 및 문헌 [Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268](인간-인간 하이브리도마를 기술하고 있음)에 기술된 방법들이 포함된다. 인간 하이브리도마 기술(트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 and Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191]에 기술되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별된 Fc 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 상기 가변 도메인 서열은 이어서 목적하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하는 기술을 하기에서 기술된다.
5. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리를 제작하고 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대해 상기 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양한 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 방법은, 예를 들면, 문헌 [Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37]에 개관되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; and Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132]에 더 기술되어 있다.
특정한 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 별개로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되고, 상기 라이브러리는 이어서 문헌 [Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455]에 기술된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로, 단일-쇄 Fv(scFv) 단편으로서든지 또는 Fab 단편으로서든지 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구성할 필요없이 면역원에 대한 고-친화성 항체를 제공한다. 또는, 문헌 [Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734]에 기술된 바와 같이, 나이브 레퍼토리를 클로닝하여(예를 들면, 인간으로부터) 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체들의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 또한, 문헌 [Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388]에 기술된 바와 같이, 줄기 세포로부터 비-재배열된 V-유전자 절편을 클로닝하고, 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변성인 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내에서 재배열을 달성함으로써 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기술하고 있는 특허 공보로는, 예를 들면, 미국 특허 제 5,750,373 호 및 미국 특허 공개 제 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360 호가 포함된다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다중특이성 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 예를 들면, 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 PD1에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이성 항체는 PD1의 2개의 상이한 에피토프들에 결합할 수 있다. 이중특이성 항체는 또한 PD1을 발현하는 세포로 세포독성 약제를 국소화시키기 위해 사용될 수 있다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로 제조될 수 있다.
다중특이성 항체를 제조하기 위한 기술로는 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현(문헌 [Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540]; WO 93/08829 호; 및 문헌 [Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659] 참조), 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작(예를 들면, 미국 특허 제 5,731,168 호 참조)이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 다중특이성 항체는 또한, 항체 Fc-헤테로이량체 분자를 제조하기 위해 정전 스티어링(electrostatic steering) 효과를 조작하고(WO 2009/089004 호); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시키고(예를 들면, 미국 특허 제 4,676,980 호; 및 문헌 [Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83] 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이성 항체를 생성하고(예를 들면, 문헌 [Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553] 참조); 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위해 "디아바디" 기술을 사용하고(예를 들면, 문헌 [Hollinger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448] 참조); 단일쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하고(예를 들면, 문헌 [Gruber, M. et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374] 참조); 예를 들면, 문헌 [Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69]에 기술된 바와 같이 삼중특이성 항체를 제조함으로써 제조될 수 있다.
"옥토퍼스(Octopus) 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체도 또한 본원에 포함된다(예를 들면, US 2006/0025576 호 참조).
상기 항체 또는 단편은 본원에서 PD1 뿐 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF"를 또한 포함한다(예를 들면, US 2008/0069820 호 참조).
본원에서 항체 또는 단편은 또한 WO　2009/080251, WO　2009/080252, WO　2009/080253, WO　2009/080254, WO　2010/112193, WO　2010/115589, WO　2010/136172, WO　2010/145792 및 WO 2010/145793, WO2011/117330, WO2012/025525, WO2012/025530, WO2013/026835, WO2013/026831, WO2013/164325, 또는 WO 2013/174873호에 기술된 다중특이성 항체들을 포함한다.
7, 항체 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는, 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 상기 변형은, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 잔기의 삽입 및/또는 상기 서열내에서의 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구조물을 수득할 수 있으나, 단, 최종 구조물은 목적하는 특성, 예를 들면, 항원-결합 특성을 가져야 한다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이유발을 위한 해당 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 예시적인 변화들이 표 1에 "예시적 치환"이란 제목하에, 및 아미노산 측쇄 부류와 관련하여 하기에서 더 기술하는 바와 같이 제공되어 있다. 보존적 치환을 "바람직한 치환"이란 제목하에 표 1에 나타내었다. 아미노산 치환은 해당 항체 내에 도입될 수 있으며, 생성물들은 목적하는 활성, 예를 들면, 유지/개선된 항원 결합 활성, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
[표 1]
Figure 112018042457960-pct00001
아미노산은 통상적인 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Gln;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 상기 부류중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 포함할 것이다.
치환 변이체의 한 유형은 모 항체(예를 들면, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)은 모 항체에 비해 특정 생물학적 성질(예를 들면, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에서 변경(예를 들면, 개선)을 가질 것이고/이거나 모 항체의 특정 생물학적 성질을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는, 편리하게, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 파지-디스플레이 기반 친화도 증진 기술을 이용하여 생성될 수 있는 친화도 증진 항체이다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고 변이 항체는 파지 상에 디스플레이되고 특정 생물 활성(예, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
예를 들면, 항체 친화도를 개선하기 위해, 변이(예를 들면, 치환)가 HVR에 수행될 수 있다. 상기 변이는 HVR "핫스팟(hotspot)", 즉, 체세포 성숙 과정동안 높은 빈도로 돌연변이가 일어나는 코돈에 의해 암호화되는 잔기(예를 들면, 문헌 [Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196] 참조), 및/또는 SDR(a-CDR)에서 이루어질 수 있으며, 이때, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 검사된다. 2차 라이브러리를 제작하고 그로부터 재선별하는 것에 의한 친화도 증진은, 예를 들면, 문헌 [Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37]에 기술되어 있다. 친화도 증진의 일부 실시양태에서, 다양한 방법들 중 임의 방법(예를 들면, 실수유발(error-prone) PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드-특이적 돌연변이유발)에 의해 증진을 위해 선택된 가변 유전자 내에 변화가 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리가 구축된다. 상기 라이브러리는 이어서 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 스크리닝된다. 변화를 도입하는 또 다른 방법은, 여러 HVR 잔기(예를 들면, 한번에 4 내지 6개 잔기)가 무작위선정되는 HVR-특이적 접근방법을 포함한다. 항원 결합에 수반되는 HVR 잔기는, 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 변이가 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 치환, 삽입 또는 결실이 일어날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변이(예를 들면, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)가 HVR에서 이루어질 수 있다. 상기 변이는 HVR "핫스팟" 또는 SDR 밖에서 일어날 수 있다. 상기에 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변이되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085]에 기술된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 상기 방법에서는, 항원과의 항체의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 표적 잔기들(예를 들면, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기들)의 잔기 또는 기를 확인하고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환시킨다. 초기 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 추가의 치환이 도입될 수 있다. 양자택일로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위한 항원-항체 복합체의 결정 구조가 있다. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기들은 치환 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 그들이 목적하는 성질을 보유하는지를 측정하기 위해 변이체를 스크리닝할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개 잔기로부터 백개 이상 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체가 포함된다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체로는 효소(예를 들면, ADEPT) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합이 포함된다.
b) Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에서 제공된 항체의 Fc 영역내에 도입됨으로써 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예를 들면, 치환)을 포함하는, 인간 Fc 영역 서열(예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
감소된 작동인자 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 항체를 포함한다(미국 특허 제 6,737,056 호). 상기 Fc 돌연변이체로는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체가 포함된다(미국 특허 제 7,332,581 호).
FcR에 대해 개선되거나 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기술되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제 6,737,056 호; WO 2004/056312 호; 및 문헌 [Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604] 참조)
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 항체는 돌연변이 L234A 및 L235A를 가지거나 또는 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 IgG1이다. 또 다른 실시양태에서, 돌연변이 S228P 및 L235E 또는 S228P, L235E 또는/및 P329G(문헌 [Kabat et al , Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]의 EU 인덱스에 따른 번호)를 갖는 IgG4이다.
증가된 반감기, 및 태아에게 모체 IgG의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체(FcRn)[Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593; and Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434]에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US 2005/0014934 호에 기술되어 있다. 상기 항체들은, 그 중에 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 상기 Fc 변이체로는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에 치환, 예를 들면, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 변이체들이 포함된다(미국 특허 제 7,371,826 호).
Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여서는, 또한 문헌 [Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 332, 738-740 (1988)]; US 5,648,260 호; US 5,624,821 호; 및 WO 94/29351 호를 참조하시오.
c) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항체, 예를 들면, "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기들을 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 항체의 접근가능한 부위에 위치되고, 항체를 다른 잔기, 예를 들면, 약물 잔기 또는 링커-약물(linker-drug) 잔기에 접합시켜 본원에서 추가로 기술하는 바와 같은 면역접합체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기들 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카바트 번호); 중쇄의 A118(EU 번호); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 번호). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들면, 미국 특허 제 7,521,541 호에 기술된 바와 같이 생성될 수 있다.
d) 항체 유도체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 당해 분야에 공지되어 있고 용이하게 이용가능한 추가의 비단백성 잔기를 함유하도록 더 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 잔기는 수용성 중합체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 수용성 중합체의 비-제한 예로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예, 글리세롤), 폴리비닐 알콜 및 그의 혼합물이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수중 안정성으로 인해 제조시 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 항체에 결합되는 중합체들의 수는 달라질 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 결합되는 경우, 이들은 같거나 다른 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 개선될 항체의 특정한 성질 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건하에서 치료에 사용될 것인지 여부 등을 포함하나 이로 한정되지는 않는 고려사항들에 근거하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 방사선에 노출됨으로써 선택적으로 가열될 수 있는 항체와 비단백성 잔기의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백성 잔기는 탄소 나노튜브이다[Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605]. 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 정상 세포에 유해하지 않지만 항체-비단백성 잔기에 근접한 세포가 사멸되는 온도까지 비단백성 잔기를 가열시키는 파장을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
재조합 방법 및 조성물
항체는, 예를 들면, 미국 특허 제 4,816,567 호에 기술된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 항-PD1 항체를 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 상기 핵산은 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들면, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 암호화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들면, 발현 벡터)가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 상기 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터, 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 포함한다(예를 들면, 이들 벡터로 형질전환되었다). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포 또는 림프계 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 상기에서 제공된 바와 같은, 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고, 선택적으로 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 것을 포함하는, 항-PD1 항체의 제조 방법이 제공된다.
항-PD1 항체의 재조합 생성을 위해, 예를 들어, 전술한 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고, 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터내에 삽입시킨다. 상기 핵산은 통상적인 절차를 이용하여(예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리하고 서열화할 수 있다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포로는 본원에 기술된 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다. 예를 들면, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 작동인자 기능이 필요하지 않은 경우, 세균에서 생성될 수 있다. 세균에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들면, US 5,648,237 호, US 5,789,199 호 및 US 5,840,523 호를 참조하시오(또한 이. 콜라이에서 항체 단편의 발현을 기술하고 있는 문헌 [Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo B.K.C.(ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254] 참조). 발현 후에, 항체는 가용성 분획중 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며 더 정제될 수 있다.
원핵세포 이외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 야기하는 진균 및 효모 균주를 포함하여, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물도 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다(문헌 [Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; and Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215] 참조).
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루지페르다 ( Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 많은 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물도 또한 숙주로 사용될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 호(유전자이식 식물에서 항체를 생성하기 위한 플랜티바디즈(PLANTIBODIES)™ 기술을 설명하고 있음) 참조).
척추동물 세포도 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장하기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 태아 신장 세포주(예를 들면, 문헌 [Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74]에 기술된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들면, 문헌 [Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간세포(Hep G2); 마우스 유방종양 세포(MMT 060562); 예를 들면, 문헌 [Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68]에 기술된 바와 같은 TRI 세포; MRC5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 DHFR- CHO 세포[Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220]를 포함한 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예를 들면, Y0, NS0 및 Sp2/0가 포함된다. 항체 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들면, 문헌 [Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.(ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268]을 참조하시오.
분석법
본원에 제공된 항-PD1 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 분석법들에 의해 그의 물리/화학적 성질 및/또는 생물 활성을 확인하고, 그에 대해 스크리닝하거나 또는 특성화할 수 있다.
1. 결합 분석법 및 기타 분석법
한 양태에서, 본 발명의 항체는, 예를 들면, ELISA, 웨스턴 블롯(Western blot) 등과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 검사된다.
또 다른 양태에서, 경쟁 분석법을 이용하여 PD1에 결합하기 위해 PD1-0103(서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열 포함)과 (또는 양자택일로, 동일한 5 내지 6개 HVR을 갖는, 인간화 PD1-0103 변이체 항체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315과) 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태는, 인간 PD1에 대한 결합을 두고 서열번호 7의 VH 서열의 3개 HVR 모두 및 서열번호 8의 VL 서열의 3개 HVR 모두를 포함하는 항-PD1 항체와 경쟁하는 항체이다. 본 발명의 한 실시양태는, 인간 PD1에 대한 결합을 두고 서열번호 57의 VH 서열의 3개 HVR 모두 및 서열번호 58의 VL 서열의 3개 HVR 모두를 포함하는 항-PD1 항체와 경쟁하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 상기 경쟁 항체는 항-PD1 항체 PD1-0103에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예를 들면, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 지도화하기 위한 상세한 예시적 방법은 문헌 [Morris, G.E. (ed.), Epitope Mapping Protocols, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996)]에 제공되어 있다.
예시적인 경쟁 분석법에서는, 고정화된 PD1(-ECD)를, PD1에 결합하는 제 1 표지된 항체(예를 들면, 항-PD1 항체 PD1-0103 또는 인간화 항체 PD1-0103-0312) 및 PD1에 대한 결합을 두고 상기 제 1 항체와 경쟁하는 그 능력에 대해 검사되는 제 2의 비표지 항체를 포함하는 용액중에서 배양한다. 상기 제 2 항체는 하이브리도마 상등액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 PD1을, 제 1 표지된 항체는 포함하지만 제 2의 비표지 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 배양한다. PD1에 대한 제 1 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 배양한 후, 과량의 미결합 항체를 제거하고, 고정화된 PD1과 결합된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 PD1과 결합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 검사 샘플에서 실질적으로 감소된다면, 제 2 항체가 PD1에 대한 결합을 두고 제 1 항체와 경쟁함을 나타낸다(문헌 [Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)] 참조). 또 다른 예시적인 경쟁 분석법에 대해서는 실시예 2를 참조하시오(에피토프 지도화 ELISA/결합 경쟁 분석법).
2. 활성 분석법
한 양태에서, 생물 활성을 갖는 그의 항-PD1 항체를 확인하기 위한 분석법이 제공된다. 생물 활성은, 예를 들면, 상이한 면역 세포들, 특히 T-세포의 활성화 및/또는 증식을 증대시키는 능력을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이들은 면역조절 사이토카인(예, 인터페론-감마(IFN-감마) 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파))의 분비를 증대시킨다. 증대시키거나 증대시킬 수 있는 다른 면역조절 사이토카인은, 예를 들면, IL12, 그랜자임 B 등이다. 생물 활성은 또한 사이노몰구스 결합 교차반응성뿐 아니라, 상이한 세포 유형에 대한 결합을 포함할 수 있다. 생체내 및/또는 시험관내에서 상기 생물 활성을 갖는 항체들도 또한 제공된다
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 예를 들면, 하기 실시예들에서 기술된 바와 같이 상기 생물 활성에 대해 검사한다.
면역접합체(암 단독 또는 표적에 대해 변형)
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성 약제, 예를 들면, 화학치료제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편들) 또는 방사성 동위원소에 접합된, 본원에 기술된 항-PD1 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 실시양태에서, 면역접합체는, 항체가 다음을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 하나 이상의 약물들에 접합된 항체-약물 접합체(ADC)이다: 메이탄시노이드(US　5,208,020 호, US　5,416,064 호 및 EP 0 425 235 B1 호 참조); 오리스타틴, 예를 들면, 모노메틸 오리스타틴 약물 잔기 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(US　5,635,483 호, US　5,780,588 호 및 US 7,498,298 호); 돌라스타틴; 칼리케아마이신 또는 그의유도체(US　5,712,374, US　5,714,586, US　5,739,116, US　5,767,285, US　5,770,701, US　5,770,710, US　5,773,001 및 US　5,877,296 호; 문헌 [Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; and Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928] 참조); 안트라사이클린, 예를 들면, 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌 [Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343]; 및 미국 특허 제 6,630,579 호 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예를 들면, 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 다음을 포함하지만 그로 한정되지 않는, 효소적으로 활성인 독소 또는 그의 단편에 접합된, 본원에 기술된 바와 같은 항체를 포함한다: 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편인 디프테리아 A 쇄, 외독소 A 쇄(슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모덱신 A 쇄, 알파-사르신, 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국 자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 커신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합된 본원에 기술된 바와 같은 항체를 포함하여 방사성접합체를 형성한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생성에 이용가능하다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 방사성접합체가 검출에 사용되는 경우, 상기 접합체는 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들면, TC99m or I123, 또는 핵 자기 공명(NMR) 영상(자기 공명 영상, MRI로도 알려져 있음)을 위한 스핀 표지, 예를 들면, 요오드-123, 또한 요오드-131, 인듐-111, 플루오르-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체와 세포독성 약제의 접합체는 다양한 이작용성 단백질 커플링제, 예를 들면, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이작용성 유도체(예를 들면, 다이메틸 아디피미데이트 HCI), 활성 에스터(예를 들면, 다이숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들면, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들면, 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들면, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이이소시아네이트(예를 들면, 톨루엔 2,6-다이이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물(예를 들면, 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(MX-DPTA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다(WO 94/11026 호 참조). 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(문헌 [(Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131]; 미국 특허 제 5,208,020 호)를 사용할 수 있다.
면역접합체 또는 ADC는 본원에서 명백하게, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 (예를 들면, 피어스 바이오테크놀로지, 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc.), 미국 일리노이주 록포드 소재)에서) 상업적으로 시판하는 SVSB(숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 포함하지만 이로 한정되지는 않는 가교결합제 시약들을 사용하여 제조된 접합체들을 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 항-PD1 항체는 생물 샘플에서 PD1의 존재를 검출하기에 유용하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들면, 면역 세포 또는 T 세포 침윤물을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-PD1 항체가 제공된다. 또 다른 양태에서, 생물 샘플중 PD1의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 생물 샘플을 PD1에 대한 항-PD1 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 본원에 기술된 바와 같은 항-PD1 항체와 접촉시키고, 항-PD1 항체와 PD1 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들면, PD1이 환자 선별을 위한 바이오마커인 경우, 항-PD1 항체를 사용한 치료에 적합한 대상을 선별하기 위해 항-PD1 항체를 사용한다.
특정 실시양태에서, 표지된 항-PD1 항체가 제공된다. 표지로는 직접 검출되는 표지 또는 잔기(예를 들면, 형광성 표지, 발색 표지, 전자-고밀도 표지, 화학발광 표지 및 방사성 표지)뿐 아니라, 예를 들면, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 잔기, 예를 들어, 효소 또는 리간드가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 예시적인 표지로는 방사성동위원소, 32P, 14C, 125I. 3H 및 131I, 형광단, 예를 들면, 희토류 킬레이트화물 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리퍼라제, 예를 들면, 반딧불이 루시퍼라제 및 세균성 루시퍼라제(미국 특허 제 4,737,456 호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들면, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 같은 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소와 커플링된 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들면, 우리카제 및 잔틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
약학 제형
본원에 기술된 바와 같은 항-PD1 항체의 약학 제형은 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체를 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, A.(ed.) (1980)] 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로, 사용되는 투여량 및 농도에서 수용체에게 무독성이며, 다음을 포함하나 이로 한정되지는 않는다: 완충제, 예를 들면, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스콜브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 방부제(예를 들면, 옥타데실 다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 당, 예를 들면, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-생성 상대-이온, 예를 들면, 나트륨; 금속 착체(예를 들면, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 담체로는 또한 간질성(intersitial) 약물 분산제, 예를 들면, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예를 들어, rhuPH20(하일레넥스(HYLENEX)®, 박스터 인터내셔날 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))이 포함된다. rhuPH20을 포함하여, 특정한 예시적 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 제 2005/0260186 호 및 제 2006/0104968 호에 기술되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 콘드로이티나제와 같은 하나 이상의 추가의 글리코스아미노글리카나제와 혼합된다.
예시적인 동결건조 항체 제형이 미국 특허 제 6,267,958 호에 기술되어 있다. 수성 항체 제형으로는 미국 특허 제 6,171,586 호 및 WO 2006/044908 호에 기재된 것들이 포함되며, 상기 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본 발명의 제형은 또한 치료되는 특정한 적응증에 필요한 대로 하나보다 많은 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 활성 성분을 함유할 수 있다. 예를 들면, 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 활성 성분들은 의도한 목적에 효과적인 양으로 조합에 적절히 존재한다.
활성 성분은, 예를 들면, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐에, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리(메틸 메타크릴레이트) 미세캡슐 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 미세구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐)에, 또는 마크로유화액에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들면, 필름 또는 미세캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은, 예를 들면, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 항-PD1 항체(또는 항원 결합 단백질)는 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 양태에서, 약제로 사용하기 위한, 항-PD1 항체가 제공된다. 다른 양태에서, 암을 치료하는데 사용하기 위한 항-PD1 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-PD1 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 개체에게 효과량의 항-PD1 항체를 투여하는 것을 포함하는 암을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 항-PD1 항체를 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은, 면역자극제로 사용되고/되거나 인터페론-감마(IFN-감마) 분비를 자극하기 위한 항-PD1 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 개체에게 면역자극 및/또는 인터페론-감마(IFN-감마) 분비를 자극하기 위한 효과량의 항-PD1 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역자극 및/또는 인터페론-감마(IFN-감마) 분비를 자극하는 방법에서 사용하기 위한 항-PD1 항체를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은, 면역자극제로 사용하거나 인터페론-감마(IFN-감마) 분비를 자극하기 위한 항-PD1 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 개체에게 면역자극 또는 인터페론-감마(IFN-감마) 분비의 자극을 위한 항-PD1 항체 효과량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역자극 또는 인터페론-감마(IFN-감마) 분비를 자극하는 방법에서 사용하기 위한 항-PD1 항체를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은, 면역자극제로 사용하거나 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 분비를 자극하기 위한 항-PD1 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, 개체에게 면역자극 또는 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 분비의 자극을 위한 항-PD1 항체 효과량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역자극 또는 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 분비를 자극하는 방법에서 사용하기 위한 항-PD1 항체를 제공한다.
임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 약제의 생산 또는 제조에 있어서, 항-PD1 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 약제는 암 치료를 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 약제는, 암을 갖는 개체에게 효과량의 약제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 약제는 암 세포의 세포 매개 용해를 유도하기 위한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 약제는, 암 세포에서 세포자살을 유도하거나 암 세포 증식을 억제하기에 효과적인 양의 약제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 앓고 있는 개체에서 암 세포의 세포 매개 용해를 유도하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 암을 갖는 개체에게 효과량의 항-PD1을 투여하는 것을 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 암을 앓고 있는 개체에서 암 세포의 세포 매개 용해를 유도하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은, 암을 앓고 있는 개체에서 암 세포의 세포 매개 용해를 유도하기에 효과적인 양의 항-PD1을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 예를 들면, 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 항-PD1 항체를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 한 실시양태에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 항-PD1 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명의 항체(및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내, 및 경우에 따라, 국소 치료를 위해 병변내 투여를 포함하여, 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 투약은 부분적으로 투여가 단기인지 또는 만성인지 여부에 따라, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들면, 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의할 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스(bolus) 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체는 올바른 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화되고 투약되고 투여된다. 이와 관련하여 고려할 요인들로는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개개 환자의 임상적 상태, 질환의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의사에게 공지된 기타 요인들이 포함된다. 항체는 문제의 질환을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 약제와 함께 제형화될 필요는 없지만 선택적으로 함께 제형화된다. 상기 다른 약제의 효과량은 제형에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료 유형, 및 상기 논의된 다른 요인들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 본원에 기술된 바와 동일한 투여량으로 본원에 기술된 바와 같은 투여 경로하에, 또는 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%의 양으로, 또는 실험적/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가 치료제와 함께 사용될 때)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 아니면 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료, 항체에 대한 환자의 임상 병력 및 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 항체는 환자에게 한번에 또는 일련의 치료과정 동안 적절히 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.5 내지 10 mg/kg)의 항체가, 예를 들면, 한번 이상의 별도의 투여에 의하든지 또는 연속 주입에 의하든지, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 전형적인 일일 투여량은, 상기 언급한 요인들에 따라서, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상동안 반복 투여하기 위해, 병태에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 항체의 한 예시적인 투여량은 약 0.05 내지 약 10 mg/kg의 범위이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 상기 용량은 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주마다(예를 들면, 환자가 약 2 내지 약 20개, 또는 예를 들면, 약 6개 용량의 항체를 투여받도록) 투여될 수 있다. 초기의 보다 높은 투입 용량에 이어, 하나 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 예시적인 투약 방법은 약 4 mg/kg의 초기 투입 용량에 이어, 약 2 mg/kg의 매주 유지 용량의 항체를 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투약 방법들도 유용할 수 있다. 상기 치료의 진행은 통상적인 기술 및 분석법들에 의해 용이하게 모니터된다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법은 항-PD1 항체 대신에 또는 그에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기, 및 용기 상에 또는 용기에 부착된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 용기는 조성물을 단독으로 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 함께 포함하며, 멸균 진입구를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물중 하나 이상의 활성 약제는 본 발명의 항체이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 병태를 치료하기 위해 사용되는 것을 지시한다. 또한, 제품은 (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성 약제 또는 그렇지 않으면 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제 2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서의 제품은 조성물이 특정 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 양자택일적으로 또는 추가로, 품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면, 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거(Ringer)액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2(또는 제 3)의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자의 관점에서 바람직한 다른 물질들을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제품은 항-PD1 항체 대신에 또는 그에 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
아미노산 서열의 설명
서열번호 1 중쇄 HVR-H1, PD1-0103
서열번호 2 중쇄 HVR-H2, PD1-0103
서열번호 3 중쇄 HVR-H3, PD1-0103
서열번호 4 경쇄 HVR-L1, PD1-0103
서열번호 5 경쇄 HVR-L2, PD1-0103
서열번호 6 경쇄 HVR-L3, PD1-0103
서열번호 7 중쇄 가변 도메인 VH, PD1-0103
서열번호 8 경쇄 가변 도메인 VL, PD1-0103
서열번호 9 중쇄 HVR-H1, PD1-0098
서열번호 10 중쇄 HVR-H2, PD1-0098
서열번호 11 중쇄 HVR-H3, PD1-0098
서열번호 12 경쇄 HVR-L1, PD1-0098
서열번호 13 경쇄 HVR-L2, PD1-0098
서열번호 14 경쇄 HVR-L3, PD1-0098
서열번호 15 중쇄 가변 도메인 VH, PD1-0098
서열번호 16 경쇄 가변 도메인 VL, PD1-0098
서열번호 17 중쇄 HVR-H1, PD1-0050
서열번호 18 중쇄 HVR-H2, PD1-0050
서열번호 19 중쇄 HVR-H3, PD1-0050
서열번호 20 경쇄 HVR-L1, PD1-0050
서열번호 21 경쇄 HVR-L2, PD1-0050
서열번호 22 경쇄 HVR-L3, PD1-0050
서열번호 23 중쇄 가변 도메인 VH, PD1-0050
서열번호 24 경쇄 가변 도메인 VL, PD1-0050
서열번호 25 중쇄 HVR-H1, PD1-0069
서열번호 26 중쇄 HVR-H2, PD1-0069
서열번호 27 중쇄 HVR-H3, PD1-0069
서열번호 28 경쇄 HVR-L1, PD1-0069
서열번호 29 경쇄 HVR-L2, PD1-0069
서열번호 30 경쇄 HVR-L3, PD1-0069
서열번호 31 중쇄 가변 도메인 VH, PD1-0069
서열번호 32 경쇄 가변 도메인 VL, PD1-0069
서열번호 33 중쇄 HVR-H1, PD1-0073
서열번호 34 중쇄 HVR-H2, PD1-0073
서열번호 35 중쇄 HVR-H3, PD1-0073
서열번호 36 경쇄 HVR-L1, PD1-0073
서열번호 37 경쇄 HVR-L2, PD1-0073
서열번호 38 경쇄 HVR-L3, PD1-0073
서열번호 39 중쇄 가변 도메인 VH, PD1-0073
서열번호 40 경쇄 가변 도메인 VL, PD1-0073
서열번호 41 중쇄 HVR-H1, PD1-0078
서열번호 42 중쇄 HVR-H2, PD1-0078
서열번호 43 중쇄 HVR-H3, PD1-0078
서열번호 44 경쇄 HVR-L1, PD1-0078
서열번호 45 경쇄 HVR-L2, PD1-0078
서열번호 46 경쇄 HVR-L3, PD1-0078
서열번호 47 중쇄 가변 도메인 VH, PD1-0078
서열번호 48 경쇄 가변 도메인 VL, PD1-0078
서열번호 49 중쇄 HVR-H1, PD1-0102
서열번호 50 중쇄 HVR-H2, PD1-0102
서열번호 51 중쇄 HVR-H3, PD1-0102
서열번호 52 경쇄 HVR-L1, PD1-0102
서열번호 53 경쇄 HVR-L2, PD1-0102
서열번호 54 경쇄 HVR-L3, PD1-0102
서열번호 55 중쇄 가변 도메인 VH, PD1-0102
서열번호 56 경쇄 가변 도메인 VL, PD1-0102
서열번호 57 인간화 변이체 -PD1-0103_01의 중쇄 가변 도메인 VH
서열번호 58 인간화 변이체 -PD1-0103_01의 경쇄 가변 도메인 VL
서열번호 59 인간화 변이체 -PD1-0103_02의 경쇄 가변 도메인 VL
서열번호 60 인간화 변이체 -PD1-0103_03의 경쇄 가변 도메인 VL
서열번호 61 인간화 변이체 -PD1-0103_04의 경쇄 가변 도메인 VL
서열번호 62 인간 카파 경쇄 불변 영역
서열번호 63 인간 람다 경쇄 불변 영역
서열번호 64 IgG1으로부터 유래된 인간 중쇄 불변 영역
서열번호 65 돌연변이 L234A 및 L235A를 갖는 IgG1으로부터 유래된 인간 중쇄 불변 영역
서열번호 66 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 IgG1으로부터 유래된 인간 중쇄 불변 영역
서열번호 67 IgG4로부터 유래된 인간 중쇄 불변 영역
서열번호 68 예시적인 인간 PD1 서열(신호 서열 없음)
서열번호 69 인간 PD1 세포외 도메인(ECD)
서열번호 70 예시적인 인간 PD1 서열(신호 서열 포함)
서열번호 71 PD1-0103 및 PD1-0103 인간화 변이체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 및 PD1-0103-0315의 최소 HVR1
서열번호 72 PD1-0103 및 PD1-0103 인간화 변이체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 및 PD1-0103-0315의 최소 HVR2
서열번호 73 PD1-0103 및 PD1-0103 인간화 변이체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 및 PD1-0103-0315의 최소 HVR3
서열번호 74 PD1-0103 및 PD1-0103 인간화 변이체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 및 PD1-0103-0315의 최소 LVR1
서열번호 75 PD1-0103 및 PD1-0103 인간화 변이체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 및 PD1-0103-0315의 최소 LVR2
서열번호 76 PD1-0103 및 PD1-0103 인간화 변이체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 및 PD1-0103-0315의 최소 LVR3
서열번호 77 카바트 번호에 따른 71, 72, 73의 위치에서 아미노산 서열 RDN을 포함하는 FR-H3의 단편
하기에는 항-PD1 항체 PD1-0016 (및 그의 인간화 변이체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 및 PD1-0103-0315), PD1-0098, PD1-0050, PD1-0069, PD1-0073, PD1-0078 및 PD1-0102의 표시된 HVR(굵고 밑줄친 활자의 HVR)을 포함하는 VH 및 VL 도메인들의 아미노산 서열들이 열거되어 있다:
항- PD1 PD1 -0103:
VH PD1-0103:
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAAS GFSFSSY TMSWVRQTPEKRLDWVATISG GGR DIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLMSEDTALYYCVLL TGRVYFALD SWGQGTSVTVSS
VL PD1-0103:
KIVLTQSPASLPVSLGQRATISCRA SESVDTSDNSF IHWYQQRPGQSPKLLIY RSS TLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDVATYYCQQ NYDVPW TFGGGTKLEIK
인간화 항- PD1 PD1 -0103 변이체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 및 PD1-0103-0315:
VH PD1-0103-0312= VH PD1-0103-0313= VH PD1-0103-0314= VH PD1-0103-0315:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFSFSSY TMSWVRQAPGKGLEWVATISG GGR DIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLL TGRVYFALD SWGQGTLVTVSS
VL PD1-0103-0312:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKA SESVDTSDNSF IHWYQQKPGQSPKLLIY RSS TLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ NYDVPW TFGQGTKVEIK
VL PD1-0103-0313:
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRA SESVDTSDNSF IHWYQQRPGQSPRLLIY RSS TLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQ NYDVPW TFGQGTKVEIK
VL PD1-0103-0314:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRA SESVDTSDNSF IHWYQQKPGQSPRLLIY RSS TLESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQ NYDVPW TFGQGTKVEIK
VL PD1-0103-0315:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRA SESVDTSDNSF IHWYQQKPGQSPRLLIY RSS TLESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQ NYDVPW TFGQGTKVEIK
항- PD1 PD1 -0098:
VH PD1-0098:
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVT GYSITSDY AWNWIRQFPGDKLEWLGYIT YSG FTNYNPSLKSRISISRDTSKNQFFLQLNSVATEDTATYYCARW HGSAPWYFD YWGRGTTLTVSS
VL PD1-0098:
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRS SQNIVHSDGNTY LEWYLQKPGQSPNLLIY KVS RRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQ GSHFPL TFGAGTKLELK
VH : 0050
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVT GYSITSDY AWNWIRQFPGNKLEWMGYIT YTG RTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARE MDYYGSTLD YWGQGTTLTVSS
VL : 0050
KIVLTQSPASLAVSLRQRATISCRA SESVDRYGNSF IHWYQQKPGQPPKVLIY RAS NLESGFPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQ NNEDPY TFGSGTKLEIK
VH : 0069
QVQLQQSGPELVRPGVSVKISCKGS GYTFTDY AMHWVKQSHARTLEWIGVIST YSG DTNYNQKFKDKATMTVDKSSSTAYLELARMTSEDSAIYYCARL GITTGFA YWGQGTLVTVSA
VL : 0069
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRA SKGVSTSSYSF MHWYQQKPRQPPKLLIK YAS YLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCHH SREFPW TFGGGTKLEIK
VH : 0073
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAAS GFTFSNY GMSWIRQTPEKGLEWVATISG GGR DTYYPDSVKGRFTISRDNVKNNLYLQMSSLRSEDTAFYYCASY YYGID YWGQGTSVTVSS
VL : 0073
DIVMTQPHKFMSTSVGDRVRITCKA SQDVTTA VAWYQQKPGQSPKLLIY WAS TRHTGVPDRFTGSGSGTEFTLTISSVQAEDLALYYCQQ HYSIPW TFGGGTKLEIK
VH : 0078
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKAS GYTFTST WMHWVKQRPGQGLEWIGAIDP SDS YTTYNQKFKGKATLTVDTSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRS PFD YWGQGTTLTVSS
VL : 0078
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKA SQDVSTA VAWYQQKPGQSPKLLIY SAS YRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFAISSVQAEDLAVYYCQQ HYSHPF TFGSGTKLEIK
VH : 0102
DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVT GYSITSGY SWHWIRQFPGNKLEWMGFIH SSG DTNYNPSLKSRISFTRDTSKNQFFLQLSSLTDEDTATYYCATY RNWYFD VWGAGTTVTVSS
VL : 0102
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMRCKS SQSLLNSGTQKNY LTWYQQKPGQPPKLLIY WAS TRESGVPNRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLSVYYCQS DYTFPL TFGGGTKLELK
하기에서 본 발명의 특정 실시양태들이 열거된다:
1. Asn58에서 글리코실화되는 서열번호 70의 글리코실화 인간 PD1의 Asn58에서 (코어) 당쇄에 결합하는, 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
2. 인간 PD1의 위치 60 내지 64, 68, 78 내지 84, 126 내지 134의 1개 이상의 아미노산에 추가로 결합하는, 1 항에 따른 항체.
3. Asn58에서 그의 중쇄와 함께 당쇄에 결합하는, 1 항 또는 2 항 중 어느 한 항에 따른 항체.
4. 인간 PD1의 위치 61, 62, 64, 83, 126, 128, 132, 134 중 1개 이상의 아미노산에 결합하는, 2 항 또는 3 항 중 어느 한 항에 따른 항체.
5. 인간 PD1의 위치 61, 62, 64, 83, 126, 128, 132, 134의 아미노산에 결합하는, 2 항 또는 3 항 중 어느 한 항에 따른 항체.
6. 인간 PD1의 위치 60, 61, 62, 63, 64, 68, 78, 82, 83, 84, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 134의 아미노산에 결합하는, 2 항 또는 3 항 중 어느 한 항에 따른 항체.
7. Asn58에서 글리코실화되는 서열번호 70의 글리코실화 인간 PD1의 Asn58의 (코어) 당쇄 내의 제 1 및 제 2 G1Nac, FUC, BMA 및 MAN에 결합하는, 인간 PD1에 결합하는, 1 항 내지 6 항 중 어느 한 항에 따른 항체.
8. Asn58에서 글리코실화되는 인간 PD1에 대한 결합과 비교하여, Asn58에서 글리코실화되지 않는 서열번호 70의 인간 PD1에 대해 감소된 결합을 나타내는, 1 항 내지 7 항 중 어느 한 항에 따른 항체.
9. 다음을 포함하는, 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체:
(a) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; (f) 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및 (g) 카바트 번호에 따른 71, 72 및 73의 위치에서 (RDN의) 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3.
10. A) i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
B) i) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 58의 VL 서열을 포함하거나,
ii) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 59의 VL 서열을 포함하거나,
iii) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 60의 VL 서열을 포함하거나,
iv) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 61의 VL 서열을 포함하는,
9 항에 따른, 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
하기에서 본 발명의 특정 실시양태들이 열거된다:
1. 다음을 포함하는, 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체:
A) (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
B) (a) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
C) (a) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
D) (a) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
E) (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
F) (a) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는
G) (a) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
2. 다음을 포함하는, 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체:
A) (a) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
B) (a) (i) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
C) (a) (i) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
D) (a) (i) 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
E) (a) (i) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
F) (a) (i) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인; 또는
G) (a) (i) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인.
3. A) i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
B) i) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 58의 VL 서열을 포함하거나,
ii) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 59의 VL 서열을 포함하거나,
iii) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 60의 VL 서열을 포함하거나,
iv) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 61의 VL 서열을 포함하거나; 또는
C) i) 서열번호 15의 VH 서열 및 서열번호 16의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
D) i) 서열번호 23의 VH 서열 및 서열번호 24의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
E) i) 서열번호 31의 VH 서열 및 서열번호 32의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
F) i) 서열번호 39의 VH 서열 및 서열번호 40의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
G) i) 서열번호 47의 VH 서열 및 서열번호 48의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는
H) i) 서열번호 55의 VH 서열 및 서열번호 56의 VL 서열, 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체를 포함하는,
인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
4. i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열; 또는
ii) i)의 항체의 VH 및 VL의 인간화 변이체
를 포함하는, 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
5. 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 58의 VL 서열을 포함하는, 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
6. 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 59의 VL 서열을 포함하는, 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
7. 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 60의 VL 서열을 포함하는, 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
8. 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 61의 VL 서열을 포함하는, 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
9. 독립적으로, 하기 성질들 중 하나 이상을 특징으로 하는, 전술한 실시양태들 중 어느 하나에 따른 항-PD1 항체:
항-PD-1 항체는
i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항-PD1 항체와 PD-1에 대한 결합을 위해 경쟁하고/하거나;
ii) 인간 및 사이노몰구스 PD-1에 결합하고/하거나;
iii) 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 인터페론-감마(IFN-감마) 분비를 85% 이상 증대시키고/시키거나;
iv) 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 분비를 200% 이상 증대시킨다.
10. 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 분비를 200% 이상(한 바람직한 실시양태에서는 250% 이상) 증대시키는, PD1에 결합하는 단리된 항체.
11. 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 인터페론-감마(IFN-감마) 분비를 85% 이상(한 바람직한 실시양태에서는 90% 이상, 한 바람직한 실시양태에서는 95% 이상) 증대시키는, PD1에 결합하는 단리된 항체.
12. i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항-PD1 항체와 PD-1에 대한 결합을 위해 경쟁하고/하거나;
ii) 인간 및 사이노몰구스 PD-1에 결합하고;
iii) 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 인터페론-감마(IFN-감마) 분비를 85% 이상 증대시키고;
iv) 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 분비를 200% 이상 증대시키는,
인간 PD-1에 결합하는 단리된 항체.
13. 단일클론 항체인, 전술한 실시양태들 중 어느 하나에 따른 항체.
14. 인간, 인간화 또는 키메라 항체인, 전술한 실시양태들 중 어느 하나에 따른 항체.
15. PD1에 결합하는 항체 단편인, 전술한 실시양태들 중 어느 하나에 따른 항체.
16. 전장 IgG1 항체인, 전술한 실시양태들 중 어느 하나에 따른 항체.
17. 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카바트의 EU 인덱스에 따른 번호)를 갖는 전장 IgG1 항체인, 전술한 실시양태들 중 어느 하나에 따른 항체.
18. 전술한 실시양태들 중 어느 하나에 따른 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
19. 실시양태 19의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
20. 항체가 생성되도록 실시양태 20의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체의 제조 방법.
21. 숙주 세포로부터 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는, 실시양태 21의 방법.
22. 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 따른 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 제형.
23. 약제로 사용하기 위한, 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 따른 항체.
24. 암을 치료하는데 사용하기 위한, 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 따른 항체.
25. 약제의 제조에 있어서, 실시양태 1 내지 18 중 어느 하나에 따른 항체의 용도.
26. 약제가 암 치료를 위한 것인, 실시양태 26의 용도.
27. 실시양태 1의 항체 효과량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 개체를 치료하는 방법.
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 예들이다. 상기에 제공된 일반적인 설명을 고려하여 다양한 다른 실시양태들이 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
전술한 본 발명을 명확한 이해를 위해 예증 및 예시로써 다소 상세하게 기술하였지만, 상기 설명 및 예들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해해서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 명백하게 전체적으로 참고로 도입된다.
실시예 1:
항-PD-1 항체의 생성
마우스의 면역화
100 ㎍ 벡터 DNA(플라스미드 15300_hPD1-fl)를 피내 적용한 후, 전기천공(1000 V/cm, 기간 0.1 ms, 간격 0.125 s의 2회 사각펄스; 이어서 287.5 V/cm, 기간 10 ms, 간격 0.125 s의 4회 사각펄스)에 의해 전장 인간 PD-1을 암호화하는 플라스미드 발현 벡터를 사용하여, NMRI 마우스를 유전적으로 면역화시켰다. 마우스들은 제 0, 14, 28, 42, 56, 70 및 84 일에 6회 연속 면역접종을 받았다. 혈액을 제 36, 78 및 92 일에 채취하고 혈청을 준비하고, 이것을 ELISA(하기 참조)에 의한 역가 측정에 사용하였다. 최고 역가를 갖는 동물들을 제 96 일에 50 ㎍의 재조합 인간 PD1 인간 Fc 키메라의 정맥내 주사에 의한 추가접종을 위해 선별하고, 추가접종 3 일 후에 비장세포를 골수종 세포주에 융합시켜, 하이브리도마 기술에 의해 단일클론 항체를 단리하였다. 혈청 역가의 측정(ELISA).
인간 재조합 PD1 인간 Fc 키메라를 PBS 중 0.3 ㎍/ml, 100 ㎕/웰로 96-웰 ㅁ눈크 맥시소프(NUNC Maxisorp) 플레이트 상에 고정화시킨 후, PBS, 200 ㎕/웰 중 2% 크로테인 C(Crotein C)로 플레이트를 차단하고; PBS, 100 ㎕/웰 중 0.5% 크로테인 C 중에서 항혈청의 연속 희석물을 2중으로 적용하고; HRP-접합된 염소 항-마우스 항체(잭슨 임뮤노리서치(Jackson Immunoresearch)/디아노바(Dianova) 115-036-071; 1/16 000)로 검출하였다. 모든 단계에서, 플레이트는 37 ℃에서 1 시간동안 배양하였다. 모든 단계들 사이에, 플레이트를 PBS중 0.05% 트윈 20으로 3회 세척하였다. BM 블루 POD 기질 용액(로슈(Roche)) 100 ㎕/웰을 첨가하여 신호를 발생시키고; 1 M HCl 100 ㎕/웰을 첨가하여 중단시켰다. 흡광도는 기준으로서 690 nm에 대해 450　nm에서 판독하였다. 역가는 반-최대 신호를 야기하는 항혈청의 희석률로 정의되었다.
실시예 2:
항-PD1 항체의 특성화
인간 PD1에 대한 항-PD1 항체의 결합
hu PD1에 대한 ELISA
눈크 맥시소프 스트렙타비딘 코팅된 플레이트(마이크로코트(MicroCoat) #11974998001)를 25 ㎕/웰 비오틴일화 PD1-ECD-AviHis로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕ 항-PD1 샘플 또는 기준 항체(인간 항 PD1; 로슈/마우스 항-PD1; 바이오레전드(Biolegend); cat.:329912)를 첨가하고 RT에서 1 시간동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕/웰 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, JIR109-036-088)/양-항-마우스-POD(GE 헬쓰케어; NA9310)를 1:2000/1:1000 희석하에 첨가하고, RT에서 진탕기상에서 1 시간동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕/웰 TMB 기질(로슈 카탈로그 No. 11835033001)을 첨가하고 2 내지 3의 OD까지 배양하였다. 측정은 370/492 nm에서 수행하였다.
ELISA 결과는 하기 표 2 및 3에 요약하여 EC50-값[ng/ml]으로서 열거되어 있다.
PD1에 대한 세포 ELISA
부착성 CHO-K1 세포주를 전장 인간 PD1을 암호화하는 플라스미드 15311_hPD1-fl_pUC_Neo로 안정하게 형질감염시키고, G418(플라스미드 상의 네오마이신 내성 마커)를 사용하여 선별하고 384-웰 평저 플레이트에 0.01x10E6 세포/웰의 농도로 접종하고 밤새 성장시켰다.
다음날, 25 ㎕/웰의 PD1 샘플 또는 인간 항-PD1(로슈)/마우스 항-PD1(바이오레전드; cat.:329912) 기준 항체를 첨가하고 4 ℃에서(내재화를 방지하기 위해) 2 시간동안 배양하였다. 조심스럽게 세척(1x90 ㎕/웰 PBST)한 후, 1xPBS-완충액에 희석된 30 ㎕/웰 0.05% 글루타르알데하이드(시그마(Sigma), Cat.No: G5882, 25%)를 첨가하여 세포를 고정시키고 RT에서 10 분동안 배양하였다. 세척(3x90 ㎕/웰 PBST)한 후, 검출을 위해 25 ㎕/웰의 2차 항체: 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, JIR109-036-088)/양-항-마우스-POD(GE NA9310)를 첨가한 다음 RT에서 진탕기상에서 1 시간동안 배양하였다. 세척(3x90 ㎕/웰 PBST) 후에, 25 ㎕/웰 TMB 기질 용액(로슈 11835033001)을 첨가하고 1.0 내지 2.0의 OD까지 배양하였다. 플레이트를 370/492 nm에서 측정하였다.
세포 ELISA 결과는 하기 표 3에 요약하여 "EC50 CHO-PD1"-값[ng/ml]으로 열거되어 있다.
cyno PD1에 대한 ELISA
눈크 맥시소프 스트렙타비딘 코팅된 플레이트(마이크로코트 #11974998001)를 25 ㎕/웰 비오틴일화 cyno PD1-ECD-비오틴으로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕ 항-PD1 샘플 또는 기준 항체(인간 항 PD1; 로슈)를 첨가하고 RT에서 진탕기상에서 1 시간동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕/웰 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, JIR109-036-088)를 1:1000 희석하에 첨가하고, RT에서 진탕기상에서 1 시간동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕/웰 TMB 기질(로슈, 11835033001)을 첨가하고 2 내지 3의 OD까지 배양하였다. 측정은 370/492 nm에서 수행하였다.
ELISA 결과는 하기 표 2 및 3에 요약하여 EC50-값[ng/ml]으로서 열거되어 있다.
PD 리간드 1 치환 분석
눈크 맥시소프 스트렙타비딘 코팅된 플레이트(마이크로코트 #11974998001)를 25 ㎕/웰 비오틴일화 PD1-ECD-AviHis로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕ 항-PD1 샘플 또는 기준 항체(마우스 항-PD1; 바이오레전드; cat.:329912)를 첨가하고 RT에서 진탕기상에서 1 시간동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕/웰 PD-L1(재조합 인간 B7-H1/PD-L1 Fc 키메라; 156-B7, R&D)을 첨가하고 RT에서 진탕기상에서 1 시간동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕/웰 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, JIR109-036-088)를 1:1000 희석하에 첨가하고, RT에서 진탕기상에서 1 시간동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕/웰 TMB 기질(로슈, 11835033001)을 첨가하고 2 내지 3의 OD까지 배양하였다. 측정은 370/492 nm에서 수행하였다.
ELISA 결과는 하기 표 2에 요약하여 IC50-값[ng/ml]으로서 열거되어 있다.
PD 리간드 2 치환 분석
눈크 맥시소프 스트렙타비딘 코팅된 플레이트(마이크로코트 #11974998001)를 25 ㎕/웰 비오틴일화 PD1-ECD-AviHis로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕ 항-PD1 샘플 또는 기준 항체(마우스 항 huPD1; 로슈)를 첨가하고 RT에서 진탕기상에서 1 시간동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕/웰 PD-L2(재조합 인간 B7-DC/PD-L2 Fc 키메라; 1224-PL-100, R&D)를 첨가하고 RT에서 진탕기상에서 1 시간동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕/웰 염소-항-인간 H+L-POD(JIR, JIR109-036-088)를 1:2000 희석하에 첨가하고, RT에서 진탕기상에서 1 시간동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕/웰 TMB 기질(로슈, 11835033001)을 첨가하고 2 내지 3의 OD까지 배양하였다. 측정은 370/492 nm에서 수행하였다.
ELISA 결과는 하기 표 2에 요약하여 IC50-값[ng/ml]으로서 열거되어 있다.
에피토프 지도화 ELISA/결합 경쟁 분석
눈크 맥시소프 플레이트(Nunc #464718)를 25 ㎕/웰 포획 항체(염소 항 마우스 IgG; JIR; 115-006-071)로 코팅하고 RT에서 진탕기상에서 1 시간동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 플레이트를 RT에서 진탕기상에서 2% BSA 함유 PBS 완충액으로 1 시간동안 차단하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕ 마우스 항-PD1 샘플을 첨가하고 RT에서 진탕기상에서 1 시간동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 포획 항체를 RT에서 진탕기상에서 30 ㎕/웰 마우스 IgG(JIR; 015-000-003)로 1 시간동안 차단하였다. 동시에 비오틴일화 PD1-ECD-AviHis를 RT에서 진탕기상에서 제 2 샘플 항체와 함께 1 시간동안 예비배양하였다. 분석 플레이트를 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰)한 후에, PD1 항체 혼합물을 분석 플레이트로 옮기고 RT에서 진탕기상에서 1 시간동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕/웰 스트렙타비딘 POD(로슈, #11089153001)를 1:4000 희석하에 첨가하고 RT에서 진탕기상에서 1 시간동안 배양하였다. 세척(PBST-완충액으로 3x90 ㎕/웰) 후에, 25 ㎕/웰 TMB 기질(로슈, #11835033001)을 첨가하고 1.5 내지 2.5의 OD까지 배양하였다. 측정은 370/492 nm에서 수행하였다. 에피토프 군들은 기준 항체에 대한 계층적 군집화(hierarchical clustering)에 의해 정의하였다.
[표 2] 예시적 항체들의 결합, PD-L1 억제 및 에피토프 영역 군들(ELISA)
Figure 112018042457960-pct00002
[표 3] 마우스 모 항체 PD1-0103으로부터 유도된 인간화 PD1 항체들의 생화학적 및 세포-결합(ELISA)
Figure 112018042457960-pct00003
인간화 항-PD-1 항체들의 비아코어 특성화
표면 플라즈몬 공명(SPR) 기반 분석을 이용하여 여러 뮤린 PD1 결합자뿐 아니라 상업적인 인간 PD1 결합 기준항체 사이의 결합의 동적 파라미터를 측정하였다. 그러므로, 항-인간 IgG를 (비아코어) CM5 센서 칩의 표면에 아민 커플링시킴으로써 고정화시켰다. 이어서, 샘플을 포획하고, hu PD1-ECD를 상기 샘플들에 결합시켰다. 센서 칩 표면은 매 분석 주기 후에 재생시켰다. 평형 상수 및 동적 속도 상수들은 최종적으로, 데이터를 1:1 랭뮤어(langmuir) 상호작용 모델에 적합화시켜 수득하였다.
약 2000 공명 단위(RU)의 20 ㎍/ml 항-인간 IgG(GE 헬쓰케어 #BR-1008-39)를, GE 헬쓰케어에서 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 비아코어 T200에서 CM5 센서칩의 유동 세포 1 및 2(양자택일로: 3 및 4) 상에 커플링시켰다.
샘플 및 러닝 완충액(running buffer)은 HBS-EP+(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3　mM EDTA, 0.05%(v/v) 계면활성제 P20, pH 7.4)이었다. 유동 세포 온도는 25 ℃로 설정하였고 샘플 구획 온도는 12 ℃로 설정하였다. 시스템은 러닝 완충액으로 프라이밍되었다.
샘플을 10 nM의 농도로 20 초동안 주입하여 제 2 유동 세포에 결합시켰다. 이어서, 완전한 일련의 인간 PD1-ECD 농도(144 nM, 48 nM, 16 nM, 5.33 nM, 1.78 nM, 0.59 nM, 0.20 nM 및 0 nM)를 각 샘플 위로 120 초동안 주입한 후, 30/300 초의 해리 시간 및 3 M MgCl2를 사용한 2단계 20 초 재생 단계가 이어졌으며, 상기 재생 단계 중 마지막 단계는 러닝 완충액으로 "주입후 추가 세척"을 포함하였다.
최종적으로, 이중의 참조 데이터를 비아코어 T200 평가 소프트웨어(Evaluation Software)를 사용하여 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합화시켰다. 수득된 K D, k a 및 k d 값들은 표 4에 나타내었다.
[표 4] 비아코어에 의해 측정된 키메라 PD1-0103 및 인간화 PD1- Ab에 대한 동적 속도 상수 및 평형 상수
Figure 112018042457960-pct00004
표 4에 나타낸 바와 같이, 키메라 PD1-0103의 인간화 변이체들(제조는 실시예 6 참조) 모두 모 항체(키메라 PD1-0103)와 유사한 동적 성질들을 나타낸다.
동역학
CM5 센서 시리즈 S를 비아코어 4000 시스템에 장착하고 검출 스팟을 제조사의 지시에 따라 유체역학적으로 지정하였다.
다중클론 토끼 IgG 항체 <IgGFCγM>R (잭슨 임뮤노리서치 래버러토리즈 인코포레이티드(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.))를 10000 Ru에서 유동 세포 1,2,3 및 4 중의 검출 스팟 1 및 5 상에 고정화시켰다. 커플링은 EDC/NHS 화합물을 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행하였다. 유동 세포들 중 남은 스팟들은 기준의 역할을 하였다. 샘플 완충액은 1 mg/ml 카복시메틸덱스트란이 보충된 시스템 완충액이었다.
한 실시양태에서, 분석은 25 ℃에서 수행하였다. 또 다른 실시양태에서, 분석은 37 ℃에서 수행하였다. 50 nM의 각 뮤린 단일클론 항체를 10 ㎕/분으로 1 분동안 주입시켜 센서 표면 상에 포획시켰다. 이어서, 각각의 항원들을 100 nM, 2x 33 nM, 11 nM, 4　nM, 1 nM 및 시스템 완충액 0 nM의 일련의 농도에서 30 ㎕/분으로 4 분의 결합 단계 시간동안 주입하였다. 해리는 추가로 4 분동안 모니터하였다. 포획 시스템은 30 ㎕/분으로 10 mM 글리신 (pH 1.5)의 3 분 주입을 이용하여 재생시켰다. 관련된 동적 데이터는 비아코어 평가 소프트웨어를 제조사의 지시에 따라 사용하여 산출하였다.
에피토프 지도화
비아코어 4000 기기에 비아코어 CAP 센서를 장착하고 제조사가 권장한 바와 같이 제조하였다. 상기 기기 완충액은 HBS-ET(10 mM HEPES pH 7.4, 150　mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% w/v 트윈 20)이었다. 상기 기기는 25 ℃에서 운전되었다.
모든 샘플을 시스템 완충액에 희석하였다. 35 kDa 비오틴일화 항원 PD1-ECD-AviHis를 200 RU에서 유동 세포 1, 2, 3 및 4 중의 스팟 1 및 5에서 30 ㎕/분으로 1 분동안 주입시켜 CAP 센서 표면 상에 포획시켰다. 스팟 2, 3 및 4는 기준의 역할을 하였다. 또 다른 실시양태에서, 35 kDa 비오틴일화 항원 PD1-ECD-AviHis를 200 RU에서 동일한 방식으로 CAP 센서 상에 포획시켰다.
이어서, 1차 항체를 100 nM에서 30 ㎕/분으로 3 분동안 주입한 후 2차 항체를 100 nM에서 30 ㎕/분으로 3 분동안 주입하였다. 1차 항체는 표면 제시된 항원의 완전한 포화까지 주입하였다. 1차 및 2차 항원 주입 단계의 마지막에, 각 항체들의 결합 반응을 모니터하기 위해 기록점 "말기 결합"(BL)을 설정하였다. 2차 항체 결합 반응 "BL2"와 1차 항체 반응 "BL1" 사이의 비율인 몰비를 산출하였다. 상기 몰비는, 항원이 이미 1차 항체에 의해 복합체화된 경우, 2차 항체의 항원 접근성의 지표로서 사용되었다.
복합체들은, 2M 구아니딘-HCL 250 mM NaOH 재생 완충액을 제조사에서 권장한 대로 30 ㎕/분으로 2 분동안 주입한 후, 시스템 완충액을 30 ㎕/분으로 1 분동안 주입시켜 센서 표면으로부터 완전히 제거하였다.
실시예 3:
혼합 림프구 반응( MLR )에서 사이토카인 생성에 대한 상이한 항 -PD-1 항체들의 효과
3A) 혼합 림프구 반응(MLR)은 한 개체(공여체 X)로부터 또 다른 개체(공여체 Y)의 림프구까지 림프구의 활성화를 측정하는 면역 세포 분석법이다. 혼합 림프구 반응을 이용하여 림프구 작동인자 세포에 대한 PD1 경로 차단의 효과를 입증하였다. 분석에서는 T 세포를 항-PD1 mAb의 존재 또는 부재하에서 활성화 및 그의 IFN-감마 분비에 대해 검사하였다.
동종이계 MLR을 수행하기 위해, 미지의 HLA 유형을 갖는, 적어도 4명의 건강한 공여체들로부터의 말초혈 단핵 세포(PBMC)를, 류코셉(Leukosep)(그레이너 바이오 원(Greiner Bio One), 227 288)을 이용한 밀도 구배 원심분리에 의해 단리하였다. 간략하게, 헤파린첨가 혈액 샘플을 3배 부피의 PBS로 희석하고, 희석된 혈액 25 ml 분취량을 50 ml 류코셉 튜브에 적층시켰다. 실온에서 800 x g에서 15 분동안 원심분리(휴지없이) 후에, 림프구 함유 분획들을 수거하고, PBS에 세척하고, 기능 분석에 직접 사용하거나 또는 냉동 배지(10% DMSO, 90% FCS)에 1.0E+07 세포/ml로 재현탁하고 액체 질소중에 저장하였다. 2명의 상이한 공여체들로부터의 PBMC를 1:1 자극자/반응자 세포 비로 혼합함으로써 개별적인 2-방향 MLR 반응을 촉발시키고, 상이한 농도 범위의, 정제된 항-PD1 단일클론 항체들 PD1-0050, PD1-0069, PD1-0073, PD1-0078, PD1-0098, PD1-0102, PD1-0103의 존재 또는 부재하에, 37 ℃, 5% CO2에서 평저 96-웰 플레이트에서 적어도 2중으로 공-배양을 6 일동안 수행하였다. 기준 항-PD1 항체로서, 니볼루맙(MDX-5C4 또는 MDX-1106으로도 알려져 있음) 또는 펨브롤리주맙(MK-3475 또는 Org 1.09A로도 알려져 있음)의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체를 합성하고, 인간 IgG1(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카바트의 EU 인덱스) 포함)의 주쇄와 함께 클로닝하였다. 음성 대조군으로서 항체를 사용하지 않거나 이소타입 대조군 항체를 사용하였으며, rec hu IL-2(20 EU/ml)를 양성 대조군으로 사용하였다. 6 일 후에, 사이토카인 측정을 위해 각 배양물로부터 100 ㎕의 배지를 취하였다. IFN-감마의 수준은 OptEIA ELISA 키트(BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))를 사용하여 측정하였다.
결과는 표 5(IFN-g 분비/방출)에 나타내었다. 항-PD1 단일클론 항체는 T 세포 활성화 및 IFN-감마 분비를 농도 의존성 방식으로 촉진하였다. IFNg 분비의 % 증가율의 값은, 어떤 차단 mAb도 첨가하지 않고(E-c로서 기저 동종이계 자극 유도된 IFNg 값) MLR의 IFN-g 생성에 대해서, 및 20 EU/ml rec hu IL-2의 첨가하에(양성 대조군 = E+c로서 100% IFNg 값) MLR의 IFN-g 생성에 대해 산출하였으며, 식: 상대 자극[%] = ((E샘플 - E-c)/(E+c - E-c)*100에 따라 산출하였다.
[표 5] 양성 대조군으로서 재조합 인간 IL-2 처리(20 EU/ml)(= 100% 증가)의 효과와 비교시 동종이계 자극 및 항-PD-1 항체로 처리후 IFN 감마 분비의 백분율
Figure 112018042457960-pct00005
여러 PD1 차단 항체들 PD1-0050, PD1-0069, PD1-0073, PD1-0078, PD1-0098, PD1-0102, PD1-0103은 인터페론 감마(IFN-g)의 분비를 증대시킴으로써 강한 면역 조절 활성을 나타내었다(모든 항체들에 대해 데이터 나타내지 않음).
3B) 또 다른 실험에서, 키메라 PD1-0103(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카바트의 EU 인덱스)를 갖는 인간 IgG1 이소타입)을 평가하였다. 키메라 PD1-0103에 의한 PD1의 차단은 동종이계 자극 1차 인간 T 세포에 의한 IFN-감마 분비를 크게 증대시킨다. 키메라 PD1-0103은 기준 항-PD1 항체들보다 더 효능이 강하다(도 1 참조).
비교를 위해, 니볼루맙(MDX-5C4 또는 MDX-1106으로도 알려져 있음) 및 펨브롤리주맙(MK-3475 또는 Org 1.09A로도 알려져 있음)의 어느 하나의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 기준 항-PD1 항체를 합성하고, 인간 IgG1(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카바트의 EU 인덱스) 포함)의 주쇄와 함께 클로닝하고 사용하였다.
3C) 추가 실험에서, 항-PD-1 항체 PD1-0103의 인간화 변이체들(도 2 및 3에서 인간화 항체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0314, 또한 하기 실시예 6 참조)의 면역 조절 활성, a) IFN 방출(분비), b) TNF-알파 방출(분비)를 전술한 바와 같이 MLR에서 평가하였다. 키메라 PD1-0103 항체 및 그의 인간화 변이체들의 효과를, 인간 IgG1(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카바트의 EU 인덱스) 포함)의 주쇄와 함께 니볼루맙(MDX-5C4 또는 MDX-1106으로도 알려져 있음) 및 펨브롤리주맙(MK-3475 또는 Org 1.09A로도 알려져 있음)의 어느 하나의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 기준 항-PD1 항체와 비교하였다. MLR 배양 6 일 후에, 50 ㎕의 상등액을 취하고 바이오-플렉스 프로(Bio-Plex Pro)™ 인간 사이토카인 Th1/Th2 분석법(바이오-래드 래버러토리즈 인코포레이티드(Bio-Rad Laboratories Inc.))을 이용하여 여러 사이토카인들을 단일 배양물 중에서 측정하였다(모든 사이토카인에 대해 데이터 나타내지 않음).
키메라 PD1-0103 항체 및 그의 인간화 변이체들(PD1-0103_0312 및 PD1-0103_0314)은 T 세포 활성화 및 IFN-감마 분비를 증대시키는데 있어서, 기준 항-PD1 항체들에 비해 더 효능이 강하였다(도 2 참조).
또한, 키메라 PD1-0103 항체 및 그의 인간화 변이체들은 항원 제시 세포에 의한 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파)(도 3 참조) 및 IL-12(데이터 나타내지 않음) 분비를 증가시키고, T 세포를 자극하는 단핵구/대식세포 또는 항원 제시 세포의 능력을 증대시킨다.
실시예 4:
동종이계 성숙 수지상 세포와 공배양된 인간 CD4 T 세포에 의한 세포독성 그 랜자임 B 방출 및 IFN-γ 분비에 대한 항-PD-1 차단의 효과
동종이계 배경에서 항-PD-1 처리의 효과를 더 조사하기 위해, 새로 정제된 CD4 T 세포를 단핵구-유래 동종이계 성숙 수지상 세포(mDC)의 존재하에서 5 일동안 공배양시키는 분석법을 개발하였다. 1 주일 전에 플라스틱 부착을 통해 새 PBMC로부터 단핵구를 단리한 후, 비-부착 세포를 제거하였다. 이어서, 이들을 GM-CSF(50 ng/ml) 및 IL-4(100 ng/ml)를 함유하는 배지중에서 5 일동안 배양하여 단핵구들로부터 미성숙 DC를 생성하였다. iDC 성숙화를 유도하기 위해, 배양 배지에 TNF-알파, IL-1베타 및 IL-6 (각각 50 ng/ml)을 추가 2 일동안 첨가하였다. 이어서, 유세포분석(LSR포르테사(LSRFortessa), BD 바이오사이언시즈)을 통해 주조직적합성 복합체 클래스 II(MHCII), CD80, CD83 및 CD86의 표면 발현을 측정함으로써 DC 성숙화를 평가하였다.
최소 혼합 림프구 반응(mMLR) 당일에, 비관련 공여체로부터 수득된 108개 PBMC로부터 마이크로비드 키트(밀테나이 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 통해 CD4 T 세포를 농축시켰다. 배양 전에, CD4 T 세포를 5 μM의 카복시-플루오레세인-숙신이미딜 에스터(CFSE)로 표지하였다. 이어서, 105개 CD4 T 세포를, 도면에서 달리 나타내지 않는 한, 10 ㎍/ml의 농도에서, 차단 항-PD1 항체(PD1-0103, 키메라 PD1-0103, 또는 도 4A 및 4B에서 0312, 0313, 0314, 0315로 약칭되어 있는 인간화 항체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315)의 존재 또는 부재하에, 성숙 동종이계-DC와 함께(5:1) 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다.
5 일후에, 세포-배양 상등액을 수거하고, 나중에 ELISA(R&D 시스템즈)에 의해 IFN-감마 수준을 측정하기 위해 사용하고, 세포를 37 ℃에서 골지 플러그( Golgi Plug)(브레펠딘(Brefeldin) A) 및 골지 스탑(Golgi Stop)(모넨신(Monensin))의 존재하에서 5 시간동안 더 방치하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 표면상에서 항-인간 CD4 항체 및 생존/사멸(Live/Dead) 정착성 염료 아쿠아(Aqua)(인비트로겐(Invitrogen))로 염색한 후에 픽스/펌(Fix/Perm) 완충액(BD 바오이사이언시즈)으로 고정/투과시켰다. 그랜자임 B(BD 바이오사이언시즈), IFN-감마 및 IL-2(둘 다 이바이오사이언스(eBioscience)로부터)에 대한 세포내 염색을 수행하였다. 결과는 도 4A 및 4B에 나타내었다.
상이한 농도의 PD1-0103의 인간화 변이체들(도면에서 0312, 0313, 0314, 0315로 약칭되어 있는 인간화 항체 PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315, 또한 하기 실시예 6 참조)을 또한 검사하고, 이들이 그랜자임 B 및 인터페론 감마를 증대시키는데 있어서 동일하게 우수함을 밝혀내었다. DP47은 Fc감마R에 의한 인식을 방지하기 위해 Fc 부분에 LALA 돌연변이를 갖는 비결합 인간 IgG이며, 음성 대조군으로 사용되었다.
실시예 5:
키메라 항체 유도체
항-PD1 마우스 항체 PD1-0098, PD1-0103의 가변 중쇄 및 경쇄 영역들을 PCR을 통해 증폭시키고, 이들을, 작동인자 기능을 제거하는 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카바트의 EU 인덱스)(류신 234가 알라닌으로, 류신 235가 알라닌으로, 프롤린 329가 글리신으로)를 갖는 인간 IgG1 주쇄/인간 CH1-힌지-CH2-CH3과의 융합 단백질로서 중쇄 발현 벡터 내에 클로닝시키고 인간 C-카파에 융합 단백질로서 경쇄 발현 벡터 내에 클로닝시켜 키메라 PD1 항체들을 생성하였다. 이어서, LC 및 HC 플라스미드를 HEK293에 동시형질감염시키고, 7 일후에 항체 정제에 대한 표준 방법으로 상등액으로부터 정제하였다. 상기 키메라 PD1-항체들은 키메라 chiPD1-0098 (chiPD1-0098) 및 키메라 PD1-0103 (chiPD1-0103)로 다시 명명하였다. 비교를 위해, 니볼루맙(MDX-5C4 또는 MDX-1106으로도 알려져 있음) 및 펨브롤리주맙(MK-3475 또는 Org 1.09A로도 알려져 있음)의 어느 하나의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 기준 항-PD1 항체를 합성하고, 인간 IgG1(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카바트의 EU 인덱스) 포함)의 주쇄와 함께 클로닝하고 사용하였다.
실시예 6:
항-PD1 항체 PD-0103( huMab PD- 0103)의 인간화 변이체들의 생성, 발현 및 정제, 및 특성화
뮤린 항-PD1 항체 0103의 VH 및 VL 도메인의 인간화
뮤린 항-PD1 항체 0103의 뮤린 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열(서열번호 7 및 8)을 기반으로, 인간화 항-항-PD1 항체 변이체들을 생성하였다.
인간화 VH-변이체는 여러개의 돌연변이를 갖는 인간 J-요소 생식계열 IGHJ5-01과 함께 인간 생식계열 IMGT_hVH_3_23을 기반으로 한다(서열번호 57 생성).
VL의 인간화 변이체는 인간 J-요소 생식계열 IGKJ1-01과 함께 인간 생식계열 IMGT_hVK_4_1, IMGT_hVK_2_30, IMGT_hVK_3_11 및 IMGT_hVK_1_39를 기반으로 한다. 상이한 돌연변이들에 의해 서열번호 58 내지 서열번호 61의 인간화 변이체들이 생성되었다.
PD1-0103의 중쇄 및 경쇄 가변 영역들에 대한 인간화 아미노산 서열들을 DNA로 역-번역하고, 생성된 cDNA를 합성(젠아트(GenArt))한 다음, 작동인자 기능을 제거하는 LALA 및 PG 돌연변이(류신 234가 알라닌으로, 류신 235가 알라닌으로, 프롤린 329가 글리신으로)를 갖는 인간 IgG1 주쇄/인간 CH1-힌지-CH2-CH3과의 융합 단백질로서 중쇄 발현 벡터 내에 클로닝시키거나 인간 C-카파에 융합 단백질로서 경쇄 발현 벡터 내에 클로닝시켰다. 이어서, LC 및 HC 플라스미드를 HEK293에 동시형질감염시키고, 7 일후에 항체 정제에 대한 표준 방법으로 상등액으로부터 정제하였다. 생성된 인간화 PD1-항체들은 다음과 같이 명명하였다:
[표 6] PD1-0103의 인간화 변이체 항체들의 VH 및 VL 서열
Figure 112018042457960-pct00006
[표 7] PD1-0103의 인간화 변이체 항체들의 HVR 서열
Figure 112018042457960-pct00007
인간화 PD1-0103 항체 변이체 및 모 키메라 PD1-0103을 전술한 바와 같이 특성화하였다. 결과는 표 8에 나타내었다.
[표 8] 인간화 PD1-0103 항체 변이체 및 모 키메라 PD1-0103에 대한 결과 요약
Figure 112018042457960-pct00008
실시예 7
중화 효능 PD-1 항체
시험관내에서 억제된 T 세포 반응의 복구를 모방하는데 있어서 사내 제조된 PD-1 항체의 중화 효능을 검사하기 위해, 상업적으로 시판하는 PD1/PD-L1 리포터 분석법(프로메가(Promega))을 이용하였다. 상기 시스템은 PD1+ NFAT Jurkat 세포, 및 또한 활성화 신호를 제공하는 PD-L1+ CHO 상대물로 이루어진다. 원칙적으로, 리포터 시스템은 3 단계를 기반으로 한다: (1) TCR-매개 NFAT 활성화, (2) PD-1/PD-L1 축에 의한 활성화시 NFAT 신호의 억제, 및 (3) PD-1 차단 항체에 의한 NFAT 신호의 회복.
재료 및 방법
- PD-L1 배지: PAN 바이오테크(PAN Biotech) (#P04-03609); FBS(10%) 및 L-Gln(4mM)
- 분석 배지: RPMI 1640(#31870; 인비트로겐), 25 mM HEPES, 2 mM L-Gln, FBS(2%)
- 상기 분석에 사용된 세포(둘다 프로메가에서 구매된 세포 유형):
PD-L1+ CHO 세포(배치 번호 #139147): 2-3x104 세포/96 웰
PD-1+ NFAT Jurkat 세포(배치 번호 #133024): 3.5x104 세포/웰.
제 1 일에, PD-L1+ 세포를 해동하고, 상기 언급된 배지에 지시된 세포 농도로 접종하고, 37 ℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 다음날, 배지를 제거하고 PD-L1+ 세포를 제조된 항체들과 함께 지시된 농도에서 (분석 배지중에서) 배양하였다. 동시에, PD-1+ NFAT Jurkat 세포를 해동하고, 상기 언급된 세포 수를 PD-L1+ 세포로 옮기고 상기 세포와 공-배양하였다. 37 ℃ 및 5% CO2에서 6 시간동안 배양한 후, 바이오-글로(Bio-Glo) 기질을 실온으로 가온시켰다(첨가 1 내지 2 시간 전에). 세포 배양 플레이트를 배양기에서 꺼내어 실온으로 조정한 후(10 분) 웰 당 80 ㎕ 바이오-글로 용액을 첨가하고, 5 내지 10 분동안 배양한 후, 테칸 인피니트(Tecan Infinite) 판독기에서 키트 제조사의 권장사항에 따라서 발광을 측정하였다. 결과는 도 5A 및 5B에서 볼 수 있으며, 상기 도면들에는 TCR 자극시 상이한 PD-1 항체들에 의한 NFAT 신호의 PD-1/PD-L1 매개된 억제의 복구가 나타나 있다: 도 5A: 키메라 PD1_0103은 기준 항체와 비교시 재현가능하게 우수한 효과를 나타내었다. 기준항체로서 니볼루맙(MDX-5C4 또는 MDX-1106으로도 알려져 있음)의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항-PD1 항체를 합성하고, 인간 IgG1(돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카바트의 EU 인덱스) 포함)의 주쇄와 함께 클로닝하였다. 도 5B: PD1_0103의 4개 인간화 변이체들은 리드(lead) 항체와 유사한 시험관내 효능을 나타내었으며, 또한 기준 항체보다 약간 더 우수하였다.
실시예 8:
PD-1 엑토도메인에 의한 Fab PD1-0103의 결정화
복합체 생성을 위해 Fab PD1-0103을 1.1 몰 과량으로 PD-1 엑토도메인과 혼합하였다. 얼음위에서 1 시간동안 배양한 후, 복합체를 PNGase 단계에 의해 탈글리코실화시켜 복합체 생성에 수반되지 않은 글리칸을 제거하였다. PD-1 ECD에 의한 Fab 단편 PD1-0103(인간 CH1 및 CL 포함)의 복합체 결정들에 대한 결정화 스크리닝을 15 mg/ml의 농도에서 수행하였다. 결정화 소적들은 증기 확산 시팅 드롭(sitting drop) 실험에서 0.1 ㎕의 단백질 용액을 0.1 ㎕ 수용기 용액과 혼합시켜 21 ℃에 두었다. 결정들은 침전제로서 PEG를 함유하는 다양한 조건에서 나타났다. 결정들을 사용하여, 30% PEG1500으로부터 4 일이내에 나타나고 7 일이내에 0.03x0.06x0.02 ㎛의 최종 크기로 성장한 구조를 측정하였다.
결정들을 동결보호제로서 20% 글리세롤로 보충된 수용기 용액내로 옮긴 다음 액체 N2 중에서 순간-냉각시켰다. 회절상들을 스위스 라이트 소스(Swiss Light Source)의 빔 라인 X10SA에서 100K의 온도에서 필라투스(Pilatus) 6M 검출기를 사용하여 수집하고 XDS 패키지로 처리하였다[Kabsch , W. Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. J. Appl . Cryst. 26, 795-800 ( 1993)]. 1개 결정으로부터의 데이터를 합쳐서 결정학적 비대칭 단위 당 2개의 복합체 분자를 갖는 스페이스 기 P1에서 1.9 Å 해상도 데이터 세트를 수득하였다(표 1 참조).
구조는 탐색 모델로서 PDB-ID 3UTZ로부터의 Fab 단편의 배위를 이용한 분자 치환에 의해 측정하였다. PD-1 ECD에 대한 탐색 배위로서 PDB-ID 3RRQ를 이용하였다. Fab를 불변 도메인 및 가변 도메인으로 분할하고, 팔꿈치 각도에서 가능한 변화를 설명하기 위해, CCP4 프로그램 PHASER에서 2개의 별개의 탐색 둘 다를 사용하여 CCP4를 수행하였다[CCP4 (Collaborative Computational Project, N. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr. D, 760-763 ( 1994)]. 상기 모델은 COOT에서 재구축되고[Emsley , P., Lohkamp , B., Scott, WG. & Cowtan , K. Features and development of COOT. Acta Crystallogr . D Biol . Crystallogr. 60, 486-501 (2010)], CCP4 프로그램 REFMAC를 사용하여 개선되었다. 최종 개선 단계는 프로그램 BUSTER를 사용하여 수행하였다[Bricogne G., Blanc E., Brandl M., Flensburg C., Keller P., Paciorek W.,Roversi P, Sharff A., Smart O.S ., Vonrhein C., Womack T.O . (2016). BUSTER version 2.11.6. Cambridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd.].
[표 9] Fab PD1-0103-PD-1 ECD 결정에 대한 데이터 수집 및 구조 개선 통계
Figure 112018042457960-pct00009
PD-1 엑토도메인과의 복합체에서 Fab PD1-0103의 구조 측정
에피토프 및 파라토프를 상세하게 특성화하기 위해, Fab PD1-0103과의 복합체중 PD-1 에피토프의 결정 구조를 1.9 Å의 해상도까지 측정하였다. 상기 구조는 Fab PD1-0103이 BC 및 FG 루프 영역에 의해서 및 PD-1 V-형 Ig 도메인의 전방 β-시트의 β-가닥 CC'FG의 잔기에 의해 생성된 에피토프를 인식함을 보여준다. 게다가, 상기 에피토프는 PD-1의 BC 루프의 일부인 위치 Asn58에서의 N-결합된 글리코실화 트리를 포함한다. Fab PD1-0103의 경쇄의 CDR2를 제외하고 모든 CDR들이 파라토프에 기여한다.
PD-1의 1063 Å2의 표면영역이 중쇄에 의해 기여된 743 Å2 및 경쇄에 의해 기여된 320 Å2 하에 Fab PD1-0103에 의해 점유된다. 프로그램 PISA를 사용한 결합 계면의 분석에 의해 6개 수소 결합 및 반데르발스(Van der Waals) 힘에 의한 Fab PD1-0103과 PD-1 ECD와의 상호작용 패턴이 밝혀졌다. 측쇄 수소 결합은 중쇄 CDR1의 잔기(Thr33) 및 CDR2의 잔기(Ser52, Arg56, Asp57)와 PD-1의 BC 루프의 Glu61 및 Ser62 사이에 형성된다. 반데르발스 접촉은 주로 경쇄 및 중쇄의 CDR3, 특히 HCDR3의 Phe105에 의해서 및 BC 루프의 잔기 Val 64, Pro83에 및 FG 루프의 Ile126 및 Leu128에 가까이 위치한 HCDR1의 Tyr32에 의해 유도된다. 추가의 반데르발스 접촉이 FG 루프 잔기 Pro130, Ala132, Ile134와 Fab PD1-0103의 중쇄의 CDR2 및 경쇄의 CDR3 사이에서 관찰된다. Fab PD1-0103의 경쇄는 오직 PD-1의 FG 루프와만 접촉한다. 복합체 생성시 경쇄의 CDR2에 의한 접촉은 제공되지 않는다.
PD-1의 위치 Asn58에서의 N-결합된 글리코실화 트리는 에피토프의 일부이며, Fab PD1-0103의 중쇄의 잔기들과만 상호작용한다.
PD-1의 위치 Asn58에서의 코어 당쇄(N-결합된 글리코실화) 트리는 모노사카라이드와 관련하여 하기의 구조를 갖는다:
Asn58-N-GlcNAc(FUC) - GlcNAc- - BMA - MAN (도 9 참조) (이때, 하기의 약자들을 사용한다).
[GlcNAc]= NGA = N-아세틸-베타-D-갈락토스아민 = 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-베타-D-갈락토피라노스
[FUC] = 알파-L-푸코스　
[BMA] = 베타-D-만노피라노스
[MAN] = 알파-D-만노피라노스
당쇄 중 맨처음 GlcNAC는 푸코실화되어 GlcNAc(FUC)로 약칭된다.
상기 구조에서, 코어 글리칸은 1개의 만노스 단위를 제외하고 전자 밀도에 있어 잘 정의되어 있다. 푸코스 잔기는 CDR1 및 CDR2를 갖는 PD-1에 의해 생성된 친수성 포켓내로 향한다. 푸코스의 결합은 PD-1의 Glu61 및 Gln99와 함께 CDR1의 Ser30 및 Ser31과의 수소 결합망에 의해 배위된다. 추가의 접촉은 제 1 GlcNac의 Arg56에 대한 수소 결합 및 Man에 대한 프레임워크 잔기 Arg72, Asp73, Asn74의 수소 결합에 의해 제공된다.
[표 10] PD1 - Fab PD1-0103 중쇄 접촉부의 목록
5Å의 거리 컷오프에 의해 확인된 접촉부
Figure 112018042457960-pct00010
[표 11] PD1 - Fab PD1-0103 경쇄 접촉부의 목록
5Å의 거리 컷오프에 의해 확인된 접촉부
Figure 112018042457960-pct00011
[표 12] Asn58의 코어 당쇄의 PD1 - Fab PD1-0103 중쇄 접촉부의 목록
5Å의 거리 컷오프에 의해 확인된 접촉부
Figure 112018042457960-pct00012
요약
- PD1 상의 에피토프는 평평한 표면과 유사하다
→ 주로 PD1의 전방 b-시트 및 CDR3에 의해 결합
- 상호작용은 극성 및 반데르발스 접촉을 포함한다.
- PD1과 Fab의 중쇄와의 큰 상호작용 표면영역
- 위치 Asn58에서의 글리코실화는 Fab 단편에 대한 PD1의 결합에 관여한다
- 푸코스 단위는 PD1 및 Fab PD1-0103의 중쇄에 의해 생성된 포켓을 점유한다.
실시예 9:
Asn58에서 글리코실화된 인간 PD1에 대한 결합에 비해 Asn58에서 글리코실 화되지 않은 인간 PD1에 대한 감소된 항체 결합( 글리코실화 및 비- 글리코실화 재조합 PD1에 대한 항-PD-1 항체의 비아코어 특성화)
표면 플라즈몬 공명(SPR) 기반 분석을 이용하여 글리코실화 PD1과 비-글리코실화 재조합 인간 PD1 사이의 결합의 동적 파라미터를 측정하였다. 그러므로, 항-인간 IgG를 (비아코어) CM5 센서 칩의 표면에 아민 커플링시킴으로써 고정화시켰다. 이어서, 샘플을 포획하고, hu PD1-ECD를 상기 샘플들에 결합시켰다. 매 분석 주기 후에 센서 칩 표면을 재생시켰다. 평형 상수 및 동적 속도 상수들은 최종적으로 데이터를 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합화시킴으로써 수득하였다.
약 2000 공명 단위(RU)의 20 ㎍/ml 항-인간 IgG(GE 헬쓰케어 #BR-1008-39)를, GE 헬쓰케어에서 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0에서 비아코어 T200에서 CM5 센서칩의 유동 세포 1 및 2(양자택일로: 3 및 4) 상에 커플링시켰다.
샘플 및 러닝 완충액은 HBS-EP+ (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3　mM EDTA, 0.05%(v/v) 계면활성제 P20, pH 7.4)이었다. 유동 세포 온도는 25 ℃로 설정하였고 샘플 구획 온도는 12 ℃로 설정하였다. 시스템은 러닝 완충액으로 프라이밍되었다.
샘플을 10 nM의 농도로 20 초동안 주입하여 제 2 유동 세포에 결합시켰다. 이어서, 완전한 일련의 인간 PD1-ECD(글리코실화되거나 비-글리코실화된) 농도(200 nM, 66.6 nM, 22.2 nM, 7.4　nM, 2.46 nM 및 0 nM)를 각 샘플 위로 200 초동안 주입한 후, 0/2000 초(66.6 nM & 22.2 nM)의 해리 시간 및 3 M MgCl2를 사용한 2단계 20 초 재생 단계가 이어졌으며, 상기 재생 단계 중 마지막 단계는 러닝 완충액으로 "주입후 추가 세척"을 포함하였다.
최종적으로, 이중 참조 데이터를 비아코어 T200 평가 소프트웨어를 사용하여 1:1 랭뮤어 상호작용 모델에 적합화시켰다. 수득된 K D, k a 및 k d 값들은 표 13에 나타내었다.
[표 13] 비아코어에 의해 측정된 동적 속도 상수 및 평형 상수
Figure 112018042457960-pct00013
펨브롤리주맙 및 니볼루맙과 대조적으로 비글리코실화 PD-1 및 글리코실화 PD-1에 대한 PD-103-0312의 결합은 명백하게 구별된다(또한 도 13A 및 13B 참조).
실시예 10:
CEA에 대한 T 세포 이중특이성 항체와 함께 PD1 항체들의 생체내 항-종양 효능
인간 조혈 줄기 세포의 후속 입양 전달하에 NOG 마우스를 조정함으로써 인간화 동물을 생성하였다. 생성된 마우스들은 인간 유래 세포들의 20 내지 85% 범위의 인간 및 마우스 백혈구 사이의 키메라 비를 나타낸다. 상기 모델에서, T 세포는 기능성이며, CEA 및 CD3에 결합하는 이중특이성 항체(WO2014/131712 호에 기술되어 있음)에 의해 종양 세포를 사멸하도록 활성화될 수 있다. 이어서, 상기 인간화된 동물에 백만개 CEA 양성 종양 세포인, MKN45 위암종 세포를 측면 위치에서 피하에 주사하였다. 종양 성장은, 종양의 3차원 축을 작동유전자 유도 캘리퍼로 1주일에 3회 측정하여 평가할 수 있었다(도 14A 및 14B). 종양 주입후 제 9 일에, 마우스들을 종양 크기에 근거하여 동종 동물 군들을 갖도록 무작위선정하고 치료적 처리를 시작하였다. 비히클 군들(도 xA 및 XB, 원)을 제외하고, 모든 마우스 군에는, CEACD3TCB를 2.5 mh/Kg의 용량으로 1주일에 2회 정맥내 투여하였다. 게다가, 각각의 마우스 군들은 1개의 조합 상대로도 또한 처리되었다: 복강내로 매주 0.15 mg/Kg(도 14A, 사각형) 또는 매주 1.5 mg/Kg(도 14A, 사각형)의 항-PD1 (PD1-0103-0312); 복강내로 매주 0.15 mg/Kg(도 14A, 다이아몬드) 또는 매주 1.5 mg/Kg(도 14B, 다이아몬드)의 니볼루맙. 한 처리군내에서의 종양 크기의 평균를 시간 경과에 따라 나타내었다. 상기 군은 각각 9 내지 10 마리들로 이루어졌고, 측정은 군당 3마리 이상의 마우스들이 존재할 때까지 계속한다. 표준 곡선하면적(sAUC)을 산출하고, 일방향 ANOVA 분석을 이용하여 통계적 유의성을 산출하였다.
SEQUENCE LISTING <110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG <120> ANTI-PD1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> P33103PCT <140> PCT/EP2016/073248 <141> 2016-09-29 <150> EP15188061.4 <151> 2015-10-02 <160> 77 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 1 Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr 1 5 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 2 Gly Gly Arg 1 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 3 Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 4 Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser Asp Asn Ser Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 5 Arg Ser Ser 1 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 6 Asn Tyr Asp Val Pro Trp 1 5 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 7 Glu Val Ile Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Asp Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Ser Ser Leu Met Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Phe Ala Leu Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 8 Lys Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ser 20 25 30 Asp Asn Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr 85 90 95 Asp Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 9 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr 1 5 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 10 Tyr Ser Gly 1 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 11 His Gly Ser Ala Pro Trp Tyr Phe Asp 1 5 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 12 Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 3 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 13 Lys Val Ser 1 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 14 Gly Ser His Phe Pro Leu 1 5 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 15 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asp Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Leu Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Ala Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp His Gly Ser Ala Pro Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 67 <211> 327 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 67 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 68 <211> 268 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 68 Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe 20 25 30 Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr 35 40 45 Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu 50 55 60 Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu 65 70 75 80 Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala 100 105 110 Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg 115 120 125 Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly 130 135 140 Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser 145 150 155 160 Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala 165 170 175 Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp 180 185 190 Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe 195 200 205 Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys Val Pro Glu 210 215 220 Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser 225 230 235 240 Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro 245 250 255 Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 260 265 <210> 69 <211> 150 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 69 Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe 20 25 30 Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr 35 40 45 Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu 50 55 60 Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu 65 70 75 80 Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn 85 90 95 Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala 100 105 110 Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg 115 120 125 Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly 130 135 140 Gln Phe Gln Thr Leu Val 145 150 <210> 70 <211> 288 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 70 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly 165 170 175 Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 180 185 190 Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205 Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 210 215 220 Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro 225 230 235 240 Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly 245 250 255 Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 260 265 270 Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285 <210> 71 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Minimal HVR1 of PD1-0103 and PD1-0103 humanized variant PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 , and PD1-0103-0315 <400> 71 Ser Ser Tyr Thr 1 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Minimal HVR2 of PD1-0103 and PD1-0103 humanized variant PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 , and PD1-0103-0315 <400> 72 Ser Gly Gly Gly Arg Asp Ile Tyr 1 5 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Minimal HVR3 of PD1-0103 and PD1-0103 humanized variant PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 , and PD1-0103-0315 <400> 73 Gly Arg Val Tyr Phe 1 5 <210> 74 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Minimal LVR1 of PD1-0103 and PD1-0103 humanized variant PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 , and PD1-0103-0315 <400> 74 Thr Ser Asp Asn Ser Phe 1 5 <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Minimal LVR2 of PD1-0103 and PD1-0103 humanized variant PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 , and PD1-0103-0315 <400> 75 Arg Ser Ser Thr Leu Glu Ser 1 5 <210> 76 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Minimal LVR3 of PD1-0103 and PD1-0103 humanized variant PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314 , and PD1-0103-0315 <400> 76 Asn Tyr Asp Val Pro Trp 1 5 <210> 77 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> fragment of FR-H3 comprising the amino acid sequence RDN at positions of 71, 72, 73 according to Kabat numbering <400> 77 Arg Asp Asn 1

Claims (33)

  1. (a) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (b) 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
    (c) 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (d) 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (e) 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2;
    (f) 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 및
    (g) 카바트 번호에 따른 위치 71, 72 및 73에서 RDN을 포함하는 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 FR-H3을 포함하는, 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    A) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열을 포함하거나; 또는
    B) i) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 58의 VL 서열을 포함하거나,
    ii) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 59의 VL 서열을 포함하거나,
    iii) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 60의 VL 서열을 포함하거나,
    iv) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 61의 VL 서열을 포함하는,
    인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
  3. (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2;
    (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및
    (f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는,
    인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
  4. (a) (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인 및
    (b) (i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는,
    인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
  5. A) i) 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열 또는
    B) i) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 58의 VL 서열을 포함하거나,
    ii) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 59의 VL 서열을 포함하거나,
    iii) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 60의 VL 서열을 포함하거나,
    iv) 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 61의 VL 서열을 포함하는,
    인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
  6. 서열번호 7의 VH 서열 및 서열번호 8의 VL 서열을 포함하는,
    인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
  7. 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 58의 VL 서열을 포함하는,
    인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
  8. 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 59의 VL 서열을 포함하는,
    인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
  9. 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 60의 VL 서열을 포함하는,
    인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
  10. 서열번호 57의 VH 서열 및 서열번호 61의 VL 서열을 포함하는,
    인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    독립적으로 하기 성질들 중 하나 이상을 특징으로 하는, 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체:
    상기 항체는
    i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 VH 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 항-PD-1 항체와 PD-1에 대한 결합을 위해 경쟁하거나;
    ii) 인간 및 사이노몰구스 PD-1에 결합하거나;
    iii) 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 인터페론-감마(IFN-감마) 분비를 85% 이상 증대시키거나;
    iv) 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 동종이계 자극 T 세포에 의한 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 분비를 200% 이상 증대시킨다.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(카바트의 EU 인덱스에 따른 번호)를 갖는 전장 IgG1 항체인, 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
  13. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
  14. 제 13 항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  15. 항체가 생성되도록 제 14 항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체의 제조 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    숙주 세포로부터 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암 치료에 사용하기 위한 약학 제형.
  18. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로 사용하기 위한 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
  19. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    암 치료에 사용하기 위한 인간 PD1에 결합하는 단리된 항체.
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