KR102049211B1 - 내피세포의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, (a) 다능성 줄기세포로부터, 배양체가 형성되지 않고, 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단을 유도하는 공정, 및 (b) 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단을 RepSox 의 존재하에서 배양하는 공정을 이 순서로 실시하는, 내피세포의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해, 다능성 줄기세포로부터 고품질의 내피세포를 효율적으로 제조하는 것이 가능해진다. 본 발명의 방법에 의해 얻어진 내피세포는, 예를 들어 심근 시트의 제조에 유용하고, 심질환의 치료에 대한 이용이 기대된다. 본 발명의 방법에 의해 얻어진 내피세포를 심근세포 및 벽세포와 혼합하여 배양함으로써 심근 시트를 제조할 수 있다.

Description

내피세포의 제조 방법
본 발명은, 다능성 줄기세포로부터 고품질의 내피세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
재생 의료에 관한 기술 혁신, 특히 다능성 줄기세포의 조제법과 그 분화 유도법이 개발된 것에 의해, 생물의 조직 재생을 목표로 하는 연구가 활발히 실시되고 있다. 생물 개체의 생명 유지에 불가결인 심장에 관해서도, 재생 의료 기술을 심질환의 치료에 이용하는 것이 생각되고 있다. 예를 들어, 다능성 줄기세포로부터 인위적으로 제조한 심근세포를 심장 질환의 치료에 응용하는 시도가 있다. 이 때, 심근세포를 단독으로 사용하는 것이 아니라, 예를 들어 심근세포를 포함하는 시트상의 세포 구축물을 형성시키는 방법이 개발되어 있으며 (특허문헌 1), 얻어진 심근 시트의 유용성이 심근경색 모델 동물에 있어서 나타나 있다.
특허문헌 1 에서는 심근세포를 내피세포, 벽세포 및 Flk/KDR 양성 세포와 조합하여 배양함으로써 심근 시트가 제조된다. 상기 문헌에서는 심근세포, 내피세포, 벽세포 등의 복수의 세포를 세포 혼합물로서 조제하는 방법을 개시하고 있지만, 심근 시트의 품질이나 제조 공정을 관리하는 관점에서는, 이들 세포를 별개로 조제할 것이 요망된다. 또, 내피세포는 심혈 관계 이외의 조직, 장기를 인공적으로 구성시킬 때에, 조직 내에서 형성되는 혈관의 재료가 되는 것이 기대되고 있다.
내피세포의 제조에 관해서는 이미 복수의 방법이 알려져 있다. 다능성 줄기세포로부터 효율적으로 내피세포를 제조하는 방법으로서, 예를 들어 특허문헌 2 에 기재된 방법이 있다. 당해 방법은 다능성 세포를 상이한 유효 성분을 함유하는 복수의 배지 중에서 단계적으로 배양하는 방법이지만, 얻어진 세포의 품질에 관해서는 여전히 개선의 여지가 있다.
국제 공개 WO2012/133945 국제 공개 WO2014/192925
상기의 심근 시트의 제조에 사용하는 재료로서 사용하기 위해, 또 내피세포 자체를 의료용 조성물이나 연구용의 재료로서 사용하기 위해, 보다 고품질의 내피세포를 효율적으로 제조하는 방법이 요구되고 있다. 본 명세서에 있어서,「고품질의 내피세포」란, 얻어지는 세포수가 많은, 고순도인 (내피세포 마커의 양성률이 높은), 분화 단계가 갖추어져 있는, 세포 증식능이 우수한 (예를 들어, 유약 (幼若) 한), 동결 융해에 의한 데미지를 받기 어려운, 로트간 차가 작은 등의 특징을 1 개 이상 갖는 내피세포를 가리킨다.
본 발명은, 이와 같은 종래의 제조 방법이 갖고 있던 문제를 해결하고자 하는 것으로, 고품질의 내피세포를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.
본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 실시한 결과, 다능성 줄기세포로부터 내피세포를 유도할 때에, 내피 전구세포를 RepSox 를 함유하는 배지의 존재하에서 배양함으로써, 많은 고순도 내피세포를 취득할 수 있는 것을 처음으로 알아내었다. 또한 상기 방법으로 얻어지는 내피세포의 대부분은 유약 내피세포이며, 동결 보존을 실시한 후에도 높은 생존률 및 증식률을 유지하고 있는 것을 밝혀내었다. 본 발명은 그와 같은 지견을 기초로 하여 완성된 것이다.
즉, 본 발명은,
[1] (a) 다능성 줄기세포로부터, 배양체 (胚樣體) 가 형성되지 않고, 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단을 유도하는 공정, 및
(b) 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단을 RepSox 의 존재하에서 배양하는 공정을 이 순서로 실시하는, 내피세포의 제조 방법,
[2] 다능성 줄기세포가, 배성 줄기세포 (ES 세포) 또는 유도 다능성 줄기세포 (iPS 세포) 인, 상기 [1] 에 기재된 방법,
[3] 공정 (a) 에 있어서, 다능성 줄기세포가, (i) 액티빈 A 를 함유하는 배지, (ii) 골 형성 단백질 4 를 함유하는 배지, 및 (iii) 혈관 내피세포 증식 인자를 함유하는 배지에서 순차 배양되는, 상기 [1] 또는 [2] 에 기재된 방법,
[4] (ii) 골 형성 단백질 4 를 함유하는 배지가 추가로 염기성 선유아세포 증식 인자를 함유하고 있는, 상기 [3] 에 기재된 방법,
[5] 공정 (a) 후에, (a') 중배엽계 세포 집단으로부터 내피 전구세포를 단리하는 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 [1] ∼ [4] 중 어느 한 항에 기재된 방법,
[6] 공정 (a') 에 있어서, 내피 전구세포로서 키나아제 삽입 도메인 수용체 양성 세포가 단리되는, 상기 [5] 에 기재된 방법,
[7] 공정 (b) 에 앞서, 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단 또는 단리된 내피 전구세포의 RepSox 를 함유하지 않는 배지에서의 배양이 실시되는, 상기 [1] ∼ [6] 중 어느 한 항에 기재된 방법,
[8] 공정 (b) 후에, (c) 내피세포를 동결하는 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 [1] ∼ [7] 중 어느 한 항에 기재된 방법,
[9] 상기 [1] ∼ [8] 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 내피세포를 제조하는 공정, 및 내피세포를 심근세포 및 벽세포와 혼합하여 배양하는 공정을 포함하는, 심근 시트의 제조 방법, 그리고
[10] 키나아제 삽입 도메인 수용체 양성의 내피 전구세포와 RepSox 를 함유하는 세포 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 의해, 다능성 줄기세포로부터 고품질의 내피세포를 효율적으로 제조하는 것이 가능해진다. 본 발명의 방법에 의해 얻어진 내피세포는, 예를 들어 심근 시트의 제조에 유용하고, 심질환의 치료에 대한 이용이 기대된다. 또한, 내피세포의 이상 등에서 기인하는 질환의 세포 모델, 약물의 안전성 평가를 위한 재료로서 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 내피세포를 심근세포 및 벽세포와 혼합하여 배양함으로써 심근 시트를 제조할 수 있다.
본 발명을 이하에 상세하게 설명한다.
본 명세서에 있어서「다능성 줄기세포」란, 복수종의 세포로 분화 가능한 다능성을 갖고, 또한, 자기 증식능도 겸비하는 줄기세포로서, 이하의 것에 한정되지 않지만, 예를 들어 유도 다능성 줄기세포 (induced pluripotent stem cell : iPS 세포), 배성 줄기세포 (embryonic stem cell : ES 세포), 정자 줄기세포 (germline stem cell : GS 세포), 배성 생식 세포 (embryonic germ cell : EG 세포), 핵 이식에 의해 얻어지는 클론배 유래의 배성 줄기세포 (nuclear transfer ES cell : ntES 세포), 융합 줄기세포 등이 포함된다. 바람직한 다능성 줄기세포는 iPS 세포 또는 ES 세포이고, 더욱 바람직한 다능성 줄기세포는 iPS 세포이다.
iPS 세포는, 어느 특정한 핵 초기화 물질을, 핵산 또는 단백질의 형태로 체세포에 도입하는 것 또는 약제에 의해 당해 핵 초기화 물질의 내재성의 mRNA 및/또는 단백질의 발현을 상승시키는 것에 의해 제조할 수 있는, ES 세포와 거의 동등한 특성, 예를 들어 분화 다능성과 자기 복제에 의한 증식능을 갖는 체세포 유래의 인공의 줄기세포이다 (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006), Cell, 126 : 663-676, K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131 : 861-872, J. Yu et al. (2007), Science, 318 : 1917-1920, M. Nakagawa et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26 : 101-106). 핵 초기화 물질은, ES 세포에 특이적으로 발현되어 있는 유전자 또는 ES 세포의 미분화 유지에 중요한 역할을 하는 유전자 혹은 그 유전자 산물이면 되고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 Oct3/4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc, N-Myc, TERT, SV40 large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b, Nanog, Esrrb 또는 Esrrg 가 예시된다. 이들 핵 초기화 물질은, iPS 세포 수립시에는, 조합되어 사용되어도 된다. 예를 들어 상기 핵 초기화 물질을 적어도 1 개, 2 개 혹은 3 개 함유하는 조합이고, 바람직하게는 4 개를 함유하는 조합이다.
본 발명의 실시에는 세포주로서 수립된 인간 iPS 세포주를 사용해도 된다. 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 인간 iPS 세포주는 ChiPSC7, ChiPSC11, ChiPSC12, ChiPSC19, ChiPSC20, ChiPSC21, ChiPSC22, ChiPSC23, 201B7, 201B7-Ff, 253G1, 253G4, 1201C1, 1205D1, 1210B2 및 836B3 이고, 더욱 바람직한 인간 iPS 세포주는 ChiPSC12 이다. 상기 서술한 인간 iPS 세포주는 Cellartis 나 iPS 아카데미아 재팬사 또는 교토 대학 iPS 연구소로부터 입수 가능하다.
ES 세포는, 인간이나 마우스 등의 포유 동물의 초기배 (예를 들어 배반포) 의 내부 세포괴로부터 수립된, 분화 다능성과 자기 복제에 의한 증식능을 갖는 줄기세포이다. ES 세포는, 마우스에서 1981년에 발견되었으며 (M. J. Evans and M. H. Kaufman (1981), Nature 292 : 154-156), 그 후, 인간, 원숭이 등의 영장류에서도 ES 세포주가 수립되었다.
ES 세포는, 대상 동물의 수정란의 배반포로부터 내부 세포괴를 취출하고, 내부 세포괴를 선유아세포의 피더 상에서 배양함으로써 수립할 수 있다. 또, 계대 배양에 의한 세포의 유지는, LIF, bFGF 등의 물질을 첨가한 배지를 사용하여 실시할 수 있다. 인간 및 원숭이의 ES 세포의 수립과 유지의 방법에 대해서는, 예를 들어 H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., 345 : 926-932, H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99 : 1580-1585 등에 기재되어 있다. 또, 몇몇의 연구 기관은 ES 세포의 분양을 실시하고 있다. 예를 들어 인간 ES 세포주인 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3 은, 교토 대학 재생 의과학 연구소 (교토, 일본) 로부터 입수 가능하다.
다능성 줄기세포의 배양은, 임의의 방법으로 조제한 다능성 줄기세포를 적절한 배양 용기/배양 기재 중에서, 바람직하게는 접착 배양함으로써 실시된다. 여기서 접착 배양이란, 세포를 배양 용기/배양 기재에 접착한 상태에서 배양하는 것을 가리킨다. 접착 배양에서는, 배양체 (embryoid body : EB) 는 형성되지 않는다. 접착 배양은, 세포가 접착될 수 있는 물질로 코팅된 배양 용기/배양 기재를 사용하여 실시된다. 세포가 접착될 수 있는 물질로는, 예를 들어 각종 세포 외 매트릭스 (콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 엔탁틴, 헤파란황산프로테오글리칸 등), 그 개변물이나 수식물, 폴리리신, 및 그들의 조합을 들 수 있다. 바람직하게는 복수의 세포 외 매트릭스를 함유하는 조성물인 매트리겔 (등록 상표) 이나 신써맥스 (등록 상표) 가 본 발명에 사용된다.
본 공정, 그리고 본 발명에 있어서의 다른 배양 공정에서 사용되는 배양 용기/배양 기재는, 세포의 유지·생존·분화·성숙·자기 복제를 저해하는 것이 아니면 어떠한 소재, 형상의 것도 사용할 수 있다. 배양 용기/배양 기재의 형상에도 한정은 없으며, 플라스크, 플레이트, 디시, 백, 배양조 등 임의의 형상의 것을 사용할 수 있다. 시판되고 있는 각종 배양 용기/배양 기재를 사용해도 된다. 또한, 중공사를 구비한 배양 용기나 비즈와 같은 배양 기재를 이용한 배양을 실시해도 된다.
기초 배지로는, 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, RPMI1640 배지, DEF-CS 배지, Medium199, MCDB131 배지, IMDM, EMEM, αMEM, DMEM, Ham's F12 배지, Fischer's 배지, 및 이들의 혼합 배지 등이 기초 배지로서 사용된다. 또한, 제노 프리 배지나 합성 배지 (Chemically-Defined 배지) 도 사용된다. 다능성 줄기세포의 배양용으로서 판매되고 있는 시판되는 배지, 예를 들어 StemFit (등록 상표), mTeSR1, Essential8 (상표) 등을 사용해도 된다. 바람직하게는 DEF-CS 배지가 기초 배지로서 사용된다. 배지에는, 혈청이 첨가되어 있어도 되고, 혹은 무혈청이어도 된다. 필요에 따라, 예를 들어 알부민, 트랜스페린, 증식 인자, KSR, N2 서플리먼트, B27 서플리먼트, 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 지질, 아미노산, 비타민, 2-메르캅토에탄올, 3'-티올글리세롤, 미량 원소, 항생 물질, 항산화제, 완충제, 무기염류 등이 첨가되어도 된다.
세포가 접착될 수 있는 물질로 코팅된 배양 용기 상에, 예를 들어 0.5 ∼ 20 × 104 세포/㎠, 바람직하게는 1 ∼ 10 × 104 세포/㎠ 로 세포를 파종하고, 적절한 배지 중에서 배양한다. 배양 기간은, 예를 들어 12 시간 이상, 바람직하게는 24 시간 이상, 더욱 바람직하게는 3 일간 이상이 예시되지만, 세포에 따라 적절한 배양 기간을 결정하는 것은 당연하다. 또, 배양 기간 중에 배지 교환이나 계대를 적절히 실시해도 된다.
접착 배양되어 있는 다능성 줄기세포, 그리고 본 발명에 있어서의 다른 세포를 배양 용기로부터 분리하는 방법으로는, 물리적 방법, 킬레이트제를 사용하는 방법, 프로테아제 활성 및/또는 콜라게나아제 활성을 갖는 분리액, 예를 들어 TrypLE (상표) Select, Accutase (등록 상표) 및 Accumax (등록 상표) 등을 사용하는 효소적 방법이나 그들의 조합을 들 수 있다. 바람직하게는, 효소적 방법으로 다능성 줄기세포의 콜로니를 해리시킨 후, 물리적으로 세세하게 세포를 분산시키는 방법이 실시된다. 통상적으로, 사용하고 있는 배양 용기에 대해 80 ％ 컨플루언트가 될 때까지 배양된 다능성 줄기세포가 분리 조작에 제공된다.
(1) 본 발명의 내피세포의 제조 방법
(a) 다능성 줄기세포로부터, 배양체가 형성되지 않고, 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단을 유도하는 공정
본 공정은, 다능성 줄기세포로부터 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단으로의 분화를 유도하는 공정이다. 본 발명의 바람직한 양태에서는 iPS 세포 또는 ES 세포로부터, 특히 바람직한 양태에서는 iPS 세포로부터, 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포의 집단이 유도된다. 본 공정에 있어서는, 바람직하게는 접촉 배양을 실시함으로써, 배양체가 형성되지 않고 상기 세포 집단을 유도할 수 있다.
본 명세서에 있어서「중배엽계 세포 집단」이란, 중배엽 세포 (mesodermal cells) 그 자체 및/또는 중배엽 세포로부터 분화하여 생성되는 세포를 함유하는 세포 집단을 의미한다. 중배엽 세포로부터 분화하여 생성되는 세포로서, 헤만지오블래스트 (hemangioblast), 간엽계 줄기세포 (mesenchymal stem cells), 조혈 줄기세포 (hematopoietic stem cells), 내피 전구세포 (endothelial progenitor cells), 심근 전구세포 (cardiac progenitor cells) 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서「내피 전구세포」란, 내피세포로의 분화의 방향이 정해진 세포를 의미한다. 내피 전구세포는 전사 인자나 세포 표면 항원의 발현 양식을 해석함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, 분화 유도 전에는 검출되지 않거나, 혹은 검출되어도 약간이고, 또한 분화 유도 후에 현저하게 그 발현량이 증가하는 전사 인자나 세포 표면 항원의 발현 상황을 단독으로, 혹은 조합하여 측정한다. 내피 전구세포의 확인에 유효한 마커로서, 예를 들어 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kinase insert domain receptor : KDR), FOXF1, BMP4, MOX1, SDF1 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 내피세포 전구세포는 KDR 을 발현하는 세포이다. KDR 은, 별명으로서, 혈관 내피세포 증식 인자 수용체-2 (vascular endothelial growth factor receptor-2 : VEGFR-2) 나 Flk-1 이라고도 불리는 분자이며, 혈관 신생의 과정에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다.
본 공정 (다능성 줄기세포로부터, 배양체가 형성되지 않고, 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단을 유도하는 공정) 에는 특별히 한정은 없고, 공지된 방법에서 적절한 것을 선택하면 되는데, 본 발명에 바람직한 방법으로서, 액티빈 A 및/또는 골 형성 단백질 4 (bone morphogenetic protein 4 : BMP4) 의 존재하에서 다능성 줄기세포를 배양하여, 중배엽 세포를 얻는 방법이 예시된다. 더욱 바람직하게는,「(i) 액티빈 A 를 함유하는 배지에서의 배양」,「(ii) BMP4 를 함유하는 배지에서의 배양」및「(iii) 혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF) 를 함유하는 배지에서의 배양」의 3 단계의 배양을 순차 실시함으로써 다능성 줄기세포로부터 중배엽 세포를 유도하는 방법이 예시된다. 이하에서는, 이 3 단계의 배양에 대해 상세하게 서술한다.
(i) 액티빈 A 를 함유하는 배지에서의 배양
본 발명의 일 양태로서, 액티빈 A 를 함유하는 배지에서 배양하기 전에, 다능성 줄기세포를 세포 외 매트릭스에 의한 샌드위치법으로 배양해 둠으로써, 중배엽 세포를 효율적으로 유도할 수 있다. 세포 외 매트릭스로서 매트리겔을 사용할 수 있다. 즉, 매트리겔로 코팅된 배양 용기 상에, 예를 들어 1 ∼ 20 × 104 세포/㎠, 바람직하게는 2 ∼ 15 × 104 세포/㎠ 로 다능성 줄기세포를 파종하고, 예를 들어 DEF-CS 배지 중에서 2 ∼ 3 일간 접착 배양한다. 그 후, 예를 들어 1 : 10 ∼ 1 : 300 희석, 바람직하게는 1 : 20 ∼ 1 : 150 희석, 더욱 바람직하게는 1 : 40 ∼ 1 : 80 희석의 매트리겔이 첨가된 배지로 교환하고, 추가로 16 ∼ 24 시간 배양함으로써, 다능성 줄기세포 전체를 매트리겔로 덮는다. 이와 같이 하여 얻어진 매트리겔 피복 다능성 줄기세포의 배지를, 액티빈 A 를 함유하는 배지로 교환한다.
배지에 첨가되는 액티빈 A 의 농도는, 예를 들어 10 ∼ 1000 ng/㎖, 바람직하게는 25 ∼ 500 ng/㎖, 더욱 바람직하게는 50 ∼ 200 ng/㎖ 이다. 또, 본 발명이 발휘하는 효과를 저해하지 않는 범위에서 배지에 다른 성장 인자 등이 첨가되어도 되는데, 바람직하게는 본 배양은 BMP4 및 VEGF 의 비존재하에서 실시된다.
기초 배지로는, 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, RPMI1640 배지, DEF-CS 배지, Medium199, MCDB131 배지, IMDM, EMEM, αMEM, DMEM, Ham's F12 배지, Fischer's 배지, 및 이들의 혼합 배지 등이 기초 배지로서 사용된다. 다능성 줄기세포의 배양용으로서 판매되고 있는 시판되는 배지를 사용해도 된다. 바람직하게는 RPMI1640 배지가 기초 배지로서 사용된다. 배지에는, 혈청이 첨가되어 있어도 되고, 혹은 무혈청이어도 된다. 필요에 따라, 예를 들어 알부민, 트랜스페린, 증식 인자, KSR, N2 서플리먼트, B27 서플리먼트, 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 지질, 아미노산, 비타민, 2-메르캅토에탄올, 3'-티올글리세롤, 미량 원소, 항생 물질, 항산화제, 완충제, 무기염류 등이 첨가되어도 된다.
바람직한 배지로서, L-글루타민, B27 서플리먼트 및 액티빈 A 가 첨가된 RPMI1640 배지가 예시된다. 또한, 상기 배지, 그리고 본 발명에 있어서의 다른 배지에 첨가되는 L-글루타민 대신에, L-알라닐-L-글루타민디펩티드 또는 GlutaMAX (상표) 를 첨가할 수 있다. GlutaMAX (상표) 는, L-알라닐-L-글루타민디펩티드를 함유한다. 안정적인 구조를 갖는 L-알라닐-L-글루타민디펩티드는, 보존 중이나 배양 중에 L-글루타민과 같이 분해하여 독성 암모니아가 되는 경우는 없기 때문에, 세포의 배양에 적합하다.
다능성 줄기세포는, 상기의 배지 중에서 접착 배양에 제공된다. 배양 온도는, 이하에 한정되지 않지만, 예를 들어 30 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 37 ℃ 이고, CO2 함유 공기의 분위기하에서 배양이 실시되고, CO2 농도는, 바람직하게는 2 ∼ 8 ％ 이다. 배양 시간은, 예를 들어 6 시간 ∼ 5 일간이고, 바람직하게는 12 ∼ 48 시간이다.
(ii) BMP4 를 함유하는 배지에서의 배양
액티빈 A 를 함유하는 배지에서 배양된 다능성 줄기세포는, 계속해서 BMP4 를 함유하는 배지에서의 배양에 제공된다. 본 배양은, 상기 (i) 의 배양과 동일한 방법으로 실시해도 되고, 상기 배양과는 상이한 방법으로 실시해도 된다. 바람직하게는 세포 외 매트릭스를 사용하는 접착 배양, 예를 들어 매트리겔을 사용하는 접착 배양이 실시된다. 상기 배양과 동일한 방법으로 배양을 실시하는 경우, 배지를 교환한 후, 동일한 용기에서의 배양을 계속해도 된다.
배지에 첨가되는 BMP4 의 농도는, 예를 들어 0.5 ∼ 200 ng/㎖, 바람직하게는 1 ∼ 100 ng/㎖, 보다 바람직하게는 2 ∼ 50 ng/㎖ 이다.
본 발명의 바람직한 양태에서는, 배지에는 염기성 선유아세포 증식 인자 (basic fibroblast growth factor : bFGF) 가 추가로 첨가된다. 본 양태에서 사용되는 배지에 첨가되는 bFGF 의 농도는, 예를 들어 0.5 ∼ 200 ng/㎖, 바람직하게는 1 ∼ 100 ng/㎖, 보다 바람직하게는 2 ∼ 50 ng/㎖ 이다. 또한, 본 발명이 발휘하는 효과를 저해하지 않는 범위에서 배지에 다른 성장 인자 등이 첨가되어도 되는데, 바람직하게는 본 배양은 액티빈 A 및 VEGF 의 비존재하에서 실시된다.
본 배양에서 사용하는 배지도, 상기한 것과 동일한 기초 배지 그리고 각종 성분을 적절히 조합하여 조제할 수 있다. 바람직한 배지로서, L-글루타민, B27 서플리먼트, bFGF 및 BMP4 가 첨가된 RPMI1640 배지가 예시된다.
배양 온도는, 이하에 한정되지 않지만, 예를 들어 30 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 37 ℃ 이고, CO2 함유 공기의 분위기하에서 배양이 실시되고, CO2 농도는, 바람직하게는 2 ∼ 8 ％ 이다. 배양 시간은, 예를 들어 12 시간 ∼ 5 일간이고, 바람직하게는 2 ∼ 4 일간이다.
(iii) VEGF 를 함유하는 배지에서의 배양
상기 (ii) 의 배양 후, 세포는 VEGF 를 함유하는 배지에서의 배양에 제공된다. 본 배양도, 상기 (i), (ii) 의 배양과 동일하게 실시하면 된다. 바람직하게는 세포 외 매트릭스를 사용한 접착 배양이 실시된다.
본 배양에 사용되는 배지에 있어서의 VEGF 의 농도는, 예를 들어 10 ∼ 2000 ng/㎖, 바람직하게는 50 ∼ 500 ng/㎖ 이다. 또한, 본 발명이 발휘하는 효과를 저해하지 않는 범위에서 배지에 다른 성장 인자 등이 첨가되어도 되는데, 바람직하게는 본 배양은 액티빈 A 및 BMP4 의 비존재하에서 실시된다.
본 배양에서 사용하는 배지도, 상기한 것과 동일한 기초 배지 그리고 각종 성분을 적절히 조합하여 조제할 수 있다. 바람직한 배지로서, L-글루타민, B27 서플리먼트 및 VEGF 가 첨가된 RPMI1640 배지가 예시된다.
배양 온도는, 이하에 한정되지 않지만, 예를 들어 30 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 37 ℃ 이고, CO2 함유 공기의 분위기하에서 배양이 실시되고, CO2 농도는, 바람직하게는 2 ∼ 8 ％ 이다. 배양 시간은, 예를 들어 6 시간 ∼ 5 일간이고, 바람직하게는 12 ∼ 48 시간이다.
본 배양에 의해, 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단이 얻어진다. 여기서, 내피 전구세포의 비율 (KDR 양성률) 은 전체 세포수의 예를 들어 40 ％ 이상, 바람직하게는 50 ％ 이상, 보다 바람직하게는 60 ％ 이상이다.
(a') 중배엽계 세포 집단으로부터 내피 전구세포를 단리하는 공정
본 공정은, 상기의 공정에서 얻어진 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단으로부터, 내피 전구세포를 단리하는 공정이다. 또한, 상기의 공정에서 얻어진 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단에 있어서, 내피 전구세포의 비율 (KDR 양성률) 이 이미 충분히 높은 경우에는, 본 공정를 실시하지 않는 것도 가능하다. 본 공정 (a') 는, 공정 (a) 후에 실시되는 것이 바람직하다.
본 공정에 있어서의 내피 전구세포의 단리는, 예를 들어 형광 활성화 셀 소터 (fluorescence-activated cell sorting : FACS) 또는 자기 세포 분리 장치 (magnetic-activated cell sorting : MACS) 등을 사용하여, 상기의 내피 전구세포 마커를 발현하는 세포를 선택적으로 포착하고, 이어서 포착된 세포를 회수함으로써 실시된다. 상기의 분리 수단에서는, 내피 전구세포 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것이 유리하다. 따라서, 예를 들어 내피 전구세포 표면에 발현되어 있는 KDR 이나 그 밖의 마커에 결합하는 항체 또는 그 단편이 본 발명에 이용된다.
구체적으로는, 내피 전구세포를 함유하는 세포 집단에, 적절한 표지를 붙인, 내피 전구세포 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 항 KDR 항체를 접촉시킨다. 그 후, 표지된 세포를 모음으로써, 내피 전구세포의 단리가 달성된다. 예를 들어 형광으로 표지된 항체와 접촉시킨 세포 집단을 FACS 에 의한 분리에 제공함으로써, 항체가 결합한 세포를 단리할 수 있다. 또, 자성 물질로 표지된 항체를 사용하는 경우에는, MACS 등을 이용할 수 있다. 또한, 상기 항체에 붙여진 표지 혹은 상기 항체 자체와 특이적으로 결합하는 다른 항체 (2 차 항체) 를 조합해도 된다. 이 경우, 세포의 분리는 2 차 항체에 부가된 표지를 이용하여 실시된다. 상기의 항 KDR 항체나 2 차 항체는 시판되는 항체를 사용할 수 있다. 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어「PE 형광 라벨을 결합한 항 KDR 항체」와「항 PE 항체를 포매한 자기 비즈」를 사용할 수 있다.
단리된 내피 전구세포의 비율 (KDR 양성률) 은 예를 들어 70 ％ 이상, 바람직하게는 80 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상이다.
단리된 내피 전구세포를 직접 내피세포로 분화시킬 수도 있고, 일단 내피 전구세포의 분화 상태를 유지한 채로 유지 배양하고 나서, 내피세포로 분화시킬 수도 있다.
내피 전구세포의 분화 상태를 유지한 채로 유지 배양하는 경우에는, 상기 공정에 있어서의 배양과 동일하게 실시하면 된다. 즉, 바람직하게는 매트리겔 등의 세포 외 매트릭스를 사용한 접착 배양에 의해 실시된다. 본 유지 배양에서 사용하는 배지도, 상기한 것과 동일한 기초 배지 그리고 각종 성분을 적절히 조합하여 조제할 수 있다. 내피세포의 배양용으로서 판매되고 있는 시판되는 배지, 예를 들어 내피세포 증식 배지 등을 사용해도 된다. 바람직한 배지로서, L-글루타민, B27 서플리먼트 및 VEGF 가 첨가된 RPMI1640 배지가 예시된다. 배지는 추가로, 페니실린이나 스트렙토마이신 등의 항생 물질이나 ROCK 저해제를 함유하고 있어도 된다. ROCK 저해제는 Rho 키나아제 (ROCK) 의 기능을 억제할 수 있는 것이면 특별히 한정은 되지 않지만, 예를 들어 Y-27632 가 예시된다. Y-27632 의 농도는, 예를 들어 1 ∼ 500 μM, 바람직하게는 3 ∼ 200 μM, 더욱 바람직하게는 10 ∼ 50 μM 이다. 또한, 본 발명이 발휘하는 효과를 저해하지 않는 범위에서 배지에 다른 성장 인자 등이 첨가되어도 되는데, 바람직하게는 본 유지 배양은 하기에서 상세하게 서술되는 RepSox 의 비존재하에서 실시된다.
본 유지 배양의 배양 시간은, 예를 들어 24 시간 이상, 바람직하게는 2 일간 이상, 보다 바람직하게는 3 일간 이상이 예시되지만, 세포의 상태나 배양 조건 등에 따라 적절한 배양 시간을 결정하는 것은 당연하다. 또, 배양 기간 중에 배지 교환이나 계대를 적절히 실시해도 된다.
본 유지 배양의 공정에서는, 통상적으로, 내피 전구세포수의 현저한 증감은 없다. 또, 이 유지 배양에 의해 내피 전구세포의 비율 (KDR 양성률) 은 거의 저하되지 않는다. 예를 들어, 3 일간 유지 배양을 실시한 후, 내피 전구세포의 비율 (KDR 양성률) 은 70 ％ 이상, 바람직하게는 80 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상이다.
(b) 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단을 RepSox 의 존재하에서 배양하는 공정
본 공정은, 상기의 공정에서 얻어진 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단을 RepSox 의 존재하에서 배양하는 공정이다. 공정 (a') 를 실시한 경우, 본 공정에서는 내피 전구세포를 RepSox 의 존재하에서 배양하게 된다.
상기 공정에서 얻어진 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단 또는 내피 전구세포는, 계속해서 RepSox 를 함유하는 배지에서의 배양에 제공된다. 본 배양 공정은, 상기 공정에 있어서의 배양과 동일한 방법으로 실시해도 되고, 상기 공정에 있어서의 배양과는 상이한 방법으로 실시해도 된다. 바람직하게는 세포 외 매트릭스를 사용하는 접착 배양이 실시된다. 상기 공정에 있어서의 배양과 동일한 방법으로 배양을 실시하는 경우, 배지를 교환한 후, 동일한 용기에서의 배양을 계속해도 된다. 매트리겔로 코팅된 배양 용기를 사용하는 경우, 예를 들어 0.5 ∼ 10 × 104 세포/㎠, 바람직하게는 1 ∼ 5 × 104 세포/㎠ 로 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단 또는 내피 전구세포를 파종하고, RepSox 를 함유하는 배지에서 배양한다. 본 공정에 있어서 RepSox 를 사용함으로써 내피 전구세포로부터 내피세포에 처음으로 분화시키므로, 본 공정 (b) 에 앞서, 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단 또는 단리된 내피 전구세포의 RepSox 를 함유하지 않는 배지에서 배양을 실시하는 것이 바람직하다.
RepSox (CAS No.446859-33-2) 는, 별명으로서, E-616452, SJN2511, Alk5 Inhibitor II, TGF-βRI Kinase Inhibitor II 등이라고도 불리는 저분자 화합물이다. RepSox 는, TGF-β 수용체 중 하나인 ALK5 의 강력한 선택적 저해제로, ALK5 를 저해함으로써 TGF-β 의 기능을 억제한다. RepSox 는 TGF-β 저해제 중 하나이다. 여기서, 트랜스포밍 증식 인자 (transforming growth factor : TGF)-β 는 자연에 존재하는 많은 특색 있는 증식 인자 중 하나이며, 조직 발생, 세포 분화, 배 (胚) 육성 등에 있어 중요한 역할을 한다.
SB431542 (CAS No.301836-41-9) 는, TGF-β 수용체인 ALK4, ALK5 및 ALK7 을 저해하는 저분자 화합물이다. SB431542 는, 상기의 수용체군을 저해함으로써, TGF-β 의 기능을 억제한다. SB431542 는 TGF-β 저해제 중 하나이다.
본 공정에서 사용되는 RepSox 의 농도는, 내피세포를 고효율로 유도하는 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 본 공정에 사용되는 배지에 첨가되는 RepSox 의 농도는, 예를 들어 0.5 ∼ 100 μM, 바람직하게는 1 ∼ 50 μM, 보다 바람직하게는 3 ∼ 30 μM 이다.
본 공정에서 사용하는 배지도, 상기한 것과 동일한 기초 배지 그리고 각종 성분을 적절히 조합하여 조제할 수 있다. 바람직한 배지로서, RepSox 가 첨가된 내피세포 증식 배지가 예시된다.
RepSox 의 존재하에서의 배양 시간은, 예를 들어 24 시간 ∼ 14 일간, 바람직하게는 2 ∼ 7 일간이 예시되지만, RepSox 의 농도에 따라 적절한 배양 시간을 결정하는 것은 당연하다. 또, 배양 시간 중에 RepSox 의 농도를 적절히 변경해도 된다.
내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단 또는 내피 전구세포를 RepSox 의 존재하에서 배양함으로써, 내피 전구세포의 증식을 촉진시킬 수 있으며, 결과적으로, 내피세포 마커를 발현하는 내피세포를 많이 얻을 수 있다. 또, 본 공정에 의해 얻어진 내피세포는, 얻어지는 세포수가 많은, 고순도인 (내피세포 마커의 양성률이 높은), 분화 단계가 갖추어져 있는, 세포 증식능이 우수한 (예를 들어, 유약한), 동결 융해에 의한 데미지를 받기 어려운, 로트간 차가 작은 등의 특징을 1 개 이상 갖는다.
본 명세서에 있어서「내피세포」란, PE-CAM (CD31), VE-cadherin (CD144), 엔도글린 (CD105) 및 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand factor : vWF) 등의 내피세포 마커 중, 적어도 하나를 발현하고 있는 세포를 의미한다. 여기서, CD31 을 발현하는 세포가 바람직하고, CD31 및 CD144 의 양방을 발현하는 세포가 보다 바람직하다. 특히 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 본 발명에 의해 얻어진 내피세포는, 예를 들어 70 ％ 이상, 바람직하게는 80 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상의 비율로 CD31 양성 세포를 함유한다.
내피세포는, 그 분화 단계에 따라, 더욱 세세하게 분류할 수 있다. 내피세포 중에서도 보다 미분화인 것은「유약 내피세포」라고 불리고, 보다 분화가 진행된 것은「성숙 내피세포」라고 불린다. 내피세포의 분화 단계는, 전사 인자나 세포 표면 항원의 발현 양식을 해석함으로써 확인할 수 있다. 즉, 내피세포의 분화의 진행에 따라 현저하게 그 발현량이 변화하는 전사 인자나 세포 표면 항원의 발현 상황을 단독으로, 혹은 조합하여 측정한다. 내피세포의 분화 단계의 확인에 유효한 마커로서, 예를 들어, 상기 내피세포 마커 (CD31, CD144, CD105, vWF) 와 CD34 를 들 수 있다. CD34 는 조혈 줄기세포나 내피 전구세포의 마커이다. 또, CD34 는 유약 내피세포에도 발현하고 있다. 특별히 한정되지 않지만, CD31 및 CD34 의 양방을 발현하는 세포 (이하, CD31+/CD34+ 세포) 는, 유약 내피세포의 일례이다. 특별히 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 본 발명에 의해 얻어진 내피세포는 유약 내피세포를 많이 함유하며, 예를 들어 70 ％ 이상, 바람직하게는 80 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상의 비율로 CD31+/CD34+ 세포를 함유한다.
본 발명의 내피세포의 제조 방법에 의해, 혈관 내피세포나 림프관 내피세포 또는 각막 내피세포 등, 여러 가지 내피세포를 제조할 수 있다.
내피세포의 배양을 계속함으로써, 보다 많은 내피세포를 얻을 수 있다. 이 공정에서 사용하는 배지에는, 기초 배지 그리고 각종 성분을 적절히 조합하여 조제한 배지를 사용하면 되는데, 바람직하게는 본 공정은 RepSox 의 비존재하에서 실시된다. 내피세포의 배양용으로서 판매되고 있는 시판되는 배지, 예를 들어 내피세포 증식 배지 등을 사용해도 된다. 예를 들어 내피세포 증식 배지를 사용하고, 1 ∼ 3 일마다의 배지 교환 및 계대를 실시하면서 배양을 계속함으로써, 내피세포를 제조할 수 있다. 이렇게 하여 제조된 내피세포는, 장기에 걸쳐 내피세포의 특성을 유지할 수 있다.
또, 본 공정 (b) 에서 내피세포 마커의 큰 저하는 보이지 않는다. 특별히 한정되지 않지만, 내피세포는, 예를 들어 분화 유도 개시 후 30 일째라도 60 ％ 를 초과하는 CD31 양성률, 바람직하게는 80 ％ 를 초과하는 CD31 양성률을 유지할 수 있다.
(c) 내피세포를 동결하는 공정
본 공정은, 공정 (b) 후에 실시되는 공정이며, 상기의 일련의 공정에서 얻어진 내피세포를 동결하는 공정이다. 내피세포의 동결은, 내피세포를 동결 보호제가 함유되는 용액에 현탁하고, 이 현탁액을 적절한 보존 용기에 나누어 주입하고, 적절한 방법으로 동결함으로써 실시된다.
내피세포를 동결하는 공정에서 사용되는 동결 보호제는, 세포의 유지·생존·분화·성숙·자기 복제를 저해하는 것이 아니면 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들어, 글리세린, 에틸렌글리콜, 디메틸술폭시드, 자당, 글루코오스, 폴리비닐피롤리돈, 트레할로오스 등을 사용할 수 있다. 시판되고 있는 각종 동결 보호제를 사용해도 된다. 예를 들어 스템 셀 뱅커 (등록 상표 : 니폰 전약 공업 제조), 바람직하게는 셀 뱅커 (등록 상표 : 닛폰 전약 공업 제조) 가 동결 보호제로서 사용된다. 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 셀 뱅커에, 0.5 ∼ 10 × 106/㎖, 바람직하게는 1 ∼ 5 × 106/㎖ 의 농도가 되도록 내피세포를 현탁하고, 이 현탁액을 보존 용기에 나누어 주입한다.
보존 용기는, 세포의 유지·생존·분화·성숙·자기 복제를 저해하는 것이 아니면 어떠한 소재, 형상의 것도 사용할 수 있다. 보존 용기의 형상에도 한정은 없으며, 바이알, 플라스크, 백 등 임의의 형상의 것을 사용할 수 있다. 시판되고 있는 각종 보존 용기를 사용해도 된다. 예를 들어 바이알이 보존 용기로서 사용된다.
동결 방법은, 세포의 유지·생존·분화·성숙·자기 복제를 저해하는 것이 아니면 어떠한 방법으로도 실시된다. 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 완속 동결 (slow freezing) 이 실시된다. 프로그램 프리저를 사용하여 완속 동결할 수도 있고, 바이셀 등의 동결 처리 용기를 사용하여 완속 동결할 수도 있다.
동결된 내피세포는, 액체 질소 또는 －80 ℃ 의 딥 프리저 등 중에서 보존하면 된다. 액체 질소 중에서 보존한 경우, 내피세포는, 예를 들어 24 시간 이상, 바람직하게는 3 일 이상, 보다 바람직하게는 2 주간 이상 보존 가능하다.
동결된 내피세포의 융해 방법은, 세포의 유지·생존·분화·성숙·자기 복제를 저해하는 것이 아니면 어떠한 방법으로도 실시된다. 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 37 ℃ 로 가온한 워터 배스를 사용하여 2 분 ∼ 3 분 가온하여, 세포를 해동한다. 융해된 내피세포의 생존률은 60 ％ 이상, 바람직하게는 70 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 80 ％ 이상이다.
융해된 내피세포의 배양은, 본 발명에 있어서의 다른 세포의 배양과 동일하게 실시하면 된다. 즉, 바람직하게는 세포 외 매트릭스를 사용한 접착 배양에 의해 실시된다. 본 배양에서 사용하는 배지도, 상기한 것과 동일한 기초 배지 그리고 각종 성분을 적절히 조합하여 조제할 수 있다. 바람직한 배지로서, 내피세포 증식 배지가 예시된다. 배양 시간은, 예를 들어 24 시간 이상, 바람직하게는 3 일간 이상, 보다 바람직하게는 7 일간 이상이 예시되지만, 필요 세포량에 따라 적절한 배양 시간을 결정하는 것은 당연하다. 또, 배양 기간 중에 배지 교환이나 계대를 적절히 실시해도 된다. 예를 들어, 7 일간 배양을 실시한 경우, 내피 전구세포는 예를 들어 1.1 배 이상, 바람직하게는 1.3 배 이상, 더욱 바람직하게는 1.5 배 이상으로 증가한다. 또, 배양에 의해 내피세포의 비율 (CD31 양성률) 은 거의 저하되지 않는다. 예를 들어, 7 일간 배양을 실시한 후, 내피세포의 비율 (CD31 양성률) 은 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 95 ％ 이상이다.
(2) 본 발명의 심근 시트의 제조 방법
상기의, 본 발명에 의해 얻어지는 내피세포는, 내피세포를 구성 요소로서 함유하는 심근 시트의 제조에 사용할 수 있다. 예를 들어, 일본 공개특허공보 2012-210156호에는, Flk/KDR 양성 세포와 심근세포, 내피세포 및 벽세포를 혼합하여 시트를 형성시키는, 심근 시트의 제조 방법이 기재되어 있다. 본 발명을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 본 발명에서 제조된 내피세포를 사용하여, 일본 공개특허공보 2012-210156호에 기재된 방법으로 심근 시트를 제조할 수 있다.
본 명세서에 있어서「심근 시트」란, 심장 또는 혈관을 형성하는 각종 세포로 이루어지고, 세포간 결합에 의해 세포끼리가 연결된 시트상의 세포 집합체이다. 여기서, 심장 또는 혈관을 형성하는 각종 세포란 심근세포, 내피세포 및 벽세포가 예시된다. 이하, 일본 공개특허공보 2012-210156호에 기재된 방법으로 심근 시트를 제조하는 방법에 대해 설명한다.
＜심근세포를 제조하는 공정＞
본 공정은, 다능성 줄기세포로부터 심근세포를 제조하는 공정이며, 공지된 방법에 의해 달성된다. 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 다능성 줄기세포를 WO2012/133954호에 기재된 방법으로 배양함으로써, 심근세포를 얻을 수 있다.
＜FLK 양성 세포 및 벽세포를 제조하는 공정＞
FLK 양성 세포는, 다능성 줄기세포를 임의의 방법, 예를 들어 Yamashita et al. (2000), Nature, 408 : 92-96 에 기재된 방법으로 배양함으로써 얻을 수 있다. 또, 동 문헌의 기재에 기초하여 FLK 양성 세포를 배양함으로써, 내피세포 및 벽세포의 혼합 세포를 얻을 수 있다. 또한, 벽세포 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여, 벽세포를 단리할 수 있다. 여기서, 벽세포란, 혈관 벽세포 (혈관 내피세포를 외측으로부터 둘러싸는 세포) 와 동등한 성질을 나타내는 세포 또는 그 전구세포를 의미한다.
＜심근 시트를 제조하는 공정＞
온도 감수성 배양 용기 (예를 들어 셀 시드사 제조의 UpCell 등) 상에서 FLK 양성 세포를 배양한다. 1 ∼ 7 일간 배양한 후, 예를 들어 3 일 후에, 본 발명의 방법으로 조제된 내피세포 및 벽세포의 혼합 세포, 심근세포의 적당량을 배양 용기에 첨가한다. 이 세포 혼합물을, 혈관 내피세포 증식 인자 (vascular endothelial growth factor : VEGF) 를 함유하는 배지 중에서 1 ∼ 10 일, 예를 들어 4 일간 배양함으로써, 시트상의 세포 구조물이 생성된다. 이렇게 하여 형성된 심근 시트는, 배양 용기를 실온에 둠으로써 배양 용기로부터 박리시키고, 회수할 수 있다. 또한, 원하는 바에 따라 제조된 심근 시트는 적층화된다.
이와 같이 하여 제조된 심근 시트는 심질환, 예를 들어 심부전, 심근경색, 허혈성 심질환, 심근염, 각종 심근증의 치료나, 그 밖의 용도에 사용할 수 있다. 예를 들어, 심근경색과 같은 심질환에 관해서는, 심장의 원하는 부위를 덮도록 하여 심근 시트를 배치하여, 치료가 실시된다. 심근 시트는 심장 조직에 생착되어, 심장의 기능 회복을 촉진시킨다.
본 발명에 의해, 내피세포의 제조 방법, 심근 시트의 제조 방법 외에, 당해 제조 방법으로 제조한 내피세포 및 당해 제조 방법으로 제조한 심근 시트도 제공된다.
(3) 본 발명의 세포 조성물
본 발명의 세포 조성물은, 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kinase insert domain receptor : KDR) 양성의 내피 전구세포와, RepSox 를 함유하고, 인·비트로에서의 내피세포의 제조에 사용된다.
본 발명의 세포 조성물에 함유되는 KDR 양성의 내피 전구세포는, 공지된 방법에 의해 다능성 줄기세포를 분화시켜 조제할 수 있다. 예를 들어, ES 세포, iPS 세포와 같은 다능성 줄기세포를 재료로 하고, 상기 본 발명의 내피세포의 제조 방법 중 공정 (a) 를 실시함으로써, 혹은 공정 (a) 및 공정 (b) 를 실시함으로써 얻을 수 있다. 필요에 따라 추가로 상기 공정 (a') 를 실시해도 된다. 여기서, 당해 세포 조성물에 함유되는 KDR 양성의 내피 전구세포의 함유량에는 특별히 한정은 없고, 예를 들어 70 ％ 이상, 바람직하게는 80 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상의 세포가 KDR 양성이다.
상기 세포 조성물에 함유되는 RepSox 의 농도는, 내피세포를 고효율로 유도하는 등의 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. RepSox 의 농도는, 예를 들어 0.5 ∼ 100 μM, 바람직하게는 1 ∼ 50 μM, 보다 바람직하게는 3 ∼ 30 μM 이다.
상기 세포 조성물은, 본 발명에 있어서의 다른 공정에서 사용한 것과 동일한 기초 배지 그리고 각종 성분을 적절히 조합하여 조제한 배지를 함유할 수 있다. 바람직한 배지로서, RepSox 가 첨가된 내피세포 증식 배지가 예시된다.
상기 세포 조성물을, 예를 들어 24 시간 ∼ 14 일간, 바람직하게는 2 ∼ 7 일간 배양함으로써, 내피 전구세포로부터 내피세포로의 분화가 유도되고, 내피세포 마커를 발현하는 내피세포를 얻을 수 있다. 사용하는 RepSox 의 농도에 따라 적절한 배양 시간을 결정하는 것은 당연하다.
실시예
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 의해 한정되지 않는 것으로 한다.
실시예 1 iPS 세포로부터 혈관 내피세포로의 분화
인간 iPS 세포 (ChiPSC12 주) (Cellartis) 를 DEF-CS 배지 (Cellartis) 중에서, 당해 배지에 부속된 설명서에 따라 배양하였다.
효율적으로 중배엽 세포를 분화 유도하기 위해, 이하의 순서로, iPS 세포를 매트리겔로 덮었다 (매트리겔 샌드위치법). 먼저, 계대 배양한 iPS 세포에 TrypLE (상표) Select (Life technologies) 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 3 ∼ 7 분간 인큐베이트하였다. 박리된 세포를, 피펫팅에 의해 단일 세포 (single cell) 로 하고 나서 회수하여 세포수를 카운트하였다. 다음으로, 매트리겔 (상표) (Corning) 로 코팅된 배양 용기 상에 6 × 104 세포/㎠ 로 세포를 파종하고, DEF-CS 배지 중에서 2 ∼ 3 일간 배양하였다. 그 후, 1 : 60 희석의 매트리겔이 첨가된 DEF-CS 배지로 교환하고, 추가로 16 ∼ 24 시간 배양함으로써, 매트리겔로 세포 상층을 덮었다.
얻어진 매트리겔 피복 iPS 세포를, 이하의 순서로 중배엽 세포로 분화시켰다. 먼저, 매트리겔 피복 iPS 세포의 배지를, 100 ng/㎖ 액티빈 A (R＆D), 2 mM GlutaMAX (상표) (Thermo Fisher Scientific) 및 B27 서플리먼트 (인슐린 불포함) (Gibco) 가 첨가된 RPMI1640 배지 (Gibco) 로 교환하고 (이 시점을 분화 유도 개시 ＝ Day 0 으로 한다), 24 시간 배양하였다 (Day 1). 다음으로, 10 ng/㎖ 인간 골 형성 단백질 4 (human bone morphogenetic protein 4 : hBMP4) (R＆D), 10 ng/㎖ 인간 염기성 선유아세포 증식 인자 (human basic fibroblast growth factor : hbFGF) (Peprotech), 2 mM GlutaMAX 및 B27 서플리먼트가 첨가된 RPMI1640 배지로 교환하고, 3 일간 배양하였다 (Day 4). 그 후, 100 ng/㎖ 혈관 내피세포 증식 인자 (vascular endothelial growth factor : VEGF) (Peprotech), 2 mM GlutaMAX 및 B27 서플리먼트가 첨가된 RPMI1640 배지로 배지 교환하고, 하룻밤 배양을 실시하였다 (Day 5). 또한, 배양물의 광학 현미경 관찰을 실시한 결과, Day 0 ∼ Day 5 를 통하여 배양체의 형성은 확인할 수 없었다.
Day 5 의 배양물로부터 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kinase insert domain receptor : KDR) 양성 세포를 자기 세포 분리 장치 [MACS (등록 상표), Miltenyi biotech] 를 사용하여 분리함으로써, 혈관 내피 전구세포를 단리하였다. KDR 양성 세포를 분리함에 있어서는, PE 형광 라벨을 결합한 항 KDR 항체 (Miltenyi biotech) 를 1 차 항체로 하여 세포의 표지에 사용하고, 항 PE 항체를 포매한 자기 비즈 (Miltenyi biotech) 에 의해 1 차 항체로 표지된 세포를 회수하였다. MACS 로 분리된 세포 중에 존재하는 KDR 양성 세포의 비율을 플로 사이토메트리로 측정한 결과, KDR 양성률은 89 ∼ 99 ％ 였다. 얻어진 세포를, 매트리겔로 코팅된 배양 용기에 2.7 × 104 세포/㎠ 로 파종하고, B27 서플리먼트, 50 유닛/㎖ 페니실린, 50 μg/㎖ 스트렙토마이신, 2 mM GlutaMAX, 20 μM Y-27632 및 100 ng/㎖ VEGF 가 첨가된 RPMI1640 배지 중에서 16 ∼ 24 시간 배양하였다 (Day 6). 또한, Day 6 의 배지를, B27 서플리먼트, 50 유닛/㎖ 페니실린, 50 μg/㎖ 스트렙토마이신, 2 mM GlutaMAX 및 100 ng/㎖ VEGF 가 첨가된 RPMI1640 배지로 교환하고, 2 일간 배양하였다 (Day 8).
Day 8 에 세포를 회수하고, 표 1 에 나타내는 농도의 RepSox 가 첨가된 내피세포 증식 배지 (Promocell) 에서 현탁한 후, 2 × 104 세포/㎠ 로 배양 용기에 파종하고, 3 일간 배양하였다 (Day 11). 여기서, 음성 대조로서, 다른 TGF-β 저해제인 SB431542 를 사용하였다.
Day 11 에 세포를 회수하여 세포수를 카운트하였다. 세포를 TGF-β 저해제를 함유하지 않는 배지, 즉 내피세포 증식 배지에서 현탁한 후, 2 × 104 세포/㎠ 로 배양 용기에 파종하였다. 1 ∼ 3 일마다 배지 교환을 실시하고, Day 19 에 세포를 회수하여 세포수를 카운트함과 함께, 그 일부를 사용하여 내피세포 마커인 CD31 양성 세포율을 플로 사이토메트리로 측정하였다. 남은 세포는 내피세포 증식 배지 (TGF-β 저해제를 함유하지 않는다) 에서 현탁한 후, 1 × 104 세포/㎠ 로 배양 용기에 파종하였다. 1 ∼ 3 일마다 배지 교환을 실시하고, Day 30 에 세포를 회수하여 세포수를 카운트함과 함께, CD31 양성 세포율을 플로 사이토메트리로 측정하였다.
Day 8 의 세포수를 1 로 하였을 때의, Day 19 및 Day 30 에 있어서의 세포수를 표 1 에 나타낸다. 또, Day 19 및 Day 30 에 있어서의, CD31 양성 세포의 비율을 표 2 에 나타낸다.
Figure 112019063971459-pct00001
Figure 112019063971459-pct00002
사용한 TGF-β 저해제의 종류에 상관없이, Day 19 에서는 CD31 양성률이 97 ％ 를 상회하고 있어, 본 발명의 방법에 의해 고순도의 혈관 내피세포가 얻어지는 것이 나타났다. SB431542 를 사용한 경우, 10 μM SB431542 에서는 Day 30 에 있어서의 세포 증식률이 0.9 였다. 또, 20 μM SB431542 에서는 Day 30 에 있어서의 세포 증식률은 5.1 이었지만, CD31 양성률이 33.0 ％ 였다. 한편, TGF-β 저해제로서 RepSox 를 사용한 경우, 3 μM RepSox 를 함유하는, 어느 배지에 있어서도, Day 30 에 있어서의 세포 증식률은 2.5 이상이고, CD31 양성률은 87 ％ 이상이었다. 이러한 결과는, 혈관 내피세포의 분화 유도에 있어서, SB431542 와 비교하여, RepSox 가 세포 증식률 및 순도의 양방을 높은 레벨로 만족할 수 있는 것을 나타내고, 따라서 RepSox 가 보다 유용한 것을 나타낸다. 또한, TGF-β 저해제를 첨가하지 않은 배지에서는, Day 11 에 충분한 세포량이 얻어지지 않았기 때문에, 계대하지 않았다.
실시예 2 혈관 내피세포의 동결 융해
실시예 1 에 기재된, 20 μM RepSox 가 첨가된 배지를 사용하는 방법으로 혈관 내피세포의 유도를 실시하고, Day 18 ∼ 22 에 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 세정 후, Stem Cell Banker (타카라 바이오) 에 3 × 106/㎖ 의 세포 농도가 되도록 현탁하고, 이 현탁액 1 ㎖ 씩을 바이알에 나누어 주입하였다. 바이알을 동결 처리 용기 (바이셀, 니혼 프리저) 에 넣고, －80 ℃ 의 보냉고에서 세포의 완속 동결을 실시하였다. 그 후, 각 바이알을 액체 질소에 옮기고, 3 일간 보존하였다.
동결 세포를 37 ℃ 로 가온한 워터 배스를 사용하여 2 분 30 초 가온하고, 세포를 해동하였다. 일부의 세포를 사용하여 세포 생존률을 측정한 결과, 세포 생존률은 87 ％ 였다. 미리 8 ㎖ 의 내피세포 증식 배지를 나누어 주입한 튜브에 나머지 세포 전체량을 첨가하였다. 그 후, 1 ㎖ 의 내피세포 증식 배지에서 바이알을 린스하고, 린스한 배지를 튜브에 첨가하였다. 튜브를 200 × g 으로 5 분간 원심한 후, 상청을 폐기하였다. 세포를 새로운 내피세포 배양 배지에서 현탁하고, 2 × 104 세포/㎠ 로 배양 용기에 파종하였다. 다음날에 배지 교환을 실시하고, 이후에는 1 ∼ 3 일마다 배지 교환을 실시하였다.
세포 해동 후 7 일째에 세포를 회수하여 세포수를 카운트함과 함께, 내피세포 마커인 CD31 의 양성 세포율을 플로 사이토메트리로 측정한 결과, 1.5 ∼ 4 배의 세포 증식률 및 95 ％ 이상 (96.6 ∼ 99 ％) 의 CD31 양성률이 확인되었다. 이 결과로부터, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어진 내피세포는 동결 융해에 의한 데미지가 매우 작은 것이 분명해졌다.
실시예 3 CD31+/CD34+ 세포 측정
인간 iPS 세포 (ChiPSC12 주) 를 DEF-CS 배지 중에서, 당해 배지에 부속된 설명서에 따라 배양하였다.
계대 배양한 iPS 세포에 TrypLE (상표) Select 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 3 ∼ 7 분간 인큐베이트하였다. 박리된 세포를, 피펫팅에 의해 단일 세포로 하고 나서 회수하여 세포수를 카운트하였다. 다음으로, 매트리겔 (상표) 로 코팅된 배양 용기 상에 6 × 104 세포/㎠ 로 세포를 파종하고, DEF-CS 배지 중에서 2 ∼ 3 일간 배양하였다. 그 후, 1 : 60 희석의 매트리겔이 첨가된 DEF-CS 배지로 교환하고, 추가로 16 ∼ 24 시간 배양함으로써, 매트리겔로 세포 상층을 덮었다.
얻어진 매트리겔 피복 iPS 세포를, 이하의 순서로 중배엽 세포로 분화시켰다. 먼저, 매트리겔 피복 iPS 세포의 배지를, 100 ng/㎖ 액티빈 A, 2 mM GlutaMAX (상표) 및 B27 서플리먼트 (인슐린 불포함) 가 첨가된 RPMI1640 배지로 교환하고 (이 시점을 분화 유도 개시 ＝ Day 0 으로 한다), 24 시간 배양하였다 (Day 1). 다음으로, 10 ng/㎖ hBMP4, 10 ng/㎖ hbFGF, 2 mM GlutaMAX 및 B27 서플리먼트가 첨가된 RPMI1640 배지로 교환하고, 3 일간 배양하였다 (Day 4). 그 후, 100 ng/㎖ VEGF, 2 mM GlutaMAX 및 B27 서플리먼트가 첨가된 RPMI1640 배지로 배지 교환하고, 하룻밤 배양을 실시하였다 (Day 5). 또한, 배양물의 광학 현미경 관찰을 실시한 결과, Day 0 ∼ Day 5 를 통하여 배양체의 형성은 확인할 수 없었다.
Day 5 의 배양물로부터 KDR 양성 세포를 자기 세포 분리 장치를 사용하여 분리함으로써, 혈관 내피 전구세포를 단리하였다. KDR 양성 세포를 분리함에 있어서는, PE 형광 라벨을 결합한 항 KDR 항체를 1 차 항체로 하여 세포의 표지에 사용하고, 항 PE 항체를 포매한 자기 비즈에 의해 1 차 항체로 표지된 세포를 회수하였다. MACS 로 분리된 세포 중에 존재하는 KDR 양성 세포의 비율을 플로 사이토메트리로 측정한 결과, KDR 양성률은 89 ∼ 99 ％ 였다. 얻어진 세포를, 매트리겔로 코팅된 배양 용기에 2.7 × 104 세포/㎠ 로 파종하고, B27 서플리먼트, 50 유닛/㎖ 페니실린, 50 μg/㎖ 스트렙토마이신, 2 mM GlutaMAX, 20 μM Y-27632 및 100 ng/㎖ VEGF 가 첨가된 RPMI1640 배지 중에서 16 ∼ 24 시간 배양하였다 (Day 6). 또한, Day 6 의 배지를, B27 서플리먼트, 50 유닛/㎖ 페니실린, 50 μg/㎖ 스트렙토마이신, 2 mM GlutaMAX 및 100 ng/㎖ VEGF 가 첨가된 RPMI1640 배지로 교환하고, 2 일간 배양하였다 (Day 8).
Day 8 에 세포를 회수하고, 표 3 에 나타내는 농도의 RepSox 가 첨가된 내피세포 증식 배지 (Promocell) 에서 현탁한 후, 2.7 × 104 세포/㎠ 로 배양 용기에 파종하고, 3 일간 배양하였다 (Day 11).
Day 11 에 세포를 TGF-β 저해제를 함유하지 않는 배지, 즉 내피세포 증식 배지로 배지 교환을 실시하고, Day 13 에 세포를 회수하여 세포수를 카운트함과 함께, 그 일부를 사용하여 CD31 양성 세포 및 CD34 양성 세포를 플로 사이토메트리로 측정하였다. 남은 세포는 내피세포 증식 배지 (RepSox 를 함유하지 않는다) 에서 현탁한 후, 2.7 × 104 세포/㎠ 로 배양 용기에 파종하였다. 1 ∼ 3 일마다 배지 교환을 실시하고, Day 13 및 Day 18 에 세포를 회수하여 세포수를 카운트함과 함께, CD31 양성 세포 및 CD34 양성 세포를 플로 사이토메트리로 측정하였다.
여기서, CD31 은 내피세포의 마커이고, CD34 는 조혈 줄기세포나 내피 전구세포의 마커이다. 또, CD34 는 유약 내피세포에도 발현하고 있다. 따라서, 본 발명에 있어서의, CD31 양성 또한 CD34 양성의 세포 (이하, CD31+/CD34+) 는, 혈관 내피세포 중에서도 분화가 진행되지 않은 것, 즉, 유약한 혈관 내피세포인 것으로 생각된다. Day 13 및 Day 18 에 있어서의, CD31+/CD34+ 세포의 비율을 표 3 에 나타낸다.
Figure 112019063971459-pct00003
RepSox 농도에 상관없이, Day 13 에서는 CD31+/CD34+ 세포가 95 ％ 이상이었다. 또, Day 18 에서는, RepSox 의 농도가 높을수록 CD31+/CD34+ 세포의 비율이 높아졌다. 이러한 결과는, 혈관 내피세포의 분화 유도에 있어서, RepSox 를 사용함으로써, 여러 가지 내피세포로 분화 성숙될 수 있는 포텐셜을 갖는 유약한 혈관 내피세포가 높은 비율로 얻어지는 것을 나타낸다.
산업상 이용가능성
본 발명에 의해 고품질의 내피세포가 제공된다. 본 발명의 내피세포는, 특히 심근 시트의 제조에 유용하다.

Claims (10)

  1. (a) 인간 다능성 줄기세포로부터, 배양체가 형성되지 않고, 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단을 유도하는 공정,
    (a') 중배엽계 세포 집단으로부터 내피 전구세포를 단리하는 공정, 및
    (b) 단리된 내피 전구세포를 RepSox 의 존재하에서 배양하는 공정을 이 순서로 실시하는, 내피세포의 제조 방법으로서,
    공정 (a) 에 있어서, 인간 다능성 줄기세포가, (i) 액티빈 A 를 함유하는 배지, (ii) 골 형성 단백질 4 를 함유하는 배지, 및 (iii) 혈관 내피세포 증식 인자를 함유하는 배지에서 순차 배양되는, 내피세포의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    인간 다능성 줄기세포가, 인간 배성 줄기세포 (인간 ES 세포) 또는 인간 유도 다능성 줄기세포 (인간 iPS 세포) 인, 내피세포의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    (ii) 골 형성 단백질 4 를 함유하는 배지가 추가로 염기성 선유아세포 증식 인자를 함유하고 있는, 내피세포의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    공정 (a') 에 있어서, 내피 전구세포로서 키나아제 삽입 도메인 수용체 양성 세포가 단리되는, 내피세포의 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    공정 (b) 에 앞서, 내피 전구세포를 함유하는 중배엽계 세포 집단 또는 단리 된 내피 전구세포의 RepSox 를 함유하지 않는 배지에서의 배양이 실시되는, 내피세포의 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    공정 (b) 후에, (c) 내피세포를 동결하는 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 내피세포의 제조 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 내피세포를 제조하는 공정, 및 내피세포를 심근세포 및 벽세포와 혼합하여 배양하는 공정을 포함하는, 심근 시트의 제조 방법.
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