JP5842289B2 - 効率的な内皮細胞の誘導方法 - Google Patents
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Description
しかしながら、ヒトiPS細胞1個から分化誘導される内皮細胞の収量は依然として低いものであり、医療応用を可能にするするためにはさらなる改善の必要性が存在する。
[1]a)多能性幹細胞に対して分化刺激を与えて多能性幹細胞から内皮細胞前駆細胞を20%以上含む細胞集団を形成させる工程、
b)該細胞集団をcAMPおよびVEGFを含む培地で培養して内皮細胞前駆細胞の割合が全細胞の40%以上となるようにする工程、および
c)b)で得られた細胞集団をVEGFを含む培地で培養して内皮細胞前駆細胞から内皮細胞を誘導する工程、
を含む、多能性幹細胞から内皮細胞を製造する方法。
[2]内皮細胞前駆細胞がVEGF receptor-2(KDR)陽性細胞である、[1]に記載の方法。
[3]工程b)において、培養は1〜4日間行われる、[1]または[2]に記載の方法。
[4]工程c)において、VEGFを含む培地はcAMPを含まない、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]工程b)において、cAMPの濃度が0.5mM〜2mMである、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]工程b)およびc)において、VEGFの濃度が50ng/ml〜200ng/mlである、[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]工程b)において、該培地がp90 ribosomal S6 kinase (RSK)阻害剤をさらに含む、[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]工程b)の途中または工程b)の後に、内皮細胞前駆細胞を純化する工程をさらに含む、[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]内皮細胞前駆細胞を純化する工程が工程(b)の工程の開始から1〜5日後に行われる、[8]に記載の方法。
[10]工程c)の後に、さらに、得られた細胞をbFGF、EGFおよびフィブロネクチンを含む培地中で培養する工程を含む、[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11]工程a)が、以下の工程i)およびii)を含む、[1]〜[10]のいずれかに記載の方法。
(i) 多能性幹細胞をActivin Aを含む培地中で培養する工程、および
(ii)工程(i)で得られた細胞をBMPおよびbFGFを含む培地中で培養する工程、
[12]工程(i)の前に多能性幹細胞へ細胞外基質を添加することで細胞をコーティングする工程、および工程(ii)の前に工程(i)で得られた細胞へ細胞外基質を添加することで細胞をコーティングする工程を含む、[11]に記載の方法。
[13]前記多能性幹細胞がiPS細胞である、[1]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14]前記多能性幹細胞がヒト由来である、[1]〜[13]のいずれかに記載の方法。
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、以下のものに限定されないが、例えば胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、***幹細胞(「GS細胞」)、胚性生殖細胞(「EG細胞」)、誘導多能性幹(iPS)細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞、およびiPS細胞である。
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚(例えば胚盤胞)の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
***幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、***形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培地で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、***幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
誘導多能性幹 (iPS) 細胞は、ある特定の核初期化物質を、DNAまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することまたは薬剤によって当該核初期化物質の内在性のmRNAおよびタンパク質の発現を上昇させることによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676、K. Takahashi et al. (2007) Cell, 131: 861-872、J. Yu et al. (2007) Science, 318: 1917-1920、M. Nakagawa et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 101-106、国際公開WO 2007/069666および国際公開WO 2010/068955)。核初期化物質は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えば、Oct3/4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc, N-Myc, TERT, SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b, Nanog, EsrrbまたはEsrrgが例示される。これらの初期化物質は、iPS細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも1つ、2つもしくは3つ含む組み合わせであり、好ましくは4つを含む組み合わせである。
遺伝子名 マウス ヒト
L-Myc NM_008506 NM_001033081
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
Glis1 NM_147221 NM_147193
ヒト&サル)ES細胞用培地(リプロセル、京都、日本)、mTeSR-1)、などが含まれる。
nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している(T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502)。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術(J.B. Cibelli et al. (1998), Nat. Biotechnol., 16:642-646)とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで再プログラム化することができる。
体細胞と卵子もしくはES細胞とを融合させることにより、融合させたES細胞と同様な多能性を有し、さらに体細胞に特有の遺伝子も有する幹細胞である(Tada M et al. Curr Biol. 11:1553-8, 2001; Cowan CA et al. Science. 2005 Aug 26;309(5739):1369-73)。
本発明の多能性幹細胞から内皮細胞を製造する方法は、
a)多能性幹細胞に対して分化刺激を与えて多能性幹細胞から内皮細胞前駆細胞を20%以上含む細胞集団を形成させる工程、
b)当該細胞集団をcAMPおよびVEGFを含む培地で培養して内皮細胞前駆細胞の割合が全細胞の40%以上となるようにする工程、および
c)b)で得られた細胞集団をVEGFを含む培地で培養して内皮細胞前駆細胞から内皮細胞を誘導する工程、を含む。
内皮細胞には血管内皮細胞や角膜内皮細胞が含まれる。
浮遊培養により誘導してもよく、あるいはコーティング処理された培養皿を用いて接着培養により誘導してもよい。
工程a)では多能性幹細胞に対して分化刺激を与えて多能性幹細胞から内皮細胞前駆細胞を20%以上含む細胞集団を形成させる。ここで、内皮細胞前駆細胞の割合は全細胞数の20%以上であれば特に上限はないが、通常は約20〜40%である。
KDR等のマーカーの発現は、例えば、マーカーを特異的に認識する抗体を用いて確認することができる。しかしながら、本発明の方法においては、工程b)の開始前に一定以上の内皮細胞前駆細胞が存在していればよく、マーカーの発現量を確認するステップは不要である。
一方、Embrioid body (胚様体)を形成させることにより、外因性の因子を加えなくても内皮細胞前駆細胞に分化しうるため、必ずしも外因性の分化誘導因子を添加する必要はなく、多能性幹細胞を上記のような浮遊培養に供することで分化刺激を与える態様も工程a)には含まれる。
(i) 多能性幹細胞をActivin Aを含む培地中で培養する工程、
(ii)工程(i )で得られた細胞をBMPおよびbFGFを含む培地中で培養する工程、
前記工程(ii)の培地におけるBMPの濃度は、例えば、1ng/ml〜100ng/mlである。
前記工程(ii)の培地におけるbFGFの濃度は、例えば、1ng/ml〜100ng/mlである。
前記工程(ii ) の培養時間は、例えば10日以下の培養であり、好ましくは、2〜5日である。
前記工程における細胞外基質の濃度は、例えば、1/100希釈〜1/10希釈の範囲内である。
工程b)では、工程a)で得られた細胞集団をcAMPおよびVEGFを含む培地で培養して内皮細胞前駆細胞の割合が全細胞の40%以上となるようにする。
内皮細胞前駆細胞の割合は全細胞の40〜100%であればよいが、通常は40〜80%、より好ましくは50〜95%である。例えば、KDR陽性細胞の割合が上記の範囲になればよい。
工程b)において、工程a)で得られた細胞集団をcAMPおよびVEGFを含む培地で培養することにより、内皮細胞前駆細胞の割合が工程a)終了時点と比べて好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上となる。
工程(b)の培地におけるVEGFの濃度は、好ましくは50ng/ml〜200ng/mlである。
cAMPおよびVEGF以外の培地成分は上述したような一般的な培地成分を用いることができる。
内皮細胞前駆細胞を純化する工程は、内皮細胞前駆細胞を含む細胞集団から内皮細胞前駆細胞を単離することで行ってもよいし、内皮細胞前駆細胞を含む細胞集団から内皮細胞前駆細胞以外の細胞を除去することで行ってもよい。
これらの工程は、例えば、上述した内皮細胞前駆細胞のマーカーに対する抗体を用いることで行うことができる。
工程c)で用いられるVEGFを含む培地はcAMPを含んでもよいが、cAMPを加えた状態で培養を長期間行うと内皮細胞の誘導効率が低下する場合があるので、cAMPは含まないことが好ましい。
工程(c)の培地におけるVEGFの濃度は、好ましくは50ng/ml〜200ng/mlである。
前記工程(c) の培養時間は、例えば10日以下の培養であり、好ましくは、1〜5日であり、特に好ましくは2日である。
前記工程(d)の培地におけるbFGFの濃度は、例えば、10ng/ml〜30ng/mlである。
前記工程(d)の培地におけるEGFの濃度は、例えば、1ng/ml〜100ng/mlである。
前記工程(d)の培地におけるフィブロネクチンの濃度は、例えば、1μg/ml〜100μg/mlである。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれらの実施例によって制限されないものとする。
ヒトiPS細胞(201B6および836B3)は、京都大学の山中教授より受領し、以前に報告された方法(Uosaki H. et al. PLoS One 2011;6:e23657)と同様の方法を用いて維持培養を行った。詳細には、次のとおりである。ヒトiPS細胞を、マトリゲル(growth factor reduced, 1:60希釈、Invitrogen)でコーティングされた培養皿に播種し、マウス胎児性線維芽細胞(MEF)からのconditioned medium(培養上清)(MEF-CM)に4ng/mLのヒトbFGF(hbFGF, WAKO)を添加した培地を用いて維持培養を行った。Conditioned mediumの基礎培地は、Knockout DMEM (GIBCO) 471mL, Knockout serum replacement (KSR) 120mL, NEAA 6mL, 200mM L-Glutamine 3mL, 55mM 2-ME (メルカプトエタノール(GIBCO), 4 ng/ml hbFGF)を混合することにより作製された。MEFは、Mitomycin-C (MMC) (WAKO)により2.5時間処理されたものを用いた。
4〜6日毎に、CTK solution (0.1% Collagenase IV, 0.25% Trypsin, 20% KSR, および1 mM CaCl2 in Phosphate buffered saline (PBS))を用いて細胞コロニーを剥離し、セルストレーナーでsmall clumpの状態にして継代培養した。
続いて、効率的な内皮細胞への分化誘導条件を見出すため、下記に示すプロトコールの各工程(工程(1)〜工程(6))を元に種々の条件を変えて評価を行った。
上記の方法で継代培養したヒトiPS細胞を、Versene (Invitrogen)を用いて37℃で3-5分間インキュベートすることにより、培養皿から剥離した。Verseneを吸引した後、MEF-CMにてピペッティングし、single cellにて回収した後、遠心分離して細胞数をカウントした。
(1)次いで、マトリゲルでコーティングした培養皿上に6,000 -9,000 細胞/cm2の密度で細胞を播種し、bFGFを補充したMEF-CM培地中で数日間培養した。
(2)その後、培地をマトリゲルを補充したMEF-CM培地に換えてさらに数時間培養し、マトリゲルで細胞上層を覆った(マトリゲルサンドイッチ)。
得られたマトリゲル被覆細胞を用いて、下記の手順により内皮細胞へ分化誘導させた。
(3)培地を、Activin A (ActA; R&D Systems)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、数時間培養した。
(4)洗浄後、培地を、human Bone morphogenetic protein 4 (BMP4; R&D)、hbFGFおよびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、数日間培養した。
(5)洗浄後、培地を、8-bromo cAMP(cAMP)、血管内皮細胞成長因子(VEGF; WAKO)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、数日間培養した。
(6)さらに洗浄後、培地を、血管内皮細胞成長因子(VEGF; WAKO)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、数日間培養した。
その結果、VECad及びCD31二重陽性細胞は工程(5)の開始後、出現し、工程(6)において、全細胞数の60〜80%にまで達した。一方、コントロールにおいてはVECad及びCD31二重陽性細胞はほとんど検出されなかった。
その結果、KDR陽性細胞は培養開始の時点(d0)で全細胞の約20%存在し、工程(4)の終了時には約50%に増加した。その後、工程(5)の培養を行うことにより、約90%まで増加した。一方、コントロールにおいてはKDR陽性細胞は工程(5)以降減少した。
以上より、工程(5)でcAMPとVEGFを含む培地で培養してKDR陽性細胞を増加させ、その後、工程(6)でVEGFを含む培地で培養することにより、内皮細胞を効率よく誘導できることが分かった。
工程(2)のマトリゲルサンドイッチから工程(3)の開始期間および工程(3)のActivin Aの投与期間、ならびに濃度について検討するために、Activin Aの濃度として100ng/ml、125ng/mlおよび150ng/ml、Activin Aの投与期間を12時間、18時間および24時間、ならびにマトリゲルサンドイッチから工程(3)の開始時期を12時間後および24時間後との各組合せを用いた場合の内皮細胞の誘導率を評価した。各工程の培養条件は、下記のとおりである。
(1)マトリゲルでコーティングした培養皿上に6,000 -9,000 細胞/cm2の密度で細胞を播種し、4 ng/mL bFGFを補充したMEF-CM培地中で3日間培養した。
(2)その後、培地をマトリゲル(1/60希釈)を補充したMEF-CM培地に換えてさらに数時間培養し、マトリゲルで細胞上層を覆い、12時間または24時間培養した(マトリゲルサンドイッチ)。
(3)培地を、各濃度のActivin A (ActA; R&D Systems)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、各期間培養した。
(4)洗浄後、培地を、10 ng/mL human Bone morphogenetic protein 4 (BMP4; R&D)、10 ng/mL hbFGFおよびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、3日間培養した。
(5)洗浄後、培地を、1.0mM 8-bromo cAMP(cAMP)、100ng/ml 血管内皮細胞成長因子(VEGF; WAKO)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、3日間培養した。
(6)さらに洗浄後、培地を、100ng/ml 血管内皮細胞成長因子(VEGF; WAKO)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、2日間培養した。
その結果、いずれの場合もVECad及びCD31二重陽性細胞は得られたが、マトリゲルサンドイッチから工程(3)の開始までが、24時間であり、工程(3)の期間が18時間であり、およびActivin Aの濃度が125ng/mlの場合に、最も誘導率が高いことが見出された(図3)。
工程(3)以降の工程で、マトリゲルを追加で投与するのに適した時期を評価するために、マトリゲルの再投与時期をd2、d1.5、d1、d3、d4、d6およびd7(この時、工程(3)の開始時期をd0とする)にて、内皮細胞の誘導率を評価した。それ以外の各工程の培養条件は、下記のとおりである。
(1)マトリゲルでコーティングした培養皿上に6,000 -9,000 細胞/cm2の密度で細胞を播種し、4 ng/mL bFGFを補充したMEF-CM培地中で3日間培養した。
(2)その後、培地をマトリゲル(1/60希釈)を補充したMEF-CM培地に換えてさらに1日間培養し、マトリゲルで細胞上層を覆った(マトリゲルサンドイッチ)。
(3)培地を、125ng/mL Activin A (ActA; R&D Systems)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、18時間培養した。
(4)洗浄後、培地を、10 ng/mL human Bone morphogenetic protein 4 (BMP4; R&D)、10 ng/mL hbFGFおよびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、3日間培養した。
(5)洗浄後、培地を、1.0mM 8-bromo cAMP(cAMP)、100ng/ml 血管内皮細胞成長因子(VEGF; WAKO)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、3日間培養した。
(6)さらに洗浄後、培地を、100ng/ml 血管内皮細胞成長因子(VEGF; WAKO)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、2日間培養した。
その結果、いずれの場合もVECad及びCD31二重陽性細胞は得られたが、工程(4)で追加のマトリゲルを投与した場合に、最も誘導率が高いことが見出された(図4)。
工程(5)のcAMPの濃度、投与時期および投与期間について評価するために、cAMPの濃度を0.25mM、0.5mMおよび1mMを用いて、さらに、d4-d7、d5-d8、d3-d7、d4-d8およびd3-d8の期間に投与した場合の組合せにて内皮細胞の誘導率を評価した(d3開始の場合、工程(4)は2日間となり、d5開始の場合、工程(4)は4日間となり、d8終了の場合、工程(6)は2日間となる)。それ以外の各工程の培養条件は、下記のとおりである。
(1)マトリゲルでコーティングした培養皿上に6,000 -9,000 細胞/cm2の密度で細胞を播種し、4 ng/mL bFGFを補充したMEF-CM培地中で3日間培養した。
(2)その後、培地をマトリゲル(1/60希釈)を補充したMEF-CM培地に換えてさらに1日間培養し、マトリゲルで細胞上層を覆った(マトリゲルサンドイッチ)。
(3)培地を、125ng/mL Activin A (ActA; R&D Systems)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、18時間培養した。
(4)洗浄後、培地を、10 ng/mL human Bone morphogenetic protein 4 (BMP4; R&D)、10 ng/mL hbFGFおよびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、数日間培養した。
(5)洗浄後、培地を、8-bromo cAMP(cAMP)、100ng/ml 血管内皮細胞成長因子(VEGF; WAKO)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、数日間培養した。
(6)さらに洗浄後、培地を、100ng/ml 血管内皮細胞成長因子(VEGF; WAKO)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、d9まで数日間培養した。
その結果、1mMの濃度でd4-d7でcAMPを投与した場合に最も内皮細胞誘導率が高いことが見出された(図5)。なお、d8までcAMP存在下で培養すると、やや内皮細胞の割合が低下したことから、cAMPは一定期間経過後、培地から除くことが好ましいことが分かった。
工程(5)のVEGFの濃度について評価するために、VEGFの濃度を0 ng/ml(-)、100ng/ml、200ng/mlおよび400ng/mlを用いて内皮細胞の誘導率を評価した。さらに、cAMPの有無との組み合わせにおいても評価した。各工程の培養条件は、下記のとおりである。
(1)マトリゲルでコーティングした培養皿上に6,000 -9,000 細胞/cm2の密度で細胞を播種し、4 ng/mL bFGFを補充したMEF-CM培地中で3日間培養した。
(2)その後、培地をマトリゲル(1/60希釈)を補充したMEF-CM培地に換えてさらに1日間培養し、マトリゲルで細胞上層を覆った(マトリゲルサンドイッチ)。
(3)培地を、125ng/mL Activin A (ActA; R&D Systems)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、18時間培養した。
(4)洗浄後、培地を、10 ng/mL human Bone morphogenetic protein 4 (BMP4; R&D)、10 ng/mL hbFGFおよびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、3日間培養した。
(5)洗浄後、培地を、0 mMまたは1.0mM 8-bromo cAMP(cAMP)、各濃度の血管内皮細胞成長因子(VEGF; WAKO)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、3日間培養した。
(6)さらに洗浄後、培地を、100ng/ml 血管内皮細胞成長因子(VEGF; WAKO)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、2日間培養した。
その結果、1mMのcAMPと共に100ng/mlの濃度でVEGFを投与した場合に最も内皮細胞誘導率が高いことが見出された(図6、図7および表1)。
実施例2〜5において明らかとなった、それぞれのパラメータの最適な条件を組み合わせて内皮細胞への分化誘導実験を行った。
すなわち、分化誘導プロトコールは下記のとおりである。
継代培養したヒトiPS細胞を、Versene (Invitrogen)を用いて37℃で3-5分間インキュベートすることにより、ヒトiPS細胞を培養皿から剥離した。Verseneを吸引した後、MEF-CMにてピペッティングし、single cellにて回収した後、遠心分離して細胞数をカウントした。マトリゲルでコーティングした培養皿上に6,000 〜9,000 細胞/cm2の密度で4 ng/mL bFGF添加MEF-CMを培地として播種した。3日間の培養の後、マトリゲルでコーティング (1/60希釈)添加MEF-CMに培地を換えてさらに1日間培養し、マトリゲルで細胞上層を覆った(マトリゲルサンドイッチ)。
得られたマトリゲル被覆細胞を用いて、下記の手順により内皮細胞へ分化誘導させた。
(d0-d1)培地を、125ng/mL Activin A (ActA; R&D Systems)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、18時間培養した。
(d1-d4)洗浄後、培地を、10 ng/mL human Bone morphogenetic protein 4 (BMP4; R&D)、10 ng/mL hbFGF、Matrigel (1/60希釈)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、3日間培養した。
(d4-d7)洗浄後、培地を、1.0mM 8-bromo cAMP(cAMP)、100ng/ml 血管内皮細胞成長因子(VEGF; WAKO)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、3日間培養した。
(d7-d9)さらに洗浄後、培地を、100ng/ml 血管内皮細胞成長因子(VEGF; WAKO)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)に交換し、2日間培養した。
その後、分化誘導の9日目(D9)に、フローサイトメトリーにより、血管内皮カドヘリン陽性細胞(VECad陽性細胞)を内皮細胞として回収し、細胞数を測定した。
その結果、VECad陽性細胞数/全細胞数(%)は、56.2±12.5%であり、VECad陽性細胞数は、1.66±0.70×105であった。
次に、内皮細胞を誘導するに当たり、内皮細胞前駆細胞を純化したのちに培養することの効果を調べた。
すなわち、内皮細胞への分化誘導法において、工程(6)終了後の9日目(d9)において内皮細胞を直接純化する方法(以下、直接的純化法ともいう)と、工程(5)の途中の6日目(d6)にVEGF receptor-2(KDR)陽性細胞を純化する工程を入れた場合(以下、間接的純化法ともいう)とで、回収内皮細胞の収量と純度を比較するために、下記の実験を行った。
まず、直接的純化法によるサンプルを得るために、実施例1の内皮細胞分化誘導法に基づいて9日目(d9)まで培養し、蛍光活性化セルソーター(FACS) にて、VECad、CD31二重陽性細胞を純化し回収した。総細胞数を計測し、フローサイトメトリーにてVEcad、CD31二重陽性細胞の割合を測定することで回収内皮細胞の収量と純度を測定した。
一方、間接的純化法によるサンプルを得るために、実施例6の内皮細胞分化誘導法に基づいて6日目(d6)まで培養し、KDR陽性細胞を純化し回収した。回収されたKDR陽性細胞は、マトリゲルでコーティングした培養皿上に10,000 細胞/cm2の密度で1.0mM cAMP、100ng/ml VEGF、10 μmol/L Rho結合タンパク質キナーゼ阻害剤 (Y-27632; CalBiochem)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)と共に播種された。その後2日間(d7-d9)、100ng/ml 血管内皮細胞成長因子(VEGF; WAKO)およびB27 supplementを補充したRPMI培地(インスリン不含)にて培養し、分化9日目に回収した。直接的純化法と同様に回収内皮細胞(VECad、CD31二重陽性細胞)の収量と純度を測定した。
その結果、工程(5)の途中の6日目(d6)にVEGF receptor-2(KDR)陽性細胞を純化して培養を継続した場合、9日目(d9)に内皮細胞を直接純化するよりも、有意に高い収量を示すことが見出された(図8aおよび表2)。
さらに、直接的純化法および間接的純化法により採取された細胞の再培養及び増殖が可能であるか検討した。9日目(d9)までの分化誘導は、上記と同様の方法にて行われた。直接的純化法および間接的純化法(d6で純化)により得られたd9での内皮細胞を、それぞれ1%ゼラチンによってコートされたdish上に播種し、bFGF (20 ng/ml)、EGF (10 ng/ml)、及び、human plasma fibronectin (10 μg/ml)を補充したHuman Endothelial-SFM 培地(Gibco)にて培養し、分化14日目(d14)にVECad、CD31二重陽性細胞を純化・回収し、回収内皮細胞の収量と純度を測定した。
その結果、9日目(d9)に直接的純化法および間接的純化法で採取された細胞は14日(d14)までの5日間に直接的純化法では2.57±1.41倍、間接的純化法では2.65±0.64倍となった。再培養後の増殖には差がなく、14日目(d14)における細胞収量も、6日目(d6)にKDR陽性細胞を純化した場合において、9日目(d9)に内皮細胞を直接純化するよりも、高い収量を示すことが見出された(図8cおよび表2)。
実施例6の方法において、KDR陽性細胞の純化ステップをそれぞれd4、d5、d6に行い、d9まで培養を継続した。すなわち、d4に純化操作を行う場合は、BMPとbFGFを含む培地で培養した直後にKDR陽性細胞を純化し、その後、cAMPとVEGFを含んだ培地で3日間培養し、その後、VEGFを含む培地で3日間培養した。d5に純化操作を行う場合は、BMPとbFGFを含む培地で培養後、培地をcAMPとVEGFを含んだ培地に交換してさらに1日培養した後にKDR陽性細胞を純化し、次いで、cAMPとVEGFを含んだ培地でさらに2日培養し、その後、VEGFを含む培地で3日間培養した。d6に純化操作を行う場合は、BMPとbFGFを含む培地で培養後、培地をcAMPとVEGFを含んだ培地に交換してさらに2日培養した後にKDR陽性細胞を純化し、次いで、cAMPとVEGFを含んだ培地でさらに1日培養し、その後、VEGFを含む培地で3日間培養した。
表3および図9に、純化のタイミングと、純化直前のKDR陽性率およびd9における内皮細胞の割合を示した。その結果、d4でKDR陽性細胞が20%ほど出現してきた段階で、VEGF, cAMPにより刺激し、1〜2日後、KDR陽性細胞が50〜90%程度になったところで純化し、内皮細胞へ誘導する方法が特に効率よく内皮細胞を製造できることが分かった。
RSKによる内皮細胞誘導効果を検証するため内皮細胞への分化が困難であることが知られている血清入りの培地にて検討した。内皮細胞への分化誘導4日目まで(d1-d4)は、実施例6と同様の方法により行った。次いで、培地を10% Serumを補充したRPMI培地に換え、分化誘導4〜7日目(d4-d7)に、1.0mM cAMP、100ng/ml VEGFおよびRSKの選択的抑制剤である20μM SL 0101-1(Tocris Bioscience)を投与した場合と、1.0mM cAMPおよび100ng/ml VEGFを投与した場合の分化9日目(d9)における総細胞数中のVECad、CD31二重陽性細胞率を測定した。
その結果、SL 0101-1を添加した場合、添加しなかった場合と比較して、有意に高い内皮細胞の誘導率を示すことが見出された(図10および表4)。
Claims (7)
- a)多能性幹細胞に対して分化刺激を与えて多能性幹細胞から内皮細胞前駆細胞を20%以上含む細胞集団を形成させる工程、
b)該細胞集団をcAMPおよびVEGFを含む培地で培養して内皮細胞前駆細胞の割合が全細胞の40%以上となるようにする工程、および
c)b)で得られた細胞集団をVEGFを含み、cAMPを含まない培地で培養して内皮細胞前駆細胞から内皮細胞を誘導する工程、
を含む、多能性幹細胞から内皮細胞を製造する方法。 - a)多能性幹細胞に対して分化刺激を与えて多能性幹細胞から内皮細胞前駆細胞を20%以上含む細胞集団を形成させる工程、
b)該細胞集団をcAMPおよびVEGFを含む培地で培養して内皮細胞前駆細胞の割合が全細胞の40%以上となるようにする工程、および
c)b)で得られた細胞集団をVEGFを含む培地で培養して内皮細胞前駆細胞から内皮細胞を誘導する工程、を含み、
さらに、工程b)の途中または工程b)の後に、内皮細胞前駆細胞を純化する工程、
を含む、多能性幹細胞から内皮細胞を製造する方法。 - 工程c)において、VEGFを含む培地はcAMPを含まない、請求項2に記載の方法。
- 工程b)において、該培地がp90 ribosomal S6 kinase (RSK)阻害剤をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)の後に、さらに、得られた細胞をbFGF、EGFおよびフィブロネクチンを含む培地中で培養する工程を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 工程a)が、以下の工程i)およびii)を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
(i) 多能性幹細胞をActivin Aを含む培地中で培養する工程、および
(ii)工程(i)で得られた細胞をBMPおよびbFGFを含む培地中で培養する工程、 - 工程(i)の前に多能性幹細胞へ細胞外基質を添加することで細胞をコーティングする工程、および工程(ii)の前に工程(i)で得られた細胞へ細胞外基質を添加することで細胞をコーティングする工程を含む、請求項6に記載の方法。
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