WO2018101466A1 - 内皮細胞の製造方法 - Google Patents

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由姫 山本
榎　竜嗣
泰弘 戸坂
庸子 山口
峰野　純一
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タカラバイオ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing high-quality endothelial cells from pluripotent stem cells.
  • a myocardial sheet is produced by culturing cardiomyocytes in combination with endothelial cells, wall cells and Flk / KDR positive cells.
  • the above document discloses a method for preparing a plurality of cells such as cardiomyocytes, endothelial cells, and wall cells as a cell mixture. From the viewpoint of managing the quality of the myocardial sheet and the manufacturing process, these cells are separately classified. It is desirable to prepare. Endothelial cells are expected to become a material for blood vessels formed in tissues when artificially constructing tissues and organs other than the cardiovascular system.
  • the term “high quality endothelial cell” means a high number of cells obtained, high purity (high positive rate of endothelial cell marker), complete differentiation stage, and excellent cell proliferation ability. It refers to an endothelial cell having one or more characteristics such as being young (for example, young), being hardly damaged by freezing and thawing, and having a small difference between lots.
  • the present invention is intended to solve the problems of such a conventional production method, and an object of the present invention is to provide a method for producing high-quality endothelial cells.
  • the present invention [1] (a) Inducing a mesodermal cell population containing endothelial progenitor cells without forming an embryoid body from pluripotent stem cells, and (b) mesoderm containing endothelial progenitor cells Culturing the cell line population in the presence of RepSox; A method for producing endothelial cells, [2] The method according to [1] above, wherein the pluripotent stem cell is an embryonic stem cell (ES cell) or an induced pluripotent stem cell (iPS cell).
  • ES cell embryonic stem cell
  • iPS cell induced pluripotent stem cell
  • the pluripotent stem cells are (i) a medium containing activin A, (ii) a medium containing bone morphogenetic protein 4, and (iii) a medium containing vascular endothelial growth factor
  • the method according to any one of [8] The method according to any one of [1] to [7] above, further comprising (c) a step of freezing endothelial cells after step (b), [9] A step of producing endothelial cells by the method according to any one of [1] to [8], and a step of culturing the endothelial cells by mixing them with cardiomyocytes and wall cells, Including a method for producing a myocardial sheet, and [10] It relates to a cell composition containing a kinase insertion domain receptor-positive endothelial progenitor cell and RepSox.
  • the method of the present invention makes it possible to efficiently produce high-quality endothelial cells from pluripotent stem cells.
  • Endothelial cells obtained by the method of the present invention are useful, for example, in the production of myocardial sheets, and are expected to be used for the treatment of heart diseases. Furthermore, it can be used as a cell model for diseases caused by abnormalities of endothelial cells and the like, and as a material for drug safety evaluation.
  • a myocardial sheet can be produced by mixing and culturing the endothelial cells obtained by the method of the present invention with cardiomyocytes and wall cells.
  • the “pluripotent stem cell” is a stem cell having pluripotency capable of differentiating into a plurality of types of cells and also having self-proliferation ability, and is not limited to the following.
  • induced pluripotent stem cells iPS cells
  • embryonic stem cells embryonic stem cells
  • GS cells sperm stem cells
  • embryonic germ cells embryonic germ cells
  • Embryonic stem cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer (nuclear transfer ES cells: ntES cells), fusion stem cells, and the like.
  • Preferred pluripotent stem cells are iPS cells or ES cells, and more preferred pluripotent stem cells are iPS cells.
  • iPS cells are produced by introducing a specific nuclear reprogramming substance into a somatic cell in the form of a nucleic acid or protein, or by increasing the expression of endogenous mRNA and / or protein of the nuclear reprogramming substance by a drug.
  • It is an artificial stem cell derived from a somatic cell that has almost the same characteristics as ES cells, such as differentiation pluripotency and proliferation ability by self-replication (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006), Cell, 126: 663-676, K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861-872, J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920, M. Nakagawa et al.
  • the nuclear reprogramming substance is not particularly limited as long as it is a gene that is specifically expressed in ES cells, a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, or a gene product thereof, for example, Oct3 / 4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc, N-Myc, TERT, SV40 large T antigen, HPV16 E6HP7L , Nanog, Esrrb or Esrrg.
  • These nuclear reprogramming substances may be used in combination when iPS cells are established. For example, a combination including at least one, two, or three of the above nuclear reprogramming substances, preferably a combination including four.
  • a human iPS cell line established as a cell line may be used.
  • preferred human iPS cell lines are ChiPSC7, ChiPSC11, ChiPSC12, ChiPSC19, ChiPSC20, ChiPSC21, ChiPSC22, ChiPSC23, 201B7, 201B7-Ff, 253G1, 253G4, 1201C1, 1205B, and 1203
  • the iPS cell line is ChiPSC12.
  • the above human iPS cell lines are available from Cellartis, iPS Academia Japan, or iPS Research Institute, Kyoto University.
  • ES cells are stem cells established from the inner cell mass of early embryos (for example, blastocysts) of mammals such as humans and mice, and having pluripotency and proliferation ability by self-replication. ES cells were discovered in mice in 1981 (MJ Evans and MH Kaufman (1981), Nature 292: 154-156), and then ES cell lines were established in primates such as humans and monkeys. It was done.
  • ES cells can be established by taking an inner cell mass from a blastocyst of a fertilized egg of a target animal and culturing the inner cell mass on a fibroblast feeder. Moreover, the maintenance of the cell by subculture can be performed using the culture medium which added substances, such as LIF and bFGF.
  • LIF and bFGF added substances
  • the culture of pluripotent stem cells is performed by culturing pluripotent stem cells prepared by an arbitrary method in an appropriate culture vessel / culture substrate, preferably by adhesion culture.
  • adhesion culture refers to culturing cells in a state of being adhered to a culture vessel / culture substrate. In the adherent culture, an embryoid body (EB) is not formed.
  • Adhesion culture is performed using a culture vessel / culture substrate coated with a substance to which cells can adhere.
  • substances to which cells can adhere include various extracellular matrices (collagen, gelatin, laminin, fibronectin, vitronectin, entactin, heparan sulfate proteoglycan, etc.), alterations and modifications thereof, polylysine, and combinations thereof. It is done.
  • Matrigel registered trademark
  • Synthemax registered trademark
  • the culture vessel / culture substrate used in this step and other culture steps in the present invention may be of any material and shape as long as it does not inhibit cell maintenance, survival, differentiation, maturation, or self-replication. I can do it.
  • the shape of the culture vessel / culture substrate is not limited, and any shape such as a flask, a plate, a dish, a bag, and a culture tank can be used.
  • Various commercially available culture vessels / culture substrates may be used.
  • culture using a culture substrate such as a culture vessel or beads equipped with hollow fibers may be performed.
  • a medium used for culturing animal cells can be used.
  • RPMI1640 medium, DEF-CS medium, Medium199, MCDB131 medium, IMDM, EMEM, ⁇ MEM, DMEM, Ham's F12 medium, Fischer's medium, and mixed media thereof are used as the basal medium.
  • a xeno-free medium or a synthetic medium (Chemically-Defined medium) is also used.
  • Commercially available media sold for pluripotent stem cell culture such as StemFit (registered trademark), mTeSR1, Essential8 (trademark), etc. may be used.
  • DEF-CS medium is used as the basal medium.
  • Serum may be added to the medium, or it may be serum-free.
  • albumin, transferrin, growth factor, KSR, N2 supplement, B27 supplement, fatty acid, insulin, collagen precursor, lipid, amino acid, vitamin, 2-mercaptoethanol, 3′-thiolglycerol, trace element, antibiotic Substances, antioxidants, buffers, inorganic salts and the like may be added.
  • the cells are coated with a substance capable of bonding, for example, 0.5 ⁇ 20x10 4 cells / cm 2, preferably cells were seeded at 1 ⁇ 10x10 4 cells / cm 2, and cultured in a suitable medium .
  • the culture period is, for example, 12 hours or longer, preferably 24 hours or longer, more preferably 3 days or longer, but it is natural that an appropriate culture period is determined depending on the cells.
  • medium exchange and passage may be performed as appropriate during the culture period.
  • a physical method As a method for separating the pluripotent stem cells that have been subjected to adhesion culture and other cells in the present invention from the culture vessel, a physical method, a method using a chelating agent, a separation solution having protease activity and / or collagenase activity, for example, Examples include enzymatic methods using TrypLE (registered trademark) Select, Accutase (registered trademark) and Accumax (registered trademark), and combinations thereof.
  • a method of physically finely dispersing the cells is performed after the colony of pluripotent stem cells is dissociated by an enzymatic method.
  • pluripotent stem cells cultured until they become 80% confluent with respect to the culture vessel being used are subjected to the separation operation.
  • Step a) Step of Inducing Mesodermal System Cell Population Containing Endothelial Progenitor Cell without Formation of Embryoid Body from Pluripotent Stem Cell This is a step of inducing differentiation from a pluripotent stem cell into a mesodermal cell population containing endothelial progenitor cells.
  • a population of mesodermal cells containing endothelial progenitor cells is derived from iPS cells or ES cells, and in a particularly preferred embodiment from iPS cells.
  • the cell population can be induced without forming an embryoid body, preferably by performing contact culture.
  • mesoderm cell population means a cell population containing mesodermal cells themselves and / or cells that are differentiated from mesoderm cells.
  • mesoderm cells As cells generated by differentiation from mesoderm cells, hemangioblast, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, endothelium progenitor cells, and endothelial progenitor cells. cardiac progenitor cells).
  • endothelial progenitor cell means a cell that has been directed to differentiation into endothelial cells. Endothelial progenitor cells can be confirmed by analyzing the expression patterns of transcription factors and cell surface antigens. For example, the expression status of transcription factors and cell surface antigens, which are not detected before differentiation induction, or are small even if detected, and their expression levels increase significantly after differentiation induction, are measured alone or in combination. To do. Examples of markers that are effective for confirming endothelial progenitor cells include kinase insert domain receptor (KDR), FOXF1, BMP4, MOX1, and SDF1. Preferably, the endothelial progenitor cells are cells that express KDR. KDR is a molecule called vascular endothelial growth factor receptor-2 (Vascular endorefactor factor-2: VEGFR-2) or Flk-1 as another name, and plays an important role in the process of angiogenesis.
  • KDR vascular endothelial growth factor receptor-2
  • a method suitable for the present invention is a method of obtaining mesoderm cells by culturing pluripotent stem cells in the presence of activin A and / or bone morphogenetic protein 4: BMP4. Illustrated. More preferably, “(i) culture in a medium containing activin A”, “(ii) culture in a medium containing BMP4” and “(iii) a medium containing vascular endothelial growth factor (VEGF)”.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • pluripotent stem cells are cultured by a sandwich method using an extracellular matrix, Mesodermal cells can be efficiently induced.
  • Matrigel can be used as the extracellular matrix. That is, pluripotent stem cells are seeded on a culture vessel coated with Matrigel at, for example, 1 to 20 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , preferably 2 to 15 ⁇ 10 4 cells / cm 2. Incubate for 3 days.
  • the medium is replaced with a medium supplemented with Matrigel diluted 1:10 to 1: 300, preferably 1:20 to 1: 150, more preferably 1:40 to 1:80, and further 16 to 24 hours.
  • a medium supplemented with Matrigel diluted 1:10 to 1: 300 preferably 1:20 to 1: 150, more preferably 1:40 to 1:80, and further 16 to 24 hours.
  • the whole pluripotent stem cell is covered with Matrigel.
  • the thus obtained medium for matrigel-coated pluripotent stem cells is replaced with a medium containing activin A.
  • the concentration of activin A added to the medium is, for example, 10 to 1000 ng / mL, preferably 25 to 500 ng / mL, more preferably 50 to 200 ng / mL.
  • other growth factors and the like may be added to the medium as long as the effects exhibited by the present invention are not impaired.
  • the main culture is performed in the absence of BMP4 and VEGF.
  • a medium used for culturing animal cells can be used as the basal medium.
  • RPMI1640 medium, DEF-CS medium, Medium199, MCDB131 medium, IMDM, EMEM, ⁇ MEM, DMEM, Ham's F12 medium, Fischer's medium, and mixed media thereof are used as the basal medium.
  • a commercially available medium sold for culturing pluripotent stem cells may be used.
  • RPMI 1640 medium is used as the basal medium.
  • Serum may be added to the medium, or it may be serum-free.
  • albumin for example, albumin, transferrin, growth factor, KSR, N2 supplement, B27 supplement, fatty acid, insulin, collagen precursor, lipid, amino acid, vitamin, 2-mercaptoethanol, 3′-thiolglycerol, trace element, antibiotic Substances, antioxidants, buffers, inorganic salts and the like may be added.
  • a preferred medium is RPMI 1640 medium supplemented with L-glutamine, B27 supplement and activin A.
  • L-alanyl L-glutamine dipeptide or GlutaMAX (trademark) can be added instead of L-glutamine added to the above-mentioned medium and the other medium in the present invention.
  • GlutaMAX TM includes L-alanyl L-glutamine dipeptide. L-alanyl L-glutamine dipeptide having a stable structure is suitable for culturing cells because it does not decompose and become toxic ammonia like L-glutamine during storage or culture.
  • Pluripotent stem cells are subjected to adhesion culture in the aforementioned medium.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is, for example, 30 to 40 ° C., preferably 37 ° C.
  • the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air, and the CO 2 concentration is preferably 2 to 8%.
  • the culture time is, for example, 6 hours to 5 days, preferably 12 to 48 hours.
  • (Ii) Culture in medium containing BMP4 The pluripotent stem cells cultured in a medium containing activin A are subsequently subjected to culture in a medium containing BMP4.
  • the main culture may be performed by the same method as the culture of (i) or may be performed by a method different from the culture.
  • an adhesion culture using an extracellular matrix for example an adhesion culture using Matrigel, is performed.
  • the culture in the same container may be continued after exchanging the medium.
  • the concentration of BMP4 added to the medium is, for example, 0.5 to 200 ng / mL, preferably 1 to 100 ng / mL, more preferably 2 to 50 ng / mL.
  • a basic fibroblast growth factor is further added to the medium.
  • concentration of bFGF added to the medium used in this embodiment is, for example, 0.5 to 200 ng / mL, preferably 1 to 100 ng / mL, more preferably 2 to 50 ng / mL.
  • other growth factors and the like may be added to the medium as long as the effects exhibited by the present invention are not impaired.
  • the main culture is performed in the absence of activin A and VEGF.
  • the medium used in the main culture can also be prepared by appropriately combining the same basic medium and various components as described above.
  • an RPMI1640 medium supplemented with L-glutamine, B27 supplement, bFGF and BMP4 is exemplified.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is, for example, 30 to 40 ° C., preferably 37 ° C.
  • the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air, and the CO 2 concentration is preferably 2 to 8%.
  • the culture time is, for example, 12 hours to 5 days, preferably 2 to 4 days.
  • (Iii) Culture in medium containing VEGF After the culture in (ii), the cells are subjected to culture in a medium containing VEGF.
  • the main culture may be performed in the same manner as the cultures (i) and (ii).
  • adhesion culture using an extracellular matrix is performed.
  • the concentration of VEGF in the medium used for the main culture is, for example, 10 to 2000 ng / mL, preferably 50 to 500 ng / mL.
  • other growth factors and the like may be added to the medium as long as the effects exhibited by the present invention are not impaired.
  • the main culture is performed in the absence of activin A and BMP4.
  • the medium used in the main culture can also be prepared by appropriately combining the same basic medium and various components as described above.
  • an RPMI1640 medium supplemented with L-glutamine, B27 supplement and VEGF is exemplified.
  • the culture temperature is not limited to the following, but is, for example, 30 to 40 ° C., preferably 37 ° C.
  • the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air, and the CO 2 concentration is preferably 2 to 8%.
  • the culture time is, for example, 6 hours to 5 days, preferably 12 to 48 hours.
  • the ratio of endothelial progenitor cells is, for example, 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more of the total number of cells.
  • This step is a step of isolating endothelial progenitor cells from a mesodermal cell population containing endothelial progenitor cells obtained in the above step. It is. In the mesodermal cell population containing endothelial progenitor cells obtained in the above step, this step may be omitted if the ratio of endothelial progenitor cells (KDR positive rate) is already sufficiently high.
  • This step (a ′) is preferably carried out after step (a).
  • Isolation of endothelial progenitor cells in this step is performed by using, for example, the above-mentioned endothelial progenitor cell marker using a fluorescence activated cell sorting (FACS) or a magnetic cell separating device (magnetic-activated cell sorting: MACS). Is performed by selectively capturing cells that express, and then collecting the captured cells.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • MACS magnetic-activated cell sorting
  • an antibody that specifically binds to an endothelial progenitor cell marker for example, an anti-KDR antibody
  • a cell population containing endothelial progenitor cells is contacted with a cell population containing endothelial progenitor cells.
  • isolation of endothelial progenitor cells is achieved by collecting the labeled cells. For example, by subjecting a cell population brought into contact with a fluorescently labeled antibody to separation by FACS, cells bound with the antibody can be isolated.
  • a label attached to the antibody or another antibody (secondary antibody) that specifically binds to the antibody itself may be combined. In this case, cell separation is performed using a label added to the secondary antibody.
  • Commercially available antibodies can be used as the anti-KDR antibody and the secondary antibody.
  • “anti-KDR antibody bound with PE fluorescent label” and “magnetic bead embedded with anti-PE antibody” can be used.
  • the ratio of isolated endothelial progenitor cells is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, and more preferably 90% or more.
  • the isolated endothelial progenitor cells can be directly differentiated into endothelial cells, or can be differentiated into endothelial cells after maintaining and culturing the endothelial precursor cells while maintaining their differentiated state.
  • the medium used in the maintenance culture can also be prepared by appropriately combining the same basic medium and various components as described above.
  • a commercially available medium sold for culturing endothelial cells such as an endothelial cell growth medium, may be used.
  • an RPMI1640 medium supplemented with L-glutamine, B27 supplement and VEGF is exemplified.
  • the medium may further contain antibiotics such as penicillin and streptomycin and ROCK inhibitors.
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of Rho kinase (ROCK).
  • Y-27632 is exemplified.
  • the concentration of Y-27632 is, for example, 1 to 500 ⁇ M, preferably 3 to 200 ⁇ M, more preferably 10 to 50 ⁇ M.
  • other growth factors and the like may be added to the medium as long as the effects exhibited by the present invention are not impaired.
  • the maintenance culture is performed in the absence of RepSox described in detail below. .
  • the culture time of the main maintenance culture is, for example, 24 hours or more, preferably 2 days or more, more preferably 3 days or more. However, it is natural to determine an appropriate culture time depending on the state of the cells, the culture conditions, and the like. That is. In addition, medium exchange and passage may be performed as appropriate during the culture period.
  • the ratio of endothelial progenitor cells (KDR positive rate) is hardly lowered by this maintenance culture.
  • the ratio of endothelial progenitor cells is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more.
  • step (B) A step of culturing a mesodermal cell population containing endothelial progenitor cells in the presence of RepSox This step involves culturing a mesodermal cell population containing endothelial progenitor cells obtained in the above step in the presence of RepSox. It is the process of culturing in.
  • step (a ′) is performed, in this step, endothelial progenitor cells are cultured in the presence of RepSox.
  • the mesodermal cell population or endothelial progenitor cell containing endothelial progenitor cells obtained in the above step is subsequently subjected to culture in a medium containing RepSox.
  • the main culturing step may be performed by the same method as the culturing in the above step, or may be performed by a method different from the culturing in the above step.
  • an adhesion culture using an extracellular matrix is performed.
  • the medium may be exchanged and the culturing in the same container may be continued.
  • a mesodermal cell population or endothelial progenitor cell containing endothelial progenitor cells at 0.5 to 10 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , preferably 1 to 5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 And is cultured in a medium containing RepSox.
  • the mesodermal cell population containing endothelial progenitor cells or isolated endothelial progenitor cells Culturing is preferably carried out in a medium that does not contain RepSox.
  • RepSox (CAS No. 446859-33-2) is a low molecular compound that is also called E-616252, SJN2511, Alk5 Inhibitor II, TGF- ⁇ RI Kinase Inhibitor II, etc. as aliases.
  • RepSox is a potent selective inhibitor of ALK5, which is one of TGF- ⁇ receptors, and suppresses the function of TGF- ⁇ by inhibiting ALK5.
  • RepSox is one of TGF- ⁇ inhibitors.
  • transforming growth factor (TGF) - ⁇ is one of many characteristic growth factors that exist in nature, and plays an important role in tissue development, cell differentiation, embryo development and the like.
  • SB431542 (CAS No. 301836-41-9) is a low molecular weight compound that inhibits ALK4, ALK5 and ALK7 which are TGF- ⁇ receptors. SB431542 suppresses the function of TGF- ⁇ by inhibiting the above receptor group. SB431542 is one of TGF- ⁇ inhibitors.
  • the concentration of RepSox used in this step is not particularly limited as long as a desired effect such as inducing endothelial cells with high efficiency can be achieved.
  • the concentration of RepSox added to the medium used in this step is, for example, 0.5 to 100 ⁇ M, preferably 1 to 50 ⁇ M, more preferably 3 to 30 ⁇ M.
  • the medium used in this step can also be prepared by appropriately combining the same basic medium and various components as described above.
  • a preferable medium is exemplified by an endothelial cell growth medium to which RepSox is added.
  • the culture time in the presence of RepSox is, for example, 24 hours to 14 days, preferably 2 to 7 days, but it is natural to determine an appropriate culture time depending on the concentration of RepSox. Further, the RepSox concentration may be appropriately changed during the culture time.
  • endothelial progenitor cells containing endothelial progenitor cells By culturing mesodermal cell populations or endothelial progenitor cells containing endothelial progenitor cells in the presence of RepSox, proliferation of endothelial progenitor cells can be promoted, and as a result, endothelial cells that express endothelial cell markers are expressed. You can get a lot.
  • the endothelial cells obtained by this step have a high number of cells, high purity (high positive rate of endothelial cell marker), complete differentiation stages, and excellent cell proliferation ability (for example, Have one or more characteristics such as being less susceptible to damage caused by freezing and thawing, and having a small difference between lots.
  • endothelial cells refers to endothelial cell markers such as PE-CAM (CD31), VE-cadherin (CD144), endoglin (CD105), and von Willebrand factor (von WF), It means a cell expressing at least one.
  • cells expressing CD31 are preferred, and cells expressing both CD31 and CD144 are more preferred.
  • the endothelial cells obtained by the present invention contain CD31 positive cells in a ratio of, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more.
  • Endothelial cells can be further classified according to their differentiation stage. Among the endothelial cells, the more undifferentiated cells are called “juvenile endothelial cells”, and the more differentiated cells are called “mature endothelial cells”.
  • the differentiation stage of endothelial cells can be confirmed by analyzing the expression pattern of transcription factors and cell surface antigens. That is, the expression status of transcription factors and cell surface antigens whose expression levels change remarkably with the progress of endothelial cell differentiation is measured alone or in combination. Examples of markers that are effective for confirming the differentiation stage of endothelial cells include the endothelial cell markers (CD31, CD144, CD105, vWF) and CD34.
  • CD34 is a marker for hematopoietic stem cells and endothelial progenitor cells. CD34 is also expressed in young endothelial cells. Although not particularly limited, cells expressing both CD31 and CD34 (hereinafter, CD31 + / CD34 + cells) are examples of juvenile endothelial cells. Although the present invention is not particularly limited, the endothelial cells obtained by the present invention contain a large number of juvenile endothelial cells, for example, at a ratio of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more. Includes CD34 + cells.
  • the endothelial cell production method of the present invention can produce various endothelial cells such as vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells or corneal endothelial cells.
  • More endothelial cells can be obtained by continuing the culture of endothelial cells.
  • a basal medium and a medium prepared by appropriately combining various components may be used, but this step is preferably performed in the absence of RepSox.
  • a commercially available medium sold for culturing endothelial cells such as an endothelial cell growth medium, may be used.
  • endothelial cells can be produced by using an endothelial cell growth medium and continuing the culture while performing medium exchange and passage every 1 to 3 days. The endothelial cells thus produced can maintain the properties of the endothelial cells over a long period of time.
  • the endothelial cells can maintain a CD31 positive rate exceeding 60%, preferably a CD31 positive rate exceeding 80%, even on the 30th day after the start of differentiation induction.
  • Step of freezing endothelial cells This step is a step performed after step (b), and is a step of freezing the endothelial cells obtained in the series of steps. Endothelial cells are frozen by suspending the endothelial cells in a solution containing a cryoprotective agent, dispensing the suspension into an appropriate storage container, and freezing it by an appropriate method.
  • cryoprotectant used in the step of freezing endothelial cells can be used as long as it does not inhibit cell maintenance, survival, differentiation, maturation, or self-replication.
  • glycerin, ethylene glycol, dimethyl sulfoxide, sucrose, glucose, polyvinyl pyrrolidone, trehalose and the like can be used.
  • Various commercially available cryoprotectants may be used.
  • stem cell bunker (registered trademark: manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo)
  • cell banker registered trademark: manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo) is used as a cryoprotectant.
  • the storage container can be of any material and shape as long as it does not inhibit cell maintenance, survival, differentiation, maturation, or self-replication.
  • the shape of the storage container is not limited, and any shape such as a vial, a flask, or a bag can be used.
  • Various commercially available storage containers may be used.
  • a vial is used as a storage container.
  • the freezing method can be performed by any method as long as it does not inhibit cell maintenance, survival, differentiation, maturation, and self-replication. Although not particularly limited, for example, slow freezing is performed. It can be frozen slowly using a program freezer, or can be frozen slowly using a freezing container such as a bicelle.
  • the frozen endothelial cells may be stored in liquid nitrogen or a deep freezer at -80 ° C.
  • the endothelial cells can be stored, for example, for 24 hours or longer, preferably 3 days or longer, more preferably 2 weeks or longer.
  • the method for thawing frozen endothelial cells can be performed by any method as long as it does not inhibit cell maintenance, survival, differentiation, maturation, and self-replication.
  • the cells are thawed by heating for 2 to 3 minutes using a water bath heated to 37 ° C.
  • the survival rate of the thawed endothelial cells is 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more.
  • the cultured endothelial cells may be cultured in the same manner as other cells in the present invention. That is, it is preferably performed by adhesion culture using an extracellular matrix.
  • the medium used in the main culture can also be prepared by appropriately combining the same basic medium and various components as described above.
  • a preferable medium is exemplified by an endothelial cell growth medium.
  • the culture time is, for example, 24 hours or longer, preferably 3 days or longer, more preferably 7 days or longer, but it is a matter of course that an appropriate culture time is determined depending on the required cell amount.
  • medium exchange and passage may be performed as appropriate during the culture period.
  • endothelial progenitor cells increase, for example, 1.1 times or more, preferably 1.3 times or more, and more preferably 1.5 times or more. Further, the ratio of endothelial cells (CD31 positive rate) is hardly lowered by the culture. For example, after culturing for 7 days, the ratio of endothelial cells (CD31 positive rate) is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more.
  • the endothelial cells obtained by the present invention described above can be used for the preparation of a myocardial sheet containing endothelial cells as components.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2012-210156 describes a method for producing a myocardial sheet in which Flk / KDR positive cells are mixed with cardiomyocytes, endothelial cells and wall cells to form a sheet.
  • a myocardial sheet can be prepared by the method described in JP 2012-210156 A using the endothelial cells produced in the present invention.
  • the “myocardial sheet” is a sheet-like cell aggregate composed of various cells forming a heart or a blood vessel and connected to each other by intercellular bonding.
  • the various cells forming the heart or blood vessels are exemplified by cardiomyocytes, endothelial cells and wall cells.
  • a method for producing a myocardial sheet by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2012-210156 will be described.
  • This step is a step of producing cardiomyocytes from pluripotent stem cells and is achieved by a known method.
  • cardiomyocytes can be obtained by culturing pluripotent stem cells by the method described in WO2012 / 133554.
  • FLK positive cells can be obtained by pluripotent stem cells by any method, for example, Yamashita et al. (2000), Nature, 408: 92-96.
  • a mixed cell of endothelial cells and mural cells can be obtained by culturing FLK-positive cells based on the description in the document.
  • mural cells can be isolated using antibodies that specifically bind to mural cell markers.
  • the wall cell means a cell exhibiting the same properties as a blood vessel wall cell (a cell surrounding a vascular endothelial cell from the outside) or a progenitor cell thereof.
  • FLK positive cells are cultured on a temperature-sensitive culture vessel (for example, UpCell manufactured by Cellseed Co., Ltd.). After culturing for 1 to 7 days, for example, 3 days later, an appropriate amount of mixed cells of endothelial cells and mural cells and cardiomyocytes prepared by the method of the present invention is added to the culture vessel. By culturing the cell mixture in a medium containing vascular endothelial growth factor (VEGF) for 1 to 10 days, for example, 4 days, a sheet-like cell structure is generated.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the myocardial sheet thus formed can be separated from the culture container and collected by placing the culture container at room temperature. Further, the manufactured myocardial sheets are laminated as desired.
  • the myocardial sheet thus produced can be used for the treatment of heart diseases such as heart failure, myocardial infarction, ischemic heart disease, myocarditis, various cardiomyopathy, and other applications.
  • a myocardial sheet is disposed so as to cover a desired part of the heart, and treatment is performed.
  • the myocardial sheet is engrafted in the heart tissue and promotes functional recovery of the heart.
  • endothelial cells produced by the production method and myocardial sheets produced by the production method are also provided.
  • the KDR positive endothelial progenitor cells contained in the cell composition of the present invention can be prepared by differentiating pluripotent stem cells by a known method. For example, by using a pluripotent stem cell such as an ES cell or iPS cell as a material and performing the step (a) in the method for producing endothelial cells of the present invention, or the steps (a) and (b) Can be obtained. If necessary, the step (a ′) may be further performed.
  • the content of KDR-positive endothelial progenitor cells contained in the cell composition is not particularly limited. For example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more of the cells are KDR-positive. is there.
  • the concentration of RepSox contained in the cell composition is not particularly limited as long as a desired effect such as inducing endothelial cells with high efficiency can be achieved.
  • the concentration of RepSox is, for example, 0.5 to 100 ⁇ M, preferably 1 to 50 ⁇ M, more preferably 3 to 30 ⁇ M.
  • the cell composition may contain a basal medium similar to that used in other steps of the present invention and a medium prepared by appropriately combining various components.
  • a preferable medium is exemplified by an endothelial cell growth medium to which RepSox is added.
  • the cell composition By culturing the cell composition, for example, for 24 hours to 14 days, preferably 2 to 7 days, differentiation from endothelial progenitor cells to endothelial cells is induced, and endothelial cells that express an endothelial cell marker can be obtained. . It is natural to determine an appropriate culture time depending on the concentration of RepSox used.
  • Example 1 Differentiation of iPS cells into vascular endothelial cells
  • Human iPS cells (ChiPSC12 strain) (Cellartis) were cultured in DEF-CS medium (Cellartis) according to the instructions attached to the medium.
  • iPS cells were covered with Matrigel (Matrigel sandwich method) by the following procedure.
  • TrypLE TM Select Life technologies
  • the detached cells were collected by pipetting up to a single cell and counted.
  • the cells were then seeded at 6 ⁇ 10 4 cells / cm 2 on a culture vessel coated with Matrigel TM (Corning) and cultured in DEF-CS medium for 2-3 days. Thereafter, the DEF-CS medium supplemented with 1:60 dilution of Matrigel was replaced, and further cultured for 16 to 24 hours to cover the upper layer of the cells with Matrigel.
  • the obtained Matrigel-coated iPS cells were differentiated into mesoderm cells by the following procedure.
  • the medium of Matrigel-coated iPS cells was added to RPMI 1640 medium (Gibco) supplemented with 100 ng / mL activin A (R & D), 2 mM GlutaMAX TM (Thermo Fisher Scientific) and B27 supplement (without insulin) (Gibco).
  • KDR kinase insert domain receptor
  • the obtained cells were seeded at 2.7 ⁇ 10 4 cells / cm 2 in a Matrigel-coated culture vessel, and B27 supplement, 50 units / mL penicillin, 50 ⁇ g / mL streptomycin, 2 mM GlutaMAX, 20 ⁇ M Y-27632 and 100 ng / mL.
  • the cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with VEGF for 16 to 24 hours (Day 6). Furthermore, the medium of Day 6 was replaced with RPMI 1640 medium supplemented with B27 supplement, 50 units / mL penicillin, 50 ⁇ g / mL streptomycin, 2 mM GlutaMAX and 100 ng / mL VEGF (Day 8).
  • the cells were collected in Day 8, suspended in an endothelial cell growth medium (Promocell) added with RepSox at the concentration shown in Table 1, seeded in a culture vessel at 2 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , and cultured for 3 days (Day 11).
  • Promocell endothelial cell growth medium
  • RepSox RepSox at the concentration shown in Table 1
  • SB431542 another TGF- ⁇ inhibitor
  • Cells were collected on Day 11 and counted.
  • the cells were suspended in a medium containing no TGF- ⁇ inhibitor, ie, an endothelial cell growth medium, and then seeded in a culture vessel at 2 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • the medium was changed every 1 to 3 days, the cells were collected on Day 19, and the number of cells was counted.
  • a part of the cells was used to measure the rate of CD31 positive cells, which are endothelial cell markers, by flow cytometry.
  • the remaining cells were suspended in an endothelial cell growth medium (not containing a TGF- ⁇ inhibitor) and then seeded in a culture vessel at 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • the medium was changed every 1 to 3 days, and the cells were collected on Day 30 and counted, and the CD31 positive cell rate was measured by flow cytometry.
  • Table 1 shows the number of cells in Day 19 and Day 30 when the number of cells in Day 8 is 1.
  • Table 2 shows the ratio of CD31 positive cells in Day 19 and Day 30.
  • Day 19 had a CD31 positive rate exceeding 97%, indicating that highly pure vascular endothelial cells can be obtained by the method of the present invention.
  • SB431542 the cell proliferation rate at Day 30 was 0.9 with 10 ⁇ M SB431542. Further, in 20 ⁇ M SB431542, the cell proliferation rate in Day 30 was 5.1, but the CD31 positive rate was 33.0%.
  • RepSox was used as a TGF- ⁇ inhibitor, the cell proliferation rate in Day 30 was 2.5 or more and the CD31 positive rate was 87% or more in any medium containing 3 ⁇ M RepSox.
  • Example 2 Freezing and Thawing of Vascular Endothelial Cells Induction of vascular endothelial cells was carried out by the method described in Example 1 using a medium supplemented with 20 ⁇ M RepSox, and the cells were collected at Day 18-22. The collected cells were washed and then suspended in Stem Cell Banker (Takara Bio) at a cell concentration of 3 ⁇ 10 6 / mL, and 1 mL each of this suspension was dispensed into vials. The vial was placed in a freezing container (Bicelle, Japan Freezer), and the cells were slowly frozen in a -80 ° C cool box. Each vial was then transferred to liquid nitrogen and stored for 3 days.
  • Stem Cell Banker Stem Cell Banker
  • the frozen cells were heated for 2 minutes 30 seconds using a water bath heated to 37 ° C., and the cells were thawed. When the cell viability was measured using some cells, the cell viability was 87%. The remaining total amount of cells was added to a tube into which 8 mL of endothelial cell growth medium had been dispensed in advance. The vial was then rinsed with 1 mL of endothelial cell growth medium and the rinsed medium was added to the tube. After centrifuging the tube at 200 ⁇ g for 5 minutes, the supernatant was discarded. Cells were suspended in fresh endothelial cell culture medium and seeded in culture vessels at 2 ⁇ 10 4 cells / cm 2 . The medium was changed on the next day, and thereafter, the medium was changed every 1 to 3 days.
  • Example 3 CD31 + / CD34 + Cell Measurement Human iPS cells (ChiPSC12 strain) were cultured in a DEF-CS medium according to the instructions attached to the medium.
  • TrypLE TM Select was added to the subcultured iPS cells and incubated at 37 ° C. for 3-7 minutes. The detached cells were collected by pipetting up to a single cell and counted. Next, cells were seeded at 6 ⁇ 10 4 cells / cm 2 on a Matrigel TM -coated culture vessel and cultured in DEF-CS medium for 2-3 days. Thereafter, the DEF-CS medium supplemented with 1:60 dilution of Matrigel was replaced, and further cultured for 16 to 24 hours to cover the upper layer of the cells with Matrigel.
  • the obtained Matrigel-coated iPS cells were differentiated into mesoderm cells by the following procedure.
  • the medium was replaced with RPMI1640 medium supplemented with 10 ng / mL hBMP4, 10 ng / mL hbFGF, 2 mM GlutaMAX and B27 supplement (Day 4).
  • the medium was changed to RPMI1640 medium supplemented with 100 ng / mL VEGF, 2 mM GlutaMAX and B27 supplement, and cultured overnight (Day 5).
  • RPMI1640 medium supplemented with 100 ng / mL VEGF, 2 mM GlutaMAX and B27 supplement, and cultured overnight (Day 5).
  • formation of embryoid bodies could not be confirmed through Day 0 to Day 5.
  • Vascular endothelial progenitor cells were isolated by separating KDR positive cells from Day 5 cultures using a magnetic cell separator.
  • an anti-KDR antibody bound with a PE fluorescent label was used as a primary antibody for labeling the cells, and the cells labeled with the primary antibody were collected using magnetic beads embedded with the anti-PE antibody.
  • the KDR positive rate was 89-99%.
  • the obtained cells were seeded at 2.7 ⁇ 10 4 cells / cm 2 in a Matrigel-coated culture vessel, and B27 supplement, 50 units / mL penicillin, 50 ⁇ g / mL streptomycin, 2 mM GlutaMAX, 20 ⁇ M Y-27632 and 100 ng / mL.
  • the cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with VEGF for 16 to 24 hours (Day 6). Furthermore, the medium of Day 6 was replaced with RPMI 1640 medium supplemented with B27 supplement, 50 units / mL penicillin, 50 ⁇ g / mL streptomycin, 2 mM GlutaMAX and 100 ng / mL VEGF (Day 8).
  • the cells were changed to Day 11 in a medium containing no TGF- ⁇ inhibitor, that is, an endothelial cell growth medium, and the cells were collected on Day 13 and the number of cells was counted.
  • CD34 positive cells were measured by flow cytometry.
  • the remaining cells were suspended in an endothelial cell growth medium (without RepSox) and then seeded in a culture vessel at 2.7 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • the medium was changed every 1 to 3 days, the cells were collected in Day 13 and Day 18, the number of cells was counted, and CD31 positive cells and CD34 positive cells were measured by flow cytometry.
  • CD31 is a marker for endothelial cells
  • CD34 is a marker for hematopoietic stem cells and endothelial progenitor cells.
  • CD34 is also expressed in young endothelial cells. Therefore, CD31-positive and CD34-positive cells (hereinafter referred to as CD31 + / CD34 +) in the present invention are considered to be young vascular endothelial cells that are not differentiated among vascular endothelial cells.
  • Table 3 shows the ratio of CD31 + / CD34 + cells in Day 13 and Day 18.
  • the present invention provides high-quality endothelial cells.
  • the endothelial cells of the present invention are particularly useful for producing a myocardial sheet.

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Abstract

本発明は、（ａ）多能性幹細胞より、胚様体が形成されることなく、内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団を誘導する工程、及び（ｂ）内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団をＲｅｐＳｏｘの存在下で培養する工程、をこの順で実施する、内皮細胞の製造方法に関する。本発明により、多能性幹細胞から高品質な内皮細胞を効率よく製造することが可能となる。本発明の方法により得られた内皮細胞は、例えば心筋シートの製造に有用であり、心疾患の治療への利用が期待される。本発明の方法により得られた内皮細胞を心筋細胞及び壁細胞と混合して培養することにより心筋シートを製造することができる。

Description

内皮細胞の製造方法
　本発明は、多能性幹細胞から高品質の内皮細胞を製造する方法に関する。
　再生医療に関する技術革新、特に多能性幹細胞の調製法とその分化誘導法が開発されたことにより、生物の組織再生を目指す研究が盛んに実施されている。生物個体の生命維持に不可欠である心臓に関しても、再生医療技術を心疾患の治療に利用することが考えられている。例えば、多能性幹細胞から人為的に作製した心筋細胞を心臓疾患の治療に応用する試みがある。この際、心筋細胞を単独で使用するのではなく、例えば心筋細胞を含むシート状の細胞構築物を形成させる方法が開発されており（特許文献１）、得られた心筋シートの有用性が心筋梗塞モデル動物において示されている。
　特許文献１では心筋細胞を内皮細胞、壁細胞及びＦｌｋ／ＫＤＲ陽性細胞と組み合わせて培養することによって心筋シートが製造される。前記文献では心筋細胞、内皮細胞、壁細胞などの複数の細胞を細胞混合物として調製する方法を開示しているが、心筋シートの品質や製造工程を管理する観点からは、これらの細胞を別個に調製することが望まれる。また、内皮細胞は心血管系以外の組織、臓器を人工的に構成させる際に、組織内で形成される血管の材料となることが期待されている。
　内皮細胞の製造に関してはすでに複数の方法が知られている。多能性幹細胞から効率よく内皮細胞を製造する方法として、例えば特許文献２に記載された方法がある。当該方法は多能性細胞を異なる有効成分を含む複数の培地中で段階的に培養する方法だが、得られた細胞の品質に関してはなお改善の余地がある。
国際公開ＷＯ２０１２／１３３９４５ 国際公開ＷＯ２０１４／１９２９２５
　上記の心筋シートの製造に使用する材料として使用するため、また内皮細胞自体を医療用組成物や研究用の材料として使用するために、より高品質な内皮細胞を効率よく製造する方法が求められている。本明細書において、「高品質な内皮細胞」とは、得られる細胞数が多い、高純度である（内皮細胞マーカーの陽性率が高い）、分化段階が揃っている、細胞増殖能に優れている（例えば、幼若である）、凍結融解によるダメージを受けにくい、ロット間差が小さい、などの特徴を１つ以上もつ内皮細胞を指す。
　本発明は、このような従来の製造方法が有していた問題を解決しようとするものであり、高品質な内皮細胞を製造する方法を提供することを目的とするものである。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、多能性幹細胞から内皮細胞を誘導する際に、内皮前駆細胞をＲｅｐＳｏｘを含まない培地の存在下で培養することにより、多くの高純度内皮細胞を取得し得ることを初めて見出した。さらに前記方法で得られる内皮細胞の多くは幼若内皮細胞であり、凍結保存を行った後も高い生存率及び増殖率を保持していることを明らかにした。本発明はそのような知見を基にして完成されたものである。
　すなわち、本発明は、
[１]（ａ）多能性幹細胞より、胚様体が形成されることなく、内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団を誘導する工程、及び
（ｂ）内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団をＲｅｐＳｏｘの存在下で培養する工程、
をこの順で実施する、内皮細胞の製造方法、
[２]多能性幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、前記[１]に記載の方法、
[３]工程（ａ）において、多能性幹細胞が、（ｉ）アクチビンＡを含有する培地、（ｉｉ）骨形成タンパク質４を含有する培地、及び（ｉｉｉ）血管内皮細胞増殖因子を含有する培地、で順次培養される、前記[１]又は[２]に記載の方法、
[４]（ｉｉ）骨形成タンパク質４を含有する培地がさらに塩基性線維芽細胞増殖因子を含有している、前記[３]に記載の方法、
[５]工程（ａ）の後に、（ａ’）中胚葉系細胞集団より内皮前駆細胞を単離する工程、をさらに含むことを特徴とする、前記[１]～[４]のいずれか１項に記載の方法、
[６]工程（ａ’）において、内皮前駆細胞としてキナーゼ挿入ドメイン受容体陽性細胞が単離される、前記[５]に記載の方法、
[７]工程（ｂ）に先だって、内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団又は単離された内皮前駆細胞のＲｅｐＳｏｘを含まない培地での培養が実施される、前記[１]～[６]のいずれか１項に記載の方法、
[８]工程（ｂ）の後に、（ｃ）内皮細胞を凍結する工程、をさらに含むことを特徴とする、前記[１]～[７]のいずれか１項に記載の方法、
[９]前記[１]～[８]のいずれか１項に記載の方法により内皮細胞を製造する工程、及び内皮細胞を心筋細胞及び壁細胞と混合して培養する工程、
を含む、心筋シートの製造方法、並びに
[１０]キナーゼ挿入ドメイン受容体陽性の内皮前駆細胞と、ＲｅｐＳｏｘとを含有する細胞組成物、に関する。
　本発明の方法により、多能性幹細胞から高品質な内皮細胞を効率よく製造することが可能となる。本発明の方法により得られた内皮細胞は、例えば心筋シートの製造に有用であり、心疾患の治療への利用が期待される。さらに、内皮細胞の異常等に起因する疾患の細胞モデル、薬物の安全性評価のための材料として使用することができる。また、本発明の方法により得られた内皮細胞を心筋細胞及び壁細胞と混合して培養することにより心筋シートを製造することができる。
　本発明を以下に詳細に説明する。
　本明細書において「多能性幹細胞」とは、複数種の細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、自己増殖能をも併せもつ幹細胞であり、以下のものに限定されないが、例えば誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、***幹細胞（ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ＥＳ　ｃｅｌｌ：ｎｔＥＳ細胞）、融合幹細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞はｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であり、さらに好ましい多能性幹細胞はｉＰＳ細胞である。
　ｉＰＳ細胞は、ある特定の核初期化物質を、核酸又はタンパク質の形態で体細胞に導入すること又は薬剤によって当該核初期化物質の内在性のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現を上昇させることによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ａｎｄ　Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６），Ｃｅｌｌ，１２６：６６３－６７６、Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００７），Ｃｅｌｌ，１３１：８６１－８７２、Ｊ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７－１９２０、Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：１０１－１０６）。核初期化物質は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子又はＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えばＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ１８、ｃ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０　ｌａｒｇｅ　Ｔ　ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＰＶ１６　Ｅ６、ＨＰＶ１６　Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｌｉｎ２８、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｎａｎｏｇ、Ｅｓｒｒｂ又はＥｓｒｒｇが例示される。これらの核初期化物質は、ｉＰＳ細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば上記核初期化物質を少なくとも１つ、２つもしくは３つ含む組み合わせであり、好ましくは４つを含む組み合わせである。
　本発明の実施には細胞株として樹立されたヒトｉＰＳ細胞株を使用してもよい。特に限定されないが、好ましいヒトｉＰＳ細胞株はＣｈｉＰＳＣ７、ＣｈｉＰＳＣ１１、ＣｈｉＰＳＣ１２、ＣｈｉＰＳＣ１９、ＣｈｉＰＳＣ２０、ＣｈｉＰＳＣ２１、ＣｈｉＰＳＣ２２、ＣｈｉＰＳＣ２３、２０１Ｂ７、２０１Ｂ７－Ｆｆ、２５３Ｇ１、２５３Ｇ４、１２０１Ｃ１、１２０５Ｄ１、１２１０Ｂ２及び８３６Ｂ３であり、さらに好ましいヒトｉＰＳ細胞株はＣｈｉＰＳＣ１２である。上述のヒトｉＰＳ細胞株はＣｅｌｌａｒｔｉｓやｉＰＳアカデミアジャパン社又は京都大学ｉＰＳ研究所から入手可能である。
　ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、分化多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。ＥＳ細胞は、マウスで１９８１年に発見され（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ　ａｎｄ　Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１５４－１５６）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもＥＳ細胞株が樹立された。
　ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、ＬＩＦ、ｂＦＧＦなどの物質を添加した培地を用いて行うことができる。ヒト及びサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えばＨ．Ｓｕｅｍｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３４５：９２６－９３２、Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１５８０－１５８５などに記載されている。また、いくつかの研究機関はＥＳ細胞の分譲を行っている。例えばヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
　多能性幹細胞の培養は、任意の方法で調製した多能性幹細胞を適切な培養容器／培養基材中で、好ましくは接着培養することで実施される。ここで接着培養とは、細胞を培養容器／培養基材へ接着した状態で培養することを指す。接着培養では、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ　ｂｏｄｙ：ＥＢ）は形成されない。接着培養は、細胞が接着しうる物質でコーティングされた培養容器／培養基材を用いて実施される。細胞が接着しうる物質としては、例えば各種の細胞外マトリックス（コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エンタクチン、へパラン硫酸プロテオグリカン等）、その改変物や修飾物、ポリリジン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは複数の細胞外マトリックスを含有する組成物であるマトリゲル（登録商標）やシンセマックス（登録商標）が本発明に使用される。
　本工程、ならびに本発明における他の培養工程で使用される培養容器／培養基材は、細胞の維持・生存・分化・成熟・自己複製を阻害するものでなければいかなる素材、形状のものも用いることが出来る。培養容器／培養基材の形状にも限定はなく、フラスコ、プレート、ディッシュ、バッグ、培養槽など任意の形状のものを用いることができる。市販されている各種の培養容器／培養基材を使用してもよい。さらに、中空糸を備えた培養容器やビーズのような培養基材を利用した培養を実施してもよい。
　基礎培地としては、動物細胞の培養に用いられる培地を使用することができる。例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＥＦ－ＣＳ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、ＭＣＤＢ１３１培地、ＩＭＤＭ、ＥＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地などが基礎培地として使用される。さらに、ゼノフリー培地や合成培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－Ｄｅｆｉｎｅｄ培地）も使用される。多能性幹細胞の培養用として販売されている市販の培地、例えばＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）、ｍＴｅＳＲ１、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）などを使用してもよい。好ましくは、ＤＥＦ－ＣＳ培地が基礎培地として使用される。培地には、血清が添加されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えばアルブミン、トランスフェリン、増殖因子、ＫＳＲ、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前躯体、脂質、アミノ酸、ビタミン、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール、微量元素、抗生物質、抗酸化剤、緩衝剤、無機塩類などが添加されてもよい。
　細胞が接着しうる物質でコーティングされた培養容器上に、例えば０．５～２０ｘ１０４細胞／ｃｍ２、好ましくは１～１０ｘ１０４細胞／ｃｍ２で細胞を播種し、適切な培地中で培養する。培養期間は、例えば１２時間以上、好ましくは２４時間以上、さらに好ましくは３日間以上が例示されるが、細胞によって、適切な培養期間を決定するのは当然のことである。また、培養期間中に、培地交換や継代を適宜実施してもよい。
　接着培養されている多能性幹細胞、ならびに本発明における他の細胞を培養容器から分離する方法としては、物理的方法、キレート剤を用いる方法、プロテアーゼ活性及び／又はコラゲナーゼ活性を有する分離液、例えばＴｒｙｐＬＥ（商標）　Ｓｅｌｅｃｔ、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）及びＡｃｃｕｍａｘ（登録商標）等、を用いる酵素的方法やそれらの組合せが挙げられる。好ましくは、酵素的方法で多能性幹細胞のコロニーを解離させた後、物理的に細かく細胞を分散させる方法が実施される。通常、使用している培養容器に対して８０％コンフルエントになるまで培養された多能性幹細胞が分離操作に供される。
（１）本発明の内皮細胞の製造方法
（ａ）多能性幹細胞より、胚様体が形成されることなく、内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団を誘導する工程
　本工程は、多能性幹細胞から内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団への分化を誘導する工程である。本発明の好適な態様ではｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞から、特に好適な態様ではｉＰＳ細胞から、内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞の集団が誘導される。本工程においては、好ましくは接触培養を実施することにより、胚様体が形成されることなく前記細胞集団を誘導することができる。
　本明細書において「中胚葉系細胞集団」とは、中胚葉細胞（ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ　ｃｅｌｌｓ）そのもの及び／又は中胚葉細胞から分化して生じる細胞を含有する細胞集団を意味する。中胚葉細胞から分化して生じる細胞として、ヘマンジオブラスト（ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）、内皮前駆細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ）、心筋前駆細胞（ｃａｒｄｉａｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ）などが挙げられる。
　本明細書において「内皮前駆細胞」とは、内皮細胞への分化を方向づけられた細胞を意味する。内皮前駆細胞は転写因子や細胞表面抗原の発現様式を解析することによって確認することができる。例えば、分化誘導前には検出されないか、あるいは検出されても僅かであって、かつ分化誘導後に顕著にその発現量が増加する転写因子や細胞表面抗原の発現状況を単独で、あるいは組み合わせて測定する。内皮前駆細胞の確認に有効なマーカーとして、例えばキナーゼ挿入ドメイン受容体（ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｓｅｒｔ　ｄｏｍａｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＫＤＲ）、ＦＯＸＦ１、ＢＭＰ４、ＭＯＸ１、ＳＤＦ１などが挙げられる。好ましくは、内皮細胞前駆細胞はＫＤＲを発現する細胞である。ＫＤＲは、別名として、血管内皮細胞増殖因子受容体－２（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２：ＶＥＧＦＲ－２）やＦｌｋ－１とも呼ばれる分子で、血管新生の過程において重要な役割を担っている。
　本工程（多能性幹細胞より、胚様体が形成されることなく、内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団を誘導する工程）には特に限定はなく、公知の方法から適切なものを選択すればよいが、本発明に好適な方法として、アクチビンＡ及び／又は骨形成タンパク質４（ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４：ＢＭＰ４）の存在下で多能性幹細胞を培養し、中胚葉細胞を得る方法が例示される。さらに好ましくは、「（ｉ）アクチビンＡを含有する培地での培養」、「（ｉｉ）ＢＭＰ４を含有する培地での培養」及び「（ｉｉｉ）血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）を含有する培地での培養」、の３段階の培養を順次実施することにより多能性幹細胞から中胚葉細胞を誘導する方法が例示される。以下では、この３段階の培養について詳述する。
（ｉ）アクチビンＡを含有する培地での培養
　本発明の一態様として、アクチビンＡを含有する培地で培養する前に、多能性幹細胞を細胞外マトリックスによるサンドイッチ法で培養しておくことにより、中胚葉細胞を効率よく誘導することができる。細胞外マトリックスとしてマトリゲルが使用できる。すなわち、マトリゲルでコーティングされた培養容器上に、例えば１～２０ｘ１０４細胞／ｃｍ２、好ましくは２～１５ｘ１０４細胞／ｃｍ２で多能性幹細胞を播種し、例えばＤＥＦ－ＣＳ培地中で２～３日間接着培養する。その後、例えば１：１０～１：３００希釈、好ましくは１：２０～１：１５０希釈、さらに好ましくは１：４０～１：８０希釈のマトリゲルが添加された培地に交換し、さらに１６～２４時間培養することにより、多能性幹細胞全体をマトリゲルで覆う。このようにして得られたマトリゲル被覆多能性幹細胞の培地を、アクチビンＡを含有する培地に交換する。
　培地に添加されるアクチビンＡの濃度は、例えば１０～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２５～５００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５０～２００ｎｇ／ｍＬである。また、本発明の奏する効果を損なわない範囲で培地に他の成長因子等が添加されてもよいが、好ましくは、本培養はＢＭＰ４及びＶＥＧＦの非存在下にて実施される。
　基礎培地としては、動物細胞の培養に用いられる培地を使用することができる。例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＥＦ－ＣＳ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９、ＭＣＤＢ１３１培地、ＩＭＤＭ、ＥＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地などが基礎培地として使用される。多能性幹細胞の培養用として販売されている市販の培地を使用してもよい。好ましくは、ＲＰＭＩ１６４０培地が基礎培地として使用される。培地には、血清が添加されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、例えばアルブミン、トランスフェリン、増殖因子、ＫＳＲ、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前躯体、脂質、アミノ酸、ビタミン、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール、微量元素、抗生物質、抗酸化剤、緩衝剤、無機塩類などが添加されてもよい。
　好ましい培地として、Ｌ－グルタミン、Ｂ２７サプリメント及びアクチビンＡが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地が例示される。なお、前記培地、ならびに本発明における他の培地に添加されるＬ－グルタミンの代わりに、Ｌ－アラニルＬ－グルタミンジペプチド又はＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を添加することができる。ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）は、Ｌ－アラニルＬ－グルタミンジペプチドを含む。安定した構造をもつＬ－アラニルＬ－グルタミンジペプチドは、保存中や培養中にＬ－グルタミンのように分解して毒性アンモニアになることはないため、細胞の培養に適している。
　多能性幹細胞は、前記の培地中で接着培養に供される。培養温度は、以下に限定されないが、例えば３０～４０℃、好ましくは３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは２～８％である。培養時間は、例えば６時間～５日間であり、好ましくは１２～４８時間である。
（ｉｉ）ＢＭＰ４を含有する培地での培養
　アクチビンＡを含有する培地で培養された多能性幹細胞は、引き続いてＢＭＰ４を含有する培地での培養に供される。本培養は、前記（ｉ）の培養と同じ方法で実施してもよく、前記培養とは異なる方法で実施してもよい。好ましくは細胞外マトリックスを使用する接着培養、例えばマトリゲルを使用する接着培養が実施される。前記培養と同じ方法で培養を実施する場合、培地を交換したうえ、同じ容器での培養を続けてもよい。
　培地に添加されるＢＭＰ４の濃度は、例えば０．５～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１～１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２～５０ｎｇ／ｍＬである。
　本発明の好適な態様では、培地には塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）がさらに添加される。本態様で使用される培地に添加されるｂＦＧＦの濃度は、例えば０．５～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１～１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２～５０ｎｇ／ｍＬである。さらに、本発明の奏する効果を損なわない範囲で培地に他の成長因子等が添加されてもよいが、好ましくは、本培養はアクチビンＡ及びＶＥＧＦの非存在下で実施される。
　本培養で用いる培地も、前記したものと同様の基礎培地並びに各種成分を適宜組み合わせて調製することができる。好ましい培地として、Ｌ－グルタミン、Ｂ２７サプリメント、ｂＦＧＦ及びＢＭＰ４が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地が例示される。
　培養温度は、以下に限定されないが、例えば３０～４０℃、好ましくは３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは２～８％である。培養時間は、例えば１２時間～５日間であり、好ましくは２～４日間である。
（ｉｉｉ）ＶＥＧＦを含有する培地での培養
　前記（ｉｉ）の培養の後、細胞はＶＥＧＦを含有する培地での培養に供される。本培養も、前記（ｉ）、（ｉｉ）の培養と同様に実施すればよい。好ましくは細胞外マトリックスを用いた接着培養が実施される。
　本培養に使用される培地におけるＶＥＧＦの濃度は、例えば１０～２０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０～５００ｎｇ／ｍＬである。さらに、本発明の奏する効果を損なわない範囲で培地に他の成長因子等が添加されてもよいが、好ましくは、本培養はアクチビンＡ及びＢＭＰ４の非存在下で実施される。
　本培養で用いる培地も、前記したものと同様の基礎培地並びに各種成分を適宜組み合わせて調製することができる。好ましい培地として、Ｌ－グルタミン、Ｂ２７サプリメント及びＶＥＧＦが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地が例示される。
　培養温度は、以下に限定されないが、例えば３０～４０℃、好ましくは３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは２～８％である。培養時間は、例えば６時間～５日間であり、好ましくは１２～４８時間である。
　本培養により、内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団が得られる。ここで、内皮前駆細胞の比率（ＫＤＲ陽性率）は全細胞数の例えば４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上である。
（ａ’）中胚葉系細胞集団より内皮前駆細胞を単離する工程
　本工程は、前記の工程で得られた内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団より、内皮前駆細胞を単離する工程である。なお、前記の工程で得られた内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団において、内皮前駆細胞の比率（ＫＤＲ陽性率）がすでに十分高い場合は、本工程を実施しないことも可能である。本工程（ａ’）は、工程（ａ）の後に実施されることが好ましい。
　本工程における内皮前駆細胞の単離は、例えば蛍光活性化セルソーター（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）又は磁気細胞分離装置（ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ：ＭＡＣＳ）などを用いて、前記の内皮前駆細胞マーカーを発現する細胞を選択的に捕捉し、次いで捕捉された細胞を回収することにより行われる。前記の分離手段では、内皮前駆細胞マーカーに特異的に結合する抗体を利用することが有利である。したがって、例えば内皮前駆細胞表面に発現しているＫＤＲやその他のマーカーに結合する抗体又はその断片が本発明に利用される。
　具体的には、内皮前駆細胞を含有する細胞集団に、適切な標識を付した、内皮前駆細胞マーカーに特異的に結合する抗体、例えば抗ＫＤＲ抗体を接触させる。その後、標識された細胞を集めることにより、内皮前駆細胞の単離が達成される。例えば蛍光で標識された抗体と接触させた細胞集団をＦＡＣＳによる分離に供することにより、抗体が結合した細胞を単離することができる。また、磁性物質で標識された抗体を使用する場合には、ＭＡＣＳなどを利用できる。さらに、前記抗体に付された標識もしくは前記抗体自体と特異的に結合する他の抗体（二次抗体）を組み合わせてもよい。この場合、細胞の分離は二次抗体に付加された標識を利用して実施される。前記の抗ＫＤＲ抗体や二次抗体は市販の抗体を使用することができる。特に限定されないが、例えば「ＰＥ蛍光ラベルを結合した抗ＫＤＲ抗体」と「抗ＰＥ抗体を包埋した磁気ビーズ」を使用することができる。
　単離された内皮前駆細胞の比率（ＫＤＲ陽性率）は例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。
　単離された内皮前駆細胞を直接内皮細胞に分化させることもできるし、いったん内皮前駆細胞の分化状態を保ったままで維持培養してから、内皮細胞に分化させることもできる。
　内皮前駆細胞の分化状態を保ったままで維持培養する場合は、前記工程における培養と同様に実施すればよい。すなわち、好ましくはマトリゲルなどの細胞外マトリックスを用いた接着培養により実施される。本維持培養で用いる培地も、前記したものと同様の基礎培地並びに各種成分を適宜組み合わせて調製することができる。内皮細胞の培養用として販売されている市販の培地、例えば内皮細胞増殖培地などを使用してもよい。好ましい培地として、Ｌ－グルタミン、Ｂ２７サプリメント及びＶＥＧＦが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地が例示される。培地は更に、ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質やＲＯＣＫ阻害剤を含んでいてもよい。ＲＯＣＫ阻害剤はＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものであれば特に限定はされないが、例えばＹ－２７６３２が例示される。Ｙ－２７６３２の濃度は、例えば１～５００μＭ、好ましくは３～２００μＭ、さらに好ましくは１０～５０μＭである。さらに、本発明の奏する効果を損なわない範囲で培地に他の成長因子等が添加されてもよいが、好ましくは、本維持培養は、下記で詳述されるＲｅｐＳｏｘの非存在下で実施される。
　本維持培養の培養時間は、例えば２４時間以上、好ましくは２日間以上、より好ましくは３日間以上が例示されるが、細胞の状態や培養条件などによって、適切な培養時間を決定するのは当然のことである。また、培養期間中に、培地交換や継代を適宜実施してもよい。
　本維持培養の工程では、通常、内皮前駆細胞数の顕著な増減はない。また、この維持培養により内皮前駆細胞の比率（ＫＤＲ陽性率）はほとんど低下しない。例えば、３日間維持培養を行った後、内皮前駆細胞の比率（ＫＤＲ陽性率）は７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である。
（ｂ）内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団をＲｅｐＳｏｘの存在下で培養する工程
　本工程は、前記の工程で得られた内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団をＲｅｐＳｏｘの存在下で培養する工程である。工程（ａ’）を実施した場合、本工程では内皮前駆細胞をＲｅｐＳｏｘの存在下で培養することとなる。
　前記工程で得られた内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団又は内皮前駆細胞は、引き続いてＲｅｐＳｏｘを含有する培地での培養に供される。本培養工程は、前記工程における培養と同じ方法で実施してもよく、前記工程における培養とは異なる方法で実施してもよい。好ましくは細胞外マトリックスを使用する接着培養が実施される。前記工程における培養と同じ方法で培養を実施する場合、培地を交換したうえ、同じ容器での培養を続けてもよい。マトリゲルでコーティングされた培養容器を使用する場合、例えば０．５～１０ｘ１０４細胞／ｃｍ２、好ましくは１～５ｘ１０４細胞／ｃｍ２で内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団又は内皮前駆細胞を播種し、ＲｅｐＳｏｘを含有する培地で培養する。本工程においてＲｅｐＳｏｘを使用することによって内皮前駆細胞から内皮細胞に初めて分化させるので、本工程（ｂ）に先立って、内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団又は単離された内皮前駆細胞のＲｅｐＳｏｘを含まない培地で培養を実施することが好ましい。
　ＲｅｐＳｏｘ（ＣＡＳ　Ｎｏ．４４６８５９－３３－２）は、別名として、Ｅ－６１６４５２、ＳＪＮ２５１１、Ａｌｋ５　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＩＩ、ＴＧＦ－βＲＩ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＩＩなどとも呼ばれる低分子化合物である。ＲｅｐＳｏｘは、ＴＧＦ－β受容体の一つであるＡＬＫ５の強力な選択的阻害剤で、ＡＬＫ５を阻害することによりＴＧＦ－βの機能を抑制する。ＲｅｐＳｏｘはＴＧＦ－β阻害剤の一つである。ここで、トランスフォーミング増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）－βは自然に存在する多くの特色ある増殖因子の一つであり、組織発生、細胞分化、胚育成などにおいて重要な役割を果たす。
　ＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ　Ｎｏ．３０１８３６－４１－９）は、ＴＧＦ－β受容体であるＡＬＫ４、ＡＬＫ５及びＡＬＫ７を阻害する低分子化合物である。ＳＢ４３１５４２は、上記の受容体群を阻害することにより、ＴＧＦ－βの機能を抑制する。ＳＢ４３１５４２はＴＧＦ－β阻害剤の一つである。
　本工程で使用されるＲｅｐＳｏｘの濃度は、内皮細胞を高効率で誘導するなどの所望の効果を達成し得る限り特に限定されない。本工程に使用される培地に添加されるＲｅｐＳｏｘの濃度は、例えば０．５～１００μＭ、好ましくは１～５０μＭ、より好ましくは３～３０μＭである。
　本工程で用いる培地も、前記したものと同様の基礎培地並びに各種成分を適宜組み合わせて調製することができる。好ましい培地として、ＲｅｐＳｏｘが添加された内皮細胞増殖培地が例示される。
　ＲｅｐＳｏｘの存在下での培養時間は、例えば２４時間～１４日間、好ましくは２～７日間が例示されるが、ＲｅｐＳｏｘの濃度によって、適切な培養時間を決定するのは当然のことである。また、培養時間中にＲｅｐＳｏｘの濃度を適宜変更してもよい。
　内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団又は内皮前駆細胞をＲｅｐＳｏｘの存在下で培養することにより、内皮前駆細胞の増殖を促進することができ、結果として、内皮細胞マーカーを発現する内皮細胞を多く得ることができる。また、本工程により得られた内皮細胞は、得られる細胞数が多い、高純度である（内皮細胞マーカーの陽性率が高い）、分化段階が揃っている、細胞増殖能に優れている（例えば、幼若である）、凍結融解によるダメージを受けにくい、ロット間差が小さい、などの特徴を１つ以上もつ。
　本明細書において「内皮細胞」とは、ＰＥ－ＣＡＭ（ＣＤ３１）、ＶＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＣＤ１４４）、エンドグリン（ＣＤ１０５）およびフォンウィルブラント因子（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　ｆａｃｔｏｒ：ｖＷＦ）などの内皮細胞マーカーのうち、少なくとも一つを発現している細胞を意味する。ここで、ＣＤ３１を発現する細胞が好ましく、ＣＤ３１及びＣＤ１４４の両方を発現する細胞がより好ましい。特に本発明を限定するものではないが、本発明により得られた内皮細胞は、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の比率でＣＤ３１陽性細胞を含む。
　内皮細胞は、その分化段階に応じて、さらに細かく分類することができる。内皮細胞の中でもより未分化なものは「幼若内皮細胞」と呼ばれ、より分化が進んだものは「成熟内皮細胞」と呼ばれる。内皮細胞の分化段階は、転写因子や細胞表面抗原の発現様式を解析することによって確認することができる。すなわち、内皮細胞の分化の進行に応じて顕著にその発現量が変化する転写因子や細胞表面抗原の発現状況を単独で、あるいは組み合わせて測定する。内皮細胞の分化段階の確認に有効なマーカーとして、例えば、上記内皮細胞マーカー（ＣＤ３１、ＣＤ１４４、ＣＤ１０５、ｖＷＦ）とＣＤ３４とが挙げられる。ＣＤ３４は造血幹細胞や内皮前駆細胞のマーカーである。また、ＣＤ３４は幼若内皮細胞にも発現している。特に限定されないが、ＣＤ３１及びＣＤ３４の両方を発現する細胞（以下、ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋細胞）は、幼若内皮細胞の一例である。特に本発明を限定するものではないが、本発明により得られた内皮細胞は幼若内皮細胞を多く含み、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の比率でＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋細胞を含む。
　本発明の内皮細胞の製造方法により、血管内皮細胞やリンパ管内皮細胞又は角膜内皮細胞など、種々の内皮細胞を製造することができる。
　内皮細胞の培養を継続することにより、より多くの内皮細胞を得ることができる。この工程で使用する培地には、基礎培地並びに各種成分を適宜組み合わせて調製した培地を使用すればよいが、好ましくは、本工程はＲｅｐＳｏｘの非存在下にて実施される。内皮細胞の培養用として販売されている市販の培地、例えば内皮細胞増殖培地などを使用してもよい。例えば内皮細胞増殖培地を使用し、１～３日毎の培地交換及び継代を行いながら培養を継続することで、内皮細胞を製造することができる。こうして製造された内皮細胞は、長期にわたって内皮細胞の特性を維持できる。
　また、本工程（ｂ）で内皮細胞マーカーの大きな低下は見られない。特に限定されないが、内皮細胞は、例えば分化誘導開始後３０日目であっても６０％を超えるＣＤ３１陽性率、好ましくは８０％を超えるＣＤ３１陽性率を維持することができる。
（ｃ）内皮細胞を凍結する工程
　本工程は、工程（ｂ）の後に実施される工程であり、前記の一連の工程で得られた内皮細胞を凍結する工程である。内皮細胞の凍結は、内皮細胞を凍結保護剤が含まれる溶液に懸濁し、この懸濁液を適切な保存容器に分注し、適切な方法で凍結することで実施される。
　内皮細胞を凍結する工程で用いられる凍結保護剤は、細胞の維持・生存・分化・成熟・自己複製を阻害するものでなければいかなるものも用いることが出来る。例えば、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ショ糖、グルコース、ポリビニルピロリドン、トレハロースなどを用いることができる。市販されている各種の凍結保護剤を使用してもよい。例えばステムセルバンカー（登録商標：日本全薬工業製）、好ましくはセルバンカー（登録商標：日本全薬工業製）が凍結保護剤として使用される。特に限定されないが、例えばセルバンカーに、０．５～１０ｘ１０６／ｍＬ、好ましくは１～５ｘ１０６／ｍＬの濃度となるように内皮細胞を懸濁し、この懸濁液を保存容器に分注する。
　保存容器は、細胞の維持・生存・分化・成熟・自己複製を阻害するものでなければいかなる素材、形状のものも用いることが出来る。保存容器の形状にも限定はなく、バイアル、フラスコ、バッグなど任意の形状のものを用いることができる。市販されている各種の保存容器を使用してもよい。例えばバイアルが保存容器として使用される。
　凍結方法は、細胞の維持・生存・分化・成熟・自己複製を阻害するものでなければいかなる方法でも実施される。特に限定されないが、例えば緩速凍結（ｓｌｏｗ　ｆｒｅｅｚｉｎｇ）が実施される。プログラムフリーザーを用いて緩速凍結することもできるし、バイセルなどの凍結処理容器を用いて緩速凍結することもできる。
　凍結された内皮細胞は、液体窒素又は－８０℃のディープフリーザー等の中で保存すればよい。液体窒素の中で保存した場合、内皮細胞は、例えば２４時間以上、好ましくは３日以上、より好ましくは２週間以上保存可能である。
　凍結された内皮細胞の融解方法は、細胞の維持・生存・分化・成熟・自己複製を阻害するものでなければいかなる方法でも実施される。特に限定されないが、例えば３７℃に加温したウォーターバスを用いて２分～３分加温し、細胞を解凍する。融解された内皮細胞の生存率は、６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上である。
　融解された内皮細胞の培養は、本発明における他の細胞の培養と同様に実施すればよい。すなわち、好ましくは細胞外マトリックスを用いた接着培養により実施される。本培養で用いる培地も、前記したものと同様の基礎培地並びに各種成分を適宜組み合わせて調製することができる。好ましい培地として、内皮細胞増殖培地が例示される。培養時間は、例えば２４時間以上、好ましくは３日間以上、より好ましくは７日間以上が例示されるが、必要細胞量によって、適切な培養時間を決定するのは当然のことである。また、培養期間中に、培地交換や継代を適宜実施してもよい。例えば、７日間培養を行った場合、内皮前駆細胞は例えば１．１倍以上、好ましくは１．３倍以上、さらに好ましくは１．５以上に増加する。また、培養により内皮細胞の比率（ＣＤ３１陽性率）はほとんど低下しない。例えば、７日間培養を行った後、内皮細胞の比率（ＣＤ３１陽性率）は８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
（２）本発明の心筋シートの製造方法
　上記の、本発明により得られる内皮細胞は、内皮細胞を構成要素として含有する心筋シートの作製に使用することができる。例えば、特開２０１２－２１０１５６号公報には、Ｆｌｋ／ＫＤＲ陽性細胞と心筋細胞、内皮細胞及び壁細胞を混合してシートを形成させる、心筋シートの製造方法が記載されている。本発明を特に限定するものではないが、本発明で製造された内皮細胞を使用し、特開２０１２－２１０１５６号公報に記載された方法で心筋シートを作製することができる。
　本明細書において「心筋シート」とは、心臓又は血管を形成する各種細胞から成り、細胞間結合により細胞同士が連結されたシート状の細胞集合体である。ここで、心臓又は血管を形成する各種細胞とは心筋細胞、内皮細胞及び壁細胞が例示される。以下、特開２０１２－２１０１５６号公報に記載された方法で心筋シートを製造する方法について説明する。
＜心筋細胞を製造する工程＞
　本工程は、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する工程であり、公知の方法により達成される。特に限定されないが、例えば、多能性幹細胞をＷＯ２０１２／１３３９５４号に記載の方法で培養することにより、心筋細胞を得ることができる。
＜ＦＬＫ陽性細胞及び壁細胞を製造する工程＞
　ＦＬＫ陽性細胞は、多能性幹細胞を任意の方法、例えばＹａｍａｓｈｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．（２０００），Ｎａｔｕｒｅ，４０８：９２－９６に記載の方法で培養することにより得ることができる。また、同文献の記載に基づいてＦＬＫ陽性細胞を培養することにより、内皮細胞及び壁細胞の混合細胞を得ることができる。さらに、壁細胞マーカーに特異的に結合する抗体を用いて、壁細胞を単離することができる。ここで、壁細胞とは、血管壁細胞（血管内皮細胞を外側から取り巻く細胞）と同等の性質を示す細胞又はその前駆細胞を意味する。
＜心筋シートを製造する工程＞
　温度感受性培養容器（例えばセルシード社製のＵｐＣｅｌｌ等）上でＦＬＫ陽性細胞を培養する。１～７日間培養した後、例えば３日後に、本発明の方法で調製された内皮細胞及び壁細胞の混合細胞、心筋細胞の適量を培養容器に添加する。この細胞混合物を、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）を含有する培地中で１～１０日、例えば４日間培養することにより、シート状の細胞構造物が生成する。こうして形成された心筋シートは、培養容器を室温に置くことで培養容器から剥離させ、回収することができる。さらに、所望により、製造された心筋シートは積層化される。
　このようにして製造された心筋シートは心疾患、例えば心不全、心筋梗塞、虚血性心疾患、心筋炎、各種心筋症の治療や、その他の用途に使用できる。例えば、心筋梗塞のような心疾患に関しては、心臓の所望の部位を覆うようにして心筋シートを配置し、治療が実施される。心筋シートは心臓組織に生着し、心臓の機能回復を促進する。
　本発明により、内皮細胞の製造方法、心筋シートの製造方法の他、当該製造方法で製造した内皮細胞及び当該製造方法で製造した心筋シートも提供される。
（３）本発明の細胞組成物
　本発明の細胞組成物は、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｓｅｒｔ　ｄｏｍａｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＫＤＲ）陽性の内皮前駆細胞と、ＲｅｐＳｏｘとを含有し、イン・ビトロでの内皮細胞の製造に使用される。
　本発明の細胞組成物に含有されるＫＤＲ陽性の内皮前駆細胞は、公知の方法により多能性幹細胞を分化させて調製することができる。例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞を材料とし、前記本発明の内皮細胞の製造方法のうちの工程（ａ）を実施することにより、あるいは工程（ａ）および工程（ｂ）を実施することにより得ることができる。必要に応じて、更に前記工程（ａ’）を実施してもよい。ここで、当該細胞組成物に含有されるＫＤＲ陽性の内皮前駆細胞の含有量には特に限定はなく、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の細胞がＫＤＲ陽性である。
　前記細胞組成物に含有されるＲｅｐＳｏｘの濃度は、内皮細胞を高効率で誘導するなどの所望の効果を達成し得る限り特に限定されない。ＲｅｐＳｏｘの濃度は、例えば０．５～１００μＭ、好ましくは１～５０μＭ、より好ましくは３～３０μＭである。
　前記細胞組成物は、本発明における他の工程で用いたものと同様の基礎培地並びに各種成分を適宜組み合わせて調製した培地を含有することができる。好ましい培地として、ＲｅｐＳｏｘが添加された内皮細胞増殖培地が例示される。
　前記細胞組成物を、例えば２４時間～１４日間、好ましくは２～７日間培養することにより、内皮前駆細胞から内皮細胞への分化が誘導され、内皮細胞マーカーを発現する内皮細胞を得ることができる。使用するＲｅｐＳｏｘの濃度によって、適切な培養時間を決定するのは当然のことである。
　以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されないものとする。
実施例１　ｉＰＳ細胞から血管内皮細胞への分化
　ヒトｉＰＳ細胞（ＣｈｉＰＳＣ１２株）（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ）をＤＥＦ－ＣＳ培地（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ）中で、当該培地に付属の説明書に従い培養した。
　効率的に中胚葉細胞を分化誘導するため、以下の手順で、ｉＰＳ細胞をマトリゲルで覆った（マトリゲルサンドイッチ法）。まず、継代培養したｉＰＳ細胞にＴｒｙｐＬＥ（商標）　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加え、３７℃で３～７分間インキュベートした。剥離した細胞を、ピペッティングによりｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌにしてから回収して細胞数をカウントした。次に、マトリゲル（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングされた培養容器上に６ｘ１０４細胞／ｃｍ２で細胞を播種し、ＤＥＦ－ＣＳ培地中で２～３日間培養した。その後、１：６０希釈のマトリゲルが添加されたＤＥＦ－ＣＳ培地に交換し、さらに１６～２４時間培養することにより、マトリゲルで細胞上層を覆った。
　得られたマトリゲル被覆ｉＰＳ細胞を、以下の手順で中胚葉細胞へ分化させた。まず、マトリゲル被覆ｉＰＳ細胞の培地を、１００ｎｇ／ｍＬ　アクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ）、２ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＢ２７サプリメント（インスリン不含）（Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に交換し（この時点を分化誘導開始＝Ｄａｙ０とする）、２４時間培養した（Ｄａｙ１）。次に、１０ｎｇ／ｍＬ　ヒト骨形成タンパク質４（ｈｕｍａｎ　ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４：ｈＢＭＰ４）（Ｒ＆Ｄ）、１０ｎｇ／ｍＬ　ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｕｍａｎ　ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ｈｂＦＧＦ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ及びＢ２７サプリメントが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、３日間培養した（Ｄａｙ４）。その後、１００ｎｇ／ｍＬ　血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、２ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ及びＢ２７サプリメントが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地に培地交換し、一晩培養をおこなった（Ｄａｙ５）。なお、培養物の光学顕微鏡観察を行った結果、Ｄａｙ０～Ｄａｙ５を通して、胚様体の形成は確認できなかった。
　Ｄａｙ５の培養物からキナーゼ挿入ドメイン受容体（ｋｉｎａｓｅ　ｉｎｓｅｒｔ　ｄｏｍａｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＫＤＲ）陽性細胞を磁気細胞分離装置［ＭＡＣＳ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　ｂｉｏｔｅｃｈ］を用いて分離することで、血管内皮前駆細胞を単離した。ＫＤＲ陽性細胞を分離するにあたっては、ＰＥ蛍光ラベルを結合した抗ＫＤＲ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　ｂｉｏｔｅｃｈ）を一次抗体として細胞の標識に使用し、抗ＰＥ抗体を包埋した磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　ｂｉｏｔｅｃｈ）により一次抗体で標識された細胞を回収した。ＭＡＣＳで分離された細胞中に存在するＫＤＲ陽性細胞の比率をフローサイトメトリーにて測定したところ、ＫＤＲ陽性率は８９～９９％であった。得られた細胞を、マトリゲルでコーティングされた培養容器に２.７ｘ１０４細胞／ｃｍ２で播種し、Ｂ２７サプリメント、５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ　ペニシリン、５０μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、２ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ、２０μＭ　Ｙ－２７６３２及び１００ｎｇ／ｍＬ　ＶＥＧＦが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で１６～２４時間培養した（Ｄａｙ６）。さらに、Ｄａｙ６の培地を、Ｂ２７サプリメント、５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ　ペニシリン、５０μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、２ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ及び１００ｎｇ／ｍＬ　ＶＥＧＦが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、２日間培養した（Ｄａｙ８）。
　Ｄａｙ８に細胞を回収し、表１に示す濃度のＲｅｐＳｏｘが添加された内皮細胞増殖培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）で懸濁した後、２ｘ１０４細胞／ｃｍ２で培養容器に播種し、３日間培養した（Ｄａｙ１１）。ここで、陰性対照として、別のＴＧＦ－β阻害剤であるＳＢ４３１５４２を使用した。
　Ｄａｙ１１に細胞を回収して細胞数をカウントした。細胞をＴＧＦ－β阻害剤を含まない培地、すなわち内皮細胞増殖培地で懸濁した後、２ｘ１０４細胞／ｃｍ２で培養容器に播種した。１～３日毎に培地交換を行い、Ｄａｙ１９に細胞を回収して細胞数をカウントするとともに、その一部を使用して内皮細胞マーカーであるＣＤ３１陽性細胞率をフローサイトメトリーにて測定した。残った細胞は内皮細胞増殖培地（ＴＧＦ－β阻害剤を含まない）で懸濁した後、１ｘ１０４細胞／ｃｍ２で培養容器に播種した。１～３日毎に培地交換を行い、Ｄａｙ３０に細胞を回収して細胞数をカウントするとともに、ＣＤ３１陽性細胞率をフローサイトメトリーにて測定した。
　Ｄａｙ８の細胞数を１としたときの、Ｄａｙ１９及びＤａｙ３０における細胞数を表１に示す。また、Ｄａｙ１９及びＤａｙ３０における、ＣＤ３１陽性細胞の比率を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　使用したＴＧＦ－β阻害剤の種類に関わらず、Ｄａｙ１９ではＣＤ３１陽性率が９７％を上回っており、本発明の方法により高純度の血管内皮細胞が得られることが示された。ＳＢ４３１５４２を用いた場合、１０μＭ　ＳＢ４３１５４２ではＤａｙ３０における細胞増殖率が０．９であった。また、２０μＭ　ＳＢ４３１５４２ではＤａｙ３０における細胞増殖率は５．１だったが、ＣＤ３１陽性率が３３．０％だった。一方、ＴＧＦ－β阻害剤としてＲｅｐＳｏｘを用いた場合、３μＭ　ＲｅｐＳｏｘを含む、いずれの培地においても、Ｄａｙ３０における細胞増殖率は２．５以上であり、ＣＤ３１陽性率は８７％以上だった。これらの結果は、血管内皮細胞の分化誘導において、ＳＢ４３１５４２と比べて、ＲｅｐＳｏｘが細胞増殖率及び純度の両方を高いレベルで満足できることを示し、ゆえにＲｅｐＳｏｘがより有用であることを示す。なお、ＴＧＦ－β阻害剤を添加しなかった培地では、Ｄａｙ１１に十分な細胞量が得られなかったため、継代しなかった。
実施例２　血管内皮細胞の凍結融解
　実施例１記載の、２０μＭ　ＲｅｐＳｏｘが添加された培地を使用する方法で血管内皮細胞の誘導を実施し、Ｄａｙ１８～２２に細胞を回収した。回収した細胞を洗浄後、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋｅｒ（タカラバイオ）に３ｘ１０６／ｍＬの細胞濃度となるように懸濁し、この懸濁液１ｍLずつをバイアルに分注した。バイアルを凍結処理容器（バイセル、日本フリーザー）に入れ、－８０℃の保冷庫にて細胞の緩速凍結を行った。その後、各バイアルを液体窒素に移し、３日間保存した。
　凍結細胞を３７℃に加温したウォーターバスを用いて２分３０秒加温し、細胞を解凍した。一部の細胞を用いて細胞生存率を測定したところ、細胞生存率は８７％だった。あらかじめ８ｍＬの内皮細胞増殖培地を分注したチューブに残りの細胞全量を添加した。その後、１ｍＬの内皮細胞増殖培地でバイアルをリンスし、リンスした培地をチューブに加えた。チューブを２００ｘｇで５分間遠心した後、上清を廃棄した。細胞を新たな内皮細胞培養培地で懸濁し、２ｘ１０４細胞／ｃｍ２で培養容器に播種した。翌日に培地交換を行い、以降は１～３日毎に培地交換を行った。
　細胞解凍後７日目に細胞を回収して細胞数をカウントするとともに、内皮細胞マーカーであるＣＤ３１の陽性細胞率をフローサイトメトリーにて測定した結果、１．５～４倍の細胞増殖率及び９５％以上（９６．６～９９％）のＣＤ３１陽性率が認められた。この結果から、本発明の製造方法によって得られた内皮細胞は凍結融解によるダメージが非常に小さいことが明らかとなった。
実施例３　ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋細胞測定
　ヒトｉＰＳ細胞（ＣｈｉＰＳＣ１２株）をＤＥＦ－ＣＳ培地中で、当該培地に付属の説明書に従い培養した。
　継代培養したｉＰＳ細胞にＴｒｙｐＬＥ（商標）　Ｓｅｌｅｃｔを加え、３７℃で３～７分間インキュベートした。剥離した細胞を、ピペッティングによりｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌにしてから回収して細胞数をカウントした。次に、マトリゲル（商標）でコーティングされた培養容器上に６ｘ１０４細胞／ｃｍ２で細胞を播種し、ＤＥＦ－ＣＳ培地中で２～３日間培養した。その後、１：６０希釈のマトリゲルが添加されたＤＥＦ－ＣＳ培地に交換し、さらに１６～２４時間培養することにより、マトリゲルで細胞上層を覆った。
　得られたマトリゲル被覆ｉＰＳ細胞を、以下の手順で中胚葉細胞へ分化させた。まず、マトリゲル被覆ｉＰＳ細胞の培地を、１００ｎｇ／ｍＬ　アクチビンＡ、２ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）及びＢ２７サプリメント（インスリン不含）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地に交換し（この時点を分化誘導開始＝Ｄａｙ０とする）、２４時間培養した（Ｄａｙ１）。次に、１０ｎｇ／ｍＬ　ｈＢＭＰ４、１０ｎｇ／ｍＬ　ｈｂＦＧＦ、２ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ及びＢ２７サプリメントが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、３日間培養した（Ｄａｙ４）。その後、１００ｎｇ／ｍＬ　ＶＥＧＦ、２ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ及びＢ２７サプリメントが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地に培地交換し、一晩培養をおこなった（Ｄａｙ５）。なお、培養物の光学顕微鏡観察を行った結果、Ｄａｙ０～Ｄａｙ５を通して、胚様体の形成は確認できなかった。
　Ｄａｙ５の培養物からＫＤＲ陽性細胞を磁気細胞分離装置を用いて分離することで、血管内皮前駆細胞を単離した。ＫＤＲ陽性細胞を分離するにあたっては、ＰＥ蛍光ラベルを結合した抗ＫＤＲ抗体を一次抗体として細胞の標識に使用し、抗ＰＥ抗体を包埋した磁気ビーズにより一次抗体で標識された細胞を回収した。ＭＡＣＳで分離された細胞中に存在するＫＤＲ陽性細胞の比率をフローサイトメトリーにて測定したところ、ＫＤＲ陽性率は８９～９９％であった。得られた細胞を、マトリゲルでコーティングされた培養容器に２.７ｘ１０４細胞／ｃｍ２で播種し、Ｂ２７サプリメント、５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ　ペニシリン、５０μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、２ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ、２０μＭ　Ｙ－２７６３２及び１００ｎｇ／ｍＬ　ＶＥＧＦが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で１６～２４時間培養した（Ｄａｙ６）。さらに、Ｄａｙ６の培地を、Ｂ２７サプリメント、５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ　ペニシリン、５０μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、２ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ及び１００ｎｇ／ｍＬ　ＶＥＧＦが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、２日間培養した（Ｄａｙ８）。
　Ｄａｙ８に細胞を回収し、表３に示す濃度のＲｅｐＳｏｘが添加された内皮細胞増殖培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）で懸濁した後、２．７ｘ１０４細胞／ｃｍ２で培養容器に播種し、３日間培養した（Ｄａｙ１１）。
　Ｄａｙ１１に細胞をＴＧＦ－β阻害剤を含まない培地、すなわち内皮細胞増殖培地にて培地交換を行い、Ｄａｙ１３に細胞を回収して細胞数をカウントするとともに、その一部を使用してＣＤ３１陽性細胞及びＣＤ３４陽性細胞をフローサイトメトリーにて測定した。残った細胞は内皮細胞増殖培地（ＲｅｐＳｏｘを含まない）で懸濁した後、２．７ｘ１０４細胞／ｃｍ２で培養容器に播種した。１～３日毎に培地交換を行い、Ｄａｙ１３及びＤａｙ１８に細胞を回収して細胞数をカウントするとともに、ＣＤ３１陽性細胞及びＣＤ３４陽性細胞をフローサイトメトリーにて測定した。
　ここで、ＣＤ３１は内皮細胞のマーカーであり、ＣＤ３４は造血幹細胞や内皮前駆細胞のマーカーである。また、ＣＤ３４は幼若内皮細胞にも発現している。よって、本発明における、ＣＤ３１陽性かつＣＤ３４陽性の細胞（以下、ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋）は、血管内皮細胞のうちでも分化がすすんでいないもの、すなわち、幼若な血管内皮細胞であると考えられる。Ｄａｙ１３及びＤａｙ１８における、ＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋細胞の比率を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　ＲｅｐＳｏｘ濃度に関わらず、Ｄａｙ１３ではＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋細胞が９５％以上だった。また、Ｄａｙ１８では、ＲｅｐＳｏｘの濃度が高いほどＣＤ３１＋／ＣＤ３４＋細胞の割合が高くなった。これらの結果は、血管内皮細胞の分化誘導において、ＲｅｐＳｏｘを用いることにより、種々の内皮細胞に分化成熟し得るポテンシャルを有する幼若な血管内皮細胞が高い割合で得られることを示す。
　本発明により、高品質な内皮細胞が提供される。本発明の内皮細胞は、特に心筋シートの製造に有用である。

Claims (10)

  1. 　（ａ）多能性幹細胞より、胚様体が形成されることなく、内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団を誘導する工程、及び
    （ｂ）内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団をＲｅｐＳｏｘの存在下で培養する工程、
    をこの順で実施する、内皮細胞の製造方法。
  2. 　多能性幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、請求項１に記載の方法。
  3. 　工程（ａ）において、多能性幹細胞が、（ｉ）アクチビンＡを含有する培地、（ｉｉ）骨形成タンパク質４を含有する培地、及び（ｉｉｉ）血管内皮細胞増殖因子を含有する培地、で順次培養される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　（ｉｉ）骨形成タンパク質４を含有する培地がさらに塩基性線維芽細胞増殖因子を含有している、請求項３に記載の方法。
  5. 　工程（ａ）の後に、（ａ’）中胚葉系細胞集団より内皮前駆細胞を単離する工程、をさらに含むことを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　工程（ａ’）において、内皮前駆細胞としてキナーゼ挿入ドメイン受容体陽性細胞が単離される、請求項５に記載の方法。
  7. 　工程（ｂ）に先だって、内皮前駆細胞を含有する中胚葉系細胞集団又は単離された内皮前駆細胞のＲｅｐＳｏｘを含まない培地での培養が実施される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　工程（ｂ）の後に、（ｃ）内皮細胞を凍結する工程、をさらに含むことを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の方法により内皮細胞を製造する工程、及び内皮細胞を心筋細胞及び壁細胞と混合して培養する工程、
    を含む、心筋シートの製造方法。
  10. 　キナーゼ挿入ドメイン受容体陽性の内皮前駆細胞と、ＲｅｐＳｏｘとを含有する細胞組成物。
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