CN109996866A - 用于产生内皮细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于产生内皮细胞的方法，其中按以下顺序进行步骤(a)在不形成胚状体的情况下从多能干细胞诱导含有内皮祖细胞的中胚层细胞群，和步骤(b)在存在RepSox的情况下培养含有内皮祖细胞的中胚层细胞群。根据本发明，从多能干细胞高效率地产生高质量的内皮细胞变成可能。通过本发明的方法产生的内皮细胞可用于例如产生心肌细胞层，并且预期用于治疗心脏疾病。通过将通过本发明的方法产生的内皮细胞与心肌细胞和壁细胞混合并然后培养该混合物，可产生心肌细胞层。

Description

用于产生内皮细胞的方法
技术领域
本发明涉及用于从多能干细胞产生高质量的内皮细胞的方法。
背景技术
已经开发了与再生疗法相关的技术创新，特别是用于产生多能干细胞的方法及用于诱导多能干细胞的分化的方法，使得已深入进行了针对生物组织的再生的研究。而且对于对单个生物的生命维持必不可少的心脏，认为再生医学技术可用于治疗心脏疾病。例如，已经尝试将从多能干细胞人工产生的心肌细胞应用于心脏疾病的治疗。此时心肌细胞不是单独使用，而是例如已经开发了用于形成含有心肌细胞的层状细胞构造的方法(专利公布1)，并且已经在具有心肌梗塞的模型动物中显示出由此获得的心肌层的有用性。
在专利公布1中，通过将心肌细胞与内皮细胞、壁细胞和Flk /KDR阳性细胞组合并培养细胞来产生心肌层。尽管以上公布公开了作为细胞混合物制备多种细胞比如心肌细胞、内皮细胞和壁细胞的方法，但是从控制心肌层的质量或产生过程的观点来看，期望单独制备这些细胞。另外，当人工构建除血管以外的组织或器官时，预期内皮细胞被用作用于组织中形成的血管的材料。
已知有几种用于产生内皮细胞的方法。一种用于从多能干细胞有效产生内皮细胞的方法为例如专利公布2中描述的方法。尽管该方法为在含有不同活性成分的多种培养基中逐步培养多能干细胞的方法，但仍然存在改善所获得的细胞质量的空间。
现有技术参考文献
专利公布
专利公布1：WO 2012/133945
专利公布2：WO 2014/192925
发明概述
本发明要解决的问题
为了使用内皮细胞作为用于产生如上所述的心肌层的材料并使用内皮细胞本身作为医学组合物或用于研究的材料，期望一种有效产生更高质量的内皮细胞的方法。本文使用的术语“高质量的内皮细胞”是指具有一种或多种以下特征的内皮细胞，比如获得的细胞数量高、纯度高(内皮细胞标志物的阳性率高)、分化阶段为同质的、具有极好的细胞增殖能力(例如幼年)、更不易受冷冻和解冻损伤的影响、和批次之间的差异小。
本发明旨在解决常规产生方法所具有的问题，并且本发明的目的为提供一种用于产生高质量的内皮细胞的方法。
解决问题的方法
作为解决上述问题的深入研究的结果，本发明人首次发现当从多能干细胞诱导内皮细胞时，通过在存在不含RepSox的培养基的情况下培养内皮祖细胞可获得大量的高纯度内皮细胞。进一步地，本发明人已经发现，通过以上方法获得的大多数内皮细胞为幼年内皮细胞，并且甚至在冷冻保存之后也保持高成活力和增殖率。本发明基于上述发现得以完成。
具体来说，本发明涉及：
[1] 一种用于产生内皮细胞的方法，其包括按以下顺序进行：
(a) 在不形成胚状体的情况下从多能干细胞诱导含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群；和
(b) 在存在RepSox的情况下培养含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群。
[2] 以上[1]的方法，其中多能干细胞为胚胎干细胞(ES细胞)或诱导性多能干细胞(iPS细胞)；
[3] 以上[1]或[2]的方法，其中在步骤(a)中在以下培养基中依序培养多能干细胞：
(i) 含有激活素A的培养基，
(ii) 含有骨形态发生蛋白4的培养基，和
(iii) 含有血管内皮生长因子的培养基；
[4] 以上[3]的方法，其中(ii)含有骨形态发生蛋白4的培养基进一步含有碱性成纤维细胞生长因子；
[5] 以上[1]~[4]中任何一项的方法，其特征为在步骤(a)之后进一步包括(a') 从中胚层谱系细胞群分离内皮祖细胞；
[6] 以上[5]的方法，其中在步骤(a')中，激酶***结构域受体阳性细胞被分离为内皮祖细胞；
[7] 以上[1]~[6]中任何一项的方法，其中在步骤(b)之前，含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群或分离的内皮祖细胞在没有RepSox的培养基中进行培养；
[8] 以上[1]~[7]中任何一项的方法，其特征为在步骤(b)之后进一步包括(c) 冷冻内皮细胞；
[9] 一种用于产生心肌层的方法，其包括：
根据以上[1]~[8]中的任何一项定义的方法产生内皮细胞，和
将内皮细胞与心肌细胞和壁细胞混合以培养细胞；和
[10] 含有激酶***结构域受体阳性内皮祖细胞和RepSox的细胞组合物。
发明效果
根据本发明的方法，可从多能干细胞有效地产生高质量的内皮细胞。根据本发明的方法获得的内皮细胞可用于产生例如心肌层，并且预期用于治疗心脏疾病。进一步地，细胞可用作由内皮细胞的异常等引起的疾病的细胞模型，或者作为药物安全性评价的材料。另外，通过将通过本发明的方法获得的内皮细胞与心肌细胞和壁细胞混合并培养细胞，可产生心肌层。
用于实施本发明的方式
本发明将在下文详细说明。
本文使用的术语“多能干细胞”是指具有能够分化成多种细胞的多能性以及还具有自我增殖能力的干细胞，并且多能干细胞包括例如(但不限于)诱导性多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)、种系干细胞(GS细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、源自通过核移植获得的克隆胚胎的胚胎干细胞(核移植ES细胞；ntES细胞)、融合干细胞等。优选的多能干细胞为iPS细胞或ES细胞，并且更优选的多能干细胞为iPS细胞。
iPS细胞为一种体细胞来源的人工干细胞，其具有与ES细胞几乎相同的特性，例如分化多能性和通过自我复制的增殖能力，并且iPS细胞可通过将核酸或蛋白质形式的特定核重编程物质引入到体细胞中或通过用试剂增加核重编程物质的内源性mRNA和/或蛋白质的表达水平来产生(K. Takahashi和S. Yamanaka (2006), Cell, 126: 663-676; K.Takahashi等(2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu等(2007), Science, 318: 1917-1920; 和M. Nakagawa等(2008), Nat. Biotechnol., 26: 101-106)。核重编程物质可为在ES细胞中特异性表达的基因或者在维持ES细胞的未分化状态中起重要作用的基因或其基因产物。该物质包括例如(但不特别限于) Oct3/4、Klf4、Klf1、Klf2、Klf5、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18、c-Myc、L-Myc、N-Myc、TERT、SV40大T抗原、HPV16 E6、HPV16 E7、Bmil、Lin28、Lin28b、Nanog、Esrrb或Esrrg。当建立iPS细胞时，这些核重编程物质可组合使用。例如，该组合包括至少1种、2种或3种上述核重编程物质，和优选地该组合包括4种上述核重编程物质。
作为细胞系建立的人iPS细胞系可用于本发明的实施方案中。优选的人iPS细胞系为(但不特别限于) ChiPSC7、ChiPSC11、ChiPSC12、ChiPSC19、ChiPSC20、ChiPSC21、ChiPSC22、ChiPSC23、201B7、201B7-Ff、253G1、253G4、1201C1、1205D1、1210B2和836B3，和更优选的人iPS细胞系为ChiPSC12。上述人iPS细胞系可从Cellartis或iPS Academia Japan,Inc.或Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University获得。
ES细胞为从哺乳动物比如人或小鼠的早期胚胎(例如胚泡)的内细胞团建立，并且具有分化多能性和通过自我复制的增殖能力的干细胞。1981年在小鼠中发现了ES细胞(M.J. Evans和M. H. Kaufman (1981), Nature292: 154-156)，并且随后还在灵长类动物比如人和猴中建立了ES细胞。
ES细胞可通过从受试动物的受精卵的胚泡中提取内细胞团并在成纤维细胞的饲养细胞上培养内细胞团来建立。另外，通过传代培养维持细胞可通过使用补充有物质比如LIF或bFGF的培养基来进行。用于建立和维持人和猴的ES细胞的方法描述于例如H.Suemori等(2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345: 926-932; H. Kawasaki等(2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 1580-1585等中。另外，一些研究机构分配ES细胞。例如，作为人ES细胞系的KhES-1、KhES-2和KhES-3可从Institute for FrontierMedical Sciences, Kyoto University (Kyoto, Japan)获得。
多能干细胞的培养通过优选地使根据任何方法制备的多能干细胞经受在合适的培养容器/培养基底中的粘附培养来进行。这里，粘附培养是指在细胞粘附于培养容器/培养基底的状态下培养细胞。在粘附培养中，未形成胚状体(EB)。通过使用涂有细胞可粘附的物质的培养容器/培养基底进行粘附培养。细胞可粘附的物质包括例如各种细胞外基质(胶原蛋白、明胶、层连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等)、其改变的产物或修饰的产物、聚赖氨酸及其组合。优选地，本发明中使用Matrigel (注册商标)或Synthemax (注册商标)，其每种均为含有多种细胞外基质的组合物。
对于本发明的该步骤和其它培养步骤中使用的培养容器/培养基底，可使用具有任何种类的材料或形状的那些，只要其不抑制细胞的维持、成活力、分化、成熟或自我复制。培养容器/培养基底的形状也没有限制，并且可使用具有任何形状的那些，比如瓶、板、皿、袋和温育器。可使用各种市售可得的培养容器/培养基底。进一步地，可使用提供有中空丝的培养容器、或培养基底比如珠粒进行培养。
作为基础培养基，可使用可用于培养动物细胞的培养基。例如，RPMI 1640培养基、DEF-CS培养基、培养基199、MCDB131培养基、IMDM、EMEM、αMEM、DMEM、Ham F12培养基、Fischer培养基、其混合培养基等用作基础培养基。进一步地，也使用无Xeno培养基或合成培养基(化学限定培养基)。可使用作为用于培养多能干细胞的培养基销售的市售可得的培养基，例如Stem Fit (注册商标)、mTeSR1、Essentia18 (商标)等。优选地，DEF-CS培养基用作基础培养基。培养基可添加有血清，或者可不含血清。任选地，可向其中添加例如白蛋白、转铁蛋白、生长因子、KSR、N2补充剂、B27补充剂、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、脂类、氨基酸、维生素、2-巯基乙醇、3'-硫代甘油、微量元素、抗生素、抗氧化剂、缓冲剂、无机盐等。
将细胞以例如0.5-20 x 104个细胞/cm2，优选地1-10 x 104个细胞/cm2的密度接种至涂有细胞可粘附的物质的培养容器中，并将细胞在合适的培养基中进行培养。培养期包括例如12小时或更长时间，优选地24小时或更长时间，和更优选地3天或更长时间，但是预期根据细胞确定合适的培养期。另外，在培养期间可适当地进行培养基更换或传代培养。
用于从培养容器中分离本发明的已经受粘附培养的多能干细胞和其它细胞的方法包括物理方法、使用螯合剂的方法、使用具有蛋白酶活性和/或胶原酶活性的分离溶液(例如TrypLE (商标) Select、Accutase (注册商标)、Accumax (注册商标)等)的酶促方法，及其组合。优选地，在通过酶促方法解离多能干细胞的集落之后，进行使细胞物理经受精细分散的方法。通常，将已紧靠所用的培养容器培养至80%汇合的多能干细胞经受分离操作。
(1) 本发明的用于产生内皮细胞的方法
(a) 在不形成胚状体的情况下从多能干细胞诱导含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群的步骤
该步骤为从多能干细胞诱导分化成含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群的步骤。在本发明的一个优选实施方案中从iPS细胞或ES细胞，和在特别优选的实施方案中从iPS细胞诱导含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群。在该步骤中，通过优选地进行接触培养，可在不形成胚状体的情况下诱导以上细胞群。
本文使用的术语“中胚层谱系细胞群”意指含有中胚层细胞本身和/或通过从中胚层细胞分化产生的细胞的细胞群。通过从中胚层细胞分化产生的细胞包括成血管细胞、间充质干细胞、造血干细胞、内皮祖细胞、心脏祖细胞等。
本文使用的术语“内皮祖细胞”意指其分化指向内皮细胞的细胞。内皮祖细胞可通过分析转录因子或细胞表面抗原的表达模式来确认。例如，单独或组合测量转录因子或细胞表面抗原的表达模式，其中其表达水平未被检测到或低(即使在诱导分化之前被检测到)，并且在诱导分化之后显著增加。有效用于确认内皮祖细胞的标志物包括例如激酶***结构域受体(KDR)、FOXF1、BMP4、MOX1、SDF1等。优选地，内皮细胞祖细胞为表达KDR的细胞。KDR为一种分子，其也称为血管内皮生长因子受体-2：VEGFR-2或Flk-1作为另一个名称，并且在血管形成的过程中起重要作用。
该步骤(在不形成胚状体的情况下从多能干细胞诱导含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群的步骤)没有特别限制，并且可从已知方法中选择合适的方法。用于本发明的优选方法包括这样的方法，即，其包括在存在激活素A和/或骨形态发生蛋白4 (BMP4)的情况下培养多能干细胞以提供中胚层细胞。更优选地，举例说明通过依序进行以下3步培养从多能干细胞诱导中胚层细胞的方法：“(i) 在含有激活素A的培养基中培养”，“(ii) 在含有BMP4的培养基中培养”和“(iii) 在含有血管内皮生长因子(VEGF)的培养基中培养。这种3步培养将在下文详细说明。
(i) 在含有激活素A的培养基中培养
作为本发明的一个实施方案，在含有激活素A的培养基中培养细胞之前，通过用细胞外基质以夹层法培养多能干细胞可有效诱导中胚层细胞。Matrigel可用作细胞外基质。具体来说，将多能干细胞以例如1-20 x 104个细胞/cm2，优选地2-15 x 104个细胞/cm2的密度接种至涂有Matrigel的培养容器中，并使细胞经受在例如DEF-CS培养基中粘附培养2-3天。之后，将培养基更换为添加有稀释至例如1:10-1:300、优选地1:20-1:150和更优选地1:40-1:80的Matrigel的培养基，并将细胞进一步培养16-24小时，其中全部多能干细胞被Matrigel包被。由此获得的Matrigel包被的多能干细胞的培养基更换为含有激活素A的培养基。
添加至培养基中的激活素A的浓度为例如10-1000 ng/mL，优选地为25-500 ng/mL，和更优选地为50-200 ng/mL。另外，可在该范围内向培养基中添加其它生长因子等，使得不损害本发明的效果，并且优选地在不存在BMP4和VEGF的情况下进行这种添加。
作为基础培养基，可使用可用于培养动物细胞的培养基。例如，RPMI 1640培养基、DEF-CS培养基、培养基199、MCDB131培养基、IMDM、EMEM、αMEM、DMEM、Ham F12培养基、Fischer培养基、其混合培养基等用作基础培养基。可使用作为用于培养多能干细胞的培养基销售的市售可得的培养基。优选地，RPMI 1640培养基用作基础培养基。培养基可添加有血清，或者可不含血清。任选地，可向其中添加例如白蛋白、转铁蛋白、生长因子、KSR、N2补充剂、B27补充剂、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、脂类、氨基酸、维生素、2-巯基乙醇、3'-硫代甘油、微量元素、抗生素、抗氧化剂、缓冲剂、无机盐等。
优选的培养基包括添加有L-谷氨酰胺、B27补充剂和激活素A的RPMI 1640培养基。此处，代替添加至以上培养基或本发明的另一种培养基中的L-谷氨酰胺，可添加L-丙氨酰L-谷氨酰胺二肽或GlutaMAX (商标)。GlutaMAX (商标)含有L-丙氨酰L-谷氨酰胺二肽。由于具有稳定结构的L-丙氨酰L-谷氨酰胺二肽在储存或培养期间不会以与L-谷氨酰胺相同的方式分解以形成有毒的氨，因此L-丙氨酰L-谷氨酰胺二肽适合于细胞培养。
使多能干细胞经受在上述培养基中的粘附培养。培养温度为例如(但不限于) 30℃-40℃，和优选地为37℃。培养在含有CO2的空气的气氛下进行，和CO2浓度优选地为2-8%。培养时间为例如6小时-5天，和优选地为12-48小时。
(ii) 在含有BMP4的培养基中培养
已经在含有激活素A的培养基中培养的多能干细胞随后经受在含有BMP4的培养基中培养。该培养可以与以上(i)的培养相同的方式进行，或者可以与以上培养不同的方式进行。优选地，用细胞外基质进行粘附培养，例如使用Matrigel进行粘附培养。在通过与以上培养相同的方法进行培养的情况下，可更换培养基，并然后可在同一容器中继续培养。
添加至培养基中的BMP4的浓度为例如0.5-200 ng/mL，优选地为1-100 ng/mL，和更优选地为2-50 ng/mL。
在本发明的一个优选实施方案中，将碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)进一步添加至培养基中。添加至可用于本实施方案的培养基中的bFGF的浓度为例如0.5-200 ng/mL，优选地为1-100 ng/mL，和更优选地为2-50 ng/mL。进一步地，可在该范围内向培养基中添加其它生长因子等，使得不损害由本发明呈现的效果，并且优选地在不存在激活素A和VEGF的情况下进行这种添加。
用于该培养的培养基可通过适当地组合与上述那些相同的基础培养基和各种组分来制备。优选的培养基包括添加有L-谷氨酰胺、B27补充剂、bFGF和BMP4的RPMI 1640培养基。
培养温度为例如(但不限于) 30℃-40℃，和优选地为37℃。培养在含有CO2的空气的气氛下进行，和CO2浓度优选地为2-8%。培养时间为例如12小时-5天，和优选地为2-4天。
(iii) 在含有VEGF的培养基中培养
在以上(ii)的培养之后，使细胞经受在含有VEGF的培养基中培养。该培养也可以与以上(i)和(ii)的培养相同的方式进行。优选地，进行用细胞外基质的粘附培养。
可用于该培养的培养基中的VEGF的浓度为例如10-2000 ng/mL，和优选地为50-500 ng/mL。进一步地，可在该范围内向培养基中添加其它生长因子等，使得不损害由本发明呈现的效果，并且优选地在不存在激活素A和BMP4的情况下进行这种培养。
用于该培养的培养基也可通过适当地组合与上述那些相同的基础培养基和各种组分来制备。优选的培养基包括添加有L-谷氨酰胺、B27补充剂和VEGF的RPMI 1640培养基。
培养温度为例如(但不限于) 30℃-40℃，和优选地为37℃。培养在含有CO2的空气的气氛下进行，和CO2浓度优选地为2-8%。培养时间为例如6小时-5天，和优选地为12-48小时。
通过该培养，获得含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群。此处，内皮祖细胞的比率(KDR阳性率)为例如总细胞数的40%或更多，优选地50%或更多，和更优选地60%或更多。
(a’) 从中胚层谱系细胞群中分离内皮祖细胞的步骤
该步骤为从上述步骤中获得的含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群中分离内皮祖细胞的步骤。此处，当上述步骤中获得的含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群中的内皮祖细胞的比率(KDR阳性率)已足够高时，也可不进行该步骤。优选的是该步骤(a’)在步骤(a)之后进行。
在该步骤中分离内皮祖细胞通过用荧光激活细胞分选术(FACS)、磁激活细胞分选术(MACS)等选择性地捕获表达上述内皮祖细胞标志物的细胞，并然后收集捕获的细胞来进行。在上述分离方法中，有利的是使用与内皮祖细胞标志物特异性结合的抗体。因此，例如，与KDR或在内皮祖细胞的表面上表达的其它标志物结合的抗体或其片段用于本发明。
具体来说，使含有内皮祖细胞的细胞群与适当标记的抗体接触，所述抗体与内皮祖细胞标志物特异性结合，例如抗KDR抗体。之后，通过收集标记的细胞实现内皮祖细胞的分离。例如，可通过使与荧光标记的抗体接触的细胞群经受经FACS的分离来分离抗体结合的细胞。另外，在使用以磁性材料标记的抗体的情况下，可使用MACS等。进一步地，以上抗体可与另一种抗体(二抗)组合，所述二抗与附着于以上抗体的标记物或抗体本身特异性结合。在这种情况下，通过使用附着于二抗的标记物进行细胞的分离。市售可得的抗体可用作以上抗KDR抗体或二抗。例如，可使用“与PE荧光标记物结合的抗KDR抗体”和“包埋抗PE抗体的磁珠”，但不特别限于此。
分离的内皮祖细胞的比率(KDR阳性率)为例如70%或更多，优选地为80%或更多，和更优选地为90%或更多。
分离的内皮祖细胞可直接分化成内皮细胞，或者内皮祖细胞可在维持培养一次之后分化成内皮细胞，同时保持内皮祖细胞的分化状态。
在内皮祖细胞经受维持培养同时保持内皮祖细胞的分化状态的情况下，可以与上述步骤中的培养相同的方式进行维持培养。具体来说，通过使用细胞外基质比如Matrigel的粘附培养进行维持培养。用于该维持培养的培养基也可通过适当地组合与上述那些相同的基础培养基与各种组分来制备。可使用作为用于培养内皮细胞的培养基(例如用于增殖内皮细胞的培养基等)销售的市售可得的培养基。优选的培养基包括添加有L-谷氨酰胺、B27补充剂和VEGF的RPMI 1640培养基。培养基可进一步含有抗生素(比如青霉素或链霉素)或ROCK抑制剂。ROCK抑制剂没有特别限制，只要抑制剂可抑制Rho激酶(ROCK)的功能，并且抑制剂包括例如Y-27632。Y-27632的浓度为例如1-500 μM，优选地为3-200 μM，和更优选地为10-50 μM。进一步地，可在该范围内向培养基中添加其它生长因子等，使得不损害由本发明呈现的效果，并且优选地在不存在以下详述的RepSox的情况下进行这种维持培养。
维持培养的培养时间包括例如24小时或更长时间，优选地2天或更长时间，和更优选地3天或更长时间，并且预期根据细胞的状态或培养条件确定合适的培养时间。另外，在培养期间可适当地进行培养基更换或传代培养。
通常，在该维持培养步骤中，内皮祖细胞的数量没有显示出显著的增加或减少。另外，维持培养几乎不降低内皮祖细胞的比率(KDR阳性率)。例如，在维持培养进行3天之后，内皮祖细胞的比率(KDR阳性率)为70%或更多，优选地为80%或更多，和更优选地为90%或更多。
(b) 在存在RepSox的情况下培养含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群的步骤
该步骤为在存在RepSox的情况下培养在上述步骤中获得的含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群的步骤。在进行步骤(a')的情况下，在该步骤中，在存在RepSox的情况下培养内皮祖细胞。
随后使上述步骤中获得的含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群或内皮祖细胞经受在含有RepSox的培养基中的培养。该培养步骤可以与上述步骤中的培养相同的方式进行，或者可以与上述步骤中的培养不同的方式进行。优选地，进行用细胞外基质的粘附培养。在以与上述步骤中的培养相同的方式进行培养的情况下，更换培养基，并然后可在同一容器中继续培养。在使用涂有Matrigel的培养容器的情况下，例如含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群或内皮祖细胞以0.5-10 x 104个细胞/cm2，和优选地1-5 x 104个细胞/cm2的密度接种，并且细胞在含有RepSox的培养基中培养。由于在该步骤中通过使用RepSox首次使内皮祖细胞分化成内皮细胞，优选的是在该步骤(b)之前将含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群或分离的内皮祖细胞在不含RepSox的培养基中进行培养。
RepSox (CAS号446859-33-2)为低分子量化合物，其也称为E-616452、SJN2511、Alk5抑制剂II、TGF-βRI激酶抑制剂II等作为另一个名称。RepSox为ALK5 (TGF-β受体之一)的强选择性抑制剂，其通过抑制ALK5来抑制TGF-β的功能。RepSox为TGF-β抑制剂之一。此处，转化生长因子(TGF)-β为具有许多特征的天然存在的生长因子之一，其在组织发育、细胞分化、胚胎生长等中起重要作用。
SB431542 (CAS号301836-41-9)为低分子量化合物，其抑制ALK4、ALK5和ALK7 (其各自均为TGF-β受体)。SB431542通过抑制上述受体组来抑制TGF-β的功能。SB431542为TGF-β抑制剂之一。
可用于该步骤的RepSox的浓度没有特别限制，只要RepSox可实现期望的效果，比如高效诱导内皮细胞。添加至用于该步骤的培养基中的RepSox的浓度为例如0.5-100 μM，优选地为1-50 μM，和更优选地为3-30 μM。
用于该步骤的培养基也可通过适当地组合与上述那些相同的基础培养基与各种组分来制备。优选的培养基包括添加有RepSox的用于增殖内皮细胞的培养基。
在存在RepSox的情况下的培养时间包括例如24小时-14天，和优选地为2-7天，并且预期根据RepSox的浓度确定合适的培养时间。另外，RepSox的浓度可适当地变化。
在存在RepSox的情况下培养含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群或内皮祖细胞，从而可促进内皮祖细胞的增殖，并且结果是可大量获得表达内皮细胞标志物的内皮细胞。另外，在该步骤中获得的内皮细胞具有一种或多种以下特征，比如获得的细胞数量高、纯度高(内皮细胞标志物的阳性率高)、分化阶段为同质的、具有极好的细胞增殖能力(例如幼年)、更不易受冷冻和解冻损伤的影响、和批次之间的差异小。
本文使用的术语“内皮细胞”意指表达至少一种内皮细胞标志物比如PE-CAM(CD31)、VE-钙粘蛋白(CD144)、内皮糖蛋白(CD105)和冯维勒布兰德因子(vWF)的细胞。此处，表达CD31的细胞为优选，和表达CD31和CD144两者的细胞为更优选。通过本发明获得的内皮细胞含有CD31阳性细胞，其比率为例如70%或更多，优选地为80%或更多，更优选地为90%或更多，但本发明不特别限于此。
内皮细胞可根据其分化阶段更精细地分类。在内皮细胞中，更加未分化的细胞称为“幼年内皮细胞”，和具有分化进展的细胞称为“成熟内皮细胞”。内皮细胞的分化阶段可通过分析转录因子或细胞表面抗原的表达模式来确认。具体来说，单独或组合测量转录因子或细胞表面抗原的表达模式，其中其表达水平根据内皮细胞的分化进展而显著变化。有效确认内皮细胞的分化阶段的标志物包括例如上述内皮细胞标志物(CD31、CD144、CD105、vWF)和CD34。CD34为造血干细胞或内皮祖细胞的标志物。另外，CD34也在幼年内皮细胞上表达。表达CD31和CD34两者的细胞(下文中CD31+/CD34+细胞)为(但不特别限于)幼年内皮细胞的一个实例。通过本发明获得的内皮细胞含有大量的幼年内皮细胞，并且例如细胞含有70%或更多、优选地80%或更多和更优选地90%或更多的比率的CD31+/CD34+细胞，但本发明不特别限于此。
根据本发明的用于产生内皮细胞的方法，可产生各种内皮细胞比如血管内皮细胞、***内皮细胞或角膜内皮细胞。
通过继续培养内皮细胞可获得更大量的内皮细胞。作为用于该步骤的培养基，可使用通过适当地组合基础培养基和各种组分制备的培养基，并且优选的是该步骤在不存在RepSox的情况下进行。可使用作为用于培养内皮细胞的培养基(例如用于增殖内皮细胞的培养基)销售的市售可得的培养基。例如，内皮细胞可通过使用用于增殖内皮细胞的培养基，并且继续培养同时每1-3天进行培养基更换和传代培养来产生。由此产生的内皮细胞可长期保持内皮细胞的特性。
另外，在该步骤(b)中未观察到内皮细胞标志物的大量减少。内皮细胞可保持(但不特别限于) CD31阳性率超过60%，和优选地CD31阳性率超过80%，甚至在开始诱导分化之后30天时。
(c) 冷冻内皮细胞的步骤
该步骤为在步骤(b)之后进行的步骤，并且为冷冻在上述一系列步骤中获得的内皮细胞的步骤。通过将内皮细胞悬浮于含有冷冻保护剂的溶液中，将该悬浮液分配于合适的储存容器中，并根据适当的方法冷冻储存容器来进行内皮细胞的冷冻。
作为可用于冷冻内皮细胞的步骤的冷冻保护剂，可使用任何冷冻保护剂，只要冷冻保护剂不抑制细胞的维持、成活力、分化、成熟或自我复制。例如可使用甘油、乙二醇、二甲基亚砜、蔗糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖等。还可使用各种市售可得的冷冻保护剂。例如，由Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd制造的STEM-CELLBANKER (注册商标)，和优选地由Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.制造的CELLBANKER (注册商标)用作冷冻保护剂。例如，内皮细胞悬浮于(但不特别限于) CELLBANKER中，使得其浓度为0.5-10 x 106/mL，和优选地为1-5 x 106/mL，并将悬浮液分配于储存容器中。
作为储存容器，可使用具有任何材料和形状的那些储存容器，只要该容器不抑制细胞的维持、成活力、分化、成熟或自我复制。储存容器的形状也没有特别限制，并且可使用具有任何形状的容器，比如小瓶、瓶或袋。可使用各种市售可得的储存容器。例如小瓶用作储存容器。
作为冷冻方法，进行任何方法，只要该方法不抑制细胞的维持、成活力、分化、成熟或自我复制。例如进行缓慢冷冻，但不特别限于此。也可用程序化的冷冻机进行缓慢冷冻，并且也可使用冷冻处理的容器比如BICELL进行缓慢冷冻。
冷冻的内皮细胞可储存于液氮、保持在-80℃的深度冷冻机等中。当细胞储存于液氮中时，内皮细胞可储存例如24小时或更长时间，优选地3天或更长时间，和更优选地2周或更长时间。
作为用于解冻冷冻的内皮细胞的方法，进行任何方法，只要该方法不抑制细胞的维持、成活力、分化、成熟或自我复制。例如将细胞用温热至37℃的水浴温热并解冻，但不特别限于此。解冻的内皮细胞的成活力为60%或更高，优选地为70%或更高，和更优选地为80%或更高。
解冻的内皮细胞的培养可以与本发明中的其它细胞的培养相同的方式进行。具体来说，培养优选地通过用细胞外基质的粘附培养来进行。用于该培养的培养基也可通过适当地组合与上述那些相同的基础培养基和各种组分来制备。优选的培养基包括用于增殖内皮细胞的培养基。培养时间包括例如24小时或更长时间，优选地3天或更长时间，和更优选地7天或更长时间，并且预期根据需要的细胞量确定合适的培养时间。另外，可在培养期间适当地进行培养基更换或传代培养。例如，在培养进行7天的情况下，内皮祖细胞增加至例如1.1倍或更多，优选地1.3倍或更多，和更优选地1.5倍或更多。另外，内皮细胞的比率(CD31阳性率)几乎不降低。例如，在培养进行7天之后，内皮细胞的比率(CD31阳性率)为80%或更多，优选地为90%或更多，和更优选地为95%或更多。
(2) 本发明的用于产生心肌层的方法
通过上述本发明获得的内皮细胞可用于产生含有内皮细胞作为组分的心肌层。例如，日本专利特许公报第2012-210156号描述了一种用于产生心肌层的方法，其中使Flk/KDR阳性细胞与心肌细胞、内皮细胞和壁细胞混合以形成层。心肌层可按照日本专利特许公报第2012-210156号中描述的方法，使用本发明中产生的内皮细胞来产生，但本发明不特别限于此。
本文使用的术语“心肌层”是指由形成心脏或血管的各种细胞组成的层状细胞构造，其中细胞经细胞间结合彼此连接。此处，形成心脏或血管的各种细胞包括心肌细胞、内皮细胞和壁细胞。下文将说明按照日本专利特许公报第2012-210156号中描述的方法产生心肌层的方法。
<产生心肌细胞的步骤>
该步骤为从多能干细胞产生心肌细胞的步骤，其通过已知方法实现。心肌细胞可通过例如按照WO 2012/133954中描述的方法培养多能干细胞来获得，但不特别限于此。
<产生FLK阳性细胞和壁细胞的步骤>
FLK阳性细胞可通过按照任何方法，例如Yamashita等(2000), Nature, 408: 92-96中描述的方法培养多能干细胞来获得。另外，通过基于相同参考文献的描述培养FLK阳性细胞，可获得内皮细胞和壁细胞的细胞混合物。进一步地，可通过使用与壁细胞标志物特异性结合的抗体来分离壁细胞。此处，壁细胞意指呈现出与血管壁细胞(来自其外部的血管内皮细胞周围的细胞)或其祖细胞等同的特性的细胞。
<产生心肌层的步骤>
FLK阳性细胞在温敏性培养容器，例如由CellSeed Inc.制造的UpCell等上培养。在细胞培养1-7天之后，例如3天之后，将通过本发明的方法制备的内皮细胞和壁细胞的细胞混合物和心肌细胞以适当的量加入到培养容器中。将细胞混合物在含有血管内皮生长因子(VEGF)的培养基中培养1-10天，例如4天，从而形成层状细胞构造。可通过使培养容器在室温下静置，从培养容器中取出由此形成的心肌层，从而可收集心肌层。进一步地，根据需要，层压产生的心肌层。
由此产生的心肌层可用于治疗心脏疾病，例如心力衰竭、心肌梗塞、缺血性心脏病、心肌炎、各种心肌病或其它应用。例如，对于心脏疾病比如心肌梗塞，放置心肌层以覆盖期望的心脏部位，从而进行治疗。心肌层被带至心脏组织，以促进心脏功能的恢复。
根据本发明，除了用于产生内皮细胞的方法和用于产生心肌层的方法之外，还提供通过该方法产生的内皮细胞和通过该方法产生的心肌层。
(3) 本发明的细胞组合物
本发明的细胞组合物含有激酶***结构域受体(KDR)阳性内皮祖细胞和RepSox，并且该组合物用于体外内皮细胞的产生。
本发明的细胞组合物中含有的KDR阳性内皮祖细胞可通过按照已知方法分化多能干细胞来制备。例如，可通过使用多能干细胞比如ES细胞或iPS细胞作为材料，并且在本发明的用于产生内皮细胞的以上方法中进行步骤(a)，或者进行步骤(a)和步骤(b)，来获得内皮祖细胞。可根据需要进一步进行以上步骤(a')。此处，细胞组合物中含有的KDR阳性内皮祖细胞的含量为例如(但不特别限于)为KDR阳性的细胞的70%或更多，优选地80%或更多，和更优选地90%或更多。
以上细胞组合物中含有的RepSox的浓度没有特别限制，只要可实现期望的效果比如高效诱导内皮细胞。RepSox的浓度为例如0.5-100 μM，优选地为1-50 μM，和更优选地为3-30 μM。
上述细胞组合物可含有通过适当地组合与本发明的其它步骤中使用的那些相同的基础培养基和各种组分制备的培养基。优选的培养基包括添加有RepSox的用于增殖内皮细胞的培养基。
将上述细胞组合物培养例如24小时-14天，和优选地2-7天，从而诱导内皮祖细胞分化成内皮细胞，从而可获得表达内皮细胞标志物的内皮细胞。预期根据使用的RepSox的浓度确定合适的培养时间。
实施例
通过以下实施例更具体地描述本发明，但不旨在使本发明的范围限于这些实施例。
实施例1：从iPS细胞分化成血管内皮细胞
按照培养基附带的说明书，在DEF-CS培养基(Cellartis)中培养人iPS细胞(ChiPSC12品系) (Cellartis)。
为了有效地诱导中胚层细胞的分化，按照以下程序用Matrigel包被iPS细胞(Matrigel夹层法)。首先，将TrypLE (商标) Select (Life technologies)添加至已传代培养的iPS细胞中，并将细胞在37℃下温育3-7分钟。通过吸液将分离的细胞收集为单细胞，并计数细胞数量。接下来，将细胞以6 x 104个细胞/cm2的密度接种至涂有Matrigel (商标)(Corning)的培养容器中，并在DEF-CS培养基中培养2-3天。之后，将培养基更换为添加有稀释至1:60的Matrigel的DEF-CS培养基，并将细胞再培养16-24小时，从而用Matrigel包被细胞的上层。
按照以下程序使获得的Matrigel包被的iPS细胞分化成中胚层细胞。首先，将Matrigel包被的iPS细胞的培养基更换为添加有100 ng/mL激活素A (R&D)、2 mM GlutaMAX(商标) (Thermo Fisher Scientific)和B27补充剂(不含胰岛素) (Gibco)的RPMI 1640培养基(Gibco) (该时间点定义为开始诱导分化=第0天)，并将细胞培养24小时(第1天)。接下来，将培养基更换为添加有10 ng/mL人骨形态发生蛋白4 (hBMP4) (R&D)、10 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF) (Peprotech)、2 mM GlutaMAX和B27补充剂的RPMI 1640培养基，并将细胞培养3天(第4天)。之后，将培养基更换为添加有100 ng/mL血管内皮生长因子(VEGF) (Peprotech)、2 mM GlutaMAX和B27补充剂的RPMI 1640培养基，并将细胞培养过夜(第5天)。此处，作为用光学显微镜观察所培养的细胞的结果，从第0天至第5天不能确认胚状体的形成。
在第5天用磁激活细胞分选术[MACS(注册商标), Miltenyi biotech]从培养的细胞中分离激酶***结构域受体(KDR)阳性细胞，从而分离血管内皮祖细胞。为了分离KDR阳性细胞，将结合有PE荧光标记物的抗KDR抗体(Miltenyi biotech)用作用于标记细胞的一抗，并用包埋抗PE抗体的磁珠(Miltenyi biotech)收集用一抗标记的细胞。当用流式细胞术测量通过MACS分离的细胞中存在的KDR阳性细胞的比率时，KDR阳性率为89-99%。将获得的细胞以2.7 x 104个细胞/cm2的密度接种至涂有Matrigel的培养容器中，并在添加有B27补充剂、50单位/mL青霉素、50 μg/mL链霉素、2 mM GlutaMAX、20 μM Y-27632和100 ng/mLVEGF的RPMI 1640培养基中培养16-24小时(第6天)。进一步地，将第6天的培养基更换为添加有B27补充剂、50单位/mL青霉素、50 μg/mL链霉素、2 mM GlutaMAX和100 ng/mL VEGF的RPMI 1640培养基，并将细胞培养2天(第8天)。
在第8天收集细胞，并悬浮于以表1中列出的浓度添加有RepSox的用于增殖内皮细胞的培养基(Promocell)中。之后，将细胞以2 x 104个细胞/cm2的密度接种至培养容器中，并培养3天(第11天)。此处，另一种TGF-β抑制剂SB431542用作阴性对照。
在第11天收集细胞，并计数细胞数量。使细胞悬浮于不含TGF-β抑制剂的培养基中，即用于增殖内皮细胞的培养基，并以2 x 104个细胞/cm2的密度接种至培养容器中。每1-3天更换培养基，并在第19天收集细胞，且计数细胞数量。同时，其一部分用于通过流式细胞术测量CD31 (一种内皮细胞标志物)阳性细胞比率。使剩余的细胞悬浮于用于增殖内皮细胞的培养基(不含TGF-β抑制剂)中，并然后将细胞以1 x 104个细胞/cm2的密度接种至培养容器中。每1-3天更换培养基，在第30天收集细胞，并计数细胞数量。同时，用流式细胞术测量CD31阳性细胞比率。
当第8天的细胞数量定义为1时，第19天和第30天的细胞数量如表1所示。另外，第19天和第30天的CD31阳性细胞比率如表2所示。
[表1]
[表2]
表明无论使用何种TGF-β抑制剂，第19天的CD31阳性率超过97%，使得通过本发明的方法获得了具有高纯度的血管内皮细胞。当使用SB431542时，第30天的细胞增殖率在10 μMSB431542中为0.9。另外，尽管第30天的细胞增殖率在20 μM SB431542中为5.1，但CD31阳性率为33.0%。另一方面，当RepSox用作TGF-β抑制剂时，第30天的细胞增殖率在含有3 μMRepSox的培养基中为2.5或更高和CD31阳性率为87%或更高。这些结果表明，与SB431542的那些相比较，RepSox在诱导血管内皮细胞的分化中可以高水平满足细胞增殖率和纯度两者，并且因此RepSox更有用。此处，由于在第11天在没有添加TGF-β抑制剂的培养基中未获得足够量的细胞，因此细胞未进行传代培养。
实施例2：血管内皮细胞的冷冻和解冻
血管内皮细胞的诱导按照实施例1中所述的使用添加有20 μM RepSox的培养基的方法进行，并且从第18-22天收集细胞。洗涤收集的细胞，并悬浮于Stem Cell Banker (TAKARABIO INC.)中，使得细胞浓度为3 x 106/mL，并将1 mL的每种悬浮液分配于小瓶中。将小瓶置于冷冻处理的容器(BICELL, Nihon Freezer Co., Ltd.)中，并使细胞经受在保持于-80℃温度下的冷冻储存室中缓慢冷冻。之后，将每个小瓶转移至液氮中，并储存3天。
将冷冻的细胞用温热至37℃的水浴温热2分30秒以使细胞解冻。通过使用一部分细胞测量细胞成活力，并且结果是细胞成活力为87%。将全部量的剩余细胞加入预先分配有8 mL用于增殖内皮细胞的培养基的管中。之后，用1 mL用于增殖内皮细胞的培养基冲洗小瓶，并向管中加入冲洗过的培养基。将管以200 x g离心5分钟，并然后弃去上清液。将细胞悬浮于新鲜的用于培养内皮细胞的培养基中，并将细胞以2 x 104个细胞/cm2的密度接种至培养容器中。第二天更换培养基，并然后每1-3天更换培养基。
在解冻细胞之后第7天收集细胞，并计数细胞数量。同时，用流式细胞术测量CD31(一种内皮细胞标志物)阳性细胞比率。结果，发现细胞增殖率为1.5-4倍，和CD31阳性率为95%或更高(96.6-99%)。从结果可以看出，通过本发明的方法获得的内皮细胞通过冷冻和解冻具有非常小的损伤。
实施例3：CD31+/CD34+细胞的测量
按照培养基附带的说明书，在DEF-CS培养基中培养人iPS细胞(ChiPSC12品系)。
将TrypLE (商标) Select添加至已经传代培养的iPS细胞中，并将细胞在37℃下温育3-7分钟。通过吸液将分离的细胞收集为单细胞，并计数细胞数量。接下来，将细胞以6x 104个细胞/cm2的密度接种至涂有Matrigel (商标)的培养容器中，并在DEF-CS培养基中培养2-3天。之后，将培养基更换为添加有稀释至1:60的Matrigel的DEF-CS培养基，并将细胞再培养16-24小时，从而用Matrigel包被细胞的上层。
按照以下程序使获得的Matrigel包被的iPS细胞分化成中胚层细胞。首先，将Matrigel包被的iPS细胞的培养基更换为添加有100 ng/mL激活素A、2 mM GlutaMAX (商标)和B27补充剂(不含胰岛素)的RPMI 1640培养基(该时间点定义为开始诱导分化=第0天)，并将细胞培养24小时(第1天)。接下来，将培养基更换为添加有10 ng/mL hBMP4、10ng/mL hbFGF、2 mM GlutaMAX和B27补充剂的RPMI 1640培养基，并将细胞培养3天(第4天)。之后，将培养基更换为添加有100 ng/mL VEGF、2 mM GlutaMAX和B27补充剂的RPMI 1640培养基，并将细胞培养过夜(第5天)。此处，作为用光学显微镜观察所培养的细胞的结果，从第0天至第5天不能确认胚状体的形成。
在第5天通过使用磁激活细胞分选术从培养的细胞中分离KDR阳性细胞，从而分离血管内皮祖细胞。为了分离KDR阳性细胞，将结合有PE荧光标记物的抗KDR抗体用作用于标记细胞的一抗，并用包埋抗PE抗体的磁珠收集用一抗标记的细胞。当用流式细胞术测量通过MACS分离的细胞中存在的KDR阳性细胞的比率时，KDR阳性比率为89-99%。将获得的细胞以2.7 x 104个细胞/cm2的密度接种至涂有Matrigel的培养容器中，并在添加有B27补充剂、50单位/mL青霉素、50 μg/mL链霉素、2 mM GlutaMAX、20 μM Y-27632和100 ng/mL VEGF的RPMI 1640培养基中培养16-24小时(第6天)。进一步地，将第6天的培养基更换为添加有B27补充剂、50单位/mL青霉素、50 μg/mL链霉素、2 mM GlutaMAX和100 ng/mL VEGF的RPMI1640培养基，并将细胞培养2天(第8天)。
在第8天收集细胞，并悬浮于添加有表3中列出的浓度的RepSox的用于增殖内皮细胞的培养基(Promocell)中。之后，将细胞以2.7 x 104个细胞/cm2的密度接种至培养容器中，并培养3天(第11天)。
在第11天将培养基更换为不含TGF-β抑制剂的培养基，即用于增殖内皮细胞的培养基，并在第13天收集细胞，且计数细胞数量。此时，一部分细胞用于通过流式细胞术测量CD31阳性细胞和CD34阳性细胞。使剩余的细胞悬浮于用于增殖内皮细胞的培养基(不含RepSox)中，并且然后将细胞以2.7 x 104个细胞/cm2的密度接种至培养容器中。每1-3天更换培养基，并在第13天和第18天收集细胞，且计数细胞数量。同时，用流式细胞术测量CD31阳性细胞和CD34阳性细胞。
此处，CD31为内皮细胞的标志物，和CD34为造血干细胞或内皮祖细胞的标志物。另外，CD34也在幼年内皮细胞中表达。因此，本发明中的CD31阳性和CD34阳性细胞(下文中CD31+/CD34+)被认为是血管内皮细胞中尚未发展分化阶段的细胞，即幼年血管内皮细胞。第3天和第18天的CD31+/CD34+细胞比率如表3所示。
[表3]
无论RepSox的浓度如何，CD31+/CD34+细胞在第13天为95%或更大。另外，在第18天，随着RepSox的浓度变得更高，CD31+/CD34+细胞的比例变得更高。这些结果表明，在诱导血管内皮细胞的分化中，通过使用RepSox以高比例获得具有分化和成熟为各种内皮细胞的潜力的幼年内皮细胞。
工业应用性
根据本发明，提供了高质量的内皮细胞。本发明的内皮细胞特别用于心肌层的产生。

Claims (10)

1. 一种用于产生内皮细胞的方法，其包括按以下顺序进行：
(a) 在不形成胚状体的情况下，从多能干细胞诱导包含内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群；和
(b) 在存在RepSox的情况下培养包含内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群。
2.权利要求1的方法，其中所述多能干细胞为胚胎干细胞(ES细胞)或诱导性多能干细胞(iPS细胞)。
3.权利要求1或2的方法，其中在步骤(a)中在以下培养基中依序培养所述多能干细胞：
(i) 包含激活素A的培养基，
(ii) 包含骨形态发生蛋白4的培养基，和
(iii) 包含血管内皮生长因子的培养基。
4. 权利要求3的方法，其中(ii) 包含骨形态发生蛋白4的培养基进一步包含碱性成纤维细胞生长因子。
5. 权利要求1~4中任何一项的方法，其特征为在步骤(a)之后进一步包括(a') 从所述中胚层谱系细胞群分离内皮祖细胞。
6.权利要求5的方法，其中在步骤(a')中，激酶***结构域受体阳性细胞被分离为内皮祖细胞。
7.权利要求1~6中任何一项的方法，其中在步骤(b)之前，包含内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群或分离的内皮祖细胞在没有RepSox的培养基中进行培养。
8. 权利要求1~7中任何一项的方法，其特征为在步骤(b)之后进一步包括(c) 冷冻内皮细胞。
9. 一种用于产生心肌层的方法，其包括：
根据权利要求1~8中的任何一项定义的方法产生内皮细胞，和
将所述内皮细胞与心肌细胞和壁细胞混合以培养所述细胞。
10.一种包含激酶***结构域受体阳性内皮祖细胞和RepSox的细胞组合物。
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