KR101674097B1 - 췌장, 난소 및 다른 암의 검출 및 치료 - Google Patents

췌장, 난소 및 다른 암의 검출 및 치료 Download PDF

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Abstract

본 원은 변성된 CD70에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 난소, 췌장 및 다른 암들의 진단, 예측, 예방 및 치료 방법을 제공한다.

Description

췌장, 난소 및 다른 암의 검출 및 치료{DETECTION AND TRATMENT OF PANCREATIC, OVARIAN AND OTHER CANCERS}
본 발명은 난소, 췌장 및 다른 암들의 진단, 예측, 예방 및 치료 및 모니터링 치료의 방법들에 관한 것이다.
연속성
본 원은 2008년 4월 11일자로 출원된, 미국 가 출원 제 61/044,457 호의 이점을 청구하며, 이의 내용은 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
CD70은 다양한 정상 및 악성 세포 유형에 의해 발현되는 세포막-결합되고 분비되는 분자의 종양 괴사 인자(TNF) 계열의 구성원이다. CD70은 세포의 외부에 노출된 카복실 말단과 원형질막의 시토졸 쪽에서 발견되는 아미노 말단을 갖는 II형 막통과 단백질이다(Bowman et al., 1994, J. Immunol. 152:1756-61; Goodwin et al., 1993, Cell 73:447-56). 인간 CD70은 20 아미노산 세포질 도메인, 18 AA 막통과 도메인, 및 2 개의 잠재적인 N-결합된 글리코실화 부위를 갖는 155 AA 세포 외 도메인을 함유한다(상기 Bowman et al,; 상기 Goodwin et al.). 항-CD70 항체에 의한 방사성 동위원소-표지된 CD70-발현 세포의 특수 면역침전은 29 및 50 kDa의 폴리펩타이드를 제공한다(상기 Goodwin et al.; Hintzen et al., 1994, J. Immunol. 152:1762-73). CD70에 대해, TNF-알파 및 TNF-베타에 대한 그의 상동성을 근거로 삼량체 구조가 예견된다(Petsch et al., 1995, Mol. Immunol. 32:761-72).
CD70은 인간의 정상 조직상에서 제한된 발현을 갖는다. 이는 CD70을 매력적인 암 치료용 표적으로 만든다. 그러나, CD70 발현은 단지 소수의 암들, 예를 들어 신 세포 암종, 결장암, 몇몇 유형의 비-호지킨 림프종 및 다발성 골수종에서만 확인되었다. 암 세포 상에서의 CD70 발현은 전형적으로, 천연 CD70에 결합하는 항체를 사용하여, 예를 들어 면역조직화학에 의해 검출된다. 고정된 환자 샘플 상에서의 CD70 발현의 검출은 CD70에 대해 충분한 특이성이 결여된 불량한 질의 항체로 인해 문제가 되는 것으로 나타났다. 특히, 교차-반응성 및 배경 염색은 고정된 샘플 중에서의 CD70의 검출을 방해한다.
본 발명은 상기 및 다른 필요성을 해결한다.
본 발명은 CD70에 대한 항체를 사용하는 난소, 췌장 및 다른 암들의 진단, 예측, 예방 및 치료 및 모니터링 치료의 방법들을 제공한다. 본 발명은 폐, 두경부(후두 또는 인두), 흑색종, 교모세포종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 예를 들어 여포성 림프종, 투명 세포 및 유두 암종을 포함한 신 세포 암종, 결장직장 및 방광 암종의 진단, 예측, 예방 및 치료 및 모니터링 치료의 방법들을 추가로 제공한다.
하나의 태양에서, 천연 CD70에 대한 결합에 비해 변성된 CD70에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 항체는 천연 CD70에 대한 결합에 비해, 고정된 난소 SK-OV-3 또는 췌장 PANC-1 암 세포 주 상의 변성된 CD70에 특이적으로 결합한다. 상기 항체는 단클론 항체, 예를 들어 키메릭, 인간화된 또는 인간 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-8733번으로 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 SG-21.1C1 또는 ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-8734 번으로 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 SG-21.5D12와 동일하거나 또는 이보다 양호한 특이적인 결합으로 포르말린-고정되고 파라핀 매몰된 세포 또는 조직상의 변성된 CD70에 결합한다. 특히, 상기 항체의 비 특이적인 교차-반응성은 항체 SG-21.1C1 또는 항체 SG-21.5D12의 경우보다 작다. 일부 실시태양에서, 상기 항체는 변성된 CD70과, 항체 SG-21.1C1 또는 항체 SG-21.5D12와의 특이적인 결합에 대해 경쟁할 수 있다.
또 다른 태양에서, 천연 CD70에 비해 변성된 CD70에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 관련된 태양에서, 환자의 조직 샘플 중에서 CD70의 발현을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 조직 샘플은 상기 환자의 췌장, 난소, 폐, 후두, 인두, 유방, 신장, 뇌, 결장, 혈액 또는 피부로부터의 것일 수 있다. 상기 조직을 고정시키고 CD70 단백질을 변성시킨다. 상기 고정된 조직 샘플을 천연 CD70에 비해 변성된 CD70에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키고, 상기 고정된 조직 샘플에 대한 상기 항체의 결합을, CD70이 상기 샘플 중에서 발현되는지의 여부를 측정하기 위해 검출한다. 상기 고정된 조직 샘플 상에서의 CD70의 발현은 상기 환자가 CD70 발현 암을 가질 가능성을 지시한다. 일부 실시태양에서, 상기 샘플을 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 매몰시킨다.
또 다른 태양에서, 췌장, 난소, 폐, 후두, 인두, 유방 또는 피부의 암을 갖는 환자의 진단, 예측, 치료 프로토콜의 결정 또는 모니터링 치료의 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 환자의 췌장, 난소, 폐, 후두, 인두, 유방 또는 피부로부터의 샘플에서 세포 중의 CD70 발현을 측정함을 포함하며, 여기에서 상기 환자의 진단, 예측, 치료 프로토콜의 결정 또는 모니터링 치료에 검출 가능한 CD70 발현의 존재를 사용한다. 상기 샘플은 포르말린 고정되고 파라핀 매몰된 샘플일 수 있다. 상기 방법은 상기 측정 단계가 검출 가능한 수준의 CD70을 가리키는 경우 상기 환자에게 유효 섭생의 CD70 항체 또는 CD70 항체 약물 접합체를 투여함을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 태양에서, CD70 양성 암의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 CD70의 검출 가능한 발현을 갖는 췌장, 난소, 폐, 후두, 인두, 유방 또는 피부의 암이 있는 환자에게 유효 섭생의 CD70에 대한 결합제를 투여함을 포함하며, 여기에서 상기 결합제는 항체, 항체 유도체 또는 항체 약물 접합체이다. 상기 항체는 효과기 작용을 가질 수도 있다. 상기 환자는 상기 암의 차도 없이 수술, 방사선 및/또는 CD70과 관련되지 않은 작용제에 의한 화학요법에 의한 선행 치료를 받았을 수도 있다. 일부 실시태양에서, 상기 항체는 키메릭, 인간화된 또는 인간 항체, 예를 들어 단클론 항체 1F6 또는 2F2의 키메릭 또는 인간화된 형태이다. 상기 항체 약물 접합체는 세포독성제, 예를 들어 항튜불린제, DNA 마이너 그루브 결합제, 또는 DNA 마이너 그루브 알킬화제를 포함할 수 있다. 상기 항체 약물 접합체 중의 항체를 링커, 예를 들어 세포 내 조건 하에서 절단 가능한 링커를 통해 세포독성 또는 세포 증식 억제제에 접합시킬 수 있다.
또 다른 태양에서, 진단에 사용하기 위한, 변성된 CD70에 특이적으로 결합하는 항체 및 치료에 사용하기 위한, 천연 CD70의 세포 외 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 복합적 진단 및 약학 키트를 제공한다.
본 발명의 태양들은 첨부된 도면, 그림 및 표와 함께, 하기 예시적인 실시태양들의 상세한 설명을 참고로 가장 잘 이해될 것이다.
본 원은 변성된 CD70에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 난소, 췌장 및 다른 암들의 진단, 예측, 예방 및 치료 효과를 나타낸다.
도 1은 786-O, 293F:CD70 형질감염된 세포 및 293F 형질감염되지 않은 세포로부터의 단백질 추출물 중에서 변성된 CD70을 검출하기 위해 항체 SG21.1C1 및 SG-21.5D12를 사용하는 단백질 추출물의 웨스턴 블럿을 나타낸다.
도 2는 상기 SG21.1C1 항체를 사용하는, 포르말린 고정되고 파라핀 매몰된(FFPE) 췌장 세포 주 PANC-1 상에서의 CD70 단백질 발현을 나타낸다.
도 3은 SG21.1C1 항체를 사용하는, 난소 세포 주 Ovcar-3, SK-OV-3, Ca-Ov-3 및 TOV-21G에서의 CD70 단백질 발현을 나타낸다.
도 4는 항체 SG-21.1C1 또는 SG-21.5D12 대 대조용 mIgG에 의해 검출된 바와 같은 췌장 종양 샘플에서의 CD70 단백질 발현을 나타낸다.
도 5는 색원체 패스트 레드(보다 짙은 색상)를 사용하는, 상기 SG-21.1C1 항체에 의해 검출된 바와 같은 정상 췌장 및 췌장 종양 세포 상에서의 CD70 단백질 발현을 나타낸다.
도 6은 췌장암 세포에서 CD70 단백질 발현의 평가를 나타낸다. x-축은 CD70 염색강도를 가리키고 y-축은 CD70-양성인 면적의 퍼센트를 가리킨다.
도 7은 난소 종양에서 CD70 단백질 발현의 평가를 나타낸다. x-축은 CD70 염색강도를 가리키고 y-축은 CD70-양성인 면적의 퍼센트를 가리킨다.
도 8은 난소암 세포 주, SKOV-3에 대한 다양한 인간화된 1F6 항체 약물 접합체의 시험관 내 세포독성 활성의 평가를 나타낸다.
도 9A 내지 C는 하기 세포 주들에 대한 인간화된 1F6 항체 약물 접합체의 시험관 내 세포 독성 활성의 평가를 나타낸다: (A) CD70-형질감염된 췌장 세포주, HPAFII; (B) CD70 형질감염된 PANC-1 췌장 세포주; 및 (C) CD70 형질감염된 MiaPaCa-2 세포주.
도 10은 누드 마우스에서 CD70-형질감염된 MiaPaCa 췌장 암종 종양에 대한 인간화된 1F6 항체 약물 접합체의 생체 내 효능의 평가를 나타낸다.
정의
달리 나타내지 않는 한, 본 발명에 사용된 바와 같은 하기의 용어 및 어구들은 하기의 의미로 해석된다.
"항체"란 용어는 (a) 특정 항원(예를 들어 CD70)에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 면역글로불린 폴리펩타이드, 및 면역글로불린 폴리펩타이드, 즉 면역글로불린 계열의 폴리펩타이드의 면역학적으로 활성인 부분, 또는 이들의 단편, 또는 (b) 상기 항원(예를 들어 CD70)에 면역특이적으로 결합하는 상기와 같은 면역글로불린 폴리펩타이드 또는 단편의 보존적으로 치환된 유도체를 지칭한다. 항체들은 예를 들어 문헌[Harlow & Lane, Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)]에 일반적으로 개시되어 있다. 항체와 관련하여 내용상 달리 명백하지 않은 한 하기에 보다 상세히 개시한 바와 같은 항체 유도체 또는 약물 접합체를 또한 포함한다.
"항체 유도체"는 이종 분자의 공유 결합에 의해, 예를 들어 이종 폴리펩타이드의 결합에 의해, 또는 상기 항체와 통상적으로 관련되지 않은 글리코실화, 탈글리코실화, 아세틸화 또는 인산화 등에 의해 변경된, 상기 정의한 바와 같은 항체를 의미한다.
"단클론 항체"란 용어는 그의 생산 방법이 아닌, 임의의 원핵 또는 진핵 세포 클론, 또는 파지 클론을 포함한 단세포 클론으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 따라서, "단클론 항체"란 용어는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체로 제한되지 않는다.
"항원"은 항체가 특이적으로 결합하는 존재이다.
"억제하다" 또는 "의 억제"란 용어는 측정 가능한 양까지의 감소 또는 완전한 방지를 의미한다.
"작용제"란 용어는 예를 들어 약학적, 치료학적 또는 약물학적 화합물을 포함한, 원소, 화합물 또는 분자 존재를 의미한다. 작용제는 천연 또는 합성이거나 또는 이의 조합일 수 있다. "치료제"는 암세포에 대해 단독으로 또는 또 다른 작용제(예를 들어 전구약물과 함께 전구약물 전환 효소)와 함께 치료(예를 들어 유리한) 효과를 발휘하는 작용제이다. 전형적으로, 본 발명에 개시된 방법 및 조성물에 따라 유용한 치료제는 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 발휘하는 것들이다.
세포에 대한 작용제의 효과에 관하여 "세포독성 효과"는 상기 세포의 살해를 의미한다.
"세포증식억제 효과"는 세포 증식의 억제를 의미한다.
"세포독성제"는 세포에 대해 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 갖고, 이에 의해 세포 집단 내에서 세포 각각의 생육을 고갈 또는 억제하는 작용제를 의미한다.
CD70-발현 세포에 대한 CD70 항체의 효과와 관련하여 "고갈하다"란 용어는 상기 CD70-발현 세포의 수 감소 또는 제거를 지칭한다.
본 발명에 개시된 방법에 따라 사용되는 항-CD70 항체 또는 그의 유도체와 관련하여 "작용성"이란 용어는 상기 항체 또는 그의 유도체가 (1) CD70에 결합할 수 있고/있거나 (2) CD70-발현 세포의 증식을, 단독으로 또는 세포독성제에 접합 시 고갈하거나 억제함을 가리킨다.
"예방"이란 용어는 CD70-발현 암의 임상적 또는 진단적 증상의 개시 전에 (a) 상기 CD70-발현 암, 또는 그의 임상적 또는 진단적 증상 중 하나 이상의 발생 또는 개시를 차단하거나, (b) 상기 CD70-발현 암의 발병의 중증도를 억제하거나, 또는 (c) 상기 CD70-발현 암의 발병 가능성을 줄이기 위해 환자에게 항-CD70 항체-약물 접합체(ADC) 또는 ADC 유도체를 투여함(예를 들어 췌장암 또는 난소암에 걸릴 소인이 있거나 위험이 높은 개인에게 투여함)을 지칭한다.
"치료" 또는 "치료하다"란 용어는 CD70-발현 암의 임상적 또는 진단적 증상의 감소 또는 제거에 의해 입증된 바와 같이, 상기 CD70-발현 암의 임상적 또는 진단적 증상의 개시 후에 임의의 임상 단계에서 환자에게 항-CD70 항체, 항체 약물 접합체 또는 ADC 유도체의 투여에 의해 상기 환자에게서 상기 질병의 진행을 지체, 중단 또는 역전시킴을 지칭한다. 치료는 예를 들어 증상의 중증도, 증상의 수, 또는 재발 회수의 감소를 포함할 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한"이란 용어는 동물 및 보다 특히 인간에 사용하는 것에 대해 연방 또는 주 정부의 규제 당국에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 열거됨을 의미한다.
"약학적으로 상용성인 성분"이란 용어는 CD70 항체와 함께 투여되는 약학적으로 허용 가능한 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다.
약제의 투여와 관련하여 "유효량"이란 용어는 환자에게서 CD70-발현 췌장암 또는 난소암의 발생을 억제하거나 또는 그의 하나 이상의 임상적 또는 진단적 증상을 개선시키기에 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 유효량의 작용제를 본 발명에 개시된 방법에 따라 "유효 섭생"으로 투여한다. "유효 섭생"이란 용어는 CD70-발현 암의 치료를 성취하기 위한 작용제의 양과 상기 성취에 적합한 투여 회수의 조합을 지칭한다.
"환자"란 용어는 진단학적, 예방학적 또는 치료학적 치료를 받는 인간 및 다른 포유동물 환자를 포함한다.
"AFP"란 약어는 다이메틸발린-발린-돌라아이소류신-돌라프로인-페닐알라닌-p-페닐렌다이아민을 지칭한다.
"MMAE"란 약어는 모노메틸 아우리스타틴 E를 지칭한다.
"AEB"란 약어는 아우리스타틴 E와 파라아세틸 벤조산과의 반응에 의해 생성되는 에스터를 지칭한다.
"AEVB"란 약어는 아우리스타틴 E와 벤조일발레르산과의 반응에 의해 생성되는 에스터를 지칭한다.
"MMAF"란 약어는 도발린-발린-돌라아이소류닌-돌라프로인-페닐알라닌을 지칭한다.
"fk" 및 "phe-lys"란 약어는 다이펩타이드 페닐알라닌-리신을 지칭한다.
"vc" 및 "val-cit"란 약어는 다이펩타이드 발린-시트룰린을 지칭한다.
치료제는 전형적으로는 바람직하지 못한 오염물질로부터 실질적으로 순수하다. 이는 작용제가 방해 단백질 및 오염물질이 실질적으로 없을 뿐만 아니라 전형적으로는 약 50% w/w(중량/중량) 이상 순수함을 의미한다. 때때로 상기 작용제는 약 80% w/w 이상, 보다 바람직하게는 90 또는 약 95% w/w 이상 순수하다. 그러나, 통상적인 단백질 정제 기법을 사용하여, 99% 이상의 순도 w/w를 갖는 동종 펩타이드를 수득할 수 있다.
상세한 설명
I. 일반적인 설명
본 발명은 CD70에 대한 항체를 사용하는 난소 및 췌장암의 진단, 예측, 예방 및 치료 및 모니터링 치료의 방법들을 제공한다. 본 발명은 폐, 두경부(후두 또는 인두), 흑색종, 교모세포종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 예를 들어 여포성 림프종, 투명 세포 및 유두 암종을 포함한 신 세포 암종, 결장직장 및 방광 암종의 진단, 예측, 예방 및 치료 및 모니터링 치료의 방법들을 추가로 제공한다. 상기 방법들은 부분적으로, CD70이 몇몇 암에서 상승된 수준으로 발현됨을 보이는 실시예들에 제공된 결과를 전제로 한다. 상기 상승된 발현은 변성된 CD70에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 난소 및 췌장암 조직으로부터의 포르말린 고정되고 파라핀 매몰된(FFPE) 샘플에서 검출되었다. 더욱이, CD70의 상승된 발현은 또한 상기 CD70의 변성된 세포 외 도메인에 대한 항체를 사용하여 다른 암 조직들로부터의 포르말린 고정되고 파라핀 매몰된(FFPE) 샘플에서 검출되었다.
본 발명의 실시가 기전의 이해에 의존하지 않는다 하더라도, 특히 난소 및 췌장 조직, 및 일반적으로 다른 암의 FFPE 샘플에서 CD70을 검출하는 것의 성공은 천연 CD70에 비해 상기와 같은 샘플 중의 변성된 CD70에 우선적으로 결합하는 항체의 사용에 있는 것으로 여겨진다. 췌장 및 난소암 중의 검출 가능한 CD70의 빈도 및/또는 그의 수준이, 앞서 CD70이 관련되었던 일부 다른 암성 조직만큼 크지 않다 하더라도, 이는 정상 조직에 비해 암성 조직에 매우 특이적이다. 따라서, CD70이 검출될 수 있는 난소암 또는 췌장암을 갖는 환자에서, CD70은 암성 세포에 대해 독성을 선택적으로 명하는데 특히 유용한 표적을 제공한다. 유사하게, 다른 암들(예를 들어 폐, 두경부(후두 또는 인두), 흑색종, 교모세포종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 예를 들어 여포성 림프종, 투명 세포 및 유두 암종을 포함한 신 세포 암종, 결장직장 및 방광 암종)을 갖는 환자에서, 본 발명은 상기와 같은 환자로부터의 고정된 샘플 중에서 CD70 발현을 검출하는 용이한 방법을 제공한다.
II . CD70 에 대한 항체
하기 설명은 먼저 난소 및 췌장암 및 그의 치료에서 CD70의 검출에 적용할 수 있는 CD70에 대한 항체의 성질을 고려하며 이어서 각 용도에 대한 항체의 바람직한 성질에 초점을 둔다.
A. CD70에 대한 항체의 일반적인 설명
항-CD70 항체는 단클론, 키메릭(예를 들어 인간 불변 영역 및 마우스 가변 영역을 가짐), 인간화된, 덧댄(veneered) 또는 인간 항체; 단쇄 항체 등을 포함한다. 상기 면역글로불린 분자는 임의의 유형 또는 부류(예를 들어 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY) 또는 하위부류(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 것일 수 있다.
항-CD70 항체는 항원-결합 항체 단편, 예를 들어 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fd 쇄, 단쇄 Fv(scFv), 단쇄 항체, 다이설파이드-결합된 Fv(sdFv), 낙타, 라마 등으로부터의 나노바디 또는 단편을 포함한, VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, 또는 Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 또는 상술한 상기 항체들 중 임의의 것의 CD70-결합 단편일 수 있다. 단쇄 항체를 포함한 항원-결합 항체 단편은 가변 영역(들)을 단독으로 또는 하기 전체 또는 일부와 함께 포함할 수 있다: 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 및 CL 도메인. 또한 항원-결합 단편은 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 및 CL 도메인과의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 항체는 인간, 설치류(예를 들어 마우스 및 래트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니 피그, 카멜리드, 말 또는 닭이다.
상기 항체들은 단일-특이적, 이중-특이적, 삼중-특이적, 또는 이보다 크게 다중 특이적일 수 있다. 다중 특이 항체는 CD70의 상이한 에피토프들에 특이적이거나 또는 CD70뿐만 아니라 이종 단백질 모두에 대해 특이적일 수도 있다(예를 들어 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; 미국 특허 제 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 및 5,601,819 호; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553을 참조하시오). 본 발명에 개시된 방법들의 실시에 유용한, 이중-특이 및 삼중-특이 항체를 포함한 다중 특이 항체들은 CD70과 제 2 세포 표면 수용체 또는 수용체 복합체, 예를 들어 면역글로불린 유전자 상과 구성원, TNF 수용체 상과 구성원, 인테그린, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 주요 조직적합성 단백질, 렉틴(C-형, S-형 또는 I-형), 또는 대조용 단백질 보체 모두에 면역특이적으로 결합하는 항체이다.
항-CD70 항체를 또한 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, 또는 10-15 M의, CD70에 대한 그의 결합 친화성에 관하여 개시할 수 있다.
항-CD70 항체는 키메릭 항체일 수 있다. 키메릭 항체는 상기 항체의 상이한 부분들이 상이한 동물 종으로부터 유래하는 분자, 예를 들어 쥐 단클론 항체로부터 유래된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체이다. 키메릭 항체의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Morrison, Science, 1985, 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202]; 미국 특허 제 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816,397 호를 참조하시오).
항-CD70 항체는 또한 덧댄 항체를 포함한 인간화된 항체일 수 있다. 인간화된 항체는 목적하는 항원과 결합하고 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)및 인간 면역글로불린 분자로부터의 틀 및 불변 영역을 갖는 항체 분자이다. 종종, 상기 인간 틀 영역 중의 틀 잔기들은 상기 CDR 공여체 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환되어 항원 결합이 변경되거나 또는 바람직하게는 개선될 것이다. 이들 틀 치환은 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어 항원 결합에 중요한 틀 잔기의 확인을 위한 상기 CDR과 틀 잔기의 상호작용, 및 특정 위치에서 이상한 틀 잔기의 확인을 위한 서열 비교를 모델링함으로써 확인된다(예를 들어 미국 특허 제 5,585,089 호(Queen et al); 문헌[Riecbmann et al., 1988, Nature 332:323]을 참조하시오). 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 기법, 예를 들어 CDR-그래프트화(EP 0 239 400; WO 91/09967; 미국 특허 제 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089 호), 덧댐(veneering) 또는 표면처리(resurfacing)(EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan, Molecular Immunology, 1991, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973) 및 쇄 셔플링(미국 특허 제 5,565,332 호)을 사용하여 인간화할 수 있다(상기 참고문헌들은 모두 본 발명에 참고로 인용된다).
항-CD70 항체는 또한 인간 항체일 수 있다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 방법들, 예를 들어 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 방법(상기 참조)에 의해 제조될 수 있다. 또한 예를 들어 미국 특허 제 4,444,887 및 4,716,111 호; WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741을 참조하시오. 또한, 선택된 에피토프를 인식하는 인간 항체를 "유도 선택"이라 칭하는 기법(여기에서 선택된 비-인간 단클론 항체, 예를 들어 마우스 항체를 사용하여 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택을 유도한다)을 사용하여 생성시킬 수 있다(예를 들어 문헌[Jespers et al., 1994, Biotechnology 12:899-903] 참조). 인간 항체를 또한 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 상기 항원에 대해 지시된 단클론 항체를 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된, 트랜스제닉 마우스로부터 획득할 수 있다. 인간 항체의 생산 기술에 대한 개관에 대해 문헌[Lonberg and Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93]을 참조하시오. 상기 인간 항체 및 인간 단클론 항체의 생산 기술 및 상기와 같은 항체의 생산을 위한 프로토콜에 대한 상세한 논의에 대해 예를 들어 PCT 공보 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 유럽 특허 제 0 598,877 호; 및 미국 특허 제 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; 및 5,939,598 호를 참조하시오.
항체들을 공지된 방법에 의해, 예를 들어 웨스턴 블럿, 방사성면역분석, ELISA(효소 결합된 면역흡수 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 침강소 반응, 젤 확산 침강소 반응, 면역확산 분석, 응집반응 분석, 보체 고정 분석, 면역방사계측 분석, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석과 같은 기법을 사용하는 경쟁 및 비-경쟁 면역분석 시스템에 의해 CD70에 대한 특이 결합에 대해 분석할 수 있다(예를 들어 문헌[Ausubel et al., eds., Short Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, Inc., New York, 4th ed., 1999); Harlow & Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999]을 참조하시오).
더욱이, CD70에 대한 항체의 결합 친화성 및 항체 CD70 상호작용의 중지율(off-rate)을 경쟁 결합 분석에 의해 측정할 수 있다. 경쟁 결합 분석의 일례는 표지된 CD70(예를 들어 3H 또는 125I)을 증가량의 표지되지 않은 CD70의 존재 하에서 관심 항체와 배양하고 상기 표지된 CD70에 결합된 항체를 검출함을 포함하는 방사성면역분석이다. 이어서 상기 CD70에 대한 항체의 친화성 및 결합 중지율을 스캐차드 플롯 분석에 의해 상기 데이터로부터 측정할 수 있다. 제 2 항체와의 경쟁을 또한 방사성면역분석을 사용하여 측정할 수 있다. 이 경우에, CD70을 증가량의 표지되지 않은 제 2 항체의 존재 하에서 표지된 화합물(예를 들어 3H 또는 125I)에 접합된 관심 항체와 함께 배양한다. 한편으로, 상기 CD70에 대한 항체의 결합 친화성 및 항체-CD70 상호작용의 개시율 및 중지율을 표면 플라스몬 공명에 의해 측정할 수 있다.
항체를 상기 항체의 유형에 따라 표준 과정에 의해 상기 CD70 단백질의 항원 함유 단편으로부터 제조할 수 있다(예를 들어 문헌[Kohler, et al., Nature, 256:495,(1975); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual(C.S.H.P., NY, 1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033(1989)] 및 WO 90/07861; WO 91/17271(Dower et al.) 및 WO 92/01047(McCafferty et al.)을 참조하시오)(이들 문헌은 각각 모든 목적을 위해 참고로 인용된다). 예로서, 단클론 항체를 광범위하게 다양한 기법, 예를 들어 하이브리도마, 재조합체, 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합을 사용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 기법은 예를 들어 상기 문헌[Harlow et al.] 및 [Hammerling, et al., In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp.563-681(Elsevier, N.Y., 1981)]에 일반적으로 논의되어 있다. 상기 항-CD70 항체의 제조에 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예로는 예를 들어 문헌[Briinnan et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280]; PCT 출원 제 PCT/GB91/01 134 호; PCT 공보 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 특허 제 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; 및 5,969,108 호(이들 내용은 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시된 것들이 있다.
특정 에피토프를 인식하는 항체 단편의 제조 기법들이 또한 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편을 파파인(Fab 단편의 생성을 위해) 또는 펩신(F(ab')2 단편의 생성을 위해)과 같은 효소를 사용하여, 면역글로불린 분자의 단백질분해 절단에 의해 생성시킬 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경 쇄 불변 영역 및 중 쇄의 CH1 도메인을 함유한다. 예를 들어 WO 92/22324; 문헌[Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; Better et al., 1988, Science 240:1041-1043](이들의 내용은 본 발명에 참고로 인용되어 있다)에 개시된 방법을 사용하는 Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편의 재조합적 생성 기법을 또한 사용할 수 있다.
단쇄 Fv 및 항체를 생성시키기 위해 사용할 수 있는 기법들의 예는 미국 특허 제 4,946,778 및 5,258,498 호; 문헌[Huston et al., 1991, Methods in Enzymology 203:46-88; Shu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999; Skerra et al., 1988, Science 240:1038-1040]에 개시된 것들을 포함한다.
본 발명의 방법에 유용한 항-CD70 항체 및 그의 유도체를 재조합 발현 기법에 의해 생성시킬 수 있다. CD70에 결합하고/하거나 CD70-발현 세포의 증식을 고갈하거나 억제하는 항체 또는 그의 유도체의 재조합 발현은 상기 항체 또는 그의 유도체를 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 벡터의 제작을 필요로 한다. 일단 상기와 같은 단백질을 암호화하는 핵산이 수득되었으면, 상기 단백질 분자의 생산을 위한 벡터를 당해 분야에 널리 공지된 기법을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생성시킬 수 있다. 문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3rd ed., 2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2nd ed., 1989); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, New York, 4th ed., 1999); Glick & Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA(ASM Press, Washington, D.C., 2nd ed., 1998)]에 개시된 것들과 같은 표준 기법들을 재조합 핵산 방법, 핵산 합성, 세포 배양, 트랜스유전자 통합, 및 재조합 단백질 발현에 사용할 수 있다.
예를 들어, 항-CD70 항체의 재조합 발현을 위해서, 발현 벡터는 프로모터에 작동적으로 결합된, 그의 중 쇄 또는 경 쇄, 또는 중 쇄 또는 경 쇄 가변 도메인을 암호화할 수 있다. 발현 벡터는 예를 들어 상기 항체 분자의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어 WO 86/05807; WO 89/01036; 및 미국 특허 제 5,122,464 호를 참조하시오)을 포함할 수 있으며, 상기 항체의 가변 도메인을 상기 전체 중 쇄 또는 경 쇄의 발현을 위해 상기와 같은 벡터에 클로닝할 수 있다. 상기 발현 벡터를 공지된 기법에 의해 숙주 세포로 옮기고 이어서 상기 형질감염된 세포를 배양하여 항-CD70 항체를 생성시킨다. 전형적으로, 이중-쇄 항체의 발현을 위해서, 상기 중 쇄 및 경 쇄 모두를 암호화하는 벡터를 상기 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 동시 발현시킬 수 있다.
다양한 원핵 및 진핵 숙주-발현 벡터 시스템을 사용하여 항-CD70 항체 또는 그의 유도체를 발현시킬 수 있다. 전형적으로 진핵 세포를, 특히 완전한 재조합 항-CD70 항체 분자의 경우, 상기 재조합 단백질의 발현을 위해 사용한다. 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 세포(CHO)(예를 들어 DG44 또는 CHO-S)는 인간 거대세포바이러스 또는 중국 햄스터 난소 EF-1α 프로모터로부터의 주요 중간 초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께 항-CD70 항체 및 그의 유도체의 생산에 유효한 발현 시스템이다(예를 들어 문헌[Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2]; 미국 특허 제 5,888,809 호(Allison)를 참조하시오).
다른 숙주-발현 시스템은 세균 세포 중의 플라스미드-계 발현 시스템(예를 들어 문헌[Ruther et al., 1983, EMBO 1,2:1791; Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509]을 참조하시오); 스포도프테라 프루지페르다 ( Spodoptera frugiperda ) 세포 중의 곤충 시스템, 예를 들어 아우토그라파 칼리포르니카( Autographa californica) 핵 다각체 병 바이러스(AcNPV) 발현 벡터; 및 포유동물 세포 중의 바이러스-계 발현 시스템, 예를 들어 아데노바이러스-계 시스템(예를 들어 문헌[Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359; Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544]을 참조하시오)을 포함한다.
B. CD70의 검출을 위한 항체
검출 방법에 사용하기 위한 CD70에 대한 항체의 선택은 CD70이 변성된 CD70 또는 천연 CD70(세포 상에서 발현 시)의 검출을 필요로 하는 기법에 의해 검출되는지의 여부에 따라 변한다. 표적 CD70이 변성된 것인 웨스턴 블럿팅 또는 면역조직화학 검출과 같은 방법에서, 변성된 형태(예를 들어 인간 또는 키노몰구스 CD70)로 CD70에 결합하는 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 전형적으로 상기와 같은 항체는 천연 형태(즉 천연 중에 존재하거나 또는 변성 조건, 예를 들어 용매, 세제 또는 승온(예를 들어 50 ℃ 이상)에 노출 없이 단리되는 CD70) 보다 변성된 형태에 우선적으로 결합한다. 상기와 같은 항체를 변성된 CD70 면역원(예를 들어 인간 또는 키노몰구스 CD70), 또는 세포 외 부분으로부터의 그의 면역원성 단편을 사용하여 생육시킬 수 있다. 변성은 상기 면역원을 SDS(예를 들어 0.5%)로 처리하고 80 ℃ 이하로 임의로 가열함으로써 수행될 수 있다. 변성을 또한 단순히 면역원을 정제시키기 위해 사용된 SDS 젤로부터 상기 면역원을 용출시킴으로써 수행할 수도 있다. 한편으로, 변성된 CD70에 우선적으로 결합하는 항체를 면역원으로서 CD70의 세포 외 도메인으로부터의 합성 펩타이드를 사용하여 생성시킬 수 있다. 일부 상기와 같은 펩타이드는 상기 천연 펩타이드의 상응하는 분절의 형태를 유지시키기에 너무 짧다. 합성 펩타이드는 면역원으로서 사용을 위해 변성이 필요할 수 있지만 대개는 필요하지 않다.
상기 또는 다른 방법들에 의해 생성된 항체를 천연 CD70에 비해 변성된 CD70에 우선적으로 결합하는 것에 대해 선별한다. 변성 및 천연 CD70 항원을 동일한 분석에 의해 또는 상이한 분석에 의해 분석할 수 있다. 특히, 후자의 접근법을 사용하는 경우, 상기 선별을 천연 CD70에 결합하는 것으로 공지된 대조용 항체, 예를 들어 하기에 개시하는 치료 항체(예를 들어 인간화된 1F6 또는 2F2; 예를 들어 미국 특허 출원 제 2006-0233794 및 2006-0083736 호, 및 국제 특허 공보 WO 06/113909를 참조하시오)를 사용하여 수행할 수 있다. 항체가 대조용 항체의 비에 비해, 천연 CD70에 비해 변성된 CD70에 대해 보다 높은 결합 비를 나타내는 경우, 상기 항체는 변성된 CD70에 우선적으로 결합한다.
췌장 및 난소암에서 CD70의 검출에 바람직한 항체는 포르말린으로 고정되고 파라핀에 매몰된(FFPE) 췌장 또는 난소암 시편 상의 CD70에 특이적으로 결합하는 것이다. 상기 항체는 처리되지 않은 췌장 또는 난소암 세포 상의 천연 CD70 항원에 비해 상기 FFPE 처리에 의해 드러난 CD70 상의 에피토프를 우선적으로 인식한다. 상기와 같은 항체를 FFPE-특이적 항-CD70 항체라 칭한다. 상기와 같은 항체는 천연 CD70에 대해 검출 가능한 특이적 결합이 없다. 바람직하게는, 상기 항체의 특이적 결합은 항체 SG-21.1C1 또는 SG-21.5D12와 동일하거나 이보다 양호하다. 특히, 상기 항체는 바람직하게는, 항체 SG-21.1C1 또는 SG-21.5D12에 비해, 특이적인 결합 조건 하에서 고정된 세포의 웨스턴 블럿팅 또는 염색에 의해 측정 시 다른 세포 단백질들과 동일하거나 이보다 낮은 검출 가능한 교차 반응성을 갖는다.
다른 암들(하기 실시예에 개시된 바와 같음)에서 CD70의 검출에 바람직한 항체는 포르말린으로 고정되고 파라핀에 매몰된(FFPE) 이들 암 시편 상의 CD70에 특이적으로 결합하는 것이다. 상기 항체는 처리되지 않은 췌장 또는 난소암 세포 상의 천연 CD70 항원에 비해 상기 FFPE 처리에 의해 드러난 CD70 상의 에피토프를 우선적으로 인식한다. 상기와 같은 항체는 천연 CD70에 대해 검출 가능한 특이적 결합이 없다. 바람직하게는, 상기 항체의 특이적 결합은 항체 SG-21.1C1 또는 SG-21.5D12와 동일하거나 이보다 양호하다. 특히, 상기 항체는 바람직하게는, 항체 SG-21.1C1 또는 SG-21.5D12에 비해, 특이적인 결합 조건 하에서 고정된 세포의 웨스턴 블럿팅 또는 염색에 의해 측정 시 다른 세포 단백질들과 동일하거나 이보다 낮은 검출 가능한 교차 반응성을 갖는다.
일부 예시적인 FFPE-특이적 항-CD70 항체는 mAbs SG-21.1C1(또한 SG-21.1C1-B3라 칭한다) 및 SG-21.5D12.C3(또한 SG-21.5D12.C3라 칭한다)이다. 다른 바람직한 항체들은 변성된 CD70에 대한 특이적 결합에 대해 SG-21.1C1.B3 또는 SG-21.5D12.C3와 경쟁한다. 다른 바람직한 항체는 SG-21.1C1.B3의 중 쇄로부터의 3 개의 CDR을 포함하는 중 쇄 및 SG-21.1C1.B3의 경 쇄로부터의 3 개의 CDR을 포함하는 경 쇄를 포함한다. 다른 바람직한 항체는 SG-21.5D12.C3의 중 쇄로부터의 3 개의 CDR을 포함하는 중 쇄 및 SG-21.5D12.C3의 경 쇄로부터의 3 개의 CDR을 포함하는 경 쇄를 포함한다. 다른 바람직한 항체는 SG-21.1C1.B3의 성숙한 중 쇄 가변 영역과 90% 이상 서열 일치성을 갖는 성숙한 중 쇄 가변 영역 및 SG-21.1C1.B3의 성숙한 경 쇄 가변 영역과 90% 이상 서열 일치성을 갖는 성숙한 경 쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 바람직한 항체는 SG-21.5D12.C3의 성숙한 중 쇄 가변 영역과 90% 이상 서열 일치성을 갖는 성숙한 중 쇄 가변 영역 및 SG-21.5D12.C3의 성숙한 경 쇄 가변 영역과 90% 이상 서열 일치성을 갖는 성숙한 경 쇄 가변 영역을 포함한다.
C. 치료학적 용도를 위한 CD70에 대한 항체
치료용으로 사용되는 항체는 췌장 또는 난소암 세포 상의 천연 CD70 항원의 세포 외 도메인에 특이적으로 결합한다. 치료용으로 사용되는 항체는 또한 폐, 두경부(후두 또는 인두), 흑색종, 교모세포종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 예를 들어 여포성 림프종, 투명 세포 및 유두 암종을 포함한 신 세포 암종, 결장직장 및 방광 암종 상의 천연 CD70 항원의 세포 외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 항체는 리간드 CD27에 결합하는 CD70에 대해 각각 작용적, 비-작용적 또는 길항적일 수 있다. 본 발명의 실시가 기전의 이해에 의존하는 것은 아니지만, 상기 항체는 CD70에 대한 결합 및 세포 내에 내면화되는 결과로서 또는 CD70에 대한 결합 및 세포 외부 상에 축적되는 결과로서 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 발휘할 수 있다. 상기 어느 경우든, 세포독성 또는 세포증식억제 효과는 상기 항체를 세포독성제 또는 세포증식억제제에 접합시킴으로써 촉진될 수 있다. CD70에 결합된 항체에 의해 상기 세포의 외부로부터 발휘된 세포독성 또는 세포증식억제 효과는 항체 불변(효과기) 작용에 의해 추가로 또는 양자택일적으로 촉진될 수 있다. 상기 항체 불변 도메인은 다양한 Ig 효과기 작용, 예를 들어 항체 의존적인 세포독성(ADCC), 보체 의존적인 세포독성(CDC) 및/또는 항체 의존적인 세포 식작용(ADCP)에서 상기 항체의 관여를 매개한다. 임의로, CD70-결합제의 효과기 작용은 WO2006/113909에 개시된 바와 같은 여러 가지 접근법에 의해 증대될 수 있다. 상기 항체에 의해 발휘되는 세포독성 또는 세포증식억제 효과는 또한 CD70과 그의 리간드, CD27과의 상호작용을 차단함으로써 촉진될 수 있다.
바람직한 항-CD70 항체는 WO 2004/073656 및 공개된 미국 출원 제 2006-0233794 호 및 WO2006/113909에 개시된 바와 같이, mAb 1F6 또는 2F2, 또는 그의 키메릭 또는 인간화된 형태이다. 바람직한 중 쇄 성숙한 가변 영역은 서열식별번호: 1의 서열을 가지며, 바람직한 경 쇄 성숙한 가변 영역은 서열식별번호: 2의 서열을 갖는다.
다른 유용한 항체들은 각각 서열식별번호: 1 및 2에 90% 이상 및 바람직하게는 95% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 성숙한 중 쇄 및 경 쇄 가변 영역을 포함한다. 결합에 필요한 가변 영역 틀 잔기들에 관한 지침이 WO2006/113909에 제공되어 있다. 다른 유용한 항-CD70 항체 또는 그의 유도체는 예를 들어 면역분석에 의해 측정 시, CD70에 대한 mAb 1F6 또는 2F2의 결합을 경쟁적으로 억제할 수 있다. 경쟁적인 억제는 항체가 2 배 이상 및 바람직하게는 5 배 과잉으로 존재할 때 CD70에 대한 1F6 또는 2F2의 억제를 50% 이상, 보다 전형적으로는 60% 이상, 더욱 더 전형적으로는 70% 이상, 및 가장 전형적으로는 75% 이상까지 억제하거나, 또는 항체가 CD70에 대한 1F6 또는 2F2의 결합을 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상까지 경쟁적으로 억제함을 의미한다.
다른 바람직한 항체는 1F6의 중 쇄 가변 영역으로부터의 3 개의 CDR을 포함하는 중 쇄 및 1F6의 경 쇄 가변 영역으로부터의 3 개의 CDR을 포함하는 경 쇄를 포함한다. 다른 바람직한 항체는 2F2의 성숙한 중 쇄 가변 영역과 90% 이상 서열 일치성을 갖는 성숙한 중 쇄 가변 영역 및 2F2의 성숙한 경 쇄 가변 영역과 90% 이상 서열 일치성을 갖는 성숙한 경 쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 바람직한 항체는 1F6의 성숙한 중 쇄 가변 영역과 90, 95 또는 99% 이상 서열 일치성을 갖는 성숙한 중 쇄 가변 영역 및 1F6의 성숙한 경 쇄 가변 영역과 90, 95 또는 99% 이상 서열 일치성을 갖는 성숙한 경 쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 바람직한 항체는 2F2(서열식별번호: 3)의 성숙한 중 쇄 가변 영역과 90, 95 또는 99% 이상 서열 일치성을 갖는 성숙한 중 쇄 가변 영역 및 2F2(서열식별번호: 4)의 성숙한 경 쇄 가변 영역과 90, 95 또는 99% 이상 서열 일치성을 갖는 성숙한 경 쇄 가변 영역을 포함한다.
CD70에 대한 다수의 다른 항체들이 예를 들어 미국 특허 출원 공보 제 2005-0191299 호; 및 국제 공보 제 WO 07/038637 호에 개시되어 있다. CD70의 세포 외 도메인에 결합하는 다른 항체들을 하기에 개시된 바와 같이 단독으로 또는 유도체 및/또는 접합체로서의 적합성에 대해 선별할 수 있다. 선별은 표지된 항체를 사용하여 CD70을 발현하는 세포 내로의 내면화를 평가할 수 있다. 선별은 또한 세포독성을 평가할 수 있다. 추가적인 선별을 췌장 또는 난소암 및 다른 암의 동물 모델상에서 수행할 수 있다. 예를 들어, SKOV-3 난소 암종 세포 주, AN3CA 자궁내막 암종 세포 주, TOV21G 난소 암종 세포를 사용할 수 있다. 또한, PANC1 및 MiaPaca2 췌장 세포 주를 사용할 수 있다.
항-CD70 항체의 유도체를 또한 본 발명 방법의 실시에 사용할 수 있다. 전형적인 변경으로는 예를 들어 글리코실화, 탈글리코실화, 아세틸화, peg화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 그룹에 의한 유도체화, 단백질분해적 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 결합 등이 있다. 임의의 다수의 화학적 변경들을 예를 들어 특정한 화학적 절단, 아세틸화, 폼일화 또는 튜니카마이신 존재 하의 대사 합성에 의해 수행할 수 있다. 또한, 상기 유도체는 하나 이상의 비-전통적인 아미노산을 함유할 수 있다.
상기 항체 유도체는 하나 이상의 단량체를 포함하는 다량체, 예를 들어 이량체일 수 있으며, 이때 각각의 단량체는 (i) 항-CD70 항체의 항원-결합 영역, 또는 이로부터 유래된 폴리펩타이드 영역(예를 들어 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환에 의해), 및 (ii) 항체 유도체가 CD70에 특이적으로 결합하는 다량체(예를 들어 동종이량체)를 형성하도록, 다량체화(예를 들어 이량체화) 폴리펩타이드 영역을 포함한다. 전형적으로, 항-CD70 항체의 항원 결합 영역, 또는 이로부터 유래한 폴리펩타이드 영역은 이종 단백질과 재조합적으로 또는 화학적으로 융합되며, 여기에서 상기 이종 단백질은 이량체화 또는 다량체화 도메인을 포함한다. CD70-발현 암의 치료 또는 예방을 위해서 환자에게 상기 항체 유도체를 투여하기 전에, 상기 유도체에 동종이량체 또는 이종이량체의 형성을 허용하는 조건을 가한다. 이종이량체는, 동일한 이량체화 도메인이지만 상이한 CD70 항원-결합 영역을, 동일한 CD70 항원-결합 영역이지만 상이한 이량체화 도메인을, 또는 상이한 CD70 항원-결합 영역 및 이량체화 도메인을 포함할 수 있다.
항-CD70 항체 유도체를, 항-CD70 항체를 제 2 항체에 접합시킴으로써 형성시킬 수 있다("항체 이종접합체")(예를 들어 미국 특허 제 4,676,980 호를 참조하시오). 본 발명 방법의 실시에 유용한 이종접합체는 CD70에 결합하는 항체(예를 들어 단클론 항체 1F6 또는 2F2의 CDR 및/또는 중 쇄를 갖는 항체) 및 표면 수용체 또는 수용체 복합체, 예를 들어 면역글로불린 유전자 상과 구성원, TNF 수용체 상과 구성원, 인테그린, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 주요 조직적합성 단백질, 렉틴(C-형, S-형, 또는 I-형), 또는 보체 대조용 단백질에 결합하는 항체를 포함한다.
CD70에 대한 항체 및 그의 유도체를 세포독성 또는 세포증식억제 부분에 접합시켜 항체 약물 접합체(ADC)를 형성시킬 수 있다. 항체 또는 항체 유도체에 접합시키기에 특히 적합한 부분은 화학요법제, 전구약물 전환 효소, 방사성 동위원소 또는 화합물, 또는 독소이다. 예를 들어, 항-CD70 항체 또는 그의 유도체를 세포독성제, 예를 들어 화학요법제, 또는 독소(예를 들어 세포증식억제 또는 세포파괴제, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소)에 접합시킬 수 있다.
상기 항-CD70 항체 또는 그의 유도체를 전구약물 전환 효소에 접합시킬 수 있다. 상기 전구약물 전환 효소를 공지된 방법을 사용하여 항체 또는 그의 유도체에 재조합적으로 융합시키거나 화학적으로 접합시킬 수 있다. 예시적인 전구약물 전환 효소는 카복시펩티다제 G2, 베타-글루쿠로니다제, 페니실린-V-아미다제, 페니실린-G-아미다제, β-락타마제, β-글루코시다제, 나이트로리덕타제 및 카복시펩티아제 A이다.
단백질, 및 특히 항체에 치료제를 접합시키기 위한 기법들이 널리 공지되어 있다. (예를 들어 문헌[Arnon et al., "암치료에서 약물의 면역표적화를 위한 단클론 항체", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Reisfeld et al. eds. Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "약물 전달을 위한 항체", Controlled Drug Delivery(Robinson et al. eds., Marcel Dekker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, "암치료에서 세포독성제의 항체 담체: 고찰", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications(Pinchera et al. eds., 1985); "암치료에서 방사성표지된 항체의 분석, 결과, 및 치료학적 사용에 대한 장래의 가망성", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy(Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985); 및 Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58]을 참조하시오. 또한 PCT 공보 WO 89/12624를 참조하시오).
상기 치료제를, 상기가 항체를 절단하지 못하는 경우, 그의 활성을 감소시키는 방식으로(예를 들어 가수분해에 의해, 항체 분해에 의해, 또는 절단제에 의해) 접합시킬 수 있다. 상기와 같은 치료제를, 상기 CD70-발현 암세포의 세포 내 환경에서 절단에 민감하지만 상기 세포 외 환경에는 실질적으로 민감하지 않은 절단 가능한 링커에 의해, 상기 접합체가 상기 CD70-발현 암세포에 의해 내면화될 때 상기 항체 또는 그의 유도체로부터 절단되도록(예를 들어 엔도솜 중에서 또는 예를 들어 pH 민감성 또는 프로테아제 민감성 덕분에, 리소솜 환경 또는 소포 환경에서) 상기 항체 또는 그의 유도체에 부착시킨다.
전형적으로, 상기 ADC는 상기 치료제와 항-CD70 항체 또는 그의 유도체 사이에 링커 영역을 포함한다. 상기 나타낸 바와 같이, 전형적으로, 상기 링커는 세포 내 조건 하에서 절단 가능하며, 따라서 상기 링커의 절단이 상기 세포 내 환경(예를 들어 리소솜 또는 엔도솜 또는 소포 내)에서 상기 항체로부터 상기 치료제를 방출시킨다. 상기 링커는 예를 들어 리소솜 또는 엔도솜 프로테아제를 포함한 세포 내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 전형적으로, 상기 펩티딜 링커는 2 개 아미노산 길이 이상 또는 3 개 아미노산 길이 이상이다. 절단제는 카텝신 B 및 D 및 플라스민을 포함할 수 있다(예를 들어 문헌[Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123]을 참조하시오). CD70-발현 세포 중에 존재하는 효소들에 의해 절단 가능한 펩티딜 링커들이 가장 전형적이다. 예를 들어 티올-의존성 프로테아제 카텝신-B(암성 조직에서 고도로 발현된다)에 의해 절단 가능한 펩티딜 링커(예를 들어 Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly 펩타이드를 포함하는 링커)를 사용할 수 있다. 다른 상기와 같은 링커들이 예를 들어 미국 특허 제 6,214,345 호에 개시되어 있다. 특정한 실시태양에서, 세포 내 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩티딜 링커는 Val-Cit 링커 또는 Phe-Lys 다이펩타이드를 포함한다(예를 들어 상기 Val-Cit 링커를 사용하는 독소루비신의 합성을 개시하는 미국 특허 제 6,214,345 호를 참조하시오). 상기 치료제의 세포 내 단백질분해적 방출을 사용하는 한 가지 이점은 상기 작용제가 접합 시 전형적으로 감독되고 상기 접합체의 혈청 안정성이 전형적으로 높다는 것이다.
상기 절단 가능한 링커는 pH-민감성, 즉 몇몇 pH 값에서 가수분해에 민감성일 수 있다. 전형적으로, 상기 pH-민감성 링커는 산성 조건 하에서 가수분해 가능하다. 예를 들어 리소솜 중에서 가수분해 가능한 산-불안정 링커(예를 들어 하이드라존, 세미카바존, 티오세미카바존, 시스-아코니틱 아미드, 오쏘에스터, 아세탈, 케탈 등)를 사용할 수 있다. (예를 들어 미국 특허 제 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929 호; 문헌[Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661]을 참조하시오). 상기와 같은 링커는 중성 pH 조건, 예를 들어 혈액 중 조건 하에서 비교적 안정하지만, 상기 리소솜의 대략적인 pH인 pH 5.5 또는 5.0 이하에서 불안정하다. 몇몇 실시태양에서, 상기 가수분해 가능한 링커는 티오에테르 링커(예를 들어 아실하이드라존 결합을 통해 상기 치료제에 부착된 티오에테르)이다(예를 들어 미국 특허 제 5,622,929 호를 참조하시오).
다른 링커들은 환원 조건 하에서 절단 가능하다(예를 들어 다이설파이드 링커). 다이설파이드 링커는 SATA(N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트), SPDP(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트), SPDB(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)부티레이트) 및 SMPT(N-숙신이미딜-옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-다이티오)톨루엔), SPDB 및 SMPT를 사용하여 형성시킬 수 있는 것들을 포함한다. (예를 들어 문헌[Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Theraphy of Cancer(C.W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987]을 참조하시오. 또한 미국 특허 제 4,880,935 호를 참조하시오).
상기 링커는 또한 말로네이트 링커(Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), 말레이미도벤조일 링커(Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), 또는 3'-N-아미드 동족체(Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12)일 수 있다.
상기 링커는 또한 절단 가능하지 않은 링커, 예를 들어 약물 유닛에 직접 부착되는 말레이미도-알킬렌- 또는 말레이미드-아릴 링커일 수 있다. 활성 약물-링커는 상기 항체의 분해에 의해 방출된다.
전형적으로, 상기 링커는 세포 외 환경에 실질적으로 민감하지 않으며, 이는 상기 ADC의 샘플 중 상기 링커의 약 20% 이하, 전형적으로는 약 15% 이하, 보다 전형적으로는 약 10% 이하, 및 훨씬 더 전형적으로는 약 5% 이하, 약 3% 이하, 또는 약 1% 이하가, 상기 ADC 또는 ADC 유도체가 세포 외 환경 중(예를 들어 혈장 중)에 존재할 때 절단됨을 의미한다. 링커가 상기 세포 외 환경에 실질적으로 민감하지 않은 지의 여부는 예를 들어 (a) ADC 또는 ADC 유도체("ADC 샘플") 및 (b) 동 몰 량의 접합되지 않은 항체 또는 치료제("대조용 샘플") 모두와 소정의 기간(예를 들어 2, 4, 8, 16 또는 24 시간) 동안 혈장과 독립적으로 배양하고 이어서 상기 ADC 샘플 중에 존재하는 접합되지 않은 항체 또는 치료제의 양을 대조용 샘플 중에 존재하는 것과, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정하여 비교함으로써 측정할 수 있다.
상기 링커는 또한 세포 내면화를 촉진할 수 있다. 상기 링커는 치료제에 접합 시(즉 본 발명에 개시된 바와 같이 상기 ADC 또는 ADC 유도체의 링커-치료제 부분의 환경에서) 세포 내면화를 촉진할 수 있다. 한편으로, 상기 링커는 상기 치료제 및 항-CD70 항체 또는 그의 유도체 모두와 접합 시(즉 본 발명에 개시된 바와 같이 상기 ADC 또는 ADC 유도체의 환경에서) 세포 내면화를 촉진할 수 있다.
본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있는 다양한 링커들은 WO 2004-010957에 개시되어 있으며 하기 화학식 II의 형태를 갖는다:
[화학식 II]
-Aa-Ww-Yy-
상기 식에서,
-A-는 스트레처(stretcher) 단위이고;
a는 0 또는 1이고;
각각의 -W-는 독립적으로 아미노산 단위이고;
w는 독립적으로 0 내지 12 범위의 정수이고;
-Y-는 이격자 단위이고;
y는 0, 1 또는 2이다.
전형적인 링커를 하기 화학식 Ia 및 Ib의 사각 괄호 안에 나타내며, 여기에서 A-, -W-, -Y-, -D, w 및 y는 상기 정의한 바와 같고 R1은 -C1-C10 알킬렌, -C3-C8 카보사이클로-, -O-(C1-C8 알킬)-, -아릴렌-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카보사이클로)-, -(C3-C8 카보사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 헤테로사이클로-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카보사이클로)-, -(C3-C8 헤테로사이클로)-C1-C10 알킬렌-, -(CH2CH2O)r- 및 (CH2CH2O)r-CH2- 중에서 선택되고; r은 1 내지 10 범위의 정수이다. Ab는 항체이다.
[화학식 Ia]
Figure 112010072449630-pct00001
[화학식 Ib]
Figure 112010072449630-pct00002
상기 아미노산 단위(-W-)는, 존재하는 경우, 상기 스트레처 단위(-A-)를 상기 이격자 단위(-Y-)(상기 이격자 단위가 존재하는 경우)에 연결시키고, 상기 스트레처 단위를 세포독성제 또는 세포증식억제제(약물 단위; D)(상기 이격자 단위가 존재하지 않는 경우)에 연결시킨다.
존재하는 경우, -Ww-는 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 테트라펩타이드, 펜타펩타이드, 헥사펩타이드, 헵타펩타이드, 옥타펩타이드, 노나펩타이드, 데카펩타이드, 운데카펩타이드 또는 도데카펩타이드 단위이다. w는 2 내지 12 범위의 정수이다.
상기 이격자 단위(-Y-)는, 존재하는 경우, 아미노산 단위를 상기 약물 단위에 연결시킨다. 이격자 단위는 2 가지 일반적인 유형, 즉 자기-희생적 및 비 자기-희생적 유형을 갖는다. 비 자기-희생적 이격자 단위는 상기 이격자 단위의 일부 또는 전부가 상기 항-CD70 항체-링커-약물 접합체 또는 약물-링커 화합물로부터 아미노산 단위의 효소적 절단 후에 상기 약물 단위에 결합된 채로 남아있는 것이다. 비 자기-희생적 이격자 단위의 예는 (글리신-글리신) 이격자 단위 및 글리신 이격자 단위를 포함한다. 글리신-글리신 이격자 단위 또는 글리신 이격자 단위를 함유하는 항-CD70 항체-링커-약물 접합체가 종양-세포 관련된-프로테아제를 통해 효소적 절단을 겪을 때, 암-세포-관련된 프로테아제 또는 림프구-관련된 프로테아제, 글리신-글리신-약물 부분 또는 글리신-약물 부분이 Ab-Aa-Ww-로부터 절단된다. 상기 약물을 유리시키기 위해서, 독립적인 가수분해 반응이 상기 표적 세포 내에서 일어나 상기 글리신-약물 단위 결합을 절단시켜야 한다.
한편으로, 자기-희생적 이격자 단위를 함유하는 항-CD70 항체 약물 접합체는 상기 약물(D)을 별도의 가수분해 단계의 필요없이 방출시킬 수 있다. 상기 실시태양에서, -Y-는 p-아미노벤질 알콜(PAB) 그룹의 질소 원자를 통해 -Ww-에 결합되고 카보네이트, 카바메이트 또는 에테르 그룹을 통해 -D에 직접 연결된 PAB 단위이다. 자기-희생적 이격자의 다른 예는 상기 PAB 그룹과 전자적으로 동등한 방향족 화합물, 예를 들어 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체(예를 들어 문헌[Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237]을 참조하시오) 및 오쏘 또는 파라-아미노벤질 아세탈을 포함한다. 아미드 결합 가수분해 시 용이한 환화를 겪는 이격자, 예를 들어 치환 및 비 치환된 4-아미노부티르산 아미드(Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), 적합하게 치환된 바이사이클로[2.2.1] 및 바이사이클로[2.2.2] 고리 시스템(Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드(Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867)를 사용할 수 있다. 글리신의 α-위치에서 치환된 아민-함유 약물의 제거(Kingsbury, et al., 1984, J. Med. Chem. 27:1447)가 또한 상기 항-CD70 항체-링커-약물 접합체에 적용할 수 있는 자기-희생적 이격자 전략의 예이다. 한편으로, 상기 이격자 단위는 분지된 비스(하이드록시메틸)스타이렌(BHMS) 단위이며, 이를 사용하여 추가적인 약물들을 통합시킬 수 있다.
세포독성제의 유용한 부류들로는 예를 들어 안트라사이클린, 항튜불린제, DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 복제 억제제, 화학요법 증감제 등이 있다.
세포독성제의 유용한 부류의 예로는 아우리스타틴, 캄토테신, 듀오카마이신, 에토포시드, 마이탄시노이드 및 빈카 알칼로이드가 있다.
적합한 세포독성제는 예를 들어 아우리스타틴(예를 들어 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE), DNA 마이너 그루브 결합제(예를 들어 에네다인 및 렉시트롭신), 듀오카마이신, 탁산(예를 들어 패클리탁셀 및 도세탁셀), 빈카 알칼로이드, 독소루비신, 모폴리노-독소루비신, 및 시아노모폴리노-독소루비신을 포함한다.
상기 세포독성제는 화학요법제, 예를 들어 독소루비신, 패클리탁셀, 멜파란, 빈카 알칼로이드, 메토트렉세이트, 미토마이신 C 또는 에토포시드일 수 있다. 또한, 효능제, 예를 들어 CC-1065 동족체, 칼리케아미신, 마이탄신, 돌라스타틴 10의 동족체, 리족신, 및 팔리톡신을 상기 항-CD70 항체 또는 그의 유도체에 결합시킬 수 있다.
예시적인 실시태양들에서, 상기 세포독성제 또는 세포증식억제제는 아우리스타틴 E 또는 그의 유도체일 수 있다. 전형적으로, 상기 아우리스타틴 E 유도체는 예를 들어 아우리스타틴 E와 케토산 사이에 형성된 에스터이다. 예를 들어 아우리스타틴 E를 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응시켜 각각 AEB 및 AEVB를 생성시킬 수 있다. 다른 전형적인 아우리스타틴은 AFP, MMAF 및 MMAE를 포함한다. 상기 아우리스타틴 E 및 그의 유도체의 합성 및 구조는 예를 들어 미국 특허 출원 공보 제 2005-0238649 및 2006-0074008 호에 개시되어 있다.
상기 세포독성제는 DNA 마이너 그루브 결합제일 수 있다. (예를 들어 미국 특허 제 6,130,237 호를 참조하시오). 예를 들어, 상기 마이너 그루브 결합제는 CBI 화합물 또는 에네다인(예를 들어 칼리케아미신)일 수 있다.
상기 ADC 또는 ADC 유도체는 항-튜불린제를 포함할 수 있다. 항-튜불린제의 예로는 비 제한적으로 탁산(예를 들어 탁솔(등록상표)(패클리탁셀), 탁소테레(등록상표)(도세탁셀)), T6T(튤라릭), 빈카 알칼로이드(예를 들어 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 및 비노렐빈), 및 아우리스타틴(예를 들어 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB)이 있다. 예시적인 아우리스타틴은 하기 화학식 III 내지 XIII에 나타낸다. 다른 적합한 항튜불린제는 예를 들어 바카틴 유도체, 탁산 동족체(예를 들어 에포틸론 A 및 B), 노코다졸, 콜히친 및 콜시미드, 에스트라머스틴, 크립토피신, 세마도틴, 마이탄시노이드, 콤브레타스타틴, 디스코더몰리드 및 엘류쎄로빈을 포함한다.
[화학식 III]
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[화학식 IV]
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[화학식 V]
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[화학식 VI]
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[화학식 VII]
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[화학식 VIII]
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[화학식 IX]
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[화학식 X]
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[화학식 XI]
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[화학식 XII]
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[화학식 XIII]
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상기 세포독성제는 항튜불린제의 또 다른 그룹인 마이탄시노이드일 수 있다. 예를 들어, 상기 마이탄시노이드는 마이탄신 또는 마이탄신 함유 약물 링커, 예를 들어 DM-1 또는 DM-4이다(ImmunoGen, Inc.; 또한 문헌[Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131] 참조).
CD70에 대한 다른 결합제들을 항체에 대한 대안으로서 사용할 수 있다. 상기와 같은 CD70-표적화 부분은 CD70에 결합하고 세포독성제에 접합 시 CD70-발현 세포의 증식을 고갈하거나 억제하는 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 단백질은 다량체, 가장 전형적으로는 이량체이다.
다른 CD70-표적화 부분은 CD70에 결합하는 CD27 및 그의 변체 또는 단편을 포함할 수 있다. CD70-표적화 부분은 CD70에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 리간드 및 다른 분자들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 개시된 방법들에 유용한 다른 CD70-표적화 부분을 단백질-단백질 상호작용의 선별에 적합한 임의의 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 전형적으로, 단백질은 처음에 CD70에 특이적으로 결합하는 그의 능력, 이어서 세포독성제 또는 세포증식억제제에 접합 시 활성화된 림프구 또는 CD70-발현 암세포에 대해 세포증식억제 또는 세포독성 효과를 발휘하는 그의 능력에 의해 동정되었다. 사용될 수 있는 방법은 λgt11 라이브러리의 항체 탐침 기법과 유사한 방식으로 발현 라이브러리를 표지된 CD70으로 탐침 조사함을 수반하는 "상호작용 클로닝" 기법을 포함한다. (예를 들어 문헌[Blanar and Rutter, 1992, Science 256:1014-1018] 참조). 또 다른 방법은 2-하이브리드 시스템(Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582)이며 클론테크(Clontech)(Palo Alto, CA)로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
일단 CD70-결합 단백질이 동정되면, 그의 능력(단독으로 또는 다량체화되거나 이량체화 또는 다량체화 도메인에 융합되거나 또는 세포독성 또는 세포증식억제 부분에 접합될 때)을 항체에 대한 경우와 유사한 방식으로 측정한다.
III . CD70 검출
진단 용도를 위해 분석할 샘플을 외과적 시술, 예를 들어 생검법에 의해 수득할 수 있다. CD70을, 전형적으로는 공지되거나 암(예를 들어 췌장 또는 난소암)으로부터의 것으로 의심이 가는 세포를 함유하는 샘플을 항체와 접촉시키는 면역 분석에 의해 검출한다. 접촉 후에, 상기 시편 중의 상기 세포에 대한 항체의 결합 사건의 존재 또는 부재를 측정한다. 상기 결합은 상기 시편 중의 암세포 상에서 발현된 항원의 존재 또는 부재와 관련이 있다. 일반적으로, 상기 샘플을, 검출 가능한 신호를 생성시킬 수 있는 항-CD70 항체의 표지된 특정 결합 짝과 접촉시킨다. 한편으로, 상기 항-CD70 항체 자체를 표지할 수 있다. 표지 유형의 예로는 효소 표지, 방사성동위원소 표지, 비방사성 표지, 형광 표지, 독소 표지 및 화학발광 표지가 있다. 상기 표지로부터의 신호 검출은 상기 샘플 중의 CD70에 특이적으로 결합된 항체의 존재를 가리킨다.
상기 분석이 수행되는 샘플을 고정시키거나 동결시켜 조직학적 절제를 허용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 절제된 조직 샘플을 알데하이드 정착제, 예를 들어 폼알데하이드, 파라폼알데하이드, 글루타르알데하이드; 또는 중금속 정착제, 예를 들어 염화 제 2 수은 중에 고정시킨다. 보다 바람직하게는, 상기 절제된 조직 샘플을 상기 항체와의 배양 전에 포르말린 중에 고정시키고 파라핀에 매몰시킨다. 포르말린-고정되고 파라핀-매몰된(FFPE) 시편에 의해 제공되는 이점은 조직 섹션 중의 세포 및 건축학적 형태 세부의 보존이다(예를 들어 문헌[Fox et al., 1985, J. Histochem. Cytochem. 33:845-853] 참조). 임의로, FFPE 시편을 시트레이트, EDTA, 효소적 절단 또는 열로 처리하여 에피토프의 입수성을 증가시킬 수 있다(예를 들어 문헌[Shi et al., 1991, J Histochem Cytochem. 39:741-748] 참조).
한편으로, 단백질 분획을 공지되거나 의심이 가는 췌장 또는 난소암으로부터의 세포로부터 단리하고 ELISA, 웨스턴 블럿팅, 면역침전 등에 의해 분석할 수 있다. 또 다른 변화로, 세포를 바람직하게는 또 다른 췌장 또는 난소 세포 마커와 함께 FACS 분석에 의해 CD70의 발현에 대해 분석할 수 있다.
추가의 변화로, mRNA를 췌장 또는 난소암으로 공지되거나 또는 의심이 가는 세포로부터 추출할 수 있다. 이어서 상기 mRNA 또는 이로부터 유래된 핵산, 예를 들어 cDNA를 CD70을 암호화하는 DNA에 결합하는 핵 탐침에의 하이브리드화에 의해 분석할 수 있다.
또 다른 변화로, 췌장 또는 난소암을, 표지된 항-CD70 항체를 환자에게 투여하고 상기 항체를 생체 내 영상화에 의해 검출함으로써 생체 내에서 검출할 수 있다.
조직 샘플 중의 CD70의 검출은 정성적 또는 정량적이거나 또는 이 둘 모두일 수 있다. 정성적 검출은 CD70 발현의 존재 또는 부재를 검출함을 의미한다. 정량적 발현은 CD70의 발현 수준을 측정함을 의미한다. 췌장 또는 난소 조직 샘플 중의 CD70의 존재 및/또는 수준을 하나 이상의 표준에 대해 측정할 수 있다(필요하지 않을 수도 있다). 상기 표준은 역사적으로 또는 현대적으로 결정될 수 있다. 상기 표준은 예를 들어 상이한 환자로부터 암성이 아닌 것으로 공지된 췌장 또는 난소 샘플, CD70을 발현하지 않는 것으로 공지된 상기 환자 또는 다른 환자로부터의 조직, 또는 췌장 또는 난소 세포 주일 수 있다. 상기 표준은 또한 관련이 없는 항체(예를 들어 세균 항원에 대해 발생시킨 항체)와 접촉된 분석 중인 환자 샘플일 수도 있다. CD70은 비-암성 췌장 또는 난소 조직에서는 임의의 유의수준 정도로 발현되지 않으므로, 상기와 같은 비-암성 조직을 제로(배경) 발현 표준으로서 사용할 수 있다.
표준(사용되는 경우)에 비해 CD70에 대한 항-CD70 항체의 결합으로부터 검출 가능한 신호의 존재는 상기 조직 샘플 중의 CD70의 존재를 가리키고, 상기 검출 가능한 결합의 수준은 CD70의 발현 수준의 정보를 제공한다. 조직 섹션 상에서 수행된 분석에서, 상기 발현 수준을 CD70의 검출 가능한 발현을 나타내는 샘플의 표면적 퍼센트로서 나타낼 수 있다. 한편으로, 또는 또한, 상기 발현 수준(강도)을 상기 샘플 중의 총 발현의 척도 및 상기 샘플 중의 CD70을 발현하는 세포의 척도로서 사용할 수 있다.
IV . 진단, 예측, 고안 및 모니터링 치료
췌장 또는 난소 조직 샘플 중의 CD70 발현의 검출은 상기 샘플이 암성임을 가리킨다. 유사하게, 다른 환자 샘플에서 CD70 발현의 검출은 상기 환자가 폐, 두경부(후두 또는 인두), 흑색종, 교모세포종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 예를 들어 여포성 림프종, 투명 세포 및 유두 암종을 포함한 신 세포 암종, 결장직장 또는 방광 암종을 가짐을 가리킨다. 치료용으로 사용되는 항체는 천연 CD70 항원의 세포 외 도메인에 특이적으로 결합한다.
CD70의 존재 및/또는 수준에 의해 제공된 암의 정보를 진단 수단과 병용할 수 있다, 예를 들어 의사에 의한 환자의 내부 또는 외부 검사, X-선, CT 스캔(컴퓨터 단층촬영), PET 스캔(양전자 단층 촬영), PET/CT 스캔, 초음파, MRI(자기 공명 영상화), 내시경 검사, ERCP(내시경역행췌담관조영술), 조직학적 검사 및 전체 진단에 도달 시 조직 배양과 병행할 수 있다.
추정 상 의사에게 가장 큰 관련으로, CD70의 존재 및 수준이 상기 환자에 대한 치료 프로토콜을 구상하고, 특히 환자에게 CD70에 대한 항체, 유도체, ADC 또는 다른 결합제를 투여하기 위한 유용한 정보를 제공한다. 정상적인 췌장 또는 난소 조직에서 검출 가능한 CD70 발현의 필수적인 부재로 인해, 암에서 상기 수용체의 존재는 치료학적 치료의 표적을 제공한다. 상기 CD70 발현의 수준이 높을수록 및/또는 CD70을 발현하는 종양의 퍼센트가 클수록, 더 유효한 치료가 존재하는 듯하다. 치료 후 CD70의 연속된 분석은 상기 치료가 유효한지의 여부, 상기 치료가 유효한 CD70-양성 신호(즉 CD70-양성 암세포의 존재에 대한 대리로서) 수준의 감소를 모니터하는 수단을 제공한다.
V. 치료의 여지가 있는 환자
상기 방법들에 의해 치료의 여지가 있는 환자들은 대개 상술한 바와 같이 암의 다른 징후 또는 증상들이 수반된 그들의 췌장, 난소 또는 다른 조직 중에 CD70의 검출 가능한 수준을 갖는다. 상기 췌장 및 난소암 모두의 다양한 서브유형 및 단계들은 하기에 보다 상세히 개시하는 바와 같이 존재한다. 때때로, 본 발명의 방법에 의해 치료된 환자들은 앞서 상기 암의 완화 또는 심지어 그의 성장 지체의 유발 없이 다른 유형의 치료(예를 들어 수술, 화학요법 및/또는 방사선)를 경험하였다. 일부 상기와 같은 환자들에서, 상기 암은 보다 많은 상기와 같은 요법들 중 하나에 의한 치료에 내성이 있다.
췌장암의 위험이 있는 일부 환자를 또한 상기 질병의 징후 및 증상이 나타나기 전에 예방학적으로 치료할 수 있다. 상기와 같은 개인은 상기 질병을 경험한 친척들이 있는 개인, 및 유전 또는 생화학 마커의 분석에 의해 위험이 있는 것으로 결정된 개인을 포함한다.
A. 췌장암 환자
췌장암은 췌장 샘 내의 악성 종양이다. 췌장암 환자의 거의 90%는 55 세 초과이다. 상기 암이 발견된 시기의 평균 연령은 72세이다. 췌장암의 위험 인자로는 연령, 남성, 아프리카 인종, 흡연, 육류가 많은 식사, 비만, 당뇨병, 만성 췌장염(관련은 있지만 우연은 아닌 것으로 알려져 있다), 가솔린과 관련된 몇몇 살충제, 염료 및 화학물질에의 직업상 노출, 가족력, 헬리코박터 파이로리 감염, 치은염 또는 치주 질환이 있다. (Pancreatic Cancer. Von Hoff et al., ed., Maine: 2005.). 췌장암의 단지 10 내지 15% 만이 유전성으로 간주된다. 췌장암과 관련이 있는 일부 유전자 마커는 PNCA1, PALLD 또는 BRCA2 유전자의 돌연변이를 포함할 수 있다(예를 들어 문헌[Banke et al., 2000, Med. Clin. North Am. 84:677-690; Meckler et al., 2001, Am. J. Surg. Path. 25:1047-1053; Pogue-Geile et al., 2006, PLoS Med. 3: e516; Murphy et al., 2002, Cancer Res. 62:3789-3793]을 참조하시오).
그러나, 현재 인식된 위험 범주 안의 환자들이 모두 췌장암을 나타내지는 않을 것이다. 다수의 췌장암은 "산발적으로"(즉 가족력 없는 환자에게서) 발생한다.
췌장암을 앓고 있는 개인은 병상 보고서에서 획득된, 상기 종양의 조직학에 따라 인지될 수 있다. 조직학은 임상 치료, 관리 및 예후의 다수의 태양들을 지시한다. 상기 종양이 췌장의 외분비 또는 내분비선으로부터 출발하는지의 여부를 근거로 췌장암의 2 가지 주요 유형이 존재한다. 췌장의 외분비선으로부터 형성된 종양이 훨씬 더 통상적이다. 췌장 종양의 약 95%는 선암종이다. 나머지 5%는 외분비 췌장의 다른 종양들(예를 들어 장액성 낭성 종양), 선방세포암, 및 췌장 신경내분비 종양(예를 들어 인슐린종)을 포함한다.
내분비 종양을 또한 섬세포 종양이라고도 칭하며 여러 가지 하위유형들로 분류된다. 대부분은 양성이나, 몇 가지는 암성이다. 특정 유형의 암(팽대 암)은 간 및 췌장관으로부터의 담관이 소장으로 흘러들어가는 경우 발생할 수 있다. 상기 유형의 암은 종종 피부 및 눈의 황색화와 같은 징후들을 유발하므로, 상기는 대개 대부분의 췌장암들보다 더 이른 단계에 발견된다. 성공적인 치료의 기회는 팽대암을 앓고 있는 환자들의 경우 더 양호하다.
췌장암의 단계화를 미국 암 연합회(AJCC) 기준에 따라 수행할 수 있다. 상기 암 단계들을 로마 숫자 I 내지 IV를 사용하여 표지하며, 이때 IV 기는 암이 퍼졌고 보다 심각함을 가리킨다. 구체적으로, I 기 췌장암은 일부 금지된 민감한 구역 내로 퍼지지 않았고 연루된 국소 결절 또는 말단 전이가 없는 종양을 포함한다. II 기는 샘창자, 담관, 또는 "췌장주위" 조직 내로 퍼졌고 연루된 국소 결절 또는 말단 전이가 없는 종양을 포함한다. III 기 암은 이들 구역 내로 퍼졌을 수도 퍼지지 않았을 수도 있고 국소 결절을 가지나 말단 전이의 증거는 보이지 않는 종양을 포함한다. IVA 기는 위, 비장, 대장 또는 인접한 큰 혈관 내로 퍼졌고 연루된 국소 결절을 가지나 말단 전이의 증거는 보이지 않는 종양을 포함한다. IVB 기는 임의의 종류의 결절 상태 및 말단 전이의 증거를 갖는 임의의 유형의 췌장 종양을 포함한다. 이렇게 지칭하기는 하지만, 상기 췌장암 단계화 시스템은, 상기 단계들이 환자의 예후 또는 치료 선택권에 충분히 부합되지 않으므로, 순수한 형태로 좀처럼 사용되지 않는다. 대안은 방사선학적 발견에 근거한 3 단계 분류(잠재적으로 절제가능한, 국소적으로 진행된 및 전이성)이다. 다른 예후 인자들도 또한 고려된다. 현미경 하에서 세포가 얼마나 비정상적으로 보이는지를 가리키는 상기 암의 등급을 때때로 G1에서부터 G4까지의 규모로 나열하며, 이때 G1 암은 가장 정상 세포처럼 보이고 최상의 예측을 갖는다. 수술한 환자들의 경우, 상기 절제의 정도, 즉 종양이 전부 제거되었는지의 여부가 또한 예측에 중요하다. 이를 때때로 R0에서부터 R2까지의 규모로 나열하며, 이때 R0은 볼 수 있는 종양이 전부 제거된 것을 가리키고 R2는 볼 수 있는 일부 종양이 제거될 수 없음을 가리킨다.
초기 췌장암 증상은 비특이적이고 다양하다. 통상적인 증상으로는, 전형적으로는 등으로 방사상으로 퍼지고 앞으로 기대면 완화되는 상복부 통증(췌장부 또는 미부의 암종에서 나타남), 식욕 상실, 현저한 체중 손실 및 담관 폐쇄와 관련된 무통 황달(췌장 두부의 암종)이 있다. 그러나, 이들 증상은 모두 다수의 다른 원인들을 가질 수 있으며 췌장암에 국한되는 것은 아니다.
B. 난소암 환자
난소암은 난소에서 시작하는 암이다. 난소암은 대개 50 세 이상의 여성들에서 발생하나, 또한 보다 젊은 여성들이 걸릴 수도 있다. 그의 원인은 알려져 있지 않다. 독일 폴란드 러시아계 유대인 여성과 같은 특정 집단에서, 종종 일반적인 집단보다 더 어린 연령에서 위험성이 더 높다. 유방암의 개인력 또는 난소, 유방 또는 다른 관련 암의 가족력이 있는 환자, 특히 젊은 연령의 경우 위험성이 상승할 수도 있다. 자궁암, 결장암 또는 다른 위장관 암의 강한 가족력은 가족성 대장암으로서 알려진 증후군(HNPCC, 또한 린치 II 증후군으로서 알려짐)의 존재를 가리킬 수도 있으며, 이는 난소암의 보다 높은 발생 위험성을 부여한다. 세포유전적 연구 및 이형접합성 상실 조사는 일부의 유전자 또는 염색체 영역이 난소암 개시 및 진행에 관련됨을 제시한다(예를 들어 문헌[Pejovic et al., 1992, Genes Chromosomes Cancer, 4:58-68; Testa et al, 1994, Cancer Res., 54:2778-2784; Yang-Feng et al, 1993, Int. J. Cancer, 54:546-551]을 참조하시오). 난소암에 대한 위험의 유전자 마커는 비 제한적으로 BRCA1 또는 BRCA2 유전자의 돌연변이를 포함한다(Futreal et al., 1994, Science, 266:120-122). 난소암에 대한 강한 유전적 위험성을 갖는 환자는 출산 종료 후 예방적 난소절제술의 사용을 고려할 수도 있다. 현재 인정된 위험 범주 안의 모든 여성들에서 난소암이 발생하는 것은 아니다. 난소암의 대부분은 산발적으로 발생한다.
난소암을 앓고 있는 개인은 병상 보고서에서 획득된, 상기 종양의 조직학에 따라 인지될 수 있다. 조직학은 임상 치료, 관리 및 예후의 다수의 태양들을 지시한다. 종양이 출발된 세포의 종류 및 상기 종양이 양성인지 암성인지의 여부를 근거로 난소암에 3 가지 주요 유형이 존재한다. 생식세포 종양은 난을 생산하는 세포로부터 출발한다. 기질적 종양은 난소를 함께 붙들고 여성 호르몬인 에스트로젠 및 프로제스테론을 생산하는 결합 조직 세포로부터 출발한다. 상피 종양은 난소의 외면을 덮는 세포로부터 출발한다. 대부분의 난소암은 상피 종양이며, 소수는 상기 생식세포 또는 기질 세포로부터 발생한다.
난소암은 종종 원발성이나, 체내 다른 곳의 원발암으로부터의 전이의 결과로서 2차적일 수도 있다. 예를 들어, 유방암으로부터, 또는 위장관 암으로부터(이 경우 난소암은 크루켄버그 암이다)일 수 있다. 표면 상피-기질 종양은 복강의 내층으로부터 기원할 수 있으며, 이 경우 난소암은 원발성 복막암에 대해 2차적이나, 치료는 상기 유형의 원발성 난소암의 경우와 기본적으로 동일하다.
난소암에서, 암 단계는 하기와 같다: I 기는 한쪽 또는 양쪽 난소로 국한되고; II 기는 골반 확장부 또는 이식물을 포함하고; III 기는 골반을 넘어 미시적인 복막 전이를 포함하거나; 또는 소장 또는 장막까지 확장된 골반으로 국한되고; IV 기는 간 내 또는 복강 외부와 같은 말단 전이를 포함한다.
초기 난소암은 흔히 자각증상이 없거나, 또는 그 증상이 애매하거나 비특이적이어서 환자가 무시할 수도 있는 순한 증상들만을 생성시킨다. 증상으로는 복부팽만감, 골반 또는 복부 통증, 식사 장애 또는 긴박뇨 증상, 예를 들어 가야할 필요성의 긴박하거나 빈번한 느낌이 있을 수 있다. (예를 들어 문헌[Smith et al., 2005, Cancer 104(7):1398-1407; 2007년 6월 12일자로 미국 암 협회, 부인암 재단, 및 부인과 종양학 협회에 의해 발표된 합의 진술] 참조). 상기 암이 나타난 환자의 60% 이상은 이미 난소 이상으로 이미 퍼진 III 기 또는 IV 기 암을 갖는다.
C. 다른 암 환자
상기 방법들에 의한 치료의 여지가 있는 다른 환자들은 대개 폐, 두경부(후두 또는 인두), 흑색종, 교모세포종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 예를 들어 여포성 림프종, 투명 세포 및 유두 암종을 포함한 신 세포 암종, 결장직장 또는 방광 암종의 샘플 중에서 CD70의 검출 가능한 수준을 갖는다. 상기와 같은 환자는 암의 다른 징후 또는 증상들을 동반할 수 있다. 때때로, 본 발명의 방법들에 의해 치료된 환자들은 암의 완화 또는 심지어 암 성장의 지연 없이 앞서 다른 유형의 치료(예를 들어 수술, 화학요법 및/또는 방사선)를 경험하였다.
암의 위험성이 있는 일부 환자들을 또한 상기 질병의 징후 및 증상이 나타나기 전에 예방학적으로 치료할 수도 있다. 상기와 같은 개인은 상기 질병의 경험이 있는 친척들이 있는 개인, 및 유전자 또는 생화학적 마커의 분석에 의해 위험성이 있는 것으로 측정된 개인을 포함한다.
VI . 치료 방법
본 발명은 본 발명에 개시된 항체, 유도체 및 ADC, 및 다른 항-CD70 결합제(집합적으로 작용제)에 의한 췌장 또는 난소암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 상기 조성물을 환자에게 투여할 수 있다.
피 내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 비 내, 경막외, 및 경구 경로를 포함한 다양한 전달 시스템을 사용하여 상기 작용제를 투여할 수 있다. 상기 작용제를 예를 들어 주입 또는 일시 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내층(예를 들어 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여할 수 있으며 화학요법제와 같은 다른 생물학적으로 활성인 작용제들과 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다.
상기 작용제를 주사에 의해, 카테터의 사용에 의해, 좌약의 사용에 의해, 또는 이식물의 사용에 의해 투여할 수 있으며, 상기 이식물은 멤브레인, 예를 들어 시알라스틱(sialastic) 멤브레인, 또는 섬유를 포함한 다공성, 비 다공성 또는 젤라틴성 물질이다.
한편으로, 상기 작용제들을 조절된 방출 시스템 중에서 전달할 수 있다. 예를 들어 펌프를 사용할 수 있다(문헌[Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574] 참조). 한편으로, 중합체성 물질을 사용할 수 있다(예를 들어 문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer & Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen & Ball eds., Wiley, New York, 1984; Ranger & Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105] 참조). 다른 조절된 방출 시스템들이 예를 들어 상기 문헌[Langer]에 논의되어 있다.
상기 작용제를 치료 또는 예방 유효량의 상기 작용제 및 하나 이상의 약학적으로 상용성인 성분을 포함하는 약학 조성물로서 투여할 수 있다. 예를 들어 상기 약학 조성물은 전형적으로는 하나 이상의 약학 담체(예를 들어 멸균 액체, 예를 들어 물 및 오일, 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것 포함, 예를 들어 땅콩 오일, 대두 오일, 광성물 오일, 참깨 오일 등)를 포함한다. 상기 약학 조성물을 정맥 내로 투여하는 경우 물이 보다 전형적인 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액을 또한, 특히 주사용 용액의 경우 액체 담체로서 사용할 수 있다. 적합한 약학 부형제는 예를 들어 전분, 글루코스, 락토오스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카젤, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화 나트륨, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 상기 조성물은 경우에 따라 소량의 습윤 또는 유화제, pH 완충제(예를 들어 아미노산) 및/또는 용해 또는 안정제(예를 들어 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈 또는 당, 예를 들어 슈크로스, 트레할로스 등)를 또한 함유할 수 있다. 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유화액, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방성 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 상기 조성물을 전통적인 결합제 및 담체, 예를 들어 트라이글리세라이드와 함께 좌약으로서 제형화할 수 있다. 경구 제형은 표준 담체, 예를 들어 약제 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함할 수 있다. 적합한 약학 담체의 예들이 문헌[E.W. Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences"]에 개시되어 있다. 상기와 같은 조성물은 환자에게 적합한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해서 적합한 양의 담체와 함께, 전형적으로는 정제된 형태로, 치료 유효량의 핵산 또는 단백질을 함유할 것이다. 상기 제형은 투여 방식에 상응한다.
전형적으로, 정맥 내 투여를 위한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 약제는 주사 부위의 통증을 덜기 위해서 용해제 및 국소 마취제, 예를 들어 리그노카인을 또한 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분들을 별도로 또는 단위 투여형으로 함께 혼합하여, 예를 들어 활성제의 양을 지시하는 앰풀 또는 향낭과 같은 밀폐 용기 중의 농축물 또는 건조한 동결건조 분말로서 공급한다. 상기 약제를 주입에 의해 투여해야 하는 경우, 멸균 약제 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 투약할 수 있다. 상기 약제를 주사에 의해 투여하는 경우, 상기 성분들을 투여 전에 혼합할 수 있도록 주사용 멸균 수 또는 염수의 앰풀을 제공할 수 있다.
췌장 또는 난소암의 치료 또는 예방에 유효한 작용제의 양을 표준 임상 기법에 의해 측정할 수 있다. 또한, 시험관 내 분석을 임의로 사용하여 최적 투여량 범위의 확인을 도울 수 있다. 상기 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 췌장 또는 난소암의 단계에 따라 변하며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량을 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽할 수 있다. 1 회 용량을 세포 배양액에서 측정된 바와 같은 IC50(즉 증상의 1/2-최대 억제를 성취하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 성취하기 위해 동물 모델에서 제형화할 수 있다.
예를 들어, 상기 작용제의 독성 및 치료 효능을 LD50(집단의 50%에 대한 치사 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 유효한 용량)의 측정에 대한 표준 약학 과정에 의해 세포 배양액 또는 실험 동물에서 측정할 수 있다. 상기 독성과 치료 효과 간의 용량 비는 치료 지수이며 이를 LD50/ED50의 비로서 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 작용제가 바람직하다. 작용제가 독성 부작용을 나타내는 경우, 상기 작용제를 병든 조직의 부위로 표적화하는 전달 시스템을 사용하여 비-CD70-발현 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하고, 이에 의해 부작용을 감소시킬 수 있다.
일반적으로, CD70-발현 암이 있는 환자에게 투여되는 항체, 유도체 또는 ADC의 투여량은 전형적으로는 환자의 체중 ㎏ 당 0.1 내지 100 ㎎이다. 보다 전형적으로, 상기 환자에게 투여되는 투여량은 환자의 체중 ㎏ 당 0.1 내지 10 ㎎, 훨씬 더 전형적으로는 환자의 체중 ㎏ 당 0.1 내지 5 ㎎, 또는 0.1 내지 3 ㎎이다. 일반적으로, 인간 항체는 외부 단백질에 대한 면역 반응으로 인해 인간 항체 내에서 다른 종들로부터의 항체보다 더 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 인간화된, 키메릭 또는 인간 항체를 포함하는 ADC의 보다 적은 투여량 및 덜 빈번한 투여가 종종 가능하다.
CD70에 대한 항체, 유도체 및 ADC를 또한 췌장 또는 난소암의 치료 또는 예방을 위한 하나 이상의 다른 치료제와 함께 투여할 수 있다. 예를 들어, 복합 요법은 제 2 세포증식 억제 또는 세포독성제(예를 들어 비접합된 세포증식억제 또는 세포독성제, 예를 들어 암 치료에 통상적으로 사용되는 것들)를 포함할 수 있다. 복합 요법은 또한, 예를 들어 CD70-발현 암세포의 표면상의 CD70 이외의 수용체 또는 수용체 복합체를 표적화하는 작용제의 투여를 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기와 같은 항체 또는 리간드는 CD70-발현 암 세포 상의 세포 표면 수용체에 결합하고 상기 CD70-발현 암세포에 세포증식억제 또는 세포독성 신호를 전달함으로써 상기 항-CD70 항체의 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 향상시킨다.
상기 작용제와 함께 투여될 수 있는 다른 약물은 성장 인자 억제제, 또는 혈관형성 억제 인자를 포함한다. 예를 들어, 표피 성장 인자 수용체 타이로신 키나제 억제제인, 에를로티닙이라 칭하는 약물을 진행된 췌장암의 치료에 사용할 수 있다(Bareschino et al., 2007, Ann Oncol. Suppl 6:35-41). 상기와 같은 복합 투여는 질병 매개변수들(예를 들어 증상의 중증도, 증상의 수, 또는 재발 회수)에 대해 부가적 또는 상승작용적 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 방법을 다른 치료 수단들, 예를 들어 수술, 방사선, 표적화된 요법, 면역요법, 성장 인자 억제제의 사용, 또는 혈관형성 억제 인자와 병용할 수 있다.
수술은 바람직한 치료이며 조직학을 통한 차별적인 진단을 위해 조직 시편을 수득하는데 빈번히 필요하다. 개선된 생존은 상기 질병의 보다 정확한 단계화 및 복부 중 종양의 보다 높은 공격적인 외과적 절제율에 기인한다. 수술의 유형은 진단 시 암이 얼마나 만연되었는지 뿐만 아니라 추정되는 암의 유형 및 등급에 따라 변한다.
췌장 선암종을 앓고 있는 환자들의 경우, 외과의사는 휘플 시술(또한 췌십이지장절제술이라고 칭함)을 수행할 수 있다. 이 시술에서, 췌장의 두부 및 때때로 췌장부를 위 및 소장의 일부, 담낭, 총담관의 일부, 및 일부 가까운 림프절과 함께 제거한다. (예를 들어 문헌[Michalski et al., 2007, Nat. Clin. Pract. Oncol. 4(9):526-35] 참조). 췌장의 내분비 종양(섬 세포 종양)을 앓고 있는 환자들의 경우, 수술은 실용적인 선택권이다. (예를 들어 문헌[Akerstrom and Hellman, 2007, Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 21(1):87-109] 참조).
난소암 환자에서, 외과의사는 하나(한쪽 난소절제술) 또는 2개 난소(양쪽 난소절제술), 나팔관(난관절제술) 및 자궁(자궁절제술)을 제거할 수 있다. 일부 매우 초기 종양, 예를 들어 I 기 종양의 경우, 특히 생식성을 보존하기 원하는 젊은 여성에서 단지 관련된 난소 및 난관만을 제거할 것이다("한쪽 나팔관-난소절제술", USO). 진행된 암에서, 완전한 절제가 가능하지 않은 경우, 가능한 한 많은 종양을 제거한다(데벌킹(debulking) 수술). 상기 유형의 수술이 성공적인 경우, 예후는 큰 종양 덩어리(직경 1 ㎝ 초과)를 남겨둔 환자에 비해 개선된다. 최소 침습 수술 기법은 매우 큰(10 ㎝ 초과) 종양의 안전한 제거를 용이하게 하여 수술 합병증을 보다 적게할 수 있다(예를 들어 문헌[Ehrlich et al., 2007, J. Pediatr. Surg. 42(5):890-3] 참조).
화학요법은 암세포를 죽이기 위한 항암 또는 세포독성 약물의 사용을 지칭한다. 화학요법은 수술 전 또는 후에 환자에게 제공될 수 있다. 종양의 조직학에 따라, 일부 종류의 종양(특히 기형종)은 화학요법에 민감하지 않다. 예를 들어 젬시타빈, 5-플루오로우라실, 시스플라틴 또는 미토마이신 C와 같은 약물에 의한 정맥 내 화학요법을 사용하여 췌장암을 치료할 수 있다. 정맥 내 화학요법, 예를 들어 젬시타빈, 토포테칸, 독소루비신, 리포솜 독소루비신, 카보플라틴, 패클리탁셀을 사용하여 난소암을 치료할 수 있다. 부분적으로 정맥 내 및 부분적으로 복강 내인 화학요법은 또한 중간 생존 시간을 개선시킬 수 있다. (The Chemotherapy Source Book(3rd edition). Ed. Perry. Lippincott, Williams and Wilkins, 2001; Oxford Textbook of Palliative Medicine. (2nd Ed.) Derek Doyle et al. Oxford University Press. 1999).
방사선 요법은 가능한 한 정상세포에 대해 덜 해롭게 하면서 암세포를 죽이거나 축소시키기 위한 고 에너지 선, 예를 들어 x-선에 의한 치료이다. 방사선은 수술 전 또는 후에 환자에게 제공될 수 있다. 방사선 요법을 또한, 퍼지지 않았지만 수술에 의해 제거될 수 없는 췌장암의 치료에 사용할 수 있다. 방사선 요법은 종종 난소암의 치료에는 사용되지 않으나, 적합한 경우 때때로 사용될 수도 있다. 복합적인 방사선 및 화학요법을 수술에 의해 제거하기에는 너무 넓게 퍼진 종양을 갖는 환자들에게 사용할 수 있다.
항-CD70 항체, 유도체 또는 ADC를 수술, 화학요법 또는 방사선 요법 치료 중인 환자에게 동시에 투여할 수 있다. 한편으로, 환자는 항-CD70 항체, 유도체 또는 ADC의 투여 전이나 투여에 이어서 1 시간 이상 수 개월 이하까지, 예를 들어 상기 ADC 또는 ADC 유도체의 투여 전 또는 투여에 이어서 1 시간, 5 시간, 12 시간, 하루, 일주일, 한 달, 또는 세 달 이상까지 수술, 화학요법 또는 방사선 요법을 경험할 수 있다.
VII . 키트
본 발명은 상기 검출 방법들과 함께 사용하기 위한 진단 키트를 제공한다. 상기 키트는 전형적으로는 상술한 바와 같은 검출에 유용한 변성된 CD70에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 함유한다. 하나 이상의 추가적인 용기는 상기 분석에 사용되는 요소들, 예를 들어 시약 또는 완충제를 동봉할 수 있다. 상기와 같은 키트는, 또한 또는 한편으로, 항체 결합의 직접 또는 간접적인 검출에 적합한 정보제공 그룹을 함유하는 검출 시약을 함유할 수 있다.
본 발명은 췌장 및 난소암 치료용 약학 키트를 또한 제공한다. 전형적으로, 상기와 같은 키트는 본 발명에 개시된 바와 같은 치료 조성물로서 제형화된 시약을 함유하며, 키트로 분배하기에 적합한 다양한 형태들 중 어느 하나일 수 있다. 상기와 같은 형태는 작용제, 예를 들어 항-CD70 항체, 유도체 또는 ADC를 제공하기 위한 액체, 분말, 정제, 현탁액 등의 제형일 수 있다. 상기 키트는 또한 상기 동결건조된 항체, 유도체 또는 ADC의 주사, 재조성 또는 희석을 위한 약학적으로 허용 가능한 희석제(예를 들어 멸균 수)를 포함할 수 있다.
본 발명은 진단 및 치료를 위한 복합 키트를 추가로 제공한다. 상기와 같은 키트는 전형적으로는 고정된 조직 섹션 중의 검출에 사용하기 위한, 천연 CD70보다 변성된 CD70에 우선적으로 결합하는 하나 이상의 항체, 및 치료에 사용하기에 변성된 CD70보다 양호하지 않은 경우 또한 적어도 천연 CD70에 결합하는 상이한 항체를 포함한다.
키트는 또한 전형적으로 본 발명에 개시된 검출 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 표지 또는 설명서를 함유한다. 상기 표지 또는 설명서는 키트의 제조, 운반, 판매 또는 사용 중 언제라도 상기 키트에 첨부되거나 또는 달리 동반되는 임의의 서면 또는 기록 자료를 지칭한다. 이는 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해 지시된 형태의 통지일 수 있으며, 상기 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 및 판매 당국에 의한 승인을 반영한다. 상기 표지 또는 설명서는 또한 광고 전단 및 팸플릿, 포장 재료, 설명서, 오디오 또는 비디오 카세트, 컴퓨터 디스크뿐만 아니라 상기 약학 키트에 직접 인쇄된 문서를 포함할 수 있다.
본 발명을 하기의 실시예들에 추가로 개시하며, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 하기 실시예들에 개시된 세포 주들은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC) 또는 DMSZ(Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbH, Braunschweig, Germany)에 의해 명시된 조건에 따라 배양액 중에서 유지되었다. 세포 배양 시약들은 인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) 또는 다른 공급처로부터 수득되었다.
실시예
실시예 1. 단클론 항체 SG -21.1 C1 .B3 및 SG -21.5 D12 . C3 의 제조
단클론 항체 SG-21.1C1.B3 및 SG-21.5D12.C3를, 면역원, CD70의 변성된 세포 외 도메인(CD70-ECD)으로 수 회 시험감염시킨 마우스로부터 회수한 비장 또는 림프절로부터의 B-세포를 사용하여 생성시켰다. 이어서 상기 B-세포를 골수종 종양 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성시켰다. 따라서 상기 하이브리도마로부터 다수의 단클론 항체들을 생성시켰다. 상기 하이브리도마를 클론 형성능이 보장되도록 희석하고 증식시켰다.
상기 상이한 클론으로부터의 항체를, 플래그-CD70을 사용하는 ELISA 또는 키노몰구스 원숭이("cyno") CD70을 발현하는 고정된 293F 및 변성된 L540cy 세포(CD70을 발현한다)를 사용하는 차별적인 FMAT 스크린(Applied Biosystems, Foster City, CA)과 같은 시험에 의해, 변성된 CD70 항원에 결합하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 형질감염되지 않은 293F 및 L540cy 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. (일부 L540cy 세포는 CD70에 대해 양성이었다).
상기 결과는 시험된 100 개 이상의 하이브리도마가 변성된 CD70에 결합하는 능력에 대해 양성임을 보였다. 2 개의 양성 하이브리도마, SG-21.1C1.B3("1C1") 및 SG-21.5D12.C3("5D12")으로부터의 항체를 면역조직화학을 위해 선택하였다.
실시예 2: 포르말린-고정되고 파라핀 매몰된( FFPE ) 샘플의 제조
포르말린-고정되고 파라핀 매몰된 조직을 문헌[Theory and Practice of Histotechnology, Second Edition. 1980, Sheehan. D.C. and Hrapchak, B.B., editors(Battelle Press(Columbus, OH). Chapter 3, pp. 59-78)]에 개시된 바와 같이, 표준 방법에 따라 제조하였다.
FFPE에 의한 세포의 제조는 조직 표본의 경우와 유사하였다. 간단히, 세포를 고정시키기 전에 적합한 배양 배지 중에 약 15,000 세포/웰/1일로 도말하였다. 상기 세포를 하기와 같이 고정시켰다: 세포를 PBS로 2 회 세척하고 이어서 실온에서 45 분간 10% 포르말린으로 고정시켰다. 그 후에, 상기 세포를 PBS로 2 회 세척하고 이어서 실온에서 15 분간 PBS + 0.5% 트리톤 X-100을 침투시켰다. 이어서 상기 세포를 PBS로 1 회 세척하고 4 ℃에서 PBS + 0.02% 나트륨 아지드 중에 보관하였다. FMAT 선별에 앞서, 상기 PBS + 아지드를 제거하고 상기 플레이트를 실온에서 30 분간 PBS + 5% 염소 혈청으로 차단하였다.
실시예 3: 면역조직화학을 위한 조직 미세배열의 제조
FFPE 조직 섹션의 조직 미세배열을 유에스 바이오맥스(US Biomax), 트라이스타(TriStar) 또는 사이브르디(Cybrdi)를 포함한 상업적인 출처로부터 수득하였다. 조직 미세배열을 또한 예일(Yale) 조직 미세배열 제작 프로토콜, 버전 1.0 및 이후 최신정보에 따라 제조하였다.
실시예 4: FFPE 샘플에 대한 면역조직화학 시약으로서 단클론 항체 SG-21.1C1.B3 및 SG -21.5 D12 . C3 의 개발
A. CD70 클론의 면역조직화학적 시험
키노몰구스 원숭이 CD70을 암호화하는 발현 구조물을, 완전-길이 키노몰구스 CD70 유전자를 발현 벡터 내로 클로닝하여 제조하였다. 상기 구조물을 293F 세포에 형질감염시켰다. 상기 293F:CD70 형질감염된 세포는 1C1 및 5D12 항체로 염색하기 위한 양성 대조군으로서 소용되었다. 모 293F 세포 주는 음성 대조군으로서 소용되었다. 조직 염색을 위해, CD70을 발현하는 786-O 세포는 양성 대조군으로서 소용되었다.
상기 세포 및 조직을 실시예 2에 개시된 과정에 따라 고정시키고 파라핀 왁스에 매몰시켰다. IHC 염색 및 항원 복구를 비젼 바이오시스템스 본드-맥스(Vision BioSystems Bond-max)TM 시스템(현재 Leica Microsystems)을 사용하여 수행하였다. 항원 복구를 EDTA 복구 방법을 사용하여 40 분간 수행하였다. 한편으로, 항원 복구를 99 내지 100 ℃의 온도에서 1 시간 동안 트릴로지(Trilogy) 항원 복구 시스템(Cell Marque, Hot Springs, AR)을 사용하여 수행하였다.
1C1 1 차 항체 또는 5D12 1 차 항체는 모든 고정된 293F:CD70 형질감염된 세포를 강하게 염색한 반면, 모 293 세포에서는 염색이 검출되지 않았다. 상기 결과는 또한 786-O 세포(신 세포 암종)에서 강한 염색을 보인 반면, 라모스(Ramos) 이종이식편 대조군에서는 배경 염색이 검출되었다.
1C1 클론을 추가로 서브클로닝하고 서브클론, 1C1-B3(SG-21.1C1.B3)을 선택하였다. 마찬가지로, 5D12를 추가로 서브클로닝하고 서브클론, 5D12-C3(SG-21.5D12.C3)을 선택하였다. 상기 2 개의 서브클론을 정제하고 1 차 항체로서 사용하여 786-O 이종이식편 및 라모스 이종이식편 샘플을 염색하였다. 상기 결과는 1C1-B3 및 5D12-C3의 서브클로닝 및 정제가 상기 라모스 이종이식편에서 배경 염색을 제거함을 보였다.
항-CD70 항체를 생산하는 하이브리도마는 10801 유니버시티 블러바드 마나사스 VA 20110-2209에 있는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되었다. ATCC 수탁 번호 PTA-8733을 갖는 항체 1C1을 생산하는 세포 주 SG-21.1C1.B3은 2007년 10월 24일자로 ATCC에 기탁되었고; ATCC 수탁 번호 PTA-8734를 갖는 항체 5D12를 생산하는 세포 주 SG-21.5D12.C3은 2007년 10월 24일자로 ATCC에 기탁되었다
B. 2B3 항체와 비교된 SG-21 항체 1C1 및 5D12에 의한 웨스턴 블럿팅
SG-21 항체 1C1 및 5D12 항체가 세포 및 조직 용해물 중에서 CD70을 검출하는지의 여부를 측정하기 위해서, 웨스턴 블럿 실험을 수행하였다. 또 다른 CD70 결합 항체인 2B3을 또한 비교용으로 사용하였다. 세포막 제제를 음성 대조군으로서 786-O 세포, 293F:cynoCD70(cyno CD70을 발현함) 세포 및 293F 세포로부터 제조하였다. 세포막 추출물을 제조하기 위해서, 세포를 저장성 완충 용액에 용해시키고 세포찌꺼기를 제거하기 위해서 4 ℃에서 10,000 x g에서 10 분간 원심분리시켰다. 이어서 상등액을 4 ℃에서 30 분간 100,000 x g에서 원심분리시켜 세포막 분획을 펠릿화하였다. 상기 세포막 분획(펠릿)을 50 mM 트리스 + 150 mM NaCl 및 5 mM EDTA 중의 0.5% NP40에 용해시켰다. 모든 샘플 제조를 프로테아제 억제제의 존재 하에서 수행하여 CD70을 완전하게 유지시켰다. 상기 단백질의 양을 BCA 키트(Pierce)를 사용하여 570 ㎚에서 측정하였다. CD70 ECD(CD70의 세포 외 도메인) 및 플래그 표지된 CD70-ECD를 또한 표준 방법에 의해 제조하였다. 상기 단백질 샘플을 90 ℃에서 3 분간 변성시키고 얼음 상에서 3 분간 냉각시켰다. 상기 샘플을 SDS-PAGE를 사용하여 분리시키고 이어서 검출을 위해 나이트로셀룰로스 멤브레인으로 옮겼다. 4 개의 동일한 SDS-PAGE 젤 및 멤브레인을 제조하였다. 상기 멤브레인을 1% BSA가 있는 PBS 및 0.05% 트윈(폴리솔베이트)이 있는 2% 무 지방 우유 중에서 차단하였다. 이어서 각각의 1 차 항체를 상기 용액에 0.5 ㎍/㎖로 가하고 실온에서 4 시간 동안 0.05% 트윈이 있는 PBS 중에서 배양시켰다. 상기 멤브레인을 세척하고 2 차 항체-효소 접합체(상기 1 차 항체를 인식한다)를 가하고 실온에서 45 분간 배양하였다. 상기 멤브레인을 세척하고 화학발광 기질과 함께 배양하여 CD70을 검출하였다.
도 1에 관하여, 결과는 SG-21 항체 1C1 및 5D12 항체가 786-O 및 293F:CD70 형질감염체 중의 CD70을 검출하였지만, 음성 대조군인 293F 세포에서는 아님을 보였다. 현저하게는, 상기 검출된 밴드들은 786-O 및 293F:CD70 형질감염체 중에서 동일한 크기를 가졌다. SG-21 항체 2B3은 786-O 및 293:cynoCD70 샘플 중에서 CD70을 검출하지 못했지만 CD70ECD 및 플래그-CD70-ECD는 검출하였다. 상기 결과는 1C1 및 5D12 항체가 상기 샘플들 중에서 CD70을 검출함을 가리켰다.
C. SG21.1C1 항체를 사용하는 종양 및 비-종양 세포 주에서의 CD70 발현
하기의 암 샘플들을 함유하도록 제조된 조직 미세배열을 상업적 출처로부터 수득하거나 구입하였다: 유방 암종, 난소 암종, 중피종, 골육종, 전립선 암종, 간세포 암종, 교모세포종, 역형성별아교세포종, 자궁암, 배아세포암, 편평세포암종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 비-T, 비-B 모든 조직구 림프종, 비-호지킨 림프종(NHL) 버킷 림프종, NHL 여포성 림프종, 급성 골수구성 백혈병(AML), 악성 대 세포 림프종(ALCL), 적혈구성백혈병, 결장 암종, 비-소 세포 폐암(NSCLC), 소 세포 폐암(SCLC), 신 세포 암종(RCC), 투명 세포 유형 RCC, 유두상 RCC, 흑색종, 췌장 암종 및 방광 암종. 하기의 세포 또는 세포 주들을 또한 사용하였다: 엡스타인-바 바이러스-형질전환된 B 림프모구성 세포 주(EBV-LCL), 정상적인 인간 유방 상피 세포(HMEC), 정상적인 인간 혈관 내피 세포(HUVEC), 정상적인 혈액 단핵구(PBMC), 정상적인 인간 대동맥 내피 세포(HAEC), 정상적인 인간 신장 내피 세포(HREC), 정상적인 인간 폐 미세혈관 내피 세포(HMVEC-L), 정상적인 인간 내부-신생아 피부 미세혈관 내피 세포(HMVEC-네오) 및 정상적인 인간 폐 동맥 내피 세포(HPAEC).
상기 조직 미세배열을 상술한 프로토콜을 사용하여 SG21.1C1 항체로 면역염색하였다. 염색은 하기 세포 주들에서 관찰되었다: 난소 암종 세포 주 SK-OV-3; 교모세포종 세포 주 GMS-10; 다발성 골수종 세포 주 LB, LP-1, AMO-1, I-310(MM.1R), C2E3(MM.1S), MOLP-8, JJN-3 및 L363; 호지킨 림프종 세포 주 KMH2, HS445, RPMI-1666, L248 및 HD-M-YZ; EBV-LCL WIL2-S, Farage 및 IM-9; NHL, 여포성 세포 주 WSU-NHL; 투명 세포형 RCC 세포 주 Caki-1, Caki-2, 786-O 및 769-P; 유두상 RCC 세포 주 CAL54, A498; RCC SK-RC-6 및 SK-RC-7; 흑색종 세포 주 A375M 및 A375SM, 췌장 암종 세포 주 PANC-1 및 방광 암종 T24. 확인되지 않은 일부 세포 주들의 염색은 흐릿하거나 혼합되었다. 일부 세포 주들은 세포질 염색을 갖는다. 췌장 및 난소 세포 주의 염색에 대해서 각각 도 2 및 3을 참조하시오.
D. 1C1 및 5D12 항체의 비교 염색
1C1 및 5D12 항체를 정상적인 키노몰구스 원숭이, 정상적인 인간 흉선, 신장 및 골격근 조직 및 췌장 종양 조직으로부터의 293F, 293F-cynoCF0 세포 주, RCC Caki-1, 정상적인 편도선, 골격근, 방광, 림프 조직(림프절, 흉선, 비장)을 염색하여 비교하였다. 상기 면역-염색 프로토콜은 상술한 바와 같았다.
상기 결과는 1C1 및 5D12가 293F 및 293-cyno CD70 세포 주(데이터 도시 안 됨); RCC Caki-1 및 키노몰구스 편도선 조직(데이터 도시 안 됨); 정상 키노몰구스 원숭이로부터의 림프 조직(림프절, 흉선, 비장) 및 췌장 종양 조직을 유사하게 염색함을 보였다(도 4 참조). 1C1 및 5D12의 일부 차별적인 염색이 정상적인 인간 및 원숭이 골격근 조직 및 정상적인 원숭이 방광 조직에서 관찰되었으며 여기에서 5D12는 상기 조직들을 염색하였지만 1C1은 아니었다. 차별적인 염색이 정상적인 인간 흉선 및 신장 조직에서 또한 관찰되었으며 여기에서 5D12는 세포질을 염색하였다.
실시예 5: 1 C1 항체를 갖는 정상적인 결장 및 결장직장 암 조직 및 정상적인 췌장 및 췌장암 조직에서 CD70 발현
상이한 암 유형들로부터의 종양 조직의 전체 패널을 평가하기 전에, CD70 발현을 먼저 결장 및 췌장암에서 분석하였다. 상기 면역염색 프로토콜은 실시예 4에 개시된 바와 같았다. 본 연구에 사용된 색원체는 패스트레드였다.
상기 결과는 정상적인 결장 조직에서, 단지 드문 림프구들만이 CD70에 대해 양성으로 염색됨을 보였다. 다른 세포들은 CD70에 대해 음성이었다. 결장암 조직의 한 샘플에서, 상기 종양 세포는 양성으로 염색되었다. 결장 조직의 두 번째 샘플에서, 상기 종양 세포는 음성이었지만 기질은 양성이었다. 마찬가지로, 정상적인 췌장 조직에서, 상기 염색은 CD70에 대해 음성이었다. 췌장암 조직의 한 샘플에서, 종양 세포는 양성이었고 두 번째 샘플에서, 종양 세포는 음성이었지만 기질은 양성이었다. (도 5 참조).
실시예 6: SG21 .1 C1 항체를 갖는 종양 조직에서 CD70 발현
종양 조직들을 하기의 종양 유형들로부터 수득하였다: 호지킨 림프종, 신장, 림프종, 다발성 골수종, 췌장, 후두/인두, 난소, 결장 및 유방. 정상 및 종양 조직을 실시예 3에 개시된 조직 배열 프로토콜에 따라 제조하였으며 면역-염색 프로토콜은 실시예 4A에 개시된 바와 같았다. 1C1 항체를 1 차 항체로서 사용하였다. 면역조직화학(IHC) 발현을 연루된 종양의 염색 강도 및 퍼센트를 근거로 나중에 평가하였다. 염색 강도를 1 내지 4로 등급화하였으며, 이때 1은 최소 염색을; 2는 순한 염색을; 3은 보통 염색을; 4는 강한 염색을 가리켰다. 연루된 종양의 퍼센트를 또한 1 내지 4로 등급화하였으며, 이때 1은 0 내지 5%; 2는 5 내지 25%; 3은 25 내지 75%; 및 4는 75 내지 100%를 가리켰다. 상기 측정은 정량적이었다. 호지킨 림프종의 경우, CD70-양성 세포의 IHC 발현을 리드-스턴버그(Reed-Sternberg) 세포 평가를 근거로 분석하였다. 리드-스턴버그 세포는 미지 기원의 큰 세포이며, 대개는 그 존재가 호지킨 림프종의 공통적인 조직학적 특징인 다핵 세포이다.
호지킨 림프종 종양 조직은 전체 종양 중 세포에 대한 CF70-양성 종양 세포의 최고 퍼센트(97% 또는 33/34)를 가졌다. 신장 종양은 전체 종양 중 세포에 대해 두 번째로 높은 퍼센트(70% 또는 14/20)의 CF70-양성 종양 세포를 가졌다. 림프종은 전체 종양 중 세포에 대해 세 번째로 높은 퍼센트(61% 또는 72/119)의 CF70-양성 종양 세포를 가졌다. 다발성 골수종은 전체 종양 중 세포에 대해 네 번째로 높은 퍼센트(42% 또는 13/31)의 CF70-양성 종양 세포를 가졌다. 췌장암은 전체 종양 중 세포에 대해 다섯 번째로 높은 퍼센트(25% 또는 35/140)의 CF70-양성 종양 세포를 가졌다.
도 6은 CD70에 대해 양성 신호를 제공하는 140 개 췌장 샘플 중 35 개에 대한 염색 강도 및 종양 염색%의 그래프를 예시한다. 상기 도면은 염색 강도와 종양 염색 퍼센트 간의 복잡한 관계를 나타낸다. 즉, 일부 종양은 높은 퍼센트이지만 낮은 강도의 세포 염색을 갖고, 다른 것들은 낮은 퍼센트이지만 높은 강도의 세포 염색을 가지며, 다른 것들은 중간 염색 강도 및 퍼센트의 세포 염색을 나타낸다. 후두/인두암은 전체 종양 중 세포에 대해 여섯 번째로 높은 퍼센트(22% 또는 18/82)의 CF70-양성 종양 세포를 가졌다. 난소암은 전체 종양 중 세포에 대해 일곱 번째로 높은 퍼센트(15% 또는 37/241)의 CF70-양성 종양 세포를 가졌다.
도 7은 난소암을 염색하는 241 개 CD70 중 37 개에 대한 염색 강도 및 종양 염색 퍼센트를 예시한다. 염색 강도와 세포 염색의 퍼센트 간에 어떤 관계가 존재하였다. 결장직장암은 전체 종양 중 세포에 대해 일곱 번째로 높은 퍼센트(9% 또는 17/194)의 CF70-양성 종양 세포를 가졌다. 유방암은 전체 종양 중 세포에 대해 가장 낮은 퍼센트(2% 또는 5/204)의 CF70-양성 종양 세포를 가졌다.
CD70-양성 종양/전체 종양, 염색 강도(세포 표적 발현), CD70-양성 종양 연루 퍼센트(종양 표적 발현)를 근거로 요약하기 위해서, 상기 종양 유형의 일반적인 지시 등급은 하기와 같다: 호지킨 > 신장 > 림프종 > 다발성 골수종 > 췌장 > 후두/인두 > 난소 > 결장직장 > 유방. 상기 모든 종양 조직들에 대한 결과를 표 1에 나타낸다.
다양한 암에서 CD70 발현
종양 유형 CD70+/전체 CD70+의 %
호지킨 33/34 97
신장 204/283 72
림프종 72/119 61
다발성 골수종 13/31 42
췌장 35/140 25
후두/인두 18/82 22
난소 37/241 15
피부 4/30 13
폐(전체) 40/475 8
폐 선암종 17/172 10
결장 17/194 9
유방 5/204 2
실시예 7: h1F6 -약물 접합체는 난소 암종 세포 주에서 효능을 나타낸다
상기 새로운 암에 대한 전형적인 세포 주들에 대한 공지된 항-CD70 항체 약물 접합체의 효능을 확인하기 위해서, SKOV-3 세포를 다른 세포 주들에 대해 앞서 일반적으로 개시한 바와 같이 준비하고 시험하였다. (국제 특허 공보 WO 2006-113909 참조). 상기 세포들을 하기의 항-CD70 항체 약물 접합체와 배양하였다: h1F6-vc-MMAF(4), h1F6vc-MMAE(4), 1F6mc-MMAE(4), 또는 h1F6mc-MMAF(8) 또는 유리 MMAF. (약물 링커의 설명에 대해 명세서 및 미국 특허 출원 공보 제 2005-0238649 호 및 2006-0233794 호를 참조하시오. 각 접합체 뒤의 괄호 안의 숫자는 항체당 평균 약물 부하를 가리킨다). 상기 SKOV-3 세포를 96 시간 동안 지시된 농도로 접합체와 함께 배양하였다. 상기 연구를 위해서, 프로메가 셀티터글리오(Promega CelltiterGlo)를 사용하여 생육성을 측정하였다.
h1F6vc-MMAF(4) h1F6vc-MMAE(4) h1F6mc-MMAF(4) h1F6mc-MMAF(8) MMAF
5 ng/ml 60 ng/ml 29 ng/ml 12 ng/ml 18 nM
도 8에 관하여, 4 개의 항-CD70 ADC는 모두 상기 난소암 세포 주에 대해 활성이었다. 도 2에 관하여, IC50을 나타낸다. 상기 IC50은 다른 CD70-발현 암세포 주들에 대해 보고된 바와 일치한다. 이러한 결과는 상기 암세포 주 상의 CD70에 결합된 항-CD70 ADC가 내면화되고 아우리스타틴 페이로드를 방출함을 입증한다.
실시예 8: h1F6 -약물 접합체는 CD70 형질감염된 췌장 암종 세포주에서 효능을 나타낸다
전형적인 세포 주들에 대한 공지된 항-CD70 항체 약물 접합체의 효능을 확인하기 위해서, 췌장 세포주 HPAFII, PANC-1 및 MiaPaCa-2를 핵산을 암호화하는 변경된 키노몰구스 CD70으로 형질감염시켰다. MiaPaCa-2 세포는 CD70 단백질을 검출 가능한 수준으로 발현하지 못한다. h1F6은 상기 형질감염된 세포주에 의해 발현된 천연 CD70 단백질에 결합한다. 상기 형질감염된 세포주에 의한 CD70의 발현을 FACS 분석에 의해 확인하였다(데이터 도시 안 됨). h1F6 mc-MMAF(4)(SGN-75)의 활성을 다른 세포주들에 대해 앞서 일반적으로 개시한 형질감염된 췌장 세포주 상에서 시험하였다. (실시예 7 국제 특허 공보 WO 2006-113909 참조). (접합체 뒤 괄호 안의 숫자는 항체당 평균 약물 부하를 가리킨다.) 도 9A 내지 C에 관하여, 상기 세포를 96 시간 동안 지시된 농도로 상기 접합체와 함께 배양하였다. 도 9A에 관하여, 상기 형질감염된 HPAFII 세포에 대한 상기 접합체의 활성을 나타낸다. 세포 생육성을 프로메가 셀티터글리오를 사용하여 측정하였다. 도 9B 및 9C에 관하여, 형질감염된 PANC-1 및 MiaPACa-2 형질감염된 세포 주들에 대한 상기 접합체의 활성을 나타낸다. 상기 연구를 위해서, 세포 생육성을 앞서 개시한 바와 같이 레자수린을 사용하여 측정하였다. 프로메가 셀티터글리오의 PANC-1 활성. 상기 접합체는 시험관 내에서 모든 상기 세포주들에 대해 세포독성 활성을 보였다.
실시예 9: h1F6 -약물 접합체는 췌장암의 이종이식편 모델에서 효능을 나타낸다
누드(nu/nu) 암컷 마우스(7 동물/그룹)에게 우측 옆구리에 투관침을 통해 CD70-형질감염된 MiaPaCa 종양 덩어리(실시예 8에 개시된 바와 같이 제조됨)를 이식하였다. SGN-75 또는 비결합 대조용 ADC(3 ㎎/㎏)에 의한 투여를 종양이 100 ㎣(q4d x 4 ip)에 도달할 때 출발하였다. 종양 부피를 모니터하고 종양 부피가 1000 ㎣에 도달하면 동물들을 안락사시켰다. 도 10에 관하여, 데이터를 2 가지 방식으로 플롯팅하였다. 중간 종양 부피 플롯을 하나 이상의 동물이 안락사할 때까지 각 그룹에 대해 계속하였다. 카플란-마이어 곡선은 각 그룹의 개개의 동물에 대해 종양이 800 ㎣에 도달하는 시간을 나타낸다. SGN-75에 의한 처리는 상기 이종이식편 모델에서 유효하였다.
본 발명은 본 발명에 개시된 특정 실시태양에 의해 범위가 제한되지 않는다. 본 발명에 개시된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변경들은 상기 설명 및 첨부된 도면으로부터 당해 분야의 숙련가들에게 자명해질 것이다. 상기와 같은 변경을 첨부된 청구의 범위 내에 포함시키고자 한다. 상기 내용으로부터 달리 자명하지 않는 한 본 발명의 임의의 단계, 요소, 실시태양, 특징 또는 태양을 임의의 다른 것들과 함께 사용할 수 있다. 본 원에서 언급한 모든 특허 출원, 및 과학 발행물, 수탁 번호 등은 개별적으로 나타내는 바와 동일한 정도로 모든 목적을 위해 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> Seattle Genetics, Inc. Ryan, Maureen <120> Detection and Treatment of Pancreatic, Ovarian and Other CD70 Positive Cancers <130> 0070-00602PC <150> 61/044,457 <151> 2008-04-11 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 137 <212> PRT <213> Mus_musculus <400> 1 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ala Gly Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ala Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 2 <211> 132 <212> PRT <213> Mus_musculus <400> 2 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser 35 40 45 Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln His Ser Arg Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg 130 <210> 3 <211> 137 <212> PRT <213> Mus_musculus <400> 3 Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Asp 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Met Thr 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Thr Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ser Thr Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Gly Pro Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asp Arg Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gly Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 4 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr 20 25 30 Val Ser Leu Gly Gln Lys Thr Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser 35 40 45 Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asp Leu Pro Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln His Ser Arg Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Thr Arg 130

Claims (47)

  1. 포르말린으로 고정되고 파라핀에 매몰된 세포 또는 조직의 샘플 상의 변성된 인간 CD70에 특이적으로 결합하고,
    (a) ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-8733 번으로 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 SG-21.1C1.B3 또는 ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-8734 번으로 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 SG-21.5D12.C3의 중 쇄 가변 영역과 서열 일치성을 갖는 중 쇄 가변 영역; 및
    (b) ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-8733 번으로 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 SG-21.1C1.B3 또는 ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-8734 번으로 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 SG-21.5D12.C3의 경 쇄 가변 영역과 서열 일치성을 갖는 경 쇄 가변 영역을 포함하는 단클론 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    변성된 CD70에 대한 특이적인 결합에 대해 ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-8733 번으로 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 SG-21.1C1.B3 또는 ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-8734 번으로 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 SG-21.5D12.C3와 경쟁하는 항체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-8733 번으로 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 SG-21.1C1.B3 또는 ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-8734 번으로 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 SG-21.5D12.C3와 동일하거나 또는 이보다 양호한 특이적인 결합으로 포르말린-고정되고 파라핀 매몰된 세포 또는 조직상의 변성된 CD70에 결합하는 항체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-8733 번으로 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 SG-21.1C1.B3 또는 ATCC에 기탁되고 수탁 번호 PTA-8734 번으로 지정된 하이브리도마에 의해 생산된 항체 SG-21.5D12.C3인 항체.
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  9. 환자의 췌장, 난소, 폐, 후두, 인두, 유방 또는 피부의 암, 교모세포종, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 신 세포 암종, 결장직장 또는 방광 암종의 진단, 예측, 치료 프로토콜 결정에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하여 CD70 발현 여부를 측정하는 방법:
    a) 상기 환자의 췌장, 난소, 폐, 후두, 인두, 유방, 신장, 뇌, 결장, 혈액 또는 피부의 조직 샘플을 고정시키고, 상기 조직 샘플 중의 CD70을 변성시키는 단계;
    b) 상기 고정된 조직 샘플을 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 단계; 및
    c) 상기 고정된 조직 샘플에 대한 상기 항체의 결합을 검출하여 CD70이 상기 샘플 중에서 발현되는지의 여부를 측정하는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 a) 단계에서 상기 조직 샘플은 포르말린 고정되고 파라핀 매몰된 것인 CD70 발현 여부를 측정하는 방법:
  11. 암을 갖는 환자의 치료 용도를 위한 CD70 항체 또는 CD70 항체 약물 접합체를 포함하는 조성물로서, 상기 환자는 제9항의 방법으로 측정하여 검출 가능한 수준의 CD70을 갖는 것인 조성물.
  12. 삭제
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 항체 약물 접합체가
    항-튜불린제, DNA 마이너 그루브 결합제, 및 DNA 마이너 그루브 알킬화제로부터 선택되는 세포독성제; 또는
    아우리스타틴, 에네다인, 렉시트롭신, 듀오카마이신, 탁산, 퓨로마이신, 돌라스타틴, 마이탄시노이드, 및 빈카 알칼로이드로부터 선택된 세포독성제를 포함하는 것인 조성물.
  14. 제 11 항에 있어서,
    상기 항체는 링커를 통해 세포독성제에 접합시키는 것인 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 링커는 세포 내 조건 하에서 절단 가능하며;
    상기 절단 가능한 링커는 세포 내 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩타이드를 포함하고,
    상기 펩타이드는 다이펩타이드이고,
    상기 다이펩타이드가 val-cit 링커 또는 phe-lys 링커인 조성물.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 링커는 세포 내 조건 하에서 절단 가능하며;
    상기 절단 가능한 링커는 5.5 미만의 pH에서 가수분해 가능하고,
    상기 가수분해 가능한 링커는 하이드라존 링커인 조성물.
  17. 제 14 항에 있어서,
    상기 링커는 세포 내 조건 하에서 절단 가능하며;
    상기 절단 가능한 링커는 다이설파이드인 조성물.
  18. 제 11 항에 따른 조성물로서,
    상기 환자는 췌장암을 갖고, 췌장암이 선암종인 조성물.
  19. 제 11 항에 따른 조성물로서,
    상기 환자는 난소암을 갖고, 난소암이 상피세포의 것인 조성물.
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