CN102056626A - 胰腺癌、卵巢癌和其它癌症的检测和治疗 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了使用特异性结合变性的CD70的抗体诊断、预后、预防和治疗卵巢癌、胰腺癌和其它癌症的方法。

Description

胰腺癌、卵巢癌和其它癌症的检测和治疗
继续性
本申请要求2008年4月11日提交的美国临时申请号61/044,457的权益，该申请的公开通过引用整体并入本文。
背景
CD70是肿瘤坏死因子(TNF)家族的成员，肿瘤坏死因子是结合细胞膜并且分泌的分子，其由多种正常和恶性细胞类型表达。CD70是跨膜II型蛋白，其羧基末端暴露给细胞之外，其氨基末端被发现于质膜的胞质溶胶侧(Bowman et al.，1994，J.Immunol.152：1756-61；Goodwin et al.，1993，Cell 73：447-56)。人CD70含有20个氨基酸的细胞质结构域、18个氨基酸的跨膜结构域和155个氨基酸的细胞外结构域，具有两个潜在的N-连接的糖基化位点(上文的Bowman et al.；上文的Goodwin et al.)。通过抗CD70抗体对经放射性标记的表达CD70的细胞进行的特异性免疫沉淀产生了29kDa和50kDa的多肽(上文的Goodwin et al.；Hintzen et al，1994，J.Immunol.152：1762-73)。基于其与TNF-α和TNF-β的同源性，预测CD70为三聚体结构(Petsch et al，1995，Mol.Immunol.32：761-72)。
CD70在人的正常组织上仅具有有限的表达。这使得CD70成为有吸引力的癌症治疗靶标。但是，仅在少数癌症(例如肾细胞癌、结肠癌、某些类型的非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤)上鉴定到了CD70表达。典型地，使用与天然CD70结合的抗体，例如通过免疫组织化学来检测癌细胞上的CD70表达。由于缺乏针对CD70的足够特异性的品质不良的抗体，在被固定的患者样品上检测CD70表达已被证实为是有问题的。具体地，交叉反应性和背景染色干扰了在被固定的样品中CD70的检测。本发明解决了该问题和其它需求。
发明内容
本发明提供了使用针对CD70的抗体对卵巢癌、胰腺癌和其它癌症进行诊断、预后、预防和治疗以及监测治疗的方法。本发明还提供了对肺癌、头颈癌(喉或咽)、黑素瘤、成胶质细胞瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(例如滤泡性淋巴瘤)、肾细胞癌(包括透明细胞和乳突肾细胞癌)、结直肠癌和膀胱癌进行诊断、预后、预防和治疗以及监测治疗的方法。
在一个方面，本发明提供了相对与天然CD70的结合而言与变性的CD70特异性结合的抗体。在一些实施方式中，相对与天然CD70的结合而言，抗体与被固定的、卵巢SK-OV-3或胰腺PANC-1癌细胞系上的变性的CD70特异性结合。抗体可以是单克隆抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。优选地，抗体特异结合经***固定的石蜡包埋的细胞或组织上的变性的CD70，所述结合具有与抗体SG-21.1C1(以分配的保藏号PTA-8733保藏于ATCC的杂交瘤产生的)或抗体SG-21.5D12(以分配的保藏号PTA-8734保藏于ATCC的杂交瘤产生的)相同或更好的特异性。具体地，抗体的非特异***叉反应性小于抗体SG-21.1C1或抗体SG-21.5D12的非特异***叉反应性。在一些实施方式中，该抗体可与抗体SG-21.1C1或与抗体SG-21.5D12竞争特异结合变性的CD70。
在另一方面，本发明提供了诊断试剂盒，所述试剂盒包含相对于与天然CD70的结合而言与变性的CD70特异性结合的抗体。在一个相关方面，本发明提供了检测患者组织样品中CD70表达的方法。该组织样品可以来自患者的胰腺、卵巢、肺、喉、咽、乳腺、肾、脑、结肠、血或皮肤。该组织被固定，并且CD70蛋白被变性。将被固定的组织样品与相对于天然CD70而言与变性的CD70特异性结合的抗体相接触，检测抗体与被固定的组织样品的结合，以确定样品中是否有CD70表达。被固定的组织样品上CD70的表达表示患者可能患有表达CD70的癌症。在一些实施方式中，用***固定样品，并将其包埋于石蜡中。
在另一方面，本发明提供了对具有胰腺、卵巢、肺、喉、咽、乳腺或皮肤的癌症的患者进行诊断、预后、确定治疗方案或监测治疗的方法。所述方法包括：测定来自患者的胰腺、卵巢、肺、喉、咽、乳腺或皮肤的样品细胞中CD70的表达，其中，可检测到的CD70表达的存在用于患者的诊断、预后、确定治疗方案或监测治疗中。样品可以是经***固定的石蜡包埋的样品。所述方法还可包括：如果测定步骤表明可检测到的CD70水平，那么向患者施用CD70抗体或CD70抗体药物缀合物的有效剂量方案(regimen)。
在另一方面，本发明提供了治疗CD70阳性癌症的方法。所述方法包括向患有具有CD70的可检测表达的胰腺、卵巢、肺、喉、咽、乳腺或皮肤的癌症的患者施用CD70的结合试剂的有效剂量方案，其中，所述结合试剂是抗体、抗体衍生物或抗体药物缀合物。抗体可具有效应功能。患者可以之前经历过通过手术、放疗和/或用与CD70无关的试剂进行的化疗所进行的治疗，但所述治疗没有诱导癌症减轻。在一些实施方式中，抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，例如单克隆抗体1F6或2F2的嵌合或人源化形式。抗体药物缀合物可包括细胞毒性剂，例如抗微管蛋白剂、DNA小沟结合剂或DNA小沟烷基化剂。抗体药物缀合物中的抗体可经由接头(例如，在细胞内条件下可被切割的接头)与细胞毒性剂或细胞抑制剂缀合。
在另一方面，提供了组合诊断性和药物试剂盒，其包含与变性的CD70特异性结合的用于诊断的抗体，以及与天然CD70的细胞外结构域特异性结合的用于治疗的抗体。
将参照下文中对示例性实施方式的详细描述，结合附图、图和表，最好地理解本发明的多个方面。
附图简述
图1显示了蛋白质提取物的蛋白质印迹，其中使用抗体SG-21.1C1和SG-21.5D12检测来自786-O、293F：CD70经转染细胞和293F未经转染细胞的蛋白提取物中的变性CD70。
图2显示了经***固定的石蜡包埋的(FFPE)胰腺细胞系PANC-1上CD70蛋白的表达，其中使用SG21.1C1抗体。
图3显示了在卵巢细胞系Ovcar-3、SK-OV-3、Ca-Ov-3和TOV-21G中CD70蛋白的表达，其中使用SG21.1C1抗体。
图4显示了胰腺肿瘤样品中的CD70蛋白表达，这是通过抗体SG-21.1C1或SG-21.5D12相对于对照mlgG检测的。
图5显示了正常胰腺细胞和胰腺肿瘤细胞上的CD70蛋白表达，这是使用色素原Fast Red(较深色)通过SG-21.1C1抗体检测的。
图6显示了对胰腺癌细胞中CD70蛋白表达的评估。x轴表示CD70染色强度，y轴表示CD70阳性的面积百分比。
图7显示了对卵巢肿瘤中CD70蛋白表达的评估。x轴表示CD70染色强度，y轴表示CD70阳性的面积百分比。
图8显示了对多种人源化1F6抗体药物缀合物针对卵巢癌细胞系SKOV-3的体外细胞毒性活性的评估。
图9A-C显示了对人源化1F6抗体药物缀合物在下述细胞系上的体外细胞毒性活性的评估：(A)经CD70转染的胰腺细胞系HPAFII；(B)经CD70转染的PANC-1胰腺细胞系；和(C)经CD70转染的MiaPaCa-2细胞系。
图10显示了对人源化1F6抗体药物缀合物在裸鼠中经Cd70转染的MiaPaCa胰腺癌肿瘤上的体内效力的评估。
定义
除非另有指明，本文中使用的下述术语和短语旨在具有下述含义。
术语“抗体”指(a)免疫球蛋白多肽和免疫球蛋白多肽的免疫活性部分，即，免疫球蛋白家族的多肽或其含有与特异性抗原(例如CD70)免疫特异性结合的抗原结合位点的片段，或(b)此类免疫球蛋白多肽或片段的保守取代衍生物，其与抗原(例如CD70)免疫特异性结合。抗体被一般性描述于例如Harlow & Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press，1988)中。除非上下文另有明显指示，提到抗体还包括抗体衍生物或药物缀合物，将在下文中对其进行更详细地描述。
“抗体衍生物”表示经异源分子共价连接(例如通过异源多肽的连接)来修饰或通过正常情况下不与抗体相关的糖基化、去糖基化、乙酰化或磷酸化等来修饰的如上文定义的抗体。
术语“单克隆抗体”指源于单个细胞克隆(包括任何真核或原核细胞克隆或噬菌体克隆)并且并非其生产方法的抗体。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。
“抗原”是与抗体特异性结合的实体。
术语“抑制”或“对......的抑制”表示降低了可测量的量，或者完全阻止。
术语“试剂”表示元素、化合物或分子实体，包括例如药物性、治疗性或药理性化合物。试剂可以是天然的或合成的或其组合。“治疗剂”是单独或与另外的试剂(例如，前药转化酶组合前药)组合对癌细胞发挥治疗性(例如有益的)效果的试剂。典型地，可用于本文所述的方法和组合物的治疗剂是施加细胞毒性或细胞抑制性效果的那些。
在提到试剂对细胞的效果时，“细胞毒性效果”表示杀死细胞。
“细胞抑制性效果”表示对细胞增殖的抑制。
“细胞毒性剂”指对细胞具有细胞毒性或细胞抑制性效果由此分别减少(depleting)或抑制细胞群体中细胞生长的试剂。
在CD70抗体对表达CD70的细胞的作用的上下文中，术语“减少”表示表达CD70的细胞的数目减少或消失。
在将用于根据本文所述的方法中的抗CD70抗体或其衍生物的上下文中，术语“功能性”表示：抗体或其衍生物(1)能与CD70结合，和/或(2)单独或与细胞毒性剂缀合时，减少或抑制表达CD70的细胞的增殖。
术语“预防”指在表达CD70的癌症的临床或诊断症状发作之前向受试者施用抗CD70抗体-药物缀合物(ADC)或ADC衍生物(例如向具有患胰腺癌或卵巢癌的高风险倾向的个体施用)，以(a)阻断表达CD70的癌症或其一种或多种临床或诊断症状的出现或发作，(b)抑制表达CD70的癌症的发作严重性，或者(c)减少表达CD70的癌症的发作的可能性。
术语“治疗”表示：通过在表达CD70的癌症的临床或诊断症状发作之后在任何临床阶段向受试者施用抗CD70抗体、抗体药物缀合物或ADC衍生物来减慢、停止或逆转患者中表达CD70的癌症的进程，如通过疾病的临床或诊断症状的减少或消失来证实。治疗可包括例如减少症状的严重性、症状的量或复发频率。
术语“可药用”表示联邦或州政府管理机构许可的或美国药典或其它公认药典中列出的用于动物的(更特别地，用于人类的)。术语“药物相容”成分表示与CD70抗体一起施用的可药用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。
在施用药物试剂的上下文中，术语“有效量”表示足以在患者中抑制表达CD70的胰腺癌或卵巢癌的一种或多种临床或诊断症状的出现或减轻所述症状的试剂的量。根据本文所述的方法，在“有效剂量方案”中施用试剂的有效量。术语“有效剂量方案”是足以实现对表达CD70的癌症的治疗的试剂的量和给药频率的组合。
术语“患者”包括接受诊断、预防或治疗性治疗的人和其它哺乳动物受试者。
缩写“AFP”指二甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleuine-dolaproine-苯丙氨酸-对苯二胺。
缩写“MMAE”是单甲基auristatin E。
缩写“AEB”表示通过用auristatin E与对乙酰苯甲酸反应产生的酯。
缩写“AEVB”表示通过用auristatin E与苯甲酰戊酸反应产生的酯。
缩写“MMAF”表示dovaline-缬氨酸-dolaisoleunine-dolaproine-苯丙氨酸。
缩写“fk”和“phe-lys”表示二肽苯丙氨酸-赖氨酸。
缩写“vc”和“val-cit”表示二肽缬氨酸-瓜氨酸。
治疗剂典型地可基本不含不想要的污染物。这意味着试剂典型地至少为大约50％w/w(重量/重量)纯度，以及基本上不含干扰性蛋白质和污染物。有时试剂至少为大约80％w/w纯，更优选至少90或大约95％w/w纯度。但是，使用常规的蛋白纯化技术，也可获得至少99％纯度w/w的同质肽。
发明详述
I.一般性
本发明提供了使用针对CD70的抗体对卵巢癌和胰腺癌进行诊断、预后、预防和治疗以及监测治疗的方法。本发明还提供了对肺癌、头颈癌(喉或咽)、黑素瘤、成胶质细胞瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(例如滤泡性淋巴瘤)、肾细胞癌(包括透明细胞和乳突肾细胞癌)、结直肠癌和膀胱癌进行诊断、预后、预防和治疗以及监测治疗的方法。所述方法部分取决于实施例中示出的结果，其显示CD70在某些癌症中以升高的水平表达。使用特异性结合变性的CD70的抗体，在来自卵巢和胰腺癌组织的经***固定的石蜡包埋的(FFPE)样品中检测到升高的表达。此外，还使用针对变性的CD70细胞外结构域的抗体，在来自其它癌症组织的经***固定的石蜡包埋的(FFPE)样品中检测到升高的CD70表达。
虽然本发明的实施不依赖于对机制的理解，但我们相信，在特别是卵巢和胰腺组织以及一般而言其它癌症中的FFPE样品中成功检测到CD70是因为使用了相对于天然CD70而言优先结合这些样品中变性的CD70的抗体。虽然在胰腺和卵巢癌中可检测到的CD70的频率和/或其水平没有CD70此前已关联的一些其它癌性组织中那么高，但相对于正常组织而言，它们对癌性组织仍然是非常特异的。因此，在具有其中可检测到CD70的卵巢癌或胰腺癌的患者中，CD70可作为特别有用的靶标，用于将毒性选择性导向癌细胞。类似地，在具有其它癌症(例如，肺癌、头颈癌(喉或咽)、黑素瘤、成胶质细胞瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(例如滤泡性淋巴瘤)、肾细胞癌(包括透明细胞和乳突肾细胞癌)、结直肠癌和膀胱癌)的患者中，本发明提供了在来自此类患者的经固定样品中检测CD70表达的易行方法。
II.针对CD70的抗体
下述说明首先考虑可应用于检测卵巢和胰腺癌中的CD70以及对其加以治疗的针对CD70的抗体的性质，然后关注与用于各应用的抗体的优选性质。
A.针对CD70的抗体的一般性描述
抗Cd70抗体包括单克隆、嵌合(具有人恒定区和小鼠可变区)、人源化、贴面(veneered)或人抗体；单链抗体等等。免疫球蛋白分子可以是任何类型或类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)的或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)的。
抗CD70抗体可以是结合抗原的抗体片段，例如Fab，F(ab′)，F(ab′)2，Fd链，单链Fv(scFv)，单链抗体，二硫键连接的Fv(sdFv)，包含VL或VH结构域的片段，包括纳米抗体或来自骆驼、美洲驼(llama)等的片段，或Fab表达文库产生的片段，或上文所述的任何抗体的CD70结合片段。结合抗原的抗体片段(包括单链抗体)可包含单独的可变区或与下述全部或部分组合的可变区：铰链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域。此外，结合抗原的片段还可包含可变区与铰链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域的任何组合。典型地，抗体是人、啮齿类(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、驼类(camelid)、马或鸡的抗体。
抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或更多特异性的。多特异性抗体可以是对CD70不同的表位特异的，或者可以对CD70以及异源蛋白两者均特异(见例如WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO92/05793；Tutt et al.，1991，J.Immunol.147：60-69；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920和5,601,819；Kostelny et al.，1992，J.Immunol.148：1547-1553.)。可用于实施本文所述的方法的多特异性抗体(包括双特异性和三特异性抗体)是与CD70以及第二细胞表面受体或受体复合物(例如，免疫球蛋白基因超家族成员、TNF受体超家族成员、整联蛋白、细胞因子受体、趋化因子受体、主要组织相容性蛋白、凝集素(C型、S型或I型)或补体控制蛋白)二者均免疫特异性结合的抗体。
还可按照它们与CD70的结合亲和力(10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M)来描述抗CD70抗体。
抗CD70抗体可以是嵌合抗体。嵌合抗体是这样的分子，其中抗体的不同部分源于不同的动物物种，例如，具有源于鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的(见例如，Morrison，Science，1985，229：1202；Oi et al.，1986，BioTechniques4：214；Gillies et al.，1989，J.Immunol.Methods 125：191-202；美国专利号5,807,715；4,816,567和4,816,397)。
抗CD70抗体还可以是人源化抗体，包括贴面抗体。人源化抗体是这样的抗体分子，其结合想要的抗原，并且具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDRs)和来自人免疫球蛋白分子的构架和恒定区。通常，人构架区中的构架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变，或优选以改善抗原结合。通过本领域公知的方法来鉴定这些构架取代，例如，通过构建CDR和构架残基的相互作用模型来鉴定对于抗原结合来说重要的构架残基，以及通过序列比较以鉴定出具***置上的不寻常的构架残基(见例如Queen et al.，美国专利号5,585,089；Riecbmann et al.，1988，Nature 332：323)。可使用本领域已知的多种技术来对抗体进行人源化，例如CDR移植(EP 0 239 400；WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101和5,585,089)、贴面或重塑表面(EP 0 592 106；EP 0 519 596；Padlan，Molecular Immunology，1991，28(4/5)：489-498；Studnicka et al.，1994，Protein Engineering 7(6)：805-814；Roguska et al.，1994，PNAS91：969-973)和链改组(美国专利号5,565,332)(所有这些参考文献都通过引用并入本文)。
抗CD70抗体还可以是人抗体。可通过本领域已知的多种方法来制造人抗体，例如噬菌体展示方法(见上文)，其中使用源于人免疫球蛋白序列的抗体文库。还见例如，美国专利号4,444,887和4,716,111；WO 98/46645,WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735和WO 91/10741。此外，可使用被称为“引导选择”的技术，来产生识别选择的表位的人抗体，其中，使用选择的非人单克隆抗体，例如，小鼠抗体，来引导识别相同表位的完全人抗体的选择(见例如Jespers et al.，1994，Biotechnology 12：899-903)。还可使用表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。可使用杂交瘤技术，从经免疫的转基因小鼠获得针对抗原的单克隆抗体。关于产生人抗体的技术的综述，见Lonberg and Huszar，1995，Int.Rev.Immunol.13：65-93。关于产生人抗体和人单克隆抗体的该技术以及用于产生此类抗体的方案的详细讨论，见例如PCT公开WO98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；欧洲专利号0 598,877和美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771和5,939,598。
可通过已知方法测定抗体与CD70的特异性结合，所述方法例如，竞争性和非竞争性免疫测定***，使用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹层”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射分析测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定(见例如Ausubel et al.，eds.，Short Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，Inc.，NewYork，4th ed.1999)；Harlow & Lane，Using Antibodies：A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1999.))。
此外，可通过竞争性结合测定法来测定抗体与CD70的结合亲和性以及抗体CD70相互作用的解离速率(off-rate)。竞争性结合测定的一个例子是放射免疫测定，包括：在存在增加量的未经标记的CD70的情况下，将经标记的CD70(例如3H或125I)与目的抗体一起孵育，并且检测与经标记的CD70结合的抗体。然后可通过Scatchard作图分析，从数据来确定抗体对CD70的亲和性和结合解离速率。还可使用放射免疫测定来测定与第二抗体的竞争。在这种情况下，在存在增加量的未经标记的第二抗体的情况下，将CD70与缀合到经标记的化合物(例如3H或125I)上的目的抗体一起孵育。或者，可通过表面等离振子共振来测定抗体与CD70的结合亲和性以及抗体-CD70相互作用的结合和解离速率。
可根据抗体类型，通过标准方法，从CD70蛋白的含有抗原的片段来制备抗体(见例如，Kohler，et al，Nature，256：495，(1975)；Harlow & Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(C.S.H.P.，NY，1988)；Queen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 86：10029-10033(1989)和WO 90/07861；Dower et al.，WO 91/17271和McCafferty et al.，WO 92/01047(每份文献都为了所有目的通过引用并入本文))。例如，可使用多种技术来制备单克隆抗体，例如，使用杂交瘤、重组以及噬菌体展示技术或者它们的组合。杂交瘤技术在例如上文的Harlow et al.和Hammerling，et al.，In MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas，pp.563-681(Elsevier，N.Y.，1981)中有一般性讨论。可用于制造抗CD70抗体的噬菌体展示方法包括，例如Briinnan et al.，1995，J.Immunol.Methods 182：41-50；Ames et al.，1995，J.Immunol.Methods 184：177-186；Kettleborough et al.，1994，Eur.J.Immunol.24：952-958；Persic et al.，1997，Gene 187：9-18；Burton et al.，1994，Advances in Immunology 57：191-280；PCT申请号PCT/GB91/01 134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中公开的那些(这些文献的公开内容都通过引用并入本文)。
用于产生识别特定表位的抗体片段的技术也是本领域公知的。例如，可通过使用木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab′)2片段)，对免疫球蛋白分子进行蛋白水解切割，来产生Fab和F(ab′)2片段。F(ab′)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。还可使用例如WO 92/22324；Mullinax et al.，1992，BioTechniques 12(6)：864-869和Sawai et al.，1995，AJRI 34：26-34和Better et al.，1988，Science240：1041-1043(这些文献的公开内容都通过引用并入本文)中公开的方法，使用重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术。
可用于生产单链Fvs和抗体的技术的例子包括美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston et al.，1991，Methods in Enzymology 203：46-88；Shuet al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：7995-7999和Skerra et al.，1988，Science 240：1038-1040中描述的那些。
还可通过重组表达技术来生产可用于本发明方法中的抗CD70抗体及其衍生物。与CD70结合和/或减少或抑制表达CD70的细胞增殖的抗体或其衍生物的重组表达需要构建含有编码所述抗体或其衍生物的核酸的表达载体。一旦获得了编码此类蛋白的核酸，即可使用本领域公知的技术，通过重组DNA技术，来生产用于生产蛋白质分子的载体。可使用标准技术，例如Sambrook and Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，3rd ed.，2001)；Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2nd ed.，1989)；Ausubel et al.，Short Protocols in Molecular Biology(John Wiley &Sons，New York，4th ed.，1999)和Glick & Pasternak，MolecularBiotechnology：Principles and Applications of Recombinant DNA(ASMPress，Washington，D.C，2nd ed.，1998)中描述的那些技术，用于重组核酸方法、核酸合成、细胞培养、转基因掺入和重组蛋白质表达。
例如，为重组表达抗CD70抗体，表达载体可编码与启动子有效连接的其重链或轻链或重链或轻链可变区。表达载体可包括，例如，编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(见例如WO 86/05807；WO 89/01036和美国专利号5,122,464)，并且抗体的可变结构域可被克隆进此类载体，用于表达整条重链或轻链。通过已知技术将表达载体转入宿主细胞，然后培养经转染的细胞以产生抗CD70抗体。典型地，为表达双链抗体，编码重链和轻链的载体可在宿主细胞中共表达，以表达整个免疫球蛋白分子。
可利用多种原核和真核宿主表达载体***来表达抗CD70抗体或其衍生物。典型地，真核细胞(特别是对于整个重组的抗CD70抗体分子而言)被用于表达重组蛋白。例如，与载体(例如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件或中国仓鼠卵巢EF-lα启动子)结合的哺乳动物细胞，例如，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(例如DG44或CHO-S)，是生产抗CD70抗体及其衍生物的有效表达***(见例如Foecking et al.，1986，Gene45：101；Cockett et al.，1990，Bio/Technology 8：2；Allison，美国专利号5,888,809)。
其它宿主表达***包括：细菌细胞中的基于质粒的表达***(见例如Ruther et al.，1983，EMBO 1，2：1791；Inouye & Inouye，1985，Nucleic AcidsRes.13：3101-3109；Van Heeke & Schuster，1989，J.Biol.Chem.24：5503-5509)；昆虫表达***，例如，在草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞中使用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)表达载体；以及哺乳动物中的基于病毒的表达***，例如，基于腺病毒的***(见例如Logan & Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.SciUSA 81：355-359；Bittner et al.，1987，Methods in Enzymol.153：51-544)。
B.用于检测CD70的抗体
对用于检测方法中的针对CD70的抗体的选择取决于是否通过需要检测变性的CD70或天然CD70(细胞上表达的)的技术来检测CD70。在其中靶标CD70是变性的方法(例如蛋白质印迹或免疫组织化学检测)中，优选使用与变性形式的CD70(例如，人或猕猴CD70)结合的抗体。典型地，较之天然形式(即，自然界中存在的CD70，或者当在没有暴露于变性条件(例如，溶剂、去污剂或升高的温度(例如超过50℃))下分离的)而言，此类抗体优先结合变性的形式。可使用变性的CD70免疫原(例如人或猕猴CD70)或其来自细胞外部分的免疫原性片段，产生此类抗体。可通过用SDS(例如0.5％)处理免疫原以及任选地加热至80℃来实现变性。还可通过简单地从用于纯化免疫原的SDS凝胶洗脱免疫原来实现变性。或者，可使用来自CD70的细胞外结构域的合成肽作为免疫原，来生产优先结合变性CD70的抗体。一些此类肽太短，以至于无法保留天然肽的相应区段的构象。合成肽可以被变性，但是通常无须变性即可用作为免疫原。
针对相对天然CD70而言优先结合变性的CD70，来筛选通过这些或其它方法产生的抗体。可通过相同测定法或通过不同测定法来测定变性的和天然的CD70抗原。特别地，如果使用后一种方法，可使用已知结合天然CD70的对照抗体，例如下文所述的治疗性抗体(例如，人源化1F6或2F2；见美国专利申请公开号2006-0233794和2006-0083736以及国际专利公开WO 06/113909)来进行筛选。如果抗体较之对照抗体的比例显示出相对天然CD70来说与变性CD70结合的更高比例的话，该抗体优先与变性CD70结合。
用于在胰腺和卵巢癌中检测CD70的优选抗体是与用***固定并且包埋于石蜡中的(FFPE)胰腺癌或卵巢癌样品上的CD70特异性结合的那些抗体。较之未受处理的胰腺癌或卵巢癌细胞上的天然CD70抗原而言，这些抗体优先识别被FFPE处理暴露的CD70上的表位。此类抗体被称为FFPE特异性抗CD70抗体。此类抗体缺乏与天然CD70的可检测到的特异性结合。优选地，抗体的特异性结合与抗体SG-21.1C1或SG-21.5D12相同或更好。特别地，通过蛋白质印迹或对固定细胞的染色进行测定时，在特异性结合条件下，所述抗体较之抗体SG-21.1C1或SG-21.5D12而言优选具有相同或更低的可检测到的与其它细胞蛋白的交叉反应性。
用于在其它癌症(如下文实施例中所述)中检测CD70的优选抗体是与用***固定并且包埋于石蜡中的(FFPE)这些癌症样品中的CD70特异性结合的那些抗体。较之未受处理的胰腺癌或卵巢癌细胞上的天然CD70抗原而言，这些抗体优先识别被FFPE处理暴露的CD70上的表位。此类抗体缺乏与天然CD70的可检测到的特异性结合。优选地，抗体的特异性结合与抗体SG-21.1C1或SG-21.5D12相同或更好。特别地，通过蛋白质印迹或对固定细胞的染色进行测定时，在特异性结合条件下，所述抗体较之抗体SG-21.1C1或SG-21.5D12而言优选具有相同或更低的可检测到的与其它细胞蛋白的交叉反应性。
一些示例性FFPE特异性抗CD70抗体是mAbs SG-21.1C1(也被称为SG-21.1C1-B3)和SG-21.5D12.C3(也被称为SG-21.5D12.C3)。其它一些优选的抗体与SG-21.1C1.B3或SG-21.5D12.C3竞争与变性的CD70的特异性结合。其它一些优选的抗体包含：含有来自SG-21.1C1.B3的重链的三个CDRs的重链和含有来自SG-21.1C1.B3的轻链的三个CDRs的轻链。其它一些优选的抗体包含：含有来自SG-21.5D12.C3的重链的三个CDRs的重链和含有来自SG-21.5D12.C3的轻链的三个CDRs的轻链。其它一些优选的抗体包含：与SG-21.1C1.B3的成熟重链可变区具有至少90％序列同一性的成熟重链可变区和与SG-21.1C1.B3的成熟轻链可变区具有至少90％序列同一性的成熟轻链可变区。其它一些优选的抗体包含：与SG-21.5D12.C3的成熟重链可变区具有至少90％序列同一性的成熟重链可变区和与SG-21.5D12.C3的成熟轻链可变区具有至少90％序列同一性的成熟轻链可变区。
C.用于治疗性应用的针对CD70的抗体
用于治疗性应用的抗体与胰腺癌或卵巢癌细胞上天然CD70抗原的细胞外结构域特异性结合。用于治疗性应用的抗体还可与肺癌、头颈癌(喉或咽)、黑素瘤、成胶质细胞瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(例如滤泡性淋巴瘤)、肾细胞癌(包括透明细胞和乳突肾细胞癌)、结直肠癌和膀胱癌上的天然CD70抗原的细胞外结构域特异性结合。对于CD70与其配体CD27的结合而言，抗体可以是激动性的、非激动性的或拮抗性的。虽然本发明的实施并不依赖于对机制的理解，但我们相信，抗体可由于与CD70结合并且内化于细胞中，或者通过与CD70并且在细胞之外积累，而发挥细胞毒性或细胞抑制效果。在这两种事件的任一种中，可通过将抗体与细胞毒性或细胞抑制剂缀合来促进细胞毒性或细胞抑制效果。与CD70结合的抗体从细胞之外发挥的细胞毒性或细胞抑制性效果可被抗体恒定(效应)功能额外或替代性促进。抗体恒定结构域介导多种Ig效应功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)。任选地，可通过WO2006/113909中描述的多种方法，增大CD70结合试剂的效应功能。还可通过阻断CD70与其配体CD27的相互作用，来促进抗体发挥的细胞毒性或细胞抑制性效果。
优选的抗CD70抗体是mAb 1F6或2F2或其嵌合或人源化形式，如WO 2004/073656和公开的美国申请号2006-0233794中和WO2006/113909中所述。优选的重链成熟可变区具有SEQ ID NO：1的序列，优选的轻链成熟可变区具有SEQ ID NO：2的序列。
其它有用的抗体包含分别与SEQ ID NO：1和2具有至少90％以及优选至少95％或99％序列同一性的成熟重链和轻链可变区。WO2006/113909提供了关于需要哪些可变区构架残基用于结合的教导。其它有用的抗CD70抗体或其衍生物可竞争性抑制mAb 1F6或2F2与CD70的结合，如通过免疫测定法所测定的。竞争性抑制表示，当抗体以至少两倍以及优选五倍过量存在时，其将1F6或2F2与CD70的结合抑制至少50％，更典型地，至少60％，还更典型地，至少70％，最典型地，至少75％，或者，抗体将1F6或2F2与CD70的结合竞争性抑制至少80％，至少85％，至少90％或至少95％。
其它一些优选抗体包含：含有来自1F6的重链可变区的三个CDRs的重链和含有来自1F6的轻链可变区的三个CDRs的轻链。其它一些优选的抗体包含：与2F2的成熟重链可变区具有至少90％序列同一性的成熟重链可变区和与2F2的成熟轻链可变区具有至少90％序列同一性的成熟轻链可变区。其它一些优选的抗体包含：与1F6的成熟重链可变区具有至少90、95或99％序列同一性的成熟重链可变区和与1F6的成熟轻链可变区具有至少90、95或99％序列同一性的成熟轻链可变区。其它一些优选的抗体包含：与2F2的成熟重链可变区(SEQ ID NO：3)具有至少90、95或99％序列同一性的成熟重链可变区和与2F2的成熟轻链可变区(SEQ ID NO：4)具有至少90、95或99％序列同一性的成熟轻链可变区。
例如美国专利申请公开号2005-0191299和国际公开号WO 07/038637中描述了大量其它针对CD70的抗体。可按照下文所述，针对其单独或作为衍生物和/或缀合物的适合度，来筛选与CD70的细胞外结构域结合的其它抗体。筛选可使用经标记的抗体来评估向表达CD70的细胞中的内化。筛选还可评估细胞毒性。还可在胰腺癌或卵巢癌或其它癌症的动物模型上进行其它筛选。例如，可使用SKOV-3卵巢癌细胞系、AN3CA子宫内膜癌细胞系、TOV21G卵巢癌细胞。此外，可使用PANC1和MiaPaca2胰腺细胞系。
抗CD70抗体的衍生物还可用于实施本发明的方法。典型的修饰包括，例如，糖基化、去糖基化、乙酰化、peg化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护基团进行的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白的连接等等。可进行多种化学修饰中的任一种，例如，通过特异性化学切割、乙酰化、甲酰化或衣霉素存在下的代谢合成。此外，衍生物可含有一个或多个非典型氨基酸。
抗体衍生物可以是包含一个或多个单体的多聚体，例如二聚体，其中每个单体包括(i)抗CD70抗体的抗原结合区域或源于其的多肽区域(例如通过一个或多个氨基酸的保守取代)和(ii)多聚化(例如二聚化)多肽区域，使得抗体衍生物形成与CD70特异性结合的多聚体(例如同源二聚体)。典型地，抗CD70抗体的抗原结合区域或者源于其的多肽区域与异源蛋白重组或化学融合，其中所述异源蛋白包含二聚化或多聚化结构域。在为了治疗或预防表达CD70的癌症的目的将抗体衍生物施用给受试者之前，令衍生物经历允许形成同源二聚体或异源二聚体的条件。异源二聚体可包含相同的二聚化结构域但是包含不同的CD70抗原结合区域，包含相同的CD70抗原结合区域但是不同的二聚化结构域，或者包含不同的CD70抗原结合区域和二聚化结构域。
可通过将抗CD70抗体与第二抗体缀合来形成抗CD70抗体衍生物(“抗体异源缀合物”)(见例如美国专利号4,676,980)。可用于实施本发明的方法的异源缀合物包含：与CD70结合的抗体(例如具有单克隆抗体1F6或2F2的CDRs和/或重链的抗体)以及与表面受体或受体复合物(例如免疫球蛋白基因超家族成员、TNF受体超家族成员、整联蛋白、细胞因子受体、趋化因子受体、主要组织相容性蛋白、凝集素(C型、S型或I型)或补体控制蛋白)结合的抗体。
针对CD70的抗体及其衍生物可与细胞毒性或细胞抑制性部分缀合，形成抗体药物缀合物(ADC)。特别适合与抗体或抗体衍生物缀合的部分是化学治疗剂、前体药物转化酶、放射性同位素或化合物或者毒素。例如，抗CD70抗体或其衍生物可与细胞毒性剂，例如化学治疗剂或毒素(例如，细胞抑制性或杀细胞性试剂，例如，相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素)缀合。
抗CD70抗体或其衍生物可与前体药物转化酶缀合。可使用已知方法，将前体药物转化酶与抗体或其衍生物重组融合，或者以化学方法缀合。示例性的前体药物转化酶是羧肽酶G2、β-葡糖醛酸糖苷酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、β-内酰胺酶、β-葡糖苷酶、硝基还原酶和羧肽酶A。
用于将治疗剂与蛋白质(特别是与抗体)缀合的技术是公知的。(见例如，Arnon et al.，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Reisfeldet al.eds.，Alan R.Liss，Inc.，1985)中的″Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy，″；Hellstrom et al.，Controlled Drug Delivery(Robinson et al.eds.，Marcel Dekker，Inc.，2nded.1987)中的″Antibodies For Drug Delivery，″；Thorpe，MonoclonalAntibodies′84：Biological And Clinical Applications(Pinchera et al.eds.，1985)中的″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：AReview″；Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy(Baldwin et al.eds.，Academic Press，1985)中的″Analysis，Results，andFuture Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody InCancer Therapy，″和Thorpe et al.，1982，Immunol.Rev.62：119-58。还见例如PCT公开WO 89/12624.)。
治疗剂可以以降低其活性的方式缀合，除非从抗体切除(例如通过水解、通过抗体降解或通过切割试剂)。此类治疗剂通过可切割的接头(其对表达CD70的细胞的细胞内环境中的切割敏感，但是对细胞外环境基本上不敏感)与抗体或其衍生物连接，使得当它被表达CD70的癌细胞内化时缀合物被从抗体或其衍生物上切割下来(例如，在内体中，或者，例如通过pH敏感性或蛋白酶敏感性，在溶酶体环境中或者在胞膜窖环境中)。
典型地，ADC包含治疗剂和抗CD70抗体或其衍生物之间的接头区域。如上文所提到的，典型地，接头在细胞内条件下可被切割，从而，在细胞内环境中，接头的切割从抗体释放出治疗剂(例如，在溶酶体或内体或胞膜窖内)。接头可以是例如，被细胞内肽酶或蛋白酶(包括溶酶体或内体的蛋白酶)切割的肽基接头。典型地，肽基接头长度为至少两个氨基酸或至少三个氨基酸。切割试剂可包括组织蛋白酶B和D和纤溶酶(见例如Dubowchik and Walker，1999，Pharm.Therapeutics 83：67-123)。最典型的是可被表达CD70的细胞中存在的酶切割的肽基接头。例如，可使用可被硫醇依赖性蛋白酶——组织蛋白酶B(在癌性组织中高水平表达的)切割的肽基接头(例如，包含Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly肽的接头)。其它此类接头描述于例如美国专利号6,214,345中。在一些特定的实施方式中，可被细胞内蛋白酶切割的肽基接头包含Val-Cit接头或Phe-Lys二肽(见例如美国专利6,214,345，其描述了对具有Val-Cit接头的阿霉素的合成)。使用细胞内蛋白水解释放治疗剂的一个优点是所述试剂在缀合时通常被解毒，并且缀合物的血清稳定性通常很高。
可切割的接头可以是pH敏感的，即，对某些pH值下的水解敏感。典型地，pH敏感的接头是可在酸性条件下水解的。例如，可使用可在溶酶体中水解的酸不稳定接头(例如腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等等)(见例如美国专利号5,122,368；5,824,805；5,622,929；Dubowchik and Walker，1999，Pharm.Therapeutics 83：67-123；Neville et al.，1989，Biol.Chem.264：14653-14661.)。此类接头在中性pH条件下(例如血中)相对稳定，但是它们在低于pH 5.5或pH 5.0(溶酶体的近似pH)下不稳定。在某些实施方式中，可水解的接头是硫醚接头(例如通过酰基腙键与治疗剂连接的硫醚(见例如美国专利号5,622,929))。
其它接头可在还原条件下被切割(例如二硫化物接头)。二硫化物接头包括可使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)、SPDB和SMPT形成的那些(见例如Thorpe et al.，1987，Cancer Res.47：5924-5931；Wawrzynczak et al.，In Immunoconjugates：Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel ed.，Oxford U.Press，1987。还见美国专利号4,880,935.)。
接头还可以是丙二酸酯接头(Johnson et al.，1995，Anticancer Res.15：1387-93)、马来酰亚胺苯甲酰接头(Lau et al.，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1299-1304)或3’-N-酰胺类似物(Lau et al.，1995，Bioorg-Med-Chem.3(10)：1305-12)。
接头还可以是不可切割的接头，例如与药物单元直接连接的马来酰亚胺基-亚烷基接头或马来酰亚胺-芳基接头。活性药物接头通过抗体的降解而释放。
典型地，接头对细胞外环境基本上不敏感，这意味着：当ADC或ADC衍生物存在于细胞外环境(例如血浆)中时，ADC样品中接头的不超过大约20％，典型地不超过大约15％，更典型地不超过大约10％，进一步更典型地不超过大约5％，不超过大约3％或者不超过大约1％被切割。可例如通过将(a)ADC或ADC衍生物(“ADC样品”)和(b)等摩尔量的未经缀合的抗体或治疗剂(“对照样品”)二者与血浆一起独立孵育预定的时间(例如2、4、8、16或24小时)，然后将ADC样品中存在的未经缀合的抗体或治疗剂与对照样品中的相比(例如通过高效液相色谱来测量)，来确定接头是否对细胞外环境基本上不敏感。
接头还可促进细胞内化。当接头与治疗剂缀合时(即，在本文所述的ADC或ADC衍生物的接头-治疗剂部分的环境中)，其可促进细胞内化。或者，当接头与治疗剂或抗CD70抗体或其衍生物两者均缀合时(即，在本文所述的ADC或ADC衍生物的环境中)，其可促进细胞内化。
WO 2004-010957中描述了多种可用于本发明组合物的接头，其具有下述形式：
-Aa-Ww-Yy-    (II)
其中：
-A-是延伸单元；
a是0或1；
每个-W-独立地是氨基酸单元；
w独立地是0至12范围内的整数；
-Y-是间隔单元；以及
y是0、1或2。
代表性的接头被描述于式(Ia)和(Ib)(见下文)的方括号中，其中，A-、-W-、-Y-、-D、w和y如上文所定义，并且R1选自-C1-C10亚烷基-、-C3-C8碳环-、-O-(C1-C8烷基)-、-亚芳基-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环)-、-(C3-C8碳环)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环)-、-(C3-C8杂环)-C1-C10亚烷基-、-(CH2CH2O)r-和-(CH2CH2O)r-CH2-；并且，r是1-10范围内的整数。Ab是抗体。
Figure BPA00001275632300211
如果存在的话，氨基酸单元(-W-)将延伸单元(-A-)与间隔单元(-Y-)相连(如果间隔单元(-Y-)存在的话)，以及将延伸单元与细胞毒性或细胞抑制剂(药物单元；D)相连(如果间隔单元不存在的话)。
如果存在的话，-Ww-是二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元，w是从2至12的整数。
如果存在的话，间隔单元(-Y-)将氨基酸单元与药物单元连接起来。间隔单元有两种常见类型：自身去除型(self-immolative)和非自身去除型。非自身去除型间隔单元是这样的，其中，从抗CD70抗体-接头-药物缀合物或药物-接头化合物上酶促切割下氨基酸单元之后，间隔单元的部分或全部保持与药物单元结合。非自身去除型间隔单元的例子包括(甘氨酸-甘氨酸)间隔单元和甘氨酸间隔单元。当含有甘氨酸-甘氨酸间隔单元或甘氨酸间隔单元的抗CD70抗体-接头-药物缀合物经历与肿瘤细胞相关的蛋白酶、与癌细胞相关的蛋白酶或淋巴细胞相关的蛋白酶的酶促切割时，甘氨酸-甘氨酸-药物部分或者甘氨酸-药物部分被从Ab-Aa-Ww-上切割下来。为释放出药物，应当在靶细胞中发生独立的水解反应，以切割甘氨酸-药物单元键。
或者，含有自身去除型间隔单元的抗CD70抗体药物缀合物可无需单独的水解步骤即释放药物(D)。在这些实施方式中，-Y-是经由PAB基团的氮原子与-Ww-相连并且经由碳酸酯、氨基甲酸酯或者醚基团与-D直接相连的对氨基苄基醇(PAB)单元。自身去除型间隔基的其它例子包括与PAB基团电荷等同的芳香族化合物，例如，2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(见例如Hay et al.，1999，Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)以及邻或对-氨基苄基缩醛。可使用在酰胺键水解时经历易环化的间隔基，例如，经取代的和未经取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues et al.，1995，Chemistry Biology2：223)、经适当取代的双环[2.2.1]和双环[2.2.2]环***(Storm et al.，1972，J.Amer.Chem.Soc.94：5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry et al.，1990，J.Org.Chem.55：5867)。在甘氨酸的α-位置取代的含胺药物的消除(Kingsbury，et al.，1984，J.Med.Chem.27：1447)也是可应用到抗CD70抗体-接头-药物缀合物的自身去除型间隔基策略的例子。或者，间隔单元是支化的双(羟甲基)苯乙烯(BHMS)单元，其可用于掺入另外的药物。
细胞毒性剂的有用类别包括，例如蒽环类、抗微管蛋白试剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、化疗增敏剂等等。
细胞毒性剂的有用类别的例子包括auristatins、喜树碱类、多卡米星类、依托泊苷类、美登木素生物碱类和长春花生物碱类。
合适的细胞毒性剂包括，例如auristatins(例如auristatin E、AFP、MMAF、MMAE)、DNA小沟结合剂(例如烯二炔类和lexitropsins)、多卡米星类、紫杉烷类(例如紫杉醇和多西他赛)、长春花生物碱类，阿霉素，吗啉代-阿霉素和氰基吗啉代-阿霉素。
细胞毒性剂可以是化疗剂，例如，阿霉素、紫杉醇、苯丙氨酸氮芥、长春花生物碱类、甲氨蝶呤、丝裂霉素C或依托泊苷。此外，有效的试剂，例如，CC-1065类似物、加利车霉素(calicheamicin)、美登素、多拉司他汀10的类似物、根瘤菌素和岩沙海葵毒素(palytoxin)可与抗CD70抗体或其衍生物相连。
在示例性的实施方式中，细胞毒性或细胞抑制剂可以是auristatin E或其衍生物。典型地，auristatin E衍生物是例如auristatin E和酮酸之间形成的酯。例如，auristatin E与对乙酰苯甲酸或苯甲酰戊酸反应，分别产生AEB和AEVB。其它典型的auristatins包括AFP、MMAF和MMAE。auristatin E及其衍生物的合成和结构被描述于例如美国专利申请公开号2005-0238649和2006-0074008中。
细胞毒性剂可以是DNA小沟结合试剂。(见例如美国专利号6,130,237)。例如，小沟结合试剂可以是CBI化合物或烯二炔类(例如加利车霉素)。
ADC或ADC衍生物可包含抗微管蛋白试剂。抗微管蛋白试剂的例子包括但不限于：紫杉烷类(例如
Figure BPA00001275632300231
(紫杉醇)、
Figure BPA00001275632300232
(多西他赛))、T67(Tularik)、长春花生物碱类(例如长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)和长春烯碱(vinorelbine))和auristatins(例如auristatin E、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)(示例性的auristatins显示于下文式III-XIII中)。其它合适的抗微管蛋白试剂包括，例如浆果赤霉素衍生物、紫杉烷类似物(例如埃坡霉素(epothilone)A和B)、洛可达唑(nocodazole)、秋水仙素(colchicine)和colcimid、雌莫司汀(estramustine)、cryptophysins、西马多丁(cemadotin)、美登木素生物碱、考布他汀、discodermolide和eleutherobin。
Figure BPA00001275632300251
Figure BPA00001275632300271
细胞毒性剂可以是美登木素生物碱，其是另一类抗微管蛋白试剂。例如，美登木素生物碱是美登素或含药物接头的美登素，例如，DM-1或DM-4(ImmunoGen，Inc.；还见Chari et al.，1992，Cancer Res.52：127-131)。
针对CD70的其它结合试剂可用作为抗体的备选物。此类CD70靶向部分可包括来自与CD70结合的抗体的一个或多个CDRs并且当与细胞毒性剂缀合时减少或抑制表达CD70的细胞的增殖。典型地，蛋白质是多聚体，最典型地，是二聚体。
其它的CD70靶向部分可包括CD27及与其CD70结合的变体或片段。CD70靶向部分还可包括与CD70特异性结合的肽、配体和其它分子。
可使用适于针对蛋白-蛋白相互作用加以筛选的任何方法，来鉴定可用于本文所述的方法的其它CD70靶向部分。典型地，最初通过它们与CD70特异性结合的能力，继而通过它们在与细胞毒性或细胞抑制剂缀合时对活化的淋巴细胞或表达CD70的癌细胞施加细胞抑制或细胞毒性效果的能力，来鉴定蛋白。可使用的方法包括“相互作用克隆”技术，其需要使用与对λgt11文库进行抗体探测的技术相似的方式用经标记的CD70来探测表达文库(见例如Blanar and Rutter，1992，Science 256：1014-1018)。另一方法是双杂交***(Chien et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci USA88：9578-9582)，其可从Clontech(Palo Alto，CA)商购。
一旦鉴定了CD70结合蛋白，可以以与用于抗体相似的方式，来测定其(单独或多聚化或与二聚化或多聚化结构域融合或与细胞毒性或细胞抑制性部分缀合时)在表达CD70的癌细胞上施加细胞抑制性或细胞毒性效果(当与细胞毒性剂缀合时)的能力。
III.检测CD70
用于诊断性应用的待检测样品可通过手术程序获得，例如，活组织检查。典型地，通过免疫测定来检测CD70，其中，将含有已知或怀疑来自癌症(例如胰腺癌或卵巢癌)的细胞的样品与抗体接触。接触之后，测定样品中抗体与细胞的结合事件的存在与否。结合与在该样品中癌性细胞上表达的抗原的存在与否相关。通常，将样品与能产生可检测信号的抗CD70抗体的经标记特异性结合配偶体接触。或者，抗CD70抗体本身可被标记。标记的类型的例子包括酶标记、放射性同位素标记、非放射性标记、荧光标记、毒素标记和化学发光标记。对来自标记的信号的检测指示与样品中CD70特异性结合的抗体的存在。
进行测定的样品可被固定或冷冻，以允许进行组织学切片。优选地，在醛固定剂(例如甲醛、多聚甲醛、戊二醛)或重金属固定剂(例如氯化汞)中固定经切除的组织样品。更优选地，在与抗体一起孵育之前，在***中固定经切除的组织样品，并且将其包埋于石蜡中。经***固定石蜡包埋(FFPE)的样品的优点是在组织切片中保存了细胞和构造形态细节(见例如Fox et al.，1985，J.Histochem.Cytochem.33：845-853)。任选地，可用柠檬酸盐、EDTA、酶促消化或热来处理FFPE样品，以增加表位的可及性(见例如Shi et al.，1991，J Histochem Cytochem.39：741-748)。
或者，可从已知或怀疑是胰腺癌或卵巢癌的细胞中分离蛋白级分，并通过ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀等等进行分析。在另一变型中，可通过FACS分析针对CD70的表达对细胞加以分析，优选与另一胰腺或卵巢细胞标记组合。
在另一变型中，可从已知或怀疑是胰腺癌或卵巢癌的细胞中提取mRNA。然后可通过与结合编码CD70的DNA的核酸探针的杂交，来分析mRNA或源于其的核酸，例如cDNA。
在另一变型中，可通过向患者施用经标记的抗CD70抗体并经由体内成像对抗体加以检测，来对胰腺癌或卵巢癌进行体内检测。
对组织样品中CD70的检测可定性或定量进行或者两者均进行。定性检测表示检测CD70表达存在与否。定量表达表示测定CD70的表达水平。可(但不是必须)参照一个或多个标准品来测定所讨论的胰腺或卵巢组织样品中CD70的存在和/或水平。可根据历史纪录或同时测定标准品。标准品可以是例如来自不同受试者的已知不是癌的胰腺或卵巢样品、来自患者或其它受试者的已知不表达CD70的组织或者胰腺或卵巢细胞系。标准品还可以是在分析下与无关抗体(例如针对细菌抗原产生的抗体)接触的患者样品。因为CD70在非癌性的胰腺或卵巢组织中不会以显著程度表达，此类非癌性组织可用作为零(背景)表达标准品。
相对于标准品(如果使用的话)而言来自抗CD70抗体与CD70的结合的可检测信号的存在表明组织样品中CD70的存在，可检测到的结合的水平提供了CD70的表达水平的指示。在对组织切片进行的测定中，表达水平可表示为显示出可检测到的CD70表达的样品表面积百分比。或者，或另外，表达的水平(强度)可用作样品中的总表达的量度或样品中表达CD70的细胞的量度。
IV.诊断、预后、设计和监测治疗
在胰腺或卵巢组织样品中检测到CD70的表达是对样品是癌性的指示。类似地，在其它患者样品中检测到CD70的表达是对患者具有肺癌、头颈癌(喉或咽)、黑素瘤、成胶质细胞瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(例如滤泡性淋巴瘤)、肾细胞癌(包括透明细胞和乳突肾细胞癌)、结直肠癌和膀胱癌的指示。用于治疗性应用的抗体特异性结合天然CD70抗原的细胞外结构域。
通过CD70的存在和/或水平提供的对癌症的指示可以与通过医师、X-射线、CT扫描(计算机层析X射线照相术)、PET扫描(正电子成像术)、PET/CT扫描、超声波、MRI(核磁共振成像)、内窥镜检查、ERCP(内镜下逆行胰胆管造影术)、组织学检查和组织培养对患者的内在或外在检查等诊断手段结合，以实现总体诊断。
可能对医师来说最相关地的，即CD70的存在和水平提供了用于为患者设计治疗方案(特别是向患者施用针对CD70的抗体、衍生物、ADC或其它结合试剂)的信息。因为在正常胰腺或卵巢组织中基本上不存在可检测到的CD70表达，该受体在癌症中的存在提供了治疗性治疗的靶标。CD70表达水平越高和/或表达CD70的肿瘤百分比越高，治疗可能就越有效。治疗之后对CD70进行的持续分析提供了监测治疗是否有效的手段，CD70阳性信号水平(即CD70阳性癌细胞存在的代表)的降低表明治疗有效。
V.适于接受治疗的患者
[0117]适于通过所述方法来治疗的患者通常在其胰腺、卵巢或其它组织中具有可检测到的CD70水平，并伴随上文所述的其它癌症病征或症状。胰腺癌和卵巢癌的多种亚型和阶段如下文所更详细描述的那样。有时，受本发明的方法治疗的患者此前接受过其它类型的治疗(例如手术、化疗和/或放疗)但并没有导致康复或者甚至减缓癌的生长。在一些此类患者中，癌症对一种或多种此类疗法的治疗是顽固的。
一些处于胰腺癌风险的患者也可在疾病病征和症状出现之前被预防性治疗。此类个体包括亲属曾经历这些疾病的个体以及通过遗传学或生物化学标记分析确定为具有风险的个体。
A.胰腺癌患者
胰腺癌是胰腺内的恶性肿瘤。几乎90％的胰腺癌患者长于55岁。目前该癌症被发现的平均年龄为72岁。胰腺癌的风险因素包括：年龄，男性，非洲裔，吸烟，高肉类膳食，肥胖，糖尿病，慢性胰腺炎(已被关联，但是并没有被认为是因果关系)，职业性接触某些杀虫剂、染料和汽油相关的化学物质，家族史，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染，牙龈炎或牙周疾病(Pancreatic Cancer.Von Hoff et al.，ed.，Maine；2005.)。仅10-15％的胰腺癌被认为是遗传性的。与胰腺癌相关的一些遗传标记包括PNCA1、PALLD或BRCA2基因的突变(见例如Banke et al.，2000，Med.Clin.North Am.84：677-690；Meckler et al.，2001，Am.J.Surg.Path.25：1047-1053；Pogue-Geile et al.，2006，PLoS Med.3：e516；Murphy et al.，2002.Cancer Res.62：3789-3793)。
但是，目前认可的风险类别中并非所有患者都将患胰腺癌。很多胰腺癌是“偶发性”产生的(即，没有家族史的患者中)。
可根据病理学报告中获得的肿瘤组织学来识别遭受胰腺癌的个体。组织学表明临床治疗、管理和预后的很多方面。基于肿瘤是从胰脏的外分泌或内分泌腺起始，胰腺癌有两大类。从胰脏的外分泌腺形成的肿瘤要普遍得多。大约95％的胰腺肿瘤是腺癌。剩下的5％包括外分泌胰脏的其它肿瘤(例如浆液性囊腺瘤)、腺泡细胞癌和胰腺神经内分泌肿瘤(例如胰岛素瘤)。
内分泌肿瘤通常被称为胰岛细胞肿瘤，其被分为若干亚型。大多数是良性的，但是有一些是癌性的。可能发生一种特定类型的癌症(壶腹癌)，其中来自肝的胆管和胰管进入小肠。因为这种类型的癌症通常导致皮肤和眼睛泛黄的病征，其通常在比大多数胰腺癌更早的阶段被发现。对于壶腹癌患者来说，成功治疗的机会更高。
可根据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer(AJCC))的标准来对胰腺癌分期。使用罗马数字I至IV来标记癌症分期，其中IV期表示癌症已扩散，并且更为严重。具体地，I期胰腺癌包括还没有扩散进某些指定的敏感区域并且没有涉及到局部结节或远端转移的肿瘤。II期包括已扩散进十二指肠、胆管或“胰腺周围”组织但是没有涉及到局部结节或远端转移的肿瘤。III期癌症包括可能已或者可能并没有扩散进这些区域但是以及涉及到局部结节却没有显示出远端转移证据的肿瘤。IVA期包括已扩散进胃、脾、大肠或相邻大血管并且涉及到局部结节但是没有显示出远端转移证据的肿瘤。IVB期包括具有任何类型的结节状况并且具有远端转移证据的任何类型的胰腺肿瘤。虽然提到了这些，但该胰腺癌分期***很少单独使用，因为分期与患者预后或治疗选择并非完全匹配。一个备选是三阶段分类(可能切除、局部发展和转移的)，其基于放射学发现。还考虑其它预后因素。显示细胞在显微镜下异常程度的癌症分级有时也以G1至G4的划分列出，其中G1癌症看起来最像正常细胞，其具有最好的前景。对于接受手术的患者来说，切除的程度，即，是否去除肿瘤的全部对于前景来说也是重要的。这有时以R0至R2的划分列出，其中R0指示可见的肿瘤全部都已被去除，而R2指示一部分可见肿瘤不能去除。
早期胰腺癌症状是非特异性并且多变的。常见症状包括上腹部疼痛(其典型地发射至背部，并且前倾能有所减轻(在胰腺体或尾中的癌症中观察到的))、丧失胃口、显著的体重减轻和与胆管阻塞相关的无痛性黄疸(胰头癌)。但是，所有这些症状都可能是具有多种其它诱因，它们并不限于胰腺癌。
B.卵巢癌患者
卵巢癌是卵巢中起始的癌症。卵巢癌通常发生于年过50的妇女，但是其也可能影响到较年轻的女性。其病因未知。某些群体，例如北欧犹太妇女处于较高风险，通常比一般群体较早年龄发病。具有乳腺癌个人史的患者，或者具有卵巢癌、乳腺癌或其它相关癌症家族史(特别是年轻时)的患者可具有升高的风险。子宫癌、结肠癌或其它肠胃癌的强家族史可指示被称为遗传性非息肉性结肠直肠癌(HNPCC，也被称为Lynch II综合征)的综合征的存在，这带来了患卵巢癌的高风险。细胞发生学研究以及杂合性丧失研究提示，一些基因或染色体区域参与卵巢癌的起始和发展(见例如Pejovic et al.，1992，Genes Chromosomes Cancer，4：58-68；Testa et al.，1994，Cancer Res.，54：2778-2784：Yang-Feng et al.，1993，Int.J.Cancer，54：546-551)。针对卵巢癌风险的遗传标记包括但不限于BRCA1或BRCA2基因中的突变(Futreal et al.，1994，Science，266：120-122)。具有卵巢癌的高遗传风险的患者可考虑在完成生育后采用预防性卵巢切除术。目前认可的风险类别中并非所有妇女都将患卵巢癌。卵巢癌的大部分是偶发性产生的。
可根据病理学报告中获得的肿瘤组织学来认定遭受卵巢癌的个体。组织学指示临床治疗、管理和预后的很多方面。基于肿瘤起始的细胞类型以及肿瘤是良性还是癌性的，存在三种主要类型的卵巢癌。生殖细胞肿瘤从产生卵子的细胞起始。间质肿瘤从将卵巢保持到一起并且产生***——***和孕酮的***细胞起始。上皮肿瘤从覆盖卵巢外表面的细胞起始。大多数卵巢癌是上皮肿瘤，少数肿瘤是从生殖细胞或***产生的。
卵巢癌通常是原发性的，但也可能是继发性的(从身体其它部分的原发癌转移而来的)。例如，从乳腺癌或从肠胃癌(这种情况下卵巢癌是克鲁肯贝格(Krukenberg)癌)。表面上皮-间质肿瘤可源于腹腔内衬(lining)，这种情况下卵巢癌是原发性腹膜癌所继发的，但是治疗基本上与该类型的原发性卵巢癌相同。
在卵巢癌中，癌症分期如下：I期限于一侧或双侧卵巢；II期涉及骨盆延伸或植入；III期涉及显微镜下骨盆之外的腹膜转移；或者限于骨盆但延伸至小肠或网膜；IV期涉及远端转移，例如，肝，或者转移到腹腔外。
早期卵巢癌通常无症状，或者仅产生温和症状，其可能被患者忽略，因为这些症状轻微并且不具有特异性。症状可以包括胃气胀、骨盆或腹部疼痛、饮食困难或迅速饱胀、泌尿症状(例如尿频或尿急)(见例如Smithet al.，2005，Cancer 104(7)：1398-1407；Fhe consensus statement releasedby the American Cancer Society，the Gynecologic Cancer Foundation，andthe Society of Gynecologic Oncologists on June 12，2007.)。表现出这种癌症的患者中超过60％已是III期或IV期癌症，此时其已扩散到卵巢之外。
C.其它癌症患者
适于被本发明的方法治疗的其它患者通常在肺癌、头颈癌(喉或咽)、黑素瘤、成胶质细胞瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(例如滤泡性淋巴瘤)、肾细胞癌(包括透明细胞和乳突肾细胞癌)、结直肠癌和膀胱癌样品中具有可检测到的CD70水平。此类患者可伴随其它癌症病征或症状。有时，受本发明的方法治疗的患者此前接受过其它类型的治疗(例如手术、化疗和/或放疗)但并没有导致康复或者甚至减缓癌的生长。在一些此类患者中，癌症对一种或多种此类疗法的治疗是顽固的。
一些处于癌症风险的患者也可在疾病病征和症状出现之前被预防性治疗。此类个体包括亲属曾经历这些疾病的个体以及通过遗传学或生物化学标记分析确定为具有风险的个体。
VI.治疗方法
本发明提供了通过本文公开的抗体、衍生物和ADC以及其它抗CD70结合试剂(合称为试剂)来治疗或预防胰腺癌或卵巢癌的方法。可向患者施用组合物。
多种递送***可用于施用所述试剂，包括皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。试剂可例如通过输注或推注，通过经由上皮或皮肤粘膜内衬(例如，口腔黏膜、直肠和肠黏膜等等)的吸收来施用，并且可与其它生物活性试剂(例如化学治疗剂)一起施用。施用可以是全身性的或局部性的。
试剂可通过注射、通过导管、通过栓剂或者通过植入物(植入物可以是有孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜，例如sialastic膜，或纤维)施用。
或者，试剂可以在控释***中递送。例如，可使用泵(见Langer，1990，Science 249：1527-1533；Sefton，1989，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald et al.，1980，Surgery 88：507；Saudek et al.，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。或者，可使用聚合材料(见Medical Applications of ControlledRelease(Langer & Wise eds.，CRC Press，Boca Raton，Florida，1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance(Smolen & Ball eds.，Wiley，New York，1984)；Ranger & Peppas，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61。还见Levy et al.，1985，Science 228：190；During et al.，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard et al.，1989，J.Neurosurg.71：105.)。其它控释***讨论于例如上文提及的Langer中。
试剂可作为包含治疗或预防有效量的试剂和一种或多种药物相容成分的药物组合物施用。例如，药物组合物典型地包括一种或多种药物载体(例如无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等)。当药物组合物静脉内施用时，水是更典型的载体。盐水溶液和右旋糖和甘油水溶性也可用作为液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括，例如，淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。如果需要的话，组合物还可含有少量润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂(例如氨基酸)和/或增溶剂或稳定剂(例如非离子表面活性剂，例如tween或糖，例如蔗糖、海藻糖等等)。这些组合物可采用溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、持续释放制剂等等的形式。组合物可与常规粘合剂和载体(例如甘油三酯)一起配制为栓剂。口服制剂可包括标准载体，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。合适的药物载体的例子被描述于E.W.Martin的″Remington′sPharmaceutical Sciences″中。此类组合物将含有治疗有效量的核酸或蛋白质(典型地，纯化形式的)以及合适量的载体，以提供对患者适当施用的形式。制剂与施用方式相对应。
典型地，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。如果需要的话，药物还可包括增溶剂和局部麻醉剂，例如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，成分单独提供或者混合到一起以单位剂量形式提供，例如，作为标出活性剂的量的密封容器(例如安瓿或小药囊)中的冻干粉或浓缩物。当药物通过输注施用时，可将其分散于含有无菌药物级的水或盐水的输注瓶中。当药物通过注射施用时，可提供用于注射的无菌水或盐水的安瓿，使得各成分在施用之前被混合。
可通过标准临床技术来测定对于治疗或预防胰腺癌或卵巢癌有效的试剂的量。此外，任选地，可利用体外测定法来帮助鉴定最优剂量范围。用于制剂中的精确剂量也取决于施用途径以及胰腺癌或卵巢癌的分期，这应当根据执业医师的判断和每位患者的状况来决定。有效剂量可从源于体外或动物模型测试***的剂量反应曲线外推得到。可在动物模型中配制剂量，以获得包括IC50(即，实现对症状的半最大抑制的测试化合物浓度)(如在细胞培养物中测定)的循环血浆浓度范围。
例如，可通过用于测定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)的标准药物程序，在细胞培养物或实验动物中测定试剂的毒性和治疗效果。毒性和治疗效果的剂量比是治疗指数，其可表示为LD50/ED50比。显示出大的治疗指数的试剂是优选的。当试剂展示出毒性副作用时，可使用将试剂靶向至受影响的组织位点的递送***，使得对不表达CD70的细胞的潜在危害最小，由此降低副作用。
通常，施用给患有表达CD70的癌症的患者的抗体、衍生物或ADC的剂量通常为0.1mg/kg至100mg/kg受试者体重。更典型地，施用给受试者的剂量为0.1mg/kg至10mg/kg受试者体重，进一步更典型为0.1mg/kg至5mg/kg，或者0.1mg/kg至3mg/kg受试者体重。通常，人抗体在人体内具有比来自其它物种的抗体更长的半寿期，这是由于对外来蛋白的免疫应答导致的。因此，包含人源化、嵌合或人抗体的ADCs的较低剂量和较低施用频率通常是可能的。
针对CD70的抗体、衍生物和ADCs还可以与一种或多种用于其它治疗剂组合施用治疗或预防胰腺癌或卵巢癌。例如，组合疗法可包括第二种细胞抑制性或细胞毒性剂(例如，未经缀合的细胞抑制性或细胞毒性剂，例如通常用于治疗癌症的那些)。组合疗法还可包括，例如施用靶向表达CD70的癌细胞表面上CD70之外的受体或受体复合物的试剂。典型地。此类抗体或配体与表达CD70的癌细胞上的细胞表面受体结合，通过向表达CD70的癌细胞递送细胞抑制性或细胞毒性信号来增强抗CD70抗体的细胞毒性或细胞抑制性效果。
可与所述试剂一起施用的其它药物包括生长因子抑制剂或者抗血管发生因子。例如，可使用被称为埃罗替尼(erlotinib)的药物(其是上皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂)来治疗胰腺癌(Bareschino et al.，2007，AnnOncol.Suppl 6：35-41)。此类组合施用可对疾病参数(例如，症状严重性、症状数量或复发频率)具有加合或协同效果。
本发明的方法可与其它治疗手段(例如手术、放疗、靶向疗法、免疫疗法、使用生长因子抑制剂或抗血管发生因子)组合。
手术是优选的治疗，为了获得组织样品用于经由其组织学进行差异诊断，手术通常是必需的。提高的存活率归因于更精确的疾病分期和更高的腹部肿瘤主动手术切除率。手术类型取决于诊断时癌症扩散的程度(癌症分期)以及癌症的假定类型和级别。
对于遭受胰腺腺癌的患者来说，外科医生可进行Whipple程序(也被称为胰十二指肠切除术)。在该程序中，会将胰头(以及有时还会将胰体)与胃和小肠的部分、胆囊、部分胆总管以及一些附近的***一起去除(见例如Michalski et al.，2007，Nat.Clin.Pract.Oncol.4(9)：526-35.)。对于遭受胰脏内分泌肿瘤(胰岛细胞肿瘤)的患者来说，手术是可行的选择(见例如
Figure BPA00001275632300371
and Hellman，2007，Best Pract.Res.Clin.Endocrinol.Metab.21(l)：87-109.)。
在卵巢癌患者中，外科医生可去除一侧(单侧卵巢切除术)或两侧卵巢(双侧卵巢切除术)、输卵管(输卵管切除术)和子宫(子宫切除术)。对于一些非常早期的肿瘤而言，例如I期的那些，仅涉及到的卵巢和输卵管被去除(“单侧输卵管-卵巢切除术”，USO)，尤其是在希望保持其生育能力的年轻女性中。在晚期恶性肿瘤中(完全切除不可行的情况下)，切除尽可能多的肿瘤(削体手术)。在该类型的手术成功的情况下，较之剩下大肿瘤质(直径大于1cm)的患者来说，预后将得以改善。最少侵入性手术技术可促进安全去除非常大(大于10cm)的肿瘤但仅有极少的手术并发症(见例如Ehrlich et al.，2007，J.Pediatr.Surg.42(5)：890-3.)。
化疗指使用抗癌或细胞毒性药物来杀死癌细胞。化疗可在手术前或手术后给予患者。取决于肿瘤的组织学，一些种类的肿瘤(特别是畸胎瘤)对化疗并不敏感。可使用药物，例如吉西他滨、5-氟尿嘧啶、顺铂或丝裂霉素C，进行静脉内化疗来治疗胰腺癌。可使用静脉内化疗如吉西他滨、拓扑替康、阿霉素、脂质体阿霉素、卡铂、紫杉醇来治疗卵巢癌。部分静脉内并且部分腹膜内的化疗也可提高中位存活时间(The ChemotherapySource Book(3rd edition).Ed.Perry.Lippincott，Williams and Wilkins，2001；Oxford Textbook of Palliative Medicine.(2nd Ed.)Derek Doyle et al.Oxford University Press.1999.)。
放疗是用高能射线，例如X射线，来杀死癌细胞或使其缩小并且尽可能少伤害正常细胞的治疗。可在手术前或手术后向患者给予放射。放疗还可用于治疗没有扩散但是无法通过手术去除的胰腺癌。放疗通常不用于治疗卵巢的癌症，但是如果合适的话，偶尔也可使用。组合放疗和化疗还可用于肿瘤过于扩散以至于没法通过手术去除的患者。
抗CD70抗体、衍生物或ADC可同时施用给正在经历手术、化疗或放疗治疗的患者。或者，患者可在施用抗CD70抗体、衍生物或ADC之前或之后至少1小时至多达数月(例如在施用ADC或ADC衍生物之前或之后至少1小时、5小时、12小时、1天、1周、1月或3个月)时经历手术、化疗或放疗。
VII.试剂盒
本发明提供了用于上述检测方法的诊断试剂盒。试剂盒典型地含有用于按照上文所述进行检测的、与变性的CD70特异性结合的抗体或其片段。一个或多个另外的容器可包括将用于测定法中的成分，例如试剂或缓冲剂。此类试剂盒还可含有，或者备选地含有：含适于直接或间接检测抗体结合的报道基团的检测试剂。
本发明还提供了用于治疗胰腺癌和卵巢癌的药物试剂盒。典型地，此类试剂盒含有按照本文所述被配制为治疗性组合物的试剂，此类试剂盒可以是适于以试剂盒配送的多种形式中的任何形式。此类形式可包括液体、粉剂、片剂、混悬剂以及用于提供试剂(例如抗CD70抗体、衍生物或ADCs)的类似制剂。试剂盒还可包括可药用稀释剂(例如无菌水)用于注射、重构或稀释经冻干的抗体、衍生物或ADC。
本发明还提供了用于诊断和治疗的组合试剂盒。此类试剂盒典型地包括：至少一种较之天然CD70而言优先与变性的CD70结合的抗体(用于在固定组织切片中进行检测)，还含有用于治疗的不同的抗体，其以与变性CD70至少相同(如果不是更好的话)的程度结合天然CD70。
试剂盒还典型地含有用于本文所述的检测和/或治疗方法的标签或说明书。标签或说明书指在其生产、运输、销售或使用期间的任何时间试剂盒所附的或伴随的任何书面或记录的材料。其可以是管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构指定的形式的通知，该通知反映了生产、使用或销售机构对于施用给人的许可。标签或说明书还可包括广告性传单和小册子、包装材料、说明书、音像磁带、计算机磁盘以及直接印刷到药物试剂盒上的说明。
本发明还在下述实施例中描述，实施例不意在限制本发明的范围。下述实施例中描述的细胞系按照美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection(ATCC))或德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany(DMSZ))指定的条件以培养物形式保存。细胞培养试剂从Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA或其它供应商获得。
实施例
实施例1制备单克隆抗体SG-21.1C1.B3和SG-21.5D12.C3
用变性的CD70细胞外结构域(CD70-ECD)作为免疫原对小鼠进行数次攻击，使用来自从上述小鼠移出的脾或***的B-细胞来产生单克隆抗体SG-21.1C1.B3和SG-21.5D12.C3。然后将这些B-细胞与骨髓瘤肿瘤细胞融合，以产生杂交瘤。由此从这些杂交瘤产生了大量的单克隆抗体。稀释杂交瘤，以确保克隆形成能力和生长。
测试如ELISA(使用Flag-CD70)或差别FMAT筛选(AppliedBiosystems，Foster City，CA)(使用经固定的表达293F的猕猴(“cyno”)CD70和变性的L540cy细胞(其表达CD70))，针对与变性的CD70抗原结合的能力测试了来自不同克隆的抗体。未经转染的293F和L540cy细胞被用作阴性对照(一些L540细胞是CD70阳性的)。
结果显示，关于与变性的CD70结合的能力，超过100个杂交瘤被测试为阳性。来自两个阳性杂交瘤的抗体SG-21.1C1.B3(“1C1”)和SG-21.5D12.C3(“5D12”)被选用来进行免疫组织化学分析。
实施例2制备经***固定的石蜡包埋的(FFPE)样品
按照标准方法(按照Theory and Practice of Histotechnology，第二版.1980，Sheehan，D.C.and Hrapchak，B.B.，编者(Battelle Press(Columbus，OH).Chapter 3，pp.59-78)所述)来制备经***固定的石蜡包埋的组织。
通过FFPE制备细胞与组织制备相似。简言之，在固定前1天，将细胞以大约15,000个细胞/孔接种到合适的培养基中。按照下文所述来固定细胞：用PBS将细胞洗涤两次，然后在室温下用10％的***固定45分钟。之后，用PBS对细胞洗两次，然后用PBS+0.5％Triton X-100在室温下对细胞进行15分钟的透化。然后用PBS洗涤细胞一次，并将细胞于4℃保存于PBS+0.02％叠氮化钠中。在FMAT筛选之前，除去PBS+叠氮化物，在室温下用PBS+5％山羊血清对平板封闭30分钟。
实施例3制备组织微阵列用于免疫组织化学
从商业来源，包括US Biomax、TriStar或Cybrdi，获得FFPE组织切片的组织微阵列。还按照Yale Tissue Microassay Construction Protocols，版本1.0及其后续更新来制备组织微阵列。
实施例4开发单克隆抗体SG-21.1C1.B3和SG-21.5D12.C3作为用于FFPE样品的免疫组织化学试剂
A.CD70克隆的免疫组织化学测试
通过将全长的猕猴CD70基因克隆进表达载体，来制造编码猕猴CD70的表达构建体。将该构建体转染进293F细胞。这些293F：CD70转染的细胞被用作为1C1和5D12抗体染色的阳性对照。亲本293F细胞系用作为阴性对照。对于组织染色而言，表达CD70的786-O细胞作为阳性对照。
按照实施例2所述的程序，对细胞和组织加以固定，并将其包埋于石蜡中。使用Vision BioSystems Bond-maxTM***(现为Leica Microsystems)进行IHC染色和抗原提取。使用EDTA提取方法，进行40分钟的抗原提取。或者，使用Trilogy抗原提取***(Cell Marque，Hot Springs，AR)在99-100℃的温度下进行1小时的抗原提取。
1C1一级抗体或5D12一级抗体都对所有固定的293F：CD70转染细胞强烈染色，而在亲本293F细胞中没有检测到染色。结果还显示786-O细胞(肾细胞癌)中有强烈染色，然而在Ramos异种移植物对照中也检测到背景染色。
1C1克隆被进一步亚克隆，并选择了亚克隆1C1-B3(SG-21.1C1.B3)。类似地，5D12也被进一步亚克隆，并选择了亚克隆5D12-C3(SG-21.5D12.C3)。纯化这两个亚克隆，用其作为一级抗体来染色786-O异种移植物和Ramos异种移植物样品。结果显示，1C1-B3和5D12-C3的亚克隆和纯化除去了Ramos异种移植物中的背景染色。
产生抗CD70抗体的杂交瘤已被保藏于10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209的美国典型培养物保藏中心(ATCC)。被称为SG-21.1C1.B3的产生抗体1C1的细胞系于2007年10月24日以ATCC保藏号PTA-8733保藏于ATCC；被称为SG-21.5D12.C3的产生抗体5D12的细胞系于2007年10月24日以ATCC保藏号PTA-8734保藏于ATCC。
B.与2B3抗体相比用SG-21抗体1C1和5D12进行的蛋白质印迹
为测定SG-21抗体1C1和5D12抗体是否能在细胞和组织裂解物中检测CD70，进行了蛋白质印迹实验。还使用了另一结合CD70的抗体2B3用于比较。膜制备物是从786-O细胞、293F：cynoCD70(表达cyno CD70)的细胞和293F细胞(作为阴性对照)来制备的。为制备膜提取物，将细胞裂解于低渗缓冲液中，并于4℃以10,000xg离心10分钟，以除去残渣。然后在4℃以100,000xg对上清液离心30分钟，以沉淀膜级分。将膜级分(沉淀)溶于50mM Tris加150mM NaCl和5mM EDTA中的0.5％NP40中。为了保持CD70完整，所有样品制备都是在存在蛋白酶抑制剂的情况下进行的。使用BCA试剂盒(Pierce)于570nm测量蛋白质的量。还通过标准方法制备了CD70 ECD(CD70的细胞外结构域)和经Flag标记的CD70-ECD。在90℃将蛋白样品变性3分钟，并在冰上冷冻3分钟。使用SDS-PAGE对样品加以分离，并将其转至硝酸纤维素膜用于检测。制备四份相同的SDS-PAGE凝胶和膜。在具有1％BSA和2％脱脂乳并具有0.05％Tween(聚山梨醇酯)的PBS中对膜加以封闭。然后将每种一级抗体以0.5μg/ml加入到溶液中，将其在室温下在具有0.05％Tween的PBS中孵育4小时。洗涤膜，加入识别一级抗体的二级抗体-酶缀合物，在室温下孵育45分钟。洗膜，并与化学发光底物一起孵育，以检测CD70。
参照图1，结果显示，SG-21抗体1C1和5D12抗体在786-O和293F：CD70转染子中检测到了CD70，但是在阴性对照293F细胞中没有检测到。明显地，在786-O和293F：CD70转染子中检测到的条带大小相同。SG-21抗体2B3没有在786-O和293F：cynoCD70样品中检测到CD70，但是检测到了CD70ECD和flag-CD70-ECD。结果表明1C1和5D12抗体检测到了样品中的CD70。
C.使用SG21.1C1抗体，肿瘤和非肿瘤细胞系中的CD70表达
从商业来源获得或定制组织微阵列，其含有下述癌症样品：乳腺癌、卵巢癌、间皮瘤、骨肉瘤、***癌、肝细胞癌、成胶质细胞瘤、AnaplasticAstrocytonma、子宫癌、胚癌、表皮样癌、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非-T、非-B全组织细胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(NHL)、伯基特淋巴瘤、NHL滤泡性淋巴瘤、急性髓性白血病(AML)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、红白血病、结肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、肾细胞癌(RCC)、透明细胞类型RCC、***状类型RCC、黑素瘤、胰腺癌和膀胱癌。还使用下述细胞或细胞系：经EB病毒转化的B类淋巴母细胞细胞系(EBV-LCL)、正常人乳腺上皮细胞(HMEC)、正常人血管上皮细胞(HUVEC)、正常血单核细胞(PBMC)、正常人主动脉内皮细胞(HAEC)、正常人肾内皮细胞(HREC)、正常人肺微血管内皮细胞(HMVEC-L)、正常人内-新生儿皮肤微血管内皮细胞(HMVEC-neo)和正常人肺动脉内皮细胞(HPAEC)。
按照上文所述的方案，用SG21.1C1抗体对组织微阵列进行免疫染色。在下述细胞系中观察到了染色：卵巢癌细胞系SK-OV-3；成胶质细胞瘤细胞系GMS-IO；多发性骨髓瘤细胞系LB、LP-1、AMO-1、I-310(MM.1R)、C2E3(MM.1S)、MOLP-8、JJN-3和L363；霍奇金淋巴瘤细胞系KMH2、HS445、RPMI-1666、L248和HD-M-YZ；EBV-LCL WIL2-S、Farage和IM-9；NHL、滤泡性细胞系WSU-NHL；RCC透明细胞类型细胞系Cali-1、Caki-2、786-O和769-P；RCC***类型细胞系CAL54、A498；RCCSK-RC-6和SK-RC-7；黑素瘤细胞系A375M和A375SM；胰腺癌细胞系PANC-1和膀胱癌T24。对未鉴定的一些细胞系的染色是微弱的或混杂的。一些细胞系具有胞质染色。关于胰腺和卵巢细胞系的染色，分别参见图2和图3。
D.1C1和5D12抗体的比较染色
通过染色293F，293F-cynoCF1细胞系，RCC Caki-1，来自正常猕猴的正常扁桃体、骨骼肌、膀胱、淋巴样组织(***、胸腺、脾)，正常人胸腺、肾和骨骼肌组织和胰腺肿瘤组织，来比较1C1和5D12抗体。按照上文所述进行免疫染色方案。
结果显示，1C1和5D12对293F和293-cyno CD70细胞系(数据未示出)；RCC Caki-1和猕猴扁桃体组织(数据未示出)；来自正常猕猴的淋巴样组织(***、胸腺、脾)(数据未示出)和胰腺肿瘤组织类似地染色(见图4)。在正常人和猴骨骼肌组织和正常猴膀胱组织中观察到了1C1和5D12的一定的差别染色，其中5D12对组织加以染色，但1C1没有。还在正常人胸腺和肾组织中观察到了差别染色，其中5D12对胞质染色。
实施例5使用1C1抗体，正常结肠和结直肠癌组织以及正常胰脏和胰腺癌组织中的CD70表达
评估来自不同癌症类型的整个组的肿瘤组织之前，首先在结肠和胰腺癌中测定CD70表达。按照实施例4所述进行免疫染色方案。用于这些研究的色原是Fast Red。
结果显示，在正常结肠组织中，仅极少的淋巴细胞对CD70阳性染色。其它细胞都是CD70阴性的。在结肠癌组织的一份样品中，肿瘤细胞被阳性染色。在结肠组织的第二份样品中，肿瘤细胞阴性但是间质阳性。类似地，在正常胰脏组织中，CD70染色呈阴性。在胰腺癌组织的一份样品中，肿瘤细胞为阳性，在第二份样品中，肿瘤细胞阴性但是间质为阳性(见图5)。
实施例6使用SG21.1C1抗体，肿瘤组织中的CD70表达
从下述肿瘤类型获得肿瘤组织：霍奇金淋巴瘤、肾、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胰腺、喉/咽、卵巢、结肠和乳腺。按照实施例3所述的组织阵列方案，制备正常的和肿瘤组织，免疫染色方案如实施例4A所述。1C1抗体被用作为一级抗体。之后基于染色强度和涉及的肿瘤的百分比来评估免疫组织化学(IHC)表达。染色强度被记为1至4，其中1表示最小染色；2，轻度染色；3，中度染色；以及4，强烈染色。涉及的肿瘤的百分比也被记为1至4，其中1表示0-5％；2，5-25％；3，25-75％；以及4，75％-100％。测量是定性的。对于霍奇金淋巴瘤而言，基于Reed-Sternberg细胞评估来测定CD70阳性细胞的IHC表达。Reed-Sternberg细胞是未知来源的大细胞，其通常是多核的，其存在是霍奇金淋巴瘤的共有组织学特征。
霍奇金淋巴瘤肿瘤组织具有最高的CF70阳性肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的百分比(97％或33/34)。肾肿瘤具有第二高的CF70阳性肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的百分比(70％或14/20)。淋巴瘤具有第三高的CF70阳性肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的百分比(61％或72/119)。多发性骨髓瘤具有第四高的CF70阳性肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的百分比(42％或13/31)。胰腺癌具有第五高的CF70阳性肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的百分比(25％或35/140)。
图6显示了对产生CD70阳性信号的140份中的35份胰腺样品而言染色强度和％肿瘤染色的图。该图显示了染色强度和肿瘤染色百分比的复杂关系。即，一些肿瘤具有高的细胞染色百分比，但是强度低，而另有一些具有低的细胞染色百分比，但是强度高，还有一些显示出中等的染色强度和细胞染色百分比。喉/咽癌具有第六高的CF70阳性肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的百分比(22％或18/82)。卵巢癌具有第七高的CF70阳性肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的百分比(15％或37/241)。
图7显示了对于241份中37份CD70染色卵巢癌而言，染色强度和肿瘤染色百分比。在染色强度和细胞染色的百分比之间有一定关联。结直肠癌具有第七高的CF70阳性肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的百分比(9％或7/194)。乳腺癌具有最低的CF70阳性肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的百分比(2％或5/204)。
总之，基于CD70-阳性肿瘤/总肿瘤、染色强度(细胞靶向表达)、CD70阳性肿瘤涉及百分比(肿瘤靶向表达)，肿瘤类型的一般性适应症顺序如下所示：霍奇金＞肾＞淋巴瘤＞多发性骨髓瘤＞胰腺＞喉/咽＞卵巢＞结直肠＞乳腺。所有肿瘤组织的结果示于表1中。
表1多种癌症中的CD70表达
肿瘤类型    CD70+/总的    CD70+的百分比
霍奇金        33/34        97
肾            204/283      72
淋巴瘤        72/119       61
多发性骨髓瘤  13/31        42
胰腺          35/140       25
喉/咽         18/82        22
卵巢          37/241       15
皮肤          4/30         13
肺(所有的)    40/475       8
肺腺癌        17/172       10
结肠          17/194       9
乳腺          5/204        2
实施例7h1F6-药物缀合物在卵巢癌细胞系中显示出效力
为验证已知的CD70抗体药物缀合物针对这些新癌的代表性细胞系的效力，制备SKOV-3细胞，按照之前对其它细胞系的一般性的描述加以测试。(见国际专利公开WO 2006-113909.)。将细胞与下述抗CD70抗体药物缀合物一起孵育：h1F6-vc-MMAF(4)、h1F6vc-MMAE(4)、1F6mc-MMAF(4)或h1F6mc-MMAF(8)或游离MMAF。(关于对药物接头的描述，参见说明书美国专利申请公开号2005-0238649和2006-0233794的内容。每种缀合物之后的括号内的数字表示每种抗体的平均药物负载)。将SKOV-3细胞与指出浓度的缀合物一起孵育96小时。对于这些研究而言，使用Promega CelltiterGlo来测定存活力。
表2
  h1F6-vc-   h1F6vc-   1F6mc-   h1F6mc-   MMAF
  MMAF(4)   MMAE(4)   MMAF(4)   MMAF(8)
  5ng/ml   60ng/ml   29ng/ml   12ng/ml   18nM
参照图8，所有四种抗CD70ADCs对该卵巢癌细胞系都有活性。参照表2，显示了IC50。这些IC50与针对表达CD70的其它癌细胞系所报道的相一致。这些结果证实，与该癌细胞系上的CD70结合的抗CD70ADCs被内化，并且释放出auristatin有效负载。
实施例8h1F6-药物缀合物在经CD70转染的胰腺癌细胞系中显示出效力
为验证已知的CD70抗体药物缀合物对针对代表性细胞系的效力，用编码经修饰的猕猴CD70的核酸来转染胰腺细胞系HPAFII、PANC-1和MiaPaCa-2。MiaPaCa-2细胞不表达可检测水平的CD70蛋白。h1F6与这些经转染的细胞系表达的天然CD70蛋白结合。通过FACS分析证实了经转染的细胞系的CD70表达(数据未示出)。按照之前针对其它细胞系一般性的描述，对经转染的胰腺细胞系测试了h1F6mc-MMAF(4)(SGN-75)的活性。(见国际专利公开WO 2006-113909的实施例7)(缀合物之后的括号内的数字表示每种抗体的平均药物负载)。参照图9A-C，将细胞与指出浓度的缀合物一起孵育96小时。参照图9A，显示了缀合物对经转染的HPAFII细胞的活性。使用Promega CelltiterGlo来测定细胞存活力。参照图9B和9C，显示了缀合物对经转染的PANC-1和MiaPACa-2转染细胞系的活性。对于这些研究而言，按照前文所述，使用刃天青(rezasurin)来测定细胞存活力。Promega CelltiterGlo的PANC-1活性。缀合物显示出在所有这些细胞系上的体外细胞毒性活性。
实施例9h1F6-药物缀合物在胰腺癌的异种移植物模型中显示出效力
通过套管针，用经CD70转染的MiaPaCa肿瘤块(按照实施例8中所述的制备)植入裸(nu/nu)雌性小鼠(7只动物/组)的右侧腹。当肿瘤达到10mm3(q4dx4ip)时，开始给予SGN-75或未结合的对照ADC(3mg/kg)。监测肿瘤体积，当肿瘤体积达到1000mm3时处死动物。参照图10，数据以两种方式作图：A.对于每组持续进行中位肿瘤体积作图，直到一只或多只动物被处死。B.Kaplan-Meier曲线显示了对于每组中各动物的肿瘤达到800mm3的时间。用SGN-75进行处理在该异种移植物模型中是有效的。
本发明并不限于本文所述的特定实施方式的范围。除了本文所述的之外，本领域技术人员从前文的描述和相关附图还显而易见对本发明的多种修改。此类修改也意欲落入所附权利要求的范围内。除非上下文明显另有指明，本发明的任何步骤、要素、实施方式、特征或方面可与任何其它的组合使用。为了所有目的，本申请中提到的所有专利申请和科学出版物、检索号等等都通过引用整体并入本文，并入的程度与单独提到它们一样。
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Claims (47)

1.一种抗体，其相对与天然CD70的结合而言与被固定的卵巢SK-OV-3或胰腺PANC-1癌细胞系上变性的CD70特异性结合。
2.权利要求1的抗体，其是嵌合的或人源化抗体。
3.权利要求1的抗体，其以特异性结合结合经***固定的石蜡包埋的细胞或组织上的变性CD70，所述特异性结合与以指定的保藏号PTA-8733保藏于ATCC的杂交瘤产生的抗体SG-21.1C1或以指定的保藏号PTA-8734保藏于ATCC的杂交瘤产生的抗体SG-21.5D12的相同或更好。
4.权利要求1的抗体，所述抗体与以指定的保藏号PTA-8733保藏于ATCC的杂交瘤产生的抗体SG-21.1C1或以指定的保藏号PTA-8734保藏于ATCC的杂交瘤产生的抗体SG-21.5D12竞争特异性结合变性的CD70。
5.权利要求4的抗体，其是以指定的保藏号PTA-8733保藏于ATCC的杂交瘤产生的抗体SG-21.1C1或以指定的保藏号PTA-8734保藏于ATCC的杂交瘤产生的抗体SG-21.5D12。
6.权利要求4的抗体，其包含与抗体SG-21.1C1的重链可变区具有至少90％序列同一性的重链可变区和与抗体SG-21.1C1的轻链可变区具有至少90％序列同一性的轻链可变区。
7.权利要求4的抗体，其包含与抗体SG-21.5D12的重链可变区具有至少90％序列同一性的重链可变区和与抗体SG-21.5D12的轻链可变区具有至少90％序列同一性的轻链可变区。
8.权利要求4的抗体，其包含具有抗体SG-21.1C1的重链可变区的CDRs的氨基酸序列的重链可变区互补决定区(CDRs)和具有抗体SG-21.1C1的轻链可变区的CDRs的氨基酸序列的轻链可变区CDRs。
9.权利要求4的抗体，其包含具有抗体SG-21.5D12的重链可变区的CDRs的氨基酸序列的重链可变区CDRs和具有抗体SG-21.5D12的轻链可变区的CDRs的氨基酸序列的轻链可变区CDRs。
10.诊断试剂盒，其包含：
权利要求1-9中任意一项的抗体和使用所述抗体辅助对胰腺、卵巢、肺、喉、咽、乳腺或皮肤的癌症进行诊断、预后或监测的说明书。
11.在患者的组织样品中检测CD70表达的方法，所述方法包括从所述患者获得胰腺、卵巢、肺、喉、咽、乳腺或皮肤的组织样品；
固定所述组织样品，并且对所述组织样品中的CD70进行变性；
将被固定的组织样品与权利要求1-9中任意一项的抗体接触；并
检测所述抗体与所述被固定的组织样品的结合，以确定CD70是否在所述样品中表达；
其中，所述被固定的组织样品上CD70的表达表明所述患者可能患有表达CD70的癌症。
12.权利要求11的方法，还包括相对于对照组织样品而言，基于CD70在所述样品中的表达诊断癌症患者。
13.权利要求11的方法，还包括相对于对照组织样品而言，基于CD70的表达对所述患者中癌症的存在进行预后。
14.权利要求11的方法，还包括确定所述患者的治疗方案，其中CD70的可检测到的表达表明所述治疗方案包括用CD70抗体或抗体药物缀合物进行治疗。
15.权利要求11的方法，其中所述样品经***固定并且包埋于石蜡中。
16.对具有胰腺、卵巢、肺、喉、咽、乳腺或皮肤的癌症的患者进行诊断、预后、确定治疗方案或监测治疗的方法，所述方法包括：测定在来自所述患者的胰腺、卵巢、肺、喉、咽、乳腺或皮肤的样品的细胞中CD70的表达，其中可检测到的CD70表达的存在用于所述患者的诊断、预后、确定治疗方案或监测治疗。
17.权利要求16的方法，其中测定在经***固定的石蜡包埋的样品中细胞上的CD70表达。
18.权利要求16的方法，其中通过与针对编码CD70的核酸的探针的杂交测定CD70表达。
19.权利要求16的方法，还包括：如果所述测定步骤表明可检测到的CD70水平，那么向所述患者施用CD70抗体或CD70抗体药物缀合物的有效剂量方案。
20.权利要求19的方法，其中施用CD70抗体。
21.权利要求19的方法，其中施用CD70抗体药物缀合物。
22.权利要求16的方法，其中CD70的表达作为所述样品中表达可检测到的CD70的细胞的百分比来测定。
23.权利要求16的方法，其中CD70的表达作为所述样品中细胞的平均表达水平来测定。
24.治疗CD70阳性癌症的方法，所述方法包括向具有CD70的可检测表达的胰腺、卵巢、肺、喉、咽、乳腺或皮肤的癌症的患者施用CD70结合试剂的有效剂量方案，其中所述结合试剂是抗体、抗体衍生物或抗体药物缀合物。
25.权利要求24的方法，其中所述结合试剂是具有效应功能的抗体。
26.权利要求24的方法，其中所述结合试剂是抗体药物缀合物。
27.权利要求24的方法，其中所述患者已经历过通过手术、放疗和/或用与CD70无关的试剂化疗而没有导致癌症减轻的治疗。
28.权利要求24的方法，其中所述抗体是单克隆抗体1F6或2F2或其嵌合或人源化形式。
29.权利要求24的方法，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
30.权利要求26的方法，其中所述抗体药物缀合物包含选自由抗微管蛋白试剂、DNA小沟结合试剂和DNA小沟烷基化试剂组成的组的细胞毒性剂。
31.权利要求26的方法，其中所述抗体药物缀合物包含选自由auristatins、烯二炔类、lexitropsin、多卡米星、紫杉烷、嘌呤霉素、多拉司他汀、美登木素生物碱和长春花生物碱组成的组的细胞毒性剂。
32.权利要求30的方法，其中所述抗体药物缀合物包含抗微管蛋白试剂。
33.权利要求32的方法，其中所述抗微管蛋白试剂是auristatins、长春花生物碱、鬼臼毒素、紫杉烷、浆果赤霉素衍生物、cryptophysin、美登木素生物碱或考布他汀。
34.权利要求33的方法，其中所述抗微管蛋白试剂是AFP、MMAP、MMAE、AEB、AEVB、auristatin E、长春新碱、长春碱、长春地辛、长春烯碱、VP-16、喜树碱、紫杉醇、多西他赛、埃坡霉素A、埃坡霉素B、洛可达唑、秋水仙素、colcimid、雌莫司汀、西马多丁、discodermolide、美登素、DM-I或eleutherobin。
35.权利要求26的方法，其中所述抗体通过接头与所述细胞毒性或细胞抑制剂缀合。
36.权利要求35的方法，其中所述接头在细胞内条件下是可切割的。
37.权利要求36的方法，其中所述可切割的接头包含可被细胞内蛋白酶切割的肽。
38.权利要求37的方法，其中所述肽是二肽。
39.权利要求38的方法，其中所述二肽是val-cit接头或phe-lys接头。
40.权利要求36的方法，其中所述可切割的接头在低于5.5的pH下是可水解的。
41.权利要求40的方法，其中所述可水解的接头是腙接头。
42.权利要求36的方法，其中所述可切割的接头是二硫化物接头。
43.权利要求24的方法，其中所述患者具有胰腺癌，并且所述胰腺癌是腺癌。
44.权利要求24的方法，其中所述患者具有卵巢癌，并且所述卵巢癌是上皮细胞的卵巢癌。
45.权利要求24的方法，其中所述患者是人。
46.组合诊断和药物试剂盒，所述试剂盒包含用于诊断的权利要求1-9任意一项的抗体，以及用于治疗的与天然CD70的细胞外结构域特异性结合的抗体。
47.在患者的组织样品中检测CD70表达的方法，所述方法包括：
获得肾、脑或血液的组织样品；
固定所述组织样品，并且将所述组织样品中的CD70蛋白质变性；
将被固定的组织样品与权利要求1-9任意一项的抗体接触；以及
检测所述抗体与所述被固定的组织样品的结合，以确定CD70是否在所述样品中表达；
其中所述被固定的组织样品上CD70的表达表明所述患者可能患有表达CD70的癌症。
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