KR101644674B1 - Ｃｄ３７―결합 분자 및 이의 면역접합체 - Google Patents

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Abstract

CD37에 결합하는 항체 및 면역접합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 신규한 항암제가 제공된다. 상기 제제, 항체, 또는 면역접합체를 사용하는 방법, 가령 종양의 성장을 억제하는 방법이 추가로 제공된다.

Description

ＣＤ３７―결합 분자 및 이의 면역접합체 {CD37-BINDING MOLECULES AND IMMUNOCONJUGATES THEREOF}
본 발명의 분야는 일반적으로 CD37에 결합하는 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩티드, 및 면역접합체에 관련될 뿐 아니라 B-세포 악성종양과 같은 질병의 치료를 위해 그러한 CD37-결합 분자를 사용하는 방법과 관련된다.
GP52-40, 테트라스파닌(tetraspanin)-26, 또는 TSPAN26로도 공지인 백혈구 항원 CD37("CD37")는 테트라스파닌 슈퍼패밀리의 막관통단백질이다(Maecker et al., 1997 FASEB J. 11:428-442). 상기 단백질은 전구-B에서 말초 성숙 B-세포 단계로 되는 동안 B 세포상에 발현되지만, 혈장 세포로 되는 말단 분화(terminal differentiation)시 부재하는, 4개의 막관통 도메인을 가지는 중하게 글리코실화된 단백질이다. (Link et al., 1987, J Pathol. 152:12-21). CD37 항원은 오로지 T-세포, 골수성 세포(myeloid cell) 및 과립구(granulocyte)에서만 약하게 발현된다 (Schwartz-Albiez et al. 1988, J. Immunol., 140(3)905-914). 그러나, CD37는 또한 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma, NHL) 및 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphoid leukemia, CLL)을 유발하는 것들과 같은 악성 B-세포에 발현된다(Moore et al. 1986, J Immunol. 137(9):3013-8). 이러한 발현 프로파일은 CD37이 B-세포 악성종양에 대한 유망한 치료 표적을 표현함을 시사한다.
CD37의 정확한 생리적 역할이 불분명한 반면에, 연구를 통해 T-세포 증식에서의 잠재적 역할이 시사된다(van Spriel et al. 2004, J Immunol., 172(5):2953-61). 세포 표면 당단백질 중 테트라스파닌 패밀리의 일부로서, CD37는 또한 다른 표면 단백질과 복합체를 형성할 수 있다(Angelisova 1994, Immunogenetics., 39(4):249-56). CD37 발현이 결핍된 마우스가 개발되었으며 상기 마우스는 림프 기관의 발달 및 세포 조성에서 어떠한 변화도 나타내지 않았다. 단지 감소된 수준의 IgG1 및 T-세포 의존성 항원에 대한 반응의 변화만이 관찰되었다(Knobeloch et al. 2000, Mol Cell Biol., 20(15):5363-9).
항체는 그러한 암을 치료하기 위한 유망한 방법으로 떠오르고 있다. 특히, 표적 세포에서 아폽토시스(apoptosis)를 유발할 수 있는 항체가 바람직하다. 그 외에도, 보체 의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 활성 및 항체 의존성 세포독성(antibody-dependent cytotoxicity, ADCC)을 가지는 항체가 또한 바람직하다.
최근에, 리툭시맙(rituximab)으로 지칭되는 항-CD20 항체가 B-세포 악성종양을 치료하기 위해 사용되고 있다(Leget et al., 1998, Curr. Opin. Oncol., 10:548-551). 그렇지만, 단지 일부 환자들만이 리툭시맙 치료에 차도를 보이며, 심지어 리툭시맙을 투약하고 차도를 보이는 환자조차도 결국 재발하고 대개 리툭시맙 치료에 대해 내성이 발생한다. 그 외에도, CD37-결합제가 또한 B-세포 악성종양을 위한 잠재적 치료제로서 검사되고 있다. 트루비온 파마슈티칼스(Trubion Pharmaceuticals)는 CD37-결합제 SMIP-016 및 TRU-016를 개발했다(Zhao et al., 2007, Blood, 110:2569-2577). SMIP-016은 하이브리도마(hybridoma)로부터의 다양한 영역 및 유전자조작된 인간 불변 영역을 포함하는 단일 사슬 폴리펩티드이다. TRU-016은 항-CD37 SMIP 단백질의 인간화된 버전이다. 예를 들어 미국 공개공보 제2007/0009519호를 참조하라. TRU-016은 만성 림프성 백혈병(CLL)의 치료를 위해 임상적으로 검사되고 있다. 뵈링거 잉겔하임(Boehringer Ingelheim)이 또한 국제 공개 공보 WO 2009/019312에서 CD37 결합제를 개시했다. 그러나, 이들 결합제 중 어느 하나에 대해서도 CDC 활성은 기술되지 않았고, 어떠한 시험관 내(in vitro) 아폽토시스-촉진(pro-apoptotic) 활성도 가교-결합제(cross-linking agent)의 부재에서 기술되지 않았다.
방사선-면역치료요법(Radio-immunotherapy, RIT)이 2개의 개별적인 연구에서 방사성-표지된 항-CD37 항체 MB-1를 이용하여 시도되었다. 치료적 투여량의 131I-MB-1이 6명의 재발 NHL 환자에 투여되었다(Press et al. 1989 J Clin Oncol. 7(8):1027-38, Press at el. 1993, N Engl J Med. 329(17):1219-24). 모든 6명의 환자들이 4 내지 31달의 기간을 두고 완전관해(complete remission, CR)를 얻었다. 또다른 연구에서, 131I-MB-1이 10명의 재발 NHL 환자에 투여되었다(Kaminski et al. 1992 J Clin Oncol. 10(11):1696-711). 총 4명의 환자가 2 내지 6 달의 기간 범위로 차도를 보였음에도 불구하고, 단지 1명의 CR만이 보고되었다. 그러나, 필수 비-표적 기관의 방사선 노출에 대한 염려를 야기하는 방사성-표지의 바람직하지 않은 생체내 분포로 인해 모든 환자를 치료할 수 없었다. 실제로, 중증의 골수억제(myelosupression) 및 심폐독성(cardiopulmonary toxicity)을 비롯한 RIT 관련 독성이 이들 연구에서 관찰되었다. 이들 임상 데이터가 항-CD37 방사성-면역접합체가 효과적일 수 있음을 시사하는 반면, 이들 요법은 시행자에게 번거로우며, 재발시 사후-RIT 환자는 방사선의 높은 선량과 연관된 위험으로 인해 RIT로 다시 치료할 수 없다.
RIT의 한계를 극복하기 위해, 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate, ADC)로도 지칭되는 항체-세포독성제 접합체(antibody-cytotoxic agent conjugate, ACC)가 개발되었다. 이들은 화학적 연결기를 통해 항체에 공유적으로 연결된 세포독성제를 포함하는 면역접합체이며, 항체가 인식하는 단백질을 발현하는 세포에 세포독성제를 특정하게 수송하게 할 수 있다. 그렇지만, 빈약하게 내화된(internalized) 단백질은 그러한 요법을 위한 바람직한 표적으로 간주되지 않는다. CD37과 CD20은 CD20이 테트라스파닌 패밀리의 구성원이 아님에도 불구하고 두 항원이 모두 4개의 막관통 도메인을 포함하므로 구조적으로 유사하다(Tedder et al. 1989, J. Immun. 142: 2560-2568). CD37 및 CD20를 비롯한 몇몇 B-세포 항원에 대한 항체가 엔도사이토시스(endocytosis) 및 분해를 진행하는 이들의 능력에 대해 연구되었다(Press et al. 1989, Cancer Res. 49(17):4906-12, 및 Press et al. 1994, Blood. 83(5):1390-7). 항-CD37 항체 MB-1는 세포 표면에 잔존했으며 시험관 내(in vitro) 다우디(Daudi) 림프종 세포에서 서서히 내화되었다. MB-1 항체는 또한 시험관 내(in vitro) NHL 환자 세포에서 낮은 속도의 엔도사이토시스 및 세포내 대사를 가졌다. 유사한 결과가 항-CD20 항체 1F5를 이용하여 얻어졌으며, 상기 항체도 또한 주로 림프종 세포 표면에 잔존하고 빈약하게 내화되었다. CD20 항체의 ADC가 이전에 연구되었었지만 특히 비-이황화물 또는 산 안정한 연결기가 사용되는 경우, 유효하게 강한 효력을 입증하지 못했다(예를 들어 Polson et al., 2009, Cancer Res., 69(6):2358-2364를 참조하라). 이들 관찰에 비추어, CD37는 항체-약물 접합체에 대한 바람직한 표적으로 간주되지 않았다.
그러므로, B-세포 악성종양을 치료하기 위한 수단으로서 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 항체-약물 접합체(면역접합체)를 포함하는 CD37 결합제에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 그러한 필요성을 다룬다.
인간 CD37에 결합하는 신규한 항체, 이들 항체를 포함하는 면역접합체, 및 이들의 사용 방법이 본 명세서에 기술된다. 신규한 폴리펩티드, 가령 인간 CD37에 결합하는 항체, 그러한 항체의 단편, 및 그러한 항체와 연관된 다른 폴리펩티드가 또한 제공된다. 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 또한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로서 제공된다. 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포가 추가로 제공된다. 신규한 CD37 항체 또는 면역접합체를 포함하는 조성물(예컨대, 약제학적 조성물)이 또한 제공된다. 그 외에도, 신규한 CD37 항체 또는 면역접합체를 만드는 방법 및 사용 방법이 또한 제공되며, 가령 종양 성장을 억제 및/또는 암을 치료하기 위해 신규한 CD37 항체 또는 면역접합체를 사용하는 방법이 제공된다.
CD37에 특이적으로 결합하고, 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유발할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 또한 아폽토시스 및/또는 항체 의존성 세포매개 세포독성 (ADCC)을 유발할 수 있다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 항체와 동일한 CD37에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다: (a) SEQ ID NO:55의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:72의 폴리펩티드를 포함하는 항체; (b) SEQ ID NO:59의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:75의 폴리펩티드를 포함하는 항체; (c) SEQ ID NO:61의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:77의 폴리펩티드를 포함하는 항체; (d) SEQ ID NO:197의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:80의 폴리펩티드를 포함하는 항체; (e) SEQ ID NO:66의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:82의 폴리펩티드를 포함하는 항체; (f) SEQ ID NO:68의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:84의 폴리펩티드를 포함하는 항체; 및 (g) SEQ ID NO:70의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:86의 폴리펩티드를 포함하는 항체.
일부 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD37에 특이적으로 결합하고 SEQ ID NO: 180의 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 특정 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 184의 폴리펩티드에 결합하지 않는다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD37에 특이적으로 결합하고, 항체 또는 이의 단편은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 항체를 경쟁적으로 억제한다: (a) SEQ ID NO:55의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:72의 폴리펩티드를 포함하는 항체; (b) SEQ ID NO:59의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:75의 폴리펩티드를 포함하는 항체; (c) SEQ ID NO:61의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:77의 폴리펩티드를 포함하는 항체; (d) SEQ ID NO:197의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:80의 폴리펩티드를 포함하는 항체; (e) SEQ ID NO:66의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:82의 폴리펩티드를 포함하는 항체; (f) SEQ ID NO:68의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:84의 폴리펩티드를 포함하는 항체; 및 (g) SEQ ID NO:70의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:86의 폴리펩티드를 포함하는 항체.
특정 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2010년 2월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭(Deposit Designation) PTA-10664, 2010년 2월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10665, 2010년 2월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10666, 2010년 2월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10667, 2010년 2월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10668, 2010년 2월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10669, 및 2010년 2월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10670로 이루어진 군에서 선택된 하이브리도마에 의해 만들어진다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD37에 특이적으로 결합하고, 항체는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열을 포함한다: (a) SEQ ID NOs: 4, 5, 및 6 및 SEQ ID NOs: 28, 29, 및 30; (b) SEQ ID NOs: 7, 8, 및 9 및 SEQ ID NOs: 31, 32, 및 33; (c) SEQ ID NOs: 10, 11, 및 12 및 SEQ ID NOs: 34, 35, 및 36; (d) SEQ ID NOs: 13, 14, 및 15 및 SEQ ID NOs: 37, 38, 및 39; (e) SEQ ID NOs: 13, 14, 및 15 및 SEQ ID NOs: 37, 40, 및 39; (f) SEQ ID NOs: 16, 17, 및 18 및 SEQ ID NOs: 41, 42, 및 43; (g) SEQ ID NOs: 19, 20, 및 21 및 SEQ ID NOs: 44, 45, 및 46; (h) SEQ ID NOs: 19, 20, 및 21 및 SEQ ID NOs: 44, 47, 및 46; (i) SEQ ID NOs: 22, 23, 및 24 및 SEQ ID NOs: 48, 49, 및 50; (j) SEQ ID NOs: 22, 23, 및 24 및 SEQ ID NOs: 48, 51, 및 50; (k) SEQ ID NOs: 25, 26, 및 27 및 SEQ ID NOs: 52, 53, 및 54; 및 (l) 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)을 포함하는 (a) 내지 (k)의 변이체.
추가적 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음으로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열과 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 99% 동일, 또는 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다: (a) SEQ ID NO:55 및 SEQ ID NO:72; (b) SEQ ID NO:56 및 SEQ ID NO:73; (c) SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:198; (d) SEQ ID NO:58 및 SEQ ID NO:198; (e) SEQ ID NO:59 및 SEQ ID NO:75; (f) SEQ ID NO:60 및 SEQ ID NO:76; (g) SEQ ID NO:61 및 SEQ ID NO:77; (h) SEQ ID NO:62 및 SEQ ID NO:78; (i) SEQ ID NO:63 및 SEQ ID NO:79; (j) SEQ ID NO:197 및 SEQ ID NO:80; (k) SEQ ID NO:65 및 SEQ ID NO:81; (l) SEQ ID NO:66 및 SEQ ID NO:82; (m) SEQ ID NO:67 및 SEQ ID NO:83; (n) SEQ ID NO:68 및 SEQ ID NO:84; (o) SEQ ID NO:69 및 SEQ ID NO:85; (p) SEQ ID NO:70 및 SEQ ID NO:86; 및 (q) SEQ ID NO:71 및 SEQ ID NO:87.
일부 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 쥐과(murine), 비-인간, 인간화, 키메라(chimeric), 재표면화, 또는 인간의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일부 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 가교-결합제의 부재에서 시험관 내(in vitro) CD37을 발현하는 세포의 아폽토시스를 유발할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유발할 수 있다. 더욱 추가적인 구체예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC)을 유발할 수 있다.
다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD37에 특이적으로 결합하는 인간 또는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 가교-결합제의 부재에서 시험관 내(in vitro) CD37을 발현하는 세포의 아폽토시스를 유발할 수 있다. 추가적 구체예에서, 인간 또는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유발할 수 있고/또는 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC)을 유발할 수 있다.
역시 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 CD37 및 마카크속 원숭이(macaque) CD37에 결합한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장(full length) 항체 또는 항원 결합 단편이다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, 단일 사슬 Fv 또는 scFv, 이황화 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디(intrabody), IgG△CH2, 미니바디(minibody), F(ab')3, 테트라바디(tetrabody), 트리아바디(triabody), 디아바디(diabody), 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, CD37-결합제는 CD37에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드이고, 상기 폴리펩티드는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함한다: (a) SEQ ID NOs: 4, 5, 및 6 및 SEQ ID NOs: 28, 29, 및 30; (b) SEQ ID NOs: 7, 8, 및 9 및 SEQ ID NOs: 31, 32, 및 33; (c) SEQ ID NOs: 10, 11, 및 12 및 SEQ ID NOs: 34, 35, 및 36; (d) SEQ ID NOs: 13, 14, 및 15 및 SEQ ID NOs: 37, 38, 및 39; (e) SEQ ID NOs: 13, 14, 및 15 및 SEQ ID NOs: 37, 40, 및 39; (f) SEQ ID NOs: 16, 17, 및 18 및 SEQ ID NOs: 41, 42, 및 43; (g) SEQ ID NOs: 19, 20, 및 21 및 SEQ ID NOs: 44, 45, 및 46; (h) SEQ ID NOs: 19, 20, 및 21 및 SEQ ID NOs: 44, 47, 및 46; (i) SEQ ID NOs: 22, 23, 및 24 및 SEQ ID NOs: 48, 49, 및 50; (j) SEQ ID NOs: 22, 23, 및 24 및 SEQ ID NOs: 48, 51, 및 50; (k) SEQ ID NOs: 25, 26, 및 27 및 SEQ ID NOs: 52, 53, 및 54; 및 (l) 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 (a) 내지 (k)의 변이체.
다른 구체예에서, CD37-결합제는 CD37에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드이며, 상기 폴리펩티드는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 서열과 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 99% 동일 또는 동일한 서열을 포함한다: (a) SEQ ID NO:55 및 SEQ ID NO:72; (b) SEQ ID NO:56 및 SEQ ID NO:73; (c) SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:198 (d) SEQ ID NO:58 및 SEQ ID NO:198; (e) SEQ ID NO:59 및 SEQ ID NO:75; (f) SEQ ID NO:60 및 SEQ ID NO:76; (g) SEQ ID NO:61 및 SEQ ID NO:77; (h) SEQ ID NO:62 및 SEQ ID NO:78; (i) SEQ ID NO:63 및 SEQ ID NO:79; (j) SEQ ID NO:197 및 SEQ ID NO:80; (k) SEQ ID NO:65 및 SEQ ID NO:81; (l) SEQ ID NO:66 및 SEQ ID NO:82; (m) SEQ ID NO:67 및 SEQ ID NO:83; (n) SEQ ID NO:68 및 SEQ ID NO:84; (o) SEQ ID NO:69 및 SEQ ID NO:85; (p) SEQ ID NO:70 및 SEQ ID NO:86; 및 (q) SEQ ID NO:71 및 SEQ ID NO:87.
항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 폴리펩티드를 만드는 세포가 또한 본 명세서에 기술된 방법에 따라 만들어지고 사용될 수 있다. 상기 방법은 (a) 그러한 CD37-결합제를 만드는 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 항체, 이의 항원-결합 단편, 또는 폴리펩티드를 배양된 세포로부터 분리하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 폴리펩티드를 만드는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, CD37-결합제는 화학식 (A) - (L) - (C)을 가지는 면역접합체이며, 여기서: (A)는 CD37-결합제; (L)는 연결기; 및 (C)는 세포독성제이며; 여기서 상기 연결기 (L)는 (A) 내지 (C)를 연결한다.
일부 구체예에서, CD37-결합제는 화학식 (A) - (L) - (C)을 가지는 면역접합체이며, 여기서: (A)는 CD37에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편; (L)는 비-절단성(non-cleavable) 연결기; 및 (C)는 세포독성제이며; 여기서 상기 연결기 (L)는 (A) 내지 (C)를 연결한다.
일부 구체예에서, CD37-결합제는 화학식 (A) - (L) - (C)을 가지는 면역접합체이며, 여기서: (A)는 CD37에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편; (L)는 연결기; 및 (C)는 메이탄시노이드(maytansinoid)이며; 여기서 상기 연결기 (L)는 (A) 내지 (C)를 연결한다.
면역접합체 연결기는 비-절단성 연결기일 수 있다. 연결기는 절단성 연결기, 비-절단성 연결기, 친수성 연결기, 및 디카르복실산계 연결기로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 연결기는 다음으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다: N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트(SPP); N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부타노에이트(SPDB) 또는 N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)-2-설포부타노에이트(설포-SPDB); N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 시클로헥산카르복실레이트(SMCC); N-설포석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 시클로헥산카르복실레이트(설포SMCC); N-석신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB); 및 N-석신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-테트라에틸렌글리콜] 에스테르(NHS-PEG4-말레이미드). 연결기는 N-석신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-테트라에틸렌글리콜] 에스테르(NHS-PEG4-말레이미드)일 수 있다.
세포독성제는 메이탄시노이드, 메이탄시노이드 유사체, 독소루비신(doxorubicin), 변형된 독소루비신, 벤조디아제핀(benzodiazepine), 탁소이드(taxoid), CC-1065, CC-1065 유사체, 듀오카르마이신(duocarmycin), 듀오카르마이신 유사체, 칼리키아미신(calicheamicin), 돌라스타틴(dolastatin), 돌라스타틴 유사체, 아리스타틴(aristatin), 토메이마이신(tomaymycin) 유도체, 및 렙토마이신(leptomycin) 유도체 또는 상기 제제의 전구약물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 세포독성제는 메이탄시노이드일 수 있다. 세포독성제는 N(2')-데아세틸-N(2')-(3-메르캅토-1-옥소프로필)-메이탄신(DM1) 또는 N(2')-데아세틸-N2-(4-메르캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)-메이탄신(DM4)일 수 있다.
또한 본 명세서에 제공된 것은 CD37-결합제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 상기 약제학적 조성물은 2차 항암제를 포함할 수 있다.
표지된 CD37-결합제를 포함하는 진단 시약이 또한 본 명세서에 제공된다. 상기 표지는 방사성표지, 형광단(fluorophore), 발색단(chromophore), 영상화제 및 금속 이온으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한 본 명세서에 제공된 것은 CD37-결합제를 포함하는 키트이다.
본 명세서에 기술된 방법은 세포를 CD37 결합제 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, CD37을 발현하는 세포의 성장을 억제하기 위한 방법을 포함한다.
본 방법은 또한 환자에게 치료적 유효량의 CD37 결합제 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 가진 환자를 치료하기 위한 방법을 제공한다.
본 방법은 2차 항암제를 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 2차 항암제는 화학치료제일 수 있다.
암은 B 세포 림프종, NHL, 전구 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙 B 세포 신생물, B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구 림프종(small lymphocytic lymphoma, SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프구형질구성 림프종, 외투세포 림프종 (mantle cell lymphoma, MCL), 여포성 림프종(follicular lymphoma, FL), 저등급, 중간-등급 및 고-등급 (FL), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종, MALT형 변연부 B 세포 림프종, 림프절 변연부 B 세포 림프종, 비장형 변연부 B 세포 림프종, 모양 세포성 백혈병(hairy cell leukemia), 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷(Burkitt's) 림프종, 형질세포종, 형질세포골수종, 이식후 림프세포증식 장애(post-transplant lymphoproliferative disorder), 발덴스트롬 매크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 및 미분화 대세포 림프종(anaplastic large-cell lymphoma, ALCL)로 이루어진 군에서 선택된 암일 수 있다.
SEQ ID NOs: 55-87로 이루어진 군에서 선택된 서열과 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 99% 동일, 또는 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드가 또한 본 명세서에 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NOs: 121-151과 적어도 90%, 적어도 95% 동일, 적어도 99% 동일, 또는 동일한 서열을 포함할 수 있다.
그러한 폴리뉴클레오티드 및 벡터를 포함하는 벡터 및 숙주 세포가 또한 본 명세서에 포함된다.
도 1은 비-형질감염된 300-19 대조 세포(왼쪽) 및 CD37-발현 300-19 세포(오른쪽)에 결합하는 항체에 대한 막대그래프를 도시한다. 이들 막대그래프는 10 nM의 muCD37-3, muCD37-12, muCD37-38을 이용한 염색 및 일차 항체의 부재에 대해 나타낸다.
도 2는 비-형질감염된 300-19 대조 세포(왼쪽) 및 CD37-발현 300-19 세포(오른쪽)에 결합하는 항체에 대한 막대그래프를 도시한다. 이들 막대그래프는 10 nM muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 및 muCD37-57를 이용한 염색에 대해 나타낸다.
도 3은 유세포분석기(flow cytometry)로 분석한 WSU-DLCL-2 세포로의 (A) muCD37-3 및 muCD37-12 및 (B) muCD37-8, muCD37-10 및 muCD37-14의 결합을 도시한다. 평균형광강도(Mean fluorescence intensity, MFI)가 사용된 각각의 항체 농도에 대해 표시된다. 각 항체의 분명한 Kd에 해당하는 항체 결합의 EC50을 측정하기 위해 결합 곡선이 사용되었다.
도 4는 아폽토시스의 유발을 측정하기 위해 10 nM 농도의 (A) 리툭시맙, muCD37-3, muCD37-8, muCD37-10, muCD37-12 또는 muCD37-14 및 (B) 리툭시맙, huCD37-3, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 또는 muCD37-57으로 배양된 라모스(Ramos) 림프종 세포를 이용하는 아넥신 V 분석(Annexin-V assay)의 결과를 도시한다. 항체의 부재(무 Ab)에서 처리안된 세포의 대조 샘플이 비교에 사용된다.
도 5는 다양한 농도의 muCD37-3, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51 및 muCD37-16 항체로 5일 동안 배양된 SU-DHL-4 림프종 세포에 대한 WST-8 증식 분석의 결과를 도시한다.
도 6은 (A) CD37-3 VL 및 (B) CD37-3 VH에 대한 CD37-3 표면 잔기 및 재표면화 버전 내 치환의 목록을 도시한다.
도 7은 (A) CD37-50 VL 및 (B) CD37-50 VH에 대한 CD37-50 표면 잔기 및 재표면화 버전 내 치환의 목록을 도시한다.
도 8은 CD37-3 및 CD37-50 가변 영역과 이의 쥐의 상응부(counterpart)에 대해 재표면화된 서열의 배열을 도시한다: A) CD37-3 경사슬 가변 도메인; B) CD37-3 중사슬 가변 도메인. C) CD37-50 경사슬 가변 도메인; D) CD37-50 중사슬 가변 도메인. 대시 "-"는 쥐의 서열과 동일함을 의미한다.
도 9는 (A) 유세포분석기로 분석한 라모스 세포에 대한 muCD37-3, chCD37-3, muCD37-12 및 chCD37-12의 직접 결합 분석 및 (B) 2 nM 농도의 muCD37-3-PE 접합체의 존재에서 BJAB 세포에 대한 muCD37-3, chCD37-3, huCD37-3v1.0 및 huCD37-3v1.01의 경쟁적 결합 분석을 도시한다.
도 10은 유세포분석기로 분석한 마카크속 원숭이 CD37 항원을 발현하는300-19 세포에 대한 항-CD37 항체의 결합을 도시한다: (A) muCD37-3, muCD37-12, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56, muCD37-57, WR17 및 TRU-016의 결합 및 (B) huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 및 huCD37-57의 결합. 각 항체의 분명한 Kd에 해당하는 항체 결합의 EC50을 측정하기 위해 결합 곡선이 사용되었다.
도 11은 다양한 농도의 (A) huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50 및 (B) huCD37-51, huCD37-56, huCD36-57 및 리툭시맙으로 배양된 라모스 림프종 세포에서 아폽토시스의 유발을 측정하기 위한 아넥신-V 분석의 결과를 도시한다. 인간 IgG1 동형(isotype) 대조 항체(huIgG 대조)로 처리한 세포의 대조 샘플이 비교에 사용된다.
도 12는 다양한 농도의 muCD37-3, chCD37-3, huCD37-3v1.0 및 huCD37-3v1.01 항체로 5일 동안 배양된 (A) SU-DHL-4 및 (B) DOHH-2 림프종 세포에 대한 WST-8 증식 분석의 결과를 도시한다.
도 13은 다양한 농도의 huCD37-3, TRU-016 또는 리툭시맙 항체로 5일 동안 배양된 (A) 그랜타(Granta)-519 및 (B) SU-DHL-4 림프종 세포에 대한 WST-8 증식 분석의 결과를 도시한다.
도 14는 보체의 원천으로서 5% 인간 혈청의 존재하에 (A) huCD37-3, huCD37-38, chCD37-12 또는 huIgG1 동형 대조 항체 및 (B) huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56, huCD37-57, chCD37-12 또는 huIgG1 동형 대조 항체로 배양된 라모스 림프종 세포에 대한 CDC 분석의 결과를 도시한다.
도 15는 효과기 세포로서 정제된 인간 NK 세포의 존재하에 (A) huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50, TRU-016 및 (B) huCD37-51, huCD37-56, huCD37-57, TRU-016 또는 인간 IgG1 동형 대조 항체로 배양된 다우디 림프종 세포에 대한 ADCC 분석의 결과를 도시한다.
도 16은 전장 쥐, 인간, 및 마카크속 원숭이 CD37 아미노산 서열의 배열을 도시한다. 대시 "-"는 쥐의 서열과 동일함을 의미한다. 소형 및 대형 세포외 도메인은 밑줄로 표시된다.
도 17은 인간, 재조합 및 야생형 쥐, 마카크속 원숭이 및 키메라 CD37 서열의 대형 세포외 도메인의 배열을 도시한다. 대시 "-"는 인간 서열과 동일함을 의미한다. 유전자조작된 절단 부위의 위치가 나타나있고 영향 받는 잔기는 밑줄로 표시된다.
도 18은 각각 1.5 μg/mL의 항체를 이용하여 유세포분석기로 분석한 (A) 인간 CD37 야생형 및 (B) hCD37-M3 변이체로 형질감염된 세포에 대한 일군의 CD37항체의 결합을 도시한다.
도 19는 각각 1.5 μg/mL의 항체를 이용하여 유세포분석기로 분석한 (A) hCD37-M1 변이체 및 (B) hCD37-M45 변이체로 형질감염된 세포에 대한 일군의 CD37항체의 결합을 도시한다.
도 20은 유세포분석기로 분석한 BJAB 세포에 대한 (A) huCD37-3-SMCC-DM1 huCD37-3-SPP-DM1 및 huCD37-3-설포-mal-DM4와 비교한 huCD37-3및 (B) huCD37-38-SMCC-DM1과 비교한 huCD37-38의 결합을 도시한다. 각 항체 또는 접합체의 분명한 Kd에 해당하는 항체 또는 접합체 결합의 EC50을 측정하기 위해 결합 곡선이 사용되었다.
도 21은 (A) 아폽토시스의 유발을 측정하기 위한 아넥신-V 분석의 결과 및 (B) CDC 분석의 결과를 도시한다. 분석은 다양한 농도의 huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, huIgG1 대조 항체, huIgG1-SMCC-DM1 대조 접합체, 또는 리툭시맙으로 배양된 라모스 림프종 세포에 대해 수행되었다. CDC 분석은 보체 원천으로서 5% 인간 혈청의 존재하에 수행되었다.
도 22는 (A) huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-PEG4-mal-DM1, TRU-016 또는 huIgG1 동형 대조 항체로 배양된 다우디 림프종 세포 및 (B) 효과기 세포로서 정제된 인간 NK 세포의 존재하에 huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-PEG4-mal-DM1 또는 huIgG1 동형 대조 항체로 배양된 라모스 림프종 세포에 대한 ADCC 분석의 결과를 도시한다.
도 23은 10 nM 농도의 huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, 또는 비-결합 huIgG1-SMCC-DM1 대조 접합체로 20시간 동안 배양된(A) BJAB 세포 및 (B) RL 세포에 대해 프로피디움 아이오다이드(Propridium Iodide) 염색을 사용하는 세포주기 분석의 결과를 도시한다.
도 24는 3 x 10-8 M 내지 1 x 10-11 M 범위의 농도로 5일 동안 (A) huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-38-SMCC-DM1, huCD37-50-SMCC-DM1, huCD37-51-SMCC-DM1, huCD37-56-SMCC-DM1, huCD37-57-SMCC-DM1로 배양된 다우디 세포, 및 (B) huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-38-SMCC-DM1, huCD37-50-SMCC-DM1, huCD37-51-SMCC-DM1, 또는 비-결합 huIgG1-SMCC-DM1 대조 접합체로 배양된 그랜타-519 세포에 대한 WST-8 세포독성 분석의 결과를 도시한다.
도 25는 SCID 마우스의 피하에 이식된 BJAB 림프종 세포를 사용하는 공인된 이종이식 모델(xenograft model)의 결과를 도시한다. 동물들은 세포 접종 후 12일에 단 한번 10 mg/kg의 (A) huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-50 Ab, huCD37-50-SMCC-DM1 또는 (B) huCD37-38 Ab, huCD37-38-SMCC-DM1, huCD37-56 Ab, huCD37-56-SMCC-DM1로 처리되었다. 상이한 처리군의 평균 종양 부피가 종양 세포 접종 후 시간에 대해 표시된다.
도 26은 SCID 마우스의 피하에 이식된 BJAB 림프종 세포를 사용하는 공인된 이종이식 모델의 결과를 도시한다. 동물들은 세포 접종 후 9일에 단 한번 10 mg/kg의 huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-설포-mal-DM4 또는 5 mg/kg의 huCD37-3-SPP-DM1로 처리되었다. 상이한 처리군의 평균 종양 부피가 종양 세포 접종 후 시간에 대해 표시된다.
도 27은 SCID 마우스의 피하에 이식된 SU-DHL-4 미만성 거대 B-세포 림프종 세포를 사용하는 공인된 이종이식 모델의 결과를 도시한다. 동물들은 세포 접종 후 17일에 단 한번 10 mg/kg의 huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-설포-mal-DM4 또는 5 mg/kg의 huCD37-3-SPP-DM1로 처리되었다. 상이한 처리군의 중간 종양 부피가 종양 세포 접종 후 시간에 대해 표시된다.
도 28은 SCID 마우스의 피하에 이식된 BJAB 림프종 세포를 사용하는 공인된 이종이식 모델의 결과를 도시한다. 동물들은 세포 접종 후 9일에 단 한번 10 mg/kg의 huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1로 처리되었다. 상이한 처리군의 평균 종양 부피가 종양 세포 접종 후 시간에 대해 표시된다.
도 29는 SCID 마우스의 피하에 이식된 SU-DHL-4 미만성 거대 B-세포 림프종 세포를 사용하는 공인된 이종이식 모델의 결과를 도시한다. 동물들은 세포 접종 후 15일에 단 한번 10 mg/kg의 huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1로 처리되었다. 상이한 처리군의 평균 종양 부피가 종양 세포 접종 후 시간에 대해 표시된다.
도 30은 SCID 마우스의 피하에 이식된 DoHH2 여포성 B-세포 림프종 세포를 갖는 공인된 이종이식 모델을 이용하는 분석의 결과를 도시한다. 동물들은 세포 접종 후 12일에 시작하여 (i) 10 mg/kg의 huCD37-3 항체의 단일 용량, (ii) 10 mg/kg의 huCD37-3-SMCC-DM1 접합체의 단일 용량, (iii) 3주 동안 주 2회 2 mg/kg의 리툭시맙의 6회 용량, (iv) 5회의 하루 0.2 mg/kg 용량의 프레드니손(prednisone, CVP)과 함께 단일 40 mg/kg 용량의 시클로포스파미드(cyclophosphamide) 및 0.5 mg/kg의 빈크리스틴(vincristine)을 투여하는 요법, 또는 (v) 비히클 대조로 처리되었다. 상이한 처리군의 중간 종양 부피가 종양 세포 접종 후 시간에 대해 표시된다.
도 31은 SCID 마우스의 피하에 이식된 JVM3 CLL 세포를 갖는 공인된 이종이식 모델을 이용하는 분석의 결과를 도시한다. 동물들은 세포 접종 후 7일에 시작하여 (i) 10 mg/kg의 huCD37-3 항체의 단일 용량, (ii) 5 mg/kg 용량의 huCD37-3-SMCC-DM1 접합체, (iii) 10 mg/kg 용량의 huCD37-3-SMCC-DM1 접합체, (iv) 3주 동안 주 2회 5 mg/kg의 오파투무맙(ofatumumab)의 6회 용량, (v) 단일 50 mg/kg 용량의 벤다무스틴(bendamustine), 또는 (vi) 비히클 대조로 처리되었다. 상이한 처리군의 중간 종양 부피가 종양 세포 접종 후 시간에 대해 표시된다.
도 32는 다양한 NHL 및 CLL 종양 세포주에서 측정된 CD37 및 CD20 발현 수준(A) 및 이들 세포주에서 측정된 huCD37-3-SMCC-DM1의 시험관 내(in vitro) 세포독성(B)을 도시한다.
본 발명은 CD37 발현 (예컨대, 양성) 세포에 대한 다음의 세 가지 세포독성 활성에서 높은 효력을 가지는 신규한 부류의 CD37 결합 분자를 제공한다: 아폽토시스, ADCC, 및 CDC의 유발. 또한, 항-CD37 항체의 면역접합체는 생체 내(in vivo) 종양 모델을 이용하여 입증된 바와 같이 기대 이상으로 우수하게 CD37 발현 세포를 제거한다.
I.정의
본 발명의 이해를 촉진하기 위해, 많은 용어 및 구문이 하기에 정의된다.
본 명세서에 사용된 용어 CD37는 달리 명시되지 않는 한 임의의 자연적인 CD37를 가리킨다. CD37는 또한 GP52-40, 백혈구 항원 CD37, 및 테트라스파닌-26으로 지칭된다. 용어 "CD37"는 "전장(full-length)", 조작되지 않은 CD37뿐만 아니라 세포내 과정으로 야기된 임의의 형태의 CD37를 포괄한다. 상기 용어는 또한 CD37의 자연발생적인 변이체, 예컨대, 스플라이스 변이체(splice variant), 대립유전자 변이체(allelic variant), 및 동종체(isoform)를 포괄한다. 본 명세서에 기술된 CD37 폴리펩티드는 다양한 원천으로부터, 가령 인간 조직형 또는 또다른 원천으로부터 분리될 수 있거나 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.
용어 "항체"는 분자의 가변 영역 내 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 상기한 것들의 조합과 같은 표적을 인식하고 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 온전한(intact) 다클론성 항체, 온전한 단클론성 항체, 항체 단편(가령 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편), 단일 사슬 Fv (scFv) 돌연변이, 다중특이성 항체 가령 적어도 두 가지 온전한 항체로부터 생성된 이특이성(bispecific) 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항체가 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 동안 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤(mu)로 지칭되는 이의 중-사슬 불변 도메인의 유사성을 기초로 하여 면역글로불린의 5개 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 또는 이의 하위 부류(동형) (예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)중 어느 하나일 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린은 상이하고 매우 공지인 서브유닛 구조 및 3-차원 배치를 갖는다. 항체는 노출되어 있거나 독소(toxin), 방사성동위원소(radioisotope)와 같은 다른 분자와 접합될 수 있다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 이것이 결합하는 항원, 가령 CD37의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 일부 구체예에서, 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다. 상기 생물학적 활성은 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 심지어 100% 감소될 수 있다.
용어 "항-CD37 항체" 또는 "CD37에 결합하는 항체"는 충분한 친화성을 가지고 CD37에 결합할 수 있어서, CD37를 표적화하는데 진단제 및/또는 치료제로서 유용한 항체를 가리킨다. 항-CD37 항체가 관련없는, 비-CD37 단백질에 결합하는 정도는 예컨대, 방사면역분석법(radioimmunoassay, RIA)으로 측정한 CD37에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만일 수 있다. 특정 구체예에서, CD37에 결합하는 항체는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, 또는 ≤0.1 nM의 해리상수(dissociation constant, Kd)를 갖는다.
용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부분을 가리키며 온전한 항체의 항원 결정 가변 영역을 가리킨다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일 사슬 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"단클론성 항체"는 단일 항원 결정기, 또는 에피토프의 고도로 특이적인 인식 및 결합에 관여하는 동종 항체 집단을 가리킨다. 이는 전형적으로 상이한 항원 결정기에 대해 지향성인 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체와 대조적이다. 용어 "단클론성 항체"는 온전하고 전장 단클론성 항체는 물론이고 항체 단편(가령 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬 (scFv) 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다. 더욱이, "단클론성 항체"는 하이브리도마, 파지 선별(phage selection), 재조합 발현, 및 형질전환 동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 방식으로 만들어진 그러한 항체를 가리킨다.
용어 "인간화 항체"는 최소의 비-인간(예컨대, 쥐) 서열을 내포하는 특정 면역글로불린 사슬, 키메라 면역글로불린, 또는 이들의 단편인 비-인간(예컨대, 쥐) 항체의 형태를 가리킨다. 전형적으로, 인간화 항체는 상보성 결정 영역(complementary determining region, CDR)으로부터의 잔기가 바람직한 특이성, 친화성 및 능력을 가지는 비-인간 종(예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린이다(Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(framework region, FR) 잔기는 바람직한 특이성, 친화성 및 능력을 가지는 비-인간 종으로부터인 항체 내의 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 항체 특이성, 친화성, 및/또는 능력을 개선하고 최적화하기 위해 Fv 프레임워크 영역 내 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내의 추가적인 잔기의 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 면역글로불린에 상응하는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역을 내포하는 적어도 하나, 및 전형적으로 둘 또는 셋의 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이지만 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스(consensus) 서열에 해당한다. 인간화 항체는 또한 전형적으로 인간 면역글로불린에 해당하는 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc)을 포함할 수 있다. 인간화 항체를 생성하기 위해 사용된 방법의 예는 미국 특허 제5,225,539호에 기술되어 있다.
항체의 "가변 영역"은 단독이거나 조합된, 항체 경사슬의 가변 영역 또는 항체 중사슬의 가변 영역을 가리킨다. 중사슬 및 경사슬의 가변 영역은 각각 극변 영역(hypervariable region)으로도 공지인 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역(FR)으로 이루어진다. 각 사슬 내 CDR은 다른 사슬로부터의 CDR과 FR에 의해 아주 근접하게 연결되어, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 두 가지 기술이 존재한다: (1) 종간(cross-species) 서열 가변성을 기초로 한 접근법(즉, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구를 기초로 한 접근법(Al-lazikani et al (1997) J. Molec . Biol . 273:927-948)). 그 외에도, 이들 두 접근법의 조합이 일부 경우에 당해 분야에서 CDR을 측정하기 위해 사용된다.
가변 도메인 내 잔기를 지칭하는 경우(대략적으로 경사슬의 잔기 1-107 및 중사슬의 잔기 1-113)카밧식 번호부여 시스템(Kabat numbering system)이 일반적으로 사용된다(예를 들면, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
카밧식의 아미노산 위치 번호부여는 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)에서 항체의 모음의 중사슬 가변 도메인 또는 경사슬 가변 도메인에 대해 사용되는 번호부여 시스템을 가리킨다. 상기 번호부여 시스템을 사용하여, 실제의 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 축소 또는 삽입에 상응하는 더 적거나 추가적인 아미노산을 내포할 수 있다. 예를 들면, 중사슬 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤의 단일 아미노산 삽입체(insert)(카밧식에 따른 잔기 52a) 및 중사슬 FR 잔기 82 뒤의 삽입된 잔기(예컨대, 카밧식에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c, 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카밧식 번호부여는 소정의 항체에 대해서 "표준" 카밧 번호 서열과 항체 서열의 상동성 영역을 정렬시켜서 결정될 수 있다. 초티아(Chothia)식은 반면 구조적인 루프(loop)의 위치를 가리킨다(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). 카밧식 번호부여 방식을 이용하여 번호를 매길 경우 초티아 CDR-H1 루프의 말단은 루프의 길이에 따라 H32 및 H34 사이로 달라진다(이는 카밧식 번호부여 양식이 H35A 및 H35B에 삽입을 배치하기 때문이고; 35A 이나 35B이 부재할 경우, 상기 루프는 32에서 끝나며; 35A만이 존재하는 경우, 상기 루프는 33에서 끝나고; 35A 및 35B가 모두 존재하는 경우, 상기 루프는 34에서 끝난다). AbM 극변 영역이 카밧 CDR 및 초티아 구조 루프 간의 타협점을 제시하며, 옥스포드 분자 abM 항체 모델링 소프트웨어(Oxford Molecular's AbM antibody modeling software)를 통해 사용된다.
Figure 112012082667400-pct00001
용어 "인간 항체"는 인간에 의해 만들어진 항체 또는 당해 분야에 공지인 임의의 기술을 사용하여 만들어진, 인간에 의해 만들어진 항체에 상응하는 아미노산 서열을 가지는 항체를 의미한다. 인간 항체의 이러한 정의는 온전한 또는 전장 항체, 이의 단편, 및/또는 예를 들면, 쥐의 경사슬 및 인간 중사슬 폴리펩티드를 포함하는 항체와 같은 적어도 하나의 인간 중사슬 및/또는 경사슬 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다.
용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 두 개 이상의 종으로부터 유래된 항체를 가리킨다. 전형적으로, 경사슬 및 중사슬 모두의 가변 영역은 바람직한 특이성, 친화성, 및 능력을 가지는 포유류(예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 등) 중 한 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하는 동시에 불변 영역은 또다른 종(대개는 인간)에서의 면역 반응 유발을 방지하기 위해 상기 종으로부터 유래된 항체의 서열에 상동적이고, 이는 후자의 종에서의 면역 반응 유발을 방지하기 위함이다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 본 명세서에 상호교환적으로 사용되며 특정 항체가 인식하고 특정하게 결합할 수 있는 항원의 부분을 가리킨다. 상기 항원이 폴리펩티드인 경우, 에피토프는 단백질의 3차원 접힘(tertiary folding)에 의해 나란히 배치된 근접 아미노산 및 비-근접 아미노산 모두로부터 형성될 수 있다. 근접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성시 유지되는 반면, 3차원 접힘으로 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성시 사라진다. 에피토프는 독특한 입체적 구성으로된 아미노산을 전형적으로 적어도 3개, 더욱 일반적으로는, 적어도 5 또는 8-10개 포함한다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자의 단일 결합 부위(예컨대, 항체) 및 이의 이의 결합 상대(예컨대, 항원) 사이의 비공유적 상호작용의 총 합의 강도를 가리킨다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된, "결합 친화성"은 결합쌍의 구성원(예컨대, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화성을 가리킨다. 상대 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수(Kd)로 표현될 수 있다. 친화성은 본 명세서에 기술된 것을 비롯하여 당해분야에 공지인 일반적인 방법으로 측정될 수 있다. 저-친화성 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 쉽게 분해되는 경향을 갖는 반면, 고-친화성 항체는 일반적으로 항원에 더 빠르게 결합하고 결합을 더 오래 유지하는 경향을 갖는다. 결합 친화성을 측정하는 다양한 방법이 당해 분야에 공지이며, 이들 중 임의의 하나가 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 특정한 예시적 구체예가 하기에 기술된다.
결합 친화성을 가리키기 위해 "또는 그 이상"이 본 명세서에 사용된 경우는 분자 및 이의 결합 상대 사이의 더 강한 결합을 가리킨다. 더 강한 결합을 가리키기 위해 "또는 그 이상"이 본 명세서에 사용된 경우는 더 적은 수치의 Kd 값으로 표현된, 더 강한 결합을 가리킨다. 예를 들면, 항원에 대해 "0.6 nM 또는 그 이상"의 친화성을 가지는 항체에서, 항원에 대한 항체의 친화성은 <0.6 nM, 즉, 0.59 nM, 0.58 nM, 0.57 nM 등이거나 0.6 nM 미만인 임의의 값이다.
"특이적으로 결합함"은 일반적으로 항체가 에피토프에 이의 항원 결합 도메인을 통해 결합하며, 상기 결합이 항원 결합 도메인 및 에피토프 사이에 일부의 상보성(complementarity)을 수반함을 의미한다. 상기 정의에 따르면, 항체는 무작위의, 관련없는 에피토프에 결합하는 것보다 한 에피토프에 더욱 쉽게 이의 항원 결합 도메인을 통해 결합하는 경우, 상기 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 지칭된다. 용어 "특이성"은 본 명세서에서 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적인 친화성을 수식하기 위해 사용된다. 예를 들면, 항체 "A"는 소정의 에피토프에 대해 항체 "B"보다 더 높은 특이성을 가지는 것으로 간주될 수 있거나 항체 "A"는 연관된 에피토프 "D"에 대한 것보다 에피토프 "C"에 더 높은 특이성을 가지고 결합하는 것으로 지칭될 수 있다.
"우선적으로 결합함"은 항체가 이것이 연관된, 유사한, 상동 또는 유사체 에피토프에 결합할 때보다 더 쉽게 한 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 따라서, 소정의 에피토프에 "우선적으로 결합"하는 항체는 심지어 그러한 항체가 연관된 에피토프와 교차-반응할 수 있음에도 불구하고 연관된 에피토프 보다 상기 에피토프에 더 쉽게 결합할 것이다.
항체는 기준 항체가 에피토프에 결합하는 것을 일부 정도까지 차단하는 정도로 상기 에피토프에 우선적으로 결합하는 경우, 기준항체가 소정의 에피토프에 결합하는 것을 "경쟁적으로 억제"한다고 지칭된다. 경쟁적 억제는 당해 분야에 공지인 임의의 방법, 예를 들면, 경쟁 ELISA 분석에 의해 측정될 수 있다. 항체는 소정의 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%로 경쟁적으로 억제하는 것으로 지칭될 수 있다.
본 명세서에 사용된 문구 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은 두 가지 수치 값 사이에 충분히 높은 정도의 유사성(일반적으로 하나는 본 발명의 항체와 관련되고 다른 하나는 기준/비교자(comparator) 항체와 관련됨)을 의미하며 그래서 당해 분야의 숙련가는 두 가지 값 사이의 차이를 상기 값(예컨대, Kd 값)으로 측정된 생물학적 특성의 맥락내에서 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 없거나 없는 것으로 간주할 것이다. 상기 두 값 사이의 차이는 기준/비교기 항체에 대한 수치의 함수로서 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 또는 약 10% 미만일 수 있다.
"분리된" 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태인 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 분리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 더 이상 자연에서 발견되지 않는 형태인 정도까지 정제된 것들을 포함한다. 일부 구체예에서, 분리된 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
본 명세서에 사용된 "실질적으로 순수함"은 적어도 50% 순수(즉, 오염물질이 없음), 적어도 90% 순수, 적어도 95% 순수, 적어도 98% 순수, 또는 적어도 99% 순수한 물질을 가리킨다.
본 명세서에 사용된 용어 "면역접합체" 또는 "접합체"는 세포 결합제에 연결된 화합물 또는 이의 유도체(즉, 항-CD37 항체 또는 이의 단편)를 가리키고 다음의 일반식으로 정의된다: C-L-A, 여기서 C = 세포독소(cytotoxin), L = 연결기, 및 A = 세포 결합제 또는 항-CD37 항체 또는 항체 단편. 면역접합체는 또한 역순으로 된 일반식: A-L-C로 정의될 수 있다.
"연결기"는 화합물, 일반적으로는 메이탄시노이드와 같은 약물을 항 CD37 항체 또는 이의 단편과 같은 세포-결합제에 안정한, 공유적인 방식으로 연결시킬 수 있는 임의의 화학적 모이어티이다. 연결기는 화합물 또는 항체가 활성으로 남는 조건하에서 산-유도성 분해, 광-유도성 분해, 펩티다제-유도성 분해, 에스테라제-유도성 분해, 및 이황화결합 분해에, 취약하거나 실질적으로 저항성일 수 있다. 적절한 연결기가 당해 분야에 공지이고 예를 들면, 이황화 기, 티오에스테르 기, 산분해성(acid labile) 기, 광분해성(photolabile) 기, 펩티다제 분해성 기 및 에스테라제 분해성 기를 포함한다. 연결기는 또한 본 명세서에 기술되고 당해 분야에 공지인 바와 같이 하전된 연결기, 및 이의 친수성 형태를 포함한다.
용어 "암" 및 "암성(cancerous)"은 세포의 군집이 조절되지 않는 세포 성장으로 특징지어지는 포유류에서의 생리학적 조건을 가리키거나 기술한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "종양" 및 "신생물(neoplasm)"은 과도한 세포 성장 또는 증식으로 야기된, 전-암성(pre-cancerous) 병변을 비롯하여 양성(비-암성) 또는 악성(암성)인 하나 이상의 세포를 가리킨다. 치료 및/또는 예방될 수 있는 "암" 또는 "종양형성" 질병의 예는 NHL, 전구 B-세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙 B-세포 신생물을 비롯한 B-세포 림프종, 가령 B-세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구 림프종(SLL), B-세포 전림프구성 백혈병, 림프구형질구성 림프종, 외투 세포 림프종(MCL), 저-등급, 중간-등급 및 고-등급 FL을 비롯한 여포성 림프종 (FL), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B-세포 림프종(MALT형, 림프절 및 비장형), 모양 세포성 백혈병, 미만성 거대 B-세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질세포골수종, 이식후 림프세포증식 장애, 발덴스트롬 매크로글로불린혈증, 및 미분화 대세포 림프종(ALCL)을 포함한다.
용어 "암 세포", "종양 세포" 및 문법적 등가어는 종양 세포 집단의 벌크(bulk)를 포함하는 비-종양형성 세포, 및 종양형성 줄기 세포(암 줄기 세포)를 모두 포함하는 종양 또는 전-암성 병변에서 유래된 세포의 총 집단을 가리킨다. 본 명세서에 사용된 용어 "종양 세포"는 암 줄기 세포로부터 이들 종양 세포를 구분하기 위해 재생성 및 분화 능력이 결핍된 종양 세포만을 가리키는 경우 용어 "비-종양형성"에 의해 수식될 것이다.
용어 "개체"는 인간, 비-인간 영장류, 설치류, 등을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 특정 치료의 수용체가 되는 임의의 동물(예컨대, 포유류)을 가리킨다. 전형적으로, 용어 "개체" 및 "환자"는 인간 개체와 관련하여 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
하나 이상의 추가적인 치료제와의 "병용으로" 투여는 동시에(일시에 함께) 및 임의의 순서로 연속되는 투여를 포함한다.
용어 "약제학적 제형"은 활성 성분의 생물학적 활성을 효과적이도록 허용하고, 제형이 투여될 개체에게 허용될 수 없게 독성인 부가적인 성분을 함유하지 않는 형태인 조제물을 가리킨다. 제형은 무균제형일 수 있다.
본 명세서에 개시된 "유효량"의 항체는 특정하게 언급된 목적을 수행하기 위해 충분한 양이다. "유효량"은 언급된 목적과 관련하여 경험적으로 및 일상적 방식으로 결정될 수 있다.
용어 "치료적 유효량"은 개체 또는 포유류에서 질병 또는 장애를 "치료"하기에 효과적인 항체 또는 다른 약물의 양을 가리킨다. 암의 경우에, 약물의 치료적 유효량은 암 세포의 수를 감소; 종양 크기를 감소; 말초 기관으로의 암 세포의 침투를 억제(즉, 어느 정도로 늦추거나 멈춤); 종양 전이를 억제(즉, 어느 정도로 늦추거나 멈춤); 종양 성장을 일부 정도까지 억제; 및/또는 하나 이상의 암과 관련된 증상을 일부 정도까지 완화시킬 수 있다. 본 명세서의 "치료" 정의를 참조하라. 약물이 존재하는 암 세포 성장을 방지하고/또는 제거할 수 있는 정도까지, 약물은 세포억제성(cytostatic) 및/또는 세포독성(cytotoxic)일 수 있다. "예방적 유효량"은 필요한 투여량 및 시간에 있어서 바람직한 예방적 결과를 얻기 위해 효과적인 양을 가리킨다. 반드시 그렇지는 않지만 전형적으로는, 예방적 투여량이 질병의 전 또는 초기 단계에 개체에 사용되므로, 예방적 유효량은 치료적 유효량 보다 적을 것이다.
본 명세서에 사용된 경우 단어 "표지"는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 형성하는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 가리킨다. 표지는 그 자체로 검출가능(예컨대, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지)하거나, 효소 표지의 경우에는, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다.
"화학치료제"는 작용의 메커니즘과는 관계없이 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제는 예를 들면, 리툭시맙 및 시클로포스파미드와 같은 CD20의 길항제, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손, 플루다라빈, 에토포시드, 메토트렉세이트, 레날리도미드, 클로람부실, 벤타무스틴 및/또는 그러한 화학치료제의 변형된 버전을 포함한다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하는 것" 또는 "완화하는" 또는 "완화하는 것"과 같은 용어들은 1) 진단된 병리적 용태 또는 장애를 치유, 지연, 증상을 감소, 및/또는 진행을 중지하는 치료 수단 및 2) 표적하는 병리적 용태 또는 장애의 진행을 방지 및/또는 늦추는 예방 또는 방지 수단을 모두 가리킨다. 따라서, 치료를 필요로 하는 개체는 이미 장애를 가지는 개체; 장애를 가지기 쉬운 개체; 및 장애가 예방되어야 하는 개체를 포함한다. 특정 구체예에서, 환자가 다음 중 하나 이상을 보이는 경우 개체는 본 발명의 방법에 따라 암에 대해 성공적으로 "치료된"다: 암 세포 수의 감소 또는 완전한 부재; 종양 크기의 감소; 예를 들면, 연 조직 및 뼈로의 암의 퍼짐을 비롯한 말초 기관으로의 암 세포 침투의 억제 또는 부재; 종양 전이의 억제 또는 부재; 종양 성장의 억제 또는 부재; 특정 암과 연관된 하나 이상의 증상의 완화; 감소된 이환율(morbidity) 및 사망률(mortality); 삶의 질 향상; 종양의 종양형성성, 종양형성 빈도, 또는 종양형성 능력의 감소; 종양 내 암 줄기 세포의 수 및 빈도 감소; 종양형성 세포의 비-종양형성 상태로의 분화; 또는 효과의 일부 조합.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 가리키며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 중합체로 포함될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 이들의 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에의 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부가될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분이 끼어들어갈 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 가령 표지 성분의 접합으로 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은 예를 들면, "캡(cap)", 자연발생적인 뉴클레오티드 중 하나 이상이 유사체로 치환되는 것, 뉴클레오티드간 변형 가령, 예를 들면, 하전되지 않은 결합(예컨대, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트, 등.) 및 하전된 결합(예컨대, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 등)을 갖는 것, 예를 들면, 단백질(예컨대, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호전달 펩티드, ply-L-리신, 등)과 같은 펜던트(pendant) 모이어티를 함유하는 것, 인터컬레이터(intercalator)(예컨대, 아크리딘(acridine), 소랄렌(psoralen), 등)를 가지는 것, 킬레이트제(chelator)(예컨대, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속, 등)을 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 결합을 갖는 것(예컨대, 알파 아노머 핵산, 등), 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드(들)의 변형되지 않은 형태를 포함한다. 또한, 당에 원래 존재하는 임의의 히드록실 기는 예를 들면, 표준 보호기에 의해 보호된 포스포네이트 기, 포스페이트 기에 의해 대체되거나, 활성화되어 부가적인 뉴클레오티드에 부가적인 결합을 만들 수 있거나, 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 1 내지 20개 탄소 원자의 아민 또는 유기 캡핑기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실은 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들면, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머(epimeric) 당 가령 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스(lyxose), 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 아시클릭(acyclic) 유사체 및 비염기성 뉴클레오시드 유사체 가령 메틸 리보사이드를 포함하는, 일반적으로 당해 분야에 공지인 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당을 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 결합은 대안적인 연결기로 대체될 수 있다. 이들 대안적인 연결기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), "(O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈")로 대체된 구체예를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 여기서 각각의 R 또는 R'은 독립적으로 H이거나, 에테르(--O--) 결합, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄딜을 임의로 함유하는 치환되거나 치환되지 않은 알킬(1-20 C)이다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 전술된 설명은 RNA 및 DNA를 비롯하여 본 명세서에 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
용어 "벡터"는 관심이 되는 하나 이상의 유전자(들) 또는 서열(들)을 숙주 세포로 전달하거나 임의로 발현시킬 수 있는 구조체를 의미한다. 벡터의 예는 바이러스성 벡터, 노출된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파아지 벡터, 양이온성 축합제(condensing agent)와 연관된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜으로 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 생산자 세포(producer cell)와 같은 특정한 진핵 세포을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 가리키기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 간섭될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 간섭(intervention)에 의해; 예를 들면, 이황화 결합 형성, 글리코실화(glycosylation), 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 가령 표지 성분을 이용한 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 본 정의에 역시 포함되는 것은 예를 들면, 아미노산의 하나 이상의 유사체를 함유하는 폴리펩티드(예를 들면, 비천연 아미노산, 등을 포함), 뿐만 아니라 당해 분야에 공지인 다른 변형이다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체를 기초로 하기 때문에, 특정 구체예에서, 폴리펩티드가 단일 사슬 또는 연결된 사슬로 발생할 수 있음이 이해된다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 맥락에서 용어 "동일" 또는 "동일성" 백분율은 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 아미노산 치환은 고려하지 않고, 최대 대응도를 위해 (필요한 경우, 갭(gap)을 도입하여) 비교하고 정렬할 경우에, 동일하거나, 동일한 특정 백분율로 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 가지는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 가리킨다. 동일성 백분율은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 이용하여 또는 육안검사(visual inspection)에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 수득하기 위해 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어가 당해 분야에 공지이다. 서열 정렬 알고리즘의 그러한 한 비제한적 예는 Karlin et al, 1990, Proc . Natl. Acad . Sci ., 87:2264-2268에 기술된 알고리즘이며, Karlin et al., 1993, Proc. Natl . Acad . Sci ., 90:5873-5877에서 변형되고, NBLAST 및 XBLAST 프로그램(Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res ., 25:3389-3402)으로 포함된다. 특정 구체예에서, 갭처리 BLAST(Gapped BLAST)가 Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res . 25:3389-3402에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech사, 사우스 샌프란시스코, 캘리포니아) 또는 Megalign (DNASTAR)가 서열을 정렬하기 위해 사용될 수 있는 추가적으로 일반에서 입수가능한 소프트웨어 프로그램이다. 특정 구체예에서, 두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 백분율은 GCG 소프트웨어 내 GAP 프로그램을 이용하여 (예컨대, NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60 70, 또는 90의 갭 가중치(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치(length weight)를 이용하여) 측정한다. 특정한 대안적인 구체예에서, Needleman 및 Wunsch의 알고리즘(J. Mol . Biol . (48):444-453 (1970))을 포함하는 GCG 소프트웨어 패키지 내 GAP 프로그램이 두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율을 측정하기 위해 사용될 수 있다(예컨대, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5의 길이 가중치를 이용하여). 대안적으로, 특정 구체예에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은 Myers 및 Miller의 알고리즘(CABIOS, 4:11-17 (1989))을 이용하여 결정된다. 예를 들면, 동일성 백분율은 ALIGN 프로그램(버전 2.0)을 사용하고, 잔기표, 12의 갭 길이 페널티(penalty) 및 4의 갭 페널티를 가지는 PAM120를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 정렬 소프트웨어에 의한 최대 정렬을 위해 적절한 파라미터는 당업자의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트(default) 파라미터가 사용된다. 특정 구체예에서, 첫 번째 아미노산 서열 대 두 번째 서열 아미노산의 동일성 백분율 "X"는 100 x (Y/Z)로 계산되며, 여기서 Y는 첫 번째 및 두 번째 서열에서 동일 상대로서 확인된 아미노산 잔기의 수이고(육안검사 또는 특정한 서열 정렬 프로그램으로 배열함) Z는 두 번째 서열 내 잔기의 총 수이다. 첫 번째 서열의 길이가 두 번째 서열보다 길 경우, 첫 번째 서열 대 두 번째 서열의 동일성 백분율은 두 번째 서열 대 첫 번째 서열의 동일성 백분율보다 길 것이다.
비-제한적 예로서, 임의의 특정한 폴리뉴클레오티드가 기준 서열에 대해 특정 백분율의 서열 동일성을 가지는지 (예컨대, 적어도 80% 동일, 적어도 85% 동일, 적어도 90% 동일, 및 일부 구체예에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일) 여부는 특정 구체예에서, 베스트핏(Bestfit) 프로그램(위스콘신 서열분석 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package), Unix용 버전 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신 53711, 매디슨, 사이언스 드라이브 575, 유니버시티 리서치 파크)을 이용하여 결정될 수 있다. 베스트핏은 두 서열 사이의 상동성의 최고의 세그먼트(segment)를 찾기 위해 Smith 및 Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981)의 부분 상동성(local homology) 알고리즘을 사용한다. 특정한 서열이 본 발명에 따른 기준 서열과 예를 들면, 95% 동일한지 결정하기 위해 베스트핏 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하는 경우, 파라미터는 동일성 백분율이 기준 뉴클레오티드 서열의 전장 이상으로 산출되고, 기준 서열 내 뉴클레오티드의 총 수에서 최대 5%의 상동성은 갭이 허용되도록 설정된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 두 핵산 또는 폴리펩티드는 실질적으로 동일하여, 이들이 서열 비교 알고리즘을 이용하거나 육안 검사에 의해 측정되어, 최대의 대응을 위해 비교되고 정렬된 경우, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 및 일부 구체예에서는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는 것을 의미한다. 동일성은 적어도 약 10, 약 20, 약 40-60 잔기 길이 또는 그 사이의 임의의 정수값인 서열의 영역에 걸쳐 존재할 수 있고, 60-80 잔기보다 긴 영역, 예를 들면, 적어도 약 90-100 잔기에 걸칠 수 있고, 일부 구체예에서, 예를 들어 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역과 같은 서열은 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
"보존적 아미노산 치환"은 한 아미노산 잔기가 유사한 곁사슬을 갖는 또다른 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 곁사슬을 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당해 분야에 명시되어 있고, 염기성 곁사슬(예컨데, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 곁사슬(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 곁사슬(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 곁사슬(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 곁사슬(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 곁사슬(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 예를 들면, 티로신에 대한 페닐알라닌의 치환은 보존적 치환이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 항체의 서열 내의 보존적 치환은 항원(들), 즉, 폴리펩티드 또는 항체가 결합하는 CD37에 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드 또는 항체가 결합하는 것을 차단하지 않는다. 항원 결합을 제거하지 않고 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 식별하는 방법이 당해 분야에 공지이다(예컨대, Brummell et al., Biochem . 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:.412-417 (1997)을 참조).
본 개시 및 청구 범위에 사용된 바와 같은, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 명확하게 달리 명시되지 않는 한 복수 형태를 포함한다.
구체예가 표현 "포함하는"과 함께 본 명세서에 기술된 경우에는, "~로 이루어진" 및/또는 "~를 필수로 하여 이루어진"의 용어로 기술된 달리 유사한 구체예가 역시 제공되는 것으로 이해된다.
본 명세서의 "A 및/또는 B"와 같은 문구에서 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" 및 "B"를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, "A, B, 및/또는 C"와 같은 문구에서 사용된 용어 "및/또는"은 각각의 다음 구체예를 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
II . CD37 결합제
본 발명은 CD37에 특이적으로 결합하는 제제를 제공한다. 이들 제제는 본 명세서에서 "CD37 결합제"로 지칭된다. 인간, 마카크속 원숭이, 및 쥐 CD37에 대한 전장 아미노산 서열은 당해 분야에 공지이고 또한 각각 SEQ ID NOs:1-3에 의해 본 명세서에 제공된다.
인간 CD37:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLAYR (SEQ ID NO:1)
마카크속 원숭이 CD37:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVILGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGVFTMGLALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLQDIVEKTIQRYHTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHSPQDWFQVLTLRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGQLARSRHSTDICAVPANSHIYREGCARSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLRYR (SEQ ID NO:2)
쥐 CD37 (NP_031671):
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGGLIFCFGTWILIDKTSFVSFVGLSFVPLQTWSKVLAVSGVLTMALALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPFVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNIISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYDRLARYR (SEQ ID NO:3)
특정 구체예에서, CD37 결합제는 항체, 면역접합체 또는 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, CD37 결합제는 인간화 항체이다.
특정 구체예에서, CD37-결합제는 다음의 효과들 중 하나 이상을 가진다: 종양 세포의 증식 억제, 종양 내 암 줄기 세포의 빈도를 감소시킴으로서 종양의 종양형성성 감소, 종양 성장 억제, 생존 증가, 종양 세포의 세포사 촉발, 종양형성 세포를 비-종양형성 상태로 분화, 또는 종양 세포의 전이 방지.
특정 구체예에서, CD37-결합제는 보체 의존성 세포독성을 유발시킬 수 있다. 예를 들면, CD37-결합제를 이용한 세포의 처리는 세포 생존도를 처리안된 세포의 세포 생존도의 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만 또는 약 35% 미만으로 낮추는 CDC 활성을 야기할 수 있다. CD37-결합제를 이용한 세포의 처리는 또한 세포 생존도를 처리안된 세포의 세포 생존도의 약 70-80%, 약 60-70%, 약 50-60%, 약 40-50%, 또는 약 30-40%으로 낮추는 CDC 활성을 야기할 수 있다. 일부 특정한 구체예에서, CD37-결합제는 라모스 세포에서 보체 의존성 세포독성을 유발시킬 수 있다.
특정 구체예에서, CD37-결합제는 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC)을 유발시킬 수 있다. 예를 들면, CD37-결합제를 이용한 세포의 처리는 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%로 세포용해(cell lysis)를 일으키는 ADCC 활성을 야기할 수 있다. CD37-결합제를 이용한 세포의 처리는 약 10-20%, 약 20-30%, 약 30-40%, 또는 약 40-50%로 세포용해를 일으키는 ADCC 활성을 야기할 수 있다. CD37-결합제를 이용한 세포의 처리는 또한 약 10-50%, 약 20-50%, 약 30-50%, 또는 약 40-50%로 세포용해를 일으키는 ADCC 활성을 야기할 수 있다. 일부 특정한 구체예에서, CD37-결합제는 다우디, 라모스, 및/또는 그라나타(Granata)-519 세포에서 ADCC을 유발시킬 수 있다.
일부 구체예에서, CD37-결합제는 아폽토시스를 유발시킬 수 있다. 예를 들면, CD37-결합제를 이용한 세포의 처리는 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 55%의 세포에서 아폽토시스를 유발할 수 있다. 일부 특정한 구체예에서, CD37-결합제는 라모스 세포 및/또는 라지(Raji) 세포에서 아폽토시스를 유발시킬 수 있다.
일부 구체예에서, CD37-결합제는 종양 부피를 감소시킬 수 있다. 종양 부피를 감소시키는 CD37-결합제의 능력은 예를 들면, 처리된 개체의 중간 종양 부피를 대조 개체의 중간 종양 부피로 나눈 것인 %T/C 값을 측정하여 평가될 수 있다. 일부 구체예에서, CD37-결합제를 이용한 처리는 약 55% 미만, 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만인 %T/C 값을 야기할 수 있다. 일부 특정한 구체예에서, CD37-결합제는 BJAB 이종이식 모델 및/또는 SU-DHL-4 이종이식 모델에서 종양 크기를 감소시킬 수 있다.
특정 구체예에서, 인간 CD37에 특이적으로 결합하는 면역접합체 또는 다른 제제는 세포독성제를 통해 세포사를 촉발한다. 예를 들면, 특정 구체예에서, 인간 CD37 항체에 대한 항체는 종양 세포에서 활성화되는 메이탄시노이드에 접합되어 단백질 내재화에 의해 CD37을 발현한다. 특정한 대안적인 구체예에서, 제제 또는 항체는 접합되지 않는다.
특정 구체예에서, CD37-결합제는 종양 성장을 억제할 수 있다. 특정 구체예에서, CD37-결합제는 생체내(in vivo, 예컨대, 이종이식 마우스 모델 및/또는 암을 가진 인간에서) 종양 성장을 억제할 수 있다.
CD37-결합제는 CD37 항체 CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 및 CD37-57 및 이들의 단편, 변이체 및 유도체를 포함한다. CD37-결합제는 또한 다음으로 이루어진 군에서 선택된 항체 CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 및 CD37-57과 동일한 CD37 에피토프에 특이적으로 결합하는 CD37-결합제를 포함한다. CD37-결합제는 또한 다음으로 이루어진 군에서 선택된 항체 CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 및 CD37-57를 경쟁적으로 억제하는 CD37-결합제를 포함한다.
일부 특정한 구체예에서, CD37-결합제의 CD37로의 결합은 인간 CD37 아미노산 109-138을 필요로 하지 않는다. 따라서, 일부 CD37-결합제는 SEQ ID NO:180의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 다른 구체예에서, CD37-결합제의 CD37로의 결합은 인간 CD37 아미노산 202-243의 돌연변이에 의해 차단된다. 따라서, 일부 CD37-결합제는 SEQ ID NO:184의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합하지 않는다.
일부 구체예에서, CD37-결합제는 SEQ ID NO:180의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:183의 폴리펩티드에 결합하지만, SEQ ID NO:184의 폴리펩티드에 결합하지 않는다.
일부 구체예에서, CD37-결합제는 SEQ ID NO:190의 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구체예에서, CD37-결합제는 SEQ ID NO:190의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:189의 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구체예에서, CD37-결합제는 SEQ ID NO:190의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:188의 폴리펩티드에 결합한다.
일부 구체예에서, CD37-결합제는 SEQ ID NO:192의 폴리펩티드에 결합하지만, SEQ ID NO:194의 폴리펩티드에 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, CD37-결합제는 SEQ ID NO:193의 폴리펩티드에 결합하지만, SEQ ID NO:194의 폴리펩티드에는 결합하지 않는다.
특정 CD37-결합제가 결합하는 CD37 펩티드 단편은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 200-243, SEQ ID NO:1의 아미노산 202-220, 또는 SEQ ID NO:1의 아미노산 221-243을 포함하거나, 이들을 필수로 하여 구성되거나 또는 이들로 이루어진 CD37 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, CD37-결합제는 SEQ ID NO:1의 아미노산 202-243을 포함하는 인간 CD37 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, CD37-결합제의 CD37로의 결합은 SEQ ID NO:1의 아미노산 202-243을 필요로 한다. 일부 구체예에서, CD37-결합제의 CD37로의 결합은 SEQ ID NO:1의 아미노산 200-220을 필요로 한다. 일부 구체예에서, CD37-결합제의 CD37로의 결합은 SEQ ID NO:1의 아미노산 221-243을 필요로 한다.
CD37-결합제는 또한 CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 또는 CD37-57의 중사슬 및 경사슬 CDR 서열을 포함하는CD37-결합제를 포함한다. CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 및 CD37-57의 중사슬 및 경사슬 CDR은 연관된 서열을 내포한다. 그러므로, CD-37 결합제는 또한 CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 및 CD37-57의 정렬에 의해 얻어지는 컨센서스 서열을 포함하는 중사슬 및 경사슬 CDR 서열을 포함할 수 있다. CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 및 CD37-57의 CDR 서열, 뿐만 아니라 CD37-38, CD37-50, CD37-51, CD37-56 및 CD37-57의 컨센서스 서열은 하기의 표 1 및 표 2에 기술된다.
[표 1]
가변 중사슬 CDR 아미노산 서열
Figure 112012082667400-pct00002
[표 2]
가변 경사슬 CDR 아미노산 서열
Figure 112012082667400-pct00003
CD37 결합 분자는 CDR당 최대 4(즉 0, 1, 2, 3, 또는 4)개의 보존적 아미노산 치환을 가지는 CD37-3, CD37-12, CD37-50, CD37-51, CD37-56, 또는 CD37-57의 CDR을 포함하는 CD37에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.
폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 개별적인 가변 경사슬 또는 가변 중사슬 중 하나를 포함한다. 항체 및 폴리펩티드는 또한 가변 경사슬 및 가변 중사슬 둘 다를 포함할 수 있다. 쥐, 키메라 및 인간화 CD37-3, CD37-12, CD37-50, CD37-51, CD37-56 및 CD37-57 항체의 가변 경사슬 및 가변 중사슬 서열이 하기의 표 3 및 표 4에 제공된다.
[표 3]
가변 중사슬 아미노산 서열
Figure 112013057895372-pct00074
삭제
[표 4]
가변 경사슬 아미노산 서열
Figure 112013057895372-pct00075
삭제
또한 제공된 것은 다음을 포함하는 폴리펩티드이다: (a) SEQ ID NOs:55-71에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드; 및/또는 (b) SEQ ID NOs:72-87에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NOs:55-87에 대해 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 (a) SEQ ID NOs:55-71에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드, 및/또는 (b) SEQ ID NOs:72-87에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 (a) SEQ ID NOs:55-71의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및/또는 (b) SEQ ID NOs:72-87의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 CD37에 특이적으로 결합하는 항체 및/또는 폴리펩티드이다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 CD37에 특이적으로 결합하는 쥐, 키메라 또는 인간화 항체이다. 특정 구체예에서, SEQ ID NOs:55-87에 대해 특정 백분율의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드는 단지 보존적 아미노산 치환에 의해서만 SEQ ID NOs:55-87와 상이하다.
폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 개별적인 경사슬 또는 중사슬 중 하나를 포함할 수 있다. 항체 및 폴리펩티드는 또한 경사슬 및 중사슬을 둘 다 포함할 수 있다. 쥐, 키메라 및 인간화 CD37-3, CD37-12, CD37-50, CD37-51, CD37-56 및 CD37-57 항체의 경사슬 및 가변 사슬 서열이 하기의 표 5 및 표 6에 제공된다.
[표 5]
전장 중사슬 아미노산 서열
Figure 112012082667400-pct00006
Figure 112012082667400-pct00007
Figure 112012082667400-pct00008
[표 6]
전장 경사슬 아미노산 서열
Figure 112012082667400-pct00009
Figure 112012082667400-pct00010
또한 제공된 것은 다음을 포함하는 폴리펩티드이다: (a) SEQ ID NOs:88-104에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드; 및/또는 (b) SEQ ID NOs:105-120에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NOs:88-120에 대해 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 (a) SEQ ID NOs:88-104에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드, 및/또는 (b) SEQ ID NOs:105-120에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 (a) SEQ ID NOs:88-104의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및/또는 (b) SEQ ID NOs:105-120의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 CD37에 특이적으로 결합하는 항체 및/또는 폴리펩티드이다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 CD37에 특이적으로 결합하는 쥐, 키메라 또는 인간화 항체이다. 특정 구체예에서, SEQ ID NOs:88-120에 대해 특정 백분율의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드는 단지 보존적 아미노산 치환에 의해서만 SEQ ID NOs:88-120와 상이하다.
특정 구체예에서, CD37 항체는 2010년 2월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10664, 2010년 2월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10665, 2010년 2월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10666, 2010년 2월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10667, 2010년 2월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10668, 2010년 2월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10669 및 2010년 2월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10670(ATCC, 미국 버지니아 20110, 마나사스, 유니버시티 불리바드 10801)으로 이루어진 군에서 선택된 하이브리도마로부터 생산된 항체일 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 PTA-10665, PTA-10666, PTA-10667, PTA-10668, PTA-10669 및 PTA-10670로 이루어진 군에서 선택된 하이브리도마로부터 생산된 항체의 VH-CDR 및 VL-CDRS를 포함한다.
특정 구체예에서, CD37 항체는 재조합 플라스미드 DNA phuCD37-3LC(2010년 3월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10722)에 의해 암호화된 경사슬을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, CD37 항체는 재조합 플라스미드 DNA phuCD37-3HCv.1.0 (2010년 3월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10723)에 의해 암호화된 중사슬을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, CD37 항체는 재조합 플라스미드 DNA phuCD37-3LC(PTA-10722)에 의해 암호화된 경사슬 및 재조합 플라스미드 DNA phuCD37-3HCv.1.0 (PTA-10723)에 의해 암호화된 중사슬을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, CD37 항체는 재조합 플라스미드 DNA phuCD37-3LC (PTA-10722)에 의해 암호화된 VL-CDR 및 재조합 플라스미드 DNA phuCD37-3HCv.1.0 (PTA-10723)에 의해 암호화된VH-CDR을 포함할 수 있다.
단클론성 항체는 Kohler 및 Milstein저 (1975) Nature 256:495에 기술된 것과 같은 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법을 이용하여, 마우스, 햄스터, 또는 다른 적절한 숙주 동물을 상기 기술된 바와 같이 면역화하여 면역대상 항원에 특이적으로 결합하게 될 항체의, 림프구에 의한 생산을 유도한다. 림프구는 또한 시험관 내(in vitro)에서 면역화될 수 있다. 면역화 후에, 림프구는 분리되고 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 적절한 골수종 세포주와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성하고, 상기 세포는 이후 융합안된 림프구 및 골수종 세포로부터 분리될 수 있다. 면역침강법, 면역블로팅법에 의해, 또는 시험관 내( in vitro ) 결합 분석(예컨대 방사면역분석법(RIA); 효소-결합 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA))에 의해 측정된 바와 같이 선택된 항원을 특이적으로 지향하는 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마는 이후 표준 방법을 이용한 시험관 내( in vitro ) 배양 (Goding저, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) 또는 동물 내 복수종양(ascites tumor)과 같이 생체 내( in vivo)에서 번식시킬 수 있다. 단클론성 항체는 이후 상기에서 다클론성 항체에 대해 기술된 바와 같이 배양 배지 또는 복수로부터 정제될 수 있다.
대안적으로 단클론성 항체는 또한 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 바와 같이 재조합 DNA 방법을 이용하여 만들어질 수 있다. 단클론성 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 가령 항체의 중사슬 및 경사슬을 암호화하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 RT-PCR에 의해, 성숙 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터 분리되며 이들의 서열은 통상적 절차를 이용하여 결정된다. 중사슬 및 경사슬을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 이후 적절한 발현 벡터로 클로닝되며, 이를 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 E. coli 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염시킨 경우, 단클론성 항체가 숙주 세포에 의해 생산된다. 또한, 바람직한 종의 재조합 단클론성 항체 또는 이의 단편은 바람직한 종의 CDR을 발현하는 파아지 전시 라이브러리(display library)로부터 기술되는 바와 같이 분리될 수 있다(McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; 및 Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).
단클론성 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(들)은 추가로 재조합 DNA 기술을 사용하여 대안적인 항체를 생성하는 많은 상이한 방식으로 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 예를 들면, 마우스 단클론성 항체의 경사슬 및 중사슬의 불면 도메인은 1) 예를 들면, 인간 항체의 이들 영역으로 치환되어 키메라 항체를 생성하거나 2) 비-면역글로불린 폴리펩티드로 치환되어 융합 항체를 생성할 수 있다. 일부 구체예에서, 불변 영역은 절단 또는 제거되어 단클론성 항체의 바람직한 항체 단편을 생성한다. 가변 영역의 위치-지정(site-directed) 또는 고밀도(high-density) 돌연변이유도(mutagenesis)가 단클론성 항체의 특이성, 친화성, 등을 최적화하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 인간 CD37에 대한 단클론성 항체는 인간화 항체이다. 특정 구체예에서, 그러한 항체는 치료적으로 사용되어 인간 개체에 투여할 경우 항원성 및 HAMA(인간 항-마우스 항체) 반응을 감소시킨다. 인간화 항체는 당해 분야에 공지인 다양한 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 특정한 대안적인 구체예에서, CD37에 대한 항체는 인간 항체이다.
인간 항체는 당해 분야에 공지인 다양한 기술을 이용하여 직접 제조할 수 있다. 시험관 내(in vitro)에서 면역화되거나 면역화된 개인으로부터 분리된, 표적 항원에 대해 지향성인 항체를 생산하는 불멸화된(immortalized) 인간 B 림프구가 생성될 수 있다(예컨대, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; 및 미국 특허 제5,750,373호를 참조). 또한, 인간 항체는 파아지 라이브러리로부터 선택될 수 있고, 여기서 상기 파아지 라이브러리는 예를 들면, Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314, Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162, Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381, 및 Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581)에 기술된 바와 같이 인간 항체를 발현한다. 항체 파아지 라이브러리를 생성하기 위한 기술 및 용도가 또한 미국 특허 제5,969,108호, 제6,172,197호, 제5,885,793호, 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호; 제6,593,081호; 제6,300,064호; 제6,653,068호; 제6,706,484호; 및 제7,264,963호; 및 Rothe et al., 2007, J. Mol. Bio., doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018에 기술된다(상기 각각은 전체로서 참고문헌으로 포함된다). 친화성 증대(affinity maturation) 전략 및 사슬 셔플링(chain shuffling) 전략(Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783, 전체로서 참고문헌으로 포함됨)은 당해분야에 공지이며 고친화성 인간 항체를 생성하기 위해 이용될 수 있다.
인간화 항체는 또한 면역화시킬 경우 내생적 면역글로불린 생산의 부재에서 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 인간 면역글로불린 부위(loci)를 포함하는 형질전환 마우스에서 만들어질 수 있다. 상기 접근법은 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 CD37를 특이적으로 인식하는 이특이성 항체를 포함한다. 이특이성 항체는 적어도 두 개의 상이한 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있는 항체이다. 상이한 에피토프는 동일한 분자 내에 있거나(예컨대 동일한 CD37) 상이한 분자에 있을 수 있어서, 예를 들면, 항체가 CD37뿐만 아니라, 예를 들면, 1) T-세포 수용체(예컨대 CD3) 또는 Fc 수용체(예컨대 CD64, CD32, 또는 CD16)와 같은 백혈구 상의 효과기 분자 또는 2) 하기에 상세하게 기술되는 세포독성제를 모두 특이적으로 인식하고 결합할 수 있다.
예시적인 이특이성 항체는 둘 중 적어도 하나가 본 발명의 폴리펩티드에서 기인한, 두 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 면역글로불린 분자의 항-항원성 가지(arm)는 T 세포 수용체 분자(예컨대 CD2, CD3, CD28, 또는 B7) 또는 IgG을 위한 Fc 수용체와 같은 백혈구 상의 촉발(triggering) 분자에 결합하는 가지와 조합될 수 있어서 세포 방어 메커니즘을 특정 항원을 발현하는 세포에 집중시킬 수 있다. 이특이성 항체는 또한 세포독성제를 특정 항원을 발현하는 세포에 지향하도록 사용될 수 있다. 이들 항체는 항원-결합 가지 및 세포독성제 또는 방사성핵종(radionuclide) 킬레이트제, 가령 EOTUBE, DPTA, DOTA, 또는 TETA에 결합하는 가지를 가진다. 이특이성 항체를 만들기 위한 방법은 당해 분야에 알려져 있다(Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121:120; Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368; 및 미국 특허 제5,731,168호). 둘 이상의 결합가(valency)를 가지는 항체가 또한 포함된다. 예를 들면, 삼특이성 항체가 제조될 수 있다(Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)). 따라서, 특정 구체예에서 CD37에 대한 항체는 다중특이성이다.
특정 구체예에서 예를 들면, 종양 침입을 증가시키기 위한 항체 단편이 제공된다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 공지이다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질가수분해를 통해 유래된다(예를 들면 Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; Brennan et al., 1985, Science, 229:81). 특정 구체예에서, 항체 단편은 재조합으로 제조된다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 E. coli 또는 다른 숙주 세포에서 발현되고 분비될 수 있고, 따라서 다량의 이들 단편의 생산을 가능하게 한다. 그러한 항체 단편은 또한 상기 논의된 항체 파아지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 항체 단편은 또한 예를 들면 미국 특허 제5,641,870호에 기술된 선형 항체일 수 있고, 일특이성 또는 이특이성일 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술이 숙련된 기술자에게 명백할 것이다.
본 발명에 따르면, 기술은 CD37에 특이적인 단일-사슬 항체의 제조를 위해 개조될 수 있다(미국 특허 제4,946,778호를 참조). 또한, 방법은 Fab 발현 라이브러리의 구성을 위해 개조될 수 있어(Huse, et al., Science 246:1275-1281 (1989)) CD37 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 동종체에 대한 바람직한 특이성을 가지는 단클론성 Fab 단편의 빠르고 효과적인 판별을 가능하게 한다. 항체 단편은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당해 분야의 기술에 의해 제조될 수 있다: (a) 항체 분자의 펩신 분해에 의해 제조된 F(ab')2 단편; (b) F(ab')2 단편의 이황화 연결의 환원으로 생성된 Fab 단편, (c) 항체 분자가 파페인(papain) 및 환원제로 처리되어 생성된 Fab 단편, 및 (d) Fv 단편.
추가로, 특히 항체 단편의 경우에, 혈청 반감기를 늘리기 위해 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어, 항체 단편 내 적절한 영역을 돌연변이시켜 재생 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프를 항체 단편에 포함시키거나, 상기 에피토프를 펩티드 태그(tag)에 포함시키고 이를 이후 항체 단편에 말단 또는 중간부에 융합시켜(예컨대, DNA 또는 펩티드 합성에 의해) 성취될 수 있다.
이종접합체 항체가 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 이종접합체 항체는 두 개의 공유적으로 연결된 항체로 이루어진다. 그러한 항체는 예를 들면, 면역 세포가 원치않는 세포를 표적화하도록 하기 위해 제안되었다(미국 특허 제4,676,980호). 항체가 가교결합제의 포함을 비롯하여 합성 단백질 화학에서 공지인 방법을 이용하여 시험관 내(in vitro)에서 제조될 수 있는 점이 포함된다. 예를 들면, 면역독소(immunotoxin)는 이황화 교환반응을 사용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 구성될 수 있다. 상기 목적을 위해 적절한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, 변형된 항체가 인간 CD37의 폴리펩티드를 가지는 항체와의 연결을 가능하게 하는 임의 유형의 가변 영역을 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 상기 측면에서, 가변 영역은 원하는 종양 연결 항원에 대한 체액성 반응을 증가시키고 면역글로불린을 생성하도록 유도될 수 있는 임의 유형의 포유류를 포함하거나 이로부터 유래될 수 있다. 그러므로, 변형된 항체의 가변 영역은 예를 들면, 인간, 쥐, 비-인간 영장류(예컨대 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey), 마카크속 원숭이, 등) 또는 이리(lupine)과의 것일 수 있다. 일부 구체예에서 변형된 면역글로불린의 가변 및 불변 영역은 모두 인간의 것이다. 다른 구체예에서 양립할 수 있는(compatible) 항체의 가변 영역(일반적으로 비-인간 출처에서 유래)은 유전자조작되거나 분자의 결합특성을 개선하거나 면역원성을 감소시키도록 특정하게 맞춤화될 수 있다. 이런 관점에서, 본 발명에서 유용한 가변 영역은 인간화되거나 다르게는 외래 아미노산 서열의 도입을 통해 변형될 수 있다.
특정 구체예에서, 중사슬 및 경사슬 모두에서 가변 도메인은 하나 이상의 CDR의 적어도 부분적인 치환에 의해 및, 필요한 경우, 부분적인 프레임워크 영역 치환 및 서열 변화에 의해 변형된다. CDR은 프레임워크 영역이 유래된 항체와 동일한 부류 또는 하위 부류의 항체로부터 유래될 수 있지만, CDR이 상이한 부류의 항체 및 가능하게는 상이한 종의 항체로부터 유래될 것이 예상된다. 한 가변 도메인의 항원 결합 능력을 또다른 도메인에 전달하기 위해 반드시 모든 CDR을 공여체 가변 영역으로부터의 완전한 CDR로 대체할 필요는 없다. 오히려, 일부 경우에는 항원 결합 부위의 활성을 유지하기에 필요한 잔기만 전달하는 것이 필요하다. 미국 특허 제5,585,089호, 제5,693,761호 및 제5,693,762호에 제시된 설명을 볼 때, 일상적 실험의 수행 또는 검사 및 오류 검사를 통해 감소된 면역원성을 가지는 기능적 항체를 얻는 것은 당연하게 당해 분야의 숙련가의 능력에 속할 것이다.
가변 영역에의 변형에도 불구하고, 본 발명의 변형된 항체는 적어도 일부의 하나 이상의 불변 영역 도메인이 결실되었거나 다르게는 변형되어 있어서 자연의 또는 변형되지 않은 불변 영역을 포함하는 대략 동일한 면역원성의 항체와 비교할 때, 증가된 종양 국소화(localization) 또는 감소된 혈청 반감기와 같은 바람직한 생화학적 특성을 제공하는 항체(예컨대, 전장 항체 또는 이의 면역반응성 단편)를 포함할 것임을 당해 분야의 숙련가는 이해할 것이다. 일부 구체예에서, 변형된 항체의 불변 영역은 인간의 불변 영역을 포함할 것이다. 본 발명과 양립가능한 불변 영역의 변형은 하나 이상의 도메인에서 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다. 즉, 본 명세서에 개시된 변형된 항체는 세 가지 중사슬 불변 도메인(CH1, CH2 또는 CH3) 중 하나 이상 및/또는 경사슬 불변 도메인(CL)의 변형 또는 변경을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 도메인이 부분적으로 또는 전부 결실된 변형된 불변 영역이 포함된다. 일부 구체예에서, 변형된 항체는 도메인이 결실된 구조체 또는 전체 CH2 도메인이 제거된 변이체(△CH2 구조체)를 포함할 것이다. 일부 구체예에서, 제거된 불변 영역 도메인은 부재된 불변 영역에 의해 전형적으로 부여되던 분자 유연성을 일부 제공하는 짧은 아미노산 스페이서(spacer)(예컨대 10 잔기)에 의해 치환될 것이다.
이들의 배치 외에도, 불변 영역이 몇몇 효과기 기능을 매개함이 당해 분야에 공지이다. 예를 들면, 보체의 C1 성분과 항체의 결합은 보체 시스템을 활성화한다. 보체의 활성화는 옵소닌작용(opsonisation) 및 세포 병원체의 용해에서 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 촉진하고 자가면역 과민반응(autoimmune hypersensitivity)에도 관여할 수 있다. 또한, 항체는 Fc 영역을 통해, 항체 Fc 영역상의 Fc 수용체 부위가 세포상의 Fc 수용체(FcR)에 결합되어 세포에 결합한다. IgG(감마 수용체), IgE(에타 수용체), IgA(알파 수용체) 및 IgM(뮤 수용체)를 비롯한 상이한 부류의 항체에 대해 특이적인 수많은 Fc 수용체가 존재한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 포식작용(engulfment) 및 항체-코팅된 입자의 파괴, 면역 복합체의 제거, 살해세포(killer cell)에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해(항체-의존성 세포-매개 세포독성, 또는 ADCC로 지칭됨), 염증 매개물질의 방출, 태반 전달 및 면역글로불린 생산의 제어를 포함하는 수많은 중요하고 다양한 생물학적 반응들을 촉발한다.
특정 구체예에서, CD37-결합 항체는 다시, 투여된 항체의 생물학적 프로파일에 영향을 주는 변형된 효과기 기능을 제공한다. 예를 들면, 불변 영역 도메인의 결실 또는 (점 돌연변이 또는 다른 수단을 통한) 비활성화는 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시키고 이를 통해 종양 국소화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우에, 본 발명과 일치하는 불변 영역 변형은 보체 결합을 조정하고 따라서 혈청 반감기 및 접합된 세포독소의 비특이적 결합을 감소시킬 수 있다. 그러나 불변 영역의 다른 변형이 이황화 결합 또는 올리고당 모이어티를 제거하기 위해 사용될 수 있고 이는 증가된 항원 특이성 또는 항체 유연성으로 인해 개선된 국소화를 가능하게 한다. 유사하게, 본 발명에 따른 불변 영역의 변형은 매우 공지인 생화학적 또는 숙련된 기술자의 이해 범위내에 있는 분자공학 기술을 이용하여 쉽게 만들어질 수 있다.
특정 구체예에서, CD37-결합제는 하나 이상의 효과기 기능을 갖지 않는 항체이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 항체는 어떠한 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC) 활성 및/또는 어떠한 보체-의존성 세포독성(CDC) 활성도 가지지 않는다. 특정 구체예에서, 항체는 Fc 수용체 및/또는 보체 인자에 결합하지 않는다. 특정 구체예에서, 항체는 어떠한 효과기 기능도 가지지 않는다.
특정 구체예에서, 변형된 항체는 CH3 도메인을 개별적인 변형된 항체의 경첩영역(hinge region)에 직접 융합하기 위해 유전자조작될 수 있음이 주목될 것이다. 다른 구조체에서 펩티드 스페이서를 경첩영역 및 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 양립가능한 구조체가 발현될 수 있고 여기서 CH2 도메인은 결실되어 있고 잔여(변형되거나 변형되지 않은) CH3 도메인은 경첩영역에 5-20개 아미노산 스페이서로 연결되어 있다. 그러한 스페이서가 예를 들면 불변 도메인의 조절 요소가 유리 상태로 남아 접근가능한 것 또는 경첩영역이 유연하게 남는 것을 보장하기 위해 첨가될 수 있다. 그러나, 아미노산 스페이서가 일부 경우에 면역원성인 것으로 드러나고 구조체에 대해 원치 않는 면역 반응을 도출할 수 있는 점에 유의해야 한다. 따라서, 특정 구체예에서, 구조체에 첨가된 임의의 스페이서는 변형된 항체의 바람직한 생화학적 성질을 유지하기 위해 비교적 비-면역원성이거나, 심지어 모두 제거될 것이다.
전체 불변 영역 도메인의 결실 외에도, 본 발명의 항체가 몇몇의 또는 심지어 단일 아미노산의 부분적인 결실 또는 치환에 의해 제공될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들면, CH2 도메인의 선택된 부분 내의 단일 아미노산의 돌연변이가 실질적으로 Fc 결합을 감소시키고 이를 통해 종양 국소화를 증가시키기 충분할 수 있다. 유사하게, 효과기 기능(예컨대 보체 CLQ 결합)이 조절되도록 제어하는 하나 이상의 불변 영역 도메인 중 일부를 단순히 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 불변 영역의 그러한 부분적인 결실은 항체의 선택된 특성(혈청 반감기)을 개선할 수 있는 반면 주요 불변 영역 도메인과 연관된 다른 바람직한 기능은 온전하게 유지할 수 있다. 더욱이, 상기에서 시사한 바와 같이, 개시된 항체의 불변 영역은 수득되는 구조체의 프로파일을 향상시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 변형될 수 있다. 이러한 관점에서 보존된 결합 부위(예컨대 Fc 결합)에 의해 제공되는 활성을 저해하는 것을 가능하게 하면서, 실질적으로 변형된 항체의 배치 및 면역원성 프로파일을 유지할 수 있다. 특정 구체예는 효과기 기능의 감소 또는 증가와 같은 바람직한 특성을 개선하기 위해 또는 더 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공하기 위해 불변 영역에 하나 이상의 아미노산을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 그러한 구체예에서 선택된 불변 영역 도메인에서 유래한 특정 서열을 삽입하거나 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 추가로 본 명세서에 제시된 키메라, 인간화 및 인간 항체, 또는 이들의 항체 단편에 실질적으로 상동성인 변이체 또는 등가물을 포함한다. 이들은 예를 들면, 보존적 치환 돌연변이, 즉 유사한 아미노산에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들면, 보존적 치환은 아미노산을 동일한 일반 부류에 속한 또다른 아미노산으로, 가령, 예를 들면, 하나의 산성 아미노산을 또다른 산성 아미노산으로, 하나의 염기성 아미노산을 또다른 염기성 아미노산으로 또는 하나의 중성 아미노산을 또다른 중성 아미노산으로 치환하는 것을 가리킨다. 보존적 아미노산 치환에 대한 것은 당해 분야에 매우 공지이다.
본 발명의 폴리펩티드는 인간 CD37에 대한 항체, 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드, 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 일부 아미노산 서열이 단백질의 구조 또는 기능에 중요한 영향을 끼치지 않고 달라질 수 있음을 당해 분야에서 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 추가로 CD37 단백질에 대해 상당한 활성을 나타내거나 항체, 또는 이의 단편의 영역을 포함하는 다양한 폴리펩티드를 포함한다. 그러한 돌연변이는 결실, 삽입, 역위, 반복, 및 유형 치환을 포함한다.
폴리펩티드 및 유사체는 추가로 일반적으로는 단백질의 일부가 아닌 추가적인 화학적 모이어티를 포함하도록 변형될 수 있다. 이들 유도된 모이어티는 용해성, 생물학적 반감기 또는 단백질의 흡수를 개선할 수 있다. 이들 모이어티는 또한 단백질 등의 임의의 바람직한 부수효과를 감소시키거나 제거할 수 있다. 이들 모이어티에 대한 개요는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)에서 찾을 수 있다.
본 명세서에 기술된 분리된 폴리펩티드는 당해 분야에 공지인 임의의 적절한 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러한 방법은 직접적인 단백질 합성 방법에서부터 분리된 폴리펩티드 서열을 암호화하는 DNA 서열을 구성하고 적절한 형질전환된 숙주에서 이들 서열을 발현시키는 것에 이른다. 일부 구체예에서, DNA 서열은 재조합 기술을 이용하여 관심의 야생형 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 분리하거나 합성하여 구성된다. 임의적으로, 서열은 부위-특이적 돌연변이에 의해 돌연변이 유발되어 이의 기능적 유사체를 제공할 수 있다. 예컨대 Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) 및 미국 특허 제4,588,585호를 참조하라.
일부 구체예에서 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 화학적 합성에 의해 올리고뉴클레오티드 합성장치를 이용하여 구성될 것이다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 바람직한 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 관심의 재조합 폴리펩티드가 제조될 숙주 세포에서 선호되는 이들 코돈(codon)의 선택을 기초로 설계될 수 있다. 관심의 분리된 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하기 위해 표준 방법이 적용될 수 있다. 예를 들면, 역-번역된(back-translated) 유전자를 구성하기 위해 완전한 아미노산 서열이 사용될 수 있다. 추가로, 특정한 분리된 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 올리고머가 합성될 수 있다. 예를 들면, 바람직한 폴리펩티드의 부분들을 암호화하는 여러 개의 작은 올리고뉴클레오티드가 합성되고 이후 연결될 수 있다. 개별적인 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 조립을 위한 5' 또는 3' 오버행(overhang)을 포함한다.
일단 조립되면(합성, 위치-지정 돌연변이 또는 또다른 방법을 통함), 관심의 특정한 분리된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터에 삽입될 것이며 바람직한 숙주에서 단백질의 발현을 위해 적절한 발현 제어 서열에 유효하게 연결된다. 적절한 조립은 적절한 숙주에서 뉴클레오티드 서열분석(sequencing), 제한지도작성법(restriction mapping), 및 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 발현에 의해 확인될 수 있다. 당해 분야에 매우 공지인 바와 같이, 숙주 내 형질감염된 유전자의 높은 발현 수준을 얻기 위해, 상기 유전자는 선택된 발현 숙주에서 기능을 갖는 전사 및 번역 발현 제어 서열에 유효하게 연결되어야만 한다.
특정 구체예에서, 인간 CD37에 대한 항체, 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA를 증폭하고 발현하기 위해 재조합 발현 벡터가 사용된다. 재조합 발현 벡터는 포유류, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자에서 유래된 적절한 전사 또는 번역 조절 요소에 유효하게 연결된, 항-CD37 항체, 또는 이의 단편의 폴리펩티드 사슬을 암호화하는 합성 또는 cDNA-유래 DNA 단편을 가지는 복제가능한 DNA 구조체이다. 전사 단위체는 일반적으로 하기에 상세하게 기술되는 (1) 유전자 발현에 조절 역할을 가지는 유전적 요소 또는 요소들, 예를 들면, 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조 또는 암호화 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종료 서열의 조립체를 포함한다. 그러한 조절 요소는 전사를 제어하기 위한 오퍼레이터(operator) 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로 복제개시점(origin of replication)에 의해 부여되는 숙주에서 복제하는 능력, 및 형질전환체의 인식을 촉진하기 위한 선별 유전자(selection gene)가 추가적으로 포함될 수 있다. DNA 영역은 이들이 기능적으로 서로 연관되어 있는 경우 유효하게 연결된다. 예를 들면, 신호 펩티드(분비 선도(leader))를 위한 DNA는 이것이 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전구체로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 관한 DNA에 유효하게 연결되고; 프로모터는 이것이 서열의 전사를 제어하는 경우 암호화 서열에 유효하게 연결되고; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 허용하도록 배치되는 경우 암호화 서열에 유효하게 연결된다. 효모 발현 시스템에서 사용하기 위해 의도된 구조적 요소는 숙주 세포에 의해 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 선도 서열을 포함한다. 대안적으로, 재조합 단백질이 선도 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우, 이는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 상기 잔기는 임의로 이후에 발현된 재조합 단백질로부터 절단되어 최종 생성물을 제공할 수 있다.
발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 의존적일 것이다. 광범위한 발현 숙주/벡터 조합이 사용될 수 있다. 진핵 숙주를 위한 유용한 발현 벡터는 예를 들면, SV40의 발현 제어 서열, 소유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 거대세포바이러스(cytomegalovirus)를 포함하는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주를 위한 유용한 발현 벡터는 공지의 박테리아 플라스미드, 가령 pCR 1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체를 비롯한 대장균(Esherichia coli)의 플라스미드, 더 넓은 범위의 숙주 플라스미드, 가령 M13 및 섬유상(filamentous) 단일-가닥(single-stranded) DNA 파아지를 포함한다.
CD37-결합 폴리펩티드 또는 항체(또는 항원으로서 사용을 위한 CD37 단백질)의 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 곤충 또는 적절한 프로모터의 제어하에 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵생물은 그람음성 또는 그람양성 생물, 예를 들면 E. coli 또는 bacilli를 포함한다. 고등 진핵 세포는 하기에 기술되는 포유류 기원의 공인된 세포주를 포함한다. 무세포(Cell-free) 번역 시스템이 또한 사용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모, 및 포유류 세포 숙주와 함께 사용하기 위해 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 Pouwels 등에 의해 기술되며(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985), 이의 연관된 개시들은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다. 항체 생산을 비롯한 단백질 생산의 방법에 관한 추가적인 정보는 예컨대, 미국 공개 공보 제2008/0187954호, 미국 특허 제6,413,746호 및 제6,660,501호, 및 국제특허공보 제WO 04009823호에서 찾을 수 있고, 상기 각각은 본 명세서에 전체로서 참고 문헌으로 포함된다.
다양한 포유류 또는 곤충 세포 배양 시스템이 또한 재조합 단백질을 발현하는데 유리하게 이용된다. 포유류 세포에서 재조합 단백질의 발현은 이들 단백질이 일반적으로 정확하게 접히기 때문에, 적절히 변형되고 완전히 기능성으로 수행될 수 있다. 적절한 포유류 숙주 세포주의 예는 Gluzman(Cell 23:175, 1981)에 기술된 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주를 포함하며, 적절한 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주는 예를 들면, L 세포, C127, 3T3, 중국 햄스터 난소(CHO), HeLa 및 BHK 세포주를 포함한다. 포유류 발현 벡터는 비전사 요소 가령 복제개시점, 발현되어야 하는 유전자에 연결된 적절한 프로모터 및 인핸서, 및 다른 5' 또는 3' 인접하는(flanking) 비전사 서열, 및 5' 또는 3' 비번역 서열, 가령 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스(splice) 공여 및 수용 부위, 및 전사 종료 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서 이형 단백질을 생산하기 위한 바큐로바이러스(Baculovirus) 시스템이 Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)에서 검토되어 있다.
형질전환된 숙주에 의해 생산된 단백질은 임의의 적절한 방법에 따라 정제될 수 있다. 그러한 표준 방법은 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화성 및 사이징(sizing) 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해성(differential solubility), 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술을 포함한다. 헥사히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코팅 서열 및 글루타티온-S-전이효소와 같은 친화성 태그가 단백질에 부착되어 적절한 친화성 컬럼의 통과에 의해 쉽게 정제되도록 할 수 있다. 분리된 단백질은 또한 단백질가수분해(proteolysis), 핵자기공명 및 x-선 결정분석과 같은 기술을 이용하여 물리적으로 규명될 수 있다.
예를 들면, 재조합 단백질을 배양 배지로 분비하는 시스템으로부터의 상청액(supernatant)을 먼저 시판되는 단백질 농축 여과기, 예를 들면, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 농축할 수 있다. 농축 단계 후에, 농축물을 적절한 정제 매트릭스에 가할 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 수지, 예를 들면, 펜던트(pendant) 디에틸아미노에틸(diethylaminoethyl, DEAE) 기를 가지는 매트릭스 또는 기질이 사용될 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로오스 또는 단백질 정제에서 흔히 사용되는 다른 유형일 수 있다. 대안적으로, 양이온 교환 단계가 사용될 수 있다. 적절한 양이온 교환체는 설포프로필 또는 카르복시메틸 기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스를 포함한다. 마지막으로, 소수성 RP-HPLC 배지, 예컨대, 펜던트 메틸 또는 다른 지방족 기를 가지는 실리카겔을 이용하는 하나 이상의 역상고성능액체크로마토그래피(reversed-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC) 단계가 추가로 CD37-결합제를 정제하기 위해 사용될 수 있다. 전술한 정제 단계들 중 일부 또는 전부가, 다양한 조합으로, 또한 동종의 재조합 단백질을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
박테리아 배양으로 생산된 재조합 단백질은 예를 들면, 먼저 세포 펠렛으로부터의 추출, 그 후에 농축, 염석(salting-out), 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 중 하나 이상의 단계를 통해 분리될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 최종 정제 단계를 위해 사용될 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 사용하기 위한 미생물 세포는 동결-융해 사이클링(freeze-thaw cycling), 초음파처리(sonication), 기계적 분쇄, 또는 세포 용해제의 사용을 비롯한 임의의 통상적인 방법에 의해 분쇄될 수 있다.
항체 및 기타 단백질을 정제하기 위한 당해 분야에 공지인 방법은 또한 예를 들면, 미국 공개공보 제2008/0312425호, 제2008/0177048호, 및 제2009/0187005호에 기술된 것을 포함하며, 상기 각각은 본 명세서에 전체로서 참고 문헌으로 포함된다.
특정 구체예에서, CD37-결합제는 항체가 아닌 폴리펩티드이다. 높은 친화성을 가지고 단백질 표적에 결합하는 비-항체 폴리펩티드를 동정하고 생산하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에 공지이다. 예컨대, Skerra, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304 (2007), Hosse et al., Protein Science, 15:14-27 (2006), Gill et al., Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658 (2006), Nygren, FEBS J., 275:2668-76 (2008), 및 Skerra, FEBS J., 275:2677-83 (2008)를 참조, 상기 각각은 본 명세서에 전체로서 참고 문헌으로 포함된다. 특정 구체예에서, 파아지 전시 기술이 CD37-결합 폴리펩티드를 동정/생산하기 위해 사용되었다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 단백질 A, 리포칼린, 피브로넥틴 도메인, 안키린(ankyrin) 컨센서스 반복도메인, 및 티오레독신으로 이루어진 군에서 선택되는 유형의 단백질 골격(scaffold)을 포함한다.
일부 구체예에서, 제제는 비-단백질 분자이다. 특정 구체예에서, 제제는 소형 분자이다. 비-단백질 CD37-결합제의 동정에 유용한 조합화학 라이브러리 및 기술이 당해 분야의 숙련가에게 공지이다. 예컨대, Kennedy et al., J. Comb. Chem, 10:345-354 (2008), Dolle et al, J. Comb. Chem., 9:855-902 (2007), 및 Bhattacharyya, Curr. Med. Chem., 8:1383-404 (2001)을 참조, 상기 각각은 본 명세서에 전체로서 참고 문헌으로 포함된다. 특정한 추가적인 구체예에서, 제제는 탄수화물, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan), 당단백질, 또는 프로테오글리칸(proteoglycan)이다.
특정 구체예에서, 제제는 핵산 앱타머(aptamer)이다. 앱타머는 또다른 분자에 결합하는 이들의 능력을 기초로 (예컨대, 랜덤 또는 돌연변이체 풀(pool)로부터) 선택된 폴리뉴클레오티드 분자이다. 일부 구체예에서, 앱타머는 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정한 대안적인 구체예에서, 앱타머는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구체예에서, 앱타머는 하나 이상의 변형된 핵산 잔기를 포함한다. 단백질에 결합하기 위한 핵산 앱타머를 생성하고 선별하는 방법은 당해 분야에 매우 공지이다. 예컨대, 미국 특허 제5,270,163호, 미국 특허 제5,683,867호, 미국 특허 제5,763,595호, 미국 특허 제6,344,321호, 미국 특허 제7,368,236호, 미국 특허 제5,582,981호, 미국 특허 제5,756,291호, 미국 특허 제5,840,867호, 미국 특허 제7,312,325호, 미국 특허 제7,329,742, 국제 공개 공보 WO 02/077262, 국제 공개 공보 WO 03/070984, 미국 특허 출원 공개 공보 제2005/0239134호, 미국 특허 출원 공개 공보 제2005/0124565호, 및 미국 특허 출원 공개 공보 제2008/0227735호를 참조, 상기 각각은 본 명세서에 전체로서 참고 문헌으로 포함된다.
III .면역접합체
본 발명은 또한 약물 또는 전구약물에 연결되거나 접합된, 항-CD37 항체, 항체 단편, 및 본 명세서에 개시된 이들의 기능적 균등물(functional equivalent)을 포함하는 접합체(또한 본 명세서에서 면역접합체로서 지칭됨)에 관한 것이다. 적절한 약물 또는 전구약물은 당해 분야에 공지이다. 약물 또는 전구약물은 세포독성제일 수 있다. 본 발명의 세포독성 접합체에서 사용되는 세포독성제는 세포의 사멸을 야기하거나, 세포사를 유발하거나, 일부 방식으로 세포 생존도를 감소시키는 임의의 화합물 일 수 있으며, 예를 들면, 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체를 포함한다. 다른 적절한 세포독성제는 예를 들면 벤조디아제핀, 탁소이드, CC-1065 및 CC-1065 유사체, 듀오카르마이신 및 듀오카르마이신 유사체, 엔다이인(enediyne) 가령 아우리스타틴, 토메이마이신 유도체, 렙토마이신 유도체, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 카르보플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실 및 모르폴리노 독소루비신을 비롯한 칼리키아미신, 돌라스타틴 및 돌라스타틴 유사체이다.
그러한 접합체는 약물 또는 전구약물을 항체 또는 기능적 균등물에 연결하기 위해 연결기를 사용하여 제조될 수 있다. 적절한 연결기는 당해 분야에 매우 공지이며 예를 들면, 이황화물 기, 티오에테르 기, 산분해성 기, 광분해성 기, 펩티다제 분해성 기 및 에스테라제 분해성 기를 포함한다.
약물 또는 전구약물은 예를 들면, 항-CD37 항체 또는 이의 단편에 이황화 결합을 통해 연결될 수 있다. 연결기 분자 또는 가교결합제는 항-CD37 항체 또는 이의 단편과 반응할 수 있는 반응성 화학기를 포함한다. 세포-결합제와의 반응을 위한 반응성 화학기는 N-석신이미딜 에스테르 및 N-설포석신이미딜 에스테르일 수 있다. 추가적으로 연결기 분자는 반응성 화학기를 포함하며, 이는 약물과 반응하여 이황화 결합을 형성할 수 있는 디티오피리딜 기일 수 있다. 연결기 분자는 예를 들면, N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP)(예컨대, Carlsson et al., Biochem. J., 173: 723-737 (1978)를 참조), N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부타노에이트(SPDB) (예컨대, 미국 특허 제4,563,304호를 참조), N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)2-설포부타노에이트 (설포-SPDB)(미국 공개공보 제20090274713호를 참조), N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오) 펜타노에이트(SPP)(예컨대, CAS 등록번호 제341498-08-6호를 참조), 2-이미노티올란, 또는 아세틸석신산 무수물을 포함한다. 예를 들면, 항체 또는세포 결합제는 가교결합 시약으로 변형될 수 있고 이에 따라 유래된 유리 또는 보호된 티올기를 함유하는 항체 또는세포 결합제는 이후 이황화물- 또는 티올-함유 메이탄시노이드와 반응하여 접합체를 생성한다. 접합체는 HPLC, 크기-배제, 흡착, 이온 교환 및 친화성 포획, 투석 또는 접선 유동 여과(tangential flow filtration)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에서, 항-CD37 항체는 세포독성 약물에 이황화 결합 및 폴리에틸렌 글리콜 스페이서를 통해 연결되어 면역접합체의 효력, 용해성 또는 효능을 강화한다. 그러한 절단성 친수성 연결기는 WO2009/0134976에 기술되어 있다. 이러한 연결기 설계의 추가적인 이익은 바람직한 높은 단량체 비율 및 최소의 항체-약물 접합체의 응집이다. 본 양태에 특별히 포함되는 것은 2-8개의 범위의 좁은 약물 로드를 가지는 폴리에틸렌 글리콜 스페이서((CH2CH2O)n=1-14)를 내포하는 이황화 기(-S-S-)를 통해 연결된 세포-결합제 및 약물의 접합체이고 암 세포에 대해 비교적으로 높은 효력의 생물학적 활성을 보이며 높은 접합을 수득하는 바람직한 생화학적 특성 및 최소의 단백질 응집과 함께 높은 단량체 비율을 가지는 것으로 기술된다.
본 양태에 특별히 포함되는 것은 화학식(I)의 항-CD37 항체 약물 접합체 또는 화학식 (I')의 접합체이다:
CB-[Xl-(-CH2-CH2O-)n-Y-D]m (I)
[D-Y-(-CH2-CH2O-)n-Xl]m-CB (I')
여기서:
CB는 항-CD37 항체 또는 단편을 나타내고;
D는 약물을 나타내고;
X는 세포-결합제에 티오에테르 결합, 아미드 결합, 카르바메이트 결합, 또는 에테르 결합을 통해 부착된 지방족, 방향족 또는 헤테로시클릭 단위체를 나타내고;
Y는 이황화 결합을 통해 약물에 부착된 지방족, 방향족 또는 헤테로시클릭 단위체를 나타내고;
l는 0 또는 1이고;
m은 2 내지 8중의 한 정수이고; 및
n은 1 내지 24중의 한 정수이다.
일부 구체예에서, m은 2 내지 6중의 한 정수이다.
일부 구체예에서, m은 3 내지 5중의 한 정수이다.
일부 구체예에서, n은 2 내지 8중의 한 정수이다. 대안적으로, 예를 들어, 미국 특허 제6,441,163호 및 제7,368,565호에 개시된 바와 같이, 약물은 세포-결합제와 반응하기에 적절한 반응성 에스테르를 도입하기 위해 먼저 변형될수 있다. 세포-결합제를 가지는 활성화 연결기 모이어티를 함유하는 이들 약물의 반응은 세포-결합제 약물 접합체을 생산하는 또다른 방법을 제공한다. 메이탄시노이드는 또한 예를 들면 미국 특허 제6,716,821호에 제시된 바와 같이 PEG 연결기를 이용하여 항-CD37 항체 또는 단편에 연결될 수 있다. 이들 PEG 비-절단성 연결기는 물 및 비-수성 용매 모두에 용해성이고, 하나 이상의 세포독성제를 세포 결합제에 연결하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 PEG 연결기는 세포독성제 및 세포 결합제와 연결기의 양쪽 말단에서 한쪽 말단에서는 작용성 설프히드릴 또는 이황화 기를 통해, 및 다른 말단에서는 활성 에스테르를 통해 반응하는 이종이작용성(heterobifunctional) PEG 연결기를 포함한다. PEG 연결기를 이용하여 세포독성 접합체를 합성하는 일반적인 예로서, 다시 본 명세서에 전체로서 참고 문헌으로 포함되는 미국 특허 제6,716,821호가 참고가 된다. 합성은 세포-결합제를 가지는 반응성 PEG 모이어티를 함유하는 하나 이상의 세포독성제의 반응으로 시작하며, 각각의 반응성 PEG 모이어티의 말단 활성 에스테르가 세포 결합제의 아미노산 잔기에 의해 변위되는 것을 야기하여, 세포 결합제에 PEG 연결기를 통해 공유적으로 결합된 하나 이상의 세포독성제를 포함하는 세포독성 접합체를 얻는다. 대안적으로, 세포 결합은 반응성 이황화 모이어티(가령 이황화피리딜)를 도입하기 위해 이작용성 PEG 가교결합제로 변형될 수 있고, 이는 이후 티올-함유 메이탄시노이드로 처리되어 접합체를 제공할 수 있다. 또다른 방법에서, 세포 결합은 티올 모이어티를 도입하기 위해 이작용성 PEG 가교결합제로 변형될 수 있고 이는 이후 반응성 이황화물-함유 메이탄시노이드(가령 이황화피리딜)로 처리되어 접합체를 제공할 수 있다.
비-절단성 연결을 가지는 항체-메이탄시노이드 접합체가 또한 제조될 수 있다. 그러한 가교결합제는 당해 분야에 기술되어 있으며(미국 공개공보 제20050169933호를 참조), N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 시클로헥산카르복실레이트(SMCC)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 항체는 1-10개의 반응성 기를 도입하기 위해 문헌에 기술된 바와 같이 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 설포-SMCC, 말레이미도벤조일-N-히드록시석신이미드 에스테르(MBS), 설포-MBS 또는 석신이미딜-아이오도아세테이트와 같은 가교결합 시약으로 변형된다(Yoshitake et al, Eur. J. Biochem., 101:395-399 (1979); Hashida et al, J. Applied Biochem., 56-63 (1984); 및 Liu et al, Biochem., 18:690-697 (1979)). 변형된 항체는 이후 티올-함유 메이탄시노이드 유도체와 반응하여 접합체를 생성한다. 접합체는 세파덱스(Sephadex) G25 컬럼을 통한 겔 여과(gel filtration) 또는 투석 또는 접선 유동 여과에 의해 정제될 수 있다. 변형된 항체는 티올-함유 메이탄시노이드(1 내지 2 몰당량/말레이미도 기)로 처리되고 항체-메이탄시노이드 접합체는 세파덱스 G-25 컬럼을 통한 겔 여과, 세라닉 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 컬럼에서 크로마토그래피, 투석 또는 접선 유동 여과 또는 이들 방법의 조합에 의해 정제된다. 전형적으로, 항체당 평균 1-10개 메이탄시노이드가 연결된다. 한 방법은 항체를 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)로 변형하여 말레이미도 기를 도입하고 이후 변형된 항체와 티올-함유 메이탄시노이드를 반응시켜 티오에테르-연결된 접합체를 제공하는 것이다. 다시 항체 분자 당 1 내지 10개 약물 분자를 가지는 접합체가 나온다. 항체, 항체 단편, 및 다른 단백질의 메이탄시노이드 접합체는 동일한 방식으로 만들어진다.
본 발명의 또다른 양태에서, CD37 항체는 PEG 스페이서의 중개를 통한 비-절단성 결합을 통해 약물에 연결된다. 약물 및 항-CD37 항체 또는 단편 사이에 연결기를 형성하는, 친수성 PEG 사슬을 포함하는 적절한 가교결합 시약이 당해 분야에 매우 공지이며, 또는 시판된다(예를 들면 오하이오 주, 포웰 소재 콴타바이오디자인(Quanta Biodesign)사 제품). 적절한 PEG-함유 가교결합제는 또한 시판되는 PEG 그 자체로부터 당해분야의 숙련가에게 공지인 표준 합성 화학 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 약물은 이작용성 PEG-함유 가교결합제와 반응하여 다음 화학식, Z-Xl-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D의 화합물을, 미국 공개공보 제20090274713호 및 WO2009/0134976에 상세하게 기술된 방법에 의해 제공할 수 있고, 상기 화합물은 이후 세포 결합제와 반응하여 접합체를 제공할 수 있다. 대안적으로, 세포 결합은 티올-반응성 기(가령 말레이미드 또는 할로아세트아미드)를 도입하기 위해 이작용성 PEG 가교결합제로 변형될 수 있고 이는 이후 티올-함유 메이탄시노이드로 처리되어 접합체를 제공할 수 있다. 또다른 방법에서, 세포 결합은 티올 모이어티를 도입하기 위해 이작용성 PEG 가교결합제로 변형될 수 있고 이는 이후 티올-반응성 메이탄시노이드(가령 메이탄시노이드 함유 말레이미드 또는 할로아세트아미드)로 처리되어 접합체를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또다른 양태는 화학식(II) 또는 화학식 (II')의 항-CD37 항체 약물 접합체이다:
CB-[Xl-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D]m (II)
[D-Yp-(-CH2-CH2-O-)n-Xl]m-CB (II')
여기서, CB는 항-CD37 항체 또는 단편을 나타내고;
D는 약물을 나타내고;
X는 티오에테르 결합, 아미드 결합, 카르바메이트 결합, 또는 에테르 결합을 통해 세포-결합제에 결합된 지방족, 방향족 또는 헤테로시클릭 단위체를 나타내고;
Y는 티오에테르 결합, 아미드 결합, 카르바메이트 결합, 에테르 결합, 아민 결합, 탄소-탄소 결합 및 히드라존 결합으로 이루어진 군에서 선택된 공유결합을 통해 약물에 결합된 지방족, 방향족, 또는 헤테로시클릭 단위체를 나타내고;
l는 0 또는 1이고;
p는 0 또는 1이고;
m은 2 내지 15 중의 한 정수이고; 및
n은 1 내지 2000 중의 한 정수이다.
일부 구체예에서, m은 2 내지 8중의 한 정수이고; 및
일부 구체예에서, n은 1 내지 24중의 한 정수이다.
일부 구체예에서, m은 2 내지 6중의 한 정수이다.
일부 구체예에서, m은 3 내지 5중의 한 정수이다.
일부 구체예에서, n은 2 내지 8 중의 한 정수이다. 적절한 PEG-함유 연결기의 예는 항-CD37 항체 또는 이의 단편과 반응하기 위한 N-석신이미딜 에스테르 또는 N-설포석신이미딜 에스테르 모이어티, 뿐만 아니라 화합물과 반응하기 위한 말레이미도- 또는 할로아세틸계 모이어티를 가지는 연결기를 포함한다. PEG 스페이서가 본 명세서에 기술된 방법을 통해 당해 분야에 공지인 임의의 가교결합제에 포함될 수 있다.
본 명세서에 개시된 많은 연결기는 미국 툭허 공개 공보 제20050169933호 및 제20090274713호, 및 WO2009/0134976에 상세하게 기술되어 있고; 상기 문헌의 내용은 전체로서 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.
본 발명은 약 2 내지 약 8개의 약물 분자("약물 로드"), 예를 들면, 메이탄시노이드가 항-CD37 항체 또는 이의 단편에 연결된 양태를 포함하며, 접합체의 항-종양 효과는 동일한 세포 결합제에 연결된 더 적거나 더 많은 수의 약물의 약물 로드와 비교할 때 훨씬 더욱 효과적이다. 본 명세서에 사용된 "약물 로드"는 세포 결합제(예컨대, 항-CD37 항체 또는 이의 단편)에 부착할 수 있는 약물 분자(예컨대, 메이탄시노이드)의 수를 가리킨다. 한 양태에서, 세포 결합제에 부착할 수 있는 약물 분자의 수는 평균 약 2 내지 약 8개(예컨대, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1)일 수 있다. N 2'-데아세틸-N 2'-(3-메르캅토-1-옥소프로필)-메이탄신(DM1) 및 N 2'-데아세틸-N2'-(4-메르캅토-4-메틸-1-옥소펜틸) 메이탄신(DM4)이 사용될 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 면역접합체는 항체당 1개의 메이탄시노이드를 포함한다. 또다른 양태에서, 면역접합체는 항체당 2개의 메이탄시노이드를 포함한다. 또다른 양태에서, 면역접합체는 항체당 3개의 메이탄시노이드를 포함한다. 또다른 양태에서, 면역접합체는 항체당 4개의 메이탄시노이드를 포함한다. 또다른 양태에서, 면역접합체는 항체당 5개의 메이탄시노이드를 포함한다. 또다른 양태에서, 면역접합체는 항체당 6개의 메이탄시노이드를 포함한다. 또다른 양태에서, 면역접합체는 항체당 7개의 메이탄시노이드를 포함한다. 또다른 양태에서, 면역접합체는 항체당 8개의 메이탄시노이드를 포함한다.
한 양태에서, 면역접합체는 항체당 약1 내지 약8개의 메이탄시노이드를 포함한다. 또다른 양태에서, 면역접합체는 항체당 약2 내지 약7개의 메이탄시노이드를 포함한다. 또다른 양태에서, 면역접합체는 항체당 약2 내지 약6개의 메이탄시노이드를 포함한다. 또다른 양태에서, 면역접합체는 항체당 약2 내지 약5개의 메이탄시노이드를 포함한다. 또다른 양태에서, 면역접합체는 항체당 약3 내지 약5개의 메이탄시노이드를 포함한다. 또다른 양태에서, 면역접합체는 항체당 약3 내지 약4개의 메이탄시노이드를 포함한다.
한 양태에서, 면역접합체를 포함하는 조성물은 항체당 평균 약 2 내지 약 8 (예컨대, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1)개로 부착된 약물 분자(예컨대, 메이탄시노이드)를 가진다. 한 양태에서, 면역접합체를 포함하는 조성물은 항체당 평균 약 1 내지 약 8개의 약물 분자(예컨대, 메이탄시노이드)를 가진다. 한 양태에서, 면역접합체를 포함하는 조성물은 항체당 평균 약 2 내지 약 7개의 약물 분자(예컨대, 메이탄시노이드)를 가진다. 한 양태에서, 면역접합체를 포함하는 조성물은 항체당 평균 약 2 내지 약 6개의 약물 분자(예컨대, 메이탄시노이드)를 가진다. 한 양태에서, 면역접합체를 포함하는 조성물은 항체당 평균 약 2 내지 약 5개의 약물 분자(예컨대, 메이탄시노이드)를 가진다. 한 양태에서, 면역접합체를 포함하는 조성물은 항체당 평균 약 3 내지 약 5개의 약물 분자(예컨대, 메이탄시노이드)를 가진다. 한 양태에서, 면역접합체를 포함하는 조성물은 항체당 평균 약 3 내지 약 4개의 약물 분자(예컨대, 메이탄시노이드)를 가진다.
한 양태에서, 면역접합체를 포함하는 조성물은 항체당 평균 약 2 ± 0.5, 약 3 ± 0.5, 약 4 ± 0.5, 약 5 ± 0.5, 약 6 ± 0.5, 약 7 ± 0.5, 또는 약 8 ± 0.5개로 부착된 약물 분자(예컨대, 메이탄시노이드)를 가진다. 한 양태에서, 면역접합체를 포함하는 조성물은 항체당 평균 약 3.5 ± 0.5개의 약물 분자(예컨대, 메이탄시노이드)를 가진다.
항-CD37 항체 또는 이의 단편은 이작용성 가교결합 시약과 항-CD37 항체 또는 이의 단편을 반응시켜 변형될 수 있고, 이를 통해 항-CD37 항체 또는 이의 단편에 연결기 분자의 공유적 부착을 야기한다. 본 명세서에 사용된, "이작용성 가교결합 시약"은 세포-결합제를 본 명세서에 기술된 약물과 같은 약물에 공유적으로 연결하는 임의의 화학적 모이어티이다. 또다른 방법에서, 일부의 연결 모이어티는 약물에 의해 제공된다. 이런 관점에서, 약물은 세포-결합제를 약물에 연결하는데 사용되는 더 큰 연결기 분자의 부분인 연결 모이어티를 포함한다. 예를 들면, 메이탄시노이드 DM1을 형성하기 위해, 메이탄신의 C-3 히드록실 기에서 유리 설프히드릴 기(SH)를 가지기 위해 곁사슬이 변형된다. 상기 티올레이트화 형태의 메이탄신은 변형된 세포-결합제와 반응하여 접합체를 형성할 수 있다. 그러므로, 최종 연결기는 하나는 가교결합 시약에 의해 제공되고, 그 반면 다른 하나는 DM1의 곁사슬에 의해 제공된 두 가지 성분으로 조립된다.
약물 분자는 또한 혈청 알부민과 같은 중개적 담체 분자를 통해 항체 분자에 연결될 수 있다.
본 명세서에 사용된, 표현 "세포-결합제에 연결된" 또는 "항-CD37 항체 또는 단편에 연결된"은 세포-결합제 항-CD37 항체 또는 단편에 적절한 연결기를 통해 결합된 적어도 하나의 약물 유도체, 또는 이의 전구체를 포함하는 접합체 분자를 가리킨다. 한 연결기는 SMCC이다.
특정 구체예에서, 본 발명에서 유용한 세포독성제는 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체이다. 적절한 메이탄시노이드의 예는 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체의 에스테르를 포함한다. 포함된 것은 미세소관 형성을 억제하고 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체와 같이 포유류 세포에 고도로 독성인 임의의 약물이다.
적절한 메이탄시놀 에스테르의 예는 변형된 방향족 고리를 가지는 것들 및 다른 위치에 변형을 가지는 것들을 포함한다. 그러한 적절한 메이탄시노이드는 미국 특허 제4,424,219호; 제4,256,746호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,362,663호; 제4,364,866호; 제4,450,254호; 제4,322,348호; 제4,371,533호; 제5,208,020호; 제5,416,064호; 제5,475,092호; 제5,585,499호; 제5,846,545호; 제6,333,410호; 제7,276,497호 및 제7,473,796호에 개시되어 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 면역접합체는 세포독성제로서 티올-함유 메이탄시노이드(DM1)를 이용하며, 정식 명칭은 N 2'-데아세틸-N 2'-(3-메르캅토-1-옥소프로필)-메이탄신이다. DM1은 다음의 구조식 (III)으로 표현된다:
Figure 112012082667400-pct00011
(III)
또다른 구체예에서, 본 발명의 접합체는 티올-함유 메이탄시노이드인 N 2'-데아세틸-N 2'(4-메틸-4-메르캅토-1- 옥소펜틸)-메이탄신(예컨대, DM4)를 세포독성제로서 이용한다. DM4는 다음의 구조식 (IV)로 표현된다:
Figure 112012082667400-pct00012
(IV)
입체장애성(sterically hindered) 티올 결합을 내포하는 곁사슬을 포함하는 또다른 메이탄시노이드는 N 2'-데아세틸-N-2'(4-메르캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신(DM3로 명명)이며, 다음의 구조식 (V)로 표현된다:
Figure 112012082667400-pct00013
(V)
미국 특허 제5,208,020호 및 제7,276,497호에 교시된 각각의 메이탄시노이드가 또한 본 발명의 접합체에서 사용될 수 있다. 이러한 관점에서, 제5,208,020호 및 제7,276,697호의 전체 개시는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다.
메이탄시노이드 상의 많은 위치들은 연결 모이어티를 화학적으로 연결하기 위한 위치로서 기능할 수 있다. 예를 들면, 히드록실 기를 가지는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록시로 변형된 C-15 위치 및 히드록시 기를 가지는 C-20 위치가 모두 유용할 것으로 예상된다. 일부 구체예에서, C-3 위치는 연결 모이어티를 화학적으로 연결하기 위한 위치로서 기능하며, 일부 특정한 구체예에서, 메이탄시놀의 C-3 위치는 연결 모이어티를 화학적으로 연결하기 위한 위치로서 기능한다.
일부 접합체의 구조적 표현이 하기에 나타난다:
Figure 112012082667400-pct00014
(VI)
Figure 112012082667400-pct00015
(VII)
Figure 112012082667400-pct00016
(VIII)
Figure 112012082667400-pct00017
(IX)
Figure 112012082667400-pct00018
(X)
Figure 112012082667400-pct00019
(XI)
Figure 112012082667400-pct00020
(XII)
Figure 112012082667400-pct00021
(XIII)
그러한 항체-메이탄시노이드 접합체를 생산하기 위한 몇몇 설명이 미국 특허 제6,333,410호, 제6,441,163호, 제6,716,821호, 및 제7,368,565호에 제공되며, 상기 각각은 전체로서 본 명세서에 포함된다.
일반적으로, 수성 완충액 내 항체의 용액은 반응성 기를 내포하는 이황화물 모이어티를 가지는 몰과량(molar excess)의 메이탄시노이드와 함께 배양할 수 있다. 반응 혼합물은 과량의 아민(가령 에타놀아민, 타우린, 등)을 부가하여 퀀칭(quenched)될 수 있다. 메이탄시노이드-항체 접합체는 이후 겔 여과에 의해 정제될 수 있다.
항체 분자당 결합되는 메이탄시노이드 분자의 수는 252 nm 및 280 nm에서 흡광도의 비율을 분광광학적으로(spectrophotometrically) 측정하여 결정될 수 있다. 메이탄시노이드 분자/항체의 평균수는 예를 들면, 약 1-10, 2-5, 3-4, 또는 약 3.5일 수 있다. 한 양태에서, 메이탄시노이드 분자/항체의 평균수는 약 3.5 ± 0.5이다.
안트라시클린(anthracycline) 화합물, 뿐만 아니라 유도체, 중간물 및 이들의 변형된 버전이 또한 항-CD37 면역접합체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 독소루비신, 독소루비신 유도체, 독소루비신 중간물, 및 변형된 독소루비신이 항-CD37 접합체에 사용될 수 있다. 예시적인 화합물이 WO 2010/009124에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 전체로서 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다. 그러한 화합물은 예를 들면, 다음 화학식의 화합물:
Figure 112012082667400-pct00022
여기서 R1은 수소 원자, 히드록시 또는 메톡시 기이고 R2는 C1-Cs 알콕시 기임, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
메이탄시노이드 또는 다른 약물을 가지는 항체의 접합체는 시험관 내(in vitro)에서 다양한 원치않는 세포주의 증식을 억제하는 이들의 능력에 대해 평가될 수 있다. 예를 들면, 인간 림프종 세포주 다우디 및 인간 림프종 세포주 라모스와 같은 세포주가 이들 화합물의 세포 독성을 측정하기 위해 쉽게 사용될 수 있다. 평가될 세포는 화합물에 4 내지 5 일간 노출되고 세포의 생존율이 공지의 방법에 의한 직접 분석으로 측정될 수 있다. 이후에 상기 분석의 결과로부터 IC50 값이 산출될 수 있다.
면역접합체는 본 명세서에 기술된 일부 구체예에 따르면 세포내로 내재화될 수 있다. 따라서 면역 접합체는 CD37-발현 세포에 의해 흡수되거나 내재화되는 경우 치료 효과를 발휘할 수 있다. 일부 특정한 구체예에서, 면역접합체는 세포독성제에 절단성 연결기를 통해 연결된 항체, 항체 단편, 또는 폴리펩티드를 포함하고, 세포독성제는 항체, 항체 단편, 또는 폴리펩티드로부터 절단되고, 여기서 CD37-발현 세포에 의해 내재화된다.
일부 구체예에서, 면역접합체는 종양 부피를 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 면역접합체를 이용한 처리는 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만인 %T/C 값을 도출한다. 일부 특정한 구체예에서, 면역접합체는 BJAB 이종이식 모델 및/또는 SU-DHL-4 이종이식 모델에서 종양 크기를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에서 siRNA 분자는 약물 대신에 본 발명의 항체에 연결될 수 있다. siRNA는 올리고뉴클레오티드의 변형을 위해 흔히 사용되는 방법에 의해 본 발명의 항체에 연결될 수 있다(예를 들면, 미국 특허공개공보 제20050107325호 및 제20070213292호를 참조). 따라서 3' 또는 5'-포스포라미디트 형태인 siRNA가 히드록실 관능기를 내포하는 가교결합제의 한쪽 말단과 반응하여 siRNA 및 가교결합제 사이에 에스테르 결합을 제공할 수 있다. 유사하게 말단 아미노 기를 내포하는 가교결합제와 siRNA 포스포라미디트의 반응이 siRNA에 아민을 통한 가교결합제의 결합을 야기한다. 대안적으로, siRNA는 표준 화학적 방법에 의해 유도체화되어 티올 기를 도입할 수 있다. 이러한 티올-함유 siRNA는 변형되어 활성 이황화물 또는 말레이미드 모이어티가 도입된 항체와 반응하여, 절단성 또는 비-절단성 접합체를 생성할 수 있다. 1-20개 사이의 siRNA 분자가 이러한 방법으로 항체에 연결될 수 있다.
III . 폴리뉴클레오티드
특정 구체예에서, 본 발명은 CD37에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 그러한 폴리펩티드의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 예를 들면, 본 발명은 인간 CD37에 대한 항체를 암호화하거나 그러한 항체의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA의 형태이거나 DNA의 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 유전체 DNA, 및 합성 DNA를 포함하며; 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있고, 단일 가닥일 경우에는 암호화 가닥 또는 비-암호화(안티-센스) 가닥일 수 있다.
특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 분리되어 있다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수하다.
본 발명은 SEQ ID NOs:4-120로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 추가로 하기의 표 7-10에 나타난 것 중에서 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
[표 7]
가변 중사슬 폴리뉴클레오티드 서열
Figure 112012082667400-pct00023
Figure 112012082667400-pct00024
Figure 112012082667400-pct00025
Figure 112012082667400-pct00026
[표 8]
가변 경사슬 폴리뉴클레오티드 서열
Figure 112012082667400-pct00027
Figure 112012082667400-pct00028
Figure 112012082667400-pct00029
[표 9]
전장 중사슬 폴리뉴클레오티드 서열
Figure 112012082667400-pct00030
Figure 112012082667400-pct00031
Figure 112012082667400-pct00032
Figure 112012082667400-pct00033
Figure 112012082667400-pct00034
Figure 112012082667400-pct00035
[표 10]
전장 경사슬 폴리뉴클레오티드 서열
Figure 112012082667400-pct00036
Figure 112012082667400-pct00037
Figure 112012082667400-pct00038
또한 제공된 것은 SEQ ID NOs:121-170에 대해 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드이다. 따라서, 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 (a) SEQ ID NOs:121-135 또는 152-161에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드, 및/또는 (b) SEQ ID NOs:136-151 또는 162-170에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 (a) SEQ ID NOs: 121-135 또는 152-161의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드; 및/또는 (b) SEQ ID NOs: 136-151 또는 162-170의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 재조합 플라스미드 DNA phuCD37-3LC (2010년 3월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10722)에 의해 암호화된 경사슬 또는 phuCD37-3LC (PTA-10722)에 의해 암호화된 경사슬에 대해 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%인 경사슬을 암호화한다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 재조합 플라스미드 DNA phuCD37-3HCv.1.0 (2010년 3월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10723)에 의해 암호화된 중사슬 또는 phuCD37-3HCv.1.0 (PTA-10723)에 의해 암호화된 중사슬에 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 동일한 중사슬을 암호화한다. 특정 구체예에서 폴리뉴클레오티드는 재조합 플라스미드 DNA phuCD37-3LC (PTA-10722) 또는 재조합 플라스미드 phuCD37-3HCv.1.0 (PTA-10723)이다.
특정 구체예에서 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 폴리펩티드의 발현 및 분비를 보조하는 폴리뉴클레오티드과 동일한 해독틀(reading frame) 내에 융합된 성숙 폴리펩티드를 위한 암호화 서열을 포함한다(예컨대 세포에서 폴리펩티드의 수송을 제어하기 위한 분비 서열로서 기능하는 선도 서열). 선도 서열을 가지는 폴리펩티드는 전구단백질이며 숙주 세포에 의해 절단되어 성숙 형태의 폴리펩티드를 형성하는 선도 서열을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 성숙 단백질에 부가적인 5' 아미노산 잔기가 더해진 전구단백질을 암호화할 수 있다. 전구서열을 가지는 성숙 단백질은 전구단백질이고 단백질의 비활성 형태이다. 일단 전구서열이 절단되면 활성 성숙 단백질이 남는다.
특정 구체예에서 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 암호화된 폴리펩티드의 정제를 가능하게 하는 표지자 서열과 동일한 해독틀 내에 융합된 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 표지자 서열은 박테리아 숙주의 경우에 pQE-9 벡터에 의해 공급되는, 성숙 폴리펩티드의 정제를 위해 제공되는 표지자에 융합된 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 포유류 숙주(예컨대 COS-7 세포) 가 사용되는 경우 표지자 서열은 인플루엔자 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 단백질로부터 유래한 헤마글루티닌 태그일 수 있다.
본 발명은 추가로 예를 들면, 단편, 유사체, 및 유도체를 암호화하는 상기에 전술된 폴리뉴클레오티드의 변이체와 관련된다.
폴리뉴클레오티드 변이체는 암호화 영역, 비-암호화 영역, 또는 둘 모두에 변이를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 폴리뉴클레오티드 변이체는 침묵(silent) 치환, 부가, 또는 결실을 생성하는 변이를 포함하지만, 암호화된 폴리펩티드의 특성 또는 활성은 변화시키지 않는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 변이체는 유전 암호의 퇴화로 인한 침묵 치환에 의해 생성된다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 다양한 원인으로 인해, 예컨대, 특정 숙주에 있어서 코돈 발현을 최적화하기 위해 제조될 수 있다(인간 mRNA로부터 E. coli와 같은 박테리아 숙주에서 선호되는 것으로의 코돈 변화).
본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 세포가 또한 제공된다.
IV .사용 방법 및 약제학적 조성물
본 발명의 CD37-결합제(항체, 면역접합체, 및 폴리펩티드를 포함)는 치료적 처리 방법, 가령 B-세포 악성종양과 같은 암의 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 적용 분야에서 유용하다. 특정 구체예에서, 제제는 종양 성장 억제, 분화 유발, 종양 부피 감소, 및/또는 종양의 종양형성성 감소를 위해 유용하다. 사용 방법은 시험관 내(in vitro ), 생체 외( ex vivo ), 또는 생체 내( in vivo ) 방법일 수 있다. 특정 구체예에서, CD37-결합제 또는 항체 또는 면역접합체, 또는 폴리펩티드는 이것이 결합하는 인간 CD37의 길항제이다.
한 양태에서, 본 발명의 항-CD37 항체 및 면역접합체는 생물학적 샘플에서 CD37의 존재를 검출하기 위해 유용하다. 본 명세서에 사용된 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. 특정 구체예에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다. 특정 구체예에서, 그러한 조직은 다른 조직, 예를 들면, B 세포 및/또는 B 세포 연관 조직에 비해 CD37을 높은 수준으로 발현하는 정상 및/또는 암성 조직을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 CD37의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 CD37에 항-CD37 항체의 결합을 허용하는 조건하에 생물학적 샘플을 항-CD37 항체와 접촉시키는 단계 및 항-CD37 항체 및 CD37 사이에 복합체가 형성되었는지 검출하는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 CD37의 증가된 발현과 연관된 장애를 진단하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 검사 세포를 항-CD37 항체와 접촉시키는 단계; CD37에 항-CD37 항체의 결합을 검출하여 검사 세포의 CD37 발현 수준을(정량적이거나 정성적으로) 결정하는 단계; 및 검사 세포의 CD37 발현 수준을 대조 세포(예컨대, 검사 세포와 동일한 조직 기원의 정상 세포 또는 그러한 정상 세포에 필적하는 수준으로 CD37를 발현하는 세포)의CD37 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 대조 세포와 비교한 검사 세포의 더 높은 수준의 CD37의 발현은 CD37의 증가된 발현과 연관된 장애의 존재를 나타낸다. 특정 구체예에서, 검사 세포는 CD37의 증가된 발현과 연관된 장애를 가지는 것으로 의심되는 개체로부터 수득된다. 특정 구체예에서, 상기 장애는 암 또는 종양과 같은 세포 증식성 장애이다.
특정 구체예에서, 상기 기술된 것과 같은 진단 또는 검출의 방법은 세포 표면 또는 표면에 CD37를 발현하는 세포에서 얻은 막 표본에 발현된 CD37에 항-CD37 항체가 결합하는 것의 검출을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 CD37에 항-CD37 항체의 결합을 허용하는 조건하에 세포를 항-CD37 항체와 접촉시키는 단계, 및 세포 표면에 항-CD37 항체 및 CD37 사이에 복합체가 형성되었는지 검출하는 단계를 포함한다. 세포의 표면에 발현된 CD37에 항-CD37 항체가 결합한 것을 검출하기 위한 예시적인 분석은 "FACS" 분석이다.
특정한 다른 방법이 CD37에 항-CD37 항체가 결합한 것을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 방법은 당해 분야에 매우 공지인 항원-결합 분석, 가령 웨스턴 블롯, 방사면역분석법, ELISA(효소-결합 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침강 분석, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석, 및 면역조직화학염색법(immunohistochemistry, IHC)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 구체예에서, 항-CD37 항체는 표지되어 있다. 표지는 직접 검출되는 표지 또는 모이어티(가령 형광, 발색(chromophoric), 전자-고밀도, 화학발광, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라 예컨대, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 효소 또는 리간드와 같은 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 구체예에서, 항-CD37 항체는 불용성 매트릭스 상에 고정화(immobilized)되어 있다. 고정화는 항-CD37 항체를 용액에 유리 상태로 잔여하는 임의의 CD37로부터 분리시키는 단계를 수반한다. 이는 통상적으로 분석 절차 전에, 비수용성 매트릭스 또는 표면에의 흡착(Bennich et al., 미국 특허 제3,720,760호), 또는 공유 커플링(예를 들면, 글루타르알데히드 가교 결합을 이용함)에 의해 항-CD37 항체를 불용성화하거나, 예컨대, 면역침강법으로 항-CD37 항체 및 CD37 사이에 복합체가 형성된 후에 항-CD37 항체를 불용성화하여 달성된다.
상기 구체예 중 어느 하나의 진단 또는 검출이 본 발명의 면역접합체를 항-CD37 항체 대신에 또는 이에 부가하여 사용하여 수행될 수 있다.
특정 구체예에서, CD37-결합제 또는 길항제(예컨대, 항-CD37 항체)로 치료되는 질병은 암이다. 특정 구체예에서, 암은 CD37-결합제(예컨대, 항체)가 결합하는 CD37 발현 세포에 의해 특징지어진다.
본 발명은 치료적 유효량의 CD37-결합제를 개체(예컨대, 치료를 필요로 하는 개체)에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 암은 B-세포 악성종양이다. 특정 구체예에서, 암은 B 세포 림프종, NHL, 전구 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙 B 세포 신생물, B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프구형질구성 림프종, 외투 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL), 저등급, 중간-등급 및 고-등급(FL), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종, MALT 유형 변연부 B 세포 림프종, 림프절 변연부 B 세포 림프종, 비장형 변연부 B 세포 림프종, 모양 세포성 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 형질세포골수종, 이식후 림프세포증식 장애, 발덴스트롬 매크로글로불린혈증, 및 미분화 대세포 림프종(ALCL)으로 이루어진 군에서 선택된다. 특정 구체예에서, 개체는 인간이다.
본 발명은 추가로 본 명세서에 기술된 항체 또는 다른 제제를 이용하여 종양 성장을 억제하기 위한 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 종양 성장을 억제하기 위한 방법은 세포를 CD37-결합제(예컨대, 항체)와 시험관 내( in vitro )에서 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들면, CD37을 발현하는 불멸화된 세포주 또는 암 세포주는 종양 성장을 억제하기 위한 항체 또는 다른 제제가 부가된 배지에서 배양된다. 일부 구체예에서, 종양 세포는 예를 들면, 조직 생검, 흉수(pleural effusion), 또는 혈액 샘플과 같은 환자의 샘플로부터 분리되고 종양 성장을 억제하기 위한 CD37-결합제가 부가된 배지에서 배양된다.
일부 구체예에서, 종양 성장을 억제하는 방법은 종양 또는 종양 세포를 CD37-결합제(예컨대, 항체)와 생체 내( in vivo )에서 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, CD37-결합제와 종양 또는 종양 세포의 접촉은 동물 모델에서 수행된다. 예를 들면, CD37-결합제는 면역저하된(immunocompromised) 마우스(예컨대 NOD/SCID 마우스)에서 성장한 하나 이상의 CD37을 발현하는 이종이식편에 종양 성장을 억제하기 위해 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 암 줄기 세포는 예를 들면, 조직 생검, 흉수, 또는 혈액 샘플과 같은 환자의 샘플로부터 분리되고 종양 세포 성장을 억제하기 위해 이후에 CD37-결합제를 투여하는 면역저하된(immunocompromised) 마우스에 주사된다. 일부 구체예에서, CD37-결합제는 종양형성 세포를 동물에 도입하는 것과 동시에 또는 그 직후에 종양 성장을 억제하기 위해 투여된다. 일부 구체예에서, CD37-결합제는 종양형성 세포가 특정 크기까지 성장한 후에 치료제로서 투여된다.
특정 구체예에서, 종양 성장을 억제하는 방법은 치료적 유효량의 CD37-결합제를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 개체는 인간이다. 특정 구체예에서, 개체는 종양을 가지고 있거나 종양을 제거한 적이 있다.
특정 구체예에서, 종양은 CD37-결합제 또는 항체가 결합하는 CD37를 발현한다. 특정 구체예에서, 종양은 인간 CD37을 과발현한다.
그 외에도, 본 발명은 치료적 유효량의 CD37-결합제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 종양의 종양형성성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 종양에서 암 줄기 세포의 빈도가 상기 제제의 투여로 감소된다.
본 발명은 추가로 (예를 들면, CD37-결합제를 종양형성 세포를 포함하는 종양을 가지거나 그러한 종양을 제거한 적이 있는 개체에 투여함으로써 종양형성 세포를 CD37-결합제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양형성 세포를 비-종양형성 세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
종양 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포의 분화를 유발하기 위한 본 명세서에 기술된 CD37-결합제, 폴리펩티드, 또는 항체의 용도가 또한 제공된다. 예를 들면, 세포를 본 명세서에 기술된 유효량의 CD37-결합제(예컨대, 항-CD37 항체)와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포가 분화하도록 유도하는 방법이 나타난다. 치료적 유효량의 CD37-결합제, 폴리펩티드, 또는 항체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 종양 내 세포가 분화하도록 유도하는 방법이 또한 제공된다. 특정 구체예에서, 종양은 췌장 종양이다. 특정한 다른 구체예에서, 종양은 결장 종양이다. 일부 구체예에서, 상기 치료 방법은 치료적 유효량의 CD37-결합제, 폴리펩티드, 또는 항체를 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 추가로 본 명세서에 기술된 하나 이상의 CD37-결합제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 약제학적 조성물은 추가로 약제학적으로 허용가능한 비히클(vehicle)을 포함한다. 이들 약제학적 조성물은 인간 환자에서 종양 성장을 억제하고 암을 치료하는데 사용된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 정제된 항체 또는 제제를 약제학적으로 허용가능한 비히클(예컨대 담체, 부형제)과 조합하여 저장 및 사용을 위한 제형이 제조된다(Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000). 적절한 약제학적으로 허용가능한 비히클은 무독성 완충액 가령 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 염화나트륨과 같은 염; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제(예컨대 염화옥타데실디메틸벤질 암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 가령 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜(catechol); 레조르시놀(resorcinol); 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔(cresol)); 저분자량 폴리펩티드(예컨대 약 10 미만의 아미노산 잔기); 단백질 가령 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 아미노산 가령 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 탄수화물 가령 단당류, 이당류, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; EDTA와 같은 킬레이트제(chelating agent); 당 가령 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 나트륨과 같은 염-형성 반대-이온(counter-ion); 금속 복합체(예컨대 Zn-단백질 복합체); 및 비-이온성 계면활성제 가령 TWEEN 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료를 위한 수많은 경로로 투여될 수 있다. 투여는 국소(가령 질 내 및 직장 내 수송을 비롯한 점막으로) 가령 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 점안액, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말; 폐(예컨대, 흡입기(nebulizer)에 의한 것을 비롯한 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입을 통함; 기관내, 비강내, 상피 및 경피); 경구; 또는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입을 비롯한 비경구; 또는 두개내(intracranial)(예컨대, 척추강내 또는 뇌실내) 투여일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 약제학적 복합 제제로, 또는 병용 요법과 같은 투여 용법으로, 항-암 특성을 가지는 2차 화합물과 조합될 수 있다. 약제학적 복합 제제 또는 투여 용법의 2차 화합물은 서로 역효과를 주지 않도록 조합의 ADC에 대해 상호보완적인 활성을 가질 수 있다. CD37-결합제 및 2차 항암제를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 예를 들면, CD37-결합제는 리툭시맙과 같은 CD20 길항제와 병용으로 투여될 수 있다.
질병의 치료를 위해, 본 발명의 항체 또는 제제의 적절한 투여량 모두는 치료하는 담당의의 재량에서, 치료되는 질병의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 질병의 민감도, 항체 또는 제제가 치료적 또는 예방적 목적으로 투여되는지, 선행 치료, 환자의 임상 이력, 등에 의존적이다. 항체 또는 제제는 한 번 또는 수일 내지 수달에 이르는 일련의 치료를 거쳐 투여되거나, 치유가 나타나거나 질병 상태의 축소(예컨대 종양 크기의 감소)가 달성될 때까지 투여될 수 있다. 최적의 투여 스케쥴은 환자의 체내 약물 축적으로부터 산출될 수 있고 개별적인 항체 또는 제제의 상대적인 효력에 따라 달라질 것이다. 투여 담당의는 최적 투여량, 투여 방법론 및 반복 횟수를 쉽게 결정할 수 있다. 특정 구체예에서, 투여량은 체중의 kg당 0.01 μg 내지 100 mg이고, 하루, 매주, 매달 또는 매년 한 번 이상 제공될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체 또는 다른 CD37-결합제는 매2주에 한 번 또는 매3주에 한 번 제공된다. 특정 구체예에서, 항체 또는 다른 CD37-결합제의 투여량은 체중의 kg당 약 0.1 mg 내지 약 20 mg이다. 치료 담당의는 측정된 잔류시간(residence time) 및 체액 또는 조직 내 약물의 농도를 기초로 하여 투여에 있어서 반복 횟수를 예측할 수 있다.
병용 요법은 "상승(synergy)"을 제공하고 "상승적(synergistic)"임을 입증할 수 있고, 이는 활성 성분들을 함께 사용할 때 얻어진 효과가 이들 화합물을 개별적으로 사용하여 도출된 효과의 합보다 더 큰 것이다. 상승적 효과는 활성 성분들이: (1) 조합된, 단일 투여 제형으로 동시-제형화되고 동시에 투여되거나 수송되거나; (2) 개별 제형으로서 순차적으로 또는 나란히 수송되거나; 또는 (3) 일부 다른 용법일 경우 얻어질 수 있다. 순차 요법으로 수송되는 경우에, 상승적 효과는 화합물이 예컨대 개별 주사기에서 상이한 주입을 통해 연속적으로 투여되거나 수송되는 경우 얻어질 수 있다. 일반적으로, 순차 요법 동안에는, 각각의 활성 성분의 효과적 투여량이 연속적으로, 즉 순서대로 투여되는 반면, 병용 요법에서는, 둘 이상의 활성 성분의 효과적 투여량이 함께 투여된다.
VI . CD37 결합제를 포함하는 키트
본 발명은 본 명세서에 기술된 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는, 본 명세서에 기술된 항체, 면역접합체 또는 다른 제제를 포함하는 키트를 제공한다. 특정 구체예에서, 키트는 CD37에 대한 적어도 하나의 정제된 항체를 하나 이상의 용기(container) 내에 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 키트는 모든 대조, 분석을 수행하기 위한 지시, 및 분석을 위해 필요한 임의의 소프트웨어 및 결과의 표시를 비롯하여, 검출 분석을 수행하기 위해 필요한 및/또는 충분한 모든 성분을 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 개시된 본 발명의 항체, 면역접합체 또는 다른 제제가 당해 분야에 매우 공지인 공인된 키트 구성방식 중 하나에 쉽게 포함될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
추가로 제공된 것은 CD37-결합제(예컨대, CD37-결합 항체), 뿐만 아니라 2차 항암제를 포함하는 키트이다. 특정 구체예에서, 2차 항암제는 화학치료제(예컨대, 리툭시맙)이다.
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본 개시의 구체예는 본 개시의 특정 항체의 제조 및 본 개시의 항체를 이용하기 위한 방법을 상세하게 기술하는 다음의 비-제한적 실시예를 참조로 하여 추가로 명시될 수 있다. 재료 및 방법 모두에 대한 많은 변형들이 본 개시의 범위에서 벗어나지 않고 실시될 수 있음이 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
실시예
본 명세서에 기술된 실시예 및 구체예는 단지 예시의 목적을 위함이고 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당해 분야의 기술자에게 제안될 것이며, 이들이 본 출원의 사상 및 이해 범위 내에 포함되어야 함이 주지된다.
세포주 및 성장
Figure 112012082667400-pct00039
모든 세포주를 가습된 5% CO2 배양기에서 37℃로 10% 소태아혈청, 2 mM 글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(모든 시약은 인비트로겐(Invitrogen) 제품)으로 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양했다. 세포를 한 주에 두 번씩 신선한 배지로 희석하여 계대배양(passage)하고 0.2 내지 1 x 106개 세포/ml로 유지했다.
실시예 1
쥐 CD37 항체의 생산
전체 CD37 암호화 서열(CDS)을 XbaI 및 BamHI 절단 부위에 근접하게 내포하여 인간 CD37의 발현을 가능하게 하는 발현 플라스미드 pSRa-CD37를 제작했다. Balb/c 마우스에서 유래한 전구-B 세포주인 300-19 세포(M. G. Reth et al. 1985, Nature, 317: 353-355)를 상기 발현 플라스미드로 형질감염시켜 높은 수준의 인간 CD37을 안정하게 세포 표면에 발현하게 하고 Balb/c VAF 마우스의 면역화를 위해 사용했다. 이뮤노젠(ImmunoGen, Inc)사에서 사용하는 표준 면역 프로토콜에 따라 마우스에 매 2-3 주마다 마우스당 대략 5x106개 CD37-발현 300-19 세포로 피하에 면역접종했다. 면역화된 마우스를 하이브리도마 생성을 위해 희생시키기 3일전에 항원을 추가 투여하여 촉진했다. 표준 실험동물 프로토콜에 따라 마우스로부터 비장을 수집하고 두 장의 무균, 불투명한 현미경 슬라이드 사이로 분쇄하여 RPMI-1640 배지 내 단일 세포 현탁액을 얻었다. 상기 비장 세포의 펠렛을 얻고, 세척하고, 폴리에틸렌 글리콜-1500 (로쉐(Roche) 783 641)을 사용하여 쥐 골수종 P3X63Ag8.653 세포와 융합시켰다(J. F. Kearney et al. 1979, J Immunol , 123: 1548-1550). 융합된 세포를 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘(hypoxanthine-aminopterin-thymidine, HAT)(시그마(Sigma) H-0262)를 함유하는 RPMI-1640 선별 배지에 재현탁하고 37 ℃에서 5% CO2로 96-웰 평평한-바닥(flat-bottomed) 배양 플레이트(코닝-코스타(Corning-Costar) 3596, 웰당 200 μL의 세포 현탁액)에서 성장시키기 위해 선별했다. 5일간 배양 후, 100 μL의 배양 상청액을 각각의 웰로부터 제거하고 하이포잔틴-티미딘(HT) 영양분(시그마 H-0137)을 함유하는 100 μL의 RPMI-1640 배지로 교체했다. 하이브리도마 클론이 항체 선별을 위해 준비될 때까지 37 ℃에서 5% CO2로 배양을 지속했다. J. Langone 및 H. Vunakis 저(Eds., Methods in Enzymology, Vol. 121, "Immunochemical Techniques, Part I"; Academic Press, Florida) 및 E. Harlow 및 D. Lane 저("Antibodies: A Laboratory Manual";1988; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)에 기술된 것을 포함하여, 면역화 및 하이브리도마 생산의 다른 기술을 또한 사용할 수 있다.
하이브리도마 선별 및 선택
하이브리도마로부터의 배양 상청액을 CD37-발현 300-19 세포에는 결합하지만, 비-형질감염된 300-19 세포에는 결합하지 않는 마우스 단클론성 항체의 분비에 대해 유세포분석기로 선별했다. 100 μl의 하이브리도마 상청액을 100 μL FACS 완충액(2% 정상 염소 혈청으로 보충된 RPMI-1640 배지)내 CD37-발현 300-19 세포 또는 비-형질감염된 300-19 세포(샘플당 1 x105개 세포)와 함께 3시간 동안 배양했다. 이후, 세포의 펠렛을 얻고, 세척하고, 100 μL의 PE-접합된 염소 항-마우스 IgG-항체(잭슨 연구소(Jackson Laboratory), FACS 완충액 내 6 μg/mL)와 함께 1 시간 동안 배양했다. 다시 세포의 펠렛을 얻고, FACS 완충액으로 세척하고 1% 포름알데히드를 함유하는 200 μL의 PBS에 재현탁했다. 샘플을 HTS 다중웰 샘플러를 구비한 FACS칼리버 세포분류기(Calibur flow cytometer) 또는 FACS 분석 세포분류기를 사용하여 획득하고 셀퀘스트 프로(CellQuest Pro, 모두 미국 샌디에고 소재의 BD 바이오사이언스(Biosciences)사 제품)을 이용하여 분석했다.
양성으로 검사된 하이브리도마 클론은 희석을 제한하여 2차 클로닝(subcloning)했다. 유세포분석기를 통해 CD37에 대해 모세포와 동일한 반응성을 나타낸 각각의 하이브리도마로부터 하나의 2차 클론을 이후의 분석을 위해 선택했다. 안정한 2차 클론을 배양하고 분비된 각각의 항-CD37 항체의 동형을 시판되는 동형판별 시약(isotyping reagent)을 이용하여 동정했다(로쉐 1493027).
본 연구의 과정을 따라 총 45번의 개별적인 융합 실험을 수행했다. 단일 융합 실험은 일상적으로 대략 200 내지 1000개의 하이브리도마 클론을 수득했다. 모든 수득된 하이브리도마 클론을 유세포분석기로 CD37 결합에 대해 선별했고 총 184개의 하이브리도마 클론이 CD37에 대한 특이적 결합을 나타냈다.
항체 정제
예를 들면 단백질 A 또는 G 크로마토그래피(HiTrap 단백질 A 또는 G HP, 1 mL, 아머스햄 바이오사이언스(Amersham Biosciences))와 같은 표준 방법을 이용하여 항체를 하이브리도마 2차 클론 상청액으로부터 정제했다. 간단하게, 크로마토그래피를 위해 상청액을 1/10 부피의 1 M Tris/HCl 완충액, pH 8.0을 부가하여 제조했다. pH-조정된 상청액을 0.22 μm 여과막을 통해 여과하고 결합 완충액(PBS, pH 7.3)으로 평형화된 컬럼 상에 로딩했다. 컬럼을 280 nm에서 흡광도가 없는 안정한 기준선이 얻어질 때까지 결합 완충액으로 세척했다. 항체를 0.15 M NaCl을 함유하는 0.1 M 아세트산 완충액, pH 2.8을 이용하여 0.5 mL/분의 유속으로 용리했다. 대략 0.25 mL의 분획을 수집하고 1/10 부피의 1M Tris/HCl, pH 8.0을 부가하여 중성화했다. 피크 분획(들)을 1x PBS에 대해 밤새 두 번 투석하고 0.2 μm 여과막을 통해 여과시켜 무균화했다. 정제된 항체는 A280에서의 흡광도를 통해 정량했다.
단백질 A 정제된 분획을 쥐 항체를 위해 4차 암모늄(Q) 크로마토그래피를 이용한 이온 교환 크로마토그래피(IEX)를 사용하여 추가로 정제했다. 간단하게, 단백질 A 정제로부터의 샘플을 결합 완충액(10 mM Tris, 10 mM 염화나트륨, pH 8.0)으로 완충액을 교환하고 0.22 μm 여과기를 통해 여과했다. 준비된 샘플을 이후 결합 완충액으로 평형화된 Q 고속류(fast flow) 수지(GE 라이프사이언스(Lifesciences))상에 120 cm/hr의 유속으로 로딩했다. 컬럼 크기는 샘플 내 모든 Mab가 결합하기에 충분한 수용능력을 가지도록 선택했다. 컬럼을 이후 280 nm에서 흡광도가 없는 안정한 기준선이 얻어질 때까지 결합 완충액으로 세척했다. 20 컬럼 부피(CV)에서 염화나트륨10 mM부터 출발하여 500 mM까지인 구배로 항체를 용리했다. 280 nm (A280)에서의 흡광도 측정치를 기초로 하여 피크 분획을 수집했다. 단량체의 백분율을 7.8 x 300 mm SWXL 가드 컬럼으로된(펜실베니아주 몰고메리빌 소재, 토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience) 사) 6.0 x 40 mm TSK 겔 G3000SWXL상에서 애질런트(Agilent) HPLC 1100 시스템(캘리포니아주 산타클라라 소재, 애질런트 사)을 이용하는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC)로 평가했다. 95% 이상의 단량체 함량을 가지는 분획을 수집하고, TFF 시스템을 이용하여 완충액을 PBS (pH 7.4)로 교환하고, 0.2 μm 여과막을 통해 여과하여 무균화했다. 정제된 항체의 IgG 농도를 1.47의 흡광 계수(extinction coefficient)를 사용하여 A280로 결정했다. 양호한 선별성을 가지는 항체를 정제하기 위해 세라믹 히드록시아파타이트(ceramic hydroxyapatite, CHT)와 같은 대안적인 방법을 또한 사용했다. IEX 크로마토그래피에 대해 기술된 것과 유사한 프로토콜과 함께 40 μm 입자 크기를 가지는 제II형 CHT 수지(바이오-라드 연구실(Bio-Rad Laboratories))를 사용했다. CHT에 대한 결합 완충액은 20 mM 인산나트륨, pH 7.0에 해당하며 항체를 20 CV를 통해 20-160 mM 인산나트륨의 구배로 용리했다.
실시예 2
유세포분석기를 통한 결합 특성분석
정제된 항체를 이용하여 유세포분석기를 통해 결합 특이성을 검사했다. CD37-발현 300-19 세포에 대한 muCD37-3, muCD37-12, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 및 muCD37-57의 결합 및 모 300-19 세포에 대한 결합의 부재를 입증하는 FACS 막대그래프가 도 1 및 도 2에 나타난다. 모든 쥐 항체를 100 μL FACS 완충액(2% 정상 염소 혈청으로 보충된 RPMI-1640 배지)에서 CD37-발현 300-19 세포 또는 비-형질감염된 300-19 세포 (샘플당 1 x105 개 세포)로 3시간 동안 배양했다. 이후, 세포의 펠렛을 얻고, 세척하고, 100 μL의 FITC-접합된 염소 항-마우스 IgG-항체(잭슨 연구소, FACS 완충액 내 6 μg/mL)에서 1 시간 동안 배양했다. 다시 세포의 펠렛을 얻고, FACS 완충액으로 세척하고 1% 포름알데히드를 함유하는 200 μL의 PBS에 재현탁했다. 샘플을 HTS 다중웰 샘플러를 가지는 FACS칼리버 세포분류기 또는 FACS 분석 세포분류기를 사용하여 획득하고 셀퀘스트 프로(모두 미국 샌디에고 소재의 BD 바이오사이언스사 제품)를 이용하여 분석했다.
muCD37-3, muCD37-12, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 또는 muCD37-57로 배양된 CD37-발현 300-19 세포의 FACS 막대그래프는 형광 이동(fluorescence shift)을 나타낸 반면, 모 300-19 세포는 그렇지 않았다. 또한, 두 세포주를 단지 FITC-접합된 염소 항-마우스 IgG-항체 단독으로 배양했을 경우 어떠한 유의미한 형광 이동도 검출되지 않았다(도 1 하단).
항체가 또한 내생적으로 발현된 CD37에 결합할 수 있음을 확인하기 위해, CD37-양성 WSU-DLCL-2 림프종 세포 및 muCD37-3, muCD37-12, muCD37-8, muCD37-10 또는 muCD37-14 항체를 사용하여 결합 실험을 수행했다. WSU-DLCL-2 세포를 다양한 농도의 쥐 항체로 배양하고 유세포분석기 분석에 대해 상기 기술된 바와 같이 처리했다. 데이터 분석은 셀퀘스트 프로(미국 샌디에고 소재, BD 바이오사이언스)를 이용하여 수행했고 각각의 샘플에 있어서 FL1 (MFI)에 대한 평균 형광강도(fluorescence intensity)를 변환하여 항체 농도에 대해 반대수-선도(semi-log plot) 상에 도시했다(도 3). 용량-반응 곡선을 비선형 회귀(non-linear regression)를 통해 생성하고 각 항체의 겉보기(apparent) 해리 상수(Kd)에 해당하는 각 곡선의 EC50 값을 그래프패드(GraphPad) 프리즘(Prism) v4 (캘리포니아 샌디에고 소재, 그래프패드 소프트웨어)을 사용하여 산출했다. 검사된 모든 항체에 대해 형광의 급격한 이동을 관찰했고 Kd 값은 muCD37-3, muCD37-8, muCD37-10, muCD37-12 또는 muCD37-14 항체에 대해 각각 0.52 nM, 1.7 nM, 2.7 nM, 1.1 nM 또는 0.91 nM와 일치했다.
유사하게, 상기 기술된 동일한 유세포분석기 분석에 있어서 CD37-양성 BJAB 림프종 세포를 사용했을 때 강한 결합을 또한 관찰했다. Kd 값을 상기 기술된 바와 같이 산출했고 muCD37-3, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 및 muCD37-57에 대해 각각 0.2 nM, 0.4 nM, 0.6 nM, 0.4 nM 및 1 nM와 일치했다.
실시예 3
쥐 항체의 아폽토시스 -촉진 활성
쥐 항-CD37 항체는 라모스 및 라지 림프종 세포주의 아폽토시스를 유발했다. 아폽토시스의 정도를 아넥신-V(인비트로겐) 및 TO-PRO-3(인비트로겐)의 FITC 접합체로 염색한 후에 유세포분석기 분석으로 측정했다. 건강한, 정상 세포에서, 포스파티딜세린은 막 이중층 내부에 발현되며, 세포막의 안쪽막에서 바깥쪽막으로 포스파티딜세린의 전달은 아폽토시스의 최초 검출가능한 신호 중 하나이다. 아넥신 V는 온전한 세포의 세포막 이중층의 안쪽이 아닌 바깥쪽에서 포스파티딜세린에 결합한다. 그러므로 아넥신 V 결합의 정도는 아폽토시스의 유발에 대한 지표이다. TO-PRO-3은 단량체 시아닌 핵산 착색제이며, 아폽토시스의 후기 단계에 발생하는 바와 같이 오로지 막의 온전함이 파괴된 경우에만 세포막에 침입할 수 있다. 2-색 유세포분석기에서 세 집단의 세포가 구별가능하다: 비-아폽토시스성 세포(아넥신-V 음성 및 TO-PRO-3 음성), 초기 아폽토시스성 세포(아넥신-V 양성 및 TO-PRO-3 음성) 및 괴사성(necrotic) 세포 또는 후기 아폽토시스성 세포(아넥신-V 양성 및 TO-PRO-3 양성).
기하급수적으로 성장하는 세포를 10% 소태아혈청(FBS), 2mM L 글루타민, 및 50 μg/mL 겐타마이신으로 보충된 RMPI-1640 배지(이하 완전 RMPI-1640 배지로 표현됨)에서 24-웰 플레이트에 약 2 x 105 개 세포/mL로 도말했다. 달리 언급하지 않는 한, 세포를 일반적으로 완전 RMPI-1640 배지에서 성장시켰다. 세포를 37℃에서 가습된 5% CO2 배양기에서 20 내지 24 시간 동안 10 nM의 항-CD37 항체로 배양했다. 이후 세포의 펠렛을 얻고, 500 μl PBS로 두 번 세척하고, 100 μL 결합 완충액(10 mM Hepes-NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2)에 재현탁하고, 얼음에서 15분간 5 μL의 아넥신 V-FITC로 염색했다. 이후, 1 μM의 TO-PRO-3를 가지는 400 μL의 결합 완충액을 상기 혼합물에 부가하고, 즉시 FITC 및 TO-PRO-3의 세포-연관된 형광을 유세포분석기로 측정했다. 각 샘플에 대해 5천 번의 형광발생을 수집했다. TO-PRO-3의 형광(FL4-H; y-축) 및 아넥신 V-FITC의 형광(FL1-H; x-axis)의 점 선도를 BD 셀퀘스트 소프트웨어를 이용하여 생성했다.
아넥신-V 양성 세포(TO-PRO-3 양성 및 음성 세포를 모두 포함)의 백분율을 이들 선도로부터 각 샘플에 대해 결정했고 라모스 세포에 대해 도 4에 나타난다. 본 발명의 항체 선별로부터 분리된 몇몇 항체를 아폽토시스-촉진 활성에 대해 리툭시맙과 비교하여 검사했다. 예기치 않게도, 일부의 분리된 쥐 항-CD37 항체, 가령 muCD37-3 및 muCD37-12는 매우 강한 아폽토시스-촉진 활성을 나타냈다. 대략적으로 muCD37-3에 노출된 39%의 라모스 세포 및 muCD37-12에 노출된 46%의 라모스 세포가 아넥신-V 양성이었다. 이와 반대로, 항-CD20 항체 리툭시맙을 이용한 처리는 단지 13%의 아넥신-V 양성 세포를 유발했고, 그 반면 처리안된 대조 샘플은 5%의 아넥신-V 양성 세포를 포함했다. 몇몇 분리된 쥐 항-CD37 항체는 어떠한 아폽토시스-촉진 활성도 나타내지 않았다. 예를 들면, 라모스 세포를 muCD37-8, muCD37-10 또는 muCD37-14로 처리한 것은 처리안된 세포에 비해 아넥신-V 양성의 백분율의 증가가 미미하거나 전혀 증가를 야기하지 않았다. 이는 도 3에 나타난 바와 같이 CD37에 필적하는 이들의 결합 친화성에도 불구하고 이러하다.
추가적인 항체를 분리하고 라모스 세포에서 아폽토시스를 유발하는 이들의 능력에 대해 선별했다. CD37에 높은 친화성으로 결합하는 분리된 많은 항체 중, 단지 일부만 아폽토시스-촉진 활성을 가졌다. 아넥신-V 분석의 결과는 도 4B에 나타난다. 쥐 항체 muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 및 muCD37-57는 아폽토시스를 유발할 수 있었고 처리안된 대조 샘플에서의 5%와 비교하여 38 - 45%의 아넥신-V 양성 라모스 세포를 도출했다. 앞의 분석과 유사하게, 항-CD20 항체 리툭시맙을 이용한 처리는 단지 18%의 아넥신-V 양성 세포를 도출했다.
그 외에도, 쥐 항체를 라지 림프종 세포에서 아폽토시스를 유발하는 이들의 능력에 대해 검사했다. 라모스 세포에서 본 바와 같이, CD37에 높은 친화성으로 결합하는 분리된 많은 항체 중, 단지 일부만 아폽토시스-촉진 활성을 가졌다. muCD37-3 또는 muCD37-12을 이용한 처리는 각각 36% 또는 49%의 아넥신-V 양성 세포를 도출했다. 이와 반대로, 항-CD20 항체 리툭시맙을 이용한 처리는 단지 20%의 아넥신-V 양성 세포를 도출한 반면, 처리안된 대조 샘플은 4%의 아넥신-V 양성 세포를 도출했다.
유사하게, 처리안된 세포에서는 15%인 것에 비해 muCD37-3, muCD37-38, muCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 또는 muCD37-57로 처리된 대략 60%의 라지 세포가 아넥신-V 양성 세포였다.
실시예 4
증식 분석
항-CD37 항체의 세포 성장을 억제하는 능력을 시험관 내( in vitro ) 세포독성 분석을 이용하여 측정했다. 표적 세포를 완전 RPMI 배지(RPMI-1640, 10% 소태아혈청, 2 mM 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 모든 시약은 인비트로겐 제품)내 100 μL로 웰당 5,000 세포씩 도말했다. 항체를 연속 3-배 희석을 이용하여 완전 RPMI 배지로 희석하고 웰당 100 μL를 부가했다. 최종 농도는 전형적으로 3 x 10-8 M 내지 4.6 x 10-12 M 범위였다. 세포를 37℃에서 가습된 5% CO2 배양기에서 4 내지 5 일 동안 배양했다. 잔여 세포의 생존도를 비색(colorimetric) WST-8 분석(미국 메릴랜드 록빌 소재, 도진도 몰레큘라 테크놀로지 사(Dojindo Molecular Technologies, Inc.))을 통해 결정했다. WST-8는 생존하는 세포 내 탈수소효소에 의해 조직 배양 배지에 용해성인 오렌지색 포르마잔 생성물로 환원된다. 생성된 포르마잔의 양은 생존하는 세포의 수와 정비례한다. WST-8를 최종 부피의 10%에 부가하고 플레이트를 37℃에서 가습된 5% CO2 배양기에서 추가적인 2-4 시간 동안 배양했다. 플레이트를 다중웰 플레이트 판독기에서 450 nm(A450)에서의 흡광도를 측정하여 분석했다. 배지 및 WST-8 만을 가지는 웰의 백그라운드 A450 흡광도를 모든 값으로부터 제했다. 생존도 백분율은 각각의 처리된 샘플값을 처리안된 세포를 가진 웰의 평균값으로 나눠서 산출했다. 생존도 백분율 = 100* (A450 처리된 샘플 - A450 백그라운드)/ (A450 처리안된 샘플 - A450 백그라운드). 상기 생존도 백분율 값을 각각의 처리에 있어서 항체 농도에 대해 반대수-선도에 도시했다.
쥐 CD37 항체 및 SU-DHL-4 림프종 세포를 이용한 전형적인 증식 분석의 결과가 도 5에 표현된다. 몇몇 쥐 항체가 SU-DHL-4 세포의 증식을 실질적으로 그리고 용량-의존적인 방식으로 억제할 수 있는 반면, 다른 항체는 그러한 효과가 없는 것이 명백하다. 예를 들면, muCD37-3을 이용한 처리는 0.17 nM의 EC50을 가지고 검사된 최대 항체 농도에서 세포 생존도를 34%까지 감소시켰다. 유사하게, muCD37-38을 이용한 처리는 0.19 nM의 EC50을 가지고 검사된 최대 항체 농도에서 세포 생존도를 25%까지 감소시켰다. 유사하게, muCD37-50 또는 muCD37-51을 이용한 처리는 각각 0.25 nM 또는 0.5 nM의 EC50을 가지고 검사된 최대 항체 농도에서 세포 생존도를 38%까지 감소시켰다. 이와 반대로, 예를 들면 CD37-16을 이용한 처리는 세포 생존도를 용량-의존적인 방식으로 낮추지 않았다.
실시예 5
CD37 -3 항체의 VL 및 VH 영역의 클로닝 및 서열분석
세포의 전체(total) RNA를 CD37-3 하이브리도마의 5 x 106개 세포로부터 RN이지 키트(RNeasy kit, 키아젠(QIAgen))를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 제조했다. 이후에 슈퍼스크립트(SuperScript) II cDNA 합성 키트(인비트로겐)를 이용하여 cDNA를 전체 RNA로부터 합성했다.
하이브리도마 세포로부터 유래한 cDNA에 첫 번째 변성 PCR 반응을 위한 절차는 Wang et al. ((2000) J Immunol Methods. 233:167-77) 및 Co et al. ((1992) J Immunol. 148:1149-54)에 기술된 방법을 기초로 했다. VH 서열을 다음의 변성 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭시켰다: EcoMH1 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC (SEQ ID NO:171), EcoMH2 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG (SEQ ID NO:172) 및 BamIgG1 GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC (SEQ ID NO:173). VL 서열은 다음의 변성 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭시켰다: SacIMK GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA (SEQ ID NO:174) 및 HindKL TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC (SEQ ID NO:175). (혼합 염기는 다음과 같이 명시된다: N=G+A+T+C, S=G+C, Y=C+T, M=A+C, R=A+G, W=A+T). PCR 반응 혼합물을 이후 1% 저 융용(low melt) 아가로스 겔 상에서 러닝시키고, 300 내지 400 bp 밴드를 잘라내어, 자이모(Zymo) DNA 미니 컬럼을 이용하여 정제하고, 서열분석을 위해 에이젠코트 바이오사이언스(Agencourt Biosciences)로 보냈다. 각각의 5' 및 3' PCR 프라이머를 서열분석용 프라이머로서 사용하여 가변 영역 cDNA를 양쪽 방향으로부터 합성했다. DNA 서열분석 결과로부터 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열을 예측했다.
VL 및 VH cDNA 서열을 클로닝하기 위해 사용한 변성 프라이머가 5' 말단 서열을 변형시키므로, 완전한 서열을 확인하기 위해서는 추가적인 서열분석 시도가 필요했다. NCBI IgBlast 사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)에서 항체 서열을 유도하는 쥐 생식선 서열을 검색하기 위해 예비 cDNA 서열을 사용했다. 이후 쥐 항체의 생식선에 연결된 선도 서열을 어닐링(anneal)하기 위해 PCR 프라이머를 설계하여, 이러한 신규한 PCR 반응으로 PCR 프라이머에 의해 변형되지 않은 완전한 가변 영역 cDNA 서열이 수득되도록 했다. PCR 반응, 밴드 정제, 및 서열분석을 상기 기술된 것과 같이 수행했다.
서열 확인을 위한 질량 결정
가변 영역에 대한 cDNA 서열 정보를 생식선 불변 영역 서열과 조합하여 전장 항체 cDNA 서열을 얻었다. 이후 중사슬 및 경사슬의 분자량을 산출하고 쥐 CD37-3 항체의 LC/MS 분석으로 얻어진 분자량과 비교했다. 분자량 측정은 CD37-3 경사슬 및 중사슬 모두에 대한 cDNA 서열과 일치한다.
키메라화( Chimerization )
경사슬 가변 영역에 대한 다양한 서열은 pchCD37-3LCZ 플라스미드 내 EcoRI 및d BsiWI 부위로 클로닝된다. 중사슬 가변 영역은 pchCD37-3HCN 플라스미드 내 HindIII 및 Apa1 부위로 클로닝된다. 동등한 플라스미드를 chCD37-12을 위해 제작했다. 표준 인산칼슘 절차(BD 바이오사이언스, CalPhos 포유류 형질감염 키트, Cat # 631312)를 이용하여 HEK-293T 세포에서 키메라 항체를 발현하기 위해 이들 플라스미드를 사용했다. 상청액을 상기 기술된 표준 단백질 A 크로마토그래피 절차를 사용하여 정제했지만, 정제 크로마토그래피 단계는 카르복시메틸(CM) 고속류 이온 교환(IEX) 수지(GE 라이프사이언스) 및 10 mM 인산칼륨, 10 mM 염화나트륨 결합 완충액 (pH 7.5)을 이용하거나 상기 기술된 대안적인 CHT 방법을 이용하여 수행했다.
실시예 6
항체 인간화
예를 들면 Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994) 및 Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996)에서와 같이 전술된 재표면화(resurfacing) 방법에 따라 CD37-3 및 huCD37-50 항체를 인간화했고, 상기 문헌은 전체로서 본 명세서에 참고 문헌으로 포함된다. 재표면화는 일반적으로 경사슬 및 중사슬 모두에서 가변 영역 프레임워크 표면 잔기를 동정하는 것 및 이들을 인간 동등물로 대체하는 것을 포함한다. 쥐 CDR은 재표면화 항체 내에 보존된다. CD37-3 및 CD37-50의 예시적인 CDR이 표 11에 나타난 바와 같이 명시된다. 재표면화를 위해 사용된 중사슬 CDR2의 명시 외에도, 상기 표는 쥐 및 인간 CD37-3 및 CD37-50 모두에 대한 예시적인 카밧식으로 정의된(Kabat defined) 중사슬 CDR2를 제공한다. 밑줄친 서열은 재표면화를 위한 CDR로 간주되지 않는 카밧 중사슬 CDR2의 부분을 표시한다.
[표 11]
Figure 112012082667400-pct00040
재표면화를 위해 명시된 CD37-3 및 CD7-50 경사슬 및 중사슬 CDR는 표 11에 예시의 방식으로 제공된다. 쥐 CD37-50 경사슬 CDR2 내 리신 53을 인간화 CD37-50 내 아스파라긴(이탤릭으로 나타냄)으로 대체하여 LC CDR2의 양쪽 버전이 제공된다. 중사슬 CDR2에 대한 카밧식 정의는 또한 쥐 및 인간 CD37-3 둘 다에 대해 제공된다. 밑줄친 서열은 재표면화를 위한 CDR로 간주되지 않는 카밧 중사슬 CDR2의 부분을 표시한다.
표면 잔기 위치는 이의 상대적 접근가능성이 30% 이상인 임의의 위치로서 정의된다(Pedersen J.T. et. Al, J. Mol. Biol. 1994; 235: 959-973). 이후 가장 상동성인 인간 표면 서열을 동정하기 위해 표면 잔기를 인간 생식선 표면 서열과 나란히 배열한다. CD37-3에 대해서, 대체 표면으로 사용된 인간 생식선 서열은 VL 및 VH에 대해 각각 IGKV1/OR2-0*01 및 IGHV4-34*09였다. CD37-50에 대해서, 대체 표면으로 사용된 인간 생식선 서열은 VL 및 VH에 대해 각각 IGKV3/OR2-268*01 및 IGHV4-31*03였다. 도 6의 목록에서 볼 수 있는 바와 같이, 총 경사슬 내 7개 및 중사슬 내 7개의 표면 잔기가 CD37-3 내 인간 상응부로 대체되었다. CD37-50에 있어서 도 7에 나타난 바와 같이, 인간 상응부로 대체된 전체 표면 잔기는 VL 및 VH에서 각각 7개 및 5개이다. CD37-3에서, 중사슬 잔기 61은 CDR-H2에 매우 근접하며 이의 인간 잔기 프롤린으로의 치환이 감소된 결합 친화성을 야기할 수 있기 때문에, 두 번째 재표면화 버전은 쥐 세린 잔기를 내포하도록 합성했다. 이들 항체가 세포독성 접합체로서 검사되었기 때문에, 리신 접합이 결합 친화성에 영향을 줄 수 있다는 염려를 피하기 위해 CD37-50 경사슬 CDR2 리신 53을 아스파라긴으로 대체했다. 도 8은 경사슬 및 중사슬 둘 다의 CD37-3 및 CD37-50 가변 도메인에 대한 재표면화 서열을 이의 쥐 상응부와 나란치 배열한 것을 나타낸다.
huCD37 -3 항체의 재조합 발현
huCD37-3 및 CD37-50에 대한 가변 영역 서열은 블루 헤론 바이오테크놀로지(Blue Heron Biotechnology)에 의해 코돈-최적화되고 합성되었다. 상기 서열은 단일 사슬 포유류 발현 플라스미드에서 개별적인 불변 서열을 가지는 인프레임(in-frame) 클로닝을 위해 제한 효소 부위에 인접해 있다. 경사슬 가변 영역은 pAbKZeo 플라스미드 내 EcoRI 및 BsiWI 부위로 클로닝된다. 중사슬 가변 영역은 pAbG1Neo 플라스미드 내 HindIII 및 Apa1 부위로 클로닝된다. 이들 플라스미드는 과도적(transient)이거나 안정한 포유류 세포 형질감염에서 재조합 항체를 발현하기 위해 사용될 수 있다. HEK 293T 세포에서 재조합 항체를 발현하기 위한 과도적 형질감염은 변형된 PEI 절차(Durocher, Y. et al., Nucleic acids Res . 30:E9 (2002))를 이용하여 수행했다. 상청액을 키메라화 항체에 대해 상기 기술된 바와 같은 표준 절차를 이용하여 단백질 A 및 정제 크로마토그래피 단계를 통해 정제했다.
TRU -016의 발현
분리된 항-CD37 항체의 활성을 비교하기 위해, 앞서 동정된 항-CD37 항체를 클로닝하고 발현시켰다. 항-CD37 SMIP에 대한 DNA 서열을 US2007/0059306로부터 SEQ ID 51를 사용하여 가져왔다. 상기 서열은 pAbG1Neo 포유류 발현 플라스미드로 클로닝하기 위해 HindIII 및 Xho1 제한 효소 부위에 인접했다. 발현 및 정제는 상기 huCD37-3에 대해 기술된 바와 같이 수행했다.
실시예 7
키메라 항체의 결합 친화성
키메라 항체 chCD37-3 및 chCD37-12를 라모스 세포에 대한 이들의 결합 친화성에 대해 이들의 쥐 상응부와 비교하여 분석했다. 라모스 세포 및 muCD37-3, chCD37-3, muCD37-12 및 chCD37-12 항체를 이용하여 유세포분석기 결합 분석을 수행하고 실시예 2에 기술된 바와 같이 2차 FITC-접합된 염소-항-쥐 및 -항-인간 항체를 이용하여 분석했다. 도 9A는 각각의 항체에 대한 비-선형 회귀를 통해 생성된 용량-반응 곡선을 보여준다. 각 항체의 겉보기 해리 상수(Kd) 값을 그래프패드 프리즘 v4 (캘리포니아 주 샌디에고, 그래프패드 소프트웨어 사)을 이용하여 산출했다. muCD37-3, chCD37-3, muCD37-12 및 chCD37-12에 대한 Kd가 각각 0.4 nM, 0.8 nM, 0.8 nM 및 1.2 nM와 일치하므로, 키메라화가 어떠한 항체의 결합 친화성에도 크게 영향을 주지 않았음이 명백하다.
huCD37 -3 v1 .0 및 huCD37 -3 v1 .01의 결합 친화성
CD37-3의 키메라 및 인간화 버전의 결합 친화성을 평가하기 위해 BJAB 세포를 이용한 유세포분석기 결합 분석 및 경쟁적 결합 구성방식을 사용했다. BJAB 세포를 1 nM 농도의 PE-표지된 muCD37-3 항체로 배양하고 다양한 양의 muCD37-3, chCD37-3, huCD37-3v1.0 또는 huCD37-3v1.01을 부가하여 경쟁을 측정했다. 샘플을 4℃에서 3시간 동안 배양했다. 이후, 세포의 펠렛을 얻고, FACS 완충액으로 세척하고 1% 포름알데히드를 함유하는 200 μL의 PBS에 재현탁했다. 샘플을 HTS 다중웰 샘플러를 가지는 FACS칼리버 세포분류기를 사용하여 획득하고 셀퀘스트 프로(모두 미국 샌디에고, BD 바이오사이언스사 제품)를 이용하여 분석했다. 수득된 평균 PE 형광을 사용된 경쟁 항체의 양에 대해 반대수-선도에 도시했다. 도 9B는 각 항체에 대한 비-선형 회귀로 생성된 용량-반응 곡선을 보여준다. 각 항체의 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값을 그래프패드 프리즘 v4 (캘리포니아 샌디에고 소재, 그래프패드 소프트웨어)을 사용하여 산출했다. 쥐의 모항체와 결합하기 위해 모든 버전이 동일하게 경쟁하므로, 키메라화 또는 인간화가 CD37-3의 결합 친화성에 영향을 미치지 못했음이 명백하다. muCD37-3, chCD37-3, huCD37-3v1.0 또는 huCD37-3v1.01에 대한 경쟁 결합의 EC50은 각각 0.8 nM, 0.7 nM, 1 nM 및 0.6 nM와 일치한다.
인간화 항체의 결합 친화성
인간화 항체 huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 및 chCD37-57을 BJAB 세포에 대한 이들의 결합 친화성에 대해 이들의 쥐 상응부와 비교하여 분석했다. 2차 FITC-접합된 염소-항-쥐 및 -항-인간 항체를 이용하여 유세포분석기 결합 분석을 수행하고 실시예 2에 기술된 바와 같이 분석하여, 각 항체에 대한 비-선형 회귀를 통해 용량-반응 곡선을 생성했다. 각 항체의 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값을 그래프패드 프리즘 v4 (캘리포니아 샌디에고 소재, 그래프패드 소프트웨어)을 사용하여 산출했다. 인간화가 임의의 항체의 결합 친화성에 크게 영향을 주지 않았음이 명백하다. muCD37-3 및 huCD37-3에 대한 Kd는 0.2 nM와 일치하는 반면, muCD37-38 및 huCD37-38에 대한 Kd는 각각 0.4 nM 및 0.3 nM와 일치한다. 유사하게, muCD37-50 및 huCD37-50에 대한 Kd는 각각 0.6 nM 및 0.2 nM와 일치하는 반면, muCD37-51 및 huCD37-51에 대한 Kd는 각각 0.6 nM 및 0.8 nM와 일치한다. 마지막으로, muCD37-56 및 huCD37-56에 대한 Kd는 각각 0.4 nM 및 0.2 nM와 일치하는 반면, muCD37-57 및 huCD37-57에 대한 Kd는 각각 1.0 nM 및 0.3 nM와 일치한다.
실시예 8
마카크속 원숭이 CD37 의 발현
마카크속 원숭이 CD37의 CD37 AA 서열은 젠뱅크(Genbank, GI: 718718)로부터 얻었다. 상기 서열은 블루 헤론 바이오테크놀로지에 의해 코돈-최적화되고 합성되었다. 발현 플라스미드 pSRa-CD37mac는 마카크속 원숭이의 전체 CD37 암호화 서열(CDS)을 XbaI 및 BamHI 절단 부위에 인접하게 포함하여 구성했고 이는 마카크속 원숭이 CD37의 발현을 가능하게 했다. Balb/c 마우스로부터 유래한 전구-B 세포주인 300-19 세포(M. G. Reth et al. 1985, Nature, 317: 353-355)를 세포 표면에 마카크속 원숭이 CD37를 안정하게 발현하도록 상기 발현 플라스미드로 형질감염시켰다.
마카크속 원숭이 CD37 에 대한 쥐 항체의 결합 친화성
쥐 항체 muCD37-3, muCD37-12, muCD37-38, huCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 및 muCD37-57를 300-19/CD37mac 세포 발현 마카크속 원숭이 CD37에 결합하는 이들의 능력에 대해 분석했다. 2차 FITC-접합된 염소-항-쥐 또는 염소-항-인간 항체를 이용하여 유세포분석기 결합 분석을 수행하고, 실시예 2에 기술된 바와 같이 분석했다. 전술된 항-CD37 항체 WR17 및 항-CD37 SMIP TRU-016와 결합을 비교했다. 도10A에서 볼 수 있는 바와 같이, 몇몇 분리된 항-CD37 항체, muCD37-38, huCD37-50, muCD37-51, muCD37-56 및 muCD37-57는 마카크속 원숭이 유래 CD37 항원에 결합할 수 있다. 그와 반대로, muCD37-3, muCD37-12, 전술된 항-CD37 항체 WR17 및 항-CD37 SMIP TRU-016는 마카크속 원숭이 유래 CD37 항원에 결합할 수 없다.
마카크속 원숭이 CD37 에 대한 인간화 항체의 결합 친화성
인간화 항체 huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 및 huCD37-57를 300-19/CD37mac 세포 발현 마카크속 원숭이 CD37에 대한 이들의 결합 친화성에 대해 분석했다. 유세포분석기 결합 분석을 2차 FITC-접합된 염소-항-인간 항체를 이용하여 수행했고, 실시예 2에 기술된 바와 같이 분석하고 용량-반응 곡선을 각 항체의 비-선형 회귀를 통해 생성했다. 각 항체의 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값을 그래프패드 프리즘 v4 (캘리포니아 샌디에고 소재, 그래프패드 소프트웨어)을 사용하여 산출했다. 도 10B으로부터, 몇몇 분리된 인간화 항체는 마카크속 원숭이 CD37에 결합하지만 huCD37-3는 그렇지 않았음이 명백하다. huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 및 huCD37-57에 대한 Kd 값은 각각 1.1 nM, 1.8 nM, 14 nM, 5 nM, 및 2 nM와 일치한다. 그러므로, 인간화는 분리된 항체의 결합 특이성에 영향을 주지 않는다.
실시예 9
키메라 및 인간화 항체의 아폽토시스 -촉진 활성
키메라 및 인간화 항체의 아폽토시스-촉진 활성을 라모스 세포에서 평가했다. 세포를 10nM 농도의 항체 또는 huIgG 동형 대조 항체로 20 시간 동안 배양하고 이후 아넥신-V-FITC 및 TO-PRO-3 염색 및 유세포분석기 분석을 진행한다. ChCD37-12는 muCD37-12의 강한 아폽토시스-촉진 활성을 유지시킨다. 4%의 처리안된 대조 세포와 비교하여 muCD37-12 또는 chCD37-12 항체로 처리한 후 대략 40%의 라모스 세포가 아넥신-V 양성이다. 유사하게, 4%의 처리되거나 처리안된 동형 대조 세포와 비교하여 huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 또는 huCD37-57 항체로 처리한 후 대략 40%의 라모스 세포가 아넥신-V 양성이다. 이와 반대로, 항-CD20 항체 리툭시맙을 이용한 처리는 단지 13%의 아넥신-V 양성 세포를 도출했다. 상기 결과는 본 명세서의 분리된 쥐 항-CD37 항체의 강한 아폽토시스-촉진 활성이 이들로부터 유래한 키메라 또는 인간화 항체에 의해 유지됨을 입증한다. 그러므로, 항-CD37 항체의 상기 군의 고유한 기능적 특성인, 가교-결합의 부재에서도 강한 아폽토시스-촉진 활성은 키메라화 또는 인간화에 의해 부정적인 영향을 받지 않는다.
huCD37 -3 및 TRU -016의 아폽토시스 -촉진 활성
라모스 및 라지 림프종 세포에 대한 huCD37-3의 아폽토시스-촉진 활성을 항-CD37 SMIP TRU-016에 비교했다. TRU-016은 2차 항체와 가교-결합되지 않는한 어떠한 아폽토시스-촉진 활성도 갖지 않는 화합물로서 기술되어 왔다. 예시적인 항-CD37 항체 huCD37-3 및 chCD37-38가 양쪽 림프종 세포주에 대해 훨씬 더 강한 아폽토시스-촉진 활성을 가짐이 명백하다. huCD37-3 또는 chCD37-38을 이용한 처리는 3%의 처리안된 대조 세포에 비해 40% 또는 49%의 아넥신-V 양성 라모스 세포를 도출했다. 리툭시맙 처리는 단지 15%의 아넥신-V 양성 라모스 세포를 도출했다. 이와 반대로, TRU-016 처리는 아넥신-V 양성 라모스 세포의 백분율을 증가시키지 않았다. 유사하게, huCD37-3 또는 chCD37-38을 이용한 처리는 7%의 처리안된 대조 세포에 비해 34% 또는 30%의 아넥신-V 양성 라지 세포를 도출했다. 리툭시맙 처리는 단지 19%의 아넥신-V 양성 라지 세포를 도출했다. 이와 반대로, TRU-016 처리는 아넥신-V 양성 라모스 세포의 백분율을 증가시키지 않았다.
인간화 항체의 아폽토시스 -촉진 활성에 대한 용량 반응
다양한 양의 각각의 항체를 라모스 세포로 20 시간 동안 배양하고 이후 아넥신-V-FITC 및 TO-PRO-3 염색 및 유세포분석기 분석을 진행했다. 아넥신-V 양성 세포의 백분율을 항체 농도에 대해 반대수-선도에 도시했고, EC50 값을 비-선형 회귀 분석을 사용하여 정합된 곡선으로부터 산출했다. 모든 인간화 항체가 적어도 40%의 백분율로 최대 아넥신-V 양성 세포를 가지는 강한 아폽토시스-촉진 활성을 가짐이 명백하다. 도 11. 상기 활성에 대한 EC50은 huCD37-3, huCD37-38 및 huCD37-50에 대해 각각 0.08, 0.08 및 0.11 nM와 일치한다. 그외에도, 상기 활성에 대한 EC50은 huCD37-51, huCD37-56 및 huCD37-57에 대해 각각 0.41, 0.57 및 1.01 nM와 일치한다. 이와 반대로, 항-CD20 항체 리툭시맙을 이용한 처리는 4%의 동형 대조 항체로 처리된 세포에 비해 단지 15%의 최대 백분율로 아넥신-V 양성 세포를 도출했다.
실시예 10
키메라 및 인간화 항- CD37 항체에 대한 증식 분석
키메라 및 인간화 항-CD37 항체의 세포 성장을 억제하는 능력을 실시예 4에 기술된 바와 같이 시험관 내( in vitro ) 세포독성 분석으로 측정했다. SU-DHL-4 및 DOHH-2 림프종 세포를 이용하는 전형적인 증식 분석의 결과는 도 12에 나타난다. 모든 항체가 SU-DHL-4 세포의 증식을 실질적으로 그리고 용량-의존적인 방식으로 억제할 수 있었음이 명백하다. 예를 들면, muCD37-3을 이용한 처리는 0.07 nM의 EC50을 가지고 SU-DHL-4 세포의 생존도를 35%까지 감소시켰다. 유사하게, chCD37-3, huCD37-3v1.0 또는 huCD37-3v1.01를 이용한 처리는 각각 0.03 nM, 0.06 nM 또는0.03 nM의 EC50을 가지고 검사된 최대 항체 농도에서 SU-DHL-4 세포의 생존도를 대략 30%까지 감소시켰다. 유사하게, 모든 항체가 DOHH-2 여포성 림프종 세포의 증식을 실질적으로 그리고 용량-의존적인 방식으로 억제할 수 있었다. 예를 들면, muCD37-3을 이용한 처리는 0.05 nM의 EC50을 가지고 DOHH-2 세포의 생존도를 45%까지 감소시켰다. 유사하게, chCD37-3, huCD37-3v1.0 또는 huCD37-3v1.01을 이용한 처리는 각각 0.06 nM, 0.07 nM 또는 0.05 nM의 EC50을 가지고 DOHH-2 세포의 생존도를 대략 35%까지 감소시켰다. 상기 결과는 다양한 버전의 CD37-3 항체가 키메라화 또는 인간화에 의해 영향받지 않는 유사한 항-증식성 활성을 가짐을 입증한다.
추가적인 인간화 항-CD37 항체를 유사한 시험관 내( in vitro ) 세포독성 분석으로 검사했다. 검사된 모든 인간화 항체가 SU-DHL-4 세포의 증식을 실질적으로 그리고 용량-의존적인 방식으로 억제할 수 있었다. 예를 들면, huCD37-38을 이용한 처리는 SU-DHL-4 세포의 생존도를 0.42 nM의 EC50을 가지고 24%까지 낮춘 반면, huCD37-50을 이용한 처리는 SU-DHL-4 세포의 생존도를 0.39 nM의 EC50을 가지고 31%까지 감소시켰다. 이와 반대로, 항-CD20 항체 리툭시맙을 이용한 처리는 SU-DHL-4 세포의 생존도를 1.6 nM의 EC50을 가지고 35%까지 감소시켰다. 그 외에도, huCD37-51 또는 huCD37-56를 이용한 처리는 SU-DHL-4 세포의 생존도를 각각 0.60 nM 또는 0.68 nM의 EC50을 가지고 24%까지 감소시켰다. 추가로, huCD37-57을 이용한 처리는 SU-DHL-4 세포의 생존도를 0.42 nM의 EC50을 가지고 31%까지 감소시켰다. 동형 대조 항체를 이용한 처리는 SU-DHL-4 세포의 생존도에 영향을 주지 않았다.
다른 항체와 비교한 huCD37 -3의 항-증식성 활성
분리된 항-CD37 항체의 항-증식성 활성을 더욱 규명하기 위해, 예시적인 huCD37-3 항체의 효과를 항-CD37 SMIP TRU-16 화합물의 효과와 비교하였다. 종양 마이크로어레이를 이용한 면역조직화학염색법으로 CD37 및 CD20이 유사한 발현 패턴을 나타내며 NHL의 하위유형으로 우세함을 확인했다. 하기의 표 12를 참조하라. 따라서, 항-CD20 항체 리툭시맙에 대한 비교가 또한 이루어졌다. 일군의 세포주는 그랜타-519, SU-DHL-4, 나말와 및 다우디 림프종 세포를 포함했다. 도 13.
[표 12]
림프종 종양 마이크로어레이에서 CD20 염색과 비교한 CD37 염색.
Figure 112012082667400-pct00041
모든 경우에, huCD37-3 처리는 용량-의존적인 방식으로 세포 생존도의 감소를 야기했다. 예를 들면, huCD37-3를 이용한 처리는 0.062 nM의 EC50을 가지고 그랜타-519 세포의 생존도를 대략 37%까지 감소시켰다. 리툭시맙 처리는 0.36 nM의 EC50을 가지고 그랜타-519 세포의 생존도를 대략 47%까지 감소시켰다. huCD37-3을 이용한 처리는 0.053 nM의 EC50을 가지고 SU-DHL-4 세포의 생존도를 대략 17%까지 감소시켰다. 리툭시맙 처리는 0.2 nM의 EC50을 가지고 SU-DHL-4 세포의 생존도를 대략 20%까지 감소시켰다. 이와 매우 대조적으로, TRU-016를 이용한 처리는 그랜타-519 또는 SU-DHL-4 세포의 생존도를 상당한 정도까지 또는 용량-의존적인 방식으로 낮추지 않았다. 추가의 실시예에서, huCD37-3을 이용한 처리는 0.1 nM의 EC50을 가지고 나말와 세포의 생존도를 대략 47%까지 낮추었고 0.25 nM의 EC50을 가지고 다우디 세포의 생존도를 대략 68%까지 감소시켰다. 리툭시맙 처리는 나말와 세포에 영향을 주지 못했지만 2.6 nM의 EC50을 가지고 다우디 세포의 생존도를 대략 69%까지 감소시켰다. 이와 매우 대조적으로, TRU-016을 이용한 처리는 나말와 또는 다우디 세포의 생존도를 상당한 정도까지 또는 용량-의존적인 방식으로 낮추지 않았다. 마지막으로, huCD37-3을 이용한 처리는 0.08 nM의 EC50을 가지고 라모스 세포의 생존도를 대략 53%까지 낮추었던 반면, TRU-016 이나 리툭시맙의 처리는 라모스 세포 생존도에 어떠한 영향도 주지 않았다. 상기 결과는 분리된 항-CD37 항체의 항-증식성 활성의 고유함을 강조한다.
실시예 11
CD37 항체의 CDC 활성
키메라 및 인간화 항-CD37 항체의 보체-의존성 세포독성(CDC) 활성을 평가하기 위해, 공개된 방법에 따른 세포 기반 분석을 수행했다(Gazzano-Santoro H, J Immunol Methods. 1997 202(2):163-71). 항체를 RHBP (RPMI-1640, 20 mM HEPES, 0.1 % BSA, 1% 페니실린-스트렙토마이신) 배지에서 전형적으로 5 μg/mL (= 3.3 x 10-8 M) 내지 2.3 ng/mL (= 1.5 x 10-11 M) 범위의 다양한 농도로 50 μL/웰씩 이중복으로 평평한-바닥 96-웰 조직 배양 플레이트에 분취했다. 표적 세포를 웰당 100 μL의 RHBP 배지 에서 5 x 104개 세포로 항체에 부가했다. 동결건조된(Lyophilized) 인간 보체(미국 세인트 루이스 소재, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 바이알당 1 mL의 무균 정제된 물로 복원하고 사용하기 직전에 RHBP 배지로 20% 스톡이 되도록 5-배 희석했다. 5%의 최종 농도를 위해 50 μL/웰의 보체 용액을 각 웰에 부가했다. 플레이트를 5% CO2 가습된 배양기에서 37℃로 2 시간 동안 배양하여 보체 매개 세포용해가 일어나게 했다. 상기 배양 시간 후, 알라마 블루(Alamar Blue) 시약(인비트로겐)을 10%의 최종 농도로 각 웰에 부가하여 잔여 세포의 생존도를 측정했다. 플레이트를 EX540/EM590 nm에서 형광(상대 형광 단위, relative fluorescence units, RFU)을 측정하기 전에 37℃에서 16 내지 20 시간 동안 배양했다. 대조는 세포 없이 배지 및 보체를 갖는 삼중복 웰(배지 단독, 생존도 0%) 및 항체 없이 세포 및 보체를 갖는 웰(세포 단독, 생존도 100%)을 포함했다. 각 샘플에 대한 특정 세포 생존도의 백분율을 다음 식에 의해 결정했다: 생존도 백분율 = (샘플 - 배지 단독)/ (세포 단독 - 배지 단독).
라모스 세포를 이용한 예시적인 CDC 분석의 결과가 도 14에 나타난다. 인상적이게도, chCD37-12는 라모스 세포에 대해 강력한 CDC 활성을 갖는다. 이것은 0.037 μg/mL의 EC50을 가지고 검사된 최대 항체 농도에서 라모스 세포의 생존도를 32%까지 감소시켰다. 그 외에도, 몇몇 분리된 항체가 다양한 정도로 라모스에 대한 CDC 활성을 나타냈다. HuCD37-3, huCD37-38, huCD37-50을 이용한 처리는 각각 59%, 50% 및 45%까지 세포 생존도의 감소를 야기했다. huCD37-51, huCD37-56 또는 huCD37-56을 이용한 처리는 라모스 세포의 세포 생존도를 검사된 최대 항체 농도에서 대략 70 - 80%까지 완만하게 감소시켰다.
실시예 12
CD37 항체의 ADCC 활성
종양 세포주의 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 측정하기 위해 갓 분리한 인간 자연 살해(NK) 세포를 효과기 세포로서 사용하여 락테이트 탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 방출 분석을 사용했다(Shields RL, J Biol Chem. 2001 276(9):6591-604). NK 세포를 먼저 NK 분리 키트 II(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotech), 130-091-152)에 관한 변형된 프로토콜을 사용하여 정상 공여자로부터의 인간 혈액으로부터 분리했다(매사추세츠 브라이튼 소재, 리서치 블러드 컴포넌트 사(Research Blood Components, Inc.)). 혈액을 1x PBS로 2-배 희석했다. 25 mL의 희석된 혈액을 50 mL 코니칼 튜브(conical tube) 내 25 mL의 피콜 파크(Ficoll Paque) 위에 조심스럽게 올리고 400 g로 45 분간 실온에서 원심분리했다. 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 계면으로부터 수집하고, 새로운 50 mL 코니칼 튜브로 옮긴 뒤, 1x PBS로 한 번 세척했다. PBMC를 2 mL의 NK-분리 완충액(1x PBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA)에 재현탁하고, 이후 500 μL의 비오틴-항체 칵테일(Biotin-Antibody Cocktail)을 상기 세포 현탁액에 부가했다. 비오틴-항체 칵테일은 NK 세포를 제외한 림프구에 결합하는 비오틴화 항체를 함유하여, NK 세포의 음성선택을 야기한다. 혼합물을 4℃에서 10 분 동안 배양하고, 이후 1.5 mL의 NK-분리 완충액 및 1 mL의 항-비오틴 마이크로 비드(Micro Bead)를 부가했다. 세포-항체 혼합물을 추가적인 15 분 동안 4℃에서 배양했다. 다음으로, 세포를 50 mL의 NK-분리 완충액으로 한 번 세척하고 3 mL의 NK-분리 완충액에 재현탁했다. 이후, MACS LS 컬럼을 오토맥스 분리기(autoMACS separator, 밀테니 바이오텍)에 넣고 3 mL의 NK-분리 완충액으로 예비-세척했다. 세포 현탁액을 컬럼 상에 자동으로 가하고, 세척하고, 표지안된 NK 세포를 갖는 용출 분획을 새로운 50-mL 코니칼 튜브에 수집했다. 수득된 NK 세포를 30 mL의 완전 RPMI 배지(5% 소태아혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1 mM HEPES, 1 mM 피루브산나트륨, 1% 100X MEM 비-필수 아미노산 용액으로 보충된 RPMI-1640)에 밤새 도말했다. 이어지는 분석 및 모든 희석은 RHBP 배지(20 mM HEPES, pH 7.4, 0.1% BSA 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 RPMI-1640 배지)에서 수행했다.
RHBP 배지 내 다양한 농도의 항체를 50 μL/웰씩 이중복으로 둥근 바닥(round bottom) 96-웰 플레이트에 분취했다. 표적 세포를 RHBP 배지에서 106 세포/mL로 재현탁하고 100 μL/웰씩 항체 희석액을 함유하는 각 웰에 부가했다. 표적 세포 및 항체 희석액을 함유하는 플레이트를 37℃에서 30분 동안 배양했다. NK 세포를 이후 표적 세포를 함유하는 웰에 50 μL/웰씩 부가했다. 전형적인 비율은 1 개 표적 세포 대 3-4 개 NK 세포였다. 다음의 대조를 각 실험을 위해 설정했다: NK 세포 단독, 표적 세포 단독(자발적 LDH 방출), NK 세포를 갖는 표적 세포(항체 의존적 LDH 방출), 10% Triton X-100를 갖는 표적 세포(최대 LDH 방출). 혼합물을 37℃에서 4 시간 동안 배양하여 세포용해가 일어나게 했다. 플레이트를 10 분 동안 1200 rpm으로 원심분리하고, 100 μL의 상청액을 새로운 평평한-바닥 96-웰 플레이트로 조심스럽게 옮겼다. 세포독성 검출 키트(로쉐 1 644 793)의 LDH 반응 혼합물(100 μL/웰)을 각각의 웰에 부가하고 실온에서 5 내지 30 분 동안 배양했다. 샘플의 광학 밀도를 490 nm (OD490)에서 측정했다. 각 샘플의 특이적 세포용해 백분율(percent specific lysis)을 다음 화학식을 이용하여 결정했다: 특이적 세포용해 백분율 = (샘플값 - 자발적 방출)/(최대 방출 - 자발적 방출) *100.
인간화 항체를 이용한 배양은 인간 NK 효과기 세포의 존재에서 다우디, 라모스 및 그랜타-519 림프종 세포에 대해 양호한 ADCC 활성을 야기했다. 다우디 림프종 세포에 대한 이들의 ADCC 활성을 TRU-016의 ADCC 활성과 비교했다(도 15).
HuCD37-3, huCD37-38 또는 huCD37-50 항체를 이용한 처리는 각각 0.42 ng/mL, 1.31 ng/mL, 또는 2.42 ng/mL의 EC50 값을 가지고 대략 41%, 39% 또는 40% 다우디 세포용해를 야기했다. 상기 활성은 42% 다우디 세포용해가 관찰되고 0.93 ng/mL의 EC50을 가지는, TRU-016 처리의 결과와 유사했다. 그외에도, huCD37-51, huCD37-56 및 huCD37-57를 이용한 처리는 각각 5.7 ng/mL, 4.3 ng/mL, 또는 7.9 ng/mL의 EC50값을 가지고 대략 39%, 36% 또는 36%의 다우디 세포용해를 야기했다.
라모스 림프종 세포에 대한 분리된 항체의 ADCC 활성을 TRU-016의 ADCC 활성과 비교했다. HuCD37-3, huCD37-38 또는 huCD37-50 항체를 이용한 처리는 각각 0.95 ng/mL, 2.0 ng/mL, 또는 3.0 ng/mL의 EC50값을 가지고 대략 43%, 42% 또는 46% 라모스 세포용해를 야기했다. 상기 활성은 59% 라모스 세포용해가 관찰되고 1.53 ng/mL의 EC50을 가지는, TRU-016 처리의 결과와 유사했다. 그외에도, huCD37-51, huCD37-56 및 huCD37-57를 이용한 처리는 각각 5.7 ng/mL, 4.3 ng/mL, 또는 7.9 ng/mL의 EC50값을 가지고 대략 53%, 43% 또는 44%의 라모스 세포용해를 야기했다.
추가적인 실험에서 그랜타-519 세포에 대한 huCD37-3 및 chCD37-38의 ADCC 활성을 TRU-016의 ADCC 활성과 비교했다. HuCD37-3 또는 chCD37-38 항체를 이용한 처리는 각각 0.13 ng/mL, 또는 0.73 ng/mL의 EC50값을 가지고 대략 19% 또는 18% 그랜타-519 세포용해를 야기했다. TRU-016 처리는 16% 그랜타-519 세포용해의 관찰 및 0.83 ng/mL의 EC50값을 야기했다.
실시예 13
에피토프 지도작성
상이한 CD37 항체의 에피토프에 대한 아미노산 요건의 국소화는 흔하거나 고유한 기능적 특성을 특정한 분자간 상호작용과 연관시키는 것을 도울 수 있다. CD37의 세포외 도메인은 약 18 잔기의 소형 루프, 및 대략 135 아미노산으로 이루어진 대형 루프인, 두 개의 세포외 루프를 내포한다. 에피토프 요건은 기존의 공개된 CD37 항체에 대해서는 기술된 바 없다. 본 발명의 분리된 CD37 항체를 더욱 규명하기 위해, 대형 세포외 루프 내에 AA 치환을 갖는 몇몇 CD37 항원 변이체를 제조했다.
CD37 변이체 클로닝 및 발현
블루 헤론 바이오테크놀로지에 의해 코돈-최적화하고 합성하고, XbaI 및 BamHI 절단 부위에 인접하게 하여 pSRa 벡터 다중 클로닝 부위로 클로닝이 촉진되도록 한, 전체 인간 또는 마카크속 원숭이 CD37 cDNA 서열을 내포하는 포유류 발현 플라스미드를 제조했다. 인간 및 마카크속 원숭이 CD37 서열이 고도로 상동성이므로(도 16), 이들 구조체의 발현으로 실시예 8에 기술된 바와 같이 이들 두 종간의 11개 세포외 CD37 아미노산 차이 중 적어도 하나를 필요로 하는 에피토프를 인식하는 것으로부터 인간 및 마카크속 원숭이의 교차 반응성 항체를 구별할 수 있다.
CD37 항체 에피토프를 더욱 규명하기 위해, 일련의 쥐 및 인간 키메라 CD37 구조체를 제조했다. 소형 CD37 세포외 루프의 크기 및 높은 상동성으로 인해, 에피토프 국소화 시도는 대형 세포외 루프에 제한된다. 대형 세포외 루프의 잔기 I108 내지 Q235를 암호화하는 EcoRV 내지 Pst1 카세트(cassette)에 인간, 쥐, 및 마카크속 원숭이 CD37 서열 간에 보존될 수 있는 4 개의 고유한 절단 부위를 포함시켜 5부분으로 더욱 분할되도록 재설계했다(도 17). 다음의 인간 및 마우스 키메라 CD37 구조체가 생성되었다:
hCD37-M1
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO:180)
hCD37-M2
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO:181)
hCD37-M3
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO:182)
hCD37-M45
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO:183)
muCD37-R176
ISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQ (SEQ ID NO:184).
하나의 그러한 절단 부위를 보존하기 위해, 인간 R176인 Kpn1를 모든 쥐/인간 키메라 구조체에 포함시켰다. 쥐 및 인간 CD37 카세트는 블루 헤론에서 주문했고 PCR로 생산한 본래의 인간 CD37 구조체의 5' 말단 단편과 함께 pSRa 벡터로 클로닝하여 본래의 마카크속 원숭이 CD37 구조체에서 취한 EcoRV 부위 및 3' 말단 Pst1 내지 Xba1 제한효소 단편을 포함시켰다. 쥐 및 인간 키메라 CD37 카세트를 이후 공통의 고유 절단 부위를 활용하는 표준 제한효소 분해 및 연결법을 사용하여 제작했다.
유사 쥐 CD37 서열의 AA S109 내지 A138를 암호화하는 EcoRV-SacII 제한효소 단편을 삽입하여 hCD37-M1 변이체를 생성했다. 유사 쥐 CD37 서열의 AA V177 내지 L201을 암호화하는 KpnI-Blp1 제한효소 단편을 삽입하여 유사하게 hCD37-M3 변이체를 생성했다. 유사 쥐 CD37 서열의 AA S202 내지 I243를 암호화하는 Blp1-PstI 제한효소 단편을 삽입하여 hCD37-M45 변이체를 생성했다. 수득된 클론을 제한효소로 분해한 이후 DNA 서열분석을 통해 확인했다.
표준 전기천공법(electroporation) 절차를 이용하여 쥐 및 인간 키메라 CD37 변이체 발현 플라스미드를 300-19 세포에 형질감염시켜서 안정한 세포주를 얻었다. 간단하게, 5 x 106 개 300-19 세포를 차가운 RPMI-1640 배지에서 260V 및 960 μF로 설정된 바이오라드(BioRad) 유전자주입기를 이용하여 전기천공시켰다. 이후에, 세포를 희석하고 10% FBS 및 50 μM β-메르캅토에탄올로 보충된 RPMI-1640 배지에서96-웰 플레이트에 도말했다. 24시간 후에 G418(인비트로겐)을 2 mg/mL의 최종 농도로 부가하여 형질감염된 세포가 선별되도록 했다. 2주 후에, 단일 콜로니를 분리하고, CD37 표면 발현에 대해 유세포분석기로 분석하고 증식시켰다.
CD37 변이체에 대한 항체 결합
인간 CD37 야생형 및 변이체를 발현하는 세포에 대한 다양한 CD37 항체의 결합을 1.5 μg/mL의 각 항체를 이용하여 유세포분석기로 분석했다. 본 발명의 분리된 항체를 시판되는 CD37 항체 WR17, 뿐만 아니라 TRU-016 SMIP와 비교했다. 도 18A에서 볼 수 있는 바와 같이, 모든 항체가 야생형 CD37 발현 세포에 결합했다. 유사하게, 검사된 모든 항체가 hCD37-M3 변이체에 결합했다(도 18B). 이와 반대로, 본 발명의 분리된 항체는 hCD37-M1 변이체에 결합했지만, TRU-016 및 WR17는 hCD37-M1 변이체에 결합하지 못했다(도 19A). CD37-50 및 CD37-51 항체 및 TRU-016가 또한 hCD37-M45 변이체에 결합할 수 있었다. WR17는 hCD37-M45 변이체에 대해 부분적인 결합을 보여준 반면, 다른 항체 CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-56 및 CD37-57는 결합하지 못했다(도 19B). 이는 본 발명의 모든 분리된 항체가 CD37 항원에 결합하기 위해 상응하는 쥐 AA 잔기로 변화된 hCD37-M1 변이체 내 12 AA 잔기를 필요로 하지 않음을 시사한다. 이와 반대로, CD37-3, CD37-12, CD37-38, CD37-56 및 CD37-57 항체는 CD37 항원에 결합하기 위해 상응하는 쥐 AA 잔기로 변화된 적어도 하나의 hCD37-M45 변이체 내 10 AA 잔기를 필요로 한다.
상기의 예기치 않은 결과는 고유한 조합의 기능적 특성을 가지는 본 발명의 분리된 항체가 신규한 부류의 CD37 항체를 나타냄을 가리킨다.
그 외에도, 다음의 설계에 따라 유사한 구조체가 제조되어 있다. 구조체는 CD37의 대형 세포외 루프를 암호화하는 다양한 조합의 쥐, 인간 및/또는 마카크속 원숭이 서열을 내포한다(도 17을 참조). 단일 인간 부분이 쥐 대형 세포외 루프 서열에 삽입된 구조체의 예는 다음과 같다:
hCD37mECD-H1: MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARY (SEQ ID NO: 185)
hCD37mECD-H2: MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 186)
hCD37mECD-H3:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGPRAKLRQTADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 187)
hCD37mECD-H4:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGHLARSRHSADICALPAKAHIYREGCAQSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 188)
hCD37mECD-H5
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGPRAKLRQTADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 189)
및 hCD37mECD-H45
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRVRLERRVQELVLRTIQSYRTNPDETAAEESWDYAQFQLRCCGWQSPRDWNKAQMLKANESEEPRVPCSCYNSTATNDSTVFDKLFFSQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 190).
추가적인 예는 단일 마카크속 원숭이 부분이 인간 대형 세포외 루프 서열에 삽입된 구조체이며 다음과 같다:
hCD37-Mac12:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLQDIVEKTIQRYHTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHSPQDWFQVLTLRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 191)
hCD37-Mac4:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGQLARSRHSTDICAVPAESHIYREGCAQGLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 192)
hCD37-Mac5:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGHLARSRHSADICAVPANSHIYREGCARSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARYR (SEQ ID NO: 193)
및 hCD37-Mac45:
MSAQESCLSLIKYFLFVFNLFFFVLGSLIFCFGIWILIDKTSFVSFVGLAFVPLQIWSKVLAISGIFTMGIALLGCVGALKELRCLLGLYFGMLLLLFATQITLGILISTQRAQLERSLRDVVEKTIQKYGTNPEETAAEESWDYVQFQLRCCGWHYPQDWFQVLILRGNGSEAHRVPCSCYNLSATNDSTILDKVILPQLSRLGQLARSRHSTDICAVPANSHIYREGCARSLQKWLHNNLISIVGICLGVGLLELGFMTLSIFLCRNLDHVYNRLARY (SEQ ID NO: 194).
추가적으로, 항체 결합을 위해 중요한 잔기를 동정하기 위해 단일 점 돌연변이를 인간 대형 세포외 루프 서열에 생성했다.
SEQ ID NOs: 185-194를 발현하는 세포에 대한 CD37 결합제의 결합은 상기 기술된 바와 같이 유세포분석기로 분석한다.
실시예 14
huCD37 -3- SPP - DM1 의 제조
N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트(SPP) 연결기를 에탄올에 용해했다. huCD37-3 항체를 5 mg/mL으로 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, 및 5% 에탄올을 함유하는 50 mM 인산칼륨 완충액(pH 6.5)에서 대략 100 분간 실온에서 7 배 몰 과량의 SPP 연결기와 함께 배양했다. 반응 혼합물을 전술한 인산칼륨 완충액으로 평형화시킨 세파덱스™ G25F 컬럼을 사용하여 정제했다. 항체를 포함하는 분획을 모으고 이후 단계에서 사용했다.
메이탄시노이드 DM1를 디메틸아세트아미드(DMA, 최종 농도는 3%)에 용해하고 연결기에 비해 1.7 배의 몰 과량을 SPP 변형된 항체에 점적하여 부가했다. 실온에서 밤새 배양한 후에, 접합된 항체를 포스페이트 완충된 식염수(PBS), pH 6.5에서 평형화된 세파덱스™ G25F에서 크로마토그래피로 정제했다. huCD37-3-SPP-DM1 접합체를 이후 10 mM 히스티딘, 250 mM 글리신, 1% 수크로스를 함유하는 완충액, pH 5.5으로 투석했다. 항체 분자 당 연결된 DM1 분자의 수는 항체 및 DM1에 대해 기본에 보고된 흡광 계수를 이용하여 결정했다(Liu et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 93, 8618-8623 (1996)). 접합 반응 후에 존재하는 유리 메이탄시노이드의 백분율은 20-50 μg 접합체를 100 mM 암모늄 아세테이트 완충액, pH 7.0 내 25% 아세토니트릴에서 평형화시킨 HiSep 컬럼 상에 주입하고, 아세토니트릴로 용리하여 결정했다. 유리 메이탄시노이드 종의 피크 범위(구배로 용리하고 용리 시간을 공지 표준과 비교하여 동정)를 252 nm의 파장으로 설정된 흡광도 검출기를 사용하여 측정하고 결합된 메이탄시노이드(컬럼 유체-통과 분획 내 접합체 피크에서 용리)와 관련된 피크 범위와 비교하여 총 유리 메이탄시노이드 종의 백분율을 산출했다. 비접합된 메이탄시노이드가 <1% 로 존재하는, huCD37-3 항체당 3.5-4개 DM1 분자를 가지는 접합체를 얻었다.
huCD37 -3- SMCC - DM1 의 제조
(석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC, 피어스 테크놀로지 사(Pierce Biotechnology, Inc)) 연결기를 DMA에 용해했다. huCD37-3 항체는, 항체를 5 mg/mL씩 50 mM 인산칼륨, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6.5 내에서 10 몰 과량의 SMCC과 함께 배양하여 SMCC로 변형시켜 말레이미드를 항체에 도입했다. 주변 온도에서 대략 100 분 후에, 동일한 인산칼륨 완충액으로 평형화된 세파덱스™ G25 컬럼을 이용하여 반응 혼합물을 정제했다. 항체 함유 분획을 모으고 이후 단계에서 사용했다.
SMCC-변형된 항체를 말레이미드 연결기에 비해 1.7 몰 과량으로 DM1의 10 mM 용액과 반응시켰다. 반응물을 주변 온도에서 대략 18 시간 동안 교반했다. 접합 반응 혼합물을 pH 6.5의 1 x PBS로 평형화된 세파덱스™ G25 겔 여과 컬럼을 통해 여과했다. huCD37-3-SMCC-DM1 접합체를 이후 10 mM 히스티딘, 250 mM 글리신, 1% 수크로스를 함유하는 완충액, pH 5.5으로 투석했다. 항체 분자당 연결된 DM1 분자의 수 및 총 유리 메이탄시노이드 종의 백분율을 상기 기술된 바와 같이 결정했다. 비접합된 메이탄시노이드가 <1% 로 존재하는, huCD37-3 항체당 3.5-4개 DM1 분자를 가지는 접합체를 얻었다.
huCD37 -3- 설포 - mal - DM4 의 제조
DM4 티올 및 이종이작용성 연결기 1-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일옥시)-4-옥소부탄-2-설폰산 (3-설포-mal)의 용액을 N,N-디메틸아세트아미드(DMA) 내 30-60 mM의 농도로 만들었다. 연결기 및 DM4를 최대 40 % v/v의 200 mM 석시네이트 완충액, 2 mM EDTA, pH 5.0을 함유하는 DMA와 함께 혼합하여 DM4 대 연결기의 비를 1.6으로, DM4의 최종 농도를 15 mM과 같도록 제공했다. 혼합 후에, 반응물을 2시간 동안 휴지시키고 4 mg/ml Ab, 90% 포스페이트 완충액/10% DMA, pH 7.5의 최종 접합 조건 하에 포스페이트 완충액(pH 7.5) 내 huCD37-3 항체의 혼합물에 부가했다. 접합 반응을 주변 온도에서 2 시간 동안 지속되게 했다. huCD37-3-설포-mal-DM4 접합체를 PBS 내 투석으로 생성된 과량의 미반응된 DM4 및 비접합된 연결기로부터 정제하고, 이후 10 mM 히스티딘, 250 mM 글리신, 1% 수크로스를 함유하는 완충액, pH 5.5으로 최종 투석했다. 최종 저장을 위해 접합체를 0.22 μm 여과기를 통해 여과했다. 최종 접합체 내 huCD37-3 항체 분자당 DM4 분자의 수(평균) 및 총 유리 메이탄시노이드 종의 백분율은 상기 기술된 바와 같이 결정했다. 비접합된 메이탄시노이드가 <1% 로 존재하는, huCD37-3 항체당 3.5-4개 DM4 분자를 가지는 접합체를 얻었다.
huCD37 -3- PEG4 - mal - DM1 의 제조
N-히드록시석신이미딜-(폴리에틸렌 글리콜)4-(N-말레이미도메틸)-DM1 (NHS-PEG4-mal-DM1) 시약을 DMA에 용해했다. huCD37-3 항체를 5 mg/mL씩 50 mM 인산칼륨, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 7.5에서 7 배 몰 과량의 NHS-PEG4-mal-DM1(총 10% DMA)와 함께 배양했다. 주변 온도에서 대략 2 시간 후에, 반응 혼합물을 1x PBS, pH 7.4로 평형화된 세파덱스™ G25 컬럼을 이용하여 정제했다. 항체 함유 분획을 모으고 10 mM 히스티딘, 250 mM 글리신, 1% 수크로스를 함유하는 완충액, pH 5.5으로 투석했다. 항체당 연결된 DM1 분자의 수 총 유리 메이탄시노이드 종의 백분율은 상기 기술된 바와 같이 결정했다. 비접합된 메이탄시노이드가 <1% 로 존재하는, huCD37-3 항체당 3.5-4개 DM4 분자를 가지는 접합체를 얻었다.
실시예 15
메이탄시노이드 접합체의 결합 친화성
SMCC-DM1, SPP-DM1 또는 설포-mal-DM4에 접합된 후 예시적인 huCD37-3의 결합 친화성을 상기 실시예에 기술된 바와 같이 유세포분석기로 분석했다. 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값을 도 20A에 나타난 결합 곡선으로부터 산출했고 접합체 huCD37-3에 대해서는 0.26 nM, huCD37-3-SMCC-DM1에 대해서는 0.46, huCD37-3-SPP-DM1에 대해서는 0.56 nM, 그리고 huCD37-3-설포-mal-DM4에 대해서는 0.89 nM와 일치했다. 상기 결과는 SMCC-DM1, SPP-DM1 또는 설포-mal-DM4 접합이 예시적인 huCD37-3 항체의 친화성을 눈에 띄게 변화시키지 않음을 입증한다.
SMCC-DM1에 접합된 후 huCD37-38의 결합 친화성을 상기 실시예에 기술된 바와 같이 유세포분석기로 분석했다. 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값은 도 20B에 나타난 결합 곡선으로부터 산출했고 접합체 huCD37-38에 대해서는 1.04 nM 그리고 huCD37-38-SMCC-DM1에 대해서는 1.2 nM와 일치했다. 상기 결과는 SMCC-DM1 접합이 huCD38 항체의 친화성을 눈에 띄게 변화시키지 않음을 입증한다. 유사하게, SMCC-DM1에 접합된 후 huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 및 huCD37-57의 결합 친화성을 유세포분석기로 분석했다. 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값은 결합 곡선으로부터 산출했고 huCD37-50에 대해서는 0.43 nM, huCD37-50-SMCC-DM1에 대해서는 0.70 nM, huCD37-51에 대해서는 2.0 nM, huCD37-51-SMCC-DM1에 대해서는 1.6 nM, huCD37-56에 대해서는 0.3 nM, huCD37-56-SMCC-DM1에 대해서는 0.34 nM, huCD37-57에 대해서는 0.30 그리고 huCD37-57-SMCC-DM1에 대해서는 0.34와 일치했다. 상기 결과는 또한 SMCC-DM1 접합이 huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 또는 huCD37-57 항체의 친화성을 눈에 띄게 변화시키지 않음을 입증한다.
PEG4 - mal - DM1 접합체의 결합 친화성
PEG4-mal-DM1에 접합된 후 예시적인 huCD37-3 및 huCD37-50 항체의 결합 친화성을 상기 실시예에 기술된 바와 같이 유세포분석기로 분석했다. 겉보기 해리 상수(Kd)에 대한 값은 결합 곡선으로부터 산출했고 접합체huCD37-3에 대해서는 0.28 nM, huCD37-3-PEG4-mal-DM1에 대해서는 0.35 nM, huCD37-50에 대해서는 0.68 nM 그리고 huCD37-50-PEG4-mal-DM1에 대해서는 1.1 nM와 일치했다. 상기 결과는 PEG4-mal-DM1 접합이 예시적인 huCD37-3 또는 huCD50 항체의 친화성을 눈에 띄게 변화시키지 않음을 입증한다.
huCD37 -3- SMCC - DM1 접합체의 아폽토시스 -촉진 활성
SMCC-DM1에 접합된 후 huCD37-3의 아폽토시스-촉진 활성을 상기 기술된 바와 같이 라모스 세포에서 아넥신-V 염색을 통해 평가했다. huCD37-3 항체 또는 huCD37-3-SMCC-DM1 접합체를 이용한 처리는 대략 0.09 nM의 EC50 값을 가지고 대략 40%의 아넥신-V 양성 라모스 세포를 도출했다(도 21A). 비-결합 대조 항체 또는 비-결합 SMCC-DM1 대조 접합체로 처리된 라모스 세포는 단지 최대 4%의 아넥신-V 양성 세포를 내포했다. 이에 비교하여, 항-CD20 항체 리툭시맙을 이용한 처리는 대략 2 nM의 EC50값을 가지고 단지 16%의 아넥신-V 양성 세포를 도출했다. 이와 반대로, TRU-016 처리는 아넥신-V 양성 라모스 세포의 백분율을 증가시키지 않았다. 이는 인간 항-CD37 항체 huCD37-3의 강한 아폽토시스-촉진 활성이 SMCC-DM1에 접합된 후에 유지됨을 입증한다.
huCD37 -3- SMCC - DM1 접합체의 CDC 활성
SMCC-DM1에 접합된 후 huCD37-3의 CDC 활성을 5% 인간 보체의 존재하에 라모스 세포에서 평가했다. HuCD37-3 또는 huCD37-3-SMCC-DM1을 이용한 처리는 각각 53% 및 73%로 세포 생존도의 감소를 야기했다(도 21B). 그러므로, 예시적인 huCD37-3 항체의 CDC 활성은 메이탄시노이드 접합 후에 유지된다.
접합체의 ADCC 활성
SMCC-DM1 또는 PEG4-mal-DM1에 접합된 후 huCD37-3의 ADCC 활성을 인간 NK 효과기 세포의 존재하에 다우디 및 라모스 세포에서 상기 기술된 바와 같이 LDH 방출 분석을 통해 평가했다. 도 22A에서 볼 수 있는 바와 같이, huCD37-3-SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1 접합체는 다우디 세포 상의 비접합된 huCD37-3 항체와 유사한 ADCC 활성을 갖는다. HuCD37-3, huCD37-3 SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1을 이용한 처리는 각각 0.42 ng/mL, 1.13 ng/mL, 또는 0.91 ng/mL의 EC50 값을 가지고 대략 41%, 39% 또는 36%의 다우디 세포용해를 야기했다. 표적 세포와 유사한 결과를 라모스 세포를 이용하여 얻었다. 이전과 같이, huCD37-3-SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1 접합체는 라모스 세포 상의 비접합된 huCD37-3 항체에 상응하는 ADCC 활성을 가진다(도 22B). HuCD37-3, huCD37-3 SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1을 이용한 처리는 각각 0.95 ng/mL, 1.33 ng/mL, 또는 1.57 ng/mL의 EC50 값을 가지고 대략 43%, 41% 또는 42%의 라모스 세포용해를 야기했다. 그러므로, 예시적인 huCD37-3 항체의 강력한 ADCC 활성은 메이탄시노이드 접합 후에 유지된다.
huCD37 -3- SMCC - DM1 에 의한 세포주기정지의 유도
세포주에서 세포주기정지를 유발하는 항-CD37 항체 및 접합체의 잠재성을 프로피듐 아이오다이드(propridium iodide, PI) 염색 이후 유세포분석기 분석을 통해 평가했다. 기하급수적으로 성장하는 세포를 1,300 rpm으로 5 분간 실온에서 원심분리하여 수확하고 완전 RPMI 배지에 0.5 x 106 세포/mL로 재현탁했다. 세포를 웰당 1mL씩 24-웰 플레이트(팔콘(Falcon) 3077)으로 옮겨 0.5 x 106 세포/분석과 같게 했다. 검사 화합물을 10 nM의 최종 농도로 각 웰에 부가했다. 완전 RPMI 배지를 처리안된 대조 웰에 부가했다. 세포를 밤새 16 내지 20 시간 동안 37℃로 가습된 5% CO2 배양기에서 배양했다. 다음날, 세포를 5 mL 폴리스티렌 튜브로 옮겨서 수확하고, 3 mL PBS로 한 번 세척하고, 얼음에서 30분 동안 1 mL 70% 에탄올 내에 고정시켰다. 샘플을 이후 다시 3 mL PBS로 한 번 세척하고 0.5 mL PBS에 재현탁했다. Rnase를 샘플에 5 μL/mL씩 부가하고 37℃에서 30분 동안 배양했다. 샘플을 이후 50 μg/mL의 최종 농도로 프로피듐 아이오다이드를 이용하여 염색했다. PI 염색 후 24 시간 이내에 샘플을 획득했다. 샘플을 FACS칼리버(미국 샌디에고 소재, BD 바이오사이언스사 제품)에서 러닝시켰다. FL2-A 파라미터를 선형 스케일로 설정하고, G1 피크가 약 200에 위치하도록 FL2 PTM를 조정했다. 낮은 유속으로 샘플을 획득하고 샘플당 10,000회 수집했다. 세포 주기의 상이한 단계에 있는 세포의 분포를 모드핏(ModFit) 소프트웨어(버전 5.11, 미국, 베리티 소프트웨어 하우스 사(Verity Software House Inc.))를 이용하여 결정했다. 상기 프로그램은 PI 데이터를 자동으로 모델링하기 위해 피크 정합 기술을 활용하며 바람직한 정량적 데이터를 제공한다. 데이터를 표준 프로그램 설정을 이용하여 분석했다.
BJAB 및 RL 림프종 세포의 세포주기정지에 대한 huCD37-3 및 huCD37-3-SMCC-DM1의 효과를 10 nM 농도의 어느 한 화합물로 16-20 시간 배양한 후 평가했고 이후 프로피듐 아이오다이드(PI) 염색 및 유세포분석기 분석을 진행했다. huCD37-3-SMCC-DM1을 이용한 배양은 G2/M 단계의 세포의 백분율이 처리안된 BJAB 림프종 세포에 대한 13%부터 huCD37-3-SMCC-DM1 처리된 세포에 대한 95%까지 증가하는 것을 야기했다(도 23A). 유사하게, huCD37-3-SMCC-DM1를 이용한 배양은 G2/M 단계의 세포의 백분율이 처리안된 RL 림프종 세포에 대한 12%부터 huCD37-3-SMCC-DM1 처리된 세포에 대한 33%까지 증가하는 것을 야기했다(도 23B). 이와 반대로, huCD37-3 항체는 BJAB 또는 RL 세포의 세포 주기에 어떠한 영향도 주지 않았다. 그외에도, 동일한 농도로 검사된 비-결합 SMCC-DM1 접합체 또한 어떠한 세포 유형의 세포 주기에도 영향을 주지 않았다. 이는 분리된 항-CD37 항체로 만들어진 메이탄시노이드 접합체가 CD37-양성 림프종 세포주의 특정한 세포 주기 정지를 유발했음을 입증했다.
실시예 16
시험관 내( in vitro ) 세포독성 분석
세포 성장을 억제하는 항CD37 항체-접합체의 능력을 항체에 대한 실시예 10에 기술된 바와 같이 시험관 내( in vitro ) 세포독성 분석을 이용하여 측정했다. 간단하게, 표적 세포를 완전 RPMI 배지(RPMI-1640, 10% 소태아혈청, 2 mM 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 모든 시약은 인비트로겐 제품)내 100 μL로 웰당 5,000 세포씩 도말했다. 접합체를 연속 3-배 희석을 이용하여 완전 RPMI 배지로 희석하고 웰당 100 μL를 부가했다. 최종 농도는 전형적으로 3 x 10-8 M 내지 4.6 x 10-12 M 범위였다. 세포를 37℃에서 가습된 5% CO2 배양기에서 4 내지 5 일 동안 배양했다. 잔여 세포의 생존도를 항체 분석에 대해 기술된 바와 같이 비색 WST-8 분석을 통해 결정하고 450 nm(A450)에서의 흡광도를 다중웰 플레이트 판독기에서 측정했다(미국 메릴랜드 록빌 소재, 도진도 몰레큘라 테크놀로지 사). 생존도 백분율은 각각의 처리된 샘플값을 처리안된 세포를 가진 웰의 평균값으로 나눠서 산출했다. 상기 생존도 백분율 값을 각 처리에 있어서 항체-접합체 농도에 대해 반대수-선도에 도시했다.
다양한 항체의 SMCC - DM1 접합체의 시험관 내( in vitro ) 세포독성
다양한 항-CD37 항체로 만들어진 SMCC-DM1 접합체의 시험관 내( in vitro ) 세포독성을 비-특이적 huIgG-SMCC-DM1 접합체의 활성과 비교했다. huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-38-SMCC-DM1, huCD37-50-SMCC-DM1, huCD37-51-SMCC-DM1, huCD37-56-SMCC-DM1, huCD37-57-SMCC-DM1, 또는 비-결합 huIgG1-SMCC-DM1 대조 접합체로 배양된 다우디 세포에 대한 전형적인 세포독성 분석의 결과가 도 24A에 나타난다. 모든 특이적 접합체가 대조 접합체에 비해 특이적인 세포 살해를 야기했고 검사된 최대 농도에서 세포 생존도를 완전히 감소시켰다. EC50 값은 huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50, huCD37-51, huCD37-56 및 huCD37-57의 SMCC-DM1 접합체에 대해 각각 0.067 nM, 0.098 nM, 0.13 nM, 0.20 nM, 0.31 nM 및 0.35 nM와 일치했다. 이와 반대로, 비-결합 동형 대조 항체의 SMCC-DM1 접합체는 단지 20 nM의 EC50 값을 가지고 세포 살해를 야기했다.
유사하게, 도 24B는 huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-38-SMCC-DM1, huCD37-50-SMCC-DM1, huCD37-51-SMCC-DM1, 또는 비-결합 huIgG1-SMCC-DM1 대조 접합체로 5일 동안 배양된 그랜타-519 세포를 이용한 전형적인 세포독성 분석의 결과를 나타낸다. 모든 특이적 SMCC-DM1을 이용한 처리는 huCD37-3, huCD37-38, huCD37-50, 및 huCD37-51의 SMCC-DM1 접합체에 대해 각각 0.047 nM, 0.074 nM, 0.12 nM 및 0.25 nM의 EC50 값을 가지고 검사된 최대 농도에서 생존도를 완전히 감소시켰다. 이와 반대로, 비-결합 동형 대조 항체의 SMCC-DM1 접합체는 단지 20 nM의 EC50 값을 가지고 세포 살해를 야기했다.
huCD37 -3- SMCC - DM1 , - SPP - DM1 및 설포 - mal - DM4 접합체의 시험관 내( in vitro ) 세포독성
다우디, 그랜타-519 및 BJAB 세포에 대한 huCD37-3-SMCC-DM1, -SPP-DM1 및 설포-mal-DM4 접합체의 시험관 내( in vitro ) 세포독성을 비-특이적 huIgG-MCC-DM1 접합체의 활성과 비교했다. 검사된 모든 접합체가 검사된 최대 농도에서 huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-SPP-DM1 및 huCD37-3-설포-mal-DM4에 대해 각각 0.065 nM, 0.12 nM 및 0.14 nM의 EC50 값을 가지고 다우디 세포의 생존도를 완전히 감소시켰다. 이와 반대로, 비-특이적 huIgG-SMCC-DM1 접합체는 19 nM의 EC50을 가졌다. 유사하게, 검사된 모든 접합체가 검사된 최대 농도에서 huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-SPP-DM1 및 huCD37-3-설포-mal-DM4에 대해 각각 0.047 nM, 0.13 nM 및 0.088 nM의 EC50 값을 가지고 그랜타-519 세포의 생존도를 완전히 감소시켰다. 이와 반대로, 비-특이적 huIgG-SMCC-DM1 접합체는 19 nM의 EC50을 가졌다. 마지막으로, 검사된 모든 접합체가 검사된 최대 농도에서 huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-SPP-DM1 및 huCD37-3-설포-mal-DM4에 대해 각각 0.041 nM, 0.11 nM 및 0.11 nM의 EC50 값을 가지고 BJAB 세포의 생존도를 완전히 감소시켰다. 이와 반대로, 비-특이적 huIgG-SMCC-DM1 접합체는 16 nM의 EC50을 가졌다.
huCD37 -3- SMCC - DM1 및 huCD37 -3- PEG4 - mal - DM1 접합체의 시험관 내( in vitro ) 세포독성
일군의 림프종 세포주에 대한 huCD37-3-SMCC-DM1 및 huCD37-3-PEG4-mal-DM1 접합체의 시험관 내( in vitro ) 세포독성을 비-특이적 huIgG-SMCC-DM1 접합체의 활성과 비교했다. HuCD37-3접합체를 이용한 처리는 huCD37-3-SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1 접합체에 대해 각각 0.036 nM 또는 0.018 nM의 EC50을 가지고 검사된 최대 농도에서 다우디 세포 생존도를 완전히 감소시켰다. 이와 반대로, 비-결합 동형 대조 접합체는 huIgG-SMCC-DM1 또는 huIgG-PEG4-mal-DM1에 대해 각각 16 nM 또는 30 nM을 초과하는 EC50을 가지고 생존도를 감소시켰다. 유사하게, huCD37-3접합체를 이용한 처리는 huCD37-3-SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1 접합체에 대해 각각 0.014 nM 또는 0.012 nM의 EC50을 가지고 검사된 최대 농도에서 그랜타-519 세포 생존도를 완전히 감소시켰다. 이와 반대로, 비-결합 동형 대조 접합체는 huIgG-SMCC-DM1 또는 huIgG-PEG4-mal-DM1에 대해 각각 6.5 nM 또는 12 nM를 초과하는 EC50을 가지고 생존도를 감소시켰다.
일군의 림프종 세포주에 대한 huCD37-3-SMCC-DM1 및 huCD37-3-PEG4-mal-DM1 접합체의 시험관 내( in vitro ) 세포독성을 비-특이적 huIgG-SMCC-DM1 접합체의 활성과 비교했다. HuCD37-3접합체를 이용한 처리는 huCD37-3-SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1 접합체에 대해 각각 0.019 nM 또는 0.010 nM의 EC50을 가지고 검사된 최대 농도에서 BJAB 세포 생존도를 완전히 감소시켰다. 이와 반대로, 비-결합 동형 대조 접합체는 huIgG-SMCC-DM1 또는 huIgG-PEG4-mal-DM1에 대해 각각 13 nM 또는 17 nM의 EC50을 가지고 생존도를 감소시켰다. 유사하게, huCD37-3접합체를 이용한 처리는 huCD37-3-SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1 접합체에 대해 각각 0.031 nM 또는 0.024 nM의 EC50을 가지고 검사된 최대 농도에서 SU-DHL-4 세포 생존도를 완전히 감소시켰다. 이와 반대로, 비-결합 동형 대조 접합체는 huIgG-SMCC-DM1 또는 huIgG-PEG4-mal-DM1 둘다에 대해 30 nM을 초과하는 EC50을 가지고 생존도를 감소시켰다. huCD37-3-SMCC-DM1 접합체가 또한 FL 세포주 DOHH-2 뿐만 아니라 CLL 세포주 가령 JVM-2 및 JVM-3에 대한 잠재력을 나타냈다(도 32B).
HuCD37-3접합체를 이용한 처리는 huCD37-3-SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1 접합체에 대해 각각 0.071 nM 또는 0.045 nM의 EC50을 가지고 검사된 최대 농도에서 라지 세포 생존도를 완전히 감소시켰다. 이와 반대로, 비-결합 동형 대조 접합체는 huIgG-SMCC-DM1 또는 huIgG-PEG4-mal-DM1에 대해 각각 24 nM 또는 47 nM의 EC50을 가지고 생존도를 감소시켰다. 다음으로, 동일한 접합체를 라지-VCR로 지칭되는 빈크리스틴-내성 라지 클론으로 검사했다. 모 라지 세포에서 나타난 바와 같이, 접합체는 둘다 특이적 세포 살해를 나타냈다. HuCD37-3접합체를 이용한 처리는 huCD37-3-SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1 접합체에 대해 각각 0.11 nM 또는 0.037 nM 의 EC50을 가지고 검사된 최대 농도에서 라지-VCR 세포 생존도를 완전히 감소시켰다. 이와 반대로, 비-결합 동형 대조 접합체는 huIgG-SMCC-DM1 또는 huIgG-PEG4-mal-DM1에 대해 각각 46 nM 또는 100 nM의 EC50을 가지고 생존도를 감소시켰다.
HuCD37-3접합체를 이용한 처리는 huCD37-3-SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1 접합체에 대해 각각 0.033 nM 또는 0.024 nM의 EC50을 가지고 검사된 최대 농도에서 나말와 세포 생존도를 완전히 감소시켰다. 이와 반대로, 비-결합 동형 대조 접합체는 huIgG-SMCC-DM1 또는 huIgG-PEG4-mal-DM1에 대해 각각 20 nM 또는 30 nM을 초과하는 EC50을 가지고 생존도를 감소시켰다. 유사하게, huCD37-3접합체를 이용한 처리는 huCD37-3-SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1 접합체에 대해 각각 0.16 nM 또는 0.069 nM의 EC50을 가지고 검사된 최대 농도에서 라모스 세포 생존도를 완전히 감소시켰다. 이와 반대로, 비-결합 동형 대조 접합체는 huIgG-SMCC-DM1에 대해 20 nM 및 huIgG-PEG4-mal-DM1에 대해 30 nM을 초과하는 EC50을 가지고 생존도를 감소시켰다.
항원 음성 Molt -4 세포에 대한 huCD37 -3- SMCC - DM1 의 시험관 내( in vitro ) 세포독성
huCD37-3-SMCC-DM1 세포독성의 특이성을 더욱 규명하기 위해, 이의 활성을 비-CD37 발현 Molt-4 T-세포 급성 림프구성 백혈병 세포주에 대한 비-특이적 huIgG-MCC-DM1 접합체와 비교했다. 상대적으로 빈약한 비-특이적 세포독성을 포착하기 위해 접합체 둘다의 증가된 농도를 본 실험에서 사용했다. HuCD37-3-SMCC-DM1 및 비-특이적 접합체는 각각 38 nM 및 42 nM의 EC50을 가지고 동일한 세포독성을 나타냈다.
항- CD37 항체 메이탄시노이드 접합체의 시험관 내( in vitro ) 세포독성의 요약
이들 세포독성 결과를 함께 놓고 볼 때, 분리된 항-CD37 항체로 만들어진 접합체가 일군의 CD37-양성 림프종 세포주에 대해 특이적인 세포독성을 나타냈음이 명백하다(도 32B). 각각의 경우에 검사된 양호한 특이성 창(specificity window)이 각각의 CD37-발현 세포주에 대해 관찰되어, 세포독성이 표적 세포에 특이적 항-CD37 항체가 결합한 결과임을 시사한다. 그외에도, huCD37-3-SMCC-DM1 및 비-특이적 접합체는 항원-음성 Molt-4 세포에 대해 동일한 빈약한 세포독성을 나타냈다. 이는 상기 예시적인 접합체에 대해 관찰된 세포독성이 CD37 발현에 의존적임을 입증한다. huCD37-3 항체는 또한 DOHH-2, 그라나타-519, SU-DHL-4, JVM-2, 및 JVM-3를 비롯한 많은 세포주에 대해 활성이었다. 이와 반대로, 항-CD37 SMIP TRU-016 화합물은 임의의 이들 세포주의 생존에 어떠한 직접적인 영향도 주지 않았다. 항-CD20 항체는 정량적 유세포분석기로 측정하면 대개 더 높은 CD20 발현 수준에도 불구하고 이들 세포주의 대부분에서 huCD37-3보다 덜 직접적인 활성을 나타냈다(도 32A).
실시예 17
BJAB 이종이식 모델에서 항- CD37 항체 및 이들의 SMCC - DM1 접합체의 생체 내( in vivo ) 효능
항-CD37 항체 및 이들의 SMCC-DM1 접합체를 SCID 마우스에 피하로 이식된 BJAB 림프종 세포를 이용하는 공인된 이종이식 모델로 검사했다. 동물을 종양이 대략 120 mm3 의 평균 종양 부피에 도달할 때 종양 부피에 따라 치료군으로 무작위배정하고, 세포 접종 후 제12일에 한 번 10 mg/kg의 (A) huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-50 Ab, huCD37-50-SMCC-DM1 또는 (B) huCD37-38 Ab, huCD37-38-SMCC-DM1, huCD37-56 Ab, huCD37-56-SMCC-DM1로 처리했다. 상이한 치료군의 평균 종양 부피가 종양 세포 접종 후 시간에 대해 도 25에 도시된다. 임의의 항체를 이용한 처리가 평균 종양 부피의 완만한 감소를 야기했던 반면, 임의의 SMCC-DM1 접합체를 이용한 처리는 평균 종양 부피의 더욱 상당한 감소를 야기했음이 명백하다. 그 외에도, 각각의 처리에 대해 %T/C 값을 산출했고 이는 각 처리군의 중간 종양 부피를 비히클 처리군의 중간 종양 부피로 나눈 것에 해당한다. 42% 아래의 % T/C 값을 갖는 처리는 활성인 것으로 간주되며, 12% 아래의 % T/C 값을 갖는 처리는 매우 활성인 것으로 간주된다. 검사된 모든 SMCC-DM1 접합체를 이용한 처리는 중간 종양 부피의 상당한 감소를 야기했다. 세포 접종후 제29일의 %T/C 값은 huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-50-SMCC-DM1, huCD37-38-SMCC-DM1 또는 huCD37-56-SMCC-DM1에 대해 각각 20%, 20%, 9% 또는 4%와 일치했다.
BJAB 이종이식 모델에서 huCD37 -3 항체, 설포 - mal - DM4 , - SPP - DM1 및 SMCC-DM1 접합체의 생체 내( in vivo ) 효능
추가적인 메이탄시노이드 접합체의 생체 내(in vivo) 효능을 평가하기 위해, 예시적인 huCD37-3 항체의 설포-mal-DM4 및 SPP-DM1 접합체를 SCID 마우스에 정맥으로 이식한 BJAB 림프종 세포를 이용하는 이종이식 모델에서 SMCC-DM1 접합체와 비교했다.
동물을 종양이 대략 120 mm3 의 평균 종양 부피에 도달할 때 종양 부피에 따라 치료군으로 무작위배정하고, 세포 접종 후 제9일에 한 번 10 mg/kg의 huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-설포-mal-DM4 또는 5 mg/kg의 huCD37-3-SPP-DM1로 처리했다. 상이한 치료군의 평균 종양 부피가 종양 세포 접종 후 시간에 대해 도 26에 도시된다. 임의의 접합체를 이용한 처리가 평균 종양 부피의 상당한 감소를 야기했음이 명백하다. 각각의 처리에 대한 %T/C 값을 각 처리군에 대한 중간 종양 부피를 이용하여 상기 기술된 바와 같이 산출했다. 세포 접종후 제21일의 %T/C 값은 huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-설포-mal-DM4 또는 huCD37-3-SPP-DM1에 대해 각각 49%, 5%, 7% 또는 4%와 일치했다. 실험의 마지막인 제121일에, huCD37-3-설포-mal-DM4 처리는 8 마리 중 3마리의 종양-없는 생존체(tumor-free survivor, TFS)를 도출한 반면, huCD37-3-SPP-DM1 처리는 8마리 중 1마리의 TFS를 도출했다. huCD37-3 항체, huCD37-3-SMCC-DM1 또는 PBS 비히클 대조군에서는 어떠한 TFS도 관찰되지 않았다. 이는 예를 들어 SMCC-DM1, 설포-mal-DM4 또는 SPP-DM1 접합체와 같은 huCD37-3 항체의 메이탄시노이드 접합체가 BJAB 모델에서 매우 활성이었음을 시사했다.
SU - DHL -4 이종이식 모델에서 huCD37 -3 항체, 설포 - mal - DM4 , - SPP - DM1 및 SMCC-DM1 접합체의 생체 내( in vivo ) 효능
예시적인 huCD37-3 항체의 설포-mal-DM4 및 SPP-DM1 접합체의 생체 내( in vivo) 효능을 SMCC-DM1 접합체와 비교하여 평가하기 위해 SCID 마우스에 피하로 이식된 SU-DHL-4 미만성 거대 B-세포 림프종 세포를 이용하는 두 번째 이종이식 모델을 사용했다. 동물을 종양이 안착되었을 때 체중에 따라 치료군으로 무작위배정하고, 세포 접종 후 제17일에 한 번 10 mg/kg의 huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-설포-mal-DM4 또는 5 mg/kg의 huCD37-3-SPP-DM1로 처리했다. 상이한 치료군의 중간 종양 부피가 종양 세포 접종 후 시간에 대해 도 27에 도시된다. huCD37-3 항체를 이용한 처리가 중간 종양 부피의 감소를 야기했던 반면, 임의의 접합체를 이용한 처리가 중간 종양 부피의 더욱 상당한 감소를 야기했음이 명백하다. 각각의 치료에 대한 %T/C 값을 상기 기술된 바와 같이 산출했다. 세포 접종 후 제37일의 %T/C 값은 huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, huCD37-3-설포-mal-DM4 또는 huCD37-3-SPP-DM1에 대해 각각 32%, 1%, 1% 또는 3%와 일치했다. 실험의 마지막인 제125일에, huCD37-3-SMCC-DM1 또는 huCD37-3-설포-mal-DM4 처리는 10 마리 중 8 마리의 종양-없는 생존체(TFS)를 도출한 반면, huCD37-3-SPP-DM1 처리는 10 마리 중 9 마리의 TFS를 도출했다. huCD37-3 항체 또는 PBS 비히클 대조군에서는 어떠한 TFS도 관찰되지 않았다. 이는 SU-DHL-4 모델에서 단일 10 mg/kg 용량으로 huCD37-3 항체가 그 자체로 활성이었음을 시사했다. 그 외에도, 예를 들면 SMCC-DM1, 설포-mal-DM4 또는 SPP-DM1 접합체와 같은 메이탄시노이드 접합체는 항체에 효능을 부가했고 상기 모델에서 훨씬 많은 효력을 야기했다.
BJAB 이종이식 모델에서 huCD37 -3 항체, PEG4 - mal - DM1 및 SMCC - DM1 접합체의 생체 내( in vivo ) 효능
huCD37-3 항체 및 이의 PEG4-mal-DM1 and SMCC-DM1 접합체를 SCID 마우스에 피하로 이식된 BJAB 림프종 세포를 이용하는 공인된 이종이식 모델에서 검사했다. 동물을 종양이 대략 120 mm3 의 평균 종양 부피에 도달할 때 종양 부피에 따라 치료군으로 무작위배정하고, 세포 접종 후 제9일에 한 번 10 mg/kg의 huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1로 처리했다. 도 28에 나타난 바와 같이, 양쪽 접합체를 이용한 처리는 평균 종양 부피의 상당한 감소를 야기했다. 각각의 처리에 대한 %T/C 값을 각 처리군에 대한 중간 종양 부피를 이용하여 상기 기술된 바와 같이 산출했다. 세포 접종 후 제24일의 %T/C 값은 huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1에 대해 각각 48%, 16% 또는 5%와 일치했다. 세포 접종 후 제 74일에, huCD37-3-SMCC-DM1 처리는 9 마리중 1 마리의 종양-없는 생존체(TFS)를 도출했던 반면, huCD37- PEG4-mal-DM1 처리는 9 마리중 1 마리의 TFS를 도출했다. huCD37-3 항체 또는 PBS 비히클 대조군에서는 어떠한 TFS도 관찰되지 않았다. 그 외에도, huCD37-3-SMCC-DM1은 세포 접종 후 제24일에 34%의 %T/C 값을 가지고 상기 모델에서 5 mg/kg의 단일 용량으로 활성이었다. 이는 예를 들면 SMCC-DM1 또는 PEG4-mal-DM1 접합체와 같은 huCD37-3 항체의 메이탄시노이드 접합체가 BJAB 모델에서 매우 활성이었음을 시사했다.
SU - DHL -4 이종이식 모델에서 huCD37 -3 항체, PEG4 - mal - DM1 and SMCC - DM1 접합체의 생체 내( in vivo ) 효능
huCD37-3 항체 및 이의 PEG4-mal-DM1 및 SMCC-DM1 접합체를 SCID 마우스에 피하로 이식된 SU-DHL-4 미만성 거대 B-세포 림프종 세포를 이용하는 공인된 이종이식 모델에서 검사했다. 동물을 체중에 따라 치료군으로 무작위배정하고, 세포 접종 후 제15일에 한 번 10 mg/kg의 huCD37-3 Ab, huCD37-3-SMCC-DM1 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1로 처리했다. 상이한 치료군의 평균 종양 부피가 종양 세포 접종 후 시간에 대해 도 29에 도시된다. huCD37-3 항체를 이용한 처리가 평균 종양 부피의 감소를 야기했던 반면 양쪽 접합체를 이용한 처리가 평균 종양 부피의 더욱 상당한 감소를 야기했음이 명백하다. 각각의 처리에 대한 %T/C 값을 각 처리군에 대한 중간 종양 부피를 이용하여 상기 기술된 바와 같이 산출했다. 세포 접종 후 제38일의 %T/C 값은 huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, 또는 huCD37-3-PEG4-mal-DM1에 대해 각각 34%, 4% 또는 2%와 일치했다. 세포 접종 후 제74일에, huCD37-3-SMCC-DM1 처리는 10 마리 중 8 마리의 종양-없는 생존체(TFS)를 도출했던 반면, huCD37-3- PEG4-mal-DM1 처리는 10 마리 중 10 마리의 TFS를 도출했다. huCD37-3 항체 또는 PBS 비히클 대조군에서는 어떠한 TFS도 관찰되지 않았다. 이는 SU-DHL-4 모델에서 단일 10 mg/kg 용량으로 huCD37-3 항체가 그 자체로 활성이었음을 시사했다. 그 외에도, 예를 들면 SMCC-DM1 또는 PEG4-mal-DM1 접합체와 같은 메이탄시노이드 접합체는 항체에 대한 비접합된 항체 효능과 비교하여 증진된 효능을 나타냈고 상기 모델에서 훨씬 많은 효력을 야기했다. huCD37-3-SMCC-DM1 접합체는 또한 상기 모델에서 세포 접종 후 제37일에 각각 18% 및 6%의 %T/C 값을 가지고 2.5 또는 5 mg/kg의 단일 용량으로 강한 효능을 나타냈다.
DoHH2 이종이식 모델에서 huCD37 -3 항체, huCD37 -3- SMCC - DM1 접합체, 리툭시맙 항체의 생체 내( in vivo ) 효능 및 시클로포스파미드 , 빈크리스틴 , 및 프레드니손( CVP )의 용법
huCD37-3 항체 및 이의 SMCC-DM1 접합체를 SCID 마우스에 피하로 이식된 DoHH2 여포성 림프종 세포를 이용하는 공인된 이종이식 모델에서 검사했다. 동물을 종양 부피에 따라 치료군으로 무작위배정하고, 접종 후 제12일에 10 mg/kg의 단일 용량인 huCD37-3 항체 또는 huCD37-3-SMCC-DM1 접합체로; 2 mg/kg의 6회 용량인 리툭시맙으로 3주 동안 주 2회로; 또는 단일 40 mg/kg 용량의 시클로포스파미드, 및 0.5 mg/kg의 빈크리스틴을 5회의 하루 0.2 mg/kg 용량의 프레드니손(CVP)과 함께 투여하는 용법으로 치료를 시작했다. 상이한 치료군의 중간 종양 부피를 종양 세포 접종 후 시간에 대해 도 30에 도시했다. huCD37-3 항체를 이용한 처리가 중간 종양 부피의 감소를 야기했던 반면, huCD37-3-SMCC-DM1 접합체를 이용한 처리는 중간 종양 부피의 더욱 상당한 감소를 야기했다. huCD37-3-SMCC-DM1 접합체는 리툭시맙을 이용한 처리와 유사한 중간 종양 감소를 야기했고 CVP를 이용한 처리에 비해서 훨씬 지속적인 중간 종양 감소를 야기했다. 종양 성장 지연(T-C 값)은 처리군(T) 및 대조군(C) 종양이 소정의 크기에 도달하기까지 요구되는 중간 시간(일)로서 정의되고, 종양 없는 생존체를 배제한 각 처리군에 대해 산출했다. 중간 처리 종양이 800 mm3에 도달하는데 대한 T-C 값은 huCD37-3, huCD37-3-SMCC-DM1, 리툭시맙 및 CVP에 대해 각각 8, 25, 24, 및 13일과 일치했다. 실험의 마지막인, 세포 접종 후 제139일에, huCD37-3-SMCC-DM1 처리는 9 마리 중 1 마리의 종양-없는 생존체(TFS)를 도출했다. huCD37-3 항체, 리툭시맙, CVP, 또는 PBS 비히클 대조군에서는 어떠한 TFS도 관찰되지 않았다. SMCC-DM1 접합체는 리툭시맙에 필적하는 종양 성장 지연 및, 비접합된 항체 및 DoHH2 모델에서 CVP를 이용한 처리에 비해 증진된 종양 성장 지연을 나타냈다.
JVM -3 이종이식 모델에서 huCD37 -3 항체, huCD37 -3- SMCC - DM1 접합체, 오파투무맙 항체 및 벤다무스틴의 생체 내( in vivo ) 효능
huCD37-3 항체 및 이의 huCD37-3-SMCC-DM1 접합체를 SCID 마우스에 피하로 이식된 JVM-3 만성 림프구성 백혈병 세포를 이용하는 공인된 이종이식 모델에서 검사했다. 동물을 종양 부피에 따라 치료군으로 무작위배정하고, 접종 후 제7일에 10 mg/kg의 단일 용량인 huCD37-3 항체로, 5 또는 10 mg/kg 용량의 huCD37-3-SMCC-DM1 접합체로, 5 mg/kg의 6회 용량의 오파투무맙을 3주간 주 2회로, 또는 단일 50 mg/kg 용량의 벤다무스틴으로 치료를 시작했다. 상이한 치료군의 중간 종양 부피를 종양 세포 접종 후 시간에 대해 도 31에 도시했다. huCD37-3 항체를 이용한 처리가 중간 종양 부피의 감소를 야기했던 반면, huCD37-3-SMCC-DM1 접합체를 이용한 처리는 중간 종양 부피의 더욱 상당한 감소를 야기했다. 각각의 처리에 대한 %T/C 값을 각 처리군에 대한 중간 종양 부피를 이용하여 상기 기술된 바와 같이 산출했다. 세포 접종 후 제20일의 %T/C 값은 huCD37-3, 5 mg/kg huCD37-3-SMCC-DM1, 10 mg/kg huCD37-3-SMCC-DM1, 오파투무맙, 및 벤다무스틴에 대해 각각 31%, 19%, 10%, 35%, 및 38%과 일치했다. 실험의 마지막인, 세포 접종 후 제76일에, huCD37 및 오파투무맙 항체 처리는 둘다 10 마리 중 1 마리의 종양-없는 생존체(TFS)를 도출했던 반면, 5 및 10 mg/kg씩의 huCD37-3-SMCC-DM1는 각각 10 마리 중 1 및 2 마리의 TFS를 도출했다. 벤다무스틴 또는 PBS 비히클 대조군에서는 어떠한 TFS도 관찰되지 않았다. 이는 JVM-3 모델에서 단일 10 mg/kg 용량으로 huCD37-3 항체가 그 자체로 활성이었음을 시사했다. 메이탄시노이드 접합체인, huCD37-3-SMCC-DM1는 비접합된 항체에 비해 증진된 효능을 나타냈다. 그 외에도, huCD37-3-SMCC-DM1 메이탄시노이드 접합체를 이용한 처리는 상기 모델에서 오파투무맙 또는 벤다무스틴 처리보다 훨씬 많은 효력을 야기했다.
항- CD37 항체 접합체의 생체 내( in vivo ) 효능의 요약
CD37는 메이탄시노이드 면역접합체를 위한 표적으로서 평가되지 않았지만, CD20는 평가되었던 바 있다. CD37 및 CD20는 두 항원이 모두 4개의 막관통 도메인 및 하나의 소형 및 하나의 대형 세포외 루프를 포함하는 세포 표면 단백질로서 구조적으로 유사하다. 양쪽 항원에 대한 항체는 서서히 내화되며 느린 속도 내지 중간 속도의 세포내 대사를 가지는 것으로 나타났다(Press et al. 1989, Cancer Res. 49(17):4906-12, 및 Press et al. 1994, Blood. 83(5):1390-7). CD20 항체의 면역접합체는 이미 평가된 바 있다. 한 경우에, 항-CD20 항체의 비-절단성 MCC-DM1 접합체가 비접합된 항체와 동일한 효능을 나타냈던 반면, 동일한 항체의 절단성 SPP-DM1 접합체는 SCID 마우스의 그랜타-519 이종이식 모델에서 개선된 효능을 나타냈다(Polson AG, Cancer Res 2009;69:2358-64). 유사하게, 산-안정한 아미드 연결기로 이루어진 리툭시맙의 칼리키아미신 접합체는 누드 마우스의 라모스 이종이식 모델에서 개선된 생체 내(in vivo) 효능을 나타내지 않았다. 오로지 산-분해성 디메틸 히드라지드 Ac-But 연결기로 이루어진 리툭시맙의 칼리키아미신 접합체만이 상기 연구에서 개선된 생체 내(in vivo) 효능을 나타냈다(DiJoseph JF, Cancer Immunol Immunotherapy 2007;56:1107-1117).
이와 매우 대조적으로 본 발명의 몇몇 분리된 항-CD37 항체의 비-절단성 SMCC-DM1 접합체는 BJAB, SU-DHL-4, DoHH2 및 JVM-3 이종이식 모델에서 비접합된 항체에 비해 극적으로 개선된 생체 내( in vivo ) 효능을 나타낸다. 이는 분리된 항체가 이들을 생체 내( in vivo )에서 예를 들면 SMCC-DM1 접합체와 같은 메이탄시노이드 접합체로서 더욱 효과적이도록 하는 고유한 특성을 가짐을 암시한다.
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내용 및 요약 부분을 제외한 상세한 설명 단락이 청구항을 해석하는데 사용되도록 의도됨이 이해되어야 한다. 내용 및 요약 단락은 전부는 아니지만 하나 이상의, 본 발명자들에 의해 포함된 본 발명의 예시적인 구체예를 제시하며, 따라서 본 발명 및 첨부된 청구범위를 어떠한 방식으로든 제한하지 않는 것으로 의도된다.
본 발명은 상기에서 구체적인 기능 및 이들의 관계의 적용을 예시하는 기능적 구성 요소들을 보조로 하여 기술되었다. 이들 기능적 구성 요소들의 경계는 서술의 편의를 위해 본 명세서에서 임의로 규정되었다. 대체되는 경계들은 구체적인 기능 및 이들의 관계가 적절하게 수행되는 경우에 한해 정의될 수 있다.
특정 구체예의 전술된 설명은 본 발명의 일반적인 특성을 완전히 드러내므로 다른 이들이 본 발명의 일반적 개념으로부터 벗어나지 않고 당해 분야의 기술적 지식을 적용하여, 과도한 실험 없이도 특정 구체예와 같은 다양한 응용 분야를 위해 쉽게 변형 및/또는 적응시킬 수 있을 것이다. 그러므로, 그러한 적응 및 변형은 본 명세서에 제시된 교시 및 안내를 기초로 하여, 개시된 구체예의 의미 및 동등한 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서의 용어 또는 어법이 당업자에게 본 교시 및 안내에 비추어 해석되도록, 본 명세서의 어법 및 용어는 제한이 아닌 설명의 목적을 위함임이 이해되어야 한다.
본 발명의 폭 및 범위는 상기-기술된 어떠한 예시적인 구체예에도 제한되어서는 안되며, 오로지 다음의 청구 범위 및 이들과 등가인 범위에 따라 정의되어야 한다.
ATCC (American Type Culture Collection) PTA-10664 20100218 ATCC PTA-10665 20100218 ATCC PTA-10666 20100218 ATCC PTA-10667 20100218 ATCC PTA-10668 20100218 ATCC PTA-10669 20100218 ATCC PTA-10670 20100218 ATCC PTA-10722 20100318 ATCC PTA-10723 20100318
SEQUENCE LISTING <110> Immunogen, Inc. Deckert, Jutta Park, Peter Tavares, Daniel Rui, Lingyun <120> CD37-BINDING MOLECULES AND IMMUNOCONJUGATES THEREOF <130> 2921.003PC03 <140> PCT/US2011/028172 <141> 2011-03-11 <150> 61/412,644 <151> 2010-11-11 <150> 61/327,314 <151> 2010-04-23 <150> 61/313,628 <151> 2010-03-12 <160> 198 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 280 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD37 <400> 1 Met Ser Ala Gln Glu Ser Cys Leu Ser Leu Ile Lys Tyr Phe Leu Phe 1 5 10 15 Val Phe Asn Leu Phe Phe Phe Val Leu Gly Ser Leu Ile Phe Cys Phe 20 25 30 Gly Ile Trp Ile Leu Ile Asp Lys Thr Ser Phe Val Ser Phe Val Gly 35 40 45 Leu Ala Phe Val Pro Leu Gln Ile Trp Ser Lys Val Leu Ala Ile Ser 50 55 60 Gly Ile Phe Thr Met Gly Ile Ala Leu Leu Gly Cys Val Gly Ala Leu 65 70 75 80 Lys Glu Leu Arg Cys Leu Leu Gly Leu Tyr Phe Gly Met Leu Leu Leu 85 90 95 Leu Phe Ala Thr Gln Ile Thr Leu Gly Ile Leu Ile Ser Thr Gln Arg 100 105 110 Ala Gln Leu Glu Arg Ser Leu Arg Asp Val Val Glu Lys Thr Ile Gln 115 120 125 Lys Tyr Gly Thr Asn 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Phe 165 170 175 Val Pro Cys Ser Cys Tyr Asn Ser Thr Ala Thr Asn Asp Ser Thr Val 180 185 190 Phe Asp Lys Leu Phe Phe Ser Gln Leu Ser Arg Leu Gly Pro Arg Ala 195 200 205 Lys Leu Arg Gln Thr Ala Asp Ile Cys Ala Leu Pro Ala Lys Ala His 210 215 220 Ile Tyr Arg Glu Gly Cys Ala Gln Ser Leu Gln Lys Trp Leu His Asn 225 230 235 240 Asn Ile Ile Ser Ile Val Gly Ile Cys Leu Gly Val Gly Leu Leu Glu 245 250 255 Leu Gly Phe Met Thr Leu Ser Ile Phe Leu Cys Arg Asn Leu Asp His 260 265 270 Val Tyr Asp Arg Leu Ala Arg Tyr Arg 275 280 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-3, VH-CDR1 <400> 4 Thr Ser Gly Val Ser 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-3, VH-CDR2 <400> 5 Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-3, VH-CDR3 <400> 6 Gly Gly Tyr Ser Leu Ala His 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-12, VH-CDR1 <400> 7 Lys Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-12, VH-CDR2 <400> 8 Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ser Arg 1 5 10 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-12, VH-CDR3 <400> 9 Gly Thr Val Val Ala Asp 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-38, VH-CDR1 <400> 10 Ser Gly Phe Gly Trp His 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-38, VH-CDR2 <400> 11 Tyr Ile Leu Tyr Ser Gly Gly Thr Asp 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-38, VH-CDR3 <400> 12 Gly Tyr Tyr Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Val Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-50, VH-CDR1 <400> 13 Ser Gly Phe Ala Trp His 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-50, VH-CDR2 <400> 14 Tyr Ile Leu Tyr Ser Gly Ser Thr Val 1 5 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-50, VH-CDR3 <400> 15 Gly Tyr Tyr Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-51, VH-CDR1 <400> 16 Ser Gly Phe Ala Trp His 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-51, VH-CDR2 <400> 17 Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Asn 1 5 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-51, VH-CDR3 <400> 18 Gly Tyr Tyr Gly Phe Gly Ala Trp Phe Val Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-56, VH-CDR1 <400> 19 Ser Gly Phe Ala Trp His 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-56, VH-CDR2 <400> 20 Tyr Ile His Tyr Ser Gly Gly Thr Asn 1 5 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-56, VH-CDR3 <400> 21 Gly Tyr Tyr Gly Phe Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Antibody CD37-57, VH-CDR1 <400> 22 Ser Gly Phe Ala Trp His 1 5 <210> 23 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Xaa 1 5 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain CDR amino acid sequence; Consensus, VH-CDR3 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Where Xaa is Tyr or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Where Xaa is Val or Ala <400> 27 Gly Tyr Tyr Gly Xaa Gly Ala Trp Phe Xaa Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-3, VL-CDR1 <400> 28 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Arg Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-3, VL-CDR2 <400> 29 Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-3, VL-CDR3 <400> 30 Gln His Tyr Trp Gly Thr Thr Trp Thr 1 5 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-12, VL-CDR1 <400> 31 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-12, VL-CDR2 <400> 32 Tyr Ala Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-12, VL-CDR3 <400> 33 Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr 1 5 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-38, VL-CDR1 <400> 34 Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met His 1 5 10 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-38, VL-CDR2 <400> 35 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-38, VL-CDR3 <400> 36 Gln Gln Trp Ile Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-50, VL-CDR1 <400> 37 Ser Ala Thr Ser Ser Val Thr Tyr Met His 1 5 10 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-50, VL-CDR2 <400> 38 Asp Thr Ser Lys Leu Pro Tyr 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-50, VL-CDR3 <400> 39 Gln Gln Trp Ser Asp Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-50, VL-CDR2, Humanized <400> 40 Asp Thr Ser Asn Leu Pro Tyr 1 5 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-51, VL-CDR1 <400> 41 Ser Ala Thr Ser Ser Val Thr Tyr Met His 1 5 10 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-51, VL-CDR2 <400> 42 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chain CDR amino acid sequence; CD37-57, VL-CDR1 <400> 48 Ser Ala Thr Ser Ser Val Thr Tyr Met His 1 5 10 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-57, VL-CDR2 <400> 49 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-57, VL-CDR3 <400> 50 Gln Gln Trp Ser Asp Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; CD37-57, VL-CDR2, Humanized <400> 51 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; Consensus, VL-CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Where Xaa is Thr or Ser <400> 52 Ser Ala Xaa Ser Ser Val Thr Tyr Met His 1 5 10 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain CDR amino acid sequence; 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Arg Asn Leu Asp His 260 265 270 Val Tyr Asn Arg Leu Ala Arg Tyr Arg 275 280 <210> 191 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD37-Mac12 <400> 191 Met Ser Ala Gln Glu Ser Cys Leu Ser Leu Ile Lys Tyr Phe Leu Phe 1 5 10 15 Val Phe Asn Leu Phe Phe Phe Val Leu Gly Ser Leu Ile Phe Cys Phe 20 25 30 Gly Ile Trp Ile Leu Ile Asp Lys Thr Ser Phe Val Ser Phe Val Gly 35 40 45 Leu Ala Phe Val Pro Leu Gln Ile Trp Ser Lys Val Leu Ala Ile Ser 50 55 60 Gly Ile Phe Thr Met Gly Ile Ala Leu Leu Gly Cys Val Gly Ala Leu 65 70 75 80 Lys Glu Leu Arg Cys Leu Leu Gly Leu Tyr Phe Gly Met Leu Leu Leu 85 90 95 Leu Phe Ala Thr Gln Ile Thr Leu Gly Ile Leu Ile Ser Thr Gln Arg 100 105 110 Ala Gln Leu Glu Arg Ser Leu Gln Asp Ile Val Glu Lys Thr Ile Gln 115 120 125 Arg Tyr His Thr Asn Pro Glu Glu Thr Ala Ala Glu Glu Ser Trp Asp 130 135 140 Tyr Val Gln Phe Gln Leu Arg Cys Cys Gly Trp His Ser Pro Gln Asp 145 150 155 160 Trp Phe Gln Val Leu Thr Leu Arg Gly Asn Gly Ser Glu Ala His Arg 165 170 175 Val Pro Cys Ser Cys Tyr Asn Leu Ser Ala Thr Asn Asp Ser Thr Ile 180 185 190 Leu Asp Lys Val Ile Leu Pro Gln Leu Ser Arg Leu Gly His Leu Ala 195 200 205 Arg Ser Arg His Ser Ala Asp Ile Cys Ala Val Pro Ala Glu Ser His 210 215 220 Ile Tyr Arg Glu Gly Cys Ala Gln Gly Leu Gln Lys Trp Leu His Asn 225 230 235 240 Asn Leu Ile Ser Ile Val Gly Ile Cys Leu Gly Val Gly Leu Leu Glu 245 250 255 Leu Gly Phe Met Thr Leu Ser Ile Phe Leu Cys Arg Asn Leu Asp His 260 265 270 Val Tyr Asn Arg Leu Ala Arg Tyr Arg 275 280 <210> 192 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD37-Mac4 <400> 192 Met Ser Ala Gln Glu Ser Cys Leu Ser Leu Ile Lys Tyr Phe Leu Phe 1 5 10 15 Val Phe Asn Leu Phe Phe Phe Val Leu Gly Ser Leu Ile Phe Cys Phe 20 25 30 Gly Ile Trp Ile Leu Ile Asp Lys Thr Ser Phe Val Ser Phe Val Gly 35 40 45 Leu Ala Phe Val Pro Leu Gln Ile Trp Ser Lys Val Leu Ala Ile Ser 50 55 60 Gly Ile Phe Thr Met Gly Ile Ala Leu Leu Gly Cys Val Gly Ala Leu 65 70 75 80 Lys Glu Leu Arg Cys Leu Leu Gly Leu Tyr Phe Gly Met Leu Leu Leu 85 90 95 Leu Phe Ala Thr Gln Ile Thr Leu Gly Ile Leu Ile Ser Thr Gln Arg 100 105 110 Ala Gln Leu Glu Arg Ser Leu Arg Asp Val Val Glu Lys Thr Ile Gln 115 120 125 Lys Tyr Gly Thr Asn Pro Glu Glu Thr Ala Ala Glu Glu Ser Trp Asp 130 135 140 Tyr Val Gln Phe Gln Leu Arg Cys Cys Gly Trp His Tyr Pro Gln Asp 145 150 155 160 Trp Phe Gln Val Leu Ile Leu Arg Gly Asn Gly Ser Glu Ala His Arg 165 170 175 Val Pro Cys Ser Cys Tyr Asn Leu Ser Ala Thr Asn Asp Ser Thr Ile 180 185 190 Leu Asp Lys Val Ile Leu Pro Gln Leu Ser Arg Leu Gly Gln Leu Ala 195 200 205 Arg Ser Arg His Ser Thr Asp Ile Cys Ala Val Pro Ala Glu Ser His 210 215 220 Ile Tyr Arg Glu Gly Cys Ala Gln Gly Leu Gln Lys Trp Leu His Asn 225 230 235 240 Asn Leu Ile Ser Ile Val Gly Ile Cys Leu Gly Val Gly Leu Leu Glu 245 250 255 Leu Gly Phe Met Thr Leu Ser Ile Phe Leu Cys Arg Asn Leu Asp His 260 265 270 Val Tyr Asn Arg Leu Ala Arg Tyr Arg 275 280 <210> 193 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD37-Mac5 <400> 193 Met Ser Ala Gln Glu Ser Cys Leu Ser Leu Ile Lys Tyr Phe Leu Phe 1 5 10 15 Val Phe Asn Leu Phe Phe Phe Val Leu Gly Ser Leu Ile Phe Cys Phe 20 25 30 Gly Ile Trp Ile Leu Ile Asp Lys Thr Ser Phe Val Ser Phe Val Gly 35 40 45 Leu Ala Phe Val Pro Leu Gln Ile Trp Ser Lys Val Leu Ala Ile Ser 50 55 60 Gly Ile Phe Thr Met Gly Ile Ala Leu Leu Gly Cys Val Gly Ala Leu 65 70 75 80 Lys Glu Leu Arg Cys Leu Leu Gly Leu Tyr Phe Gly Met Leu Leu Leu 85 90 95 Leu Phe Ala Thr Gln Ile Thr Leu Gly Ile Leu Ile Ser Thr Gln Arg 100 105 110 Ala Gln Leu Glu Arg Ser Leu Arg Asp Val Val Glu Lys Thr Ile Gln 115 120 125 Lys Tyr Gly Thr Asn Pro Glu Glu Thr Ala Ala Glu Glu Ser Trp Asp 130 135 140 Tyr Val Gln Phe Gln Leu Arg Cys Cys Gly Trp His Tyr Pro Gln Asp 145 150 155 160 Trp Phe Gln Val Leu Ile Leu Arg Gly Asn Gly Ser Glu Ala His Arg 165 170 175 Val Pro Cys Ser Cys Tyr Asn Leu Ser Ala Thr Asn Asp Ser Thr Ile 180 185 190 Leu Asp Lys Val Ile Leu Pro Gln Leu Ser Arg Leu Gly His Leu Ala 195 200 205 Arg Ser Arg His Ser Ala Asp Ile Cys Ala Val Pro Ala Asn Ser His 210 215 220 Ile Tyr Arg Glu Gly Cys Ala Arg Ser Leu Gln Lys Trp Leu His Asn 225 230 235 240 Asn Leu Ile Ser Ile Val Gly Ile Cys Leu Gly Val Gly Leu Leu Glu 245 250 255 Leu Gly Phe Met Thr Leu Ser Ile Phe Leu Cys Arg Asn Leu Asp His 260 265 270 Val Tyr Asn Arg Leu Ala Arg Tyr Arg 275 280 <210> 194 <211> 280 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD37-Mac45 <400> 194 Met Ser Ala Gln Glu Ser Cys Leu Ser Leu Ile Lys Tyr Phe Leu Phe 1 5 10 15 Val Phe Asn Leu Phe Phe Phe Val Leu Gly Ser Leu Ile Phe Cys Phe 20 25 30 Gly Ile Trp Ile Leu Ile Asp Lys Thr Ser Phe Val Ser Phe Val Gly 35 40 45 Leu Ala Phe Val Pro Leu Gln Ile Trp Ser Lys Val Leu Ala Ile Ser 50 55 60 Gly Ile Phe Thr Met Gly Ile Ala Leu Leu Gly Cys Val Gly Ala Leu 65 70 75 80 Lys Glu Leu Arg Cys Leu Leu Gly Leu Tyr Phe Gly Met Leu Leu Leu 85 90 95 Leu Phe Ala Thr Gln Ile Thr Leu Gly Ile Leu Ile Ser Thr Gln Arg 100 105 110 Ala Gln Leu Glu Arg Ser Leu Arg Asp Val Val Glu Lys Thr Ile Gln 115 120 125 Lys Tyr Gly Thr Asn Pro Glu Glu Thr Ala Ala Glu Glu Ser Trp Asp 130 135 140 Tyr Val Gln Phe Gln Leu Arg Cys Cys Gly Trp His Tyr Pro Gln Asp 145 150 155 160 Trp Phe Gln Val Leu Ile Leu Arg Gly Asn Gly Ser Glu Ala His Arg 165 170 175 Val Pro Cys Ser Cys Tyr Asn Leu Ser Ala Thr Asn Asp Ser Thr Ile 180 185 190 Leu Asp Lys Val Ile Leu Pro Gln Leu Ser Arg Leu Gly Gln Leu Ala 195 200 205 Arg Ser Arg His Ser Thr Asp Ile Cys Ala Val Pro Ala Asn Ser His 210 215 220 Ile Tyr Arg Glu Gly Cys Ala Arg Ser Leu Gln Lys Trp Leu His Asn 225 230 235 240 Asn Leu Ile Ser Ile Val Gly Ile Cys Leu Gly Val Gly Leu Leu Glu 245 250 255 Leu Gly Phe Met Thr Leu Ser Ile Phe Leu Cys Arg Asn Leu Asp His 260 265 270 Val Tyr Asn Arg Leu Ala Arg Tyr 275 280 <210> 195 <211> 446 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain polynucleotide sequences; huCD37-50 antibody <400> 195 aagcttgcca ccatggggtg gtcctgcata atccttttcc tggttgctac tgctaccgga 60 gtccattcac aggtgcagct gcaggagtcc ggccccggcc tgctcaagcc ttctcagagt 120 ctgagtctga cttgtactgt ttctggctac agcataacca gcggtttcgc ttggcactgg 180 atcagacagc atcccggcaa caaactggag tggatgggat acatactgta ctcaggctca 240 actgtctatt ccccctccct gaaatcccgg atcagtatta cccgtgacac ttctaagaac 300 catttttttc tgcagctgaa cagcgttacc gcagctgaca ctgcaaccta ctactgtgcc 360 cggggatatt atggatacgg agcttggttc gcttactggg gccaaggcac cctcgtaact 420 gtgagtgctg cttccaccaa gggccc 446 <210> 196 <211> 446 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain polynucleotide sequences; huCD37-51 antibody <400> 196 aagcttgcca ccatgggttg gtcttgcatc atcctgttcc tggtggccac tgccactggc 60 gtgcattcag aagttcagtt ggtggagtcc ggcccagaag tgctgaaacc cggcgaatca 120 ctgtccctga cttgtaccgt gtcaggttat agcatcagca gcggctttgc ttggcactgg 180 attcggcagt ttccaggcaa gggactggaa tggatgggct acatccatta cagtggctca 240 accaattaca gccctagcct gcagggccga atctctatta ccagggatag ttctattaac 300 cagtttttcc tgcagcttaa ttccgtgact gcctctgaca cagcaactta ctattgcgcc 360 cgtggctact acgggttcgg agcctggttt gtatactggg gtcagggcac cctggtcact 420 gtctcagccg cctctaccaa gggccc 446 <210> 197 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy chain amino acid sequences; muCD37-50 antibody <400> 197 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Phe Ala Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Leu Tyr Ser Gly Ser Thr Val Tyr Ser Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 198 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light chain amino acid sequences; huCD37-3v1.0 and huCD37-3v1.1 antibody <400> 198 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Arg Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Asn Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Trp Gly Thr Thr Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105

Claims (66)

  1. CD37에 특이적으로 결합하는, 정제된 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로, 상기 항체 또는 이의 단편은 적어도 그의 키메라(chimeric) 또는 쥐과(murine) 모 항체의 특성을 유지하여, 가교-결합제의 부재하에서 시험관 내(in vitro) 에서 CD37 을 발현하는 세포의 아폽토시스를 유발하고, 여기에서 상기 항체 또는 이의 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 은 하기로 나타내는 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    각각 SEQ ID NOs: 4, 5 및 6, 및 SEQ ID NOs: 28, 29 및 30.
  2. 2010년 2월 18일자로 ATCC에 기탁된 ATCC 기탁 명칭 PTA-10664의 하이브리도마(hybridoma)에 의해 생산된 항원 CD37에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 항체는 다음으로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (a) SEQ ID NO:57 및 SEQ ID NO:198; 및
    (b) SEQ ID NO:58 및 SEQ ID NO:198.
  5. 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 의 서열로 각각 SEQ ID NOs: 4, 5 및 6 및 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 의 서열로 각각 SEQ ID NOs: 28, 29 및 30 을 포함하는, CD37 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO:57 의 중쇄 가변 영역 서열 및 SEQ ID NO:198 의 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 삭제
  8. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 재표면화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 최대 길이 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 단일 사슬 Fv 또는 scFv, 이황화 연결된 Fv, 인트라바디(intrabody), IgG△CH2, 미니바디(minibody), F(ab')3, 테트라바디(tetrabody), 트리아바디(triabody), 디아바디(diabody), DVD-Ig, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 화학식 (A) - (L) - (C)를 가지는 면역접합체로, 여기서:
    (A)는 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    (L)은 연결기이고;
    (C)는 세포독성제이고;
    여기서 상기 연결기(L)은 (A)와 (C)을 연결하는 면역접합체.
  11. 제10항에 있어서, 3 개 내지 4 개의 (C)를 추가로 포함하는 면역접합체.
  12. 제10항에 있어서, 상기 연결기는 절단성 연결기, 비-절단성 연결기, 친수성 연결기, 디카르복실산계 연결기, N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트(SPP); N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부타노에이트(SPDB) 또는 N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)-2-설포부타노에이트(설포-SPDB); N-석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 시클로헥산카르복실레이트(SMCC); N-설포석신이미딜 4-(말레이미도메틸) 시클로헥산카르복실레이트(설포SMCC); N-석신이미딜-4-(아이오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB); 및 N-석신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-테트라에틸렌글리콜] 에스테르(NHS-PEG4-말레이미드)로 이루어진 군에서 선택되는 면역접합체.
  13. 제10항에 있어서, 상기 세포독성제는 메이탄시노이드, 메이탄시노이드 유사체, 독소루비신, 변형된 독소루비신, 벤조디아제핀(benzodiazepine), 탁소이드(taxoid), CC-1065, CC-1065 유사체, 듀오카르마이신(duocarmycin), 듀오카르마이신 유사체, 칼리키아미신, 돌라스타틴, 돌라스타틴 유사체, 아우리스타틴(auristatin), 토메이마이신(tomaymycin) 유도체, 및 렙토마이신(leptomycin) 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 면역접합체.
  14. 제10항에 있어서, 상기 세포독성제는 N(2')-데아세틸-N(2')-(3-메르캅토-1-옥소프로필)-메이탄신(DM1) 또는 N(2')-데아세틸-N2-(4-메르캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)-메이탄신(DM4)인 면역접합체.
  15. 제10항에 있어서, (A)는 SEQ ID NO:57의 폴리펩티드 및 SEQ ID NO:198의 폴리펩티드를 포함하는 항체이고, (L)은 SMCC이고, (C)는 DM1인 면역접합체.
  16. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 면역접합체, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물.
  17. 제10항의 면역접합체를 포함하는 약제학적 조성물로, 면역접합체는 (A)당 평균 3개 내지 4개의 (C) 를 가지는 암 치료용 약제학적 조성물.
  18. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 면역접합체를 포함하는 암 치료용 키트.
  19. CD37를 발현하는 세포의 성장을 억제하기 위한 시험관 내 방법으로, 상기 세포를 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 면역접합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 시험관 내 방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 암은 백혈병 또는 림프종인 약제학적 조성물.
  21. 제10항의 면역접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백혈병 또는 림프종 치료용 약제학적 조성물.
  22. 제15항의 면역접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백혈병 또는 림프종 치료용 약제학적 조성물.
  23. 제16항에 있어서, 상기 암은 B 세포 림프종, NHL, 전구 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙 B 세포 신생물, B 세포 만성 림프구성 백혈병 (CLL)/소림프구 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프구형질구성 림프종, 외투세포 림프종(mantle cell lymphoma, MCL), 여포성 림프종(FL), 저등급, 중간-등급 및 고-등급(FL), 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B 세포 림프종, MALT형 변연부 B 세포 림프종, 림프절 변연부 B 세포 림프종, 비장형 변연부 B 세포 림프종, 모양 세포성 백혈병(hairy cell leukemia), 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷(Burkitt's) 림프종, 형질세포종, 형질세포골수종, 이식후 림프세포증식 장애(post-transplant lymphoproliferative disorder), 발덴스트롬 매크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 백혈병, 림프종, 및 미분화 대세포 림프종(anaplastic large-cell lymphoma, ALCL)으로 이루어진 군에서 선택되는 약제학적 조성물.
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