CN101646688A - 利用栗精胺提高抗体依赖性细胞毒性的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了具有改善的ADCC和改变的糖基化特征的免疫糖蛋白，包括抗体。由在包含栗精胺的培养基中生长的宿主细胞产生了免疫球蛋白。

Description

利用栗精胺提高抗体依赖性细胞毒性的方法
相关申请的交叉参考
[0001]本申请要求2006年10月24日提交的美国临时申请no.60/853,944的权利，通过参考将其全部并入本文。
发明领域
[0002]本发明涉及具有改善的性质包括抗体依赖性细胞毒性和糖基化特征的免疫糖蛋白包括抗体，用于生产这些免疫糖蛋白的细胞培养方法和培养基，以及这些免疫糖蛋白在治疗疾病中的应用。
背景
[0003]利用免疫药物除去靶细胞群是许多征兆中的重要治疗干涉。免疫药物实现除去靶细胞所使用的作用机制可以包括补体介导的细胞裂解、凋亡信号传导通路的激活、存活所需的信号传导通路的阻断以及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，也被称作Fc依赖性细胞毒性。ADCC是有效的机制，这被认为对于许多免疫药物的效力而言是重要的。
[0004]ADCC激活的机制包括Fc受体结合免疫药物分子，其中免疫药物分子结合到靶细胞的表面。Fc受体与免疫药物的结合可以被免疫球蛋白的恒定区中的结构域介导，例如CH2和/或CH3结构域。不同类型的恒定区可以结合不同的Fc受体。例子包括IgG1 Fc结构域结合同源Fc受体CD16(FcγRIII)、CD32(FcγRII-B1和-B2)以及CD64(FcγRI)，IgA Fc结构域结合同源Fc受体CD89(FcαRI)，IgE结构域结合同源Fc受体FcεR1和CD23。
[0005]Fc受体结合增强的免疫药物组合物可以表现出更大的ADCC能力。利用IgG Fc结构域达到这一点的所报道的方法包括引入氨基酸改变和糖结构的修饰。糖结构的修饰可以是优选的，因为Fc结构域中氨基酸的改变可以增强药物组合物的免疫原性。对于免疫球蛋白分子，已经证明N-连接的糖结合到CH2结构域的Asn-297对于ADCC活性是关键的。其通过酶或通过N-连接的共有位点改变的清除导致ADCC活性很小至没有ADCC活性。某些研究已经报道免疫球蛋白分子的ADCC活性的水平还依赖于糖结构，而造成ADCC的实际糖部分(moiety)或结构还未被阐明。目前关于非免疫球蛋白Fc融合蛋白的ADCC的最佳糖结构了解地很少。
[0006]在糖蛋白中，糖可以结合到三肽基序Asn-X-Thr/Ser中天冬酰胺的侧链中酰胺氮原子。这种类型的糖基化，被命名为N-连接的糖基化，其是在内质网(ER)中以多个单糖添加到磷酸长醇上形成14-残基支链的糖复合物开始的。接着，这种糖复合物被通过寡糖转移酶(OST)复合物转移到蛋白质上。在糖蛋白离开ER内腔之前，从14-残基寡糖去除三个葡萄糖分子。酶ER葡糖苷酶I、ER葡糖苷酶II和ER甘露糖苷酶参与ER处理。
[0007]随后，肽被转运到高尔基复合体，在此处N-连接的糖链被以许多不同的方式修饰。在高尔基体的顺(cis)区室、中间(medial)区室中，原始的14-糖类N-连接的复合物可以通过被除去甘露糖(Man)残基而修整，通过添加N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNac)和/或岩藻糖(Fuc)残基而延长。通常各种形式的N-连接糖具有共同的由3个甘露糖和2个N-胰腺氨基葡萄糖残基构成的五糖核心。最后，在高尔基反(trans)区域中，可以添加其他GlcNac残基，随后是半乳糖(Gal)和末端唾液酸(Sial)。在高尔基复合体中的糖处理被称作“末端糖基化”以将其与ER中发生的“核心糖基化”区分开。可以在许多形式和结构上发生最终的复合物糖单元，其中某些具有2个、3个或4个直链(被称作双触角、三触角或四触角)。许多酶参与高尔基体处理，其包括高尔基甘露糖苷酶IA、IB和IC，GlcNAc-转移酶I，高尔基甘露糖苷酶II，GlcNAc-转移酶II，半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶。
[0008]一份报告已经暗示FcγRIIIa报告子介导的ADCC活性的至关重要的糖决定因素是缺少添加到N-连接的结构的α-1，6-岩藻糖部(moiety)(Shinkawa等人，J Biol Chem.2003Jan 31；278(5)：3466-73；还参见Shields等人，J Biol Chem.2002 Jul 26；277(30)：26733-40)。另一种糖型，等分(bisected)N-连接糖的水平也被提议能够赋予提高的ADCC(Umana等人，Nat Biotechnol.1999Feb；17(2)：176-80)，但也有矛盾的证据(Shinkawa等人，J Biol Chem.2003 Jan 31；278(5)：3466-73)。关于宿主细胞中提高的GnTIII产生不仅二分糖(bisectedsugar)提高而且缺少核心岩藻糖修饰的免疫球蛋白的发现暗示了对该矛盾的可能解答(Ferrara等人，Biotechnol Bioeng.2006 Apr 5；93(5)：851-61)。这与其他人所观察到的岩藻糖单独在改变ADCC能力中具有关键作用以及与二分糖具有关联的暗示一致，反映了在宿主细胞中两种修饰中的联系。然而，使用GnTIII体外处理Rituxan和Herceptin抗体以提高二分糖的另一份报道暗示二分糖的直接作用(Hodoniczky等人，Biotechnol.Prog.，2005 Nov-Dec 21(6)：1644-52)。然而，以非常高的水平过表达Gnt III可能对于细胞是有毒的(Umana等人，BiotechnolProg.1998 Mar-Apr；14(2)：189-92)。
[0009]某些提议的用于生产岩藻糖含量较低的免疫球蛋白的方法对于制造对于治疗症状具有最佳ADCC活性的生物药物具有显著的缺陷。例如，使用除去岩藻糖残基的酶(岩藻糖苷酶)包括额外的昂贵的制造步骤，其具有潜在的显著经济和药物连贯性风险。细胞系的分子改造以敲除参与合成岩藻糖基化糖蛋白的酶在目前的实践中要求特殊的宿主株不能“可调地”生产ADCC能力不同的药物以调节治疗应用的效力和安全性。未增强ADCC产品的比较的产生是昂贵且耗时的。使用RNAi或反义分子处理细胞系以降低(knock down)这些关键酶的水平可能具有意想不到的脱靶效应，并如果真正在制造水平上执行将是昂贵的。
[0010]因此，一直存在需要有利的方法用于制备ADCC增强的免疫药物以及这样所产生的改善的免疫药物用于治疗用途。
发明概述
[0011]本发明提供了培养基和大规模细胞培养方法用于改善免疫糖蛋白的性质包括效应子功能例如ADCC和/或糖基化特征例如岩藻糖含量的降低。本发明还提供了通过这些方法所产生的改善的免疫糖蛋白，以及这些免疫糖蛋白在治疗疾病中的应用。
[0012]在某些实施方式中，本发明提供了用于提高宿主细胞所产生的免疫糖蛋白的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法，其通过将宿主细胞培养在含有浓度为大约25至大约800μM之间，或者在大约100至大约500μM之间，或在大约100至大约400μM之间，或在大约100至大约300μM之间的栗精胺(castanospermine)的培养基中。在示范性实施方式中，ADCC被提高至少2倍、3倍、4倍或5倍。
[0013]在相关的实施方式中，本发明提供了提供了提高宿主细胞所产生免疫糖蛋白分子的CD16结合的方法，其通过将宿主细胞培养在含有浓度为大约25至大约800μM之间，或者在大约100至大约500μM之间，或在大约100至大约400μM之间，或在大约100至大约300μM之间的栗精胺的培养基中。在示范性实施方式中，CD16结合被提高了至少50％、75％、100％、125％、150％、175％或200％。
[0014]在本发明的方法中，细胞生长、活力和/或密度不受显著影响(例如保持未处理的细胞的至少80％或更高)。培养基中免疫糖蛋白产生的水平可以为至少100μg/mL、125μg/mL或150μg/mL。
[0015]在任意前述实施方式中，培养基可以是基本上无血清的并且可以包含第二糖修饰剂(carbohydrate modifier)。
[0016]本发明还预期了包含通过本文所描述方法所产生的免疫糖蛋白的组合物，任选地具有无菌的可药用的载体或稀释剂。可以以杀死或抑制在其表面表达被所述免疫球糖蛋白结合的分子的癌细胞生长的方法给药这些组合物，或者以耗尽在其表面表达被所述免疫球糖蛋白结合的分子的细胞的方法给药这些组合物。
[0017]本发明的方法整体上包括在含有适当浓度的糖修饰剂例如栗精胺的培养基中培养产生免疫糖蛋白的宿主细胞，以及提供改善效应子功能的优点，而不显著影响细胞的生长或蛋白质产量水平。使用本发明的方法可以制造的示范性免疫糖蛋白包括免疫球蛋白和小型组合式免疫药物(SMIPTM)产品。根据本发明的方法制备的这些结合分子有利地基本上保持了相同的与靶结合的性质以及所得到的直接生物活性，但表现出改善的效应子介导的功能。
[0018]在一个方面中，本发明提供了改善宿主细胞所产生的免疫糖蛋白的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或Fc受体结合的方法。这些方法包括将宿主细胞培养在体积为至少750mL、1L、2L、3L、4L、5L、10L、15L、20L或更多含有糖修饰剂例如栗精胺的培养基中，其中糖修饰剂的浓度能够提高宿主细胞所产生的免疫糖蛋白的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或Fc受体结合。尽管这些糖修饰剂例如栗精胺的最佳浓度依赖于糖修饰剂的能力和期望的ADCC的相对调控，但培养基中糖修饰剂的示范性终浓度为低于800μM，或低于750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10μM。
[0019]可以通过改变应用到细胞培养的糖修饰剂例如栗精胺的浓度或持续时间而调控对ADCC的相对影响，这提供了相对于通过改变糖基化而改善ADCC的传统方法的额外优势。可以使用本领域中已知的检验对ADCC活性进行测量和表达，在示范性的实施方式中提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍。
[0020]糖基化和糖含量已知影响多种免疫球蛋白效应子介导的功能包括ADCC、CDC和循环半衰期。本文所描述的数据显示本发明的方法令人吃惊地能够提供表现出改善的ADCC而不影响CDC或半衰期的免疫糖蛋白。因此，在示范性的实施方式中，免疫糖蛋白分子组合物的ADCC得到提高，但其他免疫球蛋白型效应子功能例如补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或延长的循环半衰期仍类似或未被显著影响(例如提高或降低低于2倍，或提高或降低低于50％、40％、30％、20％或10％)。
[0021]可以将免疫糖蛋白分子组合物的Fc受体结合测定为糖修饰剂处理的免疫糖蛋白分子对比未处理的免疫糖蛋白分子结合CD16的相对比例。下面在实施例中描述了示范性检验。在示范性实施方式中Fc受体结合提高了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍或6倍。根据本发明使用糖修饰剂例如栗精胺处理的宿主细胞所产生的免疫糖蛋白组合物将以比未经此处理的宿主细胞所产生的免疫糖蛋白组合物在FcR结合检验中高的亲和力结合CD16(高和低亲和力形式即在氨基酸158处为V或F)和/或CD32a或b和/或CD64。本文显示，Fc受体结合亲和力的这种提高与ADCC活性的提高相关。
[0022]本发明还提供了用于改变免疫糖蛋白的糖含量/糖基化特征和/或降低岩藻糖含量的方法，其通过将宿主细胞培养在体积为至少750mL、1L、2L、3L、4L、5L、10L、15L、20L或更多含有糖修饰剂例如栗精胺的培养基中，其中糖修饰剂的浓度能够降低免疫糖蛋白组合物的总岩藻糖含量和/或改变其糖基化特征。在培养基中糖修饰剂例如栗精胺的示范性终浓度为低于800μM，或低于750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10μM。
[0023]可以通过改变应用到细胞培养的糖修饰剂例如栗精胺的浓度或持续时间而调控对岩藻糖含量的相对影响。组合物的总岩藻糖含量可以被表达为未岩藻糖基化免疫糖蛋白与组合物中免疫糖蛋白总数目的相对百分比。示范性的组合物含有至少30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多未岩藻糖基化的分子。根据本发明糖修饰剂例如栗精胺处理的宿主细胞所产生的免疫糖蛋白的岩藻糖含量相对于未经此处理的宿主细胞会降低至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多。
[0024]在任何前述方法中，宿主细胞在暴露到糖修饰剂例如栗精胺的过程中可以表现出高生长水平。例如，产生免疫糖蛋白的CHO细胞的示范性群体倍增时间为大约14小时；期望根据本发明的糖修饰剂的浓度(例如有效提高ADCC的浓度)不会降低该倍增时间。理想地，糖修饰剂例如果精胺的有效浓度在加入糖修饰剂后的72小时时间点不会降低细胞生长超过10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。
[0025]在任一前述方法中，宿主细胞可以在暴露到糖修饰剂例如栗精胺的过程中表现出高蛋白质产量水平。例如，在存在有效量糖修饰剂例如栗精胺时蛋白质产量水平可以为大约50μg/mL或更高，或大约75、100、125或150μg/mL或更高。优选，宿主细胞表现出高生长水平和高蛋白质产量水平。
[0026]可以使用任何本领域已知的培养基，包括基本上不含血清的培养基。补料分批、连续进料和其他类型本领域已知的培养方法也可以用于本发明的方法。可以将糖修饰剂加入到种子株中，加入到起始批次培养基中，在快速生长期后，或者连续加入培养基(例如在连续进料过程中)。例如，可以将糖修饰剂以10×或100×浓度加入到早期种子株或给料中，以便后续添加培养基会将糖修饰剂的浓度稀释到仍有效达到改善重组产物ADCC的水平。可替换地，在加入到细胞的所有培养基中包含有效浓度的糖修饰剂，这回避了对稀释的需求。在每种情况中，糖修饰剂都在细胞培养过程的相对早期加入，并且在整个培养过程中保持有效的浓度，以优化免疫糖蛋白的均一性。糖修饰剂的效果被认为是长期持续的，并且能够持续到在一次加入糖修饰剂之后至少11～12天能够被观察到。
[0027]示范性糖修饰剂包括核心糖基化抑制剂，末端糖基化抑制剂，甘露糖酶抑制剂和/或早期糖修饰剂，任选地包括或不包括甘露糖基化特异性抑制剂，并在下面更详细地描述。本发明预期两种或更多种，或者三种或者更多种糖修饰剂的组合可以提供额外的好处。栗精胺是一种特别被预期的糖修饰剂。
[0028]在一个方面中，本发明提供了包含任何前述方法所产生免疫糖蛋白分子的组合物，其优选具有至少107M-1或至少108M-1或109M-1与靶分子的结合亲和力。这些组合物可以包含一种或者更多种可药用的载体或稀释剂。
[0029]在进一步的方面中，本发明提供了治疗方法包括为个体进行给药这类组合物，其中所述个体能够从这类给药受益，例如患有表达靶分子所介导的障碍的个体，或者患有癌细胞在其表面表达靶分子的癌症类型的个体。本发明还预期这类组合物在耗尽在其表面表达靶分子的细胞的方法中的应用。如果靶是CD37，本发明特别预期抑制癌细胞生长或破坏癌细胞的方法，其包括为个体给药包含根据本发明所产生的抗-CD37SMIP产品的组合物。类似的，如果靶是CD20，本发明特别预期抑制癌细胞生长或破坏癌细胞的方法，其包括为个体给药包含根据本发明所产生的抗-CD20SMIP产品的组合物。在相关实施方式中，预期了治疗癌症的方法，其包括阻止或反转癌症进展。本发明还提供了治疗自体免疫或炎症疾病的方法，其通过给药根据本发明方法所产生的抗-CD37或抗-CD20SMIP。在相关的方面中，本发明预期本发明任选包含无菌载体或稀释剂的糖蛋白组合物在制备药物中的应用，其中所述药物用于治疗任何本文所描述的疾病或障碍。
免疫糖蛋白
[0030]术语“免疫糖蛋白”是指糖基化多肽，其结合靶分子并含有来自免疫球蛋白恒定区的充分的氨基酸序列以提供效应子功能优选ADCC和/或CDC。示范性分子将含有来自免疫球蛋白CH2结构域的序列，或者来自一种或更多种免疫球蛋白的CH2和CH3结构域。根据本发明预期进行生产的免疫糖蛋白的具体子集包括单链蛋白质，其任选地通过铰链和/或CH3结构域中的共价或非共价结合而二聚化。该单链蛋白质的子集不包括典型的免疫球蛋白的四聚体构型(因为不存在轻链)，但包括Fc-配体或Fc-可溶受体融合物。单链蛋白质的具体例子包括SMIP产物。
[0031]SMIP产品和其生产方法之前已经被描述在共有的美国专利申请no.10/627,556和美国专利公开2003/133939，2003/0118592和2005/0136049中，均被通过参考整体并入本文。具有效应子功能的多价结合蛋白被描述在2007年6月12日提交的国际专利申请No.PCT/US07/71052(要求2006年6月12日提交的U.S.S.N.60/813,261以及2006年10月20日提交的60/853,287的优先权)中。SMIP是新型的结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白，其具有下列特征：同源结构例如抗原、相应受体等的结合结构域；IgG1、IgA或IgE铰链区多肽或突变IgG1铰链区多肽具有0、1或2个半胱氨酸残基；以及免疫球蛋白CH2和CH3结构域。在一个实施方式中，结合结构域分子具有1或2个半胱氨酸残基。在相关的实施方式中，预期，如果结合结构域分子包含2个半胱氨酸残基，则第一个半胱氨酸(典型地包括在重链和轻链可变区之间)不被缺失或氨基酸置换。SMIP产物能够ADCC和/或CDC，但它们形成二硫键连接的多聚体的能力可能被破坏。示范性的SMIP产物可以具有一个或更多个结合区，例如来自免疫球蛋白的可变轻链和/或可变重链结合区的免疫球蛋白超家族的结合区。在示范性实施方式中，这些区域被接头肽分开，其中接头肽可以是本领域中已知的任何接头肽以能够与结构域或区连接兼容。示范性的接头是基于Gly4Ser接头基序的接头，例如(Gly4Ser)n，其中n＝3-5。可以根据本发明产生的示范性SMIP产品包括结合CD20或CD37的产品。结合CD20或CD37以及包括特异性结合序列和/或氨基酸修饰的SMIP产品被描述在共有的、同样未决的美国专利申请no.10/627,556和11/493,132中，均被通过参考整体并入本文中。
[0032]免疫糖蛋白的其他例子包括结合结构域-Ig融合，其中结合结构域可以是非天然存在的肽或天然存在的配体或受体的片段。如果是受体，则优选胞外结构域的片段。与免疫球蛋白或Fc区的示范性融合包括：sTNFRII与Fc区的融合蛋白依那西普(Etanercept)(美国专利No.5,605,690)、表达在呈递细胞上的LFA-3与Fc区的融合蛋白阿法赛特(Alefacept)(美国专利No.5,914,111)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)与Fc区的融合蛋白[J.Exp.Med.，181，1869(1995)]、白介素15与Fc区的融合蛋白[J.Immunol.，160，5742(1998)]、因子VII与Fc区的融合蛋白[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，12180(2001)]、白介素与Fc区的融合蛋白[J.Immunol.，154，5590(1995)]、白介素2与Fc区的融合蛋白[J.Immunol.，146，915(1991)]、CD40与Fc区的融合蛋白[Surgery，132，149(2002)]、Flt-3(fms-类酪氨酸激酶)与抗体Fc区的融合蛋白[Acta.Haemato.，95，218(1996)]、OX40与抗体Fc区的融合蛋白[J.Leu.Biol.，72，522(2002)]、其他CD分子[例如CD2、CD30(TNFRSF8)、CD95(Fas)、CD106(VCAM-1)、CD137]、粘附分子[例如ALCAM(活性白细胞细胞粘附分子)、钙粘蛋白、ICAM(细胞间粘附分子)-1、ICAM-2、ICAM-3]、细胞因子受体[例如白介素-4R、白介素-5R、白介素-6R、白介素-9R、白介素-10R、白介素-12R、白介素-13Rα1、白介素-13Rα2、白介素-15R、白介素-21R]、趋化因子、诱导细胞死亡的信号分子[例如B7-H1、DR6(死亡受体6)，PD-1(程序死亡-1)、TRAIL R1]、共刺激分子[例如B7-1、B7-2、B7-H2、ICOS(可诱导共刺激剂)]、生长因子[例如ErbB2、ErbB3、ErbB4、HGFR]、分化诱导因子(例如B7-H3)、激活因子(例如NKG2D)、信号转移分子(例如gp130)。
[0033]免疫糖蛋白的其他实施例包括抗体。本文的术语“抗体”被定义为包括全组装抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(双特异性抗体、能够结合抗原的抗体片段(例如Fab’、F’(ab)2、Fv、单链抗体、二聚抗体(diabody))和包含前述的重组肽只要它们表现出期望的抗原结合活性。预期原始分子和/或片段的多聚体或集合体包括化学衍生抗体。预期任何同种型类别或亚类的抗体包括IgG、IgM、IgD、IgA和IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同的同种型具有不同的效应子功能；例如IgG1和IgG3同种型具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。
[0034]“免疫球蛋白”或“原始抗体”是四聚体糖蛋白，其由两对相同的多肽链(两条“轻链”和两条“重链”)构成。每条链的氨基末端部分包括大约100～110或更多个氨基酸的“可变区”(“V”)，其主要负责抗原识别。在该可变区中，“高变区”或“互补性决定区”(CDR)由轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)构成(正如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)]所描述的)，和/或那些来自高变环的残基(即轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3))和重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(正如[Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)]所描述的))。
[0035]每条链的羧基末端部分含有恒定区。轻链在恒定区中具有单个结构域。因此，轻链具有一个可变区和一个恒定区结构域。重链在恒定区中具有多个结构域。IgG、IgA和IgD抗体的重链具有3个被称为CH1、CH2和CH3的恒定区结构域，IgM和IgE抗体的重链具有四个恒定区结构域CH1、CH2、CH3和CH4。因此，重链具有一个可变区和3个或4个恒定区。
[0036]免疫球蛋白的重链还可以被分成3个功能区：Fd区(包含VH和CH1的片段，即重链的两个N-末端结构域)、铰链区和Fc区(“可结晶片段”区，其来自恒定区并在胃蛋白酶消化后形成)。Fd区与轻链结合形成Fab(″抗原结合片段″)。因为抗原会以立体化学的方式与每个Fab的氨基末端的抗原结合区反应，因此该IgG分子是二价的，即其能够结合两个抗原分子。Fc区含有与细胞上的免疫球蛋白分子、以及与补体级联反应的起始元件相互作用的结构域。因此，通常Fc片段被认为负责免疫球蛋白的效应子功能，例如补体结合(complement fixation)和结合Fc受体。
[0037]本文所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本均一的抗体群获得的抗体，即包含每个抗体的群是一致的，除了可能天然存在的突变或可替换的翻译后修饰可能少量存在外，而不管是从杂交瘤产生还是通过DNA重组技术产生。单克隆抗体的非限制性例子包括鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体或其变体或衍生物。
[0038]人源化或修饰抗体序列以更类似人抗体被描述在例如Jones等人，Nature 321：522525(1986)；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，81：68516855(1984)；Morrison and Oi，Adv.Immunol.，44：65 92(1988)，Verhoeyer等人，Science 239：1534 1536(1988)，Padlan，Molec.Immun.28：489 498(1991)；Padlan，Molec.Immunol.31(3)：169217(1994)；和Kettleborough，C.A.等人，Protein Eng.4(7)：773 83(1991)；Co，M.S.，等人(1994)，J.Immunol.152，2968-2976)；Studnicka等人Protein Engineering 7：805-814(1994)；中，均被通过参考并入本文。
[0039]分离人单克隆抗体的一种方法是使用噬菌体展示技术，其被描述在例如Dower等人，WO 91/17271，McCafferty等人，WO92/01047和Caton and Koprowski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6450-6454(1990)中，均被通过参考并入本文。分离人单克隆抗体的另一种方法使用转基因动物，其不产生内源性免疫球蛋白并被改造成含有人免疫球蛋白基因座。参见例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.，7：33(1993)；WO 91/10741，WO 96/34096，WO 98/24893或美国专利申请公开no.20030194404，20030031667或20020199213；均被通过参考并入本文。
[0040]可以通过重组DNA技术活通过酶或化学切割原始抗体而产生抗体片段。″抗体片段″包括原始全长抗体的一部分，优选原始抗体的抗原结合或可变区，并包括从抗体片段形成的多特异性(双特异性、三特异性等)抗体。抗体片段的非限制性例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv[可变区]、结构域抗体(dAb)[Ward等人，Nature 341：544-546，1989]、互补性决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)[Bird等人，Science242：423-426，1988，和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883，1988，任选包括多肽接头和任选多特异性Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994)]、单链抗体片段、二聚抗体[EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)]、三聚抗体(triabody)、四聚抗体(tetrabody)、微型抗体[Olafsen，等人，Protein Eng Des Sel.2004 Apr；17(4)：315-23]、线性抗体(linear antibody)[Zapata等人，Protein Eng.，8(10)：1057-1062(1995)]；螯合重组抗体[Neri等人，J Mol Biol.246：367-73，1995]，三链抗体(tribody)或双链抗体(bibody)[Schoonjans等人，J Immunol.165：7050-57，2000；Willems等人，J Chromatogr B Analyt TechnolBiomed Life Sci.786：161-76，2003]、细胞内抗体(intrabody)[Biocca，等人，EMBO J.9：101-108，1990；Colby等人，Proc Natl Acad Sci US A.101：17616-21，2004]、纳米抗体(nanobody)[Cortez-Retamozo等人，Cancer Research 64：2853-57，2004]、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼化抗[Desmyter等人，J.Biol.Chem.276：26285-90，2001；Ewert等人，Biochemistry 41：3628-36，2002；美国专利公开No.20050136049和20050037421]、含VHH的抗体、模拟抗体(mimetibody)[美国专利公开No.20050095700和20060127404；WO04/002424 A2；WO 05/081687 A2]、或其变体或衍生物，以及含有免疫球蛋白至少一部分的多肽，其足以提供与多肽的特异性抗原结合，例如CDR序列，只要抗体保持期望的抗原结合活性。
[0041]术语“变体”在结合抗体使用时是指抗体的多肽序列在可变区或与可变区等价的部分含有至少一个氨基酸置换、缺失或***，只要该变体保持期望的结合亲和力或生物活性。此外，本发明的抗体可以在恒定区中具有氨基酸修饰以修饰抗体的效应子功能，包括半衰期或清除、ADCC和/或CDC活性。例如，这些修饰能够增强药物动力学或增强抗体在治疗癌症中的效力。在IgG1的情况中，恒定区的修饰，特别是铰链或CH2区的修饰可以提高或降低效应子功能包括ADCC和/或CDC活性。在其他实施方式中，IgG2恒定区被修饰成降低抗体-抗原聚集体的形成。在IgG4的情况中，恒定区的修饰特别是铰链区的修饰，可以降低半抗体(half-antibody)的形成。
[0042]术语“衍生物”在结合抗体使用时是指通过缀合到治疗或诊断剂、标记(例如用放射性核或各种酶)、共价聚合物结合例如聚乙二醇化(利用聚乙二醇衍生)和通过化学合成非天然氨基酸的***或置换而共价修饰的抗体。本发明的衍生物将保持本发明未衍生化的分子的结合性质。癌症靶向抗体与细胞毒性剂例如放射性同位素(例如I131、I125、Y90和Re186)、化学治疗剂或毒素的缀合可以增强破坏癌细胞。
[0043]对于靶分子是“特异性”的免疫糖蛋白以高于任何其他靶的亲和力结合该靶。本发明的免疫糖蛋白与它们的靶可以具有至少大约104M-1或可替换地105M-1、106M-1、107M-1、108M-1、109M-1或1010M-1的Ka的亲和力。可以使用传统技术容易测定这些亲和力，例如通过使用BIAcore仪器或通过使用放射标记靶抗原的放射免疫检验。可以通过例如Scatchard等人，Ann N.Y.Acad.Sci.，51：660(1949)的方法对亲和力数据进行分析。
糖修饰剂
[0044]“糖修饰剂”是小分子有机化合物，优选分子量＜1000道尔顿，其抑制参与对作为结合到多肽的糖一部分的糖进行添加、除去或修饰的酶。糖基化是非常复杂的过程，其发生在内质网中(“核心糖基化”)和高尔基体中(“末端糖基化”)。
[0045]糖基化酶的其他基于多肽或基于多核苷酸的抑制剂包括抑制早期糖修饰剂活性的RNAi或反义根据本发明都是有用的，但被排除在“糖修饰剂”的定义之外。
[0046]本文所使用的“早期糖修饰剂”是指在将N-乙酰氨基葡萄糖添加到甘露糖之前一个或者更多个糖基化步骤包括ER葡糖苷酶I、ER葡糖苷酶II、ER甘露糖苷酶、高尔基体甘露糖苷酶IA、高尔基体甘露糖苷酶IB、高尔基体甘露糖苷酶IC和GlcNAc-转移酶I的抑制剂。
[0047]后续糖基化步骤包括高尔基体甘露糖苷酶II、GlcNAc-转移酶II、半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶、岩藻糖基转移酶和岩藻糖激酶。
[0048]示范性的糖修饰剂包括任意下列的。栗精胺被认为是葡糖苷酶I和II抑制剂。去氧岩藻糖野尻霉素(Deoxyfuconojirimycin)是岩藻糖苷酶抑制剂。6-甲基-四氢-吡喃-2H-2，3，4-三醇已经被报道在体内抑制L-岩藻糖的磷酸化，即GDP-L-岩藻糖生物合成的第一步。6，8a-二表-栗精胺被报道为岩藻糖基转移酶抑制剂。1-N-亚胺基糖A和B(也分别被称作1-丁基-5-甲基-哌啶-3，4-二醇盐酸盐和5-甲基-哌啶-3，4-二醇盐酸盐)已经被报道为岩藻糖基转移酶抑制剂。去氧甘露糖野尻霉素(Deoxymannojirimycin)(DMJ)是ER甘露糖苷酶I抑制剂。Kifunensine(Kf)是ER甘露糖苷酶I抑制剂。苦马豆素(Swainsonine)(Sw)是ER甘露糖苷酶II抑制剂。莫能菌素(Monensin)(Mn)是ER和高尔基体之间细胞内蛋白质转运的抑制剂，其干扰核心寡糖的延长。
[0049]本文所描述的数据显示多种糖苷酶和/或甘露糖苷酶抑制剂提供了一种或者更多种提高ADCC活性、提高Fc受体结合和改变糖基化特征的期望效果。
[0050]在示范性实施方式中，栗精胺(MW 189.21)被加入到培养基中，终浓度为大约200μM(对应大约37.8μg/mL)，或者高于大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、或150μM，最高达到大约300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、60或50μg/mL范围内的浓度。例如，预期10-50、或50-200、或50-300、或100-300、或150-250μM的范围。
[0051]在其他示范性实施方式中，DMJ例如DMJ-HCl(MW199.6)被加入到培养基中，终浓度为大约200μM(对应大约32.6μgDMJ/mL)，或者高于大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、或150μM，最高达到大约300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、60或50μg/mL范围内的浓度。例如，预期10-50、或50-200、或50-300、或100-300、或150-250μM的范围。
[0052]在另一个示范性实施方式中，kifunensine(MW 232.2)被加入到培养基中终浓度为大约10μM(对应大约2.3μg/mL)，或者高于大约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μM，最高达到大约50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12或11μM范围内的浓度。例如预期1-10、或1-25、或1-50、或5-10、或5-25、或5-15μM的范围。
重组构建体、细胞和培养方法
[0053]本文所使用的“宿主细胞”具体地排除了啮齿动物杂交瘤但包括任何能够糖基化(即将糖添加到多肽的氨基酸)并且已经被通过重组方式修饰成表达高水平蛋白质产物的其他细胞。术语“宿主细胞”中包括保持重组修饰和表达蛋白质产物能力的宿主细胞的后代。
[0054]表达载体或调控序列的示范性元件可以包括复制起点、启动子、操纵子、或其他介导转录和翻译的元件。启动子可以是组成型的，或者活跃的，并可以进一步是细胞类型特异性的，组织特异性的，单个细胞特异性的，事件特异性的，瞬时特异性的或者可诱导的。事件特异性的启动子仅在事件发生之后才是活跃的或上调的。除了启动子外，可以***抑制子序列、负调节子或组织特异性沉默子以降低非特异性表达。其他元件包括内部核糖体结合位点、转录终止子序列包括多聚腺苷酸化序列、剪接供体和受体序列和增强子、可选择标记物等。
[0055]培养基可以包含任何本领域中已知的任何必要或期望成分例如糖包括葡萄糖、必需和/或非必需氨基酸、脂类和脂类前体、核酸前体、维生素、无机盐、痕量元素包括稀有金属和/或细胞生长因子。培养基可以是化学上明确的，或者可以包含血清、植物水解产物或其他衍生的物质。培养基可以基本上或完全无血清或无动物组分。“基本上无血清”的意思是培养基缺少任何血清，或含有非显著量的血清。在细胞培养过程中消耗的示范性补充氨基酸包括天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸和缬氨酸。
[0056]可商业获得的脂类和/或脂类前体包括胆碱、乙醇胺或者磷酸乙醇胺、胆固醇、脂肪酸例如油酸、亚油酸、亚麻酸、甲酯、D-α-生育酚例如以乙酸酯形式、硬脂酸；肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸；或花生四烯酸。必需氨基酸包括精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。非必需氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸。可以商业获得的无机或者微量元素、适当情况提供的盐包括钠、钙、钾、镁、铜、铁、锌、硒、钼、钒、锰、镍、硅、锡、铝、钡、镉、铬、钴、锗、钾、银、铷、锆、氟化物、溴化物、碘化物和氯化物。培养基还可以任选地包括非离子表面活性剂或表面活跃的试剂(surface-active agent)以保护细胞免于混合或进入空气。培养基还可以包含缓冲液例如碳酸氢钠、磷酸二氢盐和磷酸氢二盐、HEPES和/或Tris。培养基还可以包含蛋白质生产的诱导剂例如丁酸钠或咖啡因。
[0057]本发明还提供了产生免疫糖蛋白的方法，其包括在任何培养基中或者在任何本文所描述的条件下培养宿主细胞。这些方法可以进一步包括从宿主细胞或培养基回收免疫糖蛋白的步骤。糖修饰剂可以被包括在起始培养基中，或者可以在起始培养期或后期的过程中加入。如果重组蛋白分泌到培养基中，则可以在几个收获循环中定期收获培养基并替换新培养基。
[0058]尽管被广泛用于治疗性蛋白的生产的CHO细胞是优选的，但本领域中所有已知产生糖基化蛋白的宿主细胞都可以被使用包括酵母细胞、植物细胞、植物、昆虫细胞和哺乳动物细胞。酵母细胞的例子包括毕赤酵母(Pichia)、例如P.pastoris和酵母菌属(Saccharomyces)例如酿酒酵母(S.cerevisiae)以及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、K.Zactis、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)、魏氏克鲁维酵母(K.wickeramii)、K.waltii、K.drosophilarum、K.thernotolerans和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏克鲁维酵母(K.yarrowia)；里氏木霉(Trichoderma reesia)，粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、施旺酵母(Schwanniomyces)Schwanniomyces occidentalis、脉孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、Totypocladium、曲霉菌(Aspergillus)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)，汉逊酵母属(Hansenula)，假丝酵母(Candida)、克勒克酵母(Kloeckera)、拟酵母(Torulopsis)和红酵母属(Rhodotorula)。示范性昆虫细胞包括苜蓿尺蠖(Autographa californica)和草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和果蝇(Drosophila)。示范性哺乳动物细胞包括各种CHO、BHK、HEK-293、NS0、YB2/3、SP2/0和人细胞例如PER-C6或HT1080以及VERO、HeLa、COS、MDCK、NIH3T3、Jurkat、Saos、PC-12、HCT 116、L929、Ltk-、WI38、CV1、TM4、W138、Hep G2、MMT、白血病细胞系、胚胎干细胞或受精***。
[0059]可以在任何培养体系中并根据本领域已知的任何方法培养细胞，包括T型烧瓶、旋转器和振荡器烧瓶、滚筒瓶和搅拌罐生物反应器。着壁依赖性细胞可以被培养在被保持在搅拌罐生物反应器中的微载体上例如高分子球体。可替换的，细胞可以以单细胞悬浮液的形式生长。可以以分批方法加入培养基，例如如果以单批次一次性将培养基加入到细胞中或者以定期加入小批次培养基的分批给料方法加入到细胞中。可以在培养的最后收获培养基，或者在培养过程中多次收获培养基。连续灌注生产工艺也是本领域中公知的，并且包括连续将新培养基给料到培养物种，同时从反应器中连续回收相同体积。灌注培养通常达到比分批培养高的细胞密度，并且能够利用重复收获而维持数星期或数月。
免疫糖蛋白的应用
[0060]本发明的免疫糖蛋白可以用作治疗剂用于治疗靶分子所接到的疾病，或者例如作为细胞溶解剂以杀死具有所表达靶分子或与细胞表面结合的靶分子的癌细胞。
[0061]“治疗”或“治疗”是指治疗性治疗或预防性治疗。治疗性治疗可以改善接受治疗的个体中疾病的至少一种症状，或者可以延迟个体中发展中疾病的恶化，或者防止其他相关疾病的发生。通过评估疾病状态领域公知的临床标准的评估对改善的应答进行评定。
[0062]“治疗有效剂量”或“有效剂量”的免疫糖蛋白是指化合物的量足以导致被治疗的疾病的一种或者更多种症状的改善。在用于每种活性成分时，单独给药治疗有效剂量是指单独的成分。在用于组合时，治疗有效剂量是指导致治疗效果的活性成分的组合量，无论是组合给药、系列给药还是同时给药。根据患者的体重，可以给药的剂量可以是例如0.01～50mg/kg，并可以以每日或每周的基础，或者每2周、每3周或一月一次的基础给药。
[0063]为了将本发明的免疫糖蛋白给药给人或测试动物，优选将分子配制在包含一种或者更多种可药用的载体或稀释剂的组合物中，如果该组合物是用于肠胃外给药，则优选无菌载体或稀释剂。描述“药物上或药理上可以接受的”是指如下所述，在使用本领域公知路线给药时，分子体(entity)和组合物不产生过敏或其他不利反应。“可药用的载体”包括任何和所有临床上可以使用的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌及、等渗剂和吸收延缓剂等。通常，组合物还基本上不含热源质以及其他可能对受体有害的杂质。
[0064]免疫糖蛋白可以被口腔、局部、透皮、肠胃外、通过吸入喷射、经***、经直肠、或通过颅内注射给药。本发明所使用的肠胃外包括皮下注射、静脉内注射、肌内注射、脑池内注射或输注技术。通过静脉内、皮内、肌内、***内、腹腔内、鞘内、眼球后、肺内注射或在特定位点手术植入也是预期的。
[0065]在一个实施方式中，给药是在需要在癌症或受影响组织的位点进行的，所述癌症或受影响组织需要通过直接注射到位点中或者通过可以在内部释放制剂的持续递送机制而进行治疗。例如，在本发明植入到癌症附近的制剂中可以包括生物可降解微球或胶囊或能够持续递送组合物(例如可溶多肽、抗体或小分子)的其他生物可降解高分子构造。
[0066]还可以在多个位点将治疗组合物递送给患者。可以同时仅是多份给药，或者在持续的时间段内给药。
[0067]优选注射含水溶液。含水组合物可以被冻干用于储存，并在使用之前在适当载体中复原(reconstitute)。这种技术已经显示对于传统免疫球蛋白是有效的。能够采用任何适当的冻干和复原技术。本领域技术人员能够理解冻干和复原能够引起不同程度的活性损失并且可能需要调节使用水平以进行补偿。
[0068]在所有情况中，该形式必须是无菌的，并且必须是流动的达到容易发生注射的程度。可以例如通过使用包覆例如软磷脂，通过维持在分散液时所需的粒径以及通过使用表面活性剂而维持恰当的流动性。其在制造和储藏条件下必须是稳定的，并且能够被保持抵抗微生物的污染行为例如细菌和真菌。可以通过各种抗菌剂和抗真菌及例如对羟苯甲酸、氯代丁醇、石炭酸、山梨酸、硫柳汞等实现对微生物行为的防止。在许多情况中，期望包括等渗剂例如糖或氯化钠。
[0069]此外，预期在本发明中使用的组合物的亲水和疏水性质被很好地平衡，这样增强了它们在体外特别是体内应用的实用性，而其他缺少该平衡的组合物是基本上实用性较低的。具体的，被预期在本发明中使用的组合物具有在含水介质中具有适当的溶解度，这能够允许在体内吸收和生物利用度，同时还具有在脂类中的溶解度，这允许化合物穿过细胞膜到达假定的作用位点。
[0070]本发明中还预期免疫糖蛋白组合物结合第二试剂的给药。
[0071]作为额外的方面，本发明包括试剂盒或制品，其包含以辅助其用于实施本发明方法的方式包装的一种或者更多种化合物或组合物。在一个实施方式中，这类试剂盒包括包装在容器例如密封瓶或器皿中的本发明所描述的免疫糖蛋白，任选地具有第二治疗剂，具有粘贴到容器或包括在包装中的标签描述化合物或组合物在实施方法中的应用。优选，化合物或组合物被以单位剂型的形式包装。试剂盒可以还包括适于将组合物根据具体的给药路线给药化合物或用于实施筛选检验的装置。优选，试剂盒含有描述化合物应用的标签。
[0072]本发明进一步预期本发明的免疫糖蛋白在制备药物中的应用，所述药物用于抑制或防止或治疗特征在于免疫糖蛋白所结合靶或由免疫糖蛋白所结合靶介导的个体中的疾病、病症或障碍。
附图说明
[0073]图1描绘根据细胞/ml的细胞计数所显示的，生长在具有各种浓度栗精胺的细胞培养基中表达TRU-016的CHO细胞的细胞生长。
[0074]图2描绘根据活细胞百分比所显示的，生长在具有各种浓度栗精胺的细胞培养基中表达TRU-016的CHO细胞的细胞活力。
[0075]图3描绘在存在各种浓度的栗精胺时培养的细胞所产生的TRU-015的CD16结合，并且显示了几何平均荧光强度对比栗精胺浓度。
[0076]图4描绘根据几何平均荧光强度所显示的，在存在各种浓度6，8a-二表果精胺、苦马豆素或去氧甘露糖野尻霉素(DMJ)时所培养的细胞所产生的TRU-016的CD16结合。
[0077]图5描绘根据平均荧光强度所显示的，在存在不同浓度kifunensine所培养的细胞所产生的TRU-016的CD16结合。
[0078]图描绘6根据平均荧光强度所显示的，在存在不同浓度栗精胺时所培养的细胞所产生的蛋白质A-纯化的TRU-016的CD16结合。
[0079]图7和8分别描绘使用高亲和力和低亲和力供体PBMC测量的TRU-015的ADCC，以及所加入TRU-015对比特异性杀死百分比的图表。
[0080]图9描绘在存在不同浓度栗精胺时所培养的细胞素所产生的TRU-016的ADCC以及特异性杀死百分比对比所加入TRU-016浓度的图表。
[0081]图10描绘在存在各种糖修饰剂时培养的细胞所产生的TRU-016的ADCC，以及特异性杀死百分比对比所加入TRU-016浓度的图表。
[0082]图11描绘在给药在存在各种糖修饰剂时培养的细胞所产生的TRU-016的小鼠中的药物动力学数据。
[0083]图12描绘给药使用各种糖修饰剂处理的细胞所产生的TRU-016的小鼠血清中的TRU-016的CD16结合。
[0084]图13描绘植入肿瘤细胞以及给药使用各种糖修饰剂处理的细胞或未处理细胞所产生TRU-016的小鼠在第8天的相对肿瘤体积。
[0085]图14描绘植入肿瘤细胞以及给药使用各种糖修饰剂处理的细胞或未处理细胞所产生TRU-016的小鼠的存活百分比。
[0086]图15描绘在存在栗精胺时所培养的细胞所产生的TRU-015的CDC以及碘化丙锭阳性(死细胞)百分比对比TRU-015测试蛋白浓度的图表。
[0087]图16描绘在存在各种糖修饰剂时所培养的细胞所产生的TRU-016的CDC，以及碘化丙锭阳性(死细胞)百分比对比TRU-016测试蛋白浓度的图表。
[0088]图17描绘在栗精胺浓度范围内，TRU-016的相对特异性蛋白产量。
[0089]图18描绘在果精胺浓度范围内，TRU-016同时结合CD37与FcγRIIIa(CD16)的检验结果。
[0090]图19描绘对于栗精胺浓度范围，TRU-016与表达CD37的细胞的剂量应答结合曲线。
[0091]图20描绘在栗精胺浓度范围内TRU-016的ADCC活性曲线。
本发明的详细描述
实施例
实施例1
产生SMIP产物
TRU-016
[0092]CD37-特异性SMIP被描述在共有的美国专利申请No.10/627,556和美国专利公开No.2003/133939，2003/0118592以及2005/0136049中，均通过参考将其整体并入本文。如下所述产生示范性SMIP、TRU-016。
[0093]TRU-016[G28-1scFv VH11S(SSC-P)H WCH2 WCH3]是重组单链蛋白质，其结合CD37抗原。TRU-016的核苷酸和氨基酸序列被列于SEQ ID NO：1和2中。结合结构域基于在前述段落的专利公开中所已经公开的G28-1抗体序列，通过参考将其并入本文。将结合结构域通过经修饰的铰链区连接到效应子结构域人IgG1的CH2和CH3结构域。TRU-016以溶液中的二聚体存在。
[0094]通过重组DNA技术在中国仓鼠卵巢(CHO)哺乳动物细胞表达体系中产生TRU-016。通过蛋白质A亲和层析从CHO培养物上清纯化TRU-016SMIP。使用dPBS，以5.0ml/分钟(150cm/小时)对50mL r蛋白质A FF琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare rProtein A SepharoseFF，Catalog # 17-0974-04)平衡1.5倍柱体积(CV)。以1.7ml/分钟的流速使用AKTA Explorer 100 Air(GE healthcare AKTA Explorer 100 Air，Catalog # 18-1403-00)将培养物上清上样到r蛋白质A琼脂糖凝胶FF柱，捕获重组TRU-016。使用dPBS，接着1.0M NaCl、20mM磷酸钠pH 6.0、接着使用25mM NaCl，25mM NaOAc，pH 5.0对柱清洗5倍柱体积(CV)。这些清洗步骤从r蛋白质A柱除去了非特异性结合的CHO宿主细胞蛋白质，这有助于在洗脱后产品沉淀。
[0095]使用100mM甘氨酸pH 3.5从柱洗脱重组TRU-016。回收10mL洗脱产物级分，接着将洗脱产物使用20％洗脱体积的0.5M2-(N-吗啉)乙烷磺酸(MES)pH 6.0调至pH 5.0。将该洗脱产物浓缩至大约25mg/mL TRU-016并过滤除菌。
[0096]将纯化的蛋白质进行GPC尺寸排阻层析法(SEC)以达到对来自较高分子量聚集体的TRU-016(二聚体)的进一步纯化。使用dPBS，以12.6ml/分钟(38cm/小时)对含有1L Superdex 200FF琼脂糖凝胶的XK 50/100柱(GE healthcare XK 50/100孔层析柱Catalog#18-8753-01)平衡1.5倍柱体积(CV)。将最大体积54ml(3％CV)的样品应用到柱。柱继续以12.6ml/分钟运行，洗脱蛋白质被分级在40mL级分中。使用分析型HPLC对每种级分进行分析产品质量，并汇集＞95％POI(未聚集的)TRU-016的洗脱级分。将所得到的汇集物以0.22μm进行过滤除菌。接着浓缩材料，并使用20mM磷酸钠和240mM蔗糖pH 6.0进行配置。
[0097]纯化葡萄糖变体(glycovariant)的可替换方法如下。通过蛋白质A亲和层析从CHO培养上清纯化TRU-016。使用dPBS，以1.0mL/分钟对1mL MabSelect亲和层析柱(GE Healthcare HitrapMabSelect，catalog #28-4082-53)平衡7倍柱体积(CV)。使用AktaExplorer 100 Air(GE Healthcare，Akta Explorer 100 Air，catalog #18-1403-00)以1.0mL/分钟将培养上清上样到MabSelect柱捕获重组TRU-016。使用dPBS对柱清洗20CV，接着使用20mM磷酸钠、1.0MNaCl pH 7.0清洗5CV，接着使用dPBS清洗3CV。
[0098]使用10mM pH 3.5从柱洗脱重组TRU-016，接着使用10mM柠檬酸盐3.0解吸8CV。在解吸之后，使用dPBS对柱重新平衡5CV。在洗脱过程中，将按白纸收集到级分中，并根据所吸光度进行汇集，并利用每5mL洗脱液添加大约400μL 0.55M 2-(N-吗啉)乙烷磺酸(MES)pH 6.0而将所汇集的材料调至pH 5。将该中和的洗脱液过滤除菌，并进行活性检验以及处理分析检验。
[0099]可以进行实验确认TRU-016保持了亲代抗体与CD37细胞表面受体的结合特异性。通过LSM密度梯度分离人PBMC，并与未偶联的TRU-016和偶联PE的抗-人CD19进行孵育。清洗细胞，并与1∶100 FITC GAH IgG(Fc特异性)在冰上孵育45分钟。清洗细胞，并通过双色流式细胞仪在FACsCalibur仪器上使用Cell Quest软件进行分析。通过CD19染色对细胞选通(gate)B淋巴细胞或非B淋巴细胞。
[00100]通过提高TRU-016的浓度，B淋巴细胞(CD19阳性选通(gate))的FITC信号会从0.01μg/ml快速提高到1.0μg/ml，直到达到大约1μg/ml的饱和，或者平均荧光强度(MFI)为1000。相反，非B淋巴细胞群的染色时可检测的，但非常低，并随着scFvIg浓度的提高而缓慢提高。
TRU-015
[00101]类似地制备CD20-特异性SMIP。CD20-特异性SMIP被描述在共有的美国专利公开2003/133939、2003/0118592和2005/0136049，均通过参考被整体并入本文。示范性的SMIP、TRU-015描述如下。
[00102]TRU-015是重组单链蛋白质，其结合CD20抗原。SEQ IDNO：3和4分别列出了TRU-015的核苷酸和氨基酸序列。结合结构域基于公众可得到的人CD20抗体序列。结合结构域通过修饰的CSS铰链区连接到效应子结构域，人IgG1的CH2和CH3结构域。TRU-015在溶液中以二聚体存在。
[00103]TRU-015包含来自SEQ ID NO：4氨基酸1～23的2e12导肽(leader peptide)克隆序列；2H7鼠抗人CD20轻链可变区，其中在可变区残基11具有赖氨酸成为丝氨酸(VHL11S)的氨基酸置换，这反映在SEQ ID NO：4的位点34；asp-gly3-ser-(gly4ser)2接头，从SEQID NO：4的残基129开始；2H7鼠抗人CD20重链可变区，其在重链区的末端缺少丝氨酸残基，即从VTVSS变化为VTVS；人IgG1 Fc结构域，其包括经修饰的铰链区，其包含(CSS)序列和野生型CH2和CH3结构域。
实施例2
使用糖修饰剂培养宿主细胞
[00104]将转染TRU-016或TRU-015cDNA的CHO细胞培养在摇瓶或波动包(wave bag)中，其中通常根据下面所述的程序具有不同浓度的各种糖修饰剂。
[00105]对于摇瓶批次，将对数期宿主细胞以100,000个细胞/ml接种在摇瓶中，其具有待测试浓度的糖修饰剂以及任选地具有氨甲喋呤@50nM。
[00106]在t＝0，以3×106/mL将细胞接种在1350mL Ex-Cell302培养基中(SATC Biosciences；添加非必需氨基酸、丙酮酸盐、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、HT补充物和胰岛素，全部来自Invitrogen)，并在T＞＝72小时，调至总体积5L。在37℃和5％二氧化碳下孵育细胞，并从第6～7天开始，监控生长和活力。典型地，在第10～12天收获上清液，此时细胞活力降至60％以下。
[00107]加入叠氮化钠达到0.02％，通过离心除去细胞，并将上清液过滤除菌通过0.22uM过滤器。对所显示的上清液进行本文其他实施例中所描述的一些检验，而对经历进一步蛋白质A纯化的材料则进行其他检验。对于波动包批次，将对数期宿主细胞接种到5L波动包中。以10～20％调节的Ex-Cell 302培养基(SATC Biosciences；添加非必需氨基酸、酮酸盐、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、HT补充物和胰岛素，全部来自Invitrogen)，具有测试浓度的糖修饰剂。在37℃和5％二氧化碳下对细胞进行孵育，并每天进行生长和活力监控。典型地在第11～12天或者细胞活力降低到50％以下时，收获上清。
[00108]通过在Sorvall Legend以3000rpm(1932rcf)离心20分钟除去，将上清液进行过滤除菌。对所显示的上清液进行本文其他实施例中所描述的某些检验，而对经历进一步蛋白质A纯化的材料进行其他检验。
[00109]如下所述，对使用不同浓度的各种糖修饰剂培养的细胞所产生的TRU-016检验CD16结合、ADCC、CDC、药物动力学参数和体内活性。
[00110]图1和2是代表性的，并且显示已最高达到1000μM浓度的糖修饰剂栗精胺的处理不会影响细胞计数或经过所有取样时间段(最高达到144小时)的细胞活力百分比。
实施例3
结合FcR
[00111]将根据实施例2产生的免疫糖蛋白体外检验与Fcγ受体的可溶性Ig-融合版本的结合，其中受体的胞外结构域与鼠IgG2a Fc融合。
[00112]通过分别将Fcγ受体I的胞外结构域(Genbank Acc.No.BC032634)、IIa(Genbank Acc.No.NM_021642)、IIb(Genbank Acc.No.BC031992)和III-V158(高亲和力等位基因)(Genbank Acc.No.X07934)以及III-F158(低亲和力等位基因)融合到具有在残基238Pro变成Ser突变(MIgG2aP238S)的鼠IgG2a Fc，产生可溶性Fcγ受体材料。对于两种形式的FcγRIII(CD 16)，都将HE4导肽克隆到CD 16氨基酸1～178中，接着融合到MIgG2aP238S。
[00113]如下进行检验，将500,000个WIL2-S细胞(B淋巴瘤细胞系，其在其表面表达CD37以及CD20)在冰上Costar 96孔板中孵育45分钟，其中，所述Costar 96孔板中有在具有1％胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲液(PBS)中5μg/ml TRU-015或TRU-016。通过离心细胞，使用稀释剂(PBS+1％FBS))并在Sorvall Legend RT中以1200rpm再次离心2分钟进行清洗而除去未结合的TRU-015或TRU-016。接着将细胞与在相同的稀释剂中的期望FcγR-MIg融合以1μg/ml浓度在冰上孵育45分钟。
[00114]接着将复合物与1∶100稀释的PE偶联的AffiniPureF(Ab’)2山羊抗小鼠IgG[Jackson Immunoresearch](小鼠Fc-特异性抗体，与人Fc有最小的交叉反应)孵育。通过单色流式细胞仪在FACsCalibur上使用CellQuest软件(Becton Dickinson)对细胞进行分析。
[00115]如果在该检验中使用来自实施例2的TRU-016上清液而不是纯化的TRU-016蛋白，则可以通过使用稀释的上清液以及TRU-016标准对WIL2-S细胞直接染色，而定量上清液中SMIP的浓度。通过使用1∶50稀释的FITC偶联的F(Ab’)2山羊抗人(γ)[CaltagH10101]检测TRU-016。
[00116]测定与低亲和力等位基因和高亲和力等位基因的结合，以类似地比较ADCC活性。CD16结合的提高(低或高亲和力等位基因)与ADCC活性的提高相关。
[00117]图3～6展示了代表性结果。
[00118]对培养基中含0、2、5、10、30或100μg/mL栗精胺所培养的CHO细胞而产生的TRU-015纯化的蛋白质测试CD16结合(低亲和力等位基因)。图3展示了几何平均荧光强度的代表性结果，并且显示CD16结合在提高培养基中栗精胺浓度时CD16结合的剂量依赖性结合。
[00119]对培养基中含浓度为50或250μM的6，8a-二表栗精胺、或浓度为50或250μM的苦马豆素、或浓度为50或250μM的的去氧甘露糖野尻霉素(DMJ)所培养的CHO细胞而产生的TRU-016上清液测试CD16结合。图4中显示了平均荧光强度的代表性结果，并且显示两种浓度的DMJ都提高了CD16结合。尽管以这些浓度对6，8a-二表栗精胺或苦马豆素没有观察到效果，但对纯化的蛋白质进行了进一步测试以确定效果。
[00120]对培养基中含有浓度为0、0.5、1、3、5或10μM的kifunensine所培养的CHO细胞所产生的TRU-016上清液测试CD16结合。图5中展示了平均荧光强度的代表性结果，并且显示kifunensine比DMJ在提高CD16结合方面有效得多，并且及时在最低浓度0.5μM下也大大提高了CD16结合。
[00121]对培养基中含有0、10、25、50、100或200μM栗精胺所培养的CHO细胞所产生的蛋白质A纯化的TRU-016测试CD16结合。图6中展示了平均荧光强度的代表性结果，并且显示在提高的培养基中栗精胺的浓度下，CD结合的剂量依赖性提高。
实施例4
ADCC活性
[00122]为了测定纯化的TRU-016的ADCC活性，将标记的BJAB B细胞用作靶，并将人外周血单核细胞(PBMC)作为效应子细胞。使用500μCi/mL 51Cr铬酸钠对BJAB B细胞(107个细胞)在37℃下在IMDM/10％FBS中标记2小时。从肝素化的人全血分离PBMC，在淋巴细胞分离介质(LSM，ICN Biomedical)梯度上对全血进行分级。将试剂样品加入到具有10％FBS的RPMI培养基，并制备每种试剂的系列稀释液。以2×104个细胞/孔加入51Cr标记的BJAB。接着以5×105个细胞/孔加入PBMC，达到25∶1的效应子(PBMC)∶靶(BJAB)的最终比例。在96孔板的四个孔中设置反应。将TRU-016的系列稀释液加入到空中，如图中所示，最终浓度在0ng/mL～20μg/mL的范围内。使反应在37℃下5％CO2中进行6小时，之后进行收获和计数。在Packard TopCounNXT上对50μl干燥的培养上清液测量所释放的CPM。通过减法(样品的cpm[四份样品的平均]-自然释放的cpm)/(最大释放cpm-自然释放cpm)×100计算特异性杀死百分比，并将数据根据特异性杀死百分比对比TRU-016浓度进行作图。
[00123]图7～10中展示了代表性结果。
[00124]对培养基中含有0、2、5、10、30或100μg/mL栗精胺所培养的CHO细胞所产生的TRU-015纯化的蛋白质测试使用PBMC从高亲和力(V/V158)和低亲和力(F/F158)CD16供体测量的ADCC。图7和8中展示了特异性杀死百分比的代表性结果(分别为高亲和力和低亲和力供体)，并且显示在培养基中提高浓度的栗精胺下，剂量依赖性的ADCC活性提高。
[00125]对培养基中含有0、10、25、50、100或200μM栗精胺所培养CHO细胞产生的TRU-016纯化的蛋白质测试ADCC。图9中展示了特异性杀死百分比的代表性结果，并显示在培养基中提高浓度的栗精胺下，剂量依赖性的ADCC活性提高。
[00126]对培养基中含有200μM DMJ、10μM kifenunsine或200μM栗精胺所培养的CHO细胞所产生的TRU-016纯化的蛋白质测试ADCC。图10中展示了特异性杀死百分比的代表性结果，并且显示所有这些浓度的糖修饰剂改善了CHO细胞所产生的免疫糖蛋白的ADCC。
实施例5
CDC活性
[00127]为了测定根据实施例2所产生的TRU-016纯化的蛋白质的CDC活性，将Ramos B细胞以在75μl中5×105个细胞/孔悬浮在Iscoves(Gibco/Invitrogen，Grand Island，NY)中。将TRU-016(75μl)以所显示浓度的两倍加入到细胞中。使结合反应进行45分钟，接着离心，并在无血清的Iscoves中清洗。将细胞重悬浮在具有各宗浓度人血清(含有补体)的Iscoves中。将细胞在37℃下孵育60分钟。通过离心对细胞进行清洗，并重悬浮在具有0.5μg/ml碘化丙锭的染色培养基中。将样品在室温下黑暗中孵育15分钟，之后，通过流式细胞仪使用FACsCalibur和CellQuest软件(Becton Dickinson)进行分析。
[00128]对未处理的CHO细胞，或者使用30μg/ml栗精胺处理的CHO细胞所产生的TRU-015纯化的蛋白质测试CDC活性。结果展示在图15中。
[00129]对未处理CHO细胞或者培养基中含有200μM DMJ、10μM kifenunsine或200μM栗精胺所培养的CHO细胞所产生的TRU-016纯化的蛋白质测试CDC活性。结果展示在图16中。
[00130]这些结果显示糖修饰的TRU-015或TRU-016的CDC与未处理CHO细胞所产生的相应蛋白质的CDC类似，这说明宿主细胞的培养基中存在糖修饰剂对宿主细胞所产生的免疫糖蛋白的CDC没有显著的影响。
实施例6
药物动力学特征
[00131]在0时间点，对雌性BALB/c小鼠i.v.注射200μgTRU-016测试蛋白(未处理的CHO或被200μM DMJ、10μM kifenunsine或200μM栗精胺处理的CHO细胞所产生的TRU-016)。在注射后的15分钟、2、6、24、48、72、96和192小时收集血清样品(每个时间点3只小鼠)。
[00132]在基于FACS的结合检验中使用CD37+Ramos人细胞系测定每种TRU-016测试样品的血清浓度。将CD37+Ramos细胞(5×105个细胞/孔)连同待测试的血清样品孵育在96孔平底板中。将加料(spiked)血清样品用于标准曲线。将细胞在4℃下孵育1小时，之后加入检测抗体。使用荧光素偶联的山羊抗人IgG Fcγ片段特异性抗体检测TRU-016测试蛋白与CD37+Ramos细胞的结合。将标准曲线用于构建作为抗原浓度函数的结合曲线。简言之，标准曲线包括各种抑制浓度的TRU-016测试蛋白，其被加料到1∶2稀释在FACS缓冲液中的正常小鼠血清中。对每个板运行两次标准曲线。将来自FACS分析的平均荧光强度(MFI)输出到Softmax Pro软件，并用于计算TRU-016测试蛋白的血清浓度。
[00133]药物动力学研究的结果显示在含有200μM DMJ、10μMkifenunSine或200μM栗精胺的培养基中所培养的CHO细胞所产生的TRU-016(图11中展示的)在被被给药给小鼠时表现出了与未处理CHO小鼠所产生的TRU-016类似的药物动力学特征，这说明宿主细胞培养基中的糖修饰剂对半衰期或其他药物动力学参数没有显著影响。
[00134]对从在给药TRU-016之后48、72、96和192小时后从小鼠获得的含有TRU-016的血清重复CD16检验，显示血清在所测试的所有时间点都保持了其提高的CD 16结合活性。结果显示在图12中。
实施例7
糖修饰的免疫糖蛋白的体内活性
[00135]在第0天为裸鼠皮下给药5×106个Ramos细胞，并在第0、2、4、6和8天静脉注射200μg对照人IgG或经200μM DMJ、10μM kifenunsine或200μM栗精胺处理的CHO细胞所产生的TRU-016测试蛋白质。典型地，小鼠在6天内产生肿瘤，并在稍后死亡。使用数字测径器和LabCat软件每周测量肿瘤三次，并将肿瘤体积计算为1/2[长度×(宽度)]2。每周测定体重一次。
[00136]当肿瘤尺寸达到1500mm3(在周五达到1200mm3)，处死小鼠。如果发生肿瘤溃疡，肿瘤抑制动物的活动性，或者如果体重损失达到或超过20％也将小鼠处死。
[00137]在研究开始后的8天相对肿瘤体积的中间结果显示在图13中。在开始研究后关于存活百分比的属于显示在图14中以及下表1中。
表1
  组  中值存活时间(天)*   p值
  HuIgG   8   --
  CS TRU-016   13   0.0054
  DMJ TRU-016   13.5   0.0005
  Kifu TRU-016   10   00084
*每种糖修饰的TRU-016的数值都与huIgG处理的对照组显著不同。
[00138]体内研究结果显示经200μM DMJ、10μM kifenunsine或200μM栗精胺处理的CHO细胞所产生的TRU-016在癌症动物模型中能够降低肿瘤体积并提高平均存活时间。
实施例8
不同浓度的栗精胺对蛋白质产量的影响
[00139]进行进一步的实验以测定栗精胺浓度对细胞活力、密度和TRU-016的特异性蛋白质产量的影响。
[00140]在开始试验之前，在37℃和5％二氧化碳下在潮湿的培养箱中，将转染TRU-016的CHO细胞培养在摇瓶的Ex-CellTM 302CHO无血清培养基(SAFC Biosciences)中，所述培养基被补充了1×非必需氨基酸(MediaTech)、1×丙酮酸钠(MediaTech)、4mM L-谷氨酰胺(MediaTech)、500nM氨甲喋呤(MP Biomedicals)和1mg/L重组胰岛素(Recombulin-GIBCO/Invitrogen Corp.)。通过将栗精胺在无菌、过滤/去离子水(MediaTech)中稀释而制备200mM储液浓度的栗精胺(AlexisBiochemicals)，并使用0.2μm HT Tuffryn膜(Pall Corporation)过滤通过13mm
Figure A20078003945200331
将储液等分到无菌的O-环状(O-ringed)0.5mL微型离心管(Fisherbrand，Fisher Scientific)中，并在-20℃冷冻。在开始实验前大约1小时，在室温下将所需要的份数冷冻，并通过涡旋(vortexing)充分混合每瓶的内含物。
[00141]对于每次实验，将对数期的细胞接种在上述培养基中，达到在250mL摇瓶中总体积为60mL密度为200,000个细胞/mL，并以待测试的浓度加入CS。800μM、400μM、200μM、100μM、50μM、25μM和0μM的CS浓度均在两份烧瓶中进行测试。在潮湿的恒温箱中在37℃和5％二氧化碳下对所有培养物进行孵育，酶至少每隔一天监控活细胞密度和整体细胞活力。
[00142]当整体活力达到50～70％(实验1)和30～50％(实验2)时在第8天收获培养物。通过在Sorvall Super T21中以3000rpm离心20分钟而除去细胞和细胞碎片，之后将上清液无菌过滤通过具有0.22μm Millipore Express Plus膜的Millipore Steriflip单元，并在2-8℃下储存直到纯化。
[00143]正如每个样品的完整细胞面积(ICA)所显示的，尽管细胞活力和生长似乎不受显著影响，但提高栗精胺浓度似乎可以降低免疫糖蛋白产生。结果显示在图17中和下表2中。400μm和800μm CS的浓度显示降低TRU-016蛋白质产量分别大约40％-55％。
[00144]表2
CS浓度(μM) 收获时的活力(％)   所产生的平均TRU-016(ug/mL)±SD ICAa106个细胞*天/mL 比产量b(pg/细胞/天)
  800   70.6   99.65±6.1   23.9   3.99
  800   65.2   23.8   4.36
  400   68.2   124.93±1.4   22.4   5.53
  400   65.7   23.0   5.48
  200   55.5   143.53±1.4   21.9   6.60
  200   51.1   22.0   6.47
  100   54.4   161.83±0.1   21.6   7.48
  100   54.6   21.6   7.49
  50   49.4   176.63±1.0   21.6   8.15
  50   50.0   21.4   8.27
  25   53.9   180.31±6.6   21.4   8.22
  25   54.5   21.1   8.78
  0   65.1   2082.4±0.3   22.4   9.29
  0   62.6   21.7   9.62
a完整细胞面积(ICA)
ICA＝((VCCn+VCCn+1)/2)×(tn+1-tn)
其中
VCCn＝在时间n时活细胞密度
VCCn+1＝在时间n+1时的活细胞密度
单位：106个小*天/mL
b比产量＝所产生的总量(ug/mL)/ICA
单位：pg/细胞/天
实施例9
TRU-016同时结合CD37以及FcγRIIIa(CD16)的检验
[00145]进行试验测定栗精胺浓度对TRU-016功能活性的影响，这根据所测量的其与FcγRIIIa的结合以及其与靶抗原CD37的结合。
[00146]在下列检验中测试实施例8中所产生的TRU-016，其同时评估了TRU-016结合结构域结合表达CD37的靶细胞的能力，以及TRU-016SMIP的Fc部分结合人CD16和鼠IgG Fc融合蛋白的能力。
[00147]所利用的靶细胞是Daudi(ATCC CRL-213)细胞系。Daudi细胞是人B-成淋巴细胞类细胞系，其来自Burkitt’s淋巴细胞瘤并表达高水平的CD37。定制的可溶性CD16:MuIgGFc融合蛋白是连接到鼠IgGFc的人CD16(低亲和力多态性)。
[00148]将适当数目的Daudi细胞(350,000/孔乘以孔的数目)并在15℃下一250×g离心5分钟。除去上清。通过使用FACS Buffer稀释来自USB(USB US19943)1∶4的4％储液制备1％的冷低聚甲醛。通过将2％FBS(Gibco)加入到Dulbecco’s PBS(Invitrogen)(v/v)中并使用0.22μm过滤器无菌过滤而制备FACS缓冲液。在4℃下保存和使用FACS缓冲液。将细胞重悬浮在1％低聚甲醛中(体积等于50μL/孔乘以孔的数目)，并铺在圆底96孔板中。在4℃下孵育细胞30分钟。在孵育后，通过向每孔加入150μL FACS缓冲液，250×g离心3分钟并除去上清而对细胞进行清洗。将细胞重悬浮在50μL FACS缓冲液中。将TRU-016稀释在FACS缓冲液中，浓度范围在饱和到背景水平之间(24μg/mL-0.011μg/mL)，加入到适当的孔中，50μL/孔，并将细胞在4℃下孵育25分钟。将CD16:MuIgGFc融合蛋白稀释在FACS缓冲液中达到饱和水平(20μg/ml)并加入进行检验(50μL/孔)，在4℃下额外孵育30分钟以与已经被结合到细胞表面的TRU-016形成复合物。通过在15℃下250×g离心3分钟，除去上清，接着使用200μL/孔FACS缓冲液清洗3次而从孔除去所有未结合的试剂。接着将细胞与荧光团(R-藻红蛋白，Jackson 115-116-071)标签F(ab’)2抗体，对Fc特异性的抗体(并选择为对人Fc的反应性最低)孵育。该抗体将结合CD16:MuIgGFc融合蛋白的MuIgGFc部分。将抗体以1∶200稀释在FACS缓冲液中，并向每孔加入100μL。在4℃下黑暗中孵育板45分钟。通过向每孔加入150μL FACS缓冲液并在15℃下250×g离心3分钟以及除去上清而除去所有未结合R-PE。随后利用200μL/well FACS缓冲液，在15℃下250×g离心3分钟以及除去上清而进行第二次清洗。使用200μL/孔1％低聚甲醛重悬浮细胞并在4℃下储存过夜。
[00149]在BD FACSCalibur流式细胞仪***上测量每个样品所结合的荧光，并使用Cell Quest Pro软件(Becton Dickinson，ver 5.2)进行分析。将每个样品的GeoMean荧光强度相对于TRU-016浓度进行作图。产生剂量应答并使用SoftMax Pro软件(Molecular Devices，ver5.0.1)拟合4-参数逻辑(4-PL)曲线。将TRU-016的滴度用于形成测试和参照材料的剂量应答曲线进行比较。将“D”-参数(最大曲线渐近线)用作经处理和未处理样品比较的参照。“D”数值的提高代表相应样品结合活性的提高。
[00150]实验结果展示在图18中，并显示相对于最高达到400μM的CS浓度的的剂量依赖性结合应答，在400μM结合似乎变平。
[00151]为了证明CS处理的TRU-016与CD16增强的结合并不是部分由于增强的分子与CD37的结合，除了在检验板中加入并孵育经处理或未处理的TRU-016样品，并通过在15℃下250×g离心3分钟除去上清接着使用200μL/孔FACS缓冲液清洗3次而除去未结合的TRU-016之外，重复上述检验。接着，将细胞与偶联FITC的山羊抗人IgG Fc特异性抗体(Caltag H10501)孵育。该抗体将与结合到细胞的TRU-016的人IgG链结合。将抗体在FACS缓冲液中1∶50稀释，并将100μL加入到每个孔中。将板在4℃下黑暗中孵育45分钟。通过向每个孔中加入100μLFACS缓冲液，在15℃下250×g离心3分钟，接着除去上清而除去所有未结合的FITC标记的抗体。随后，使用200μL/孔FACS缓冲液进行第二次清洗。使用200μL/孔2％低聚甲醛重悬浮细胞，并保存在4℃下过夜。在BD FACSCalibur流式细胞仪***上测量每个样品所结合的荧光，并使用Cell Quest Pro软件(BectonDickinson，ver 5.2)进行分析。对每个样品的GeoMean荧光强度相对于TRU-016浓度进行作图。产生剂量应答并使用SoftMax Pro软件(Molecular Devices，ver 5.0.1)拟合4-参数逻辑(4-PL)曲线。将TRU-016的滴度用于形成测试和未处理对照和CS处理样品的剂量应答曲线进行比较。
[00152]如图19中所示，所有CS处理的样品的与表达CD37的细胞以及未处理TRU-016样品的剂量应答结合曲线基本上相互相同，这说明使用CS处理并不改变TRU-016与其特异性靶抗原的结合。
实施例10
抗体依赖性细胞毒性(ADCC)检验
[00153]进行实验根据ADCC活性所测量的，测定栗精胺浓度对TRU-016功能活性的影响。
[00154]将根据实施例8中所产生的TRU-016与表达CD37的Daudi癌症B细胞系结合原代外周血淋巴细胞(PBL)效应子细胞孵育以评估ADCC活性。
[00155]将Daudi靶细胞(5×106)加入到15ml圆锥管中，接着在20℃下200×g离心5分钟，并除去上清。通过加入0.3mCi铬-51(51Cr，GE Healthcare，CJ51)将细胞沉淀重悬浮。将细胞在37℃5％CO2下孵育75分钟，使得细胞吸收放射性同位素。接着对细胞进行清洗以除去所有未吸收的51Cr。这是通过将10mL完全培养基(具有10％FBS(Gibco)的IMDM(Gibco))加入到管中，在20℃下200×g离心5分钟接着除去上清完成的。最终重悬浮在11.5mL完全培养基中。将TRU-016稀释在完全培养基中，其浓度能够产生相对于细胞裂解背景水平的最大值(500ng/mL-0.005ng/mL)。将这些滴度以50μL/孔铺在圆底96孔板中。加入51Cr标记的靶细胞达到50μL/孔的TRU-016以及对照孔(不含TRU-016的对照培养基)的剂量滴定。通过密度梯度离心使用淋巴细胞分离培养基根据规程(LSM，MP Biomedical，50494/36427)从新甘素化的全血分离PBL。将PBL效应子细胞，100μL/孔，以25∶1-30∶1(效应子∶靶)之间的比例加入到孔中。将检验在37℃5％CO2下孵育4.5～5个小时。效应子细胞相对于TRU-016浓度裂解靶细胞，释放成比例量的51Cr进入检验上清。在孵育后，将板在20℃下250×g离心3分钟。将25μL体积的无细胞上清从所有孔中移除到闪烁板(Perkin Elmer 6005185)并干燥过夜。使用Topcount板阅读器(PerkinElmer，C9904VO)测量闪烁板的每个孔中51Cr同位素的量。数据表达为特异性释放的百分比。如下计算特异性释放；
[00156](样品值-自然发生值)/(最大值-自然发生值)*100％
自然发生值＝仅从靶细胞释放的51Cr量
最大释放＝从经去污剂裂解剂处理的靶释放的51Cr量
背景对照＝从靶细胞+效应子细胞(无TRU-016)释放的51Cr量
[00157]产生剂量应答并使用SoftMax Pro软件(MolecularDevices，ver 5.0.1)拟合4-参数逻辑(4-PL)曲线。将TRU-016的滴度用于形成测试和参照材料的剂量应答曲线进行比较。将经处理物品的EC50值与未处理对照(无CS)进行比较以测定ADCC活性的提高百分比。下表总结了图20中所展示的数据。数据显示经过100μM-800μM终浓度范围内的CS处理的TRU-016的ADCC活性，相对于未处理TRU-016被显著提高。
表3
样品ID   供体Q高1∶17   供体N低1∶17   供体AF杂合1∶25   供体AF杂合1∶13
  对照CS 0μM 1.24 2.60 0.23 0.37
CS 100μM   0.25(502％)   0.70(370％) 0.03(728％) n/a
CS 200μM   0.21(589％)   0.54(479％) n/a 0.06(579％)
CS 400μM   0.24(515％)   0.53(492％) n/a 0.08(440％)
CS 800μM   0.25(492％)   0.63(414％) n/a 0.08(451％)
比例1∶X＝靶与效应子比例(从全血新分离的PBMC)
对于CD等位基因供体是纯合高亲和力(高)、纯合低亲和力(低)或杂合的。
[00158]尽管根据上述示范性实施方式已经对本发明的组合物和方法进行了描述，但本领域技术人员清楚可以对本文所描述的组合物和/或方法或者方法中的步骤或步骤的顺序进行变化，而不离开本发明的概念、主旨和范围。更具体的，明显的是某些化学和生理相关的试剂可以置换本文所描述的试剂，而能达到相同或相似的结果。所有这些对于本领域技术人员明显的类似置换和修饰被认为在所附权利要求所限定的本发明的主旨、范围和概念中。
[00159]本文中所引用的参考文献全部具体地通过参照并入本文，达到它们提供了对本文所列出的内容做出示范性细节补充的程度。

Claims (15)

1.提高宿主细胞所产生免疫糖蛋白分子的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法，该方法包括下列步骤：
在体积为至少1升的培养基中培养所述宿主细胞，其中所述培养基包含栗精胺，其浓度在大约25至大约800μM之间，这提高了所述宿主细胞所产生免疫糖蛋白分子的ADCC。
2.权利要求1的方法，其中ADCC被提高至少2倍。
3.权利要求1的方法，其中ADCC被提高至少5倍。
4.提高宿主细胞所产生免疫糖蛋白分子的CD16结合的方法，其包括下列步骤：
在体积为至少1升的培养基中培养所述宿主细胞，其中所述培养基包含栗精胺，其浓度在大约25至大约800μM之间，这提高了所述宿主细胞所产生免疫糖蛋白分子的CD16结合。
5.权利要求4的方法，其中CD16结合被提高至少50％。
6.权利要求4的方法，其中CD16结合被提高至少2倍(200％)。
7.权利要求1至7任一项的方法，其中培养基中免疫糖蛋白产量的水平为至少100μg/mL。
8.权利要求1至7任一项的方法，其中栗精胺以大约100至400μM之间的浓度存在。
9.权利要求1至8任一项的方法，其中所述培养基基本上无血清。
10.权利要求1至9任一项的方法，其中在补料分批培养物中培养宿主细胞。
11.权利要求1至9任一项的方法，其中在连续进料培养物中培养宿主细胞。
12.权利要求1至9任一项的方法，其中培养基包含第二糖修饰剂。
13.组合物，其包含根据权利要求1至12任一项的方法所产生的免疫糖蛋白以及无菌可药用的载体或稀释剂。
14.杀死或抑制癌症细胞生长的方法，其包括为个体给药权利要求13的组合物的步骤，其中所述癌症细胞在其表面表达被所述免疫糖蛋白分子结合的分子。
15.耗尽细胞的方法，其包括为个体给药权利要求13的组合物，其中所被耗尽的细胞在其表面表达被所述免疫糖蛋白分子结合的分子。
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