KR101579218B1 - Ｃｄ138 발현성 종양 세포에 대한 표적화를 개선시키기 위한 방법 및 물질 - Google Patents

Ｃｄ138 발현성 종양 세포에 대한 표적화를 개선시키기 위한 방법 및 물질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기질 세포에 대한 CD138 발현 종양 세포의 유착을 감소시키는, CD138에 대한 특이성을 가진 면역접합체 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다. 이렇게 유착이 감소되면 종양 세포가 면역접합체 뿐만 아니라 다른 물질, 특히 세포독성 물질에 대해서도 감수성을 나타내게 된다.

Description

ＣＤ138 발현성 종양 세포에 대한 표적화를 개선시키기 위한 방법 및 물질{METHODS AND AGENTS FOR IMPROVING TARGETING OF CD138 EXPRESSING TUMOR CELLS}
본 출원은 2007년 12월 26일자 미국 가출원 61/016,614, 2008년 8월 8일자 미국 가출원 61/087,466 및 2008년 8월 8일자 미국 가출원 61/087,590에 대한 우선권을 주장하며, 이들 출원의 내용은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 CD138을 발현하는 표적 세포에 대한 기질 세포(stroma cell)의 유착을 감소시켜 CD138을 발현하는 세포가 관여하는 질병 상태를 보다 효과적으로 치료하기 위한, 항원 CD138에 대한 면역접합체 및 상기 면역접합체를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
CD138은 세포외 매트릭스의 수용체로서 작용하는 것으로, 다발성 골수종(MM: multiple myeloma) 세포에서 과다 발현되며, MM 세포의 분화 및/또는 증식에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 또한, CD138은 난소암 세포, 신장암 세포, 담관암 세포, 유방암 세포, 전립선암 세포, 폐암 세포, 대장암 세포, 호지킨 림프종 세포, 비-호지킨 림프종 세포, 만성 림프성 백혈병(CLL: chronic lymphocytic leukemia)에서 일부 발현되고 있다.
본 발명을 설명하기 위해, 특히 실시에 대한 부가적인 상세한 내용을 제공하기 위해, 본원에서 인용되는 특허 등의 공개 문헌 및 그외 자료들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 편의상, 공개 문헌들은 하기에서 저자 및 발행일로 언급되거나, 및/또는 첨부된 참고문헌 목록에 저자의 알파벳 순으로 열거된다.
Tassone 등(2004)은 MM 세포의 표면에서 발현되는 CD138 항원에 대한 뮤라인 IgG1 항체 B-B4의 우수한 결합성을 보고하였다. 또한, Tassone 등은, 다발성 골수종 세포에 대한 작용자(effector) 분자로서 마이탄시노이드 DM1을 포함하는, 면역접합체 B-B4-DM1의 우수한 세포독성 활성을 보고하였다(미국 특허 공개번호 20070183971).
또한, Tassone은, 다발성 골수종(MM) 세포에서, MM 환자에게 일반적으로 투여되는 다수 약물, 예컨대 덱사메타손에 대한 내성을 유도하는 골수 미세환경에서도 상기 B-B4 접합체가 유효함을 확인하였다. Tassone의 면역접합체는 골수 기질 환경에서 MM 종양 세포를 효과적으로 파괴할 수 있었다.
한편, Tassone 등은, MM의 효과적인 치료법 및 그러나 치료에 사용될 수 있는 물질의 조성물을 제공하는데 기여하였지만, 당해 기술 분야에서는 다수의 해결해야할 과제들이 남아 있는 실정이다.
B-B4를 기초로 한 면역 접합체를 이용하는 개선된 치료법들이 요구되고 있다. 또한, 한가지 이상의 유익한 특성을 보이는 B-B4 기반의 면역접합체를 이용하는 효과적인 치료법들이 요구되고 있다. 상기 면역접합체의 특성들로는, 바람직하게는, 항원 결합성 개선, 특히 CD138 발현성 종양 세포를 포함하는 종양 세포 및 세포 부속물의 사멸성 개선, 또는 표적에 대한 보다 균일한 결합성이 있으며, 특히 CD138 발현성 세포와 관련있는 질병 상태들을 보다 효과적으로 퇴치하는 능력을 포함한다.
미국 특허 공개번호 20070183971
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본 발명은, 개체의 종양 세포에서 CD138 발현성 종양 세포에 대한 기질 세포의 유착을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은,
상기 종양 세포에, CD138 발현 세포를 표적화하는 면역접합체, 특히 절단성 링커와 본원에 기술된 작용자를 포함하는 면역접합체를, CD138 발현 세포에 대한 기질 세포의 유착을 감소시키는데 유효한 양으로 투여하는 단계, 및 선택적으로, 상기 종양 세포에 다른 세포독성 물질을 종양 세포의 증식을 저해, 지연 및/또는 예방하는 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
상기 유착은 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 그 이상으로 감소될 수 있거나, 및/또는 다른 세포독성 물질(상기 면역접합체들 중 한가지는 아님)에 대한 유착 매개성 약물 내성을 포함하여, 유착 매개 약물 내성을 완화시키는 결과를 도출할 수 있으며, 상기 다른 세포독성 물질은 종양 세포의 증식을 저해, 지연 및/또는 예방하는 양으로 투여된다. 상기 면역접합체와 상기 세포독성 물질(들)은 따라서 연속적으로 투여될 수 있으며, 면역접합체를 투여한 후 세포독성 물질을 투여하거나, 또는 동시-투여할 수 있다.
특히, 본 발명의 면역접합체는, 하기 성분을 포함한다:
(a) 조작된(engineered) 표적 항체, 및
(b) 작용자 분자,
상기 면역접합체는 CD138 발현 표적 세포를 균일하게 표적화한다.
본 발명의 상기 조작된 표적 항체는,
(i) 필수적으로 비-인간 항체의 CD138에 대한 항원 결합부(ABR)로 구성되거나, 또는
(ii) CD138에 대한 비-인간 항체의 항원 결합부(ABR), 및 한 부분 이상이 인간 항체의 영역인 다른 항체 영역으로 구성될 수 있다.
상기 ABR은,
(a) 서열번호 1의 99번에서 111번의 아미노산 잔기들을 포함하는 중쇄 가변부 CDR3, 및
(b) 서열번호 2의 89번에서 97번의 아미노산 잔기들을 포함하는 경쇄 가변부 CDR3를 각각 포함할 수 있다.
상기 ABR은,
(a) 서열번호 1의 31번에서 35번 및 51번에서 68번의 아미노산 잔기들을 포함하는 중쇄 가변부 CDR1 및 CDR2, 및/또는
(b) 서열번호 2의 24번에서 34번 및 50번에서 56번의 아미노산 잔기들을 포함하는 경쇄 가변부 CDR1 및 CDR2를 각각, 더 포함할 수 있다.
상기 다른 항체 영역은,
(a) 서열번호 1의 123번에서 448번의 아미노산 잔기들, 및/또는
(b) 서열번호 2의 108번 내지 214번의 아미노산 잔기들 각각과,
이의 돌연변이를 포함할 수 있으며, 상기 돌연변이는,
(i) 상기 조작된 표적 항체의 항체-의존적인 세포독성 및/또는 보체-의존적인 세포독성을 유지 또는 낮추거나, 및/또는
(ii) 상기 조작된 표적 항체를 안정화한다.
상기 작용자 분자는 링커를 통해 상기 조작된 표적 항체에 부착될 수 있다. 링커는 이황화 결합을 포함할 수 있다. 상기 작용자 분자(예, DM4)는 표적 항체와 작용자 분자 사이에 입체 방해(sterical hindrance)를 제공할 수 있다. 작용자 분자는 하나 이상의 마이탄시노이드(예, DM1, DM3, 또는 DM4) 탁센 또는 CC1065, 또는 이의 유사체일 수 있다.
상기 면역접합체는 CD138에 결합할 수 있으며, 표적 변이성(targeting variation)은 150%, 140%, 130%, 120%, 110%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60% 또는 50% 미만이다.
본 발명은 또한 CD138을 표적으로 하는 표적 물질을 포함하는 면역 접합체에 관한 것으로, 상기 표적 물질은 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 면역글루불린 중쇄 또는 이의 일부는 서열번호 1과 70% 이상의 서열 동일성을 가진다. 상기 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부의 불변 영역은 IgG4 이소타입 불변 영역일 수 있다.
또한, 본 발명은
본원에 기술된 면역접합체 하나 이상을 제공하는 단계, 및
개체에게 상기 면역접합체를 다발성 골수종의 치료에 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 MM을 치료하는 방법에 관한 것이다.
상기 면역접합체의 표적 물질은, 서열번호 2와 약 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 경쇄 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 면역접합체의 표적 물질은, 서열번호 1과 약 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 중쇄 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은,
본원에 기술된 면역접합체 하나 이상을 제공하는 단계, 및
상기 면역접합체를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 면역접합체 매개형 약물 전달 방법에 관한 것으로, IgG4 이소타입은 ADCC, 보체 의존적인 세포독성 및/또는 Fc-매개의 간 FcR 표적화를 완화시킨다.
또한, 본 발명은,
본원에 기술된 면역접합체 하나 이상을 세포 배양물에 종양 세포의 증식을 저해, 지연 및/또는 예방하기 위한 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 세포 배양물에서 종양 세포의 증식을 저해, 지연 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 상기 유효량은 CD138 발현성 종양 세포 및 선택적으로, CD138을 발현하지 않는 부속 세포, 특히 종양 기질 세포에서 세포 사멸 또는 계속적인 세포 주기 정지를 유도할 수 있다. 상기 세포 배양물에서 세포는 암 환자로부터 수득할 수 있으며, 상기 면역접합체를 상기 유효량으로 투여한 후, 상기 세포 배양물의 세포를 상기 암 환자에게 재이식할 수 있다.
또한, 본 발명은, 환자에게 전술한 면역접합체 하나 이상을 종양의 증식 및/또는 상기 종양 세포의 전파를 저해 또는 감소시키는 양으로 투여하는 단계를 포함하는, CD138 종양 세포를 포함하는 종양의 증식 및/또는 상기 종양의 종양 세포의 전파를, 환자에게서 저해, 지연 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이며, 상기 면역접합체는 상기 종양 세포의 증식 및/또는 전파를 저해, 지연 또는 예방한다.
상기 면역접합체(들)의 작용자 분자는 독소, 세포독성 효소, 저분자량의 세포독성 약물, 구멍-형성 물질, 생물학적 반응 개질제, 프로드럭 활성화 효소, 항체, 사이토카인 또는 방사성 핵종일 수 있다.
본 발명의 면역접합체는 1회 투여량 5 mg/m2 내지 약 300 mg/m2로, 선택적으로 매시간, 매일, 매주의 간격으로 또는 이의 조합으로 투여할 수 있다.
다중 투약 요법은 매시간, 매일 및 매주 요법을 포함하며, 이는 본 발명의 일부분이며, 특히 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주 또는 8주의 간격으로의 투여를 포함한다.
또한, 본 발명은 환자에게서 종양의 증식 및/또는 악성 종양 세포의 전파를 저해, 지연 및/또는 예방하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(a) 환자에게 하나 이상의 세포독성 물질 및/또는 방사선을 종양 크기를 감소시키는데 유효한 양으로 투여하는 단계; 및
(b) 상기 환자에게 전술한 면역접합체 하나 이상을 종양의 증식 및/또는 종양 세포의 전파를 저해, 지연 또는 예방하는 양으로 투여하는 단계
를 포함하며,
상기 면역접합체는 CD138 발현 세포를 포함하는 종양 세포의 증식 및/또는 전파를 저해, 지연 또는 예방한다.
본 발명의 임의의 구현예에서, 상기 세포독성 물질은, 특히 메팔란(mephalan), 빈크리스틴(vincristine), 독소루비신(doxorubicin), 덱사메타손(dexamethasone), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 에토포시드(etoposide), 사이타라빈(cytarabine), 시스플라틴(cisplatin), 탈리도미드(thalidomide), 프레드니손(prednisone), 탈리도미드(thalidomide), 보르테조밉(bortezomib), 레날리도미드(lenalidomide), 소라페닙(sorafenib), 로미뎁신(romidepsin) 또는 이의 조합일 수 있으며, 또는 항체 기반일 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) 본원에 기술된 면역접합체 하나 이상을 제공하는 단계, 및
(b) 상기 면역접합체를 개체에게 투여하여, 상기 개체의 골수종 세포의 생존 또는 증식을 선택적으로 감소시키는 단계를 포함하는,
골수종 세포 생존의 억제가 유익할 수 있는 증상을 가진 개체의 치료 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 종양의 증식 및/또는 종양 세포의 전파를 저해, 지연 및/또는 예방하기 위한 본원에 기술된 면역접합체들 중 임의의 것과, 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 약학 조성물은 본원에 기술된 세포독성 물질을 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명은, 개별 용기, 종양의 증식 및/또는 종양 세포의 전파를 저해, 지연 및/또는 예방하기 위해 조합하여 사용하기 위한 약학 조성물을 포함하는 키트에 관한 것으로, 하나의 용기에는 전술한 약학 조성물이 유효량으로 포함되어 있으며, 다른 분리된 용기에는 종양의 증식 및/또는 종양 세포의 전파를 저해, 지연 및/또는 예방하기 위한, 유효량의 물질, 바람직하게는 세포독성 물질과 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 제2 약학 조성물이 포함되어 있다.
또한, 본 발명은,
(a) 절단성 링커를 통해 입체적으로 방해를 받는 작용자 분자가 부착된, CD138에 대한 조작된 표적 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는 단계, 및
(b) 개체에게 상기 (a)의 면역접합체를 종양의 증식 및/또는 종양 세포의 전파를 저해, 지연 및/또는 예방하는 양으로 투여하는 단계를 포함하며,
상기 (a)의 면역접합체는, 입체적으로 방해받지 않는 대응체 대비 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40% 또는 그 이상을 초과하는, 종양 증식 저해 활성을 제공하는 것을 특징으로 하는, 개체에서 CD138 종양 세포를 포함하는 종양의 증식 및/또는 종양 세포의 전파를 저해, 지연 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
비절단성 링커를 포함하는 방해받지 않는 대응체의 종양 증식 저해 활성은, 절단성 링커를 포함하는 이것의 방해받지 않는 대응체의 종양 증식 저해 활성 보다, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 최대 약 15%와 같이 높을 수 있다.
CD138에 대한 상기 조작된 표적 항체는 필수적으로 비-인간 항체의 CD138에 대한 항원 결합 영역으로 구성되거나, 또는 비-인간 항체의 CD138에 대한 항원 결합 영역과 한 부분 이상이 인간 항체의 부분인 다른 항체 영역을 포함할 수 있다.
상기 절단성 링커는 이황화 결합을 포함할 수 있다. 작용자 분자는 DM4일 수 있다. 면역접합체는 약학 조성물의 일부일 수 있으며, 약 5 mg/m2 내지 약 300 mg/m2의 양으로 1회 이상의 투약으로 개체에게 투여할 수 있다.
본 발명은, 면역접합체가,
(a)
(i) 비-인간 항체의 CD138에 대한 항원 결합 영역으로 필수적으로 구성되거나, 또는
(ii) CD138에 대한 비-인간 항체의 항원 결합 영역 및 한 부분 이상이 인간 항체의 일부분인 다른 항체 영역을 포함하는
조작된 표적 항체, 및
(b) 작용자 분자를 포함하며,
상기 면역접합체가 CD138에 균일하게 결합하는, 약제로서 이용하기 위한 면역접합체를 제공한다.
본 발명은, CD138을 표적으로하는 표적 물질을 포함하는 약제로서의 추가적인 면역접합체를 제공하며,
상기 표적 물질은 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부분의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부분이 서열번호 1과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는다.
특히, 본 발명의 일 측면에서, 상기 단락의 면역접합체는 다발성 골수종의 치료에 사용하기 위한 것이다. 특히, 상기 면역접합체는 다발성 골수종의 치료 약제의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명은, 환자에게 면역접합체 매개 약물 전달에 이용하기 위한, 특히 ADCC, 보체 의존적인 세포독성 및/또는 Fc-매개 간의 FcR의 표적화를 완화하는데 사용하기 위한 면역접합체를 추가적으로 제공하며, 이때 상기 면역접합체는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부분의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함하는, CD138을 표적으로 하는 표적 물질을 포함하며, 상기 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부분은 서열번호 1과 70% 이상의 서열 동일성을 가지며, 상기 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부분의 불변 영역은 IgG4 이소타입 불변 영역이다.
또한, 본 발명은 환자의 암 치료에 사용하기 위한, 세포 배양물에서 면역접합체로 처리된 종양 세포를 제공하며,
상기 면역접합체는
(a)
(i) 비-인간 항체의 CD138에 대한 항원 결합 영역으로 필수적으로 구성되거나, 또는
(ii) CD138에 대한 비-인간 항체의 항원 결합 영역 및 한 부분 이상이 인간 항체의 일부분인 다른 항체 영역을 포함하는
조작된 표적 항체, 및
(b) 작용자 분자를 포함하며,
상기 면역접합체는 CD138에 균일하게 결합하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 환자의 암 치료에 사용하기 위한, 세포 배양물에서 면역접합체로 처리된 종양 세포를 제공하며,
상기 면역접합체는 CD138을 표적으로 하는 표적 물질을 포함하며,
상기 표적 물질은 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부분의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함하며,
상기 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부분은 서열번호 1과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명은, 환자에서 CD138 종양 세포를 포함하는 종양의 증식 및/또는 그러한 종양의 종양 세포의 전파를 저해, 지연 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 면역접합체를 제공하며,
상기 면역접합체는,
(a)
(i) 비-인간 항체의 CD138에 대한 항원 결합 영역으로 필수적으로 구성되거나, 또는
(ii) CD138에 대한 비-인간 항체의 항원 결합 영역 및 한 부분 이상이 인간 항체의 일부분인 다른 항체 영역을 포함하는
조작된 표적 항체, 및
(b) 작용자 분자를 포함하며,
상기 면역접합체가 CD138에 균일하게 결합하는 것을 특징으로 한다.
다른 구현예로, 본 발명은 환자에서 CD138 종양 세포를 포함하는 종양의 증식 및/또는 그러한 종양의 종양 세포의 전파를 저해, 지연 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 면역접합체로서,
상기 면역접합체는 CD138을 표적으로 하는 표적 물질을 포함하며,
상기 표적 물질은 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부분의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함하며,
상기 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부분은 서열번호 1과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 것을 특징으로 하는 면역접합체를 제공한다.
또다른 구현예로, 본 발명은 CD138 발현 세포를 포함하는 종양 세포의 치료에서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위해 조합된 조제물로서 면역접합체와 1종 이상의 항암제를 포함하는 약제를 제공하며,
상기 면역접합체는
(a)
(i) 비-인간 항체의 CD138에 대한 항원 결합 영역으로 필수적으로 구성되거나, 또는
(ii) CD138에 대한 비-인간 항체의 항원 결합 영역 및 한 부분 이상이 인간 항체의 일부분인 다른 항체 영역을 포함하는
조작된 표적 항체, 및
(b) 작용자 분자를 포함하며,
상기 면역접합체는 CD138에 균일하게 결합하며,
상기 1종 이상의 항암제는 종양 크기를 줄일 수 있는 것을 특징으로 한다.
다른 구현예로, 본 발명은, CD138 발현 세포를 포함하는 종양 세포의 치료에서 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위해 조합된 조제물로서 면역접합체와 1종 이상의 항암제를 포함하는 약제를 제공하며,
상기 면역접합체는 CD138을 표적으로 하는 표적 물질을 포함하며,
상기 표적 물질은 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부분의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함하며,
상기 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부분은 서열번호 1과 70% 이상의 서열 동일성을 가지며,
상기 1종 이상의 항암제는 종양 크기를 줄일 수 있는 것을 특징으로 한다.
상기 2 개의 구현예에 대한 다른 측면에 있어서, 상기 조합된 조제물은 방사선 치료받은 환자에게 투여하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 측면에서, 환자의 종양 세포를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, CD138 발현 세포를 포함하는 면역접합체의 용도를 제공하며,
상기 면역접합체는
(a)
(i) 비-인간 항체의 CD138에 대한 항원 결합 영역으로 필수적으로 구성되거나, 또는
(ii) CD138에 대한 비-인간 항체의 항원 결합 영역 및 한 부분 이상이 인간 항체의 일부분인 다른 항체 영역을 포함하는
조작된 표적 항체, 및
(b) 작용자 분자를 포함하며,
상기 약제는 종양 크기를 줄이기 위해 방사선 치료 받은 환자에게 투여되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 환자의 종양 세포를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, CD138 발현 세포를 포함하는 면역접합체의 용도를 제공하며,
상기 면역접합체는 CD138을 표적으로 하는 표적 물질을 포함하며,
상기 표적 물질은 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부분의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함하며,
상기 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부분은 서열번호 1과 70% 이상의 서열 동일성을 가지며,
상기 약제는 종양 크기를 줄이기 위해 방사선 치료 받은 환자에게 투여되는 것을 특징으로 한다.
상기 구현예들에서, 약제는 환자의 종양의 증식 및/또는 악성 종양 세포의 전파를 저해, 지연 및/또는 예방할 수 있다.
또한, 본 발명은 개체에서 골수종 세포의 생존을 억제하기 위한 면역접합체를 제공하며,
상기 면역접합체는
(a)
(i) 비-인간 항체의 CD138에 대한 항원 결합 영역으로 필수적으로 구성되거나, 또는
(ii) CD138에 대한 비-인간 항체의 항원 결합 영역 및 한 부분 이상이 인간 항체의 일부분인 다른 항체 영역을 포함하는
조작된 표적 항체, 및
(b) 작용자 분자를 포함하며,
상기 면역접합체는 CD138에 균일하게 결합하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은, 개체에서 골수종 세포의 생존을 억제하기 위한 면역접합체를 제공하며,
상기 면역접합체는 CD138을 표적으로 하는 표적 물질을 포함하며,
상기 표적 물질은 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부분의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 포함하며,
상기 면역글로불린 중쇄 또는 이의 일부분은 서열번호 1과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 것을 특징으로 하는 한다.
상기 2개의 구현예들에서, 면역접합체는, 특히 개체에서 상기 골수종 세포의 생존 또는 증식을 선택적으로 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명은, 개체에서 CD138 종양 세포를 포함하는 종양의 증식 및/또는 그러한 종양의 종양 세포의 전파를 저해, 지연 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 면역접합체로서, 상기 면역접합체가 절단성 링커를 통해 작용자 분자와 부착된 CD138에 대한 조작된 표적 항체를 포함하며, 상기 작용자 분자가 입체적으로 방해를 받는 것을 특징으로 하는, 면역접합체를 제공한다.
상기 구현예에서, 면역접합체는, 특히 방해받지 않는 대응체에 비해 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40% 또는 그 이상으로 더 높은 종양 증식 저해 활성을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 개체의 종양 세포에서 CD138을 발현하는 종양 세포에 대한 기질 세포의 유착을 감소시키는 방법에 사용하기 위한, CD138 표적 물질을 제공한다.
본 발명은, 개체의 종양 세포에서 CD138을 발현하는 종양 세포에 대한 기질 세포의 유착을 감소시키는 방법에, 동시(동시-투여), 개별 또는 순차적으로 사용하기 위한 조합된 조제물로서, CD138 표적 물질과 표적 면역접합체 또는 세포 증식 억제 물질 등의 다른 물질을 포함하는 약제를, 추가로 제공한다.
상기 구현예에서, 상기 조합된 조제물은 특히 개체에서 종양 세포의 증식을 저해, 지연 및/또는 예방할 수 있다.
도 1은 부착된 작용자 분자를 가지고 있는 nBT062를 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 BT062를 화학식으로 나타낸 것이다.
도 3은 안사미톡신 P-3의 마이탄시놀 변환을 나타낸다(단순화를 위해 입체 화학은 생략됨).
도 4는 DM4의 합성 반응예를 나타낸 것이다.
도 5는 항체 접합(DM4에 nBT062)을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 6은 OPM-2 세포에 대한 nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1, nBT062-SMCC-DM1 및 nBT062 항체의 결합을 분석한 것이다. 다양한 농도의 nBT062 및 접합체를 세포에 제공하였고, 평균 형광을 FACS 분석으로 측정하였다.
도 7(A)-(D)는 MOLP-8 (CD138+) 및 BJAB (CD138-) 세포에 대한 nBT062-DMx 접합체의 시험관내 세포독성을 나타낸 것이다. 세포를 바닥이 평평한 플레이트에서 배양하고, 5일간 기재된 농도의 면역접합체와 함께 인큐베이션하였다. WST 시약을 추가의 3시간 동안 첨가하여, 세포 생활성을 측정하였다. (D)에서, nBT062-SPDB-DM4의 세포독성 활성을 블록킹 항체(1 μM nBT062)의 존재 또는 부재하에 분석하였다.
도 8은 MOLP-8 종양 세포 접종 후 시간(일) 경과에 따른 (A) PBS, (B) nBT062 항체, (C) 유리형 DM4 또는 (D) 비표적성 접합체 huC242-DM4 처리한 각 마우스에서의 종양 체적을 나타낸 것이다.
도 9는 MOLP-8 종양 세포 접종 후 시간(일) 경과에 따른 (A) PBS, (B) nBT062-SPDB-DM4, (C) B-B4-SPP-DM1 또는 (D) nBT062-SPP-DM1을 처리한 각 마우스에서의 종양 체적을 나타낸 것이다.
도 10은 CB.17 SCID 마우스에서의 MOLP-8 인간 다발성 골수종 이종이식체에 대한 접종 후 시간(일) 경과에 따른 평균 종양 체적(+/- SD)을 나타낸 것이다.
도 11A 및 B는 SCID 마우스에서 벌키 MOLP-8 종양 모델의 CD138+ MOLP-8 종양 세포에 대한 nBT062-DMx 항-종양 활성을 나타낸 것이다. 각 군에서 종양 체적은 평균(+/- SD)으로 나타내었다.
도 12는 SCIDhu/INA-6 모델에서 인간 골수 환경내 다발성 골수종에 대한 nBT062 함유성 DMx 접합체의 항-종양 효능을 나타낸 그래프이다. 다발성 골수종 세포(shuIL-6R)에 의해 생산되는 가용성 인간 IL-6 수용체를 종양 적하(tumor burden)의 인디케이터로 사용하였다. ▲: nBT062-SPP-DM1, ■: nBT062-SPDB-DM4; ◆: 비히클 대조군.
도 13은 시험관에서의 nBT062-SPDB-DM4 매개 무고체(bystander)의 사멸을 나타낸 것이다. CD138 양성 OPM2 세포 및 CD138 음성 Namawla 세포를 여러가지 농도의 nBT062-SPDB-DM4와 함께 인큐베이션하였고, 세포 생활성을 측정하였다. OD450 값은 세포 생활성 측정치이다.
도 14는 (A) 여러가지 MM 세포에 의해 발현되는 CD138 발현 및 (B) DOX40 세포(상단 패널) 및 OPM1 세포(하단 패널)의 현미경 분석 결과를 나타낸 것이다. CD138 발현은 우측에, 핵산은 좌측에 나타낸다.
도 15(A)는 40, 80 및 120분 후 MM 세포에 대한 nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1의 세포 독성을 나타낸 것이다. 도 15(B)는 2일간 nBT062-SPDB-DM4를 처리한 후 3명의 다른 환자들에서 분리한 MM 세포의 세포 생활력을 나타낸다. 도 15(C)는 세포 생활성을 측정하기 전에 72 시간 동안 nBT062-SPDB-DM4와 함께 배양한 3명의 건강한 개체로부터 유래한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다.
도 16(A)는 OPM1 세포에 면역접합체를 0, 12 또는 24시간 처리하고, PI 염색에 의해 세포 사이클 프로파일을 분석한, 세포 사이클 분석 결과이다. 도 16(B)에서, 24, 48 또는 72시간 동안 면역접합체의 존재 또는 부재하에 OPM1 세포를 배양하였다. 세포자살 세포율은 Apo 2.7 항체 염색 및 유세포 측정 분석에 의해 분석하였다. 도 16(C)에서, OPM1 세포를 기재된 시간(좌측 패널) 동안 885 ㎍/ml nBT062-SPDB-DM4 존재 중에, 또는 여러가지 농도의 면역접합체(중간 패널)와 함께 배양하였다. pan-카스파제 저해제 zVAD-fmk는 OPM1 세포에 대한nBT062-SPDB-DM4 유발성 카스파제 -8,-9, 및 -3, 및 폴리(ADP-리보스)중합효소(PARP) 절단을 차단하였다(우측 패널).
도 17은 (A) - (C)에서 면역접합체에 대한 MM 세포의 증식 및 민감성에 대한 IL-6, IGF-1 및 BMSC 효과를 나타낸다. 도 17(D)는 면역접합체 대신 덱사메타손을 이용한 실험의 결과를 나타낸다. 도 17(E)는 면역접합체의 존재 또는 부재하에, 종양 세포 및 BMSC의 공동-배양한 세포 유착 실험 결과를 나타낸다.
도 18(A)는 OPM1GFP 세포에 의한 GFP 발현 분석 결과이다. 도 18(B)는 5x106 OPM1GFP 세포를 주입한 SCID 군에서의 종양 크기에 대한 nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 또는 완충액 대조군의 효과를 나타낸 것이다. 도 18(C)는 비히클 단독(실선; 정상 염수, n=5) 처리한 대조군 대비, nBT062-SPDB-DM4가 현저하게 생존율을 증가시킴(P　<0.0023, 점선, n=5)을 나타낸다. 도 18(D)는 nBT062-SPDB-DM4가 생체내에서 세포자살을 유도함을 나타낸다.
본 발명은 CD138 표적 물질을 포함하는 면역접합체, 상기 면역접합체의 작용자(들) 분자의 표적 부위로의 전달, 및 표적 세포, 조직 및 장기의, 내부, 외부, 또는 그 근처에서의 작용자(들) 분자의 부위 특이적인 분비에 관한 것이다. 상기 작용자 분자는 표적 부위에서 면역접합체의 표적 물질 부분으로부터의 절단/해리에 의해 활성화될 수 있다. 본 발명은 생체내에서 종양 증식에 대항하기 위한 이들 면역접합체의 용도 및 골수 미세환경에서 직면하는 방어 메카니즘을 극복 또는 감소시키기 위한 이들 면역접합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 면역접합체는, 치료학적 치료가 필요한 개체에 또는 치료학적 처리가 필요한 개체로부터 분리된 세포에 투여될 수 있다. 작용자 분자 또는 분자들은, 표적 세포, 조직 또는 장기의, 내부, 외부, 또는 그 근처에서의 절단/해리에 의해 면역접합체로부터 분리될 수 있다.
일 예에서, 면역접합체는, CD138 발현 세포를 표적으로 하는 항체 nBT062, 및 암 환자에게 투여되는 작용자 분자로서 1종 이상의 세포독성 약물이나 독소를 포함한다. 이러한 예로, 면역접합체의 치료학적 유효량은 환자에게 정맥내 투여되며, 암 세포에 모인다. 그런 후, 작용자 분자 또는 분자들이 자연적인 방법에 의해 항체로부터 분리된다. 절단된 후 또는 절단되는 중에, 작용자 분자는 알킬화에 의해 안정화될 수 있으며, CD138을 발현하지 않는 기질 세포 등의 주변 부속 세포에 확산될 수 있다.
두번째 예에서, 면역접합체는, CD138 발현 세포를 표적으로 하는 항체 nBT062와, 1종 이상의 작용자 분자로서의 세포독성 약물 또는 독소를 포함하며, 추가적인 세포독성 물질은 암 환자에게 투여된다. 이러한 예로, 치료학적 유효량의 면역접합체 및 세포독성 물질은 연속적으로 투여된다. 먼저, 면역접합체를 환자에게 정맥내 투여하여, 골수 미세환경의 암 세포에 모이게 한다. 상기 면역접합체는 실질적으로 세포 유착 매개 약물 내성(CAM-DR)을 무력화시키고 골수 미세환경에서 CD138을 발현하는 종양 세포의 상당 부분을 파괴한다. 특히, 작용자 분자(들)이 자연적인 방법에 의해 항체로부터 분비되어 종양 세포를 파괴한다. 면역접합체는 적어도 부분적으로 기질 세포에 대한 종양 세포의 유착을 방해하며, 일부는 작용자 분자의 확산에 의해 파괴될 수 있다. 12시간 후에, 세포독성 물질을 투여한다. 활성이 어느 정도 이상 CAM-DR에 의해 정상적으로 감소되는 세포독성 물질은, 기질 세포와 연관되어 있지 않은 종양 세포에 작용하여, 면역접합체의 작용에서 벗어났던 CD138 발현 종양 세포를 파괴할 수 있다.
CD138 또는 신데칸(syndecan)-1(또한, SYND1; SYNDECAN; SDC; SCD1; CD138 항원이라 함, SwissProt accession number: P18827 인간)은 처음에는 상피 기원의 세포상에 존재하는 것으로 기술되었으나 나중에 조혈 세포에서 발견된, 막의 당단백질이다(Sanderson, 1989). CD138은 가용성 분자(예, 성장 인자들 EGF, FGF, HGF) 및 불용성 분자들(예, 세포외 매트릭스 성분들, 콜라겐 및 파이브로넥틴)에 헤파란 설페이트 체인을 통해 결합하는 긴 세포외 도메인을 가지고 있으며(Langford, 1998; Yang, 2007), 세포외 매트릭스에 대한 수용체로서 작용한다. 또한, CD138은 부착 세포에 의해 발현되는 헤파린-결합 분자를 통해 세포-세포 유착을 매개한다. CCD138은 골수종 세포의 성장 인자들에 대한 공동-수용체로서 작용하는 것으로 밝혀졌다(Bisping, 2006). 혈장 세포 분화에 대한 연구를 통해, CD138을 분화 항원으로서 간주할 수 있는 것으로 확인되었다(Bataille, 2006).
악성 조혈에서, CD138은 MM 세포, 난소암, 신장 종양, 담낭암, 유방암, 전립선암, 폐암, 대장암, 호지킨 및 비호지킨 림프종의 세포, 만성 림프성 백혈병(CLL)(Horvathova, 1995), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수모구성 백혈병(AML)(Seftalioglu, 2003 (a); Seftalioglu, 2003 (b)), 고형 조직 육종, 대장암 뿐만 아니라 그외 조혈 악성 종양 및 CD138을 발현하는 고형암의 대부분에서 고도로 발현된다(Carbone et al., 1999; Sebestyen et al.,1999; Han et al., 2004; Charnaux et al., 2004; O'Connell et al.,2004; Orosz and Kopper, 2001).
CD138 발현이 양성인 것으로 확인된 기타 암으로는, 다수의, 난소 선암종, 방광 이행성 세포 암종, 신장 투명 세포 암종, 편평 세포 폐 암종; 유방 암종 및 자궁암들이 있다(예, Davies et al., 2004; Barbareschi et al., 2003; Mennerich et al., 2004; Anttonen et al., 2001; Wijdenes, 2002).
정상적인 인간 조혈 구성에서, CD138 발현은 혈장 세포로 국한되며(Wijdenes, 1996; Chilosi, 1999), CD138은 말초 혈액 림프구, 단핵구, 과립구 및 적혈구 세포에서는 발현되지 않는다. 특히, CD34+ 줄기 세포와 전구 세포는 CD138을 발현하지 않으며, 항-CD138 mAb는 조혈 줄기 세포 배양물에서 다수의 콜로니 형성 유닛에 작용하지 않는다(Wijdenes, 1996). 비-조혈계의 경우, CD138은 폐, 간, 피부, 신장 및 장 내부의 단일 층화된 상피에서 주로 발현된다. 내피 세포에서는 약한 염색만 관찰되었다(Bernfield, 1992; Vooijs, 1996). CD138은 인간 림프종 세포에서 다형체 형태(polymorphic form)로 존재하는 것으로 보고되었다(Gattei, 1999).
단일클론 항체 B-B4, BC/B-B4, B-B2, DL-101, 1 D4, MI15, 1.BB.210, 2Q1484, 5F7, 104-9, 281-2, 특히 B-B4는 CD138에 특이적으로 것으로 보고되었다. B-B4 중에서, 1D4 및 MI15는 CD138의 무손상 분자(intact molecule)와 코어 단백질 둘다를 인지하며, 동일하거나 매우 비슷한 에피토프 중 어느 하나를 인지하는 것으로 확인되었다(Gattei, 1999). 이전의 연구를 통해, B-B4가 수용성 CD138을 인지하지 않고 단지 막 결합형의 CD138만 결합하는 것으로 보고되었다(Wijdenes, 2002).
B-B4는 뮤라인의 IgG1 mAb로서, 인간 신데칸-1(CD138) 상의 코어 단백질 90-95개의 잔기로 구성된 선형 에피토프에 결합한다(Wijdenes, 1996; Dore, 1998). B-B4는, CD138의 발현 패턴과 일치되게, 혈장 세포주 RPMI8226에서 강하게 반응하지만, 내피 세포와는 반응하지 않는 것으로 확인되었다. 또한, CD138의 발현 패턴과 일치되게, B-B4는 상피 세포주 A431(각질세포로부터 유래) 및 HepG2(간세포 유래)와도 반응한다. 면역독소 B-B4-사포린은 또한 혈장 세포주 RPMI8226에 강한 독성을 나타내며, 실제 유리형 사포린 보다 독성이 훨씬 더 강하다. 그러나, B-B4-사포린은 집락형성 분석법(clonogenic assay)에서 A431 세포의 생장을 저해하는 효과가 없는 것으로 나타났지만, 테스트한 2종의 상피 세포주에서, B-B4-사포린은 세포주 A431에만 독성을 나타내었다(Vooijs, 1996). 다른 연구자들도 종양에 대한 MM-관련 항원의 특이성 결핍을 보고하였다(Couturier, 1999).
특정 성분들로 "필수적으로 구성된" 항체/면역접합체는, 본원에서, 항체/면역접합체가 명시된 성분과 항체의 기본적인 특성에 현저한 영향을 미치지 않는 추가적인 물질 또는 성분들로 이루어져 있음을 의미한다.
본 발명에서, 용어 "종양 세포"는 암 세포 뿐만 아니라 고형 종양의 일부를 형성하거나 형성하지 않을 수 있는 전-암성 세포를 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에 따른 "표적 물질"은 표적 세포에 의해 발현되는 분자와 조합할 수 있으며, 펩타이드 및 비-펩타이드를 포함한다. 특히, 본 발명에 따른 표적 물질은 표적 항체 및 비-면역글로불린 단백질을 기본으로 할 수 있는 비-면역글로불린 표적 분자를 포함하며, 그 예로는, AFFILIN® 분자, ANTICALINS® 및 AFFIBODIES®가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 비-면역글로불린 표적 분자는 또한 표적 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드(앱타머)와 같은 비-펩타이드성 표적 분자, 또한 생리학적 리간드, 특히 대상 항원의 리간드, 예컨대 CD138을 포함한다.
본 발명에 따른 "표적 항체"는 천연 항체이거나 천연 항체를 기초로 하거나, 또는 합성에 의해 또는 유전자 조작에 의해 제조되며, 대상 세포 또는 세포들(표적 세포(들)) 상에서 항원에 결합한다. 본 발명에 따른 표적 항체로는, 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적인 항체(예, 2 특이성 항체) 또는 항체 단편을 포함한다. 상기 표적 항체는, 예컨대 표적 세포에 대한 이의 친화성을 개선시키거나(Ross, 2003) 또는 이의 면역원성을 감소시키도록 조작할 수 있다. 표적 항체는 작용자 분자 등의 리포좀 제형에 부착될 수 있다(Carter, 2003). 항체 단편은 무손상 항체의 일부분, 바람직하게는 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변성 영역을 포함한다. 본 발명에 따른 항체 단편의 예로는, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편이 있으며, 또한, 2가 항체(diabody); 도메인 항체(dAb) (Ward, 1989; 미국 특허 6,005,079); 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적인 항체가 있다. 단쇄 가변 단편 항체(scFv)에서, 중쇄 및 경쇄(VH 및 VL)는, 예컨대 2개의 도메인이 기능성 항원 결합 포켓을 조합하는데 충분한 유연성을 지닌 서열 (글리신4세린)n의, 짧은 아미노산 링커에 의해 연결될 수 있다. 다양한 신호 서열의 부가는 표적 항체의 더욱 정확한 표적화를 가능하게 할 수 있다. 경쇄 불변 영역(Cl)의 부가는 이황화 결합을 통한 이량화를 가능하게 하여, 안정성 및 항원항체 결합력(avidity)을 증가시킬 수 있다. scFv를 구축하기 위한 가변 영역은, 표적 대상에 대한 mAb를 이용가능하다면, 모 하이브리도마로부터 추출한 mRNA로부터 가변 영역을 클로닝하는 RT-PCR에 의해 수득할 수 있다. 또는, scFv는 파지 디스플레이 기법에 의해 새롭게 제조할 수 있다(Smith, 2001). 본원에서, 용어 "기능적 단편"은 표적 항체 언급에 사용될 때, 언급한 항체에 의해 특이적으로 결합되는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 표적 항체의 일부분을 의미한다. 본 발명에 따른 2중 특이적인 항체는, 예컨대 표적 조직에 대해 반응성인 하나 이상의 팔(arm)과 링커 모이어티에 반응하는 팔을 가질 수 있다(미국 특허 공개번호 20020006379). 또한, 본 발명에 따른 2중 특이적인 항체는 표적 세포 상에서 2개 이상의 항원에 결합할 수 있다(Carter, 2003). 본 발명에 따른 항체는, 예컨대 티올 기를 도입하기 위한 시스테인 잔기 도입에 의해 변형시킬 수 있다(Olafsen, 2004).
본 발명에서, 표적 항체는 임의의 소스로부터 유래될 수 있으며, 낙타 항체, 뮤라인 항체, 인간/마우스 키메라 항체 또는 인간/원숭이 키메라 항체, 특히 nBT062와 같은 인간/마우스 키메라 항체일 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
인간화 항체는 인간-항체와 비-인간 항체로부터 유래된 서열을 포함하는 항체이며, 또는 이는 본 발명의 범위내에 포함된다. 항체를 인간화하는 적합한 방법으로는 CDR-그래프팅(상보성 결정 영역 그래프팅)(EP 0 239 400; WO 91/09967; 미국 특허 5,530,101; 및 5,585,089), 베니어링(veneering) 또는 재표면화(resurfacing)(EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan, 199; Studnicka et al., 1994; Roguska et al., 1994), 체인 셔플링(chain shuffling)(미국 특허 5,565,332) 및 DeImmunosationTM(Biovation, LTD)이 있다. CDR-그래프팅에서, 예컨대 mAb B-B4로부터 마우스 상보성 결정 영역(CDR)을 인간 가변 프래임워크에 그래프팅한 다음, 인간 불변 영역과 연결하여, 인간 B-B4 항체(hB-B4)를 제조한다. CDR-그래프팅에 의해 인간화된 몇가지 항체들이 현재 임상적으로 사용되고 있으며, 그 예로는 MYLOTARG (Sievers et al., 2001) 및 HECEPTIN (Pegram et al, 1998)이 있다.
재표면화 기법은 분자 모델링, 통계적 분석 및 돌연변이 유발을 조합 사용하여, 표적 숙주의 공지 항체들의 표면과 비슷하도록 항체 가변 영역의 비-CDR 표면을 변형시킨다. 항체 재표면화 전략 및 방법들과, 그외 여러가지 숙주에서의 항체 면역원성을 낮추기 위한 방법들이, 예컨대 미국 특허 5,639,641에 기술되어 있다. 인간 항체는, 파지 디스플레이 방법 등의 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법들로 제조할 수 있다. 또한, 미국 특허 4,444,887, 4,716,111, 5,545,806, 및 5,814,318; 국제 특허 출원 공개번호 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741을 참조한다.
인간/마우스 키메라 항체 또는 인간/원숭이 키메라 항체, 인간화 항체 또는 예컨대 표적 세포에 대한 친화성을 개선시키거나 또는 면역원성을 낮추도록 조작된 항체, 또는 항체 단편, 특히, 임의의 비-자연적 변형을 겪은 표적 항체의 기능적 단편, 2가 항체; 도메인 항체; 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 및 다중 특이적인 항체와 같이 임의의 비-자연적인 변형을 이룬 표적 항체는, 본원에서 조작 된 표적 항체로 언급된다.
키메라 항체는 기본인 비-인간 항체, 예컨대 뮤라인 항체의 항체 결합 영역(ABR 또는 Fab 영역)을 유지하지만, 임의의 불변 영역은 예컨대 인간 항체에 의해 제공될 수 있다. 통상적으로, 항체의 인간화 및/또는 불변 영역의 교체는, 항원 결합에 기여하는 항체의 영역이 이러한 교체에 의해 영향을 받지 않기 때문에, 항체의 친화성에 영향이 없을 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조작된, 특히 인간화된 항체는 기본이 되는 해당 비-인간 항체 보다 결합 친화성(KD 값으로 표시됨)이 더 높을 것이다. 특히, nBT062 항체 및 이를 기반으로 한 항체들은 뮤라인 B-B4 보다 항체 친화성이 더 높을 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 이러한 조작된/인간화 항체를 포함하는 면역접합체는 또한 항체 결합성이 더 높다. 또한, 이들 면역접합체는 임의의 구현예에서, B-B4 함유성 대응체 보다 더 높은 종양 크기 감소율 등의 다른 유리한 특징을 나타낼 수 있다. 바람직한 구현예에서, 조작된, 특히 인간화 표적 항체는 해리 상수 KD (nM)가 < 1.6, < 1.5, 또는 ≤1.4인 결합 친화성을 나타내지만, 이의 뮤라인 대응체의 해리 상수 KD (nM)는 ≥1.6이다. 표적 항체와 같은 표적 물질을 포함하는 면역접합체는 해리 상수 KD (nM)가 < 2.6, < 2.5, < 2.4, < 2.3, < 2.2, < 2.1, < 2.0일 수 있으며, ≤ 1.9이 바람직하지만, 뮤라인 대응체 항체를 포함하는 면역접합체의 해리 상수 KD (nM)는 ≥2.6 (표 3, 재료 및 방법)이다.
완전한 인간 항체(fully human antibody)도 사용할 수 있다. 이러한 항체는 파지 디스플레이 방법에 의해 선택할 수 있는데, 이때 CD138 또는 이의 항원 결정기를 사용하여 예컨대 B-B4 가변 영역을 발현하는 파지에 선택적으로 결합한다(Krebs, 2001). 이러한 방법은 유익하게는 친화성 성숙 기법과 함께 사용하여, 항체의 친화성을 향상시킨다. 본원에 언급된 모든 항체는 분리된 항체이다.
일 구현예에서, 표적 항체는 미접합 형태에서 중등도 또는 불량 수준으로 내재화된다. 중등도의 내재화는 37℃에서 3시간 인큐베이션한 후, 항체 약 30% 내지 약 75%가 내재화된 것이고, 불량한 내재화는 항체의 약 0.01% 내지 최대 약 30%가 내재화된 것이다. 바람직한 구현예에서, 표적 항체는 CD138에, 예컨대 항체들 B-B4, BC/B-B4, B-B2, DL-101, 1 D4, MI15, 1.BB.210, 2Q1484, 5F7, 104-9, 281-2, 특히 B-B4 결합한다. SP02/0 골수종 세포를 Balb/c 마우스 비장 세포와 교잡하여 제조한, 하이브리도마 세포를 2007년 12월 11일에 D-38124 브라운슈바이크 마셰로데르 베그에 소재한 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁하였다. 이러한 B-B4 발현 하이브리도마 세포의 식별 번호는 DSM ACC2874이다. 다른 구현예에서, 표적 항체는 실질적으로 비-세포-표면 발현된 CD138에는 결합하지 않는다. 본 발명에서, 특정 항체의 명칭이 "nBT062 표적 항체"와 같이 용어 "표적 항체"와 조합되어 있으면, 이 표적 항체가 항체 nBT062의 결합 특이성을 가지고 있음을 의미한다. 만일 표적 항체가 명기한 항체에 "기본이 되는" 것으로 지칭되어 있다면, 이 표적 항체는 상기 항체의 결합 특이성을 가지지만, 표적 항체에 대한 전술한 내용에 부합되는 어떠한 형태도 취할 수 있음을 의미한다. 본 발명의 내용에서, 특정 항원의 명칭이 " CD138 표적 항체"와 같이 용어 "표적 항체"와 조합되어 있다면, 표적 항체가 CD138에 대한 결합 특이성이 있다는 것을 의미한다. 본 발명의 내용에서, 예컨대 표적 항체를 "세포-표면 발현된 CD138을 선택적으로 표적화하는"과 같이 무언가를 "선택적으로" 하거나, 또는 무언가에 대해 "선택적인" 것으로 언급되어 있다면, 이는, 제시된 예의 경우에서, 세포-표면 발현된 CD138에 대해 임의의 다른 항원 대비 유의한 선택성(즉 CD138-음성 세포에 비해 CD138-양성 세포에 대해 더 강한 친화성)이 있음을 의미한다. 해당 조건에서의 부작용은 이의 선택성으로 인해 실질적으로 줄이거나 또는 회피한다.
"비-면역글로불린 표적 물질"은 본 발명에서 비-면역글로불린 단백질로부터 유래된 표적 분자 뿐만 아니라 비-펩타이드성 표적 분자를 포함한다. 이러한 정의에 포함되는 소형 비-면역글로불린 단백질을, 특히 표면에서 발현되는 CD138에 대해 특이적인 친화성을 가지도록 제작한다. 이러한 소형 비-면역글로불린 단백질은 10 kDa - 20 kDa과 같이 비교적 저분자량의 Affilin® 분자 등의 스캐폴드 기반의 조작된 분자를 포함한다. 적합한 스캐폴드로는, 예컨대 감마 결정을 포함한다. 이들 분자는, 천연 상태에서는, 표적 분자에 대한 특이적인 결합 활성이 없다. 용매 노출된 아미노산의 국소적으로 한정된 랜덤화를 통한 단백질 표면의 조작에 의해, 완전히 새로운 결합 부위가 만들어진다. 전자의 비-결합성 단백질은 이로써 특이적인 결합 단백질로 변형된다. 이러한 분자는 CD138과 같은 표적에 결합하도록 특이적으로 제작할 수 있으며, 하나 이상의 작용자 분자의 특이적인 전달을 가능하게 할 수 있다(scil Proteins GmbH at www.scilproteins.com, 2004). 비-면역글로불린 표적 분자에 대한 다른 종류는리포칼린으로부터 유래되며, 그 예로, 구조적으로 면역글로불린과 다소 비슷한ANTICALINS®가 있다. 그러나, 리포칼린은 160 - 180개의 아미노산 잔기를 가진 폴리펩타이드 단쇄로 구성되어 있다. 리포칼린의 결합 포켓은 형태를 바꿔, 대상 분자를 고친화적이고 고특이적으로 인지할 수 있다(예, Beste et al., 1999). 상표 Affibody®(Affibody AB)로 시판되는 것과 같은 인공 박테리아 수용체도 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 인공 박테리아 수용체 분자는 작고 단순한 단백질이며, 단백질 A(스타필로코커스 아우레우스)의 IgG-결합 도메인들 중 하나의 스캐폴드를 기반으로 한 3중-나선 번들로 구성될 수 있다. 이러한 분자들은 다수의 면역글로불린과 비슷한 결합 특성을 가지고 있지만, 실질적으로 더 작고, 분자량은 대게 10 kDa을 초과하지 않으며, 또한, 비교적 안정적이다. 적합한 인공 박테리아 수용체 분자는, 예컨대 미국 특허 5,831,012; 6,534,628 및 6,740,734에 기술되어 있다.
기타 "비-면역글로불린 표적 분자"는 대상 항원의 생리 리간드이다. CD138의 생리 리간드로는, 예컨대 ADAMTS4(어그레카나제-1), 항트롬빈-3, bFGF, 카텝신 G, CCL5 (RANTES), CCL7, CCL11, CCL17, CD44, 콜라겐(1형 콜라겐, 2형 콜라겐, 3형 콜라겐, 4형 콜라겐, 5형 콜라겐, 6형 콜라겐), CXCL1, 엘라스타제, gp120 , HGF [간세포 성장 인자], 라미닌-1, 라미닌-2, 라미닌-5, 미드카인(midkine), MMP-7, 호중구 엘라스타제(neutrophil elastase) 및 플레이오트로핀(pleiotrophin)(HBNF, HBGF-8)이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 비-펩타이드성 표적 분자로는, CD-138에 결합하는 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드(앱타머)가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
"작용자 분자"는 본 발명에서 표적 물질, 특히 표적 항체 및/또는 조작된 표적 항체에 부착되어 있으며, 바람직한 효과, 예컨대 세포자살 또는 다른 타입의 세포 사멸 또는 표적 세포나 세포들의 연속적인 세포 주기 정지를 발휘하는, 분자 또는 이의 유사체 또는 유도체이다. 본 발명에 따른 작용자 분자는 표적 세포에서 원하는 효과를 발휘할 수 있는 분자를 포함하며, 독소, 약물, 특히 저분자량의 세포독성 약물, 방사핵종, 생물 반응 변형제, 구멍-형성제, 리보뉴클레아제, 세포자살-유발 활성의 세포자살 시그널링 케스케이드의 단백질, 세포독성 효소, 프로드럭 활성화 효소, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항체 또는 사이토카인 뿐만 아니라 그것의 기능적 유도체 또는 유사체/단편을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 독소는 비제한적으로 디프테리아 독소 또는 외독소 A와 같은 박테리아 독소, 비제한적으로 리신과 같은 식물 독소를 포함할 수 있다. 세포자살-유발 활성의 세포자살 시그널링 케스케이드의 단백질로는, 그란자임(Granzyme) B, 그란자임 A, 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9, 절단형(truncated) Bid (tBid), Bax 및 Bak가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
바람직한 구현예에서, 작용자는, 특히 면역접합체의 표적 항체의 기본이 되는 항체의 천연 형태가 내재화성이 불량할 때, 면역접합체의 내부 작용자 전달을 증가시킨다. 다른 바람직한 구현예에서, 작용자는 천연 형태에서는 비-선택적이다. 특정 구현예에서, 작용자는 천연 형태로 있을 때 전신 독성 등의 높은 비-선택적인 독성을 가진다. 본 발명의 작용자 분자의 "천연 형태"는 표적 물질에 부착되어 면역접합체를 형성하기 전의 작용자 분자이다. 다른 바람직한 구현예에서, 작용자 분자의 비-선택적인 독성은 표적 물질에 접합시 실질적으로 없어진다. 다른 바람직한 구현예에서, 작용자 분자는 표적 세포에 도달하였을 때 표적 세포에 사멸 또는 계속적인 세포 주기 정지를 야기한다. 본 발명에 따른 약물-작용자 분자는, 예컨대 마이탄시노이드(maytansinoid), 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴(auristatin) 및 크리토피신(crytophycin)과 같이 튜불린 중합 저해제로서 작용하는, 소형의 세포독성이 높은 약물; DNA 알킬화제, 예컨대 CC-1065 유사체 또는 유도체(미국 특허 5,475,092; 5,585,499; 6,716,821) 및 두오카르마이신(duocarmycin); 에네디인(enediyne) 항생제, 예컨대 칼리케아미신(calicheamicin) 및 에스페라미신(esperamicin); 및 강력한 톡소이드(탁센) 약물(Payne, 2003)을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 마이탄시노이드 및 칼리케아미신이 특히 바람직하다. 작용자 마이탄시노이드는 임의 기원의 마이탄시노이드를 포함하며, 그 예로는 합성 마이탄시노이드, 마이탄시노이드의 유사체 및 유도체가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 독소루비신(Doxorubicin), 다우노마이신(daunomycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 빈블라스틴(vinblastine), 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin), 마크로마이신(macromycin), 트레니몬(trenimon) 및 알파-아마니틴(α-amanitin)은 본 발명의 범위에 포함되는 일부 다른 작용자 분자들이다. 또한, 본 발명은 작용자 분자로서 안티센스 DNA 분자를 포함한다. 예컨대 특이적인 약물의 명치 또는 약물 클래스가 "작용자" 또는 "작용자 분자"라는 용어와 본원에서 함께 사용되는 경우, 명시된 약물 또는 약물 클래스를 기초로한 본 발명에 따른 면역접합체의 작용자를 의미한다.
마이탄신은 에티오피아의 관목 마이테누스 세라타로부터 최초로 유래된 천연 산물이다(Remillard, 1975; 미국 특허 3,896,111). 이 약물은 튜불린 중합을 저해하여, 세포 유사 분열 차단 및 세포 사멸을 발생시킨다(Remillard, 1975; Bhattacharyya, 1977; Kupchan, 1978). 마이탄신의 세포독성은 빈카 알카로이드 또는 탁솔과 같이 튜불린 중합에 작용하는 임상 사용중인 항암제 보다 200-1000배 높다. 그러나, 마이탄신에 대한 임상 연구에서, 이의 높은 전신 독성으로 인해 적정 약물 농도(therapeutic window)가 없는 것으로 나타났다. 마이탄신 및 마이탄시노이드는 세포독성이 높지만, 이의 암 요법에서의 임상적인 사용은 대게 종양에 대한 불량한 선택성이 그 이유인 심각한 전신 부작용으로 인해 매우 제한되고 있다. 마이탄신을 이용한 임상 연구에서, 중추 신경계와 위장계에 심각한 부작용이 있는 것으로 나타났다.
또한, 마이탄시노이드는 트레비아 누디플로라(Trewia nudiflora)의 종자 조직 등의 다른 식물들에서 분리되었다(미국 특허 4,418,064).
또한, 어떤 미생물은 마이탄시놀 및 C-3 마이탄시놀 에스테르 등의 마이탄시노이드를 생산한다(미국 특허 4,151,042).
본 발명은 예컨대 미국 특허 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,371,533; 4,424,219 및 4,151,042에 개시된, 합성 마이탄시놀 및 마이탄시놀 유사체 등의, 임의 기원의 마이탄시노이드와 관련있다.
바람직한 구현예에서, 마이탄시노이드는 티올-함유성 마이탄시노이드이고, 더 바람직하게는 Chari 등 또는 Chari 등(Chari, 1992)의 미국 특허 6,333,410에 기술된 방법에 따라 제조된다.
DM-1(N2-데아세틸-N2-(3-머캅토-1-옥소프로필)-마이탄신)은 본 발명에서 바람직한 작용자 분자이다. DM1은 마이탄신 보다 세포 독성이 3 내지 10배 높으며, 이황화 결합(들)을 통해 종양-관련 항원에 대한 단일클론 항체에 연결함으로써 프로드럭으로 변환되었다. 이러한 접합체들(때로는 "종양 활성화된 프로드럭"(TAP)) 중 일부는 표적 세포와 조합되어 내재화되면 활성화되어 약물로부터 분리되기 때문에, 혈액 성분에 세포 독성을 나타내지 않는다(Blattler, 2001). 수종의 항체-DM1 접합체들이 개발되었으며(Payne, 2003), 임상 실험을 거쳤다. 예컨대, 결장직장암 환자는 huC242-DM1 치료를 잘 받아들였지만, 어떠한 검출가능한 면역 반응을 유도하지 못하였으며, 순환 기간이 길었다(Tolcher, 2003).
그외 특히 바람직한 마이탄시노이드는 입체 방해의 티올 결합을 함유하는 측쇄를 포함하며, 그 예로는 "DM3"라고도 하는 마이탄시노이드 N2'-데아세틸-N2'-(4-머캅토-1-옥소페닐)마이탄신, 및 "DM4"라고도 하는 N2'-데아세틸-N2'-(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)마이탄신이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. DM4의 합성은 도 3 및 4에 나타나 있으며, 본원 도처에 기술되어 있다. DM4는 이의 αC에 메틸기를 가지고 있다는 점에서 DM1 및 DM3와 상이하다. 이는, DM4가 링커, 특히 이황화 결합을 포함하는 링커를 통해 nBT062와 같은 표적 물질에 부착되었을 때, 입체 방해를 형성한다. 입체적으로 방해가 되는 티올기를 가지고 있는 매우 다양한 마이탄시노이드들(1 또는 2개의 치환기, 특히 알킬 치환기, 예컨대 DM4의 메틸 치환기를 소유)이 2004년 11월 25일자로 공개된 미국 특허 공개번호 2004/0235840에 기술되어 있으며, 이 특허는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다. DM3 및 DM4의 황 원자에 인접한 탄소 상의 메틸 기와 같은 알킬기에 의해 부여되는 입체 방해는 면역접합체의 세포내 절단율에 영향을 미칠 수 있다. 가변성 알킬 유닛은 따라서 시험관내 및 생체내에서 유효성, 효능 및 안전성/독성에 영향을 미칠 수 있다.
Goldmahker 등의 미국 특허 공개번호 06/0233814에 보고된 바에 따르면, 약물이 그 표적에서 분리되면, 입체 방해가 유리형 약물의 알킬화(예, 메틸화)를 유도한다. 알킬화는 약물의 안정성을 증가시켜, 이른바 방관자 효과(bystander effect)를 허용할 수 있다. 그러나, 당해 기술 분야의 당업자에게 명확한 바와 같이, 링커를 통해 표적 물질에 작용자가 부착되었을 때 입체 방해를 형성하는 위치에 알킬기와 같은 치환을 포함하는 다른 작용자 분자들도 본 발명의 일부이다(미국 특허 공개 2004/0235840). 바람직하게는, 이러한 방해는 유리형 약물의 알킬화와 같은 화학적 변형을 유도하여 전체 안전성을 증가시킴으로써, 약물이 CD138 발현 종양 세포에 대해 세포 사멸 또는 계속적인 세포 주기 정지를 유도하게 할 뿐만 아니라, 선택적으로 예컨대 종양을 지탱 또는 보호하는 부속 세포, 특히 종양 기질 세포 및 통상적으로 CD138을 발현하지 않는 종양 혈관계의 세포가 약물로부터 영향을 받아 이의 지지 기능 또는 보호 기능이 감소되거나 소실되게 한다.
또한, 작용자 분자로서 DNA 알킬화제가 특히 바람직하며, CC-1065 유사체 또는 유도체가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. CC-1065는 스트렙토마이세스 젤렌시스(Streptomyces zelensis)의 배양물로부터 분리된 강력한 항종양-항생제이며, 시험관내에서 예외적으로 세포독성인 것으로 확인되었다(미국 특허 4,169,888). 미국 특허 5,475,092, 5,585,499 및 5,739,350에 기술된 예컨대 CC-1065 유사체 또는 유도체는, 본 발명의 범위에 포함된다. 당해 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 미국 특허 5,846,545에 따른 변형된 CC-1065 유사체 또는 유도체 및 예컨대 미국 특허 6,756,397에 기술된 CC-1065 유사체 또는 유도체의 프로드럭도 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 특정 구현예에서, CC-1065 유사체 또는 유도체는 예컨대 미국 특허 6,534,660에 기술된 바와 같이 합성할 수 있다.
바람직한 작용자 분자를 제조하는 화합물의 다른 기로는, 특히 매우 강력하며, 티올 또는 다이설파이드기를 함유하는 탁산이다. 탁산은 튜불린의 탈중합을 저해하여 마이크로튜블의 조합 및 세포 사멸 속도를 증가시키는, 유사 분열 방추체 독약이다. 본 발명의 범위에 포함되는 탁산은, 예컨대 미국 특허 6,436,931; 6,340,701; 6,706,708 및 미국 특허 공개번호 20040087649; 20040024049 및 20030004210에 기술되어 있다. 다른 탁산류들도, 예컨대 미국 특허 6,002,023, 미국 특허 5,998,656, 미국 특허 5,892,063, 미국 특허 5,763,477, 미국 특허 5,705,508, 미국 특허 5,703,247 및 미국 특허 5,367,086에 기술되어 있다. 당해 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 미국 특허 6,596,757에 기술된 바와 같인 페길화(PEGylated) 탁산도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에 따른 칼리케아미신 작용자 분자는 감마 1I, N-아세틸 칼리케아미신 및 칼리케아미신의 그외 유도체를 포함한다. 칼리케아미신은 서열-특이적인 방식으로 DNA의 마이너 그로브에 결합하며, 재정렬 과정을 거쳐 이중 가닥 DNA의 파괴를 유도하는 자유 라디칼을 노출시킴으로써, 세포 자살 및 세포 사멸을 발생시킨다. 본 발명에 사용될 수 있는 칼리케아미신 작용자 분자의 예는 미국 특허 5,053,394에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 면역접합체는 하나 이상의 표적 물질, 특히 표적 항체 및 하나의 작용자 분자를 포함한다. 상기 면역접합체는 예컨대 안정화를 위한 추가 분자를 포함할 수도 있다. 면역접합체에서, 용어 "접합"은 통상적으로 하나 이상의 작용자 분자와 표적 물질의 작동가능한 조립을 설명하는 것으로 사용되며, 어떠한 타입의 작동가능한 조립만을 지칭하는 의도는 아니며, 특히 화학적 "접합"으로만 한정되지 않는다. 표적 물질이 표적 부위에 결합할 수 있고 부착된 작용자가 의도한 대로 충분히 기능할 수 있는 한, 특히 표적 부위에 전달되는 한, 모든 부착 형태가 적합할 것이다. 본 발명에 따른 접합 방법으로는, 작용자 분자의 표적 항체에 작용자 분자 및/또는 표적 항체의 사전 변형없이 또는 사전 변형을 포함하는 직접 부착 또는 링커를 통한 부착이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 링커는 예컨대 산 불안정성(acid labile) 광분해성 링커, 효소 절단성 링커, 예컨대 펩티다제에 의해 절단할 수 있는 링커로 기능적으로 분류할 수 있다. 본 발명의 다수의 구현예에서, 절단성 링커가 바람직하다. 이러한 절단성 링커는 세포 환경, 특히 절단시 분리되는 약물에 유해한 효과가 없는 세포내 환경에 존재하는 조건 하에서 절단될 수 있다. 임의의 세포내 구역에서 존재하는 것과 같은 pH 4-5 등의 낮은 pH는 산 불안정성 링커를 절단할 것이지만, 광분해성 링커는 예컨대 적외선에 의해 절단될 것이다. 그러나, 대부분의 세포에 존재하는 생리학적 조건에 의해/조건 하에 절단되는 링커가 바람직하며, 본원에서는 생리 절단성 링커라고 언급힌다. 즉, 다이설파이드 링커가 본 발명의 다수의 구현예들에서 바람직하다. 이들 링커는 생리 조건 하에서 발생할 수 있는 다이설파이드 교환을 통해 절단가능하다. 바람직한 헤테로2중 기능의 다이설파이드 링커로는, N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP) (예, Carlsson et al.(1978)), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부타노에이트(SPDB) (예, 미국 특허 4,563,304), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트(SPP) (예, CAS Registry number 341498-08-6), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC) (예, Yoshitake et al., (1979)), 및 N-숙신이미딜 4-메틸-4-[2-(5-니트로-피리딜)-디티오]펜타노에이트(SMNP) (예, 미국 특허 4,563,304)가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물에 사용하기 가장 바람직한 링커 분자는 SPP, SMCC, 및 SPDB이다.
다른 적합한 링커로는, 비제한적으로, SH-함유성 화합물과 화합물을 연결할 수 있는 헤테로 2중 기능의 링커인, 설포숙신이미딜 말레이미도메틸 사이클로헥산 카르복실레이트(SMCC)와 같은 "절단불가능" 결합을 포함할 수도 있다.
2중 기능성 및 헤테로 2중 기능성 링커 분자, 예컨대, 카르보하이드레이트-직접 헤테로 2중 기능성 링커 분자, 예컨대 S-(2-티오피리딜)-L-시스테인 하이드라지드(TPCH) 역시 본 발명의 범위에 포함된다(Vogel, 2004). 마이탄시노이드와 같은 작용자 분자는 2 단계 반응 프로세스를 통해 표적 항체에 접합할 수 있으며, 제1 단계는, 표적 항체를 N-숙신이미딜 피리딜디티오프로피오네이트(SPDP)와 같은 가교 시약을 이용하여 표적 항체에 디티오피리딜 기를 도입하여 표적 항체를 변형하는 단계이다. 제2 단계에서는, 티올기를 가진 반응성 마이탄시노이드, 예컨대 DM1을 변형된 항체에 부가하여, 상기 변형된 항체에서 티오피리딜기를 치환시키고, 이황화-연결된 세포독성 마이탄시노이드/항체 접합체를 제조한다(미국 특허 5,208,020). 그러나, 미국 특허 공개번호 20030055226에 기술된 방법과 같은 한단계 접합 방법도 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 일 구현예에서, 동일하거나 상이한 종류의 다중 작용자 분자들을 표적 항체에 부착시키다. 본원의 도처에 기술된 바와 같이, 사용되는 링커의 특성은 방관자 사멸에 영향을 미칠 수 있다(Kovtun et al., 2006). 또한, 도 13의 내용을 참조한다.
미국 특허 6,716,821에 기술된 바와 같이, CC-1065 유사체 또는 유도체를, 예컨대 PEG 연결기를 통해 표적 물질에 접합시킬 수 있다.
칼리케아미신을 링커를 통해(미국 특허 5,877,296 및 미국 특허 5,773,001) 또는 미국 특허 5,712,374 및 미국 특허 5,714,586에 기술된 접합 방법에 따라 표적 항체에 접합시킬 수 있다. 미국 특허 공개번호 20040082764에 칼리케아미신 접합체를 제조하는 다른 바람직한 방법이 기술되어 있다. 본 발명의 면역접합체는 재조합 융합 단백질의 형태를 취할 수 있다.
용어 "세포독성 물질"은 "세포독성/암 약물"을 포함하며, 그 예로는 멜파란, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신 및 리포좀 독소루비신(DOXIL), 사이클로포스파미드, 에토포시드, 시타라빈 및 시스플라틴 등의 화학요법제, 프레디손 및 덱사메탄손 등의 코르티코스테로이드, 및 칼리도미드, 보르테조밉, 레날리도미드 등의 물질, 소라페닙 등의 키나제 저해제, 또는 로미뎁신 등의 HDAC(히스톤 데아세틸라제) 저해제, 뿐만 아니라 항-호르몬제, 항-혈관신생제, 심장보호제, 면역자극제, 면역억제제, 혈관신생 저해제, 단백질 타이로신 키나제(PTK) 저해제가 있다. 또한, 이러한 설명에, 당해 기술 분야에서 인지되는 세포 독성 효과를 가지는 면역접합체 및 항체 등의 항체 기반의 세포독성 물질도 포함된다. 항-CD40이 바람직한 항체이다. 그외 항체로는, 예컨대 AVASTIN (bevacizuab) 또는 MYELOMACIDE (milatuzumab)이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
탈로미드(α-(N-프탈리미도)글루타리미드; 탈리오미드)는 면역조절제이다. 탈리도미드의 실험식은 C13H10N2O4이며, 그람 분자량은 258.2이다. 탈리도미드의 CAS 번호는 50-35-1이다. 이 화합물은, 다양한 방식으로 골소종 세포의 증식 및 생존을 저해하는 능력 및 신생 혈관의 증식을 저해하는 능력 등의 복수의 작용을 가지는 것으로 보인다.
벨카드(Velcade)는 다발성 골수종 치료에 사용되는 프로테오좀 저해제이다. 벨카드는 골수종 세포에 세포 사멸을 야기하는 것으로 작용하거나 및/또는 골 미세환경에 작용함으로써 골수종 세포 증식 및 생존을 저해하도록 간접적으로 작용하는 것으로 생각된다. 특정 이론 또는 작용 모드로 제한하고자 하는 것은 아니며, 벨카드는 정상적인 세포 프로세스를 파괴하여, 세포자살을 촉진시키는 프로테오좀 저해를 형성시킨다.
레블리미드(Revlimid)는 면역조절제이다. 레블리미드는 골수종 세포에서 복수의 경로로 작용함으로써, 세포자살을 유도하고, 골수종 세포 증식을 저해하고, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 저해하여 혈관신생을 저해하며, 골수 기질 세포에 대한 골수종 세포의 유착을 저해하는 것으로 생각된다.
덱사메타손은 항염증 및 면역억제제로서 작용하는 합성 글루코코르티코이드 스테로이드 호르몬이다. 덱사메타손은, 암 환자에게 투여시, 암 요법의 부작용을 중화할 수 있다. 또한, 덱사메타손은 단독으로 또는 탈리도미드, 아드리아미신 또는 빈크리스틴 등의 다른 항암제와 함께 제공될 수 있다.
용어 "와 조합하여"는 정확히 동시 투여로 한정되지 않는다. 대신, 상기 용어는 본 발명의 면역접합체와 다른 요법(예, 방사능 요법) 또는 물질, 특히 상기에서 언급된 세포독성 물질의, 순차적인, 및 이들이 서로 작용하여 본 발명의 면역접합체나 예컨대 다른 물질 또는 물질들 중 한가지만 단독으로 사용하여 치료하였을 때와 비교하여 증가된 유익성을 제공할 수 있는 시간 간격으로 투여하는 것을 포함한다. 면역접합체 및 다른 물질이나 물질들은 부가적으로(additively) 작용하는 것이 바람직하며, 상승적으로 작용하는 것이 더 바람직하다. 이러한 분자는 의도한 목적에 유효한 양으로 적절하게 제공된다. 숙련된 의료 실무자들은 실험을 통해 또는 물질의 약물동력학 및 작용 방식을 고려함으로써, 각 치료 물질의 적정 용량 및 용량들과, 적합한 투약 시기 및 방법을 결정하 수 있다. 본원에서, "공동-투여"는 면역접합체와 동시에, 대개 조합된 투약 형태로의 투여를 의미한다.
용어 "서열 동일성"은 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 동일성 수치이다. 일반적으로, 서열을 순서 매치가 가장 많이 되도록 정렬한다. "동일성"은 자체적으로 당해 기술 분야에서 인정되는 의미를 가지며, 공개된 기법들을 이용하여 계산할 수 있다(예, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 서열들 간의 동일성을 측정하기 위한 다수의 방법들이 존재하지만, 용어 "동일성"은 당업자들에게 잘 알려져 있다(Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).
임의의 특정한 핵산 분자가, 예컨대 nBT062 핵산 서열 또는 이의 일부와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%로 동일한지는, 일차 서열 정렬을 위해 DNAsis 소프트웨어와 같은 공지의 컴퓨터 프로그램과, 다중 서열 정렬을 위한 ESEE 버전 3.0 DNA/단백질 서열 소프트웨어([email protected])에 의해 편리하게 측정할 수 있다(Hitachi Software, San Bruno, Calif.).
아미노산 서열이 예컨대 서열번호 1 또는 2나, 또는 이의 일부와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지는, BESTFIT 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)과 같은 공지의 컴퓨터 프로그램을 이용하여 편리하게 결정할 수 있다. BESTFIT는 Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)의 국소 상동성 알고리즘을 이용하여, 2개의 서열 간의 최상의 상동성 세그먼트를 찾는다.
DNAsis, ESEE, BESTFIT 또는 그외 기타 서열 정렬 프로그램을 이용하여, 특정 서열이, 예컨대 본 발명에 따른 참조 서열과 95% 동일한지를 결정하고자 하는 경우, 상동성%가 참조 핵산 또는 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 계산되고, 기준 서열에서 뉴클레오티드 총 수에 최대 5%의 상동성에서 갭이 허용되도록, 파라미터를 설정한다.
만일, 본원에서, 특정 서열의 잔기들의 조합과의 특정 서열 동일성을 언급하는 경우, 이러한 서열 동일성은 명시한 잔기들의 총 수에 관한 것이다.
기본 항체 분자는, 가변 영역이 항원에 결합하고, 나머지 불변 영역이 항원 독립적인 반응을 도출할 수 있는, 2중 기능성 구조이다. 항체의 주 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM은 불변 영역에 의해 결정한다. 이러한 클래스는 서브클래스(이소타입)으로 추가로 분류할 수 있다. 예컨대, IgG 클래스에는 불변 영역에 의해 결정되는 4가지 이소타입, 즉 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 있다. 다양한 인간 항체 클래스들에서, 오직 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgM안 보체 시스템을 효율적으로 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 불변 영역은 항원 결합 부위를 형성하진 않지만, 불변 영역 및 힌지 영역의 정렬이 분자에 부분적인 유연성을 부여하여 항원 결합을 허용할 수 있다.
여러가지 IgG 이소타입들이 단핵구, B 세포 및 NK 세포와 같은 세포 상의 Fc 수용체에 결합하여, 세포가 사이토카인을 분비하도록 활성화시킬 수 있다. 또한, 여러가지 이소타입들은 보체를 활성화하여, 국소 또는 전신 염증을 발생시킬 수 있다. 특히, 여러가지 IgG 이소타입은 다양한 수준으로 FcγR에 결합할 수 있다. FcγR은 Ig 슈퍼패밀리에 속하는 표면 당단백질 그룹이며, 주로 백혈구에서 발현된다. FcγR 당단백질은 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)로 지칭된 3가지 클래스로 분류된다. IgG1, IgG2 및 IgG3는 다양한 이들 FcγR 당단백질에 강하게 결합하고, IgG4는 매우 약한 결합을 나타낸다. 특히, IgG4는 FcγRI의 중간 바인더이며, ADCC(항체 의존적인 세포성 세포독성)이 비교적 낮거나 심지어 없으며, FcγRIIIA 또는 FcγRIIA에 결합하지 않는다. 또한, IgG4는 저해 수용체인 FcγRIIB의 약한 바인더이다. 또한, IgG4는 오직 약한 보체 고정(complement fixation)을 매개하거나 매개하지 않으며, 약한 보체 의존적인 세포독성(CDC)을 매개하거나 매개하지 않는다. 본 발명에서, IgG4는 LSEC(liver sinusoidal endothelial cell) 상에서 FcRγII와의 상호작용을 나타내지 않고, Kupffer 세포(대식 세포) 상에서 FcRγI-III와 상호작용하지 않거나 약하며, 간의 NK 세포 상에서 FcRγIII와 상호작용하지 않기 때문에, 간 FcR의 Fc-매개 표적화를 방지하기 위해 특히 사용할 수 있다. 임의의 CDC를 더욱 감소시키는 특정 돌연변이도 본 발명의 일부분이다. 예컨대, IgG4의 327, 330 및 331 위치의 잔기는 ADCC(항체 의존적인 세포성 세포독성) 및 CDC(Amour, 1999; Shields, 2001)를 감소시키는 것으로 확인되었다. 항체를 안정화하는 많은 돌연변이들도 본 발명의 일부분이다(또한, 본원에서는 "안정화성 돌연변이"라 함). 이러한 돌연변이로는, 특히, IgG4의 CH2 영역에서의 루신->글루탐산 돌연변이와 IgG4 힌지 코어에서의 세린->프롤린 치환 돌연변이가 있다. 이러한 돌연변이는, 본 발명의 특정 구현예에서, 반-분자(half-molecule)의 양을 <10%, <5%, 바람직하게는 <2% 또는 <1%로 감소시킨다. 또한, 이렇게 안정화된 항체의 생체내 반감기는 1, 2, 3, 4 또는 6일 이상의 몇 일로 증가될 것이다(Schuurman, 1999).
본원에 기술된 표적 항체 등의 표적 물질은 또한, 항원, 특히 CD138에 대한 이의 결합 친화성 측면에서 기술되거나 명시될 수 있다. 표적 항체와 같은 표적 물질의 바람직한 결합 친화성은, 해리 상수 KD (nM) < 1.6, < 1.5 또는 ≤1.4로 특정화된다. 표적 항체 등의 표적 물질을 포함하는 면역접합체의 경우, 해리 상수 KD (nM)는 < 1.6, < 1.5 또는 < 2.5, < 2.4, < 2.3, < 2.2, < 2.1, < 2.0, 또는 ≤ 1.9인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 항원 결합 영역(ABR)은 사용되는 표적 항체 또는 조작된 표적 항체의 유형을 기초로 바뀔 것이다. 천연 항체 및 대부분의 키메라 항체와 인간화 항체의 경우, 항원 결합 영역은 경쇄와 중쇄의 첫번째 2개의 도메인으로 이루어져 있다. 그러나, 경쇄가 없는 중쇄 항체의 경우, 항원 결합 영역은, 예컨대 중쇄의 첫번째 2개의 도메인으로만 이루어질 수 것이며, 단일 폴리펩타이드 체인에서 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 조합된, 단쇄 항체(ScFv)의 경우에는, ABR은 단지 하나의 폴리펩타이드 분자에 의해 제공된다. FAB 단편은 일반적으로 파파인 절단에 의해 수득되며, 하나의 경쇄와 중쇄의 일부를 가지며, 하나의 항원 조합 부위만 있는 ABR을 구성한다. 한편, 2가 항체는 2개의 항원-결합 영역이 있는 소형 항체 단편이다. 그러나, 본 발명에서, 표적 항체 또는 조작된 표적 항체의 항원 결합 영역은 표적 항체 또는 조작된 표적 항체의 결합 특이성을 주로 결정하는 임의 영역이다.
ABR 또는 다른 표적 항체 영역이, "임의 항체의" 예컨대 인간 또는 비-인간 항체의 것으로 칭해지는 경우, 이는 본원에서, ABR이 해당되는 천연 ABR과 동일하거나 또는 그것을 기초로 함을 의미한다. 천연 ARB의 결합 특이성을 가지고 있다면, ABR은 천연 ABR을 기초로 하는 것이다. 그러나, 이러한 ARB는, 예컨대 점 돌연변이, 부가, 결손 또는 번역 후 수정, 예컨대 당화를 포함할 수 있다. 이러한 ABR은 특히 천연 ABR의 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본 발명에서, 표적 항체와 같은 표적 물질, 특히 이를 포함하는 면역접합체의 균일한 표적화는 표적 물질을 이용한 상기 표적화의 바람직한 결과 수득과 관련있는 편차(variance) 단위이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 바람직한 결과는 표적에 대한 단순 결합에 의해 수득된다. 이는, 예컨대 특정 표적 물질이 이후 결합에 대해 보호를 제공하는 구현예 사례이다. 그러나, 표적 물질의 균일성(homogeneity)은 예컨대 상기 표적 물질을 포함하는 면역접합체의 효능을 통해 쉽게 평가할 수 있다. 예컨대, CD138과 같이, 종양 세포를 파괴 및/또는 종양의 증식을 정지시킬 목적의 작용자를 포함하는, 종양 항원에 대한 상기 면역접합체의 효능은, CD138 항원을 발현하는 세포를 포함하는 종양의 증식 억제 정도에 의해 결정할 수 있다. 이렇듯, 면역접합체는 그 효능에 있어 심한 편차를 나타낼 수 있다. 예컨대, 면역접합체는 때때로 종양 증식을 우수한 효능으로 정지시킬 수 있지만, 다른 때에는 대조군의 효능을 거의 넘어서지 않는 효능을 보일 수도 있다. 한편, 면역접합체의 효능에 있어 낮은 편차는, 면역접합체 및/또는 표적 인자 각각이 바람직한 결과를 일관되게 제공함을 의미한다. 표적화의 균일성을 정량하는 한가지 방법은, 표적화 변이성을 계산하는 것이다. 특정 표적 물질을 포함하는 면역접합체에 의해 정지되는 종양 증식과 관련하여, 표적화 변이성은 종양이 미리 결정된 크기, 예컨대 300mm3가 되는데 소요되는 시간을 먼저 측정함으로써 계산할 수 있다. 바람직하게는, 미리 결정된 크기에 도달하기 전과 후의, 임의의 종양 증식이 거의 동일한 속도로 점차 증가하도록, 미리 결정된 크기를 채택한다. 군의 개체들에서 그러한 시간을 측정한 후, 개체 군에서의 이러한 시간의 평균(Tm)을 계산한다(예, SCID 마우스, 또는 그외 균일한 종양 증식을 나타내는 적합한 모델). 그런 후, 표적화에 일정 부분 이상의 효능을 나타내는 군의 개체에서의 관찰 결과와 Tm의 상관 관계를 확인하여, 상기 미리 결정된 크기에 도달하는 최소 시간(Tf)과 관련성을 확인하고, 한편으로는, 가장 높은 표적화 효능을 나타내는 군의 개체 결과와 상관 관계를 확인하고, 따라서 하기 식에 따른 미리 결정된 크기에 대한 표적화 변이성을 계산함으로써 상기 미리 결정된 크기에 도달하는 최대 시간(Ts)과의 관련성을 본다:
표적화 변이성[%] = Ts-Tf/Tm x 100
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조작된 표적 항체를 포함하는 면역접합체의 표적화 변이성은 < 150%, < 140%, < 130%, < 120%, < 110%, < 100%, < 90%, < 80%, < 70%, < 60%, 또는 < 50%이며, 특정 구현예에서는, 심지어 < 45%이다. 바람직하게는, 표적화 변이성은 약 10% 내지 약 150%이며, 바람직하게는 약 10% - 약 100%, 약 10% - 약 80%, 약 10% - 약 70%, 약 10% - 약 60%, 약 10% - 약 50%이다.
또한, 표적화의 균일성은 종양 증식 지연 측정 등의 다른 수단에 의해 정량할 수 있다. 또한, 당해 기술 분야의 당업자라면 쉽게 이해되는 바와 같이, 특정 크기의 종양 체적은 기본적인 표적화 변이성을 결정할 수 있는 파라미터일 뿐이다. 원하는 결과에 따라, 기타 파라미터로 시간(예, 종양 증식 지연 측정을 위한)을 포함할 수 있으며, 결합율%도 사용할 수 있다. 당해 기술분야의 당업자라는 이러한 그외 파라미터를 쉽게 정할 수 있다.
도 9는 (C) 및 (D)에서, 뮤라인 항체 BB4 (BB4-SPP-DM1; 도 9C)을 포함하는 면역접합체와 이를 기초로한 조작된 표적 항체 nBT062 (nBT062-SPP-DM1; 도 9D)를 포함하는 면역접합체 사이의 표적화/결합 균일성 차이를 나타낸다. 이들 그래프에서 알 수 있는 바와 같이, 조작된 표적 항체를 포함하는 면역접합체로부터 수득한 결과는 뮤라인 항체를 포함하는 면역접합체로부터 수득한 결과 보다 실질적으로 더욱 균일하였다. 이는, B-B4의 항체 결합 영역이 nBT062에서 변형되지 않았기 때문에, 특히 주목되었다. 따라서, 뮤라인 항체의 항체 결합 영역을 포함하지만 뉴라인 항체의 다른 부분은 포함하지 않는 면역접합체는, 당해 기술 분야의 당업자가 예상할 수 있는 결과를 훨씬 넘어선 특징들을 나타내었다.
nBT062(또한, 도 1 참조)는 B-B4의 키메라 버전의 뮤라인 인간 키메라 IgG4 mAb이다. 이 B-B4의 키메라 버전은 HAMA(인간 항-마우스 항체) 반응을 감소시키고, CD138에 대한 B-B4의 항체 결합 영역의 기능성을 유지하도록 제조되었다. 놀랍게도, 조작된 표적 항체를 포함하는 면역접합체를 이용하여 수득한 결과들은 훨씬 더 균일하였다(결과의 편차가 줄어듬). nBT062의 제조 프로토콜은 하기에 명시되어 있다. nBT062를 발현하는 중국 햄스터 난소 세포는 2007년 12월 11일에 D-38124 브라운슈바이크 마셰로데르 베그에 소재한 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁하였다. 이의 식별 번호는 DSM ACC2875이다. B-B4를 기반으로 한 CD138 특이적인 키메라 항체는 본원에서 통상 c-B-B4라고 한다.
중쇄 및 경쇄 둘다의 아미노산 서열은 nBT062에 대한 뉴클레오티드 서열의 번역으로부터 예측하였다. 중쇄 및 경쇄의 예측되는 아미노산 서열은 표 1에 나타낸다. 예측되는 가변 영역은 굵은 체로 나타내고, CDR 예상 부분은 밑줄을 그었다.
nBT062의 예상되는 아미노산 서열 - 예상되는 nBT062 중쇄 서열(서열번호 1):
1 QVQLQQSGSE LMMPGASVKI SCKATGYTFS NYWIE WVKQR PGHGLEWIGE
51 ILPGTGRTIY NEKFKGKA TF TADISSNTVQ MQLSSLTSED SAVYYCAR RD
101 YYGNFYYAMD Y WGQGTSVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL
151 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT
201 KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPS CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK
251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS
301 TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV
351 YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
401 DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSLG(K)

C-말단의 라이신은 제거(clipping)되기 쉽지만, 다소 불완전한 제거로인해 존재할 수 있다. 서열번호 1에는 괄호 (K)가 포함되어 있지 않는다.

- 예상되는 nBT062 경쇄 서열(서열번호 2):
1 DIQMTQSTSS LSASLGDRVT ISC SASQGIN NYLN WYQQKP DGTVELLIYY
51 TSTLQSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEP EDIGTYYC QQ YSKLPRT FGG
101 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
201 LSSPVTKSFN RGEC
크라벳 및 코티아의 일반적인 CDR 정의와 BT062의 예상되는 CDR의 비교
Kabat CDR 정의 nBT062
경쇄 CDR1: 잔기 24-34 CDR1 : 잔기 24-34
CDR2: 잔기 50-56 CDR2: 잔기 50-56
CDR3: 잔기 89-97 CDR3: 잔기 89-97
중쇄 CDR1: 잔기 31-35 CDR1 : 잔기 31-35
CDR2: 잔기 50-56 CDR2: 잔기 51-68
CDR3: 잔기 95-102 CDR3: 잔기 99-111

코티아 CDR 정의 nBT062
경쇄 CDR1: 잔기 26-32 CDR1: 잔기 24-34
CDR2: 잔기 50-52 CDR2: 잔기 50-56
CDR3: 잔기 91-96 CDR3: 잔기 89-97
중쇄 CDR1: 잔기 26-32 CDR1: 잔기 31-35
CDR2: 잔기 52-56 CDR2: 잔기 51-68
CDR3: 잔기 96-101 CDR3: 잔기 99-111
BT062는 링커, 본원에서는 SPDB를 통해 세포 증식 억제성 마이탄시노이드 유도체 DM4가 부착되어 있으며, CD138을 표적으로 하는 키메라 항체 nBT062를 포함하는 면역접합체이다. 도 1 및 2에 BT062를 화학적으로 나타내었다. nBT062 및 마이탄시노이드 작용자 분자를 포함하는 면역접합체는 흔히 이의 링커 및 마이탄시노이드 작용자 측면에서 특정화되며, 예컨대 nBT062-SMCC-DM1은, nBT062, SMCC(티오에스테르 결합을 포함하는 "비절단성" 링커) 및 작용자로서 DM1을 포함하는 면역접합체이다. 보다 일반적으로, nBT062 및 작용자 분자를 포함하는 면역접합체는 또한, nBT062-링커-작용자 또는 간단하게 nBT062-작용자(nBT062N, N은 본원에 기술된 임의의 작용자임)로도 기재할 수 있다.
본원에서는, CD138에 대한 조작된 표적 항체와 이에 절단성 링커(CL)을 통해 부착된 작용자 분자를 포함하는 면역접합체의 방해가 없는 대응체(UI: 무방해 면역접합체)를 언급하며, 본 명세서에서는 UICL이라고 하며, 이것은 작용자 분자가 입체적으로 방해를 받고 절단성 링커를 포함하는, 면역접합체(HICL - 방해가 있는 면역접합체, 절단성 링커)와 대조가 된다. UICL은, 조작된 표적 항체를 포함하나 작용자 분자가 입체적으로 방해를 받지 않는 HICL와 등가의 면역접합체이다. 한쌍의 HICL/UICL의 예는 BT062 및 nBT062-SPP-DM1이다. 비절단성 링커를 포함하는 이러한 면역접합체의 방해가 없는 대응체(UINCL)는, 작용자 분자가 입체 방해가 되지 않고 조작된 표적 항체와 비절단성 링커를 포함하는 등가의 면역접합체이다. BT062의 경우, nBT062-SMCC-DM1은 비절단성 링커를 포함하는 방해가 없는 대응체(UNICL)의 예이다.
면역접합체의 종양 증식의 저해 활성(= 종양 증식 저해 활성)은 상대 평가이다. 이는, 활성 100%로 설정된 면역접합체의 최고 수행 활성에 대한 접합체의 상대적인 종양 증식 저해 활성을 나타낸다. 예컨대, 32일간의 종양 증식 지연(TGD)를 야기하는, 접합체, 즉 BT062의 최고 수행 활성이 100%로 설정되어 있다면, 예컨대, 18일의 종양 증식 지연(TGD)을 보이는 nBT062-DM1의 활성은 하기와 같이 계산한다:
종양 증식 저해 활성 = 100 x (TGDnBT062 - DM1 / TGDBT062),
보다 일반적으로는:
종양 증식 저해 활성 = 100 x (TGD샘플 / TGD기준).
도 11B에 나타낸 결과에 대한 적합한 예를 제공한다.
TGD * ( days ) % 활성**
PBS 0 0
nBT062 - SMCC - DM1 18 56
BT062 32 100
nBT062 - SPP - DM1 13 40
표 3: 치료군에 450 ㎍/kg을 투여한 SCID 마우스에서 MOLP-8 종양 이종이식에 대한 nBT062-DMx의 종양 증식 지연(TGD) 및 활성 %.
(*) 치료군에서 미리 정한 크기(160 mm3)가 되는데 걸리는 평균 시간 - 대조군에서 미리 정한 크기가 되는데 걸리는 평균 시간으로서, 수일간의 종양 증식 지연(TGD).
(**) 종양 증식 저해 활성 = 100 x (TGD샘플 / TGDBT062). BT062의 활성은 100%로 정해짐..
표 2에 제시된 예에서, BT062는 방해가 없는 대응체(nBT062-SPP-DM1)의 활성 보다 60% 높은 종양 증식 저해 활성과, 비절단성 링커를 포함하는 방해가 없는 대응체 면역접합체(nBT062-SMCC-DM1)의 활성 보다 44% 높은 종양 증식 저해 활성을 제공한다.
예컨대, huC242-마이탄시노이드 면역접합체에서, 절단성 링커는 이른바 방관자 효과를 제공할 수 있는 것으로 종래에 보고되었다. Goldmahker 등(미국 특허 공개번호 2006/0233814)도, 작용자 분자가 추가적인 변형, 특히 알킬화를 거친 경우, 표적 물질에서의 절단 시 방관자 효과가 특히 분명해진다. 또한, Goldmahker 등은, UICL가 대응되는 UINCL 보다 TGD가 우수한 것으로 확인하였다(예, 도 6의 미국 특허 공개번호n 2006/0233814).
그러나, HICL/UICL/UINCL 면역접합체의 전체적인 효능은 면역접합체마다 및/또는 표적마다 다른 것으로 보인다. 예컨대, HICL 트라스투주맵(trastuzumab)-SPP-DM4는 UINCL 트라스투주맵-SMCC-DM1 보다 종양 크기 감소 능력에서 분명하게 우수하였지만, UICL 면역접합체 트라스투주맵-SPP-DM1의 성능은 대응되는 HICL(미국 특허 공개번호n 2008/0171040, Eberts et al.)과 실질적으로 비슷하여, 면역접합체 및 표적의 기능으로 수득되는 결과를 나타내었다.
도 11A는 HICL은 UICL 및 UNICL 보다 우수함을 나타내며, 또한, 놀랍게도, UICL은 단일 고용량 요법(250㎍/kg)에서 UINCL 보다 어떠한 우수한 결과도 나타내지 않았다. 실제, 이러한 요법에서 UICL에서 관찰되는 수일간의 TGD는 실제 UINCL 보다 실제 낮았다. 이러한 결과는, 용량 증가(450㎍/kg)에 따라 더욱 우수하였다. 종합하여, 도 11A에 나타낸 바와 같이, HICL은 단일 투약 실험에서 예기치 않은 수준으로 UICL 보다 우수하였다. 이러한 결과와 일치되게, 반복 투약 실험에서, HICL는 UICL 보다 상당히 우수하였으며, UICL의 결과는 대조군의 결과에서 매우 약간 우수한 결과를 나타내었다. 또한, UICL은 보다 높은 용량에서 UINCL 보다 우수하였다.
다발성 골수종 세포의 기질 세포, 특히 골수 기질 세포로의 유착은, 다발성 골수종 환자에서 관찰되었던 유착 매개의 약물 내성(CAM-DR)을 설명할 수 있었다. 특정 구현예에서, 본 발명의 면역접합체는 CAM-DR을 완화시킬 수 있다. 특히, 본 발명의 특정 구현예에서, 이러한 유착은 면역접합체를 상기 다발성 골수종에, 예컨대, 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 그 이상으로 투여시 없어진다. 도 17E에 나타낸 바와 같이, 특히 UICL 및 HICL은, 기질 세포를 금방 처리한 샘플(또한, 기질 세포가 처리되지 않은 샘플)에서 다발성 골수종 세포의 BMSC(골수 기질 세포) 유착을 저해할 수 있었지만, UINCL 대응체는 이러한 효과가 없었다. 이러한 결과들은, 유착 강하 효과는 면역접합체의 링커 특성에 의존적이며, 작용자 분자가 보다 쉽게 해리되게 하는 절단성 링커가 바람직하다. 다발성 골수종 세포가 BMSC와의 유착을 일정 부분 이상 방지한다는 사실은, 또한, 상기 세포가, CAM-DR의 결과 인해 다발성 골수종 세포에 대한 적어도 충분한 효능(full efficiency) 작용 저해 등의 기타 세포독성 물질이 쉽게 접근가능하게 해 준다. 따라서, 면역접합체의 투여는 바람직하게는 세포독성 물질의 동시 또는 추후 투여와 조합된다. 면역접합체와 세포독성 물질의 투여 간격은 12시간 내지 6시간 일 수 있으며, 12시간, 24시간, 2일, 3일, 4일 또는 5일일 수 있다.
본원에 기술된 면역접합체는, 정맥내, 비경구, 경구, 근육내, 강내(intrathecal) 또는 에어로졸 등의 임의 경로로 투여할 수 있다. 전달 방식은 원하는 효과에 따라 결정될 것이다. 당업자는 본 발명에서 특정 치료제의 최상의 투여 경로를 쉽게 알 것이다. 적합한 투여량은 투여 경로 및 처방된 치료제에 따라 결정될 것이며, 현행 치료 프로토콜에 비추어 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.
본 발명의 면역접합체 및/또는 임의의 다른 세포독성 물질을 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물은, 통상적인 약학 컴파운딩 기법에 따라 제조할 수 있다. 예로, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Ed. (1985, Mack Publishing Co., Easton, Pa.)를 참조한다. 전형적으로, 유효량의 활성 성분을 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합할 수 있다. 담체는 투여에 적한한 조제 형태에 따른 매우 다양한 형태, 예컨대 정맥내, 경구, 비경구, 강내, 경피 또는 에어로졸 형태를 취할 수 있다.
경구 투여를 위해, 면역접합체 및/또는 세포독성 물질을 캡슐제, 환제, 정제, 로젠제, 용해제(melts), 산제, 현탁제 또는 유화제 등의 고형 또는 액체 조제물로 제형화할 수 있다. 경구 투약 형태로 조성물을 조제하는 경우, 예컨대, 물, 글리콜, 오일, 알코올, 향제, 보존제, 착색제, 현탁제 등의 일반적인 임의의 약학 매질을 경구 액제 조제물(예, 현탁제, 엘릭시르제 및 용액제)의 경우에 사용할 수 있거나, 또는 경구 고형 조제물(예, 산제, 캡슐제 및 정제)의 경우에는 전분, 당, 희석제, 과립제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등을 사용할 수 있다. 이의 투여 용이성으로 인해, 고형 약학 담체가 분명하게 사용되는 경우, 정제 및 캡슐제가 가장 높은 경구 투약 단위 형태이다. 원하는 경우, 표준 기법에 의해 정제를 당 코팅하거나 장-코딩할 수 있다. 활성 물질은 위장관을 통과할 수 있도록 안정적이어야 한다. 필요에 따라, 안정적인 통과에 적합한 물질을 사용할 수 있는데, 문헌에 기재된 인지질 또는 렉시틴 유도체 뿐만 아니라 리포좀, 미세입자(마이크로스피어 및 마크로스피어 포함)를 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위해, 면역접합체 및/또는 세포독성 물질을 약학 담체에 용해히키고, 용액 또는 현탁액으로 투여할 수 있다. 적합한 담체의 예로는, 물, 염수, 포스페이트 완충 용액(PBS), 덱스트로스 용액, 프럭토스 용액, 에탄올 또는 동물성 오일, 식물성 오일 또는 합성 오일이 있다. 또한, 담체는 다른 성분, 예컨대, 보존제, 현탁제, 가용제, 완충제 등을 포함할 수 있다. 비접합성 표적 물질 및/또는 면역접합체 및/또는 세포독성 물질을 뇌실내 또는 강내 투여하는 경우, 이는 또한 뇌축수액에 용해할 수도 있다.
개체에게 투여되는 투여량은 개체(인간 및 인간을 제외한 동물 포함)의 체표면 당 양으로 명시된다. 투여량은 상기 개체에게 양으로, 바람직하게는 비제한적으로 약 5 mg/m2 내지 약 300 mg/m2으로 투여할 수 있으며, 예컨대 약 20mg/m2, 약 50mg/m2, 약 100mg/m2, 약 150mg/m2, 약 200mg/m2 및 약 250mg/m2으로 투여할 수 있다. 면역접합체를 세포독성 물질과 조합하여 투여하는 특정 구현예에서, 면역접합체의 투여량은 더 낮을 수 있다. 면역접합체는 한번에 또는 일련의 치료 기간 동안에 적절하게 투여된다. 복수 투약 요법에서, 이러한 양을 매일 1회, 매주 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 5주에 1회 또는 6주에 1회로 투여할 수 있다. 1회 고투여량의 투약, 또는 다른 예로, 긴 간격에 맞춘 투여량으로 투여한 후 잠시 후에 투여되는 낮은 투여량으로의 투약은 본 발명의 바람직한 구현예이다. 바람직한 구현예에서, 투약 시기는, 2차 투약 및/또는 임의의 이후 치료제 전에 충분한 시간이 지나, 선행한 투여량이 실질적으로 대사되었지만, 개체 시스템에 존재하는 면역접합체의 양이 종양 증식을 저해, 지연 및/또는 예방하도록, 개체에 따라 조절한다. 예시적으로 "반복적인 단일 투약(repeated single dose)" 요법은 3주마다 1회씩 약 200mg/m2의 면역접합체의 초기 투여량을 투여하는 것이다. 다른 예로, 초기 고투약(high initial dose) 후, 약 150㎍/m2으로의 2주에 1번씩 투여량을 유지할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 공지 기법과 분석으로 쉽게 모니터링할 수 있다. 투여량은 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지, 선행된 임의 요법의 진행, 환자의 임상 병력 및 표적 물질/면역접합체에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 변경될 수 있다.
일 구현예에서, 면역접합체는 동일한 질환의 치료에 유효하지만, 면역접합체 없이 투여하였을 때 대개 CAM-DR 측면에서 제한된 효능을 가지는, 1종 이상의 추가적인 세포독성 물질과 함께 투여되며, 예컨대, CD138 특이적인 면역접합체는 덱사메타손과 조합하여 투여할 수 있다. 특히, 덱사메타손은 면역접합체를 투여한 후 2시간에 필요한 환자에게 유효량으로 투여된다.
따라서, 본 발명의 면역접합체는 또한 고투여량 화학치료제(바람직하게는, 멜파란, 멜파란/프레드니손(MP), 빈크리스틴/독소루비신/덱사메타손(VAD), 리포솜 독소루비신/빈크리스틴, 덱사메타손(DVd), 사이클로포스포아미드, 에토포시드/덱사메타손/시타라빈, 시스플라틴(EDAP)), 줄기 세포 이식(예, 자가 줄기 세포 이식 또는 동종 줄기 세포 이식, 및/또는 미니-동종(골수 비-소멸성(myeloablative)) 줄기 세포 이식), 스테로이드(예, 코르티코스테로이드, 덱사메타손, 탈리도미드/덱사메타손, 프레드니손, 멜팔란/프레드니손), 보조 치료(예, 비스포스포네이트, 성장 인자, 항생제, 정맥내 면역글로불린, 낮은 강도의 방사선요법, 및/또는 정형외과적 개입), THALOMID (탈리도미드, Celgene), VELCADE (보르테조밉, Millennium), 및/또는 Revlimid (레날리도미드)(Chelgene Corporation) 및/또는 방사선 요법 등의 기타 다발성 골수종 치료제를 이용한 치료 용법으로 특히 투여할 수 있다.
본 발명의 면역접합체를 세포독성 물질과 조합하여 투여하는 경우, 상기 투여량 및 요법들이 대게 유지된다. 그러나, 면역접합체 및 세포독성 물질이 공동-투여된다면, 이들 치료 성분들 각각을 낮은 투여량으로 사용하는 것인 특정 구현예에서 바람직하다. 이러한 상황에서, 면역접합체는 약 20 mg/m2, 약 50 mg/m2 등의 약 5 mg/m2 - 약 100 mg/m2의 투여량으로 투여할 수 있으며, 세포독성 물질은 단독 투여시 권고되는 투여량으로 투여한다.
세포 배양 기반(도 7) 및 마우스 실험(도 8 - 11)으로 수득한 실험 데이타를 통해, 이러한 사실이 더욱 뒷받침됨을 추가로 확인하였다.
다발성 골수종의 발병은 세포-표면 유착 분자를 통한 골수 기질 세포(BMSC) 및 세포외 기질(ECM)의 골수종 세포 결합을 수반한다. 이러한 결합은, 다발성 골수종 세포의 증식, 약물 내성, 및 골수 환경에서의 MM 세포의 이주를 촉발시켜, 궁극적으로 이러한 작용에 원인이 될 수 있다(Munshi et al. 2008). 특히, 신데칸-1(CD138)에서 1형 콜라겐을 통한 다발성 골수종 세포의 ECM과의 유착은, 매트릭스 메탈로프로테나제 1의 발현을 유도하게 되고, 따라서 골 흡수(bone resorption) 및 종양 침투가 촉진된다(Hideshima et al. 2007). 다발성 골수종 세포와 골수 미세환경 간의 상호작용으로, 다면발현 증식성 및 항-세포자살 케스케이드가 활성화된다.
다발성 골수종 세포가 골수 기질 구역으로 회귀한 후, 다발성 골수종 세포와 BMSC 간의 유착은, 혈관신생 및 종양 증식 촉진 활성을 가지는, 인터루킨-6(IL-6) 및 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)과 같은 다수의 사이토카인을 상향 조절한다(Hideshima et al. 2007). 이들 사이토카인에 의해 개시되는 시그널링 케스케이드는 궁극적으로 기존 치료제에 대한 MM 세포의 내성을 나타내게 된다(Anderson et al. 2000; Hideshima et al. 2006).
골수 기질 존재 하의, CD138-양성 종양 세포에 대한 nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1의 생체내 효능을 마우스 모델에서 분석하였고, 그 분석 결과는 도 12에 나타내었다. HICL 및 UICL 모두 이러한 환경에서 잘 기능하는 것으로, 도면에서 나타났다. 이 모델에서, MM 세포 증식의 파라미터로서 사용될 수 있는 shulL-6R의 수준 증가는, 이러한 2종의 면역접합체들에 의해 억제되었다.
본 발명에서, MM은 하기와 같이 예로서 BT062를 사용하여 처리된다. 이러한 예는, 어떠한 방식으로 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 범위에 속하는 nBT062 기반의 시스템이나 그외 면역접합체, 그리고 MM과 같은 질병의 치료에 이용할 수 있는 그외 치료 요법들을 쉽게 정할 수 있다.
혈류에 접근가능한 세포를 통한 환자 MM 세포 상에서의 선택적인 CD138의 발현, nBT062의 특이성 및 혈류에서의 BT062의 안정성으로 인해, BT062는 DM4의 전신 독성을 제거하여, DM4-작용자 분자(들)를 전달하고자 하는 기회를 제공한다. 본 발명의 면역접합체는, 작용자 분자가 면역접합체로부터 분리될 수 있는 세포 부위로의, 작용자 분자의 효과적인 투여 수단을 제공한다.
하나 이상의 세포독성 물질은, 본 발명의 면역접합체와 함께 처리되는 개체에서 확립된 이러한 세포독성 물질의 처리 프로토콜에 따른 투여량 및 투약 형태로 투여된다.
특히, 환자에게, 본 발명에 따라 BT062를 적절한 투여량으로, 예컨대 100mg/m2으로 이용하여, 예컨대 처음에는 매일, 이후에는 매주 사용하는 치료 요법을 실시한다. 매주 면역접합제 치료를 수행한 후 12시간 후, 또한 환자에게 멜팔란(예, 상표 ALKERAN로 시판되는 환제)을, 예컨대 환자에게 투여되는 제조사의 지침에 따른 경구 투여량으로 투여함으로써, 처리한다.
본 발명에서, 특히 고형 종양도 예로서 BT062를 이용하여 하기와 같이 치료할 수 있다. 이러한 예는 어떠한 방식으로도 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니며, 당업자라면 고형 종양의 치료에 이용할 수 있는 그외 치료 요법 및 본 발명의 그외 면역접합체를 쉽게 정할 수 있다. 종양은 먼저 예컨대 방사능으로 종양의 크기를 줄이는 치료를 한다. 이후, BT062를 투여하고, 세포독성 물질 1회분을 예컨대 ALKERAN 환제 형태로 투여하여, 남아있는 암 세포를 제거하는 매우 효과적인 방법을 제공한다. 면역접합체의 투여는 이러한 남아있는 암 세포를 특이적으로 표적화하고, 표적 부위에 작용자 분자가 분비되게 한다. 면역접합체는 이의 활성으로 인해 CAM-DR을 해결하거나 또는 없앨 뿐만 아니라, 다발성 골수 세포가 기질 세포에 유착되는 것을 저해한다는 점으로 인해, 면역접합체는 또한 그외 세포독성 물질에 대한 CAM-DR을 무력화하거나 또는 제거한다. 이러한 면역접합체의 높은 효능은, 바람직한 구현예에서, 단일 투약 요법으로도 가능하다.
본 발명은 하기 실시예들을 들어 추가적으로 설명되며, 하기 실시예들은 예를 든 것일 뿐 어떠한 방식으로도 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다. 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 표준 기법이나 하기에 구체적으로 기술된 기법들을 이용한다.
재료 및 방법
키메라 항체의 제조( cB -B4: nBT062 )
B-B4
기존에 특정화된 뮤라인 항체 B-B4(Wijdenes et al., Br J Haematol., 94 (1996), 318)를 본 실험들에 사용하였다.
B-B4 및 cB -B4 / nBT062 의 클로닝 및 발현
표준적인 재조합 DNA 기법들은 텍스트북, 예컨대 J.　Sambrook; Molecular Cloning, A Laboratory Manual; 2nd Ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA에 상세하게 기술되거나 또는 키트를 사용하는 경우에는 제조사의 지침서에 권고된 바와 같이 수행하였다. 마우스 가변 영역의 PCR-클로닝과 수정은 표준 PCR 방법으로 수행하였다. 프라이머는 각 사용 결과 섹션에 나타내었다.
cB -B4 / nBT062 의 발현
10% FCS, 580　㎍/ml L-글루타민, 50　Units/ml 페니실린 및 50 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에서 배앙한, 기하급수적으로 증식 중인 COS 세포를 트립신 처리 및 원심분리에 의해 수확하고, PBS로 헹구었다. 세포를 최종 농도 1x107 cells/ml로 PBS에 재현탁하였다. COS 세포 현탁액 700 ㎕를 Gene Pulser 큐벳에 옮기고, 중쇄 및 카파 경쇄 발현 벡터 DNA(각각 10 ㎍ 또는 슈퍼벡터 13 ㎍)와 혼합하였다. 세포에 Bio-Rad Gene Pulser를 이용하여 1900 V 및 25 μF로 전기충격을 가하였다. 형질전환된 세포를, 10% 감마-글루불린 무첨가 FBS, 580 ㎍/ml L-글루타민, 50 Units/ml 페니실린 및 50 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에서 72시간 배양한 후, 항체가 함유된 세포 배양 상층액을 회수하였다.
cB -B4 / nBT062 의 발현 수준을 측정하기 위한 포착 ELISA
PBS로 희석한 0.4 ㎍/ml 염소 항-인간 IgG 항체 100 ㎕으로, 96 웰 플레이트를 피복하였다(4℃, 밤새). 플레이트를 200 ㎕/well 세정 완충액(PBS+0.1% Tween-20)으로 3번 세정하였다. 그런 후, 웰을 PBS 중의 0.2% BSA, 0.02% Tween-20로 블록킹하고, 분비된 항체가 함유된 세포배양 상층액 200 ㎕을 첨가하였다(37℃에서 1시간 인큐베이션). 웰을 세정 완충액으로 6번 세정한 후, 염소 항-인간 카파 경쇄 퍼옥시다제 접합체를 이용하여 결합된 항체를 ㄱㅁ출하였다.
세포 배양 상층액에서의 cB -B4 / nBT062 의 정제
Protein A ImmunoPure Plus kit (Pierce, Rockford, IL)를 제조사의 권고안에 따라 사용하여, 형질전환된 CDS 7 세포의 상층액으로부터 cB-B4 항체를 정제하였다.
cB -B4 결합 및 경쟁적 분석
CD138에 대한 B-B4 및 cB-B4의 결합 활성 분석은, Diaclone (Besancon, France) sCD138 키트를 제조사의 권고안에 따라 사용하여 수행하였고, 결과 섹션에 기술한 변화에 검토하였다.
RNA 준비 및 cDNA 합성
하이브리도마 B-B4 세포를 배양하고, Qiagen Midi 키트(Hilden, Germany)로 처리하여 제조사의 프로토콜에 따라 RNA를 분리하였다. 아머샴 바이오사이언스(Piscataway, NJ)의 제1 가닥 합성 키트를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여, 약 5 ㎍의 B-B4 RNA로부터 역전사를 수행하여, B-B4 cDNA를 합성하였다.
B-B4 면역글로불린 cDNA 클로닝
면역글로불린 중쇄(IgH) cDNA를, IgH 프라이머 MHV7 (5'-ATGG-GCATC-AAGATGG-AGTCA-CAGA-CCC-AGG-3') [서열번호 3] 및 IgG1 불변 영역 프라이머 MHCG1 (5'-CAG-TGGATA-GACAGAT-GGG-GG-3') [서열번호 4]를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 마찬가지로, 면역글로불린 경쇄(IgL)를, 3가지 다른 Igκ 프라이머들 MKV2 (5'-ATG-GAGACA-GACA-CACTC-CTGC-TATGGG-TG-3') [서열번호 5], MKV4 (5'-ATG-AGGGCCC-CTGCTCA-GTTTTTT-GGCT-TCTTG-3') [서열번호 6] 및 MKV9 (5'-ATGG-TATCCAC-ACCTCA-GTTC-CTTG-3') [서열번호 7]를 각각 프라이머 MKC (5'-ACTG-GATGGTGGGA-AGATGG-3') [서열번호 8]과 조합 사용하여, 증폭하였다. 모든 증폭 산물들을 TOPO-TA 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 제조사의 지침에 따라 사용하여, pCR2.1-TOPO 벡터에 직접 연결하였다.
상기 연결한 pCR2.1 벡터 구조체로 형질전화된 E.　coli TOP10 박테리아를 LB-암피실린-Xgal 아가 플레이트에서 선별하였다. 하나의 백색 콜로니로 소규모 배양을 수행하고, 밤새 배양한 다음, QIAprep Spin Miniprep 키트를 제조사의 지침에 따라 사용하여 플라스미드를 분리하였다.
cDNA 서열 결정
BigDye 터미네이션 v3.0 사이클 시퀀싱 레디 반응 키트(ABI, Foster City, CA)를 이용하여 플라스미드의 서열을 분석하였다. 각 선별한 플라스미드는 GeneAmp9600 PCR 장치에서 프라이머 1210 및 1233을 이용한 사이클링을 수행하여, 양쪽 방향으로 서열 분석하였다. 전기영동 서열 분석을 ABI 캐필러리 시퀀서에서 수행하였다.
RT-PCR의 완전한 사이클, 클로닝 및 DNA 서열 분석을 반복 실시하여, 각 면역글로불린 쇄에 대한 3가지의 완전히 독립적인 서열 정보 세트를 수득하였다.
B-B4 Vκ DNA 서열
제1 가닥 합성을 3번의 독립적인 반응으로 수행하였다. 프라이머 MKC 및 MKV2(서열은 상기에 나타냄)로 제조한 PCR 산물을 제조사의 지침에 따라 pCR2.1-TOPO 벡터에 삽입하였다. 각각의 독립적인 RT-PCR 반응으로부터 수득한 클론을 양방향으로 서열분석하였다. MKV2-프라이머로 제조한 산물의 서열이, MOPC-21, SP2 및 Ag8 (Carroll et al., Mol Immunol., 25 (1988), 991; Cabilly et al., Gene, 40 (1985); 157)과 같은 골수종 융합 파트너로부터 기원하는 스테릴(sterile) 카파 전사체와 매우 비슷하였고, 그래서 이를 무시하였다.
MKC with MKV4 및 MKV9 프라이머를 MKC와 함께 사용한 PCR 산물들은 서로 비슷하였지만, 리더 서열 프라이머 내부의 워블(wobble) 위치만 달랐다.
B-B4 VH DNA 서열
3번의 독립적인 반응으로 제1 가닥을 합성하였고, PCR 산물을 클로닝하고, 각각의 제1 가닥 산물의 서열을 분석하였다. 5개의 클론들에서, 각각의 제1 가닥을 서열분석하였다.
키메라 cB -B4 발현 벡터의 구축
키메라 발현 벡터의 구축에는, BamHI 제한효소 부위 및 Kozak 서열이 선행되는, VH 및 Vκ에 적합한 리더 서열의 부가를 수반한다. Kozak 보존 부위 서열(consensus sequence)은 가변 영역 서열의 효율적인 번역에 중요하다. 이것은 리보솜이 번역을 시작할 수 있는 정확한 AUG 코돈을 명시하고 있으며, 대부분의 중요한 하나의 염기는 AUG 시작에서 상류 -3 위치에 있는 아데닌(또는 드물게는 구아닌)이다. 리더 서열은 Kabat 데이타베이스(Kabat et al., NIH National Technical Information Service, 1991)에서 가장 비슷한 서열로 선택된다. 이러한 부가 서열은, 정방향(For) 프라이머들(둘다 5'-AG-AGAAG - CTTGC -CGCCACC-AT-GAT-T-GCCTCTG-CTCAGTT-CCTTGGT-CTCC-3' [서열번호 9] 서열을 가짐; 제한효소 부위는 밑줄친 부분이고, Kozak 서열은 굵은 체로 표시됨) 내부에서 코딩된다. 또한, 키메라 발현 벡터의 구축에는, B-B4의 J 영역의 3' 말단과 인접하는, 천연 ApaI 제한효소 부위까지, 인간 감마 불변 영역의 5' 단편 도입을포함하며, 경쇄의 경우에는, 스플라이스 공여부위와 HindIII 부위의 부가를 포함한다. 상기 스플라이스 공여부위의 서열은 적절한 불변 영역에 가변 영역을 인-프래임으로 정확하게 부착하고, 따라서 V:C 인트론을 스플라이싱으로 제외시키는데 중요하다. 카파 인트론 + CK는 B-B4 Vκ 서열의 하류 발현 구조체에 코딩된다. 마찬가지로, 감마-4 CH는 B-B4 VH 서열의 하류 발현 구조체에 코딩된다.
B-B4 VH 및 Vκ 유전자들을 먼저 조심스럽게 분석하여, 임의의 원하지 않는 스플라이스 공여 부위, 스플라이스 수여 부위(splice acceptor), Kozak 서열과 기능성 전체 항체의 서브클로닝 및/또는 발현을 나중에 방해하게 되는 임의의 기타 서브-클로닝 제한효소 부위의 존재를 확인하였다. Vκ 서열에서 원하지 않는 HindIII 부위가 발견되었으며, 이는 아미노산 서열에 변화를 주지않으면서 PCR을 통한 부위-특이적인 돌연변이에 의해 반드시 제거되어야 한다. 이를 위해, 올리고뉴클레오티드 프라이머들 BT03 (5'-CAACA-GTA-TAGTA-AGCTC-CCTC-GGACG-TTCG-GTGG-3') [서열번호 10] 및 BT04 (5'-CC-ACC-GAACG-TCCGA-GGGAGC-TTACT-ATACTG-TTG-3') [서열번호 11]를 사용하였고, Stratagene (La Jolla, CA)의 신속변경 돌연변이유발 키트 프로토콜에 따라 돌연변이 유발을 수행하였다.
카파 쇄 키메라 형성용 프라이머
PCR 프라임 서열과 독립적인, 명백한 B-B4 Vκ 리더 서열을 Kabat 데이타베이스에서 뮤라인 리더 서열과 정렬하였다. B-B4 VH 리더와 가장 근접하게 매치되는 것은 VK-10 ARS-A(Sanz et al., PNAS, 84 (1987), 1085)이었다. 이 리더 서열은 시그널P 알고리즘에 의해 정확하게 절단되는 것으로 추정된다(Nielsen et al., Protein Eng, 10 (1997); 1). 프라이머 CBB4Kfor (상기에 언급됨) 및 g2258(5'-CGCG-GGATC-CACTCA-CGTTTGA-TTTCCAGC-TTGGT-GCCTCC-3' [서열번호 12]; 제한효소 부위는 밑줄 침)을, 완전한 리더 B-B4 Vκ 영역과, pKN100 발현 벡터에 클로닝하기 위한 HindIII 및 BamHI 말단 제한효소 부위가 포함된, PCR 산물을 제조하도록 설계하였다. 정방향 프라이머, CBB4K는 HindIII 제한효소 부위, Kozak 번역 개시부 및 VK-10 ARS-A 리더 서열을 도입시킨다. 역방향 프라이머 g2258은 스플라이스 공여 부위와 BamHI 제한효소 부위를 도입시킨다. 제조되는 단편은 pKN100의 HindIII/BamHI 제한효소 부위에 클로닝하였다.
중쇄 키메라 형성용 프라이머
PCR 프라이머 서열과 무관한, 분명한 B-B4 VH 리더 서열을 Kabat 데이타베이스에서 뮤라인 리더 서열과 정렬하였다. B-B4 VK 리더와 가장 근접하게 매치되는 것은 VH17-1A(Sun et al., PNAS, 84 (1987), 214)이었다. 이 리더 서열은 시그널P 알고리즘에 의해 정확하게 절단되는 것으로 추정된다. 프라이머 cBB4Hfor(상기에서 언급됨) 및 g22949 (5'-CGAT-GGGCCCT-TGGTG-GAGGC-TGAGGA-GACGGTG-ACTGA-GGTTCC-3' [서열번호 13]; 제한효소 부위는 밑줄 침)을, VH17-1A 리더, B-B4 VH 영역과, pG4D200 발현 벡터에 클로닝하기 위한 HindIII 및 ApaI 말단 제한효소 부위가 포함된, PCR 산물을 제조하도록 설계하였다. 정방향 프라이머, cBBHFor는 HindIII 제한효소 부위, Kozak 번역 개시부 및 VH17-1A 리더 서열을 도입시킨다. 역방향 프라이머 g22949는감마4 C 영역의 5' 말단과 천연 ApaI 제한효소 부위를 도입시킨다. 제조되는 단편은 pG4D200의 HindIII/ApaI 제한효소 부위에 클로닝하여, 벡터 pG4D200cBB4를 제조하였다.
cBB4 항체 생산
COS 7 세포 바이얼 1개를 녹이고, 10% Fetal clone I 혈청과 항생제가 보충된 DMEM에서 배양하였다. 1주일 후, 세포(0.7 ml, 107 cells/ml)에 pG4D200cBB4 + pKN100cBB4(각각 DNA 10 ㎍)을 전기충격으로 도입하거나, DNA 없이 전기충격을 가하였다. 그런 후, 세포를 8 ml 배양 배지에 도말하여, 4일간 배양하였다. 전기충격은 수차례 반복하였다.
키메라 항체의 검출
샌드위치 ELISA를 사용하여, COD 7 상층액내 항체 농도를 측정하였다. 일시적으로 형질전환된 COS 7 세포에서 약 6956 ng/ml 항체가 분비되었다(데이타 미기재).
cB -B4의 결합 활성
COS 7 배양 상층액의 cB-B4의 결합 활성을 분석하기 위해, Diaclone sCD138 키트, 고상 샌드위치 ELISA를 사용하였다. sCD138에 특이적인 단일클론 항체를 제공되는 마이크로타이터 스트립의 웰에 코팅하였다. 1차 인큐베이션하는 동안에, sCD138 및 바이오틴화된 B-B4 (bio-B-B4) 항체(B-B4 또는 cB-B4)를 비표지 테스트 항체의 연속 희석물과 함께 동시에 인큐베이션하였다.
이 분석에서 bio-B-B4의 농도를, 낮은 농도의 비표지 항체와의 경쟁을 위해, 낮추었다(그렇지 않으면, COS 7 세포 배양 상층물내 cB-B4 농도는 충분한 경쟁을 형성하기에는 매우 낮았다). 이러한 분석의 결과로, 2가지 항체들이 CD138에 동일한 특이성을 가지는 것으로 확인되었다(데이타 미기재).
cB -B4의 정제
키메라 B-B4를, 단백질 A 이뮤노퓨어 플러스 키트(Pierce)를 제조사의 권고에 따라 수행하여 COS 7 세포 상층액으로부터 정제하였다(데이타 미기재).
K D -결정: 비교 nBT062 / BB4
가용성 CD138 의 정제
U-266 세포 배양 상층액으로부터 가용성 CD138 항원을 B-B4와 커플링된 1 ml "HiTrap NHS-활성화된 HP" 컬럼을 이용한 FPLC에 의해 정제하였다. 세포 ㅂ배양 상층액을 PBS 완충액(pH7.0) 중에 컬럼에 주입하고, 이후 CD138 항원 상에서 50 mM 트리에틸아민(pH11)으로 2 mL 분획으로 용출시켰다. 용출된 CD138을 즉시 375 ㎕ 1 M Tris-HCl, pH 3으로 중화하여, 구조 및/또는 기능적 손상을 방지하였다.
CD138 바이오틴화
설포-NHS-LC (Pierce)를 이용하여 CD138을 표지하였다. NHS-활성화된 바이오틴은 pH 7-9에서 라이신 잔기와 같이 1급 아미노기와 효과적으로 반응하여, 안정적인 결합을 형성한다.
CD138의 바이오틴화를 위해, CD138 50 ㎕을 단백질 탈염 스핀 컬럼(Pierce)을 이용하여 탈염하였다. 바이오틴화 시약(EZ-Link Sulfo NHS-LC-Biotin, Pierce)을 빙냉한 탈이온수에 최종 농도 0.5 mg/mL로 용해하였다. 바이오틴화 시약과 포착 용액을 포착 시약 보다 바이오틴화 시약이 12배 몰 높은 비율로 혼합하고(50 pmol CD138 : 600 pmol 바이오틴화 시약), 바이얼을 서서히 흔들면서 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 바이오틴화 시약을 단백질 탈염 컬럼을 이용하여 제거하였다.
bCD138 의 고정
BIACORE 분석에 사용되는 센서칩(SENSOR CHIP SA, BIACORE AB)을, BIACORE 시스템에서 상호작용 분석에서 바이오틴화된 분자에 결합하도록 제작하였다. 표면은, 스트렙타비딘이 미리 고정되어 있는 카르복시메틸화된 덱스트란 매트릭스로 구성되며, 바이오틴화된 리간드의 고-친화성 포착용으로 준비하였다. bCD138의 고정화는, 매뉴얼 주입에 의해 유속 10　㎕/min으로 센서칩 상에서 수행하였다. 칩의 표면에, 50 mM NaOH 중의 1 M NaCl을 1분간 계속 주입하는 과정을 3번 수행하였다.
K D - BIACORE 를 이용항 여러가지 항체들의 결정
BIACORE C의 소프트웨어는, 오직 특정 세팅만 바꿀 수 있는 여러가지 실험들에 대한 미리 정해진 매스크, 이른바 "위저드"를 이용한다. BIACORE C는 본래 농도를 측정하기 위해 개발되었기 때문에, 친화성 측정을 수행하기 위해 설계된 위저드는 없다. 그러나, 적합한 세팅으로, "비특이적 결합" 위저드를 사용하여, 친화성 비율 상수를 측정할 수 있으며, 따라서 이를 KD-수치로 사용하였다. 이 위저드로, 2개의 플로우 셀을 측정하였고, BIACORE 런닝 완충액으로 "재생 1"을 수행함으로써, 해리 상을 90s로 설정하였다. "재생 2"는 실제 재생과 등가로, 10 mM 글리신-HCl pH 2.5로 수행하였다. 이 단계 후, 리간드 CD138을 다시 결합 경쟁적인 상태로 두었다. 전체 과정에서, HBS-EP를 런닝 완충액 및 희석 완충액으로서 사용하였다. 여러가지 항체(~150 kDa)의 CD138 결합을 측정하기 위해, 조합 및 해리를 여러가지 농도(100, 50, 25 12.5, 6.25 및 3.13 nM)에서 분석하였다. 해리 평형 상수는, 비율 상수 ka 및 kd를 계산하여 정하였다. 잠시 후에, 분석물의 KD-수치를 BIAevaluation 소프트웨어로 kd 및 ka 지수로 계산하였다. 결과는 표 4에 나타낸다.
항체 친화성
KD (nM) 평균 KD (nM)
nBT062 1.4
1.4
1.5		 1.4 +/- 0.06
B-B4 1.7
1.7
1.6		 1.6 +/- 0.06
nBT062 - SPDB - DM4 1.9
1.9
1.9		 1.9 +/- 0.00
B-B4- SPP - DM1 2.6
2.7
2.6		 2.6 +/- 0.06
표 4: nBT062 및 B-B4의 KD 수치의 비교 분석. 평균 KD 수치에 대한 표준 편차를 나타내었다.
고찰
각 항체에 대한 평균 KD 수치를 3번의 독립적인 실험들에서 계산하였다. 그 결과, nBT062는 모든 측정 결과들에서 B-B4에 비해 KD 수치가 약간 감소된 것으로 나타났다(평균 KD 수치는 각각 1.4 및 1.6 nM임).
면역접합체의 제조
nBT062 - DM1 및 huC242 - DM1
기존에 Chari (Chari et al., Cancer Res. 1 (1992), 127)에 언급된 바와 같이, 티올-함유성 마이탄시노이드 DM1을 미생물 발효 산물 안사미톡신 P-3으로부터 합성하였다. 인간화 C242 (huC242)의 제조(Roguska et al., PNAS, 91 (1994), 969) 방법은 종래에 개시되어 있다. 항체-약물 접합체를, 종래 방법과 같이 제조하였다(Liu et al., PNAS, 93 (1996), 8618). 항체 분자 당 평균 3.5개의 DM1 분자가 연결되었다.
nBT062 - DM4
BT062는 링커를 통한 이황화 결합을 통해 nBT062 키메라 단일클론 항체에 연결된, 세포독성 마이탄시노이드 약물, DM4로 구성된다. 마이탄시노이드는 튜불린 중합과 마이크로튜블 조합을 조해하는 항-유사 분열 저해제이다(Remillard et al., Science 189 (1977), 1002). BT062 (nBT062-DM4)은 도 1 및 2에 화학적 및 도식적으로 나타낸다.
DM4 합성
DM4는 잘 알려져 있는 유도체 마이탄시놀로부터 제조된다(Kupchan et al., J. Med. Chem., 21 (1978), 31). 마이탄시놀은, 리튬 트리메톡시알루미늄 하이드라이드를 이용한 미생물 발효 산물 안사미톡신 P3의 에스테르 모이어티의 환원적 절단에 의해 제조된다(도 3).
DM4는 디사이클로헥실마르보디이미드(DCC) 및 아연 클로라이드의 존재 하에, N-메틸-N-(4-메틸디티오펜타노일)-L-알라닌(DM4 측쇄)로 마이타니시놀을 활성화하여, 이황화물-함유성 마이탄시노이드 DM4-SMe를 제공함으로써, 합성한다. DM4-SMe는 디티오트레이톨(DTT)로 환원시켜, 원하는 티올-함유성 마이탄시노이드 DM4를 제공한다(DM4 프로세스 플로우 다이어그램은 도 4를 참조함).
면역접합체 BT062
nBT062-DM4의 제조 과정은 도 5에 개략적으로 나타낸다. nBT062 항체는, N-숙신이미딜-4-(2-피리딜디티오)부티레이트(SPDB 링커)로 변형시켜, 디티오피리딜기를 도입한다. DM4를 상기 변형된 항체체와 디티오피리딜기의 당량 보다 높은 농도로 혼합한다. DM4의 티올기와 링커를 통해 항체에 도입된 디티오피리딜기 간의 이황화 교환 반응에 의해 BT062 접합체를 만든다. 크로마토그래피 및 정용여과에 의한 정제를 통해, 저분자량 반응물(DM4)와 반응 산물(티오피리딘), 뿐만 아니라 접합된 항체의 응집물을 제거하여, 벌크 약물 성분을 제조한다.
FACS 분석 및 WST 세포독성 분석
FACS 분석
OPM-2 세포는 CD138을 고도로 발현하는 것으로 나타난 혈장 세포 백혈병 세포주이다. OPM-2 세포를 여러가지 농도(도 6에 기재된 농도)로 nBT062, nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 또는 nBT062-SMCC-DM1과 인큐베이션하였다. 세포를 헹구고, 형광-표지된 2차 항체를 이용한 FACS 분석으로 CD138-결합 항체 또는 접합체를 검출하였다. 이러한 실험에서, 평균 형광 측정값을 항체 농도에 대해 그래프를 그렸다.
세포 생존 분석
CD138+ MOLP-8 세포를 바닥이 평평한 플레이트에 웰당 세포 3000개로 접종하였다. CD138- BJAB 대조군 세포는 웰당 세포 1000개로 접종하였다. 세포에 다양한 농도로(도 7에 기재된 농도) nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 또는 nBT062-SMCC-DM1을 5일간 처리하였다. WST 시약(수용성 테트라졸륨 염, ROCHE)을 첨가하여, 제조사(ROCHE)의 지침에 따라 세포 생존성을 측정하였다. 시약은 MOLP-8 세포에서 7.5시간 인큐베이션하고, BJAB 세포에서는 2시간 인큐베이션하였다. 생존 세포의 분획은, 표준 과정을 이용하여 마이크로플레이트 리더에서 측정되는 광학 밀도를 기초로 계산하였다.
논의
FACS에 의해 nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1, nBT062-SMCC-DM1 또는 nBT062의 결합을 분석하였다. 표적 세포로서 CD138+ OPM-2를 nBT062 또는 면역접합체와 인큐베이션하였고, 세포-결합된 분자를 형광-표지된 2차 항체로 검출하였다. 도 6에서, 세포 결합된 항체의 양의 측정 값으로서의 평균 형광을 여러가지 항체 또는 접합체 농도에 대해 그래프를 그렸다. 그 결과, nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 및 nBT062-SMCC-DM1이 매우 비슷한 결합 특징을 보이는 것으로 나타났다. 또한, 그 결과, 비접합 항체의 결합 특징들은 접합된 독소에 의해 영향을 받지 않는 것으로, 강하게 시사되었다.
세포 생존성 분석에서, CD138+ MOLP-8 표적 세포 및 CD138- BJAB B-림프모구종(lymphoblastoma) 대조군 세포에 대한 항체의 세포독성 활성을 분석하였다. 상기 2종의 세포주 모두 바닥이 평평한 플레이트에 접종하고, 면역접합체를 증가된 농도로 첨가하여 인큐베이션하였다. 비접합 항체를 대조군으로 사용하였다. 세포 생존성을 측정하기 위해, WST 시약을 이용함으로써 면역접합체를 첨가한지 5일째에 세포독성 활성을 분석하였다. 도 7(A)-(C)에서, 비히클 대조군으로 처리한 대조군 세포 대비 생존 세포의 비를 면역접합체 농도 증가에 따라 그래프로 작성하였다. 그 결과, MOLP-8 세포에 대한 nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 및 nBT062-SMCC-DM1의 세포독성 활성은 매우 비슷한 것으로 나타났다. 예상한 것처럼, CD138- BJAB 대조군 세포는 면역접합체에 의해 사멸되지 않았으며, 이는 면역접합체 모두 CD138에 대한 세포 특이적인 결합을 통해 작용함을 의미한다. 경쟁적인 실험에서, MOLP-8 세포를 더 많은 몰량의 비접합 nBT062와 사전 인큐베이션하였다. 사전 인큐베이션은 nBT062-SPDB-DM4의 세포독성을 실질적으로 차단시켜, 세포 표면상에서의 CD138에 대한 특이적인 결합을 통해 면역접합체가 세포를 사멸시킨다는 또다른 증거를 제공해준다(도 7 (D)).
이종이식 마우스 실험
B-B4 항체, nBT062의 인간 키메라 버전의 항체-마이탄시노이드 접합체의 항종양 활성에 대한 CD138 표적화의 중요성을 평가하기 위해, 이종 마우스 실험을 수행하였다. 2가지 버전의 nBT062-마이찬시노이드 접합체를 제조하였으며, 이는 이황화 결합의 화학적 안정성에 차이가 있을 수 있다(nBT062-SPP-DM1 및nBT062-SPDB-DM4). 이들 항체-약물 접합체의 항종양 활성을 B-B4-SPP-DM1 접합체(뮤라인 모 항체 포함), 뿐만 아니라 비접합된 유리형 마이탄시노이드(DM4), 천연 비변형 nBT062 항체 및 비-표적성(무관련) IgG1-마이탄시노이드 접합체의 활성과 비교하였다. 중증 조합 면역결핍(SCID) 마우스의 인간 다발성 골수종 CD138-양성 이종이식 모델(MOLP-8)에서 접합체를 평가하였다.
이들 마우스에서, MOLP-8 세포 현탁물의 접종에 의해 피하 종양을 확립하였다(암컷 CB.17 SCID 마우스). 1회 볼루스 정맥내 주사 처리를, 종양 크기가 평균 113 mm3이 되면 수행하였다. 종양 크기 변화 및 체중 변화를 1주일에 2번 모니터링하였다. 종양 세포를 접종한 후 68일간 실험을 수행하였다.
이종이식 마우스 실험 A
마우스
5주령의 암컷 CB.17 SCID 마우스를 찰스 리버 레보레이토리스에서 입수하였다.
인간 종양 세포주
인간 다발성 골수종 세포주인 MOLP-8을 ATCC로부터 입수하였다. 세포 표면에 CD138을 발현하며, SCID 마우스에서 이종이식 종양을 형성하는, MOLP-8 세포를, 4 mM L-글루타민(Biowhittaker, Walkersville, MD), 10% 소태아 혈청(Hyclone, Logan, Utah) 및 1% 스트렙토마이신/페니실린이 함유된 RPMI-1640 배지 중에, 37℃ 및 5% CO2의 습윤 대기에서 유지시켰다.
파트 I
마우스에서의 종양 증식
각각의 마우스의 우측 어깨 아래의 부분에 1x107 MOLP-8 세포를 피하로 접종하였다. 총 부피는 마우스 당 0.2 ml이고, 이의 혈청 무첨가 배지 : 마트리젤(BD Bioscience, Bedford, MA)의 비율은 1/1 (v/v)이다. 치료하기 전에, 이종이식 종양을 매일 모니터링하고, 확립되게 두었다. 종양 세포를 접종하고 약 11일 후에 종양 크기는 약 113 mm3이 되었다. CB.17 SCID 마우스의 종양 형성율은 100%였다.
종양 세포를 접종한 지 11일째에, 마우스 42마리를 종양 크기와 체중을 기준으로 선택하였다. 종양 크기는 68.2 내지 135.9 mm3이었다. 42마리를 무작위로 종양 크기를 각각 기존으로 6마리로 구성된 7개의 군(A-G)으로 나누었다.
그룹 A의 6마리 각각에는 비히클 대조군으로서 PBS 200 ㎕를 제공하였다. 그룹 B의 각 마우스에는 nBT062 네이키드 항체 13.8 mg/kg을 제공하였다. 이 투여량은 연결된 마이탄시노이드 250 ㎍/kg 중의 nBT062 항체 성분의 양과 동일하다. 접합체에서의 마이탄시노이드 대 nBT062 항체의 분자량 비율은 약 1/55이다. 그룹 C의 각 마우스에는 DM4 250 ㎍/kg을 제공하였다. 그룹 D의 각 마우스에는 huC242-DM4 250 ㎍/kg을 제공하였다. 그룹 E, F 및 G의 각 마우스에는, 각각 nBT062-SPDB-DM4, B-B4-SPP-DM1 및 nBT062-SPP-DM1을 250 ㎍/kg으로 제공하였다.
모든 물질들은 27 게이지 ½인치 바늘이 장착된 1 ml 주사기로 외측 고리 정맥을 통해 1회 볼루스 주사로 정맥내 투여하였다. 투여하기 전에, nBT062 항체, nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1의 스톡 용액을 무균 PBS로 농도 2 mg/ml, 28.1 ㎍/ml 및 28.1 ㎍/ml로 각각 희석하여, 각 마우스에 대한 주사 부피를 120-220 ㎕가 되게 하였다.
파트 II
제2 실험 세트에서, MOLP-8 세포(마우스 당 세포 수1.5x107)를 혈첨 무처첨가 배지 및 마트리겔의 50:50 혼합물에 현탁하고, 이를 우측 어깨 아래 부위에 100 ㎕로 피하 주사하였다. 세포 주사 후, 11일째에 종양 크기는 약 80 mm3가 되었고, 대조군의 평균은 25일째에 약 750 mm3이었다. 종양 크기 배가 시간은 4.58/일로 추산되었다. 대조군(n=6)의 각 마우스에 무균 PBS 0.2 ml를 외측 꼬리 정맥(i.v.)에 볼루스 주사로 투여하였다. 모든 처리 용량은 접합된 마이탄시노이드를 기준으로 하였다. 9가지의 그룹(n=6)에, nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4, 또는 nBT062-SPP-DM1을 각각 450, 250 및 100 ㎍/kg의 용량으로 1회 정맥내 주사로 처리하였다. 다른 그룹(n=6)에는 반복 투여로(5주간 매주) nBT062-SMCC-DM1을 250 ㎍/kg로 투여하였다. 마우스는 LabCat 프로그램을 이용하여 종양 크기로 11개의 그룹(n=6)으로 무작위 분류하였다. 종양 크기는 40.0 내지 152.5 mm3이었다. 마우스의 개별 체중을 기준으로 용량을 정하였다.
종양 크기는 1주일에 2번씩 LabCat 시스템(Tumor Measurement and Tracking, Innovative Programming Associated, Inc., Princeton, NJ)으로 3차원으로 측정하였다. 종양 크기는 Tomayko et al., Cancer Chemother. Pharmacol, 24 (1989), 148에 기술된 방법에 따라 mm3로 계산하였다:
부피 = 길이 x 폭 x 높이 x ½
Bissery et al., Cancer Res., 51 (1991), 4845에 언급된 식으로 Log10 세포 사멸을 계산하였다:
Log 10 세포 사멸 = (T-C) / T d x 3.32
상기 식에서, (T-C) 또는 종양 증식 지연은, 미리 결정된 크기(600 mm3)에 도달하는데 필요한 치료군(T) 및 대조군(C)의 평균 시간(일)이다. Td는 종양 크기 배가 시간이며, 대조군 마우스의 평균 종양 크기를 기준으로 하며, 3.32는 세포 증식 log 당 세포 배가 횟수이다.
결과
각 마우스에서의 종양 증식은 도 8 및 9에 나타낸다. 각 그룹에서의 평균(+/- SD) 종양 증식은 도 10에 나타낸다.
PBS-처리 동물에서의 종양 증식과 비교하여, nBT062 항체 처리, 비접합 유리형 DM4 처리 또는 관련없는 비-표적 접합체 huC242-DM4 처리는 종양 증식에 어떠한 유의한 저해를 나타내지 않았다.
3가지 CD138-표적 접합체들인, nBT062-SPDB-DM4, B-B4-PP-DM1 및 nBT062-SPP-DM1은 모두 투여량 250 ㎍/kg에서 종양 증식을 상당히 지연시켰다. 처리군에서 측정한 평균 종양 크기를 기준으로, DM4 접합체 nBT062-SPDB-DM4가 가장 활성이 높았으며, nBT062-SPP-DM1 접합체는 뮤라인 대응체인 B-B4-SPP-DM1과 비교하여 활성이 약간 높았다(도 10). 개별 마우스로부터 수득한 결과는, 또한, B-B4-SPP-DM1으로 수득한 항종양 활성이 훨씬 더 비균질적이었고, 따라서 nBT062-SPP-DM1 처리한 마우스에서 측정한 것 보다 속성을 단정하기 더 어려웠다. 항종양 활성의 균일성 측면에서는, 표적 항체로서 nBT062를 이용하는 다른 접합체 nBT062-SPDB-DM4가 nBT062-SPP-DM1과 비슷하게 작용하였다.
모든 처리군에서는 체중 감소가 관찰되지 않아, 처리가 잘 허용됨을 나타낸다.
고찰
3가지의 CD138-표적 접합체에 대한 실험 동물 분석 결과를 통해, 항종양 활성에서의 표적화된 전달 중요성이 입증되었다. 인간 키메라 nBT062 및 뮤라인 B-B4 항체의 마이탄시노이드 접합체들은 log 세포 사멸에 의해 측정되는 바와 같이 현저한 활성을 보였지만, 비접합 DM4, 비변형된 천연 huBT062 항체 또는 비-표적화 대조군 접합체(huC242-DM4)는 처리시의 종양 증식에 유의한 효과가 없었다.
인간 키메라 항체 nBT062-SPP-DM1로부터 제조한 면역접합체는, 이것의 뮤라인 대응체인 B-B4-SPP-DM1으로 제조한 접합체 보다 약간 높은 항종양 활성을 나타내었다. 또한, nBT062-SPP-DM1 및 nBT062-SPDB-DM4 처리시 B-B4-SPP-DM1 처리시와 비교하여 개별 마우스에서 보다 균일한 반응들을 나타내었다. B-B4-SPP-DM1의 우수한 결합 편차는, 접종 후 시간(일) 경과에 따른 CB.17 SCID 마우스에서의 MOLP-8 인간 다발성 골수종 이종이식의 평균 종양 크기(+/- SD) 측정에서, 실제 nBT062-SPP-DM1 보다 B-B4-SPP-DM1에서 상대적으로 우수한 결과가 나타난 것을 설명해주었다(데이타 미기재). 표적 항체로서 nBT062를 이용하는 면역접합체의 이러한 특징은 접합체의 치료적 사용에 특히 유익할 것으로 보인다.
마지막으로, SCID 마우스의 MOLP-8 이종이식 모델에 1회 iv 투여한 후, 마이탄시노이드 접합체의 효능이 가장 우수한 것은 nBT062-SPDB-DM4이었다.
방관자 사멸(세포 생존성 분석)
CD138+ OPM2 세포와 CD138- Namalwa 세포를 둥근 바닥 플레이트에 개별 웰이나 또는 공동 배양으로 접종하였다. 세포에, 1x10-8 - 1x10-9 M의 농도로 nBT062-SPDB-DM4를 처리하였다. WST 시약(수용성 테트라졸륨염, ROCHE)을 제조사의 지침(ROCHE)에 따라 사용하여, 생존 세포의 비율을 검출하였다. 세포의 생존율은, 표준 절차에 따라 마이크로플레이트 리더에서 측정한 광학 밀도를 기초로 계산하였다.
고찰
nBT062-SPDB-DM4 처리시 다발성 골수종 세포에 매우 근접해 있는(둥근 바닥 웰에 존재함) 비-표적 세포의 방관자 사멸을, CD138-양성 OPM2 세포를 CD138-음성의 Namawla 세포와 공동 배양하는 시험관내 실험에서 분석하였다(도 13). 일반적으로, CD138-양성 세포는 nBT062-SPDB-DM4에 의해 효과적으로 사멸되지만, CD138-음성 세포는 접합체에 의해 영향을 받지 않는다. 그러나, 둥근 바닥 웰에서의 공동 배양시, nBT062-SPDB-DM4는 항원-양성 세포에 매우 근접해 있는 항원-음성 세포도 사멸시켰다(이를 종종 방관자 사멸이라고 함). Kovtun 등(2006)은, 마이탄시노이드 접합체에 의해 매개되는 방관자 사멸은 단지 항원-양성 세포에 매우 근접한 경우에만 발생한다고 하였다. Kovtun 등(2006)은, 또한, 면역접합체의 링커의 중요성도 논의하였으며, 상기 논문은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다. 생체내에서, 방관자 사멸은, 1) CD138을 비균일하게 발현하는 종양 세포의 박멸, 2) 종양 기질 세포의 사멸에 의한 종양 미세환경의 파괴, 및 3) CD138-음성 nBT062-SPDB-DM4-내성 세포의 선택 방지에 원인이 될 수 있다.
면역접합체의 활성이 종양에서 비균일한 양상으로 발현되는 표적 항원에 의해 영향을 받는다면, 방관자 효과는 특히 중요하다. 이러한 경우라면, 종양의 개개 세포는 전혀 해당 면역접합체에 의한 상기 세포의 효과적인 직접 표적화 및 사멸을 허용하는 양이 아닌 양으로 항원을 발현한다. CD138 -양성 세포와 공동 배양시 CD138-음성 세포에 대한 nBT062-SPDB-DM4의 항종양 효능은, 표적 세포의 존재가, 적합한 조건 하에서, 비-표적 세포에 대한 nBT062-SPDB-DM4의 세포독성 활성에 영향을 미친다는 것을, 명확히 한다.
이종이식 마우스 실험 B
본 실험 세트에서, 85마리의 마우스의 우측 어깨에 MOLP-8 세포(1.5x107 세포/마우스)를 피하 접종하였다. 종양 발생율은 100%였다. 평균 종양 크기 약 80　mm3의 벌키한 MOLP-8 종양을 가지고 있는 66마리의 SCID 마우스를 11개의 치료군(n=6)으로 무작위로 나누었다. 마우스에, 3가지 접합체(nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 또는r nBT062-SPP-DM1) 중 한가지를 1회 투여량으로 철리하였다. 추가 군에는 매주 nBT062-SMCC-DM1을 5회 투여하고, 대조군에는 PBS를 1회 투여하였다. 평균 종양 크기는 도 11A에 나타내었다. 용량 반응을 각 접합체에 대해 확립하였다. PBS 처리 동물의 경우, 25일에 평균 종양 체적은 750 mm3가 되었다. 대조군 종양 증식의 log-선형 플롯 상에서의 베스트-피트 선형 회귀 곡선 피트에 의해 결정된 종양 배가 시간은 4.58일이었다. nBT062-SPDB-DM4 450 ㎍/kg 처리한 동물에서 최대 log 세포 사멸(LCK=2.89)이 확인되었으며, 그 다음은 nBT062-SMCC-DM1을 250 ㎍/kg으로 매우 투여한 동물(LCK=2.1; 표 5)이었다. 두넷의 다중 비교 테스트를 수행한 ANOVA 반복 측정에 의한 처리군들의 평균 종양 증식 곡선 비교를 통해, PBS 대조군과 450 ㎍/kg nBT062-SPDB-DM4 (p<0.01), 250 ㎍/kg nBT062-SPDB-DM4 (p<0.05)와 5주간 매주 250 ㎍/kg으로 투여한 nBT062-SMCC-DM1 (p<0.05) 간에 유의한 차이가 확인되었다. 접종 후 85일 까지 종양의 부분 감소를 나타낸 450 ㎍/kg으로 nBT062-SPDB-DM4를 투여한 동물을 제외하고, 모든 처리군에서 부분 또는 완전한 종양 감소는 없었다.
여러가지 투약 계획으로 여러가지 nBT062-DMx 접합체의 항종양 활성 측정 결과로서 Log 세포 사멸(LCK) 수치. LCK 수치 계산에 대한 정보는 재료 및 방법 섹션을 참조함.
테스트 물질 투여량(㎍/kg) LCK 투약
PBS 1회 투여
nBT062-SMCC-DM1 450 0.85 1회 투여
nBT062-SMCC-DM1 250 0.53 1회 투여
nBT062-SMCC-DM1 100 0 1회 투여
nBT062-SPDB-DM4 450 2.89 1회 투여
nBT062-SPDB-DM4 250 1.05 1회 투여
nBT062-SPDB-DM4 100 0.39 1회 투여
nBT062-SPP-DM1 450 0.8 1회 투여
nBT062-SPP-DM1 250 0.39 1회 투여
nBT062-SPP-DM1 100 0.2 1회 투여
nBT062-SMCC-DM1 250 2.1 5주간 매주 투여
골수 환경에서의 nBT062 - SPDB - DM4 및 nBT062 - SPP - DM1 의 생체내 효과
인간 태아 골 임플란트를 가지고 있는 SCID 마우스의 제조
인간 태아 긴 뼈(인간 태아 골 칩)를 기존에 기술된 바와 같이 CB17 SCID-마우스의 상체에 이식하고(Urashima et al., 1997), 이를 인간 MM 세포의 BM 세포로의 회귀를 위한 마우스 모델로 제공하였다.
치료 요법( SCID - hu / INA -6 마우스)
뼈 이식 후 4주에, 최종 부피 100 ㎕ RPMI-1640 세포 배양 배지 중의 2.5x106개의 INA-6 세포를, 상기 SCID-hu 마우스의 인간 골수강에 직접 주사하였다. INA-6 세포에 의해 분비되는 가용성 인간 IL-6 수용체(shuIL-6R)의 농도 증가를 MM 세포 증식 및 질병 부담에 대한 파라미터로 이용하였다.
INA-6 세포를 주사하고 약 4주 후에 마우스에서 측정가능한 수준의 혈청 shuIL-6R이 확인되었으며, 이때, 꼬리 정맥 주사를 통해 7주간 매주 접합체 0.176 mg 또는 비히클 대조군을 투여하였다. 각 처리 후, 혈액 샘플을 수집하여, 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN)에 의해 shuIL-6R 수준을 측정하였다. 결과는 도 12에 나타낸다.
고찰
인터루킨 6(IL-6)는 다발성 골수종 세포의 증식 및 생존 인자이다. INA-6는 IL-6-의존적인 인간 골수종 세포주이며, 또한 골수 기질 세포(BMSC)의 증식에 필요하다. INA-6 세포주는 가용성 IL-6 수용체(shuIL-6R)를 생산한다. shuIL-6R 농도 증가는 MM 세포 증식 및 질병 부담의 파라미터로서 사용할 수 있다.
따라서, sCID-hu/INA-6 마우스는 이의 정상적인 골수 환경에서 증식하는 다발성 골수종 세포 모델로서 제공된다. 인간 골수와 직접 상호작용하는 상기 모델의 종양 세포는, 종양 세포 증식이 기질 세포의 존재에 의해서 촉진된다는 점에서 환자의 상태와 매우 유사하다. INA-6 세포가 가용성 인간 인터루킨-6 수용체(shuIL-6R)를 분비하기 때문에, 이 단백질의 혈청 농도를 이들 마우스내 종양 세포 하중치로 사용할 수 있다. nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1의 생체내 효능을 이러한 조건에서 테스트하였다.
7주간 매주 nBT062-SPDB-DM4 또는 nBT062-SPP-DM1을 정맥내 투여로 SCIDhu/INA-6 마우스에 처리하면, 대조군 대비 혈청내 shuIL-6R 농도 감소에 의해 검출되는 바와 같이 효과적으로 종양 감소를 유도하므로, 이는, 환자의 실제 상황을 반영하는 인간 골수 환경에서도 접합체가 우수한 효능이 있다는 것을 의미한다(도 12).
nBT062 - SMCC - DM1 , nBT062 - SPDB - DM4 및 nBT062 - SPP - DM1 의 시험관내 및 실험동물에서의 생체내 효능 분석
재료 및 방법
세포 배양
Dex-민감성(MM.1S) 및 내성(MM.1R) 인간 MM 세포주를 스티븐 로젠 박사(Northwestern University, Chicago, IL)로부터 고맙게도 제공받았다. RPMI8226 및 U266 인간 MM 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection) (Manassas, VA)에서 입수하였다. 독소루비신(Dox)-내성(RPMI-Dox40) 및 멜팔란-내성(LR5) 세포는 윌리암 달톤 박사(Lee Moffitt Cancer Center, Tampa, FL)로부터 고맙게도 제공받았다. OPM1 및 OPM2 혈장 세포 백혈병 세포는 에드워드 톰슨 박사(University of Texas Medical Branch, Galveston)로부터 고맙게도 제공받았다.
MM 및 골수(BM) 기질 세포주를, 10% 소태아 혈청, 2 mM L-글루타민(Life Technologies), 100 U/mL 페니실린 및 100 Ag/mL 스트렙토마이신(Life Technologies)이 함유된 둘베코의 이글스 변형 배지 DMEM(Sigma)에서 배양하였다. 건강한 지원자로부터 채혈한 혈액 샘플을, Ficoll Paque 농도구배 처리하여, 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 수득하였다. 헬싱키 선언에 따라 사전 동의를 구하고 다나-파버 암 연구소(Boston, MA)의 임상시험심사위원회로부터 승인받은 다음, BM 샘플로부터 환자-유래의 MM 및 BM 세포를 수득하였다. BM 단핵구 세포를 Ficoll Paque 밀도 침강을 이용하여 분리하고, 혈장 세포를 항-CD138 자기 활성화된 세포 분리 마이크로비드(Miltenyi Biotec Auburn, CA)를 이용한 양성 선별에 의해 정제하였다(>95% CD138+). 종양 세포를, 기존(Hideshima, 2001)에 개시된 바와 같이, RosetteSep 음성 선별 시스템StemCell Technologies , Vancouver , BC, Canada)을 이용하여 MM 환자의 BM으로부터 정제하였다. RosetteSep 항체 칵테일을 골수 샘플에 넣었다. CD138 음성 세포를 적혈구 세포(rosetted)와 RosetteSep 시약을 이용하고 가교한 후, 실온에서 20분간 인큐베이션한 다음 Ficoll 밀도 원심분리에 의해 분리하였다.
증식 저해 및 증식 분석
nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 및 덱사메타손의 MM 세포주, PBMC 및 BMSC의 증식에 대한 증식 저해 효과를, 기존(Hideshima, 2003)에 개시된 바와 같이, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)2,5-디페닐 테트라-소듐 브로마이드(MTT: Chemicon International, Temecula, CA) 염료 대사 측정에 의해 MTT 분석으로 분석하였다.
nBT062 - SMCC - DM1 , nBT062 - SPDB - DM4 및 nBT062 - SPP - DM1 의 BM 에서 MM 세포 증식에 대한 효과
면역접합체에 대한 MM 세포의 민감성에 있어 BM 세포의 증식 자극 효과를 평가하기 위해, MM 세포(2x104 cells/well)를 골수 기질 세포(BMSC, 1x104 cells/well)와 96웰 플레이트(Costar, Cambridge, MA)에서 약물의 존재 또는 부재하에 48시간 공동 배양하였다. [3H]-티미딘(Perkin-Elmer, Boston, MA) 흡수에 의해 DNA 합성을 측정하였다. [3H]-티미딘(0.5 μCi/well)을 실험의 마지막 8시간 동안 첨가하였다. 모든 실험은 4세트로 수행하였다.
세포 사이클 분석
MM 세포(1x106 cells)를 면역접합체의 존재 또는 부재하에 48시간 인큐베이션하고, 포스페이트-완충화된 염수(PBS)로 헹군 다음, 70% 에탄올에 -20℃에서 30분 노출시켜 투과화한 다음, 20 U/mL RNAse A (Roche Diagnostics)가 함유된 0.5 ml PBS 중에 프로피듐 요오드화물(PI)(50 ㎍/mL)과 함께 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. DNA 함량은 유세포 측정기를 이용하여 분석하였다.
면역형광
유리 커버 슬립 상에 배양한 세포를 차가운 무수 아세톤으로 10분간 고정하고, PBS로 헹군 후, PBS 중의 5% FBS로 60분간 블록킹하였다. 그런 후, 슬라이드를 항-CD138 항체(sc12765, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)와 4℃에서 24시간 인큐베이션하였다. 다시 세포를 PBS로 헹구고, 형광 표지된 염소 항-마우스 IgG와 함께 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션한 다음 Nikon E800 형광 현미경을 종래와 같이(Ikeda, 2005; Kiziltepe, 2007) 사용하여 분석하였다.
오토 형광 그린 형광 단백질-양성 ( GFP ) 인간 MM 이종이식 모델 및 인간 MM 이종이식 뮤라인 모델.
OPM1 세포에 그린 형광 단백질(OPM1GFP)을 종래에 알려진 바와 같이(Zufferey, 1998) 렌티바이러스 벡털를 이용하여 형질전환시켰다. 모든 동물 실험은 다나-파버 암 연구소의 동물 윤리 위원회로부터 승인받은 프로토콜에 따라 수행하였다. 마우스의 우측 옆구리에 00 ㎕ RPMI-1640 중의 5x106 OPM1GFP MM 세포를 피하 접종하였다. 종양이 뚜렷해지면, 마우스를 접합체의 분자량 기준으로 마우스 당 176 ㎍으로 외측 꼬리 정맥을 통해 4주간 매주 투여받는 치료군으로 할당하고, 마우스 5마리는 비히클 단독 투여 대조군으로 할당하였다. 이틀에 한번 캘리퍼스로 종양의 수직 직경이 가장 긴 것을 측정하여, 3D 타원형 체적을 구하는 하기 식을 이용하여 종양 체적으로 추산하였다: 4/3 x (너비/ 2)2 x (길이/2). 종양의 크기가 2 cm가 되거나 또는 마우스가 죽어가는 것으로 보이면, 동물을 죽였다. 치료한 첫날부터 죽을 때까지 생존율을 평가하였다. 종양 증식은 치료 첫날부터, 대조군으로 10일이고, BT062-SPDB-DM4 치료군은 21일인 죽을 때까지 캘리퍼스 측정으로 평가하였다. 종양 영역을 피하 적출한 후, Illumatool Bright Light System LT-9900 (Lightools Research, Encinitas, CA)을 이용하여 전신 형광 이미지를 모니터링하였다. 이미지는 캐논 IXY 디지탈 700 카메라로 촬영하였다. 종양 이미지의 생체외(Ex vivo) 분석은 LEICA DFC300 FX 카메라 40u/0.60 (Leica, Heidelberg, Germany)과 연결된 LEICA DM IL 현미경으로 수집하였다.
세포자살 세포의 검출
MM 세포(1x106)를 PBS로 헹구고, 면역접합체의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션하였다. 세포자살 세포를 PE-접합된 Apo 2.7 항체(7A6, Beckman Coulter, Inc.)로 염색하였다. 세포를 Epics 유세포 측정기Beckman Coulter, Inc.)에서 유세포 측정에 의해 RXP Cytomics 소프트웨어로 분석하였다.
웨스턴 블롯팅
MM 세포를 nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM1 또는 BT062-SPP-DM1 존재 또는 부재 하에 배양하고, 회수한 다음 헹군 후, 2 mM Na3VO4, 5 mM NaF, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루라이드, 5 mg/ml 컴플리트 프로테아제 저해제를 함유하는 방사능면역 침강 분석(RIPA) 완충액을 이용하여, 종래에 개시된 바와 같이(Yasui, 2005; Hayashi, 2002) 세포를 용혈시켰다. 전-세포 용혈물(레인 당 20 ㎍)을 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분리시키고, 이를 순수 니트로셀룰로스 막(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)으로 이동시켜, 폴리-ADP (아데노신 디포스페이트)-리보스 중합효소(PARP), 카스파제-8, 카스파제-3, 카스파제-9, AKT, 및 포스포(Ser 473) Akt (세포 시그널링)에 대한 항체 뿐만 아니라 항-투불린 및 항-CD138 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 이용하여 면역블롯팅하였다.
세포 유착 분석
96웰 플레이트에, 1x104 BMSC를 각 웰에 파이펫으로 넣고, 면역접합체 존재 또는 부재 하에 12시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션시, 약물 존재 또는 부재 하에 MM 세포를 BMSC에 제공하였다. 그 후, MM 세포를 PBS로 3번 헹구고, 혈청 무첨가 RPMI 배지에 세포 밀도 2x105 세포로 약물의 존재 또는 부재 하에 100 ㎕에 현탁하였다. 각 샘플군을 3세트 또는 4세트로 진행하였다. 37℃에서 2시간 공동 배양한 후, 플레이트를 뒤집어 유착되지 않는 세포, 약하게 유착된 세포 및 배지를 제거하였다. 그런 후, 웰을 PBS로 3번 헹구었다. 남아있는 유착 세포는 [3H]-티미딘(0.5 μCi/well, Perkin Elmer, Boston, MA, USA) 존재하에 10% FBS가 포함된 RPMI 배지에 추가로 8시간 인큐베이션하여, DNA 합성을 측정하였다.
통계 분석
면역접합체(IC) 처리 대 대조군 배양물에서 관찰되는 차이에 대한 통계적 유의성을 던의 다중 비교 테스트를 이용하여 결정하였다. 최소 유의성은 P < 0.5이었다. 생체내 실험에서, 종양 체적을 던의 다중 비교 테스트의 일원식 분석을 이용하여 비교하였다. 생존성은 카플란-메이어 커브 및 log-랭크 분석으로 평가하였다.
결과
MM 세포주 상의 CD138 발현
다발성 골수종 세포주에서의 CD138 발현 수준은 MM1S, OPM1, OPM2, RPMI8226, DOX40, MM1R, LR5 및 U266 세포의 전세포 용혈물을 이용한 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다(도 14A).
도 14A에서 알 수 있는 바와 같이, MM1S 및 LR5는 CD138을 약하게 발현하였고, Dox40 세포는 CD138 음성이었다. 다른 세포주들은 높은 CD138 발현을 보였다. CD138은 8개의 다발성 골수종 세포주들 중 7개(87.5%)에서 발현되는 것으로 확인되었다.
도 14B는 CD138 특이적인 항체를 이용한 면역형광 염색의 분석 결과를 나타낸다. DOX40 세포(상단 패널) 및 OPM1 세포(하단 패널)의 현미경 분석을 수행하였다. CD138 발현은 좌측에서 나타났고, 핵산은 우측에서 관찰되었다. 도 14B에서, DOX40 세포는 CD138 발현을 거의 검출할 수 없는 수준으로 나타내었다. 반면, OPM1 세포는 우수한 CD138 면역반응성을 나타내었다.
nBT062 - SMCC - DM1 , nBT062 - SPDB - DM4 및 nBT062 - SPP - DM1 은 CD138 양성 세포주에 대해 선택적인 세포 독성을 나타낸다.
CD138 항체 마이탄시노이드 접합체를 또한 세포 생활성 분석으로 테스트하였다. 면역접합체들 nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1을, CD138-양성 세포(OPM1, RPMI8226), CD138를 약하게 발현하는 세포(MM1S) 및 CD138-음성 세포(DOX40)에 대한 세포독성 효능을 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)-기반의 분석을 이용하여 평가하였다. 도 15A는 nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 또는 nBT062-SPP-DM1 각각에서 나타난 OPM1 (■), RPMI8226 (◆), DOX40 (□) 및 MM1S 세포(△)를 도시한다. 세포 생존은 MTT 분석으로 측정하였다. 지정된 인큐베이션 시간(40, 80, 129 시간) 이후의 세포 생활성은 무처리 대조군의 생활성의 %로 나타내었다. nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1을 3 내지 354 ng/ml의 농도로 세포에 처리시, CD138 양성 세포에서 증식 저해를 유도하였다. 이러한 효과는 시간 및 용량 의존적으로 양상으로 발생하였으며, 12시간 후 CD138을 높게 발현하는 2개의 세포주에서 가장 두드러졌다. 동일한 조건에서 CD139 음성 DOX40 세포에 대한 세포독성은 검출할 수 없었다(도 15A). 중요하게도, 3개의 면역접합체들은 111-442 ng/ml 농도에서 48시간의 인큐베이션 후에 측정하여 분석한 바에 따르면, 환자 유래의 음성 선별된 MM 세포에 대해 세포 독성을 나타내었다(도 15B). 도 15C는 세포 생활성을 측정하기 전에 72시간 동안 nBT062-SPDB-DM4와 배양한 3명의 건강한 개체로부터 유래된 PBMC를 나타낸다. 동일한 조건 하에 OPM1 MM 처리시의 세포 생활성은 대조군으로써 나타낸다(■). 도 15C에서 알 수 있는 바와 같이, 면역접합체는 3명의 건강한 지원자로부터 분리된 PBMC(말초 혈액 단핵구 세포)에 대해 세포독성 효과를 유도하지 않았다(도 15C). 이러한 결과는, nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1이 CD138-양성 MM 세포를 선택적으로 사멸시킴을 나타낸다(도에 나타낸 모든 데이타는 3세트의 평균으로 나타내며, 표준 편차는 에러 바로 나타낸).
nBT062 - SMCC - DM1 , nBT062 - SPDB - DM4 및 nBT062 - SPP - DM1 은 OPM1 세포에서 G2/M 세포 주기 정지를 유도한다.
마이탄시노이드는 마이크로튜불의 중합을 억제함으로써 작용하므로, DM1 및 DM4는 종양 세포에서 G2/M 세포 주기 정지를 유도하는 것으로 종래에 확인되었다(Erickson, 2006). 따라서, OPM1 세포의 세포 주기 프로파일을 nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1으로 처리한 후 평가하였다. 세포를 0 내지 72시간 동안 면역접합체와 함께 인큐베이션하고, PI로 표지한 다음 유세포 측정으로 분석하였다. 도 16A는, 0, 12 또는 24 시간 동안 면역접합체를 처리한 OPM1 세포 및 PI 염색에 의한 세포 주기 프로파일의 분석 결과를 나타낸다. 도 16A에서 알 수 있는 바와 같이, 이들 화합물들은 무처리 세포와 비교하여 G2/M 시기의 세포 비율에 현저한 효과를 보였다. nBT062-SPDB-DM4에 OPM1 세포 노출시 다른 2종의 약물을 처리한 세포와 비교하여 좀더 빠르고 강한 반응이 유도되었다.
nBT062 - SPDB - DM4 는 OPM1 세포의 세포자살을 유도한다
다음으로, nBT062-SPDB-DM4가 표적 세포에 세포자살을 유도하는지를 결정하였다. 도 16B는 면역접합체의 존재 또는 부재 하에 24, 48 또는 72 시간 동안 배양한 OPM1 세포를 나타낸다. 세포자살 세포의 비율을 Apo 2.7 항체 염색 및 유세포 분석에 의해 평가하였다. 도 16B에 나타낸 바와 같이, Apo 2.7 항체를 이용한 세포 염색시 면역접합체를 처리한 세포의 세포자살 유도가 확인되었다.
도 16C는 명시된 시간 동안 885 ㎍/ml nBT062-SPDB-DM4의 존재 하에(좌측 패널) 또는 여러가지 농도의 면역접합체(중간 패널)와 함께 배양한 OPM1 세포를 나타낸다. 도면에서, FL은 카스파제 및 PARP의 전장 형태에 해당되는 밴드이고, CL은 절단 산물에 해당되는 밴드이다. 명시된 용량으로 24시간 동안 nBT062-SPDB-DM4를 처리하기 전에, OPM1 세포를 60분간 zVAD-fmk (50 μmol/L)와 미리-인큐베이션하였다. 총 세포 용혈물을 카스파제-3, 카스파제-8, 카스파제-9, PARP 및 튜불린 특이 항체를 이용하여 면역블롯팅하였다. 도 16C에서 알 수 있는 바와 같이, OPM1 세포를 nBT062-SPDB-DM4와 처리하면, 용량 및 시간-의존적인 양상으로 카스파제-3, 카스파제-8, 카스파제-9 및 PARP의 절단이 유도되었다(좌측 및 중간 패널). 판-카스파제(pan-caspase) 저해제 zVAD-fmk는 OPM1 세포에서 nBT062-SPDB-DM4 유발성 카스파제-3, 카스파제-8, 카스파제-9 및 PARP 절단을 차단하였다(도 16C, 우측 패널). 이러한 결과는, nBT062-SPDB-DM4가 카스파제를 활성화하고, 표적 세포에서 세포자살을 유도하는 것으로 나타났다.
nBT062 - SMCC - DM1 , nBT062 - SPDB - DM4 및 nBT062 - SPP - DM1 은 BMSC 의 보호 효과를 저해한다
다발성 골수종 환자에서, 골수 미세환경은 2가지 이상의 상이한 메카니즘을 통해 MM 세포에서 증식, 생존 및 약물 내성을 유도한다: MM 세포의 파이브로넥틴의 유착은 세포 유착-매개 약물 내성(CAM-DR)을 유도하며; 골수 환경에서 인터루킨-6(IL-6) 및 인슐린 유사 성장 인자1(IGF-1)와 같은 사이토카인들은 기존 치료제에 대한 MM 세포 내성을 궁극적으로 매개하는 중요한 시그널링 케스케이드를 유도한다. BMSC 세포와의 공동 배양시 MM 세포에 대한 면역접합체의 세포독성을 IL-6, IGF-1 또는 골수 기질 세포(BMSC)의 존재 하에 분석하였다.
도 17A 내지 17C에서, OPM1 세포를 대조군 배지(검정 막대) 또는 농도를 증가시키면서 nBT062-SPDB-DM4: 55 ng/ml (진회색 막대; *), 111　ng/ml (회색 막대; **), 221 ng/ml (연회색 막대; ***), 442 ng/ml (매우 연한 회색 막대; ****) 885　ng/ml (백색 막대; *****)와 함께 48시간 배양하였다. 도 17D에서, 세포를, 대조군 배지(검정 막대) 또는 농도를 증가시키면서 덱사메타손: 250 nM (회색 막대: +), 500　nM (연회색 막대; ++), 1000 nM (백색 막대; +++)으로 72시간 처리하였다. IL-6을 일부 배양물에 1 또는 10 ng/ml의 농도로 제공하였다(도 17A). IGF-1은 농도 10 또는 50　ng/ml로 사용하였다(도 17B). 이러한 사이토카인들은 면역접합체에 대한 세포 내성을 유도하지 않았다.
면역접합체에 대한 OPM1의 증식 및 내성에 대한 BM 미세환경의 영향을 분석하기 위해, 세포를 전술한 바와 같이 BMSC의 존재 또는 부재 하에 배양하였다.
BMSC의 존재 또는 부재 하의 OPM1 세포의 공동 배양은 도 17의 패널(C) 및 (D)에 나타낸다. 모든 실험들에서, DNA 합성은 배양의 마지막 8시간 동안 [3H]-티미딘 병합을 측정함으로써 확인하였다. BMSC의 OPM1 세포 유착은 [3H]-티미딘 흡수 증가를 촉발하였다. 중요하게는, 면역접합체의 세포독성은 BMSC의 존재에 영향을 받지 않았다(도 17C). 반면에, 대조군으로 포함시킨 덱사메타손은 BMSC 촉발성 보호 효과를 극복할 수 없었다(도 17D).
nBT062 - SPDB - DM4 및 nBT062 - SPP - DM1 은 BMXS 의 MM1 세포 유착을 저해한다
면역접합체가 다발성 골수종 세포의 BMSC 유착을 저해하는지를 분석하였다. 단지 CD138을 적당한 수준으로 발현하고 BT062에 대해 약한 반응성을 보이는, MM1S 세포(도 14A 및 도 15A)를, nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 또는 nBT062-SPP-DM1의 첨가(885 ng/ml) 또는 무첨가 조건으로 2시간 공동 배양하였다. 이러한 처리 후, MM1S 세포를 BMSC와 다시 2시간 공동 배양하였다. 일부 샘플에서, 공동 배양(기질 처리)하기 전 12시간 동안 BMSC에도 면역접합체를 처리하였다(885 ng/ml). PBS로 3번 세정한 후, 유착성 세포를 [3H]-티미딘 흡수에 의해 측정하였다.
도 17E는 면역접합체의 존재 또는 부재 하에 96웰의 바닥이 평평한 플레이트에서 24시간 동안 배양한B MSC를 나타낸다. BMSC를 PBS로 3번 세정하였다. MM1S 세포를 면역접합체와 2시간 인큐베이션한 후, BMSC에 제공하였다. DNA 합성을 [3H]-티미딘 흡수에 의해 측정하였다.
도 17E에 나타낸 바와 같이, nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1은 기질 세포를 막 처리한 샘플과 비교하여, 다발성 골수종 세포의 BMSC 유착을 저해하였다(각각 3.6 배 및 2.5 배). nBT062-SMCC-DM1은 세포 유착에 거의 효과가 없는 것으로 나타났다. 이러한 결과는, nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1이 MM 세포의 BMSC 유착을 방해할 수 있으며, 이들 면역접합ㅊ 역시 세포 유착-매개 약물 내성(CAM-DR)을 해결할 수 있음을, 시사한다.
nBT062 - SPDB - DM4 는 SCID 마우스의 인간 MM 이종이식 모델에서 종양 증식을 저해한다
nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1의 생체내 활성을 GFP-양성 인간 MM 이종이식 SCID 마우스 모델에서 확인하였다.
도 18A는 OPM1GFP 세포에 의한 GFP 발현 분석 결과를 나타낸다. 도에 나타난 바와 같이, OPM1 MM 세포(OPM1GFP)의 고 형광 클론을 확립할 수 있었으며, 실험 동물에서의 이들 세포와 면역접합체의 항종양 활성을 생체내에서 조사하였다. 도 18B에서, 그룹 당 마우스 5마리에 5x106 OPM1GFP 세포를 주사하였다. 마우스에 5x106 OPM1GFP 세포를 100 ㎕ RPMI-1640 매질 중에 피하 접종하였다. nBT062-SPDB-DM4(사각형), nBT062-SPP-DM1(삼각형) 또는 완충액 대조군의 처리를 종양이 확립되면 개시하였다. 종양의 크기는 수직 직경의 직렬 캘리퍼스로 측정하였다. 에러 바는 표준 편차를 나타낸다. 종양 세포를 주사하고 14일 후에 마우스 모두에서 측정가능한 수준의 종양이 생겼고, 이를 무작위로 nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 또는 대조군 비히클(PBS)을 매주 1회 투여하였다. 수직 직경의 직렬 캘리퍼스 측정은 이틀마다 수행하여 종양 체적을 계산하였다. 종양을 가지고 있는 마우스에 nBT062-SPDB-DM4(접합체의 분자량 기준으로 마우스 당 176　㎍, 4주간 매주 1회) 처리하면, PBS 비히클을 처리한 대조군 동물과 비교하여(둔의 다중 비교 테스트; 대조군 비히클 대 nBT062-SPDB-DM4: P<0.01 도 16B), MM 종양 증식을 현저하게 저해하였다.
nBT062-SPP-DM1 접합체는 nBT062-SPDB-DM4 보다 효과가 낮았다(둔의 다중 비교 테스트; nBT062-SPP-DM1 대 BT062-SPDB-DM4: P<0.05 도 5B). 대조군 마우스는 처리 시작한 지 19일 후에 종양 크기가 커서 모두 죽였다. 카플란-메이어 그래프 및 kog-랭크 분석을 이용시, 대조군 코호트의 평균 OS는 13.6일(95% 신뢰 구간 [CI], 10-19 일)이었고, nBT062-SPDB-DM4 처리군은 26일(95% CI, 23-42 일)이었다 (도 5C). 도 18C에서 알 수 있는 바와 같이, 비히클만 처리한 대조군(실선; 정상 염수, n=5)과 비교하여, nBT062-SPDB-DM4(P　<0.0023, 점선, n=5)는 생존율을 크게 증가시켰다. 마우스를 죽이고, nBT062-SPDB-DM4 처리 마우스와 완충액 처리 대조군 마우스로부터 종양을 적출하여 TUNEL 분석을 수행하였다. OPM1GFP-형성된 마우스로부터 적출한 종양의 생체외 분석 결과, BT062-처리 동물에서의 세포자살은 대조군 마우스에 비해 크게 증가된 것으로 확인되었다(도 18D). 따라서, nBT062-SPDB-DM4는 생체내에서 세포자살을 유도한다. 투여된 화합물 어느 것도 본 실험에서 체중에 어떠한 영향을 나타내지 않았다.
고찰
상기에서 nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1의 CD138 발현성 MM 세포에 대한 시험관내 및 실험동물에서의 생체내 선택적인 항종양 활성이 입증되었다. 면역블롯팅 및 면역형광 분석을 이용하여, 분석한 대부분의 MM 세포주가 CD138을 발현하지만, DOX40은 CD138 단백질을 발현하지 않으며, MM1S 및 LR5 세포에서는 이 단백질의 발현이 약하다는 것을 확인하였다. 나머지 5개에서는 높은 CD138 발현이 확인되었다. 면역접합체 nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1은 MM 세포주에 대해 현저한 세포독성을 나타내었으며, 이들 3개 중에서도 nBT062-SPDB-DM4가 가장 우수한 화합물이었다. CD138을 높은 수준으로 발현하는 OPM1 및 RPMI8226 세포는 CD138을 낮게 발현하는 MM1S 세포나 CD138 음성 DOX40 세포 보다 면역접합체에 대해 더 민감하였다. 중요한 점은, 이러한 물질들은 MM을 앓고 있는 환자들로부터 분리된 종양 세포에 대해서도 세포독성을 나타낸다는 것이다. 또한, 중요하게도, 건강한 지원자로부터 분리한 말초 또는 골수 단핵수 세포에 대해서는 세포독성이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는, 면역접합체가 MM 종양 세포에 대한 항원-선택적인 활성을 가짐을 의미한다.
nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 및 nBT062-SPP-DM1이, G2/M 세포 주기 정지를 유도하여 세포자살성 세포 사멸을 유도함으로써 MM 세포의 세포 증식을 저해한다는 것을 입증할 수 있었다. 카스파제-3, -8, -9 및 카스파제-3 하류 표적 PARP의 절단은 면역접합체를 처리한 OPM1 세포에서 검출할 수 있었다. 또한, APO2.7 항원-양성 세포는 이들 물질과 24시간 인큐베이션한 후에 증가되었다.
종래에, IL-6이 PI3-K/Akt, MEK/ERK 및 JAK2/STAT3 시그널링 케스케이드의 활성화를 통해 다발성 골수종 세포의 증식을 촉발시키는 것으로 보고되었다. IGF-1은 또한 동일한 경로를 통해 다발성 골수종 세포의 증식과 생존을 촉진시키는 것으로 개시되어 있다. IL-6은 PI3-K/Akt 시그널링의 유도를 통해 덱사메타손-유도성 세포자살을 보호한다. 외인성 IL-6 및 IGF-1이 다발성 골수종 세포에서 면역접합체-유도성 세포독성을 저해하는지를 평가하였다. 증식 증가는 IL-6 또는 IGF-1로 치료된 세포에서 현저하였지만, 이들 사이토카인은 OPM1 세포에서 nBT062-SPDB-DM4-유도성 세포자살은 저해할 수 없었으며, 이는, 이들 물질이 상기 사이토카인의 보호 작용을 무력화할 수 있음을 시사한다. 중요한 점은, 면역접합체가 BMSC에 유착된 MM1S 세포의 증식과 유착을 저해하는데, 이는, 이것이 세포 유착 매개의 약물 내성(CAM-DR)을 해결할 수 있음을 확인해 준다는 것이다. 실험 동물에서, nBT062-SPDB-DM4는 마우스의 체중에 영향없이 확립된 MM 이종이식체의 유의한 증식 지연을 유도하였다.
테스트한 접합체들 모두 MM 세포주와 환자-유래의 일차 MM 세포에 대해 높은 세포독성 활성을 나타내었지만, 건강한 지원자 유래의 말초 혈액 단핵구 세포에서는 접합체에 대한 민감성이 나타나지 않았다.
CD138 특이적인 면역접합체는 카스파제-8/-9/ 및 -3의 절단 및 카스파제-3 하류 표적 PARP의 절단과 조합된, 표적 세포에서 G2/M 세포 주기 정지를 촉발시키고 세포자살을 유도하였다. 중요한 점은, 인터루킨-6, 인슐린 유사 성장 인자-I 또는 골수 기질 세포의 존재가 면역접합체 매개의 세포독성으로부터 MM 세포를 보호할 수 없었다는 것이다.
nBT062-SPDB-DM4 접합체는 MM 종양 증식을 현저하게 저해하며(p<0.01), 마우스의 생존을 연장시켰다.
본 발명의 방법 및 조성물은 본원에 일부 기술된 다양한 구현예의 형태로 병합될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 당업자에게는, 다른 구현예도 존재할 수 있으며 본 발명의 사상에 포함되는 것은 자명할 것이다. 따라서, 기술된 구현예들은 예시적인 것일 뿐 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다.
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Ala Arg Arg Asp Tyr Tyr Gly Asn Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid sequence (predicted) of light chain of chimeric human/mouse antibody <220> <221> CDR1 <222> (24)..(34) <220> <221> CDR2 <222> (50)..(56) <220> <221> CDR3 <222> (89)..(97) <220> <221> region IgG4 <222> (108)..(214) <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgH primer MHV7 <400> 3 atgggcatca agatggagtc acagacccag g 31 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 constant region primer MHCG1 <400> 4 cagtggatag acagatgggg g 21 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig kappa primer MKV2 <400> 5 atggagacag acacactcct gctatgggtg 30 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig kappa primer MKV4 <400> 6 atgagggccc ctgctcagtt ttttggcttc ttg 33 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ig kappa primer MKV9 <400> 7 atggtatcca cacctcagtt ccttg 25 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer MKC <400> 8 actggatggt gggaagatgg 20 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward (For) primer <400> 9 agagaagctt gccgccacca tgattgcctc tgctcagttc cttggtctcc 50 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer BT03 <400> 10 caacagtata gtaagctccc tcggacgttc ggtgg 35 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer BT04 <400> 11 ccaccgaacg tccgagggag cttactatac tgttg 35 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer g2258 <400> 12 cgcgggatcc actcacgttt gatttccagc ttggtgcctc c 41 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer g22949 <400> 13 cgatgggccc ttggtggagg ctgaggagac ggtgactgag gttcc 45

Claims (19)

  1. 개체의 종양 세포에서 CD138을 발현하는 종양 세포에 대한 기질 세포의 유착을 줄이기 위해 CD138을 발현하는 종양 세포를 표적으로 하는 면역접합체(immunoconjugate)로서, 상기 면역접합체는 작용자(effector) 분자 및 조작된(engineered) 표적 항체를 포함하며, 상기 작용자 분자와 상기 조작된 표적 항체는 절단성 링커(cleavable linker)에 의해 서로 부착되어 있고, 상기 조작된 표적 항체는 서열번호 1의 31번에서 35번(CDR1), 51번에서 68번(CDR2) 및 99번에서 111번(CDR3)의 아미노산 잔기들을 포함하는 중쇄 가변부 및 서열번호 2의 24번에서 34번(CDR1), 50번에서 56번(CDR2), 89번에서 97번(CDR3)의 아미노산 잔기들을 포함하는 경쇄 가변부를 포함하고,
    추가적인 세포독성 물질이 종양 세포의 증식을 저해, 지연 또는 예방하는 양으로 상기 종양 세포에 투여되고,
    상기 면역접합체와 상기 추가적인 세포 독성 물질은 연속하여 투여되며,
    상기 추가적인 세포독성 물질은 상기 면역접합체의 투여 후에 투여되는, 면역접합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 절단성 링커는 이황화 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 절단성 링커는 SPP 또는 SPDB인 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유착은 10% 이상 감소하는 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    유착이 줄어듦에 따라 유착 매개성 약물 내성이 완화되는 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 추가적인 세포독성 물질에 대한 유착 매개 약물 내성이 감소하는 것을 특징으로 하는 면역접합체.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 추가적인 세포독성 물질이 멜팔란(melphalan), 빈크리스틴(vincristine), 독소루비신(doxorubicin), 덱사메타손(dexamethasone), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 에토포시드(etoposide), 시타라빈(cytarabine), 시스플라틴(cisplatin), 프레드니손(prednisone), 탈리도미이드(thalidomide), 보르테조밉(bortezomib), 레날리도미드(lenalidomide), 소라페닙(sorafenib), 로미뎁신(romidepsin) 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 추가적인 세포독성 물질이 항체를 기반으로 하는 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 작용자 분자가 입체적으로 방해를 받는 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 작용자 분자는 1종 이상의 마이탄시노이드, 탁산 또는 CC1065 또는 이들의 유사체인 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 작용자 분자가 DM1, DM3, 또는 DM4와 같은 1종 이상의 마이탄시노이드인 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 작용자 분자가 DM4인 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역접합체의 상기 조작된 표적 항체가 면역글로불린 중쇄의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 면역글로불린 중쇄는 서열번호 1과 98% 이상의 서열 동일성을 가지는 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 표적 항체가 서열번호 1의 면역글로불린 중쇄 서열 및 서열번호 2의 면역글로불린 경쇄 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  15. 개체의 종양 세포에서 CD138을 발현하는 종양 세포에 대한 기질 세포의 유착을 줄이기 위해 CD138을 발현하는 종양 세포를 표적으로 하는 면역접합체로서,
    상기 면역접합체는 작용자 분자 및 조작된 표적 항체를 포함하며,
    상기 작용자 분자와 상기 조작된 표적 항체는 절단성 링커에 의해 서로 부착되어 있고,
    상기 조작된 표적 항체는 서열번호 1을 가지는 면역글로불린 중쇄 서열 및 서열번호 2를 가지는 경쇄 서열을 포함하고, 상기 작용자 분자는 DM4이고 상기 링커는 SPDB이며,
    추가적인 세포독성 물질이 종양 세포의 증식을 저해, 지연 또는 예방하는 양으로 상기 종양 세포에 투여되고,
    상기 면역접합체와 상기 세포 독성 물질은 연속적으로 투여되며,
    상기 세포독성 물질은 상기 면역접합체의 투여 후에 투여되는, 면역접합체.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 추가적인 세포독성 물질이 멜팔란(melphalan), 빈크리스틴(vincristine), 독소루비신(doxorubicin), 덱사메타손(dexamethasone), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 에토포시드(etoposide), 시타라빈(cytarabine), 시스플라틴(cisplatin), 프레드니손(prednisone), 탈리도미이드(thalidomide), 보르테조밉(bortezomib), 레날리도미드(lenalidomide), 소라페닙(sorafenib), 로미뎁신(romidepsin) 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  17. 제1항 내지 제3항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체가, 다발성 골수종, 난소암, 신장암, 담낭암, 유방암, 전립선암, 폐암, 대장암, 호지킨 및 비호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병(CLL), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수모구성 백혈병(AML), 고형 조직 육종 또는 대장암 중 어느 하나를 앓고 있는 암 환자인 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 암 환자가 다발성 골수종을 앓고 있는 것을 특징으로 하는, 면역접합체.
  19. 제1항 내지 제3항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역접합체 및 상기 추가적인 세포독성 물질의 투여 사이의 시간 간격은 12시간 내지 6일인, 면역접합체.
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