JP2011508738A - Cd138発現腫瘍細胞のターゲティングを向上させる方法及び剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】CD138発現腫瘍細胞への間質細胞の接着を、それを必要としている被験体の腫瘍細胞において減少させる方法であって、前記腫瘍細胞に、前記CD138発現腫瘍細胞を標的とする免疫複合体を、CD138発現腫瘍細胞への間質細胞の接着を減少させるのに有効な量接種する工程と、任意的に、前記腫瘍細胞に、更なる細胞傷害性剤を、腫瘍細胞の増殖の阻害、遅延、及び防止の少なくともいずれかを行う量接種する工程と、を含む方法である。この接着減少により、腫瘍細胞は、免疫複合体だけでなく、他の剤、特に細胞傷害性剤に対する感受性も強くなる。
【選択図】なし
Description
前記腫瘍細胞に、前記CD138発現腫瘍細胞を標的とする免疫複合体、具体的には、本明細書に開示する切断可能なリンカー及びエフェクタを含む免疫複合体を、CD138発現腫瘍細胞への間質細胞の接着を減少させるのに有効な量接種する工程と、
任意的に、腫瘍細胞に、更なる細胞傷害性剤を、腫瘍細胞の増殖の阻害、遅延、及び防止のいずれかを行う量接種する工程と、
を含む方法に関する。
接着は、腫瘍細胞の増殖の阻害、遅延、及び防止の少なくともいずれかを行う量接種される、更なる細胞傷害性剤(即ち、上記免疫複合体の1種ではない)に対する接着媒介性薬剤耐性を含む、接着媒介性薬剤耐性の軽減をもたらすことができる、
の少なくともいずれかである。従って、免疫複合体及びこの細胞傷害性剤(1及び複数のいずれか)は連続して接種することができ、ここで細胞傷害性剤の接種は、免疫複合体の接種後であってもよく、免疫複合体との同時接種であってもよい。
(a)改変された標的抗体、及び
(b)エフェクタ分子
を含み、
均一にCD138発現標的細胞を標的とする免疫複合体に関する。
(i)CD138に対する非ヒト抗体の抗原結合領域(ABR)から本質的に成っていてもよい抗体、
(ii)CD138に対する非ヒト抗体の抗原結合領域(ABR)と、少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域とを含んでいてもよい抗体。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基99〜111を含む重鎖可変領域CDR3、及び
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基89〜97を含む軽鎖可変領域CDR3
を含んでいてもよい。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基31〜35を含む重鎖可変領域CDR1、及び配列番号1で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基51〜68を含む重鎖可変領域CDR2、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基24〜34を含む軽鎖可変領域CDR1、及び配列番号2で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基50〜56を含む軽鎖可変領域CDR2。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基123〜448、及び
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基108〜214、の少なくともいずれかと、
以下の(i)及び(ii)の少なくともいずれかの突然変異を含んでいてもよい、
(i)改変された標的抗体の抗体依存性細胞傷害性及び補体依存性細胞傷害性の少なくともいずれかを、維持させる或いは低下させる突然変異、
(ii)改変された標的抗体を安定化させる突然変異。
CD138を標的とする標的剤が、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを含み、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列が配列番号1で表されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有する、免疫複合体に関する。免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかの定常領域は、IgG4アイソタイプ定常領域であってもよい。
本明細書で特定する1以上の免疫複合体を提供する工程と、
多発性骨髄腫を治療するのに有効な量の免疫複合体を被験体に投与する工程と、
を含む方法に関する。
本明細書で特定する1以上の免疫複合体を提供する工程と、
治療に有効な量の免疫複合体を接種する工程であって、IgG4アイソタイプが、ADCC、補体依存性細胞傷害性、及び肝FcRのFc−媒介性標的の少なくともいずれかを緩和する工程と、
を含む、免疫複合体媒介薬物送達方法に関する。
腫瘍細胞の増殖の阻害、遅延、及び防止の少なくともいずれかに有効な量の本明細書で特定する1以上の免疫複合体を細胞培養物に接種する工程を含む方法に関する。有効な量により、CD138発現腫瘍細胞と、任意的にCD138を発現していない補助細胞、特に腫瘍間質細胞における、細胞死及び連続細胞周期停止のいずれかが誘導され得る。細胞培養物中の細胞は、癌患者から得ることができ、有効な量の免疫複合体の接種後、細胞培養物の細胞を、癌患者に再移植してもよい。
腫瘍の増殖及び腫瘍細胞の伝播の少なくともいずれかを阻害する或いは低減する量の、上記で特定した少なくとも1以上の免疫複合体を患者に投与する工程を含み、
免疫複合体が、腫瘍細胞の増殖及び伝播の少なくともいずれかの阻害、遅延、及び防止のいずれかを行う方法に関する。
(a)腫瘍量を減少させるのに有効な量の、1以上の細胞傷害性剤及び放射線の少なくともいずれかを患者に投与する工程と、
(b)腫瘍の増殖及び腫瘍細胞の伝播の少なくともいずれかの阻害、遅延、及び防止のいずれかを行う量の、本明細書で特定した免疫複合体の少なくとも1種を患者に投与する工程と、
を含む、
免疫複合体が、CD138発現細胞を含む腫瘍細胞の増殖及び伝播の少なくともいずれかの阻害、遅延、及び防止のいずれかを行う方法に関する。
(a)本明細書で特定する免疫複合体の少なくともいずれか1種を提供する工程と、
(b)被験体に免疫複合体を投与して、被験体の骨髄腫細胞の生存及び増殖のいずれかを選択的に減少させる工程と、
を含む方法に関する。
(a)免疫複合体を提供する工程であって、CD138に対する改変された標的抗体が切断可能なリンカーを介してエフェクタ分子に結合し、エフェクタ分子に対する立体障害がある工程と、
(b)腫瘍の増殖及び腫瘍細胞の伝播の少なくともいずれかの阻害、遅延、及び防止のいずれかを行う量の、(a)の免疫複合体を被験体に投与する工程であって、(a)の免疫複合体が、立体障害のない相当物の腫瘍増殖阻害活性を約10%、約20%、約30%、約40%、それ以上、上回る、腫瘍増殖阻害活性を提供する工程と、
を含む方法に関する。
(a)以下の(i)及び(ii)のいずれかである改変された標的抗体と、
(i)CD138に対する非ヒト抗体の抗原結合領域から本質的に成る抗体、
(ii)CD138に対する非ヒト抗体の抗原結合領域と、少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域とを含む抗体、
(b)エフェクタ分子と、を含み、
免疫複合体がCD138に均一に結合する
免疫複合体を提供する。
CD138を標的とする標的剤が、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを含み、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列が配列番号1で表されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有する、免疫複合体を提供する。
(a)以下の(i)及び(ii)のいずれかである改変された標的抗体と、
(i)CD138に対する非ヒト抗体の抗原結合領域から本質的に成る抗体、
(ii)CD138に対する非ヒト抗体の抗原結合領域と、少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域とを含む抗体、
(b)エフェクタ分子と、
を含む免疫複合体によって、細胞培養物中で治療されており、
免疫複合体がCD138に均一に結合する、
腫瘍細胞を提供する。
CD138を標的とする標的剤が、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを含み、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列が配列番号1で表されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有する、免疫複合体によって、細胞培養物中で治療されている腫瘍細胞を提供する。
(a)以下の(i)及び(ii)のいずれかである改変された標的抗体と、
(i)CD138に対する非ヒト抗体の抗原結合領域から本質的に成る抗体、
(ii)CD138に対する非ヒト抗体の抗原結合領域と、少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域とを含む抗体、
(b)エフェクタ分子と、を含み、
免疫複合体がCD138に均一に結合する
免疫複合体を提供する。
CD138を標的とする標的剤が、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを含み、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列が配列番号1で表されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有する、免疫複合体を提供する。
(a)以下の(i)及び(ii)のいずれかである改変された標的抗体と、
(i)CD138に対する非ヒト抗体の抗原結合領域から本質的に成る抗体、
(ii)CD138に対する非ヒト抗体の抗原結合領域と、少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域とを含む抗体、
(b)エフェクタ分子と、を含み、
免疫複合体がCD138に均一に結合し、
1以上の癌用薬物が腫瘍量を減少させることができる薬品を提供する。
CD138を標的とする標的剤が、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを含み、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列が配列番号1で表されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有し、
1以上の癌用薬物が、腫瘍量を減少させることができる薬品を提供する。
(a)以下の(i)及び(ii)のいずれかである改変された標的抗体と、
(i)CD138に対する非ヒト抗体の抗原結合領域から本質的に成る抗体、
(ii)CD138に対する非ヒト抗体の抗原結合領域と、少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域とを含む抗体、
(b)エフェクタ分子と、を含み、
免疫複合体がCD138に均一に結合し、
薬品が、放射線で処理された患者に投与して腫瘍量を減少させるためのものである使用を提供する。
CD138を標的とする標的剤が、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを含み、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列が配列番号1で表されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有し、
薬品が、放射線で処理された患者に投与して腫瘍量を減少させるためのものである使用を提供する。
(a)以下の(i)及び(ii)のいずれかである改変された標的抗体と、
(i)CD138に対する非ヒト抗体の抗原結合領域から本質的に成る抗体、
(ii)CD138に対する非ヒト抗体の抗原結合領域と、少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域とを含む抗体、
(b)エフェクタ分子と、を含み、
免疫複合体がCD138に均一に結合する、免疫複合体を提供する。
CD138を標的とする標的剤が、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを含み、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列が配列番号1で表されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有する、免疫複合体を提供する。
ターゲティング変動[%]=Ts−Tf/Tm×100
丸括弧内の(K)は、配列番号1の一部ではない。
腫瘍増殖阻害活性=100×(TGDnBT062−DM1/TGDBT062)、
より一般的には、
腫瘍増殖阻害活性=100×(TGDサンプル/TGDリファレンス)。
(*)処理群が所定の大きさ(160mm3)に達する平均時間(日)から、対照群がこの所定の大きさに達する平均時間を引いたときの、腫瘍増殖遅延(TGD)(日)
(**)腫瘍増殖阻害活性=100×(TGDサンプル/TGDBT062)。BT062の活性を100%であると定義する。
キメラ抗体の構築(cB−B4:nBT062)
B−B4
既に特性評価されているマウス抗体B−B4(Wijdenes et al.,Br J Haematol.,94(1996),318)を、これらの実験で用いた。
J.Sambrook;Molecular Cloning,A Laboratory Manual;2nd Ed.(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press,USAなどのテキストブックに詳述されているように、或いはキットを用いる場合は製造業者の取扱説明書により推奨されているように、標準的な組み換えDNA技術を実施した。マウス可変領域のPCR−クローニング及び修飾は、標準的なPCR法を用いて実施した。用いたプライマーはそれぞれの結果のセクションに示した。
10%のFCS、580μg/mLのL−グルタミン、50ユニット/mLのペニシリン、及び50μg/mLのストレプトマイシンを添加したDMEM中で培養した、対数増殖期のCOS細胞を、トリプシン処理により回収し、遠心分離して、PBSで洗浄した。最終濃度が1×107細胞/mLになるように、細胞をPBSに再懸濁した。700μLのCOS細胞懸濁液を、Gene Pulserキュベットに移し、重鎖及びカッパ軽鎖発現ベクターDNA(それぞれ10μg、及び13μgのいずれかのSupervector)と混合した。Bio−Rad Gene Pulserを用いて、1900V、25μFで細胞を電気穿孔処理した。形質転換された細胞を、10%のガンマグロブリン遊離FBS、580μg/mLのL−グルタミン、50ユニット/mLのペニシリン、及び50μg/mLのストレプトマイシンを添加したDMEM中で72時間培養し、その後、抗体含有細胞培養上清を回収した。
96ウェルプレートを、PBSで希釈した0.4μg/mLのヤギ抗ヒトIgG抗体の100μLのアリコートでコーティングした(4℃、一晩)。プレートを、200μL/ウェルの洗浄緩衝液(PBS+0.1%のTween−20)で3回洗浄した。ウェルを、0.2%BSA−PBS溶液、0.02%Tween−20−PBS溶液でブロッキングして、その後分泌された抗体を含有する200μLの細胞培養上清(37℃で1時間インキュベート)を添加した。ウェルを、洗浄バッファーで6回洗浄し、その後ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖ペルオキシダ−ゼ複合体と結合した抗体を検出した。
製造業者の推奨に従って、Protein A ImmunoPure Plus kit(Pierce,Rockford,IL)を用いて、形質転換されたCOS7細胞の上清から、cB−B4抗体を精製した。
B−B4及びcB−B4のCD138への結合活性の分析を、Diaclone(Besancon,France)sCD138 kitを用いて、製造業者の推奨に従って、結果のセクションに記載した変化を考慮して実施した。
ハイブリドーマB−B4細胞を増殖させ、Qiagen Midi kit(Hilden,Germany)を用いて処理して、製造業者のプロトコルに従ってRNAを単離した。約5μgのB−B4 RNAを逆転写させて、Amersham Biosciences(Piscataway,NJ)1st strand synthesis kitを用いて、製造業者のプロトコルに従ってB−B4 cDNAを作製した。
免疫グロブリン重鎖(IgH)cDNAを、IgHプライマーMHV7(5’−ATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGACCCAGG−3’)(配列番号3)、及びIgG1定常領域プライマーMHCG1(5’−CAGTGGATAGACAGATGGGGG−3’)(配列番号4)を用いて、PCRにより増幅した。同様に、免疫グロブリン軽鎖(IgL)を、それぞれプライマーMKC(5’−ACTGGATGGTGGGAAGATGG−3’)(配列番号8)と組み合わせた、3種の異なるIgKプライマーMKV2(5’−ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTG−3’)(配列番号5)、MKV4(5’−ATGAGGGCCCCTGCTCAGTTTTTTGGCTTCTTG−3’)(配列番号6)、及びMKV9(5’−ATGGTATCCACACCTCAGTTCCTTG−3’)(配列番号7)を用いて増幅した。全ての増幅産物を、製造業者の取扱説明書に従って、TOPO−TA cloning kit(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用いて、pCR2.1−TOPOベクターと直接ライゲーションした。
ライゲーションしたpCR2.1ベクターのコンストラクトで形質転換したE.coli TOP10 bacteria(Invitrogen)を、LB−アンピシリン−Xgal寒天プレート上で選択した。少量の培養物に単一白色コロニーを接種し、一晩増殖させ、QIAprep Spin Miniprep kitを用いて、製造業者の取扱説明書に従って、プラスミドを単離した。
BigDye Termination v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(ABI,Foster City,CA)を用いて、プラスミドの配列を決定した。選択された各プラスミドを、1210及び1233プライマーを用いて、GeneAmp9600PCR装置で増幅させ(cycle)両方向に配列決定した。電気泳動配列分析を、ABIキャピラリシーケンサで行った。
RT−PCRの完全サイクル、クローニング、及びDNA配列分析を繰り返して、各免疫グロブリン鎖について、完全に独立な3つの配列情報のセットを得た。
1st strand synthesisを3つの独立な反応で実施した。プライマーMKC及びMKV2(上記配列)を用いて作製したRCP産物を、製造業者の取扱説明書に従ってpCR2.1−TOPOベクターにライゲーションした。RT−PCR反応のそれぞれの独立なセットから得られたクローンを、両方向に配列決定した。MKV−2プライマーを用いた産物の配列は、MOPC−21、SP2、及びAg8のような骨髄腫融合パートナーを起源とする無菌カッパ転写産物に非常に類似していたため((Carroll et al.,Mol Immunol.,25(1988),991;Cabilly et al.,Gene,40(1985);157)、無視した。
MKV4及びMKV9プライマーと共にMKCを用いたPCR産物は、互いに類似しており、リーダー配列プライマー内のゆらぎ(wobble)の位置のみが異なっていた。
1st strand合成を3つの独立な反応において実施し、PCR産物を各1st strand産物からクローニング及び配列決定した。5つのクローンを各1st strandから配列決定した。
キメラ発現ベクターの構築は、VH及びVKに、BamHI制限酵素部位及びKozak配列が先行する、好適なリーダー配列を付加することを必要とする。Kozak共通配列は、可変領域配列の効率的翻訳にとって極めて重要である。Kozak共通配列は、そこからリボソームが翻訳を開始することができる正確なAUGコドンを規定し、1つの最も重要な塩基は、AUG開始の上流、−3の位置にあるアデニン(或いはそれ程好ましくはないが、グアニン)である。リーダー配列は、Kabatデータベースにおいて最も類似する配列として選択される(Kabat et al.,NIH National Technical Information Service,1991)。これらの付加は、フォワード(For)プライマー内にコードされる(両方、配列5’−AGAGAAGCTTGCCGCCACCATGATTGCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCC−3’(配列番号9)を有する;制限酵素部位には下線をひき、GCCGCCACCはKozak配列である)。更に、キメラ発現ベクターの構築は、B−B4のJ領域の3’末端に隣接する、天然ApaI制限酵素部位に至るまで、ヒトガンマ1定常領域の5’断片を導入し、軽鎖には、スプライス供与部位及びHindIII部位を付加することを必要とする。スプライス供与部位は、可変領域配列を、適切な定常領域へ正確にインフレームで結合させ、V:Cイントロンを切り出すのに重要である。カッパイントロン+CKは、B−B4のVK配列の下流の発現コンストラクトにコードされる。同様に、ガンマ−4 CHは、B−B4 VH配列の下流の発現コンストラクトにコードされる。
B−B4 VH及びVK遺伝子を先ず注意深く分析して、不所望のスプライス供与部位、スプライス受容部位、Kozak配列、並びにその後機能的全抗体のサブクローニング及び発現の少なくともいずれかに干渉する、任意の余分なサブクローニング制限酵素部位の存在を全て同定した。アミノ酸配列を変化させることなくPCRを介して部位特異的突然変異誘発により除去する必要があった、不所望なHindIII部位がVK配列中に見出された。この反応では、オリゴヌクレオチドプライマーBT03(5’−CAACAGTATAGTAAGCTCCCTCGGACGTTCGGTGG−3’)(配列番号10)及びBT04(5’−CCACCGAACGTCCGAGGGAGCTTACTATACTGTTG−3’)(配列番号11)を用いて、Stratagene(La Jolla,CA)Quickchange Mutagenesis Kitのプロトコルに従って突然変異誘発を実施した。
非多義性B−B4 VKリーダー配列(PCRプライマー配列とは独立)を、Kabatデータベースにおけるマウスリーダー配列と整列させた。B−B4 VHリーダー配列に最もよく一致していたのは、VK−10 ARS−Aであった(Sanz et al.,PNAS,84(1987),1085)。このリーダー配列は、SignalPアルゴリズムにより正確に切断されることが予測される(Nielsen et al.,Protein Eng,10(1997);1)。pKN100発現ベクターにクローニングするために、プライマーCBB4Kfor(上記参照)及びg2258(5’−CGCGGGATCCACTCACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC−3’(配列番号12);制限酵素部位に下線を引く)を設計して、この完全リーダー、B−B4 VK領域、並びにHindIII及びBamHI末端制限酵素部位を含むPCR産物を作製した。フォワードプライマーCBB4Kは、HindIII制限酵素部位、Kozak翻訳開始部位、及びVK−10 ARS−Aリーダー配列を導入する。リバースプライマーg2258は、スプライス供与部位、及びBamHI制限酵素部位を導入する。得られた断片を、pKN100のHindIII/BamHI制限酵素部位にクローニングした。
非多義性B−B4 VHリーダー配列(PCRプライマー配列とは独立)を、Kabatデータベースにおけるマウスリーダー配列と整列させた。B−B4 VKリーダーに最もよく一致したのは、VH17−1A(Sun et al.,PNAS,84(1987),214)であった。このリーダー配列は、SignalPアルゴリズムにより正確に切断されことが予測される。pG4D200発現ベクターにクローニングするために、プライマーcBB4Hfor(上記参照)及びg22949(5’−CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC−3’(配列番号13);制限酵素部位に下線を引く)を設計して、VH17−1Aリーダー、B−B4のVH領域、並びに末端HindIII及びApaI制限酵素部位を含むPCR産物を作製した。フォワードプライマーCBBHForは、HindIII制限酵素部位、Kozak翻訳開始部位、及びVK−17 1Aリーダー配列を導入する。リバースプライマーg22949は、ガンマ4 C領域の5’末端、及び天然ApaI制限酵素部位を導入する。得られた断片を、pG4D200のHindIII/ApaI制限酵素部位にクローニングし、ベクターpG4D200cBB4を得た。
バイアル瓶1本分のCOS7細胞を解凍し、抗生物質を含む10%の胎児クローンI血清を添加したDMEM中で増殖させた。1週間後、細胞(107細胞/mLで0.7mL)を、pG4D200cBB4+pKN100cBB4(それぞれ10μgのDNA)を用いて、或いはDNAを用いずに電気穿孔処理した。細胞を4日間8mLの増殖培地にプレーティングした。電気穿孔処理を7回繰り返した。
サンドイッチELISAを用いて、COS7上清中の抗体濃度を測定した。一過性に形質転換されたCOS7細胞は、約6,956ng/mLの抗体を分泌した(データは示さず)。
COS7培養上清におけるcB−B4の結合活性を検定するために、Diaclone sCD138キットを用いた(固相サンドイッチELISA)。sCD138に特異的なモノクローナル抗体で、提供されたマイクロタイターストリップのウェルをコーティングした。最初のインキュベート中、sCD138及びビオチン化B−B4(bio−B−B4)抗体を、非標識試験抗体(B−B4及びcB−B4のいずれか)の希釈系列と共に同時にインキュベートした。
低濃度の非標識抗体と競合させるために、この検定におけるbio−B−B4の濃度を低下させた(さもなければ、COS7細胞培養上清におけるcB−B4の濃度は、十分な競合を得るには低過ぎた)。この検定の結果から、両方の抗体がCD138に対して同一の特異性を有することが明らかになる(データは示さず)。
キメラB−B4を、製造業者の推奨に従って、Protein A ImmunoPure Plus kit(Pierce)を用いて、COS7細胞上清から精製した(データは示さず)。
KD−決定:比較 nBT062/BB4
U−266細胞培養上清由来の可溶性CD138抗原を、B−B4にカップリングした1mLの「HiTrap NHS−活性化HP」カラムを用いて、FPLCにより精製した。細胞培養上清を、カラム上のPBS緩衝液(pH7.4)にロードし、その後CD138抗原を、50mMのトリエチルアミン(pH11)で、2mLの画分に溶出させた。溶出したCD138を、375μLの1M Tris−HCl(pH3)で直ちに中和して、構造的損傷及び機能的損傷の少なくともいずれかを防いだ。
スルホ−NHS−LC(Pierce)を用いて、CD138を標識した。NHS−活性化ビオチンは、pH7〜9の緩衝液中で、リジン残基のような一級アミノ基と効率よく反応して、安定なアミド結合を形成する。
CD138のビオチン化では、50μLのCD138を、タンパク質脱塩スピンカラム(Pierce)を用いて脱塩した。ビオチン化試薬(EZ−Link Sulfo NHS−LC−Biotin,Pierce)を、最終濃度が0.5mg/mLになるように氷冷した脱イオン水に溶解させた。捕捉試薬に比べて、12倍モル過剰であるビオチン化試薬を有する(50pmolのCD138に対して600pmolのビオチン化試薬)、ビオチン化試薬及び捕捉試薬溶液を混合し、バイアル瓶を穏やかに振盪しながら、室温で1時間インキュベートした。非結合ビオチン化試薬を、タンパク質脱塩カラムを用いて除去した。
BIACORE検定で用いるセンサチップ(SENSOR CHIP SA、BIACORE AB)を、BIACOREシステムにおける相互作用分析のためにビオチン化分子に結合するよう設計した。表面は、ストレプトアビジンで予め固定化されたカルボキシメチル化デキストランマトリックスから成り、ビオチン化リガンドの高親和性捕捉の準備が整っている。手動注入により、10μL/分の流速を用いて、SENSOR CHIP SA上で、bCD138の固定化を実施した。50mMのNaOH中の1MのNaClを、3回連続して1分間注入することにより、チップ表面を調整した。次いで、ビオチン化CD138を1分間注入した。
BIACORE Cのソフトウェアは、異なる実験に対して、ある設計のみを変化させることができる、予め規定されたマスク、いわゆる「ウィザード」を用いる。BIACORE Cは、元々濃度を測定するために開発されたため、親和性測定を実行するよう設計されたウィザードが存在しない。しかしながら、適切な設定を行えば、「非特異的結合」のためのウィザードを用いて、親和性速度定数を測定することができたため、KD−決定に用いた。このウィザードでは、BIACOREランニング緩衝液を用いて「再生(Regeneration)1」を実施することにより、2つのフローセルを測定し、解離相を90秒に設定した。真の再生に相当する「再生2」を、10mMのグリシン−HCl(pH2.5)を用いて実施した。この工程後、リガンドCD138は、再び結合競合状態になった。全手順の間、HBS−EPをランニング及び希釈緩衝液として用いた。様々な抗体(〜150kDa)のCD138への結合を決定するために、会合及び解離を様々な濃度(100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、及び3.13nM)で分析した。速度定数ka及びkdを計算することにより、解離平衡定数を決定した。その後、BIAevaluationソフトウェアでkd及びkaの商を求めることにより、分析物のKD−値を計算した。結果を表4に示す。
考察
各抗体の平均KD値を、3つの独立な実験から計算した。結果は、全ての実験において、nBT062が、B−B4に比べて僅かに低いKD値を呈することを示す(それぞれ、平均KD値は1.4nM及び1.6nMであった)。
nBT062−DM1及びhuC242−DM1
チオール含有マイタンシノイドDM1を、Chari(Chari et al.,Cancer Res.1(1992),127)により既に記載されているように、微生物の発酵産物であるアンサマイトシンP−3から合成した。ヒト化C242(huC242)の調製((Roguska et al.,PNAS,91(1994),969)は、既に記載されている。抗体−薬物複合体を、既に記載されているように調製した(Liu et al.,PNAS,93(1996),8618)。抗体分子1つ当たり、平均3.5個のDM1分子が結合した。
BT062は、nBT062キメラ化モノクローナル抗体に、リンカーを介して、ジスルフィド結合で結合した、細胞傷害性マイタンシノイド薬であるDM4から構成される、抗体−薬物複合体である。マイタンシノイドは、チューブリン重合及び微小管の組み立てを阻害する有糸***阻害剤である(Remillard et al.,Science 189(1977),1002)。BT062(nBT062−DM4)の化学的及び模式的表現を図1及び2に示す。
DM4は、周知の誘導体マイタンシノールから調製される(Kupchan et al.,J. Med. Chem.,21(1978),31)。マイタンシノールは、微生物の発酵産物である、アンサマイトシンP3のエステル部分を、リチウムトリメトキシアルミニウム水素化物で還元的に切断することにより調製される(図3参照)。
DM4は、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)及び塩化亜鉛の存在下で、マイタンシノールを、N−メチル−N−(4−メチジチオペンタノイル)−L−アラニン(DM4側鎖)でアシル化して、ジスルフィド含有マイタンシノイドDM4−SMeを得ることにより合成される。DM4−SMeは、ジチオスレイトール(DTT)で還元されて、所望のチオール含有マイタンシノイドDM4になる(DM4のプロセスフロー図については図4を参照)。
nBT062−DM4の調製手順を図5に概説する。nBT062抗体を、N−スクシニミジル−4−(2−ピリジルジチオ)ブチラート(SPDBリンカー)で修飾して、ジチオピリジル基を導入する。DM4を、ジチオピリジル基の等量を超える濃度で、修飾された抗体と混合する。DM4のチオール基と、リンカーを介して抗体に導入されたジチオピリジル基との間のジスルフィド交換反応により、BT062複合体を形成する。クロマトグラフィー及び透析ろ過により精製して、低分子量反応体(DM4)及び反応産物(チオピリジン)、並びに複合体化抗体の凝集物を除去し、バルク原体を作製する。
FACS分析
OPM−2細胞は、CD138を高発現している形質細胞白血病細胞株である。OPM−2細胞を、様々な濃度のnBT062、nBT062−SPDB−DM4、nBT062−SPP−DM1、及びnBT062−SMCC−DM1のいずれかと共にインキュベートした(図6に示す)。細胞を洗浄し、CD138に結合した抗体及び複合体のいずれかを、FACS分析において蛍光標識された二次抗体を用いて検出した。これらの実験で測定された平均蛍光を、抗体濃度に対してプロットした。
CD138+MOLP−8細胞を、3,000細胞/ウェルで平底プレートに播種した。CD138−BJAB対照細胞を1,000細胞/ウェルで播種した。細胞を、様々な濃度のnBT062−SPDB−DM4、nBT062−SPP−DM1、及びnBT062−SMCC−DM1のいずれか(図7A〜Dに示す)で5日間処理した。製造業者の取扱説明書(ROCHE)に従って、細胞生存性を測定するために、WST試薬(水溶性テトラゾリウム塩、ROCHE)を添加した。試薬をMOLP−8細胞上で7.5時間、及びBJAB細胞上で2時間インキュベートした。標準的な手順を用いてマイクロタイターリーダープレートで測定した光学密度に基づいて、生存細胞の割合を計算した。
nBT062−SPDB−DM4、nBT062−SPP−DM1、nBT062−SMCC−DM1、及びnBT062のいずれかの結合をFACSにより分析した。標的細胞として、CD138+OPM−2を、nBT062及び免疫複合体のいずれかと共にインキュベートし、細胞に結合した分子を、蛍光標識された二次抗体を用いて検出した。図6では、細胞に結合した抗体の量の尺度として平均蛍光を、様々な抗体及び複合体のいずれかの濃度に対してプロットした。結果は、nBT062−SPDB−DM4、nBT062−SPP−DM1、及びnBT062−SMCC−DM1は、非常に類似する結合特性を示すことを示す。更に、結果は、複合体化していない抗体の結合特性が、複合体化した毒素により影響を受けないことを強く示唆する。
細胞生存性アッセイでは、CD138+MOLP−8標的細胞、及びCD138−BJAB B−リンパ芽球腫対照細胞に対する抗体の細胞傷害活性を分析した。両方の細胞株を平底プレートに播種し、濃度の上昇する免疫複合体と共にインキュベートした。複合体化していない抗体を対照として用いた。細胞生存性を測定するために、WST試薬を用いることにより、免疫複合体の添加後5日間、細胞傷害活性を分析した。図7A〜図7Cでは、ビヒクル対照で処理した対照細胞に対する生存細胞の割合を、上昇する免疫複合体濃度に対してプロットした。結果は、MOLP−8細胞に対する、nBT062−SPDB−DM4、nBT062−SPP−DM1、及びnBT062−SMCC−DM1の細胞傷害活性が非常に類似していることを示す。予想通り、CD138−BJAB対照細胞は、免疫複合体により死滅せず、これは全ての免疫複合体がCD138への細胞特異的結合を介して作用することを示す。競合実験では、MOLP−8細胞を、モル過剰な複合体化していないnBT062と共にプレインキュベートした。プレインキュベートにより、nBT062−SPDB−DM4の細胞傷害性が実質的に遮断され、これは免疫複合体が細胞表面上のCD138への特異的結合を介して細胞を死滅させるという更なるエビデンスを提供する(図7D)。
B−B4抗体のヒトキメラバージョンであるnBT062の抗体−マイタンシノイド複合体の抗腫瘍活性に対する、CD138標的の重要性を評価するために、異種移植マウス実験を実施した。ジスルフィド結合の化学的安定性の異なる可能性のある、nBT062−マイタンシノイド複合体の2つのバージョンを調製した(nBT062−SPP−DM1及びnBT062−SPDB−DM4)。これらの抗体−薬物複合体の抗腫瘍活性を、B−B4−SPP−DM1複合体(マウス親抗体を含む)、並びに複合体化していない遊離マイタンシノイド(DM4)、ネイティブな非修飾nBT062抗体、及び標的ではない(無関係な)IgG1−マイタンシノイド複合体の活性と比較した。重症複合型免疫不全症(SCID)マウスにおいて、ヒト多発性骨髄腫のCD138陽性異種移植モデル(MOLP−8)で、複合体を評価した。
これらのマウスでは、MOLP−8細胞懸濁液を接種することにより、皮下腫瘍を確立した(雌CB.17 SCIDマウス)。腫瘍体積が平均113mm3に達したとき、単回ボーラス静脈内注射による処理を実施した。腫瘍体積及び体重の変化を、1週間に2回モニタした。腫瘍細胞の接種後、68日間に亘って実験を実行した。
マウス
雌CB.17 SCIDマウス(5週齢)を、Charles River Laboratoriesから入手した。
ヒト腫瘍細胞株
MOLP−8(ヒト多発性骨髄腫細胞株)は、ATCCから供給された。MOLP−8細胞(その細胞表面上でCD138抗原を発現し、SCIDマウスにおいて異種移植腫瘍を発達させる)を、4mMのL−グルタミン(Biowhittaker,Walkersville,MD)、10%のウシ胎児血清(Hyclone,Logan,Utah)、及び1%のストレプトマイシン/ペニシリンを添加したRPMI−1640培地で、5%のCO2を含む湿気のある大気中にて、37℃で維持した。
マウスにおける腫瘍増殖
各マウスの右肩下の領域に、1×107個のMOLP−8細胞を皮下接種した。総体積はマウス当たり0.2mLであり、ここで血清を含有しない培地の、マトリゲル(BD Bioscience,Bedford,MA)に対する比は1/1(v/v)であった。処理前に、異種移植腫瘍を毎日モニタし、確立を可能にした。腫瘍体積は、腫瘍細胞接種後約11日で、およそ113mm3に達した。CB.17 SCIDマウスの腫瘍発現率(take rate)は100%であった。
第2の実験セットでは、血清を含有しない培地及びマトリゲルの50:50混合物に懸濁したMOLP−8細胞(マウス当たり1.5×107細胞)を、右肩下の領域に100μL皮下注射した。腫瘍体積は、細胞接種後11日目に約80mm3に達し、対照の平均は25日目で約750mm3であった。腫瘍の倍加時間は、4.58日であると推定された。対照群の各マウス(n=6)には、0.2mLの滅菌PBSを、ボーラス注射で外側尾静脈に投与した(i.v.)。全ての処理用量は、複合体化マイタンシノイドに基づいた。それぞれ、450μg/kg、250μg/kg、及び100μg/kgの用量で、nBT062−SMCC−DM1、nBT062−SPDB−DM4、及びnBT062−SPP−DM1のいずれかを単回静脈内注射することにより、9群(n=6)を処理した。追加群(n=6)には、反復投与(週1回5週間)で250μg/kgのnBT062−SMCC−DM1を投与した。LabCatプログラムを用いて、腫瘍体積により、マウスを11群(n=6)に無作為に分けた。腫瘍体積は、40.0mm3〜152.5mm3の範囲であった。マウスには、個体の体重に基づいて投薬した。
体積=長さ×幅×高さ×1/2
Log10細胞死滅(cell kill)を、Bissery et al.,Cancer Res.,51(1991),4845に記載の式を用いて計算した:
Log10細胞死滅=(T−C)/Td×3.32
式中、(T−C)、即ち腫瘍増殖遅延は、処理群(T)及び対照群(C)の腫瘍が、所定の大きさ(600mm3)に達するのに必要な日数の中央時間である。Tdは、対照マウスの中央腫瘍体積に基づいた、腫瘍倍加時間であり、3.32は、細胞増殖の対数当たりの細胞倍加数である。
個々のマウスにおける腫瘍増殖を図8A〜9Dに示す。各群の平均(+/−SD)腫瘍増殖を図10に示す。
PBS処理した動物における腫瘍増殖と比べて、nBT062抗体、複合体化していない遊離DM4、及び無関係の非標的複合体huC242−DM4のいずれかによる処理は、腫瘍増殖をそれ程阻害しなかった。
250μg/kgの用量では、3つ全てのCD138標的複合体、nBT062−SPDB−DM4、B−B4−SPP−DM1、及びnBT062−SPP−DM1が、腫瘍増殖の著しい遅延を引き起こした。処理群で測定した平均腫瘍体積に基づくと、DM4複合体nBT062−SPDB−DM4の活性が最も高く、一方nBT062−SPP−DM1は、そのマウス相当物B−B4−SPP−DM1に比べて、僅かに高い活性を示した(図10)。加えて、個々のマウスで得られた結果は、B−B4−SPP−DM1で得られた抗腫瘍活性がより不均一であり、それ故nBT062−SPP−DM1で処理したマウスにおける測定値より予測が難しい。抗腫瘍活性の均一性の観点では、標的抗体としてnBT062を用いる他の複合体、nBT062−SPDB−DM4はnBT062−SPP−DM1に類似した挙動を示した。
いずれの処理群でも体重減少は見られず、これは処理が耐容性良好であったことを示唆する。
実験動物における3種のCD138標的複合体の分析結果は、抗腫瘍活性にいとって、標的送達が重要であることを示す。ヒトキメラnBT062及びマウスB−B4抗体のマイタンシノイド複合体は、対数細胞死滅により測定したとき、非常に高い活性を示すが、複合体化していないDM4、修飾されていないネイティブなhuBT062抗体、及び非標的対照複合体(huC242−DM4)のいずれかによる処理は、腫瘍増殖に対してそれ程影響を与えなかった。
ヒトキメラ抗体から調製した免疫複合体、nBT062−SPP−DM1は、そのマウス相当物から調製した複合体、B−B4−SPP−DM1より(then)、僅かに高い抗腫瘍活性をもたらした。加えて、nBT062−SPP−DM1及びnBT062−SPDB−DM4で処理することにより、B−B4−SPP−DM1による処理と比べて、個々のマウスにおいてより均一な反応が得られた。B−B4−SPP−DM1の高結合変異は、接種後の経時的な(日)、CB.17 SCIDマウスにおけるMOLP−8ヒト多発性骨髄腫異種移植片の中央腫瘍体積(+/−SD)が、実際に、nBT062−SPP−DM1よりも、B−B4−SPP−DM1について、比較的良好な結果をもたらしたことを説明した(データは示さず)。標的抗体としてnBT062を用いる免疫複合体のこの特徴は、特に複合体の治療的用途に有益であると思われる。
最後に、SCIDマウスのMOLP−8異種移植モデルにおいて単回iv投与した後、最も強力なマイタンシノイド複合体はnBT062−SPDB−DM4であった。
CD138+OPM2細胞及びCD138−ナマルバ細胞を、丸底プレートの別々のウェルにに播種した、或いは共培養した。細胞を、1×10−8M〜1×10−9Mの範囲の濃度の、nBT062−SPDB−DM4で処理した。製造業者の取扱説明書(ROCHE)に従って、WST試薬(水溶性テトラゾリウム塩;ROCHE)を用いて、生存細胞の割合を検出した。生存細胞の割合を、標準的な手順を用いてマイクロタイターリーダー内で測定した光学密度に基づいて計算した。
nBT062−SPDB−DM4処理時に、多発性骨髄腫に非常に近接している(丸底ウェルに存在するような)非標的細胞のバイスタンダーキリングを、CD138陽性OPM2細胞をCD138陰性ナマルバ細胞と共培養で培養したインビトロ研究において分析した(図13)。一般に、CD138陽性細胞は、nBT062−SPDB−DM4によって効率的に死滅するが、CD138陰性細胞は、複合体により影響を受けなかった。しかしながら、丸底ウェルにおける共培養では、nBT062−SPDB−DM4は、抗原陽性細胞に非常に近接している抗原陰性細胞も死滅させた(バイスタンダーキリングと称されることが多い効果)。Kovtunら(2006)は、マイタンシノイド複合体により媒介されるバイスタンダーキリングは、抗原陽性細胞に非常に近接するときにのみ生じると考察した。Kovtunら(2006)(全文が本明細書に援用される)はまた、免疫複合体のリンカーの重要性についても考察している。インビボにおけるバイスタンダーキリングは、1)CD138を不均一に発現する腫瘍細胞の根絶、2)腫瘍間質細胞の死滅による腫瘍微小環境の破壊、及び3)CD138陰性nBT062−SPDB−DM4耐性細胞の選択の妨害に寄与する可能性がある。
この実験セットでは、85匹のマウスの右肩にMOLP−8細胞(1.5×107細胞/マウス)を皮下接種した。腫瘍発現率は100%であった。平均腫瘍体積が約80mm3である、嵩高いMOLP−8腫瘍を有する66匹のSCIDマウスを、11の処理群(n=6)に無作為に分けた。マウスを、3種の複合体(nBT062−SMCC−DM1、nBT062−SPDB−DM4、及びnBT062−SPP−DM1のいずれか)のうち1種の単回用量で処理した。追加群には、週用量のnBT062−SMCC−DM1を5回投与し、対照群には単回用量のPBSを投与した。平均腫瘍体積を図11Aに示す。各複合体について、用量反応が確立された。PBS処理した動物では、25日目に中央腫瘍体積が750mm3に達した。対照腫瘍増殖の対数線形プロット上において最も適合した線形回帰曲線適合により決定された腫瘍倍加時間は、4.58日であった。450μg/kgのnBT062−SPDB−DM4で処理した動物が、最高の対数細胞死滅(LCK=2.89)を有し、続いて、250μg/kgの週用量のnBT062−SMCC−DM1で処理した動物(LCK=2.1;表5を参照)であった。ダネットの多重比較試験を実施してANOVAを反復測定することによる、処理群の平均腫瘍体積曲線の比較は、PBS対照群と、450μg/kgのnBT062−SPDB−DM4(p<0.01)、250μg/kgのnBT062−SPDB−DM4(p<0.05)、及び250μg/kgの週用量5回のnBT062−SMCC−DM1(p<0.05)との間に有意な差を示した。接種後85日目までに腫瘍が部分的に縮小した、450μg/kgのnBT062−SPDB−DM4を投与した動物を除いて、いずれの処理群でも、部分的腫瘍縮小及び完全な腫瘍縮小のいずれも生じなかった。
ヒト胎児骨移植片を有するSCIDマウスの調製
ヒト胎児長骨(ヒト胎児骨片)を、既に記載されているように(Urashima et al.,1997)、CB17 SCID−マウス(SCID−hu)の上体に移植し、それによりヒトMM細胞のヒトBM細胞へのホーミングについてのマウスモデルを提供した。
骨移植の4週間後、最終体積100μLのRPMI−1640細胞培養培地中、2.5×106個のINA−6細胞を、上記SCID−huマウスのヒト骨髄腔に直接注入した。可溶性ヒトIL−6受容体(shuIL−6R)(これはINA−6細胞により放出される)のレベル上昇を、MM細胞増殖及び疾患負担のパラメータとして用いた。
INA−6細胞注入のおよそ4週間後、マウスは測定可能な血清shuIL−6Rを発現し、次いで7週間の間週1回尾静脈注射を介して0.176mgの複合体及びビヒクル対照のいずれかを投与した。各処理後、血液サンプルを回収し、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA、R&D Systems,Minneapolis,MN)により、shuIL−6Rレベルを測定した。結果を図12に記す。
インターロイキン6(IL−6)は、多発性骨髄腫の増殖及び生存因子である。INA−6は、IL−6依存性ヒト骨髄腫細胞株であり、これはまた、増殖に骨髄間質細胞(BMSC)を必要とする。INA−6細胞株は、可溶性IL−6受容体(shuIL−6R)を産生する。shuIL−6Rのレベル上昇は、MM細胞増殖及び疾患負担のパラメータとして用いることができる。
材料及び方法
細胞培養
Dex感受性(MM.1S)及びDex耐性(MM.1R)ヒトMM細胞株は、Steven Rosen博士(Northwestern University,Chicago,IL)により供与頂いた。RPMI8226及びU266ヒトMM細胞株は、American Type Culture Collection(Manassas,VA)から入手した。ドキソルビシン(Dox)耐性(RPMI−Dox40)細胞及びメルファラン耐性(LR5)細胞は、William Dalton博士(Lee Moffitt Cancer Center,Tampa,FL)により供与頂いた。OPM1及びOPM2形質細胞性白血病細胞は、Edward Thompson博士(University of Texas Medical Branch,Galveston)により供与頂いた。
全てのMM及び骨髄(BM)間質細胞株を、10%のウシ胎児血清、2mMのL−グルタミン(Life Technologies)、100U/mLのペニシリン、及び100Ag/mLのストレプトマイシン(Life Technologies)を含有するダルベッコ変法イーグル培地DMEM(Sigma)中で培養した。健常ボランティアから回収した血液サンプルを、Ficoll Paque勾配により加工して、末梢血単核細胞(PBMC)を得た。ヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントを得、Dana−Farber Cancer Institute(Boston,MA)の治験審査委員会に承認を受けた後、BMサンプルから患者由来のMM及びBM細胞を得た。BM単核細胞を、Ficoll Paque密度沈降を用いて分離し、形質細胞を、抗CD138磁気活性化細胞分離マイクロビーズ(Miltenyi Biotec Auburn,CA)を用いたポジティブ選択により精製した(>95% CD138+)。腫瘍細胞を、既に記載されているように(Hideshima,2001)、RosetteSepネガディブ選択系(StemCell Technologies,Vancouver,BC,Canada)を用いて、MM患者のBMから精製した。RosetteSep抗体カクテルを、骨髄サンプルに添加した。CD138陰性細胞を、RosetteSep試薬を用いて赤血球(ロゼット状)に架橋させ、室温で20分間インキュベートし、次いでFicoll密度遠心分離により分離した。
nBT062−SMCC−DM1、nBT062−SPDB−DM4、nBT062−SPP−DM1、及びデキサメタゾンの、MM細胞株、PBMC及びBMSCの増殖に対する増殖阻害効果を、既に記載されているように(Hideshima,2003)、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)2,5−ジフェニルテトラナトリウムブロミド(MTT;Chemicon International,Temecula,CA)色素代謝を測定することにより、MTTアッセイで評価した。
MM細胞の免疫複合体への感受性に対する、BM細胞の増殖刺激効果を調べるために、MM細胞(2×104細胞/ウェル)を、薬物の非存在下及び存在下のいずれかにおいて、96ウェルプレート(Costar,Cambridge,MA)内にて、骨髄間質細胞(BMSC、1×104細胞/ウェル)と共に48時間共培養した。DNA合成を、[3H]−チミジン(Perkin−Elmer,Boston,MA)取り込みにより測定した。[3H]−チミジン(0.5μCi/ウェル)を、実験の最後8時間の間に添加した。全ての実験を、4連で行った。
MM細胞(1×106細胞)を、免疫複合体の存在下及び非存在下のいずれかにおいて48時間インキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、−20℃で70%エタノールに30分間曝露させることにより透過処理し、20U/mLのRNAse A(Roche Diagnostics)を含有する0.5mLのヨウ化プロピジウム(PI)(50μg/mL)−PBS溶液と共に室温で30分間インキュベートした。DNA含量を、フローサイトメトリーを用いて分析した。
カバーガラス上で増殖させた細胞を、10分間冷無水アセトンで固定し、PBSで洗浄し、5%のFBS−PBS溶液で60分間ブロッキングした。次いで、スライドを、抗CD138抗体(sc12765,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)と共に、4℃で24時間インキュベートした。再び細胞をPBSで洗浄し、蛍光標識したヤギ抗マウスIgGと共に、4℃で1時間インキュベートし、既に記載されているように(Ikeda,2005;Kiziltepe,2007)、Nikon E800蛍光顕微鏡を用いて分析した。
OPM1細胞を、既に記載されているように(Zufferey,1998)、レンチウイルスベクターを用いて、緑色蛍光タンパク質(OPM1GFP)をトランスフェクトした。CB17 SCIDマウス(48日齢〜54日齢)は、Charles River Laboratories(Wilmington,MA)から購入した。全ての動物実験は、Dana−Farber Cancer Instituteの動物倫理委員会により承認されたプロトコルに従って実施した。マウスの右側腹部に、100μLのRPMI−1640中5×106個のOPM1GFPMM細胞を皮下接種した。腫瘍が触知可能であったとき、マウスを、外側尾静脈注入により週1回4週間に亘って、複合体の分子量に基づいて176μg/マウスを投与する処理群に割り当て、5匹のマウスをビヒクルのみ投与する対照群に割り当てた。最長垂直腫瘍直径のカリパスによる測定を、1日おきに実施して、楕円の3D体積を表す、以下の式を用いて腫瘍体積を推定した:4/3×(幅/2)2×(長さ/2)。腫瘍が2cmに達したとき、或いはマウスが瀕死の状態になった場合、動物を屠殺した。処理の1日目から屠殺までの生存率を評価した。処理の1日目から、屠殺の日(対照群では10日目、BT062−SPDB−DM4処理群では21日目)までのカリパス測定値を用いて、腫瘍増殖を評価した。腫瘍領域を剃毛した後、Illumatool Bright Light System LT−9900(Lightools Research,Encinitas,CA)を用いて全身蛍光イメージングによりマウスをモニタした。canon IXY digital 700カメラを用いて撮像した。エキソビボ分析の腫瘍は、40u/0.60のLEICA DFC300 FX カメラ(Leica,Heidelberg,Germany)に接続されたLEICA DM IL顕微鏡で撮像した。
MM細胞(1×106個)を、PBSで洗浄し、免疫複合体の存在下及び非存在下のいずれかにおいてインキュベートした。アポトーシス性細胞を、PE複合体化Apo 2.7抗体(7A6,Beckman Coulter,Inc.)で染色した。細胞を、RXP Cytomicsソフトウェアを用いて、Epicsフローサイトメータ(Beckman Coulter,Inc.)において、フローサイトメトリーにより分析した。
既に記載されているように(Yasui,2005;Hayashi,2002)、MM細胞を、nBT062−SMCC−DM1、nBT062−SPDB−DM1、又はBT062−SPP−DM1の存在下及び非存在下のいずれかにおいて培養し、播種し、洗浄し、2mMのNa3VO4、5mMのNaF、1mMのフェニルメチルスルホニルフッ化物、5mg/mLの完全プロテアーゼ阻害剤を含有する放射免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファーを用いて溶解させた。全細胞溶解物(1レーンあたり20μg)を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)分離し、純ニトロセルロース膜(Bio−Rad Laboratories,Hercules,CA)に転写し、poly−ADP(アデノシン二リン酸)−リボースポリメラーゼ(PARP)、カスパーゼ−8、カスパーゼ−3、カスパーゼ−9、AKT、及びホスホ(Ser473)Akt(Cell Signaling)、並びに抗チューブリン及び抗CD138抗体(Santa Cruz Biotechnology)に対する抗体で免疫ブロットした。
96ウェルプレートにおいて、1×104個のBMSCを各ウェルにピペットで入れ、37℃で、免疫複合体の存在下及び非存在下のいずれかにおいて、12時間インキュベートした。インキュベート時、薬物の存在下及び非存在下のいずれかでMM細胞をBMSCに添加した。それによって、MM細胞をPBSで3回洗浄し、薬物の存在下及び非存在下のいずれかにおいて、100μL中2×105細胞の細胞密度で、血清を含まないRPMI培地に再懸濁させた。各サンプル群について、3連或いは4連で実行した。37℃で2時間共培養した後、非接着細胞、弱接着細胞、及び培地を、プレートを反転させることにより除去した。その後、ウェルをPBSで3回洗浄した。残りの接着細胞を、[3H]−チミジン(0.5μCi/ウェル、Perkin Elmer,Boston,MA,USA)の存在下において、10%FBSを添加したRPMI培地中で更に8時間培養して、DNA合成を測定した。
対照培養物と免疫複合体(IC)処理培養物で観察された差の統計的有意性を、Dunnの多重比較検定を用いて決定した。最小レベルの有意性では、P値が0.5未満であった。インビボにおける実験では、腫瘍体積を、Dunnの多重比較検定の1元配置分析(1−way analysis)を用いて比較した。生存率を、Kaplan−Meier曲線及びlog−rank検定を用いて評価した。
MM細胞株におけるCD138の発現
MM1S、OPM1、OPM2、RPMI8226、DOX40、MM1R、LR5、及びU266細胞の全細胞溶解物を用いて、ウエスタンブロッティングにより多発性骨髄腫細胞におけるCD138の発現レベルを分析した(図14A)。
図14Aから分かるように、MM1S及びLR5ではCD138の弱い発現が見られ、DOx40細胞はCD138陰性であった。他の細胞株は、CD138の高い発現を示した。これは、8種の多発性骨髄腫細胞株中7種(87.5%)でCD138が発現していることを示した。
図14Bは、CD138特異的抗体を用いて、免疫蛍光染色を用いた分析を示す。DOX40細胞(上方のパネル)及びOPM1細胞(下方のパネル)の顕微鏡分析を実施した。CD138発現を左側に示し、核酸を右側に示す。図14Bは、DOX40細胞では、CD138の発現は殆ど検出不可能であることを示す。対照的に、OPM1細胞は、高いCD138免疫反応性を示した。
また、CD138抗体マイタンシノイド複合体の有効性を、細胞生存率アッセイで試験した。免疫複合体nBT062−SMCC−DM1、nBT062−SPDB−DM4、及びnBT062−SPP−DM1を、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)に基づくアッセイを用いて、CD138陽性細胞(OPM1、RPMI8226)、CD138弱発現細胞(MM1S)、及びCD138陰性細胞(DOX40)に対する細胞傷害性の強度についてアッセイした。
図15Aは、それぞれnBT062−SMCC−DM1、nBT062−SPDB−DM4、及びnBT062−SPP−DM1のいずれかに曝露したときの、OPM1細胞(黒四角)、RPMI8226細胞(菱形)、DOX40細胞(白四角)、及びMM1S細胞(三角)を表す。MTTアッセイで細胞生存率を測定した。指定のインキュベート時間(40時間、80時間、120時間)後の細胞生存率を、未処理対照の生存率の百分率で示す。
3ng/mL〜354ng/mLの範囲の濃度のnBT062−SMCC−DM1、nBT062−SPDB−DM4、及びnBT062−SPP−DM1による細胞の処理は、CD138陽性細胞において増殖阻害を誘導した。この効果は、時間及び用量依存的方式で生じ、高レベルのCD138を発現している2種の細胞株における120時間後で最も顕著であった。同条件下で、CD138陰性DOX40細胞に対する細胞傷害性は殆ど測定できなかった(図15A)。重要なことに、3種の免疫複合体はまた、48時間のインキュベート時間後測定した、111ng/mL〜442ng/mLの濃度範囲で分析したとき、患者由来のネガティブ選択されたMM細胞に対して細胞傷害性であった(図15B)。図15Cは、細胞生存率を測定する前に、72時間nBT062−SPDB−DM4と共に培養した、3人の健常被験体に由来するPBMCを示す。同条件下で処理されたOPM1 MMの細胞生存率を、対照として示す(黒四角)。図15Cから分かるように、免疫複合体は、3人の健常ボランティアから単離したPBMC(末梢血単核細胞)において細胞傷害性効果を誘導しなかった(図15C)。これらの結果は、nBT062−SMCC−DM1、nBT062−SPDB−DM4、及びnBT062−SPP−DM1が、CD138陽性MM細胞を選択的に殺傷することを示す(この図に示すデータは全て、3者の平均を表す。標準偏差はエラーバーにより示す。)。
マイタンシノイドは微小管重合の抑制作用を有するため、DM1及びDM4は、腫瘍細胞においてG2/M期細胞周期停止を誘導することが既に示されている(Erickson,2006)。よって、nBT062−SMCC−DM1、nBT062−SPDB−DM4、及びnBT062−SPP−DM1で処理した後、OPM1細胞の細胞周期プロファイルを調べた。細胞を、0〜72時間免疫複合体と共にインキュベートし、PIで標識し、フローサイトメトリーにより分析した。図16Aは、0時間、12時間、及び24時間のいずれか、免疫複合体で処理し、PI染色により細胞周期プロファイルを分析したOPM1細胞を示す。図16Aから分かるように、これらの化合物は、未処理細胞に比べて、G2/M相の細胞の比率に対して顕著な効果を有していた。OPM1細胞をnBT062−SPDB−DM4に曝露すると、他の2種の薬物で処理された細胞に比べて、より速やかでより強い反応が誘導された。
次に、nBT062−SPDB−DM4が標的細胞でアポトーシスを誘導するかどうかを決定した。図16Bは、24時間、48時間、或いは72時間、免疫複合体の存在下及び非存在下のいずれかにおいて培養したOPM1細胞を示す。アポトーシス性細胞の百分率を、Apo2.7抗体染色及びフローサイトメトリー分析により調べた。図16Bに示すように、Apo2.7抗体による細胞の染色は、免疫複合体で処理された細胞のアポトーシス誘導を示した。
図16Cは、指定の時間885μg/mLのnBT062−SPDB−DM4の存在下で培養したOPM1細胞(左のパネル)、或いは様々な濃度の免疫複合体と共に培養したOPM1細胞(中央のパネル)を示す。この図では、FLは、カスパーゼ及びPARPの完全長型に対応するバンドを示し、CLは、切断産物に対応するバンドを示す。OPM1細胞を、zVAD−fmk(50μmol/L)と共に60分間プレインキュベートし、その後指定の用量のnBT062−SPDB−DM4で24時間処理した。全ての細胞溶解物を、カスパーゼ−3、カスパーゼ−8、カスパーゼ−9、PARP、及びチューブリン特異的抗体を用いて、免疫ブロットに供した。図16Cから分かるように、OPM1細胞をnBT062−SPDB−DM4で処理すると、用量及び時間依存的方式で、カスパーゼ−8、カスパーゼ−9、カスパーゼ−3、及びPARPの切断が誘導された(左及び中央のパネル)。パン−カスパーゼ阻害剤zVAD−fmkは、nBT062−SPDB−DM4のOPM1細胞におけるカスパーゼ−3、カスパーゼ−8、カスパーゼ−9、及びPARPの切断誘導を妨げた(図16C、右のパネル)。これらの結果は、nBT062−SPDB−DM4がカスパーゼを活性化し、標的細胞でアポトーシスを誘導することを示す。
多発性骨髄腫患者では、骨髄微小環境が、以下の少なくとも2種の異なる機構を介して、MM細胞の増殖、生存、及び薬物耐性を誘導する、
MM細胞のフィブロネクチンへの接着が、細胞接着媒介性薬剤耐性(CAM−DR)を生じさせる、
骨髄環境中のインターロイキン−6(IL−6)等のサイトカイン、及びインスリン様増殖因子1(IGF−1)が、最終的に従来の治療に対するMM細胞の耐性を媒介する重要なシグナル伝達カスケードを誘導する。
BMSCと共培養したMM細胞に対する免疫複合体の細胞傷害性を、IL−6の存在下及び非存在下のいずれか、或いは骨髄間質細胞(BMSC)の存在下において分析した。
図17A〜17Cでは、OPM1細胞を、48時間、対照培地(黒棒)、及び濃度の上昇するnBT062−SPDB−DM4(55ng/mL(濃灰色棒、*)、111ng/mL(灰色棒、**)、221ng/mL(薄灰色棒、***)、442ng/mL(超薄灰色棒、****)、885ng/mL(白棒、*****))のいずれかと共に培養した。図17Dの細胞は、72時間、対照培地(黒棒)、及び濃度の上昇するデキサメタゾン(250nM(灰色棒、+)、500nM(薄灰色棒、++)、1,000nM(白棒、+++))のいずれかで処理した。1及び10ng/mLのいずれかの濃度のIL−6を、一部の培養物中に添加した(図17A)。IGF−1は、10及び50ng/mLのいずれかの濃度で用いた(図17B)。これらのサイトカインはいずれも、免疫複合体に対する細胞の耐性を誘導しなかった。
BM微小環境の増殖に対する影響、及び免疫複合体に対するOPM1の耐性を分析するために、細胞を上記BMSCの存在下及び非存在下のいずれかにおいて培養した。
BMSCの存在下及び非存在下のいずれかにおけるOPM1細胞の共培養を、図17のパネル(C)及び(D)に示す。全ての実験において、培養の最後8時間の間の[3H]−チミジン取り込みを測定することにより、DNA合成を決定した。OPM1細胞のBMSCへの接着は、[3H]−チミジン取り込みの増加を誘発した。重要なことに、免疫複合体の細胞傷害性は、BMSCの存在により影響を受けなかった(図17C)。対照的に、デキサメタゾン(対照として含まれていた)は、BMSC誘発性保護効果を克服することができなかった(図17D)。
免疫複合体が多発性骨髄腫細胞のBMSCへの接着を阻害するかどうかを分析した。MM1S細胞(CD138を中程度しか発現せず、BT062に対して弱い感受性しか示さなかった(図14A及び図15A))を、nBT062−SMCC−DM1、nBT062−SPDB−DM4、及びnBT062−SPP−DM1のいずれかと共に、或いはこれら無しで、2時間(885ng/mL)培養した。処理後、MM1S細胞を、BMSCと共に更に2時間共培養した。幾つかのサンプルではまた、BMSCを免疫複合体で12時間(885ng/mL)処理し、その後共培養した(間質処理)。PBSで3回洗浄した後、接着細胞を[3H]−チミジン取り込みにより測定した。
図17Eは、免疫複合体の存在下及び非存在下のいずれかにおいて、96ウェル平底プレート内で24時間培養したBMSCを示す。BMSCをPBSで3回洗浄した。免疫複合体と共に2時間インキュベートしたMM1S細胞を、BMSCに添加した。DNA合成を、[3H]−チミジン取り込みにより測定した。
図17Eに示すように、nBT062−SPDB−DM4及びnBT062−SPP−DM1は、間質細胞のみを処理したサンプルと比べて、多発性骨髄腫細胞のBMSCへの接着を阻害した(それぞれ、3.6倍及び2.5倍)。nBT062−SMCC−DM1は、細胞接着に対して殆ど効果を示さなかった。結果は、nBT062−SPDB−DM4及びnBT062−SPP−DM1が、MM細胞のBMSCへの接着を阻害することができ、これらの免疫複合体はまた細胞接着媒介性薬剤耐性(CAM−DR)を克服し得ることを示唆する。
SCIDマウスのGFP陽性ヒトMM異種移植モデルにおいて、nBT062−SPDB−DM4及びnBT062−SPP−DM1のインビボ活性を測定した。
図18Aは、OPM1GFP細胞によるGFP発現の分析を示す。図に示すように、OPM1 MM細胞の高蛍光クローン(OPM1GFP)を確立することができ、インビボの実験動物において、これらの細胞を用いて免疫複合体の抗腫瘍活性を試験した。図18Bでは、1群あたり5匹のマウスに、5×106個のOPM1GFP細胞を注入した。マウスに、100μLのRPMI−1640培地中、5×106個のOPM1GFP細胞を皮下接種した。nBT062−SPDB−DM4(四角)、nBT062−SPP−DM1(三角)、及びバッファー対照のいずれかによる処理は、腫瘍が確立されたときに開始した。腫瘍の大きさは、垂直直径を連続してキャリパー測定することにより測定した。エラーバーは、標準偏差を示す。腫瘍細胞の注入後14日で、全てのマウスが測定可能な腫瘍を発現し、次いでマウスをnBT062−SPDB−DM4、nBT062−SPP−DM1、及び対照ビヒクル(PBS)のいずれかで週1回処理される群に無作為に割り当てた。垂直直径の連続キャリパー測定を1日おきに実施して、腫瘍体積を計算した。腫瘍を有するマウスをnBT062−SPDB−DM4(複合体の分子量に基づいて176μg/マウス、週1回4週間)で処理することにより、PBSビヒクルで処理した対照動物と比べて、MM腫瘍の増殖は有意に阻害された(Dunnの多重比較検定、対照ビヒクル対nBT062−SPDB−DM4、P<0.01、図16B)。
nBT062−SPP−DM1複合体は、nBT062−SPDB−DM4ほど有効ではなかった(Dunnの多重比較検定、nBT062−SPP−DM1対BT062−SPDB−DM4、P<0.05、図5B)。腫瘍が大きくなったため、全ての対照マウスを、処理の開始後19日目に屠殺しなければならなかった。Kaplan−Meier曲線及びlog−rank検定を用いたところ、nBT062−SPDB−DM4で処理した群の26日(95%信頼区間[CI]、23〜42日)に対して、対照コホートの平均OSは13.6日であった(95%信頼区間[CI]、10〜19日)(図5C)。図18Cから分かるように、nBT062−SPDB−DM4は、ビヒクルのみで処理した対照群(実線、生理食塩水、n=5)に比べて、有意に生存率を増加させた(P<0.0023、点線、n=5)。マウスを屠殺し、TUNEL分析のために、nBT062−SPDB−DM4処理マウス及びバッファー処理対照マウスから腫瘍を切除した。OPM1GFP保有マウスから切除した腫瘍のエキソビボ分析は、対照マウスに比べてBT062処理動物でアポトーシスが有意に増加したことを示した(図18D)。よって、nBT062−SPDB−DM4は、インビボでアポトーシスを誘導する。投与されたいずれの化合物も、この研究において、体重には全く影響を与えなかった。
上記では、インビトロではCD138を発現しているMM細胞に対する、インビボでは実験動物における、nBT062−SMCC−DM1、nBT062−SPDB−DM4、及びnBT062−SPP−DM1の選択的抗腫瘍活性を示した。免疫ブロッティング及び免疫蛍光分析を用いて、分析したMM細胞株の大部分がCD138を発現していることが見出された。しかし、DOX40は、CD138タンパク質を発現しておらず、MM1S細胞及びLR5細胞は、タンパク質の弱い発現しか示さなかった。残り5種は、高レベルのCD138発現を示した。免疫複合体nBT062−SMCC−DM1、nBT062−SPDB−DM4、及びnBT062−SPP−DM1は、MM細胞株に対して顕著な細胞傷害性を示し、これら3種の剤のうち最も強力な化合物はnBT062−SPDB−DM4であった。高レベルのCD138を発現しているOPM1及びRPMI8226細胞は、CD138を少ししか発現していないMM1S細胞、或いはCD138陰性Dox40細胞より、免疫複合体に対する感受性が高かった。重要なことに、これらの剤はまた、MMに罹患している患者から単離された腫瘍細胞に対しても細胞傷害性を示した。重要なことに、健常ボランティアの末梢単核細胞或いは骨髄単核細胞に対しては、細胞傷害性が見られなかった。これらの結果は、免疫複合体が、MM腫瘍細胞に対して抗原選択的活性を有することを示唆する。
nBT062−SMCC−DM1、nBT062−SPDB−DM4、及びnBT062−SPP−DM1は、アポトーシス性細胞死を導くG2/M細胞周期停止を誘導することにより、MM細胞の細胞増殖を阻害することを、示すことができた。カスパーゼ−3、カスパーゼ−8、カスパーゼ−9、及びカスパーゼ−3の下流標的PARPの切断は、免疫複合体で処理したOPM1細胞で検出することができる。更に、APO2.7抗原陽性細胞は、これらの薬物と共に24時間インキュベートした後に増加した。
IL−6は、PI3−K/Akt、MEK/ERK、及びJAK2/STAT3シグナル伝達カスケードの活性化を介して、多発性骨髄腫細胞の増殖を誘発することが既に報告されている。IGF−1はまた、同一経路を用いて、多発性骨髄腫細胞の増殖及び生存を促進することが記載されている。IL−6は、PI3−K/Aktシグナル伝達の誘導を介して、デキサメタゾン誘導性アポトーシスを防ぐ。外因性IL−6及びIGF−1が、多発性骨髄腫細胞において免疫複合体誘導性細胞傷害性を阻害するかどうかを調べた。IL−6及びIGF−1で処理した細胞で増殖の増加が見られたが、これらのサイトカインはOPM1細胞でnBT062−SPDB−DM4誘導性アポトーシスを阻害することができなかった。この結果は、これらの剤が、これらのサイトカインの保護効果を克服し得ることを示唆する。重要なことに、免疫複合体は、BMSCに接着したMM1S細胞の増殖及び接着を阻害し、これは更に、それらが細胞接着媒介性薬剤耐性(CAM−DR)を克服し得ることを裏付けた。実験動物では、nBT062−SPDB−DM4は、マウスの体重に影響を与えることなく、確立されたMM異種移植片の有為な増殖遅延を誘導した。
試験した全ての複合体が、MM細胞株、及び患者由来の初期MM細胞に対して高い細胞傷害活性を示したが、一方健常ボランティア由来の末梢血単核細胞は、複合体に対して全く感受性を示さなかった。
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Claims (18)
- CD138発現腫瘍細胞への間質細胞の接着を、それを必要としている被験体の腫瘍細胞において減少させる方法であって、
前記腫瘍細胞に、前記CD138発現腫瘍細胞を標的とする免疫複合体を、CD138発現腫瘍細胞への間質細胞の接着を減少させるのに有効な量接種する工程と、
任意的に、前記腫瘍細胞に、更なる細胞傷害性剤を、腫瘍細胞の増殖の阻害、遅延、及び防止の少なくともいずれかを行う量接種する工程と、を含むことを特徴とする方法。 - 免疫複合体が、エフェクタ分子及び標的剤を含み、前記エフェクタ分子及び前記標的剤が、切断可能なリンカーを介して互いに結合している、請求項1に記載の方法。
- 切断可能なリンカーが、ジスルフィド結合を含む、請求項2に記載の方法。
- リンカーが、N−スクシニミジル4−(2−ピリジルジチオ)ペンタノエート(SPP)及びN−スクシニミジル4−(2−ピリジルジチオ)ブタノエート(SPDB)のいずれかである、請求項3に記載の方法。
- 接着が、少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、及びそれ以上のいずれか減少する、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 接着の減少により、接着媒介性薬剤耐性が軽減する、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 免疫複合体ではない更なる細胞傷害性剤に対する接着媒介性薬剤耐性を減少させ、前記更なる細胞傷害性剤が、腫瘍細胞の増殖の阻害、遅延、及び防止のいずれかを行う量接種される、請求項6に記載の方法。
- 細胞傷害性剤が、メルファラン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、デキサメサゾン、シクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、シスプラチン、サリドマイド、プレドニゾン、サリドマイド、ボルテゾミブ、レナリドマイド、ソラフェニブ、ロミデプシン、及びこれらの組み合わせのいずれかである、請求項7に記載の方法。
- 細胞傷害性剤が抗体に基づく、請求項7に記載の方法。
- エフェクタ分子が立体障害を有する、請求項1及び2のいずれかに記載の方法。
- エフェクタ分子が、少なくとも1種のマイタンシノイド、タキサン、CC1065、及びこれらの類似体のいずれかである、請求項1及び2のいずれかに記載の方法。
- エフェクタ分子が、DM1、DM3、及びDM4のいずれか等の、少なくとも1種のマイタンシノイドである、請求項11に記載の方法。
- エフェクタ分子がDM4である、請求項12に記載の方法。
- 免疫複合体の標的剤が、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を含み、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列が、配列番号1で表されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、及び少なくとも98%のいずれかの配列同一性を有する、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 免疫複合体及び細胞傷害性剤が、連続して接種され、細胞傷害性剤の接種が、免疫複合体の接種後に行われる、請求項7に記載の方法。
- 免疫複合体及び細胞傷害性剤が同時接種される、請求項7に記載の方法。
- 被験体が、多発性骨髄腫、卵巣癌腫、腎臓癌腫、胆嚢癌腫、乳癌腫、前立腺癌、肺癌、結腸癌腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄芽球性白血病(AML)、固形組織肉腫、及び結腸癌腫のいずれか1種に罹患している癌患者である、請求項1から4及び7から9のいずれかに記載の方法。
- 患者が、多発性骨髄腫に罹患している、請求項17に記載の方法。
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