KR101494664B1 - 항산화 기능을 갖는 산수유 발효 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
항산화 기능을 갖는 산수유 발효 조성물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본원은 산수유 발효물, 이를 포함하는 항산화 조성물 및 이의 제조방법을 개시한다. 본원의 산수유 발효물은 발효로 인해 항산화 기능을 나타내는 생리활성 성분이 강화되어 항산화 기능이 요구되는 각종 의약품, 화장품 또는 건강기능 식품 등에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본원은 기능성 천연 발효물과 관련된 분야이다.
최근 각종 질환을 예방 또는 치료하기 위해 기존의 합성물질 대신에 각종 식물을 포함하는 천연물에 대한 관심이 급증하고 있으며, 유용성분의 규명과 함께, 유용성분을 극대화시키기 위한 방법도 개발되고 있다.
예를 들면 항산화 물질은 동, 식물계에 널리 분포되어 있는데, 과일과 채소에 많은 페놀성 화합물, 플라보노이드, 토코페롤, 비타민 C, 셀레늄과 같은 항산화 물질은 지방의 산화를 지연시키거나 방지하며, 암, 심장혈관계 질환 등을 예방, 지연시킴으로써 노화방지에도 중요한 역할을 한다. 식물계에 존재하는 천연 항산화 물질인 토코페롤과 비타민 C는 식품, 의약품 및 화장품 등에 널리 이용되고 있다.
합성 항산화제로는 BHT(Butylated Hydroxy Toluene), BHA(Butylated Hydroxy Anisole), Propyl Gallate 등이 있다. 합성 항산화제는 항산화력이 뛰어나고 가격이 저렴하여 상업용 식품에 많이 사용되고 있으나, 인체 부작용 등 안전성에 대한 우려로 그 사용량이 법적으로 규제되어 있다. 토코페롤과 같은 천연 항산화제는 인체에 대하여 안전하기는 하나 단독으로는 산화 연쇄반응 저지 능력이 낮고, 가격이 비싼 단점이 있다.
한국 공개 특허공보 제2012-0139023호는 석이버섯 가수분해 효소 추출물 또는 이로로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물을 개시한다.
한국 공개 특허공보 제2012-0139003호는 기린초류 추출물을 유효성분으로 하는 항균 및 항산화 조성물을 개시한다.
따라서, 다양하고 새로운 소재를 이용한 안전성이 뛰어나면서도 경제성이 있는 천연물질 유래의 항산화제 발굴이 지속적으로 요구되고 있다.
본원은 항산화성 성분과 같은 기능성 성분이 강화된 천연 발효물을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 산수유 발효물을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물에 관한 것이다. 본원에 따른 일 실시예에서 발효는 효모 (Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 또는 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) 중 하나 이상을 이용하여 수행될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 일 구현예에서는 락토바실러스 아시도필러스가 사용된다.
본원에 따른 항산화 조성물은 항산화로 인해 효과가 있는 다양한 분야에 적용될 수 있으며, 예를 들면 의약품, 화장품, 건강보조식품, 기능성 식품, 식품첨가제로 제공될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서 상기 의약품은 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 상술한 본원에 따른 산수유 발효물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 효모, 바실러스 서브틸리스, 또는 락토바실러스 아시도필러스 중 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 한다. 본원에 따른 일 구현예에서 상기 방법은 산수유에 효모, 바실러스 서브틸리스, 또는 락토바실러스 아시도필러스를 접종하는 단계; 상기 효모와 바실러스 서브틸리스는 온도 28~30℃에서 균주의 성장에 적절한 속도, 저속도 예를 들면 약 100 내지 200rpm으로 교반시키면서 약 40~72시간 배양하고, 상기 락토바실러스 아시도필러스는 온도 약 35~37℃에서 약 60~84시간 발효시키는 단계를 포함한다.
본원에 따른 일 구현예에서 상기 효모, 바실러스 서브틸리스, 또는 락토바실러스 아시도필러스는 생육단계 중 유도기를 줄이고, 대수증식기로 단시간에 진입할 수 있는 양, 예를 들면 약 1 내지 5%의 양으로 접종될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니며, 사용되는 구체적 온도 및 배양시간을 고려하여 적절하게 변경될 수 있다.
본원에 따른 산수유 발효물은 발효로 인해 항산화 기능이 월등히 강화되어 항산화 효과가 필요한 각종 질환 예를 들면 염증성 질환 또는 암의 치료 또는 예방, 또는 비만 관련 질환 예방, 또는 항산화를 기능이 요구되는 각종 건강기능성 식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 다양한 발효 균주를 이용하여 발효된 산수유 발효물의 DPPH 분석을 통한 항산화 활성 정도를 측정한 결과이다.
도 2는 본원의 한 예시적 방법에 따라 제조된 발효물의 대장암 세포 증식 억제 활성 측정한 결과이다.
도 3은 본원의 한 예시적 방법에 따라 제조된 발효물의 염증 반응 억제 활성을 측정한 결과이다.
도 2는 본원의 한 예시적 방법에 따라 제조된 발효물의 대장암 세포 증식 억제 활성 측정한 결과이다.
도 3은 본원의 한 예시적 방법에 따라 제조된 발효물의 염증 반응 억제 활성을 측정한 결과이다.
본원은 산수유가 발효를 통해 유용 성분이 극대화되어 유용한 기능성 물질로서 약효를 발휘할 수 있다는 발견에 기초한 것이다.
본원에 사용되는 산수유 (학명: Cornus officinalis , 라틴명 Corni Fructus)는 층층나무과에 속하는 낙엽성 소교목으로 한국 및 기타 열대에서 온대 지역에 걸쳐 재배되는 것으로, 다양한 변종, 아종이 본원에 포함될 수 있다. 본원에 사용되는 산수유는 생리활성을 포함하는 한, 전체는 그 일부 예를 들면, 과육, 잎, 줄기, 종자 및/또는 뿌리가 사용될 수 있으며, 특히 열매, 특히 과육이 사용된다.
산수유의 생리활성 물질로 과육(果肉)에는 부교감 신경을 흥분시키는 코르닌(cornin), 모로니사이드(Morroniside), 약간의 중추신경 흥분작용이 있는 로가닌(Loganin), 탄닌(tannin), 사포닌(Saponin) 등의 배당체와 수렴성분인 탄닌(tannin)과 비타민 A가 다량 함유되어 자양강정과 수렴작용에 효과가 있고, 암을 예방할 수 있는 셀레늄 (Se) 등의 기능성분을 가지고 있으며, 그밖에 비타민 A와 다량의 당(糖)도 포함되어 있다.
본원에서 발효물이란 본 발명에 따른 균주를 이용하여 발효과정을 거친 산물을 칭하는 것으로 발효 후 고형분이 제거 또는 제거되지 않은 것이 모두 본원에 포함된다. 한 구현예에서 발효 후 고형분은 체로 거른 후 사용된다. 본원의 발효에 사용될 수 있는 균주는 본원에 따른 효과를 나타낼 수 있는 다양한 균주가 포함될 수 있으며, 예를 들면 효모(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 또는 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) 중 하나 이상을 사용하여 수행될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서는 본원의 산수유는 락토바실러스 아시도필러스를 이용하여 발효된다. 다른 구현예에서는 효모가 사용된다.
본원에 따른 산수유 발효물은 발효공정을 통해 원료내의 유효성분들이 다양한 유용성 성분으로 전이되며, 특히 발효를 통해 다양한 항산화 성분들 예를 들면 플라보노이드 또는 폴리페놀의 함량이 강화되고, 기능성 성분이 활성형태로 전이되어 그 유용성이 극대화되었다.
따라서 한 양태에서 본원은 항산화 기능을 갖는 산수유 발효물 또는 이를 포함하는 항산화 조성물에 관한 것이다.
본원에서 사용된 용어 "항산화 기능" 또는 "항산화"는 함께 사용 시 생물학적 물질의 산화를 저해, 억제하는 기능을 말하는 것으로, 자유 라디칼기, 또는 기타 반응성 산소 (O2 -, H2O2, OH, HOCL, ferryl, peroxyl, peroxynitrite, alkoxyl)를 제거하거나 또는 이의 형성을 억제하거나 또는 이들 물질을 반응성이 약한 물질로 전환하는 기능을 가지는 것을 의미하며, 항산화 기능이 있는 물질은 산화와 관련된 질환이 치료 또는 예방에 효과가 있다. 항산화성을 측정하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들면 전자공여능을 측정하는 Blois (Blois, M.S. 1958. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical, Nature, 181: 1199-1200) 이 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에서 "산화와 관련된 질환"은 자유 라디칼기, 특히 산소라디칼 (oxyradicals), 또는 반응성 산소 (reactive oxygen species, ROS)의 생산 또는 이에 노출되어 발생하는 병리적 증상, 질환을 일컫는 것으로, 기존의 자유 라디칼 억제제 예를 들면 (e.g. desferroxamine), 스카벤저 (e.g. tocopherol, glutathione) 또는 촉매 (e.g. superoxide dismutase, catalase) 등의 투여로 증상이 개선되는 질환을 포함하는 것이다.
산화와 관련된 질환은 예를 들면 자유 라디칼과 관련된 질환, 허혈성재관류손상, 염증성질환, 전신성 홍반성 낭창, 심근허혈 또는 경색, 뇌혈관 장애 (혈관색전증, 출혈성 뇌졸중), 척수외상, 크론병, 자가면역질환 (예를 들면 류마티스성 관절염, 당뇨병), 백내장, 포도막염 질병, 폐기종, 위궤양, 산소독성, 종양, 과세포사멸, 방사선병 등을 포함한다.
또한 항산화 물질은 동, 식물계에 널리 분포되어 있는데, 과일과 채소에 많은 페놀성 화합물, 플라보노이드, 토코페롤, 비타민 C와 같은 항산화 물질은 지방의 산화를 지연시키거나 방지하며, 암, 심장혈관계 질환 등을 예방, 지연시킴으로써 노화방지에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 플라보노이드와 같은 항산화 물질이 강화된 본원의 조성물은 암, 뇌심장혈관계 질환에 유용하게 사용될 수 있다. 일 구현예에서 본원의 조성물은 고형암, 특히 대장암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본원의 산수유 발효물 및 이를 포함하는 항산화 조성물은 염증반응과 관련된 MMP9 (Matrix metallopeptidase)를 활성화여 염증의 완화 및/또는 치료 효과를 나타낸다. 한 구현예에서 본원에 따른 조성물은 면역과 관련된 염증질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "염증성 질환"이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증 유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다. 일 구현예에서 상기 염증성 질환은 만성 염증과 관련된 질환으로 예를 들면 췌장염, 만성간염, 치주염, 식도염, 위염, 대장염, 폐렴, 기관지염, 인후염, 심근경색, 심부전, 알츠하이머, 관절염, 신부전, 건선, 빈혈, 당뇨, 또는 섬유화증을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "치료"란 추출물 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 염증 또는 산화성 스트레스로 인한 다른 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
본원에서 사용된 용어 "예방"은 추출물 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 본 조성물이 효과가 있는 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 항염증, 항산화 효과가 있는 본원의 추출물은 염증의 초기 증상, 또는 나타나기 전에 복용할 경우 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
본원의 산수유 발효물 또는 항산화 조성물을 포함하는 의약품은 또는 약학 조성물은 동시에 또는 연속적으로 투여가능하며, 이들 혼합물을 단독으로 또는 염증의 치료를 위한 다른 약학적 활성성분과 병행하여 투여될 수 있다.
본원의 산수유 발효물을 포함하는 조성물은 의약품 또는 약학 조성물의 제조에 있어 이의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 희석제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등의 부형제를 더 포함할 수 있다. 구체적으로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘, 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.
본원의 산수유 발효물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 산제, 정제, 환제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 액, 에멀젼, 현탄액, 시럽제, 엘릭서, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화되어 전신 또는 국소적으로 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 특히 경구 투여가 바람직하다.
경구 투여를 위한 고형 제형에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 비경구 투여를 위한 제형에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴등이 사용될 수 있다.
더 나아가 본원의 산수유 발효물을 포함하는 약학 조성물은 당해 기술분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's harmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
본원의 산수유 발효물을 포함하는 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있으나, 산수유 발효물의 유효 투여량은 통상적으로 성인(60kg)의 경우, 약 1 내지 100 g/일, 특히 약 10 내지 50g/일, 더욱 바람직하게는 약 30g/일이다. 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다. 또한, 본원의 추출물을 포함하는 조성물은 그대로 경구투여하는 것 이외에, 임의의 음식물에 첨가하여 일상적으로 섭취할 수도 있다.
본원의 산수유 발효물을 포함하는 약학 조성물은 우수한 항염증 및 항산화 효과를 제공할 뿐만 아니라, 약물에 의한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다. 이에 따라, 상기 본원의 산수유 발효물이 식품의 주, 부원료 및 식품 첨가제로서 사용이 가능하다.
따라서, 이러한 관점에서, 본 발명은 상기 기술한 본원의 산수유 발효물을 포함하는 조성물은 식품, 예를 들면, 건강보조식품, 기능성 식품, 식품첨가제 등으로 제공될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "식품"이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이다.
본원에서 사용된 용어 "기능성식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 방법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 특히 "건강기능식품"을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "건강보조식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 가공한 식품으로서, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품원료에 들어있는 성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말한다.
특히 본 발명에서 기능성식품 또는 건강보조식품은 상기 식품을 섭취하기 전과 비교하여 염증, 산화성 스트레스로 유발되는 질환의 증상을 개선하거나, 이의 경감 또는 해소에 도움을 줄 수 있는 효과가 있는 식품을 의미하며, 본원발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 이러한 질환의 정확한 기준을 알고, 개선된 정도를 판단할 수 있을 것이다.
상기 기능성식품 및 건강보조식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더욱 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본원의 산수유 발효물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효 음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본원에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 본원의 산수유 발효물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리세르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g이다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.
본원에서 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 방법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미하며, 바람직하게는 항염증, 항산화 기능을 갖는 음료를 의미한다.
상기 기능성 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본원의 산수유 발효물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본원의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0.001 내지 20 중량부 범위에서 선택될 수 있다.
염증성 질환의 개선 또는 항산화 기능을 목적으로 하는 식품에 있어서, 본원의 산수유 발효물은 전체 식품 중량의 약 0.01 내지 90 중량%, 약 0.1 내지 80 중량%, 약 1% 내지 70%, 약 1% 내지 50%, 약 1% 내지 40%, 약 1% 내지 30%, 약 1% 내지 20%의 범위로 포함할 수 있으나, 상기 범위를 벋어나는 것을 제외하는 것은 아니다. 예를 들면 음료 조성물은 100㎖ 를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 포함할 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원의 조성물에 사용되는 산수유 발효물의 제조방법에 관한 것이다. 본원에서 발효는 이로 제한하는 것은 아니나, 효모(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 또는 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus) 중 하나 이상을 사용하여 수행될 수 있다. 한 구현예에서는 본원의 산수유는 락토바실러스 아시도필러스를 이용한다.
본원에 따른 방법은 일 구현예에서 산수유에 효모, 바실러스 서브틸리스, 또는 락토바실러스 아시도필러스를 접종하는 단계; 상기 효모와 바실러스 서브틸리스는 각각 온도 약 28~30℃에서, 상기 효모 및 바실러스 서브틸리스 성장에 적절한 속도로 교반시키면서 약 40~72시간 배양하고, 상기 락토바실러스 아시도필러스는 온도 약 35~37℃에서 약 60~84시간 발효시키는 단계를 포함한다. 성장에 적절한 속도의 교반에서, 교반속도가 빠를 경우 발생하는 거품으로 인한 균체 생장속도가 저하되어 이를 극복하고, 배양 미생물의 성장에 필요한 산소 및 주영양분 전달을 효율적으로 하기 위한 속도를 말하는 것으로 예를 들면 약 100 내지 200rpm을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본 방법에서 접종되는 균체의 양은 전체 생육단계중 유도기를 가능한 단기간 예를 들면 12~15 시간 끝내고 곧 대수증식기로 진입할 수 있는 최적 접종량의 범위로, 사용되는 구체적 균주, 배양 조건에 따라 다를 수 있지만, 예를 들면 약 1 내지 5 중량%으로 포함된다.
종래의 산수유는 산수유 열매는 신선한 과육으로 장기간 보관이 어려운 점을 감안할 때 대부분 건조된 형태로 보관되는데, 종래의 건조 산수유의 경우 단순히 끓여 먹는 정도로는 산수유의 유효성분을 충분히 우려낼 수 없었다.
본원 방법에 의해 발효 제조된 산수유는 열수 추출과 비교하여 항산화 성분이 강화되고, 항염 및 항암 효과에서도 열수 추출물, 비발효물과 비교하여 우수한 효과를 나타냈다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 산수유 발효물의 제조
산수유 열매 2% (w/v)를 포함한 증류수를 121℃에서 15 분간 멸균한 후, 이를 상온으로 식힌 다음 미리 준비한 3종의 액상 종균(유산균, 효모, 청국장균)을 각각 3% (w/w)로 접종하였다.
발효 균주로 사용한 막걸리에서 분리한 효모(Saccharomyces cerevisiae), 청국장에서 분리한 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)는, 그리고 김치에서 분리한 유산균인 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus)는 모두 경상북도 구미 경운대학교 창업보육센터 소재 벤처기업인 태승바이오로부터 분양받아 사용하였다.
효모와 바실러스 서브틸리스 청국장균을 접종한 경우 온도 28~30℃인 세포배양기에서 150rpm으로 천천히 교반시키면서 48시간 발효시킨 후 종료하였고, 유산균을 접종한 경우 온도 35~37℃에서 정치된 배양기에서 72시간 발효 시킨 후 종료하였다.
미생물을 달리하여 발효시킨 3종의 산수유 발효액을 여과지를 사용하여 고형분을 제거한 후 수득된 액체를 1차로 분리하고, 2차로 이를 감압 농축기를 이용하여 3배 농축시킨 후 동결건조 시켜 시료로 사용하였다.
실시예 2 발효액의 성분 및 효능 분석
미생물 발효에 의한 산수유의 생리활성 강화 기능을 검증하기 위해, 실시예 1에서 제조한 3종의 산수유 발효액을 시료로 DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능을 지표로 한 항산화 활성을 측정하여 비교 분석하였다.
산수유 발효분말의 전자공여능은 Blois (Blois, M.S. 1958. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical, Nature, 181: 1199-1200) 의 방법에 의거하여 측정하였다. 각 농도별로 0.1M sodium acetate buffer(pH5.5)에 녹인 시료 1ml과 7.5 × 10-5M DPPH 2ml을 혼합하여 37 배양기에서 30분간 반응을 시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 측정된 흡광도 값으로부터 먼저 Inhibition concentration (%) = (1 - 시료첨가군의 O.D/시료 무첨가군의 O.D) × 100을 구한 다음 Y = aX + b 방정식을 작성하여 다음의 식으로 IC50 값을 구하였다.
IC50 = (0.5-b)/a (자유 라디칼의 활성을 50%로 저해하는데 필요한 농도)
그 결과 산수유 발효물 3종의 DPPH 라디칼 소거능은 도 1에 기재되어 있다. 이때 비교군으로 발효 시키지 않고 동일한 과정으로 제조한 산수유 열수 추출물과 천연 항산화제로 알려진 L-아스코르브산을 사용하여 비교하였다.
산수유 발효액 3종중에서 특히 유산균을 발효시킨 산수유 유산균 발효물의 경우 전자공여능이 가장 우수한 양상을 나타내었다. 300ppm 처리시 전자공여능은 유산균 발효의 경우 75.3%, 효모 발효 산수유 38.1%, 청국장균 발효 산수유 22.5%, 열수추출 산수유 14.2% 순으로 나타났으며, 특히 300ppm 이상의 농도에서는 천연 항산화제인 L-아스코르브산에 필적하는 수준의 전자공여능을 보였다.
IC50값은 유산균 발효의 경우 180ppm로 효모 발효 산수유 440ppm 보다 낮게 나타났으며, 청국장균 발효나 열수 추출 산수유의 경우는 IC50값이 큰 의미를 갖지 않는 것으로 분석되었다. 이로부터 산수유를 유산균으로 발효시킨 경우 항산화 활성이 극대화됨을 알 수 있다.
실시예 3 유산균 발효액의 항산화 성분 분석
실시예 1에서와 같이 제조한 산수유 유산균 발효액의 pH 및 당도를 분석한 결과는 다음과 같다. 유산균 발효 후 pH 및 당도가 다소 증가한 것으로 보아 발효 과정에서 유기산 및 구성 당의 변화가 있는 것으로 판단된다.
| 발효 후 | 발효 전 | |
| pH | 3.6 | 2.8 |
| 당도(brix) | 2.6 | 1.2 |
유산균 발효 산수유의 생리활성 지표물질 중 항산화와 관련된 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Ciocalteu (FC) (Oliver H. et al. 1951. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem. 193 (1): 265275) 법에 의거하여 증류수 5ml 과 시료 1ml, FC reagent 0.5ml을 순서대로 혼합하여 8분간 방치한 후 10ml의 7% Na2CO3를 첨가하였다. 이후 상온에서 2시간 반응시켜 750nm에서 흡광도를 측정하였으며, hesperitin을 표준물질로 사용하였다.
유산균 발효 산수유 분말의 총 폴리페놀 함량은 31.3 mg/100g으로 발효 시키지 않은 산수유 열수 추출물의 4.7 mg/100g에 비해 약 6.7배 증가한 수치를 나타내었다.
총 플라보노이드 함량은 Moreno 등 (Moreno MIN, et al. 2000. Comparison of the free radical scavenging activity of propolis from several region of Argentina. J Enthropharmacology 71: 109-114) 의 방법에 의거하여 10% 알루니늄 나이트레이트 0.1ml과 1M 수성 포타슘아세테이트 0.1ml, 80% 에탄올 4.3ml을 잘 혼합시킨 후 시료 0.5ml을 첨가하여 실온에 40분간 방치한 후 510nm에서 흡광도를 측정하였고, 퀘르세틴(quercetin)을 표준물질로 사용하였다.
유산균 발효 산수유 분말의 총 플라보노이드 함량은 4.3 mg/100g으로 발효시키지 않은 산수유 열수 추출물의 1.7 mg/100g에 비해 약 2.5배 증가하였으며, 이는 산수유를 유산균을 이용하여 발효시킬 경우 특히 항산화와 관련된 생리 활성물질의 함량이 증가되는 것을 나타내는 것이다.
실시예 4 산수유 유산균 발효물의 항암 및 항염증 효과
인체 대장암 세포주인 HCT116 (ATCC, CCL-247) (10% 소태아 혈청을 포함하는 McCoy 5A Media Modified (Gibco) 배지에서 배양)을 이용하여 유산균 발효 산수유 분말의 암세포 성장억제 효과를 MTT 분석 (Berridge MV et al. 2005. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review, 11: 127-152) 을 종전에 기술된 바와 같이 수행하여 확인하였다. 요약하면 암세포를 96 웰 플레이트에 1×104 cells/well이 되게 150㎕씩 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 전 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지 100㎕와 각 농도의 시료를 100㎕씩 첨가하여 48시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 각 well 당 DMSO:EtOH(1:1) 용액 150㎕ 첨가하여 30분간 교반한 후, ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 암세포 성장 억제 효과를 보는 Cytotoxicity는 다음 식을 이용하여 구하였다.
Cytotoxicity (%) = [1-(시료 첨가군의 흡광도/시료 비첨가군의 흡광도)] x100
결과는 도 2에 기재되어 있다. 도 2에 나타난 바와 같이 산수유 유산균 발효액은 대장암 세포의 증식을 농도 의존적으로 억제하였으며, 800μg/ml 처리시 대장암 세포의 성장을 약 68% 저해하였으며, 이는 발효시키지 않은 상태의 산수유 농축액 동일 조건 처리시 21%에 비해 약 3.2배 증가한 것이다.
이어 산수유 유산균 발효액 및 산수유 열수 추출농축액의 면역 염증반응과 관련된 MMP-9 분비량을 THP-1 세포주 (human acute monocytic leukemia, ATCC TIB-202)(10% 소태아 혈청을 포함하는 RPMI Complete 배지(Gibco)에서 배양)를 이용하여 zymography로 종전에 기재된 바와 같이 (H. Watanabe et al. 1993. Matrix metalloproteinase-9(92 kDa gelatinase/type IV collagenase) from U937 monoblastoid cells: correlation with cellular invasion. J Cell Sci 104: 991-999)분석하였다. 요약하면 0.1% 젤라틴이 포함된 SDS-폴리아크릴아미드 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide) 젤에서 염증반응과 관련된 MMP-9 (Matrix metallopeptidase)을 전기영동 한 후 MMP-9 이 효소작용을 할 수 있는 조건에서 젤을 배양하여 젤라틴의 분해 정도를 통해 분비된 MMP-9의 양을 측정하였다.
Zymography는 0.1% 젤라틴이 포함된 SDS-폴리아크릴아미드 젤 에서의 전기영동 후 MMP-9이 효소작용을 할 수 있는 조건에서 배양하여 젤라틴의 분해 정도를 통해 분비된 MMP-9의 양을 측정하는데 이용하였다. THP-1 세포를 1.0 ×105cells/well의 농도가 되도록 무혈청 RPMI 1640 배지에 현탁하여 96-well 플레이트에 100 μl 씩 추가한 뒤, PMB (30분 전처리), LPS는 1μg/ml, 산수유 열수 추출물 5, 500 μg/ml 및 발효 산수유 추출물을 5 및 500 μg/ml로 자극하였다. 자극으로부터 24시간 후 배양액에서 상층액만을 분리하였다. 상층액과 FOZ 완충액 (4% SDS, 20% glycerol, 0.01% bromophenol, 0.125 M Tris-Cl)를 섞어 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후 2.5% Triton X-100에 젤을 40분간 넣어두어 SDS를 제거한 뒤 분해 (digestion) 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 0.15 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.02% NaN3)에 젤을 넣어 12시간동안 37℃에서 배양하였다. 배양 후 젤을 0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (USB Corporation, Cleveland, U.S.A)로 염색 및 탈색을 통해 젤라틴의 분해를 확인하였다.
결과는 도 3에 기재되어 있다. 도 2에 나타난 바와 같이, 산수유 유산균 발효농축액은 발효하지 않은 산수유 농축액과는 달리 면역과 관련된 염증반응을 감소시키는 경향성이 유의적으로 확인되었다.
제제예 1. 액제의 제조
산수유 발효물 1000mg
설탕 20mg
이성화당 20mg
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 1000 ml로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.
제제예 2. 건강 음료의 제조
산수유 발효물 1000mg
구연산 1000mg
올리고당 100g
메실농축액 2g
타우린 1g
정제수를 가하여 전체 1000 ml로 맞추었다. 통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장보관한 다음 본 발명의 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.
제제예 3. 건강 식품의 제조
산수유 발효물 1000mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70mg
비타민 E 1.0mg
비타민 B1 0.13mg
비타민 B2 0.15mg
비타민 B6 0.5mg
비타민 B12 0.2mg
비타민 C 10mg
비오틴 10mg
니코틴산아미드 1.7mg
엽산 50mg
판토텐산칼슘 0.5mg
비타민 E 1.0mg
무기질 혼합물 적량
황산 제1철 1.75mg
산화아연 0.82mg
탄산 마그네슘 25.3mg
제1인산칼륨 15mg
제2인산칼슘 55mg
구연산칼륨 90mg
탄산칼슘 100mg
염화마그네슘 24.8mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 제조예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립 제형의 건강식품을 제조하였다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 원에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
Claims (9)
- 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus)로 발효된 산수유 열수 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 식품 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 건강보조식품, 기능성 식품, 또는 식품첨가제로 제공되는 것인, 항산화 식품 조성물.
- 삭제
- 산수유 발효물의 제조방법으로,
산수유에 락토바실러스 아시도필러스를 접종하는 단계; 및
상기 락토바실러스 아시도필러스 접종물을 35~37℃에서 60~84시간 발효시키는 단계를 포함하는, 산수유 발효물의 제조방법.
- 삭제
- 제 6 항에 있어서, 상기 발효 단계에서 100 내지 200 rpm으로 교반하는 것을 추가로 포함하는 것인, 산수유 발효물의 제조방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 락토바실러스 아시도필러스는 1 내지 5 중량%의 농도로 접종되는 것인, 산수유 발효물의 제조방법.
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